SK119997A3

SK119997A3 - New cryptophycins from synthesis

Info

Publication number: SK119997A3
Application number: SK1199-97A
Authority: SK
Inventors: Richard E Moore; Marcus A Tius; Russell A Barrow; Jian Liang; Thomas H Corbett; Frederick A Valeriote; Thomas K Hemscheidt; Galakoti Trimurtulu
Original assignee: Univ Hawaii; Univ Wayne State
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 1998-12-02
Also published as: HUP9801880A3; ATE279935T1; BG101875A; CN1183726A; PL322507A1; HUP9801880A2; EP0830136A1; ES2230561T3; CN1165337C; HU225041B1; HK1009747A1; TJ347B; NZ305571A; FI973591A0; AP9701069A0; NO326685B1; DE69633667T2; AU723652B2; WO1996040184A1; EP0830136B1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka kryptofycínových zlúčenín, spôsobu ich výroby a farmaceutických prostriedkov na ich báze.

Doterajší stav techniky

Neoplastické choroby charakterizované proliferáciou buniek, ktoré nepodliehajú normálnemu riadeniu bunkového rastu, sú u ľudí hlavnou príčinou smrti. Klinická skúsenosť s chemoterapiou ukázala, že na liečenie týchto chorôb sú nutné nové a účinnejšie liečivá. Tieto skúsenosti tiež ukázali, že liečivá, ktoré narušujú mikrotubulárny systém cytoskeletu môžu byť účinnými inhibítormi proliferácie neoplastických buniek.

Mikrotubulárny systém eukaryontných buniek je hlavnou zložkou cytoskeletu a nachádza sa v dynamickom stave skladania a rozkladania, tzn. heterodiméry tubulínu polyméru j ú za vzniku mikrotubulov, a mikrotubuly sa depolymerujú na svoje stavebné prvky. Mikrotubuly hrajú kľúčovú úlohu v regulácii stavby, metabolizmu a delení buniek. Dynamický stav mikrotubulov má rozhodujúci význam pre ich normálnu funkciu. Pri bunkovom delení tubulín polymeruje na mikrotubuly, ktoré vytvárajú mitotické deliace vretienko. Ked mitotické deliace vretienka splnia svoju funkciu, mikrotubuly sa potom depolymerujú. Z toho vyplýva, že činidlá, ktoré narušujú polymeráciu alebo depolymeráciu mikrotubulov, a tým inhibujú mitózu, zahŕňajú niektoré najúčinnejšie chemoterapeutické činidlá používané v klinickej praxe.

Také antimitotické činidlá alebo jedy je možné na základe ich molekulárneho mechanizmu účinnosti rozdeliť do troch skupín. Prvú skupinu tvoria činidlá, ako kolchicín a kolcemid, ktoré inhibujú vznik mikrotubulov sekvestrovaním tubulínu. Druhú skupinu tvoria činidlá, ako vinblastín a vinkristín, ktoré vyvolávajú vznik parakryštalických agregátov tubulínu. Vinblastín a vinkristín sú dobre známe protirakovinnové liečivá: ich pôsobenie, ktoré vyvoláva narušenie mikrotubulov mitotického vretienka, prednostne inhibuje hyperproliferativne bunky. Tretiu skupinu tvoria činidlá, ako taxol, ktoré sú promotory polymerácie tubulínu, a teda stabilizujú mikrotubulárne štruktúry.

Samotná antimitotická účinnosť však nezaručuje účinnosť proti nádorovým bunkám, najmä v tom prípade, že sa jedná o nádorové bunky, ktoré vykazujú fenotyp rezistencie na liečivá. Alkaloidy zimozelu Vinea, ako vinblastín a vinkristín, sú účinné proti neoplastickým bunkám a nádorom, ale ich účinok na niektoré tumory a bunky rezistentné na liečivá je nedostatočný. Pri neoplastických bunkách je jedným zo základov rezistencie voči liečivu (drug resistance, DR) alebo rezistencie voči niekoľkým liečivám (multiple-drug resistance, MDR) nadexpresia P-glykoproteínu. Zlúčeniny, ktoré sú špatnými substrátmi pre transport P-glykoproteínu, by mali byť užitočné na ošialenie DR alebo MDR fenotypov.

Prítomnosť DR alebo MDR fenotypu v mnohých nádorových bunkách a klinicky preukázaný spôsob pôsobenia antimikrotubulárnych činidiel proti neoplastickým bunkám vyvolávajú potrebu vyvinúť antimikrotubulárne činidlá s cytotoxicitou voči neoplastickým bunkám nerezistentným voči liečivám, ako tiež voči neoplastickým bunkám s fenotypom rezistencie voči liečivám. V tomto ohľade sú sľubné tie zlúčeniny, ktoré zahŕňajú triedu zlúčenín známych ako kryptofycíny.

Čo sa týka spôsobov výroby kryptofycínov, nie sú v súčasnosti známe žiadne postupy totálnej syntézy. Kryptofycínové zlúčeniny sa v súčasnom čase vyrábajú izoláciou z modrozelenej rasy alebo polosyntetickými obmenami týchto zlúčenín vznikajúcich v prírode. Absencia plne syntetického spôsobu výroby nezbytne vyvoláva problémy pri výrobe stereošpecifických kryptofycínov, ktoré môžu maximalizovať účinnosť a zvyšovať stabilitu zlúčenín. Prieskumy napríklad ukázali, že kryptofycíny s intaktným makrocyklickým kruhom sú účinnejšie. Je teda žiadúce vyvinúť plne syntetický spôsob výroby, pri ktorom by bolo možné vyrobiť kryptofycíny s makrocyklickým kruhom, ktoré sú stabilnejšie ako deriváty prírodných kryptofycínov. Uvedený problém rieši tento vynález.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú nové kryptofycínové zlúčeniny všeobecného vzorca

kde

Ar predstavuje metylskupinu, fenylskupinu alebo ktorú kolvek jednoduchú nesubstituovanú alebo substituovanú aromatickú alebo heteroaromatickú skupinu;

R¹ predstavuje atóm halogénu, merkaptoskupinu, aminoskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, trialkylamoniumskupinu, alkyltioskupinu, dialkylsulfoniumskupinu, sulfátovú alebo fosfátovú skupinu;

R² predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu;

alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový, episulfidový, sulfátový alebo monoalkylfosfátový kruh; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₈ a C_ig;

predstavuje nižšiu alkylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄;

predstavuje benzylskupinu, hydroxybenzylskupinu, alkoxybenzylskupinu, halogénhydroxybenzylskupinu, dihalogénhydroxybenzylskupinu, halogénalkoxybenzylskupinu alebo dihalogénalkoxybenzylskupinu;

R⁷, R⁸, R⁹ a R¹⁰ predstavuje každý nezávisle atóm vodíka alebo nižšiu alkylskupinu; a predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, iminoskupinu alebo alkylamlnoskupinu.

Predmetom vynálezu sú ďalej tiež spôsoby totálnej syntézy kryptofycínov a použitie kryptofycínov vo farmácii za účelom inhibície proliferácie cicavčích buniek a liečenie novotvarov.

Prehľad obr. na výkresoch

Na obr. 1 je znázornená všeobecná štruktúra zvolených kryptofycínových zlúčenín podľa vynálezu. Je tu tiež uvedený systém číslovania hydroxykyselinových jednotiek A a D a aminokyselinových jednotiek B a C vo vybraných predvedeniach vynálezu.

Na obr. 2A je graficky znázornený účinok kryptofycínovej zlúčeniny na proliferáciu a postup bunkového cyklu u Jurkatových buniek. Na obr. 2B je graficky znázornený účinok vinblastínu na proliferáciu a postup bunkového cyklu u Jurkatových buniek. Jurkatove bunky sa inkubujú s uvedenými koncentráciami kryptofycínovej zlúčeniny (A) alebo vinblastínu (B) počas 24 hodín. Pri každej vzorke sa spôsobom opísaným v ďalej uvedenej experimentálnej časti stanoví počet životaschopných buniek (plné štvorčeky) a mitotický index (prázdne štvorčeky). Uvedené hodnoty predstavujú stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka (sd) pre tri replikácie vzorky pri jednom z troch podobných experimentov.

Na obr. 3 je graficky znázornená reverzibilita účinkov vinblastínu, kryptofycínov a taxolu na bunkový rast. Bunky SKOVIII boli ošetrené Ο,ΙηΜ vinblastínom (prázdne štvorčeky), Ο,ΙηΜ kryptofycínmi (plné štvorčeky) alebo lnM taxolom (preškrtnuté štvorčeky) v čase 0. Pri použití týchto koncentrácií zlúčenín došlo k inhibícii bunkového rastu o 50 %. Po 24 hodinách boli bunky premyté a stanovený čas inkubované v médiu neobsahujúcom liečivo. Denzita buniek bola stanovená farbením sulforhodamínom B (SRB) spôsobom opísaným v experimentálnej časti a je vyjadrená ako stredná hodnota ± smerodajná odchýlka absorbancie pri 560 nm pre tri replikácie vzorky pri jednom z troch experimentov.

Na obr. 4 sú uvedené izobologramy kombinačných účinkov vinblastínu a kryptofycínov na proliferáciu buniek. Bunky SKOVIII boli ošetrované vinblastínom (0 až 600pM) a/alebo kryptofycíny (1 až lOOpM) počas 48 hodín. Potom bol pomocou farbenia SRB opísaného v experimentálnej časti stanovený počet buniek. Ďalej boli stanovené hodnoty IC₅₀a čiara aditivity (---) pre kombinácie vinblastínu a kryptofycínových zlúčenín. Uvedené hodnoty predstavujú stredné hodnoty z dvoch experimentov, z ktorých každý bol vykonávaný s tromi replikáciami.

Na obr. 5 je znázornená schéma syntézy kryptofycínov podlá tohto vynálezu.

Na obr. 6 je znázornená schéma výroby hydroxykyselinovej jednotky A.

Na obr. 7 je znázornená schéma výroby podjednotky kryptofycínu zahŕňajúca hydroxykyselinovú jednotku A a aminokyselinovú jednotku B.

Na obr. 8 je znázornená schéma výroby podjednotky kryptofycínu zahŕňajúca aminokyselinovú jednotku C a hydroxykyselinovú jednotku D.

Na obr. 9 je znázornená prvá schéma syntézy zvolených kryptofycínov podlá tohto vynálezu.

Na obr. 10 je znázornená druhá schéma syntézy zvolených kryptofycínov podlá tohto vynálezu.

Na obr. 11 je znázornená schéma syntézy podjednotky kryptofycínu zahŕňajúca hydroxykyselinu D.

Na obr. 12 je znázornená tretia schéma syntézy zvolených kryptofycínov podľa tohto vynálezu.

Na obr. 13 je znázornená štvrtá schéma syntézy zvolených kryptofycínov podľa tohto vynálezu.

Na obr. 14 je znázornená piata schéma syntézy zvolených kryptofycínov podľa tohto vynálezu.

Nasleduje podrobnejší opis tohto vynálezu.

Predmetom vynálezu sú kryptofycínové zlúčeniny všeobecného vzorca

Ar predstavuje metylskupinu, fenylskupinu alebo ktorúkoľvek jednoduchú nesubstituovanú alebo substituovanú aromatickú alebo heteroaromatickú skupinu;

R² predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu;

alebo

predstavuje nižšiu alkylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

R⁶ predstavuje benzylskupinu, hydroxybenzylskupinu, alkoxybenzylskupinu, halogénhydroxybenzylskupinu, dihalogénhydroxybenzylskupinu, halogénalkoxybenzylskupinu alebo dihalogénalkoxybenzylskupinu;

R Q 1 Π

R , R°, R a R predstavuje každý nezávisle atóm vodíka alebo nižšiu alkylskupinu; a

X a Y predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, iminoskupinu alebo alkylaminoskupinu.

Podlá jedného aspektu sú predmetom vynálezu kryptofycínové zlúčeniny všeobecného vzorca

kde

R¹ predstavuje atóm vodíka, hydroxyskupinu, atóm halogénu, kyslíkový atóm ketoskupiny, aminoskupinu, merkaptoskupinu, nižšiu alkoxyskupinu alebo nižšiu alkylskupinu;

R² predstavuje atóm vodíka, hydroxyskupinu, kyslíkový atóm ketoskupiny, aminoskupinu, merkaptoskupinu, nižšiu alkoxyskupinu alebo nižšiu alkylskupinu; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový alebo episulfidový kruh alebo dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C_lo a C_llf· alebo

R¹ a R⁴ brané dohromady tvoria tetrahydrofuránový kruh;

R³ predstavuje atóm vodíka alebo nižšiu alkylskupinu;

R⁴ predstavuje hydroxyskupinu, nižšiu alkanoyloxyskupinu alebo nižšiu a-hydroxyalkanoyloxyskupinu;

r5 predstavuje atóm vodíka alebo hydroxyskupinu;

predstavuje atóm vodíka; alebo

R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C_g;

R⁷ predstavuje benzylskupinu, hydroxybenzylskupinu, metoxybenzylskupinu, halogénhydroxybenzylskupinu, dihalogénhydroxybenzylskupinu, halogénmetoxybenzylskupinu alebo dihalogénmetoxybenzylskupinu;

R⁸ predstavuje hydroxyskupinu, nižší β-aminokyselinový zvyšok, kde dusíkový atóm β-aminokyseliny je viazaný k uhlíkovému atómu C_lr alebo esterifikovaný nižší β-aminokyselinový zvyšok, kde dusíkový atóm esterifikovanej β-aminokyseliny je viazaný k uhlíkovému atómu C^;

R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu, ktorá obsahuje nižší β-aminokyselinový zvyšok viazaný k zvyšku nižšej α-hydroxyalkánovej kyseliny; a

R⁵ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu, ktorá sa skladá z nižšieho β-aminokyselinového zvyšku viazaného k zvyšku nižšej a-hydroxyalkánovej kyseliny;

pričom

R¹ predstavuje atóm vodíka, nižšiu alkylskupinu alebo nižšiu alkoxyskupinu len v tom prípade, že R² predstavuje hydroxyskupinu, kyslíkový atóm ketoskupiny, aminoskupinu alebo merkaptoskupinu;

R² predstavuje atóm vodíka, nižšiu alkylskupinu alebo nižšiu alkoxyskupinu len v tom prípade, že R¹ predstavuje hydroxyskupinu, kyslíkový atóm ketoskupiny, aminoskupinu alebo merkaptoskupinu;

keď R¹ predstavuje hydroxyskupinu, R² predstavuje hydroxyskupinu, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C_R a r °

Οθ, R a R° brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X

kde atóm kyslíka O-^ zodpovedá R⁴, atóm dusíka Νθ zodpovedá R⁸, R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu, potom R⁷ nepredstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu;

keď R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C₆, R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu, potom R⁷ nepredstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu;

keď R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C10 a Cllf R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C5 a C_g, R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu, potom R⁷ nepredstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu; a keď R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidovú skupinu, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C_g, R⁴ je viazaný k terminálnej karboxyskupine 2-hydroxy-4-metylpentánovej kyseliny a R⁸ je viazaný k terminálnemu dusíku 3-amino2-metylpropiónovej kyseliny alebo metylesteru 3-amino-212 metylpropiónovej kyseliny, potom R⁷ nepredstavuje 3-chlór-

4-metoxybenzylskupinu.

Predmetom vynálezu sú ďalej kryptofycínové zlúčeniny, v ktorých aspoň jedna zo skupín viazaných k uhlíkovému atómu C₂, C₈, C_g, C_1Q a C_1;L vykazuje R-stereochémiu. Podlá ďalšieho rozpracovania sú predmetom vynálezu zlúčeniny, v ktorých aspoň jedna zo skupín viazaných k uhlíkovému atómu C₂, Cg, Cg, C i q a vykazuje S-stereochémiu.

Predmetom vynálezu sú ďalej kryprofycínové zlúčeniny hore uvedeného všeobecného vzorca, kde R⁴ alebo R⁵brané dohromady s R⁸ tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca

(X)

kde atóm kyslíka zodpovedá R⁴ alebo R⁵, atóm dusíka Νθ

Q Q zodpovedá R , R predstavuje atóm vodíka alebo nižšiu alkylskupinu a R¹⁰ predstavuje atóm vodíka alebo nižšiu alkylskupinu.

Pokiai zo súvislostí jasne nevyplýva opak, majú ďalej uvedené pojmy nasledujúce významy:

Pod pojmom nižšia β-aminokyselina sa rozumie ktorákoľvek β-aminokyselina s tromi až ôsmimi atómami uhlíka s lineárnym alebo nelineárnym uhľovodíkovým reťazcom, napríklad 3-amino-2-metylpropiónová kyselina.

Pod pojmom esterifikovaná nižšia β-aminokyselina sa rozumie ktorákoľvek β-aminokyselina s tromi až ôsmimi atómami uhlíka, v ktorej je vodíkový atóm karboxyskupiny substituovaný metylskupinou, napríklad metylester 3-amino-

2-metylpropiónovej kyseliny.

Pod pojmom nižšia alkanoyloxyskupina sa rozumie ktorákoľvek alkanoyloxyskupina s jedným až siedmimi atómami uhlíka s lineárnym alebo nelineárnym uhľovodíkovým reťazcom.

Pod pojmom nižšia α-hydroxyalkanoyloxyskupina sa rozumie ktorákoľvek α-hydroxyalkanoyloxyskupina s dvoma až siedmimi atómami uhlíka s lineárnym alebo nelineárnym uhľovodíkovým reťazcom, napríklad 2-hydroxy-4-metylvalérová kyselina.

Pod pojmom nižšia alkoxyskupina sa rozumie ktorákoľvek alkylskupina s jedným až piatimi atómami uhlíka viazaná k atómu kyslíka.

Pod pojmom nižšia alkylskupina sa rozumie alkylskupina s jedným až piatimi atómami uhlíka s lineárnym alebo nelineárnym uhľovodíkovým reťazcom, napríklad metylskupina, etylskupina, propylskupina, izopropylskupina, butylskupina, izobutylskupina, terc.butylskupina, sek.butylskupina, metylované butylskupiny, pentylskupina a terc.pentylskupina.

Pod pojmom alylicky substituovaný alkén sa rozumie alkén, ktorý obsahuje alkylovú substitúciu.

Pod pojmom epoxidový kruh sa rozumie trojčlenný kruh, ktorého hlavný reťazec sa skladá z dvoch uhlíkových a jedného kyslíkového atómu.

Pod pojmom aziridínový kruh” sa rozumie trojčlenný kruh, ktorého hlavný retazec sa skladá z dvoch uhlíkových a jedného dusíkového atómu.

Pod pojmom episulfidový kruh sa rozumie trojčlenný kruh, ktorého hlavný reťazec sa skladá z dvoch uhlíkových atómov a jedného atómu síry.

Pod pojmom sulfátový kruh sa rozumie päťčlenný kruh, ktorého hlavný reťazec tvorí štruktúra uhlík-uhlíkkyslik-síra-kyslík, ktorý ďalej obsahuje dva atómy kyslíka viazané k atómu síry.

Pod pojmom monoalkylfosfátový kruh sa rozumie päťčlenný kruh, ktorého hlavný reťazec tvorí štruktúra uhlíkuhlík-kyslík-fosfor-kyslík, ktorý ďalej obsahuje dva atómy kyslíka viazané k atómu fosforu, z ktorých jeden nesie nižšiu alkylskupinu.

Pod pojmom jednoduchá nesubstituovaná aromatická skupina sa rozumejú obvyklé aromatické kruhy obsahujúce 4n+2 ir-elektrónov v monocyklickom konjugovanom systému (ako je napríklad furyl, pyrolyl, tienyl alebo pyridýl) alebo bicyklickom konjugovanom systému (ako je napríklad indolyl alebo naftyl).

Pod pojmom jednoduchá substituovaná aromatická skupina sa rozumie fenylová skupina substituovaná jednou skupinou (napríklad nižšou alkylskupinou alebo halogénom).

Pod pojmom heteroaromatická skupina sa rozumejú aromatické kruhy, ktoré obsahujú aspoň jeden neuhlíkový substituent, ako je kyslík, dusík alebo síra.

Pod pojmom halogén sa rozumejú členy skupiny periodickej tabuľky, ktoré sú historicky označované názvom halogény. Ako neobmedzujúce príklady spôsobov halogenácie je možné uviesť adíciu halogonovodíkov, substitúciu pri vysokej teplote, fotohalogenáciu apod. Všetky tieto spôsoby sú dobre známe odborníkom v tomto odbore [Eglof, G., Organic Chemistry: An Advanced Treatise, Gilmar et al. (ed), str. 31 až 46, John Wiley & Sons (1943) a Kepm et al., Organic Chemistry, Worth Publishers, Inc. (1980)].

Podľa jedného rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R® brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅a C₆, R⁷ predstavuje 4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R® predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 2, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 2

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C10 a C1;L, R³predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami c5 a c₆, R⁷ predsta16 vuje 4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycinu 4, zodpovedá nasledujúcemu vzorci

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R⁴ brané dohromady tvoria tetrahydrofuránový kruh, R² predstavuje hydroxyskupinu, R³predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁸ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Cg a Cg, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁸ predstavuje (2-metoxykarbonylpropyl)aminoskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycinu 6, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 6

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R⁴ brané dohromady tvoria tetrahydrofuránový kruh, R² a R⁸ predstavujú hydroxyskupiny, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C_g a R⁷ predstavuje

3-chlór-4-metoxybenzylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 7, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 7

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje chlór, R²predstavuje hydroxyskupinu, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 8, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 8

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje metoxyskupinu, R² predstavuje hydroxyskupinu, R³ predstavuje metyl18 skupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 9, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 9

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje metoxyskupinu, R² a R⁴ predstavujú hydroxyskupiny, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C_g, R predstavuje 3-chlór-

4-metoxybenzylskupinu a R⁸ predstavuje (2-karboxypropyl)aminoskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 10, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 10

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R⁴ brané dohromady tvoria tetrahydrofuránový kruh, R² predstavuje hydroxyskupinu, R³predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C₆, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R® predstavuje (2-karboxypropy1)aminoskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 12, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 12

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C_1Q a C-^, R³ predstavuje metylskupinu, R⁴ predstavuje hydroxyskupinu, R⁵ a R⁶brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c5 ^{a c}6' ^r7 P^re^^stavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁸predstavuje (2-karboxypropyl)aminoskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 14, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 14

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-hydroxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 16, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 16

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C10 a cllf R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C5 a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-hydroxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 17, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 17

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C10 a c^, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C5 a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje sek.butylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 18, zodpovedá nasledujúcemu

Kryptofycín 18

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C10 a C·^, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C5 a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izopropylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 19, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 19

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycinová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Cg a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané q dohromady tvoria didepsipeptidovu skupinu vzorca X, kde R predstavuje atóm vodíka a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 21, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 21

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycinová zlúčenina, kde R·*· a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅a C_g, R⁷ predstavuje 3,5-dichlór-4-hydroxybenzylskupinu a R a R brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 23, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 23

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅a Cg, R⁷ predstavuje 4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹predstavuje atóm vodíka a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 24, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 24

Podlá ďalšieho rozpracovania kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R²dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami je predmetom vynálezu brané dohromady tvoria ^c10 ^{a c}lľ ^r3 P^dsta24 vuje metylskupinu, R⁴ predstavuje hydroxyskupinu, R⁶ predstavuje atóm vodíka, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁵ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 26, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 26

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C1Q a Cllf R³ predstavuje atóm vodíka, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C5 a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-

4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 28, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 28

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycinová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C1Q a C1;L, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Cg a Cg, R predstavuje 3-chlór-

4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje atóm vodíka a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 29, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 29

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycinová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₀ a R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ predstavuje hydroxyskupinu, R⁶ predstavuje atóm vodíka, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 30, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 30

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅a Cg, R⁷ predstavuje 3,5-dichlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 31, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 31

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ predstavuje atóm vodíka, R⁶ predstavuje atóm vodíka, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 35, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 35

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje atóm vodíka, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅a Cg, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴p a R° brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 40, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 40

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R^ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami c₁₀ a C_1;L, R³ predsta28 vuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅ a C_g, R⁷ predstavuje 3,5dichlór-4-hydroxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje izobutylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 45, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 45

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R·*· a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami a Cg, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴

Q a R° brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje propylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 49, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 49

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C10 a C-^, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C5 a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje propylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 50, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 50

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh, R³ predstavuje metylskupinu, R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₅a C_g, R⁷ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu a R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu vzorca X, kde R⁹ predstavuje metylskupinu a R¹⁰ predstavuje sek.butylskupinu. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 54, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 54

Hore uvedené zlúčeniny, kryptofycíny 2, 4, 16 až 19, 21, 23, 24, 26, 28 až 31, 40, 43, 45, 49, 50 a 54 SÚ metabolity produkované kmeňom modrozelenej rasy (cyanobacteria) Nostoc sp. Tato rasa bola kultivovaná a zo vzniknutej kultúry boli hore uvedené zlúčeniny izolované. Kryptofycíny 6 a 7 sa získajú v tom prípade, ked sa pri izolácii používajú roztoky obsahujúce metanol. Kryptofycíny 8, 9, 10 až 12, 14 a 35 sú deriváty týchto prirodzene produkovaných metabolitov, ktoré boli získané chemickou modifikáciou pri použití spôsobov opísaných v experimentálnej časti tohto opisu, spôsobov, ktoré sú ich obdobou, alebo ide o zlúčeniny, ktoré nie sú uvedené v príkladovéj časti, ale sú dostupné odborníkom v tomto odbore.

Predmetom vynálezu sú tiež spôsoby výroby hore uvedených kryptofycínových zlúčenín kultiváciou kmeňa Nostoc sp. Morfologické vlastnosti modrozelenej rasy (cyanobacteria) Nostoc sp. sú uvedené v US patente č. 4 946 835 a podlá tohto odkazu sa jedná o vláknité rasy skladajúce sa z vegetatívnych buniek. V dlhých vláknách sú občas pozorovateľné heterocysty v interkalárnych polohách. Akinéty pozorované nie sú. Reprodukcia prebieha hormogóniou, okrem náhodného prerušenia trichómu. Základ pre identifikáciu kmeňa Nostoc sp. je možné nájsť v J. Gen. Micro. 111: 1 až 61 (1979).

Do rozsahu vynálezu spadá tiež kultivácia kmeňa Nostoc sp. a izolácia nových kryptofycínových metabolitov, ako tiež skôr opísaných kryptofycínových metabolitov z tejto kultúry. V prednostnom rozpracovaní tohto vynálezu sa kultivuje kmeň Nostoc sp. označený skratkou GSV224 a zo vzniknutej kultúry sa izolujú zlúčeniny všeobecného vzorca

predstavuje atóm vodíka, hydroxyskupinu, atóm halogénu, kyslíkový atóm ketoskupiny, aminoskupinu, merkaptoskupinu, nižšiu alkoxyskupinu alebo nižšiu alkylskupinu;

predstavuje atóm vodíka, hydroxyskupinu, kyslíkový atóm ketoskupiny, aminoskupinu, merkaptoskupinu, nižšiu alkoxyskupinu alebo nižšiu alkylskupinu; alebo

R^ a R² brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový alebo episulfidový kruh alebo dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C^q a alebo

R³· a R⁴ brané dohromady tvoria tetrahydrofuránový kruh;

R predstavuje atóm vodíka alebo nižšiu alkylskupinu;

R⁵ predstavuje atóm vodíka alebo hydroxyskupinu;

R⁶ predstavuje atóm vodíka; alebo

R⁵ a R⁶ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Cg a Οθ;

predstavuje hydroxyskupinu, nižší β-aminokyselinový zvyšok, ktorého dusíkový atóm je viazaný k uhlíkovému atómu Cj, alebo esterifikovaný nižší β-aminokyselinový zvyšok, ktorého dusíkový atóm je viazaný k uhlíkovému atómu Cj;

R⁴ a R⁸ brané dohromady tvoria didepsipeptidovú skupinu, ktorá sa skladá z nižšieho β-aminokyselinového zvyšku viazaného k zvyšku nižšej a-hydroxyalkánovej kyseliny; alebo

pričom

R¹ predstavuje atóm vodíka, nižšiu alkylskupinu alebo nižšiu alkoxyskupinu len v tom prípade, že R² predstavuje hydroxyskupinu, kyslíkový atóm ketoskupiny, aminoskupinu alebo merkaptoskupinu.

V prednostnom rozpracovaní vynálezu sa chemickou modifikáciou kryptofycínového metabolitu izolovaného hore uvedeným postupom získa iná zlúčenina, ktorá rovnako má túto štruktúru. Postupy chemickej modifikácie kryptofycínových zlúčenín, ktorými sa vyrábajú ďalšie zlúčeniny podlá vynálezu, sú odborníkom v tomto odbore dostupné. Okrem toho sú ďalšie postupy podrobnejšie opísané v príkladoch rozpracovania vynálezu.

Okrem nových kryptofycínových zlúčenín podlá vynálezu zahŕňajúcich kryptofycíny 1, 3, 5, 13 a 15, sú predmetom vynálezu tiež nové spôsoby ich výroby a ich použitia. Štruktúra týchto zlúčenín zodpovedá nasledujúcim vzorcom:

Kryptofycín 1

Kryptofycín 3

Kryptofycín 13

Kryptofycín 15

Vynález je zameraný na akýkolvek kmeň Nostoc sp., prednostne na kmeň Nostoc sp. GSV 224 na produkciu kryptofycínových zlúčenín. Kmeň Nostoc sp. GSV 224 bol uložený

7. októbra 1993 v súlade s Budapeštianskou dohodou o medzinárodnom ukladaní mikroorganizmov na účely patentového konania u Patent Culture Depository of the Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland

20852, USA pod prírastkovým číslom ATCC 55483. Predpokladá sa, že pri vykonávaní postupu podľa vynálezu je možné použiť aj iné kmene Nostoc sp., konkrétne kmeň MB 5357 skôr uložený firmou Merck and Co. pod prírastkovým číslom ATCC 53789.

Ako je to aj pri iných organizmoch, podliehajú vlastnosti Nostoc sp. zmenám. Rekombinanty, varianty alebo mutanty daných kmeňov je možné získať napríklad pôsobením rôznych známych fyzikálnych a chemických mutagénov, ako je ultrafialové žiarenie, rontgenové žiarenie, gama-žiarenie a N-metyl-N'nitro-N-nitrozoguanidín. Všetky prírodné a indukované varianty, mutanty a rekombinanty daných kmeňov, ktoré si zachovávajú vlastnosť produkcie kryptofycinových zlúčenín spadajú do rozsahu tohto vynálezu.

Kryptofycínové zlúčeniny podía vynálezu je možné pripravovať tak, že sa kmeň Nostoc sp. kultivuje za submerzných aeróbnych podmienok vo vhodnom kultivačnom médiu, kým sa nedosiahne podstatná antibiotická účinnosť. Na výrobu týchto zlúčenín je rovnako možné použiť iné kultivačné techniky, ako je rast na povrchu stuženého média. Ako je odborníkom v tomto odbore známe, kultivačné médium použité na rast daného kmeňa môže zahŕňať jeden alebo viaceré zdroje dusíka a uhlíka a anorganické soli. Pri volbe zdrojov uhlíka a dusíka sa berú do úvahy híadiská hospodárnosti výroby, optimálneho výťažku a lahkosť izolácie produktu. Mnohé živné anorganické soli, ktoré sa pridávajú do kultivačného média, sú obvyklé rozpustné soli schopné poskytnúť príslušné ióny železa, draslíka, sodíka, horčíka, vápnika a ióny amóniové, chloridové, karbonátové, fosfátové, sulfátové, nitrátové apod.

Kultivačné médium by malo rovnako obsahovať esenciálne stopové prvky, ktoré sú nezbytné pre rast a vývoj organizmov. Tieto stopové prvky sa obyčajney vyskytujú ako nečistoty v iných zložkách média v dostatočných množstvách, ktoré vyhovujú rastovým požiadavkám organizmov. Kedf sa pri kultivácii vo velkom meradle vyskytnú problémy penenia, môže byť žiadúce pridávať k médiu malé množstvá (tzn. 0,2 ml/liter) protipenového činidla, ako je polypropylénglykol (s molekulovou hmotnosťou asi 2000).

Pri výrobe velkých množstiev kryptofycínových zlúčenín sa môže používať submerzná aeróbna kultivácia v nádržiach (tankoch). Malé množstvá je možné získať kultiváciou v trepanej nádobe. S ohladom na to, že pri inokulácii rozmerných nádrží organizmami dochádza obyčajne k časovému opozdeniu produkcie metabolitu, používa sa prednostne vegetatívne inokulum. Vegetatívne inokulum sa pripraví tak, že sa malý objem kultivačného média inokuluje fragmentmi formy organizmu, ktoré obsahujú vegetatívny trichóm alebo heterocystu, čím sa získa čerstvá aktívne rastúca kultúra organizmu. Vegetatívne inokulum sa potom premiestni do väčšej nádrže. Médium použité pre vegetatívne inokulum môže byť rovnaké ako médium použité pre kultiváciu alebo fermentáciu vo väčšom meradle, je však možno použiť aj iné médium.

Organizmy môžu rásť pri teplotách od asi 20 do asi 30°C pri intenzite dopadajúceho svetla od asi 100 do asi 200 μπιοί fotónov.m^-2.s“¹ (fotosynteticky účinné žiarenie).

Ako je to obvyklé pri aeróbnych submerzných kultivačných postupoch tohto typu, zavádza sa do kultúry plynný oxid uhličitý tak, že sa pridáva k prúdu sterilného vzduchu, ktorým sa prebubláva kultivačné médium. Na dosiahnutie efektívnej produkcie kryptofycínových zlúčenín robí koncentrácia oxidu uhličitého asi 1 % (pri 24°C za tlaku 0,1 MPa).

Spôsoby kultivácie Nostoc sp. sú opísané v doterajšom stave techniky, konkrétne v US patente č. 4 946 835.

Táto citácia je tu uvedená náhradou za prenesenie celého obsahu uvedenej publikácie do tohto textu.

Produkcia kryptofycínových zlúčenín môže byť sledovaná behom kultivácie skúšaním vzoriek živnej pôdy proti organizmom, o ktorých je známe, že sú senzitívne voči týmto antibiotikám. Jedným z užitočných skúšobných organizmov je Candida albicans.

Po produkčnom stupni za podmienok submerznej aeróbnej kultivácie sa kryptofycínové zlúčeniny podía vynálezu môžu izolovať z kultúry a kultivačného média postupmi známymi odborníkom v tomto odbore. Izolácia sa všeobecne robí tak, že sa najskôr prefiltruje kultivačné médium, aby sa oddelili bunky rasy, ktoré sa potom lyofilizujú. Lyofilizovanú rasu je možné extrahovať vhodnými rozpúšťadlami, ako je etanol, metanol, izopropylalkohol alebo dichlórmetán. Kryptofycíny je možné oddeíovať tak, že sa takto získaný extrakt, ako tiež kultivačné médium, podrobia rýchlej chromatograf ii na stĺpci s obrátenými fázami. Kryptofycíny je možné purifikovať vysoko účinnou kvapalinovou chromátografiou s obrátenými fázami (HPLC).

Ako je zrejmé z ich štruktúry, kryptofycínové zlúčeniny obsahujú skupiny, ktoré sú schopné chemickej modifikácie. Do rozsahu zlúčenín podía vynálezu spadajú kryptofycíny, ktoré vykazujú antineoplastickú účinnosť. Tak napríklad deriváty, ktoré sú uvedené na ilustráciu vynálezu, zahŕňajú zlúčeniny ktoré obsahujú epoxidový kyslík alebo hydroxyskupiny na atómoch uhlíka C-7 a C-8 jednotky A alebo skupinu 2-hydroxy-4-metylpentánovej kyseliny jednotky B na obr. 1. Také deriváty nových a skôr opísaných zlúčenín, ktoré vykazujú požadovanú antineoplastickú účinnosť, spadajú do rozsahu tohto vynálezu. Vzájomná súvislosť medzi štruktúrou kryptofycínových zlúčenín a neoplastickou účin38 nosťou sú uvedené v príkladoch rozpracovania vynálezu uvedených ďalej.

Zatiaľ čo o určitých kryptofycínových zlúčeninách je známe, že sú metabolity produkované rasou podía vynálezu, iné kryptofycínové zlúčeniny, napríklad kryptofycíny 8 až 15, je možné pripraviť z metabolitov pri použití zverejnených postupov známych odborníkom v tomto odbore. Tieto syntetické postupy sú napríklad opísané v US patentoch č. 4 868 208, 4 845 086 a 4 845 085, ktoré sú tu uvedené náhradou za prenesenie ich celého obsahu do tohto opisu. Je však možné použiť aj iné postupy známe odborníkom v tomto odbore. Okrem toho sú postupy prípravy derivátov podía vynálezu uvedené v príkladoch rozpracovania.

Kryptofycíny sú silné protinádorové a antifungálne depsipeptidy z modrozelenej rasy (cyanobacteria) náležiacej do Nostocaceae. Prvý kryptofycín, kryptofycín 1, bol izolovaný zo suchozemskej rasy Nostoc sp. ATCC 53789 a bolo zistené, že je veími účinný proti hubám, najmä kmeňa Cryptococcus (R. E. Schwartz et al., J. Ind. Microbiol. 1990, 5: 113 až 124). Kryptofycín 1 bol rovnako izolovaný zo suchozemskej rasy Nostoc sp. GSV 224, spolu s 24 ďalšími kryptofycínovými analógmi, ako vedlajšími zložkami rasy, a bolo zistené, že je veími účinný proti subkutánne transplantovaným tumorom u myši (G. Trimurtulu et al., J. Am. Chem. Soc. 1994, 116: 4729 až 4737; R. Barrow et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117: 2479 až 2490). Skôr boli opísané dva analógy z Nostoc GSV 224, kryptofycín 3 a 5, ako polosyntetické analógy kryptofycínu 1 (D. F. Sesin, US patent č. 4 845 085, vydaný 4. júla 1989; D. F. Sesin et al., US patent č. 4 868 208 vydaný 19. septembra 1989). Kryptofycíny pri Corbettovej skúške vykazujú významnú selektívnu cytotoxicitu voči tumorom a sú rovnako cytotoxické ako voči nádorovým bunkám senzitívnym, tak aj rezistentným na liečivá. Bolo zistené, že kryptofycín 1 vykazuje rovnaký typ účinnosti ako vinblastín, ale líši sa od nej v nezvratnosti inhibície mikrotubulárneho uskupenia (C. D. Smith et al., Cancer Res., 1994, 54: 3779 až 3784). Jeden z kryptofycínov z Nostoc sp. GSV 224, kryptofycín 24, bol izolovaný z morskej huby a bol pomenovaný ako arenastatín A (M. Kobayashi et al., Tetrahedron Lett. 1994, 35: 7969 až 7972; M. Tobayashi et al., Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu 1994, 36., 104 až 110).

Dvadsať dva ďalších kryptofycínových zlúčenín, ktoré sú tu označované ako kryptofycíny 2, 4, 6, 7, 16 až 19, 21, 23, 24, 26, 28 až 31, 40, 43, 45, 49, 50 a 54, je opísaných v US patentovej prihláške č. 08/172 632 podanej 21. decembra 1993 a 08/249 955 podanej 27. mája 1994 a v medzinárodnej patentovej prihláške PCT/US94/14740 podanej 21. decembra 1994, ako zlúčeniny ktoré sú buď metabolitmi izolovanými z kmeňa Nostoc sp. alebo sú polosyntetickými derivátmi týchto metabolitov. V týchto patentových prihláškach je tiež uvedená charakterizácia zvolených kryptofycínových zlúčenín ako antimikrotubulárnych činidiel s klinickou účinnosťou voči širokému spektru nádorov implantovaných myšiam, vrátane nádorov rezistentných voči liečivu (DR) alebo niekoľkým liečivám (MDR).

Predmetom vynálezu sú nové kryptofycínové zlúčeniny všeobecného vzorca

e

. 8 R kde

predstavuje atóm halogénu, merkaptoskupinu, aminoskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, trialkylamoniumskupinu, alkyltioskupinu, dialkylsulfoniumskupinu, sulfátovú alebo fosfátovú skupinu;

predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu; alebo

9

R^x a Ir brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový, episulfidový, sulfátový alebo monoalkylfosfátový kruh; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Cj_g a C^g;

predstavuje nižšiu alkylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

R⁷, R⁸, R⁹ a R¹⁰ predstavuje každý nezávisle atóm vodíka alebo nižšiu alkylskupinu; a

Podľa prednostného rozpracovania týchto kryptofycínových zlúčenín sú predmetom vynálezu kryptofycínové zlúčeniny hore uvedeného všeobecného vzorca, kde R⁸ predstavuje etylskupinu, propylskupinu, izopropylskupinu, butylskupinu, izobutylskupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu. V inom prednostnom rozpracovaní R⁷ predstavuje etylskupinu, propylskupinu, izopropylskupinu, butylskupinu, izobutylskupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu; a ešte v ďalšom prednostnom rozpracovaní R⁷ predstavuje atóm vodíka, R⁸ predstavuje metylskupinu, R³ predstavuje metylskupinu; a X a Y nepredstavujú obidva atóm kyslíka.

Ďalej sú predmetom vynálezu prednostne tieto kryptofycínové zlúčeniny, kde R³ predstavuje etylskupinu, propylskupinu, izopropylskupinu, butylskupinu, izobutylskupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu. Podía iného prednostného rozpracovania sú predmetom vynálezu tieto kryptofycínové zlúčeniny, kde R⁹ predstavuje metylskupinu, etylskupinu, propylskupinu, butylskupinu, izobutylskupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu. V ešte ďalšom prednostnom rozpracovaní spadajú do rozsahu vynálezu hore uvedené kryptofycíny, kde R¹⁰ predstavuje metylskupinu, etylskupinu, propylskupinu, butylskupinu, izobutylskupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu .

Predmetom vynálezu sú ďalej kryptofycínové zlúčeniny, v ktorých aspoň jedna zo skupín viazaných k uhlíkovému atómu c₃, c₆, C_1Q, c₁₆, c₁₇ a c₁₈ vykazuje R-stereochémiu. Podía ďalšieho rozpracovania sú predmetom vynálezu zlúčeniny, v ktorých aspoň jedna zo skupín viazaných k uhlíkovému atómu C₃, ^c6' ^c10' ^c16' ^c17 ^{a c}18 vykazuje S-stereochémiu.

Podlá jedného rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₈ a C_ig, R³, R⁷ a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c13 ^{a c}14' ^r6 Predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹

Ί Ω > * predstavuje izobútylskupinu, R predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 51, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³, R⁷a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 52, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 52

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³, R⁷a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami a R predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 53, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 53

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu,

R¹ predstavuje s-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³, R⁷ a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúče niny, kryptofycínu 55, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 55

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³, R⁷a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 57, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 57

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R³· predstavuje S-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³, R⁷ a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 58, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 58

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-episulfidový kruh, R³, R⁷ a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 61, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 61

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycinová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-metoxyfenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C18 a Cig, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C13 a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-

4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 81, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje metylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C^g a C₁₉, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c13 ^{a c}14' ^r6 predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutý1skupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 82, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje metylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 90, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 90

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje metylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 91, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 91

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-aziridínový kruh, R³, R⁷a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^13 a <-i4, R⁸predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 97, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 97

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-fluórfenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Ci8 a Cjg, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R^ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Ci3 a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-

4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 110, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 110

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Clg a Clg, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R^ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C13 a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka, štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 111, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje 2-tienyl51 skupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C18 a C19, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C13 a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-

4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 112, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-fluórfenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃a c₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 115, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 115

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-fluórfenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R^ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃zľ Q a C₁₄, R° predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R predstavuje izobutylskupinu, R a R predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 116, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 116

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-tolyl53 skupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycinu 117, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 117

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R a R brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 118, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 118

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje 2-tienylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 119, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

-V

Kryptofycín 119

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje 2-tienyl55 skupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Cj₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka, štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 120, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C18 a C19, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C13 a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm dusíka nesúci jediný atóm vodíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 121, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylβ ί n skupinu, R° a R^xu predstavujú atómy vodíka, X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm dusíka nesúci jediný atóm vodíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 122, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

R¹ a R² brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm dusíka nesúci jediný atóm vodíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 123, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 123

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C18 a Clg, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C13 a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 124, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 124

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R® a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 125, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 125

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-chlórfenyl59 skupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Cj₃ ^{a c}i4» ^r6predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R° a R^xu predstavujú atómy vodíka, X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 126, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 126

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ predstavuje S-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c13 ^{a c}14' R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm dusíka nesúci jediný atóm vodíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 127, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 127

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycinová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R¹ predstavuje S-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 128, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycinová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-tolylsku61 pinu, R¹ predstavuje R-chlór, R² predstavuje S-hydroxyskupinu, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 130, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 130

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R^x predstavuje R-chlór, R predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 131, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 131

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹ predstavuje S-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami Cj₃ ^{a c}i4, ^R predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 132, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-chlór63 fenylskupinu, R¹ predstavuje R-chlór, R² predstavuje

S-hydroxyskupinu, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 133, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹ predstavuje R-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 134, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 134

Ďalej sú uvedené ďalšie kryptofycínové zlúčeniny, ktoré sú substituované spôsobom, ktorý zodpovedá nasledujúcemu štruktúrnemu vzorcu.

kde

R·¹ predstavuje atóm vodíka alebo halogénu;

R² predstavuje atóm vodíka, kyslíkový atóm ketoskupiny alebo hydroxyskupinu; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh; alebo R¹ a R²brané dohromady tvoria episulfidový kruh;

R³ predstavuje atóm vodíka alebo nižšiu alkylskupinu;

R⁴ predstavuje atóm vodíka alebo hydroxyskupinu;

R⁵ predstavuje atóm vodíka alebo hydroxyskupinu; alebo

R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu;

R⁶ predstavuje atóm vodíka alebo halogénu;

pričom, keď R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidovú skupinu, R⁴ a R^ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu a R⁶predstavuje atóm chlóru, potom R³ nepredstavuje metylskupinu.

Podlá jedného rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje atóm vodíka, R² predstavuje kyslíkový atóm ketoskupiny, R³ predstavuje

S-metylskupinu, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje atóm chlóru. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 20, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 20

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje S-bróm, R²predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu a R⁶predstavuje atóm chlóru. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 25, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 25

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje R-chlór, R²predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu a R⁶predstavuje atóm chlóru. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 27, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 27

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² brané dohromady predstavujú R,R-epoxidový kruh, R³ predstavuje S-metylskupinu, R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka a R⁶ predstavuje atóm chlóru. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 32, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 32

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹, R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka, R² predstavuje S-hydroxyskupinu, R³ predstavuje R-metylskupinu a R⁶ predstavuje atóm chlóru. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 33, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 33

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹, R², R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka, R³ predstavuje R-metylskupinu a R⁶ predstavuje atóm vodíka. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 34, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 34

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje R-bróm, R²predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu a R⁶predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 37, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 37

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² dohromady tvoria S,Sepoxidový kruh, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵brané dohromady tvoria dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 38, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 38

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² dohromady tvoria S,Repoxidový kruh, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵brané dohromady tvoria dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór.

Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 39, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 39

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycinová zlúčenina, kde R¹ a R² dohromady tvoria R,Repoxidový kruh, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ predstavuje S-hydroxyskupinu, R⁵ predstavuje R-hydroxyskupinu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 41, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

HN“Á_O

Kryptofycín 41

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycinová zlúčenina, kde R¹ a R² dohromady tvoria R,Repoxidový kruh, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ predstavuje R-hydroxyskupinu, R⁵ predstavuje S-hydroxyskupinu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 42, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 42

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje atóm vodíka, R² predstavuje S-hydroxyskupinu, R³ predstavuje R-metylskupinu a R⁴ a brané dohromady tvoria dvojnú väzbu a R⁸predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 48, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 48

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje S-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 59, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 59

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ a R² dohromady tvoria S,Sepisulfidový kruh, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵brané dohromady tvoria dvojnú väzbu a R⁸ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 60, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje S-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ predstavuje atóm vodíka a R⁴ a R⁵ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu

63, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 63

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje R-chlór, R²predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 64, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 64

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje R-chlór, R²predstavuje S-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 69, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 69

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje S-chlór, R²predstavuje S-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R$ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 70, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 70

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje R-bróm, R² predstavuje S-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 71, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 71

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje S-bróm, R²predstavuje S-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 72, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 72

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje S-chlór, R² predstavuje S-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 73, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Ί5

Podľa ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R^ predstavuje S-chlór, R²predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu a R® predstavuje vodík. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycinu 74, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 74

Podía ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje S-fluór, R²predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycinu 75, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Kryptofycín 75

Podlá ďalšieho rozpracovania je predmetom vynálezu kryptofycínová zlúčenina, kde R¹ predstavuje R-fluór, R²predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ predstavuje S-metylskupinu a R⁴ a R⁵ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu a R⁶ predstavuje chlór. Štruktúra tejto zlúčeniny, kryptofycínu 76, zodpovedá nasledujúcemu vzorcu

Predmetom vynálezu sú tiež spôsoby výroby hore uvedených kryptofycínových zlúčenín, ako tiež dosial známych kryptofycínových zlúčenín, pri použití postupov totálnej syntézy.

Predmetom vynálezu sú tiež spôsoby výroby nových kryptofycínových metabolitov, ako tiež dosial známych kryptofycínových metabolitov, pri použití spôsobov podlá vynálezu.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob výroby kryptofycínu, ktorý zahŕňa výber alylicky substituovaného E-alkénu; prešmyk alylicky substituovaného E-alkénu pri použití stereošpecifického Wittigovho prešmyku; premenenie tejto zlúčeniny na prvú δ-aminokyselinu alebo δ-hydroxykyselinu; kopuláciu prvej kyseliny s druhou α-aminokyselinou za vzniku prvej podjednotky; kopuláciu tretej β-aminokyseliny so štvrtou α-hydroxykyselinou alebo α-aminokyselinou za vzniku druhej podjednotky; a kopuláciu prvej podjednotky s druhou podjednotkou za vzniku kryptofycínu.

Podlá prednostného rozpracovania je predmetom vynálezu spôsob výroby kryptofycínu, pri ktorom sa získa kryptofycínový produkt všeobecného vzorca

Ar predstavuje metylskupinu, fenylskupinu alebo ktorúkolvek jednoduchú nesubstituovanú alebo substituovanú aromatickú alebo heteroaromatickú skupinu;

n

R predstavuje atóm halogénu, merkaptoskupinu, aminoskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, trialkylamoniumskupinu, alkyltioskupinu, dialkylsulfoniumskupinu, sulfátovú alebo fosfátovú skupinu;

R² predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu;

alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový, aziridinový, episulfidový, sulfátový alebo monoalkylfosfátový kruh; alebo

predstavuje nižšiu alkylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

Prednosť sa venuje spôsobu podlá vynálezu, pri ktorom sa získa kryptofycín, kde Ar predstavuje fenylskupinu; R³ predstavuje metylskupinu; R⁶ predstavuje halogénmetoxybenzylskupinu; R⁷ predstavuje atóm vodíka; R⁸ predstavuje metylskupinu; R⁹ predstavuje izobutylskupinu; R¹⁰ predstavuje atóm vodíka; X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm kyslíka.

Okrem spôsobov výroby týchto kryptofycínov podlá vynálezu hore uvedeného všeobecného vzorca sú predmetom vynálezu spôsoby výroby skôr opísaných kryptofycínov a kryptofycínov známych z doterajšieho stavu techniky. Kryptofycíny 1, 8 a 35 je možné vyrobiť plne synteticky. Ako príklad skôr opísaných kryptofycínov známych z doterajšieho stavu techniky, ktoré je možné vyrobiť plne synteticky, je možné uviesť zlúčeniny všeobecného vzorca

kde

R¹ predstavuje atóm halogénu; a

R² predstavuje hydroxyskupinu; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh;

R³ predstavuje atóm vodíka; a

R⁴ predstavuje atóm vodíka; alebo

R³ a R⁴ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu.

Predmetom vynálezu je tiež farmaceutický prostriedok na inhibiciu proliferácie hyperproliferatívnej cicavčej bunky, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa účinné množstvo kryptofycínových zlúčenín všeobecného vzorca

predstavuje metylskupinu, fenylskupinu alebo ktorúkolvek jednoduchú nesubstituovanú alebo substituovanú aromatickú alebo heteroaromatickú skupinu;

R² predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu;

alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový, episulfidový, sulfátový alebo monoalky1fosfátový kruh; alebo

o

R predstavuje mzsiu alkylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

X a Y predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, iminoskupinu alebo alkylaminoskupinu;

a farmaceutický vhodný nosič.

Podlá prednostného rozpracovania farmaceutický prostriedok podlá vynálezu zahŕňa aspoň jedno ďalšie antineoplastické činidlo.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob inhibície proliferácie cicavčej bunky, pri ktorom sa cicavčia bunka uvedie do styku s kryptofycínovou zlúčeninou vzorca

kde

r! predstavuje atóm halogénu, merkaptoskupinu, aminoskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, trialkylamoniumskupinu, alkyltioskupinu, dialkylsulfoniumskupinu, sulfátovú alebo fosfátovú skupinu;

predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu; alebo

R³ predstavuje nižšiu alkylskupinu;

R⁴ a r5 predstavujú atómy vodíka; alebo

R Q 1Ω

R , R , R a R predstavuje každý nezávisle atóm vodíka alebo nižšiu alkylskupinu; a

X a Y predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, iminoskupinu alebo alkylaminoskupinu v množstve dostačujúcom na inhibíciu proliferácie bunky.

V prednostnom rozpracovaní sa pri tomto postupu cicavčia bunka rovnako uvádza do styku s aspoň jedným ďalším neoplastickým činidlom. Takou cicavčou bunkou je prednostne bunka hyperproliferatívna. Podlá ďalšieho prednostného rozpracovania je hyperproliferatívnou bunkou bunka ludská.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob inhibície proliferácie hyperproliferatívnej cicavčej bunky, ktorá má fenotyp rezistentný voči viacerým liečivám, pri ktorom sa bunka uvádza do styku s kryptofycínovou zlúčeninou všeobecného vzorca

R² predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu;

alebo

predstavuje nižšiu alkylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

X a Y predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, iminoskupinu alebo alkylaminoskupinu v množstve účinnom na narušenie dynamického stavu polymerácie a depolymerácie mikrotubulov za účelom zastavenia bunkovej mitózy, čím sa inhibuje proliferácia bunky.

V prednostnom rozpracovaní sa pri tomto postupu cicavčia bunka rovnako uvádza do styku s aspoň jedným ďalším neoplastickým činidlom. Takou cicavčou bunkou je predno85 stne bunka hyperproliferatívna. Podlá ďalšieho prednostného rozpracovania je hyperproliferatívnou bunkou bunka ludská.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob zmierňovania patologických stavov vyvolaných hyperproliferujúcimi cicavčími bunkami, pri ktorom sa cicavcovi za účelom inhibície proliferácie buniek podá účinné množstvo farmaceutického prostriedku podlá vynálezu opísaného hore. Cicavčou bunkou je prednostne bunka ludská.

V prednostnom rozpracovaní sa na cicavca aplikuje aspoň jedna ďalšia liečba smerujúca k zmierneniu patologického stavu. Patologický stav je prednostne charakterizovaný vznikom novotvarov. Novotvary sú prednostne zvolené zo súboru zahŕňajúceho novotvary prsníka, malobunkové plúc, ne-malobunkové plúc, kolorektálne, leukémie, melanómy, pankreatický adenokarcinóm, novotvary centrálneho nervového systému (CNS), vaječníkov, prostaty, sarkómy mäkkých tkanív alebo kostí, novotvary hlavy a krku, novotvary zažívacieho traktu, vrátane slinivky, pažeráku a žalúdku, myelomy, novotvary močového mechúru, obličiek a neuroendokrinné novotvary, vrátane tyroidných, nehodgkinských a Hodgkinovej choroby.

Spôsob výroby kryptofycínových zlúčenín je súhrnne zobrazený v schéme 1 na obr. 5. Východiskovou látkou je 3E-alkén vzorca a substituovaný na uhlíkovom atómu C-2 skupinou všeobecného vzorca XH v S-konfigurácii, kde X predstavuje atóm kyslíka alebo iminoskupinu. Ako pomerne lacný zdroj východiskovej látky vzorca a slúži L-alanín alebo kyselina L-mliečna. Klúčovým stupňom syntézy je stereoselektívny [2,3] Wittigov prešmyk (D. J-S. Tsai et al., J. Org. Chem., 1984, 49: 1842 až 1843; K. Mikami et al., Tetrahedron 1984, 25: 2303 až 2308; N. Sayo et al., Chem. Lett. 1984, 259 až 262) propargyléteru vzorca b za vzniku (3R,4R)-386 (XH-substituovaného)-4-alkylhept-5(E)-en-l-inu vzorca c, kde X predstavuje atóm kyslíka alebo chránený dusík (napríklad terc.butyldimetylsilylaminoskupinu). Zlúčeninu vzorca c je potom možné premeniť na δ-hydroxy- alebo aminokyselinovú jednotku A (ktorá je prekurzorom kryptofycínu), metyl(5S,6R)-5-(XP-substituovaný)-6-alkyl-8-arylokta-2E,7Edienoát vzorca d, kde P predstavuje vhodnú chrániacu skupinu, pri použití postupov známych odborníkom v tomto odbore.

Jedna stratégia pri syntéze kryptofycínu, ktorý sa skladá z δ-hydroxy- alebo aminokyselinovej jednotky A, a-aminokyselinovej jednotky B, β-aminokyselinovej jednotky C a α-hydroxy- alebo aminokyselinovej jednotky D, spočíva v zostavení makrocyklu z dvoch prekurzorov, ktoré predstavujú zvyšky kryptofycínovej molekuly, napríklad A-B prekurzoru vzorca e, ktorý obsahuje δ-hydroxy- alebo aminokyselinovú jednotku A a α-aminokyselinovú jednotku B a C-D prekurzoru vzorca f, ktorý obsahuje β-aminokyselinovú jednotku C a α-hydroxy- alebo aminokyselinovú jednotku D.

Pri postupe, ktorý je tu opísaný, sa kryptofycín zostaví z prekurzorov A-B a C-D v dvoch stupniach tak, že sa (1) spoja konce jednotiek A a D v prekurzoroch A-B a C-D za vzniku acyklického medziproduktu C-D-A-B a (2) sa spoja konce jednotiek B a C za vzniku cyklického produktu.

Pri syntéze kryptofycínu 51, ktorá je opísaná v príkladoch rozpracovania, vzniká medzi δ-hydroxyskupinou jednotky A v zvyšku A-B a skupinou karboxylovej kyseliny jednotky D v C-D zvyšku esterová väzba, čím sa získa acyklický C-D-A-B medziprodukt. Potom sa vytvára amidová väzba medzi skupinou karboxylovej kyseliny jednotky B v A-B zvyšku a β-aminoskúpinou jednotky C v C-D zvyšku. Zlúčenina vzorca K je prekurzorom zvyšku A-B, zlúčenina vzorca P je prekurzo87 rom zvyšku C-D a zlúčenina vzorca R je acyklickým C-D-A-B prekurzorom kryptofycínu 51. Zlúčeniny vzorca K a P obsahujú chrániace skupiny na skupine karboxylovej kyseliny jednotky B a β-aminoskupine jednotky C, aby sa v stupni 1 obmedzila kopulácia za vzniku esterovej väzby medzi jednotkami A a D. Tieto chrániace skupiny sa z medziproduktu C-D-A-B odstránia, takže v stupni 2 môže dôjsť k vzniku amidovej väzby medzi jednotkami B a C.

Syntéza metyl-(5S,6R)-5-terc.butyldimetylsilyloxy-6-metyl-8-fenylokta-2E,7E-dienoátu vzorca G, prekurzoru jednotky A kryptofycínu 51, je súhrnne ilustrovaná v schéme 2 (obr. 6). Východiskový (S)-trans-3-pentén-2-ol vzorca A sa pripraví enzymatickým rozštiepením racemickej zlúčeniny. Reakciou zlúčeniny vzorca A s propargylchloridom a bázou za podmienok fázového prenosu sa získa propargyléter vzorca B v 86 % výťažku. Reakciou zlúčeniny vzorca B s butyllítiom pri -90°C sa získa alkohol vzorca C v 71% výťažku. Požadovaná 3R,4R-anti-zlúčenina vzorca C je jediným produktom vzniknutým pri Wittigovom prešmyku. Po chránení hydroxyskupiny v zlúčenine vzorca C v podobe terc.butyldimetylsilyléteru (alebo terc.butyldimetylsilyléteru), a hydroborácii trojnej väzby (H. C. Brown, Organic Synthesis Via Boranes, Wiley, 1975) sa získa aldehyd vzorca D v 73% výťažku (vztiahnuté na zlúčeninu vzorca C). Zlúčenina vzorca D sa premení na trans-a,p-nenasýtený ester vzorca E Horner-Emmonsovou reakciou (výťažok 90 %). Selektívnou ozonolýzou dvojnej väzby medzi uhlíkovými atómami C6-C7 v zlúčenine E sa získa aldehyd vzorca F v 83% výťažku. Zlúčenina vzorca F sa na záver podrobí Wittigovej reakci s benzyltrifenylfosfóniumchloridom v prítomnosti butyllítia, čím sa získa zlúčenina vzorca G v 80% výťažku. Výťažok zlúčeniny vzorca G vztiahnutý k zlúčenine vzorca A je 26 %.

Kopulácia prekurzoru jednotky A vzorca G s D-3(3-chlór-4-metoxyfenyl)alanínovou jednotkou B za účelom výroby A-B prekurzoru vzorca K je súhrnne znázornená v schéme 3 na obr. 7. Hydrolýzou metylesterovej skupiny v zlúčenine vzorca G pri použití hydroxidu lítneho v acetóne sa získa karboxylová kyselina vzorca H v 95% výťažku. Kopulácia tejto kyseliny vzorca H s trichlóretylesterom vzorca I za vzniku zlúčeniny vzorca J (výťažok 65 %) sa vykonáva tak, že sa roztok zlúčeniny vzorca H v N,N-dimetylformamide (DMF) nechá reagovať s malým prebytkom pentafluórfenyldifenylfosfinátu (FDPP), ekvimolárnym množstvom trifluóracetátovej soli vzorca I a potom 3 ekvivalentmi diizopropyletylamínu (DIEA) pri 25°C (S. Chen et al., Tetrahedron Lett. 1991, 32: 6711 až 6714). Následnou fluórdesilyláciou zlúčeniny vzorca J sa získa zlúčenina vzorca K v. 95% výťažku.

Chránená aminokyselina vzorca I sa vyrobí z D-tyrozínu päťstupňovým postupom. V prvom stupni sa D-tyrozín chlóruje sulfurylchloridom v ladovej kyseline octovej (R. Zeynek, Hoppe-Seyler's Z. F. Physiol. Chemie 1926, 144: 247 až 254). Následne sa reakciou suspenzie aminokyseliny v 50% vodnom dioxáne s diterc.dibutyldikarbonátom v prítomnosti trietylamínu získa N-(terc.butoxykarbonyl)-3-(3-chlór-4hydroxyfenyl)-D-alanín v 94% výťažku. Tento produkt sa dimetyluje pôsobením dimetylsulfátu v prítomnosti uhličitanu draselného v refluxujúcom acetóne za vzniku metylesteru (výťažok 84 %). Tento metylester sa reakciou s hydroxidom sodným vo vodnom dioxáne zmydelní, čím sa získa N-(terc.butoxykarbonyl)-3-(3-chlór- 4-metoxyfenyl)-D-alanín v 86% výťažku. Táto BOC-chránená aminokyselina sa vystaví pôsobeniu trichlóretanolu, pyridínu a DCC v dichlórmetáne, čím sa získa trichlóretylester zlúčeniny vzorca I v 65% výťažku. Reakciou tejto látky s trifluóroctovou kyselinou sa získa trifluóracetátová sol zlúčeniny vzorca I v kvantitatívnom výťažku.

Syntéza (2S)-2-[3'-(terc.butoxykarbony1)amino- 2', 2¹-dimetylpropanoyloxy]-4-metylpentánovej kyseliny vzorca P, C-D prekurzoru, je súhrnne zobrazená v schéme 4 na obr.

8. Východiskovou látkou pre časť jednotky C zlúčeniny vzorca P je aminoalkohol vzorca L. Aminoskupina v zlúčenine vzorca L sa chráni tak, že sa zlúčenina vzorca L nechá reagovať s diterc.butyldikarbonátom v prítomnosti trietylamínu, pričom sa získa chránený produkt v 93% výťažku. Získaný primárny alkohol sa oxiduje reakciou s oxidom ruteničitým (P. H. J. Carlsen et al., J. Org. Chem. 1981, 46: 3936 až 3938), čím sa získa karboxylová kyselina vzorca M v 66% výťažku. L-2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina sa nechá reagovať so zmesou alylbromidu v dichlórmetáne a vodného hydrogenuhličitanu sodného obsahujúceho tetra-n-butylamóniumchlorid (S. Friedrich-Bochnitschek et al., J. Org. Chem. 1989, 54:751 až 756), čím premení na alylester vzorca N (výťažok 93 %). Kopulačná rekcia zlúčeniny vzorca M a zlúčeniny vzorca N sa vykonáva pri použití 4-dimetylaminopyridínu (DMAP) a dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) v dichlórmetáne, čím sa získa zlúčenina vzorca 0 v 75% výťažku. Skupina alylesteru v zlúčenine vzorca O sa rozštiepi v tetrahydrofuráne s obsahujúcim morfolínom v prítomnosti tetrakis(trifenylfosfín)paládia, ako katalyzátoru. Získa sa zlúčenina vzorca P v 95% výťažku (P. D. Jeffrey et al., J. Org. Chem. 1982, 47: 587 až 590).

Kopulačná reakcia A-B prekurzoru vzorca K a C-D prekurzoru vzorca P je znázornená v schéme 5 na obr. 9. Reakciou zlúčeniny vzorca K a zlúčeniny vzorca P pri použití dicyklohexylkarbodiimidu a 4-dimetylaminopyridínu v dichlórmetánu sa získa plne chránený C-D-A-B medziprodukt vzorca Q v 84% výťažku. Reduktívne štiepenie trichlóretylesterovej skupiny v zlúčenine vzorca Q sa vykonáva pri použití aktivovaného zinkového prachu v kyseline octovej. Potom sa reakciou s trifluóroctovou kyselinou odstráni chrániaca skupina BOC, čím sa získa zlúčenina vzorca R vo forme trifluóracetátovej soli (celkový výťažok 91 % vztiahnuté k zlúčenine vzorca Q). Makrolaktamizáciou zlúčeniny vzorca R pri použití FDPP sa získa kryptofycín 51 v 61% výťažku (J. Dudash Jr. et al., Synth. Commun. 1993, 23: 349 až 356). Celkový výťažok kryptofycínu vztiahnutý na S-trans-3pentén-2-ol vzorca A je 7 %.

Kryptofycín 51 slúži ako prekurzor kryptofycínu 52 (R,R-epoxidu) a kryptofycínu 53 (S,S-epoxidu). Kryptofycín ďalej slúži ako prekurzor kryptofycínu 55 (18R,19Schlórhydrínu) a kryptofycínu 57 (13,14-dihydroanalógu). Kryptofycín 57 slúži ako prekurzor kryptofycínu 58. Kryptofycín slúži ako prekurzor kryptofycínu 61 pri postupu opísanom v T.H. Chán a J. R. Finkenbine, J. Am. Chem. Soc. 1972, 94: 2880 až 2882 a kryptofycínu 97 pri postupu opísanom v Y. Ittah et al., J. Org. Chem. 1978, 43: 4271 až 4273.

Pri syntéze kryptofycínov, ktoré obsahujú skupinu Ar odlišnú od fenylskupiny, je prekurzory jednotky A všeobecného vzorca d (schéma 1, R³ = Me) možné pripraviť Wittigovou reakciou aldehydu vzorca F (Schéma 2, chrániaca skupina TBS) alebo vzorca S (schéma 6, chrániaca skupina TBPS) s vhodným aryltrifenylfosfóniumchloridom v prítomnosti butyllítia. Kryptofycín 81 sa vyrobí z prekurzoru vzorca d (Ar = p-metoxyfenyl, R³ = metyl) spôsobom znázorneným v schéme 6 a 7 na obr. 10 a 11.

Skupinu Ar je tiež možné do nového kryptofycínu zavádzať v neskoršom stupni syntézy. Prvý prekurzor vzorca d (Ar = R₃ = Me) sa premení na kryptofycín 82 kopuláciou vhodného A-B prekurzoru vzorca e a C-D prekurzoru vzorca f, ako je to znázornené v schéme 8 na obr. 12. Selektívnou ozo91

nolýzou kryptofycínu 82 alebo oxidáciou zodpovedajúcich epoxidov, kryptofycínov 90 a 91, kyselinou jodistou sa získa aldehyd, kryptofycín 108. Wittigovou reakciou kryptofycínu 108 s vhodným aryltrifenylfosfóniumchloridom v prítomnosti butyllítia sa získa nový kryptofycín (schéma 9, obr. 13). Pri použití tohto postupu sa pripraví kryptofycín 110 (Ar = p-fluórfenyl), kryptofycín 111 (Ar = p-tolyl), kryptofycín 112 (Ar = 2-tienyl) a kryptofycín 124 (Ar = p-chlórfenyl). Kryptofycín 110 slúži ako prekurzor epoxidov, kryptofycínov 115 a 116. Kryptofycín 111 slúži ako prekurzor epoxidov, kryptofycínov 117 a 118 a chlórhydrínov, kryptofycínov 128, 130 a 131. Kryptofycín 112 slúži ako prekurzor epoxidov, kryptofycínov 119 až 120. Kryptofycín 124 slúži ako prekurzor epoxidov, kryptofycínov 125 a 126 a chlórhydrínov, kryptofycínov 132, 133 a 134.

Ďalšia stratégia pri syntéze kryptofycínov spočíva v tom, že sa zostaví makrocyklus z troch prekurzorov, napríklad A-B prekurzoru vzorca e, ktorý obsahuje δ-hydroxy- alebo aminokyselinovú jednotku A, prekurzoru obsahujúceho 8-hydroxyalebo aminokyselinovú jednotku D a prekurzoru obsahujúceho β-aminokyselinovú jednotku C. Pri tomto postupu sa kryptofycín zostaví z A-B, C a D prekurzorov v troch stupňoch: v prvom stupni sa spoja konce jednotiek A a D v A-B a D prekurzoroch za vzniku acylického D-A-B medziproduktu, v druhom stupni sa spoja konce jednotiek D a C v D-A-B a C prekurzorech za vzniku acyklického C-D-A-B medziproduktu a v treťom stupni sa spoja konce jednotiek B a C za vzniku cyklického produktu.

Pri syntéze kryptofycínu 121 opísanej v príkladoch rozpracovania, vzniká medzi δ-hydroxyskupinou jednotky A v A-B zvyšku a skupinou karboxylovej kyseliny v D fragmente esterová väzba za vzniku acyklického D-A-B medziproduktu. Potom sa vytvára amidová väzba medzi skupinou karboxylovej kyseliny jednotky C a α-aminoskupinou jednotky D v D-A-B

fragmente. Nakoniec sa vytvára amidová väzba medzi skupinou karboxylovej kyseliny jednotky B v A-B zvyšku a β-aminoskupinou jednotky C v C-D zvyšku. Prekurzorom A-B zvyšku je zlúčenina vzorca K, prekurzorom jednotky D je anhydrid BOC-L-leucínu a prekurzorom jednotky C je zlúčenina vzorca AL. Zlúčenina vzorca AK je acyklickým C-D-A-B prekurzorom kryptofycínu 121 (schéma 10 na obr. 14). Zlúčenina vzorca K a anhydrid BOC-L-leucínu obsahujú chrániace skupiny na skupine karboxylovej kyseliny jednotky B a a-aminoskupine jednotky D, čím sa v stupni 1 obmedzí kopulácia za vzniku esterovej väzby medzi jednotkami A a D. Z δ-aminoskupiny jednotky D v D-A-B medziproduktu sa odstráni chrániaca skupina, takže medzi aminoskupinou jednotky B a karboxylovou kyselinou C môže v stupni 2 vzniknúť amidová väzba. Po odstránení chrániacich skupín z C-D-A-B medziproduktu môže v stupni 2 vzniknúť amidová väzba medzi jednotkami B a C.

Nové kryptofycínové zlúčeniny podía vynálezu obsahujú epoxidové kruhy, ktoré sa otvárajú nukleofiInými činidlami odlišnou rýchlosťou, než epoxidový kruh v kryptofycíne 1; alebo obsahujú chlórhydrínové funkčné skupiny, ktoré tvoria epoxidové kruhy inou rýchlosťou, než ktorou sa chlórhydrínová funkčná skupina kryptofycínu 8 premieňa na epoxidový kruh kryptofycínu 1. Epoxidový kruh kryptofycínu 1 alebo chlórhydrínová funkčná skupina (maskovaný epoxidový kruh) kryptofycínu 8 sú základom pre optimálnu účinnosť in vivo. Pokiaí je eliminovaný epoxidový kyslík (ako je to v kryprofycíne 3) alebo pokial je epoxidový kruh hydrolyzovaný na diol (ako je to pri kryptofycíne 15), protinádorová účinnosť je výrazne znížená. Kryptofycín 1 vykazuje nezanedbateíné toxické účinky na živočíchy, na rozdiel od kryptofycínu 8. To sa odráža v hodnotách T/C (väčšinou >0%) a hodnotách hrubého logaritmického usmrtenia nádorových buniek (väčšinou < 2,0) stanovených pre kryptofycín 1, na rozdiel od hodnôt pre kryptofycín 8 (väčšina hodnôt T/C 0 %

a hodnôt hrubého logaritmického usmrtenia nádorových buniek > 2,8). Kryptofycín 25, zodpovedajúci brómhydrínový analóg, vykazuje hodnoty T/C a hrubého logaritmického usmrtenia nádorových buniek porovnatelné s kryptofycínom 1. Tento nápadný rozdiel v in vivo účinnosti svedčí o tom, že brómhydrínový kryptofycín 25 in vivo sa premieňa na kryptofycín 1 rýchlejšie ako kryptofycín 8. Z toho ďalej vyplýva, že menej toxický kryptofycín 8 má pred svojou transformáciou na účinnú zlúčeninu, kryptofycín 1, pravdepodobne viac času akumulovať sa v mieste tumoru. Epoxidová skupina kryptofycínu 1 sa pravdepodobne kovalentne viaže k svojmu cieíovému receptoru v nádorovej bunke. Nové kryptofycíny podía vynálezu by potenciálne mohli mať lepšiu účinnosť in vivo ako kryptofycín 1 a kryptofycín 8, pretože in vivo vykazujú priaznivejšiu rýchlosť tvorby epoxidovej zlúčeniny zo zodpovedajúceho chlórhydrínového proliečiva a kovalentnej väzby k cieíovému receptoru v nádorovej bunke.

Zlúčeniny podía vynálezu sú stabilnejšie voči hydrolýze a solvolýze ako kryptofycíny 1 a 21. Esterová väzba spojujúca jednotky C a D v kryptofycíne 1 je pomerne citlivá k mierne bázickej hydrolýze; pri pH 11 sa štiepi za vzniku hydroxykyseliny s polčasom 0,83 hodiny. Esterová väzba C-D v kryptofycíne 21, v ktorom na uhlíkovom atómu C-2 jednotky C nie je metylskupina, sa otvára rýchlejšie, s polčasom 0,25 hodiny. Esterová väzba C-D je rovnako citlivá voči solvolýze. Keď sa pri izolačnom postupu použije metanol, dôjde k výraznej metanolýze kryptofycínov 1 a 21. Kryptofycín 21 je v mnohom susceptibilnejší voči metanolýze ako kryptofycín

1. Kryptofycín 1 vykazuje protinádorovú účinnosť, zatiaí čo kryptofycín 21 je neúčinný, čo je pravdepodobne spôsobené tým, že C-D esterová väzba v kryptofycíne 21 sa in vivo hydrolyzuje rýchlejšie ako C-D esterová väzba v kryptofycíne

1. Hydrolýzou C-D esterovej väzby je rovnako možné čiastočne vysvetliť zníženie in vivo účinnosti kryptofycínu 1 pri in- traperitoneálnom a subkutánnom podávaní liečiva. C-D esterová väzba kryptofycínov s dvoma metylskupinami na uhlíkovom atómu C-2 jednotky C, ako je to pri kryptofycine 52, je pri pH 11 stabilná.

Zlúčeniny podía vynálezu a skôr opísané kryptofycínové zlúčeniny je možné používať pri liečbe ako antineoplastické činidlá, teda pri spôsobu liečby neoplastických chorôb. Pojem neoplastický, ako sa používa v tomto texte, sa vzťahuje k novotvarom, ktoré vykazujú abnormálny rast, ku ktorému dochádza tým, že proliferácia buniek nepodlieha obvyklým rastovým omedzenia. Pod pojmom antineoplastické činidlá sa v tomto texte rozumie ktorákoívek zlúčenina, prípravok, prísada, fyzikálna alebo chemická zmes, ktorá inhibuje, eliminuje, retarduje alebo revertuje neoplastický fenotyp bunky.

Pri liečbe rakoviny sa v súčasnom čase používa chemoterapia, chirurgická liečba, radiačná terapia, liečba modifikátormi biologickej odpovedi a imunoterapia. Každý z týchto spôsobov liečby má špecifické indikácie, ktoré sú známe odborníkom v tomto odbore. Pri pokusu dosiahnuť úplné zničenie neoplastických buniek je možné použiť jeden alebo všetky tieto postupy. Chemoterapia, pri ktorej sa používa jeden alebo viac kryptofycínov je predmetom vynálezu. Okrem toho je predmetom vynálezu tiež kombinačná chemoterapia, chemoterapia, pri ktorej sa používajú kryptofycíny v kombinácii s inými antineoplastickými činidlami, pretože kombinačná terapia je všeobecne účinnejšia ako terapia, pri ktorej sa používa jediné antineoplastické činidlo. Podía ďalšieho aspektu je teda predmetom vynálezu farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje terapeuticky účinné množstvo aspoň jednej novej kryptofycínovej zlúčeniny podía vynálezu alebo jej netoxických adičných solí, ktoré slúžia na zaistenie hore uvedených kladných terapeutických účinkov Také prost95 riedky je tiež možné pripravovať pri použití fyziologicky znášatelných kvapalných, gélových alebo pevných nosičov, riedidiel, adjuvantov a excipientov. Také nosiče, riedidlá adjuvanty a excipienty je možné nájsť v United States Pharmacopeia zv. XXII a National Formulary zv. XVII, U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD, USA (1989). Ďalšie spôsoby liečby sú uvedené v publikácii AHFS Drug Information 1993, ed. Američan Hospital Formulary Service, str. 522 až 660. Tieto citácie sú tu uvádzané náhradou za prenesenie celého obsahu uvedených publikácií do tohto opisu.

Predmetom vynálezu je ďalej farmaceutický prostriedok na liečbu neoplastických chorôb, ktorý obsahuje aspoň jednu kryptofycínovú zlúčeninu a aspoň jedno ďalšie antineoplastické činidlo. Antineoplastické zlúčeniny, ktoré je možné použiť v kombinácii s kryptofycínom, sú uvedené v The Merck Index, 11. vydanie, Merck & Co., Inc. (1989) str. Ther 16 až 17. Táto citácia je tu uvádzaná náhradou za prenesenie celého obsahu uvedenej publikácie do tohto opisu. Podlá ďalšieho rozpracovania vynálezu môžu byť antineoplastickými činidlami antimetabolity. Ako neomedzujúce príklady takých činidiel je možné uviesť metotrexate, 5-fluóruracil, 6-merkaptopurín, cytozín arabinozid, hydroxymočovinu a 2-chlórdeoxyadenozín. Podlá ďalšieho rozpracovania vynálezu sú ďalšími antineoplastickými činidlami alkylačné činidlá. Ako neobmedzujúce príklady týchto činidiel je možné uviesť cyklofosfamid, melfalán, busulfán, paraplatín, chlórambucil a dusíkatý yperit. Podlá ďalšieho rozpracovania vynálezu je ďalším antineoplatickým činidlom rastlinný alkaloid. Ako nebomedzujúce príklady rastlinných alkaloidov je možné uviesť vinkristín, vinblastín, taxol a etopozid. Podía ďalšieho rozpracovania vynálezu je ďalším neoplastickým činidlom antibiotikum. Ako neomedzujúce príklady takých antibiotík je možné uviesť doxorubicín (adriamycín), daunorubicín, mitomycín c a bleomycín. Podía ďalšieho rozpracovania vyná96

lezu je ďalším neoplastickým činidlom hormón. Ako neobmedzujúce príklady takých hormónov je možné uviesť kalusterón, diomostavolón, propionát, epitiostanol, mepitiostan, testolaktón, tamoxifén, polyestradiolfosfát, megesterolacetát, flutamid, nilutamid a trilotan. Podlá ďalšieho rozpracovania vynálezu je ďalším neoplastickým činidlom enzým. Ako neobmedzujúce príklady takých enzýmov je možné uviesť L-asparaginázu a aminoakridínové deriváty, ako je napríklad amsakrín. Ďalšie neoplastické činidlá je možné nájsť v Skeel, Roland T., Antineoplastic Drugs and Biológie Response Modifier: Classification, Use and Toxicity of Clinically Useful Agents, Handbook of Cancer Chemotherapy, 3. vydanie, Little Brown & Co., 1991. Táto citácia je tu uvádzaná náhradou za prenesenie celého obsahu uvedenej publikácie do tohto opisu.

Kryptofycínové zlúčeniny a farmaceutické prostriedky podlá vynálezu je vo veterinárnom lekárstve možné podávať domestikovaným zvieratám a pri klinickom použití luďom podobným spôsobom ako iné terapeutické činidlá. Všeobecne bude dávka potrebná na požadovaný terapeutický účinok kolísať v závislosti od typu použitia a spôsobu podávania, ako tiež od konkrétnych požiadaviek individuálnych hostitelov. Obvyklé dávky budú ležať v rozmedzí od asi 0,001 do 1000 mg/kg, obvyklejšie od 0,01 do 10 mg/kg telesnej hmotnosti hostiteľa. V týchto dávkach je alternatívne možné tieto terapeutické činidlá podávať konštantnou infúziou behom predĺženého obdobia, obyčajne dlhšom ako 24 hodín, kým sa nedosiahnu požadované kladné liečebné účinky. Skutočná dávka liečiva, ako tiež spôsob podávania, musia byť zvolené na základe relatívnej účinnosti, relatívnej toxicity, rastových charakteristík nádoru a účinku kryptofycínov na bunkový cyklus, farmakokinetiky liečiva, veku, pohlavia, fyzického stavu a predchádzajúcej liečby pacienta.

Kryptofycínové zlúčeniny, samotné alebo spolu s ďalšími neoplastickými činidlami, sa môžu spracovávať na farmaceutické prostriedky v prírodnej forme alebo vo forme soli. Ako príklady farmaceutický vhodných netoxických solí je možné uviesť adičné soli s bázami (vznikajúce s volnými karboxylovými alebo inými aniónovými skupinami), ktoré je možné pripraviť pri použití anorganických báz, ako napríklad hydroxidu sodného, draselného, amónneho, vápenatého alebo železitého, alebo organických báz, ako izopropylamínu, trimetylamínu, 2-etylaminoetanolu, histidínu, prokainu apod. Takými sólami môžu tiež byť adičné soli s kyselinami (vznikajúce s volnými katiónovými skupinami). Také soli kryptofycínové zlúčeniny tvoria s anorganickými kyselinami, ako napríklad kyselinou chlorovodíkovou alebo fosforečnou, alebo organickými kyselinami, ako kyselinou octovou, šťavelovou, vínnou, mandlovou apod. Ďalšie excipienty, ktoré sa používajú v prostriedkoch podlá vynálezu sú odborníkom v tomto odbore známe, a je možné je nájsť v United States Pharmacopeia zv. XXII a National Formulary zv. XVII, U.S. Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD, USA (1989). Táto citácia je tu uvádzaná náhradou za prenesenie celého obsahu uvedenej publikácie do tohto opisu.

Volba konkrétnych nosičov vhodných pre daný terapeutický prostriedok závisí od prednostného spôsobu podávania. Antineoplastické prostriedky môžu byť napríklad spracovávané na prostriedky pre orálne podávanie. Také prostriedky sa obyčajne pripravujú vo forme kvapalného roztoku alebo suspenzií alebo v pevnej forme. Orálne prostriedky obyčajne zahŕňajú bežne používané prísady, ako spojivá, plnivá, nosiče, konzervačné prostriedky, stabilizačné činidlá, emulgátory, tlmivé roztoky a excipienty, ako je napríklad manitol, laktóza, škrob, stearan horečnatý, sodná sol sacharínu, celulóza, uhličitan horečnatý apod. vo farmaceutickej kvalite. Tieto prostriedky môžu mať podobu roz98 tokov, suspenzií, tabliet, piluliek, kapsúl, prostriedkov s predĺženým uvolňovaním alebo práškov, ktoré obyčajne obsahujú 1 až 95 t, prednostne 2 až 70 % účinnej zložky.

Prostriedky podlá vynálezu sa rovnako môžu pripravovať ako injektovatelné kvapalné roztoky, suspenzie alebo emulzie. Tiež je možné ich pripravovať v pevných formách vhodných na prípravu roztokov alebo suspenzií pred injekčným podaním. Tieto injektovatelné formy môžu byť podávané subkutánne, intravenózne, intraperitoneálne, intramuskulárne, intracekálne alebo intrapleurálne. Účinné zložky alebo prísady sa často miešajú s riedidlami alebo excipientmi, ktoré sú fyziologicky znášatelné a kompatibilné s účinnou zložkou alebo zložkami. Ako vhodné riedidlá a excipienty je možné uviesť napríklad vodu, solný roztok, dextrózu, glycerol apod. a ich kombinácie. Okrem toho, keď je to žiadúce, môžu prostriedky obsahovať menšie množstvo pomocných prostriedkov, ako sú namáčadlá, emulgátory, stabilizátory pH alebo tlmivé roztoky.

Predmetom vynálezu sú ďalej spôsoby použitia hore definových kryptofycínových zlúčenín na inhibíciu proliferácie cicavčích buniek, pri ktorých sa bunky uvádzajú do styku s kryptofycínovou zlúčeninou v množstve dostačujúcom na inhibíciu proliferácie cicavčích buniek. Podlá prednostného rozpracovania vynálezu sú cicavčími bunkami bunky hyperproliferatívne. Na účely tohto opisu sa pod pojmom hyperproliferatívne cicavčie bunky rozumejú cicavčie bunky, ktoré nepodliehajú charakteristickým obmedzeniam rastu, napríklad programovej smrti buniek (apoptóze). Podlá ďalšieho rozpracovania vynálezu sú takými cicavčími bunkami bunky ludské. Predmetom vynálezu je ďalej spôsob, pri ktorom sa cicavčia bunka uvádza do styku s aspoň jednou kryptofycínovou zlúčeninou a aspoň jedným ďalším antineoplastickým činidlom. Typy antineoplastických činidiel, ktoré prichádzajú do úvahy, sú uvedené hore.

Predmetom vynálezu je ďalej spôsob použitia hore opísaných kryptofycínových zlúčenín na inhibíciu proliferácie hyperproliferatívnych buniek s fenotypom rezistentným voči liečivu, vrátane fenotypov rezistentných voči viacerým liečivám, pri ktorom sa uvedená bunka uvádza do styku s kryptofycínovou zlúčeninou v množstve dostatočnom na inhibíciu proliferácie hyperproliferatívnych cicavčích buniek. Cicavčími bunkami sú prednostne bunky ludské. Predmetom vynálezu je ďalej spôsob, pri ktorom sa cicavčia bunka uvádza do styku s aspoň jednou kryptofycínovou zlúčeninou a aspoň jedným ďalším antineoplastickým činidlom. Typy antineoplastických činidiel, ktoré prichádzajú do úvahy, sú uvedené hore.

Predmetom vynálezu je ďalej spôsob zmierňovania patologických stavov vyvolaných hyperproliferujúcimi cicavčími bunkami, napríklad novotvaru, pri ktorom sa cicavcovi podáva hore opísaný farmaceutický prostriedok v množstve účinnom na inhibíciu proliferácie hyperproliferujúcich buniek. Pod pojmom patologický stav sa v tomto texte rozumie choroba vyvolaná proliferáciou cicavčích buniek, ktoré nepodliehajú normálnym obmedzeniam bunkového rastu. Táto proliferácie buniek môže spôsobovať vznik novotvarov. Ako neobmedzujúce príklady takých novotvarov je možné uviesť novotvary prsníka, malobunkové pľúc, ne-malobunkové pľúc, kolorektálne, leukémiu, melanómy, novotvary centrálneho nervového systému (CNS), vaječníkov, prostaty, sarkómy mäkkých tkanív alebo kostí, novotvary hlavy a krku, novotvary zažívacieho traktu, vrátane slinivky, pažeráka a žalúdku, myelomy, novotvary močového mechúru, obličiek a neuroendokrinné novotvary, vrátane tyroidných novotvarov a lymfómov, nehodgkinské novotvary a Hodgkinovu chorobu. Podľa ďalšieho rozpracovania vynálezu

100 je neoplastickou bunkou bunka ludská. Predmetom vynálezu je tiež spôsob zmierňovania patologických stavov pri použití kryptofycínu v kombinácii s inými terapiami, ako tiež inými antineoplastickými činidlami. Také terapie a ich vhodnú indikáciu pre rôzne novotvary je možné nájsť v Cancer Principles and Practice of Oncology, 4. vydanie, ed. DeVita, V., Hellman, S. a Rosenberg S., Lippincott Co., 1993. Táto citácia je tu uvádzaná náhradou za prenesenie celého obsahu uvedenej publikácie do tohto opisu.

V tomto opise je ilustrované, že kryptofycínové zlúčeniny sú schopné narušovať mikrotubulárnu štruktúru v kultivovaných bunkách. Okrem toho, na rozdiel od alkaloidov Vinea, sa kryptofycínové zlúčeniny zdajú byť chudým substrátom pre P-glykoproteínovú pumpu odvádzajúcu liečivo. Kryptofycín 1 je hlavným cytotoxínom v modrozelenej rase (cyanobacteria) Nostoc sp. kmeňa GSV 224 a vykazuje výbornú účinnosť proti tumorom transplantovaným myši. Tento cyklický didepsipeptid bol skôr izolovaný z Nostoc sp. ATCC prírastkové číslo 53789 ako antifungálne činidlo a bola určená jeho hrubá štruktúra. Teraz bola pri použití kombinácie chemických a spektrometrických postupov stanovená relatívna a absolútna stereochémia tohto potenciálne dôležitého liečiva. Z GSV 224 bolo tiež izolovaných dvadsať štyri ďalších kryptofycínových zlúčenín, kryptofycín 2 až 7, 16 až 19, 21, 23, 24, 26, 28 až 31, 40, 43, 45, 49, 50 a 54 a bola stanovená ich celková štruktúra a cytotoxicita. Niekoľko derivátov a produktov degradácie je opísaných ako chemicky, tak farmakologicky.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch rozpracovania. Tieto príklady, ktoré sú zamerané na prednostnú realizáciu a prednostné aspekty tohto vynálezu, majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

101

Príklady rozpracovania vynálezu

V nasledujúcich príkladoch rozpracovania sú údaje množstiev uvádzané v gramoch (g), miligramoch (mg), mikrogramoch ^g), nanogramoch (ng), pikogramoch (pg), moloch (mol) alebo milimoloch (mmol); všetky koncentrácie sú uvádzané ako percentá objemové (%) alebo ako koncentrácie molárne (M), milimolárne (mM), mikromolárne (μΜ), nanomolárne (nM), pikomolárne (pM) alebo normálne (N); objemy sú uvádzané v litroch (1), mililitroch (ml) alebo mikrolitroch (μΐ), a dĺžkové údaje sú uvádzané v milimetroch (mm), pokiai to nie je uvedené inak.

V nasledujúcich príkladoch je demonštrovaná izolácia a syntéza kryptofycínových zlúčenín, ako tiež ich použitie ako terapautické činidlá podía vynálezu.

Pri screeningu extraktov z viac ako 1000 modrozelených ras (cyanobacteria) na protinádorovú účinnosť, bolo zistené, že lipofilný extrakt z Nostoc sp. GSV 224 je silne cytotoxický [Patterson, G. M. L et al., J. Phycol. 27: 530 až 536 (1991)] a vykazuje minimálne inhibičné koncentrácie (MIC) 0,24 ng/ml proti KB, bunkovej línii ludského karcinómu nosohltanu a 6 ng/ml proti LoVo, bunkovej línii ludského kolorektálneho adenokarcinómu. Ešte významnejšie bolo zistenie, že tento extrakt vykazuje významnú selektívnu cytotoxicitu voči tumorom pri Corbettovej skúške [Corbett, T. H. et al., Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, str. 35 až 87, Kluwer Academic Publishers: Norvell, 1992; Valeriote, F. A. et al., Discovery and Development of Anticancer Agents, Kluwer Academic Publishers: Norwell, 1993, v tlači]. Chromatografiou s obrátenými fázami (monitorovanou bioesejom) extraktu z rasy bola získaná frakcia, ktorá bola tvorená prevážne kryptofycínom 1, účinným fungicídom, ktorý bol

102 skôr izolovaný z Nostoc sp. ATCC 53789 výskumníkmi firmy Merck [Schwartz, R. E. et al., J. Ind. Microbiol. 5: 113 až 124 (1990) a Hirsch, C. F. et al., US patent 4 946 835 vydaný 7. augusta 1990], a bolo zistené, že je velmi účinný proti kmeňom Cryptococcus.

Kryptofycín 1 je najviac zodpovedný za cytotoxickú účinnosť surového extraktu z rasy Nostoc sp. GSV 224 a čistá zlúčenina vykazuje proti KB hodnotu IC_5O 3 pg/ml a proti LoVo IC₅₀ 5 pg/ml. Pri Corbettovej skúške bolo zistené, že kryptofycín 1 vykazuje silnú selektivitu voči tumorom a je rovnako cytotoxický aj voči nádorovým bunkám rezistentným voči liečivu aj viacerým liečivám. Imunofluorescenčné skúšky ukázali, že kryptofycín 1 interaguje s bunkovým cielom podobne ako vinblastín, ale na rozdiel od neho má dlhší čas účinnosti a netvorí parakryštalické telesá. Pri predbežných experimentoch in vivo kryptofycín 1 vykazoval velmi slubnú účinnosť proti tumorom implantovaným myšiam.

V Nostoc sp. GSV 224 boli prítomné menšie množstvá niekoľkých ďalších kryptofycínových zlúčenín. Dvadsať jedna z nich mohlo byť izolovaných v množstve dostatočnom na stanovenie ich štruktúry a vyhodnotenie protinádorovej účinnosti in vitro. Pri izolácii bola rasa extrahovaná zmesou dichlórmetánu a acetonitrilu v pomere 1:5a extrakt bol podrobený vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii s obrátenými fázami. Vo frakciách eluovaných zo stĺpca pre rýchlu chromatografiu s obrátenými fázami pri použití zmesi acetonitrilu a vody v pomere 65 : 35, ako elučného činidla, boli prítomné kryptofycíny 2, 3, 4, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 40, 43, 45, 49, 50 a 54 sprevádzajúce kryptofycín 1. Pokial bola rasa extrahovaná metanolom a chromatografia s obrátenými fázami bola vykonávaná pri použití zmesi metanolu a vody, ako elučného činidla, boli nájdené

103 iba kryptofycíny 2, 3, 4, 5, 6a7. Kryptofycíny 2, 3, 4, 5 a 6 boli eluované zmesou metanolu a vody v pomere 3 : 1 a kryptofycín 7 bol nájdený v časnejšej, menej cytotoxickej frakcii eluovanej zmesou metanolu a vody v pomere 1:3. Zdá sa, že acyklické kryptofycíny 5, 6 a 7 sú produktmi vznikajúcimi rozkladom kryptofycínu 1 behom izolačného postupu.

Kryptofycíny 3 a 5 sa javia ako identické s fungicídnymi polosyntetickými zlúčeninami, ktoré boli z kryptofycínu 1 pripravené výskumníkmi firmy Merck [Sesin, D. F., US patent 4 845 085 vydaný 4. júla 1989; Sesin, D. F. a Liesch, J. M., US patent 4 868 208 vydaný 19. septembra 1989]. Kryptofycín 3 bol pripravený reakciou kryptofycínu 1 so zliatinou zinku a medi alebo jodidom difosforičitým [Sesin, D. F., US patent 4 845 085 vydaný 4. júla 1989]. Kryptofycín 5 bol vyrobený metanolýzou kryptofycínu 1 [Sesin, D. F. a Liesch, J. M., US patent 4 868 208 vydaný

19. septembra 1989].

Príklad 1

Stanovenie štruktúry

Stanovenie štruktúr nových zlúčenín, kryptofycínov 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 40, 43, 45, 49, 50 a 54, ako tiež známych kryptofycínov, bolo uskutočnené priamymi postupmi dobre známými odborníkom v tomto odbore. Údaje hmotnostnej spektrometrie sú v súladu s molekulárnym zložením. Údaje protónovej a uhlíkovej nukleárnej magnetickej rezonancie získané z COSY, HMQC, HMBC a NOESY spektra umožnili zostavenie všetkých celkových štruktúr týchto zlúčenín depsipeptidového typu. Prítomnosť rôznych hydroxy- a aminokyselinových jednotiek v každej zlúčenine bola potvrdená plynovou chromátografickou hmotnostnou spektrálnou analýzou. Celková štruktúra, vrátane

104 absolútnej stereochémie, bola stanovená pri použití kombinácií chemických degradatívnych a špeciálnych analytických techník na príslušných derivátoch kryptofycínových zlúčenín.

Príklad 2

Vzájomný vzťah štruktúry a účinnosti

Všetky tu uvedené zlúčeniny boli skúšané na cytotoxicitu proti KB (ludský karcinóm nosohltanu), LoVo (ľudský karcinóm tlstého čreva) a SKOV3 (ľudský karcinóm vaječníkov), aby sa stanovili štruktúrne rysy kryptofycínu 1 nutné na dosiahnutie optimálnej účinnosti. Hodnoty IC₅₀ sú uvedené v tabuľkách 1 a 2. Porovnanie cytotoxicít ukázalo, že na dosiahnutie optimálnej cytotoxicity je nutná prítomnosť intaktného makrolidového kruhu, epoxy- a metylskupiny a dvojná väzba v jednotke 7,8-epoxy-5-hydroxy-6-metyl-8-fenyl2-okténovej kyseliny (pozri jednotku A na obr. 1), chlóru a O-metylskupiny v 3-(3-chlór-4-metoxyfenyl)alanínovej jednotke (jednotka B), metylskupiny v jednotke 3-amino-2metylpropiónovej kyseliny (jednotka C) a izobutylskupiny v jednotke 2-hydroxy-4-metylpentánovej kyseliny (jednotka D) kryptofycínu 1. Silná cytotoxica kryptofycínu 8, je najpravdepodobnejšie dôsledkom prítomnosti chlórhydrínovej funkčnej skupiny, ktorá funguje ako maskovaný epoxid.

Najúčinnejšie zlúčeniny boli tiež skúšané na selektívnu cytotoxicitu proti štyrom rôznym typom buniek, a to bunkám myšej leukémie (L1210 alebo P388), tuhých nádorov u myší (adenokarcinóm tlstého čreva 38, adenokarcinóm vývodov slinivky 03, adenokarcinóm mliečnej žľazy M16/M17), tuhého ľudského nádoru (tlstého čreva CX-1, HCT8, H116; pľúc H125; mliečnej žľazy MX-1, MCF-7) a málozhubného fibroblastu (LML) pri použití Corbettovej skúšky [Corbett, T. H. et al., Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for

105

Drug Discovery and Development, str. 35 až 87, Kluwer Academic Publishers: Norvell, 1992], skúške s difúziou na kotúči, pripravenej ako sa obyčajne používa pri skúšaní antifungálnej a antibakteriálnej účinnosti. Výsledky uvedené v tabuľke 1 ukázali, že kryptofycíny 1 až 5 a 8 nie sú selektívne voči tuhým nádorom ani voči leukémii, ale že sú voči nádorovým bunkovým líniám skôr rovnako účinné, vrátane bunkových línií rezistentných voči liečivám, ako je M17. Žiadna zo zlúčenín nevykázala zónu inhibície pre ktorúkoľvek bunkovú líniu tuhých nádorov (vždy 250 zonálnych jednotiek, tzn. 7,5 mm), väčšiu ako zónu inhibície pre leukemickú bunkovú líniu. Kryptofycíny 1 až 5 a 8 však okrem toho vykázali výrazne väčšie zóny inhibície (400 zonálnych jednotiek) pre všetky nádorové bunkové línie v porovnaní so zónou inhibície pre fibroblastový LML. Diagnosticky bolo zistené, že LML sa voči klinicky užitočným cytotoxickým činidlom (pozri údaje z Corbettovej skúšky pre 5-fluóruracil, etopozid a taxol v tabuľke 1) správa skôr podobne ako normálna bunka, než ako bunka nádorová. Pretože rôzne cytotoxicity boli väčšie ako 250 zonálnych jednotiek, sú kryptofycíny 1 až 5 a 8 selektívne voči nádorom. Tieto zlúčeniny boli teda vybrané ako vhodné na skúšanie in vivo.

Kryptofycín 1 je účinný proti širokému spektru myších a ľudských nádorov implantovaných myšiam, vrátane nádorov rezistentných voči liečivám (pozri tabuľku 3). Táto zlúčenina vykazuje vynikajúcu účinnosť proti piatim raným štádiám myších nádorov, tzn. adenokarcinómom #38 a #51, taxol-senzitívnemu a taxol-rezistentnému nádoru prsníka #16/C/RP a adenokarcinómu vývodu slinivky #03, a dvom raným štádiám ľudských nádorov skúšaných na myšiach SCID, tzn. nádoru prsníka MX-1 a adenoskvamóznemu nádoru pľúc H125, pričom vykazuje nádorovú záťaž T/C (stredná nádorová záťaž u ošetrených zvierat/stredná nádorová záťaž u neošetrených zvierat) nižšiu ako 10 %.

106

Hodnoty T/C, ktoré sú nižšie ako 42 %, sú charakteristické podlá štandardov NCI pre účinnosť. Hodnoty T/C, ktoré sú nižšie ako 10 %, zodpovedajú podlá štandardov NCI vynikajúcej účinnosti a potenciálnej klinickej účinnosti [Corbett, T. H. et al., Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts f or Drug Discovery and Development, str. 35 až 87, Kluwer Academic Publishers: Norvell, 1992]. Pri dvoch z pokusov boli zistené hodnoty hrubého logaritmického usmrtenia nádorových buniek (gros tumor celí log kill) 2,0. Veličina hrubého logaritmického usmrtenia je definovaná výrazom T-C/3,2 Td, kde T je stredný čas (dni), za ktorý nádory v ošetrenej skupine dosiahnu hmotnosť 750 mg, C je stredný čas (dni), za ktorý nádory v kontrolnej skupine dosiahnu hmotnosť 750 mg a Td je čas, za ktorý sa zdvojnásobí objem nádoru. Hodnoty hrubého logaritmického usmrtenia nádorových buniek väčšie ako 2,8; 2,0 až 2,8; 1,3 až 1,9; 0,5 až 0,8 a menšie ako 0,5 pri čase podávaní liečiva 5 až 20 dní sú klasifikované stupňami ++++, +++, ++, + a - (inaktívny). Na dosiahnutie čiastočnej alebo úplnej regresie 100 až 300mg hmotnosti väčšiny transplantovaných tuhých nádorov u myší je potrebný stupeň aktivity +++ až ++++, ktorý je charakteristický pre klinickú účinnosť.

Kryptofycín 8 je rovnako účinný proti širokému spektru nádorov implantovaných myšiam (tabulka 4). Táto zlúčenina je výborne účinná proti všetkým dosial skúšaným nádorom, pričom vykazuje hodnoty nádorovej záťaže T/C nižšiu ako 10 %, ale dôležitejšie je, že hrubé logaritmické usmrtenie vykazuje stupeň +++ až ++++ a že v niektorých prípadoch došlo k vyliečeniu.

Pri jednom pokusu, ktorý bol dosial uskutočnený, bola tiež zistená dobrá in vivo účinnosť pri kryptofycíne 35.

107

Letálna toxicita pozorovaná behom skúšania kryptofycínov 1 a 8 je atribútom leukopénie, ktorá je obvyklá pri všetkých klinicky používaných protinádorových liečiv.

Príklad 3

Kultivačné podmienky

Nostoc sp. GSV 224 bol získaný od Prof. C. P. Wolka, MSU-DOE Plánt Research Laboratory, Michigan State University, USA. Nostoc sp. ATCC 53789 pochádza zo zbierky Američan Type Culture Collection. Na zaočkovanie 201itrového skleneného demižónu sterilizovaného v autokláve obsahujúceho anorganické médium označené názvom modifikované médium BG-11 [Patterson, G. M. L et al., J. Phycol. 27: 530 až 536 (1991)], ktorého pH bolo nastavené hydroxidom sodným na 7,0, boli použité kultúry rasy z jednolitrovej nádoby. Kultúry boli kontinuálne ožiarované pri intenzite dopadajúceho svetla 200 μπιοί fotónov.m”².s^-1 (fotosynteticky aktívne žiarenie) pri použití blokov žiariviek so studeným bielym svetlom a prevzdušňované zmesou 0,5 % oxidu uhličitého vo vzduchu pri prietoku 5 litrov/min. Kultivácia bola vykonávaná pri teplote 24±1°C. Po 21 dňoch bola kultúra zobraná filtráciou. Výťažok lyofilizovaného kmeňa Nostoc sp. GSV 224 bol 0,61 g/liter kultúry a výťažok kmeňa ATCC 53789 bol 0,3 g/liter kultúry.

Príklad 4

Izolácia

Postup A

Lyofilizovaný Nostoc sp. GSV224 (50 g) sa extrahuje 2 litrami zmesi dichlórmetánu a acetonitrilu v pomere

108

: 5 počas 48 hodín. Extrakt sa skoncentruje pri zníženom tlaku. Tmavozelený pevný zvyšok (1 g; KB MIC 0,24 ng/ml) sa nanesie na stĺpec silikagélu s časticami potiahnutými ODS (55 g, 7x5 cm) a podrobia rýchlej chromatografii pri použití zmesi acetonitrilu a vody v pomere 1 : 3 (0,8 litra), zmesi acetonitrilu a vody v pomere 1 : 1 (0,8 litra), zmesi acetonitrilu a vody v pomere 65 : 35 (1,0 litra), metanolu (0,8 litra) a dichlórmetánu (0,5 litra), ako elučného činidla. Frakcia, ktorá bola eluovaná zmesou acetonitrilu a vody v pomere 65 : 35 (4 20 mg, KB MIC 14 pg/ml) sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii s obrátenými fázami (Econosil C18, 10 gm, 25 cm x 21,5 mm, UV detekcia pri 250 nm, zmes acetonitrilu a vody v pomere 65 : 35, prietoková rýchlosť 6 ml/min), čím sa získa kryptofycín 1 (t_R = 49,3 min, 220 mg) a rad nečistých frakcií. Frakcia eluovaná zo stĺpca Econosil C18 pri ^ťR 28,8 min sa ďalej prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s normálnymi fázami (patróna Econosil silikagél 5 gm, 250 x 4,6 mm, etylacetát/hexán v pomere 6 : 4, 3 ml/min), čím sa získa kryptofycín 16 (3,0 mg). Frakcia eluovaná zo stĺpca Econosil C18 pri t_R 32,5 min sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatograf ii na stĺpci silikagélu Econosil, pričom elúcia sa vykonáva zmesou etylacetátu a hexánu v pomere 55 : 45 rýchlosťou 3 ml/min, čím sa získa kryptofycín 24 (0,8 mg). Frakcie eluované zo stĺpca Econosil C18 pri t_R = 35,5 min sa dvakrát podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii na stĺpci silikagélu Econosil, pričom elúcia sa vykonáva najskôr zmesou etylacetátu a hexánu v pomere 1 : 1 rýchlosťou 3 ml/min a potom pri použití zmesi etylacetátu a metylénchloridu v pomere 4 : 6 rýchlosťou 2,5 ml/min. Získa sa kryptofycín 23 (1,2 mg,) a kryptofycín 43 (0,1 mg). Frakcia eluovaná zo stĺpca Econosil C18 pri t_R 39,5 minúty sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii na stĺpci silikagélu Econosil, pričom elúcia sa vykonáva zmesou etylacetátu a hexánu v pomere 1 : 1 rýchlosťou 3 ml/min. Získa

109

sa kryptofycín 2 (6 mg) a kryptofycín 21 (14 mg) a komplexná zmes kryptofycínov eluovaná pri ^fcR 32,5 minúty. Táto posledná frakcia, zhromaždená z 400 g suchej rasy, sa postupne podrobí semipreparatívnej chromatografii na stĺpci (partisil C18, 250 x 9,4 mm, 10 μπι) pri použití zmesi vody a acetonitrilu v pomere 35 : 65 a analytickej chromatografii s reverznými fázami (Econosil, 150 x 4,6 mm, 5 μπι), pričom elúcia sa vykonáva zmesou vody, acetonitrilu a metanolu v pomere 5:4:1 rýchlosťou 1,3 ml/min. Získa sa kryptofycín 50 (t_R 34,8, 0,4 mg) a kryptofycín 40 (t_R 38,8 min, 0,3 mg). Frakcia eluovaná zo stĺpca Econosil C18 pri t_R 44,5 minúty sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromátografii na stĺpci silikagélu Econosil, pričom elúcia sa vykonáva zmesou etylacetátu a hexánu v pomere 1 : 1 rýchlosťou 3 ml/min, čím sa získa kryptofycín 17 (0,3 mg). Purifikáciou (HPCL s normálnymi fázami) frakcie eluovanej zo stĺpca Econosil C18 pri t_R 54,5 min, ako vedíajší produkt sprevádzajúci kryptofycín 1 sa získa kryptofycín 45 (t_R 6,7 min, 0,1 mg), kryptofycín 26 (t_R 8,9 min, 0,5 mg) a kryptofycín 54 (t_R

19.8 min, <0,1 mg) pri elúcii zmesou etylacetátu a hexánu v pomere 1:1. Frakcia eluovaná zo stĺpca Econosil C18, ako široký pík (t_R 58 až 70 min) sa podrobí HPLC na stĺpci silikagélu Econosil, pričom elúcia sa vykonáva zmesou etylacetátu a hexánu v pomere 43 : 57 rýchlosťou 2,5 ml/min, čím sa získa kryptofycín ⁴ (^fcR 19,6 min, 1,5 mg), kryptofycín 31 (t_R 9,4 min, 0,8 mg), kryptofycín 19 (t_R

25.8 min, 0,3 mg), kryptofycín 49 (t_R 28 min, 0,1 mg), kryptofycín 28 (t_R 29,0 min, 0,5 mg) a nečistý kryptofycín 29 (t_R 52,5 min, 2,0 mg) a 30 (t_R 49 min, 3,0 mg). Čisté kryptofycíny 29 a 30 sa získajú po vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii s reverznými fázami (Econosil C18, 10 μιη, 250 x 10 mm) pri použití zmesi metanolu a vody v pomere 3:1, ako elučného činidla. Frakcia eluovaná zo stĺpca Econosil C18 pri t_R 78,9 minúty sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii na stĺpci silikagélu

110

Econosil, čím sa získa kryptofycín (t_R 16,4 min, 3,0 mg). Frakcia eluovaná zo stĺpca Econosil C18 pri t_R 82,8 min sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii na stĺpci silikagélu Econosil, pričom elúcia sa vykonáva zmesou etylacetátu a hexánu v pomere 45 : 55 rýchlosťou 3 ml/min, čím sa získa kryptofycín 18 (t_R 19,2 min, 0,8 mg).

Postup B

Lyofilizovaný Nostoc sp. GSV 224 (12,23 g) sa extrahuje 12 hodín 700ml a potom 5 hodín 400ml dávkou metanolu. Extrakty sa spoja a skoncentrujú pri zníženom tlaku na tmavozelený pevný zvyšok (1,84 g). Tento zvyšok sa rozdelí medzi vodu a dichlórmetán. Lipofilná frakcia (0,65 g; KB MIC 0,24 ng/ml) sa nanesie na stĺpec silikagélu s časticami potiahnutými ODS (55 g, 7 x 5 cm) a podrobí rýchlej chromatografii pri použití zmesi metanolu a vody v pomere 1 : 3 (0,8 litra), metanolu a vody v pomere 1 : 1 (0,8 litra), metanolu a vody v pomere 3 : 1 (0,8 litra), metanolu (0,8 litra) a dichlórmetánu (0,5 litra), ako elučného činidla.

Frakcia eluovaná zmesou metanolu a vody v pomere 3 : 1 (22 mg, KB MIC 14 pg/ml), ktorá je zodpovedná v podstate za všetku cytotoxickú účinnosť, sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii s obrátenými fázami (Econosil C18, 10 μπι, 250 x 10 mm, UV detekcia pri 250 nm, rýchlosť elúcie 3 ml/min) pri použití zmesi metanolu a vody v pomere 1:5, ako elučného činidla. Získajú sa kryptofycíny 7 (t_R 7,6 min, 0,2 mg), 5 (t_R 15,4 min, 2,3 mg), 2 (t_R 16,0 min, 1,0 mg), 1 (t_R 19,0 min, 12,0 mg), 4 (t_R 26,5 min, 1,2 mg) a 3 (t_R

30,2 min, 1,4 mg). Frakcia (8,1 mg) eluovaná zo stĺpca pre rýchlu chromatografiu pri použití zmesi metanolu a vody v pomere 1:3, ako elučného činidla, vykazovala pri jednej z kultúr miernejšiu cytotoxicitu (KB MIC 2 μg/ml). Po prečistení vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou pri po-

111 užití zmesi metanolu a vody v pomere 2:3, ako elučného činidla, sa získa kryptofycín G (7, t_R 6,0 min, 2,4 mg).

Príklad 5

Spektrálne údaje o kryptofycínoch 1 až 7

Symboly A, B, C a D označujú príslušné jednotky znázornené na obr. 1.

Kryptofycín 1 [a]_D +33,8 (MeOH, c = 1,83);

UV lambda_max(e) 208 (42 400), 218 (33 700), 228 (23 800), 280 (23 210); CD [θ]₂₀2 ^{+14 900}' ^[θ]206 ^{+64 900}' ^[θ]214 ⁺²⁶900, [Θ1₂24 ^{+46 300}' ^[θ]237 ⁺¹° ⁵⁰⁰·

IR (CHC1₃) v_max 3425, 2963, 1751, 1719, 1677, 1502, 1259 cm“¹.

EIMS rn/z (rel. intenzita) 654/656 (20/9), 412/414 (33/12), 280/282 (31/12), 227(80), 195/197 (92/44), 91(100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 654,2665 (vyrátané pre ^C35^H43^C1N2°8· ⁴·^3mmu chyba).

^XH NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 7,8-epoxy-5-hydroxy-

6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,74 (2, dt, 15,5 a 0,9), 6,68 (3, ddd, 15,5, 9,6 a 5,2), 2,45 (4, ddd, 14,2,

11,1 a 9,6), 2,55 (4, brdd, 14,2 a 5,2), 5,16 (5, ddd,

11,1, 4,9 a 1,9), 1,80 (6, m), 1,14 (6-Me, d, 7,1), 2,92 (7, dd, 7,5 a 2,0), 3,69 (8, d, 2,0), 7,25 (10/14, m), 7,34 - 7,39 (11/12/13, m); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D), 4,83 (2, dd, 6,8 a 3,3), 1,70 (3, m), 1,36 (3, m),

1,70 (4, m), 0,86 (5, d, 6,6), 0,85 (4Me, d, 6,6), 3-amino2-metylpropiónová kyselina (C) 2,71 (2, m), 1,22 (2-Me, d,

7,1), 3,30 (3, ddd, 13,4, 5,8 a 3,8), 3,48 (3, ddd, 13,4,

6,3 a 5,8), 6,93 (3-NH, brt, 5,8); 3-chlór-4-metoxyfenyl-

112 alanín (B) 4,80 (2, ddd, 8,7, 7,3 a 5,4), 5,61 (2-NH, d,

8,7), 3,03 (3, dd, 14,4 a 7,3), 3,13 (3, dd, 14,4 a 5,4), 7,21 (5, d, 2,1), 3,87 (7-OCH₃, s), 6,83 (8, d, 8,5), 7,07 (9, dd, 8,5 a 2,1). ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,3 (1), 125,3 (2), 141,0 (3), 36,7 (4), 76,2

(5),	40,6	(6),	13,5 (6-Me), 63,0 (7)	, 59,0 (8),	136,7 (9),
125,6 (10/14),	128,7 (11/13), 128,5	(12); D 170	,7 (1), 71,3
(2),	39,4	(3),	24,5 (4), 22,9 (5), 2	1,3 (4-Me);	C 175,6
(D,	38,2	(2),	14,1 (2-Me), 41,1 (3)	; B 170,9 (	D, 53,6
(2),	35,0	(3),	129,7 (4), 131,0 (5),	122,4 (6),	154,0 (7),
56,1	(7-OCH₃),	112,2 (8), 128,4 (9)

Kryptofycín 2 [a]_D +20,4’ (MeOH, c = 0,54);

UV lambda_max(e) 206 (43 800), 218 (37 500), 232 (22 900), 278 (2 410); CD [θ]₂₀₃ +54 100, [Θ1₂₁₂ +16 500, [θ)₂₂₅ +53 600, [θ]₂₃₆ “14 000.

IR (CHC1₃) V_max 3423, 3029, 2961, 1742, 1724, 1678, 1512, 1258 cm-¹

EIMS m/z (rel. intenzita/priradenie) 620 (11,M⁺), 431 (3), 378 (8), 377 (6), 311 (11), 246 (10), 244 (8), 227 (14), 195 (17), 161 (84, CH3O-CgH4-CH=CH=CO⁺), 121 (79, CH3O-CgH₄-CH₂ ⁺), 91 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 620,3094 (vyrátané pre ^c35^h44ⁿ2°8' °f^3mmu chyba); 161,0605 (vyrátané pre Ci₀h₉o₂, -0,2mmu chyba), 121,0658 (vyrátané pre C_gH_gO, -0,4mmu chyba).

¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 7,8-epoxy-5-hydroxy-

6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,71 (2, dd, 15,4 a 1,3), 6,70 (3, ddd, 15,4, 10,2 a 5,0), 2,45 (4, m), 2,55 (4, m), 5,18(5, ddd, 11,3, 4,8 a 2,0), 1,79 (6, m), 1,14 (6-Me, d, ,0), 2,92 (7, dd, 7,7 a 2,0), 3,68(8, d, 2,0),

7,24 (10/14, m), 7,34 - 7,39 (11/12/13, m); 2-hydroxy-4-

113 metylpentánová kyselina (D) 4,82 (2, dd, 10,1 a 3,7), 1,70 (3, m), 1,33 (3, m), 1,70 (4, m), 0,86 (5, d, 6,4), 0,84 (4-Me, d, 6,4); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C)

2,68 (2, m), 1,23 (2-Me, d, 7,3), 3,39 (3-H₂, m), 7,02 (3-NH, brt, 6,0); O-metyltyrozín (B) 4,79 (2, ddd, 8,1, 7,0 a 5,7), 5,55 (2-NZ, d, 8,1), 3,07 (3, dd, 14,5 a 7,0),

3,13 (3, dd, 14,5 a 5,7), 7,10 (5/9, d, 8,6), 6,81 (6/8, d,

8,6), 3,78 (7-OCH₃, s). ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha Uhlíka) A 165,1 (1), 125,1 (2), 141,1 (3), 36,7 (4), 76,0

(5), 40,7 (6)

125,6 (10/14) (2) (D (2) (7)

39,4

38.1

35,3

55.2 (3) (2) (3) (7-OCH₃)

13,6 (6-Me), 63,0 (7), 59,0 (8), 136,7 (9), 128,7 (11/13), 128,5 (12); D 170,6 (1), 71,3

24,5 (4), 21,3 (5), 22,9 (4-Me); C 176,0

14,2 (2-Me), 40,7 (3); B 171,1 (1), 53,9 131,0 (4), 130,2 (5/9), 114,1 (6/8), 158,6

Kryptofycín 3 [a]_D +20,3° (MeOH, c = 1,13);

UV lambda_max(e) 206 (51 700),

218 (31 200), 230 (22 900), 246 (18 800), 280 (3 230);

CD [0)205 000, [θ)212 ”390, [0)213 47 200, [0)233

-100, [0]₂51 +33,400, [0)₂7i +4 310

IR (CHC1₃) V_max 34,17, 2926, 1742, 1721, 1676, 1499, 1336 cm”¹.

EIMS m/z (rel. intenzita) 638/640 (2/0,7, M⁺), 412/414 (63/19), 280/282 (15/5), 227 (100), 195 (63), 91 (98);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 638,2764 (vyrátané pre C35H43CIN2O7, -0,5mmu chyba), 412,1516 (vyrátané pre ^C20^H27^C1N06' l'lnimu chyba), 227,1293 (vyrátané pre C₁₅H₁₇NO, l,0mmu chyba).

¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,77 (2, d, 15,5),

6,68 (3, ddd, 15,5, 9,5 a 5,3), 2,37 (4, ), 2,54 (4, m),

114

5,01 (5, ddd, 11,4, 6 a 1,5), 2,56 (6, m), 1,14 (6-Me, d, 7,0), 6,01 (7, dd, 15,8 a 8,8), 6,41 (8, d, 15,8), 7,28 -7,34 (10/11/13/14, m), 7,23 (12, m); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,84 (2, dd, 10,1 a 3,6), 1,62 (3, m), 1,36 (3, m), 1,62 (4, m), 0,77 (5, d, 6,5), 0,74 (4-Me, d, 6,3), 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,71 (2, m), 1,22 (2-Me, d, 7,3), 3,28 (3, dt, 13,5 a 7,0), 3,50(3, ddd, 13,5, 4,9 a 4), 6,93 (3-NH, brt, 6,3); 3-chlór-4metoxyfenylalanín (B) 4,82 (2, m), 5,64 (2-NH, d, 8,8), 3,05 (3, dd, 14,5 a 7,0), 3,13 (3, dd, 14,5 a 5,5), 7,22 (5, d, 2,2), 3,87 (7-OCH₃, s), 6,84 (8, d, 8,5), 7,08 (9, dd, 8,5 a 2,2) ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,4 (1), 125,2 (2), 141,4 (3), 36,5 (4), 77,1 (5), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,1 (7), 130,0 (8), 136,7 (9), 126,1 (10/14), 128,6 (11/13), 128,4 (12); D 170,1 (1), 71,6 (2),

39,5 (3), 24,5 (4), 21,2 (5), 22,7 (4-Me); C 175,6 (1),

38,3 (2), 14,0 (2-Me), 41,2 (3); B 170,9 (1), 53,5 (2),

35,1 (3), 129,8 (4) 131,0 (5), 122,4 (6), 154,0 (7), 56,1 (7-OCH₃), 112,2 (8), 127,6 (9).

Kryptofycín 4 [a]_D +36,7° (MeOH, c = 1,93);

UV lambda_max(e) 206 (41 800), 228 (25 000), 240 (21 200), 248 (22 500), 280 (3 000), 290 (1 230);

CD [Θ1205 ⁸³ [θ^211 *³ θ⁴θ> ίθΐ218 ~⁷¹ θθθ» [θ^229

-11 700, [θ]₂34 “¹³°/ [®J252 ^{+47 500}' ^[θ]270 ^{+5 400}· IR (CHC13) V_max 3410, 2962, 2917, 1741, 1718, 1678, 1511, 1251 cm“¹.

EIMS m/z (rel. intenzita) 604 (2, M+), 378 (74), 246 (11), 227 (46), 161 (100), 91 (96);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 604,3127 (vyrátané pre ^c35^h44ⁿ2°7' 2,2mmu chyba), 378,1910 (vyrátané pre ^C20^H28^N06' °»^7mmu Chyba), 227,1293 (vyrátané pre C₁₅H₁₇NO, l,7mmu chyba), 161,0605 (vyrátané pre C₁₀H_gO₂, -0,2mmu chyba)

115 ¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,74 (2, dd, 15,3 a

1,2), 6,71 (3, ddd, 15,3, 10,3 a 5,0), 2,37 (4, m), 2,53 (4, m), 5,03 (5, ddd, 11,2, 6,4 a 2,0), 2,55 (6, m), 1,13 (6-Me, d, 6,8), 6,01 (7, dd, 15,8 a 8,8), 6,40 (8, d, 15,8), 7,28 -

7,37 (10/11/13/14, m), 7,22 (12, m); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,84 (2, dd, 10,1 a 3,6), 1,65 (3, m), 1,34 (3, m), 1,65 (4, m), 0,75 (5, d, 6,5), 0,72 (4-Me, d, 6,3); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,69 (2, m), 1,22 (2-Me, d, 7,5), 3,39 (3-H₂, m), 7,03 (3-NH, brt, 6,0); O-metyltyrozín (B) 4,79 (2, m), 5,61 (2-NH, d, 7,8), 3,08 (3, dd, 14,5 a 7,0), 3,13 (3, dd, 14,5 a 5,3), 7,11 (5/9, d, 8,8), 6,81 (6/8, d, 8,8), 3,78 (7-OCH₃, s). ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,3 (1), 125,1 (2),

141.5 (3), 36,5 (4), 77,1 (R), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,1 (7), 131,8 (8), 136,7 (9), 126,2 (10/14), 128,7 (11/13),

127.6 (12); D 170,8 (1), 71,6 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 21,2 (5), 22,7 (4-Me); C 175,9 (1), 38,2 (2), 14,2 (2-Me), 40,9 (3); B 171,2 (1), 53,8 (2), 35,3 (3), 131,0 (4), 130,2 (5/9), 114,1 (6/8), 158,6 (7), 55,2 (7-OCH₃).

Kryptofycín 5 [a]_D +36,0’ (c = 0,55);

UV lambda_max(e) 206 (45 600), 218 (37 700), 280 (3 790), 286 (3 480), 325 (2 080)

CD [®]203 ^{+7 710}' ^[θ]206 ⁺²⁹ °⁰⁰' ^[θ]210 ^{+21 400}' ^[θ]222 ⁺⁵⁹800, [θ]₂34 +12 800, [θ)₂₄₁ +13 700.

IR (CHC1₃) V_max 3426, 2958, 1728, 1672, 1502, 1259 cm^-1. EIMS m/z (rel. intenzita) 686/688 (0,1510.05), 655/657 (1/0,3), 654/656 (1,5/0,5), 311/313 (75/27), 195 (66), 155 (54), 121 (51), 91 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 686,2983 (vyrátané pre ^C36^H47^C-I^N2^O9' “l/3mmu chyba).

116

NMR (CDCI3): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 7,8-epoxy-5-hydroxy-

6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,87 (2, d, 15,3),

6,72 (3, dt, 15,3 a 6,8), 2,60 (4, m), 2,52 (4, ddd, 15,2,

7,8 a 6,8), 5,11 (5, ddd, 12,3, 7,8 a 7,1), 1,87 (6, m), l, 12 (6-Me, d, 7,1), 2,91 (7, dd, 7,3 a 2,1), 3,70 (8, d,

2,1), 7,24 (10/14, brd, 7,4), 7,29 - 7,36 (11/12/13, m), 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,09 (2, m), 2,86 (2-OH, brd, 6,1), 1,83 (3, m), 1,42 (3, m), 1,86 (4, m), 0,90 (5, d, 6,6), 0,87 (4-Me, d, 6,8); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 3,64 (1-OCH₃, s), 2,60 (2, m), 1,07 (2-Me, d, 7,3), 3,27 (3, ddd, 13,5, 8,0 a 5,5), 3,39 (3, m, ), 6,32 (3-NH, t, 5,4); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B)

4,59 (2, dt, 6 a 7,5), 6,30 (2-NH, d, 7,5), 2,95 (3, dd,

13,6 a 7,5), 3,0 (3, dd, 13,6 a 6,0), 7,2 (5, d, 2,1), 3,86 (7-OCH₃, s), 6,84 8, d, 8,5), 7,05 (9, dd, 8,5, 2,1). ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 164,8 (1), 126,5 (2), 139,2 (3), 34,4 (4), 75,5 (5), 39,2 (6), 12,9 (6-Me),

63,3 (7), 58,7 (8), 136,8 (9), 125,7 (10/14), 128,6 (11/13), 128,4 (12); D 175,1 (1), 69,2 (2), 43,2 (3), 24,3 (4), 21,2 (5), 23,2 (4-Me); C 175,4 (1), 51,9 (1-OMe), 39,1 (2) , 14,7 (2-Me), 41,6 (3); B 170,6 (1), 54,6 (2), 37,4 (3) , 129,5 (4), 131,0 (5), 122,4 (6), 154,1 (7), 56,1 (7-OMe), 112,2 (8), 128,4 (9)

Kryptofycín 6 [a]_D +17,1° (MeOH, c = 1,1);

UV lambda_max(e) 206 (40 000), 218 (30 100), 228 (21 400), 282 (2 430);

^CD [®h03 ^{+37 700}' [®hio ^{5 430}' [®hl3 ^{_1 260}' ^[eh2i ⁺²⁴100, [θ]232 ⁺⁸ 480, [θ]24θ +13 400, [θ]₂₅₄ +790.

IR (CHC1₃) V_max 3425, 3006, 2956, 1726, 1672, 1641,1502, 1462, 1259 cm“¹

117

FABMS (tioglycerol) m/z (rel. intenzita) 573/575 (13/6) [M-H₂O]⁺, 217 (26), 91 (100).

^XH NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5,7,8-trihydroxy-6metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,92 (2, dt, 15,0 a 1,5), 6,94 (3, dt, 15 a 7,5), 2,51 (4, m), 2,64 (4, m),

3,97 (5, ddd, 9,3, 6,5 a 4,5), 2,03 (6, m), 1,10 (6-Me, d,

6,5), 3,70 (7, dd, 9,0 a 7,5), 4,64 (8, d, 7,5), 7,33 -7,39 (10/11/13/14, m), 7,28 (12, tt, 6,5 a 2,0); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,60 (2, td, 8,0 a 6,0), 6,09 (2-NH, brd, 8,0), 2,96 (3, dd, 13,8 a 8,0), 3,02 (3, dd, 13,8 a 6,0), 7,22 (5, d, 2,0 (3,86 (7-OCH₃, s), 6,84 (8, d, 8,5), 7,07 (9, dd, 8,5 a 2,0) 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 3,63 (1-OCH₃, s), 2,58 (2, m), 1,07 (2-Me, d, 7,0), 3,24 (3, ddd, 13,8, 8 a 6,5), 3,41 (3, ddd, 13,8, 6,5 a 4,8), 6,21 (3-NH, brt, 6,5) ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,2 (1), 125,6 (2), 141,3 (3), 36,9 (4), 82,5 (5), 46,3 (6), 14,3 (6-Me), 85,1 (7),

84,8 (8), 140,9 (í), 125,8 (10/14), 128,6 (11/13), 127,8 (12); (B) 170,6 (1), 54,5 (2), 37,3 (3), 129,6 (4), 131,0 (5), 122,5 (6), 154,1 (7), 56,1 (7-OCH₃), 112,2 (8), 128,5 (9), C 52,0 (1-OCH₃), 175,4 (1), 39,2 (2), 14,7 (2-Me),

41,6 (3)

Kryptofycín 7 [a]_D -51,9’ (MeOH, c = 0,89);

UV lambda_max(ε) 206 (23 400), 220(14 900), 282 (1 670);

CD [®bo2 ^{+35 400}' ^[θ]206 ^{_1 730}' ^t0]211 ^{19 200}' ^[eb20 ¹⁵800, [θ]232 ^{+29 000} r [θ]263 ^{+2 040}

IR (CHC1₃) v_max 3426, 2946, 1732, 1675, 1501, 1258 cm“¹EIMS m/z (rel. intenzita) 455/457 (1/0,3, [M-2H₂O]⁺), 105 (100), 77 (98)

118

FABMS m/z (matrica mágie bullet) 496/498 [M-H₂O+Na]⁺, (tioglycerolová matrica) 474/476 [M-H₂01+H]⁺.

^XH NMR (CD₃OD): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5,7,8-trihydroxy-6metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 6,06 (2, ddd, 15,5,

1.3 a 1,0),6,80 (3, dt, 15,5 a 7,5), 2,49 (4, m), 2,59 (4, m), 3,92 (5, ddd, 9,5, 6,3 a 4,7), 1,95 (6, m), l,08(6-Me, d, 6,7), 3,59(7, dd, 9,0 a 7,8), 4,56 (8, d, 7,8), 7,37 (10/14, brd, 7,3), 7,31 (11/13, brt, 7,3), 7,24 (12, tt,

7.3 a 1,5); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,52 (2, dd,

6.9 a 5,0), 2,93 (3, dd, 13,8 a 6,9), 3,15 (3, dd, 13,8 a 5,0), 7,20 (5, d, 2,2), 3,78 (7-OCH₃, S), 6,88 (8, d,

8,4), 7,08 (9, dd, 8,4 a 2,2) ¹³C NMR (CD₃OD): jednotka δ (poloha Uhlíka) A 167,4 (1), 127,6 (2), 140,9 (3), 37,9 (4), 84,0 (5), 47,6 (6), 144,4 (6-Me), 86,0 (7), 85,8 (8),

142.9 (9), 127,1 (10/14), 129,3 (11/13), 128,5 (12);

B 177,6 (1), 57,3 (2), 38,2 (3), 132,8 (4), 132,1 (5),

122.9 (6), 155,0 (7), 56,5 (7-OCH₃), 113,2 (8), 130,1 (9).

Kryptofycín 16 [a]_D +41,3’ (MeOH, c = 5,2);

UV lambda_max(e) 242 (4963), 280 (2430), 286 (2212);

IR (in substancia) V_max 3402, 3270, 2960, 1748, 1724, 1676, 1514, 1466, 1343, 1239, 1177 cm^-1;

EIMS m/z (rel. intenzita) 640/642 (66/27), 398/400 (47/16), 265 (55), 227 (93), 181 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 640,25676 (vyrátané pre ^C34^H41^CXN2°8^{/ _1}»^6nunu chyba).

6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,74 (2, d, 16),

6,67 (3, ddd, 15,3, 9,7 a 5,5), 2,45 (4, dt, 14,3 a 10,4),

2,55 (4, brdd, 14,3 a 5,3), 5,15 (5, ddd, 11,2, 4,8 a 1,8),

1,8 (6, m), 1,14 (6-Me, d, 7,0), 2,92 (7, dd, 7,5 a 2,0),

119

3,69 (8, d, 2,0), 7,24 - 7,26 (10/14, m), 7,33 - 7,39 (11/12/13, m); 3-chlór-4-hydroxyfenylalanín (B) 4,8 (2, m),

5,64 (2-NH, d, 8,8), 3,03 (3, dd, 14,5 a 7,0), 3,11 (3, dd,

14,4 a 5,6), 7,17 (5, d, 2,2), 5,61 (7-OH, s), 6,91 (8, d,

8,3), 7,0 (9, dd, 8,3 a 2,2); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,71 (2, m), 1,22 (2-Me, d, 7,3), 3,28 (3, dt,

13.6 a 6,8), 3,49 (3, ddd, 13,6, 5 a 4,1), 6,92 (3-NH, brt,

6,1); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,83 (2, dd,

10,1 a 3,3), 1,36 (3, m), 1,67 - 1,75 (3, m), 1,67 - 1,75 (4, m), 0,85 (5, d, 7,5), 0,86 (4-Me, d, 6,8). ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,3 (1), 125,3 (2), 141,0 (3), 36,7 (4), 76,2 (5), 40,6 (6), 13,5 (6-Me), 63,0 (7), 59,0 (8), 136,8 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13),

128.6 (12); B 170,9 (1), 53,6 (2), 35,1 (3), 129,9 (4),

129.6 (5), 120,0 (6), 150,4 (7), 116,4 (8), 129,2 (9);

C 175,6 (1), 38,3 (2), 14,1 (2-Me), 41,1 (3); D 170,8 (1),

71,3 (2), 39,4 (3), 24,6 (4), 21,3 (5), 22,9 (4-Me).

Kryptofycín 17 [a]_D +27,8' (CHC1₃, c = 0,37);

UV lambda_max(e) 248 (14 740), 268 (8100), 278 (3400), 284 (2840);

IR (in substancia) 3412, 2958, 1750, 1723, 1668, 1504,

1463, 1290, 1177, 751 cm^-1;

EIMS m/z (rel. intenzita) 624/626 (10/3), 398/400 (95/35), 284 (100), 149 (95);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 624,26161 (vyrátané pre ^C34^H41^C1N2°7^Z chyba).

NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,77 (2, d, 15,4),

6,67 (3, ddd, 15,4, 9,5 a 5,3), 2,37 (4, m), 4,99 (5, ddd,

11,2, 6,3 a 1,6), 2,54 (6, m), 1,14 (6-Me, d, 6,7), 6,01 (7, dd, 15,7 a 8,7), 6,41 (8, d, 15,9), 7,28 - 7,34

120 (10/11/13/14, m), 7,23 (12, m); 3-chlór-4-hydroxyfenylalanín (B) 4,82 (2, m), 5,63 (2-NH, d, 8,7), 3,12 (3, dd,

14,7 a 5,6), 3,03 (3', dd, 14,7 a 7,1), 7,18 (5, d, 2,0), 5,47 (7-OH, brs), 6,91 (8, d, 8,3), 7,02 (9, dd, 8,3 a 2,0); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,71 (2, m),

1,21 (2-Me, ď 6,9), 3,25 (3, m), 3,52 (3', m), 6,89 (3-NH, brt, 6,1); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,84 (2, dd, 9,6 a 3,1), 1,62 (3, m), 1,36 (3', m), 1,62 (4, m), 0,77 (5, ď 6,5), 0,73 (4-Me, d, 6,5) ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,4 (1), 125,3 (2), 141,3 (3), 36,5 (4), 77,1 (5), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,0 (7),

129,9 (8), 136,7 (9), 126,2 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12); B 170,9 (1), 53,5 (2), 35,1 (3), 129,6 (4), 131,9 (5), 126,2 (6), 150,3 (7), 116,3 (8), 127,6 (9); C 175,9 (1) , 38,4 (2), 13,9 (2-Me), 41,3 (3); D 170,9 (1), 71,6 (2) , 39,5 (3), 24,5 (4), 21,2 (5), 22,7 (4-Me)

Kryptofycín 18 [a]_D +54,9° (MeOH, c = 0,93);

UV lambda_max(e) 250 (20 518), 284 (3857);

IR (in substancia) V_max 3411, 3271, 2966, 1746, 1728, 1668, 1505, 1463, 1258, 1178 cm¹

EIMS m/z (rel. intenzita) 638/640 (5,4/1,1), 412/414 (59/19), 280 (17), 227 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 638,272934 (vyrátané pre C35H43CIN2O7, 2,9mmu chyba).

¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,76 (2, d, 15,5),

6,65 (3, ddd, 15,4, 9,2 a 6,2), 2,38 -2,47 (4, m), 5,08 (5, ddd, 10,6, 4,9 a 2,2), 2,58(6, m), 1,15 (6-Me, d,6,8), 6,07 (7, dd, 15,9 a 8,5), 6,43 (8, d, 15,9), 7,21 - 7,35 (10/11/12/13/14, m); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,83 (2, m), 3,05 (3, dd, 14,5 a 7,1), 5,65 (2-NH, d, 8,7), 3,14

121 (3, dd, 14,4 a 5,5), 7,21 (5, d, 2,4), 3,86 (7-OCH₃, s), 6,83 (8, d, 8,3), 7,08 (9, dd, 8,3 a 2,2); 3-amino-2metylpropiónová kyselina (C) 2,73 (2, m), 1,23 (2-Me, d,

7,2), 3,23 (3, dt, 13,5 a 6,8), 3,56 (3, ddd, 13,5, 5,7 a 4,0), 6,85 (3-NH, dd, 7,1 a 6,2); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,8 (2, d, 4,6), 1,86 - 1,89 (3, m), 0,94 (3-Me, d, 7,0), 1,20 - 1,26 (4, m), 1,39 - 1,44 (4, m), 0,77 (5, d, 7,4). ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,5 (1), 125,2 (2), 141,5 (3), 36,4 (4), 77,7 (5), 41,9 (6), 17,1 (6-Me), 129,8 (7), 131,9 (8), 136,8 (9), 128,6 (10/14), 126,2 (11/13), 127,6 (12); B 170,0 (1),

53,5 (2), 35,1 (3), 129,9 (4), 131,1 (5), 122,4 (6), 153,9 (7), 56,1 (7-OCH₃), 112,2 (8), 128,5 (9); C 175,3 (1), 38,6 (2) , 14,0 (2-Me), 41,4 (3); D 169,5 (1), 76,6 (2), 36,2 (3) , 15,5 (3-Me), 24,2 (4), 14,0 (5).

Kryptofycín 19 [a]_D +62,6' (MeOH, c = 0,67);

UV lambda_max(e) 204 (44 900), 230 (17 000), 248 (15 600), 280 (2500);

IR (in substancia) v_max 3413, 3272, 2966, 1745, 1726, 1672, 1504, 1258, 1199, 1178, 1066, 692 cm¹;

EIMS m/z (rel. intenzita) 624/626 (3,0/1,4), 398/400 (58/21), 280/282 (15/5), 227 (100), 195/197 (57/22); EIMS s vysokým rozlíšením m/z 624,2585 (vyrátané pre C34H41CIN2O7, l,8mmu chyba).

*·Η NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,76 (2, d, 15,2), 6,64 (3, ddd, 15,4, 9,1 a 6,2), 2,38 (4, m), 2,47 (4, m), 5,04 (5, ddd, 7,1, 5,1 a 1,8), 2,57 (6, m), 1,15 (6-Me, d,

6,9), 6,05 (7, dd, 15,8 a 8,5), 6,43 (8, d, 15,8), 7,29 -7,35 (10/11/13/14, m), 7,23 (12, m); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,84 (2, m), 5,67 (2-NH, d, 8,9), 3,04

122 (3, dd, 14,3 a 7,1), 3,14 (3, dd, 14,3 a 5,3), 7,22 (5, d, 2,0), 3,86 (7-OCH₃, s), 6,83 (8, d, 8,2), 7,08 (9, dd, 8,2 a 2,0); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,75 (2, m), 1,23 (2-Me, d, 7,1), 3,19 (3, m), 3,59 (3, m), 6,80 (3-NH, brt, 6,7); 2-hydroxyizovalérová kyselina (D) 4,73 (2, d,

4,2), 2,09 (3, m), 0,84 (4, d, 6,9 ), 0,95 (3-Me, d, 6,9). ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka 8 (poloha uhlíka) A 165,5 (1),

125,3 (2), 141,3 (3), 36,3 (4), 77,7 (5), 42,0 (6), 17,1 (6-Me), 129,9 (7), 131,9 (8), 136,8 (9), 126,1 (10/14),

128,6 (11/13), 127,6 (12); B 171,0 (1), 53,4 (2), 35,1 (3), 130 (4), 131,1 (5), 122,4 (6), 153,9 (7), 56,1 (7-OMe),

112,2 (8), 128,5 (9); C 17,1 (1), 38,7 (2), 13,9 (2-Me),

41,5 (3); D 169,6 (1), 76,9 (2), 29,8 (3), 19,0 (4), 16,7 (3-Me).

Kryptofycín 21 [a]_D +40,2* (CHC1₃, c = 0,72);

UV lambda_max(e) 240 (6700), 280 (2400), 288 (2100);

IR (in substancia) v_max 3403, 3279, 2957, 1731, 1673, 1503, 1464, 1409, 1372, 1258, 1174, 1065, 1023, 889 cm“¹;

EIMS m/z (rel. intenzita) 640/642 (10/4), 612 (5), 478 (15), 398 (40), 266 (33), 227 (76), 195 (95), 155 (100), 127 (90); EIMS s vysokým rozlíšením m/z 640,2550 (vyrátané pre ^C34^H41^C1N2°8· ⁰· ^2iranu chyba);

¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 7,8-epoxy-5-hydroxy6-metyl-8-fenyloktánová kyselina (A) 5,73 (2, d, 15,4),

6,68 (3, ddd, 15,0, 9,9 a 4,9), 2,45 (4, m), 2,56 (4, m),

5,19 (5, ddd, 11,2, 5,1 a 1,5), 1,80 (6, m), 1,14 (6-Me, d,

7,1), 2,92 (7, dd, 7,5 a 2,0), 3,68 (8, d, 1,8), 7,25 (10/14, m), 7,33 - 7,38 (11/12/13, m); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,74 (2, ddd, 8,2, 6,8 a 6,2), 5,68 (2-NH, d, 8,6),2,98 (3, dd, 14,3 a 7,7), 3,14 (3, dd, 14,3 a 5,6),

7,21 (5, d, 2,0), 3,86 (7-OMe, s), 6,83 (8, d, 8,4), 7,07

123 (9, dd, 8,4 a 2,0); 3-aminopropiónová kyselina (C) 2,56 (2, m), 3,51 (3, m), 3,45 (3, m), 6,90 (3-NH, brt, 58);

2- hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,89 (2, dd, 10,0 a 3,3), 1,67 (3, m), 1,31 (3, m), 1,67 (4, m), 0,84 (5, d,

6,4), 0,83 (4-Me, d, 6,4); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha Uhlíka) A 165,5 (1), 125,3 (2), 141,0 (3), 36,7 (4), 75,9 (R), 40,6 (6), 13,5 (6-Me), 63,0 (7), 59,0 (8),

136.7 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,5 (12);

B 170,7 (1), 53,9 (2), 35,0 (3), 129,8 (4), 130,9 (5),

122,4 (6), 153,9 (7), 56,1 (7-OMe), 112,2 (8), 128,3 (9); C 172,6 (1), 32,4 (2), 34,4 (3); D 170,5 (1), 71,2 (2),

39,5 (3), 24,4 (4), 22,8 (5), 21,2 (4-Me).

Kryptofycín 23 [a]_D +47’ (MeOH, c = 1,55);

UV lambda_max(e) 240 (4571), 282 (2174), 290 (2177);

IR (in substancia) v_max 3284, 2960, 1747, 1724, 1653, 1540, 1490, 1339, 1272, 1174 cm“¹

EIMS m/z (rel. intenzita) 674/675/678 (47/35/8), 432/434/436 (11/5/2), 299/301/303 (39/30/7), 277 (64), 215/217/219 (31/30/8), 141 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 674,21643 (vyrátané pre C₃₄H₄C1₂N₂O₈, -0,3mmu chyba);

¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 8-epoxy-5-hydroxy6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,77 (2, d, 15,4),

6,65 (3, ddd, 15,4, 9,3 a 6,0), 2,47 (4, dt, 14,2 a 10,2),

2,55 (4, brdd, 14,2 a 5,6), 5,13 (5, ddd, 11,0, 4,6 a 1,6), 1,81 (6, m), 1,15 (6-Me, d, 6,9), 2,93 (7, dd, 7,6 a 2,0),

3.7 (8, d, 2,0), 7,22 - 7,26 (10/14, m), 7,32 - 7,39 (11/12/13, m); 3,5-dichlór-4-hydroxyfenylalanín (B) 4,81 (2, m), 5,69 (2-NH, d, 8,6), 3,11 (3, dd, 14,5 a 5,6), 3,50 (3, dd, 14,3 a 7,0), 7,13 (5/9, s), 5,78 (7-OH, s);

3- amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,73 (2, m), 1,22

124 (2-Me, d, 7,1), 3,19 (3, dt, 13,4 a 6,9), 3,58 (3, ddd,

13,6, 5,8 a 4,1), 6,82 (3-NH, brt, 5,9); 2-hydroxy-4metylpentánová kyselina (D) 4,84 (2, dd, 9,9 a 3,2), 1,38(3, m), 1,68 - 1,75(3, m), 1,68 -1,75 (4, m), 0,86 (4-Me, d, 6,7), 0,87 (5, d, 6,7) ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,4 (1), 125,4 (2), 140,9 (3), 36,7 (4), 76,3 (5), 40,6 (6), 13,5 (6-Me), 63,0 (7), 58,9 (8),

136,7 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,6 (12);

B 170,7 (1), 53,3 (2), 35,0 (3), 130,3 (4), 129,0 (5/9), 121,0 (6/8), 146,7 (7); C 175,3 (1), 38,4 (2), 13,9 (2-Me),

41,5 (3); D 170,8 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,6 (4), 21,3 (4-Me), 22,9 (5).

Kryptofycín 24

[a]_D +48,8’ (CHC1₃, C = 0,63);

UV lambda_max(e) 228 (19 006), 242 (8249), 274 (2351);

IR (in substancia) v_max 3400, 3284, 2959, 1732, 168, 1652, 1514, 1248, 1178 cm“¹;

EIMS m/z (rel. intenzita, priradenie) 606 (2, M⁺), 364 (7), 161 (55, CH3O-CgH4-CH=CH-CO⁺), 121 (100, CH3O-CgH₄-CH₂ ⁺), 91 (68);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 606,2954 (vyrátané pre ^C34^H42^N2°8' ”l/3mmu chyba);

·*·Η NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 7,8-epoxy-5-hydroxy6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,70 (2, dd, 15,2 a 1,3), 6,70 (3, ddd, 15,2, 10,3 a 4,7), 2,43 (4, dt, 14,3 a 10,9), 2,56 (4, m), 5,20 (5, ddd, 11,3, 5,1 a 2,0), 1,79 (6, m), 1,14 (6-Me, d, 7,0), 2,912 (7, dd, 7,5 a 2,0), 3,68 (8, d, 2,0), 7,23 - 7,38 (10/11/12/13/14, m); O-metyltyrozín (B) 4,73 (2, m), 5,58 (2-NH, d, 8,3), 3,03 (3, dd,

14,5 a 7,5), 3,14 (3, dd, 14,5 a 5,7), 7,11 (5/9, d, 8,6), 6,81 (6/8, d, 8,6), 3,78 (7-OMe, s); 3-aminopropiónová kyselina (C) 2,55 (2-H₂, m), 3,42 (3, m), 3,53 (3, m), 6,97

125 (3-NH, brt, 5,7); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,89 (2, dd, 9,9 a 3,5), 1,29 (3, m), 1,62 - 1,70 (3/4, m), 0,83 (5, d, 5,9), 0,84 (4-Me, d, 6,1) ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,4 (1), 125,3 (2), 141,0 (3) , 36,7 (4), 75,9 (5), 40,6 (6), 13,4 (6-Me), 63,0 (7), 59,0 (8), 136,7 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,5 (12); B 170,7 alebo 170,6 (1), 54,1 (2), 35,2 (3), 128,5 (4) , 130,2 (5/9), 114,1 (6/8), 158,6 (7), 55,2 (7-OMe);

C 172,8 (1), 32,5 (2), 34,2 (3); D 170,6 alebo 170,7 (1),

71,2 (2), 239,5 (3), 24,4 (4), 21,3 (5), 22,8 (4-Me).

Kryptofycín 26 [a]_D +28,2° (CHC1₃, c = 1,31);

UV lambda_max(e) 254 (14 615), 284 (2949);

IR (in substancia) V_TOay 3299, 2960, 1732, 1644, 1504, 1258, 1209 cm^-1;

EIMS m/z (rel. intenzita) 656/658 (0,5/0,l,M⁺), 638/640 (1,7/1,0), 525/527 (3,7/1,8), 412/414 (10/4), 280/282 (12/11), 227 (20), 195 (48), 131 (68);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 656,2836 (vyrátané pre ^C35^H45^C1N2°8' 2,8mmu chyba), 638,2712 (vyrátané pre ^C35^H43^C1N2°7» ⁴'^7mmu chyba);

·*·Η NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 3,5-dihydroxy-6metyl-8-fenyl-7-okténová kyselina (A) 2,46 (2, dd, 14,8 a 7,8), 2,58 (2, dd, 14,8 a 3,0), 5,46 (3, m), 1,86 -1,90 (4-H₂, m), 3,61 (5, m), 2,37 (6, m), 1,14 (6-Me, d, 6,8), 6,06 (7, dd, 16 a 8,7), 6,47 (8, d, 16), 7,37 (1014, brd,

7,9), 7,32 (11/13, brt, 7,6), 7,22 - 7,2a8 (12, m) ; 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,73 (2, brdt, 6,4 a 8,1),

6,14 (2-NH, d, 8,6), 2,84 (3, dd, 14,4 a 8), 3,18 (3, dd,

14,4 a 6,3), 7,21 (5, d, 2,2), 3,85 (7-OMe, s), 6,82 (8, d,

8,6), 7,08 (9, dd, 8,6 a 2,2); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,87 (2, m), 1,19 (2-Me, d, 7,0), 3,01 (3, ddd,

126

13,4, 10,6 a 4,9), 3,73 (3, ddd, 13,4, 8,2 a 4,7), 6,72 (3-NH, brdd, 7,3 a 5,2); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,95 (2, dd, 9,7 a 4,2), 1,62 - 1,72 (3, m),

1,79 - 1,84 (3, m), 1,62 - 1,72 (4, m), 0,90 (4-Me, d,

6,4), 0,95 (5, d, 6,4). ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha Uhlíka) A 170,0 (1), 41,5 (2), 71,4 (3), 37,3 (4), 71,9 alebo

71.8 (5), 43,6 (6), 16,6 (6-Me), 130,8 (7), 132,5 (8),

136.8 (9), 126,2 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12);

B 170,9 (1), 53,2 (2), 34,7 (3), 130,3 (4), 131,1 (5),

122,2 (6), 153,8 (7), 56,1 (7-OMe), 112,2 (8), 128,5 (9);

C 174,3 (1), 40,1 (2), 14,4 (2-Me), 42,5 (3); D 170,7 (1),

71.8 alebo 71,9 (2),38,9 (3), 24,6 (4), 21,6 (4-Me), 22,9 (5).

Kryptofycín 28 [a]_D +65,6° (MeOH, C = 0,93); UV laitibda_max(e) 204 (48 000), 2780 (3400);

IR (in substancia) v_max 3413, 1504, 1258, 1197, 1175, 1066, EIMS m/z (rel.

intenzita) 624/626 (3,0/1,3)

230 (19 300), 248 (18 700),

3270, 2958, 1745, 1726, 1665, 694 cm“¹;

412/414

(70/24), 280/282 (13/6), 213 (100), 195/197 (86/40); EIMS s vysokým rozlíšením m/z 624,2626 (vyrátané pre ^C34^H41^C1N2°7' 2,4mmu chyba);

^H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka 6 (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-8-fenyl2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,78 (2, d, 15,6), 6,71 (s, ddd, 15,6, 9,9 a 5,4), 2,40(4, m), 2,53 (4, m), 5,17 (5, m),

2,53 (6-H₂, brt, 6,7), 6,07 (7, dt, 15,8 a 7,4), 6,44 (8, d,

15,8), 7,27 - 7,38(10/11/13/14, m), 7,22 (12, m);

3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,82 (2, m), 5,72 (2-NH, d,

8,5), 3,04 (3, dd, 14,5 a 7,2), 3,14 (3, dd, 14,5 a 5,4),

7,22 (5, d, 2,0), 3,87 (7-OMe, s), 6,84 (8, d, 8,5), 7,08 (9, dd, 8,5 a 2,0); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C)

127

2,72 (2, m), 1,21 (2-Me, d, 7,2), 3,29 (3, dt, 13,5 a 7,0),

3,49 (3, ddd, 13,5, 4,9 ía 3,8), 6,97 (3-NH, brt, 5,6); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,82 (2, m), 1,40 (3, m), 1,62 (3, m), 1,62 (4, m), 0,76 (4-Me, d, 6,3), 0,74 (5, d, 6,3); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,4 (1), 125,2 (2), 141,2 (3), 38,5 (4), 73,5 (5), 38,6 (6), 124,1 (7), 133,8 (8), 136,7 (9), 126,1 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12); B 170,9 (1), 53,6 (2), 35,1 (3), 129,8 (4), 131,0 (5), 122,4 (6), 154,0 (7), 56,1 (7-OMe), 112,3 (8), 128,4 (9); C 175,6 (1), 38,3 (2), 14,0 (2-Me), 41,2 (3), D 170,9 (1), 71,6 (2), 39,6 (3), 24,5 (4), 21,5 (4-Me), 22,6 (5).

Kryptofycín 29 [a]_D +22,2’ (CHC1₃, c = 1,13) UV lambda_max(e) 250 (17 000), IR (in substancia) v_max 3415, 1504, 1259, 1197, 1174, 1067,

284 (3300);

3272, 2960, 1744, 1734, 1674,

694 cm“¹;

EIMS m/z (rel. intenzita) 624/626 (2,6/1,1), 398/400 (44/15), 227 (100), 195/197 (50/16), 155/157 (59/20), 131 (63), 91 (95);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 624,2607 (vyrátané pre C34H41CIN2O7, delta = -0,5mmu chyba);

¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,75 (2, dd, 15,3 a 1,1), 6,69 (3, ddd, 15,3, 10,1 a 5,3), 2,36 (4, m), 2,54 (4, m), 5,03 (6, ddd, 11,0, 6,4 a 1,8), 2,56 (6, m), 1,14 (6-Me, d, 6,8), 6,01 (7, dd, 15,8 a 8,8), 6,41 (8, d,

15,8), 7,28 -7,33 (10/11/13/14, m), 7,22 (12, m); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,76 (2, m), 5,67 (2-NH, d,

8,6), 3,0 (3, dd, 14,4 a 10,2), 3,14 (3, dd, 14,4 a 5,9),

7,22 (5, d, 2,2), 3,87 (7-OMe, s), 6,83 (8, d, 8,4), 7,08 (9, dd, 8,4 a 2,2); 3-aminopropiónová kyselina (C) 2,55

128 (2-Η₂, m), 3,44 (3, m), 3,55 (3, m), 6,89 (3-NH, brt, 5,7);

2- hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,90 (2, dd, 9,9 a 3,5), 1,34 (3, ddd, 15,4, 10,3 a 3,5), 1,63 (3, m), 1,63 (4, m), 0,76 (4-Me, d, 6,4), 0,72 (5, d, 6,4); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,6 (1), 125,2 (2),

141.5 (3), 36,4 (4), 77,1 (5), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,1 (7), 131,8 (8), 136,7 (9), 126,2 (10/14), 128,6 (11/13),

127.6 (12); B 170,9 (1), 53,8 (2), 34,9 (3), 129,9 (4), 131,0 (5), 122,4 (6), 153,9 (7), 56,1 (7-OMe), 112,2 (8),

128,4 (9); C 172,6 (1), 32,4 (2), 34,5 (3); D 170,4 (1),

71,5 (2), 39,7 (3), 24,4 (4), 21,2 (4-Me), 22,6 (5).

Kryptofycín 30 [a]_D -12,3 (CHC1₃, c = 1,53);

UV lambda_max(e) 254 (17 200), 284 (3600);

IR (in substancia) v_max 3414, 3306, 2961, 1738, 1729, 1660, 1504, 1258, 1205, 1183, 1066, 695 cm¹;

EIMS m/z (rel. intenzita) 656/658 (1,0/0,3), 638/640 (3,0/1,0), 525/527 (3,8/1,3), 412/414 (10,5/3,6), 280/282 (10,3/3,8), 227 (29), 195/197 (48/17), 155(157 (74/21), 131 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 656,2852 (vyrátané pre C₃₅H₄₅C1N₂O₈, l,3mmu chyba);

^-H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 3,5-dihydroxy-6metyl-8-fenyl-7-okténová kyselina (A) 2,25 (2, dd, 16,0 a 9,6), 2,64 (2, brd, 16,0), 3,89 (3, m), 2,51 (3-OH, d,

6,4), 1,77 (4, ddd, 14,3, 9,8 a 2,1), 1,88 (4, ddd, 14,3,

11,3 a 3,8), 4,88 (5, ddd, 11,3, 6,2 a 2,1), 2,53 (6, m), 1,10 (6-Me, d, 6,8), 5,99 (7, dd, 15,9 a 9,0), 6,40 (8, d,

15,9), 7,28 - 7,33 (10/11/13/14, m), 7,23 (12, m);

3- chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,60 (2, m), 6,61 (2-NH, d,

8,1), 3,09 (3, dd, 14,2 a 5,6), 3,15 (3, dd, 14,2 a 7,3),

7,22 (5, d, 2,1), 3,86 (7-OMe, s), 6,83 (8, d, 8,3), 7,07

129 (9, dd, 8,3 a 2,1); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,67 (2, m), 1,21 (2-Me, d, 7,3), 3,26 (3, ddd, 13,6, 7,3 a 6,4), 3,63 (3, ddd, 13,6, 6,2 a 3,9), 6,75(3-NH, brt,

6,3); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,83 (2, dd,

9,6, 4,1), 1,42 (3, m), 1,64 (3, m), 1,64 (4, m), 0,79 (4-Me, d, 6,4), 0,76 (5, d, 6,4); ¹³C NMR (CDCl-j): jednotka δ (poloha uhlíka) A 171,6 (1), 42,4 (2), 66,0 (3), 41,3 (4), 76,0 (5), 42,0 (6), 17,3 (6-Me), 130,0 (7), 131,9 (8),

136,7 (9), 126,1 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12);

B 170,8 (1), 54,3 (2), 35,1 (3), 130,1 (4), 131,1 (5),

122,2 (6), 153,8 (7), 56,1 (7-OMe), 112,1 (8), 128,7 (9); C 175,6 (1), 39,7 (2), 13,8 (2-Me), 41,5 (3); D 171,9 (1),

72,1 (2), 39,1 (3), 24,6 (4), 21,4 (4-Me), 22,7 (5).

Kryptofycín 31 [a]_D +56,6’ (MeOH, c = 1,13);

UV lambda_max(e) 242 (3800), 284 (700);

IR (in substancia) V_max 3412, 3272, 2961, 1745, 1725, 1678, 1537, 1481, 1270, 1196, 1176, 1000, 698 cm¹;

EIMS m/z (rel. intenzita) 688/690/692 (1,2/1,0/0,4), 446/448/450 (7,9/6,7/3,1), 314/316/318 (17/11/3), 91 (100); EIMS s vysokým rozlíšením m/z 688,2336 (vyrátané pre ^C35^H42^C^2^N2°8' “lr8mmu chyba);

³H NMR (CDCI3): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 7,8-epoxy-5-hydroxy6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,78 (2, d, 15,5),

6,66 (3, ddd, 15,5, 9,4 a 6,0), 2,47 (4, ddd, 14,1, 10,8 a 9,4), 2,56 (4, m), 5,14 (5, ddd, 10,8, 4,7 a 1,7), 1,82 (6, m), 1,15 (6-Me, d, 7,1), 2,93 (7, dd, 7,5 a 1,9), 3,70 (8, d, 1,9 ), 7,24 - 7,26 (10/14, m), 7,34 - 7,39 (11/12/13, m); 2,5-dichlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,83 (2, m), 5,65 (2-NH, d, 9,0), 3,0 (3, dd, 14,4 a 7,3), 3,14 (3, dd, 14,4 a 5,6),7,16 (5/9, s),3,87 (7-0me, s); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,74 (2, m), 1,22

130 (2-Me, d, 7,1), 3,20 (3, m), 3,58 (3, ddd, 13,5, 5,6 a 4,1), 6,82 (3-NH, brt, 5,6); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,83 (2, m), 1,38 (3, m), 1,72 (3, m), 1,72 (4, m), 0,87 (4-Me, d, 6,8), 0,86 (5, d, 6,8); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,4 (1), 125,4 (2), 141,0 (3), 36,7 (4), 76,3 (5), 40,6 (6), 13,5 (6-Me), 63,0 (7), 58,9 (8), 136,7 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13),

128.6 (12); B 170,8 (1), 53,3 (2), 35,2 (3), 129,3 (4),

129.6 (5/9), 134,5 (6/8), 151,2 (7), 60,6 (7-OMe); C 175,3 (1) , 38,3 (2), 13,9 (2-CH₃), 41,5 (3); D 170,6 (1), 71,3 (2) , 39,4 (3), 24,6 (4), 22,9 (4-Me), 21,3 (5).

Kryptofycín 40 [a]_D +41,6° (CHC1₃, c = 0,31);

UV lambda_max(e) 242 (4974), 266 (3911), 274 (3666), 286 (2359), 328 (511);

IR (in substancia) V'_max 3415, 2959, 1748, 1723, 1667, 1505, 1463, 1289, 1176 cm^-1;

EIMS m/z (rel. intenzita) 640/642 (5/2), 280/282 (7/3), 213 (13), 195/197 (51/17), 155 (29), 141 (32), 121 (28), 91 (100, 69 (47);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 640,2570 (vyrátané pre ^C34^H41^C1N2°8' ~l,8™nu chyba);

³H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 7,8-epoxy-5-hydroxy8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,77 (2, d, 15,1), 6,72 (3, ddd, 15,1, 9,7 a 4,9), 2,42 (4, m), 2,58 (4, m), 5,33 (5, m), 1,89 (6, ddd, 12,9, 8,1 a 5,0), 2,13 (6, ddd, 12,9, 9,3 a 5,0), 2,98 (7, ddd, 6,7, 4,5 a 1,9), 3,64 (8, d, 1,9),

7,31 - 7,39 (10/11/13/24, m), 7,22 (12, m); 3-chlór-4metoxyfenylalanín (B) 4,83 (2, m), 5,64 (2-NH, d, 8,6), 3,03 (3, dd, 14,3 a 7,5), 3,14 (3, dd, 14,3 a 5,4), 7,21 (5, d, 2,0), 3,87 (7-OMe, s), 6,84 (8, d, 8,3)), 7,08 (9, dd, 8,3 a 2,0); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C)

131

2,72 (2, m), 1,23 (2-Me, d, 7,3), 3,31 (3, dt, 13,8 a 6,9),

3,50 (3, ddd, 13,6, 5,7 a 3,9), 6,96 (3-NH, brt, 6,0); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,85 (2, dd, 6,7,

3,4), 1,42 (3, m), 1,72 (3, m), 1,72 (4, m), 0,86 (4-Me, d,

3,7), 0,87 (5, d, 3,7); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,3 (1), 125,2 (2), 140,9 (3), 39,0 (4), 72,0 (5), 37,3 (6), 59,0 (7), 58,7 (8), 140,9 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,5 (12); B 170,9 (1), 53,6 (2),

35,1 (3), 129,8 (4), 131,0 (5), 122,5 (6), 157,0 (7), 56,1 (7-OMe), 111,2 (8), 128,4 (9); C 175, 6 (1), 38,3 (2), 14,1 (2-Me), 41,1 (3); D 170,9 (1), 71,4 (2), 39,4 (3), 24,5 (4), 21,5 (4-Me), 22,8 (5).

Kryptofycín 43 [a]_D +20’ (CHC1₃, c = 0,2);

UV lambda_max(e) 250 (20 512), 282 (4083), 294 (1734);

IR (in substancia) v_max 3400, 3272, 2927, 1727, 1660, 1516, 1455, 1242, 1175 cm¹;

EIMS m/z (rel. intenzita) 533 (24), 484 (3), 445 (14), 398 (9), 365 (29, 227 (59), 149 (67, 91 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 590,3044 (vyrátané pre ^C34^H41^N2°7' ^-5/^2nunu chyba);

¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,75 (2, d, 15,3), 6,6A9 (3, ddd, 15,3, 9,9 a 5,3), 2,37 (4, dt, 14,2 a 10,4), 2,52 (4, m), 5,01 (5, ddd, 11,2, 6,4 a 1,8 ), 2,55 (6, m), 1,13 (6-Me, d, 6,9), 6,01 (7, dd, 15,8 a 8,9), 6,41 (8, d,

15,8 ), 7,21 - 7,34 (10/11/12/13/14, m); 4-metoxyfenylalanín (B) 4,80 (2, m), 5,64 (2-NH, d, 8,4), 3,06 (3, dd,

14,5 a 7,2), 3,13 (3, dd, 14,4 a 5,3), 7,06 (5/9, d, 8,4),

6,74 (6/8, d, 8,4); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C)

2,69 (2, m), 1,22 (2-Me, d, 7,3), 3,33 (3, m), 3,44 (3, dt, 14,0 a 4,7), 7,0 (3-NH, m); 2-hydroxy-4-metylpentánová

132 kyselina (D) 4,84 (2, dd, 10,0 a 3,6), 1,60 - 1,67 (3, m), 1,35 (3, m) 1,60 - 1,67 (4, m), 0,76 (5, d, 6,4),0,73 (4-Me, d,6,7); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 125,2 (2), 141,5 (3), 36,5 (4), 77,5 (5), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,1 (7), 131,8 (8), 136,8 (9), 126,2 (10/14),

128,6 (11/13), 127,6 (12); B 53,8 (2), 35,3 (3), 129,8 (4),

130,5 (5/9), 115,6 (6/8), 154,6 (7); C 38,3 (2), 14,1 (2-Me), 41,0 (3); D 71,6 (2), 39,6 (3), 24,5 (4), 21,2 (5),

22,9 (4-Me). S ohladom na malú veíkosť vzorky nebolo možné signály karbonylového uhlíka pozorovať.

Kryptofycín 45 [a]_D +72,0° (MeOH, c = 0,12);

UV lambda_max(e) 250 (25 500), 284 (5300);

IR (in substancia) V_max 3407, 3239, 2958, 1743, 1727, 1667, 1538, 1469, 1242, 1196, 1177, 694 cm^-1;

EIMS m/z (rel. intenzita) 658/660/662 (2,1/1,4/0,3), 483 (7,6), 432/434/436 (9,5/6,4/1,8), 300/302/304 (8,0/5,5/1,2), 227 (100), 91 (87);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 658,2207 (vyrátané pre ^c34^H40^cl2^N2°7' 0/6mmu chyba);

*Ή NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,80 (2, d, 14,7),

6,66 (3, ddd, 14,7, 8,5 a 5,5), 2,38 (4, m), 2,53 (4, m),

4,97 (5, brdd, 10,4 a 6,2), 2,57 (6, m), 1,14 (6-Me, d,

6,7), 6,01 (7, dd, 15,9 a 8,7), 6,42 (8, d, 15,9), 7,28 -7,34 (10/11/13/14, m), 7,22 (12, m); 3,5-dichlór-4hydroxyfenylalanín (B) 4,82 (2, m), 5,73 (2-NH, brd, 8,7), 3,02 (3, dd, 14,3 a 6,2), 3,10 (3, dd, 14,3 a 5,2), 7,14 (5/9, s), 5,79 (7-OH, s); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,73 (2, m), 1,21 (2-Me, d, 7,0), 3,17 (3, m),

3,60 (3, m), 6,81 (3-NH, brt, 6,7); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,84 (2, dd, 10,0 a 3,2), 1,38 (3,

133 ddd, 14,9, 10,2 a 3,2), 1,65 (3, m), 1,65 (4, m), 0,78 (4-Me, d, 6,5), 0,7 (5, d, 6,5); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 165,5 (1), 125,4 (2), 141,2 (3), 36,4 (4), 77,6 (5), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,0 (7), 131,9 (8),

136,7 (9), 126,2 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12);

B 171,0 (1), 53,2 (2), 35,0 (3), 130,4 (4), 129,1 (5/9), 121,0 (6/8), 146,7 (7); C 175,2 (1), 38,5 (2), 13,9 (2-Me),

41,6 (3); D 170,7 (1), 71,5 (2), 39,5 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).

Kryptofycín 49

[a]_D +68,1° (MeOH, c = 0,075);

UV lambda_max(e) 246 (25 500), 284 (5200);

IR (in substancia) V_max 3401, 3282, 2962, 1744, 1728, 1668, 1540, 1505, 1464, 1258, 1198, 1177, 1066, 694 cm¹;

EIMS m/z (rel. intenzita) 624/626 (0,8/0,3), 398/400 (43/14), 227 (78), 195/197 (58/26), 91 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 624,2650 (vyrátané pre ^C34^H41^C1N2°7' “4,8mmu chyba);

•’-H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,77 (2, d, 14,1), 6,6A7 (3, m), 2,38 (4, m),2,50 (4, m), 5,01 (5, m), 2,56 (6, m), 1,13 (6-Me, d, 6,5), 6,03 (7, dd, 15,8 a 8,6), 6,42 (8, d, 15,8), 7,29 - 7,35 (10/11/13/14, m), 7,23 (12, m);

3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,82 (2 m), 3,06 6,83 (8, kyselina

3,53 (3,

4,81 (2, (4-H₂, m), (3, m), (C) m), dd,

0,74 (5, , m), 5,64 (2-NH, 3,13 (3, m), 7,22 (5, m), 3,87 (7-OMe, (9, m); 3-amino-2-metylpropiónová (2, m), 1,22 (2-Me, d, 6,7), 3,26 (3, (3-NH, m); 2-hydroxyvalérová kyselina m), 1,68 (3, m), 1,33

s),

m), (D)

m),

7,08

2,72

6,90

8,8 a 3,9), 1,63 (3, t, 7,3).

134

Kryptofycín 50 [а] _D +32,0’ (CHC1₃, c = 0,44);

UV lambda_max(e) 242 (4933), 262 (3996), 274 (3719), 286 (2430), 332 (359);

IR (in substancia) v_max 3412, 3274, 2958, 1752, 1724, 1676, 1648, 1503, 1465, 1258, 1177, 1066, 753;

EIMS m/z (rel. intenzita) 640/642 (4/2), 398/400 (11/4), 280/282 (10/3), 227 (17), 195/197 (57/18), 157 (20), 141 (31), 91 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 640,2531 (vyrátané pre ^C34^H41^C1N2°8' 2,lmmu chyba);

^H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka 8 (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 7,8-epoxy-5-hydroxy6-metyl-8-fenyloktánová kyselina (A) 5,73 (2, d, 15,7),

6,67 (3, ddd, 15,7, 9,7 a 5,4), 2,45 (4, m), 2,55 (4, m), 5,13 (5, ddd, 11,2, 5,0 a 1,7), 1,78 (6, m), 1,15 (6-Me, d,

6,9), 2,91 (7, dd, 7,5 a 1,9), 3,68 (8, d, 1,7), 7,25 (10/14, m), 7,33 - 7,38 (11/12/13, m); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,80 (2, ddd, 8,3, 7,1 a 5,4), 5,61 (2-NH, d, 8,3), 3,03 (3, dd, 14,4 a 7,3), 3,13 (3, dd, 14,4 a 5,6), 7,21 (5, d, 1,9), 3,87 (7-OMe, s), 6,83 (8, d,

8,4), 7,07 (9, dd, 8,4 a 2,2); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,71 (2, m), 1,22 (2-Me, d, 7,3), 3,29 (3, dt,

13,6 a 6,9), 3,49 (3, ddd, 13,6, 6,7 a 5,0), 6,92 (3-NH, brt, 6,7); 2-hydroxypentánová kyselina (D) 4,75 (2, dd, 9,2 a 3,7), 1,55 (3, m), 1,65 (3, m), 1,33 (4-H₂, m), 0,84 (5, t, 7,3); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka S (poloha uhlíka) A 165,3 (1), 125,3 (2), 141,0 (3), 36,9 (4), 76,3 (5), 40,8 (б) , 13,6 (6-Me), 63,2 (7), 59,1 (8), 136,8 (9), 125,5 (10/14), 128,7 (11/13), 128,5 (12); B 170,9 (1), 53,6 (2),

35,2 (3), 129,8 (4), 131,0 (5), 122,5 (6), 154,0 (7), 56,1 (7-OMe), 112,3 (8), 128,5 (9); C 175,6 (1), 38,4 (2), 14,1 (2-Me), 41,2 (3); D 170,4 (1), 72,4 (2), 32,7 (3), 18,4 (4), 13,5 (5).

135

Kryptofycín 54

EIMS m/z (rel. intenzita) 654/656 (17/10), 493 (5), 411/413 (12/4), 280 (16), 227 (25), 195/197 (45/25), 141 (30), 91 (100);

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 654,2686 (vyrátané pre C₃₅H₄₃C1N₂O₈, 2,2mmu chyba);

¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) (A) 5,73 (2, d, 15,4), 6,66 (3, ddd, 15,4, 9,7, 5,7), 2,46 (4, m), 2,53 (4, m), 5,16 (5, ddd, 11,0, 4,2, 1,7), 1,79 (6, m), 1,14 (6-Me, d,

6,8), 2,89 (7, dd, 7,4, 1,8), 3,69(8, d, 1,9), 7,25 (10/14, m), 7,30 - 7,38(11/12/13, m); B 4,81 (2, m), 5,63 (2-NH, d,

8,6), 3,03 (3, dd, 14,5, 7,3), 3,13 (3, dd, 14,5, 5,5), 7,21 (5, d, 2,2), 3,87 (7-OMe, s),6,83 (8, d, 8,4), 7,07 (9, dd,

8,4, 2,2); (C) 2,73 (2, m), 1,22 (2-Me, d 7,3), 3,26 (3, ddd, 13,4, 6,8, 6,8), 3,51 (3, ddd, 13,4, 6,8, 5,3), 6,88 (3-NH, brt, 6,8); (D) 4,73 (2, d, 4,2), 1,78 - 1,82 (3, m), 0,92 (3-Me, d, 6,8), 1,36 - 1,41 (4, m), 1,18 -1,20 (4, m), 0,80 (5, t, 7,5); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha Uhlíka) A 165,3 (1), 125,4 (2), 141,0 (3), 36,6 (4), 76,3 (5),40,6 (6), 13,2 (6-Me), 63,1 (7), 58,7 (8), 136,7 (9), 135,4 (10/14), 128,6 (11/13), 128,5 (12); B 170,9 (1), 53,5 (2),35,0 (3), 129,8 (4), 131,0 (5), 125,2 (6), 153,9 (7),

56,1 (7-OMe), 112,2 (8), 128,4 (9); C 175,4 (1), 38,5 (2), 14,0 (2-Me), 41,3 (3); D 169,4 (1), 76,5 (2), 36,1 (3),

15,6 (3-Me), 24,0 (4), 11,2 (5).

Príklad 6

Syntéza kryptofycínových derivátov Kryptofycín 8

K roztoku 3,8 mg kryptofycínu 1 v 1,5 ml zmesi

1,2-dimetoxyetánu a vody v pomere 2 : 1 sa pridá 9 μΐ IM

136

kyseliny chlorovodíkovej. Vzniknutý roztok sa 4 hodiny mieša pri teplote miestnosti, neutralizuje uhličitanom draselným a odparí. Zvyšok sa rozdelí medzi vodu a dichlórmetán. Látka rozpustná v dichlórmetáne sa prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami, čím sa získa 3,3 mg čistého kryptofycínu 8.

EIMS m/z (rel. intenzita) 690/692/694 (0,8/0,5/0,2). EIMS s vysokým rozlíšením m/z 690,2533 (vyrátané pre ^C35^H44^C12^N2°8' ^_5f^8mmu chyba).

¹H NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 8-chlór-5,7-dihydroxy- 6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,79 (2, d, 15,4), 6,69 (3, ddd, 15,4, 9,7 a 5,6), 2,68 (4, ddt, 14,0, 5,5 a 1,8), 2,38(4, m), 5,11 (5, ddd, 10,8,

8.6 a 1,8), 2,51 (6, m), 1,05 (6-Me, d, 7,0), 4,01 (7, dd,

9.6 a 1,9), 4,65 (8, d, 9,6), 7,36 - 7,41 (10/11/12/13/14, m); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,92 (2, dd,

10,1 a 3,5), 1,76 (3/4, m), 1,45 (3, m), 0,94 (5, d, 6,6), 0,94 (4-Me, d, 6,4); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C)

2,73 (2, m), 1,22 (2-Me, d, 7,2), 3,25 (3, ddd, 13,6, 6,8 a 6,1), 3,54 (3, ddd, 13,5, 6,1 a 3,4), 6,91 (3-NH, brt,

6,1); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B)) 4,82 (2, ddd, 8,8,

7,2 a 5,6), 5,64 (2-NH, d, 8,8), 3,03 (3, dd, 15,4 a 7,2), 3,16 (3, dd, 15,4 a 5,6), 7,23 (5, d, 2,2), 3,88 (7-OCH₃, s), 6,86 (8, d, 8,5), 7,09 (9, dd, 8,5 a 2,2)

Kryptofycín 9

K roztoku 10 mg kryptofycínu 1 v 1 ml suchého metanolu sa pridá 10 μΐ metanolického chlorovodíka (ktorý sa získa reakciou 1,25 g tionylchloridu s 25 ml metanolu).

Reakčná zmes sa 4 hodiny mieša a potom sa z nej pri zníženom tlaku odstráni rozpúšťadlo. Vzorka sa nechá stáť 12 hodín pod vákuom. Vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s reverznými fázami sa získa 8 mg čistého kryptofycínu 9.

137 ^ΧΗ NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka 8 (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz): 5,7-dihydroxy-8metoxy-6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,76 (2, d,

15.5) , 6,67 (3, ddd, 15,5, 9,5 a 5,6), 2,34 (4, ddd, 14,1,

11,1 a 9,5), 2,62 (4, dddd, 14,1, 5,6, 1,8 a 1,5), 5,09 (5, ddd, 11,1, 7,8 a 1,8), 2,24 (6, dqd, 7,8,7,0 a 2,2), 1,03 (6-Me, d, 7,0), 3,71 (7, dd, 8,3 a 2,2), 4,03 (8, d, 8,3),

3,20 (8-OCH₃, s), 7,31 - 7,40 (10/11/12/13/14, m);

2- hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,86 (2, dd, 9,8 a

3.5) , 1,71 (3/4, m), 1,41 (3, m), 0,89 (5/4-Me, d, 6,4);

3- amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,71 (2, ddq, 6,8,

3,9 a 7,2), 1,21 (2-Me, d, 7,2), 3,23 (3, ddd, 13,5, 6,8 a 6,0), 3,52 (3, ddd, 13,5, 6,0 a 3,9), 6,90 (3-NH, brt, 6,0); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,82 (2, ddd, 8,8, 7,4 a

5,7), 5,66 (2-NH, d, 8,8), 3,02 (3, dd, 14,4, 7,4), 3,15 (3, dd, 14,4 a 5,5), 7,23 (5, d, 2,2), 3,87 (7-OCH₃, s), 6,84 (8, d, 8,5), 7,08 (9, dd, 8,5 a 2,2).

Kryptofycín 10

K miešanému roztoku 7 mg kryptofycínu 9 v 1 ml acetónu a 0,3 ml vody sa pridá 8 μΐ 2M hydroxidu sodného. Vzniknutý roztok sa 4 hodiny mieša, potom IM kyselinou chlorovodíkovou neutralizuje na pH 7 a pri zníženom tlaku sa z nej odstráni rozpúšťadlo. Zvyšok sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii s reverznými fázami pri použití zmesi metanolu a vody v pomere 7:3, ako elučného činidla. Získa sa čistý kryptofycín 10 (5 mg).

^H NMR (CD₃OD): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka 8 (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz): 5,7-dihydroxy-8metoxy-6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 5,99 (2, dt, 15,4 a 1,3), 6,82 (3, dt, 15,4 a 7,3), 2,30 (4, m), 2,50 (4, m), 3,66 (5, td, 7,8 a 3,5), 2,05 (6, d peňtet, 1,8 a 7,0), 0,96 (6-Me, d, 7,0), 4,04 (7, dd, 8,8 a 2,0), 4,01 (8, d, 8,8), 3,12 (8-OCH₃, s), 7,26 - 7,36 (10/11/12/13/14, m);

138

3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,50 (2, m), 1,02 (2-Me, d, 7,3), 3,16 (3, dd, 13,4 a 6,9), 3,82 (3, dd, 13,4 a 6,6); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,57 (2, dd, 8,5 a

6,5), 2,82 (3, dd, 13,9 a 8,6), 3,03 (3, dd, 13,9 a 6,5),

7,25 (5, d, 2,2), 3,82 (7-OCH₃, s), 6,96 (8, d, 8,6), 7,13 (9, dd, 8,6 a 2,2). ¹³C NMR (CD₃OD): δ 179,5, 173,4, 168,2,

155,4, 143,7, 141,7, 131,9, 131,7, 129,8, 129,3 (2c), 129,2 (2C), 128,8, 126,2, 123,2, 113,4, 85,9, 74,5, 74,1, 56,8,

56,6, 56,3, 43,3, 41,2 40,2, 38,8, 38,0, 15,5, 9,9.

Kryptofycín 12

K roztoku 5 mg kryptofycinu 1, 5 alebo 8 v 1 ml zmesi acetónu a vody v pomere 4 : 1 sa pridá 15 μΐ 2M hydroxidu sodného. Reakční zmes sa 5 hodín mieša pri teplote miestnosti, IM kyselinou chlorovodíkovou neutralizuje na pH 7 a odparí. Látka rozpustná v dichlórmetáne sa nechá prejsť malou patrónou s oxidom kremičitým pri použití dichlórmetánu, zmesi etylacetátu a dichlórmetánu v pomere 1:1a etylacetátu, ako elučných činidel. Frakcia eluovaná etylacetátom obsahuje čistý kryptofycín 12.

¹H NMR (CD₃OD): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz): 5,7,8-trihydroxy6-metyl-8-fenyl-2-okténová kyselina (A) 6,07 (2, ddd, 15,5,

1,3 a 1,2), 6,40 (3, dt, 15,5 a 7,3), 2,49 (4, m), 2,60 (4, m), 3,92 (5, ddd, 9,3, 6,7 a 4,5), 1,94 (6, m), 1,07 (6-Me, d, 6,6), 3,61 (7, dd, 8,9 a 7,6), 4,56 (8, d, 7,6), 7,36 (10/14, dd, 7,4 a 1,5), 7,32 (11/13, brt, 7,5), 7,25 (12, m); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,54 (2, ddq, 7,0, 6,6 a 7,0), 1,02 (2-Me, d, 7,0), 3,14 (3, dd, 13,5 a 7,0), 3,42 (3, dd, 13,4 a 6,6); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,57 (2, dd, 8,4 a 6,7), 2,83 (3, dd, 13,8 a 8,4), 3,02 (3, dd, 13,8 a 6,6), 7,25 (5, d, 2,1), 3,82 (7-OCH₃, s), 6,95 (8, d, 8,5),7,12 (9, dd, 8,5 a 2,1). Metyláciou kryptofycinu 12 diazometánom sa získa kryptofycín 6.

139

Kryptofycín 14

K roztoku 3 mg kryptofycínu 6 v 1 ml zmesi acetónu a vody v pomere 3 : 1 sa pridá 5 μΐ 2N hydroxidu sodného. Reakčná zmes sa 5 hodín mieša, neutralizuje IM kyselinou chlorovodíkovou na pH 7 a potom odparí do sucha. Zvyšok sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii s reverznými fázami, čím sa získa 2,4 mg kryptofycínu 14. ^H NMR (CD₃OD): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka S (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz): 5-hydroxy-6-metyl8-fenyl-2,7-oktadiénová kyselina (A) 5,98 (2, d, 15,3), 6,78 (3, dt, 15,3 a 7,5), 2,35 (4, m), 3,64 (5, td, 7,2 a 4,8), 2,47 (6, m), 1,14 (6-Me, d, 6,9), 6,22 (7, dd, 15,9 a 8,1), 6,39 (8, d, 15,9), 7,24 - 7,36 (10/11/12/13/14, m); 3-amÍno-

2- metylpropiónová kyselina (C) 2,35 (2, m), 1,02 (2-Me, d,

6,9), 3,18 (3, dd, 13,2 a 6,6), 3,36 (3, dd, 13,2 a 4,5);

3- chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,58 (2, dd, 8,7 a 6,3),

2,80 (3, dd, 13,8 a 9,0), 3,05 (3, dd, 13,8 a 6,3), 7,25 (5, d, 2,1), 3,82 (7-OCH₃, s), 6,95 (8, d, 8,4), 7,13 (9, dd,

8,4 a 2,1) .

Kryptofycín 35

Do nádoby obsahujúcej 0,5 ml dichlórmetánu sa pridá katalytické množstvo oxidu platičitého. Vzduch sa z nádoby odčerpá a nahradí plynným vodíkom. Reakčná zmes sa mieša 20 minút pri teplote miestnosti a pridá sa k nej roztok 10 mg kryptofycínu 1 v minimálnom objeme dichlórmetánu. Reakčná zmes sa 45 minút mieša pri teplote miestnosti. Katalyzátor sa odstráni filtráciou cez vrstvu celitu na vate a z filtrátu sa odstráni rozpúšťadlo. Zvyšok sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii s reverznými fázami na stĺpci C18, čím sa získa 6,5 mg kryptofycínu 35.

EIMS m/z (rel. intenzita) 656/658 (25/10), 412/414 (25/12), 280/282 (20/10), 195/197 (78/25), 141 (58), 91 (100);

140

EIMS s vysokým rozlíšením m/z 656,2864 (vyrátané pre ^C35^H45^C1N2°8' °»^Ommu chyba);

·*·Η NMR (CDC1₃): amino- alebo hydroxykyselinová jednotka δ (poloha uhlíka, multiplicita, J v Hz) 2,3-dihydro-7,8epoxy-5-hydroxy-6-metyl-8-fenyloktánová kyselina (A) 2,32 (2, ddd, 14,5, 9,2, 5,8), 2,10 (2, ddd, 14,5, 9,2, 6,2),

1,5 -1,8 (3/4 prekrytý m), 5,07 (5, ddd, 12,5, 5,6, 2,0),

1,80 (6, m), 1,12 (6-Me, d, 7,0), 2,90 (7, dd, 7,4, 1,8),

3,67 (8, d, 1,8), 7,24 (10/14, m), 7,32 - 7,38 (11/12/13, m); 3-chlór-4-metoxyfenylalanín (B) 4,71 (2, ddd, 8,7,

6.4, 6,3), 5,62 (2-NH, d, 8,7), 3,08 (2H-3, brd, 6,4), 7,19 (5, d, 2,0), 3,87 (7-OMe, s), 6,83 (8, d, 8,5), 7,07 (9, dd,

8.4, 2,0); 3-amino-2-metylpropiónová kyselina (C) 2,72 (2, m), l,18(2-Me, d, 6,9), 3,12 (3, ddd, 11,4, 10,6, 5,6),

3.70 (3, dddd), 6,7 6(3-NH, brt, 6,0); 2-hydroxy-4-metylpentánová kyselina (D) 4,83 (2, dd, 9,9, 3,8), 1,39 (3, m),

1.70 (3, m), 1,72 (4, m), 0,87 (4-Me, d, 5,3), 0,86 (5, d,

5,3); ¹³C NMR (CDC1₃): jednotka δ (poloha uhlíka) A 172,4 (1), 36,2 (2), 32,0 (3), 21,1 (4), 76,6 (5), 40,2 (6), 13,6 (6-Me), 63,3 (7), 59,2 (8), 136,8 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,6 (12); B 170,7 (1), 53,7 (2), 35,5 (3), 130,0 (4), 131,1 (5), 122,2 (6), 153,8 (7), 56,1 (7-OMe), 112,1 (8), 128,5 (9),; C 175,2 (1), 38,2 (2(, 13,6 (2-Me), 42,1 (3); D 171,9 (1), 71,7 (2), 39,6 (3), 24,5 (4), 22,9 (4-Me), 21,4 (5).

Príklad 7

Analýza depolymeračnej účinnosti kryptofycínu na mikrotubuly

Použité materiály

Vinblastín, cytochalazín B, tetrametylrodamín izotiokyanát (TRITC)-faloidín, sulforhodamín B (SRB) a protilátky proti β-tubulínu a vimentínu boli získané od firmy

141

Sigma Chemical Company. Základné Eaglovo médium obsahujúce Earlove soli (BME) pochádzajú od firmy Gibco a fetálne teľacie sérum (FBS) od firmy Hyclone Laboratories.

Bunkové línie

Bunková línia leukemických Jurkatových T buniek a bunky hladkého svalu aorty A-10 potkana získané zo zbierky Američan Type Culture Collection boli kultivované v BME obsahujúcom 10% FBS a 50 μg/ml gentamycínsulfátu. Bunky karcinómu ľudských vaječníkov (SKOV3) a podlínia, ktorá bola selektovaná na rezistenciu voči vinblastínu (SKVLB1) je veľkorysým darom Dr. Victora Linga z Ontario Cancer Inštitúte. Obidve bunkové línie boli udržované v BME obsahujúcom 10% FBS a 50 μ9/ιη1 gentamycínsulfátu. 24 hodín po pasážovaní bol k bunkám SKVLB1 pridaný vinblastín do konečnej koncentrácie 1 μg/ml, aby sa udržal selekčný tlak na bunky nadexprimujúce P-glykoproteín.

Skúška proliferácie buniek a prerušenia cyklu

Skúška proliferácie buniek sa vykonáva spôsobom opísaným Skehan, P. et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107 až 1112 (1990). V prípade Jurkatových buniek sa kultúry ošetria uvedenými liečivami, ako je to opísané v Skehan et al., - hore uvedená citácia a celkový počet buniek sa stanoví ich spočítaním v hemacytometre. Percentuálny podiel buniek v mitóze sa stanoví farbením 0,4% Giemse v PBS a následným trojnásobným rýchlym premytím PBS. Na jedno ošetrenie sa hodnotí aspoň 1000 buniek z hľadiska prítomnosti mitotických obrazcov a vyráta sa mitotický index, ako pomer počtu buniek s mitotickými obrazcami a celkového počtu buniek.

142

Imunofluorescenčná esej

Bunky A-10 sa v BME/10% FBS nechajú rásť na krycom sklíčku do takmer konfluentného nárastu a pridajú sa k nim zlúčeniny v PBS až do uvedenej konečnej koncentrácie. Bunky sa inkubujú ďalších 24 hodín. Za účelom farbenia mikrotubulov a intermediárnych filamentov sa bunky fixujú v chladnom metanole a inkubujú s PBS obsahujúcom 10% teľacie sérum, aby sa blokovali nešpecifické väzbové miesta. Potom sa bunky inkubujú 60 minút pri 37’C s monoklonálnym anti-β-tubulinom alebo monoklonálnym anti-vimentínom pri zriedeniach odporučených výrobcami. Väzba primárnych protilátok sa následne vizualizuje 45minútovou inkubáciou s fluoresceín-konjugovaným králičím antimyším IgG. Krycie sklíčka sa upevnia na mikroskopické podložné sklíčka a fluorescenčné obrazce sa skúmajú a fotografujú pri použití fotomikroskopu Zeiss 111 opatreného epifluorescenčniou optikou pre fluoresceín. Za účelom farbenia mikrofilamentov sa bunky fixujú v 3% paraformaldehyde, permeabilizujú 0,2% Triton X-100 a pri použití tetrahydroboritanu sodného (1 mg/ml) chemicky redukujú. K bunkám sa pridá lOOnM TRITC-faloidín v PBS a vzniknutá zmes sa nechá inkubovať 45 minút pri 37’C, potom sa bunky trikrát rýchlo premyjú PBS, umiestnia na krycie sklíčka a ihneď fotografujú hore opísaným spôsobom.

Účinky kryptofycínov a vinblastínu na proliferáciu a bunkový cyklus Jurkatových buniek

Krivka závislosti odpovedi od dávky, ktorá vyjadruje účinky kryptofycínových zlúčenín na proliferáciu buniek a percentuálny podiel buniek v mitóze je uvedená na obr. 2A a krivka vyjadrujúca rovnaký vzťah pre vinblastín je uvedená na obr. 2B. Z neošetrených buniek vykazujú mitotické obrazce menej ako 3 %. Ako kryptofycínové zlúčeniny, tak vinblastín vyvolávajú v závislosti od dávky zvýšenie percentuálneho

143 podielu buniek nachádzajúcich sa v mitóze. Zvýšenie mitotického indexu tesne koreluje so znížením bunkovej proliferácie, tzn. že koncentrácia ako kryptofycínových zlúčenín, tak aj vinblastínu, ktoré vyvolajú 50% akumuláciu buniek nachádzajúcich sa v mitóze je v skutočnosti rovnaké ako koncentrácia, ktorá z 50% inhibuje bunkovú proliferáciu. Hodnota IC₅₀ tohto účinku je pre kryptofycínové zlúčeniny 0,2nM a pre vinblastín 8nM.

Účinky cytochalazínu B, vinblastínu a kryptofycínov na cytoskelet

Bunky hladkého svalu aorty (A-10) sa nechajú rásť na krycích sklíčkach a ošetria PBS, 2μΜ cytochalazínom B, lOOnM vinblastínom a lOnM kryptofycínovými zlúčeninami. Po 24 hodinách sa mikrotubuly a vimentínová stredná filamenta vizualizujú nepriamou imunofluorescenciou a mikrofilamenta sa ofarbí pomocou TRITC-faloidínu. Skúmajú sa morfologické účinky každého liečiva. Neošetrené bunky vykazujú rozsiahle mikrotubulárne sitá spolu s perinukleárnymi centrami usporiadania mikrotubulov. Vimentínové stredné filamenty sú rovnomerne distribuované po celej cytoplazme, zatial čo zväzky mikrofilamentov sú sústredené pozdĺž hlavnej osy bunky. Cytochalazín B vyvoláva úplnú depolymeráciu mikrofilamentov sprevádzanú akumuláciou parakryštalických zvyškov. Tato zlúčenina nemá vplyv na distribúciu mikrotubulov ani stredných filamentov. Ako vinblastín, tak kryptofycínová zlúčenina spôsobujú výrazný úbytok mikrotubulov. žiadna z týchto zlúčenín neovplyvňuje organizáciu mikrofilamentov; vimentínový stredný filament sa však hrúti za vzniku sústredných kruhov vôkol jadra bunky ošetrenej buď vinblastínom alebo kryptofycínovou zlúčeninou.

Účinky kryptofycínov a vinblastínu na mikrotubuly stabilizované taxolom

144

Na bunky A-10 sa 3 hodiny pôsobí 0 alebo ΙΟμΜ taxolom, potom sa k nim pridá PBS, lOOnM vinblastín alebo lOnM kryptofycínová zlúčenina. Po 24 hodinách sa pomocou imunofluorescencie opísanej hore skúma organizácia mikrotubulov. V porovnaní s kontrolnými bunkami sú mikrotubuly v bunkách ošetrených taxolom výrazne nahromadené, najmä v polárnych oblastiach bunky. Ako bolo uvedené hore, vinblastín vyvoláva úplnú depolymeráciu mikrotubulov vo vopred neošetrených bunkách. Predchádzajúce ošetrenie taxolom však zabraňuje depolymeráciu mikrotubulov v odpovedi na vinblastín. Podobne predchádzajúce ošetrenie taxolom úplne stabilizuje mikrotubuly voči kryptofycínom indukovanej depolymerácii.

Reverzibilita depolymerácie mikrotubulov vyvolanej vinblastínom a kryptofycínom

Na bunky A-10 sa 24 hodín pôsobí buď lOOnM vinblastínom alebo lOnM kryptofycínom, čím sa dosiahne úplná depolymerácia mikrotubulov. Potom sa bunky premyjú a inkubujú 1 alebo 24 hodín v médiu, ktoré neobsahuje liečivo. Po odstránení vinblastínu dochádza k rýchlej repolymerácii, čo sa po jednej hodine prejavuje vo významných hladinách mikrotubulov a v úplnom obnovení morfológie po 24 hodinách. Oproti tomu, v bunkách ošetrených kryptofycínovými zlúčeninami sa mikrotubuly opäť neobjavujú ani po jednej , ani po 24 hodinách po odstránení tejto zlúčeniny.

Reverzibilita kryptofycínom, vinblastínom a taxolom inhibovanej bunkovej proliferácie

Na bunky SKOV3 sa 24 hodín pôsobí vopred stanovenými IC₅₀ dávkami vinblastínu, kryptofycínu alebo taxolu (pozri hodnoty stanovené pri skúškach, ktoré sú súhrnne uvedené v tabulke 5). Behom tohto času denzita buniek vzraste

145

z 0,4 na 0,5 ± 0,05 jednotiek absorbancie (Obr. 3), čo indikuje 25% zvýšenie počtu buniek pri všetkých troch ošetreniach. Výsledkom odstránenia liečiva je rýchly rast buniek ošetrovaných vinblastínom, ktorý je taký, že počet buniek sa zvýši asi trojnásobne behom 24 hodín. V porovnaní s tým, je rast buniek ošetrených kryptofycínovými zlúčeninami alebo taxolom spomalený, ich počet sa zvyšuje len o 0,2 až 0,4-násobok behom 24 hodín po odstránení liečiva. Proliferačná kapacita buniek ošetrených kryptofycínmi alebo taxolom sa potom obnoví, pretože počet buniek sa behom nasledujúcich 24 hodín zdvojnásobí.

Účinky kombinácií vinblastínu a kryptofycínov na bunkovú proliferáciu

Bunky SKOV3 sa 48 hodín ošetrujú kombináciami kryptofycínov a vinblastínu. Potom sa stanovia percentuálne podiely prežitých buniek a pre každú kombináciu sa vyráta hodnota IC₅₀. Účinky ošetrenia kombináciami, ako tiež jednotlivými liečivami sú zobrazené na izobolograme (Obr. 4). Hodnoty IC₅₀ kombinácie kryptofycínovej zlúčeniny a vinblastinu sa pohybujú velmi tesne v blízkosti priamky aditivity, čo ukazuje, že tieto dve liečivá indukujú len aditívne inhibície bunkovej proliferácie.

Toxicita kryptofycínov, vinblastínu a taxolu voči bunkám SKOV3 a SKVLB1

Bunky SKLVB1 sú vzhíadom na svoju nadexceziu P-glykoproteínu rezistentné voči protirakovinovým liečivám prírodného pôvodu [Bradley, G. et al., Cancer Res. 49: 2790 až 2796 (1989)]. Schopnosť taxolu, vinblastínu a kryptofycínových zlúčenín inhibovať rast buniek SKOV3 a SKVLB1 je súhrnne uvedená v tabuľke 5. Taxol v závislosti od dávky vyvoláva inhibiciu proliferácie obidvoch bunkových línií;

146 jeho IC₅₀ je pri bunkách SK0V3 lnM a pri SKLVB1 8000nM. Vinblastín tiež inhibuje rast obidvoch týchto bunkových linií; jeho IC₅₀ je pri bunkách SKOV3 0,35nM a pri bunkách SKLVB1 4200nM. Kryptofycíny vykazujú IC₅₀ 7nM pri bunkách SK0V3 a 600pM pri bunkách SKLVB1. Výsledné faktory rezistencie buniek SKVLB1, ako tiež SKOV3, sa vyrátajú ako hodnoty IC₅₀ a sú uvedené v tabulke 5.

Bolo teda demonštrované, že účinok nových kryptofycínových zlúčenín podlá vynálezu, ako tiež skôr opísaných kryptofycínových zlúčenín, ktoré sú účinnými inhibítormi bunkovej proliferácie, spočíva v rozrušení mikrotubulárneho sita a inhibícii mitózy. Kryptofycínové zlúčeniny rozrušujú mikrotubulárne usporiadanie a tým aj normálne funkcie bunky, vrátane mitózy.

Klasické antimikrotubulárne činidlá, ako kolchicín a alkaloid zimozelu Vinea, zabraňujú mitotickému deleniu bunky. Zdá sa teda ako vhodné porovnať účinok niektorého z týchto činidiel na bunkovú proliferáciu s účinkom kryptofycínových zlúčenín. Na tieto účely bol ako reprezentant klasických antimikrotubulárnych činidiel zvolený alkaloid zimozelu Vinea, vinblastín. Bol tedy porovnávaný účinok kryptofycínových zlúčenín a vinblastínu na proliferáciu a progresiu bunkového cyklu leukémickej bunkovej línie Jurkatových T-buniek. Obidva druhy týchto zlúčenín vyvolávali paralelne inhibície bunkovej proliferácie a akumuláciu buniek v mitóze v závislosti od dávky.

Pretože antimitotické účinky sú obyčajne sprostredkované rozrušením mikrotubulov v mitotických vretienkach, boli účinky kryptofycínových zlúčenín na štruktúry cytoskeletu charakterizované fluorescenčnou mikroskopiou. Imunofluorescenčné farbenie buniek ošetrených buď kryptofycínovou zlúčeninou alebo vinblastínom jasne demonštrujú, že obidve

147

zlúčeniny vyvolávajú úplnú stratu mikrotubulov. Podobné štúdie s bunkami SK0V3 demonštrujú, že antimikrotubulárne účinky kryptofycinových zlúčenín nie sú jedinečné voči línii buniek hladkého svalstva. Žiadne liečivo neovplyvňovalo úroveň alebo distribúciu zväzkov mikrofilamentov, ktoré sa ľahko ovplyvní cytochalazínom B. To dokladá, že strata mikrotubulov nemusí byť vyvolaná nešpecifickým mechanizmom, tzn. aktiváciou proteáz alebo stratou energetického náboja. Ako vinblastín, tak aj kryptofycínové zlúčeniny tiež podporovali značné zrúcanie vimentínových stredných filamentov, takže sa vôkol bunkových jadier vytvorili svetlé vyfarbené krúžky.

Po odstránení vinblastínu z kultivačného média dochádza k rýchlej repolymerácii mikrotubulov. Oproti tomu bunky ošetrené kryptofycínovými zlúčeninami zostávajú bez mikrotubulov počas aspoň 24 hodín po odstránení zlúčeniny z kultúr.

Tento vynález tiež dokladá, že kryptofycínové zlúčeniny oklamú P-glykoproteínom sprostredkovanú rezistenciu voči niekoľkým liečivám. Transport P-glykoproteínom obmedzuje schopnosť prírodných protirakovinových liečiv inhibovať rast nádorových buniek so získanou alebo de novo rezistenciou voči liečivám [Endicott, J. A. et al., Ann. Rev. Biochem. 58: 137 až 171 (1989); Beck, W. T., Biochem. Pharm. 36: 2879 až 2887 (1987) a Moscow, J. A. et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: 14 až 20 (1988)]. Hoci sú alkaloidy zimozelu Vinea veľmi užitočné pri počiatočnej chemoterapeutickej liečbe, sú extrémne dobrými substrátmi pre transport P-glykoproteínom, čím je veľmi obmedzená ich použiteľnosť proti P-glykoproteínom médiovanej MDR nádorov. Identifikácia činidiel, ktoré majú prekonať rezistenciu voči niekoľkým liečivám, by mala viesť k vývoju užitočných a nových protirakovinových činidiel. Kryptofycínové zlúčeniny podľa

148 vynálezu takými činidlami sú, pretože sú špatnými substrátmi pre transport sprostredkovaný P-glykoproteínom. Tento fakt sa odráža v nízkom faktori rezistencie pri kryptofycínových zlúčeninách na rozdiel od vinblastínu, taxolu a iných liečiv prírodného pôvodu.

Úplná syntéza kryptofycínov

Štruktúry nove syntetizovaných zlúčenín, pozri kryptofycíny 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58 a 61, boli potvrdené priamo pri použití postupov dobre známych odborníkom v tomto odbore. Hmotnostné spektrálne údaje sú v súlade s molekulárnym zložením. Údaje H NMR a C NMR sú velmi podobné údajom kryptofycínu 1 a príbuzných v prírode sa vyskytujúcich a polosyntetických analógov. Symboly A, B, C a D v charakteristikách zlúčenín označujú zodpovedajúce j ednotky.

Nasledujúce príklady demonštrujú totálnu syntézu kryptofycínových zlúčenín, ako tiež ich použitie ako terapeutické činidlá podlá vynálezu.

Príklad 8

Syntéza kryptofycínu 51

S-trans-3-pentén-2-ol (A)

Zmes racemického trans-3-pentén-2-olu (933 mg, 11 mmol), trifluóretyllaurátu (4,14 g, 15 mmol) a lipázy slinivky ošípaných (PPL, 2,0 g) v 25 ml bezvodého dietyléteru sa 80 hodín mieša. Potom sa PPL odfiltruje a premyje trikrát éterom. Éterový filtrát sa odparí a lepivý olejovitý zvyšok sa podrobí priamej vákuovej destilácii. S-trans-3-pentén149

2-ol (A) skondenzuje v predlohe chladenej kvapalným dusíkom (383 mg).

^XH NMR (CDC1₃): δ 5,57 (4-H, dq, -15,3/6,0), 5,74 (3-H, ddd, -15,3/6,4/1,2), 4,19 (2-H, 1:4:6:4:1 pentuplet, 6,4), 2,24 (OH, bs), 1,63 (5-H₃, d, 6,0), 1,19 (1-H₃, d, 6,4) ¹³C NMR (CDC1₃): δ 135,5 (3), 125,5 (4), 68,7 (2), 23,3 (5),

17,5 (1)

S-trans-2-(2-Propinoxy)-3-pentén (B)

K intenzívne miešanej zmesi S-enantioméru A (628 mg,

7,3 mmol), tetrabutylamóniumhydrogensulfátu (138 mg, 0,41 mmol) a 40% hydroxidu sodného vo vode (5 ml) sa pri 0°C prikvapká propargylchlorid (767 mg, 10,3 mmol, 745 μΐ).

V intenzívnom miešaní sa pokračuje cez noc. Výsledná zmes sa potom pri 0^eC neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou a propargyléter sa extrahuje pentánom. Extrakt sa odparí a propargyléter sa prečistí na krátkom stĺpci silikagélu pri použití 2% dietyléteru v pentáne, ako elučného činidla. Získa sa 778 mg propargyléteru B, [a]_D -118,9° (c 2,0, CHC1₃); l-H NMR (CDC1₃): δ 5,70 (4-H, dq, 18,5/6,5), 5,31 (3-H, ddd, 18,5/7,2/1,4), 4,15 (l'-H, dd, -15,6/2,1), 4,01 (ľ-H, dd, -15,6/2,1), 4,01 (2-H, m), 2,38 (3'-H, t, 2,1),

1,73 (5-H, dd, 6,5/1,4), 1,25 (1H, d, 6,3) (3R,4R)-4-Metylhept-5(E)-en-l-in-3-ol (C)

Alikvót butyllítia v hexáne (2,5M, 5,1 ml, 12,8 mmol) sa odparí pri zníženom tlaku a zvyšok sa ochladí na -90’C a pomaly sa k nemu pridá roztok propargyléteru B (454 mg, 3,66 mmol) v 10 ml tetrahydrofuránu. Reakčná zmes sa cez noc nechá zahriať na teplotu miestnosti, rozloží roztokom chloridu amónneho a extrahuje trikrát éterom. Extrakty sa vysušia a odparia. Zvyšok sa prečistí na stĺpci silikagélu pri použití 5% etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla.

150

Získa sa 322 mg alkoholu C (výťažok 71 %), [α]θ = 32,9’ (c 3,0, CHC1₃); IR (NaCl) V_max 3306, 2968, 1455, 1379, 1029, 975 cm¹. ^XH NMR (CDC1₃): a 5,61 (6-H, dq, 15,3/6,3),5,38 (5-H, dd, 15,3/7,7), 4,13 (3-H, brs), 2,45 (1-H, d, 1,5),

2,38 (4-H, m), 2,20 (OH, bd, 3,3), 1,68 (7-H, d, 6,2), 1,09 (4-CH₃, d, 6,8). ¹³C NMR (CDC1₃): 8 131,5 (5), 127,9 (6),

83,5 (2), 73,6 (1), 66,2 (3), 43,4 (4), 18,1 (7), 15,7 (4-Me)

(3S, 4R) -3-terc. Butyldimetylsilyloxy-4-metylhept-5E-enal (D)

K miešanému roztoku alkoholu C (248 mg, 2 mmol) a imidazolu (340 mg, 5 mmol) v 3 ml suchého d ime tyl formamidu sa pridá terc.butyldimetylsilylchlorid (452 mg, 3 mmol). Vzniknutá zmes sa cez noc mieša a pridá sa k nej 10 ml 10% hydroxidu sodného, aby sa rozložil prebytočný terc.butyldimetylsilylchlorid. Produkt sa extrahuje éterom. Extrakt sa premyje postupne vodou, 0,5M kyselinou chlorovodíkovou a vodou, vysuší a odparí. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli pri použití hexánu, ako elučného činidla. Získa sa 457 mg (3R,4R-3-terc.butyldimetylsilyloxy-4-metylhept5(E)-en-l-inu (výťažok 96 %). ¹H NMR (CDC1₃): δ 5,50 (6-H, dq, 15,3/6,1), 5,38 (5-H, dd, 15,3/7,5), 4,16 (3-H, dd, 5,7/1,7), 2,37 (1-H, d, 1,7), 2,35 (4-H, m), 1,68 (7-H, d,

6,1), 1,07 (4-Me, d, 6,8), 0,90 (CMe₃, s), 0,12 (SiMe, s), 0,09 (SiMe, s).

Pri použití rovnakého postupu sa získa zodpovedajúci TBDPS derivát, (3R,4R)-3-terc.butyldifenylsilyloxy4-metylhept-5(E)-en-l-in, vo výťažku 92 %, [a]_D = +32,9’ (c 3,0, CHClj). Ή NMR (CDC1₃) δ 7,72/7,38 (2Ph-H₃), 5,32 (6-H; m), 5,25 (5-H; dd, 16,2/7,3), 4,29 (3-H; dd, 5,2/2,0), 2.38 (4-H; m), 2,33 (1-H; d, 2,0), 1,64 (7-H; d,

5,3), 1,11 (4-Me; d, 6,9), 1,06 (CMe,). ^,3C NMR (CDC1,) 6 136,1/ 135,9 /133,6 /129,7/129,6/127,5/127,3 (Ph), 132,4 (5), 126,1 (6), 83,3 (2), 73,5 (1), 68,0 (3), 43,6 (4), 26,9 (CMej), 19,4 (CMe₃), 18,0 (7), 14,7 (4-Me).

151

2-Metylbutén (1,15 ml 2M roztoku v tetrahydrofuráne, 2,3 mmol) sa pri -25’C pridá k 1,1 ml bóran-tetrahydrofuránového komplexu (IM, 1,1 mmol). Výsledná zmes sa mieša 2 hodiny za chladenia v ladovom kúpeli. Zmes sa ochladí na -50°C a v jedinej dávke sa k nej pridá roztok TBS derivátu (238 mg, 1 mmol) v 1 ml tetrahydrofuránu. Chladiaci kúpe! sa odstaví a reakčná zmes sa nechá zahriať na teplotu miestnosti a pri tejto teplote udržuje ďalšiu jednu hodinu. Potom sa k zmesi pri 0°C pridá 2,2M roztok KH₂PO₄/K₂HPO₄ (4,8 ml) a 30% peroxid vodíka (0,8 ml). Po jednej hodine sa z reakčnej zmesi odparí tetrahydrofurán a zvyšok sa extrahuje éterom. Éterový extrakt sa odparí a zvyšok sa chromatografuje na silikagéli pri použití 1% etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla. Získa sa 194 mg aldehydu D (výťažok 76 %). ¹H NMR (CDC1₃): δ 9,78 (1-H, t, 2,3), 5,46 (6-H, dq, 15,3/6,1), 5,34 (5-H, dd, 15,3/7,5), 4,13 (3-H, m), 2,47 (2-H, m), 2,31 (4-H, m), 1,66 (7-H, br d, 6,1), 0,99 (4-Me, d, 6,8), 0,87 (CMe₃, s), 0,07 (SiMe, s), 0,04 (SiMe, s).

terc.Butyldifenylsilyléterový (TBDPS) derivát aldehydu sa získa v 83% výťažku.

¹H NMR (CDC13): δ 9,52 (1-H, t, 2,4), 7,69/7,40 (2Ph-H5), 5,28 (6-H, m), 5,22 (5-H, dd, 16,2/6,2), 4,19 (3-H, m), 2,42 (2-H, m), 2,29 (4-H, m), 1,60 (7-H, d, 5,4), 1,07 (CMe3), 1,02 (4-Me, d, 6,9) ¹³C NMR (CDC13): δ 202,0 (1), 136,1/ 133,6/133,3/130,2/129,7/127,7/127,6 (Ph), 132,3 (5), 126,2 (6), 72,8 (3), 47,6 (2), 42,2 (4), 27,1 (CMe₃), 19,6 (CMe₃), 18,3 (7), 14,99 (4-Me)

Metyl-(5S,6R)-5-terc.butyldimetylsilyloxy-6-metyl-7-oxonona-2(E)-7E-dienoát (E)

K miešanému roztoku aldehydu D (0,74 g, 2,9 mmol) a trimetylfosfonoacetátu (632 mg, 3,5 mmol) v 5 ml tetrahydrof uránu ochladenému na -78°C sa pridá tetrametylguani152 dín (435 μΐ, 3,5 mmol). Po 30 minútach sa chladiaci kúpeľ odstaví. Reakčná zmes sa mieša ďalšie 4 hodiny a neutralizuje IM kyselinou chlorovodíkovou. Produkt sa extrahuje éterom. Éterový extrakt sa odparí a zvyšok sa chromátografuje na silikagéli pri použití 5% etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla. Získa sa 0,814 g zlúčeniny E (výťažok 90 %).

¹H NMR (CDC1₃): δ 6,93 (3-H, dt, 15,6/7,8), 5,62 (2-H, dd, 15,6/1,2), 5,37 (8-H, m), 5,37 (7-H, m), 3,71 (OCH₃, s),

3,61 (5-H, m), 2,29 (4-H₂, m), 2,22 (6-H, m), 1,66 (9-H₃, brd, 6,1), 0,99 (6-Me, d, 6,8), 0,88 (CMe₃, s), 0,03 (SiMe, s), 0,01 (SiMe, s).

terc.Butyldifenylsilyléterový (TBDPS) derivát aldehydu sa získa v 90% výťažku.

^XH NMR (CDC13): δ 7,68/7,38 (2Ph-H5), 6,75 (3-H, dt, 15,6/7,4), 5,62 (2-H, d, 15,6), 5,34 (8-H, m), 5,29 (7-H, m), 3,70(5-H, m), 3,68 (OCH3, s), 2,28 (4-H2, m), 2,20 (6-H, m), 1,62 (9-H3, d, 5,3), l,08(CMe3), 0,99 (6-Me, d, 6,9) ¹³C NMR (CDC13): δ 166,7 (1), 146,4 (3), 136,0/134,2/133,8/129,62/129,56/127,5/127,4 (Ph), 132,5 (7),

125,8 (8), 122,6 (2), 76,2 (5), 51,3 (OCH₃), 41,7 (6), 36,8 (4), 27,0 (CMe₃), 19,4 (CMe₃), 18,1 (9), 14,7 (6-Me)

Metyl-(5S,6R)-5-terc.butyldimetylsilyloxy-6-metyl-7-oxohept-2(E)-enoát (F)

Roztokom metylesteru E (328 mg, 1,0 mmol) a 97 μΐ pyridínu v 15 ml dichlórmetánu sa pri -78’C vedie ozón. Priebeh ozonolýzy sa monitoruje chromatografiou na tenkej vrstve. Po spotrebovaní metylesteru sa k výslednej zmesi pridá asi 500 mg zinkového prachu a 1 ml ladovej kyseliny octovej. Teplota reakčnej zmesi sa pomaly zvýši na 25’C a reakčná zmes sa prefiltruje. Filtrát sa premyje postupne nasýteným roztokom síranu meďného a hydrogenuhličitanu

153 sodného a odparí sa z nej rozpúšťadlo. Surový aldehyd F (249 mg, 83 %) sa použije v nasledujúcom stupni bez ďalšieho prečistenia.

¹H NMR (CDC1₃): δ 9,96 (7-H, t, 2,3), 6,96 (3-H, dt, 15,7/7,6), 5,90 (2-H, dd, 15,7/0,7), 4,05 (5-H, m), 3,74 (OMe, S), 2,51 (6-H, m), 2,45 (4-H₂, m), 1,09 (6-Me, d,

6,9), 0,88 (CMe₃, s), 0,04 (SiMe, s)

Metyl- (5S, 6R) -5-terc. butyldimetylsilyloxy-6-metyl-8fenylokta-2E,7E-dienoát (G)

K miešanému roztoku aldehydu F (25,0 mg, 0,08 mmol) v 1,5 ml tetrahydrofuránu sa pri -78’C pridá 0,80 ml chladnej (-78^eC) zmesi benzyltrifenylfosfóniumchloridu (268 mg, 0,69 mmol, v 6,9 ml tetrahydrofuránu) a n-butyllítium (280 μΐ 2,5M roztoku v hexáne). Po 15 minútach sa chladiaci kúpe! odstaví a v miešaní sa pokračuje 2 hodiny. Reakčná zmes sa rozloží nasýteným roztokom chloridu amónneho a tetrahydrofurán sa odparí. Zvyšok sa extrahuje dvakrát hexánom a spojené extrakty sa premyjú vodným roztokom chloridu sodného, vysušia a odparia. Olejovitý zvyšok, zmes E a Z izomérov v pomere 5 : 1, sa rozpustí v 1,5 ml benzénu s obsahom tiofenolu (0,02M) a l,ľ-azobis(cyklohexánkarbonitrilu) (VAZO, 0,006M). Výsledná zmes sa 5 hodín zahrieva k spätnému toku, ochladí na teplotu miestnosti a pridá sa k nej hexán (15 ml). Organický roztok sa premyje postupne 10% hydroxidom sodným a vodným roztokom chloridu sodného, vysuší síranom horečnatým a odparí. Zvyšok sa podrobí chromatograf ii na silikagéli pri použití 2% etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla. Získa sa 24 mg (80 %) zlúčeniny G, [a]D +68,2° (c 1,5, CHCI,); EIMS m/z 374 (<1%; M⁺), 359 (1; M⁺-CH3), 317 (10; M⁺-Ou), 275 (10), 243, (73), 143 (20), 115 (10), 97 (64), 89 (31), 73 (100); HREIMS m/z 374,2232 (C^HhOjSí, Δ +4,5mmu), 359,2031 (C₂₁H_3IO₃Si, Á+l,lmmu), 317,1579 (ChHjjOjSí, A-0,6mmu); UV (MeOH) λ (e) 206 (33500), 252 (20100) nm; IR _Vtax

154

2952, 2855, 1725, 1657, 1435, 1257, 1168, 1097, 970, 836, 775 cnr*; *H NMR & 7,2-

7,4 (Ph-H_s; m), 6,96 (3-H; ddd, 15,6/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 15,9), 6,16 (7-H; dd, 15,9/8.1), 5,84 (2-H; d, 15,6), 3,75 (5-H; ddd, 10,2/6,0/4,2), 3,72 (OMe; s), 2,44 (6-H; m), 2,36 (4-H₂; m), 1,10 (6-Me; d, 6,9), 0,91 (Si-CMe₃; s), 0,06 (Si-Me; s), 0,05 (SiMe; s); ^,3C NMR δ 166,8 (1), 146,4 (3), 137,6 (Ph ľ), 131,9 (8), 130,4 (7), 128,5 (Ph 375’), 127,0 (Ph 4’), 126,0 (Ph 276’), 122,9 (2), 75,0 (5), 51,4 (OMe), 42,8 (6), 37,6 (4), 25,9 (Si-CMej), 18,1 (Si-CMe,). 16,2 (6-Me). -4,4 (Si-Me), -4,5 (Si-Me).

Analýza pre C₂₂H₃₄O₃Si: vyrátané: C 70,52, H 9,17 nájdené: C 70,72, H 9,42 (5S, 6R)-5-terc. Butyldimetylsilyloxy-6-metyl-8-f enylokta2E,7E-diénová kyselina (H)

K roztoku esteru G (159 mg, 0,43 mmol) v 7 ml acetónu sa pridá 5 ml IM vodného hydroxidu lítneho. Výsledná zmes sa mieša 3 hodiny pri 25’C a zriedi 20 ml dietyléteru. Vzniknutá zmes sa IM kyselinou chlorovodíkovou okyslí na pH asi 4. Organická vrstva sa oddelí a premyje vždy 20 ml vodného roztoku chloridu sodného a vody, vysuší síranom horečnatým a odparí. Olejovitý zvyšok sa chromatografuje na silikagéli pri použití 40% etylacetátu v hexáne s obsahom 0,5 % kyseliny octovej. Získa sa čistá kyselina H vo forme žltého riedkeho oleja (145 mg, výťažok 95 %). [<x]_D +87,0 (c 1,4, CHClj); EIMS m/z; 343 (1; M⁺-0H), 303 (5), 275 (9), 257 (4), 229 (62), 213 (16), 171 (22), 143 (37), 131 (16), 115 (23), 97 (100), 91 (44); HREIMS m/z 343,2107 (C2tH3lO2Si, A-l,3mmu), 229,1220 (Cl3H17O2, A+0,9mmu); UV (É) 206 (24500), 252 (15600) nm; IR 3300-2800 (br), 2956, 2856, 1697, 1651, 1419, 1256, 1097, 836, 693 cm'¹; «Η NMR & 10,4 (CO2H; bs, W_in«100), 7,2-7,4 (Ph-H_s; m), 7,09 (3-H; ddd, 15,6/7,6/7,6), 6,39 (8-H; d, 15,9), 6,16 (7-H; dd, 15,9/8,1), 5,85 (2-H; d, 15,6),

155

3,78 (5-H; ddd, 6,0/6,0/4,2), 2,46 (6-Η; m), 2,40 (4-Η₂; m), 1,12 (6-Me; d, 6,9), 0,92 (Si-CMe₃; s), 0,07 (SiMe,; s); ^,3C NMR δ 171,6 (1), 149,1 (3), 137,5 (Ph ľ), 131,8 (8),

130,5 (7), 128,5 (Ph 375’), 127,1 (Ph 4’), 126,1 (Ph 276’), 122,7 (2), 74,9 (5), 42,9 (6), 37,6 (4), 25,8 (Si-CMej), 18,1 (Si-CMe₃), 16,1 (6-Me), -4,4 (Si-Me), -4,5 (Si-Me).

2,2,2-Trichlóretylester 3-(3-chlór-4-metoxyfenyl)-Dalanínu (I)

Vzorka BOC derivátu D-chlórtyrozínu (160 mg,

0,35 mmol) sa rozpustí v 3 ml neriedenej trifluóroctovej kyseliny. Vzniknutý roztok sa nechá 1 hodinu stáť pri teplote miestnosti, potom sa z nej pri zníženom tlaku odstráni prebytok reakčného činidla. Tak sa regeneruje požadovaný amín I vo forme trifluóracetátovej soli (165 mg, 100% výťažok), [a]_D +1,7 (c 5,2, CHC1₃); IR v_max

3400-2500 (br), 1760, 1680, 1500, 1200, 1130, 1070, 805, 710 cm·'; Ή NMR δ 8,07 (NH₂; br m, W_I/2=45), 7,27 (5-H; s), 7,12 (9-H; d, 8,1), 6,88 (8-H; d, 8.1), 4,86/4,67 (CH₂CC1₃; AB q, -12,0), 4,41 (2-H; bs, W_1/2»=20), 3,86 (OMe; s), 3,33 (3-H; dd, -14,4/3,6), 3,22 (3-H’; dd, -14,4/6,6); ^,3C NMR δ 167,6 (1), 155,0 (7), 130,9 (5), 128,8 (9), 125,4 (4), 123,1 (6), 112,7 (8), 93,4 (CC1₃), 75,3 (CH₂CC1₃), 56,1 (OMe), 54,2 (2),

34,9 (3).

Zlúčenina J

K miešanému roztoku zlúčeniny H (25 mg, 0,07 mmol) v 3 ml bezvodého dimetylformamidu sa pod atmosférou argónu postupne pridá pentafluórdifenylfosfinát (FDPP, 32 mg, 0,08 mmol), trifluóracetátová sol zlúčeniny I (35 mg, 0,07 mmol) a diizopropyletylamín (DIEA, 27 mg, asi 36 μΐ, 0,21 mmol, asi 3 ekvivalenty). V miešaní pri 25C sa pokračuje ďalšiu jednu hodinu, potom sa reakčná zmes extrahuje 20 ml dietyléteru. Éterový extrakt sa premyje 10 ml IM kyseliny chlorovodíkovej, 10 ml nasýteného hydrogenuhličitanu sodného, 20 ml vodného chloridu sodného a 20 ml vody, vysuší síranom horečnatým a odparí. Svetle žltý olejovitý zvyšok sa podrobí

156

chromatografii na silikagélu pri použití 15% etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina J vo forme bezfarbého oleja (32 mg, výťažok 65 %). [a]_D +11,8’ (c 1,2, CHC1₃); EIMS m/z: 644/646/648/650 (7/8/6/3; M⁺-^tBu), 570/572/574 (46/100/21), 536/538 (18/15), 394/396 (67/29), 275 (20), 155/157 (29/9); HREIMS m/z 644,0981 (C^C^NO^i, A-2,13mmu); UV (e) 204 (54900), 230 (23200), 248 (19200), 284 (3500) nm; IR 3290, 2980, 2850, 1760, 1680, 1640, 1505, 1380, 1270, 1169, 990, 720 cm·*; *H NMR A ô 7,2-7,4 (Ph-H₃; m), 6,87 (3H; ddd, 15,0/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 16,2), 6,18 (7-H; dd, 16,2/8,1), 5,82 (2-H; d, 15,0), 3,75 (5-H; ddd, 9,9/6,0/4,8), 2,46 (6-H; m), 2,36 (4-H₂; m), 1,11 (6-Me; d, 6,9), 0,91 (SiCMe₃; s), 0,07 (SiMe; s), 0,06 (SiMe; s); B δ 7,19 (5-H; d, 2,1), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,1), 6,85 (8-H; d. 8,4), 5,85 (NH; d, 7,8), 5,08 (2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,81/4,74 (CHjCClj; AB q, -11,7), 3,87 (OMe; s), 3,22 (3-H; dd, -14,1/5,7), 3,12 (3H’; dd, -14,1/6,0). ¹³C NMR A δ 165,1 (1), 143,0 (3), 137,6 (9), 132,0 (8), 130,4 (7), 128,5 (11/13), 127,0 (12), 126,0 (10/14), 124,7 (2), 75,0 (5), 42,6 (6), 37,6 (4),

25,9 (Si-CMe0. 18,1 (Si-CMe₃), 16,5 (6-Me), -4,3 (Si-Me), -4,6 (Si-Me); B δ 170,1 (1), 154,3 (7), 131,1 (5), 128,5 (4/9), 122,6 (6), 112,2 (8), 94,2 (CC1₃), 74,8 (CH₂CC1₃),

56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).

(1'R,5S,6R)-N-l'-(karbo-2, 2, 2-trichlóretoxy)-2'-(3-chlór-

4-metoxyfeny1)etyl-5-terc.butyldimetyls ilyloxy-6-metyl8-fenylokta-2E,7E-diénamid (K)

K roztoku zlúčeniny J (50 mg, 0,07 mmol) v 4 ml acetonitrilu sa pridá 400 μΣ 50% vodného roztoku fluorovodíka. Výsledná zmes sa 1 hodinu mieša pri 25’C a extrahuje 30 ml diétyléteru. Éterový extrakt sa premyje vždy 30 ml nasýteného hydrogenuhličitanu sodného, vodného chloridu sodného a vody, vysuší síranom horečnatým a odparí. Získa sa alkohol K ako bezfarbá pena (40 mg, 95% výťažok): [a)_D -6,1’ (c 1,3, CHC1₃); EIMS (rel.intenzita) 587/589/591/593 (M+,<1%)

157

552/554/556 (1/2/0.5), 456/458/460/462 (1/2/1/0,2), 342/344/346 (7/8/4), 212/214 (15/5), 195/197 (6/2), 155/157 (99/34), 131 (100), 91 (77); HREIMS mtz 587,0721 (C^Hj^ChNOj, Á+7,9mmu); UV 204 (56500), 230 (22100), 248 (18100), 284 (3600) nm; IR ^3400, 3300, 2980, 1780, 1680, 1640, 1505, 1270, 1180, 1090, 1000, 770 cm *. ‘H NMR A δ 7,2-7,4 (Ph-H_s; m), 6,92 (3-H; ddd, 15,3/7,8/7,5), 6,46 (8H; d, 15,9), 6,14 (7-H; dd, 15,9/8,4), 5,90 (2-H; d, 15,3), 3,65 (5-H; ddd 7,8/5,6/4,0),

2,39 (6-H/4-H₂; bm), 1,78 (OH; bs, W,_n =40 Hz), 1,14 (6-Me; d, 6.9); B δ 7,18 (5H; d, 1,8), 7,03 (9-H; dd, 8,4/1,8), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,97 (NH; d, 7,8), 5,06 (2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,79/4,72 (CH₂CC1₃; AB q, -12,0), 3,86 (OMe; s), 3,20 (3-H; dd, 14,1/5,7), 3,10 (3-H’; dd, -14,1/6,0). ^,3C NMR · A δ 165,3 (1), 142,6 (3), 137,0 (9),

131,7 (8), 131,0 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (12), 126,1 (10/14), 125,0 (2), 73,8 (5), 43,2 (6), 37,2 (4),.16,8 (6-Me); B δ 170,2 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,4 (9), 128,3 (4),

122,5 (6), 112,2 (8), 94,2 (CC1₃), 74,7 (CH₂CC1₃), 56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).

3- (terc. Butoxykarbonyl) amino-2,2-dimetylpropánová kyselina (M)

K roztoku 3-amino-2,2-dimetylpropán-l-olu (L) (3,0 g, 29 mmol) v 51 ml 10% roztoku trietylamínu v metanole sa pridá diterc.butyldikarbonát (6,7 g, 31 mmol). Reakčná zmes sa mieša 1 hodinu pri 25’C a odstráni sa z nej rozpúšťadlo. Zvyšok sa rozpustí v dichlórmetáne (30 ml) a dichlórmetanový roztok sa premyje dvakrát IM hydrogensíranom draselným (pH 2) a raz nasýteným roztokom chloridu sodného, vysuší síranom horečnatým a pri zníženom tlaku sa z nej odstráni rozpúšťadlo. Získa sa 5,8 g (výťažok 93 %) 3- (terc.butoxykarbonyl)amino-2,2-dimetylpropán-l-olu vo forme bielej pevnej látky, ktoré sa použije priamo v nasledujúcom stupni bez ďalšieho prečistenia (>95% čistota podlá analýzy NMR) teplota topenia: 70,5 až 71,5’C; IR v_max 3350, 1685, 1456 cm^-1; ¹H NMR: δ 4,87 (NH, brs), 3,72 (OH, brs), 3,19 (1-H2, d, 5,1), 2,95 (3-H2, d, 6,0), 1,44 (CMe3, s), 0,85 (2-Me2, s), ¹³C NMR (CDC13): δ 157,6 (BOC CO), 79,7 (CMe₃), 68,1 (1), 47,1 (3), 36,7 (2), 28,3 (CMe₃), 22,4 (2-Me₂).

158

K roztoku alkoholu, 3-(terc.butoxykarbonyl)amino-

2,2-dimetylpropán-l-olu (5,3 g, 25,9 mmol) a jodistanu sodného (16,6 g, 77,7 mmol) v tetrachlórmetáne (52 ml), acetonitrile (52 ml) a vode (78 ml) sa pridá hydrát chloridu rutenitého (122 mg). Výsledná zmes sa mieša 1 hodinu pri 25’C, prefiltruje cez celit a pridá sa k nej nasýtený roztok uhličitanu draselného vo vode (50 ml). Vodná vrstva sa

oddelí, premyje éterom (20 ml), okyslí pri O’C kyselinou chlorovodíkovou na pH 2 a extrahuje dichlórmetánom (30 ml x 3). Spojené extrakty sa premyjú nasýteným roztokom chloridu sodného a vysušia síranom horečnatým. Rozpúšťadlo sa odstráni pri zníženom tlaku. Zvyšok sa najskôr podrobí rýchlej chromatografii s obrátenými fázami na silikagéli C18 (ODS 120Ä, 12 nm) pri použití 50 až 90% metanolu, ako elučného činidla a potom prekryštalizuje z éteru. Získa sa 3,7 g (66% výťažok) zlúčeniny M vo forme bielej pevnej látky s teplotou topenia 106 až 108’C; EIMS m/z (rel. intenzita) 217 (0,1), 161 (11), 98 (25), 88 (71), 57 (100); HREIMS m/z 217,1292 (C₁₀H_igN0₄, delta +2,2 mmu); IR v_max 3450-2500, 1710, 1694, 1510 cm¹; ¹H NMR hlavného konforméru: δ 5,03 (NH, brs), 3,26 (3-H2, m), 1,45 (CMe3, s), 1,24 (2-Me2, s); ¹³C NMR (CDC13): δ 183,2 (1), 156,3 (BOCCO), 79,6 (CMe₃), 49,5/47,9 (2/3), 28,4 (CMe₃), 22,9 (2-Me₂).

Alyl(2S)-2-hydroxy-4-metylpentanoát (N)

K roztoku 2,66 g L-2-hydroxy-4-metylpentánovej kyseliny (20 mmol) a 1,74 g hydrogenuhličitanu sodného (20 mmol) v 30 ml vody sa pri O’C pridá 30 ml dichlórmetánového roztoku 6,44 g tetrabutylamóniumchloridu (20 mmol) a 1,74 ml alylbromidu (20 mmol). Reakčná zmes sa 24 hodín intenzívne mieša a potom sa z nej odparí dichlórmetán. K zvyšku sa pridá asi 50 ml vody a vodná vrstva sa extrahuje štyrikrát dietyléterom. Éterový roztok sa vysuší bezvodým síranom sodným a potom odparí. Zvyšok sa nechá prejsť krátkym

159 stĺpcom silikagélu. Získa sa 3,21 g alylesteru N (výťažok 93,0) vo forme bezfarbého oleja, [a]_D -8,4° (c 1,1, CHClj); IR 3464, 2957, 1732, 1203, 1140, 1087 cm’¹; ‘H NMR δ

5,92 (a iyl 2-H; m), 5,34 (a'iyl 3-H_z; dd, 17,4/1,1), 5.28 (a iyl 3-H_£; dd, 10,5/1,1), 4,67 (a lyl 1-H₂; d, 5,7), 4,23 (2-H; br s), 2,64 (OH; br s), 1,89 (4-H; m), 1,57 (3-H₂; m), 0,96 (5-H₃; d, 6,5), 0,95 (4-Me; d, 6,7); ^,3C NMR δ 175,3 (1), 131,4 (a.lyl C-2), 118,6 (3), 68,9 (2), 65,7 (a Iyl C-l), 43,2 (3), 24,1 (4), 23,0 (5), 21,3 (4-Me).

Alyl-(2S)—2—[3· — (terc.Butoxykarbonyl)amino-2·,2*-dimetyl-

propanoyloxy]-4-metylpentanoát (O)

K roztoku 0,8 g zlúčeniny M (3,7 mmol), 0,76 g zlúčeniny N (4,4 mmol) a 92 mg DMAP v 10 ml suchého dichlórmetánu sa pri O’C pridá 0,84 g DCC (4,1 mmol) v dichlórmetáne. Reakčná zmes sa mieša 3 hodiny pri 25’C a prefiltruje. Filtrát sa premyje nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vysuší síranom sodným a odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa podrobí rýchlej chromátografii na silikagéli pri použití 5% etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla. Získa sa 1,0 g (výťažok 92 %) čistej zlúčeniny O vo forme bezfarbého oleja, R_f 0,68 (17:83 EtOAc/ hexán), [a]p -29,4°(c 18,1, CHC1₃); EIMS m/z (rel.intenzita) 371 (2,M⁺), 242 (13), 184 (12), 126 (20) 84 (100); HREIMS m/z 371,2317 (^ci9^H33NOg, delta -0,9mmu); IR (in substancia) ^vmax ³³⁸⁵' 2963, 1731, 1720, 1513 cm“¹, ¹H NMR (300 MHz CDC1₃): C δ 5,39 (NH, zastrený brs), 3,33 (3-H, dd,-13,5/7,4)

3,27 (3-H’; dd, -13,5/5,9), 2,78 (2-H, m), 1,44 (CMe,; s), 1,23 (2-Me; s), 1,22 (2-Me; s); D δ 5,91 (a Iyl 2-H. ddt, 16,6/10,3/6,0 Hz), 5,34 (a Iyl 3-H_z; bd, 16,6), 5,27 (alyl 3-H_£; bd, 10,3), 5,08 (2-H; dd, 9,6/3,6), 4,65 (a Iyl 1-H₂; m), 1,6-1,9 (3-H₂/4-H; m), 0,94 (5-H₃; d, 6,3), 0,94 (4-Me; d, 7,3). ^,3C NMR C δ 176,5 (1). 156,3 (BOC CO), 79,0 (CMe₃), 48,6 (3), 44,0 (2), 28,4 (CMe,). 22,2/23,0 (2-Mej); D Ô 170,6 (1), 131,4 (alyl C-2), 119,1 (ťIyl C-3), 70,9 (2), 66,0 (a lyl C-l), 39,5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me).

160 (2S) -2- [ 3 ' - (terc. Butoxykarbonyl) amino-2' , 2' -dimetylpropanoyloxy]-4-metylpentánová kyselina (P)

K 10 ml roztoku 180 mg (0,49 mmol) zlúčeniny O a 60 mg (0,05 mmol) tetrakis(trifenylfosfín)paládia v suchom tetrahydrofuráne (pod atmosférou argónu) sa pomaly behom 10 minút pridá 470 μΐ (5,4 mmol) suchého morfolínu. Vzniknutá zmes sa 50 minút mieša, potom sa k nej pridá 40 ml éteru. Výsledný roztok sa premyje IM kyselinou chlorovodíkovou (40 ml) a extrahuje nasýteným hydrogenuhličitanom sodným (2 x 30 ml). Vodný extrakt sa okyslí 0,5M kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje éterom (40 ml). Éterový extrakt sa premyje vodou (2 x 30 ml), vysuší síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Získa sa zlúčenina P vo forme bezfarbého riedkeho oleja (152 mg, 95 %); [α]θ -22,2” (c 2,2, CHC1₃); EIMS m/z (relatívna intenzita) 331 (1, M⁺), 275 (1), 258 (4), 231 (9), 202 (36), 174 (13), 144 (31), 126 (16), 114 (14), 98 (54), 88 (50), 84 9100); HREIMS m/z 331,2004 (C₁₆H₂₉N0₆, delta -l,0mmu). ¹H NMR (CDClj) C δ 5,41 (NH; dd, 5,7/5,4), 3,30 (3-H,; m), 2,68 (2-H; m), 1,43 (CMe_?; br s), 1,22 (2-Me; s), 1,21 (2-Me; s); D δ 6,47 (1-OH; br s, W_in = 35), 5,09 (2-H; dd, 9,3/2,7), 1,7-1,9 (3-H₂/4-H; m), 0,97 (5-H₃; d, 6,0), 0,94 (4-Me; d, 6,0). ^I}C NMR (CDClj) C δ 176,5 (1), 156,5 (BOC CO), 79,3 (CMe₃), 48,6 (3), 44,0 (2), 28,3 (CM&j), 23,0 (2-Me), 22,2 (2-Me); D δ 175,4 (1), 70,6 (2), 39,5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,4 (4-Me).

Zlúčenina Q

K roztoku alkoholu K (80 mg, 0,14 mmol), kyseliny P (68 mg, 0,21 mmol) a DMAP (4 mg) v suchom dichlórmetáne (4 ml) sa za miešania pri 0C pod atmosférou argónu pridá DCC (44 mg, 0,21 mmol) v suchom dichlórmetáne (1 ml). Výsledná zmes sa mieša pri 0C počas 30 minút, behom ktorej sa vylúči biela zrazenina. Potom sa zmes nechá zahriať na teplotu miestnosti a mieša ďalšie 4 hodiny. Zrazenina sa odfiltruje,

161 filtrát sa zriedi dietyléterom (40 ml) a dietyléterová zmes sa premyje postupne zriedenou kyselinou chlorovodíkovou (IM, 40 ml), nasýteným hydrogenuhličitanom sodným (40 ml) a vodným chloridom sodným (40 ml). Éterová vrstva sa vysuší síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Získaná voskovitá pevná látka sa podrobí chromatografii na silikagéli pri použití zmesi etylacetátu a hexánu v pomere 1:3, ako elučného činidla. Získa sa čistá zlúčenina Q vo forme bezfarbého viskózneho oleja (103 mg, 84 %), [a]_D -3,1’ (c 2,9, CHClj); EIMS m/z 800/802/804/806 (< 1, Μ⁺-ΰ₃Η₈Ο₂), 415/417/419/421 (5/3/3/2), φ 342/344/346 (7/9/4), 286/288/290 (2/6/2), 207 (34), 178 (22), 155/157 (66/24), 131 (36), (70), 70 (100); HREIMS m/z 800,2179 (C₃₈H₄₈N₂O₈ ^3SC1₄, A-l,4mmu); UV (MeOH) (e) 204 (51200), 230 (18500), 248 (17200), 282 (2200) nm; IR (NaCl) 3376, 2965, 1755, 1728, 1712, 1678, 1504, 1258, 1150, 1067, 732 cm·*. *H NMR (CDC1₃) δ A: 7,28-7,33 (10-H/14-H/11-H/13-H; m), 7,22 (12-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,8/6,4/6,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6,01 (7-H; dd, 15,8/8,7), 5,88 (2-H; d, 15,8), 5,06 (5-H; bm, W_1/2~20 Hz), 2,62 (6-H; m), 2,53 (4-H₂; bm, W_w»15 Hz), 1,12 (6-CH₃; d,

6.8) ; B 7,18 (5-H; d. 2,0), 7,05 (9-H; dd, 8,5/2,0), 6,83 (8-H; d, 8,5), 6,49 (NH; d,

7.9) , 5,06 (2-H; bm, W_in«20 Hz), 4,79/4,70 (CH₂CC1₃; AB q, -11,7), 3,85 (OCH₃; s),

3,20 (3-H_b; dd, -14,1/5,8), 3,07 (3-H.; dd, -14,1/6,7); C 5,38 (NH; bt, 6,5), 3,27 (3-H₂; d, 6.5), 1,20 (2-CH₃; s), 1,15 (2-CH/; s); D 4,92 (2-H; dd, 10,0/3,8), 1,72 φ (4-H; bm, W_in=20 Hz), 1,67 (3-H_b; ddd, -14,1/10,0/5,0/), 1,56 (3-H.; ddd, 14,1/9,1/3,8), 1,43 (CO₂CMej; s), 0,86 (4-CH₃; d, 6,4), 0,82 (5-H₃; d, 6,4). ^,JC NMR (CDC1₃) δ A 165,4 (1), 139,3 (3), 136,9 (9), 131,7 (8), 130,1 (7), 128,6 (11/13),

127,5 (12), 126,2 (10/14), 125,4 (2), 76,5 (5), 41,1 (6), 33,4 (4), 16,7 (6-Me); B 170,0 (1), 154,1 (7), 131,2 (5), 128,8 (4), 128,5 (9), 122,3 (6). 112,1 (8), 94,3 (CHjCClj), 74,6 (£H₂CC1₃), 56,1 (7-OMe), 53,2 (2), 36,6 (3); C 176,9 (1), 156,4 (CO₂CMe₃), 79,1 (COjCMe₃), 48,7 (3), 44,0 (2), 22,8 (2-Me), 22,3 (2-Me’); D

170,7 (1), 71,4 (2), 39,5 (3), 28,4 (CO,CMe,). 24,8 (4), 23,0 (4-Me), 21,4 (5).

162

Aminokyselina R

K aminokyseline Q (100 mg, 0,11 mmol) sa pridá aktivovaný zinkový prach (400 mg, v prebytku) a kyselina octová (4 ml). Heterogénna zmes sa na 45 minút podrobí sonikácii, ďalších 90 minút mieša pri teplote miestnosti a potom naleje na vrstvu celitu. Organická látka sa z vrstvy celitu vymyje dichlórmetánom a zo vzniknutého roztoku sa pri zníženom tlaku odstráni rozpúšťadlo. Získa sa karboxylová kyselina vo forme bezfarbej amorfnej pevnej látky.

Surový produkt sa bez ďalšieho prečistenia rozpustí v trifluóroctovej kyseline (TFA, 5 ml) a nechá stáť 1 hodinu pri teplote miestnosti. Potom sa z nej pri zníženom tlaku odstráni prebytok trifluóroctovej kyseliny. Výsledná amorfná pevná látka sa potom podrobí chromatografickému prečisteniu na Sep-Pak(^R), silikagéli, pri použití dichlórmetánu a potom 10% metanolu v dichlórmetáne, ako elučného činidla. Získa sa trifluóracetát amóniovej soli požadovanej zlúčeniny. Opakovanou lyofilizáciou získaného vodného roztoku soli sa získa požadovaná volná aminokyselina R vo forme bezfarbej amorfnej pevnej látky (68 mg, výťažok 91 % z dvoch stupňov); IR (NaCl) ''max ³³⁰⁰'

3200, 2965, 1693, 1606, 1504, 1441, 1259, 1201, 1146, 1066, 727 cm·¹. *H NMR (CDjOD) δ A: 7,33 (10-H/14-H; d, 7,4), 7,28 (11-H/13-H; t, 7,4), 7,18-7,23 (12-H; m), 6,69 (3-H; ddd, 15,6/7,7/7,0), 6,43 (8-H; d, 15,8), 6,04 (7-H; dd, 15,8/8,9), 6,00 (2-H; d, 15,6), 5,01 (5-H; ddd, 9,1/6,9/3,1), 2,64 (4-H_b; bm, W_w»30 Hz), 2,60 (6-H; bm. W_1/2~20 Hz), 2,49 (4-H_a; ddd, 15,8/9,1/7,7), 1,13 (6-Me; d, 6,7); B 7,18-7,23 (5-H; m), 7,11 (9-H; dd, 8,3/1,6), 6,92 (8-H; d, 8,3), 4,59 (2-H; bm, W_in®20 Hz),

3,81 (OCHj-.s), 3,14 (3-H_b; dd, -13,7/4,3), 2,96 (3-H,; m, W_in«20 Hz); C2,96 (3H₂; bm, W,_n«20 Hz), 1,31 (2-CH₃; s), 1,25 (2-CH₃’; s); D 4,90 (2-H; dd, 9,6/4,0), 1,66 (4-H; bm, W_in»25 Hz), 1,59 (3-H_b; ddd, -14,4/9,6/4,8), 1,53 (3-H,; ddd, 14,4/9,1/4,0), 0,81 (4-Me; d, 6,5), 0,74 (5-H₃; d, 6,5). ⁿC NMR (CD₃OD) δ A

163

167,7 (1). 140,7 (3), 138,4 (9), 133,0 (8), 131,7 (7), 129,6 (11/13), 128,5 (12), 127,3 (10/14), 127,1 (2), 78,4 (5), 43,1 (6), 35,7 (4), 17,4 (6-Me); B 179,8 (1), 155,2 (7),

132,3 (4), 132,1 (5), 130,1 (9), 123,0 (6), 113,4 (8), 56,6 (7-OMe), 56,6 (2), 37,8 (3),

C 176,8 (1), 48,2 (3), 42,2 (2), 23,3 (2-Me), 23,3 (2-Me’); D 172,0 (1), 73,4 (2), 40,7 (3), 26,0 (4), 23,1 (4-Me), 21,8 (5).

Kryptofycín 51

K miešanému roztoku aminokyseliny T (75 mg, 0,11 mmol) v bezvodom dimetylformamide (20 ml) sa pri teplote miestnosti pod atmosférou argónu pridá diizopropyletylamín (DIEA, 44 mg, 60 μΐ, 0,34 mmol, asi 3 ekvivalenty) a potom pentafluórdifenylfosfinát (FDPP, 55 mg, 0,14 mmol, asi 1,3 ekvivalentu) v dimetylformamide (2 ml). Reakčná zmes sa 12 hodín mieša a pridá sa k nej dietyléter (40 ml). Éterová vrstva sa premyje postupne kyselinou chlorovodíkovou (IM, 40 ml), vodným roztokom chloridu sodného (40 ml) a vodou (40 ml), vysuší síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Voskovitý pevný zvyšok sa ďalej prečistí chromatografiou s obrátenými fázami (ODS, 10 μπι), pričom elúcia sa vykonáva zmesou 30% voda/acetonitril rýchlosťou 3 ml.min”¹. Získa sa kryptofycín 51 vo forme bezfarbej amorfnej pevnej látky (45 mg, 61 %), [a]D +26,4” (c 0,25, CHC13); EIMS m/z 652/654 (M⁺, 3/1), 632/634 (3/2), 426/428 (51/15), 227 (64), 195/197 (64/22), 155/157 (71/15), 131 (59), 91 (100); HREIMS m/z 652.2936 (C36H_4SN₂O₇ ^MC1, Ä-2,lmmu); UV (MeOH) X^, (c) 204 (52000), 228 (20400), 250 (13400), 284 (2800) nm; IR (NaCI) 3376, 3270, 2960, 1747, 1721, 1659, 1536, 1514, 1259, 1150, 1066, 1013, 980, 694 cm·’. *H NMR (CDClj) δ A 7,32 (10-H/14-H; dd, 8,0/1,5), 7,29 (11-H/13-H; t, 8,0), 7,24 (12-H;

bm, W_w«15 Hz), 6,77 (3-H; ddd, 15,2/10,8/4,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6_;01 (7-H; dd, 15,8/8,8), 5,76 (2-H; dd, 15,2/1,1), 5,04 (5-H; ddd, 11,1/6,4/1,9), 2,54 (4-H_b/6-H; bm, W_w« 15 Hz), 2,37 (4-H,; ddd, -14,3/11,1/10,8 ), 1,13 (6-Me; d, 6,8); B 7,20 (5-H; d, 2,0), 7,05 (9-H; dd, 8,4/2,0), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,61 (NH; d, 7,8), 4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,4), 3,87 (OMe; s), 3,11 (3-H_b; dd, -14,2/5,4), 3,06 (3-H/, dd, -14,2/7,6); C 7,24 (NH; bm, W_in = 15 Hz), 3,40 (3-H_b; dd, -13,5/8,5), 3,12 (3-H/, dd, -13,5/3,6),

1,22 (2-Me; s), 1,15 (2-Me’, s); D 4,85 (2-H; dd, 10,2/3,6), 1,66 (3-H_b; ddd, 14,0/10,2/4,6), 1,61 (4-H; bm W_l/2 = 20,0 Hz), 1,33 (3-H,; ddd, -14,0/9,0/3,6), 0,74 (4-

164

Me; d, 6,6), Q_s72 (5-H₃; d, 6,6). ⁿC NMR (CDC1₃) δ A 165,1 (1), 142,2 (3), 136,7 (9), 131,7 (8>, 130,1 (7), 128,6 (11/13), 127,5 (12), 126,1 (10/14), 124,6 (2), 77,0 (5),

42,2 (6), 36,5 (4), 17,3 (6-Me); B 170,3 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,3 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2), 35,3 (3); C 178,0 (1), 46,5 (3),

42,7 (2), 22,8 (2-Me), 22,6 (2-Me’); D 170,6 (1), 71,5 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).

Príklad 9

Syntéza kryptofycínu 52 a kryptofycínu 53

K miešanému roztoku kryptofycínu 51 (75 mg, 0,12 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (7,5 ml) sa pri 0°C pod atmosférou argónu pridá roztok m-chlórperoxobenzoovej kyseliny (mCPBA, 50 mg, 0,23 mmol, asi 2 ekvivalenty, vztiahnuté na 80% aktívny kyslík) v dichlórmetáne (1 ml). Po 30 minútach sa reakčná zmes nechá zahriať na teplotu miestnosti a mieša ďalších 12 hodín, potom sa z nej pri zníženom tlaku odstráni rozpúšťadlo. Získa sa zmes kryptofycínov 52 a 53 v pomere 1,8 : 1 (podlá analýzy NMR) vo forme amorfnej pevnej látky. Zmes regioizomérických epoxidov sa rozpustí v minimálnom množstve acetonitrilu a vzniknutý roztok sa podrobí chromatograf i i s obrátenými fázami (YMC-ODS, 10 μπι, 250 mm x 22,5 mm, 30% H₂O/MeCN, 6 ml.min”¹), čím sa oddelí kryptofycín 52 (37 mg, 48 %) a kryptofycín 53 (19 mg, 25 %).

Spektrálne údaje kryptofycínu 52 [a]_D +19,9° (c 0.5, CHC1₃); EIMS m/z 668/670 (4/2, M⁺), 445 (35), 244 (12),

227 (22), 195/197 (66/27), 184 (45), 155/157 (38/10), 91 (100); HREIMS m/z 663.2&Ί3 (CjeH^NjO^Cl, A-0.9mmu), 445,2497 (C^NC^, A-3,3mmu); UV (MeOH) λ,^ (č) 204 (35100), 218 (20900) nm; IR (NaCl) 3415, 3270, 2960, 1748, 1721, 1650, 1536, 1504, 1260, 1192, 1150, 1066, 1013, 800, 698 cm¹. ’H NMR (CDC1₃) δ A 7,33-7,38 (11-H/12-H/13-H; bm, W_w®25 Hz), 7,24 (10-H/14-H; m, W_ln«15 Hz),

165

6,76 (3-H; ddd, 15,1/10,8/4,3), 5,71 (2-Η; dd, 15,1/1,7), 5,20 (5-H; ddd, 11,0/5,0/1,8),

3,68 (8-H; d, 1,9), 2,92 (7-Η; dd, 7,5/1,9), 2,57 (4-H_b; ddd, -14,6/1,8/1,7), 2/45 (4-H.; ddd, -14,6/11,0/10,8), 1,78 (6-H; bm, 15 Hz), 1,14 (6-Me; d, 6.9); B 7,18 (5-H; d, 2,2), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,2), 6,83 (8-H; d, 8,4), 5,56 (NH; d, 7,9), 4,73 (2-H; ddd, 7,9/7,4/5,3), 3,87 (OMe; s), 3,09 (3-H_b; dd, -14,6/5,3), 3,05 (3-H.; dd, -14,6/7,4);

C 7,20 (NH; dd, 8,6/3,2), 3,41 (3-H_b; dd, -13,4/8,6), 3,10 (3-H.; dd, -13,4/3,2),

1,22 (2-Me; s), 1,15 (2-Me’; s); D 4,82 (2-H; dd, 10,2/3,5), 1,73 (3-H_b; bm, W_1/2 = 20 Hz), 1,66 (4-H; bm, W_in«20 Hz), 1,31 (3-H.; ddd, -13,8/9,1/3,5), 0,84 (4Me; d, 6,6), 0,82 (5-H₃; d. 6,6); ^,3C NMR (CDC1₃) δ A 164,9 (1), 141,8 (3), 136,7 (9), 128,7 (11/13), 128,3 (12), 125,6 (10/14), 124,7 (2), 75,9 (5), 63,0 (7), 59,0 (8),

40.7 (6), 36,9 (4), 13,5 (6-Me), B 170,3 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,5 (9), 122,6 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), unit C 178,0 (1), 46,5 (3),

42.8 (2), 22,8 (2-Me), 22,8 (2-Me’), D 170,5 (1), 71,2 (2), 39,3 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21^2 (5).

Spektrálne údaje kryptofycínu 53 [a]_D +20,8° (c 1,7, CHC1₃); EIMS m/z 668/670 (5/4, M⁺), 445 (32), 244 (15), 227 (24), 195/197 (64/21), 184 (60), 155/157 (33/9), 91 (100); HREIMS m/z 668,2853 (C36H4JN2Og^3SCl, Al,lmmu); UV (MeOH) (é) 204 (38700), 218 (22900) nm; IR (NaCl) Vim 3415, 3280, 2917, 2849, 1748, 1722, 1660, 1504, 1465, 1260, 1190, 1150, 1066, 755 cm·’. *H NMR (CDC1₃) δ A 7,29-7,36 (11-H/12-H/13-H, bm, W_I/2®20 Hz), 7,23 (10-H/14-H; dd, 8,3/1,7), 6,77 (3-H; ddd, 15,1/10,9/4,3), 5,81 (2-H; dd, 15,1/1,3), 5,17 (5-H; ddd, 11,2/4,9/1,8), 3,58 (8-H; d, l_r7), 2,90 (7-H; dd, 7,8/1,7),

2,67 (4-H_b; ddd, 14,7/11,2/10,9), 2,56 (4-H.; dddd, 14,7/4,3/1,8/1,3), 1,67-1,78 (6-H; bm, W_1/2=45), 1,03 (6-CH₃; d, 7,1); B 7,21 (5-H; d, 2,1), 7,07 (9-H; dd, 8,5/2,1), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,90 (2-NH; d, 7,9), 4,75 (2-H; ddd, 7,9/7,9/4,9), 3,85 (7-OCH₃; s),

3,14 (3-H_b; dd, 14,5/4,9), 3,03 (3-H,; dd, 14,5/7,9); C 7,29-7,36 (3-NH; bm, W_in»25), 3,43 (3-H_b; dd, 13,7/8,8), 3,10 (3-H,; dd, 13,7/3,4), 1,23 (2-CH₃; s), 1,17 (2-CH₃*; s); D 4,92 (2-H; dd, 10,3/3,2), 1,67-1,78 (3-H_b/4-H; bm, W_w=45), 1,48 (3-H.; ddd, 13,9/8,8/3,2), 0,89 (4-CH₃; d, 6,6), 0,86 (5-H₃; d, 6,6). ^,3C NMR (CDC1₃)

166 δ A 165,1 (1), 142,0 (3), 137,0 (9), 128,5 (11/13), 128,5 (12), 125,3 (10/14), 124,6 (2) , 76,7 (5), 63,2 (7), 56,2 (8), 40,8 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); B 170,4 (1), 154,0 (7), 130,8 (5), 129,7 (4), 128,2 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,4 (2), 35,3 (3) ; C 177,9 (1), 46,4 (3), 42,7 (2), 23,0 (2-Me), 22,7 (2-Me’); D 170,5 (1),

71,3 (2), 39,2 (3), 24,7 (4), 22,8 (4-Me), 21,3 (5).

Príklad 10

Syntéza kryptofycínu 55

K roztoku kryptofycínu 52 (6 mg, 0,009 mmol) v 0,6 ml zmesi 1,2-dimetoxyetánu a vody (2 : 1) sa pridajú 2 μΐ 12M kyseliny chlorovodíkovej. Výsledný roztok sa 20 hodín mieša pri teplote miestnosti, neutralizuje uhličitanom draselným, prefiltruje cez filter s veľkosťou pórov 5 μπι a filtrát sa odparí. Acetonitrilová vrstva sa prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami na stĺpci C18 (250 x 10 mm) pri použití zmesi metanolu a vody (4 : 1), ako elučného činidla. Získa sa 3,0 mg kryptofycínu 55 (48 %). [a]_D +42,5° (c 1,1, CHC1₃); EIMS m/z 704/706/708 (M⁺<1),

668/670 (1,5/0,5, M⁺-HC1), 445 (6), 226 (8), 195/197 (16/5), 184 (10), 155/157 (33/11), 135 (100), 91 (99), 77 (30); HREIMS mh 668,2873 (M⁺-HCI, Δ0,8mmu); UV (MeOH) (e) 204 (48400), 218 (29200), 284 (1600) nm; IR (NaCI) 3410, 3286, 2959, 1748, 1723, 1666, 1538, 1504, 1455, 1257, 1178, 1066, 753 cm-*.

‘H NMR (CDClj) δ A 7.35-7,42 (10-H/11-H/12-H/13-H/14-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,1/10,6/4,5), 5,78 (2-H; dd, 15,1/1,7), 5,16 (5-H; ddd, 11,1/8,3/2,1), 4,65 (8-H; d, 9,7), 4,01 (7-H; bd, 9,7), 2,69 (4-H_b; dddd, -14,5/4,5/2,1/1,7), 2,50 (6-H; bm, W_in = 15), 2,38 (4-H.; ddd, -14,5/11,1/10,6), 1,53 (7-OH, s), 1,04 (6-Me, d, 7,1); B l_t21 (5-H; d, 2,2), 7,07 (9-H; dd, 8,5/2,2), 6,85 (8-H; d, 8,5), 5,57 (2-NH; d, 7,8),

4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,2), 3,88 (7-OCH₃; s), 3,13 (3-H_b; dd, 14,5/5,2), 3,05 (3-H.; dd, 14,5/7,6); C 7,21 (3-NH; m), 3,38 (3-H_b; dd, 13,5/8,3), 3,17 (3-H.; dd, 13,5/4,1), 1,23 (2-CH₃; s), 1,17 (2-CH₃’; s), D 4,93 (2-H; dd, 10,1/3,5), 1,78 (3H_b; ddd, 13,5/10,1/5,0), 1,72 (4-H; bm, W_in=20), 1,43 (3-H.; ddd, 13,5/8,8/3,.5), 0,92 (4-CH₃; d, 6,6), 0,92 (5-H₃, d, 6,4). C NMR (CDCi₃) δ A 165,1 (C-l), 142,4 (C-

167

3), 138,4 (C-9), 129,0 (C-ll/13), 128,3 (C-12), 128,0 (C-10/14). 124,6 (C-2), 76,1 (C5). 74,1 (C-7), 62,0 (C-8), 38,4 (C-6), 36,5 (C-4), 8,6 (6-Me); B 170,3 (C-l), 154,1 (C-7), 130,9 (C-5), 129,6 (C-4), 129,2 (C-9), 122,6 (C-6), 112,3 (C-8), 56,1 (7-OMe),

54,3 (C-2), 35,3 (C-3); C 177,8 (C-l), 46_;5 (C-3), 42,8 (C-2), 22,9 (2-Me), 23,0 (C-2-Me’); D 170,3 (C-l), 71,3 (C-2), 39,7 (C-3), 24,8 (C-4), 22.,7 (4-Me), 21,6 (C-5).

Získa sa rovnako zodpovedajúci diol, kryptofycín 56, (2,8 mg, výťažok 44 %).

Príklad 11

Syntéza kryptofycínu 57

Do nádoby obsahujúcej 0,5 ml dichlórmetánu sa pridá malé množstvo (asi 1 mg) oxidu platičitého. Vzduch z nádoby sa odčerpá a nahradí vodíkom. Reakčná zmes sa mieša 20 minút pri teplote miestnosti, potom sa k nej pridá roztok obsahujúci 10,2 mg kryptofycínu 52 (0,015 mmol) v dichlórmetáne (0,3 ml). Vzniknutá zmes sa mieša ďalších 30 minút pri teplote miestnosti a potom sa z nej filtráciou cez vrstvu celitu na vate odstráni katalyzátor a pri zníženom tlaku sa odstráni rozpúšťadlo. Zvyšok sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii s obrátenými fázami (ODS, 10 μπι, 250 x 22,5 mm), pričom elúcia sa vykonáva zmesou acetonitrilu a vody v pomere 3 : 1 rýchlosťou 5 ml.min¹. Získa sa čistý kryptofycín 57 (9,1 mg, 89 %). [a]_D +3,4 (c 4,5, CHC1₃); EIMS m/z 670/672 M⁺,

9/3), 447 (10), 246 (63), 229 (20), 195/197 (78/25), 184 (58), 155/157 (39/13), 128 (21), 91 (100), 77 (23); HREIMS m/z 670.3037 (C^H^NjO/'Cl, A-l,6mmu); UV (MeOH) (_€) 204 (31400), 218 (12000), 284 (1200) nm; Ή NMR (CDC1₃) δ A: 7,30-1,31 (11/12/13-H, bm), 7,23 (10/14-H, bdd, 7,9, 1,9), 5,03 (5-H, ddd, 9,0, 5,6, 3,4), 3,66 (8-H, d, 2,1), 2,89 (7-H, dd, 7,7, 2,1), 2,27 (2-H_b, ddd, 14,3, 8,7, 6,2), 2,04 (2-H., ddd, 14,3, 8,8, 6,8), l,64-l_r75 (6-H/4-H₂, bm), 1,61 (3-H₂, bm, W_in«25), 1,11 (6-CH₃,

168 d, 7,1), B: 7,19 (5-H, d, 2,1), 7,04 (9-H, dd, 8,3, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8.3), 5,55 (2NH, d, 8,3), 4,65 (2-H, ddd, 8,3, 7,3, 5,3), 3,87 (7-OCH₃, s), 3,16 (3-H_b, dd, 14,3,

7.3) , 3,08 (3-H_lt dd, 14,3, 5,3), C: 6,91 (3-NH, dd, 6,4, 6,4), 3,41 (3-H_b, dd, 13,5,

6.4) , 3,30 (3-H., dd, 13,5, 6,4), 1,21 (2-CH₃, s), 1,13 (2-CH₃’, s), D: 4,80 (2-H, dd, 9,8, 4,1), 1,64-1,75 (3-H_b/4-H, bm), 1,34 (3-H„ ddd, 15,4, 10,1, 4,1), 0.86 (4-CH₃, d, 6,5), 0,84 (5-H₃, d, 6,5); ^,JC NMR (CDC1₃) Ô A: 172,6 (1), 136,9 (9), 128,7 (11/13), 128,5 (12), 125,6 (10/14), 76,8 (5), 63,4 (7), 59,2 (8), 40,2 (6), 36,2 (2), 32,2 (4), 21,4 (3), 13,6 (6-Me), B: 170,4 (1), 154,0 (7), 131,1 (5), 130,0 (4), 128,5 (9),

122,5 (6), 112,2 (8), 56,1 (7-OMe). 54,3 (2), 35,3 (3), C: 177,6 (1), 47,0 (3), 43,1 (2), 22,5 (2-Me’), 22,4 (2-Me), D: 171,7 (1), 72,0 (2), 39,0 (3), 24,6 (4), 22,8 (4Me), 21,8 (5).

Príklad 12

Syntéza kryptofycínu 58

K miešanému roztoku kryptofycínu 57 (5,5 mg, 0,008 mmol) v 3 ml chloroformu, ktorý neobsahuje etanol, sa pri asi -60*C pridá TMSC1 (tak, ako bol získaný od firmy Aldrich, asi 4,5 mg, asi 5,2 μΐ, asi 0,04 mmol). Reakčná zmes sa mieša 20 minút, keď chromatografia na tenkej vrstve ukáže, že v nej nie je prítomná žiadna východisková látka. Prchavé zložky sa odstránia pri zníženom tlaku. Amorfný pevný zvyšok sa vyberie do acetonitrilu a acetonitrilový roztok sa podrobí vysokotlakovej kvapalinovej chromatograf i i (ODS, 10 μπι, 250 x 22,5 mm), pričom elúcia sa vykonáva zmesou acetonitrilu a vody v pomere 3 : 1 rýchlosťou 5 ml.min“¹. Ako hlavný produkt sa získa čistý kryptofycín 58 (5,4 mg, 93 %). [a]_D +7,2 (¢=2,1, CHClj); EIMS m/z 706/708/710 (M*, 27/23/8), 670/672 (M*-HC1, 14/13), 583 (54), 581 (53), 485 (23), 483 (21), 447 (34), 294 (21), 282 (39), 246 (57), 195/197 (87/27), 184 (73), 155/157 (45/10), 128 (30), 91 (95), 77 (30), 69 (100); HREIMS m/z 706.2844 (CV^NA^Cl,. A-5,6mmu), m/z 670,3070 (M*-HC1, C₃₆H₄₇N₂O₈ ^3JC1, Δ4,9mmu); ΙΑΓ(ΜβΟΗ) (e) 204 (331900), 218 (11800), 284 (1800) nm; ‘H NMR (CDCIj) δ A: 7,34-7,42 (10/11/12/13/14-H, bm), 5,01 (5-H, ddd, 9,6, 8,3, 2,5), 4,65 (8-H, d, 9,6). 4,00 (7-H, dd, 9,6, 1,9), 2,42 (6-H, ddq, 8,3, 1,9, 7,0), 2,29 (2-H_b,

169 ddd, 14,3, 9,4, 4,5), 2,06 (2-H„ ddd, 14,3, 8,3, 7,5), 1,62-1,82 (3-H₂/4-H₂, bm), 0,99 (6-CHj, d, 7,0), . B: 7,20 (5-H, d, 2,1), 7,06 (9-H, dd, 8,3, 2,1), 6,84 (8-H, d, 8,3),

5,62 (2-NH, d, 8,3), 4,61 (2-H, ddd, 8,3, 7,7, 5,4), 3,87 (7-OCH₃, s), 3,17 (3-H_b, dd,

14.3, 7,7), 3,11 (3-H., dd, 14,3, 5,4), C: 6,97 (3-NH, dd, 6,4, 6,2), 3,43 (3-H_b, dd,

13.4, 6,2), 3,31 (3-H., dd, 13,4, 6,4), 1,23 (2-CH₃, s), 1,16 (2-CH₃’, s), D: 4,93 (2H, dd, 10,0, 4,0), 1,86 (3-H_b, ddd, 14,0, 10,0, 5,5), 1,58 (3-H., ddd, 14,0, 8,3, 4,0), 0,97 (4-CH₃, d, 6,8), 0,94 (5-H₃, d, 6,6); ^,3C NMR (CDC1₃) δ A: 172,8 (1), 138,-7 (9), 129,0 (12), 128,9 (11/13), 128,0 (10/14), 76,5 (5), 73,8 (7), 62,1 (8), 38,1 (6), 35,9 (2) , 31,8 (4), 21,4 (3), 8,7 (6-Me), ’ B: 170,6 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 130,2 (4),

128,5 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (7-OMe), 54,4 (2), 35,0 (3), C: 177,2 (1), 47,0 (3) , 43,2 (2), 22,5 (2-Me’), 22,4 (2-Me), D: 171,8 (1), 72,0 (2), 39,4 (3), 24,9 (4),

22,9 (4-Me), 21,7 (5).

Príklad 13

Syntéza kryptofycínu 61

K roztoku kryptofycínu 53 (5 mg, 0,007 mmol) v

0,5 ml suchého benzénu sa pridá trifenylfosfínsulfid (4 mg, 0,014 mmol) a potom 0,65 μΐ trifluóroctovej kyseliny vo forme roztoku v suchom benzéne (100 μΐ). Výsledný roztok sa mieša 6 hodín pri teplote miestnosti, neutralizuje hydrogenuhličitanom sodným, prefiltruje a odparí. Zvyšok sa rozdelí medzi vodu a dichlórmetán. Dichlórmetanová vrstva sa prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromátografiou s obrátenými fázami na stĺpci C18 pri použití zmesi acetonitrilu a vody v pomere 4:1, ako elučného činidla. Získa sa čistý kryptofycín 61 (1,9 mg, 37 %). [a]_D +28,4 (c = 0,7, CHC1₃); EIMS m/z 684/686 (M⁺, nezistené), 652/654 (M⁺-S, 5/4), 426/428 (90/29), 294 (10), 227 (100), 195/197 (57/20), 184 (20), 155/157 (34/9), 131 (45), 129 (44), 91 (76), 77 (27); HREIMS m/z 652.2973 (M*-S, C₃₆H_4JN₂O₇ ^3SC1, A-5,8mmu); UV (MeOH) (e) 204 (26700), 218 (11600), 284 (820) nm; IR (NaCI) 3410, 3271, 2958, 1749, 1724, 1670, 1503, 1463,

170

1258, 1176, 1066, 758 cm’¹. ’H NMR (CDC1₃) δ A 7,29-7,34 (11/12/13-H; m), 7,25 (10/14-H, bd, 6,6), 6,73 (3-H, ddd, 15,2/10,6/4,5), 5,66 (2-H; dd, 15.2/1,7), 5,22 (5-H, ddd, 11,2/4,2/2,0), 3,68 (8-H, d, 5,1), 3,01 (7-H, dd, 8,4/5,1), 2,52 (4-H_b, dddd, 14,4/4,5/2,0/1,-7), 2,41 (4-H„ ddd, -14,4/11,2/10,6), 1,68-1,74 (6-H, m), 1,14 (6-Me, d,

6.9); · B 7,'18 (5-H, d, 2,2), 7,04 (9-H, dd, 8,4/2,2), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,45 (NH, d,

7,8), 4,75 (2-H, ddd, 7,8/7,3/5,4), 3,87 (OMe, s), 3,09 (3-H_b, dd, -14,5/5,4), 3,05 (3H„ dd, -14,5/7,3); C 7,17 (NH, dd, 8,3, 3,9), 3,39 (3-H_b, dd, -13,5/8,3), 3,14 (3H„ dd, -13,5/3,9), 1,23 (2-Me, s), 1,16 (2-Me’, s); D 4,86 (2-H, dd, 10,2/3,4), 1,77 (3-H_b, ddd, -14,0/10,2/4,9), 1,68-1,74 (4-H, m). 1,42 (3-H., ddd, -14,0/8,7/3,4), 0,92 (4-Me, d, 6,6), 0,88 (5-H₃, d, 6,4). ^,3C NMR (CDCi₃) δ A 164,9 (1), 141,7 (3) , 138,3 (9), 128,8 (11/13), 128,0 (12), 126,7 (10/14), 124,7 (2), 76,6 (5), 45,8 (7),

43,9 (8), 43,9 (6), 36,6 (4). 16,0 (6-Me), B 170,2 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,4 (4) , 128.3 (9), 122,8 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2), 35,3 (3), C 177,9 (1),

46,5 (3), 42,7 (2), 22,9 (2-Me), 22,8 (2-Me’), D 170,4 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,7 (4), 22,7 (4-Me), 21,4 (5).

Príklad 14

Syntéza kryptofycínu 81

Zlúčenina S

Zlúčenina S je terc.butyldifenylsilyléterový (TBDMS) derivát zlúčeniny F.

Zlúčenina T

K 10 ml tetrahydrofuránového roztoku p-metoxybenzyltrifenylfosfóniumchloridu (1 mmol) sa pri -78“C pridá 400 μΐ roztoku butyllítia (1 mmol, 2,5M v hexáne). Reakčná zmes sa mieša 30 minút. 2,64ml alikvót tejto zmesi sa pri -78^eC pridá k 3 ml tetrahydrofuránového roztoku aldehydu S (75,0 mg, 0,24 mmol). Po 30 minútach sa chladenie preruší, ale v miešaní sa pokračuje dalšie 2 hodiny, ked teplota zmesi

171 pomaly stúpne na 25“C. Reakčná zmes sa rozloží nasýteným roztokom chloridu amónneho a odparí sa z nej tetrahydrofurán. Produkty sa extrahujú dvakrát hexánom. Spojené organické vrstvy sa premyjú vodným roztokom chloridu sodného, vysušia a skoncentrujú. Zvyšok sa podrobí rýchlej chromatografii na stĺpci silikagélu pri použití 3% etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla. Získa sa 63 mg zlúčeniny T a 40 mg zmesi zlúčeniny T a Z izoméru.

Zlúčenina T má tieto vlastnosti:

[a]_D +110,5° (CHC1₃, C 0,75); IRv_max 2956, 2857, 1724, 1608, 1511, 1428, 1250, 1173, 1111, 1037, 821, 703, 505 cm^-1; EIMS m/z (relatívna intenzita v percentách) 497 (<l,M⁺-OMe), 471 (31,Μ⁺-ΒΐΛ), 367 (56), 294 (31), 199 (75), 135 (100); EIMS s vysokým rozlíšením 497,24770 (vyrátané pre C₃₂H₃₇O₃Si, delta = +3,5 mmu, M⁺-0Me), 471,19859 (vyrátané pre ^c29^H3i°4^s1» delta = 0,6 mmu, M⁺-Bu^).

NMR δ 7,71/7,68 (SiPh₂, 2’-H, 6’-H/2”-H, 6-H; d; 6,5), 7,45/7,43 (SiPh₂, 4’-H/4”-H; t; 7,4), 7,39/7,38 (SiPh₂, 3’-H, 5’-H/3-H, 5-H; dd; 7,4, 6,5), 7,24 (10-H, 14-H; d; 8,7), 6,85 (11-H, 13-H; d; 8,7), 6,79 (3-H; dt; 15,7, 7,5), 6,19 (8-H, d, 16,1), 6,00 (7H, dd, 16,1, 8,1), 5,66 (2-H, dt, 15,7, 1,3), 3,82 (5-H, m), 3,81 (-OCH₃, S), 3,69 (COjCHj, S), 2,41 (6-H, m), 2,36 (4-H, m), 2,30 (4-H, m), 1,12 (6-CH₃, d, 7,0), 1,09 (CMc₃, S). ^l3C NMR δ 166,7 (1). 158,8 (12), 146,0 (3), 136,0 (SiPh₂, 2’, 672”, 6”), 134,1/133,7 (SiPh₂, 171”), 130,4 (9), 130,0 (8), 129,7/129,6 (SiPh₂, 474), 129_?5 (7), 127,6/127,5 (3’, 57 3”, 5”), 127,1 (10. 14), 122,8 (2), 113,9 (11, 13), 76,4 (5), 55,2 (OCHj), 51,3 (CO₂CH₃), 42,1 (6), 37,1 (4), 27,0 (CMe-,). 19,5 (CMe₃), 16,2 (6-CH₃).

Ďalšia zlúčenina T sa získa zo zmesi zlúčeniny T a Z-izoméru. 40 mg zmesi E a Z izomérov sa rozpustí v 4 ml benzénového roztoku obsahujúceho tiofenol (0,02M) a ACN (0,006M). Vzniknutá zmes sa 5 hodín zahrieva k spätnému

172 toku. Po jej spracovaní a prečistení na krátkom stĺpci silikagélu sa získa 37,2 mg zlúčeniny T.

Zlúčenina U

K 6 ml acetónového roztoku zlúčeniny T (76 mg, 0,15 mmol) sa pridá 4,4 ml IM hydroxidu lítneho vo vode. Vzniknutý číry roztok sa mieša cez noc, potom sa z nej odparí acetón a vodný roztok sa okyslí IM kyselinou chlorovodíkovou. Produkt sa extrahuje trikrát etylacetátom. Organické vrstvy sa vysušia a skoncentrujú. Zvyšok sa prečistí na stĺpci silikagélu pri použití zmesi 20% etylacetátu v hexáne s 0,5% kyselinou octovou. Získa sa 62,2 mg kyseliny u (81 %).

[a]_D +120,8° (CHClj, c 3.1); IR ^2960, 2858, 1695, 1650, 1511, 1427, 1250, 1111, 1036, 702 cm’¹; *H NMR δ Ί,Ί3Π,Ί0 (SiPh₂, 2’-H, 6’-H/2-H, 6-H, d, 7,0), 7,50 (SiPh₂, 4’-H/4”-H, m), 7,44 (SiPh₂, 3’-H, 5’-H/ 3-H, 5”-H, m), 7,29 (10-H, 14-H, d,

8,6), 6,96 (3-H; dt; 15,6, 7,8), 6,89 (11-H, 13-H, d, 8,6), 6,22 (8-H, d, 16,0), 6,03 (7H, dd, 16,0, 7,9), 5,70(2-H, d, 15,6), 3,88 (5-H, m), 3,83 (OCH₃, S), 2,43 (6-H, m),

2,40 (4-H, m), 1,17 (6-CH₃₁ d, 6,9), 1,14 (CMe₃, s); ¹³C NMR, 171,7 (1), 158,8 (12),

148,8 (3), 135,0 (SiPh₂, 2’, 672”, 6”), 133,9/133,7 (SiPh₂, 171), 130,3 (9), 130,0 (8), 129,7 (SiPh₂, 474), 129,4 (7), 127,6 (SiPh₂, 3’, 573, 5), 127,1 (10, 14), 122,5 (2), 113,9 (11, 13), 76,2 (5), 55,2 (OCH₃), 42,3 (6), 37,1 (4), 27,0 (CMe_?). 19,5 (CMe₃), 16,0 (6-CHj).

Zlúčenina V

Zlúčenina U (59 mg, 0,12 mmol), trifluóracetátová sol zlúčeniny I (57,2 mg, 0,12 mmol) a diizopropyletylamín (DIEA, 62 μΐ, 0,36 mmol) sa rozpustí v 1,5 ml suchého dimetylformamidu. K vzniknutému roztoku sa pridá FDPP (55 mg, 0,14 mmol) v 0,6 ml dimetylformamidu. Reakčná zmes sa 2 hodiny mieša, potom sa k nej pridá éter. Organická vrstva

173

sa premyje postupne IM kyselinou chlorovodíkovou, nasýteným hydrogenuhličitanom sodným a vodným roztokom chloridu sodného a skoncentruje. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na stĺpci silikagélu pri použití 8% etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla. Získa sa 74,2 mg zlúčeniny V (72 %); [cl]_d+53,8’ (CHC1₃, C 1,6); IRv_max 3286, 2959, 1760, 1667, 1640, 1607, 1510, 1253, 1174, 1111, 1067, 1027, 703 cm“¹; EIMS m/z (relatívna intenzita (%) 798/799/800/801/802/803/804/805 (31/14/44/17/23/10/6/3, M⁺-Bu^*) , 766 (40), 694/695/696/697/698/699/700/701 (70/31/100/38/58/19/14/5), 662 (67), 622 (71), 544 (70), 518 (83); EIMS s vysokým rozlíšením 798,1443 (vyrátané pre ^C40^H40^C14^N06^Si' ^delta “6,4mmu, M⁺-Bu^t). ¹H NMR A 7,69/7,65 (SiPh₂, 2’-H, 6’-H/2-H, 6-H; d; 6,5), 7,41 (SiPh₂, 4’-H/4-H, m), 7,35 (SiPh₂, 3’-H, 5’-H/3”-H, 5”-H, m), 7,24 (10-H, 14-H; d, 8,7), 6,85 (11-H, 13-H, d, 8,7), 6,65 (3-H, dl, 15,3, 7,5), 6,20 (8-H, d, 16,1), 6,03 (7-H, dd, 16,1, 8,0), 5,50(2-H, d, 15,3), 3,81 (OCH₃, S), 3,77 (5-H, m), 2,39 (6-H, m), 2,34 (4-H, m), 2,29 (4-H’, m), 1,11 (6-Me, d, 6.9), 1,06 (CMe₃, S); · B 7,15 (5-H, d, 1,8), 7,00 (9-H, dd, 8,4, 1,8), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,65 (NH, d, 7,7), 5,01 (2-H, ddd, 7,7, 6,0, 5,5), 4,78/4,72 (CH₂CC1₃, ABq, -

11,9), 3,86 (OMe, S), 3,15 (3-H; dd, 6,1, -14,5), 3,08 (3-H’, dd, 5,8, -14,5). ^I3C NMR δ A 165,1 (1), 158,8 (12), 142,5 (3), 136,0 (SiPh₂, 2’, 672, 6”), 134,2/133,6 (SiPh₂, 171”), 130,4 (9), 129,9 (8), 129,7/129,6 (SiPh₂, 474), 129,5 (7), 127,6/127,5 (SiPh₂, 3’, 573, 5”), 127,1 (10, 14), 124,6 (2), 113,9 (11, 13), 76,4 (5), 55,2 (OMe),

42,1 (6), 37,2 (4), 27,0 (CMej), 19,5 (CMe₃), 16,6 (6-Me); B 170,0 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,4 (4/9), 122,5 (6), 112,1 (8), 94,2 (CC1₃), 74,7 (CH₂CC1₃), 56,1 (OMe),

52,9 (2) 36,4 (3).

Zlúčenina W

K roztoku zlúčeniny V (55,8 mg, 0,065 mmol) v

5,7 ml acetonitrilu sa pri 0‘C pridá 2,0 ml 49% kyseliny fluorovodíkovej. Po 5 minútach sa íadový kúpe! odstaví a reakčná zmes sa 17 hodín intenzívne mieša. Produkt sa

174 extrahuje éterom. Extrakt sa premyje postupne nasýteným hydrogenuhličitanom sodným a vodným roztokom chloridu sodného a skoncentruje. Zvyšok sa podrobí chromatografii s normálnymi fázami na silikagéli pri použití 25% etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla. Získa sa 31,6 mg zlúčeniny W (79 %); [<x]_D -3,7’ (CHC1₃, c 1,3); IR v_M 3286, 2961, 1756, 1668, 1634, 1607, 1510, 1251, 1175, 1066, 812 cm¹. ‘H NMR δ

A 7,27 (10-H, 14-H, d, 8,5), 6,93 (3-H, dt, 15,4, 7,6), 6,83 (11-H, 13-H, d, 8,5), 6,34 (8-H, d,. 15,9), 5,88 (7-H, dd 15,9, 8,2), 5,86 (2-H, d, 15,4), 3,81 (OMe, S), 3,80 (5-H, m), 2,40 (6-H, m), 2,36 (4-H, m), 1,13 (6-Me, d, 6.8); B 7,17 (5-H, d, 1,9), 7,05 (9-H, dd, 8,5, 1,9), 6,83 (8-H, d, 8,5), 5,90 (NH, d, 7,7), 5,03 (2-H, ddd, 7,8, 5,9, 5,6), 4,79/4,72 (CH₂CC1₃, ABq, -11,9), 3,86 (OCH_3> S), 3,20 (3-H, dd, 6,0, -14_;3), 3,09 (3-H’, dd, 5,9, -14,3). ^,3C NMR δ A 165,2 (1), 159,1 (12), 142,6 (3), 131,3 (9), 129,8 (7), 128,7 (8), 127,3 (10, 14), 125,0 (2), 114,0 (11, 13). 73,8 (5), 55,3 (OMe), 43,3 (6), 37,2 (4), 16,9 (6-Me) B 170,1 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,5 (4/9), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,2 (CC1₃), 74,7 (CH₂CCI₃), 56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).

(2S,2 ’R)-2-[3 '-(terc.Butoxykarbonyl)amino-2 '-metylpropanoyloxy]-4-metylpentánová kyselina (AC)

Roztok metyl-(S)-(+)-3-hydroxy-2-metylpropanoátu (X) (10 g, 85 mmol) v 300 ml približne 9M amoniaku v metanole sa v uzatvorenej sklenenej banke 168 hodín zahrieva na 50°C. Reakčná zmes sa premyje dusíkom, čím sa odstráni prebytok amoniaku, a potom pri zníženom tlaku odparí do sucha. Zvyšok sa trituruje s éterom. Získa sa (S)-3-hydroxy-2-metylpropánamid (5,7 g, výťažok 66 %) vo forme bielej pevnej látky s teplotou topenia 85,5 až 87,5°C; [a]_D +28,7° (c = 3,5, MeOH); EIMS m/z (rel. intenzita) 88 (19, M-Me), 8,5 (35), 73 (69); HREIMS m/z 88,0397 (C₃HgNO₂, delta +0,2 mmu); IR v_max 3384, 2960, 1671, 1473 cm¹; ¹H NMR: δ 5,83 (NH, brs), 5,42 (NH, brs), 3,73 (3-H₂, m), 2,55 (2-H, m), 1,19 (2-Me, d, 7,2); ¹³C NMR: δ 180,7 (1), 65,4 (3), 44,0 (2), 14,5 (2-Me).

175

Analýza pre C₄H_gNO₂: vyrátané: C 46,59, H 8,79 nájdené: C 46,45, H 8,83

Suspenzia (S)-3-hydroxy-2-metylpropánamidu (2,1 g, 20 mmol) v bezvodom tetrahydrofuráne (20 ml) sa pomaly pridá k IM bóran-tetrahydrofuránovému komplexu (61 mmol, 61 ml) chladenému na 0C. Reakčná zmes sa 6 hodín zahrieva k spätnému toku, ochladí na O’C, opatrne rozloží koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (10 ml) a skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa nasýti hydroxidom sodným (20 g) a extrahuje chloroformom (15 ml x 4). Spojené extrakty sa vysušia síranom horečnatým, prefiltrujú a z filtrátu sa odstráni rozpúšťadlo. Zvyšok sa podrobí vákuovej destilácii. Získa sa 1,4 g (výťažok 77 %) (R)-3-amino-2-metylpropán1-olu (Y) vo forme bezfarbého oleja s teplotou varu 110 až 112°C za tlaku 5,3 kPa; [a]_D +8,9’ (c 22,6, MeOH); IR v_max3358, 1873, 1598, 1466 cm“¹; ¹H NMR: δ 5,18 (NH₂, brs), 3,8 (1-H₂, m), 2,95 (3-H, m), 2,68 (3-H, m), 1,81 (2-H, m), 0,82 (2-Me, d, 7,2); ¹³C NMR: δ 66,9 (1), 46,4 (3), 37,1 (2), 14,4 (2-Me).

K roztoku aminoalkoholu Y (2,0 g, 22 mmol) v 39 ml 10% roztoku trietylamínu v metanole sa pridá diterc.butyldikarbonát (5,4 g, 25 mmol). Reakčná zmes sa 30 minút mieša pri 25°C, potom sa z nej odstráni rozpúšťadlo. Zvyšok sa rozpustí v dichlórmetáne a dichlórmetánový roztok sa premyje dvakrát IM hydrogensíranom draselným (pH 2) a raz nasýteným roztokom chloridu sodného a vysuší síranom horečnatým. Rozpúšťadlo sa odparí pri zníženom tlaku. Získa sa 4,3 g (výťažok 100 %) (R)-3-(terc.butoxykarbonyl)amino-2metylpropán-l-olu (s čistotou nad 95 % podlá analýzy NMR) vo forme viskózneho oleja, ktorý sa použije bez ďalšieho čistenia v nasledujúcom stupni;

IR ^vrnax ³³⁵⁶! 1976, 1686, 1523, 1456 cm“¹; ¹H NMR: δ 4,82 (NH, brs), 3,54 (1-H, dd, -11,4/4,2), 3,31 (1-H/3-H, m),

176

3,25 (3-H, dd, -14,1/6,6), 1,77 (2-H, m), 1,44 (CMe₃, s), 0,87 (2-Me, d, 6,9).

K roztoku alkoholu, (R)-3-(terc.butoxykarbonyl)amino-2-metylpropán-l-olu (2,2 g, 12 mmol) a jodistanu sodného (7,5 g, 35 mmol) v tetrachlórmetáne (25 ml), acetonitrile (25 ml) a vode (38 ml) sa pridá hydrát chloridu rutenitého (51 mg, 0,25 mmol). Výsledná zmes sa mieša 1 hodinu pri 25’C, zriedi dichlórmetánom (100 ml) a prefiltruje cez celit. Filtrát sa 2M roztokom uhličitanu draselného zalkalizuje na pH 9. Vodná vrstva sa premyje éterom. Vodná vrstva sa pri O’C okyslí IM hydrogensíranom draselným na pH = 2 a extrahuje dichlórmetánom (20 ml x 3). Spojené extrakty sa premyjú nasýteným roztokom chloridu sodného, vysušia síranom horečnatým a pri zníženom tlaku sa z nich odstráni rozpúšťadlo. Získajú sa 2 g (výťažok 85 %) (R)-3-(terc.butoxykarbonyl )amino-2-metylpropánove j kyseliny (Z) vo forme lepivej pevnej látky. Čistá zlúčenina Z (1,75 g, výťažok 74 %) má po prekryštalizovaní z éteru teplotu topenia 69,5 až 70,5’C, [a]_D -18,4’ (c 2, MeOH); EIMS m/z (rel. intenzita) 147 (60, M⁺-Me₂C=CH₂), 130 (12), 74 (29), 57 (100); HREIMS m/z 147,0517 (C₅H₉NO₄, delta +1,4 mmu); IR 3322-2400,

2797, 1711, 1654, 1413 cm¹; -^H NMR hlavného konforméru: δ 5,00 (NH, brs), 3,32 (3-H, m), 3,24 (3-H‘, m), 2,71 (2-H, m), 1,44 (CMe3, s), 1,20 (2-Me, d); ¹³C NMR hlavného/vedlajšieho konforméru (v pomere 2 : 1): δ 170,7/179,5 (1), 156,0/157,7 (BOC CO), 79,5/81,0 (CMe3), 42,7/44,0 (3), 39,9/40,2 (2), 28,3/28,3 (CMe₃), 14,6/14,6 (2-Me).

Analýza pre C_gH₁₇NO₄: vyrátané: C 53,18, H 8,43 nájdené: c 53,04, H 8,62

K roztoku 2,66 g 2-hydroxy-4-metylpentánovej kyseliny (20 mmol) a 1,74 g hydrogenuhličitanu sodného (20 mmol) v 30 ml vody sa pri O’C pridá 30 ml dichlórmetánového

177 roztoku 6,44 g tetrabutylamóniumchloridu (20 mmol) a 1,74 ml alylbromidu (20 mmol). Reakčná zmes sa 24 hodín intenzívne mieša, potom sa z nej odparí dichlórmetán. K zvyšku sa pridá asi 50 ml vody. Vodná vrstva sa extrahuje štyrikrát dietylétérom. Éterový roztok sa vysuší bezvodým síranom sodným a potom odparí. Zvyšok sa nechá prejsť krátkym stĺpcom silikagélu. Získa sa 3,21 g alyl-(2S)-2-hydroxy-4-metylpentanoátu (AA) (výťažok 93 %) vo forme bezfarbého oleja. [a]_D -8,4° (c 1,1, CHC1₃); IR V_max 3464, 2957, 1732,

1203, 1140, 1087 cm⁴; Ή NMR ô 5,92 (a.lyl 2-H; m), 5,34 (a.lyl 3-H_z; dd, 17,4/1,1), ® 5,28 (a lyl 3-H_£; dd, 10,5/1,1), 4.67 (a.lyl 1-H₂; d, 5,7), 4,23 (2-H; br s), 2,64 (OH; br

s), 1,89 (4-H; m), 1,57 (3-H₂; m), 0,96 (5-H₃; d, 6,5), 0,95 (4-Me; d, 6,7); “C NMR δ

175,3 (1), 131,4 (a lyl C-2), 118,6 (3). 68,9 (2), 65,7 (a lyl C-l), 43,2 (3), 24,1 (4), 23,0 (5), 21,3 (4-Me).

K roztoku 1,74 g zlúčeniny Z (8,55 mmol), 1,34 g zlúčeniny AA (8,0 mmol) a 64 mg DMAP v 12 ml suchého dichlórmetánu sa pri 0°C prikvapká 8 ml roztoku dicyklohexylkarbodiimidu (2,47 g, 12 mmol) v dichlórmetáne. Vzniknutý číry roztok sa 30 minút mieša pri 0°C a potom 3 hodiny pri 23°C. Zo zmesi sa filtráciou oddelí biela zrazenina a z filtrátu sa odparí rozpúšťadlo. Zvyšok sa rozpustí v dietylétere. Éterový roztok sa premyje postupne chladnou 0,5M kyselinou chlorovodíkovou, hydrogenuhličitanom sodným a chloridom sodným, vysuší síranom sodným a odparí. Produkt sa prečistí rýchlou chromatografiou na silikagéli. Získa sa 2,62 g (výťažok 92 %) čistého alyl(2S,2'R)-2-[3'-(terc.butoxykarbonyl)amino-2'-metylpropanoyloxy]-4-metylpentanoátu (AB) vo forme bezfarbého oleja, [α]θ -51,3° (c 3,41, CHC1₃); EIMS (rel.intenzita) 301 (5,2), 284 (4,0), 258 (1,5), 228 (43,5), 170 (41,8), 130

178 (74,5), 112 (100); HREIMS m/z 301,1532 (C₁₄H₂₃NO₆, Á-0,7mmu, M-MejOCH,), 284,1496 (C₁₄H₂₂NO₅, Á+0,2mmu); IR 3395, 2962, 1747, 1715, 1515, 1251, 1175, 1083 «η¹. ’H NMR C δ 5,17 (NH; br s), 3,42 (3-H; m), 3,22(3-H’; m), 2,78 (2-H, m), 1,43 (CMe3; br s), 1,21 (2-Me; d, 7,1); D δ 5,90 (a lyl 2-H; m), 5,33 (a lyl 3Hz; d, 16,3), 5,27 (a lyl 3-H£; d, 10,3), 5,09 (2-H; dd, 9,7/3,7), 4,63 (a (yl 1-H2; m), 1,80 (3-H2; m), 1,64 (4-H; m), 0,96 (5-H3; d, 6,5), 0,94 (4-Me; d, 7,3). ^,JC NMR C δ 174,7 (1), 156,0 (BOC CO), 79,2 (CMe3), 43,1 (3), 40,3 (2), 28,3 (CM&), 14,5 (2Me); D δ 170,4 (1), 131,4 (a lyl C-2), 119,0 (a.lyl C-3), 70,9 (2), 65,9 (a.lyl C-l),

39,6 (3), 24,7 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me).

K 10 ml roztoku 282 mg (0,8 mmol) zlúčeniny AB a 91 mg (0,08 mmol) tetrakis(trifenylfosfín)paládia v suchom tetrahydrofuráne sa pomaly pridá 688 μΐ (8 mmol) suchého morfolínu. Reakčná zmes sa 40 minút mieša, odparí sa z nej rozpúšťadlo a k zvyšku sa pridá dichlórmetán (100 ml). Dichlórmetánový roztok sa premyje postupne 2M kyselinou chlorovodíkovou a vodou. Organická vrstva sa prefiltruje a filtrát sa extrahuje dvakrát nasýteným hydrogenuhličitanom sodným. Po premytí dichlórmetánom sa vodná vrstva najskôr pri 0°C okyslí chladným hydrogensíranom draselným a potom extrahuje trikrát éterom. Éterový extrakt sa vysuší a odparí. Získa sa 250 mg (2S,2'R)-2-[3'-(terc.butoxykarbonyl) amino-2' -metylpropanoyloxy] -4-metylpentánovej kyseliny (AC) (výťažok 100 %) vo forme voskovitej pevnej látky, [a]_D -47,9° (c 4,7, CHC1₃); EIMS m/z (rel. intenzita) 261 (12), 244 (18), 217 (28), 198 (17), 188 (100), 160 (61); HREIMS m/z 261,1221 (C_i;LH_igN0₆, delta -0,8 mmu, M-Me₂C=CH₂), 244,1221 (C_i;lH₁₈NO₅, delta -3,6 mmu); IR v_max 3376, 2960, 1738, 1518, 1174, 786 cm“¹. ¹H NMR (CDC1₃ + D₂O) C δ 3,49 (H-3, dd, -13,8/3,5), 3,12 (3-H, dd, -13,8/8,7), 2,68 (2-H, m), 1,43 (CMe₃, brs), 1,21 (2-Me, d, 7,1); D δ 5,12 (2-H,

179 dd, 9,6/3,5), 1,90 - 1,68 (3H/4-H, m), 0,97 (5-H, d, 6,1), 0,94 (4-Me, d, 6,0). ¹³C NMR: C δ 174,6 alebo 174,8 (1),

156,1 (BOC CO), 79,5 (CMe₃), 43,0 (3), 40,4 (2), 28,3 (CMe₃). 14,5 (2-Me); D δ 174,6 alebo 174,8 (1), 70,5 (2),

39,5 (3), 24,7 (4), 23,0 (5), 21,4 (4-Me).

Zlúčenina AD

Alkohol W (34,8 mg, 0,056 mmol), zlúčenina AC (26,8 mg, 0,085 mmol) a DMAP (1,74 mg) sa rozpustia v 283 μΐ dichlórmetánu. K vzniknutej zmesi sa pridá 666 μΐ dichlórmetánového roztoku dicyklohexylkarbodiimidu (17,5 mg, 0,085 mmol). Reakčná zmes sa cez noc mieša a v prúde dusíka sa z nej odparí rozpúšťadlo. K zvyšku sa pridá éter a vylúčená biela zrazenina sa odfiltruje. Filtrát sa premyje postupne 0,5M kyselinou chlorovodíkovou, nasýteným hydrogenuhličitanom sodným a vodným roztokom chloridu sodného a skoncentruje. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli pri použití 25 % etylacetátu v hexáne, ako elučného činidla, čím sa získa 46 mg zlúčeniny AD (90 %);

[a]_D -11,8’ (CHClj, c 2.0); IR ^3369, 2961, 1737, 1511, 1252, 1174, 1066, 813, 756 cm'¹. ‘H NMR (500MHz) δ A 7,25 (10-H/14-H, dt, 8,5, 2,1), 6,84 (11-H/13-H, dt,

8,5, 2,1), 6,76 (3-H, ddd, 15,5, 6,5, 6,4), 6,34 (8-H, d, 15,6), 5,88 (2-H, bd. 15,5), 5,86 (7-H, dd 15,6, 8,7), 5,04 (5, m), 3,80 (OMe, s), 2,56 (6-H, m), 2,52 (4-H, m), 1,10 (6-Me, d, 6,8); B 7,19 (5-H, d, 2,1), 7,05 (9-H, dd, 8,5, 2,1), 6,83 (8-H, d,

8,5), 6,55 (NH, bd, 7,3), 5,04 (2-H, m), 4,78/4,70 (CH₂CC1₃, ABq, -11,8), 3,85 (OCH₃, S), 3,19 (3-H, dd, 6,3, -13,8), 3,08 (3-H’, dd, 6,8, -13,8); C 5,14 (NH, bt, 6,3),

3,32 (3-H, m), 3,20 (3-H’, m), 2,73 (2-H, m), 1,42 (CMej, s), 1,18 (2-Me, d, 7,0); D 4,93 (2-H, dd, 10,0, 3,7), 1,67 (3-H/4-H, m), 1,55 (3-H’, m), 0,86 (5-H, d, 6,5), 0,83 (4-Me-H, d, 6,5). ^,3C NMR δ A 165,4 (1), 159,1 (12). 139,3 (3), 131,1 (9),

129,7 (7), 128,5 (8), 127,3 (10, 14), 125,4 (2), 114,0 (11, 13), 76,5 (5), 55,3 (OMe),

41,1 (6), 33,4 (4), 16,7 (6-Me); B 170,5 (1), 154,1 (7), 131,2 (5), 128,9 (4), 128,5 (9), 122,4 (6),’ 112,1 (8), 94,3 (CC1₃), 74,6 (CH₂CC1₃), 56,1 (OMe), 53,2 (2), 36,6 (3);

C 175,2 (1), 156,0 (BOCCO). 79,3 (CMe₃), 43,1 (3), 40,4 (2), 28,3 (CM&), 14,4 (2-Me); D 170,1 (1), 71,4 (2), 39,5 (3), 24,7 (4), 22,9 (5), 21,4 (4-Me).

180

Kryptofycín 81

Zlúčenina AD (46 mg, 0,05 mmol) sa zmieša s aktivovaným zinkovým prachom (178 mg, v prebytku) v 1,3 ml kyseliny octovej. Reakčná zmes sa na 45 minút podrobí ultrasonikácii, mieša ďalších 90 minút a pridá sa k nej asi 30 ml dichlórmetánu. Pevná látka sa odfiltruje a filtrát sa odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustí v 1,1 ml trifluóroctovej kyseliny. Výsledný roztok sa 1 hodinu mieša a potom sa z nej pri zníženom tlaku odparí kyselina trifluóroctová. K zvyšku sa pridá voda. Lyofilizáciou sa získa volná aminokyselina. Táto aminokyselina sa rozpustí v 4,6 ml dimetylformamidu. K dimetylformamidovému roztoku sa postupne pridá 26 μΐ DIEA a FDPP (30 mg, 0,075 mmol, v 2,2 ml dimetylformamidu). Vzniknutá zmes sa 6 hodín mieša, potom sa z nej odparí rozpúšťadlo. K zvyšku sa pridá etylacetát. Etylacetátový roztok sa premyje najskôr 0,5M kyselinou chlorovodíkovou a potom vodným chloridom sodným, nakoniec sa z nej odparí rozpúšťadlo. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli pri použití éteru, ako elučného činidla. Získa sa 20,5 mg kryptofycínu 81 (61 %); [a]_D +34,9° (CHC1₃, c 0,45); IR 3409, 3270, 2958, 1746, 1725, 1672, 1511, 1251, 1175, 1066, 1025, 972, 816 cm·*. *H NMR (500 MHz) δ A 7,26 (10-H/14-H; dt, 8,6, 2,5), 6,84(11H/13-H, dt, 8,6, 2,5), 6,68 (3-H, ddd, 15,4, 9,9, 5,6), 6,35 (8-H, d, 15,9), 5,86 (7-H, dd, 15,9, 8,8), 5,77(2-H, dd, 15,4, 0,9), 4,99 (5-H, ddd, 11,2, 6,0, 1,7), 3,80 (OCH₃, S), 2,53 (4-H/6-H, m), 2,37 (4-H’, ddd, 11,2, 9,9,-14,6). 1,12 (6-Me, d, 6,9); B l_t22 (5-H, d, 2,2), 7,08 (9-H, dd, 8,4, 2,4), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,64 (NH, d, 8,6), 4,81 (2-H, m), 3,86 (OMe, S), 3,13 (3-H; dd, 5,6, -14,5), 3,05 (3-H’, dd, 7,1, -14,5); C,

6,93 (NH, bdd, 5,8, 5,6), 3,50 (3-H, ddd, 5,2, 3,9, -13,5), 3,28 (3-H’, ddd, 6,9, 6,7, -

13,5), 2,71 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,3); D 4,84 (2-H, dd, 10,1, 3,4), 1,67 (3-H/

4-H; m), 1,38 (3-H’, m), 0,78 (5-H, d, 6,5). 0,75 (4-Me-H, d, 6,5). ^l3C NMR (125 MHz) δ A 165,4 (1), 159,2 (12), 141,4 (3), 131,1 (9), 129,6 (7), 128,4 (8), 127,3 (10, 14), 125,2 (2), 114,1 (11, 13), 77,5 (5), 55,3 (OMe), 42,2 (6), 36,4 (4), 17,4 (6Me): B 171,0 (1), 154,0 (7), 131,2 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,5 (6), 112,1 (8),

56,2 (OMe), 53,5 (2), 35,1 (3); C 175,6 (1), 41,2 (3), 38,3 (2). 14,0 (2-Me); D

170,9 (1), 71,6 (2). 39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (5). 21,3 (4-Me).

181

Príklad 15

Syntéza kryptofycinu 82

Zlúčenina AE

Zlúčenina AE je terc.butyldifenylsilyléterový (TBDMS) derivát zlúčeniny E.

Zlúčenina AF

Spôsobom opísaným hore pre hydrolýzu zlúčeniny T na zlúčeninu u sa zlúčenina AE (150 mg) hydrolyzuje na zlúčeninu AF (125 mg, výťažok 87 %). ¹H NMR: δ 7,69/7,64 (SÍPh₂, 2'-H, 6'-H/2-H, 6-H, d, 6,3), 7,41 (SÍPh₂, 4'-H/ 4’’-H, rn), 7,39 (SÍPh₂, 3'-H, 4-Me-H/3-H, 5-H, m), 6,86 (3-H, dt, 15,5, 7,5), 5,62 (2-H, d, 15,5), 5,30 (7-H/8-H, m), 3,72 (5-H, m), 2,28 (4-H, m), 2,20 (6-H, m), 1,52 (9-H, bd, 7,7), 1,08 (CMe₃, s), 1,00 (6-CH₃, d, 6,7).

Zlúčenina AG

Pri použití spôsobu opísaného hore na prípravu zlúčeniny V zo zlúčeniny U sa zo zlúčeniny AF (76 mg, 0,18 mmol) získa zlúčenina AG (96 mg) vo výťažku 70 %. ·*·Η NMR δ A 7,67 (SiPh₂, 2’-H, 6’-H/2-H, 6-H; m), 7/6-7,31 (SiPh₂, 3’-H, 4’-H,

4-Me-H/3”-H, 4-H, 5-H, m), 6,62 (3-H, dt, 15,4, 7,6), 5,51/5,48 (2-H, d, 15,4),

5,33 (7/8, m), 3,70 (5-H, m), 2,22 (4-H/6-H, m), 1,61 (9, bd, 7,4), 1,06 (CMej, S), 0,98 (6-Me, d, 6,8); B 7,16 (5-H, d, 1,7), 7,00 (9-H, dd, 8,5, 1,7), 6,83/6,82 (8-H, d, 8,5), 5,68/5,66 (NH, d, 7,3), 5,03 (2-H, m), 4,78/4,73 (CH₂CC1₃, ABq, -11,9), 3,87 (OMe, S), 3,16 (3-H; m), 3,09 (3-H’, m). ^,3C NMR δ A 165,1 (1), 143,0/142,9 (3), 136,0 (SiPh₂, 2’, 672”, 6), 134,3/133,7 (SiPh₂, 171”), 132,5 (7), 129,6 (8), 129,6 (SiPh₂, 474”), 127,5 (SiPh₂, 3’, 4-Me/3”, 5”), 125,7/125,4 (2), 76,3 (5), 41,6 (6), 36,9/36,8 (4), 27,0 (CMeú. 19,5 (CMe₃), 18,1 (9), 16,4/16,3 (6-Me); B 170,0 (1),

154,2 (7), 131,0 (5), 128,4 (4/9), 122,5 (6), 112,1 (8), 94,2 (CCI₃), 74,7 (CH₂CC1₃),

56,1 (OMe), 52,9 (2) 36,4 (3).

182

Zlúčenina AH

Pri použití spôsobu opísaného hore na prípravu zlúčeniny W zo zlúčeniny V sa zo zlúčeniny AG (84 mg, 0,11 mmol) získa zlúčenina AH (53,4 mg) vo výťažku 92 %. ^XH NMR δ A 6,83 (3-H, dt, 15,4, 7,5), 5,80 (2-H, d, 15,4), 5,51 (8-H, m), 5,33 (7-H, dd, 15,2, 8,3), 3,50 (5-H, m), 2,42 (4-H, m), 2,30 (4-H·, m), 2,28 (6, m), 1,68 (9, d.

7.3), 0,99 (6-Me, d, 6,7); B 7,20 (5-H, d, 1,8), 7,03 (9-H, dd, 8,4, 1,8), 6,80 (8-H, d, 8,4), 6,10 (NH, bd, 7,0), 5,07 (2-H, m), 4,80/4,70 (CH₂CC1₃, ABq, -11,5), 3,88 (OCH₃, S), 3,20 (3-H, dd, 5,5, -14,3), 3,10 (3-H’, dd, 7,2, -14,3). ^,3C NMR δ A

165,4 (1), 142,8 (3), 132,2 (7), 127,7 (8), 125,7 (2), 73,6 (5), 42,8 (6), 36,9 (4), 18,1 (9), 16,8 (6-Me); B 170,2 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,5 (4/9), 122,5 (6), 11^.2 (8). 94,2 (CClj), 74,7 (CH₂CCI₃), 56,1 (OMe), 53,1 (2), 36,5 (3).

Kryptofycín 82

Pri použití postupu opísaného hore na prípravu zlúčeniny AD sa z 27,4 mg (0,052 mmol) zlúčeniny AH vyrobí zlúčenina Al (36,8 mg, výťažok 86 %).

Postupom opísaným hore pre cyklizáciu zlúčeniny AD na kryptofycín 81 sa cyklizuje zlúčenina Al (68 mg, 0,083 mmol) za vzniku kryptofycínu 82 (28,5 mg); [a]_D+ 19,9’ (CHCI₃, c 2,0). Ή NMR (500 MHz) δ A 6,65 (3-H, ddd, 15,4, 9,5, 5,6), 5,76 (2-H, d, 15,4), 5,48 (8-H, dq, 15,3, 6,5), 5,27 (7-H, ddd, 15,3, 8,4, 1,5), 4,89 (5-

H, ddd, 10,7, 5,6, 1,5), 2,38 (4-H, m), 2,33 (4-H76-H, m), 1,66 (9-H, dd, 6,4, 1,5),

I, 00 (6-Me, d, 6.9); · B 7,22 (5-H, d, 2,0), 7,08 (9-H, dd, 8,4, 2,0), 6,83 (8-H, d,

8.4) , 5,74 (NH, m), 4,81 (2-H, ddd, 8,5, 7,3, 5,6), 3,87 (OMe. S), 3,13 (3-H; dd, 5,6, -

14.4) , 3,04 (3-H’, dd, 7,3, -14,4); C, 6,93 (NH, bdd, 6,7, 4,7), 3,52 (3-H, ddd, 4,7, 3,9, -13,5), 3,27 (3-H’, ddd, 6,8, 6,7, -13,5), 2,72 (2-H, dqd, 7,1, 6,8, 3,9), 1,20 (2-Me; d, 7.1); D 4,88 (2-H, dd, 9,6, 3,4), 1,75 (3-H/ 4-H; m), 1,47 (3-H’, m), 0,94 (5-H, d, 6,2). 0,91 (4-Me-H, d, 6,4). ^,3C NMR (125 MHz) δ A 165,5 (1),

141,7 (3), 131,4 (7), 127,1 (8), 125,2 (2), 77,7 (5), 41,5 (6), 36,2 (4), 17,9 (9), 17,2 (6Me); B 171,0 (1), 153,9 (7), 131,1 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,4 (6), 112,2 (8),

56,1 (OMe), 53,5 (2), 35,1 (3); C 175,5 (1), 41,3 (3), 38,2 (2), 14,0 (2-Me); D

170,9 (1), 71,5 (2). 39,6 (3), 24,6 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me).

183

Príklad 16

Syntéza kyptofycínu 90 a kryptofycínu 91 Všeobecný postup epoxldácie kryptofycínov styrénového typu

K roztoku kryptofycínu (asi 10 mg/ml) v dichlórmetáne sa pridajú tri ekvivalenty m-chlórperoxobenzoovej kyseliny v dichlórmetáne (asi 10 mg/ml). Reakčný roztok sa mieša pri teplote miestnosti až do spotrebovania všetkých východiskových látok, nechá prejsť krátkym stĺpcom silikagélu pri použití dichlórmetánu a potom zmesi dichlórmetánu a dietyléteru v pomere 1:4, ako elučného činidla. Získa sa zmes dvoch epoxidov, ktorá sa rozdelí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou na C-18 pri použití zmesi acetonitrilu a vody v pomere 7:3.

Pri použití tohto postupu sa kryptofycín 82 (5 mg) premení na kryptofycín 90 (2,2 mg) a kryptofycín 91 (1,2 mg).

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 90 ‘H NMR (500 MHz) δ A 6,67 (3-H, ddd, 15,4, 9,5, 5,8), 5,79 (2-H, d,

15.4) , 5,09 (5-H, ddd, 10,4, 4,5, 2,6), 2,84 (8-H, qd, 5,2. 2,2), 2,57 (7-H, dd, 7,6.

2,2), 2,46 (4-H, m). 1,82 (6-H, m), 1,32 (9-H, d, 5,2), 1,03 (6-Me, d. 6.9); B 7,22 (5-H, d, 2,2), 7,08 (9-H, dd, 8,4, 2,2), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,74 (NH, d, 8,6), 4,81 (2H, ddd, 8,3, 7,4, 5,7), 3,87 (OMe, S), 3,14 (3-H; dd, 5,4, -14,5), 3,03 (3-H’, dd, 7,3, -

14.5) ; C, 6,95 (NH, bdd, 6,7. 4,8), 3,52(3-H, ddd, 4,8, 3,7, -13,4), 3,29 (3-H’, ddd, 6,7, 6,5, -13,4), 2,74 (2-H, dqd, 7,3, 6,5, 3,7), 1,24 (2-Me; d, 7,3); D 4,90 (2-H, dd, 9,9, 3,7), 1,75 (3-H, m), 1,60 (4-H; m), 1,49 (3-H¹, ddd, 8,7, 3,7, -13,7), 0,95 (5-H, d, 6,5), 0,91 (4-Me-H, d, 6,7). ^,3C NMR (125 MHz) δ A 165,4 (1),

141.1 (3), 125,3 (2), 76,3 (5), 60,0 (7), 56,8 (8), 40,2 (6), 36,5 (4), 17,5 (9), 13,3 (6Me); B 171,0 (1), 154,0 (7), 131,1 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,5 (6), 112,3 (8).

56.1 (OMe), 53,6 (2), 35,1 (3); C 175,5 (1), 41,2 (3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); D

170,7 (1), 71,4 (2), 39,6 (3), 24,7 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me)

184

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 91

Ή NMR δ A 6,68 (3-H, ddd, 15,4, 9,8, 5,4), 5,78 (2-H, d, 15,4), 5,09 (5-H, ddd, 11,1, 3,7, 2,0), 2,75 (8-H, m), 2,62 (7-H, dd, 9,5, 2,1), 2,48 (4-H, m), 1,78 (6-H, m), 1,32 (9-H, d, 5,2), 0,99 (6-Me, d, 7,1); B 7,23 (5-H, d, 1,9), 7,09 (9-H, dd,

8,4, 1,9), 6,85 (8-H, d, 8,4), 5,68 (NH, d, 8,4), 4,82 (2-H, m), 3,88 (OMe, S), 3,15 (3H; dd, 5,4, -14,4), 3,04 (3-H', dd, 7,2, -14,4); C, 6,95 (NH, bdd, 6,0, 4,6), 3,53(3H, ddd, 5,0, 4,0, -13,4), 3,29 (3-H’, ddd, 6,9, 6,7, -13,4), 2,75 (2-H, m), 1,23 (2-Me;

d, 6_f7); D 4,92 (2-H, dd, 9,8, 3,4), 1,77 (3-H, m), 1,58 (4-H; m), 0,96 (5-H, d,

7,3), 0,92 (4-Me-H, d, 6,7).

Príklad 17

Syntéza kryptofycínu 97

K roztoku cyklického depsipeptidu, kryptofycínu 53, (9 mg, 0,013 mmol) v dimetylsulfoxide (1 ml) sa pridá azid sodný (40 mg) a koncentrovaná kyselina sírová (4 μΐ). Reakčná zmes sa 2 dni mieša pri 75 až 85°C, potom ochladí na teplotu miestnosti a zriedi dietyléterom (15 ml). Organická vrstva sa premyje vodným chloridom sodným (2 x 20 ml) a vodou (20 ml). Éterový extrakt sa vysuší síranom horečnatým a pri zníženom tlaku sa z nej odstráni rozpúšťadlo. Získa sa amorfná bezfarbá pevná látka, v ktorej prevláda azidoalkohol, kryptofycín 86. Táto látka sa prečistí chromatografiou s obrátenými fázami (ODS, 10 pm, 250 x 10 mm), pričom elúcia sa vykonáva 25% vodou a acetonitrilu rýchlosťou 3 ml.min”¹. Získa sa čistý azidoalkohol, kryptofycín 86, vo forme amorfnej bezfarbej pevnej látky (7,4 mg, 77 %).

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 86 [a]_D -22,0 (c = 3,0, CHC1₃), MS (EI) m/z 482/484 (najvyšší zistený ión, M⁺ -299, 8/3), 625/627 (14/5), 259 (7), 195/197

185 (100/34), 184 (14), 155/157 (82/70), 91 (23), 77 (22); HRMS m/z 482,1791, C₂₃H₃₁N₂O₇ ³⁵C1 (delta 2,9 mmu); MS (FAB) m/z (matrica mágie bulet) 712/714 (M⁺ + H, 79/36), 686/688 (31/12), 232 (7E), 184 (100). ¹H NMR (CDClj) δ :A: 7,37-7,42 (10/11/12/13/14-H, bm, W_in = 20), 6,77 (3-H, ddd, 15,2,

10,6, 4,4), 5,77 (2-H, dd, 15,2, 1,3), 5,45 (5-H, ddd, 11,0, 4,2, 2,0), 4,55 (8-H, d,

5.7) , 3,75 (7-H, dd, 7,3, 5,7), 2,55 (4-H„, dddd, 14,5, 4,4, 2,0, 1,3), 2,43 (4-H., ddd,

14,5, 11,0, 10,6), 2,34 (7-OH, s), 1,80 (6-H, ddq, 7,3, 4,2, 7,0), 0,99 (6-Me, d, 7,0),

B: 7,20 (5-H, d, 2,2), 7,06 (9-H, dd, 8,4, 2,2), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,76 (NH, d,

7.7) , 4,74 (2-H, ddd, 7,7, 7,5, 5,5), 3,87 (OCH₃, s), 3,10 (3-H_b, dd, 14,5, 5,5), 3,06 (3Φ H., dd, 14,5, 7,5), C: 7,22 (NH, dd, 8,4, 3,7), 3,40 (3-H_b, dd. 13,6, 8,4), 3,14 (3-

H. , dd, 13,6, 3,7), 1,23 (2-CH₃, s), 1,16 (2-CH₃‘, s), D: 4,85 (2-H, dd, 9,5, 5,1),

I, 71 (3-H_b, ddd, 13,6, 9,5, 5,9), 1,59 (4-H, bm, W_1/2 = 25), 1,50 (3-H„ ddd, 13,6, 7,9,

5,1), 0,89 (4-CH₃, d, 6,6), 0,85 (5-H₃, d, 6,6); ^,3C NMR (CDC1₃) δ A: 165,3 (1), 143,0 (3), 135,1 (9), 129,1 (12), 128,9 (11/13), 128,6 (10/14), 124,3 (2), 75,1 (7), 74/ (5), 67,8 (8), 39,3 (6), 34,7 (4), 11,9 (6-Me), B: 170,5 (1), 154,1 (7), 130,9 (5),

129.7 (4), 128,3 (9), 122,5 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), C:

177.8 (1), 46,5 (3), 42,8 (2), 22,9 (2-Me), 22,7 (2-Me’), D: 170,2 (1), 71,4 (2),

39,4 (3), 24,7 (4). 22,6 (4-Me), 21,8 (5).

Kryptofycín 97

K roztoku cyklického depsipeptidu, kryptofycínu 86 (5,5 mg, 0,008 mmol), v zmesi dietyléteru a dichlórmetánu v pomere 3 : 1 (0,5 ml) sa pridá dietyléterový roztok (0,5 ml) trifenylfosfínu (3 mg, 0,011 mmol). Reakčná zmes sa tri dni mieša pri teplote miestnosti, potom sa z nej pri zníženom tlaku odstráni rozpúšťadlo. Zvyšok sa rozpustí v dichlórmetáne a prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou na stĺpci CN (10 μπι, 250 x 10 mm), pričom elúcia sa vykonáva 80% etylacetátom v dichlórmetáne rýchlosťou 3 ml.min^-1, získa sa čistý kryptofycín 97 vo forme amorfnej bezfarbej pevnej látky (4,2 mg, 82 %).

186

UV (MeOH) λ™. (¢) 202 (24400), 218 (9400), 284 (2200) nm; MS (EI) m/z 667/669 (M⁺, 11/3), 639/641 (41/16), 442 (21), 226 (17), 195 (43), 196 (32), 197 (100), 198 (71), 199 (11), 182/184 (25/16), 155/157 (63/22), 146 (30), 91 (40), 77 (29); HRMS, obsd m/z 667,3061, CjJI^NjO “Cl (Δ-3,6 rumu). *H NMR (CDCI₃) δ A 7,35 (11H/13-H; m, W_in=15 Hz), 7,28 (12-H, m), 7_Λ16 (10-H/14-H; m, W_in = 15 Hz), 6,74 (3H; ddd, 15,2/9,0/6,1), 5,69 (2-H; d, 15,2), 5,21 (5-H; ddd, 9,2/4,3/4,2), 2,79 (8-H, bs),

2,51 (4-Hj, m), 2,11 (7-H, bd, 6,5), 1,48 (6-H, m), 1,13 (6-Me, d, 6,9); B: 7,18 (5H, d, 2,1), 7,04 (9-H, dd, 8,4, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,53 (NH, m), 4,73 (2-H, ddd,

7,6, 5,6, 5,4), 3,87 (OMe, s), 3,09 (3-H_b, dd, 14,7, 5,4), 3,04 (3-H., dd, 14,7, 7,6), • C: 7,20 (NH, m), 3,40 (3-H_b, dd, 13,5, 8,6), 3,11 (3-H., dd, 13,5, 3,3), 1,22 (2Me, s), 1,15 (2-Me, s), D: 4,84 (2-H, dd, 10,1, 3,7), 1,71 (3-H_b, m), 1,67 (4-H, bm, W_w«25), 1,35 (3-H., m), 0,86 (4-Me, d, 6,7), 0,84 (5-H₃, d, 6,5); »C NMR (CDClj) δ A: 165,0 (1), 142,1 (3), 139,2 (9), 128,8 (11/13), 127,5 (12), 125,4 (10/14), 124,6 (2), 76,6 (5), 42,5 (6), 42,1 (7), 40,5 (8), 36,6 (4), 14,8 (6-Me), B:

170,2 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,2 (9), 122,6 (6), 112,4 (8), 56,1 (7OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), C: \ll_t9 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,8 (2-Me/2-Me’)_fD: 170,5 (1), 71.3 (2), 39,5 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,3 (5).

Príklad 18

Syntéza kryptofycínov 110 až 112 a 124

Kryptofycín 108

K zmesi kryptofycínu 90 a kryptofycínu 91 (27 mg, 0,045 mmol) v 0,8 ml tetrahydrofuránu sa pridá 400 μΐ vodného roztoku kyseliny jodistej (32 mg, 0,14 mmol). Vzniknutý číry roztok sa 5 hodín mieša pri teplote miestnosti a pridá sa k nemu voda. Vodná vrstva sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Organická vrstva sa premyje vodou, vysuší a skoncentruje. Zvyšok sa prečistí chromátografiou s obrátenými fázami na stĺpci ODS pri použití zmesi acetonitrilu a vody (1:1), ako elučného činidla. Získa sa kryptofycín 108 v 90% výťažku. ¹H NMR (500 MHz) δ A 9,64 (7-H, d, 1,9), 6,67 (3-H,

187 ddd, 15,3, 10,0, 5,4), 5,81 (2-H, dd, 15,3, 0,9), 5,32 (5-H, ddd, 11,0, 6,6, 2,1), 2,65 (6-H, qdd, 7,2, 6,9, 1,9), 2,53 (4-H, m), 2,44 (4-H’, m), 1,17 (6-Me, d, 7,2); B

7,21 (5-H, d, 2,2), 7,08 (9-H, dd, 8,4, 2,2), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,91 (NH, d, 8,4), 4,80 (2-H, m), 3,86 (OMe, S), 3,16 (3-H; dd, 5,4, -14,6), 3,00 (3-H’, dd, 7,8, -14,6); C 7,05 (NH, bdd, 6,9, 5,0), 3,47(3-H, ddd, 4,6, 4,2, -13,5), 3,32 (3-H’, ddd, 6,9, 6,6, -

13,5), 2,73 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,2); D 4,83 (2-H, dd, 9,5, 3,6), 1,75 (3-H, m), 1,70 (4-H; m), 1,40 (3-H’, ddd, 9,5, 3,9, -14,0), 0,93 (5-H, d, 6,6), 0,88 (4-Me-H, d, 6,6). ^,3C NMR (125 MHz) δ A 200,6 (7), 165,4 (1), 140,5 (3), 125,6 (2), 73,7 (5), 50,1 (6), 36,1 (4), 10,8 (6-Me); B 171,1 (1), 154,0 (7), 131,0 (5), 129,9 (4),

128,3 (9), 122,4 (6), 112,3 (8), 56,1 (OMe), 53,8 (2), 35,0 (3); C 175,6 (1), 41,0 (3). 38,1 (2), 14,1 (2-Me); D 170,4 (1), 71,3 (2), 39,3 (3), 24,6 (4), 22,9 (5), 21,4 (4-Me).

Kryptofycín 108 je tiež možné vyrobiť selektívnou ozonolýzou kryptofycínu 82 pri použití postupu opísaného hore pre ozonolýzu zlúčeniny E na zlúčeninu F.

Všeobecný postup pri Wittigovej reakcii

Butyllítium (0,4 ml, 2,5M v hexáne, 1 mmol) sa pri -78’C pridá k 10 ml roztoku aryltrifenylfosfóniumchloridu (1 mmol) v tetrahydrofuráne. Reakčná zmes sa mieša 15 minút pri -78’C a potom na jednu hodinu umiestni do ľadového kúpela. Tri ekvivalenty tejto zmesi sa pri -78’C pridajú k tetrahydrofuránovému roztoku kryptofycínu 108 (asi 30 mg/ml). Reakčný roztok sa 20 minút mieša, potom sa odstaví chladiaci kúpel. Keď teplota vzraste na 25’C, reakčná zmes sa rozloží nasýteným vodným roztokom chloridu amónneho. Vzniknutá zmes sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Organický extrakt sa premyje vodou, vysuší a skoncentruje. Zvyšok sa prečistí rýchlou chromatografiou na ODS pri použití zmesi acetonitrilu a vody v pomere 65 : 35, ako elučného činidla. Získa sa zmes E a Z izomérov (obsah Z izoméru je v závislosti od povahy arylskupiny 8 až 13 % podlá analýzy NMR). Požadovaný E izomér vykryštalizuje z éteru.

188

Kryptofycín 110

Wittigovou reakciou sa z 7,3 mg kryptofycínu 108 získa 5,1 mg p-fluórfenylového analógu (obsahuje asi 8 % Z izoméru), pričom sa regeneruje približne 1 mg nezreagovaného aldehydu). Po prekryštalizovaní z éteru sa vyrobí 4,0 mg čistého kryptofycínu 110. [a]_D +42,4° (MeOH, c 2,1). ¹H NMR δ A 7,29 (10-H/14-H, dd, 8,6,

5,6), 6,99(11-H/13-H, dt, 8,6. 8,5), 6,68 (3-H, ddd, 15,3, 9,7, 5,6), 6,38 (8-H, d,

15,8), 5,83 (7-H, dd, 15,8, 8,8), 5,78 (2-H, d, 15,3), 5,00 (5-H, ddd, 10,8, 7,3, 1,3),

2,53 (4-H/6-H, m), 2,36 (4-H’, m), 1,13 (6-CH₃, d, 6,8); B 7,21 (5-H, d, 1,8), 7,07 (9-H, dd, 8,4, 1,8), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,68 (NH, d, 8,5), 4,82 (2-H, m), 3,87 (OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,04 (3-H', dd, 7,2, -14,4); C. 6,95 (NH, bdd, 6,8,

5.9) , 3,50 (3-H, td, 4,4, -13,5), 3,28 (3-H’, ddd, 6,8, 6,7, -13,5), 2,72 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,2); ’ D 4,82 (2-H, m), 1,65 (3-H/4-H; m), 1,35 (3-H’, ddd, 4,5, 3,8, -

10.9) , 0,78 (5-H, d, 6,4), 0,74 (4-Me-H, d, 6,4). ^,3C NMR (75 MHz) ά A 165,4 (1), 162,3 (12, d, ’JC.F 245,8 Hz), 141,4 (3), 132,9 (9), 130,6 (7), 129,9 (8), 127,6 (10/14, d, ³Jc._f 8,0 Hz), 125,2 (2), 115,5 (11/13, d, ²J_C._F 21,5 Hz), 77,4 (5), 42,2 (6),

36,4 (4). 17,3 (6-Me); B 170,9 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,1 (3); C 175,6 (1), 41,1 (3). 38,3 (2), 14,0 (2-Mc); D 170,9 (1), 71,5 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (5), 21,2 (4-Me).

Kryptofycín 111

Wittigovou reakciou sa z 55 mg kryptofycínu 108 získa 43 mg p-tolylového analógu (obsahuje asi 9 % Z izoméru) . Po prekryštalizovaní z éteru sa vyrobí 34 mg čistého kryptofycínu 111. [a]_D +44,3’ (CHC1₃, c 0,6); EIMS m/z (rel.intenzita %) 652 (2,9, M⁺), 497 (3,6), 412 (23,8), 242 (20), 145 (46), 105 (75); HREIMS 652,29094 (vyrátané pre C₃₆H₄₅C1N₂O₇, delta -0,6 mmu, M⁺). ¹H NMR δ A

189

7.21 (10-Η/14-Η; d. 8,0), 7,11 (11-H/13-H, d, 8,0), 6,68 (3-H, ddd, 15,2, 9,6, 5,4), 6,37 (8-H, d, 15,8), 5,95 (7-H, dd, 15,8, 8,6), 5,76 (2-H, d, 15,2), 4,99 (5-H, dd, 10,4,

6.2) , 2,51 (4-H/6-H, m), 2,38 (4-H’, m), 2,32 (12-Me, s), 1,13 (6-CH₃. d, 6,8); B

7.22 (5-H, d, 2,1), 7/)8 (9-H, dd, 8,4, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,80 (NH, d, 8,4), 4,81 (2-H, m), 3,86 (OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,03 (3-H’, dd, 7,3, -14,4); C

6,98 (NH, bdd, 6,0, 5,7), 3,49 (3-H, td, 4,6, -13,4), 3,29 (3-H¹, ddd, 6,7, 6,6, -13,4),

2,70 (2-H, m), l_r22 (2-Me; d, 7,2); D 4,81 (2-H, m), 1,65 (3-H/4-H; m), 1,37 (3H’, m), 0,78 (5-H, d, 5,8), 0,73 (4-Me-H, d, 6,4). ⁿC NMR (75 MHz) δ. A 165,5 (1), 141,5 (3), 137,4 (12), 133,9 (9), 131,7 (7), 129,3 (10/14), 129,0 (8), 126,0 (11/13),

125.1 (2), 77,4 (5), 42,2 (6), 36,4 (4), 21,1 (12-Me), 17,3 (6-Me); B 171,0 (1),

153,9 (7), 131,0 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2),

35.1 (3); C 175,6 (1), 41,1 (3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); D 170,9 (1), 71,6 (2),

39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (5), 21,2 (4-Me).

Kryptofycín 112

Wittigovou reakciou sa z 51 mg kryptofycínu 108 získa 35 mg 2-tienylového analógu (obsahuje asi 13 % Z izoméru). Po prekryštalizovaní z éteru sa vyrobí 25 mg čistého kryptofycínu 112. ¹H NMR (500 MHz) δ A 7,12 (12-H, d, 4,9), 6,94 (11-H, dd, 4,9, 3,4), 6,90 (10-H, d, 3..4), 6,68 (3-H, ddd, 15,2, 9,5, 5,3), 6,54 (8-H, d,

15,7), 5,83 (7-H, dd, 15,7, 8,7), 5,78 (2-H, d, 15,2), 4,96 (5-H, dd, 9,5, 6,5), 2,51 (4H/6-H, m), 2,35 (4-H’, m), 1,13 (6-CH₃, d, 6,8); B 7,21 (5-H, d, 1,6), 7,07 (9-H, dd, 8,4, 1,6), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,74 (NH, d, 7,1), 4,82 (2-H, m), 3,87 (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,5, -14,4), 3,04 (3-H’, dd, 7,1, -14,4); C, 6,97 (NH, bt, 5,8), 3,50 (3-H, ddd, 4,4, 4,3, -13,4), 3,28 (3-H’, ddd, 6,8, 6,6, -13,4), 2,71 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d,

7.2) ; D 4,82 (2-H, m), 1,67 (3-H/4-H; m), 1,39 (3-H’, m), 0,80 (5-H, d, 6,4), 0,77 (4-Me-H, d, 6,4).

190

Kryptofycín 124

Wittigovou reakciou sa z 153 mg kryptofycínu vzorca 108 získa 131 mg p-chlórfenylového analógu (obsahuje približne 10 % Z izoméru). Po prekryštalizovaní z éteru sa vyrobí 107 mg čistého kryptofycínu 124. [a]_D +29,2’ (CHC1₃, c 0,5); EIMS s vysokým rozlíšením m/z 672,23691 (vyrátané pre ^C35^H42^C12^N2°7' delta 0,0 mmu). NMR (500

MHz) δ A 7,26 (10-H/11-H/13-H/14-H, s), 6,68 (3-H, ddd, 15,2, 9,6, 5,4), 6,36 (8H, d, 15,8), 5,98 (7-H, dd, 15,8, 8,8), 5,77 (2-H, d, 15,2), 5,00 (5-H, bdd, 9,4, 6,3),

2,54 (4-H/6-H, m), 2,38 (4-H’, m), 1,13 (6-CH₃, d, 6,8): B 7,22 (5-H, d, 1,7), 7,07 (9-H, dd, 8,4, 1,7), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,73 (NH, bd, 7,8), 4,82 (2-H, m), 3,86 (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,5, -14,4), 3,04 (3-H’_t dd, 7,2, -14,4); C, 6,97 (NH, bi, 5,8), 3,49 (3-H, td, 4,2, -13,4), 3,29 (3-H’_f ddd, 6,7, 6,6, -13,4), 2,71 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,2); D 4,81 (2-H, m), 1,65 (3-H/4-H; m), 1,35 (3-H’, m), 0,77 (5-H, d, 7,1), 0,75 (4-Me-H, d, 7,1). ^,3C NMR (75 MHz) δ A 165,4 (1), 141,3 (3), 135,2 (12), 133,2 (9), 130,9 (7), 130,6 (8), 128,7 (11/13), 127,3 (10/14), 125,2 (2), 77,3 (5), 42,2 (6), 36,5 (4), 17,3 (6-Me); B 170,9 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 129,8 (4), 128,4 (9),

122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,1 (3); ' C 175,6 (1), 41,1 (3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); D 170,8 (1), 71,5 (2), 39,6 (3), 24,5 (4), 22,8 (5), 21,3 (4-Me).

Príklad 19

Syntéza kryptofycínov 115 až 120, 125 a 126

Kryptofycíny 115 a 116

Všeobecným postupom opísaným hore pre epoxidáciu kryptofycínov styrénového typu sa kryptofycín 110 (3,5 mg) premení na 2,0 mg kryptofycínu 115 a 1 mg kryptofycínu 116.

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 115

191 [a]_D +29,1’ (MeOH, c 0,8); EIMS m/z (relatívna intenzita, %), 672 (1,9, M⁺), 412 (5,8), 245 (17), 195 (52), 155 (31), 141 (23), 135 (15), 109 (100); EIMS s vysokým rozlíšením 668,2853 (vyrátané pre ^C35^H42^C^^FN2°8' ^de-¹-^^a+3,4 mmu, M⁺). ^ΧΗ NMR (500 MHz) δ A 7,22 (10-H/14-H, ddt, 8,7, 5,2, 2,0), 7,01 (11-H/13-H, ddt, 8,7, 8,5, 2,0), 6,68 (3-H, ddd, 15,2, 9,7, 5,2), 5,74 (2-H, dd, 15,2, 0,8), 5,15 (5-H, ddd, 11,2, 5,0, 1,8), 3,67 (8-H, d, 2,0, 2,88 (7-H, dd, 7,4, 2,0), 2,54 (4-H, dtd, 5,2, 1,8, -14,4), 2,44 (4-H’, ddd, 11,2, 9,7, -14,4), 1,79 (6-H, m), 1,13 (6-CH₃, d,

6,8); B 7,21 (5-H, d, 2,0), 7,06 (9-H, dd, 8,3, 2,0), 6,83 (8-H, d, 8,3), 5,63 (NH, d, 8,4), 4,80 (2-H, ddd, 8,4, 7,2), (NH, bdd, 6,7, 5,0),.3,48 (3-H, ddd, 5,0, 3,7, -13,4), 3,30 (3-H’, ddd, 6,8, 6,7, -13,4), 2,72 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,4); D 4,83 (2-H, dd, 9,9, 3,6), 1,70 (3-H/4-H; m), l_f35 (3-H’, m), 0,87 (5-H, d, 6,5), 0,85 (4-Me-H, d, 6,5). ^,3C NMR (125 MHz) δ A 165,3 (1), 162,9 (12, d, ’JC.F 245,4 Hz), 141,0 (3), 132,5 (9), 127,3 (10/14, d, ³JC._F

8,3 Hz), 125,3 (2), 115,7 (11/13, d, ²J_C._F 21,9 Hz), 76,1(5), 63,0 (7), 58,3 (8), 40,5 (6),

36,7 (4), 13,4 (6-Me); B 170,9 (1), 154,0 (7), 131,0 (5), 129,7 (4), 128,4 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,0 (3); C 175,6 (1), 41,1 (3), 38,2 (2), 14,1 (2-Me); D 170,7 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,5 (4), 22,9 (5), 21,3 (4-Me).

Kryptofycíny 117 a 118

Všeobecným postupom opísaným hore pre epoxidáciu kryptofycínov styrénového typu sa kryptofycín 111 (6,2 mg) premení na 3,5 mg kryptofycínu 117 a 1 mg kryptofycínu 118.

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 117 [a]_D +25,5° (MeOH, c 1,8); EIMS m/z (rel.intenzita, %), 668 (4,8, M⁺), 412 (6,2), 280 (11), 173 (9,4), 145 (15), 135 (34), 105 (100); EIMS s vysokým rozlíšením 668,28532 (vyrátané pre ^C36^H45^C1FN2°8^{z delta} +1,1 mmu, M⁺). ¹H NMR (500 MHz) δ A

192

7,17/7,13 (10-Η/11-Η/13-Η/14-Η, A₂B₂ q, 8.0), 6,67 (3-H, ddd, 15,4, 9,8, 5,6), 5,73 (2-

H, dd, 15,4, 0,9), 5,14 (5-H, ddd, 11,2, 4,9, 2,0), 3,65 (8-H, d, 2,0), 2,91 (7-H, dd,

7,6, 2,0), 2,54 (4-H, bdd, 5,6, -14,3), 2,44 (4-H’, ddd, 10,7, 9,8, -14,3), 2,35 (12-Me, s), 1,77 (6-H, m), 1,14 (6-CH₃. d, 6,9); B 7,21 (5-H, d, 2,2), 7,07 (9-H, dd, 8,5,

2,2), 6,83 (8-H, d, 8,5), 5,65 (NH, d, 8,5), 4,80 (2-H, ddd, 8,3, 7,4, 5,6), 3,87 (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,6, -14,5), 3,02 (3-H·, dd, 7,4, -14,5); C 6,93 (NH, bd, 6,8,

5,1), 3,48 (3-H, ddd, 5,1, 3,8, -13,2), 3,29 (3-H’, ddd, 6,9, 6,8, -13,2), 2,71 (2-H, m),

I, 22 (2-Me; d, 7,1); D 4,82 (2-H, dd, 9,8, 3,6), 1,70 (3-H/4-H; m), 1,33 (3-H’, m), 0,85 (5-H, d, 6,5), 0,84 (4-Me-H, d, 6,5). ^,3C NMR (125 MHz) & A 165,3 (1), 141,0 (3), 138,4 (12), 133,7 (9), 129,4 (10/14), 125,.6 (11/13), 125,3 (2), 76,2(5), 62,9 (7), 59,0 (8), 40,7 (6), 36,7 (4), 21,1 (12-Me), 13,6 (6-Me);. B 170,9 (1), 154,0 (7), 131,0 (5), 129,8 (4), 128,4 (9), 122,4 (6), 112,3 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,1 (3);

C 175,5 (1), 41,1 (3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); D 170,7 (1), 71,3 (2), 39,4 (3),

24,5 (4), 22,8 (5), 21,2 (4-Me).

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 118 ^•H NMR spektrum kryptofycínu 118 je podobné ako pri kryptofycíne 38 s tou výnimkou, že multiplety pri 7,30 až 7,38 pre protóny fenylového zvyšku sú nahradené 4H multipletom pri 7,14 a 3H singletom pri 2,35 pre protóny p-tolylového zvyšku.

Kryptofycíny 119 a 120

Všeobecným postupom opísaným hore pre epoxidáciu kryptofycínov styrénového typu sa kryptofycín 112 (8 mg) premení na 1,2 mg kryptofycínu 119 a 0,5 mg kryptofycínu 120.

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 119 ‘H NMR (500 MHz) 0 A 7.28 (12-H; d, 5.2), 7,11 (10-H, d, 3,3), 7,00 (11H, dd, 5,2, 3,3), 6,68 (3-H, ddd, 15,1, 9,9, 5,2), 5,76 (2-H, dd, 15,1, 1,3), 5,15 (5-H, ddd, 11,2, 5,5, 1,8), 3,94 (8-H, d, 2,0), 3,1Q(7-H. dd. 7,5. 2,0), 2,56 (4-H, bdd, 5,2, 193

14,3), 2,44 (4-H’, ddd, 11,2, 9,9, -14,3), 1,76 (6-Η, m), 1,13 (6-CH₃, d, 6,8); B l_t2\ (5-H, d, 2,3), 7,07 (9-H, dd, 8,4, 2,3), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,63 (NH, d, 8,4), 4,80 (2-H, ddd, 8,5, 7,4, 5,7), 3,87 (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,7, -14,5), 3,03 (3-H*, dd,

7,4, -14,5); C 6,95 (NH, bd, 6,5, 5,3), 3,48 (3-H, ddd, 5,3, 3,6, -13,5), 3,31 (3-H·, ddd, 6,8, 6,5, -13,5), 2,72 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,3); D 4,85 (2-H, dd, 10,3,

3,5), 1,70 (3-H/4-H; m), 1,33 (3-H’, m), 0,86 (5-H, d, 6,3), 0,85 (4-Me-H, d, 6,3).

Kryptofycíny 125 a 126

Všeobecným postupom opísaným hore pre epoxidáciu kryptofycínov styrénového typu sa kryptofycín 124 (47 mg) premení na 26 mg kryptofycínu 125 a 12 mg kryptofycínu 126.

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 125 [a]_D +35,6® (CHC1₃, c 0,9); EIMS s vysokým rozlíšením m/z 688,2301 (vyrátané pre ^C35^H42^C12^N2°8· ^{delta +1}/⁷mmu). ^XH NMR (500 MHz) δ A 7,35 (11-H/13-H, dt, 8,5

15,1, 0,9). 5,15 (5-H, ddd, 11,0, 4,7, 1,5), 3,66 (8-H, d. 1,9), 2,87 (7-H, dd, 7,4, 1,9), 2,53 (4-H, m). 2,42 (4-H’, ddd, 10,6, 10,5, -14,4), 1,78 (6-H, m), 1,12 (6-CH₃, d, 7,0);

B 7,20 (5-H, d, 2,1), 7,06 (9-H, dd, 8,3, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8,3), 5,72 (NH, d,

8,1), 4,79 (2-H, ddd, 8,3, 7,9, 5,4), 3,86 (OMe, s), 3,12 (3-H; dd, 5,4, -14,5), 3,02 (3H’, dd, 7,4, -14,5); C 6,97 (NH, bdd, 6,3, 5,5), 3,46 (3-H, ddd, 4,4, 4,1, -13/7),

3,22 (3-H’, ddd, 7,0, 6,3, -13,7), 2,70 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,2); D 4,82 (2-H, dd, 9,9, 3,4), 1,70 (3-H/4-H; m), 1,33 (3-H’, m), 0,87 (5-H, d, 6,5), 0,84 (4-Me-H, d.

6,5). ”C NMR (125 MHz) δ A 165,3 (1), 141,0 (3), 135,3 (12), 134,4 (9), 128,9 (11/13), 126,9 (10/14), 125,3 (2), 76,0 (5), 63,1 (7), 58,2 (8), 40,4 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); B 170,9 (1), 154,0 (7), 131,0 (5), 129,8 (4), 128,3 (9), 122,4 (6), 112,3 (8),

56,1 (OMe), 53,7 (2), 35,0 (3); C 175,6 (1), 41,0 (3), 38,2 (2), 14,1 (2-Me); D

170,7 (1), 71,2 (2), 39,4 (3), 24,5 (4), 22,9 (5), 21,3 (4-Me).

194

Údaje ze spektrál... analýzy kryptofycínu 126

Ή NMR (300 MHz) · A δ 7,26 (11-H/13-H, d, 8,1), 7,17 (10-H//14-H, d,

8,1), 6,70 (3-H, ddd, 15,1, 9,4, 5,3), 5,81 (2-H, d, 15,1), 5,14 (5-H, bdd, 10,0, 4,5), 3,57 (8-H, bs), 2,85 (7-H, bd, 7,6), 2,66 (4-H, m), 2,59 (4-H’, m), 1,77 (6-H, m), 1,04 (6-CHj, d, 7,0); B 7,23 (5-H, bs), 7,08 (9-H, bd, 8,4), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,82 (NH, d, 6,8), 4,81 (2-H, ddd, 7,2, 6,8, 5,4),.3,86 (OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,4, -14,1), 3,03 (3-H’, dd, 7,4, -14,1); C7,03 (NH, bt, 5,7), 3,47 (3-H, ddd, 4,0, 3,7, -13,1),

3,34 (3-H’, ddd, 6,8, 6,4, -13,1), 2,72 (2-H, m), 1,24 (2-Me; d, 7,0); D 4,90 (2-H, dd, 10,0, 2,5), 1,74 (3-H/4-H; m), 1,45 (3-H’, m), 0,91 (5rH, d, 6,5), 0,86 (4-Me-H, d,

6,5). ”C NMR (125 MHz) δ A 165,4 (1), 141,3 (3), 135,6 (12), 134,1 (9), 128,8 (11/13), 126,8 (10/14), 125,2 (2), 76,8 (5), 63,3 (7), 55,6 (8), 40,8 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); B 170,9 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 129,8 (4), 128,4 (9), 122,3 (6), 112,2 (8),

56,1 (OMe), 53,7 (2), 35,0 (3); C 175,7 (1), 41,0 (3), 38,2 (2), 14,1 (2-Me); D

170,8 (1), 71,4 (2), 39,3 (3), 24,6 (4), 23,1 (5), 21,3 (4-Me).

Príklad 20

Syntéza kryptofycínov 121 až 123 a 127

Zlúčenina AJ

K roztoku monohydrátu BOC-L-leucínu (1,245 g, 5 mmol) v 30 ml bezvodého dichlórmetánu sa pod atmosférou dusíka za miešania pri O’C pridá pevný hydrochlorid l-(3dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (EDC) (0,53 g, 2,75 mmol). Reakčná zmes sa 1,5 hodiny mieša pri O’C a skoncentruje pri teplote nižšej ako 5’C. Zvyšok sa zriedi 35 ml chladného etylacetátu a vzniknutý roztok sa postupne premyje dvoma dávkami (vždy 10 ml) ľadovo chladného 5% vodného roztoku hydrogensíranu draselného, ľadovo chladného 5% vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a ľadovo chladného vodného roztoku chloridu sodného. Organická fáza sa oddelí, vysuší síranom horečnatým pri 5’C a odparí pri teplote nižšej ako 5’C. Olejovitý zvyšok sa zriedi ľadovo chladným tetrahydrofuránom (5 ml) a pridá k roztoku zlúče195 niny K (295 mg, 0,5 mmol) v ľadovo chladnom bezvodom tetrahydrofuráne (5 ml). Zmes sa mieša a nechá zahriať na 25°C (cez noc) a potom sa k nej pridá niekoľko kryštálov DMAP. K výslednej zmesi sa pridá 5% vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (5 ml). Dvojfázová zmes sa 2 hodiny intenzívne mieša pri 25’C a pridá sa k nej etylacetát (40 ml). Vodná fáza sa extrahuje ďalším etylacetátom (2 x 20 ml). Spojené organické vrstvy sa premyjú vodou a vodným chloridom sodným, vysušia síranom sodným, prefiltrujú a filtrát sa odparí. Zvyšok sa pri použití 25% etylacetátu v hexánoch prefiltruje cez vrstvu silikagélu. Získa sa zlúčenina AJ vo _ forme bezfarbého oleja (385 mg, výťažok 96 %); [a]_D 13,6’ (c

W 0,63, CHC1₃); EIMS m/z (rel.intenzita) 805/803/801 (M+,1%),

568/570/572/574 (9/10/6/2), 523/525/527 (5/6/1), 418/420/422/424 (15/15/6/2), 341/343/345/347 (58/70/35/9), 307/309/311 (29/22/10), 224/227/228/229 (10/100/31/14), 208/210/211/2*12 (20/83/45/54); HREIMS m/z 800,2218 (C_3iH₄₈ ³⁵C1₄N₂O₈, A-5,3mmu);

*H NMR (CDC1₃) A δ 7,21-7,35 (Ph-H₃; m), 6,77 (3-H; ddd, 6,7/6,7/15,3), 6,4 (8H; d, 15,8), 6,05 (7-H; dd, 8,7/15,8), 5,9.(2-H; d, 15,3), 5,0 (5-H; m), 2,6 (6-H; m),

2,55 (4-H₂; m), l,17(6-Me; d, 6,7); B δ 7,22 (5-H; s), 7,05 (9-H: d, 8,1), 6,84 (8H; d, 8,1), 6,55 (NH; d, 7,8), 5,0 (2-H; ddd, 5,5/7,1/7,8), 4,68-4,8 (CH₂CCi₃; ABq,

11,9), 3,86 (OMe; s), 3,2 (3-H; dd, 5,5/14,0), 3,06 (3-H’: dd, 7,1/14,0);; D δ 4_;8 (NH; d), 4,2 (2-H; m), 1,65 (4-H; m), 1,55 (3-H; m), 1,4 (CMe,): s), 1,37 (3-H’; m), 0,85 (4-Me; d, 6,5), 0,8 (5-H; d, 6,5); ^,3C NMR A δ 165,4(1), 139,3 (3), 137,0 (9), • 131,5 (8), 130,5 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (12), 126,2 (10/12), 125,8 (2), 76,2 (5), 40,8 (6), 33,4 4), 16,8 (6-Me); B δ 170,0 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 129,0 (9), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,4 (CCl₃), 74,7 (CH₂CC1₃), 56,1 (OMe), 53,3 (2), 36,5 (3), D δ 173,2 (1), 155,7 (BOC-CO), 80,0 (CMe₃), 52,4 (2), 41,2 (3), 28,3 (C M e,). 24,8 (4), 22,8 (4-Me), 21,6 (5).

Zlúčenina AK

Zlúčenina AJ (115 mg, 0,134 mmol) sa rozpustí v trifluóroctovej kyseline (3 ml), 1 hodinu nechá stáť pri 25’C a potom sa z nej odstráni rozpúšťadlo. Zvyšok sa opa196 kované odparí s dichlórmetánom a potom toluénom. Získaná amorfná pevná látka sa rozpustí v bezvodom tetrahydrofuráne (5 ml) ak tetrahydrofuránovému roztoku sa pridá dietylizopropylamín v množstve dostatočnom na nastavenie pH roztoku na 8 až 9 (roztok sa nakvapká na vlhký pH papierik). Reakčný roztok sa za miešania ochladí na 0°C a pridá sa k nemu roztok zlúčeniny AL v tetrahydrofuráne (3 ml). Za účelom prípravy zlúčeniny AL sa zlúčenina Z (55 mg, 0,27 mmol) rozpustí v tetrahydrofuráne (3 ml) ak výslednému roztoku sa pridá dietylizopropylamín (0,046 ml, 0,27 mmol). Vzniknutá zmes sa ochladí na -15° C a prikvapká sa k nej pivaloylchlorid (0,033 ml, 0,27 mmol). Reakčný roztok sa mieša 10 minút pri -15°C a 20 minút pri 0’C. Výsledná suspenzia sa pridá k roztoku zlúčeniny AJ v tetrahydrofuráne. Vzniknutá zmes sa mieša pri 0°C a cez noc nechá zahriať na 25’C. Po 12 hodinách pri 25°C sa k nej pridá 5% vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Získaná zmes sa 1,5 hodiny intenzívne mieša pri 25’C a pridá sa k nej etylacetát (40 ml). Oddelia sa fázy; vodná fáza sa extrahuje ďalším etylacetátom (2 x 10 ml). Spojené organické extrakty sa premyjú 5% vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (20 ml), 5% vodným roztokom hydrogensíranu draselného (20 ml) a vodným roztokom chloridu sodného, vysuší síranom sodným a odparí. Olejovitý zvyšok sa chromatografuje na silikagéli pri použití 35% etylacetátu v hexánoch, ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina AK vo forme bezfarbej peny (98 mg, výťažok 83 %); [a]_D -8,3 (c 0,88, CHC1₃); ¹H NMR (CDClj) A δ 7,28-7,35 (Ph-H₄; m), 7,22(H-12;m), 6,75 (H-3; ddd, 6,4/6,4/15,4), 6,4(H-8; d, 15,9), 6,04 (H-7; dd, 8,6/15,9), 5,95 (H-2; d, 15,4), 5,0 (H-5; m), 2,6 (H-4; m), 1,1 (6-Me; d, 6,8); B δ 7,22 (H-5, d,

1,5), 7,15 (NH; d, 7,6), 7,05 (H-9; dd, 1,5/8,2), 6,85 (H-8; d, 8,2), 5,0 (H-2; m), 4,8-

4,68 (CHjCCi₃; ABq, 12), 3,86 (OMe; s), 3,2 (H-3; m), 3,1 (H-3’; dd, 7,2/14,1); ’ C δ 5,0 (NH; m), 3,2 (H2-3; m), 2,55 (H-2; m), 1,1 (2-Me; d, 7,1); D δ 6,12 (NH;

m), 4,4 (H-2; m), 1,65 (H-4; m), 1,55 (H-3; m), 1,4 (H-3’; m), 0,86 (4-Me; d, 6,8),

0,81 (5-H; d, 6,8); ^,3C NMR (CDC1₃) A δ 165,8(1), 138,9(3), 131,5(8), 130,4(7), 128,6(11/13), 127,4(12), 126,2(10/14), 125,8 (2), 76,3(5), 33,6(4), 16,6(6-Me); ’ B δ

197

170,2(1), 154,1(7), 136,9(4),131,2(5), 128,6(9), 122,3(6), 112,2(8), 94,4(CC13), 74,5(CH₂CC1₃), 56,l(OMe), 53,4(2), 36,6(3); C ô 175,4(1), 156,3(BOC-CO), 79,5(OCMe₃), 43,6(3), 41,3(2), 15,l(2-Me); D δ 172,6(1), 51,3(2), 40,5(3), 24,5(4), 22,7(4-Me), 21,5(5).

Kryptofycín 121

Zlúčenina AK (73 mg, 0,082 mmol) sa rozpustí v kyseline octovej (3,5 ml). K vzniknutému roztoku sa pridá aktivovaný zinkový prach (400 mg). Výsledná suspenzia sa podrobí 45minútovej sonikácii, mieša ďalšiu 1,5 hodinu pri 25’C, zriedi dichlórmetánom (5 ml) a prefiltruje cez celit. Oddelená pevná látka sa premyje ďalším dichlórmetánom (10 ml) a filtrát sa odparí. Zvyšok sa bez ďalšieho prečistenia rozpustí v trifluóroctovej kyseline (3 ml). Vzniknutý roztok sa udržiava 1 hodinu pri 25’C a potom sa z nej pri zníženom tlaku odstráni rozpúšťadlo. Zvyšok sa opakovane odparuje s dichlórmetánom a potom s toluénom, kým sa nezíska bezfarbá pevná látka. Táto látka sa rozpustí v suchom dimetylformamide (3 ml). K dimetylformamidovému roztoku sa pridá FDPP (43 mg, 0,108 mmol) a potom dietylizopropylamín v množstve dostatočnom na nastavenie pH roztoku na 8 až 9, keď sa alikvót nakvapká na vlhký pH papierik. Reakčná zmes sa potom mieša 16 hodín pri 25’C a zriedi éterom (40 ml). Zriedená zmes sa premyje 5% vodným roztokom hydrogensíranu draselného (2 x 1 ml), 5% vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (15 ml) a vodným roztokom chloridu sodného, vysuší síranom sodným a odparí. Zvyšok sa prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s reverznými fázami na silikagéli C-18 (Econosil^ C-18, 22 x 250 mm), pričom elúcia sa vykonáva zmesou acetonitrilu a vody v pomere 65 : 35 rýchlosťou 6 ml/min. Frakcia eluovaná pri t_R 48 minút sa zhromaždí a odparí. Získa sa amorfná pevná látka (26 mg, výťažok 50 %): [a]_D +46,5’ (c 0,81, CHC1₃); EIMS m/z 637/639 (M⁺, 1%),

198

449/451 (2/1), 420 (5), 411/413 (7/5), 227/228 (9/7), 195 (10), 184 (15), 167/168/169 (40/86/29), 155/157 (100/26), 91 (85), 69 (86); HREIMS mh 637,2864 (C_3J H„ ^3ÍC1 N3 O6, Δ + 5,5mmu); ^lH NMR ‘ A δ 7,21- 7,35 (Ph-H3; m), 6,75 (H-3; ddd, 4,2/10,8/16), 6,4 (H-8; d, 16), 6,04 (H-7; dd_r 8.8/16), 5,75 (H-2; d, 16), 5,1 ((H-5; m),

2,55 (H-4; m; H-6; m), 2,35 (H-4’; m); B δ 7,18 (H-5; d, 2), 7,05 (H-9; dd, 2,0/8,3), 6,85 (H-8; d, 8,3), 5,7 (NH; d, 7,2), 4,7 (H-2; ddd, 4,9/7,2/7,7), 3,86 (OMe; s), 3,1 (H-3; dd, 4,9/14,4), 3,0 (H-3’; dd.7,7/ 14,4); C δ 7,25 (NH; m), 3,5 (H-3; m), 3,4 (H-3’; m), 2,55 (H-2; m), 1,2 (2-Me; d, 7,2); D δ 5,8 (NH; d, 7,2), 4,4 (H2; m), 1,55 (H-4; m), 1,38 (H₂-3; dd, 7,2/7,7), 0,76 (4-Me; d, 6,6), 0,74 (H-5; d, 6,6): ¹³ C NMR (CDCi₃) A 6 165,1 (1), 141,9 (3), 136,8 (9), 131,7 (8), 130,2 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (14), 126,1 (10/12), 125,1 (2), 76,5 (5), 42,3 (6), 36,3 (4), 17,2 (6-Me);

• B δ 171,0 (1), 154,1 (7), 130,8(5), 129,6 (4), 128,4 (9), (122,5(6), 112,4 (8), 56,2 (OMe), 54,4 (2), 35,4 (3); C δ 175,8 (1), 41,0 (3), 38,6 (2), 14,8 (2-Me); D δ 173,2 (1), 51,1 (2), 40,9 (3), 24,7 (4), 23,4 (4-Me), 21,5 (5)

Kryptofycíny 122 a 123

K miešanému roztoku (0^eC) kryptofycínu 121 (20 mg, 0,032 mmol) v bezvodom dichlórmetáne (1,3 ml) sa v jednej dávke pridá 99% mCPBA (17 mg, 0,1 mmol) a potom bezvodý toluén (0,7 ml). Výsledná zmes sa mieša 72 hodín pri 25°C a potom sa z nej pri zníženom tlaku odparí rozpúšťadlo. Pevný zvyšok sa prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s reverznými fázami na silikagéli C-18 (Econosil(^R) C-18, 22 x 250 mm), pričom elúcia sa vykonáva zmesou acetonitrilu a vody v pomere 65 : 35 rýchlosťou 6 ml/min. Vo frakcii s t_R 37,5 min sa eluuje kryptofycín 122 (9 mg, 44 %) a vo frakcii s ^ťR 40 min sa eluuje kryptofycín 123 (5 mg, 23 %).

Kryptofycín 122 [a] p +35,0 (c 1, CHC1₃); EIMS m/z 653/655 (1.6/0.7, M*). 411/413 (20/5), 280/282 (39/19), 252/254 (13/8), 223/225/227 (19/10/23), 211/213 (18/6), 195/197 (51/13), 184/186 (49/11), 176/168/169(20/16/21), 155/156/157 (95/59/42), 139/141/143

199 (60/40/24), 135/135 (30/11), 129/131(40/29), 91(100); HREIMS m/z 653,2906 (C_3J H« ³⁵Cl N₃ O_?, Δ-3/mmu); ‘H NMR (d_a-acetón.) ' A δ 6,65 (H-3; ddd, 38/11,0/15,0),

5,9 (H-2; dd, 1,9/15,0), 5,25 (H-5; ddd, 1,9/4,9/11,5), 3,82 (H-8; d, 2,0), 3,0 (H-7; dd, 2,0/7,7), 2,65 (H-4; dddd, 2,0/2,0/3,8/14,5), 2,4 (H-4’; ddd, 11,0/11,5/ 14,5), 1,85 (H6; dqd, 4,9/7,4/7,7), 1,1 (6-Me; d, 6.9); B 6 7,45 (NH; d, 7,9), 7,22 (H-9; dd, 2,0/8,4), 7,0 (H-8; d, 8,4), 4,45 (H-2; ddd, 3,6/7,9/11,2), 3,84 (OMe; s), 3,2 (H-3; dd, 3,6/14,5), 2,75 (H-3*; dd, 11,2/14,5);. C δ 7,8 (NH; d, 8,8), 3,65 (H-3; ddd, 3,3/8,8/13,2), 3,1 (H-3’; ddd, 2,1/2,1/13,2),.2,55 (H-2; m); D δ 7,35 (NH; d, 8,1),

4,25 (H-2; ddd, 4,8/8,1/10,8), 1,65 (H-4; m), 1,45 (H-3; ddd, 5,1/10,8/13,7), 1,35 (H3’; 4,8/9,0/13,7), 0,8 (4-Me/ H-5; d, 6,5); ^,3C NMR A δ 165,9(1), 140,8(3), 138,6(9), 129,4(11/13), 129,2(12), 126,7(2), 126,6(10/14), 76,0(5), 63,9(7), 59,3(8), 41,2(6), 37,7(4), 13,9(6-Me); B δ 171,9(1), 154,6(7), 132,5(4), 131,4(5), 129,0(9), 122,4(6), 113,3(8), 56,9(2), 65,4(OMe), 36,4(3); C δ 177,2(1), 41,3(3), 38,9(2), 15,7(2-Me); D δ 174,2(1), 51,7(2), 40,6(3), 25,3(4), 23,1(4-Me), 21,5(5).

Kryptofycín 123 [cr]_D +25^° (c 0,58, CHCI₃); Ή NMR (CDC1₃) A δ 7,21- 7,35 ((Ph-H₅; m),

6,75 (H-3; ddd, 4,1/10,9/14,1), 5,85 (H-2; dd, 1,4/15,2), 5,25 (H-5; m), 3,6 (H-8; d, 2,0), 2,9 (H-7; dd, 2,0/7,8), 2,7 (H-4; m), 2,55 (H-4’; m), 1,75 (H-6; m), 1,05 (6-Me; ď, 7,1), B δ 7,18(H-5;d,2,0), 7,05 (H-9; dd, 2,0, 8,5), 6,85 (H-8; d, 8,5), 5,95 (NH; d, 7,7), 4,7 (H-2;ddd, 4,9/7,7/8,1), 3,86 (OMe;s), 3,15 (H-3; dd, 4,9/14,5), 3,05 (H-3*; dd, 8,1/14,5); C δ 7,25 (NH; m), 3,55 (H-3; ddd, 4,6/8,7/13,3), 3,15 (H-3’; ddd, 3,0/3,1/13,3), 2.,55 (H-2; m), 1,2 (2-Me; d, 7,3); D δ 6,0 (NH; d, 8,2), 4,45 (H-2; m), 1,6 ( H-4; m), 1,55 (H₂-3; m), 0,88 (4-Me; d, 7,1), 0,87 (5-H; d, 7,1);

Kryptofycín 127

Kryptofycín 122 (5 mg, 0,0075 mmol) sa rozpustí v chloroformu (2 ml). Chloroformový roztok sa pod atmosférou dusíka ochladí na -40’C a prikvapká sa k nemu trimetylsilylchlorid (0,02 ml, 0,157 mmol). Vzniknutá zmes sa 1 hodinu mieša pri -40’C a potom sa z nej odparí rozpúšťadlo. Zvyšok sa prefiltruje cez vrstvu silikagélu pri použití 15% etanolu

200 v dietylétere. Získa sa kryptofycín 127 (4 mg, výťažok 77 %): [a]_D +28,6 (c 1,16, CHCL₃); EIMS m/z 653 (0,5; M⁺-HC1); 411(2); 182/184 (22/26); 153/155 (68/40); 135(31);

107/108/109(55/22/31); 91/92(100/30); 79/81(45/35); HREIMS m/z 653, 2841 (C₃jH44^3SC1N3O7, Δ 2,6mmu); ¹ H NMR (CHC13). A δ 7,3-7,4 (Ph-H5; m), 6,75 (H-3; ddd, 4,2/10,9/15,0), 5,8 (H-2; dd, 1,5/15,0), 5,2 (H-5; ddd, 1,9/9,9/9,9), 4,65 (H-8; d,

9,6), 4,0 (H-7; brd, 9,6), 2,65 (H-4; m), 2,48 (H-6; m), 2,35 (H-4’; ddd, 10,9/11,2/14,5), 1,02 (6-Me; d, 7,0); B δ 7,18 (H-5; d, 2,2), 7,05 (H-9; dd, 2,2/8,6), 6,85 (H-8; d, 8,6), 6,05 (NH; d, 7,7), 4,65 (H-2; ddd, 4,7/7,7/8,6), 3,86 (OMe; s), 3,15 (H-3; dd, 4,7/14,6), 2,9 (H-3’; dd, 8,6/14,6); C δ 7,25 (NH; £rdd, 4,1/5,7), 3,4 (Hj-3; m), 2,55 (H-2; m), 1,15 (2-Mé; d, 7,5); ’ D δ 6,2 (NH; d, 8,2),

4,45(H-2; m), 1,65 (H-4; m), l,55(H₂-3; m), 0,93 (4-Me; d, 6,8), 0,92 (5-Me; d, 6,8); ^,3C NMR (CDClj) A δ 165,4(1), 142,4(3), 138,8(9), 128,8(11/13), 128,2(12), 128,0 (10/14), 124,0 (2), 75,6(5), 73,9(7), 62,1(8), 38,6(6), 36,4 (4), 8,5(6-Me); f B δ 171,1(1), 154,0(7), 130,8(5), 129,8(4), 128,2(9), 122,4 (6), 112,4 (8), 56,1 (OMe), 54,5(2), 35,4(3); · C 6 175,8(1), 41,1(3), 38,8(2), 14,8(2-Me); D δ 173,2(1), 51,1(2), 40,9(3), 25,0(4), 22,8(5), 21,8(4-Me).

Príklad 21

Syntéza kryptofycínov 128 a 130 až 134

Kryptofycíny 128, 130 a 131

Surová zmes kryptofycínov 117 a 118 v pomere 2 : 1 (5,7 mg) sa rozpustí v chloroformu (0,5 ml). Vzniknutý roztok sa 3 hodiny pri -60’C nechá reagovať s trimetylsilylchloridom (5 μΐ). Výsledná zmes chlórhydrínov sa vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami rozdelí na kryptofycín 128, kryptofycín 130 a kryptofycín 131. Následným prečistením vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s normálnymi fázami sa získa čistý kryptofycín 128 (2,1 mg).

201

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 128 [a]_D +51,4° (CHC1₃, c 0,4); IR v_max 3408, 3281, 2958, 1747, 1731, 1668, 1538, 1505, 1258, 1179, 1067, 910, 733 cm^-1;

EIMS (relatívna intenzita, %) 668 (0,3, M⁺-HC1), 500 (1,2), 445 (4,2), 407 (6), 318 (12), 274 (17), 240 (33), 199 (29), 155 (31), 141 (23), 135 (15), 109 (100); EIMS S vysokým rozlíšením 668,2851 (vyrátané pre ^C ₃₆H₄₅C1N₂O₈,

Á+l,3mmu, M⁺-HC1). ‘H NMR (500 MHz) δ A A 7,27 (10-H/14-H, d, 8,0), 7,18 (11-H/13-H, d, 8,0), 6,69 (3-H, ddd, 15,2, 9,6, 5,4), 5,79 (2-H, dd, 15,2, 0,8), 5,10 (5H, ddd, 11,0, 8,4, 1,7), 4,63 (8-H, d, 9,6), 3,99 (7-H, bd, 9,6), 2,67 (4-H, bdd, 5,4, 14,2), 2,49 (6-H, dqd, 7,6, 7,6, 1,7), 2,36 (4-H·, td, 10.7, -14,2), 2,35 (12-Me, s), 1,04 (6-CH₃, d, 7,1); B 7,23 (5-H, d, 2,1), 7,09 (9-H, dd, 8,5, 2,1), 6,84 (8-H, d, 8,5), 5,83 (NH, d, 8,6), 4,80 (2-H, ddd, 8,2, 7,5, 5,7), 3,87 (OMe, s), 3,16 (3-H; dd, 5,6, -

14.4) , 3,00 (3-H’, dd, 7,5, -14,4); C 6,94 (NH, bt, 5,8), 3,53 (3-H, ddd, 5,4, 4,1, -

13.5) , 3,24 (3-H’, ddd, 6,9, 6,6, -13,5), 2,74 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,3); D 4,92 (2-H, dd, 9,9, 3,2), 1,75 (3-H/4-H; m), 1,47(3-H’, m), 0,94 (5-H, d, 6,4), 0,92 (4-MeH, d, 6,4). ^,3C NMR (125 MHz) δ A 165,6 (1), 141,6 (3), 139,2 (12), 135,3 (9),

129,7 (10/14), 127,9 (11/13), 125,2 (2), 76,4 (5), 74,0 (7), 62,0 (8), 38,4 (6), 36,3 (4),

21,1 (12-Me), 8,6 (6-Me); B 171,1 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 130,0 (4), 128,4 (9),

122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,0 (3); C 175,3 (1), 41,3 (3), 38,3 (2), 14,0 (2-Me); ' D 170,6 (1), 71,3 (2), 39,7 (3), 24,7 (4), 23,1 (5), 21,5 (4-Me).

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 130 ’H NMR (300 MHz) δ A 7,27 (10-H/14-H, d, 7,8), 7,16 (11-H/13-H, d, 7,8),

6,69 (3-H, ddd, 15,1, 9,6, 5,2), 5,75 (2-H, d, 15,1), 5,40 (5-H, ddd, 10,6, 3,0, 1,8), 5,05 (8-H, d, 5,9), 3,74 (7-H, ddd, 10,5, 5,4, 5,2), 2,59 (4-H, m), 2,55 (6-H, m), 2,37 (4-H’, m), 2,33 (12-Me, s), 1,06 (6-CH₃, d, 6,9); B 7,21 (5-H, bs), 7,07 (9-H, bd,

8,4), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,77 (NH, d, 6,6), 4,80 (2-H, m), 3,87 (OMe, s), 3,12 (3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,02 (3-H’, dd, 7,2, -14,4); C 7,00 (NH, bt, 6,5), 3,47 (3-H, ddd, 4,3, 4,0, -13,3), 3,24 (3-H’, ddd, 6,7, 6,6, -13,3), 2,72 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,3);

D 4,80 (2-H, m), 1,70 (3-H/4-H; m), 1,42(3-H’, ddd, 7,9, 4,7, -13,0), 0,91 (5-H, d, 6,4), 0,86 (4-Me-H, d, 6,4). ^,3C NMR (125 MHz) A 165,5 (1), 142,1 (3), 138,8

202 (12), 135,2 (9), 129,5 (10/14), 127,5 (11/13), 124,8 (2), 77,8 (5), 74,2 (7), 67,2 (8),

39,4 (6), 34,6 (4), 21,1 (12-Me), 12,3 (6-Me); B (1), 153,9 (7), 131,0 (5),

129,5 (4), 128,4 (9), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,0 (3)* C 175,6 (1), 41,1 (3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); D 170,3 (1). 71,5 (2), 39,5 (3), 24,6 (4), 22,7 (5), 21,6 (4-Me).

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 131 >H NMR (300 MHz) δ A 7,18 (10-H/11-H/13-H/14-H, s), 6,64 (3-H, ddd,

15,2, 9,8, 5,4), 5,70 (2-H, d, 15,2), 5,06 (5-H, bi, 9,1), 4,86 (8-H, d, 9,7), 4,06 (7-H, bd, 9,7), 2,54 (4-H, bdd, 5,2, -14,2), 2,37 (12-Me, s), 2,13 (4-H’, m), 1,85 (6-H, m), 0,97 (6-CHj, d, 6,6); B 7,21 (5-H, d, 2,1), 7,07 (9-H, dd, 8,4, 2,1), 6,83 (8-H, d,

8.4) , 5,66 (NH, d, 10,0), 4,79 (2-H, bq, 7,7), 3,87 (OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,6, -

14.4) , 3,02 (3-H\ dd, 7,2, -14,4); . C 6,93 (NH. bt, 6,2), 3,51 (3-H, ddd, 5,0, 4,2, -

13.5) , 3,27 (3-H¹, ddd, 6,7, 6,4, -13,5), 2,73 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,3); D 4,86 (2-H, dd, 9,7, 3,4), 1,75 (3-H/4-H; m), 1,46(3-H·, m), 0,94 (5-H, d, 6,0), 0,93 (4-MeH, d, 6,4).

Kryptofycíny 132, 133 a 134

Zmes kryptofycínu 124 a Z izoméru (134 mg,

0,199 mmol) sa rozpustí v dichlórmetáne (6 ml). Dichlórmetánový roztok sa 36 hodín pri teplote miestnosti nechá reagovať s m-chlórperoxobenzoovou kyselinou (103 mg, 0,598 mmol). K vzniknutej zmesi sa pridá fosfátový tlmivý roztok (10 ml, pH 8), aby sa odstránila chlórbenzoová kyselina vzniknutá behom reakcie. Po 30 minútach sa vodná vrstva nahradí dimetylsulfidom (50 μΐ) a čerstvou dávkou fosfátového tlmivého roztoku (10 ml). Reakčná zmes sa mieša ďalších 30 minút. Organická vrstva sa oddelí a odparí sa z nej rozpúšťadlo. Zvyšok sa suší 12 hodín za vákua. Surová zmes prevážne kryptofycínov 125 a 126 sa rozpustí v chloroformu (5 ml) a 3 hodiny pri -60^eC sa na ňu pôsobí trimetylsilylchloridom (50 μΐ). Z reakčnej zmesi sa odparí rozpúšťadlo a zvyšok sa prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromato203 grafiou s obrátenými fázami (silikagél Econosil ODS, 250 mm x 22 mm), pričom elúcia sa vykonáva zmesou vody a acetonitrilu v pomere 35 : 65 rýchlosťou 6 ml/min. Získa sa kryptofycín 134 (t_R 52,5 min, 9 mg, 6 %), neúplne čistý kryptofycín 133 (t_R 61 min, 32 mg, 22 %) a surový kryptofycín 132 (t_R 67,5 min, 72 mg). Ďalším prečistením vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s normálnymi fázami (silikagél Econosil, 250 mm x 10 mm, 56% etylacetát v hexáne, 3 ml/min) sa získa čistý kryptofycín 132 (65 mg, 45 %).

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 132 [a]_D +⁶⁰»¹“ (CHCI.,, c 1,1); EIMS m/z (relatívna intenzita, %) 688 (1,6, M⁺-HC1), 412 (10), 261 (11), 195 (57), 184 (28), 165 (28), 155 (92), 135 (85); EIMS s vysokým rozlíšením m/z 688,23563 (vyrátané pre ^C ₃₅H₄₂C1₂N₂O₈, delta -3,8 mmu, M⁺-HC1). ^ΧΗ NMR (500 MHz) S A 7,33 (10-H/11-H/13-H/14-H, s), 6,67 (3-H, ddd, 15,2, 9,9,

NMR (500 MHz) δ A 7,33 (10-H/11-H/13-H/14-H, s), 6,67 (3-H, ddd, 15,2, 9,9, 5,1), 5,79 (2-H, dd, 15,2, 1,1), 5,10 (5-H, ddd, 11,1, 8,1, 1,5), 4,63 (8-H, d, 9,5), 3,98 (7-H, bd, 9,3), 2,62 (4-H, bdd, 5,1, -14,2), 2,47 (6-H, dqd, 7,4, 7,4, 1,5), 2,40 (4-H’, td, 10,8, -14,2), 2,35 (12-Me, s), 1,02 (6-CH₃, d, 7,0); B 7,21 (5-H, d, 2,1), 7,06 (9-H, dd, 8,4, 2,1), 6,82 (8-H, d, 8,4), 6,04 (NH, d, 8,5), 4,74 (2-H, td, 8,0, 5,4), 3,85 • (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,3, -14,4), 2,95 (3-H’, dd, 7,8, -14,4); C 7,00 (NH, bt,

5,9), 3,48 (3-H, ddd, 5,0, 3,9, -13,4), 3,23 (3-H’, ddd, 6,6, 6,3, -13,4), 2,71 (2-H, m),

1,21 (2-Me; d, 7,2); D 4,91 (2-H, dd, 9,7, 3,4), 1,75 (3-H/4-H; m), 1,45(3-H’, m), 0,92 (5-H, d, 6,6), 0,91 (4-Me-H, d, 6,6). ^,3C NMR (125 MHz) δ A 165,7 (1),

141,6 (3), 137,3 (12), 134,8 (9), 129,4 (11/13), 129,0 (10/14), 125,2 (2), 76,4 (5), 74,0 (7), 61,4 (8), 38,4 (6), 36,2 (4), 8,7 (6-Me); B 171,1 (1), 153,9 (7), 131,0 (5),

130,1 (4), 128,4 (9), 122,3 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,8 (2), 34,9 (3); C 175,3 (1), 41,0 (3), 38,1 (2), 14,1 (2-Me); D 170,6 (1), 71,3 (2), 39,7 (3), 24,7 (4), 23,1 (5), 21,5 (4-Me).

204

Údaje zo spektrálnej analýzy kryptofycínu 134

NMR spektrum titulného kryptofycínu je podobné ako pri kryptofycíne 27 s tou výnimkou, že dva multiplety pri 7,31 (10/14) a 7,36 - 7,40 (11/12/13) pre protóny fenylového zvyšku sú nahradené dvoma dubletmi pri 7,26 (10/14) a 7,36 (11/13) pre protóny p-chlórfenylového zvyšku.

Príklad 22

Vzťah štruktúry a účinnosti a skúšky in vivo

Cytotoxicity kryptofycínov 1, 3 a 8 a nových kryptofycínov voči bunkovým líniám ludských nádorov KB a LoVo sú ilustrované v tabulke 6. Kryptofycín 51 a kryptofycín 3 vykazujú porovnatelné cytotoxicity (hodnoty IC_5Q v rozmedzí

3,5 až 5,8nM). Kryptofycín 52 (IC₅₀ 43 až 70pM) je však o čosi menej cytotoxický ako kryptofycín 1 (IC₅₀ 9 až 29pM) a kryptofycín 55 (IC₅₀ 33 až 47pM) o čosi menej cytotoxický v porovnaní s kryptofycínom 8 (IC₅g 9 až 19pM). Cytotoxicita v hodnotách IC₅₀ kryptofycínov 117, 122, 125, 127, 128 a 132 je porovnatelná s cytotoxitou kryptofycínov 1, 8, 52 a 55; v súčasnosti však nie je počet údajov taký, aby umožnil zmysluplné porovnanie.

Kryptofycín 52 je účinný in vivo, ale je nutné použiť zhruba trojnásobnú dávku v porovnaní s kryptofycínom

1. Účinnosť kryptofycínu 52 in vivo proti piatim tuhým nádorom myšieho pôvodu a trom ludským tuhým nádorom je uvedená v tabulke 7. Podobne je in vivo účinný kryptofycín 55, ale je rovnako nutné použiť trojnásobok celkovej dávky v porovnaní s kryptofycínom 8. Účinnosť kryptofycínu 55 in vivo proti šiestim tuhým nádorom myšieho pôvodu a štyrom ludským tuhým nádorom je uvedená v tabulke 8. Zdá sa, že údaje

205 zistené pri hodnotení účinností in vivo sú v korelácii s údajmi o účinnosti in vitro.

Kryptofycíny 117, 125, 128 a 132 sú in vivo účinné proti adenokarcinómu slinivky myšieho pôvodu (Pane 03). Kryptofycíny 117 a 128 sa zdajú byť účinnejšie: pri kryptofycíne 117 je možné použiť nižšie celkové dávky ako pri kryptofycíne 1 a pri kryptofycíne 128 je možné použiť nižšie dávky ako pri kryptofycíne 8. Oproti tomu sú kryptofycíny 125 a 132 menej účinné: vyžadujú vyššie celkové dávky v porovnaní so zodpovedajúcim kryptofycínom 1 alebo 8. Konkrétne údaje sú uvedené v tabulke 9.

Hodnoty T/C, ktoré sú nižšie ako 42 %, sú charakteristické podľa štandardov NCI pre účinnosť. Hodnoty T/C, ktoré sú nižšie ako 10 %, zodpovedajú podľa štandardov NCI vynikajúcej účinnosti a potenciálnej klinickej účinnosti. Veličina hrubé logaritmické usmrtenie je definovaná výrazom T-C/3,2 Td, kde T je stredný čas (dni), za ktorý nádory v ošetrenej skupine dosiahnu hmotnosť 750 mg, C je stredný čas (dni), za ktorý nádory v kontrolnej skupine dosiahnu hmotnosť 750 mg a Td je čas, za ktorý sa zdvojnásobí objem nádoru (T. H. Corbett et al., Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, str. 35 až 87; Kluwer: Norwell, 1992). Hodnoty hrubého logaritmického usmrtenia nádorových buniek väčší ako 2,8; 2,0 až 2,8; 1,3 až 1,9; 0,7 až 1,2 a menší ako 0,7 pri čase podávaní liečiva 5 až 20 dní sú klasifikované stupňami ++++, +++, ++, +, - (inaktívny). Na dosiahnutie čiastočnej alebo úplnej regresie 100 až 300mg hmotnosti väčšiny transplantovaných tuhých nádorov u myší je potrebný stupeň aktivity +++ až ++++, ktorý je charakteristický pre klinickú účinnosť. Kryptofycín 52 vykazuje hodnoty T/C v rozmedzí od 0 do 14% u myších nádorov a 4,1 až 16% u ľudských nádorov a hodnoty hrubého logaritmického usmrtenia v rozmedzí od 1,1 do 2

206

u myších nádorov a 0 až 3,2 u ľudských nádorov. Kryptofycín 1 vykazuje hodnoty T/C v rozmedzí od 0 do 27% a hodnoty hrubého logaritmického usmrtenia od <1 až 2. Kryptofycín 55 vykazuje hodnoty T/C vyššie ako 0 až 4,4 % a hodnoty hrubého logaritmického usmrtenia od 2,1 až >4,6 (vyliečenie), a to pri všetkých skúškach, s výnimkou jednej (tlstého čreva 26, hodnota hrubého logaritmického usmrtenia 1,2). Kryptofycín 8 vykazuje hodnoty T/C väčšinou 0 % a hodnoty logaritmického usmrtenia nad 2,8 (niekoľko prípadov vyliečenia), ako je to zrejmé z tabuľky 10. Kryptofycíny 117 a 118 majú porovnateľné hodnoty T/C a hodnoty hrubého logaritmického usmrtenia s príslušnými hodnotami iných kryptofycínov epoxidového typu (ako je kryptofycín 1 a kryptofycín 52), zatiaľ čo kryptofycíny 128 a 132 majú porovnateľné hodnoty T/C a hodnoty hrubého logaritmického usmrtenia s príslušnými hodnotami iných kryptofycínov chlorofycínového typu (kryptofycíny 8 a 55).

Všetky publikácie a patentové prihlášky uvedené v tomto opise sú tu citované náhradou za prenesenie ich celého obsahu do tohto popisu, nech už je to pri nich špecificky uvedené, alebo nie.

Vynález bol podrobne opísaný hore len na účely ilustrácie a dosiahnutia lepšej zrozumiteľnosti. Odborníkom v tomto odbore je však zrejmé, že na základe uvedených údajov je možné vynález rôznym spôsobom modifikovať, bez toho, aby to znamenalo odchýlenie od duchu vynálezu. Pre rozsah vynálezu sú rozhodujúce pripojené patentové nároky.

207

Tabuľka 1

Údaje o cytotoxite kryptofycínov a polosyntetických analógov (Údaje z Corbettovej/Valeriotovej skúšky pre 5-fluóruracil, etopozid (VP-16) a taxol sú uvedené na porovnanie.)

Typ cytotoxicity [rozdiel v zonálnych jednotkách (zu)]

Zlúčenina	pg/disk	Corbettova pg/disk skúška³	Valeriotova skúška*¹	KB IC₅₀ng/ml	LoVo ICjq ng/ml
1	12,5	E/T(>400)^c	N	0,005	0,003
2	25	E/T(>400)^c	N	0,007	0,0002
3	25	E/T(>400)^c	N	0,3	0,5
4	20	E/T(>400)^c	N	1,3	0,5
5	2,9	E/T(>600)^c	N	0,02	0,02
6	250	I		>100	>100
7				>750	>480
8	30	E/T(>500)^c 30	N	0,0002	0,01
9				15	Nestanovené
10				>100	>100
12				>100	>100
14				1,8	3
5-FU	2,5	M/T(>400)^d 2,5	LL(>400)
VP-16	5	L(350),T(530)^d 5	LL(260)
taxol	0,2	M/H/T(>400)^d

^aL = selektívny voči leukémii (napr. ^zl1210^_ZC38 ^{a Z}L1210^_ZH8 - ^{250 zu}^ M = selektívny voči tuhému nádoru myši (napr. ^ZC33^—zL1210 — zu)

H = selektívny voči tuhému nádoru človeka (napr. ^zhq^-zli210 ~ 250 zu)

208

E = rovnaká cytotoxicita voči leukémickej bunkovej línii a línii buniek tuhého nádoru (inhibičná zóny >250 zu)

T = selektívny voči nádoru (napr ^zli210^_zLML' ^ZC38^-ZLML ^{a Z}H8^-ZLML - ^{250 zu}^

I = neúčinný (inhibičné zóny <250) ^bN = neselektívny voči nádorovým (leukémie) a normálnym (CFU-GM) bunkovým líniám

LL = selektívny voči lymfocytovej leukémii

C^ZL1210^-ZCFU-GM - ^{250 zu}^

ML = selektívny voči akútnej myelogénnej leukémii (AML) (^ZAML^-ZCFU-GM - ^{250 zu}) ^c = selektívny voči bunkovým líniám citlivým na liečivá a líniám rezistentným voči liečivám (^zc38”^zLMĽ ^ZM17 “ ^ZLML ^{a Z}H8 “ ^ZLML^ d = selektívny iba voči bunkovým líniám citlivým na liečivá

209

T a b u í k a 2

Údaje o cytotoxicite kryptofycínov in vitro

	Kryptofycín	KB *C₅₀(ng/ml)	LoVo IC_5Q(ng/ml)	SKOV3 IC (ng/ml)
	1	0,0025	0,001	0,026
	2	0,023	0,021	0,18
	3	1,8	0,6	2,8
	4	6	2,5	21
•	5	12	2	7,4
	8	0,01	0,0022	0,15
	12	18	3
	15			12
	16	0,08	0,02	0,64
	17	4,7	S, 9	11
	18	15	4_t5	23
	19	9,8	5,9	41
	21	0,01	0,0003	0,029
	23	0,89	0,4	1,7
	24	0,12	0,095	0,3
	26	19	9,8	95
	28	l,⁵	0,75	6,1
	29	1	0,49	3,4
	30	11	8	21
	31	0,53	0,062	1,9
	35	0,055	0,01	0,092
	40	9,0	1,0	1,7
	43	0,72	0,8	1,1
	45	2,3	2,4	1,6
	49	1,4	1,9	1,1
	50	0,17	0,17	0,2
	54	0,80	2,2	2,2

210

Tabuľka 3

Účinnosť kryptofycínu 1 in vivo

P. č.	SC Nádor Počet i.v. injekcií	Celková dávka (mg/kg)	Strata tel.hmot. (nadir) (»)	T/C (»)	Log. usmrtenia	Vyliečenie
1560	tlstého
	čreva 38 8	10,3	prírastok	6	1,5	0/5
1694	slinivky 03 8	16,0	prírastok	0	2,0	0/5
1636	tlstého
	čreva 51 7	28,1	11	7	1,3	0/5
1720	mliečnej žľazy 16/C 5	13,2	1	5	1,4	0/5
1733	mliečnej žľazy 16/taxol 5	16,5	0	2	1,8	0/4
1833	M17/0 (adr. senz.) 5	5,4	10	23	<1	0/5
1749	slinivky 02 5	11,0	5	20	1,1	0/5
1596	malobunkový pľúc u človeka DMS273 SCID 6	7,3	0	27	<1	0/5
1806	MX-1 prsníka u človeka 8	12	3	3	2,0	0/5
1823	H125 adeno-
	skvamózny pľúc 8	14,4	15	9	1,1	0/5
	u človeka		1/5 smrť
1841	LNCaP prostaty u človeka 6	6,5	6	26	<1	0/5

211

Tabulka 4

Účinnosť kryptofycínových analógov in vivo

P. č.	Činidlo	SC Nádor	Počet i.v. injekcií	Celková dávka (mg/kg)	Strata tel.hmot. (nadir) (»)	T/C	Log. usmrtenia	Vyliečenie
1813	Kryptofycín 2	P03	10	37	2	44 1	<1	0/5
1843	Kryptofycín 3	P03	4	28/5	9	54 t	<1	0/5
1769	Kryptofycín 5	C38	15	45	2 >	10 0 t	žiadne	0/5
1825	Kryptofycín 8	P03	11	106	6	4 t	4,6	0/5
1885	Kryptofycín 8	Mam 16/C	7	21,3	4,5	6 t	2,5	0/5
1887B	Kryptofycín 8	C38	6	30	2	0 t	2,8	1/5
1900	Kryptofycín 8	C51	9	67,5	1	7 í	1,8	0/5
1843	Kryptofycín 15	P03	5	18	7	83 t	žiadne	0/5
1878	Kryptofycín 16	P03	9	82	1	89 t	žiadne	0/5
1813	Kryptofycín 21	P03	9	27	11 (1/5 smrť)	61 t	žiadne	0/5
1843	Kryptofycín 35	P03	7	23	2	11 t	1,3	0/5

212

T a b u 1 k a 5

Cytotoxicity antimitotických činidiel voči bunkám

SKOV3 a SKVLB1

Na bunky sa 48 hodín pôsobí rôznymi koncentráciami ďalej uvedených zlúčenín. Počet buniek sa stanoví spôsobom opísaným hore a pre každú zlúčeninu sa vyráta IC₅₀. Hodnoty uvedené v tabuľke predstavujú strednú hodnotu ± smerodajná odchýlka z troch skúšok.

Bunková línia

Zlúčenina

SK0V3

SKVLB1

Faktor rezistencie

IC_5O (nM)

Vinblastín	0,35	+	0,25	4200	+	1700	12	000
Taxol	1	+	0,4	8000	+	2000	8	000
Kryptofycíny	0,007	+	0,002	0,60	+	0,19		86

213

T a b u Ϊ k a 6

Cytotoxicita kryptofycínov in vitro

Kryptofycín

KB IC₅₀(nM)

LoVo IC₅₀(nM)

1	0,0092	0,0104
3	3,1-4,6	1,9-5,8
8	0,019	0,0091
51	3,5	5,2
52	0,043	0,070
53	4,2	5,5
55	0,033	0,047
57	0,064	0,27
58	0,048	0,20
61	21	15
81	5,5	5,7
82	310	45
90	0,34	0,30
91	30	34
97	3,6	5,7
110	4,6	5,3
111	4,8	3,2
112	5,4	6,2
115	0,039	0,048
117	0,036	0,031
118	2,3	1,2
119	4,4	6,1
120	4,6	6,4
122	0,021	6,9
125	0,05	0,006
127	0,176	0,075
128	0,023	2,5
132	0,082	0,037

214

Tabuľka 7

Účinnosť kryptofycínu 52 in vivo (súhrn)

P. SC Nádor	Celková	Počet	Strata	T/C	Čiastočná Úplná	LogiO	Vyliečenie	Deň bez	Účinnosť
č.	dávka	injekcií tel.hmot.	(»)	regresia regresia	usmrtenia	(bez ná-	nádoru
	(mg/kg)		(nadir)			nádor.	doru)
			(»)			buniek
Ľudské nádory
2069* H116	30	4	6,3	4,1	2/5 0/5	2,4	0/5	84	+++
tlstého
čreva
2072* LNCaP	48	8	4,8	6,9	5/5 1/5	3,2	0/5	66	++++
prostaty
2075* Glb/Panc	48	9	2,3	16	—	žiadne	0/5	68	—
2087* B125 pľúc	injekčné podávanie prebieha

Myšie nádory

2063 Mam	24	12	4,7	10	—	—	1,6	0/5	18	++
17/Adr
2065 26/A	64	10	14,0	14	—	—	1,1	0/5	24	+
tlstého
čreva
2068* 38	55	8	22	0	1/5	1/5	1,6	0/5	95	++
tlstého
čreva
2080* Mam 16/C	30	3	1,6	5	—	—	1,2	1/5	59	++
2082 Mam	36	4	0	2	—	—	2	0/5	22	+++

16/C/Adr.

2088* Pane 02 injekčné podávanie prebieha *pokračuje

215

Tabulka 8

Účinnosť kryptofycínu 52 in vivo (súhrn)

P. SC Nádor č.	Celková dávka (mg/kg)	Počet Strata injekcií tel.hmot. (nadir) (»)	T/C (*)	Čiastočná regresia	Úplná regresia	Ľogip _ usmrtenia nádor, buniek	Vyliečenie (bez nádoru)	Deň bez nádoru	Účinnosť
Ľudské nádory
2066* TSU	298,5	10	8,1	0	5/5	5/5	4,0	2/5	d 94	++++
prostaty
2069**H116	315*	7	10,4	0	4/5	3/5	6,3	2/5	d 84	++++
tlstého	157,5	7	7,6	8	4/5	0/5	3,6	0/5	d 84	++++
čreva
2072**LNCaP	300	12	3,1	0	5/5	5/5	5,9	3/5	d 77	++++
prostaty	200	5	7,7	0	4/5	3/5	6,0	0/5	d 77	++++
2075**Glb/Panc	320	8	0,0	4,4	—	—	>2	1/5	d 68	+++
2087 H125 pľúc	injekčné podávanie prebieha
Myšie nádory

2064	Mam 16/C	144	10	7,5	0	—	—	3,9	0/5	d 92	++++
2065	26	260	10	2	0	—	—	1,2	0/5	d 24	+
	tlstého
	čreva
2068	38	237	8	13	0	5/5	4/5	4,7	0/5	d 95	++++
	tlstého
	čreva
2070**Panc 03	402	6	6,0	0	—	—	>4,5	5/5	d 84	++++
		270	6	5,0	0	—	—	>4,5	4/5	d 84	++++
		180	4	0,8	0	—	—	>4,5	4/5	d 84	++++
2071**Mam 17/adr.	180	6	4,7	0	—	—	2,1	0/5	d 18	4-H-
2082	Naml6/C/adr.l80	6	1,7	0	—	—	2,4	0/5	d 22	+++
2088	Pane 02	injekčné podávanie prebieha

1/5 smrť následkom liečiva ** pokus pokračuje

216

Tabulka 9

Účinnosť kryptofycínových analógov proti časnému štádiu Pane 03 myších samcov BDF^

Klietka Činidlo	Počet i.v.	Celková	Smrť	Zmena	Stredná	T/C	Bez nádoru
č.	injekcií	dávka	násled-	tel.hmot.	veľkosť	(M	deň 14
		(mg/kg)	kom	(i)/(deň)	nádoru
			liečiva		v deň 14/
					(rozmedzí)

bez Rx — +6,8/(12) 830 (393-1458) — 0/5

	2 3 4	Kryptofycín 117	1 6 6	7,0 13,5 6,75
	5	Kryptofycín 125	7	42
	6		7	21
	7		7	10,5
	8	Kryptofycín 128	3	57
	9		4	32,5
•	10		4	16,25
	11	Kryptofycín 132	6	180
	12		6	90
	13		6	45

3/4	-20,0/(12)	0	(jedna myš)	0	1/4
1/4	-8,2/(13)	75	(0-256)	9	1/4
0/3	-2,4/ (8)	247	(80-415)	30	0/3
0/4	0/ (10)	0	(0-63)	0	3/4
0/4	-1,6/(10)	101	(0-126)	12	1/4
0/4	0/ (8)	295	(264-467)	35	0/4
1/4	-15,2/(10)	0	(vždy nula)	0	3/4
0/4	-5,7/ (6)	0	(vždy nula)	0	4/4
0/4	0/ (12)	0	(vždy nula)	0	4/4
0/4	-5,7/(10)	0	(vždy nula)	0	4/4
0/4	-3,3/ (8)	0	(vždy nula)	0	4/4
0/4	1,7/(10)	04	(108-505)	37	0/4

Nádory boli implantované v deň O; ošetrenie liečivom bolo zahájené v deň 3. Od 14 dňa vypadajú všetky myši v dobrom stave a ich hmotnosť sa zvyšuje. Nemalo by dôjsť k ďalším úmrtiam následkom liečiva.

217

T a b u Ϊ k a 10 Účinnosť kryptofycínu 8 in vivo

P. SC Nádor Počet i.v.	Celková	Zmena	T/C	Hrubé	Vyliečenie
č. injekcií	dávka	tel.hmot.	(M	log.
	(mg/kg)	(nadir)		usmrtenie
		(»)
1825B slinivky 03 11	106	-6	4	4,6	0/5
1917 slinivky 03 12	60	-1	0	2,8	0/5

1885A mliečnej

	žľazy 16/C	7	21,3	-4,5	6	2,5	0/5
1887B tlstého
	čreva 38	6	30	+2	0	3,0	0/5
1954	tlstého
	čreva 38	11	132	-8	0	>4,5	5/5
		11	88	-6	0	>4,5	4/5
1965	tlstého
	čreva 26	10	100	-5,4	0	2,3	0/5
2007	vaječníkov	6	80	-3,5	0	>2	2/5
	115						(d 20)
		8	80		0	>2	1/5
							(d 20)
1994	mliečnej žľazy 17/adr	9	53,1	-0,9	0	3,2	0/5
		9	36,9	-1,8	0	2,6	0/5
1990	mliečnej
	žľazy 16/C/adr 7	55	-6	0	2,5	0/5
2001	pankreasu 02	9	125	-3,5	0	>2	1/5
							(d 25)
1931		9	67,5	-6	18	1,8	0/5

218

tabuľka 10 - pokračovanie

P. č.	SC Nádor Počet i.v. injekcií	Celková dávka (mg/kg)	Zmena tel.hmot. (nadir) (t)	T/C (í)	Hrubé log. usmrtenie	Vyliečenie
1974	leukémia
	IV P388	7	91	-11	50	2,3	0/5
					ILS
1924	tlstého
	čreva 51	9	67,5	-6	7	2,2	0/5
1946	MX-1 prsníka	11	50	-5,9	0	>4,5	3/5
	u človeka	11	34,2	-4,5	0	4,5	1/5
1952	adenoskvam.	8	96	+3,8	0	1,8	0/5
	ľudských	8	57,5	+9,8	0	1,6	0/5
	pľúc H125
1983	ľudskej pro-	7	94,5	-3,4	0	>4	5/5
	staty TSU	7	66,5	-3,3	0	3,5	0/5
1978	ľudskej pro-	8	96	+3,1	7,3	1,6	0/5
	staty PC-3	8	67,2	+3,6	14,7	0,9	0/5
1980	tlstého	8	108	-6,7	5/5*	3,8	0/5
	čreva u člo-
	veka H116	8	75	-6,7	4/5*	3,5	0/5
	v pokročilom
	štádiu	8	53	-3,3	1/5*	2,9	0/5
1979	ľudskej pro-	6	81	-3,2	5/5**	9,1***	4/5
	staty LNCaP	6	57	-3,4	5/5**	7,1***	4/5
	v pokročilom	6	40,2	-3,2	5/5**	8,0***	2/5
	štádiu

čiastočná regresia úplná regresia obmedzený počet nového nárastu nádorov pre výpočet

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kryptofycínové zlúčeniny všeobecného vzorca I predstavuje metylskupinu, fenylskupinu alebo ktorú kolvek jednoduchú nesubstituovanú alebo substituovanú aromatickú alebo heteroaromatickú skupinu;

predstavuje atóm halogénu, merkaptoskupinu, aminoskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, trialkylamoniumskupinu, alkyltioskupinu, dialkylsulfoniumskupinu, sulfátovú alebo fosfátovú skupinu;

predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový, episulfidový, sulfátový alebo monoalkylfosfátový kruh; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₈ a C_ig;

R³ predstavuje nižšiu akylskupinu;

220

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄;

R⁶ predstavuje benzylskupinu, hydroxybenzylskupinu, alkoxybenzylskupinu, halogénhydroxybenzylskupinu, dihalogénhydroxybenzylskupinu, halogénalkoxybenzylskupinu alebo dihalogénalkoxybenzylskupinu;

R⁷, R⁸, R⁹ a R¹⁰ predstavuje každý nezávisle atóm vodíka alebo nižšiu akylskupinu; a

X a Y predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, imino skupinu alebo alkylaminoskupinu.
2. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 1 všeobeco ného vzorca I, kde R° predstavuje etylskupinu, propylskupinu, izopropylskupinu, butylskupinu, izobutý1skupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu.
3. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde R⁷ predstavuje etylskupinu, propylskpinu, izopropylskupinu, butylskupinu, izobutylskupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu.
4. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde R⁷ predstavuje atóm vodíka, R⁸ predstavuje metylskupinu, R³ predstavuje metylskupinu; a X a Y nepredstavujú obidva atóm kyslíka.
5. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde R³ predstavuje etylskupinu, propylskupinu, izopropylskupinu, butylskupinu, izobutylskupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu.

221
6. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 1 všeobec-

Q ného vzorca I, kde R predstavuje metylskupinu, etylskupinu, propylskupinu, butylskupinu, izobutylskupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu.
7. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde R¹⁰ predstavuje metylskupinu, etylskupinu, propylskupinu, butylskupinu, izobutylskupinu, pentylskupinu alebo izopentylskupinu.
8. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 1 všeobec ného vzorca I, kde aspoň jedna zo skupín viazaných k uhlíkovému atómu C₃, C₆, C_1Q, C_lg, C₁₇ a C₁₈ vykazuje R-stereochémiu.
9. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde aspoň jedna zo skupín viazaných k uhlíkovému atómu C₃, C₆, C_1Q, Cjg, C₁₇ a C₁₈ vykazuje S-stereochémiu.
10. Kryptofycínová zlúčenina podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c18 ^{a c}19' R³» R⁷ a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c13 ^{a c}14' ^r6 predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
11. Kryptofycínová zlúčenina podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³, R⁷ a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutyl-

222 skupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
12. Kryptofycinová zlúčenina podía nároku 1 všeobecΊ 2 neho vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R^x a R brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³, R⁷ a R⁸predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
13. Kryptofycinová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ predstavuje S-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³, R⁷ a R⁸predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C^₃ a C^₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
14. Kryptofycinová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³, R⁷ a R⁸predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
15. Kryptofycinová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ predstavuje s-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³, R⁷ a R⁸ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹

223 predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
16. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecΊ 9 ného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R a R brané dohromady tvoria R,R-episulfidový kruh, R³, R⁷ a R⁸predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁸ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
17. Kryptofycínová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-metoxyfenylskupinu, R¹a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C_lg a C_ig, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c13 ^{a c}14' ^r6 predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
18. Kryptofycínová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje metylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c18 ^{a C}19· ^{r3 a R?} predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c13 a ^c14' ^r6 predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
19. Kryptofycínová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje metylskupinu, R¹ a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje

224

3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
20. Kryptofycínová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje metylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje q

3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
21. Kryptofycínová zlúčenina podía nároku 1 všeobecΊ P ného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R a R brané dohromady tvoria R,R-aziridínový kruh, R³, R⁷ a R⁸predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R¹⁰ predstavuje atóm vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
22. Kryptofycínová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-fluórfenylskupinu, R¹a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C_lg a C₁₉, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c13 ^{a C}14' ^r6 Predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
23. Kryptofycínová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c18 ^{a c}19' ^{r3 a r7} predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané

225 dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
24. Kryptofycínová zlúčenina podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje 2-tienylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c18 ^{a c}19' ^{r3 a R?} Predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c13 a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
25. Kryptofycínová zlúčenina podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-fluórfenylskupinu, R¹a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
26. Kryptofycínová zlúčenina podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-fluórfenylskupinu, R¹a R² brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R³·⁸ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
27. Kryptofycínová zlúčenina podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predsta-

226 vujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
28. Kryptofycinová zlúčenina podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R a R predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
29. Kryptofycinová zlúčenina podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje 2-tienylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
30. Kryptofycinová zlúčenina podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje 2-tienylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.

227
31. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c18 ^{a c}19' ^{r3 a R?} Predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm dusíka nesúci jediný atóm vodíka.
32. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm dusíka nesúci jediný atóm vodíka.
33. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ a R²brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R° a R predstavujú atómy vodíka, X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm dusíka nesúci jediný atóm vodíka.
34. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobec ného vzorca I, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami c₁₈ a C_ig, R³ a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵

228 brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami ^c13 ^{a c}14' ^r6 predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X a Y predstavujú atómy kyslíka.
35. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹a R² brané dohromady tvoria R,R-epoxidový kruh, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X a Y predstavujú atómy kyslíka.
36. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹a R² brané dohromady tvoria S,S-epoxidový kruh, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X a Y predstavujú atómy kyslíka.
37. Kryptofycínová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje fenylskupinu, R¹ predstavuje s-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka, X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm dusíka nesúci jediný atóm vodíka.

229
38. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R¹ predstavuje s-chlór, R predstavuje R-hydroxyskupinu, R a R predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C^₃ a C₁₄, R predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
39. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R¹ predstavuje R-chlór, R² predstavuje S-hydroxyskupinu, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R® brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁸ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
40. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-tolylskupinu, R¹ predstavuje R-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³ a R⁷predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C^₃ a C₁₄, R⁸ predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
41. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹predstavuje s-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.

230
42. Kryptofycínová zlúčenina podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹predstavuje R-chlór, R² predstavuje S-hydroxyskupinu, R³a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁸ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
43. Kryptofycínová zlúčenina podía nároku 1 všeobecného vzorca I, kde Ar predstavuje p-chlórfenylskupinu, R¹predstavuje R-chlór, R² predstavuje R-hydroxyskupinu, R³a R⁷ predstavujú metylskupiny, R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄, R⁶predstavuje 3-chlór-4-metoxybenzylskupinu, R⁹ predstavuje izobutylskupinu, R⁸ a R¹⁰ predstavujú atómy vodíka a X a Y predstavujú atómy kyslíka.
44. Spôsob výroby kryptofycínových zlúčenín, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa výber alylicky substituovaného E-alkénu; prešmyk alylicky substituovaného E-alkénu pri použití stereošpecifického Wittigovho prešmyku; premenenie tejto zlúčeniny na prvú δ-aminokyselinu alebo δ-hydroxykyselinu; kopuláciu prvej kyseliny s druhou α-aminokyselinou za vzniku prvej podjednotky; kopuláciu tretej β-aminokyseliny so štvrtou α-hydroxykyselinou alebo α-aminokyselinou za vzniku druhej podjednotky; a kopuláciu prvej pod jednotky s druhou podjednotkou za vzniku kryptofycínu.
45. Spôsob podía nároku 44, vyznačujúci sa t ý m , že sa vyrábajú kryptofycínové zlúčeniny všeobecného vzorca I

231 (D kde

Ar predstavuje metylskupinu, fenylskupinu alebo ktorúkolvek jednoduchú nesubstituovanú alebo substituovanú aromatickú alebo heteroaromatickú skupinu; R¹ predstavuje atóm halogénu, merkaptoskupinu, aminoskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, trialkylamoniumskupinu, alkyltioskupinu, dialkylsulfoniumskupinu, sulfátovú alebo fosfátovú skupinu; R² predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu; alebo R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový, episulfidový, sulfátový alebo monoalkylfosfátový kruh; alebo R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₈ a C_ig;

232

R³ predstavuje nižšiu akylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄;

R⁶ predstavuje benzylskupinu, hydroxybenzylskupinu, alkoxybenzylskupinu, halogénhydroxybenzylskupinu, dihalogénhydroxybenzylskupinu, halogénalkoxybenzylskupinu alebo dihalogénalkoxybenzylskupinu;

R⁷, R⁸, R⁹ a R¹⁰ predstavuje každý nezávisle atóm vodíka alebo nižšiu akylskupinu; a

X a Y predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, iminoskupinu alebo alkylaminoskupinu.
46. Spôsob podlá nároku 45, vyznačujúci sa t ý m , že Ar predstavuje fenylskupinu; R³ predstavuje metylskupinu; R⁶ predstavuje halogénmetoxybenzylskupinu; R⁷ predstavuje atóm vodíka; R⁸ predstavuje metylskupinu; R⁹ predstavuje izobutylskupinu; R¹⁰ predstavuje atóm vodíka; X predstavuje atóm kyslíka a Y predstavuje atóm kyslíka.
47. Spôsob podlá nároku 44, vyznačujúci sa t ý m , že sa vyrábajú kryptofycínové zlúčeniny všeobecného vzorca

233 kde

R¹ predstavuje atóm halogénu; a

R² predstavuje hydroxyskupinu; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový kruh;

R³ predstavuje atóm vodíka; a

R⁴ predstavuje atóm vodíka; alebo

R³ a R⁴ brané dohromady predstavujú dvojnú väzbu.
48. Farmaceutický prostriedok, ktorý je užitočný na inhibíciu proliferácie hyperproliferatívnej cicavčej bunky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa účinné množstvo kryptofycínovej zlúčeniny všeobecného vzorca I kde

Ar predstavuje metylskupinu, fenylskupinu alebo ktorúkolvek jednoduchú nesubstituovanú alebo substituovanú aromatickú alebo heteroaromatickú skupinu;

R¹ predstavuje atóm halogénu, merkaptoskupinu, aminoskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, trialkylamoniumskupinu, alkyltioskupinu, dialkylsulfoniumskupinu, sulfátovú alebo fosfátovú skupinu;

234

R² predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu;

alebo

1 9

R a R brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový, episulfidový, sulfátový alebo monoalkylfosfátový kruh; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C_lg a C_ig;

predstavuje nižšiu akylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄;

R⁶ predstavuje benzylskupinu, hydroxybenzylskupinu, alkoxybenzylskupinu, halogénhydroxybenzylskupinu, dihalogénhydroxybenzylskupinu, halogénalkoxybenzylskupinu alebo dihalogénalkoxybenzylskupinu;

V R Q 1 Π

R , R°, R a R predstavuje každý nezávisle atóm vodíka alebo nižšiu akylskupinu; a

X a Y predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, iminoskupinu alebo alkylaminoskupinu;

a farmaceutický vhodný nosič.
49. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 48, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa aspoň jedno ďalšie antineoplastické činidlo.

235
50. Kryptofycínové zlúčeniny všeobecného vzorca I kde

Ar predstavuje metylskupinu, fenylskupinu alebo ktorúkolvek jednoduchú nesubstituovanú alebo substituovanú aromatickú alebo heteroaromatickú skupinu;

predstavuje atóm halogénu, merkaptoskupinu, aminoskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, trialkylamoniumskupinu, alkyltioskupinu, dialkylsulfoniumskupinu, sulfátovú alebo fosfátovú skupinu;

R² predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu;

alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový, episulfidový, sulfátový alebo monoalky1fosfátový kruh; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C_1Q a C_ig;

R³ predstavuje nižšiu akylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

236

R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄;

R⁶ predstavuje benzylskupinu, hydroxybenzylskupinu, alkoxybenzylskupinu, halogénhydroxybenzylskupinu, dihalogénhydroxybenzylskupinu, halogénalkoxybenzylskupinu alebo dihalogénalkoxybenzylskupinu;

R⁷, R⁸, R⁹ a R¹⁰ predstavuje každý nezávisle atóm vodíka alebo nižšiu akylskupinu; a

X a Y predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, iminoskupinu alebo alkylaminoskupinu;

na inhibíciu proliferácie cicavčích buniek.
51. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 50 spolu s aspoň jedným ďalším antineoplastickým činidlom na inhibíciu proliferácie cicavčích buniek.
52. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 50, kde cicavčie bunky sú hyperproliferatívne.
53. Kryptofycínové zlúčeniny podlá nároku 52, kde hyperproliferatívne bunky sú ludské bunky.
54. Kryptofycínové zlúčeniny všeobecného vzorca I

237 kde

Ar predstavuje metylskupinu, fenylskupinu alebo ktorúkoľvek jednoduchú nesubstituovanú alebo substituovanú aromatickú alebo heteroaromatickú skupinu;

predstavuje atóm halogénu, merkaptoskupinu, aminoskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, trialkylamoniumskupinu, alkyltioskupinu, dialkylsulfoniumskupinu, sulfátovú alebo fosfátovú skupinu;

predstavuje hydroxyskupinu alebo merkaptoskupinu; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria epoxidový, aziridínový, episulfidový, sulfátový alebo monoalkylfosfátový kruh; alebo

R¹ a R² brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₈ a C_ig;

predstavuje nižšiu akylskupinu;

R⁴ a R⁵ predstavujú atómy vodíka; alebo

R⁴ a R⁵ brané dohromady tvoria dvojnú väzbu medzi uhlíkovými atómami C₁₃ a C₁₄;

R⁶ predstavuje benzylskupinu, hydroxybenzylskupinu, alkoxybenzylskupinu, halogénhydroxybenzylskupinu, dihalogénhydroxybenzylskupinu, halogénalkoxybenzylskupinu alebo dihalogénalkoxybenzylskupinu;

238

R⁷, R⁸, R⁹ a R¹⁰ predstavuje každý nezávisle atóm vodíka alebo nižšiu akylskupinu; a

X a Y predstavuje každý nezávisle atóm kyslíka, iminoskupinu alebo alkylaminoskupinu;

na narušenie dynamického stavu polymerácie a depolymerácie mikrotubulov za účelom zastavenia bunkovej mitózy, a teda na inhibíciu proliferácie hyperproliferatívnych cicavčích buniek vykazujúcich fenotyp rezistencie voči niekolkým liečivám.
55. Kryptofycínové zlúčeniny podía nároku 54 spolu s aspoň jedným ďalším antineoplastickým činidlom na narušenie dynamického stavu polymerácie a depolymerácie mikrotubulov za účelom zastavenia bunkovej mitózy, a teda na inhibíciu proliferácie hyperproliferatívnych cicavčích buniek vykazujúcich fenotyp rezistencie voči niekolkým liečivám.
56. Kryptofycínové zlúčeniny podía nároku 54, kde cicavčie bunky sú íudské bunky.
57. Farmaceutický prostriedok podía nároku 48 na zmierňovanie patologických stavov vyvolaných hyperproliferujúcimi cicavčími bunkami.
58. Farmaceutický prostriedok podía nároku 57, kde cicavčie bunky sú íudské bunky.
59. Farmaceutický prostriedok podía nároku 57 na kombinačnú liečbu s aspoň jednou prídavnou liečbou zamerenou na zmiernenie patologického stavu.
60. Farmaceutický prostriedok podía nároku 57, kde patologický stav je charakterizovaný tvorbou novotvarov.

239
61. Farmaceutický prostriedok podía nároku 60, kde novotvary sú zvolené zo súboru zahŕňajúceho novotvary prsníka, malobunkové píúc, ne-malobunkové píúc, kolorektálne, leukémia, melanómy, pankreatický adenokarcinóm, novotvary centrálneho nervového systému (CNS), vaječníkov, prostaty, sarkómy mäkkých tkanív alebo kostí, novotvary hlavy a krku, novotvary zažívacieho traktu, vrátane slinivky, pažeráku a žalúdku, myelomy, novotvary močového mechúru, obličiek a neuroendokrinné novotvary, vrátane tyroidných, nehodgkinských a Hodgkinovej choroby.