RO118931B1

RO118931B1 - Derivaţi de criptoficine, procedeu de preparare a acestora, compoziţie farmaceutică şi utilizarea lor

Info

Publication number: RO118931B1
Application number: RO97-01693A
Authority: RO
Inventors: Richard E. Moore; Marcus A. Tius; Russeli A. Barrow; Jian Liang; Thomas H. Corbett; Frederick A. Valeriote; Thomas K. Hemscheidt; Golakoti Trimurtulu
Original assignee: University Of Hawaii; Wayne State University
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2004-01-30
Also published as: EP0830136B1; HU225041B1; DE69633667D1; DE69633667T2; AU723652B2; HUP9801880A2; ES2230561T3; MD970313A; NO326685B1; CZ278197A3; NO974105D0; EP0830136A1; PL185949B1; CN1165337C; WO1996040184A1; JPH11510476A; MD2196B2; GEP20002206B; FI973591A0; HUP9801880A3

Abstract

Invenţia se referă la derivaţi de criptoficină cu structura corespunzătoare următoarei formule chimice generale: la un procedeu de preparare a unui derivat de criptoficină, la o compoziţie farmaceutică care conţine un derivat de criptoficină şi un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic şi suplimentar un agent antineoplazic şi utilizarea derivaţilor de criptoficină pentru inhibarea proliferării unei celule de mamifer sau tratarea unei stări neoplazice. ŕ

Description

Invenția se referă la derivați de criptoficină, la procedeul lor de preparare și la o compoziție farmaceutică, iar derivații sunt utilizați, în medicină, în tratarea bolilor neoplazice, prin inhibarea proliferării celulelor hiperproliferative.

Este cunoscut faptul că bolile neoplazice sunt caracterizate prin proliferarea celulelor care nu se supun controlului normal de creștere al celulelor și constituie o cauză majoră a mortalității la om. Experiența clinică, în chemoterapie, a demonstrat că sunt de dorit noi și eficiente medicamente pentru tratarea acestor boli. Această experiență a demonstrat, de asemenea, că medicamentele care fărâmițează sistemul de microtubuli, al citoscheletului poate fi eficient în inhibarea proliferării celulelor neoplazice.

Sistemul de microtubuli, al celulelor eucariotice, este un component major al citoscheletului și este într-o stare dinamică de asamblare și dezasamblare, adică heterodimerii tubulinei sunt polimerizați, pentru a forma microtubuli și microtubulii sunt depolimerizați la componentele lor constituiente. Microtubulii joacă rol în reglarea arhitecturii celulei, metabolismului și diviziunii. Starea dinamică a microtubulilor este critică pentru funcționarea lor normală. Referitor la diviziunea celulară, tubulina se polimerizează în microtubuli care formează axul mitotic. Microtubulii sunt apoi depolimerizați, când utilizarea axului mitotic a fost îndeplinită. Ca urmare, agenții care împiedică polimerizarea sau depolimerizarea și, prin aceasta, inhibă mitoza, cuprind agenții chemoterapeutici cei mai eficienți în utilizările clinice.

Astfel de agenți antimitotici sau otrăvuri pot fi clasificați în trei grupe, pe baza mecanismului lor molecular de acțiune. în prima grupă intră agenții care includ colchicina și colcemidul, care inhibă formarea microtubulilor prin sechestrarea tubulinei. Al doilea grup cuprinde agenții, ca vinblastina și vincristina, care induc formarea agregatelor paracristaline ale tubulinei. Vinblastina și vincristina sunt medicamente anticancerigene, cunoscute: acțiunea lor de fărâmițare a axului mitotic al microtubulilor inhibă, preferențial, celulele hiperproliferative. A treia grupă constă din agenți, ca taxolul care inițiază polimerizarea tubulinei și, în acest fel, stabilizează structurile microtubulilor.

Cu toate acestea, activitatea antimitotică a unui agent nu reprezintă o garanție a eficacității împotriva unei celule tumorale, și, cu siguranță, nu față de o celulă tumorală, care prezintă un fenotip rezistent la medicament. Alcaloizii Vinca, cum ar fi vinblastina și vincristina sunt eficienți împotriva celulelor neoplazice și a tumorilor, dar nu prezintă activitate față de unele tumori și celule rezistente la medicamente. Una din condițiile ca o celulă neoplazică să prezinte rezistență la medicament (DR) sau rezistență multiplă la medicament (MDR) este cea a supraexprimării glicoproteinei-P. Compușii care sunt substraturi sărace pentru transportul glicoproteinei-P pot fi utili pentru aceste fenotipuri DR sau MDR.

Ca urmare, prezentarea fenotipului DR sau MDR prin multe celule tumorale și dovada clinică a modului de acțiune a agenților antimicrotubulari față de celulele antineoplazice necesită elaborarea agenților antimicrotubulari, citotoxici, față de celulele neoplazice rezistente la medicament, cât și față de celulele neoplazice cu un fenotip rezistent la medicamente. Agenții care s-au dovedit a fi promițători în acest sens includ o clasă de compuși cunoscuți ca criptoficine.

Referitor la procedeele de obținere a criptoficinelor, până în prezent, nu se cunoaște nici o metodă de sinteză totală a criptoficinelor. Compușii criptoficinici sunt, în prezent, obținuți prin izolare din alga verde - albastră sau prin variante semisintetice ale acestor compuși naturali. Lipsa unui procedeu de sinteză totală face dificilă obținerea criptoficinelor stereospecifice, care ar putea maximiza activitatea și ar crește stabilitatea compusului. De exemplu, cercetările au arătat că sunt mai active criptoficinele cu un ciclu macrociclic intact. Ca urmare, este de dorit o metodă de sinteză totală care să permită obținerea criptoficinelor cu un ciclu macrociclic, care este mai stabil decât al criptoficinelor naturale. Prezenta invenție rezolvă aceste probleme.

RO 118931 Β1

Problema pe care o rezolvă invenția este de a prezenta derivați de criptoficină, un procedeu de preparare a unui derivat de criptoficină și o compoziție farmaceutică cu acești derivați utilizați în inhalarea proliferării celulelor hiperproliferative.

Derivații de criptoficină, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că au următoarea structură:

în care:

Ar este metil sau fenil sau orice grupare aromatică simplă sau heteroaromatică, substituită sau nesubstituită;

FȚ este un halogen, o grupare SH, amino, monoalchilamino, dialchilamino, trialchilamino, alchiltio, dialchilsulfoniu, sulfat sau fosfat; 70

R₂ este OH sau SH; sau

R, și R₂ pot fi legate între ele cu formarea unui ciclu epoxidic, unui ciclu aziridinic, unui ciclu episulfidic, unui ciclu sulfat sau unui ciclu monoalchilfosfat; sau

R, și R₂ pot fi legate între ele cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉;

R₃ este o grupare alchil inferioară; 75

R₄ și R₅ sunt hidrogen, sau

R₄ și R_s pot fi legate între ele cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄;

R₆ este o grupă benzii, hidroxibenzil, alcoxibenzil, halohidroxibenzil, dihalohidroxibenzil, haloalcoxibenzil sau dihaloalcoxibenzil;

R₇, R₈, Rg Ș' ^Riosunt fiecare independent H sau o grupare de alchil inferior; iar 80

X și Y sunt fiecare independent O, NH sau alchilamino.

Procedeul de preparare a unui derivat de criptoficină, conform invenției, cuprinde următoarele etape:

- alegerea unui E alchene substituită alilic;

- rearanjarea E alchenei alilic substituite, prin reacția de rearanjare stereospecifică 85 Witting;

- transformarea acestui compus într-un prim δ-aminoacid sau δ-hidroxiacid;

- cuplarea primului acid la un al doilea α-aminoacid cu obținerea primei subunități;

- cuplarea unui al treilea β-aminoacid cu un al patrulea α-hidroxiacid sau a-aminoacid pentru obținerea celei de-a doua subunități; 90

- cuplarea primei subunități cu cea de-a doua subunitate cu obținerea derivatului de criptoficină.

Compoziția farmaceutică, conform invenției, conține un derivat de criptoficină, așa cum este definit mai sus, într-o cantitate eficientă terapeutic, împreună cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic și, suplimentar, cel puțin un agent antineoplazic. 95

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:

- stabilitate ridicată la hidroliză și solvoliză;

- sensibilitate ridicată la metancoliză.

RO 118931 Β1 într-o formă de realizare a invenției, aceasta se referă la noi compuși de criptoficină, având următoarea structură:

în care:

R, este H, OH, un halogen, O al unei grupări cetonice, o grupare NH₂, SH, o grupare de alcoxil inferior sau o grupare de alchil inferior;

R₂ este H, OH, O al unei grupări cationice, o grupare NH₂, SH, o grupare de alcoxil inferior sau o grupare de alchil inferior, sau

R₁ și R₂ pot fi legate între ele cu formarea unui ciclu epoxidic, unui ciclu aziridinic, unui ciclu episulfidic, sau a unei duble legături între C₁₀ și C_n; sau

R, și R4 pot fi legate între ele cu formarea unui ciclu de tetrahidrofuran;

R₃ este H sau o grupare alchil inferioară;

R₄ este OH, o grupare alcanoiloxi inferior sau o grupare α-hidroxi-alcanoiloxi inferioară;

R₅ este H sau o grupare OH;

R₆ este H; sau

R₅ și R₆ pot fi legate între ele cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆;

R₇ este o grupare benzii, hidroxibenzil, metoxibenzil, halohidroxibenzil, dihalohidroxibenzil, halometoxibenzil sau dihalometoxibenzil;

R₈ este OH, un β-aminoacid inferior, în care C, este legat la N din β-aminoacid, sau βaminoacid inferior esterificat, în care C, este legat la N din β-aminoacidul inferior esterificat;

R₄ și R₈ pot fi legate între ele cu formarea unei grupe didepsipeptidice constând dintr-un βaminoacid inferior legat de un acid α-hidroxialcanoic inferior; și

R₅ și R8 pot fi legate între ele cu formarea unei grupări didepsipeptidice, constând dintr-un β-aminoacid inferior legat de un acid α-hidroxialcanoic inferior; și cu următoarele condiții:

R, este H, o grupare de alchil inferior, sau o grupare alcoxil inferior numai dacă R₂este OH, O al unei grupări cetonice, NH₂, SH;

R₂ este H, o grupare alchil inferior, sau o grupare de alcoxil inferior numai dacă R, este OH, O al unei grupări cetonice, NH₂, SH; dacă R, este OH, R₂ este OH, R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legate între ele cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₄ și R₈ sunt legate între ele cu formarea unei grupări didepsipeptidice, având structura X:

în care O, din X corespunde lui R₄, N₄ din X corespunde lui R₈, R_g este metil și R₁₀ este izobutil, R₇ nu este 3-clor-4-metoxibenzil;

dacă Rt și R₂ sunt legate între ele cu formarea unui ciclu epoxidic, R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legate între ele, cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₄ și R₈ sunt legate între ele, cu formarea unei didepsipeptide având structura X, R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil,

R₇ nu este 3-clor-4-metoxibenzil;

RO 118931 Β1 dacă R, și R₂ sunt legate între ele, cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C,,, 150

R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legate între ele cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₄ și R₈ sunt legate între ele cu formarea didepsipeptidei având structura X, R_p este metil, și R₁₀ este izobutil, R₇ nu este 3-clor-4-metoxibenzil; și dacă R₁ și R₂ sunt legate între ele cu formarea unui ciclu epoxidic, R₃ este metil, R₅și R₆ sunt legate între ele cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₄ este legat de 155 capătul carboxilic din acidul leucic, iar R₈ este legat de capătul cu azot fie din acidul 3-amino2-metilpropionic, fie din esterul metilic al acidului 3-amino-2-metilpropionic, R₇ nu este 3-clor4-metoxibenzil.

De asemenea, invenția se referă la derivați de criptoficină în care cel puțin una din grupările atașate la C₂, C₈, C₉, C₁₀ și C_n au stereochimie de tip R. într-o altă formă de reali- 160 zare a invenției, cel puțin una din grupările atașate la C₂, C₈, C₉, C₁₀ și C_n au stereochimia de tip S.

Invenția se referă și la derivați de criptoficină, având structura de mai sus, în care structura de didepsipeptida, care este formată dacă R₄ sau R₅ sunt legate împreună cu R₈

în următoarea structură X:	165
	0^	0
X =		L JL
	Rio^		Re ^H	170

în care O, din X corespunde lui R₄ sau R_s, N₈ din X corespunde lui Re, Rg este H sau o grupare alchil inferior, iar R₁₀ este H sau o grupare alchil inferior.

în textul prezentei descrieri, termenii care urmează au semnificațiile indicate, în măsura în care, în text, nu sunt indicate alte semnificații. 175 “β-aminoacid inferior” desemnează orice β-aminoacid având de la 3 până la 8 atomi de carbon, incluzând catene hidrocarbonate liniare și neliniare; de exemplu acidul 3-amino2-metilpropionic.

“β-aminoacid inferior esterificat” desemnează orice β-aminoacid având 3 până la 8 atomi de carbon, în care atomul de hidrogen de la grupare carboxil este substituit cu o gru- 180 pare metil; de exemplu, ester metilic al acidului 3-amino-2-metilpropionic.

“Grupare alcanoiloxi inferior” desemnează o grupare alcanoiloxi având de la 1 până la 7 atomi de carbon, incluzând atât cafenele hidrocarbonate liniare, cât și neliniare.

“Grupare α-hidroxialcanoiloxi inferior” desemnează orice grupare a-hidroxialcanoiloxi, având 2 până la 7 atomi de carbon, incluzând catene hidrocarbonate lineare și nelineare, 185 de exemplu, acidul 2-hidroxi-4-metilvaleric.

“Grupare alcoxil inferior” desemnează orice grupare alchil având de la 1 până la 5 atomi de carbon, legată de un atom de oxigen.

“Grupare alchil inferior” desemnează orice grupare alchil având de la 1 până la 5 atomi de carbon, incluzând atât catenele hidrocarbonate liniare cât și neliniare cum ar fi de 190 exemplu grupările metil, etil, propil, izopropil, butii, izobutil, te/ț-butil, sec-butil, grupările butii metilate, pentil și terț-pentil.

“Alchenă substituită alilic” desemnează orice alchenă având substituent alchilic.

“Ciclu epoxidic” desemnează un ciclu de 3 atomi al cărui schelet este constituit din doi atomi de carbon și un atom de oxigen. 195 “Ciclu aziridinic” desemnează un ciclu de 3 atomi al cărui schelet este constituit din doi atomi de carbon și un atom de azot.

“Ciclu episulfidic” desemnează un ciclu de 3 atomi al cărui schelet este constituit din doi atomi de carbon și un atom de sulf.

RO 118931 Β1 “Ciclu sulfat” desemnează un ciclu de 5 atomi format din structura carbon-carbon-oxigen-sulf-oxigen cu doi atomi de oxigen, suplimentar legați de atomul de sulf.

“Ciclu monoalchilsulfonat” desemnează un ciclu de 5 atomi format din structura carbon-carbon-oxigen-fosfor-oxigen cu doi atomi de oxigen suplimentari, dintre care unul are o grupare de alchil inferior, legată la atomul de fosfor.

“Grupare aromatică simplă nesubstituită” desemnează ciclurile aromatice obișnuite având 4n+2 electroni π într-un sistem conjugat monociclic (de exemplu furii, pirolil, tienil, piridil) sau un sistem conjugat biciclic (de exemplu indolil sau naftil);

“Grupare aromatică simplă substituită” desemnează o grupare fenil substituită cu o singură grupare (cum ar fi, o grupare de alchil inferior sau un halogen).

“Grupare heteroaromatică” desemnează ciclurile aromatice care conțin unul sau mai mulți substituenți necarbonici, cum ar fi oxigen, sulf, azot.

“Halogen” desemnează acei atomi din sistemul periodic al elementelor, care din punct de vedere istoric se cunosc sub denumirea de halogeni. Procedeele de halogenare cuprind, dar nu se limitează numai la, adiția acizilor halogenați, substituția la temperatură ridicată, fotohalogenarea etc., precum și acele metode care sunt cunoscute din stadiul tehnicii [1,2],

O formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu epoxidic, R₃ este metil Rg și F% sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 4-metoxibenzil, iar R₄și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R_g este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 2, este următoarea:

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C_1V R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 4metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X în care R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 4, este următoarea:

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₄ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu tetrahidrofuranic, R₂ este o grupare OH, R₃ este metil, R₅ și R_e sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între

C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₈ este o grupare (2-carbometoxipropil)amină.

Structura acestui derivat de Criptoficină 6 este următoarea:

RO 118931 Β1

250

255

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₄ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu tetrahidrofuranic, R₂ și R₈ sunt grupări OH, R₃ este metil, R₅ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, iar R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil. Structura acestui derivat, Criptoficină 7, este următoarea:

260

265

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, este clor, R₂ este o grupare OH, R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R_g este metil, iar R₁₀este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 8, este următoarea:

270

275

280

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care Rt este o grupare metoxi, R₂ este o grupare OH, R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₄și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 9, este următoarea:

285

290

295

CRIPTOFICINĂ 9

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care FȚ este o grupare metoxi, R₂ și R₄ sunt grupări OH, R₃ este metil, R₅ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar este o grupare (2-carboxipropil)amino. Structura acestui derivat, Criptoficină 10, este următoarea:

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₄ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu tetrahidrofuranic, R₂ este o grupare OH, R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, iar R₇ este 3-cloro-4-metoxibenzil, iar R₈ este o grupare (2-carboxipropil)amino. Structura acestui derivat, Criptoficină 12, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 12

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C^, R₃ este metil, R₄ este o grupare OH, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, iar R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₈ este o grupare (2-carboxipropil)amino. Structura acestui derivat, Criptoficină 14, este următoarea:

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu epoxidic, R₃ este metil, Rg și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 16, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 16

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, este o grupare metoxi, R₂ și R₄ sunt grupări OH, R₃ este metil, R₅ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar este o grupare (2-carboxipropil)amino. Structura acestui derivat, Criptoficină 10, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 12

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C_n, R₃ este metil, R₄ este o grupare OH, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, iar R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₈ este o grupare (2-carboxipropil)amino. Structura acestui derivat, Criptoficină 14, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 16

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu epoxidic, R₃ este metil, R₅ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R_g este metil, iar R,_o este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 16, este următoarea:

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C₍₁, R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅și C_e R₇este 3clor-4-hidroxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 17, este următoarea:

350

355

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₄ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C_n, R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3clor-4-metoxibenzil iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil iar R₁₀ este sec-butil. Structura acestui derivat, Criptoficină 18, este următoarea:

360

365

370 în care R, și R₄ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C„, Ra este metil, R_s și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil iar R₁₀ este izopropil. Structura acestui derivat, Criptoficină

375

380

CRIPTOFICINĂ 19

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei grupări epoxidice, R₃ este metil, R₅și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, Ry este 3-clor-4-metoxibenzil iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este hidrogen iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 21, este

385 următoarea:

CRIPTOFICINĂ 21

390

395

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R₁ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei grupări epoxidice, R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4hidroxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura

X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 23, este următoarea:

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei grupări epoxidice, R₃ este metil, R_sși R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este hidrogen iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 24, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 24

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C_1V R₃ este metil, R₄ este hidroxi, R₆ este hidrogen, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₅ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 26, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 26

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C_1V R₃ este hidrogen, R₅ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R, este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R_g este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 28, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 28

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C_n, R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este hidrogen, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficina 29, este următoarea:

450

455

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R_t și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C_n, R₃ este metil, R₅ este hidroxi, R₆ este hidrogen, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 30, este următoarea:

460

465

470

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei grupări epoxidice, R₃ este metil, R₅și Re sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R7 este 3,5-diclor-4metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 31, este

475 următoarea:

480

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R₁ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei grupări epoxidice, R₃ este metil, R₅este hidrogen, R₆ este hidrogen, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R_g este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficină 35, este următoarea:

485

490

495

CRIPTOFICINĂ 35

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care FȚ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei grupări epoxidice, R₃ este hidrogen, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R_g este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficina 40, este următoarea:

i

CRIPTOFICINA 40

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care R! și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C_11t R₃ este metil, R₅ și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3,5-dicloro-4-hidroxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este izobutil. Structura acestui derivat, Criptoficina 45, este următoarea:

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care R₁ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei grupări epoxidice, R₃ este metil, R₅și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, F^ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este propil. Structura acestui derivat, Criptoficina 49, este următoarea:

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₀ și C_n, R₃ este metil, R_s și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R_g este metil, iar R₁₀ este propil. Structura acestui derivat, Criptoficina

50, este următoarea:

CRIPTOFICINA 50

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a derivatului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei grupări epoxidice, R₃ este metil, R₅ 550 și R₆ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₅ și C₆, R₇ este 3-clor-4-metoxibenzil, iar R₄ și R₈ sunt legați împreună cu formarea unei didepsipeptide cu structura X, în care R₉ este metil, iar R₁₀ este sec-butil. Structura acestui derivat, Criptoficină 54, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 54

Dintre derivații de mai sus, Criptoficinele 2,4, 16-19, 21, 23, 24, 26, 28-31, 40, 43, 45, 49, 50 și 54 sunt metaboliți produși de o tulpină de Nostoc sp.a algei albastre-verzi (cyanobacteria) care s-a cultivat, după care din cultură s-au izolat acești compuși. Criptoficinele 6 și 7 se obțin dacă procedura de izolare utilizează solvenți ce conțin metanol. Cripto- 565 ficinele 8, 9,10-12,14 și 35 sunt derivați ai acestor metaboliți produși natural, care au fost modificați chimic folosind procedeele descrise în Partea experimentală a prezentei descrieri, cu metode alternative pentru a obține compușii exemplificați, cât și cei neexemplificați, accesibile specialiștilor în domeniu.

Invenția se referă la procedee de obținere a derivaților de criptoficină de mai sus, prin 570 cultura unei tulpini de Nostoc sp. Caracteristicile morfologice ale Nostoc sp. ale algei albastru-verzi (cyanobacteria), după cum se prezintă în SU 4946835 sunt că ele sunt filamentoase și sunt formate din celule vegetative. în filamentele mai lungi s-au observat uneori heterochisturi dar nu s-au observat akinete. Reproducerea se face prin hormogonie și prin ruperea aleatoare a tricornului. Fundamentul pentru o identificare a Nostoc sp, poate fi găsit în Gen. 575 Micro., 111:1-61 (1979).

De asemenea invenția se referă la faptul că Nostoc sp. poate fi supus culturii și că din această cultură se pot izola noi metaboliți de criptoficină, cât și metaboliții de criptoficină descriși anterior. într-o formă de realizare preferată a invenției, tulpina Nostoc sp. Denumită GSV 224, este tulpina care este cultivată și din care se izolează compușii reprezentați prin 580 structura următoare:

R, este H, OH, un halogen, O al unei grupări cetonice, o grupare NH₂, SH, o grupare 590 de alcoxil inferior sau o grupare alchil inferior,

R₂ este H, OH, O al unei grupări cetonice, o grupare NH₂, SH, o grupare de alcoxil inferior sau o grupare de alchil inferior, sau

R) și R₂ pot fi legate între ele cu formarea unui ciclu epoxidic, a unui ciclu aziridinic, a unui ciclu episulfidic, sau a unei duble legături între C₁₀ și C_n; sau 595

R, și R₄ pot fi legate între ele cu formarea unui ciclu de tetrahidrofuran;

R₃ este H sau o grupare alchil inferioară;

R₄ este OH, o grupare de alcanoiloxi inferior sau o grupare a-hidroxi-alcanoiloxi;

R₅ este H sau o grupare OH;

R₆ este H; sau

600

RO 118931 Β1

R₄ și R₈ pot fi legate între ele cu formarea unei grupări didepsipeptidice constând dintr-un β-aminoacid inferior legat de un acid α-hidroxialcanoic inferior; și

R_s și R₈ pot fi legate între ele cu formarea unei grupări didepsipeptidice constând dintr-un β-aminoacid inferior legat de un acid α-hidroxialcanoic inferior; și în următoarele condiții:

R; este H, o grupare alchil inferior, sau o grupare de alcoxil inferior numai dacă R₂ este

OH, O al unei grupări cetonice, NH₂, SH;

într-o formă de realizare preferată a invenției, prin modificarea chimică a unui metabolit de criptoficină izolat prin procedeul de mai sus, se obține un compus distinct având, de asemenea, această structură. Procedeele de modificare chimică a compușilor de criptoficină cu scopul de a obține alți compuși care reprezintă obiectul prezentei invenții, sunt cunoscute specialiștilor în domeniu. Mai mult, în Partea experimentală a prezentei descrieri se prezintă detaliat procedee suplimentare de preparare.

Suplimentar față de noii derivați de criptoficină, conform invenției, invenția se referă și la noi procedee de obținere, ca și la utilizarea, compușilor cu structura de mai sus, care includ următoarele specii de criptoficină prezentate anterior, Criptoficinele 1, 3, 5,13 și 15.

CRIPTOFICINĂ 3

CRIPTOFICINĂ 13

RO 118931 Β1

655

660

Invenția se referă la orice tulpină Nostoc sp. și de preferință la Nostoc sp.GSV 224 pentru a obține compuși de criptoficină. în acest scop, tulpina GSV 224 a Nostoc sp. s-a depus la 7 oct. 1993, conform Tratatului de la Budapesta referitor la Depozitul Internațional al Microorganismelor în scopul procedurii de brevetare, la Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 SU ATCC 55483. Alte tulpini de Nostoc sp., în special, tulpina MB 5357, depozitată de Merck and Co. cu nr.ATCC 53789 sunt tulpini care pot fi utilizate în practica prezentei invenții.

Ca și în cazul altor organisme, caracteristicile Nostoc sp. sunt supuse variației. De exemplu, se pot obține recombinanți, varianți sau mutanți ai tulpinilor specificate prin tratament cu diferiți mutageni fizici și chimici, cum ar fi razele ultraviolete, razele X, razele gama și N-metil-N’-nitro-nitrozoguanidină. Toți varianții, mutanții și recombinanții naturali și induși, ai tulpinilor specificate care rețin caracteristica de obținere a unui compus de criptoficină intră în sfera de protecție a prezentei invenții.

Compușii de criptoficină conform invenției pot fi preparați prin cultura tulpinii Nostoc sp. în condiții aerobice de submersie într-un mediu de cultură adecvat, până la obținerea unei activități antibiotice substanțiale. Se pot folosi și alte tehnici de cultură, cum ar fi creșterea pe suprafața unui mediu solidificat. Mediul de cultură folosit pentru creșterea tulpinilor specificate poate include oricare din multele surse de azot și carbon și săruri anorganice care sunt cunoscute specialiștilor în domeniu. în alegerea surselor de carbon și azot trebuie avut în vedere o serie de factori cum ar fi eficacitatea obținerii, randamentele optime și ușurința izolării. Printre sărurile anorganice nutritive care pot fi incorporate în mediile de cultură sunt uzuale sărurile solubile care pot forma ioni de fier, potasiu, sodiu, magneziu, calciu, amoniu, clor, carbonat, fosfat, sulfat, azotat ș.a.

în mediul de cultură trebuie introduse și urme de elemente esențiale, necesare pentru creșterea și dezvoltarea organismelor. Astfel de urme de elemente se găsesc frecvent ca impurități în alți constituenți ai mediului în cantități suficiente pentru a satisface cerințele de creștere ale organismelor. Se preferă să se adauge cantități mici (exemplul 0,2 mL/L) dintr-un agent de antispumare cum ar fi polipropilen glicolul (masă moleculară aprox. 2000), în mediile de cultură pe scară largă, dacă spumarea devine o problemă.

Pentru obținerea cantităților substanțiale de compuși de criptoficină, se poate folosi cultivarea aerobă de submersie în tancuri. Cantități mici se pot obține prin cultură în baloane cu agitare. Datorită decalajului în timp în obținerea metabolitului, asociată în mod obișnuit de inocularea tancurilor mari, se preferă folosirea unui inocul vegetativ, inoculul vegetativ se prepară prin inocularea unui volum mic al mediului de cultură cu fragmente de tricorn vegetativ sau forme ale organismului care conțin heterochist pentru a obține o cultură proaspătă, cu creștere activă a organismului. Inoculul vegetativ este apoi transferat într-un tanc mare. Mediul folosit pentru inocului vegetativ poate fi același cu cel folosit pentru culturile sau fermentările mai mari, dar se pot folosi și alte medii.

Organismele pot fi crescute la temperaturi între aproximativ 20°C și 30°C și la o intensitate a luminii incidente de aproximativ 100 la 200 //mol fotoni m ^z sec¹ (radiație activă fotosintetică).

665

670

675

680

685

690

695

700

RO 118931 Β1

După cum este uzual în procedeele de cultură de submersie, bioxidul de carbon gazos se introduce în cultură prin adăugarea lui în curentul de aer steril care se barbotează prin mediul de cultură. Pentru obținerea eficientă a compușilor de criptoficină, proporția de

705 bioxid de carbon trebuie să fie de aproximativ 1% (la 24°C și presiune o atmosferă).

în US 4946835 se prezintă metode de cultură a Nostoc sp., al cărui conținut este inclus ca referință în prezenta descriere.

Producția de compuși de criptoficină poate fi însoțită, în etapa de cultivare, de testare a bulionului la organisme cunoscute a fi sensibile la aceste antibiotice. Un astfel de organism 710 este Candida albicans.

După obținerea lor, în condiții de cultură aerobă de submersie, compușii de criptoficină, conform invenției, pot fi recuperați din cultură și din mediul de cultură prin metode cunoscute specialiștilor în domeniu. Recuperarea este, în general, efectuată prin filtrarea inițială a mediului de cultură pentru a separa celulele algei și apoi uscarea prin congelare a 715 celulelor separate. Alga uscată prin congelare poate fi extrasă cu un solvent adecvat, cum ar fi etanol, metanol, izopropanol sau diclormetan. Criptoficinele pot fi separate prin supunerea acestui extract, cât și a mediului de cultură, la cromatografie rapidă cu fază inversă. Criptoficinele pot fi purificate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversă (HPLC).

720 După cum se vede din structura lor, compușii de criptoficină au grupări care pot fi supuse modificărilor chimice. Compușii conform invenției sunt acei compuși de criptoficină, care prezintă activitate anti-neoplazică. De exemplu, derivații exemplificați în prezenta invenție includ compușii care au oxigen epoxidic sau grupări hidroxil la C-7 și C-8 al unității A sau grupa de acid leucic a unității B, din fig.1. Asemenea derivați ai compușilor noi și prezentați 725 anterior, care prezintă activitate antineoplazică dorită sunt incluși în invenția revendicată. în plus, relația dintre structura compușilor de criptoficină și activitatea antineoplazică este prezentată în partea experimentală.

Deși compușii de criptoficină sunt cunoscuți a fi metaboliți produși de algele conform invenției, alți compuși de criptoficină, de exemplu, criptoficinele 8-15, pot fi derivați de la me730 taboliți folosind tehnicile cunoscute specialiștilor în domeniu; de exemplu, sintezele prezentate în US 4868208; US 4845086 și US 4845085, al căror conținut este inclus ca referință, sau prin utilizarea altor metode cunoscute specialiștilor în domeniu. în plus, prezenta invenție oferă metode de obținere a derivaților în partea experimentală.

Criptoficinele sunt depsipeptide antifungice și cu eficiență antitumorală din alga ver735 de-albastră (cianobacteria) care aparține Nostocaceae-lor. Prima criptoficină, Criptoficină 1, s-a izolat din Nostoc sp. ATCC 53789 terestru și s-a găsit a fi foarte activă față de fungi, în special față de tulpină Cryptococcus (R.E.Schwartz ș.a., J.Ind.Microbiol. 1990,5:113-124). Criptoficină 1 s-a izolat și din Nostoc sp. GSV 224 terestru, împreună cu alți 24 analogi de criptoficină ca componenți minori ai algei și s-a găsit a fi foarte activă față de tumorile solide 740 transplantate subcutanat la șoareci (G.Trimurtulu ș.a. J.Am.Chem.Soc., 1994, 116:47294737; R.Barrow ș.a., J.Am.Chem.Soc., 117:2479-2490). Doi dintre analogii din Nostoc sp.GSV 224, Criptoficinele 3 și 5, s-au descris anterior ca analogi semi-sintetici ai criptoficinei 1 (D.F.Sesin,US 4845085,1989; D.F. Sesin ș.a. US 4868208,1989). Criptoficinele prezintă citotoxicitate tumorală selectivă în evaluarea Corbett și au prezentat citotoxicitate egală 745 față de celulele tumorale sensibile la medicamente și față de cele rezistente la medicamente.

Criptoficină 1 pare a avea același mod de acțiune ca vinblastina, dar spre deosebire de acesta din urmă în inhibarea ireversibilă a ansamblului microtubul (C.D.Smith ș.a., Cancer Res.1994, 54:3779-3784). Una dintre criptoficinele din Nostoc sp.GSV 224, criptoficină 24, s-a izolat dintr-un burete marin și s-a numit arenastatin A (M.Kobayashi ș.a. Tetrahedron Lett, 750 1994, 35:7969; M.Kobayashi ș.a., Tennen Yuki Kagobutsu Koen Yoshishu 1994,36,104-110).

RO 118931 Β1

Alți 22 de compuși de criptoficină, denumiți criptoficine 2, 4, 6, 7,16,19, 21,23, 24, 26, 28-31,40, 43, 45, 49, 50 și 54 sunt prezentați în cererile de brevet US 09/172632, înregistrată la 21 dec.1993 și 08/249955, înregistrată la 27 mai 1994 și în cererea internațională PCT/US 94/14740, înregistrată la 21 Dec 1994, asemenea compuși fiind fie metaboliți izolați dintr-o tulpină de Nostoc sp., fie produși de semi-sinteză din astfel de metaboliți. în cererile de brevet menționate se prezintă și caracterizarea compușilor de criptoficină selectați ca agenți antimicrotubuli cu activitate clinică exprimată față de un spectru larg de tumori implantate în șoareci, inclusiv tumorile DR și cele MDR.

Invenția se referă la noi derivați de criptoficină având următoarea structură:

755 în care:

760

765

770

Ri este un halogen, o grupare SH, amino, monoalchilamino, dialchilamino, trialchilamoniu, alchiltio, dialchilsulfoniu, sulfat sau fosfat; 775

R₂ este OH sau SH; sau

R, și R₂ pot fi legate între ele cu formarea unui ciclu epoxidic, a unui ciclu aziridinic, a unui ciclu episulfidic, a unui ciclu sulfat sau a unui ciclu monoalchilfosfat; sau

R, și R₂ pot fi legate între ele cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉.

R₃ este o grupare alchil inferioară; 780

R₄ și R₅ sunt hidrogen, sau

R₆ este o grupare benzii, hidroxibenzil, alcoxibenzil, halohidroxibenzil, dihalohidroxibenzil, haloalcoxibenzil sau dihaloalcoxibenzil;

R₇, R₈, R₉ și R₁₀ sunt fiecare independent H sau o grupare alchilinferior; iar X și Y sunt 785 fiecare independent O, NH sau alchilamino.

într-o formă de realizare preferată a acestei criptoficine, R₈ din criptoficină este etil, propil, izopropil, butii, izobutil, pentil sau izopentil. într-o formă de realizare preferată a acestei criptoficine, R₇ este etil, propil, izopropil, butii, izobutil, pentil sau izopentil. într-o formă de realizare preferată a acestei criptoficine, R₇ este H, R₈, este metil, R₉ este metil; X și Y 790 nu sunt ambii O.

Invenția se referă la o formă de realizare preferată, suplimentară, a acestei criptoficine, în care R₃ este etil, propil, izopropil, butii, izobutil pentil sau izopentil. într-o altă formă de realizare, preferată, a acestei criptoficine, R₉ este metil, etil, propil, butii, izobutil, pentil sau izopentil. într-o altă formă de realizare preferată a acestei criptoficine, R₁₀ este metil, 795 etil, propil, butii, izobutil, pentil sau izopentil.

Invenția se referă, de asemenea, la derivați de criptoficine, în care cel puțin una dintre grupările atașate de C₃, C₆, C₁₀, C₁₆, C₁₇ și C₁₈ sunt în configurație-R. într-o altă formă de realizare preferată, cel puțin una dintre grupările atașate de C₃, C₆, C₁₀, C₁₆, C₁₇ și C₁₈ sunt în configurație-S.

800

RO 118931 Β1

O formă de realizare a compusului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și

C₁₉, R₃, R₇ și R₈ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzii, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și

Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 51, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, R! și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R, R₃, R₇ și R₈ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 52, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃, R7 și l% sunt metil, R₄ și R_s sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 53, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, Rt este S-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃, R₇ și R₈ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 55, este următoarea:

RO 118931 Β1

850

855

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, R₁ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃, R₇ și R₈ sunt me- 860 til, R₄ și R₅ sunt hidrogen, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficina 57, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, Ri este S-clor, R₂ este R-hidroxil, Rg, R,. și l% sunt metil, R> și 1¾ sunt hidrogen, Fj este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficina 58, este următoarea: 875

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, R₁ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-episulfidic, R₃, R₇ și R₈ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficina 61, este următoarea:

885

890

895 i

I

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-metoxifenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉,

R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și

C₁₄, R_e este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 81, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este metil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃ și R₇sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 82, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este metil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, l% este 3-cloro4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 90, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 90

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, R, și R_z sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil,

RO 118931 Β1

R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈și R₁₀sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 91, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 91

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este 960 fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-aziridinic, Rg, R₇și R₈sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 97, este următoarea:

965

CRIPTOFICINĂ 97

970

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-fluorfenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 110, este următoarea:

975

980

985

CRIPTOFICINĂ 110

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este 990 p-tolil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃ și F^ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 111, este următoarea:

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este

2-tienil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R_s și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 112, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-fluorfenil, R₁ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R_s sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este

3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 115, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 115

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-fluorfenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Struc-

CRIPTOFICINA 116

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-tolil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 117, este următoarea:

1050

1055

1060

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-tolil, R₄ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C14. I% este 3-cloro4-metoxibenzii, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 118, este următoarea:

1065

1070

CRIPTOFICINĂ 118

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este 2-tienil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și l^ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro4-metoxibenzil,R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 119, este următoarea:

1075

1080

1085

1090

CRIPTOFICINĂ 119

2-tienil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și Ft, sunt metil,

R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, l% este 3-cloro4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 120, este următoarea:

1095

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃ și R₇sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X este oxigen și și Y este un azot care are un singur hidrogen. Structura acestui compus, Criptoficină 121, este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 121

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-

4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X este oxigen și Y este un azot care are un singur hidrogen. Structura acestui compus, Criptoficină 122, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, F% este 3-cloro4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X este oxigen și Y este un azot care are un singur hidrogen. Structura acestui compus, Criptoficină 123, este următoarea:

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-clorfenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între θ13 ȘÎ θ14 > R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 124, este următoarea:

1150

1155

1160

CRIPTOFICINĂ 124

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-clorofenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R7 sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 125, este următoarea:

1165

1170

1175

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-clorofenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 126, este următoarea:

1180

CRIPTOFICINĂ 126

1185

1190

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este fenil, R, este S-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, Rg este izobutil,

1195

RO 118931 Β1

R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X este oxigen, iar Y este azot care are un singur hidrogen.

Structura acestui compus, Criptoficină 127, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-tolil, Rt este S-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Re este 3-cloro-4-metoxibenzil, Rg este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 128, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-tolil, Rj este R-clor, R₂ este S-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, Rg este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 130, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-tolil, R, este R-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, Rg este izobutil,

R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 131, este următoarea:

RO 118931 Β1

1245

1250

1255

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-clorfenil, R, este S-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și Ry sunt metil, și F% sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 132, este următoarea:

1260

1265

1270

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-clorfenil, Ri este R-clor, FL, este S-hidroxil, R, și Fț sunt metil, R_l și sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficină 133, este următoarea:

1275

1280

1285

O altă formă de realizare a compusului conform invenției este aceea în care Ar este p-clorofenil, R, este R-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen. Structura acestui compus, Criptoficina 134, este următoarea:

1290

RO 118931 Β1

în continuare sunt prezentate criptoficinele, ale căror grupări substituente au la bază următoarea structură:

în care:

Ri este hidrogen sau halogen;

R₂ este hidrogen, un oxigen al unei cetone, sau OH; sau

R! și R₂ pot fi legați împreună cu formarea unui ciclu epoxidic, sau R, și R₂ pot fi legați împreună cu formarea unui ciclu episulfidic;

R₃ este hidrogen sau o grupare alchil inferioară;

R₄ este hidrogen sau hidroxil;

R₅ este hidrogen sau hidroxil; sau

R₄ și R₅ pot fi legați împreună cu formarea unei duble legături;

R₆ este hidrogen sau halogen;

cu următoarea condiție: dacă R! și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu epoxidic, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor, R₃ nu este metil.

O formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, este hidrogen, R₂ este un oxigen al unei grupări cetonice, R₃ este S-metil, R₄ și R₅sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus, Criptoficină 20, este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, este S-brom, R₂ este R-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 25 este următoarea:

RO 118931 Β1

1345

1350

CRIPTOFICINA 25

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, este R-clor, R₂ este R-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 27 este următoarea:

1355

1360

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt hidrogen, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 32 este următoarea:

1365

CRIPTOFICINA 32

1370

1375

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R_n R₄ și R₅ sunt hidrogen, R₂ este S-hidroxi, R₃ este R-metil, iar Rg este clor. Structura acestui compus Criptoficină 33 este următoarea:

1380

1385

CRIPTOFICINA 33

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R_1t R₂, R₄ șiRg sunt hidrogen, R, este R-metil, iar este hidrogen. Structura acestui compus Criptoficină 34 este următoarea:

1390

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R₁ este R-brom, R₂ este R-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 37 este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₂ este sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ este S-metil, R₄ și R_s sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 38 este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,R-epoxidic, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 39 este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R) și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ este S-metil,

RO 118931 Β1

R₄ este S-hidroxi, R₅ este R-hidroxi, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină

1445

1450

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ este S-metil, R₄ este R-hidroxi, R_s este hidroxi, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 42 este următoarea:

1455

1460

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, este hidrogen, R₂ este S-hidroxi, R₃ este R-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 48 este următoarea:

1465

CRIPTOFICINĂ 48

1470

1475

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, este S-clor, R₂ este R-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și Rg sunt hidrogen, iar Rg este clor. Structura acestui compus Criptoficină 59 este următoarea:

1480

1485

CRIPTOFICINĂ 59

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care fȚ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-episulfidic, R₃ este S-metil,

R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 60 este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R! este S-clor, R₂ este R-hidroxi, R₃ este hidrogen, R₄ și Rs sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 63 este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, este R-clor, R₂ este R-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și Rg sunt hidrogen, iar Rg este clor. Structura acestui compus Criptoficină 64 este următoarea:

CRIPTOFICINA 64

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, este R-clor, R₂ este S-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 69 este următoarea:

CRIPTOFICINA 69

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, este S-clor, R₂ este S-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 70 este următoarea:

1540

1545

CRIPTOFICINĂ 70

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care Rt este R-brom, R₂ este S-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 71 este următoarea:

1550

1555

1560

CRIPTOFICINĂ 71

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină conform invenției este aceea în care R, este S-brom, R₂ este S-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 72 este următoarea:

1565

1570

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, este S-clor, R₂ este S-hidroxi, R₃ este S-metil, R, și F% sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 73 este următoarea:

1575

1580

1585

CRIPTOFICINĂ 73

RO 118931 Β1

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R, este S-clor, R₂ este R-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și R_s sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 74 este următoarea:

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R! este S-fluor, R₂ este R-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 75 este următoarea:

CRIPTOFICINĂ 75

O altă formă de realizare a compusului de criptoficină, conform invenției, este aceea în care R_t este R-fluor, R₂ este R-hidroxi, R₃ este S-metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături, iar R₆ este clor. Structura acestui compus Criptoficină 76 este următoarea:

Invenția se referă la procedee de obținere a compușilor de criptoficină de mai sus, ca și la toate criptoficinele cunoscute prezentate anterior, prin sinteză totală.

Invenția se referă și la faptul că noii metaboliți ai criptoficinei, cât și metaboliții criptoficinei prezentați anterior, pot fi sintetizați, folosind metodele conform prezentei invenții.

Invenția se referă la un procedeu de preparare a criptoficinei, care constă în selectarea unei E alchene substituită alilic; rearanjarea alchenei E substituite alilic, printr-o rearanjare stereospecifică Wittig; transformarea acestui compus într-un prim δ-aminoacid sau un δ-hidroxi acid; cuplarea primului acid cu un al doilea α-amino acid pentru a forma o primă subunitate; cuplarea unui al treilea amino acid cu un al patrulea α-hidroxi acid sau a-amino acid pentru a forma o a doua subunitate; și cuplarea primei subunități la a doua subunitate pentru a forma o criptoficină.

Invenția se referă și la o realizare preferată a procedeului conform invenției, în care criptoficină obținută are următoarea structură:

RO 118931 Β1

1640

1645 în care:

Ar este metil sau fenil sau orice grupare aromatică, simplă sau heteroaromatică, nesubstituită sau substituită;

R₁ este un halogen, SH, amino, monoalchilamino, dialchilamino, trialchilamino, alchiltio, dialchilsulfoniu, sulfat sau fosfat;

R₂ este OH sau SH; sau

R) și R₂ pot fi luați împreună, pentru a forma un ciclu epoxidic, un ciclu aziridinic, un ciclu episulfidic, un ciclu sulfat sau un ciclu monoalchilfosfat; sau

R, și R₂ pot fi luați împreună, pentru a forma o dublă legătură între C₁₈ și C₁₉;

R₃ este o grupare alchil inferior;

R₄ și R₅ reprezintă H, sau

R₄ și R₅pot fi luați împreună pentru a forma o dublă legătură între C₁₃ și C₁₄;

R₇, R₈, R₉ și R₁₀ sunt fiecare independent H sau o grupare alchil inferior; și X și Y sunt fiecare independent O, NH sau alchilamino.

într-o realizare preferată a prezentei invenții, prin metoda conform invenției, se obține o criptoficină în care Ar este fenil; R₃ este metil; Rg este halometoxibenzil; R₇ este H; 1% este metil; R₉ este izobutil; R₁₀ este Η; X este O și Y este O.

Pe lângă criptoficinele conform invenției, cu structura de mai sus, invenția se referă și la procedee de obținere a criptoficinelor prezentate anterior, cât și a celor cunoscute din stadiul tehnicii. Criptoficinele 1,8 și 35 s-au obținut prin sinteză totală. în continuare, se prezintă criptoficinele menționate anterior și criptoficine cunoscute din stadiul tehnicii, obținute

1650

1655

1660

1665

1670

în care

Rj este un halogen;

R₂ este OH; sau

R, și R₂ pot fi luați împreună, pentru a forma unui ciclu epoxidic; R₃ este H; și

1675

1680

1685

RO 118931 Β1

1690

R₄ este H; sau

R₃ și R₄ pot fi luați împreună, pentru a forma o dublă legătură.

Invenția se referă și la o compoziție farmaceutică, folositoare pentru inhibarea proliferării unei celule de mamifer hiperproliferative, care conține o cantitate eficientă, dintr-o criptoficină cu structura următoare:

1695

1700 în care

1705

1710

1715

1720

Ar este metil sau fenil sau orice grupare aromatică sau heteroaromatică, nesubstituită sau substituită;

R, este un halogen, SH, amino, monoalchilamino, dialchilamino, trialchilamino, alchiltio, dialchilsulfoniu, sulfat sau fosfat;

R₂ este OH sau SH; sau

R, și R₂ pot fi luați împreună, pentru a forma un ciclu epoxidic, un ciclu aziridinic, un ciclu episulfidic, un ciclu sulfat sau un ciclu monoalchilfosfat; sau

R, și R₂ pot fi luați împreună, pentru a forma o dublă legătură între C₁₈ și C,₉;

R₃ este o grupare de alchil inferior;

R₄ și R₅ reprezintă H, sau

R₄ Ș' R5 P^ot ti luați împreună, pentru a forma o dublă legătură între C₁₃ și C₁₄;

R₇, R₈, R₉ și R₁₀ sunt fiecare independent H sau o grupare alchil nferior; și

X și Y sunt fiecare, independent O, NH sau alchilamino; împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic.

într-o realizare preferată a prezentei invenții, compoziția farmaceutică mai cuprinde, cel puțin, un agent antineoplazic suplimentar.

Invenția se referă și la o metodă de inhibare a proliferării unei celule de mamifer, care constă în contactarea celulei de mamifer cu un compus criptoficină într-o cantitate suficientă pentru a inhiba proliferarea celulei, compusul criptoficinic având structura următoare:

1725 în care:

1730

RO 118931 Β1

R₂ este OH sau SH; sau

R₃ este o grupare alchil inferior;

R₄ și R₅ reprezintă H, sau

R₄ și R₅ pot fi luați împreună, pentru a forma o dublă legătură între C₁₃ și C₁₄;

R₇, R₈, R₉ și R₁₀ sunt fiecare independent H sau o grupare alchil inferior; și

X și Y sunt fiecare independent O, NH sau alchilamino.

într-o realizare preferată a prezentei invenții, această metodă mai cuprinde contactarea celulei cu cel puțin un agent antineoplazic suplimentar. într-o realizare preferată a prezentei invenții, celula de mamifer contactată este hiperproliferativă.

într-o altă realizare preferată a prezentei invenții, celula hiperproliferativă este o celulă umană.

Invenția se referă și la o metodă de inhibare a proliferării unei celule de mamifer hiperproliferative, având un fenotip rezistent la medicamente care constă în contactarea celulei, cu o cantitate de compus criptoficinic care este eficient în a produce ruperea stării dinamice a polimerizării și depolimerizării microtubulilor pentru a opri mitoza celulei, inhibând astfel proliferarea celulei, compusul criptoficinic având structura:

1735

1740

1745

1750

1755

1760

1765

1770

R₂ este OH sau SH; sau

R, și R₂ pot fi luați împreună pentru a forma o dublă legătură între C₁₈ și C₁₉;

R₃ este o grupare alchil inferior;

R₄ și R₅ reprezintă H, sau

R₇, R₈. Rg Ș' R10 sunt fiecare independent H sau o grupare alchil inferior; și

X și Y sunt fiecare independent O, NH sau alchilamino.

1775

1780

1785

RO 118931 Β1 într-o realizare preferată a prezentei invenții, metoda mai cuprinde contactarea celulei cu cel puțin un agent anti-neoplazic suplimentar. într-o altă realizare a prezentei invenții, celula de mamifer este celulă umană.

Invenția se referă și la o metodă pentru ameliorarea unei stări patologice, cauzate de hiperproliferarea celulelor care constă în administrarea la un subiect, a unei cantități eficiente dintr-o compoziție farmaceutică prezentată, pentru a inhiba proliferarea celulelor, într-o realizare preferată a prezentei invenții, celulele de mamifer sunt celule umane.

într-o realizare preferată a prezentei invenții, metoda mai cuprinde administrarea la un subiect a cel puțin încă unei terapii suplimentare, pentru ameliorarea stării patologice, într-o realizare preferată a prezentei invenții, starea patologică este caracterizată prin formarea neoplasmului. într-o altă realizare preferată, a prezentei invenții, neoplasmul este ales din grupul format din neoplasm mamar, pulmonar al celulelor mici, pulmonar al celulelor care nu sunt mici, colorectal, leucemia, melanoma, adenocarcinom pancreatic al sistemului nervos central (CNS), ovarian, de prostată a țesutului moale sau osos, a gâtului și capului, gastric care include pancreatic și esofagian, al stomacului, mieloma, al vezicii, renal, neuroendocrin, care include boala tiroidei și alte boli în afara bolii lui Hodgkin precum și boala lui Hodgkin.

Metoda de preparare a compușilor de criptoficină este rezumată în Schema 1 și prezentată în fig.5. Materia primă este o 3E-alchenă (a) substituită la C-2 cu o grupare XH în configurație S în care X este oxigen sau BH. L-alanina și acidul L-lactic servesc ca surse ieftine de materie primă a. Etapa cheie în sinteză o constituie rearanjarea stereoselectivă [2,3] Wittig (D.J.S Tsai ș.a., J.Org.Chem. 1984,49 49:1842-1843; K.Mikami ș.a., Tetrahedron 1984,25:2303-2308; N.Sayo ș.a., Chem.Lett. 1984,259-262) a eterului propargilic al (b) la (3R,4R)-3-(XH-substituit)-4-alchilhept-5(E)-en-1-ină (c) în care X este oxigen sau un azot protejat (de exemplu, t-butildimetilsililamino). Compusul c poate fi transformat în unitatea A de δ-hidroxi sau amino acid a criptoficinei, (5S,6R)-5-)XP-substituit)-6-alchil-8-aril-octa-2E, 7E-dienoat de metil (d) în care P este o grupare de protecție adecvată, folosind metode cunoscute specialiștilor în domeniu.

O strategie de sinteză a criptoficinei, care este compusă din unitatea A δ-hidroxi sau amino acid, o unitate B de α-amino acid, o unitate C de β-amino acid și o unitate D de a-hidroxi sau amino acid, este de a asambla macrociclul din doi precursori care reprezintă fragmentele moleculei de criptoficină, de exemplu, un precursor A-B (e) care conține unitatea A δ-hidroxi sau amino acid și unitatea B de α-amino acid și un precursor C-D (f) care conține unitatea C de β-amino acid și unitatea D de α-hidroxi sau amino acid.

în metoda prezentată aici, o criptoficină este asamblată din precursorii A-B și C-D în două etape prin (1) legarea unităților terminale A și D din precursorii A-B și C-D pentru a forma intermediarul aciclic C-D-A-B și (2) legarea părților terminale ale unităților B și C pentru a forma produsul ciclic.

în sinteza criptoficinei 51 descrisă în partea experimentală, se formează o legătură ester între grupa δ-hidroxi a unității A din fragmentul A-B și grupa acidului carboxilic al unității D din fragmentul C-D pentru a forma un intermediar aciclic C-D-A-B și apoi se formează o legătură amidică între grupa acidului carboxilic a unității B din fragmentul A-B și grupa βamino acid a unității C din fragmentul C-D. Compusul K este precursorul fragmentului A-B, compusul P este precursorul fragmentului C-D și compusul R este precursorul aciclic C-D-AB al criptoficinei 51. Compușii K și P au grupări de protecție la gruparea carboxilică a unității B și la gruparea β-amino a unității C pentru a limita cuplarea cu formare de ester între unitățile A și D în etapa 1. Aceste grupări de protecție sunt îndepărtate din intermediarul C-D-A-B astfel că poate avea loc formarea amidei între unitățile B și C în etapa 2.

RO 118931 Β1

Sinteza (5S,6R)-5-Fbutildimetilsililoxi-6-metil-8-fenil-octa-2E,7E-dienoatului de metil (G), precursor al unității A a criptoficinei 51, este rezumată în Schema 2 (fig.6). Materia primă (S)-trans-3-penten-2-propanol (A) s-a preparat prin rezoluția enzimatică a compusului racemic. Reacția A cu clorura de propargil și bază, în condiții de transfer de fază, formează propargil eterul B cu un randament de 86%. Tratarea lui B cu butii litiu la -90°C conduce la alcoolul C cu un randament de 71%. Compusul C 3R, 4R nedorit a fost singurul produs format prin rearanjarea Wittig. După protejarea grupării hidroxil a compusului C ca te/ț-butildimetilsilil eter (sau terț-butildimetilsilil eter), hidroborarea triplei legături (H.C.Brown, Organic Synthesis Via Boranes, Wiley, 1975) duce la obținerea aldehidei D cu randament de 73% din C. în continuare, D se transformă în esterul E trans a, β-nesaturat printr-o reacție Horner-Emmons cu un randament de 90%. Ozonoliza selectivă a dublei legături C₆-C₇ din D conduce la aldehida F cu un randament de 83%. în final, reacția Wittig cu clorură de benziltrifenilfosfoniu, în prezență de butillitiu, produce G cu un randament de 80%. Randamentul lui G din A a fost de 26%.

Cuplarea unității A a precursorului G cu D-3-(3-clor-4-metoxienil)alanină a unității B pentru a obține precursorul A-B (K) este rezumată în Schema 3 (Fig.7). Hidroliza grupării metil ester în G cu hidroxid de litiu în acetonă a condus la acidul carboxilic H, cu un randament de 95%. Cuplarea lui H cu ester tricloretilic I pentru a obține J poate fi realizată cu un randament de 65%, prin tratarea unei soluții a H în Ν,Ν-dimetilformamidă (DMF) cu un exces mic de pentafluorfenildifenilfosfinat (FDPP), o cantitate echimolară de sare trifluoracetat al I, urmată de 3 echivalenți de diizopropiletilamină (DIEA) la 25°C (S.Chen ș.a., Tetrahedron iert. 1991, 32:6711-6714). Fluordesililarea lui J conduce la K cu un randament de 95%.

Amino acidul I protejat s-a preparat din D-tirosină în 5 etape. în prima, D-tirosina s-a clorurat cu clorură de sulfuril în acid acetic glacial (R.Zeynek, Hoppe-Seyler’s Z.f. Physiol. Chemie 1926,144:247-254). Apoi s-a obținut N-(terț-butoxicarbonil)-3-(3-clor-4-hidroxifenil)D-alanina cu un randament de 94%, prin tratarea unei suspensii de aminoacid în soluție apoasă 50% de dioxan, cu d/'-tert-butildicarbonat în prezență de trietilamină. Produsul rezultat s-a dimetilat cu dimetil sulfat în prezență de carbonat de potasiu în acetonă la reflux, cu un randament de 84%. Metil esterul s-a saponificat apoi cu hidroxid de sodiu, în dioxan apos, pentru a obține N-(te/ț-butoxicarbonil)-3-(3-clor-4-metoxifenil)-D-alanină cu randament de 86%. Expunerea amino acidului protejat-BOC la tricloretanol, piridină și DCC în diclormetan conduce la tricloretil esterul I cu un randament de 65%. Tratarea acestui material cu acid trifluoracetic conduce la un randament cantitativ al sării trifluoracetat al I.

Sinteza acidului (2S)-2-[3^,(te/ț-butoxicarbonil)amino-2^,,2^,-dimetilpropanoiloxi]-4-metil] pentanoic (P), precursorul C-D, este rezumată în Schema 4 (fig.8). Punctul de plecare pentru porțiunea C a P a fost aminoalcoolul L. Protejarea grupării amino din L prin tratare cu dl· tert-butildicarbonat în prezență de trietilamină (randament 93%), urmată de oxidarea alcoolului primar cu tetroxid de ruteniu (P.H.J. Carlsen ș.a. J.Org.Chem. 1981,46:3936-3938) conduce la acidul carboxilic M (randament 66%). Acidul L-leucic s-a transformat în alil esterul N cu un randament de 93%, în condiții de transfer de fază, prin expunerea acestuia la un amestec de bromură de alil în diclormetan și soluție apoasă de bicarbonat de sodiu conținând clorură de fetra-n-butilamoniu (S.Friedrich-Bochnitschek ș.a., J.Org.Chem. 1989, 54:751-756). Reacția de cuplare a lui M cu N s-a efectuat cu 4-dimetilaminopiridină (DMAP) și diciclohexilcarbodiimidă (DCC) în diclormetan pentru a obține O cu randament de 75%. Scindarea alil esterului în O s-a efectuat în THF conținând morfolină și tetrakis(trifenilfosfin)paladiu, în cantități catalitice, pentru a obține P cu un randament de 95% (P.D.Jeffrey ș.a.J. Org. Chem., 1982, 47:587-590).

1835

1840

1845

1850

1855

1860

1865

1870

1875

1880

RO 118931 Β1

1885

1890

1895

1900

1905

1910

1915

1920

Cuplarea precursorului A-B (K) cu precursorul C-D (P) s-a efectuat conform Schemei 5 (fig.9). Tratarea lui K și P cu DCC/DMAP în diclorometan conduce la intermediarul C-D-AB (Q) complet protejat, cu un randament de 84%. Scindarea reductivă a grupării tricloretil ester din Q s-a efectuat prin folosire de praf de zinc activat, în acid acetic. Grupa de protecție BOC s-a îndepărtat apoi cu acid trifluoracetic pentru a obține R ca sare trifluoracetat cu un randament global de 91% din Q. Macrolactamizarea lui r cu FDPP conduce la criptoficină 51 cu un randament de 61% /J.Dudash, jr., Synth.Commun. 1993, 23:349-356). Randamentul global din S-trans-3-penten-2-propanol (A) a fost de 7%.

Criptoficină 51 s-a folosit ca precursor al criptoficinei 52, epoxidul-R,R și Criptoficinei 53, epoxidul-S,S. La rândul său, criptoficină 52 s-a folosit ca precursor al criptoficinei 55, clorohidrina - 18R, 19S și criptoficină 57, analogul 13,14-dihidro. Criptoficină 57 s-a folosit ca precursor al criptoficinei 58. Criptoficină 53 s-a folosit ca precursor al criptoficinei 61, folosind o metodă descrisă de T.H. Chan și J.R.Finkenbine, J.Am.Chem. Soc. 1972, 94:28802882 și Criptoficină 97 folosind metoda descrisă de Y.lttah ș.a., J.Org.Chem. 1978,43:42714273.

Pentru sinteza criptoficinelor care au grupări Ar diferite de fenil, precursorul unității A cu structura generală d (Schema 1,1 ,R₃=Me) poate fi preparat prin reacția Witting a aldehidei F (Schema 2; grupa de protecție TBS) sau S (Schema 6; grupa de protecție TBPS) cu clorură de ariltrifenilfosfoniu adecvată, în prezență de butillitiu. Criptoficină 81 s-a preparat din precursorul d (Ar=p-metoxifenil, R₃=Me) după cum se prezintă în Schemele 6 și 7 (fig. 10 și 11).

Grupa ar poate fi introdusă în noua criptoficină și într-o fază ulterioară a sintezei. Primul precursor d (Ar=R₃=Me) s-a transformat în criptoficină 82, prin cuplarea precursorilor A-B (e) și C-D (f) adecvați așa cum se prezintă în Schema 8 (fig. 12). Ozonoliza selectivă a criptoficinei 82 sau oxidarea cu acid periodic a epoxizilor corespunzători ai criptoficinelor 90 și 91 conduce la o aldehidă, criptoficină 108. Reacția Witting a criptoficinei 108 cu o clorură de ariltrifenilfosfoniu corespunzătoare, în prezență de butillitiu, conduce la o nouă criptoficină (Schema 9; fig.13). Folosind acest proceceu, se prepară criptoficină 112 (Ar=p-fluorfenil), Criptoficină 111 (Ar=p-tolil), Criptoficină 112 (Ar=2-tienil) și Criptoficină 124 (Ar=p-clorfenil). Criptoficină 110 servește ca precursor al epoxizilor criptoficinelor 115 și 116. Criptoficina 111 servește ca precursor al epoxizilor criptoficinelor 117 și 118 și clorhidrinelor criptoficinelor 128,130 și 131. Criptoficină 112 servește ca precursor al epoxizilor criptoficinelor 119 și 120. Criptoficină 124 servește ca precursor al epoxizilor criptoficinelor 125 și 126 și a criptoficinelor 132,133 și 134.

O altă strategie de sinteză a criptoficinei este de a asambla macrociclul din trei precursori, de exemplu, un precursor A-B (e) care conține unitatea A δ-hidroxi sau amino acid, un precursor care conține unitatea D δ-hidroxi sau amino acid și un precursor care conține unitatea C β-amino acid. în metoda descrisă în prezenta descriere, o criptoficină este asamblată din precursorii A-B, C și D în trei etape prin (1) legarea părților terminale ale unităților A și D în precursorii A-B și D pentru a forma un intermediar aciclic D-A-B, (2) legarea părților terminale ale unităților D și C în precursorii D-A-B și C pentru a forma un intermediar aciclic C-D-A-B și (3) legarea părților terminale ale unităților B și C pentru a forma produsul ciclic.

în sinteza criptoficinei 121, descrisă în partea experimentală, se formează o legătură ester între grupa δ-hidroxi a unității A din fragmentul A-B și grupa acidului carboxilic a unității

D din fragmentul D pentru a forma un intermediar aciclic D-A-B-, Apoi, se formează o legătură amidică între grupa carboxilică a unității C și grupa α-amino acidului din unitatea D a fragmentului D-A-B. în final, se formează o legătură amidică între grupa carboxilică a unității

A din fragmentul A-B și grupa β-amino a unității C din fragmentul C-D. Compusul K este precursorul fragmentului A-B, BOC-L-leucinanhidrida este precursorul unității D și compusul AL

1925

RO 118931 Β1

1930 este precursorul unității C. Compusul AK este precursorul aciclic C-D-A-B al criptoficinei 121 (Schema 10; Fig.14). Compușii K și BOC-L-leucinanhidrida au grupări de protecție la gruparea carboxilică a unității B și a grupării α-amino din unitatea D pentru a limita formarea esterului între unitățile A și D în etapa 1. Gruparea de protecție este îndepărtată de la gruparea δ-amino a unității D din intermediarul D-A-B astfel că se poate forma amida între grupa amino a unității B și acidul carboxilic C în etapa 2. Aceste grupări de protecție sunt îndepărtate din intermediarul C-D-A-B astfel că poate avea loc formarea amidei între unitățile B și C în etapa 2.

Noii derivați de criptoficină conform prezentei invenții au cicluri epoxidice care sunt deschise de nucleofili cu viteze diferite de cele ale ciclului epoxidic al criptoficinei 1, sau au funcționalități clorhidrinice care formează cicluri epoxidice cu viteze diferite de ale funcționalității clorhidrinice ale criptoficinei 8, la transformare în ciclul epoxidic al criptoficinei 1. Ciclul epoxidic al criptoficinei 1 sau funcționalitatea clorhidrinică (un ciclu epoxid mascat) a criptoficinei 8 este esențială pentru o activitate optimă in vivo. Dacă se elimină oxigenul epoxidic (ca în criptoficină 3) sau ciclul epoxidic este hidrolizat la diol (ca în criptoficină 15), activitatea antitumorală este mult diminuată. Criptoficină 1 prezintă toxicitate apreciabilă la animale comparativ cu criptoficină 8. Aceasta se reflectă în T/C (majoritatea >0%) și valorile globale ale log omorâte (majoritatea <2,0) pentru criptoficină 1, comparativ cu cele ale criptoficinei 8 (majoritatea valorilor sunt 0% și valorile globale ale log omorâte >2,8). Criptoficină 25, analogul bromhidrinic corespunzător, prezintă T/C și valori globale ale log omorâte care sunt comparabile cu cele ale criptoficinei 1. Această diferență în activitatea in vivo sugerează că criptoficină 25 bromhidrină este transformată mai rapid în criptoficină 1 in v/vo decât criptoficina 8. Aceasta mai sugerează că criptoficină 8, mai puțin toxică, necesită mai mult timp să se acumuleze la poziția tumorii înainte de a fi transformată în compusul activ criptoficină 1. Grupa epoxidică a criptoficinei 1 se leagă probabil covalent la receptorul ei țintă din celula tumorală. Noile criptoficine, conform invenției, pot avea, în mod potențial, o activitate in vivo mai bună decât criptoficină 1 și criptoficină 8 prin aceea că prezintă viteze mai favorabile ale formării epoxidului in vivo din pro-medicamentele clorhidrinice corespunzătoare și a legării covalente la receptorul țintă din celula tumorală.

Compușii conform invenției sunt mai stabili la hidroliză și solvoliză decât criptoficinele 1 și 21. Legătura ester care leagă unitățile C și D în criptoficină 1 este relativ sensibilă la hidroliza bazică în condiții blânde, scindându-se la pH 11 în prezența unui hidroxi acid cu un timp de înjumătățire de 0,83 ore. Legătura ester C-D din criptoficină 21, care nu are grupare metil la C-2 al unității c, se deschide cu o viteză mai mare, cu un timp de înjumătățire de 0,25 ore. Legătura ester C-D este, de asemenea, sensibilă la solvoliză. Când se folosește pentru separare metanol, are loc o metanoliză considerabilă a criptoficinelor 1 și 21. Criptoficina 21 este mult mai sensibilă la metanoliză decât criptoficină 1. Criptoficină 1 prezintă activitate antitumorală în timp ce criptoficină 21 este inactivă, probabil datorită faptului că legătura ester C-D din criptoficină 21 este hidrolizată mai rapid in vivo decât legătura ester CD a criptoficinei 1. Hidroliza legăturii ester poate explica, în parte, și scăderea activității in vivo a criptoficinei 1 la administrarea intraperitoneală și subcutană. Legătura ester C-D a criptoficinelor care au două grupări metil la C-2 al unității C, ca în Criptoficină 52, este stabilă la pH 11.

Compușii conform invenției și compușii criptoficin descriși anterior pot fi folosiți terapeutic ca agenți anti-neoplazici și prin urmare pot fi folosiți în metode de tratare a bolilor neoplazice. în prezenta invenție, termenul “neoplazic” se referă la un neoplasm, care reprezintă o creștere anormală, o astfel de creștere datorându-se unei proliferări a celulelor care nu se supune limitelor uzuale de creștere. Prin “agent anti-neoplazic” se înțelege orice compus, compoziție, amestec sau co-amestec care inhibă, elimină, întârzie sau inversează fenotipul neoplazic al unei celule.

1935

1940

1945

1950

1955

1960

1965

1970

1975

RO 118931 Β1 în mod curent, în tratamentul cancerului se folosesc chimioterapia, chirurgia, terapia prin radiații, terapia cu modificatori ai răspunsului biologic și imunoterapia. Fiecare mod de terapie are indicații specifice care sunt cunoscute de specialiștii în domeniu, și poate fi folosită una sau toate pentru a încerca obținerea unei distrugeri totale a celulelor neoplazice. Prezenta invenție indică chimioterapia folosind una sau mai multe criptoficine. în plus chimioterapia combinată, chimioterapia folosind criptoficine în combinație cu alți agenți neoplazici, este propusă de prezenta invenție ca fiind mai eficientă decât folosirea unui singur agent anti-neoplazic. Astfel, un alt aspect al prezentei invenții este acela al compozițiilor care conțin o cantitate eficientă terapeutic din cel puțin un nou compus criptoficinic conform invenției, care includ sărurile de adiție ale acestuia, netoxice, și care dovedesc avantajele terapeutice menționate. Asemenea compoziții pot fi furnizate împreună cu un lichid tolerabil fiziologic, gel sau purtători solizi, diluanți, adjuvanți și excipienți. Astfel de purtători, diluanți, adjuvanți și excipienți pot fi găsiți în United States Pharmacopeia vol.XXII și Național Formularyvol. XVII, U.S. Pharmacopeia Convention. în continuare, Rockville, MD (1989), conținutul căreia este inclus în prezenta descriere ca referință. Alte moduri de tratament sunt prezentate în AHFS Drug Information, 1993 ed. de American Hospital Formulary Service, pp.522-660, al cărei conținut este inclus ca referință în prezenta descriere.

Prezenta invenție se referă și la aceea că compoziția farmaceutică folosită pentru tratamentul bolilor neoplazice conține cel puțin un compus de criptoficină și cel puțin un agent anti-neoplazic suplimentar. Compușii anti-neoplazici care pot fi utilizați în combinație cu criptoficina sunt cei din The Merck Index, ed. 11 -a, Merck&Co., Inc.(1989), pp ther 16-17, al cărei conținut este inclus ca referință. într-o altă realizare a invenției, agenții anti-neoplazici pot fi antimetaboliți care pot include, dar nu se limitează la, metotrexat, 5-fluoruracil, 6-mercaptopurină, citozin arabinozidă, hidroxiuree și 2-clordeoxiadenozină. într-o altă realizare a prezentei invenții, agenții anti-neoplazici sunt agenți de alchilare care pot include, dar nu se limitează la, ciclofosfamide, melfalan, busulfan, paraplatin, clorambucil și nitrogen mustard. într-o altă realizare a prezentei invenții, agenții anti-neoplazici sunt alcaloizi din plante care pot include, dar nu se limitează la, vincristina, vinblastina, taxol și etopozid. într-o altă realizare a prezentei invenții, agenții anti-neoplazici sunt antibiotice care pot include, dar nu se limitează la, doxorubicină (adriamicin), daunorubicină, mitomicină c și bleomicină. întro altă realizare a prezentei invenții, agenții anti-neoplazici sunt hormoni, care pot include dar nu se limitează la calusteron, diomostovolon, propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolacton, tamoxifen, poliestradiol fosfat, megesterol acetat, flutamid, nilutamid și trilotan. într-o altă realizare a prezentei invenții, agenții anti-neoplazici sunt enzime, care pot include dar nu se limitează la L-asparaginază sau derivați aminoacridinici care pot include, dar nu se limitează la amsacrina. Alți agenți anti-neoplazici pot fi cei prezentați în Skeel, Roland T., “Antineoplastic Drugs and Biologic Response Modifier:Classification, Use and Toxicity of Clinically Useful Agentd’, Handbook of Cancer Chemotherapy (ed.3-a), Little Brown&Co. (1991), al cărei conținut este inclus ca referință în prezenta descriere.

Derivații de criptoficină, conform invenției, și compozițiile pot fi adminsitrați la mamifere, pentru uz veterinar, cum ar fi animalele de casă și pentru uz clinic la om, în mod similar altor agenți terapeutici. în general, doza cerută pentru o eficiență terapeutică variază conform tipului de utilizare și modului de administrare, cât și de cerințele specifice individului, în mod uzual, dozele variază de la aproximativ 0,001 la 1000 mg/kg, mai uzual de la 0,01 la 10 mg/kg corp. în acest interval, dozele pot fi administrate prin infuzie constantă într-o perioadă de timp, de obicei care nu depășește 24 ore, până ce se obține efectul terapeutic dorit. într-adevăr, doza medicamentului cât și calea de administrare trebuie alese pe baza eficacității relative, a toxicității relative, a caracteristicilor de creștere ale tumorii și efectul criptoficinelor asupra ciclului celulei, farmacocinetica medicamentului, vârstă, sex, condițiile fizice ale pacientului și de tratamentul anterior.

RO 118931 Β1

2030

Derivații de criptoficină cu sau fără alți agenți antineoplazici, pot fi formulați în compoziții terapeutice ca atare sau sub formă de sare. Sărurile netoxice acceptabile farmaceutic includ sărurile de adiție acidă (formate cu grupa carboxil liberă sau cu alte grupări anionice) care pot fi obținute cu baze anorganice cum ar fi, de exemplu, hidroxizii de sodiu potasiu, amoniu, calciu sau feric și cu baze organice cum ar fi izopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol histidina, procaina ș.a. Asemenea săruri pot fi formate și ca săruri de adiție acidă, ca orice grupări cationice libere și se formează în general cu acizii anorganici cum ar fi, de exemplu, acizii clorhidric și fosforic, sau acizii organici ca acidul acetic, oxalic, tartric, mandelic ș.a. Alți excipienți sunt cei accesibili și cunoscuți de specialiștii în domeniu, de exemplu cei prezentați în United States Pharmacopia vol.XXII și Național Formulary voi. XVII. U.S. Pharmacopeia Convention, în continuare, Rockville D (1989), care este inclusă ca referință.

I

Purtătorii adecvați a fi incluși în compozițiile terapeutice depind de calea de administrare preferată. De exemplu, compozițiile anti-neoplazice pot fi formulate pentru administrare orală. Asemenea compoziții sunt preparate tipic ca soluții sau suspensii, sau în formă solidă. Formulările orale includ aditivi folosiți în mod uzual cum ar fi lianți, agenți de umplutură, purtători, agenți de conservare, de stabilizare, emulgatori, agenți tampon și excipienți ca, de exemplu, manitol, lactoză, amidon, stearat de magneziu, zaharină, celuloză, carbonat de magneziu de puritate farmaceutică, ș.a. Aceste compoziții sunt sub formă de soluții, suspensii, tablete, pilule, capsule, formulări cu eliberare controlată sau pulberi, și conțin în mod uzual 1%-95% ingredient activ, de preferință 2%-70%.

Compozițiile conform invenției pot fi preparate și ca forme injectabile, fie ca soluții lichide, suspensii, fie ca emulsii; pot fi preparate forme solide adecvate pentru obținerea soluțiilor sau suspensiilor în lichid, înainte de injectare. Injecțiile pot fi administrate subcutanat, intravenos, intraperitoneal, intramuscular, intrarectal sau intrapleural. Ingredientul activ sau ingredienții sunt deseori amestecați cu diluanți sau excipienți care sunt tolerabili fiziologic și compatibili cu ingredientul(ții) activ(i). Diluanți și excipienți adecvați sunt, de exemplu, apa, soluția de sare, dextroză, glicerina ș.a. și combinații ale acestora. în plus, dacă se dorește, compozițiile pot conține cantități mici de substanțe auxiliare cum ar fi agenții de umectare sau emulgatorii, stabilizatorii sau agenții tampon de pH.

Invenția se referă și la metode de utilizare a compușilor criptoficin pentru inhibarea proliferării celulelor mamiferelor prin contactarea acestor celule cu un compus criptoficin întro cantitate suficientă pentru a inhiba proliferarea celulei mamiferului. O realizare preferată este o metodă de inhibare a proliferării celulelor hiperproliferative ale mamiferelor. în prezenta invenție prin “celule hiperproliferative ale mamiferelor” se înțeleg celulele care nu sunt supuse limitărilor tipice de creștere, de exemplu, moartea programată a celulei (apoptoză). O altă realizare preferată este aceea în care celula de mamifer este celula umană. Invenția se referă și la contactarea celulei de mamifer cu cel puțin un compus criptoficin și un agent antineoplazic suplimentar. Tipurile de agenți anti-neoplazici sunt cele prezentate anterior.

Invenția se referă și la metode de utilizare a compușilor criptoficin, conform invenției, pentru inhibarea proliferării celulelor hiperproliferative cu fenotipuri rezistente la medicament, incluzând cele cu fenotipuri rezistente la multiple medicamente, prin contactarea numitei celule cu un compus criptoficin într-o cantitate suficientă pentru a inhiba proliferarea unei celule hiperproliferative de mamifer. O realizare preferată este aceea în care celula de mamifer este celula umană. Invenția se referă și la contactarea celulei de mamifer cu un compus criptoficin și cel puțin un agent antineoplazic suplimentar. Tipurile de agenți antineoplazici pentru această utilizare sunt cele descrise anterior.

Invenția se referă și la o metodă pentru ameliorarea condițiilor patologice cauzate de celulele hiperproliferative ale mamiferelor, de exemplu, neoplazia, prin administrarea la un subiect a unei cantități eficiente dintr-o compoziție farmaceutică menționată anterior pentru

2035

2040

2045

2050

2055

2060

2065

2070

2075

RO 118931 Β1 a inhiba proliferarea celulelor hiperproliferative. Prin “condiții patologice” se înțelege orice stare patologică generată de proliferarea celulelor mamiferului care nu sunt supuse limitărilor normale ale creșterii celulei. O astfel de proliferare a celulelor se poate datora neoplasmelor, care includ, dar nu se limitează la următoarele tipuri de neoplasm: mamar, pulmonar al celulelor mici, pulmonar al celulelor care nu sunt mici, colorectal, leucemia, melanoma, sistemul nervos central (CNS), ovarian, prostată, sarcomul țesutului moale sau osos, cap și gât, gastric care include pancreatic și esofagian, stomac, mieloma, vezică, renal, neuroendocrin care include tiroida și limfomul Hodgkin și care nu este de tip Hodgkin. într-o altă realizare a invenției, celulele neoplazice sunt celule umane. Prezenta invenție se referă și la metode pentru ameliorarea acestor condiții patologice prin utilizarea criptoficinei în combinație cu alte terapii, cât și cu alți agenți anti-neoplazici. Astfel de terapii pentru diferite neoplazii pot fi găsite în Cancer Principles și Practice ofOncology, ed-a 4-a. Ed.DeVita.V., Hellman,S., și Rosenberg,S., Lippincott Co (1993), al cărei conținut este inclus ca referință.

în prezenta descriere, derivații de criptoficină sunt prezentați ca potențiali distrugători ai structurii microtubulare în celulele de cultură. în plus, și spre deosebire de alcaloizii Vinca, compușii criptoficin par a fi un substrat mai sărac pentru P-glicoproteină ca pompă de reflux al medicamentului. Criptoficină 1 este citotoxina principală în tulpina de algă verde-albastră (cianobacterie) Nostocsp. denumită GSV 224 și prezintă o activitate excelentă împotriva tumorilor implantate la șoareci. Această didepsipeptidă a fost inițial izolată din Nostoc sp. ATCC nr.53789 ca agent antifungic și structura globală a fost determinată anterior. Stereochimia relativă și absolută a acestui medicament, potențial important, a fost stabilită folosind o combinație de tehnici chimice și spectrale. Criptoficinele 2-7,16-19,21,21,23,24,26,2831,40, 43, 45, 49, 50 și 54 au fost, de asemenea, izolate din GSV 224 și s-au determinat structurile lor totale și citotoxicitățile. Sunt descriși câțiva derivați și produși de degradare, atât chimic cât și farmacologic.

Următoarele exemple au rolul de a ilustra anumite realizări preferate ale prezentei invenții și nu de a o limita la acestea.

Partea experimentală în partea experimentală care urmează, toate greutățile date sunt în grame (g), miligrame (mg), micrograme (^g), nanograme (ng), picograme (pg), moli (mol) sau milimoli (mmoli), toate concentrațiile sunt date ca procente de volum (%), molar (M), milimolar (mM), micromolar (μΜ), nanomolar (nM), picomolar (pM) sau normale (N), toate volumele sunt date în litri (L), mililitri (mL) sau microlitri (μί) și măsurătorile lineare în milimetri (mm), atunci când nu se specifică altceva.

Următoarele exemple demonstrează izolarea și sinteza derivaților de criptoficin cât și utilizarea lor ca agenți terapeutici conform invenției.

în extractele selectate alte peste 1000 alge verzi-albastre (cianobacterii) pentru activitatea tumorală, extractul lipofilic al Nostoc sp.GSV 224 s-a găsit a fi puternic citotoxic³, prezentând concentrații minime de inhibare (MIC) de 0,24 ng/mL față de KB, o linie de celule ale carcinomului nasofaringean și de 6 ng/mL față de LoVo, o linie de celule ale adenocarcinomului colorectal uman. Mai important, acest extract a prezentat o citotoxicitate tumorală selectivă semnificativă în evaluarea Corbett^4,5. Bioevaluările efectuate prin cromatografie cu fază inversă, pe extractul de algă a condus la o fracție care a fost predominant criptoficină 1, un fungicid potent care fusese izolat anterior din Nostoc sp. ATCC 53789 de către cercetătorii de la Merck⁶·⁷ și care s-a dovedit a fi foarte activ față de tulpina de Cryptococcus.

Criptoficină 1 responsabilă de marea parte a activității citotoxice a extractului brut de algă Nostoc sp.GSV 224 și compusul pur prezintă valori IC₅₀ de 3 și 5 pg/mL față de KB și respectiv LoVo. în evaluarea Corbett Criptoficină 1 s-a găsit a fi foarte selectivă tumoral și cu citotoxicitate egală față de celulele tumorale sensibile la medicament și cele rezistente

RO 118931 Β1 la medicament. Imunofluorescența a arătat că Criptoficină 1 interacționează cu o celulă țintă în mod similar vinblastinaui, dar diferit de acesta prin aceea că are o durată mai lungă de acțiune și nu formează corpi paracristalini. în experimentele preliminare in vivo, Criptoficină 1 prezintă o activitate foarte promițătoare față de tumorile implantate în șoareci.

în Nostoc sp.GSV 224 sunt prezente și cantități mici de alte câteva criptoficine. Douăzeci și unu dintre acestea au putut fi izolate în cantități suficiente pentru determinări structurale și evaluare antitumorală în vitro prin extracția algei cu diclormetan/acetonitril 1:5 și HPLC cu fază inversă a extractului. Criptoficinele 2, 3, 4,16,17,18,19, 21,23, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 40, 43, 45, 49, 50 și 54 însoțesc criptoficină 1 în fracțiile eluate dintr-o coloană rapidă cu fază inversă cu acetonitril/apă 65:35). Când extracția algei s-a făcut cu metanol și cromatografia cu fază inversă s-a făcut cu metanol/apă, singurii compuși găsiți au fost criptoficinele 2, 3, 4, 5,6 și 7. Criptoficinele 2, 3,4,5 și 6 s-au eluat cu metanol/apă 3:1 și criptoficină 7 s-a găsit într-o fracție anterioară, mai puțin citotoxică, eluată cu metanol/apă 1:3. Criptoficinele aciclice 5,6 și 7 par a fi artefacte generate de descompunerea criptoficinei 1 în timpul procedeului de separare.

Criptoficinele 3 și 5 par a fi identice cu compușii semisintetici fungicizi preparați din criptoficină 1 de către cercetătorii de la Merck⁸·⁹ Criptoficină 3 s-a preparat prin tratarea criptoficinei 1 cu zinc-cupru sau cu tetraiodură difosforoasă⁸. Criptoficină 5 s-a preparat prin metanoliza criptoficinei 1⁹ în continuare, se prezintă 22 (sunt doar 14 scrise) exemple de realizare în legătură cu figurile care reprezintă:

- fig.1, se referă la o structură generală a compușilor criptoficin selectași ai prezentei invenții și la un sistem de numerotare a unităților de hidroxiacid A și D și a unităților de aminoacid B și C în realizările selectate;

- fig.2A și B prezintă grafic efectele compușilor criptoficin și a vinblastinaui asupra proliferării celulei Jurkat și a desfășurării ciclului celulei. Celulele Jurkat s-au incubat cu concentrațiile indicate de compuși criptoficin (A) sau vinblastina (B) timp de 24 h. Pentru fiecare probă, s-au determinat numărul de celule viabile () și indicele mitotic (□) în modul descris, în secțiunea experimentală. Valorile reprezintă valoare ± abatere standardad (sd) pentru probe triple în unul din trei experimente similare;

- fig.3, reprezintă grafic reversibilitatea efectelor vinblastului, criptoficinelor și taxolului asupra creșterii celulei. Celulele SKOV3 s-au tratat cu 0,1 nM vinblastina (□), 0,1 nM criptoficine () sau 1nM taxol (®) la t=0. Aceste concentrații au inhibat creșterea celulei cu 50% pentru fiecare compus. După 24 h, celulele s-au spălat și incubat într-un mediu fără medicament pe durata indicată. S-a determinat densitatea celulei prin colorare și sulforhodamină B(SRB) așa cum s-a descris în secțiunea experimentală și se exprimă ca absorbanță medie ± sd la 560 nm pentru una dintre cele trei experiențe ale unei probe triple;

- fig.4, se referă la izobologramele efectelor combinate ale vinblastinaui și criptoficinelor asupra proliferării celulelor. Celulele SKOV3 s-au tratat cu vinblastina (0.600 pM) și/sau criptoficine (1-100 pM) timp de 48 h. Numărul celulelor s-a determinat apoi prin colorare cu SRB în modul descris în secțiunea experimentală, și s-au determinat IC^s () și linia aditivității (—) pentru combinațiile de vinblastina și compuși criptoficin. Valorile reprezintă media a două experimente fiecare conținând probe triple;

- fig.5, prezintă o primă schemă de sinteză a criptoficinelor conform invenției;

- fig.6, prezintă o schemă de obținere a unității hidroxi acid A;

- fig.7, prezintă o schemă de obținere a subunității unei criptoficine, conținând o unitate de hidroxi acid A și de amino acid B;

- fig.8, prezintă o schemă de obținere a subunității unei criptoficine, conținând o unitate de amino acid C și de hidroxi acid D;

2130

2135

2140

2145

2150

2155

2160

2165

2170

2175

RO 118931 Β1

- fig.9, prezintă o primă schemă de sinteză a criptoficinelor selectate conform prezentei invenții;

- fig. 10, prezintă o a doua schemă de sinteză a criptoficinelor selectate conform invenției;

- fig.11, prezintă o schemă de obținere a subunității unei criptoficine conținând o unitate hidroxi acid D;

- fig.12, prezintă o a treia schemă de sinteză a criptoficinelor selectate conform invenției;

- fig. 13, prezintă o a patra schemă de sinteză a criptoficinelor selectate conform invenției;

- fig.14, prezintă o a cincea schemă de sinteză a criptoficinelor selectate conform invenției.

Exemplul 1. Determinarea structurii

Determinarea structurii noilor compuși, adică criptoficinele 2,4,6,7,8,9,10,12,14, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 40, 43, 45, 49, 50 și 54, cât și cei prezentați anterior, s-a efectuat, în mod direct, prin metodologia cunoscută specialiștilor în domeniu. Datele de spectroscopie de masă au fost în concordanță cu compozițiile moleculare. Datele RMN pentru atomul de carbon și pentru proton obținute din spectrele COSY, HMQC, HMBC și NOESY au permis stabilirea structurilor acestor compuși de tip depsipeptidic. Prezența diferitelor unități de hidroxi și amino acid, în fiecare compus, s-a confirmat prin analiză de spectrometrie de masă cuplată cu cromatografie gazoasă. Structurile totale, inclusiv stereochimia absolută, s-au determinat folosind o combinație a degradării chimice și a tehnicilor analitice speciale pe derivați adecvați ai compușilor criptoficin.

Exemplul 2. Relația structură-activitate (SAR)

Pentru a evalua caracteristicile structurale din criptoficină 1, necesare pentru activitate optimă, toți compușii descriși s-au evaluat din punct de vedere al citotoxicității față de liniile de celule KB (carcinom nasofaringean uman), LoVo (carcicom de colon uman) și SKOV3 (carcinom ovarian uman). Valorile IC^ sunt prezentate în tabelele 1 și 2. Comparația citotoxicităților arată că ciclul macrolidic intact, grupările epoxi și metil și dubla legătură în unitatea de acid 7,8-epoxi-5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2-octenoic (vezi unitatea A în fig.1), clorul și grupările O-metil în unitatea 3-(3-clor-4-metoxifenil) (unitatea B), gruparea metil în unitatea 3-amino-2-metilpropionic (unitatea C) și gruparea izobutil în unitatea de acid leucic (unitatea D) a criptoficinei 1 sunt necesare pentru o activitate citotoxică optimă. Citotoxicitatea criptoficinei 8 este, cel mai probabil, datorită funcționalității clorohidrin care acționează ca un epoxid mascat.

Cei mai activi compuși s-au evaluat din punctul de vedere al citotoxicității selective față de patru tipuri de celule diferite, (adenocarcinom de colon 38, adenocarcinom ductal pancreatic 03, adenocarcinom mamar M16/M17), o tumoră solidă umană (colon CX-1, HCT8, H116; plămân H125;mamar MX-1, MCF-7) și un fibroblast cu malignicitate scăzută (LML), folosind evaluarea Corbett⁴, o evaluare de difuzie modelată după cea folosită în mod uzual pentru evaluări antibacteriene și antifungice. Rezultatele, prezentate în tabelul 1, indică faptul că criptoficinele 1-5 și 8 nu au fost selective nici față de tumorile solide nici față de leucemie, dar cu activitate aproape egală față de linia de celule tumorale, care include pe cele rezistente la medicament cum ar fi M17. Nici unul dintre compușii prezentați nu prezintă o zonă de inhibare pentru vreo linie de celule tumorale solide care au 250 unități zonale, adică

7,5 mm, mai mare decât zona de inhibare, pentru linia de celule de leucemie. Criptoficinele 1-5 și 8, prezintă zone de inhibare, pronunțat mai mari (40 unități zonale) pentru toate liniile de celule tumorale, comparativ cu zona de inhibare pentru fibroblaste LML. Din punctul de vedere al diagnosticului, LML se comportă mai asemănător unei celule normale decât unei

RO 118931 Β1 celule tumorale față de agenții citotoxici utilizați clinic (vezi datele evaluării Corbett pentru 5-fluoruracil, etoposid și taxol în tabelul 1). Deoarece citotoxicitățile au fost mai mari de 250 unități zonale, criptoficinele 1-5 și 8 sunt considerate selective tumoral. Acești compuși devin, astfel, candidați la testări în vivo.

Criptoficină 1 este activă față de un spectru larg de tumori umane și murine implantate la șoareci, inclusiv cele rezistente la medicamente (tabelul 3). Ea prezintă o activitate excelentă față de primele 5 stadii inițiale ale tumorilor murine, și anume, adenocarcinoamele #38 și #51, adenocarcinomul mamar sensibil la taxol și rezistent la taxol #16/C/RP și cel pancreatic #03 și două tumori umane în primă etapă testate în șoareci SCID, adică sân MX1 și plămân adenoscuamos H125, prezentând valori T/C (greutatea medie a tumorii animalelor tratate/greutatea medie a tumorilor animalelor netratate) mai mici de 10%.

Valorile T/C care sunt mai mici de 42% sunt considerate a fi active prin standarde NCI; valorile T/C mai mici de 10% sunt considerate a avea activitate excelentă și activitate clinică potențială, conform standardelor NCI⁹. Două experiențe au arătat valori ale log. omorârii globale (celule tumorale) de 2,0. Log. omorârii globale este definit ca T-C/3,2Td în care T este timpul mediu în zile ca tumorile grupului tratat să atingă 750 mg, C este timpul mediu în zile ca tumorile grupului de control să atingă 750 mg și Td este timpul de dublare a volumului tumorii. Valorile globale log. omorâte >2,8, 2,0-2,8,1,3-1,9, 0,5-0,8 și <0,5 cu durata tratamentului medicamentos de 5-20 zile sunt notate ++++, +++, ++, + și respectiv -(inactiv). O activitate de +++ la ++++, care reprezintă un indiciu al activității clinice, este necesară pentru o regresie parțială sau completă a maselor de dimensiuni 100-300 mg ale tumorilor solide transplantate la șoareci.

Criptoficină 8 este, de asemenea, activă față de un spectru larg de tumori implantate în șoareci (tabelul 4). Ea prezintă activitate excelentă față de toate tumorile testate, prezentând valori T/C<10%, dar ceea ce este mai important o activitate log. omorâte globală de la +++ la ++++ și în unele cazuri vindecări.

Activitate bună în vivo s-a observat și pentru criptoficină 35, în singura experimentare făcută până în prezent.

Toxicitatea letală observată în timpul testării criptoficinelor 1 și 8 s-a atribuit leucopeniei care este comună tuturor medicamentelor antitumorale folosite clinic.

Exemplul 3. Condiții de cultură

Nostoc sp.GSV 224 s-a obținut de Prof.C.P.Wolk, MSU-DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, Nostoc sp. ATCC 53789 s-a cumpărat de la American Type Culture Collection. O cultură într-un balon de 1 I s-a folosit pentru a inocula o autoclavă de 20 I conținând un mediu anorganic, modificat BG-11³, al cărui pH s-a ajustat la 7,0 cu NaOH. Culturile s-au iluminat continuu la o intensitate incidență de 200 μπιοΙ fotoni m'²sec'¹(radiație activă fotosinteticâ) din tuburi fluorescente cu lumină albă rece și s-au aerat la o viteză de 5 L/min cu un amestec de 0,5% CO₂ în aer, la o temperatură de 24 ± 1 °C. Cultura s-a recoltat prin filtrare după 21 zile. Randamentele de Nostoc sp.GSV 224 și ATCC 53789 au fost de 0,61 și respectiv 0,3 g/L cultură.

Exemplul 4. Separare

Metoda A: Nostoc sp.GSV224 liofilizat (50 g) s-a extras cu 2 I CH₂Cl2/CH₃CN, timp de 48 h și extractul s-a concentrat sub vid, pentru a obține un solid verde închis. Reziduul (1 g; KB MIC 0,24 ng(ml) s-a aplicat pe o coloană cu silice acoperită cu ODS (55g, 7x5 clorură de metilen/metanol) și s-a supus cromatografiei rapide cu CH₃CN/H₂O 1:3 (0,8 I). CH₃CN/H₂O (0,8 I) 1:1, CH₃CN/H₂O(1,0 I) 65:35, MeOH(0,8 I) și CHjCL, (0,5L). Fracția care s-a eluat cu CH₃CN/H₂O 65:35 (420 mg; KB MIC 14 pg/ml) a fost supusă HPLC cu fază inversă (Econosil C₁₈,10 μ, 25 cm x 21,5 mm, detectare UV la 250 CH₃CN/H₂O 65:35, debit 6 ml/min) pentru a obține criptoficină 1 (tR 49,3 min. 220 mg) și un număr de fracții impure.

2230

2235

2240

2245

2250

2255

2260

2265

2270

2275

RO 118931 Β1

Fracția eluată din coloana cu Econosil C₁₈ la t_R 28,8 min, s-a purificat, în continuare, prin HPLC cu fază normală (cartuș cu silice Econosil 5 μ\, 250 x 4,6 mm, acetat de etil/hexan 6:4, 3ml/min) pentru a obține criptoficină 16 (3,0 mg). Fracția eluată din coloana cu Econosil C₁₈la t_R 32,5 min s-a supus HPLC pe coloană cu silice Econosil folosind acetat de etil/hexan 55:45 la 3ml/min, pentru a obține criptoficină 24 (0,8 mg). Fracția eluată din coloana cu Econosil C₁₈ la tp 35,5 min s-a supus HPLC de două ori pe coloană cu silice Econosil, inițial folosind acetat de etil/hexan 1:1 la 3ml/min și apoi folosind acetat de etil/clorură de metilen 4:6 la 2,5 ml/min pentru a obține criptoficină 23(1,2 mg) și criptoficină 43(0,1 mg). Fracția eluată din coloana cu Econosil C₁₈ la t_R 39,5 min s-a supus la HPLC pe coloană cu silice Econosil cu acetat de etil/hexan 1:1 la 3ml/min pentru a obține criptoficină 2 (6 mg) și criptoficină 21 (14 mg) și un amestec complex de criptoficine, eluat la t_R 32,5 min. Această fracție din urmă, acumulată din 400 g algă uscată, s-a cromatografiat succesiv pe o coloană semipreparativă (partisil C₁₈, 250 x 9,4 mm, 10 μΙ cu apă/acetonitril 35:65 și o coloană analitică cu fază inversă (Econosil, 150 x 4,6 mm, 5 μ\) cu apă/acetonitril/metanol 5:4:1 la 1,3 ml/min pentru a obține criptoficină 50 (t_R 34,8,0,4 mg) și criptoficină 40 (tp 38,8 min, 0,3 mg). Fracția eluată din coloana cu Econosil C₁₈ la t_R 44,5 min s-a supus la HPLC pe coloană cu silice Econosil cu acetat de etil/hexan 1:1 la 3 ml/min pentru a obține criptoficină 17 (0,3 mg). Purificarea prin HPLC cu fază normală a fracției eluate din coloana Econosil C₁₈ la t_R 54,5 ca un umăr al criptoficinei 1 a dat criptoficină 45 (t_R 6,7 min, 0,1 mg), criptoficină 26 (t_R 8,9 min, 0,5 mg) și criptoficină 54 (t_R 19,8 min. <0,1 mg) prin eluare cu acetat de etil/hexan 1:1. Fracția eluată din coloana cu silice Econosil C₁₈, ca pic larg, (t_R 58 la 70 min) s-a supus HPLC pe coloană cu silice Econosil cu acetat de etil/hexan 43:57 la 2 ml/min obținându-se criptoficină 4 (t_R

19,6 min, 1,5 mg), criptoficină 31 (t_R 9,4 min, 0,8 mg), criptoficină 19 (t_R 25,8 min, 0,3 mg), criptoficină 49 (t_R 28 min, 0,1 mg), criptoficină 28 (t_R 29,0 min, 0,5 mg) și criptoficină 29 impură (t_R 52,5 min, 2,0 mg) și criptoficinele 29 și 30 obținute în stare pură după HPLC cu fază inversă (Econosil C₁₈,10 μ, 250 x 10 mm, metanol/apă 3:1). Fracția eluată din coloana Econosil C₁₈ la t_R 78,9 a fost supusă la HPLC pe coloană cu silice Econosil pentru a obține criptoficina 3 (t_R 16,4 min, 3,0 mg). Fracția eluată din coloana Econosil C₁₈ la 82,8 min s-a supus HPLC pe o coloană cu silice Econosil cu acetat de etil/hexan 45:55 la 3 ml/min pentru a obține criptoficină 18 (t_R 19,2, 0,8 mg).

Metoda B

Nostoc sp.GSV 224 liofilizat (12,23 g) s-a extras de două ori cu 700 ml și 400 ml MeOH, timp de 12 și respectiv 5 h. Extractele s-au combinat și obținându-se 1,84 g solid verde închis, care s-a extras cu apă și CH₂CI₂. Porțiunea liofilă (0,65 g; KB MIC 0,24 ng/ml) s-a aplicat pe o coloană cu silice acoperită ODS (55 g, 7 x 5 cm) și s-a supus cromatografiei rapide de MeOH/H₂O 1:3 (0,8 I) 1:1, MeOH/H₂O (0,8 I) 3:1, MeOH (0,8 I) și CH₂CI₂ (0,5 I). Fracția care s-a eluat cu MeOH/H₂O 3:1 (22 mg; KB MIC 14 pg/ml), responsabilă de aproape toată activitatea citotoxică s-a supus HPLC cu fază inversă (Econosil C₁₈,10 μ, 250 x 10 mm, detecție UV la 250 nm, debit 3 ml/min) folosind MeOH/H₂O 1:5 ca eluent pentru a obține criptoficinele 7 (t_R 7,6 min, 0,2 mg), 5 (Îr 15,4 min, 2,3 mg), 2 (tp 16,0 min, 1,0 mg), 1 (^ 19,0 min. 12,0 mg), 4 (t_R 26,5 min. 1,2 mg) și 3 (t_r 30,2 min, 1,4 mg). Una din culturile fracției (8,1 mg) care s-a eluat din coloana rapidă cu MeOH/H₂01:3 a prezentat citotoxicitate medie (KB MIC 2 /zg/ml). Purificarea prin HPLC folosind MeOH/H₂O 2:3 ca eluent a dat criptoficină G (7, t_R6, Omin, 2,4 mg).

Exemplul 5. Analizele spectrale pentru criptoficinele 1-7

Literele italice bold din datele spectrale se referă la unitățile A-D din fig.1.

Criptoficină 1 [a]_D ^+33,8°(MeOH, c 1,83); UV Ă_max(e) 208 (42.400), 218(33,700); 228 (23,800), 280 (2,210); CD [θ]₂₀₂ +15,900, [θ]₂₀₆ +64.900, [θ]₂₁₄ +26.900, [θ]₂₂₄ +46.300, [θ]₂₃₇ +10.500. IR (CHCI₃) v_max 3425, 2963,1751,1719,1677,1502,1259 cm'. EIMS m/z (intensitate relativă)

RO 118931 Β1

654/656 (20/9), 412/414 (33/12), 280/282 (31/12), 227 (80), 195/197 (92/44), 91 (100); EIMS rezoluție mare m/z 654.2665 (calculat pentru C₃₅H43CIN₂o₈, eroare 4.3 mmu). ¹H RMN (CDCI₃): unitate δ de aminoacid sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitarea; J în Hz) acid 7,8-epoxi-5-hidroxi- 6-metil-8- fenil-2-octenoic (A) 5,74 (2, dt; 15,5 and 0,9), 6,68 (3, ddd; 15,5, 9,6 și 5,2), 2,45 (4, ddd; 14.2,11,1 și 9,6), 2,55 (4, brdd; 14,2 și 5,2), 5,16 (5, ddd;

11,1,4,9 și 1,9), 1,80 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 7,1), 2,92 (7, dd; 7,5 și 2,0), 3,69 (8, d; 2,0), 7,25 (10/14, m), 7,34-7,39 (11/12/13, m); acid leucic (D) 4,83 (2, dd; 6,8 și 3,3), 1,70 (3, m), 1,36 (3, m), 1,70(4, m), 0,86 (5, d; 6,6), acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,71 (2, m), 1,22 (2-Me, d, 7,1), 3,30 (3, ddd; 13,4, 5,8 și 3,8), 3,48 (3, ddd; 13,4, 6,3 și 5,8), 6,93 (3-NH, brt; 5,8); 3-cloro-4-metoxi-fenilalanină (B) 4,80 (2, ddd; 8,7, 7,3 și 5,4), 5,61 (2-NH, d; 8,7), 3,03 (3, dd; 14,4 și 7,3), 3,13 (3, dd; 14,4 și 5,4), 7,21 (5, d; 2,1), 3,87 (7-OCH₃,s), 6,83 (8, d; 8,5), 7,07 (9, dd; 8,5 și 2,1). ¹³C RMN (CDCI₃): unitate δ (poziți carbonului) A 165,3 (1), 125,3 (2), 141,0 (3), 36,7 (4), 76,2 (5), 40,6 (6), 13,5 (6-Me), 63,0 (7), 59,0 (8), 136,7 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,5 (12); D 170,7 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,5 (4), 22,9 (5), 21,3 (4-Me); C 175,6(1), 38,2 (2), 14,1 (2-Me), 41,1(3); B 170,9 (1), 53,6 (2), 35,0 (3), 129,7 (4), 131,0 (5), 122,4 (6), 154,0 (7), 56,1 (7-OCH₃), 112,2 (8), 128,4 (9).

Criptoficină 2 [a]_D+20,4°(MeOH, c 0,54); UV λ^ε) 206 (43,800), 218 (37,500), 232 (22.900), 278 (2.410); CD [OU +54.100,[θ]₂₁₂ +16.500, [OU +53.600, [OU -14.000. IR (CHC^) 3423, 3029, 2961, 1742, 1724, 1678, 1512, 1258 cm'¹. EIMS m/z (intensitate relativă) 620 (11, M+), 431 (3), 378(8), 377 (6), 311(11), 246 (10), 244 (8), 227 (14), 195 (17), 161 (84, CH3O-C6H4-CH=CH=CO⁺), 121(79, CH3O- C₆H₄-CH₂+), 91 (100); EIMS rezoluție mare m/z 620,3094(calculat pentru C^H^NjOg, eroare 0,3 mmu); 161,0605 (calculat pentru C₁₀H₉O₂, -0,2 mmu); 121,0658 (calculat pentru C₈H₉O, eroare -0,4 mmu). Ή RMN (CDCI₃): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 7,8-epoxi-5-hidroxi6-metil-8-fenil-2-octenoic acid (A) 5,71 (2, dd; 15,4 și 1,3), 6,70 (3, ddd; 15,4,10,2 și 5,0), 2,45 (4, m), 2,55 (4, m), 5,18 (5, ddd; 11,3, 4,8 și 2,0), 1,79 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 7.0), 2,92 (7, dd; 7,7 și 2,0), 3,68 (8, d; 2,0), 7,24 (10/14, m), 7,34-7,39 (11/12/13, m); acid leucic (D) 4,82 (2, dd; 10,1 și 3,7), 1,70 (3, m), 1,33 (3, m), 1,70 (4, m), 0,86 (5, d; 6,4), 0,84 (5¹, d;

6,4); acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,68 (2, m), 1,23 (2-Me, d; 7,3), 3,39 (3-H₂, m), 7,02 (3-NH,brt; 6,0);O-metiltirosină (B) 4,79 (2, ddd; 8,1,7,0 și 5,7), 5,55 (2-NH, d; 8,1), 3,07 (3, dd; 14,5 și 7,0), 3,13 (3, dd; 14,5 și 5,7), 7,10 (5/9, d; 8,6), 6,81 (6/8, d; 8,6), 3,78 (7-OCH₃, s). ¹³C RMN (CDCI₃): unitate δ (poziția carbonului) A 165,1(1), 125,1 (2), 141,1(3), 36,7 (4), 76,0 (5), 40,7(6), 13,6 (6-Me), 63,0 (7), 59,0 (8), 136,7 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/3), 128,5 (12); D 170,6(1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,5 (4), 21,3 (5), 22,9 (4-Me); C 176.0 (1), 38,1(2), 14,2 (2-Me), 40,7 (3); B 171,1 (1), 53,9 (2), 35,3 (3), 131,0 (4), 130,2 (5/9), 114,1(6/8), 158,6 (7),

55,2 (7-OCH₃).

Criptoficină 3 [a]_o+20,3°(MeOH, c 1,13); UV Ă^Je) 206 (51.700), 218 (31.200), 230 (22,900), 246 (18.800), 280 (3.230); CD [OU +50.000, [0]₂₁₂ -390, [OU -47.200, [OU Ί00, PU +33.400, [0]₂₇₁ +4.310. IR (CHCI₃) v_max, 3417, 2926, 1742, 1721, 1676, 1499, 1336 cm¹. EIMS m/z (intensitate relativă) 638/640 (2/0,7, M⁺), 412/414 (63/19), 280/282 (15/5), 227 (100), 195 (63), 91 (98); EIMS rezoluție mare m/z 638,2764 (calculat pentru C35H43CIN2O7, eroare -0,5mmu), 412,1516 (calculat pentru C20H27CINO6, 1,1 mmu), 227,1293 (calculat pentru C15H17NO, eroare 1,0 mmu). ¹H RMN (CDCI3): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului multiplicitatea; J în Hz) acid 5-hidroxi-6-metil-2, 7 octandienoic (A) 5,77 (2, d; 15,5), 6,68 (3, ddd; 15,5, 9,5 și 5,3), 2,37 (4, m), 2,54 (4, m), 5,01 (5, ddd; 11,4, 6 și 1,5),

2,56 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 7,0),

6,01 (7, dd; 15,8 și 8,8), 6,41 (8, d; 15,8), 7,28-7,34 (10/11/13/14, m), 7,23 (12, m); acid leucic (D) 4,84 (2, dd; 10,1 și 3,6), 1,62 (3, m), 1,36 (3, m), 1,62 (4, m), 0,77 (5, d; 6,5), 0,73

2330

2335

2340

2345

2350

2355

2360

2365

2370

2375

RO 118931 Β1 (4-Me, d; 6,6); acid 3-amino-2-metil-propionic (C) 2,71 (2, m), 1,22 (2-Me, d; 7,3), 3,28 (3, dt; 13,5 și 7,0), 3,50 (3, ddd; 13,5, 4,9 și 4), 6,93 (3-NH, brt; 6,3); 3-clor-4- methoxifenilalanină (B) 4,82 (2, m), 5,64 (2-NH, d; 8,8), 3,05 (3, dd; 14,5 și 7,0), 3,13 (3, dd; 14,5 și 5,5),

7,22 (5, d; 2,2), 3,87 (7-OCH3, s), 6,84 (8, d; 8,5), 7,08 (9, dd; 8,5 și 2,2), ¹³C RMN(CDC1₃):

unitate δ (poziția carbonului) A 165,4 (1), 125,2 (2), 141,4 (3), 36,5 (4), 77,1(5), 42,3 (6),

17.3 (6-Me), 130,1(7), 130,0 (8), 136,7 (9), 126,1 (10/14), 128,6 (11/13), 128,4 (12); D 170,1(1), 71,6 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 21,2 (5), 22,7 (4-Me); C 175,6 (1), 38,3 (2), 14,0 (2-Me), 41,2 (3); B 170,9 (1), 53,5 (2), 35,1(3), 129,8 (4), 131,0 (5), 122,4 (6), 154,0 (7), 56,1 (7-OCH₃), 112,2 (8), 127,6 (9).

Criptoficină 4 [a]_D+36,7°(MeOH, c 1,93); UV A_max(e) 206 (41.800), 228 (25.000), 240 (21,200), 248 (22.500), 280 (3.000), 290 (1.230); CD [θ]_Ρ05 +63.900, [θ]₂₁₁ +3.040, [θ]₂₁₈ -710.900, [θ]^11.700, [θ]₂₃₄ -130,[θ]₂₅₂ +47.500, [θ]₂₇₀ + 5.400. IR (CHCI₃) v_max 3410, 2962,2917, 1741, 1718,1678,1511,1251 cm-1, EIMS m/z (intensitate relativă) 604 (2, M⁺), 378 (74), 246 (11), 227 (46), 161 (100), 91 (96); EIMS rezoluție mare m/z 604,3127 (calculat pentru CggH^NgO^ eroare 2,2 mmu), 378,1910 (calculat pentru C20H28NO6, eroare 0,7 mmu), 227,1293 (calculat pentru C15H17NO, 1,7 mmu) 161,0605 (calculat pentru C10H9O2, 0,2). ¹H RMN (CDCI3): unitate δ de amino sau hidroxi acid (poziția carbonului, multiplicarea; J în Hz) acid 5-hidroxi- 6metil-8-fenil-2,7-octandienoic (A) 5,74 (2, dd; 15,3 și 1,2), 6,71 (3, ddd; 15,3,10,3 și 5,0), 2,37 (4, m), 2,53 (4, m), 5,03 (5, ddd; 11,2, 6,4 și 2,0), 2,55 (6, m), 1,13 (6-Me, d; 6,8), 6,01 (7, dd; 15,8 și 8,8), 6,40 (8, d; 15,8), 7,28-7,37 (10/11/13/14, m), 7,22 (12, m); acid leucic (D) 4,84 (2, dd; 10,1 și 3,6), 1,34 (3, m), 1,65 (4, m), 0,75 (5, d; 6,5), 0,72 (4-Me, d; 6,3); acid 3amino-2-metil-propionic (C) 2,69 (2, m), 1,22(2-Me, d; 7,5), 3,39 (3-H2, m), 7,03 (3-NH, brt; 6,0);O-metiltirosină (B) 4,79 (2, m), 5,61 (2-NH, d; 7,8), 3,08 (3, dd; 14,5 și 7,0), 3,13 (3, dd; 14,5 și 5,3), 7,11 (5/9, d; 8,8), 6,81 (6/8, d; 8,8), 3,78 (7-OCH₃, s), ¹³C RMN (CDCI₃): unitate δ (poziția carbonului) A 165,3 (1), 125,1 (2), 141,5 (3), 36,5 (4), 77,1(5),

42.3 (6), 17,3 (6-Me), 130,1(7), 131,8 (8), 136,7 (9), 126,2 (10/14), 128,7 (11/13), 127,6 (12); D 170,8 (1), 71,6 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 21,2 (5), 22,7 (4-Me); C 175,9 (1), 38,2 (2), 14,2 (2-Me), 40,9 (3); B 171,2 (1), 53,8 (2), 35,3 (3), 131,0 (4), 130,2 (5/9), 114,1(6/8), 158,6 (7),

55,2 (7-OCH₃).

Criptoficină 5 [a]_o+36,0°(MeOH, c 0,55); UV Ă_max(s) 206 (45.600), 218 (37.700), 280 (3,790), 286 (48500), 325 (2.080); CD [θ]₂₀₃ + 7.710, [θ]^ + 29.000, [θ]₂₁₀ + 21.400, [θ]^ + 59.800, [θ^ + 12.800, [θ]₂₄₁ + 13.700,IR (CHCI₃) v_max 3426, 2958, 1728, 1672, 1502, 1259 cm'¹, EIMS m/z (intensitate relativă) 686/688 (0,1510/05), 655/657 (1/0,3), 654/656 (1,5/0,5), 311/313 (75/27), 195 (66), 155 (54), 121 (51), 91(100); EIMS rezoluție mare m/z 686,2983 (calculat pentru C36H47CIN209, eroare -1,3mmu), ¹H RMN (CDCI3): unitate δ amino sau hidroxiacid (poziția carbonului multiplicitatea; J in Hz) acid 7,8-epoxi-5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2-octenoic acid (A) 5,87 (2, d; 15,3), 6,72 (3, dt; 15,3 și 6,8), 2,60 (4, m), 2,52 (4, ddd; 15,2, 7,8, și 6,8), 5,11 (5, ddd; 12,3, 7,8, și 7,1), 1,87 (6, m), 1,12 (6-Me, d; 7,1), 2,91 (7, dd; 7,3 și 2,1), 3,70 (8, d; 2,1), 7,24 (10/14, brd; 7,4), 7,29-7,36 (11/12/13, m); leucic acid (D) 4,09 (2, m), 2,86 (2-OH, brd, 6,1), 1,83 (3, m), 1,42 (3, m), 1,86 (4, m), 0,90 (5, d; 6,6), 0,87 (4-Me, d; 6,8); 3-amino-2-metil-propionic acid (C) 3,64 (1-OCH₃, s), 2,60 (2, m), 1,07 (2-Me, d; 7,3), 3,27 (3, ddd; 13,5, 8,0 și 5,5), 3,39 (3, m), 6,32 (3-NH, t; 5,4); 3-clor-4metoxifenilalanină (B) 4,59 (2, dt; 6 și 7,5), 6,30 (2-NH, d; 7,5), 2,95 (3, dd; 13,6 și 7,5), 3,0 (3, dd; 13,6 și 6,0), 7,2 (5, d; 2,1), 3,86 (7-OCH₃, s), 6,84 (8, d; 8,5), 7,05 (9, dd, 8,5; 2,1), ¹³C RMN (CDCI₃): unitate δ (poziția carbonului) A 164,8 (1), 126,5 (2), 139,2 (3), 34,4 (4),

75,5 (5), 39,2 (6), 12,9 (6-Me), 63,3 (7), 58,7 (8), 136,8 (9), 125,7 (10/14), 128,6 (11/13),

128.4 (12); D 175,1(1), 69,2 (2), 43,2 (3), 24,3 (4), 21,2 (5), 23,2 (4-Me); C 175,4 (1), 51,9 (l-OMe), 39,1(2), 14,7 (2-Me), 41,6 (3); B 170,6 (1), 54,6 (2), 37,4 (3), 129,5 (4), 131,0 (5),

122.4 (6), 154,1 (7), 56,1 (7-OMe), 112,2 (8), 128,4 (9).

RO 118931 Β1

Criptoficină 6 [a]_D+17,1°(MeOH, c 1,1); UV A_max(e) 206 (40.000), 218 (30.100), 228 (21,400), 282 (2.430); CD [0]_2o3 +37.700, [θ]₂₁₀ -5,430,[θ]₂₁₃ -1.260, [θ]₂₂₁ +24.100, [θ]₂₃₂ +8.480, [θ]₂₄₀+13.400, [θ]₂₅₄, +790. IR (CHCQ v_max 3425, 3006, 2956, 1726, 1672, 1641, 1502,1462,1259 cm'¹. FABMS (tioglicerină) m/z, (intensitate relativă) 573/575 (13/6) (M-H2O]⁺, 217 (26), 91 (100), ¹H RMN(CDCI3): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 5,7,8-trihidroxi- 6-metil -8- fenil-2-octenoic acid (A) 5,92 (2, dt; 15,0 și 1,5), 6,94 (3, dt; 15 și 7,5), 2,51 (4, m), 2,64 (4, m), 3,97 (5, ddd; 9,3, 6,5 și 4,5), 2,03 (6, m), 1,10 (6-Me, d; 6,5), 3,70 (7, dd; 9,0 și 7,5), 4,64 (8, d; 7,5), 7,33-7,39 (10/11/13/14, m), 7,28 (12, temperatură de topire; 6,5 și 2,0); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,60 (2, td; 8,0 și 6,0), 6,09 (2-NH, brd; 8,0), 2,96 (3, dd; 13,8 și 8,0), 3,02 (3, dd; 13,8 și 6,0), 7,22 (5, d; 2,0), 3,86 (7-OCH₃, s), 6,84 (8, d; 8,5), 7,07 (9, dd; 8,5 și 2,0); acid 3-amino-2-metil-propionic (C) 3,63 (l-OCH₃, s), 2,58 (2, m), 1,07 (2-Me, d; 7,0), 3,24 (3, ddd; 13,8, 8 și 6,5), 3,41 (3, ddd; 13,8,

6.5 și 4,8), 6,21 (3-NH, brt; 6,5), ¹³C RMN (CDCI₃): unitate δ (poziția carbonului) A 165,2 (1),

125,6 (2), 141,3 (3), 36,9 (4), 82,5 (5), 46,3 (6), 14,3 (6-Me), 85,1(7), 84,8 (8), 140,9 (9), 125,8 (11/13), 127,8 (12); B 170,6 (1), 54,5 (2), 37,3 (3), 129,6 (4), 131,0 (5), 122,5 (6), 154,1 (7), 56,1 (7-OCH₃), 112,2 (8), 128,5 (9) C 52,0 (1-OCH₃), 175,4 (1), 39,2 (2), 14,7 (2-Me), 41,6 (3).

Criptoficină 7 [a]_D+51,9°(MeOH, c 0,89); UV Ă_max(e) 206 (23.400), 220 (14.900), 282 (1,680); CD [0)202 +35.400, [θ]₂₀₆ -1,730,[θ]₂₁₁ -19.200, [θ]^ -15.800, [θ]₂₃₂ +29.000, [θ]₂₆₃ +2.040, IR (CHCI₃) v_max, 3426, 2946, 1732, 1675, 1501, 1258 cm'¹,EIMS m/z (intensitate relativă) 455/457 (1/0,3, [M-2H2O]⁺), 105 (100), 77 (98); FABMS m/z (matrice magică) 496/498 [M-H2O+Na]⁺, (matrice tioglicerină) 474/476 [M-H2O+H]⁺, ¹H RMN (CD3OD): unitate a de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea;J în Hz) 5, 7,8 trihidroxi-6- metil-8fenil-2-octenoic (A) 6,06 (2, ddd; 15,5,1,3 și 1,0), 6,80 (3, dt; 15,5 și 7,5), 2,49 (4, m), 2,59 (4, m), 3,92 (5, ddd; 9,5, 6,3 și 4,7), 1,95 (6, m), 1,08 (6-Me, d; 6,7), 3,59 (7, dd; 9,0 și 7,8),

4,56 (8, d; 7,8), 7,37 (10/14, brd; 7,3), 7,31 (11/13, brt; 7,3), 7,24 (12, temperatura de topire;

7,3 și 1,5); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,52 (2, dd; 6,9 și 5,0), 2,93 (3, dd; 13,8 și 6,9), 3,15 (3, dd; 13,8 și 5,0), 7,20 (5, d; 2,2), 3,78 (7-OCH₃, s), 6,88 (8, d; 8,4), 7,08 (9, dd; 8,4 și 2,2), ¹³C RMN (CD₃OD): unitate δ (poziția carbonului) A 167,4 (1), 127,6 (2), 140,9 (3),

37,9 (4), 84,0 (5), 47,6 (6), 14,4 (6-Me), 86,0 (7), 85,8 (8), 142,9 (9), 127,1(10/14), 129,3 (11/13), 128,5 (12);B 177,6 (1), 57,3 (2), 38,2 (3), 132,8 (4), 132,1(5), 122,9 (6), 155,0 (7),

56.5 (7-OCH₃), 113,2 (8),m 130,1(9).

Criptoficină 16 [a]_D+41,3°(MeOH, c 5,2); UV (ε) 242 (4963), 280 (2430), 286 (2212); IR (rețea) v_max, 3402, 3270, 2960,1748,1724,1676,1514,1466,1343,1239,1177 cm’¹; EIMS m/z (intensitate relativă) 640/642 (66/27), 398/400 (47/16), 265 (55), 227 (93), 181 (100); EIMS rezoluție mare m/z 640, 25676 (calculat pentru C₃₄H₄₁CIN₂O₈, eroare -1,6 mmu). Ή RMN (CDCI₃): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 7,8-epoxi-5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2-octenoic (A) 5,74 (2, d; 16), 6,67 (3, ddd; 15,3, 9,7 și

5,5), 2,45 (4, dt; 14,3 și 10,4), 2,55 (4, brdd; 14,3 și 5,3), 5,15 (5, ddd; 11,2, 4,8 și 1,8), 1,8 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 7,0), 2,92 (7, dd; 7,5 și 2,0), 3,69 (8, d; 2,0), 7,24-7,26 (10/14, m), 7,33-7,39 (11/12/13, m); 3-clor-4- hidroxifenilalanină (B) 4,8 (2, m), 5,64 (2-NH, d; 8,8), 3,03 (3, dd; 14,5 și 7,0), 3,11 (3, dd; 14,4 și 5,6), 7,17 (5, d; 2,2), 5,61(7-OH, s), 6,91 (8, d; 8,3), 7,0 (9, dd; 8,3 și 2,2); acid 3-amino-2-metil-propionic (C) 2,71 (2, m), 1,22 (2-Me, d; 7,3), 3,28 (3, dt; 13,6, 5 și 4,1), 6,92, (3-NH, brt; 6,1); acid leucic (D) 4,83 (2, dd; 10,1 și 3,3), 1,36 (3, m), 1,67-1,75 (4, m), 1,67-1,75 (4, m), 0,85 (5, d; 7,5), 0,86 (4-Me, d; 6,8), ¹³C RMN (CDCI₃) unitate δ (poziția carbonului) A 165,3 (1), 125,3 (2), 141,0 (3), 36,7 (4), 76,2 (5),

2430

2435

2440

2445

2450

2455

2460

2465

2470

2475

RO 118931 Β1

40.6 (6), 13,5 (6-Me), 63,0 (7), 59,0 (8), 136,8 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,6 (12); Β 170,9 (1), 53,6 (2), 35,1(3), 129,9 (4), 129,6 (5), 120,0 (6), 150,4 (7), 116,4 (8), 129,2 (9); C 175,6 (1), 38,3 (2), 14,1(2-Me), 41,1(3); D 170,8 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,6 (4), 21,3 (5),

22,9 (4-Me).

Criptoficină 17 [a]_D+27,8°(CHCI₃ c 0,37); UV A_max (ε) 248 (14740), 268 (8100), 278 (3400), 284 (2840); IR (rețea) v_max, 3412, 2958, 1750, 1723, 1668, 1504, 1463, 1290, 1177, 751 cm'; EIMS m/z (intensitate relativă) 624/626 (10/3), 398/400 (95/35), 284 (100), 149 (95); EIMS rezoluție mare m/z 624,26161 (calculat pentru C^H^.CINgOy, eroare -1,4 mmu), ¹H RMN (CDCI3): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului multiplicitatea; J în Hz) 5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2,7-octadienoic (A) 5,77 (2, d; 15,4), 6,67 (3, ddd; 15,4,9,5, și 5,3), 2,37 (4, m ), 4,99 (5, ddd; 11,2, 6,3, și 1,6), 2,54 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 6,7), 6,01 (7, dd; 15,7, și 8,7), 6,41 (8, d; 15,9), 7,28-7,34 (10/11/13/14, m), 7,23 (12, m); 3-clor-4-hidroxifenilalanină (B) 4,82 (2, m), 5,63 (2-NH, d; 8,7), 3,12 (3, dd; 14,7, și 5,6), 3,03 (3', dd; 14,7, și 7,1), 7,18 (5, d; 2,0), 5,47 (7-OH, br s), 6,91 (8, d; 8,3), 7,02 (9, dd; 8,3, și 2,0); 3-amino-2-metil-propionic acid (C) 2,71 (2, m), 1,21 (2-Me, d'; 6,9), 3,25 (3, m), 3,52 (3‘, m), 6,89 (3-NH, br r; 6,1); acid leucic (D) 4,84 (2, dd; 9,6, și 3,1), 1,62 (3, m), 1,36 (3‘, m), 1,62 (4, m), 0,77 (5, d' 6,5), 0,73 (4-Me, d; 6,5); ¹³C RMN (CDCI3) unitate δ (poziția carbonului) A 165,4 (1), 125,3 (2), 141,3 (3), 36,5 (4), 77,1 (5), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,0 (7), 129,9 (8), 136,7 (9), 126,2 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12); B 170,9 (1), 53,5 (2), 35,1(3), 129,6 (4), 131,9 (5), 126,2 (6), 150,3 (7), 116,3 (8), 127,6 (9); C 175,9 (1), 38,4 (2), 13,9 (2-Me), 41,3 (3); D 170,9 (1),

71.6 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 21,2 (5), 22,7 (4-Me).

Criptoficină 18 [a]_D+54,9°(MeOH, c 0,93); UV Ă_max (ε) 250 (20518), 284 (3857); IR (rețea) v_max 3411, 3271,2966,1746,1728,1668,1505,1463,1258,1178 cm-1; EIMS m/z (intensitate relativă) 638/640 (4,5/1,1), 412/414 (59/19), 280(17), 227 (100); EIMS rezoluție mare m/z 638, 272934 (calculat pentru C₃₅H₄₃CIN₂07, eroare 2,9 mmu), ¹H RMN (CDCIj): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 5-hidroxi-6-metil-8-fenil- 2,7octandienoic (A) 5,76 (2, d; 15,5), 6,65 (3, ddd; 15,4, 9,2 și 6,2), 2,38-2,47 (4, m), 5,08 (5, ddd; 10,6, 4,9 și 2,2), 2,58 (6, m), 1,15 (6-Me, d; 6,8), 6,07 (7, dd; 15,9 și 8,5), 6,43 (8, d; 15,9), 7,21-7,35 (10/11/12/13/14, m); 3- clor-4- metoxifenilalanină (B) 4,83 (2, m), 3,05(3, dd; 14,5 și 7,1), 5,65 (2-NH, d; 8,7), 3,14 (3, dd; 14,4 și 5,5), 7,21 (5, d; 2,4), 3,86 (7-OCH3, s), 6,83 (8, d; 8,3), 7,08 (9, dd; 8,3 și 2,2); acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,73 (2, m), 1,23 (2-Me, d; 7,2), 3,23 (3, dt; 13,5 și 6,8), 3,56 (3, ddd; 13,5, 5,7 și 4,0), 6,85 (3-NH, dd; 7,1 și 6,2); acid leucic (D) 4,8 (2, d; 4,6), 1,86-1,89 (3, m), 0,94 (3-Me, d; 7,0), 1,20-1,26 (4, m), 1,39-1,44 (4, m), 0,77 (5, d; 7,4), ¹³C RMN (CDCI3) unitate δ (poziția carbonului) A 165,5 (1), 125,2 (2), 141,5 (3), 36,4 (4), 77,7 (5), 41,9 (6), 17,1 (6-Me), 129,8 (7), 131,9 (8), 136,8 (9), 128,6 (10/14), 126,2 (11/13), 127,6 (12); B 170,0 (1), 53,5 (2), 35,1(3), 129,9 (4), 131,1(5), 122,4 (6), 153,9 (7), 56,1 (7-OCH₃), 112,2 (8), 128,5 (9); C 175,3 (1), 38,6 (2), 14,0 (2-Me), 41,4 (3); D 169,5 (1), 76,6 (2), 36,2 (3), 15,5 (3-Me), 24,2 (4), 14,0 (5),

Criptoficină 19 [a]_D+62,6°(MeOH, c 0,67); UV Ă_max (ε) 204 (44900), 230 (17000), 248 (15600), 280 (2500); IR (rețea) v_max3413, 3272, 2966,1745,1726,1672,1504,1258,1199,1178,1066, 692 cm¹. EIMS m/z (intensitate relativă) 624/626 (3,0/1,4), 398/400 (58/21), 280/282(15/5), 227 (100), 195/197 (57/22); EIMS rezoluție mare m/z 624,2585 (calculat pentru C^H^, CINgOy, 1,8 eroare mmu). ¹H-RMN (CDClj):unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J in Hz) 5-hidroxi-6-metil-8- fenil-2,7-octadienoic acid (A) 5,76 (2, d; 15,2), 6,64 (3, ddd; 15,4, 9,1 și 6,2), 2,38 (4, m), 2,47 (4, m), 5,04 (5, ddd;7,1, 5,1 și 1,8),

2,57 (6, m), 1,15 (6-Me, d; 6,9), 6,05 (7, dd; 15,8 și 8,5), 6,43 (8, d; 15,8), 7,29-7,35

RO 118931 Β1 (10/11/13/14, m), 7,23 (12, m); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,84 (2, m), 5,67 (2-NH, d; 8, 9), 3,04(3, dd; 14,3 și 7,1), 3,14 (3, dd; 14,3 și 5,3), 7,22 (5, d; 2,0), 3,86 (7-OCH₃, s), 6,83 (8, d; 8,2), 7,08 (9, dd; 8,2 și 2,0); acid 3-amino-2-metil-propionic (C) 2,75 (2, m), 1,23 (2-Me, d; 7,1), 3,19 (3, m), 3,59 (3, m), 6,80 (3-NH, brt; 6,7);

acid 2-hidroxiizovaleric (D) 4,73 (2, d; 4,2), 2,09 (3, m), 0,84 (4, d; 6,9), 0,95 (3-Me, d; 6,9), ¹³C RMN (CDCIg) unitate δ (poziția carbonului) A 165,5 (1), 125,3 (2), 141,3 (3), 36,3 (4),

77,7 (5), 42,0 (6), 17,1 (6 Me), 129,9 (7), 131,9 (8), 136,8 (9), 126,1 (10/14), 128,6 (11/13),

127.6 (12); B 171,0 (1), 53,4 (2), 35,1(3), 130,0 (4), 131,1(5), 122,4 (6), 153,9 (7), 56,1 (7-OMe), 112,2 (8), 128,5 (9); C 175,1 (1), 38,7 (2), 13,9 (2-Me), 41,5 (3), D 169,6 (1), 76,9 (2), 29,8 (3), 19,0 (4), 16,7 (3-Me).

Criptoficină 21 [a]_D+40,2°(CHCI, c 0,72); UV (ε) 240 (6700), 288 (2100), 288 (2100); IR (rețea) v_max3403, 3279, 2957,1731,1673,1503,1464,1409, 1372, 1258,1174,1065,1023, 889 cm'¹; EIMS m/z (intensitate relativă) 640/642 (10/4), 612 (5), 478 (15), 398 (40), 266 (33), 227 (76), 195 (95), 155 (100), 127 (90); EIMS rezoluție mare m/z 640,2550 (calculat pentru C^H^.CI^og, eroare 0,2 mmu eroare); Ή RMN (CDCI₃) unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 7,8-epoxi-5-hidroxi-6-metil-8-feniloctanoic acid (A) 5,73 (2, d; 15,4), 6,68 (3, ddd; 15,0, 9,9 și 4,9), 2,45 (4, m), 2,56 (4, m), 5,19 (5, ddd; 11,2,5,1 și 1,5), 1,80 (6, m), 1,14 (6-Me, d;7,1), 2,92 (7, dd; 7,5 și 2,0), 3,68(8, d; 1,8), 7,25 (10/14, m), 7,33-7,38 (11/12/13, m); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B )4,74 (2, ddd; 8,2,

6.8 și 6,2), 5,68 (2-NH, d; 8,6), 2,98 (3, dd; 14,3 și 7,7), 3,14 (3, dd; 14,3 și 5,6), 7,21 (5, d; 2,0), 3,86 (7-OMe, s), 6,83 (8, d; 8,4), 7,07 (9, dd; 8,4 și 2,0); acid 3-aminopropionic (C ) 2,56 (2, m), 3,51 (3, m), 3,45 (3, m), 6,90 (3-NH, br t; 5,8); leucic acid (D)4,89 (2, dd; 10,0 și 3,3), 1,67 (3, m), 1,31 (3, m), 1,67 (4, m), 0,84 (5, d; 6,4), 0,83 (4-Me, d; 6,4); ¹³C RMN (CDCI₃): unitate δ (poziția carbonului) A 165,5 (1), 125,3 (2), 141,0 (3), 36,7 (4), 75,9 (5),

40.6 (6-Me), 13,5 (6-Me), 63,0 (7), 59,0 (8), 136,7 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,5 (12); B 170,7 (1), 53,9 (2), 35,0 (3), 129,8 (4), 130,9 (5), 122,4 (6), 153,9 (7), 56,1(7 OMe),

112.2 (8), 128,3 (9); C 172,6 (1), 32,4 (2), 34,4 (3), D 170,5 (1), 71,2 (2), 39,5 (3), 24,4 (4),

22.8 (5),21,2 (4-Me).

Criptoficină 23 [a]_D+47°(MeOH, c 1,55); UV Ă_max (ε) 240 (4571), 282 (2174); IR (rețea) v_max 3284, 2960,1747,1724,1653,1540,1490,1339,1272,1174 cm’¹; EIMS m/z (intensitate relativă) 674/675/678 (47/35/8), 432/434/436 (11/5/2), 299/301/303(39/30/7), 227 (64), 215/217/219 (31/20/8), 141 (100); EIMS rezoluție mare m/z 674,21643 (calculat pentru C^H^I^NgOe, eroare -0,3 mmu). ¹H RMN (CDCI₃) unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului multiplicitatea; J in Hz) acid 7,8-epoxi-5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2-octenoic acid (A) 5,77 (2, d; 15,4), 6,65 (3, ddd; 15,4, 9,3 și 6,0), 2,47 (4, dt;

14.2 și 10,2), 2,55 (4, br dd; 14,2 și 5,6), 5,13 (5, ddd; 11,0, 4,6 și 1,6), 1,81 (6, m), 1,15 (6-Me, d; 6,9), 2,93 (7, dd; 7,6 și 2,0), 3,7 (8, d; 2,0), 7,22-7,26 (10/14, m), 7,32-7,39 (11/12/13, m); 3,5-diclor-4-hidroxifenilalanină (B) 4,81(2, m), 5,69 (2-NH, d; 8,6), 3,11 (3, dd; 14,5 și 5,6), 3,50 (3, dd; 14,3 și 7,0), 7,13 (5/9, s), 5,78 (7-OH, s); acid 3-amino-2- metilpropionic id (C) 2,73 (2, m), 1,22 (2-Me, d; 7,1), 3,19 (3, dt; 13,4 și 6,9), 3,58 (3, ddd; 13,6, 5,8 și 4,1), acid leucic (D) 4,84 (2, dd; 9,9 și 3,2), 1,38 (3, m), 1,68-1,75 (3, m), 1,68-1,75 (4, m), 0,86 (4-Me, d; 6,7), 0,87 (5, d; 6,7), ¹³C RMN (CDCI₃) unitate δ (poziția carbonului) A 165,4 (1) , 125,4 (2), 140,9 (3), 36,7 (4), 76,3 (5), 40,6 (6), 13,5 (6-Me), 63,0 (7), 58,9 (8), 136,7 (9),

125.6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,6 (12); B 170,7 (1), 53,3 (2), 35,0 (3), 130,3 (4), 129,0 (5/9), 121,0 (6/8), 146,7 (7); C 175,3 (1), 38,4 (2), 13,9 (2-Me), 41,5 (3); D 170,8 (1), 71,3 (2) , 39,4 (3), 24,6 (4), 21,3 (4-Me), 22,9 (5).

2525

2530

2535

2540

2545

2550

2555

2560

2565

2570

RO 118931 Β1

Criptoficină 24 [a]_D+48,8°(CHCI₃, c 0,63); UV (ε) 228 (19006), 242 (8249), 274 (2351); IR (rețea) v_max 3400, 3284, 2959, 1732, 1678, 1652, 1514, 1248, 1178 cm’¹; EIMS m/z (intensitate relativă) 606 (2, M⁺), 364 (7), 161(55, CH3O-C6H4-CH=CH=CO+), 121 (100, CH3O- C6H4CH2⁺), 91 (68); EIMS rezoluție mare m/z 606,2954 (calculat pentru C34H₄₂N₂O₈, eroare -1,3 mmu); Ή RMN (CDCI₃) unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 7,8-epoxi-5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2-octenoic (A) 5,70 (2, dd; 15,2 și 1,3), 6,70 (3, ddd; 15,2, 10,3 și 4,7), 2,43 (4, dt; 14,3 și 10,9), 2,56 (4, m), 5,20 (5, ddd; 11,3, 5,1 și 2,0), 1,79 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 7,0), 2,92 (7, dd; 7,5 și 2,0), 3,68 (8, d; 2,0), 7,23 -7,38 (10/11/12/13/14, m); O-metiltirosină (B) 4,73 (2, m), 5,58 (2-NH, d; 8,3), 3,03 (3, dd; 14,5 și

7,5), 3,14 (3, dd; 14,5 și 5,7), 7,11 (5/9, d; 8,6), 6,81 (6/8, d; 8,6), 3,78 (7-OMe, s); acid 3-aminopropionic (C) 2,55 (2-H₂, m), 3,42 (3, m), 3,53 (3, m), 6,97 (3-NH, br t; 5,7); acid leucic (D) 4,89 (2, dd; 9,9 și 3,5), 1,29 (3, m), 1,62 - 1,70 (3/4, m), 0,83 (5, d; 5,9), 0,84 (4-Me, d; 6,1); ¹³C RMN (CDCI₃): unitate δ (poziția carbonului) A 165,4 (1), 125,3 (2), 141,0 (3) , 36,7 (4), 75,9 (5), 40,6 (6), 13,4 (6-Me), 63,0 (7), 59,0 (8), 136,7 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,5 (12); B 170,7 sau 170,6 (1), 54,1 (2), 35,2 (3), 128,5 (4), 130,2 (5/9), 114,1(6/8), 158,6 (7),

55.2 (7-OMe); C 172,8 (1), 32,5 (2), 34,2 (3); D 170,6 sau 170,7 (1), 71,2 (2), 39,5 (3), 24,4 (4) ,21,3 (5), 22,8 (4-Me).

Criptoficină 26 [a]_D+28,2°(CHCI₃ c 1,31); UV (ε) 254 (14615), 284 (2949); IR (rețea) v^ 3299, 2960,1732,1644,1504,1258,1209 cm'; EIMS m/z (intensitate relativă) 656/658 (0,5/0,1, M⁺), 638/640 (1,7/1,0), 525/527 (3,7/1,8), 412/414 (10/4), 280/282 (12/11), 227 (20), 195 (48), 131 (68); EIMS rezoluție mare m/z 656,2836 (calculat pentru C35H45CIN2O8, eroare 2,8 mmu), 638,2712 (calculat pentru C35H43CIN2O7, eroare 4,7 mmu); ¹H RMN (CDCI3) unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului multiplicitatea; J in Hz) acid 3,5-dihidroxi-6metil-8-fenil-7-octenoic acid (A) 2,46 (2, dd; 14,8 și 7,8), 2,58 (2, dd; 14,8 și 3,0), 5,46 (3, m), 1,86-1,90 (4-H₂, m), 3,61 (5, m), 2,37 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 6,8), 7,06 (7, dd; 16 și 8,7), 6,47 (8, d; 16), 7,37 (10/14, brd; 7,9), 7,32 (11/13, brt; 7,6), 7,22 - 7,28 (12, m); 3-clor-4methoxifenilalanină (B) 4,73 (2, br dt; 6,4 și 8,1), 6,14 (2-NH, d; 8,6), 2,84 (3, dd; 14,4 și 8), 3,18 (3, dd; 14,4 și 6,3), 7,21 (5, d; 2,2), 3,85 (7-OMe, s), 6,82 (8, d; 8,6), 7,08 (9, dd; 8,6 și 2,2); acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,87 (2, m), 1,19 (2-Me, d; 7,0), 3,01 (3, ddd; 13,4,

10,6 și 4,9), 3,73 (3, ddd; 13,4, 8,2 și 4,7), 6,72 (3-NH, brdd; 7,3 și 5,2); acid leucic (D) 4,95 (2, dd; 9,7 și 4,2), 1,62 - 1,72 (3, m), 1,79 - 1,84 (3, m), 1,62 - 1,72 (4, m), 0,90 (4-Me, d; 6,4), 0,95 (5, d; 6,4), ¹³C RMN (CDCI₃): unitate δ (poziția carbonului) A 170,0 (1), 41,5 (2),

71.4 (3), 37,3 (4), 71,9 sau 71,8 (5), 43,6 (6), 16,6 (6-Me), 130,8 (7), 132,5 (8), 136,8 (9),

126.2 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12); B 170,9 (1), 53,2 (2), 34,7 (3), 130,3 (4), 131,1(5), 122,2(6), 153,8 (7),56,1 (7-OMe), 112,2 (8), 128,5 (9); C 174,3 (1), 40,1 (2), 14,4 (2-Me),

42.5 (3); D 170,7 (1), 71,8 sau 71,9 (2), 38,9 (3), 24,6 (4), 21,6 (4-Me), 22,9 (5).

Criptoficină 28 [a]_D+65,6°(MeOH c 0,93); UV(MeOH) (ε) 204 (48000), 230 (19300), 248 (18700), 280 (3400); IR (rețea) v_max 3413, 3270, 2958, 1745, 1726, 1665, 1504, 1258, 1197, 1175, 1066, 694 cm '; EIMS m/z (intensitate relativă) 624/626 (3,0/1,3), 412/414 (70/24), 280/ 282(13/6), 213 (100), 195/197 (86/40); EIMS rezoluție mare m/z 624,2626 (calculat pentru COCINA, eroare -2,4 mmu); Ή RMN(CDC^): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 5-hidroxi-8-fenil-2,7-octadienoic (A) 5,78 (2, d; 15,6), 6,71(3, ddd; 15,6, 9,9 și 5,4), 2,40 (4, m), 2,53 (4, m), 5,17 (5, m), 2,53 (6-H2, brt; 6,7), 6,07 (7, dt; 15,8 și 7,4), 6,44 (8, d; 15,8), 7,27-7,38 (10/11/13/14, m), 7,22 (12, m); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,82 (2, m), 5,72 (2-NH, d; 8,5), 3,04 (3, dd; 14,5 și 7,2), 3,14

RO 118931 Β1 (3, dd; 14,5 și 5,4), 7,22 (5, d; 2,0), 3,87 (7-OMe, s), 6,84 (8, d; 8,5), 7,08 (9, dd; 8,5 și 2,0); acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,72 (2, m), 1,21 (2-Me, d; 7,2), 3,29 (3, dt; 13,5 și 7,0), 3,49 (3, ddd; 13,5, 4,9 și 3,8), 6,97 (3-NH, br t; 5,6); acid leucic (D) 4,82 (2, m), 1,40 (3, m), 1,62 (3, m), 1,62 (4, m), 0,76 (4-Me, d; 6,3), 0,74 (5, d; 6,3); ¹³C RMN (CDCI₃) unitate δ (poziția carbonului) A 165,4 (1), 125,2 (2), 141,2 (3), 38,5 (4), 73,5 (5), 38,6 (6), 124,1 (7),

133.8 (8), 136,7 (9), 126,1 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12); B 170,9 (1), 53,6 (2), 35,1(3),

129.8 (4), 131,0 (5), 122,4 (6), 154,0 (7), 56,1 (7-OMe), 112,3 (8), 128,4 (9); C 175,6 (1),

38.3 (2), 14,0 (2-Me), 41,2 (3), D 170,9 (1), 71,6 (2), 39,6 (3), 24,5 (4), 21,5 (4-Me), 22,6 (5),

Criptoficină 29 [a]_D+22,2°(CHCI₃ c 1,13); UV (ε) 250 (17000), 284 (3300); IR (rețea) v_max 3415, 3272, 2960, 1744,1734, 1674, 1504, 1259, 1197, 1174, 1067, 694 cm’¹; EIMS m/z (intensitate relativă) 624/626 (2,6/1,1), 398/400 (44/15), 227 (100), 195/197 (50/16), 155/157 (59/20), 131 (63), 91 (95); EIMS rezoluție mare m/z 624,2607(calculat pentru ^Η410ΙΝ2Ο7, eroare -0,5 mmu; ¹H RMN(CDCI3) unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului multiplicitatea; J în Hz) acid 5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2,7- octadienoic (A) 5,75 (2, dd; 15,3 și 1,1), 6,69 (3, ddd; 15,3,10,1 și 5,3), 2,36 (4, m), 2,54 (4, m), 5,03 (5, ddd; 11,0, 6,4 și 1,8), 2,56 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 6,8), 6,01 (7, dd; 15,8 și 8,8), 6,41 (8, d; 15,8), 7,28-7,33 (10/11/13/14, m), 7,22 (12, m); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,76 (2, m), 5,67 (2-NH, d; 8,6), 3,0 (3, dd;

14.4 și 10,2), 3,14 (3, dd; 14,4 și 5,9), 7,22 (5, d; 2,2), 3,87 (7-OMe, s), 6,83 (8, d; 8,4), 7,08 (9, dd; 8,4 și 2,2); acid 3-aminopropionic (C) 2,55 (2-H₂, m), 3,44 (3, m), 3,55 (3, m), 6,89 (3-NH, br t; 5,7); acid leucic (D) 4,90 (2, dd;

9,9 și 3,5), 1,34 (3, ddd; 15,4,10,3 și 3,5), 1,63 (3, m), 1,63 (4, m), 0,76 (4-Me, d; 6,4), 0,72 (5, d; 6,4); ¹³C RMN (CDCI₃) unitate δ (poziția carbonului) A 165,6 (1), 125,2 (2), 141,5 (3), 36,4 (4), 77,1 (5), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,1 (7), 131,8 (8), 136,7 (9), 126,2 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12); B 170,9 (1), 53,8 (2), 34,9 (3), 129,9 (4), 131,0 (5), 122,4 (6), 153,9 (7), 56,1 (7-OMe), 112,2 (8), 128,4 (9); C 172,6 (1), 32,4 (2),

34.5 (3); D 170,4 (1), 71,5 (2), 39,7 (3), 24,4 (4), 21,2 (4-Me), 22,6 (5).

Criptoficină 30 [a]_D-12,3°(CHCI₃ c 1,53); UV A_max (ε) 254 (17200), 284 (3600); IR (rețea) v_max 3414, 3306, 2961,1738,1729,1660,1504,1258,1205, 1183, 1066, 695 cm'¹; EIMS m/z (intensitate relativă) 656/658 (1,0/0,3), 638/640 (3,0/1,0), 525/527 (3,8/1,3), 412/414 (10,5/3,6), 280/282(10,3/3,8), 227 (29), 195/197 (48/17), 155/157 (74/21), 131 (100); EIMS rezoluție mare m/z 656,2852 (calculat pentru CagH^CINpQj, eroare 1,3 mmu eroare); ¹H-RMN (CDCl,) unitate de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea;J în Hz) acid 3,5 dihidroxi-6-metil-8-fenil-7-octenoic (A) 2,25 (2, dd; 16,0 și 9,6), 2,64 (2, brd; 16,0), 3,89 (3, m), 2,51 (3-OH, d; 6,4), 1,77 (4, ddd; 14,3, 9,8 și 2,1), 1,88 (4, ddd; 14,3, 11,3 și 3,8), 4,88 (5, ddd; 11,3, 6,2 și 2,1), 2,53 (6, m), 1,10 (6-Me, d; 6,8), 5,99 (7, dd; 15,9 și 9,0), 6,40 (8, d; 15,9), 7,28-7,33 (10/11/13/14, m), 7,23 (12, m); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,60 (2, m), 6,61(2-NH, d; 8,1), 3,09 (3, dd; 14,2 și 5,6), 3,15 (3, dd; 14,2 și 7,3), 7,22 (5, d; 2,1), 3,86 (7-OMe, s), 6,83 (8, d; 8,3), 7,07 (9, dd; 8,3 și 2,1); 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,67 (2, m), 1,21 (2-Me, d; 7,3), 3,26 (3, ddd; 13,6, 7,3 și 6,4), 3,63 (3, ddd; 13,6, 6,2 și 3,9), 6,75 (3-NH, br t; 6,3); acid leucic (D) 4,83 (2, dd; 9,6, 4,1), 1,42 (3, m), 1,64 (3, m), 1,64 (4, m), 0,79 (4-Me, d; 6,4), 0,76 (5, d; 6,4); Ή RMN(CDCI₃) unitate 6(poziția carbonului) A 171,6 (1), 42,4 (2), 66,0 (3), 41,3 (4), 76,0 (5), 42,0 (6), 17,3 (6-Me), 130,0 (7), 131,9 (8), 136,7 (9), 126,1 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12); B 170,8 (1), 54,3 (2), 35,1(3), 130,1 (4), 131,1(5), 122,2 (6), 153,8 (7), 56,1 (7-OMe), 112,1(8), 128,7 (9); C 175,6 (1), 39,7 (2), 13,8 (2-Me), 41,5 (3), D 171,9 (1), 72,1 (2), 39,1 3), 24,6 (4), 21,4 (4 Me), 22,7 (5).

2625

2630

2635

2640

2645

2650

2655

2660

2665

Criptoficina 31 [a]_D-50,6°(MeOH c 1,31); UV Ă_max(e) 242 (3800), 284 (700); IR(rețea) v_max3412, 3272, 2961, 1745, 1725, 1678, 1537, 1481, 1270, 1196, 1176, 1000, 698 crn¹; EIMS m/z (intensitate relativă) 688/690/692 (1,2/1,0/0,4), 446/448/450 (7,9/6,7/3,1), 314/316/318 (17/11/3), 91 (100); EIMS rezoluție mare m/z 688,2336 (calculat pentru C35H42CI2N2O8, eroare -1,8 mmu); ¹H RMN(CDCI3): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 7,8-epoxi-5-hidroxi-6-metil-8-fenil-7-octenoic acid (A) 5,78 (2, d; 15,5), 6,66 (3, ddd; 15,5, 9,4 și 6,0), 2,47 (4, ddd; 14,1, 10,8 și 9,4), 2,56 (4, m), 5,14 (5, ddd; 10,8, 4,7 și 1,7), 1,82(6, m), 1,15 (6-Me, d; 7,1), 2,93 (7,dd;7,5 și 1,9), 3,70 (8, d; 1,9), 7,24-7,26 (10/14, m), 7,34-7,39 (11/12/13, m); 3,5 diclor-4-metoxifenilalanină (B) 4,83 (2, m), 5,68 (2-NH, d; 9,0), 3,0 (3, dd; 14,4 și 7,3), 3,14 (3, dd; 14,4 și 5,6), 7,16 (5/9, s), 3,87 (7-OMe, s); acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,74 (2, m), 1,22 (2-Me, d; 7,1), 3,20 (3, m),

3,58 (3, ddd; 13,5, 5,6 și 4,1), 6,82 (3-NH, brt; 5,6); acid leucic (D) 4,83 (2, m), 1,38 (3, m), 1,72 (4, m), 1,72 (4, m), 0,87 (4-Me, d; 6,8), 0,86 (5, d; 6,8); ¹³C RMN (CDCI₃) unitate δ (poziția carbonului) A 165,4 (1), 125,4 (2), 141,0 (3), 36,7 (4), 76,3 (5), 40,6 (6), 13,5 (6 Me), 63,0 (7), 58,9 (8), 136,7 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,6 (12); B 170,8 (1), 53,3 (2),

35.2 (3), 129,3 (4), 129,6 (5/9), 134,5 (6/8), 151,2 (7), 60,6 (7-OMe); C 175,3 (1), 38,3 (2),

13,9 (2-CH₃), 41,5 (3), D 170,6 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,6 (4), 22,9 (4-Me), 21,3 (5),

Criptoficina 40 [a]_D-41,6°(CHCI₃, c 0,31); UV Ă_max (ε) 242 (4974), 266 (3911), 274 (3666), 286 (2359), 328 (511); IR (rețea); v_max 3415, 2959,1748, 1723, 1667, 1505,1463, 1289,1176 cm¹. EIMS m/z (intensitate relativă) 640/642 (5/2), 280/282 (7/3), 213 (13), 195/197 (51/17), 155 (29), 141 (32), 121 (28), 91 (100), 69 (47); EIMS rezoluție mare m/z 640,2570 (calculat pentru C34H41CIN2O8, eroare -1,8 mmu eroare); ¹H RMN (CDCI3) unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea;J în Hz) acid 7,8-epoxi-5- hidroxi- 8-fenil- 7-octenoic (A) 5,77(2, d; 15,1), 6,72 (3, ddd; 15,1, 9,7 și 4,9), 2,42 (4, m), 2,58 (4, m), 5,33 (5, m), 1,89 (6, ddd; 12,9, 8,1 și 5,0), 2,13 (6, ddd; 12,9, 9,3 și 5,0), 2,98 (7, ddd; 6,7, 4,5 și 1,9), 3,64 (8, d; 1,9), 7,31-7,39(10/11/13/14,m), 7,22 (12, m); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,83 (2, m), 5,64 (2-NH, d; 8,6), 3,03 (3, dd; 14,3 și 7,5), 3,14 (3, dd; 14,3 și 5,4), 7,21 (5, d; 2,0), 3,87 (7-OMe, s), 6,84 (8, d; 8,3), 7,08 (9, dd; 8,3 și 2,0); acid 3-amino-2-metilpropionic acid (C) 2,72 (2, m), 1,23 (2-Me, d; 7,3), 3,31 (3, dt; 13,8 și 6,9), 3,50 (3, ddd; 13,6, 5,7 și 3,9), 6,96 (3-NH, brt; 6,0); acid leucic (D) 4,85 (2, dd; 6,7, 3,4), 1,42 (3, m), 1,72 (3, m), 1,72 (4, m), 0,86 (4-Me, d, 3,7), 0,87 (5, d, 3,7); ¹³C RMN (CDCI3) unitate δ (poziția carbonului) A

165,3 (1), 125,2 (2), 140,9 (3), 39,0 (4), 72,0 (5), 37,3 (6), 59,0 (7), 58,7 (8), 140,9 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,6 (12); B 170,9 (1), 53,6 (2), 35,1(3), 129,8 (4), 131,0 (5), 122,5 (6), 157,0 (7), 56,1 (7-OMe), 112,3 (8), 128,4 (9); C 175,6 (1), 38,3 (2), 14,1 (2-Me), 41,1(3); D 170,9 (1), 71,4 (2), 39,4 (3), 24,5 (4), 21,5 (4-Me), 22,8 (5).

Criptoficina 43 [a]_D-20°(CHCI₃, c 2); UV (ε) 250 (20512), 282 (4083), 294 (1734); IR (rețea) v_max3400, 2927,1727,1660,1516,1455,1242,1175 cm ’. EIMS m/z (intensitate relativă) 533 (24), 484 (3), 445 (14), 398 (9), 364 (29), 227 (59), 149 (67), 91(100); EIMS rezoluție mare m/z 590,3044 (calculat pentru C^H^N·^, eroare -5,2 mmu eroare); Ή RMN (CDCl,) unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2, 7-octadienoic (A) 5,75 (2, d; 15,3), 6,69 (3, ddd; 15,3, 9,9 și 5,3), 2,37 (4, dt;

14.2 și 10,4), 2,52 (4, m), 5,01 (5, ddd; 11,2, 6,4 și 1,8), 2,55 (6, m), 1,13 (6-Me, d; 6,9), 6,01 (7, dd; 15,8 și 8,9), 6,41 (8, d; 15,8), 7,21-7,34 (10/11/12/13/14, m); 4-metoxifenilalanină (B)

4,80 (2, m), 5,64 (2-NH, d; 8,4), 3,06 (3, dd; 14,5 și 7,2), 3,13 (3, dd; 14,4 și 5,3), 7,06 (5/9, d; 8,4), 6,74 (6/8, d; 8,4); acid 3-amino-2- metilpropionic (C) 2,69 (2, m), 1,22 (2-Me, d; 7,3),

3,33 (3, m), 3,44 (3, dt; 14,0 și 4,7), 7,0 (3-NH, m); acid leucic (D) 4,84 (2, dd; 10,0 și 3,6), i-.

RO 118931 Β1

1,60-1,67 (3, m), 1,35 (3, m), 1,60-1,67 (4, m), 0,76 (5, d; 6,4), 0,73 (4-Me, d; 6,7); ¹³C RMN (CDCIg) unitate δ (poziția carbonului) A 125,2 (2), 141,5 (3), 36,5 (4), 77,5 (5), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,1(7), 131,8 (8), 136,8 (9), 126,2(10/14), 128,6(11/13), 127,6 (12); B 53,8 (2),

35,3 (3),

129,8 (4), 130,5 (5/9), 115,6 (6/8), 154,6 (7); C 38,3 (2), 14,1 (2-Me), 41,0 (3); D 71,6 (2),

39.6 (3), 24,5 (4), 21,2 (5), 22,9 (4-Me). Datorită mărimii mici a probei, nu s-au putut vedea semnalele carbonului carbonilic.

Criptoficină 45 [o]_D-72,0°(MeOH c 1,12); UV Ă_max (ε); 250 (25500), 284 (5300); IR (rețea) v_max 3407, 3239, 2958,1743,1727, 1667, 1538, 1469,1242, 1196,1177, 694 cm¹. EIMS m/z (intensitate relativă) 658/660/662 (2,1/1,4/0,3), 483 (7,6) 432/434/436 (9,5/6,4/1,8), 300/302/304 (8,0/5,5/1,2), 227(100) 91 (87); EIMS rezoluție mare m/z 658,2207 (calculat pentru C^H^C^NgCȚ, eroare 0,6 mmu); Ή RMN (CDCl,): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului multiplicitatea; J în Hz) acid 5-hidroxi-6-metil-8- fenil -2,7-octadienoic (A) 5,80 (2, d; 14,7), 6,66 (3, ddd; 14,7, 8,5 și 5,5), 2,38 (4, m), 2,53 (4, m), 4,97 (5, brdd; 10,4 și 6,2), 2,57 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 6,7), 6,01 (7, dd; 15,9 și 8,7), 6,42 (8, d; 15,9), 7,28-7,34 (10/11/ 13/14, m), 7,22 (12; m); 3,5-diclor-4-hidroxifenilalanină (B) 4,82 (2, m), 5,73 (2-NH, br d; 8,7), 3,02 (3, dd; 14,3 și 6,2), 3,10 (3, dd; 14,3 și 5,2), 7,14 (5/9, s), 5,79 (7-OH, s); acid 3-amino-2 metilpropionic (C) 2,73 (2, m), 1,21 (2-Me, d; 7,0), 3,17 (3, m), 3,60 (3, m),

6,81 (3-NH, brt; 6,7); acid leucic (D) 4,84 (2, dd; 10,0 și 3,2), 1,38 (3, ddd; 14,9,10,2 și 3,2), 1,65 (3, m), 1,65 (4, m), 0,78 (4-Me, d; 6,5), 0,73 (5, d; 6,5); ¹³C RMN (CDCI₃) unitate δ (poziția carbonului) A 165,5 (1), 125,4 (2), 141,2 (3), 36,4 (4), 77,6 (5), 42,3 (6), 17,3 (6-Me), 130,0 (7), 131,9 (8), 136,7 (9), 126,2 (10/14), 128,6 (11/13), 127,6 (12); B 171,0 (1), 53,2 (2), 35,0 (3), 130,4 (4), 129,1 (5/9), 121,0 (6/8), 146,7 (7); C 175,2 (1), 38,5 (2), 13,9 (2-Me),

41.6 (3), D 170,7 (1), 71,5 (2), 39,5 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).

Criptoficină 49 [a]_D -68,1 °(MeOH,c 0,075); UV (ε) 246 (25500), 284 (5200); IR (rețea) v^ 3401, 3282, 2962,1744,1728,1668,1540,1505, 1464,1258,1198,1177,1066, 694 cm'¹. EIMS m/z (intensitate relativă) 624/626 (0,8/0,3), 398/400 (43/14), 227(78), 195/197 (58/26) 91 (100); EIMS rezoluție mare m/z 624,2650 (calculat pentru C34 H₄₎CIN₂O₇, eroare -4,8 mmu); Ή RMN(CDCI₃): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2,7-octadienoic acid (A) 5,77 (2, d; 14,1), 6,67 (3, m), 2,38 (4, m), 2,50 (4, m), 5,01 (5, m), 2,56 (6, m), 1,13 (6-Me, d; 6,5), 6,03 (7, dd; 15,8 și 8,6), 6,42 (8, d; 15,8), 7,29-7,35 (10/11/13/14, m), 7,23 (12; m); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,82 (2, m), 5,64 (2-NH, m), 3,06 (3, m), 3,13 (3, m), 7,22 (5, m), 3,87 (7-OMe, s), 6,83 (8, m), 7,08 (9, m); 3-amino-2-metilpropionic acid (C) 2,72 (2, m), 1,22 (2-Me, d; 6,7), 3,26 (3, m), 3,53 (3, m), 6,90 (3-NH, m); acid 2-hidroxivaleric (D) 4,81 (2, dd; 8,8 și 3,9), 1,63 (3, m), 1,68 (3, m), 1,33 (4-H₂, m), 0,74 (5, t; 7,3).

Criptoficină 50 [a]_D-32,0°(CHCI₃ c 0,44); UV (ε) 242 (4933), 262 (3996, 274 (3719), 286 (2430), 332 (359); IR (rețea) v_max 3412, 3274, 2958, 1752, 1724, 1767, 1648, 1503, 1465, 1258, 1177,1066, 753 cm’¹; EIMS m/z (intensitate relativă) 640/642 (4/2), 398/400 (11/4), 280/282 (10/3), 227 (17), 195/197 (57/18), 157 (20), 141 (31), 91 (100); EIMS rezoluție mare m/z 640, 2531 (calculat, pentru C34 H4,CIN2O8, eroare 2,1 mmu); ¹H RMN (CDCI3) unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J in Hz) acid 78-epoxi-5-hidroxi-6 metil-8-fenil octanoic (A) 5,73 (2, d; 15,7), 6,67 (3, ddd; 15,7, 9,7 și 5,4), 2,45 (4, m), 2,55 (4, m), 5,13 (5, ddd; 11,2, 5,0 și 1,7), 1,78 (6, m), 1,15 (6-Me, d, 6,9), 2,91 (7, dd; 7,5 și 1,9), 3,68 (8, d; 1,7), 7,25 (10/14,m), 7,33-7,38 (11/12/13; m); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,80 (2, ddd; 8,3, 7,1 și 5,4), 5,61 (2-NH, d; 8,3), 3,03 (3, dd; 14,4 și 7,3), 3,13 (3, dd; 14,4 și 5,6),

2720

2725

2730

2735

2740

2745

2750

2755

2760

2765

7,21 (5, d; 1,9), 3,87 (7-OMe, s), 6,83 (8, d; 8,4), 7,07 (9, dd; 8,4 și 2,2); acid 3-amino-2- metilpropionic (C) 2,71 (2, m), 1,22 (2-Me, d; 7,3), 3,29 (3, dt; 13,6 și 6,9), 3,49 (3, ddd; 13,6, 6,7 și 5,0), 6,92 (3-NH, br t; 6,7); acid 2-hydroxypentanoic (D) 4,75 (2, dd; 9,2 și 3,7), 1,55 (3, m), 1,65 (3, m), 1,33 (4-H₂, m), 0,84 (5, t; 7,3); ¹³C RMN (CDCI₃) unitate δ (poziția carbonului) A 165,3 (1), 125,3 (2), 141,0 (3), 36,9 (4), 76,3 (5), 40,8 (6), 13,6 (6-Me), 63,2 (7), 59,1(8), 136,8 (9), 125,5 (10/14), 128,7 (11/13), 128,5 (12); B 170,9 (1), 53,6 (2), 35,1(3),

129,8 (4), 131,0 (5), 122,5 (6), 154,0 (7), 56,1 (7-OMe), 112,3 (8), 128,5 (9); C 175,6 (1),

38,4 (2), 14,1(2-Me), 41,2 (3); D 170,4 (1), 72,4 (2), 32,7 (3), 18,4 (4), 13,5 (5).

Criptoficină 54

EIMS m/z (intensitate relativă) 654/656 (17/10), 493 (5), 411/413 (12/4), 280 (16), 227 (25), 195/197 (45/25), 141 (30), 91(100); EIMS rezoluție mare m/z 654,2686 (calculat pentru C₃₅H₄₃C1N₂Og, 2,2 mmu eroare); ¹H RMN (CDCț): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) (A) 5,73 (2, d; 15,4), 6,66 (3, ddd; 15,4,9,7,5,7), 2,46 (4, m), 2,53 (4, m), 5,16 (5, ddd; 11,0, 4,2,1,7), 1,79 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 6,8), 2,89 (7, dd; 7,4,1,8), 3,69 (8, d; 1,9), 7,25 (10/14, m), 7,30-7,38 (11/12/13, m); (B) 4,81 (2, m), 5,63 (2-NH, d; 8,6), 3,03 (3, dd; 14,5, 7,3), 3,13 (3, dd; 14,5, 5,5), 7,21 (5, d; 2,2), 3,87 (7-OMe, s), 6,83 (8, d; 8,4), 7,07 (9, dd; 8,4, 2,2); (C) 2,73 (2, m), 1,22 (2-Me, d; 7,3), 3,26 (3, ddd; 13,4,6,8,6,8), 3,51(3, ddd; 13,4, 6,8, 5,3), 6,88 (3-NH, brt; 6,8); (D) 4,73 (2, d; 4,2), 1,78-1,82 (3, m), 0,92 (3-Me, d; 6,8), 1,36-1,41 (4, m), 1,18-1,20 (4, m), 0,80 (5, t; 7,5); ¹³C RMN (CDCIg): unitate δ (poziția carbonului) A 165,3 (1), 125,4 (2), 141,0 (3), 36,6 (4), 76,3 (5), 40,6 (6), 13,2 (6-Me), 63,1(7), 58,7 (8), 136,7 (9), 125,4 (10/14), 128,6 (11/13), 128,5 (12); B 170,9 (1), 53,5 (2), 35,0 (3), 129,8 (4), 131,0 (5), 125,2 (6), 153,9 (7), 56,1 (7-OMe), 112,2 (8), 128,4 (9); C 175,4 (1), 38,5 (2), 14,0 (2-Me), 41,3 (3); D 169,4 (1), 76,5 (2), 36,1(3), 15,6 (3-Me), 24,0 (4), 11,2 (5).

Exemplul 6. Sinteza derivaților de criptofocină

Criptoficină 8

La o soluție formată din 3,8 mg criptoficină 1 în 1,5 ml 2:1 -dimetoxietan/apă se adaugă 9 μ\ HCI 1N. Soluția se agită la temperatura camerei timp de 4h, se neutralizează cu carbonat de potasiu și se evaporă. Reziduul se separă între apă și CH₂CI₂. Materialul solubil în CH₂CI₂ se purifică prin HPLC cu fază inversă obținându-se 3,3 mg criptoficină 8.

EIMS m/z (intensitate relativă) 690/692/694 (0:8/0,5/0,2), EIMS de rezoluție înaltă m/z 690,2533 (calculat pentru C^H^CIgN^g, eroare -5,8 mmu), ¹H RMN (CDCI₃): unitate δ de amino sau hidroxiacid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 8-clor- 5,7- dihidroxi-6-metil-8-fenil octenoic (A) 5,79 (2, d; 15,4), 6,69 (3, ddd; 15,4,9,7 și 5,6), 2,68 (4, ddt; 14,0, 5,5 și 1,8), 2,38 (4,m), 5,11 (5, ddd; 10,8, 8,6 și 1,8), 2,51 (6, m), 1,05 (6-Me, d; 7,0), 4,01 (7, dd; 9,6 și 1,9), 4,65 (8, d; 9,6), 7,36-7,41 (10/11/12/13/14, m); acid leucic (D)) 4,92 (2, dd; 10,1 și 3,5), 1,76 (3/4, m), 1,45 (3, m), 0,94 (5, d; 6,6), 0,94 (4-Me, d; 6,4); acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,73(2, m), 1,22 (2-Me, d; 7,2), 3,25 (3, ddd; 13,6, 6,8 și 6,1), 3,54 (3, ddd; 13,5, 6,1 și 3,4), 6,91 (3-NH, brt; 6,1); 3-clor-4-metoxi-fenilalanină (B) 4,82 (2, ddd; 8,8, 7,2 și 5,6), 5,64 (2-NH, d; 8,8), 3,03 (3, dd; 15,4 și 7,2), 3,16 (3, dd; 15,4 și 5,6), 7,23 (5, d; 2,2), 3,88 (7-OCH₃, s), 6,85 (8, d; 8,5), 7,09 (9, dd; 8,5 și 2,2).

Criptoficină 9

La o soluție formată din 10 mg criptoficină 1 în 1 ml metanol uscat se adaugă 10 μΙ HCI metanolic (obținut prin tratarea a 1,25 g clorură de tionil cu 25 ml MeOH). După agitare timp de 4 h solventul se îndepărtează sub vid și proba se lasă sub vid timp de 12 h. Prin HPLC cu fază inversă se obțin 8 mg criptoficină 9.

¹H RMN (CDCI₃): unitate δ de amino sau hidroxi acid (poziția carbonului, multiplicitatea; J in Hz); acid 5,7-dihidroxi-8-methoxi-6-metil-8-fenil-2-octenoic (A) 5,76 (2, d; 15,5), 6,67 (3,

RO 118931 Β1 ddd; 15,5, 9,5 și 5,6), 2,34 (4, ddd; 14,1, 11,1 și 9,5), 2,62 (4, dddd; 14,1, 5,6, 1,8 și 1,5), 5,09 (5, ddd; 11,1, 7,8 și 1,8), 2,24 (6, dqd; 7,8, 7,0 și 2,2), 1,03 (6-Me, d; 7,0), 3,71 (7, dd;

8.3 și 2,2), 4,03 (8, d; 8,3), 3,20 (8-OCH₃, s), 7,31-7,40 (10/11/12/13/14, m); acid leucic (D) 4,86 (2, dd; 9,8 și 3,5), 1,71 (3/4, m), 1,41 (3, m), 0,89 (5/5', d; 6,4); 3-amino- 2-metilpropionic(C) 2,71 (2, ddq; 6,8, 3,9 și 7,2), 1,21 (2-Me, d; 7,2), 3,23 (3, ddd; 13,5, 6,8 și 6,0), 3,52 (3, ddd; 13,5, 6,0 și 3,9), 6,90 (3-NH, brt; 6,0); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,82 (2, ddd; 8,8, 7,4 și 5,7), 5,66 (2-NH, d; 8,8), 3,02 (3, dd; 14,4, 7,4), 3,15 (3, dd; 14,4 și 5,5), 7,23 (5, d; 2,2), 3,87 (7-OCH₃, s), 6,84 (8, d; 8,5), 7,08 (9, dd; 8,5 și 2,2).

Criptoficina 10

La o soluție formată din 7 mg criptificina 9 în 1 ml acetonă și 0,3 ml apă se adaugă 8 μΙ NaOH 2N. După agitare 4 h, soluția se neutralizează la pH 7 cu HC1 1N și solventul se îndepărtează la presiune redusă. Reziduul se supune HPLC cu faza inversă, folosind MeOH/ H₂O 7:3 și se obține criptoficina 10 pură (5 mg).

¹H RMN (CD₃OD); unitate δ de amino sau hidroxi acid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz); acid 5,7-dihidroxi-8-metoxi-6-metil-8-fenil-2-octenoic (A) 5,99 (2,dt; 15,4 și

1.3) , 6,82 (3, dt; 15,4 și 7,3), 2,30 (4, m), 2,50 (4, m), 3,66 (5, td; 7,8 și 3,5), 2,05 (6, d pentet; 1,8 și 7,0), 0,96 (6-Me, d; 7,0), 4,04 (7, dd; 8,8 și 2,0), 4,01 (8, d; 8,8), 3,12 (8-OCH₃, s), 7,26-7,36 (10/11/12/13/14, m); acid 3-amino- 2-metilpropionic acid (C) 2,50 (2, m), 1,02 (2-Me, d; 7,3), 3,16 (3, dd; 13,4 și 6,9), 3,82 (3, dd; 13,4 și 6,6); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,57 (2, dd; 8,5 și 6,5), 2,82 (3, dd; 13,9 și 8,6), 3,03 (3, dd; 13,9 și 6,5), 7,25 (5, d; 2,2),

3,82 (7-OCH₃, s), 6,95 (8, d; 8,5), 7,13 (9, dd; 8,5 și 2,1), ¹³C RMN (0¾ 0D): δ 179,5,173,4,

168.2.155.4.143.7.141.7.131.9.131.7.129.8.129.3 (2C), 129,2 (2C), 128,8,126,2,123,2, 113,4, 85,9, 74,5, 74,1,56,8, 56,6, 56,3, 43,3, 41,2, 40,2, 38,8, 38,0, 15,5, 9,9.

Criptoficina 12

La o soluție formată din 5 mg criptoficina 1, 5 sau 8 într-un ml acetonă/apă 4:1 se adaugă 15 μΙ NaOH 2N. După agitare la temperatura camerei timp de 5h, amestecul de reacție se neutralizează la pH 7 cu HCI 1N și se evaporă. Materialul solubil în CH₂CI₂ se trece printr-un mic cartuș cu silice cu CH₂CI₂, EtOAc/CH₂CI₂,1:1 și EtOAc. Fracția eluată cu EtOAc conține criptoficina 12 pură.

¹H RMN (CD₃OD): unitate δ de amino sau hidroxi acid (poziția carbonului multiplicitatea; J în Hz); acid 5,7,8-trihidroxi-6-metil-8-fenil-2-octenoic (A) 6,07 (2, ddd; 15,5,1,3 și 1,2), 6,40 (3, dt; 15,5 și 7,3), 2,49 (4, m), 2,60 (4, m), 3,92 (5, ddd; 9,3, 6,7 și 4,5), 1,94 (6, m), 1,07 (6-Me, d; 6,6), 3,61 (7, dd; 8,9 și 7,6), 4,56 (8, d; 7,6), 7,36 (10/14, dd; 7,4 și 1,5), 7,32 (11/13, brt; 7,5), 7,25 (12, m); acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,54 (2, ddq; 7,0,6,6 și 7,0), 1,02 (2-Me, d; 7,0), 3,14 (3, dd; 13,5 și 7,0), 3,42 (3, dd; 13,4 și 6,6); 3-clor- 4-metoxifenilalanină (B) 4,57 (2, dd; 8,4 și 6,7), 2,83 (3, dd; 13,8 și 8,4), 3,02 (3, dd; 13,8 și 6,6), 7,25 (5, d; 2,1), 3,82 (7-OCH₃, s), 6,95 (8, d; 8,5), 7,12 (9, dd; 8,5 și 2,1), Metilarea criptoficinei 12 cu diazometan dă criptoficina 6.

Criptoficina 14

La o soluție formată din 3 mg criptoficina 6 în I ml acetonă/H₂O 3:1 se adaugă 5 μ\ NaOH 2N. După agitare timp de 5 h, amestecul de reacție se neutralizează la pH 7 cu HCI 1N și se evaporă la sec. Reziduul se supune la HPLC în fază inversă obținându-se 2,4 mg criptoficina 14.

¹H RMN (CD₃OD): unitate δ de amino sau hidroxi acid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 5-hidroxi-6-metil-8-fenil-2,7-octadienoic (A) 5,98 (2, d; 15,3), 6,78 (3 dt;

15.3 și 7,5), 2,35 (4, m), 3,64 (5, td; 7,2 și 4,8), 2,47 (6, m), 1,14 (6-Me, d; 6,9), 6,22 (7, dd;

15,9 și 8,1), 6,39 (8, d; 15,9), 7,24-7,36 (10/11/12/13/14,m) acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,35 (2 m), 1,02 (2-Me, d; 6,9) 3,18 (3, dd; 13,2 și 6,6); 3,36 (3, dd: 13,2 și 4,5; 3-clor-4metoxifenilalanină (B) 4,58 (2, dd; 8,7 și 6,3), 2,80 (3, dd; 13,8 și 9,0), 3,05 (3, dd; 13,8 și

6.3) , 7,25 (5, d; 2,1), 3,82 (7-OCH₃, s), 6,95 (8, d; 8,4), 7,13(9, dd; 8,4 și 2,1).

2815

2820

2825

2830

2835

2840

2845

2850

2855

2860

RO 118931 Β1

Criptoficină 35 într-un balon care conține 0,5 ml CH₂CI₂ se adaugă o cantitate catalitică de PtO₂. Se elimină aerul din balon, se introduce H₂ și amestecul se agită la temperatura camerei, timp de 20 min. Se adaugă o soluție formată din 10 mg criptoficină 1 într-o cantitate minimă de CH₂CI₂ și amestecul se agită la temperatura camerei timp de 45 min. Se îndepărtează catalizatorul prin filtrare prin celită/bumbac și se evaporă solventul. HPLC cu fază inversă al reziduului pe o coloană C18 a dat 6,5 mg criptoficină 35.

EIMS m/z (relative intensity) 656/658 (25/10), 412/414 (25/12), 280/282 (20/10), 195/197 (78/25), 141 (58), 91 (100);

EIMS rezoluție mare m/z 656,2864 (calculat pentru C₃₅H₄₅CIN₂O₈ eroare 0,0 mmu); ¹H RMN (CDCI3) unitate δ de amino sau hidroxi acid (poziția carbonului, multiplicitatea; J în Hz) acid 2,3-dihidro-7,8-epoxi-5-hidroxi-6-metil-8-fenil octanoic (A) 2,32 (2, ddd; 14,5,9,2, 5,8), 2,10 (2, ddd; 14,5, 9,2, 6,2), 1,5-1,8 (3/4 suprapunere, m), 5,07 (5, ddd; 12,5, 5,6, 2,0), 1,80 (6, m), 1,12 (6-Me, d; 7,0), 2,90 (7, dd; 7,4,1,8), 3,67 (8, d; 1,8), 7,24 (10/14, m), 7,32-7,38 (11/ 12/13, m); 3-clor-4-metoxifenilalanină (B) 4,71(2, ddd; 8,7,6,4,6,3), 5,62 (2-NH, d; 8,7), 3,08 (2H-3, br d; 6,4), 7,19 (5, d; 2,0), 3,87 (7-OMe, s), 6,83 (8, d; 8,5), 7,07 (9, dd; 8,4,2,0); acid 3-amino-2-metilpropionic (C) 2,72 (2, m), 1,18 (2-Me, d; 6,9), 3,12 (3, ddd; 11,4,10,6, 5,6), 3,70 (3, ddd), 6,76 (3-NH, br t, 6,0); acid leucic (D) 4,83 (2, dd; 9,9, 3,8), 1,39 (3, m), 1,70 (3, m), 1,72 (4, m), 0,87 (4-Me, d; 5,3), 0,86 (5, d; 5,3); ¹³C RMN (CDCI3) valoarea unității δ (poziții ale carbonului: δ A 172,4 (1), 36,2 (2), 32,0 (3), 21,1 (4), 76,6 (5), 40,2 (6), 13,6 (6-Me), 63,3 (7), 59,2 (8), 136,8 (9), 125,6 (10/14), 128,7 (11/13), 128,6 (12); B 170,7 (1),

53,7 (2), 35,5 (3), 130,0 (4), 131,1(5), 122,2 (6), 153,8 (7), 56,1 (7-OMe), 112,1(8), 128,5 (9); C 175,2 (1), 38,2 (2), 13,6 (2-Me), 42,1 (3); D 171,9 (1), 71,7 (2), 39,6 (3), 24,5 (4), 22,9 (4-Me), 21,4 (5).

Exemplu 7. Analiza activității de depolimerizare a microtubulilor a criptoficinelor Materiale

Vinblastul, citocalasin B, tetrametilrodamin izotiocianat (TRITC)-faloidină, sulforodamina B (SRB) și anticorpii împotriva β-tubulinei și vimentin-ului s-au obținut de la Sigma Chemical Company. Mediul de bază Eagle (BNE) care conține sarea lui Earle afost de la Gibco, iar serul de fetus bovin (FBS) s-a cumpărat de la Hyclone Laboratories.

Linii de celule

Linia de celule T Jurkat de leucemie și celulele de mușchi neted aortic, de șobolan A-10 s-au obținut de la American Type Culture Collection și s-au cultivat în BME conținând 10% FBS și 50 /zg/ml gentamicin sulfat. Celulele de carcinom ovarian uman (SKOV3) și o sublinie care s-au ales pentru rezistența la vinblastina (SKVLB1) au constituit un dar de la Dr. Victor Ling de la Ontario Cancer Institute. Ambele linii de celule s-au menținut în BME care conține 10% FBS și 50 Mg/ml sulfat de gentamicină. Vinblastul s-a adăugat la o concentrație finală de 1 Μθ/ml la celulele SKVLB1 la 24 h după pasaj pentru a menține presiunea de selecție a celulelor de supraexprimare a P-glicoproteinei.

Proliferarea celulei și încercările de oprire a ciclului

Evaluarea proliferării celulelor s-a efectuat în modul descris de Skehan ș.a.¹¹ Pentru celulele Jurkat, culturile s-au tratat cu medicamentele indicate în modul descris de Skehan’¹și numărul total de celule s-a determinat prin numărarea celulelor într-un hemacitometru. Procentul de celule în mitoză s-a determinat prin colorare cu 0,4% Giemsa în PBS urmată de trei spălări rapide cu PBS. Cel puțin 1000 celule per tratament s-au notat pentru prezența elementelor mitotice și s-a calculat indicele mitotic ca raportul dintre celulele cu caracteristici mitotice și numărul total de celule numărate.

Determinări de imunoflurescență

S-au crescut, pe fâșii acoperite cu sticlă, 10 celule până aproape de confluență în

BME/10% FBS. S-au adăugat compușii în PBS în concentrațiile finale indicate și celulele s-au incubat încă 24 h. Pentru colorarea microtubulilor și a filamentelor intermediare, celulele

RO 118931 Β1 s-au tratat cu metanol rece și s-au incubat cu PBS conținând 10% ser bovin pentru a bloca pozițiile de legare nespecifice. Celulele s-au incubat apoi la 37°C, timp de 60 min fie cu antiβ - tubulină monoclonală, fie cu anti-vimentin la diluții recomandate de producător. Anticorpii primari legați s-au vizualizat apoi prin incubare 45 min cu IgG antișoarece de iepure conjugat cu fluoresceină.

Fâșiile s-au montat pe plăcuțele microscopului și s-au analizat caracteristicile de fluorescență și s-au fotografiat folosind un Fotomicroscop III Zeiss echipat cu elemente optice de epifluorescență pentru fluoresceină. Pentru colorarea microfilamentelor, celulele s-au fixat cu 3% paraformaldehidă, s-au permeabilizat cu 0,2% Triton X-100 și s-au redus chimic cu borohidrură de sodiu (1 mg/ml). S-au adăugat apoi PBS 100 nM TRITC-faloidin și amestecul s-a lăsat să se incubeze timp de 45 min. la 37°C. Celulele s-au spălat rapid de trei ori cu PBS înainte de montarea fâșiilor și s-au fotografiat imediat în modul descris anterior.

Efectele criptoficinelor și vinblastinaui asupra proliferării celulei Jurkat și a ciclului celulei

Curbele doză-răspuns ale efectelor compușilor critptoficin și a vinblastinaui asupra proliferării celulei și procentul de celule în mitoză sunt indicate în fig. 2A și respectiv 2B. Mai puțin de 3% din celulele netratate au prezentat aspecte mitotice. Atât compușii de criptoficină cât și vinblastimul au produs creșteri dependente de doză a procentului celulelor observate în mitoză. Creșterea indicelui mitotic s-a corelat strâns cu descreșterea proliferării celulei, adică, concentrațiile atât ale compușilor de criptoficină cât și de vinblastina care au făcut ca 50% din celule să fie în mitoză au fost aceleași cu concentrația care inhibă proliferarea celulei cu 50%. IC₅₀ pentru compușii de criptoficină și vinblastina pentru aceste efecte au fost de 0,2 și respectiv 8 nM.

Efectele citocalasin B, vinblastina și a criptoficinelor asupra citoscheletului

Celule ale mușchiului neted aortic (A-10) au fost crescute pe fâșii acoperite cu sticlă și s-au tratat cu PBS, 2 μΜ citocalasin B, 100 nM vinblastina sau 10 nM compuși de criptoficină. După 24 h, s-au vizualizat microtubuli și filamentele intermediare vimentin prin imunofluorescență indirectă și microfilamentele s-au colorat folosind TRITC-faloidin. S-au examinat efectele morfologice ale fiecărui medicament. Celulele netratate au prezentat rețele extinse de microtubuli completate cu centrii de organizare a microtubulilor perinucleari. Filamentele intermediare vimentin au fost distribuite uniform în toată citoplasmă în timp ce mănunchiuri de microfilamente au fost concentrate de-a lungul axei principale a celulei. Citocalasin B a produs depolimerizarea completă a microfilamentelor și acumularea fragmentelor paracristaline. Acest compus nu afectează distribuția nici a microtubulilor, nici a filamentelor intermediare. Atât vinblastina cât și compusul criptoficin au produs o epuizare a microtubulilor. Nici un compus nu a afectat organizarea microfilamentelor; totuși filamentele intermediare vimentin au fost în colaps, formându-se inele concentrice în jurul nucleelor celulelor tratate cu vinblastina sau un compus de criptoficină.

Efectele criptoficinelor și vinblastinaui asupra microtubulilor stabilizați cu taxol celule au fost tratate timp de 3 h cu 0 sau 10 μΜ taxol înainte de adăugarea PBS, 100 nM vinblastina sau 10 nM compus de criptoficină. După 24 h, s-a examinat organizarea microtuburilor, prin imunoflurescență, în modul descris anterior. Comparativ cu celulele de control, microtubulii în celulele tratate cu taxol au fost în mănunchiuri, în special în regiunile polare ale celulei. Ca și mai înainte, vinblastina a produs depolimerizarea completă a microtubulilor în celulele netratate. Totuși, pretratamentul cu taxol a prevenit depolimerizarea microtubulilor ca răspuns la vinblastina. în mod similar, pretratamentul cu taxol a stabilizat complet microtubulii față de depolimerizarea indusă de criptoficină.

Reversibilitatea depolimerizării microtubulilor cu vinblastina și criptoficină celule s-au tratat fie cu 100 nM vinblastina fie cu 10 nM criptoficine, timp de 24 h, ceea ce a avut ca efect depolimerizarea microtubulilor. Celulele s-au spălat apoi și s-au incubat în mediu, fără medicament, timp de 1 h sau 24 h. Microtubulii au repolimerizat rapid

2920

2925

2930

2935

2940

2945

2950

2955

2960

2965

RO 118931 Β1

2970

2975

2980

2985

2990

2995

3000

3005

3010 după îndepărtarea vinblastinei, prezentând nivele semnificative de microtubuli după 1 oră și recuperare morfologică completă după 24 h. Spre deosebire, la celulele tratate cu compuși criptoficin microtubulii nu reapar nici la 1 oră și nici la 24 h după îndepărtarea compusului.

Reversibilitatea inhibării cu criptoficine, vinblastina și taxol a proliferării celulei

Celulele SKOV3 s-au tratat timp de 24 h, cu doze IC₅₀ determinate anterior de vinblastina, compuși de criptoficină sau taxol (adică, valori determinate în experimentele prezentate în tabelul 5). în acest timp, densitatea celulei a crescut de la 0,4 la 0,5 ± 0,05 unități de absorbanță (fig. 3), ceea ce indică o creștere de 25% a numărului de celule pentru toate cele trei tratamente. îndepărtarea medicamentelor a produs o creștere rapidă a celulelor tratate cu vinblastina, astfel că numărul lor a crescut aproximativ de 3 ori în 24 h. Spre deosebire, celulele tratate cu compuși criptoficin și taxol au crescut numai de 0,2 până la 0,4 ori în 24 h, după îndepărtarea medicamentului. Capacitatea proliferativă a celulelor tratate cu taxol sau criptoficine s-a restabilit ulterior deoarece numărul de celule s-a dublat în următoarele 24 h.

Efectele combinațiilor de vinblastina și criptoficine asupra proliferării celulei

Celulele SKOV3 s-au tratat cu combinații de criptoficine și vinblastina timp de 48 h. S-a determinat apoi procentul de celule supraviețuitoare și pentru fiecare combinație s-a calculat IC₅₀. Efectele acestor tratamente combinate, cât și cele cu medicamente singulare, sunt prezentate în izobolograma din fig.4. IC^ pentru combinațiile de compuși de criptoficină și vinblastina sunt foarte apropiate de linia aditivității, ceea ce indică că aceste două medicamente induc numai inhibări aditive ale proliferării celulei.

Toxicitatea criptoficinelor, vinblastimului și taxolului față de celulele SKOV3 și SKVLB1

Celulele SKVLB1 sunt rezistente la medicamentele anticancer naturale datorită supraexprimării P-glicoproteineiⁱ’¹². Capacitatea taxolului, vinblastimului și compușilor de criptoficină de a inhiba creșterea celulelor SKOV3 și SKVLB1 este rezumată în tabelul 5. Taxolul a produs o inhibare dependentă de fază a proliferării ambelor linii de celule cu IC₅₀ pentru SKOV3 și SKVLB1 de 1 și respectiv 8000 nm. Vinblastina inhibă, de asemenea, creșterea ambelor linii de celule, cu IC^ de 0,35 și 4200 nM pentru SKOV3 și respectiv SKVLB1. Criptoficinele au prezentat valori IC_5Q de 7 și 600 pM pentru celulele SKOV3 și respectiv SKVLB1. Factorii de rezistență la compuși pentru celulele SKVLB1 sunt calculați ca ICso- în tabelul 5 sunt prezentate și valorile IC₅₀ pentru celulele SKOV3.

în acest fel, s-a demonstrat că prezenta invenție oferă compuși de criptoficină noi, ca și compuși de criptoficină prezentați, anterior, care sunt inhibitori potenți ai proliferării celulei, acționând prin ruperea rețelei de microtubuli și prin inhibarea mitozei. Compușii de criptoficină distrug organizarea microtubulilor și în acest fel funcțiile normale ale celulei, incluzând și mitoza.

Agenții anti-tubuli clasici, cum ar fi colchicina și alcaloizii Vinca, opresc diviziunea celulară la mitoză. Pare adecvat a compara efectul unuia dintre acești agenți asupra proliferării celulei cu compușii de criptoficină. în acest scop, vinblastimul din alcaloidul Vinca s-a ales ca reprezentant al agenților clasici anti-microtubuli. Ca urmare, s-a comparat efectul compușilor de criptoficină și a vinblastimului asupra proliferării și ciclului celulei pe linia de celule a leucemiei celulelor T. Ambii compuși au produs inhibări dependente de doză paralele ale proliferării celulei și a acumulării celulelor în mitoză.

Deoarece efectele antimitotice sunt mediate uzual prin ruperea microtubulilor în axele mitotice, efectele compușilor de criptoficină asupra structurilor citoscheletice s-au caracterizat prin microscopie de fluorescență. Colorarea imunofluorescentă a celulelor tratate fie cu compuși de criptoficină, fie cu vinblastina au demonstrat clar că ambii compuși produc o i 3015

RO 118931 Β1 pierdere completă a microtubulilor. Studii similare cu celule SKOV3 demonstrează că efectele anti-microtubulilor ale compușilor de criptoficină nu sunt unice liniei de celule ale mușchiului neted. Medicamentul nu a afectat nivelele sau distribuția mănunchiurilor de microfilamente, cum a indus imediat citocalasina B, ceea ce indică că pierderea microtubulilor poate fi datorată unui mecanism ne-specific, adică, activarea proteazelor sau pierderea încărcării energetice. Atât vinblastina cât și compușii de criptoficină promovează colapsul filamentelor intermediare vimentin, astfel că în jurul nucleului celulei se formează inele colorate strălucitoare.

îndepărtarea vinblastului din mediul de cultură a avut ca efect repolimerizarea rapidă a microtubulilor. Spre deosebire, celulele tratate cu compuși de criptoficină au rămas sărăcite în microtubuli timp de cel puțin 24 h după îndepărtarea compusului din cultură.

Prezenta invenție demonstrează că compușii de criptoficină evită rezistența multiplă la medicamente, mediată de P-glicoproteină. Transportul prin P-glicoproteină limitează capacitatea medicamentelor anticancer naturale de a inhiba creșterea celulelor tumorale cu rezistență la medicament dobândită sau de novo^13-15. Alcaloizii Vinca, care sunt foarte eficienți în faza inițială de chemoterapie, sunt substraturi extrem de bune pentru transport prin P-glicoproteine, și din acest motiv au utilitate foarte limitată față de tumorile MDR mediate de Pglicoproteină. De aceea, identificarea agenților care înving rezistența multiplă la medicamente, trebuie să conducă la elaborarea de agenți anti-cancer noi și folositori. Compușii de criptoficină, conform invenției, par a fi astfel de agenți deoarece ei sunt substraturi slabe pentru transportul mediat de P-glicoproteină. Acest fapt este reflectat în factorul de rezistență mic a celulelor pentru compușii de criptoficină, comparativ cu vinblastina, taxolul, și alte medicamente naturale.

Sinteza totală a criptoficinelor

Structura noilor compuși sintetizați, adică Criptoficinele 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58 și 61 s-au confirmat, în mod direct, folosind metodologia bine cunoscută specialiștior în domeniu, datele de spectroscopie de masă au fost în concordanță cu compoziția moleculară. Datele RMN de carbon și proton au fost similare cu cele ale criptoficinei 1 și înrudite analogilor naturali sau semi-sintetici.

Următoarele exemple prezintă sinteza totală a compușilor de criptoficină și utilizarea lor ca agenți terapeutici conform invenției.

Exemplul 8. Sinteza Criptoficinei 51

S-trans-3-Penten-2-propanol (A)

Un amestec racemic de trans-3-penten-2-propanol (933 mg, 11 mmoli), trifluoretil laurat (4,14 g, 15 mmoli) și lipază pancreatică porcină (PPL, 2,0 g) în 25 ml dietil eter anhidru s-a agitat, timp de 80 h. PPL s-a îndepărtat prin filtrare și s-a spălat cu eter de trei ori. Filtratul eteric s-a evaporat și uleiul lipicios s-a supus distilării sub vid. S-trans-3-penten-2propanol (A) s-a condensat într-o trapă cu azot lichid (383 mg). ¹H RMN (CDCI3) δ 5,57 (4-H; dq, -15,3/6,0), 5,47(3-H; ddd, -15,3/6,4/1,2), 4,19(2-H; 1:4:6:4:1 pentaplet, 6,4), 2,24(OH; bs), 1,63(5-H3; d. 6.0), 1,19(1-H3; d, 6,4), ¹³C RMN(CDCI3) δ 135,5(3), 125,5(4), 68,7(2), 23,3(5), 17,5(1).

S-trans-2-(2-propiniloxi)-3-pentenă (B)

La un amestec format din enantiomerul 9 al compusului A (628 mg, 7,3 mmoli), sulfat acid de tetrabutilamoniu (138 mg, 0,41 mmoli) și NaOH în apă 40% (5 ml), s-a adăugat, la

0°C, sub agitare intensă și în picături, clorură de propargil (767 mg. 10,3 mmoli, 745 μ). Agitarea puternică s-a continuat peste noapte, după care amestecul s-a neutralizat cu HCI, la

0°C și propargil eterul s-a extras cu pentan. Extractul s-a evaporat și propargil eterul s-a purificat pe o coloană scurtă cu silica gel (2% dietil eter/pentan) pentru a se obține 778 mg

3020

3025

3030

3035

3040

3045

3050

3055

3060

RO 118931 Β1 propargil eter B, [a]_D-118,9°(c 2,0, CHCI₃); ¹H RMN (CDCI₃) δ 5,70 (4-H; dq 18,5/6,5),

5,31 (3-H; ddd, 18,5/7,2/1,4), 4,15(1’-H; dd, -15,6/2,1), 4,01 (1‘-H;dd -15,6/2,1), 4,01(2-H;m),

2,38(3’-H;t, 2,1), 1,73(5-H; dd, 6,5/1,4), 1,25(11-1; d, 6,3).

(3R, 4R)-4-Metilhept-5(E)-en-1-in-3-propanol (C)

O alicotă de soluție de butii de litiu în hexan (2,5 M, 5,1 ml, 12,8 mmoli) s-a evaporat sub vid și reziduul s-a răcit la -90°C. S-a adăugat, treptat, o soluție de propargil eter B (454 mg, 3,66 mmoli) în 10 ml THF. După ce temperatura a ajuns la temperatura camerei, peste noapte, amestecul de reacție se tratează cu soluție de NH₄CI. Se extrage cu eter, de trei ori, extractul se evaporă la sec și reziduul se purifică pe o coloană cu silica gel (5% EtOAc/ hexan). Se obțin 322 mg alcool C (randament 71%), [a]_D-32,9°(c 3,0, CHCI₃); IR(NaCI) n_max3306, 2968,1455, 1379,1029, 975 eut ¹H RMN (CDCI3) δ 5,61 (6-H; dq 15,3/6,3), 5,38(5-H; dd, 15,3/7,7) 4,13(3-H;bs), 2,45(1-H; d, 1,5), 2,38(4-H; m), 2,20(OH; bd, 3,3), 1,68(7-H; d, 6,2), 1,09(4- CH3; d, 6,8). ¹³C RMN(CDCI3) d 131,5 (5), 127,9(6), 83,5(2), 73,6(1), 66,2(3), 43,4(4), 18,1(7), 15,7(4-Me).

(3R,4R)-3-tert-butildimetilsililoxi-4-metilhept-5E-enal (D)

La o soluție de alcool C (248 mg, 2 mmoli) și imidazol (340 mg, 5 mmoli) în 3 ml DMF se adaugă, sub agitare, clorură de te/ț-butildimetilsilil (452 mg, 3 mmoli). După agitarea amestecului, peste noapte, se adaugă 10 ml soluție 10% NaOH pentru a descompune excesul de clorură de tert-butildimetil silii. Produsul se extrage cu eter și extractul se spală succesiv cu apă, Hcl 0,5N și apă, se usucă și se evaporă. Prin purificarea reziduului prin cromatografie pe silica gel cu hexan se obțin 457 mg (3R,4R)-3-tert-butildimethilsililoxi- 4-metilhept-5(E)-en-1-ină (randament 96%), ¹H RMN (CDCI₃) δ 5,50 (6-H; dq, 15,3/6,1), 5,38 (5-H; dd, 15,3/7,5), 4,16 (3-H; dd, 5,7/1,7), 2,37 (1-H; d, 1,7), 2,35 (4-H; m), 1,68 (7-H; d, 6,1), 1,07 (4-Me; d, 6,8), 0,90 (CMe3; s), 0,12 (SiMe; s), 0,09 (SiMe; s).

Folosind același procedeu s-a obținut derivatul TBDPS (3R,4R)-3-te/ț-butildifenilsililoxi-4-metilhept-5(E)-en-1-ină, cu un randament de 92% [a]_D +32,9° (c 3.0, CHCI₃). ¹H RMN (CDCI3) δ 7,72/7,38 (2Ph-H5), 5,32 (6-H; m), 5,25 (5-H; dd, 16,2/7,3), 4,29 (3-H; dd, 5,2/2,0), 2,38 (4-H; m), 2,33 (1-H; d, 2,0), 1,64 (7-H; d, 5,3), 1,11 (4-Me; d, 6,9), 1,06 (CMe3), ¹³C RMN (CDCI3) δ 136, 1/135,9 /133,6/129,7/129,6/127,5/127,3 (Ph), 132,4 (5), 126,1 (6), 83,3(2), 73,5 (1), 68,0 (3), 43,6 (4), 26,9 (C), 19,4 (CMe₃), 18,0 (7), 14,7 (4-Me).

La 1,1 ml soluție BH₃ THF (1M, 1,1 mmoli), la -25°c, se adaugă 2-metilbutenă (1,15 ml soluție 2M în THF, 2,3 mmoli) și amestecul se agită într-o baie cu gheață timp de 2 h. Temperatura se lasă să ajungă la -50°C, după care se adaugă dintr-o dată o soluție de derivat TBS (238 mg, 1 mmol) în 1 ml THF. Se îndepărtează baia de răcire și amestecul de reacție se lasă să ajungă la temperatura camerei, timp de o oră. Apoi, se adaugă la 0°C soluție 2,2 M KH₂PO₄/K₂HPO₄ (4,8 ml) și H₂O₂ 30% (0,8 ml). După o oră, se evaporă THF și reziduul se extrage cu eter. Extractul eteric uscat se evaporă și reziduul se cromatografiază pe silica gel (1% EtOAc/hexan) obținându-se 194 mg aldehidă D (randament 76%). Ή RMN (CDCI₃) δ 9,78 (1-H; t, 2,3), 5,46 (6-H; dq, 15,3/6,1), 5,34 (5-H; dd, 15,3/7,5), 4,13 (3-H; m), 2,47 (2-H; m), 2,31 (4-H; m), 1,66 (7-H; brd, 6,1), 0,99 (4 Me; d, 6,8), 0,87 (CMe₃; s), 0,07 (SiMe; s), 0,04 (SiMe; s).

Derivatul tert-butildifenil(TBDPS) al aldehidei s-a obținut cu un randament de 83%. ’H RMN(CDCI₃) δ 9,52 (1-H; t, 2,4), 7,69/7,40 (2Ph-H_s), 5,28 (6-H; m), 5,22 (5-H; dd, 16,2/ 6,2), 4,19 (3-H; m), 2,42 (2-H; m), 2,29 (4-H; m), 1,60 (7-H; d, 5,4), 1,07 (CMe₃), 1,02 (4-Me; d, 6,9), ¹³C RMN(CDCI₃) d 202,0 (1), 136,1/133, 6/133, 3/130,2/129, 7/127,7/127,6 (Ph), 132,3 (5), 126,2 (6), 72,8 (3), 47,6 (2), 42,2 (4), 27,1 (CMe₃), 19,6 (CMe₃), 18,3 (7), 14,9 (4-Me).

(5S,6R)-5-terț-butildimetHsililoxi-6-metil-7-oxonona-2E, 7 E-dienoat de metil (E)

La o soluție de aldehidă D (0,74g, 2,9 mmol) și trimetil fosfonoacetate (632 mg, 3,5 mmol) în THF răcită la -78°C se adaugă, sub agitare, tetrametilguanidină (435 μ\, 3,5 mmol).

După 30 min, se îndepărtează baia de răcire și amestecul se agită încă 4 h. Amestecul se

RO 118931 Β1

3115 neutralizează cu HCI 1N și produsul se extrage cu eter. Prin evaporarea extractului eteric uscat se obține un reziduu care se cromatografiază pe silica gel (5% EtOAc/hexan) obținându-se 0,814 g E (randament 90%). ¹H RMN (CDCI₃) δ 6,93 (3-H; dt, 15,6/7,8), 5,62 (2-H; dd, 15,6/1,2), 5,37 (8-H, m), 5,37 (7-H, m), 3,71 (OCH₃, s), 3,61 (5-H, m), 2,29 (4-H₂, m), 2,22 (6 H, m), 1,66 (9-H₃; br d, 6,1), 0,99 (6-Me; d, 6,8), 0,88 (CMe₃; s), 0,03 (SiMe; s), 0,01 (SiMe; s).

Derivatul te/ț-butildifenilsilil eter (TBDPS) al aldehidei s-a obținut cu un randament de 90%. ¹RMN (CDCI3) δ 7,68/7,38 (2Ph-H5), 6,75(3-H; dt, 15,6/7,4), 5,62 (2 H; d, 15,6), 5,34 (8-H, m), 5,29 (7-H, m), 3,70 (S-H, m), 3,68 (OCH3, s), 2,28 (4-H2, m), 2,20 (6-H, m), 1,62 (9-H3; d, 5,3), 1,08 (CMe3), 0,99 (6-Me; d, 6,9), ¹³C RMN (CDCI3) d 166,7 (1), 146,4 (3), 136,0/134,2/133,8/129,62/ 129,56/ 127,5/127,4 (Ph), 132,5 (7), 125,8 (8), 122,6 (2), 76,2 (5), 51,3 (OCH₃), 41,7 (6), 36,8 (4), 27,0 (CMe₃), 19,4 (CMe₃), 18,1(9), 14,7 (6-Me).

(5S,6R)-5-tert-butildimetilsililoxi-6-metil-7-oxohept-2(E)-enoat de metil (F)

Printr-o soluție de metil ester E (328 mg, 1,0 mmoli) și 97 μΙ piridină în 15 ml CH₂CI₂la -78°C, se trece ozon și ozonoliza se urmărește prin analiză TLC. După consumarea metil esterului, se adaugă aproximativ 500 mg praf de zinc și 1 ml acid acetic glacial. Temperatura se mărește treptat la 25°C. Amestecul se filtrează și filtratul se spală succesiv cu soluții saturate de CuSO₄ și NaHCO₃. După evaporarea solventului, aldehida F brută (249 mg, 83%) se folosește în etapa următoare fără altă purificare ¹H RMN(CDCI₃) 9,96 (7-H; t, 2,3), 6,96 (3-H; dt, 15,7/7,6), 5,90 (2-H; dd, 15,7/0,7), 4,05 (5-H; m), 3,74 (OMe; s), 2,51 (6-H; m), 2,45 (4-H₂; m), 1,09 (6-Me; d, 6,9), 0,88 (CMe₃; s), 0,04 (SiMe; s), 0,03 (SiMe; s).

(5S,6R)-5-t-butildimetilsililoxi-6-metil-8-fenil-octa-2E, 7E-dienoat de metil (G)

La o soluție a aldehidei F (25,0 mg, 0,08 mmoli) în 1,5 ml THF la -78°C se adaugă 0,80 ml amestec rece (-78°C) de clorură de benziltrifenilfosfoniu (268 mg, 0,69 mmoli, în 6,9 ml THF) și n-butil litiu (280 μΙ, 2,5M în hexan). După 15 min, se îndepărtează baia de răcire și se continuă agitarea timp de 2 h. Reacția se stopează cu soluție saturată de clorură de amoniu și se evaporă THF. Concentratul se extrage cu hexan de două ori și extractele combinate se spală cu soluție de sare, se usucă și și se evaporă. Uleiul rezidual, un amestec de 5:1 izomeri E și Z, se dizolvă în 1,5 ml benzen care conține tiofen (0,02M) 1 ,Τ-azobis (ciclohexancarbonitril) (VAZO, 0,006 M) și amestecul se refluxează 5 h. După răcire la temperatura camerei, se adaugă hexan (15 ml) și soluția organică se spală succesiv cu 10% NaOH și soluție de sare, se usucă pe MgSO₄ și se evaporă. Prin cromatografierea reziduului pe silica gel (2% EtOAc/hexan), se obțin 24 mg (80%) G, [a]_D + 68,2° (c 1,5, CHCI₃); EIMS m/z 374(<1%; M⁺ 359 (1;M⁺-CH3), 317 (10; M⁺-Bu), 275 (10), 243 (73), 143 (20), 115 (10), 97 (64), 89 (31), 73 (100); HREIMS m/z 374,2232 (C^Oj și D+4,5 mmu), 359,2031 (C21H₃₁O₃Si, D+1,1 mmu), 317,1579 (C₁₈H₂₅O₃ și D 0,6 mmu); UV (MeOH) l_max (e) 206 (33500), 252 (20100) nm; IR n_max 2952, 2855, 1725, 1657, 1435, 1257, 1168, 1097, 970, 836, 775 cm'¹; ¹H RMN d 7,2-7,4 (Ph-H₅; m), 6,96 (3-H; ddd, 15,6/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 15,9), 6,16 (7-H; dd, 15,9/8,1), 5,84 (2-H; d, 15,6), 3,75 (5-H; ddd, 10,2/6,0/4,2), 3,72 (OMe; s), 2,44 (6-H; m), 2,36 (4-H₂; m), 1,10 (6-Me; d, 6,9), 0,91 (Si-CMe₃; s), 0,06 (Si-Me; s), 0,05 (Si-Me; s); ¹³C RMN d 166,8 (1), 146,4 (3), 137,6 (Ph 1'), 131,9 (8), 130,4 (7), 128,5 (Ph 375'), 127,0 (Ph 4'), 126,0 (Ph 276'), 122,9 (2), 75,0 (5), 51,4 (OMe), 42,8 (6),

37,6 (4), 25,9 (Si-CMe₃), 18,1 (Si-CMe₃), 16,2 (6-Me), 4,4 (Si-Me), 4,5 (Si-Me). Calculat pentru Ο^Η^Ο^ΐ: C, 70,52; H, 9,17. Găsit: C, 70,72; H, 9,42.

Acid (5S,6R)-5-t-butildimetilsililoxi-6-metil-8-fenilocta-2E, 7E-dienoic(H)

La o soluție de ester G (159 mg, 0,43 mmoli) în 7 ml acetonă se adaugă 5 ml LiOH apos 1N. Amestecul se agită la 25°C, timp de 3 h, se diluează cu 20 ml Et₂O și se acidulează la un pH aproximativ 4 cu HCI. Se separă stratul organic și se spală cu porții de 20 ml soluție de sare și cu apă, se usucă (MgSO₄) și se evaporă. Prin cromatografia uleiului pe

3120

3125

3130

3135

3140

3145

3150

3155

3160

RO 118931 Β1 silica gel cu 40% EtOAc în hexan care conține 0,5% AcOH. Se obține acidul pur H sub formă de ulei galben (145 mg, randament 95%); [a]_D+87,0° (c 1,4, CHCI₃); EIMS m/z; 343 (1; M⁺-OH), 303 (5), 275 (9), 257 (4), 229 (62), 213 (16), 171 (22), 143 (37), 131 (16), 115 (23), 97 (100), 91 (44); HREIMS m/z 343,2107(C21H31O2Si,A-1,3 mmu),229,1220(15 H31O^Si,-1,3 mmu), 229,1220 (C15H17O2), + 0,9 mmu); UV lmax(e) 206 (24500), 252 (15600) nm; IR nmax 3300-2800 (br), 2956, 2856, 1697, 1651, 1419, 1256, 1097, 836, 693 cm’; ¹H RMN d 10,4 (CO2H; bs, W_1/2 = 100 m), 7,2-7,4 (Ph-H_s; m), 7,09 (3-H; ddd, 15,6/7,6/7,6), 6,39 (8-H; d, 15,9), 6,16 (7-H; dd, 15,9/8,1), 5,85 (2-H; d, 15,6), 3,78 (5-H; ddd, 6,0/6,0/4,2), 2,46 (6-H; m), 2,40 (4-H₂; m), 1,12 (6-Me; d, 6,9), 0,92 (Si-CMe₃; s), 0,07 (Si-Me₂; s); ¹³C RMN d 171,6 (1), 149,1 (3), 137,5 (Ph Γ), 131,8 (8), 130,5 (7), 128,5 (Ph 375'), 127,1 (Ph 4'), 126,1 (Ph 276'), 122,7 (2), 74,9 (5), 42,9 (6), 37,6 (4), 25,8 (Si-CMe₃), 18,1(Si-CMe₃), 16,1 (6-Me), 4,4 (Si-Me), -4,5 (Si-Me).

Esterul 2,2,2-tricloretilic al 3-(3-clor -4-metoxifenil)-D-alanină (I)

O probă de derivat BOC al D-clortirosinei (160 mg, 0,35 mmoli) se dizolvă în 3 ml acid trifluoracetic și se lasă la temperatura camerei, timp de 1 h. Prin îndepărtarea reactantului în exces, sub presiune redusă, a readus amina I în sare trifluoracetat (165 mg, randament 100%, [a]₀ + 1,7° (c 5,2, CHCI ); IR n _max3400-2500 (br), 1760, 1680, 1500, 1200, 1130,1070,805, 710 cm'¹; ¹H RMN d 8,07 (NH2; br m, W1/2 = 45), 7,27 (5-H; s), 7,12 (9-H; d, 8,1), 6,88 (8-H; d, 8,1), 4,86/4,67 (CH2CCI3; AB q, -12,0), 4,41 (2-H; bs, W1/2 = 20), 3,86 (OMe; s), 3,33 (3-H; dd, -14,4/3,6), 3,22 (3-H¹; dd, -14,4/6,6); ¹³C RMN d 167,6 (1), 155,0 (7), 130,9 (5), 128,8 (9), 125,4 (4), 123,1 (6), 112,7 (8), 93,4 (CCI3), 75,3 (CH₂CC1₃), 56,1 (OMe), 54,2 (2), 34,9 (3).

Compusul J

La o soluție a H (25 mg, 0,07 mmoli) în 3 ml DMF anhidru, sub agitare și atmosferă de argon, se adaugă succesiv pentafluordifenilfosfinat (FDPP, 32 mg, 0,08 mmoli), sare trifluoracetat a I (35 mg, 0,07 mmoli) și diizopropiletilamină (DIEA, 27 mg, = 36 ml, 0,21 mmol, - 3 echiv.). Agitarea se continuă, la 25°C, timp de 1 h și apoi amestecul de reacție se extrage cu 20 ml Et₂O. Extractul eteric se spală cu 10 ml Hcl 1N, urmată de 10 ml NaHCO₃saturată, 20 ml soluție de sare și 20 ml apă, se usucă (MgSO₄) și se evaporă. Uleiul rezidual galben pal se cromatografiază pe silica gel (15% EtOAc în hexan) pentru a se obține compusul J, sub formă de ulei incolor (32 mg, randament 65%): [a]_D + 11,8° (c 1,2, CHCIg); EIMS m/z 644/646/648/650 (7/8/6/3; M⁺-Bu), 570/572/574 (46/100/21), 536/538 (18/15), 394/396 (67/29), 275 (20), 155/157 (29/9); HREIMS m/z 644,0981 (C^H^C^NOsSi, D-2,13 mmu); UV lmax (e) 204 (54900), 230 (23200), 248 (19200), 284(3500) nm; IR nmax 3290, 2980,2850, 1760, 1680, 1640, 1505, 1380, 1270, 1169, 990, 720 cm’¹; ’H RMN unitatea A d 7,2-7,4 (ph-H5; m), 6,87 (3- H; ddd, 15,0/7,8/7,5), 6,37 (8-H; d, 16,2), 6,18 (7-H; dd, 16,2/8,1), 5,82 (2-H; d, 15,0), 3,75 (5-H; ddd, 9,9/6,0/4,8), 2,46 (6-H; m), 2,36 (4-H₂; m), 1,11 (6-Me; d, 6,9), 0,91 (Si-CMe₃; s), 0,07 (SiMe; s), 0,06 (SiMe; s); unitatea B d 7,19 (5-H; d, 2,1), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,1), 6,85 (8-H; d, 8,4), 5,85 (NH; d, 7,8), 5,08 (2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,81/4,74 (CH₂CCI₃; AB q, -11,7), 3,87 (OMe; s), 3,22 (3-H; dd, -14,1/5,7), 3,12 (3 H’; dd, -14,1/6,0), ’³C RMN unitatea A δ 165,1 (1), 143,0 (3), 137,6 (9), 132,0 (8), 130,4 (7), 128,5 (11/13), 127,0 (12), 126,0 (10/14), 124,7 (2), 75,0 (5), 42,6 (6), 37,6 (4), 25,9 (Si-CMe₃), 18,1 (SiCMe₃), 16,5 (6-Me), -4,3 (Si-Me), -4,6 (Si-Me); unitatea B d 170,1 (1), 154,3 (7), 131,1 (5),

128,5 (4/9), 122,6 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCI₃), 74,8 (CH₂CCI₃), 56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).

(1 'R,5S, 6R)-N-1 '-(carbo-2ⁿ,2,2-tricloretoxi)-2'-(3-clor-4-metiloxifenil)etil-5t-butildimetilsililoxi-6-metil-8-fenil-octa-2E,7E-dienamidă (K)

La o soluție de compus J (50 mg, 0,07 mmoli) în 4 ml MeCN, se adaugă 400 μΙ soluție apoasă de HF 49% și amestecul se agită 1 h, la 25°C. Extracția în 30 ml Et₂O, urmată de spălarea extractului eteric cu porții de 30 ml de NaHCO₃ saturat, soluție de sare și apă,

RO 118931 Β1 uscare (MgSO₄) și evaporare, dă alcoolul K sub forma unei spume incolore (40 mg, randament 95%):[a]_D - 6,1 °(c 1,3, CHCI₃); EIMS m/z (intensitate relativă) 587/589/591/593 (H⁺, < 1%), 552/554/556 (1/2/0,5), 456/458/460/462 (1/2/1/0,2), 342/344/346 (7/8/4), 212/214 (15/5), 195/197 (6/2), 155/157 (99/34), 131 (100), 91 (77);HREIMS m/z 587,0721 (C27H29³⁵CI4NO₅, D+7,9 mmu); UV l_max 204 (56500), 230 (22100)nm, 248 (18100), 284 (3600)nm; IR n_max3400, 3300, 2980,1780,1680,1640, 1505,1270, 1180, 1090,1000, 770 cm’¹,¹H RMN unitatea A δ 7,2-7,4 (Ph-H5; m), 6,92 (3-H; ddd, 15,3/7,8/7,5), 6,46 (8-H; d, 15,9), 6,14 (7-H; dd, 15,9/8,4), 5,90 (2-H; d, 15,3), 3,65 (5-H; ddd 7,8/5,6/4,0), 2,39 (6-H/4-H2; bm), 1,78 (OH; bs, W1/2 = 40 Hz), 14 (6-Me; d, 6,9); unitatea B d 7,18 (5-H; d, 1,8), 7,03 (9-H; dd, 8,4/1,8), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,97 (NH; d, 7,8), 5,06 (2-H; ddd, 7,8/6,0/5,7), 4,79/4,72 (CH2CCI3; AB q, -12,0), 3,86 (OMe; s), 3,20 (3-H; dd, 14,1/5,7), 3,10 (3-H¹; dd, -14,1/6,0), ¹³C RMN unitatea A d 165,3(1), 142,6 (3), 137,0 (9), 131,7 (8), 131,0 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (12), 126,1 (10/14), 125,0 (2), 73,8 (5), 43,2 (6), 37,2 (4), 16,8 (6-Me); unitatea B d 170,2 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,4 (9), 128,3 (4), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCI3), 74,7 (CH₂CCI₃), 56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).

Acid 3-(tert-butoxicarbonil)amino-2,2-dimetilpropanoic (M)

La o soluție de 3-amino-2,2-dimetilpropan-l-ol (L) (3,0 g, 29 mmoli) în 51 ml soluție 10 % trietilamină în MeOH se adaugă di-tert-butil dicarbonat (6,7 g, 31 mmol) și amestecul se agită la 25°C, timp de 1 h. După îndepărtarea solventului, reziduul se dizolvă în CH₂CI₂(30 ml) și soluția se spală de două ori cu KHSO₄ (pH 2) și o dată cu soluție saturată de NaCI, se usucă (MgSO₄). Prin îndepărtarea solventului sub vid se obțin 5,8 g (randament 93%) 3-(te/ț-butoxicarbonil)amino-2,2-dimetilpropan-l-ol sub forma unui solid alb care se folosește direct în etapa următoare, fără altă purificare (>95% puritate prin analiză RMN), p.t. 70,5-71,5°C; IRn_max3350,1685,1456cm'¹; ¹H RMNd4,87(NH; brs), 3,72(OH; brs), 3,19 (1-H2; d, 5,1), 2,95 (3-H2; d, 6,0), 1,44 (CMe3; s), 0,85 (2-Me2; s); ¹³C RMN (CDCI3) d 157,6 (BOC CO), 79,7 (CMe₃), 68,1 (1), 47,1 (3), 36,7 (2), 28,3 (CMe₃), 22,4 (2-Me₂).

La o soluție a alcoolului 3-(te/ț-butoxicarbonil) amino- 2,2-dimetilpropan-1-ol (5,3 g, 25,9 mmoli) și periodat de sodiu (16,6 g, 77,7 mmol) în tetraclorură de carbon (52 ml), acetonitril (52 ml) și apă (78 ml) se adaugă hidratul triclorurii de ruteniu (122 mg) și amestecul se agită la 25°C pentru timp de 1h. Amestecul se filtrează prin Celită și se adaugă o soluție saturată de carbonat de potasiu în apă (50 ml). Se separă stratul apos, se spală cu eter (20 ml), se acidulează cu HCI la pH 2 la 0°C și se extrage cu CH₂CI₂ (30 ml x 3). Extractele combinate se spală cu soluție saturată de NaCI și se usucă (MgSO₄). Prin îndepărtarea solventului sub vid, se obține un reziduu care inițial se supune cromatografiei rapide cu fază inversă pe o coloană cu silice C₁₈ (ODS 120A, 50 la 90% MeOH) și apoi prin cristalizare din eter se obțin 3,7 g (randament 66%) M sub forma unui solid alb, p.t. 106-108°C; EIMS m/z (intensitate relativă) 217 (0,1), 161 (11), 98 (25), 88 (71), 57 (100); HREIMS m/z 217,1292 (C₁₀H₁₉NO₄, D+2,2 mmu); IR n_max 3450-2500, 1710,1694, 1510 cm·¹; ¹H RMN a conformerului majoritar d 5,03 (NH; br s), 3,26 (3-H2; m), 1,45 (CMe3; s), 1,24 (2-Me3; s); ¹³C RMN (CDCI3) δ 183,2 (1), 156,3 (BOC CO), 79,6 (CMe₃), 49,5/47,9 (2/3), 28,4 (CMe₃), 22,9 (2-Me₂).

(2S)-2-Hidroxi-4-metilpentanoat de alil (N)

La o soluție formată din 2,66 g acid L-leucic (20 mmoli) și 1,74 g bicarbonat de sodiu (20 mmoli) în 30 ml apă se adaugă la 0°C, 30 ml dintr-o soluție de CH₂CI₂ obținută din 6,44 g clorură de tetrabutilamoniu (20 mmoli) și 1,74 ml bromură de alil (20 mmoli). După agitarea intensă a amestecului, timp de 24 h, se evaporă clorură de metilen. Se adaugă aproximativ ml apă și stratul apos se extrage de patru ori cu Et₂O. Soluția eterică se usucă pe sulfat de sodiu anhidru și apoi se evaporă. Reziduul se trece pe o coloană scurtă cu și obținânduse 3,21 g ester alilic N (Randament 93%) sub forma unui ulei incolor, [a]_D -8,4° (c 1,1,

3215

3220

3225

3230

3235

3240

3245

3250

3255

3260

RO 118931 Β1

CHCI₃)IR n_max 3464, 2957, 1732, 1203, 1140, 1087; ¹H RMN d 5,92 (alil 2-H; m), 5,34 (alil

3-H₂; dd, 17,4/1,1), 5,28 (alil 3-H_E; dd, 10,5/1,1), 4,67 (alil 1-H₂; d, 5,7), 4,23 (2-H; brs), 2,64 (OH; br s), 1,89 (4-H; m), 1,57 (3-H₂; m), 0,96 (5-H₃; d, 6,5), 0,95 (4-Me; d, 6,7); ¹³C RMN

175,3 (1), 131,4 (alil C-2), 118,6 (3), 68,9(2) 65,7 (alil C-1), 43,2 (3), 24,1(4), 23,0 (5), 21,3 (4-Me).

(2S)-2-[3'(tert-butoxicarbonil)amino-2',2'-dimetilpropanoiloxi]-4-metilpentanoat de alil (O)

La o soluție formată din 0,8 g M (3,7 mmol), 0,76 g N (4,4 mmoli), și 92 mg DMAP în 10 ml CH₂CI₂ la 0°C s-a adăugat 0,84 g DCC (4,1 mmoli) în CH₂CI₂. Amestecul se agită la 25°C, timp de 3 h și se filtrează. Filtratul se spală cu soluție apoasă saturată, de bicarbonat de sodiu, se usucă (Na₂SO₄) și se evaporă sub vid. Prin cromatografie rapidă (silica gel, 5% EtOAc/hexan) se obține 1,0 g (randament 92%). 0 pur sub formă de ulei incolor, R_f0,68 (17:83 EtOAc/hexan), [a]_D -29,4°C (c 18,1, CHCI₃); EIMS m/z (intensitate relativă) 371 (2, M⁺), 242 (13), 184 (12), 126 (20), 84 (100); HREIMS m/z 371,2317 (C^H^NOg, D-0,9 mmu); IR (rețea) nmax3385, 2963, 1731,1720,1513 cm'¹; ¹H RMN (300 MHz, CDCI3) unitatea C δ 5,39 (NH; br s difuz), 3,33 (3-H; dd, -13,5/7,4), 3,27 (3-H‘; dd, -13,5/5,9), 2,78 (2-H, m), 1,44 (CMe₃; s), 1,23 (2-Me; s), 1,22 (2-Me; s); unitatea D δ 5,91 (alil 2-H; ddt, 16,6/10,3/6,0 Hz), 5,34 (alil 3-Hz; bd, 16,6), 5,27 (alil 3-H_e; bd, 10,3), 5,08 (2-H; dd, 9,6/3,6), 4,65 (alil 1-H₂; m), 1,6-1,9 (3-H/4-H; m), 0,94 (5-H₃; d, 6,3), 0,94 (4-Me; d, 7,3), ¹³C RMN unitatea C δ 176,5 (1), 156,3 (BOC CO), 79,0 (CMe₃), 48,6 (3), 44,0 (2), 28,4 (CMe₃), 22,2/ 23,0 (2-Me₂); unitatea D δ 170,6 (1), 131,4 (alil C-2), 119,1 (alil C-3), 70,9 (2), 66,0 (alil C-1),

39.5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me),

Acid (2S)-2-[3'(terț-butoxicarbonil)amino-2',2'-dimetil-propanoiloxi]-oxi]-4-metilpentanoic(P)

La 10 ml dintr-o soluție formată din 180 mg (0,49 mmoli) și 60 mg (0,05 mmoli) tetrakis(trifenilfosfin) paladiu în THF uscat (sub atmosferă de argon) se adaugă treptat 470 μΙ (5,4 mmoli) morfolină uscată, timp de 10 min. După agitare timp de 50 min., se adaugă 40 ml eter și soluția se spală cu Hcl 1N (40 ml) și apoi se extrage cu bicarbonat de sodiu saturat (2x30 ml). Extractul apos se acidulează cu Hcl 0,5N și se extrage cu eter (40 ml). Extractul eteric se spală cu apă (2 x 30 ml), se usucă (MgSO₄) și se evaporă sub vid obținându-se P sub forma unui ulei incolor (152 mg, 95%);

[a]_D -22,2°C (c 2,2, CHCI₃); EIMS m/z (intensitate relativă) 331 (1, M⁺), 275 (1), 258 (4), 231 (9), 202 (36), 174 (13), 144 (31), 126 (16), 114 (14), 98 (54), 88 (50), 84 (100); HREIMS m/z 331,2004 (C^H^NOg, Δ-Ι,Ο mmu), ¹H RMN (CDC^) unitatea C δ 5,41 (NH; dd, 5,7/5,4), 3,30 (3-H2; m), 2,68 (2-H; m), 1,43 (CMe3; br s), 1,22 (2-Me; s), 1,21 (2-Me; s); unitatea D δ 66,47 (1-OH; br s, W1/2 * 35), 5,09 (2-H; dd, 9,3/2,7), 1,7-1,9 (3-H./4-H; m), 0,97 (5-H3; d, 6,0), 0,94 (4-Me; d, 6,0), ¹³C RMN (CDCI3) unitatea C δ 176,5 (1), 156,5 (BOC CO), 79,3 (CMe₃),

48.6 (3), 44,0 (2), 28,3 (CMe₃), 23,0 (2-Me), 22,2 (2-Me); unitatea D δ 175,4 (1), 70,6 (2),

39,5 (3), 24,8 (4), 23,0 (5), 21,4 (4-Me).

Compusul Q

La o soluție de alcool K (80 mg, 0,14 mmoli), acid P (68 mg, 0,21 mmoli) și DMAP (4 mg) în CH₂CI₂ (4 ml) la 0°C sub atmosferă de argon, se adaugă DCC (44 mg, 0,21 mmol) în CH₂CI₂ (I ml). Amestecul se agită la 0°C timp de 30 min, timp în care se formează un precipitat alb, după care se lasă să se încălzească la temperatura camerei și se agită 4 h. Se filtrează precipitatul diluat cu eter (40 ml) și se spală succesiv cu HCI diluat (1M, 40 ml), soluție saturată de NaHCO₃ (40 ml) și soluție de sare (40 ml). Stratul eteric se usucă (MgSO₄) și se evaporă sub vid, obținându-se un solid ceros. Prin cromatografie (silice, EtOAc:hexane, 1:3) se obține Q pur sub forma unui ulei vâscos (103 mg, 84%), [a]_D -3,1 °C (c 2,9, CHCI₃); EIMS m/z 800/802/804/806 (<1, M⁺-C₅H₈O₂), 415/417/419/421 (5/3/3/2), 342/344/346 (7/9/4),'286/288/290 (2/6/2), 207 (34), 178 (22), 155/157 (66/24), 131(36), 91 (70), 70 (100);

RO 118931 Β1

HREIMS m/z 800,2179 (Ο^Ν,,Οθ³⁵^, D-1,4 mmu); UV (MeOH) A™ (e) 204 (51200), 230 (18500), 248 (17200), 282 (2200) nm; IR (NaCI) vmax, 3376, 2965, 1755, 1728, 1712,1678, 1504,1258,1150,1067, 732 cm'¹, ’H RMN (CDCI3) unitatea A δ 7,28-7,33 (10-H/14-H/11H/13-H; m), 7,22 (12-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,8/6,4/6,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6,01 (7-H; dd, 15,8/8,7), 5,88 (2-H; d, 15,8), 5,06 (5-H; bm, W_1/2 - 20 Hz), 2,62 (6-H; m), 2,53 (4-H2; bm, W_V2 « 15 Hz), 1,12 (6-CH₃; d, 6,8); unitatea Β δ 7,18 (5-H; d, 2,0), 7,05 (9-H; dd, 8,5/2,0),

6,83 (8-H; d, 8,5), 6,49 (NH; d, 7,9), 5,06 (2-H; bm, W_1/2 - 20 Hz), 4,79/4,70 (CH₂CCI₃; AB q, -11,7), 3,85 (OCH₃; s), 3,20 (3-Hb; dd, -14,1/5,8), 3,07 (3-Ha; dd, -14,1/6,7); unitatea C 5,38 (NH; bt, 6,5), 3,27 (3-H2; d, 6,5), 1,20 (2-CH₃; s), 1,15 (2-CH₃,; s); unitatea D 4,92 (2-H; dd, 10,0/3,8), 1,72 (4-H; bm, W_1fi - 20 Hz), 1,67 (3-H_b; ddd, -14,1/10,0/5,0/), 1,56 (3-Ha; ddd, 14,1/9,1/3,8), 1,43 (CO₂CMe₃; s), 0,86 (4-CH₃; d, 6,4), 0,82 (5-H₃; d, 6,4), ¹³C RMN (CDCI₃) 6 unitatea A δ 165,4 (1), 139,3 (3), 136,9 (9), 131,7 (8), 130,1 (7), 128,6 (11/13),

127,5 (12), 126,2 (10/14), 125,4 (2), 76,5 (5), 41,1 (6), 33,4 (4), 16,7 (6-Me); unitatea Β δ 170,0 (1), 154,1(7), 131,2 (5), 128,8 (4), 128,5 (9), 122,3 (6), 112,1(8), 94,3 (CH₂CCI₃), 74,6 (CH₂CCI₃), 56,1 (7-OMe), 53,2 (2), 36,6 (3); unitatea C 176,9 (1), 156,4 (CO₂CMe₃), 79,1 CO₂CMe₃), 48,7 (3), 44,0 (2), 22,8 (2-Me), 22,3 (2-Me¹); unitatea D 170,7 (1), 71,4 (2), 39,5 (3), 28,4 (CO₂CMe₃), 24,8 (4), 23,0 (4-Me), 21,4 (5).

Amino acid R

La amino acidul Q (100 mg, 0,11 mmol), se adaugă praf de Zn activat (400 mg, exces) și AcOH (4 ml). Amestecul heterogen se supune sonicării, timp de 45 min, se agită încă 90 min, la temperatura camerei și apoi se toarnă pe un strat de Celită. Materialul organic se spală de pe stratul de celită cu CH₂CI₂. Solventul se îndepărtează sub vid, obținându-se acidul carboxilic, sub forma unui solid amorf incolor.

Acidul brut nepurificat se dizolvă în acid trifluoracetic (TFA, 5 ml) și se lasă la temperatura camerei timp de 1 h. Apoi se îndepărtează excesul de TFA sub vid și solidul amorf rezultat se purifică cromatografie (Sep-Pak™, silice inițial cu CH₂CI₂ apoi cu 10% MeOH/ CH₂CI₂), obținându-se sarea trifluoracetat de amoniu a compusului dorit. Liofilizarea repetată a soluției apoase de sare a condus la amino acidul liber R sub forma unui solid amorf incolor (68 mg, 91% în cele două etape); IR (NaCI) v^ 3300, 3200,2965,1693,1606,1504,1441,

1259,1201,1146,1066, 727 cm’¹,¹H RMN (CD₃OD) δ unitatea A: 7,33 (10-H/14-H; d, 7,4), 7,28 (11-H/13-H; t, 7,4), 7,18-7,23 (12-H; m), 6,69 (3-H; ddd, 15,6/7,7/7,0), 6,43 (8-H; d,

15,8), 6,04 (7-H; dd, 15,8/8,9), 6,00 (2-H; d, 15,6), 5,01 (5-H; ddd, 9,1 /6,9/3,1), 2,64 (4-Hb; bm, W_iy2 « 30 Hz), 2,60 (6-H; bm, W_ie » 20 Hz), 2,49 (4-Ha; ddd, 15,8/9,1/7,7), 1,13 (6-Me; d, 6,7); unitatea B 7,18-7,23 (5-H; m), 7,11 (9-H; dd, 8,3/1,6), 6,92 (8-H; d, 8,3), 4,59 (2-H; bm, W_1/2 - 20 Hz), 3,81 (OCH₃; s), 3,14 (3-Hb; dd, -13,7/4,3), 2,96 (3-Ha; m, W_1/2 - 20 Hz); unitatea C 2,96 (3 H2; bm, W_1/2 ® 20 Hz), 1,31 (2-CH₃; s), 1,25 (2-CH₃·; s); unitatea D 4,90 (2-H; dd, 9,6/4,0), 1,66 (4-H; bm, W_1/2 « 25 Hz), 1,59 (3-Hb; ddd, -14,4/9,6/4,8), 1,53 (3-Ha; ddd, 14,4/9,1/4,0), 0,81(4-Me; d, 6,5), 0,74 (5-H3; d, 6,5), ¹³C RMN(CD₃OD) 6 unitatea A 167,7(1), 140,7 (3), 138,4 (9), 133,0 (8), 131,7 (7), 129,6(11/13), 128,5 (12), 127,3(10/14),

127.1 (2), 78,4 (5), 43,1 (6), 35,7 (4), 17,4 (6-Me); unit B 179,8 (1), 155,2 (7), 132,3 (4),

132.1 (5), 130,1 (9), 123,0 (6), 113,4 (8), 56,6 (7-OMe), 56,6 (2), 37,8 (3), unit C 176,8 (1),

48,2 (3), 42,2 (2), 23,3 (2-Me), 23,3 (2-Me‘); unit D 172,0 (1), 73,4 (2), 40,7 (3), 26,0 (4),

23.1 (4-Me), 21,8 (5),

Criptoficină 51

La o soluție de aminoacid T (75 mg, 0,11 mmoli) în DMF anhidru (20 ml), sub argon, s-a adăugat la temperatura camerei, sub agitare, diizopropiletilamină (DlEA, 44 mg, 60 pl,

0,34 mmol, « 3 echiv.) urmată de pentafluordifenilfosfinat (FDPP, 55 mg, 0,14 mmol, = 1,3 echiv.) în DMF (2 ml). Amestecul a fost agitat 12 h, s-a adăugat Et₂O (40 ml), iar stratul de eter a fost spălat succesiv cu HCI (1M, 40 ml), soluția saturată de clorură de sodiu (40ml)

3315

3320

3325

3330

3335

3340

3345

3350

3355

RO 118931 Β1 și apă (40 ml), după care s-a uscat (MgSO₄) și s-a evaporat sub vid. Produsul solid sub formă de ceară s-a purificat în continuare, prin cromatografie cu fază inversă (ODS, 10 μ, 30% H₂O/MeCN, 3 ml. min’¹), rezultând criptoficină 51 sub forma unui solid amorf fără culoare (45 mg, 61%), [a]D +26,4°C (c 0,25, CHCI3); EIMS m/z 652/654 (M⁺, 3/1), 632/634 (3/2), 426/428 (51/15), 227 (64), 195/197 (64/22), 155/157 (71/15), 131(59), 91 (100); HREIMS m/z 652,2936 (C36H₄₅N₂O₇ ^Cl, Δ -2,1 mmu); UV (MeOH) (ε) 204 (52000), 228 (20400), 250 (13400), 284 (2800) nm; IR (NaCI) v_max 3376, 3270, 2960, 1747, 1721,1659, 1536, 1514, 1259, 1150, 1066, 1013, 980, 694 cm’¹, Ή RMN (CDCI3)5 unitatea A 7,32 (10-H/14-H; dd, 8,0/1,5), 7,29 (11-H/13-H; t, 8,0), 7,24 (12-H; bm, W1/2 * 15 Hz), 6,77 (3-H; ddd, 15,2/10,8/4,3), 6,40 (8-H; d, 15,8), 6,01 (7-H; dd, 15,8/8,8), 5,76 (2-H; dd, 15,2/1,1), 5,04 (5-H; ddd, 11,1/6,4/1,9), 2,54 (4-Hb/6-H; bm, W1/2 = 15 Hz), 2,37 (4-Ha; ddd, -14,3/ 11,1/10,8), 1,13 (6-Me; d, 6,8); unitatea B 7,20 (5-H; d, 2,0), 7,05 (9-H; dd, 8,4/2,0), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,61 (NH; d, 7,8), 4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,4), 3,87 (OMe; s), 3,11 (3-Hb; dd, -14,2/5,4), 3,06 (3-Ha; dd, -14,2/7,6); unitatea C 7,24 (NH; bm, Wie ® 15 Hz), 3,40 (3-Η^ dd, -13,5/8,5), 3,12 (3-H2; dd, -13,5/3,6), 1,22 (2-Me; s), 1,15 (2-Me¹, s); unitatea D 4,85 (2-H; dd, 10,2/3,6), 1,66 (3-Hb; ddd, 14,0/10,2/4,6), 1,61 (4-H; bm W_1/2 - 20,0 Hz), 1,33 (3-Ha; ddd, -14,0/9,0/3,6), 0,74 (4 Me; d, 6,6), 0,72 (5-H3; d, 6,6), ¹³C RMN (CDCI₃) 6 unit A 165,1 (1), 142,2 (3), 136,7 (9), 131,7 (8), 130,1 (7), 128,6 (11/13), 127,5 (12), 126,1 (10/ 14), 124,6 (2), 77,0 (5), 42,2 (6), 36,5 (4), 17,3 (6-Me); unitatea B 170,3 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,3 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2), 35,3 (3); unitatea C 178,0 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,8 (2-Me), 22,6 (2-Me*); unitatea D 170,6 (1), 71,5 (2), 39,5 (3) ,24,5 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).

Exemplul 9. Sinteza Criptoficinei 52 și Criptoficinei 53

La o soluție, sub agitare, de Criptoficină 51 (75 mg, 0,12 mmol) în diclormetan anhidru (7,5 ml) la 0°C s-a adăugat sub argon, o soluție de acid m-cloroperbenzoic (mCPBA, 50 mg, 0,23 mmoli, ® 2 echiv. considerând 80% oxigen activ) în diclormetan (1 ml). După 30 min, amestecul de reacție s-a încălzit la temperatura camerei și s-a agitat încă 12 h. Solventul, apoi, s-a îndepărtat sub vid rezultând un amestec 1,8:1 de criptoficine 52 și 53 (prin analiză RMN), sub formă de solid amorf. Amestecul de epoxizi regioizomeri s-a dizolvat întro cantitate minimă de acetonitril și s-a supus la cromatografie cu fază inversă (IMC-ODS, 10 μ, 250 mm x 22,5 mm, 30% H₂O/MeCN, 6 ml.min'¹) pentru a separa Criptoficină 52 (37 mg, 48%) și Croptoficina 53 (19 mg, 25%).

Date spectrale ale Criptoficinei 52 [a]_D +19,9° (c 0,5, CHCI₃); EIMS m/z 668/670 (4/2, M⁺), 445 (35), 244 (12), 227 (22), 195/197(66/27), 184(45), 155/157(38/10), 91 (100); HREIMS m/z 668,2873 (C^NA^CI, A-0,9mmu), 445,2497 (C25H35NO6, Δ-3,3 mmu); UV (MeOH) Ămax (ε) 204 (35100), 218 (20900) nm; IR (NaCI) vmax 3415, 3270, 2960, 1748, 1721, 1650, 1536, 1504, 1260, 1192, 1150, 1066,1013, 800, 698 cm¹, Ή RMN (CDCI3) δ unitatea A 7,33-7,38 (11-H/12-H/13-H; bm, W_1/2 - 25 Hz), 7,24 (10-H/14-H; m, W_1/2 - 15 Hz), 6,76 (3-H; ddd, 15,1/10,8/4,3), 5,71 (2-H; dd, 15,1/1,7), 5,20 (5-H; ddd, 11,0/5,0/1,8), 3,68 (8-H; d, 1,9), 2,92 (7-H; dd, 7,5/1,9), 2,57 (4-Hb; ddd, -14,6/1,8/1,7), 2,45 (4-Ha; ddd, -14,6/11,0/10,8), 1,78 (6-H; bm, W_1/2 - 15 Hz), 1,14(6-Me; d, 6,9); unit B 7,18 (5-H; d, 2,2), 7,04 (9-H; dd, 8,4/2,2), 6,83 (8-H; d, 8,4), 5,56 (NH; d, 7,9), 4,73 (2-H; ddd, 7,9/7,4/5,3), 3,87 (OMe; s), 3,09 (3-H_b; dd, -14,6/5,3), 3,05 (3-Ha; dd, -14,6/7,4); unit C 7,20 (NH; dd, 8,6/3,2), 3,41 (3-H_b; dd, -13,4/8,6), 3,10 (3-Ha; dd, -13,4/3,2), 1,22(2-Me; s), 1,15 2-Me'; s); unitatea D 4,82 (2-H; dd, 10,2/3,5), 1,73 (3-H_b; bm, W_1/2 * 20 Hz), 1,66 (4-H; bm, W_1/2 20 Hz), 1,31 (3-Ha; ddd, -13,8/9,1/3,5), 0,84 (4 Me; d, 6,6), 0,82 (5-H3; d, 6,6); ¹³C RMN (CDCI₃) δ unitatea A 164,9 (1), 141,8 (3), 136,7 (9), 128,7 (11/13), 128,3 (12), 125,6 (10/14), 124,7 (2), 75,9 (5), 63,0 (7), 59,0 (8), 40,7 (6), 36,9 (4) , 13,5 (6-Me), unitatea B 170,3 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,5 (9), 122,6 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), unitatea C 178,0 (1), 46,5 (3), 42,8 (2), 22,8 (2-Me), 22,8 (2-Me¹), unitatea D 170,5 (1), 71,2 (2), 39,3 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,2 (5).

RO 118931 Β1

Date spectrale ale Criptoficinei 53 [a]_D +20,8° (c 1,7, CHCI₃); EIMS m/z 668/670 (5/4, M⁺), 445 (32), 244 (15), 227 (24), 195/197 (64/21), 184 (60), 155/157 (33/9), 91 (100); HREIMS m/z 668,2853 (C36H45N2O8³⁵CI, Δ 1,1 mmu); UV (MeOH) Ămax (e) 204 (38700), 218 (22900) nm; IR (NaCI) v_max 3415, 3280, 2917, 2849, 1748, 1722, 1660, 1504, 1465, 1260, 1190, 1150, 1066, 755 cm'¹, ¹H RMN (CDCI3) δ unitatea A 7,29-7,36 (11-H/12-H/13-H, bm, W1/2 - 20 Hz), 7,23 (10-H/14-H; dd, 8,3/1,7), 6,77 (3-H; ddd, 15,1/10,9/4,3), 5,81 (2-H; dd, 15,1/1,3), 5,17 (5-H; ddd, 11,2/4,9/1,8), 3,58 (8-H; d, 1,7), 2,90 (7-H; dd, 7,8/1,7), 2,67 (4-Hb; ddd, 14,7/11,2/10,9), 2,56 (4-Ha; dddd, 14,7/4,3/1,8/1,3), 1,67-1,78 (6-H; bm, W1/2 = 45), 1,03 (6-CH3; d, 7,1); unitatea B 7,21 (5-H; d, 2,1), 7,07 (9-H; dd, 8,5/2,1), 6,84 (8-H; d, 8,4), 5,90 (2-NH; d, 7,9), 4,75 (2-H; ddd, 7,9/7,9/4,9), 3,85 (7-OCH3; s), 3,14 (3-Hb; dd, 14,5/4,9), 3,03 (3-Ha; dd, 14,5/7,9); unitatea C 7,29-7,36 (3-NH; bm, Wrn=2S), 3,43 (3-Hb; dd, 13,7/8,8), 3,10 (3-Ha; dd, 13,7/3,4), 1,23 (2-CH3; s), 1,17 (2-CHa; s); unitatea D 4,92 (2-H; dd, 10,3/3,2), 1,67-1,78 (3-Hb/4-H; bm, Wie = 45), 1,48 (3-Ha; ddd, 13,9/8,8/3,2), 0,89 (4-CH3; d, 6,6), 0,86 (5-H3; d, 6,6), ¹³C RMN (CDCI3) δ unitatea A 165,1 (1), 142,0 (3), 137,0 (9), 128,5 (11/13), 128,5 (12), 125,3 (10/14),

124.6 (2), 76,7 (5), 63,2 (7), 56,2 (8), 40,8 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); unitatea B 170,4 (1), 154,0 (7), 130,8 (5), 129,7 (4), 128,2 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (7-OMe), 54,4 (2), 35,3 (3); unit C 177,9 (1), 46,4 (3), 42,7 (2), 23,0 (2-Me), 22,7 (2-Me¹); unit D 170,5 (1), 71,3 (2),

39,2 (3), 24,7 (4), 22,8 (4-Me), 21,3 (5).

Exemplu 10. Sinteza Criptoficinei 55

La o soluție de Criptoficină 52 (6 mg, 0,009 mmoli) în 0,6 ml 1,2-dimetoxietan/apă 2:1 s-au adăugat 2 μΙ de Hcl 12N. Soluția s-a agitat la temperatura camerei, timp de 20 h, s-a neutralizat cu carbonat de potasiu, s-a filtrat prin filtru de 5 μ și s-a evaporat. Produsul solubil în acetonitril s-a purificat prin HPLC în fază inversă pe C18 (coloana 250 x 10 mm) folosind MeOH/H₂O 4:1 cu obținerea a 3,0 mg de Criptoficină 55 (48%). [a]_D +42,5° (c 1,1, CHCI₃); EIMS m/z 704/706/708 (M⁺ < 1), 668/670 (1,5/0,5, M⁺-HCI), 445 (6), 226 (8), 195/ 197 (16/5), 184 (10), 155/157 (33/11), 135 (100), 91 (99), 77 (30); HREIMS m/z 668,2873 (M⁺-HCI, C36H45N2O8³⁵CI, Δ- 0,8 mmu); UV (MeOH) λ (ε) 204 (48400), 218 (29200), 284 (1600) nm; IR (NaCI) vmax 3410, 3286, 2959, 1748, 1723, 1666, 1538, 1504, 1455, 1257, 1178, 1066, 753 cm¹,¹H RMN (CDCI₃) δ unitatea A 7,35-7,42 (10-H/II-H/12-H/13-H/14-H; m), 6,78 (3-H; ddd, 15,1/10,6/4,5), 5,78 (2-H; dd, 15,1/1,7), 5,16 (5-H; ddd, 11,1/8,3/2,1), 4,65 (8-H; d, 9,7), 4,01 (7-H; bd, 9,7), 2,69 (4-H_b; dddd, -14,5/4,5/2,1/1,7), 2,50 (6-H; bm, W_1/2 = 15), 2,38 (4-H₂; ddd, -14,5/11,1/10,6), 1,53 (7-OH, s), 1,04 (6-Me, d, 7,1); unitatea B

7,21 (5-H; d, 2,2), 7,07 (9-H; dd, 8,5/2,2), 6,85 (8-H; d, 8,5), 5,57 (2-NH; d, 7,8), 4,74 (2-H; ddd, 7,8/7,6/5,2), 3,88 (7-OCH₃; s), 3,13 (3-H_b; dd, 14,5/5,2), 3,05 (3-H₂; dd, 14,5/7,6); unitatea C 7,21 (3-NH; m), 3,38 (3-H_b; dd, 13,5/8,3), 3,17 (3-Ha; dd, 13,5/4,1), 1,23 (2-CH₃; s), 1,17 (2-CH₃,; s), unitatea D 4,93 (2-H;dd, 10,1/3,5), 1,78 (3Hb; ddd, 13,5/10,1/5,0), 1,72 (4-H; bm, W_1/2 20), 1,43 (3-H₂; ddd, 13,5/8,8/3,5), 0,92 (4-CH₃; d, 6,6), 0,92 (5-H3, d, 6,4), ¹³C RMN (CDCI₃) δ unitatea A 165,1 (C-1), 142,4 (C3), 138,4 (C-9), 129,0 (C-11/13), 128,3 (C-12), 128,0 (C-10/14), 124,6 (C-2), 76,1 (C5), 74,1 (C-7), 62,0 (C-8), 38,4 (C-6), 36,5 (C4), 8,6(6-Me); unitatea B 170,3 (C-1), 154,1 (C-7), 130,9 (C-5), 129,6 (C-4), 129,2 (C-9),

122.6 (C-6), 112,3 (C-8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (C-2), 35,3 (C-3); unitatea C 177,8 (C-1), 46,5 (C-3), 42,8 (C-2), 22,9 (2-Me), 23,0 (C-2-Me¹); unitatea D 170,3 (C-1), 71,3 (C-2), 39,7 (C-3), 24,8 (C-4), 22,7 (4-Me), 21,6 (C-5). De asemenea s-a obținut și diolul corespunzător Criptoficina 56 (2,8 mg, 44%).

Exemplul 11. Sinteza Criptoficinei 57

O cantitate mică de PtO₂ ( 1 mg) s-a adăugat într-un vas de reacție, conținând

0,5 ml CH₂CI₂. S-a evacuat aerul din vas, s-a purjat hidrogen și amestecul a fost agitat la temperatura camerei, 20 min. S-a adăugat o soluție conținând 10,2 mg de Criptoficină 52

3415

3420

3425

3430

3435

3440

3445

3450

3455

RO 118931 Β1 (0,015 mmoli) în CH₂CI₂ (0,3 ml) și amestecul s-a agitat la temperatură încă 30 min. Catalizatorul a fost îndepărtat prin filtrare pe Celită/bumbac și solventul a fost îndepărtat in vacuo. HPLC în fază inversă a reziduului (ODS, 10 μΙ, 250 x 22,5 mm, MeCN/H₂O (3:1), 5 ml. min'¹) dă Criptoficină 57 pură (9,l mg, 89%), [o]D +3,4 (c=4,5, CHClj); EIMS m/z 670/672 (M⁺, 9/3), 447 (10), 246 (63), 229 (20), 195/197 (78/25), 184 (58), 155/157 (39/13), 128 (21), 91 (100), 77(23); HREIMS m/z 670,3037(C36H₄₇N₂O^³⁵CI Δ-1,6 mmu); UV(MeOH) A^ (ε) 204 (31400), 218 (12000), 284 (1200) nm; ¹H RMN (CDCI₃) δ unitatea A: 7,30-7,37 (11/12/13-H, bm), 7,23 (10/14-H, bdd, 7,9,1,9), 5,03 (5-H, ddd, 9,0, 5,6, 3,4), 3,66 (8-H, d, 2,1), 2,89 (7-H, dd, 7,7,

2.1) , 2,27 (2-H_b, ddd, 14,3, 8,7, 6,2), 2,04 (2-H_a, ddd, 14,3, 8,8, 6,8), 1,64-1,75 (6-H/4-H₂, bm), 1,61(3-H₂, bm, W_1C * 25), 1,11 (6-CH₃, d, 7,1), unitatea B: 7,19 (5-H, d, 2,1), 7,04 (9-H, dd, 8,3, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8,3), 5,55 (2 NH, d, 8,3), 4,65 (2-H, ddd, 8,3, 7,3, 5,3), 3,87 (7-OCH₃, s), 3,16 (3-H_b, dd, 14,3, 7,3), 3,08 (3H₂, dd, 14,3, 5,3), unitatea C: 6,91 (3-NH, dd, 6,4, 6,4), 3,41 (3H_a, dd, 13,5, 6,4), 3,30 (3H_a, dd, 13,5, 6,4), 1,21 (2-CH₃, s), 1,13 (2-CH₃, s), unitatea D: 4,80 (2-H, dd, 9,8,4,1), 1,64-1,75 β-Η^-Η, bm), 1,34 (3-H_a, ddd, 15,4,10,1,

4.1) , 0,86 (4-CH₃, d, 6,5), 0,84 (5-H₃, d, 6,5); ¹³C RMN (CDCI₃) δ unitatea A: 172,6 (1), 136,9 (9), 128,7 (11/13), 128,5 (12), 125,6 (10/14), 76,8 (5), 63,4 (7), 59,2 (8), 40,2 (6), 36,2 (2),

32,2 (4), 21,4 (3), 13,6 (6-Me), unitatea B: 170,4 (1), 154,0 (7), 131,1 (5), 130,0 (4), 128,5 (9), 122,5 (6), 112,2 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), unitatea C: 177,6 (1), 47,0 (3),

43.1 (2), 22,5 (2-Me¹), 22,4 (2-Me), unitatea D: 171,7 (1), 72,0 (2), 39,0 (3), 24,6 (4), 22,8 (4 Me), 21,8(5).

Exemplul 12. Sinteza Criptoficinei 58

La o soluție sub agitare, de Criptoficină 57 (5,5 mg, 0,008 mmol) în 3 ml etanol fără cloroform la aprox.-60°C, s-a adăugat TMSCI (utilizat cum rezultă din reacția Aldrich, aprox.

4,5 mg, aprox. 5,2 μΙ, aprox.0,04 mmoli). Amestecul de reacție a fost agitat 20 min, timp în care tic a indicat că nu a mai rămas nimic din reactanții inițiali. în continuare, produșii volatili s-au îndepărtat sub vid, rămânând un solid amorf. Acest material s-a turnat în acetonitril și s-a supus la HPLC (ODS, 10 μ, 250 x 22,5 mm, MeCN/H₂O (3:1), 5 ml min'¹) rezultând Criptoficină 58 pură (5,4 mg, 93%) produs principal. [a]D +7,2 (c=2,1, CHCI3); EIMS m/z 706/ 708/710 (M⁺, 27/23/8), 670/672 (M⁺-HCI, 14/13), 583 (54), 581 (53), 485 (23), 483 (21), 447 (34), 294 (21), 282 (39), 246 (57), 195/197 (87/27), 184 (73), 155/157 (45/10), 128 (30), 91 (95), 77 (30), 69 (100); HREIMS m/z 706,2844 (C^NA^CL,, Δ-5,6 mmu), m/z 670,3070 (M⁺-HCI, CgeHpNaO^CI, Δ-4,9 mmu); UV (MeOH) Amax (ε) 204 (331900), 218 (11800), 284 (1800) nm; ¹H RMN (CDCI3) δ unitatea A: 7,34-7,42 (10/11/12/13/14-H, bm), 5,01 (5-H, ddd, 9,6, 8,3, 2,5), 4,65 (8-H, d, 9,6), 4,00 (7-H, dd, 9,6, 1,9), 2,42 (6-H, ddq, 8,3, 1,9, 7,0), 2,29 (2-Hb, ddd, 14,3, 9,4, 4,5), 2,06 (2-Ha, ddd, 14,3, 8,3, 7,5), 1,62-1,82 (3^4-^, bm), 0,99 (6-CH3, d, 7,0), unitatea B: 7,20 (5-H, d, 2,1), 7,06 (9-H, dd, 8,3, 2,1), 6,84 (8-H, d, 8,3), 5,62 (2-NH, d, 8,3), 4,61 (2-H, ddd, 8,3, 7,7, 5,4), 3,87 (7-OCH3, s), 3,17 (3-Hb, dd, 14,3, 7,7), 3,11 (3-Ha, dd, 14,3, 5,4), unitatea C: 6,97 (3-NH, dd, 6,4, 6,2), 3,43 (3-Ha, dd, 13,4, 6,2), 3,31 (3-H2, dd, 13,4, 6,4), 1,23 (2-CH3, s), 1,16 (2-CH3, s), unitatea D: 4,93 (2 H, dd, 10,0, 4,0), 1,86 (3-Ha, ddd, 14,0, 10,0, 5,5), 1,58 (3H2, ddd, 14,0, 8,3, 4,0), 0,97 (4-CH3, d, 6,8), 0,94 (5-H3, d, 6,6); ¹³C RMN (CDCI3) δ unitatea A: 172,8 (1), 138,7 (9), 129,0 (12), 128,9 (11/13), 128,0 (10/14), 76,5 (5), 73,8 (7), 62,1 (8), 38,1(6), 35,9 (2), 31,8 (4), 21,4 (3), 8,7 (6-Me), unitatea B: 170,6 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 130,2 (4), 128,5 (9), 122,4 (6), 112,2 (8),

56.1 (7-OMe), 54,4 (2), 35,0 (3), unitatea C: 177,2 (1), 47,0 (3), 43,2 (2), 22,5 (2-Me¹), 22,4 (2-Me), unitatea D: 171,8 (1), 72,0 (2), 39,4 (3), 24,9 (4), 22,9 (4-Me), 21,7 (5).

Exemplul 13. Sinteza Criptoficinei 61

La o soluție de Criptoficină 53 (5 mg, 0,007 mmol) în 0,5 ml benzen uscat s-a adăugat sulfură de trifenilfosfină (4 mg, 0,014 mmol) urmată de 0,65 μΙ de acid trifluoracetic, ca soluție în benzen uscat (100 μΙ). Soluția s-a agitat apoi la temperatura camerei, timp de 6 h,

RO 118931 Β1 s-a neutralizat cu bicarbonat de sodiu, s-a filtrat și s-a evaporat. Reziduul s-a extras cu apă și CH₂CI₂. Produsul solubil în CH₂CI₂ s-a purificat prin cromatografie în fază inversă HPLC pe C18, folosind MeCN/H₂O 4:1 obținându-se Criptoficină 61 pură (1,9 mg, 37%), [a]₀+28,4 (c=0,7, CHCIg); EIMS m/z 684/686 (M⁺, neobservat), 652/654 (M⁺-S, 5/4), 426/428 (90/29), 294 (10), 227(100), 195/197(57/20), 184(20), 155/157(34/9), 131 (45), 129 (44), 91 (76), 77 (27); HREIMS m/z 652,2973 (M⁺-S, C^NA^CI, Δ-5.8 mmu); UV (MeOH) (ε) 204 (26700), 218(11600), 284(820) nm; IR(NaCI) vmax 3410, 3271, 2958, 1749, 1724, 1670, 1503, 1463, 1258, 1176, 1066, 758 cm'¹, Ή RMN (CDCI3) δ unitatea A 7,29-7,34 (11/12/ 13-H; m), 7,25 (10/14-H, bd, 6,6), 6,73 (3-H, ddd, 15,2/10,6/4,5), 5,66 (2-H; dd, 15,2/1,7),

5.22 (S-H, ddd, 11,2/4,2/2,0), 3,68 (8-H, d, 5,1), 3,01 (7-H, dd, 8,4/5,1), 2,52 (4-H_b, dddd, 14,4/4,5/2,0/1,7), 2,41 (4-H_a, ddd, -14,4/11,2/10,6), 1,68-1,74 (6-H, m), 1,14 (6-Me, d, 6,9); unitatea B 7,18 (5-H, d, 2,2), 7,04 (9-H, dd, 8,4/2,2), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,45 (NH, d, 7,8),

4,75 (2-H, ddd, 7,8/7,3/5,4), 3,87 (OMe, s), 3,09 (3-H_b, dd, -14,5/5,4), 3,05 (3 H₂, dd, -14,5/

7,3); unitatea C7,17 (NH, dd, 8,3,3,9), 3,39 (3-H_b, dd, -13,5/8,3), 3,14 (3-H_a, dd, -13,5/3,9),

1.23 (2-Me, s), 1,16 (2-Me¹, s); unitatea D 4,86(2-H, dd, 10,2/3,4), 1,77 (3-Hb> ddd, -14,0/ 10,2/4,9), 1,68-1,74 (4-H, m), 1,42 (3Ha, ddd, -14,0/8,7/3,4), 0,92 (4-Me, d, 6,6), 0,88 (5-H3, d, 6,4), ¹³C RMN (CDCI3) δ unitatea A 164,9 (1), 141,7 (3), 138,3 (9), 128,8 (11/13), 128,0 (12), 126,7 (10/14), 124,7 (2), 76,6 (5), 45,8 (7), 43,9 (8), 43,9 (6), 36,6 (4), 16,0 (6-Me), unitatea B 170,2 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,4 (4), 128,3 (9), 122,8 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,2 (2), 35,3 (3), unitatea C 177,9 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,9 (2-Me), 22,8 (2-Me¹), unitatea D 170,4 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,7 (4), 22,7 (4-Me), 21,4 (5).

Exemplul 14. Sinteza Criptoficinei 81

Compusul S

Compound S este derivatul tert-butildifenilsilil eter(TBDMS) al F.

Compusul T

La 10 ml de soluție de clorură de p-metoxibenziltrifenilfosfonium (1 mmoli) în THF, la -78°C s-a adăugat 400 μ\ soluție de butillitiu (1 mmol, 2,5 M în hexan). Amestecul a fost agitat 30 min, iar apoi o fracție 2,64 ml s-a adăugat la 3 ml de a THF soluție de aldehidă S (75,0 mg, 0,24 mmoli) la - 78°C. După 30 min, s-a oprit răcirea, dar agitarea s-a continuat încă 2 h, timp în care temperatura s-a ridicat treptat la 25°C. Reacția s-a stopat cu soluție saturată de clorură de amoniu și THF s-a evaporat. Produșii s-au extras de două ori cu hexan și stratul organic combinat s-a spălat cu soluție saturată de clorură de sodiu, s-a uscat, iar apoi s-a concentrat. Reziduul s-a supus cromatografiei rapid pe coloană cu silicagel (3% EtOAc/hexan) rezultând 63 mg de compus T și 40 mg de amestec T și izomer Z. Compusul T are următoarele proprietăți:[a]_D+110,5° (CHCI₃, c 0,75); IR v_max 2956, 2857, 1724,1608, 1511,1428,1250,1173,1111,1037, 821, 703, 505 cm'; EIMS m/z (intensitate relativă %) 497( < 1, M⁺-OMe), 471(31, M⁺-But, 367(56), 294(31), 199(75), 135(100); EIMS cu înaltă rezoluție 497,24770 (calculat pentru C32H37O3Si, Δ+3,5 mmu, M⁺-OMe), 471,19859 (calculat pentruC2gH₃₁O₄Si, Δ+0,6 mmu, M⁺-Bu), ¹H RMN δ 7,71/7,68 (SiPh2, 2'-H, 6^,-H/2-H, 6-H; d; 6,5), 7,45/7,43 (SiPh2, 4'-H/4-H; t; 7,4), 7,39/7,38 (SiPh₂, 3‘-H, 5'-H/3-H, 5-H; dd; 7,4,

6,5), 7,24 (10-H, 14-H; d; 8,7), 6,85 (11-H, 13-H; d; 8,7), 6,79 (3-H; dt; 15,7, 7,5), 6,19 (8-H, d, 16,1), 6,00 (7 H, dd, 16,1,8,1), 5,66 (2-H, dt, 15,7, 1,3), 3,82 (5-H, m), 3,81 (-OCH₃, S),

3,69 (CO₂CH₃, S), 2,41 (6-H, m), 2,36 (4-H, m), 2,30 (4-H, m), 1,12 (6-CH₃, d, 7,0), 1,09 (CMe₃, S), ¹³C RMN δ 166,7 (1), 158,8 (12), 146,0 (3), 136,0 (SiPh₂, 2', 672, 6), 134,1/

133,7 (SiPh₂, 171), 130,4 (9), 130,0 (8), 129,7/129,6 (SiPh₂, 474), 129,5 (7), 127,6/127,5 (3', 57 3, 5), 127,1 (10, 14), 122,8 (2), 113,9 (11, 13), 76,4 (5), 55,2 (OCH₃), 51,3 (CO₂CH₃), 42,1 (6), 37,1(4), 27,0 (CMe₃), 19,5 (CMe₃), 16,2 (6-CH₃).

Compus T suplimentar s-a obținut din amestecul de T și de izomer Z. 40 mg de amestec de izomeri E și Z s-a dizolvat în 4 ml de soluție benzenică conținând tiofenol (0,02M, și ACN (0,006M). Amestecul s-a încălzit la reflux pentru 5h. Prin prelucrare și purificare pe o coloană scurtă cu Si s-au obținut 37,2 mg compus T.

3510

3515

3520

3525

3530

3535

3540

3545

3550

3555

RO 118931 Β1

Compusul U

La 6 ml soluție acetonică de compus T (76 mg, 0,15 mmoli) s-au adăugat 4,4 ml de 1N LiOH în apă. Soluția limpede s-a agitat peste noapte. S-a evaporat acetona și soluția apoasă s-a acidulat cu 1N HCI. Produsul s-a extras de trei ori cu EtOAc. Stratul organic s-a uscat și concentrat. Prin purificare pe coloană cu silicagel (20% EtOAc/hexan cu 0,5% AcOH) se obțin 62,2 mg acid al compusului U (81%); [a]_D +120,8° (CHCIg, c 3,1); IR v_max2960, 2858, 1695, 1650, 1511, 1427, 1250, 1111, 1036, 702 cm¹; ¹H RMN δ 7,73/7,70 (SiPh2, 2'-H, 6'-H/2-H, 6-H, d, 7,0), 7,50 (SiPh2, 4'-H/4-H, m), 7,44 (SiPh2, 3'-H, 5'-H/3-H, 5^M-H, m), 7,29 (10-H, 14-H, d, 8,6), 6,96 (3-H; dt; 15,6, 7,8), 6,89 (ll-H, 13-H, d, 8,6), 6,22 (8-H, d, 16,0), 6,03 (7 H, dd, 16,0, 7,9), 5,70(2-H, d, 15,6), 3,88 (5-H, m), 3,83 (OCH3, S), 2,43 (6-H, m), 2,40 (4-H, m), 1,17 (6-CH₃, d, 6,9), 1,14 (CMe₃, s); ¹³C RMN, 171,7 (1), 158,8 (12), 148,8 (3), 135,0 (SiPh₂, 2', 672, 6), 133,9/133,7 (SiPh₂, 171), 130,3 (9), 130,0 (8),

129,7 (SiPh₂, 474), 129,4 (7), 127,6 (SiPh₂, 3', 573, 5), 127,1 (10, 14), 122,5 (2), 113,9 (11, 13), 76,2 (5), 55,2 (OCH₃), 42,3 (6), 37,1(4), 27,0 (CMe₃), 19,5 (CMe₃), 16,0 (6-CH₃),

Compusul V

Compusul U (59 mg, 0,12 mmol), sarea trifluoracetat a compusului I (57,2 mg, 0,12 mmol) și diizopropiletil amină (DIEA, 62 μΙ, 0,36 mmol) s-au dizolvat în 1,5 ml DMF uscat. La această soluție s-a adăugat FDPP (55 mg, 0,14 mmol), în 0,6 ml DMF) și amestecul de reacție s-a agitat 2 h. S-a adăugat eter și stratul organic s-a spălat succesiv cu 1N HCI, bicarbonat de sodiu saturat și respectiv, soluție saturată de clorură de sodiu. Concentrarea și purificarea prin cromatografie (coloană cu silicagel, 8% EtOAc/hexan) a dat

74,2 mg compus V (72%); [al_D +53,8 (CHCI₃, c 1,6); IR v_max 3286, 2959, 1760,1667,1640, 1607, 1510, 1253, 1174, 1111, 1067, 1027, 703 cm’¹; EIMS m/z (intensitate relativă %) 798/799/800/801/802/803/804/805(31/14/44/17/23/10/6/3, M⁺-But), 766(40), 694/695/696/ 697/698/699/700/701 (70/31/100/38/ 58/19/14/5), 662 (67), 622 (71), 544 (70), 518 (83); EIMS rezoluție înaltă 798,1443 (calculat pentru C40H40CI4NO6Si, Δ-6,4 mmu, M⁺-But), ¹H RMN δ unitatea A 7,69/7,65 (SiPh2, 2'-H, 6'-H/2-H, 6-H; d; 6,5), 7,41 (SiPh₂, 4'-H/4-H, m), 7,35 (SiPh₂, 3'-H, 5-H/3-H, 5-H, m), 7,24 (10-H, 14-H; d, 8,7), 6,85 (ll-H, 13-H, d, 8,7), 6,65 (3-H, dt, 15,3, 7,5), 6,20 (8-H, d, 16,1), 6,03 (7-H, dd, 16,1, 8,0), 5,50(2-H, d, 15,3), 3,81 (OCH₃, S), 3,77 (S-H, m), 2,39 (6-H, m), 2,34 (4-H, m), 2,29 (4-H‘, m), 1,11(6-Me, d, 6,9), 1,06 (CMe₃, S); unitatea B 7,15 (5-H, d, 1,8), 7,00 (9-H, dd, 8,4,1,8), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,65 (NH, d, 7,7), 5,01 (2-H, ddd, 7,7, 6,0, 5,5), 4,78/4,72 (CH₂CCI₃, ABq, 11,9), 3,86 (OMe, S), 3,15 (3-H; dd, 6,1,-14,5), 3,08 (3-H‘, dd, 5,8, -14,5), ¹³C RMN δ unitatea A 165,1(1), 158,8 (12), 142,5 (3), 136,0 (SiPh₂, 2', 672, 6), 134,2/133,6 (SiPh₂, 171), 130,4 (9), 129,9 (8), 129,7/129,6 (SiPh₂, 474), 129,5 (7), 127,6/127,5 (SiPh₂, 3', 573, 5), 127,1 (10, 14), 124,6 (2), 113,9 (11, 13), 76,4 (5), 55,2 (OMe), 42,1 (6), 37,2 (4), 27,0 (CMe₃), 19,5 (CMe₃), 16,6 (6-Me); unitatea B 170,0 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,4 (4/9), 122,5 (6), 112,1(8), 94,2 (CCI₃), 74,7 (CH₂CC1₃), 56,1 (OMe), 52,9 (2) 36,4 (3).

Compusul W

La o soluție de compus V (55,8 mg, 0,065 mmol) în 5,7 ml acetonitril s-au adăugat 2,0 ml de acid fluorhidric 49%, la °C. S-a îndepărtat baia cu gheață după cinci min și amestecul de reacție s-a agitat puternic 17 h. Produsul s-a extras cu eter și extractul s-a spălat succesiv cu bicarbonat de sodiu saturat și soluție saturată de clorură de sodiu. Concentrarea și cromatografia cu fază normală (coloană cu silicagel, 25% EtOAc/hexan) a dat 31,6 mg compus W(79%); [a]_D -3,7° (CHCI₃, c 1,3); IR v_max 3286, 2961, 1756, 1668, 1634, 1607,

1510,1251,1175,1066, 812 cm¹, Ή RMN δ unitatea A 7,27 (10-H, 14-H,d, 8,5),6,93 (3-H, dt, 15,4, 7,6), 6,83 (11-H, 13-H, d, 8,5), 6,34 (8-H, d, 15,9), 5,88 (7-H, dd 15,9, 8,2), 5,86 (2-H, d, 15,4), 3,81 (OMe, S), 3,80 (5-H, m), 2,40 (6-H, m), 2,36 (4-H, m), 1,13 (6-Me, d,

6,8); unitatea B 7,17 (5-H, d, 1,9), 7,05 (9-H, dd, 8,5,1,9), 6,83 (8-H, d, 8,5), 5,90 (NH, d,

RO 118931 Β1

7,7), 5,03 (2-H, ddd, 7,8, 5,9, 5,6), 4,79/4,72 (CH₂CCI₃, ABq, -11,9), 3,86 (OCH₃, S), 3,20 (3-H, dd, 6,0, -14,3), 3,09 (3-H', dd, 5,9, -14,3), ¹³C RMN δ unitatea A 165,2 (1), 159,1 (12), 142,6 (3), 131,3 (9), 129,8 (7), 128,7 (8), 127,3(10, 14), 125,0 (2), 114,0(11, 13),73,8 (5),

55,3 (OMe), 43,3 (6), 37,2 (4), 16,9(6-Me) unitatea B 170,1 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,5 (4/9), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCI₃), 74,7 (CH₂CCI₃), 56,1 (OMe), 53,0 (2), 36,5 (3).

Acid (2S,2R)-2-[3'(terț-butoxicarbonil)amino-2'-metilpropanoil- oxi]-4- meti/pentanoic(AC)

O soluție de (S)-(+)-3-hidroxi-2-metilpropanoat (X) (10g, 85 mmoli) în 300 ml de amoniac în metanol ca, 9M s-a încălzit la 50°C, într-un balon de sticlă, închis timp de 168 h, s-a purjat cu azot pentru a îndepărta excesul de amoniac, iar apoi s-a evaporat la sec sub vid. Reziduul s-a triturat cu eter, rezultând (S)-3-hidroxi-2metilpropanamidă (5,7 g, randament 66%) sub forma unui solid alb cu p.t. 85,5-87,5°C; [a]_D +28,7 (c 3,5, MeOH); EIMS m/z (intensitate relativă) 88 (19, M-Me), 85 (35), 73 (69); HREIMS m/z 88,0397 (C₃H₆NO₂, Δ+0,2 mmu); IR v_max 3384,2960,1671,1473 cm¹; ¹H RMN δ 5,83 (NH; br s), 5,42 (NH; br s), 3,73 (3-H2; m), 2,55 (2-H; m), 1,19 (2-Me; d, 7,2); ¹³C RMN δ 180,7 (1), 65,4 (3), 44,0 (2), 14,5 (2-Me). Analiză Găsit: C, 46,45; H, 8,83, Calculat pentru C4H₉NO₂: C, 46,59; H, 8,79.

O suspensie de (S)-3-hidroxi-2-metilpropanamidă (2,1 g, 20 mmol) în THF anhidru (20 ml) s-a adăugat treptat la complexul 1M borane-THF (61 mmoli, 61 ml) răcit la 0°C. Amestecul s-a refluxat timp de 6 h, s-a răcit la 0°C, s-a descompus cu grijă cu HCI conc. HCI (10 ml), și concentrat sub vid. Concentratul s-a saturat cu NaOH (20g), s-a extras cu CHCI₃(15 ml x 4), și extractuale combinate s-au uscat (MgSO₄). După filtrare și îndepărtarea solventului, distilare în vid s-au obținut 1,4 g (randament 77%) (R)-3-amino-2-metilpropan-1-ol (I) sub formă de ulei incolor cu bp 110-112°C (40 mm Hg); [a]_D +8,9° (c 22,6, MeOH); IR v, 3358,1873,1598,1466 cm’¹; ¹H RMN δ 5,18 (NH₂; br s), 3,8 (1 -H₂; m), 2,95 (3-H; m), 2,68 (3-H; m), 1,81 (2-H; m), 0,82(2-Me; d, 7,2); ¹³C RMN δ 66,9(1), 46,4(3), 37,1(2), 14,4 (2-Me).

La o soluție de amino alcool Y (2,0 g, 22 mmoli) în 39 ml de soluție 10% trietilamină în MeOH s-a adăugat d/-tert-butil dicarbonat (5,4 g, 25 mmoli) și amestecul s-a agitat la 25°C, timp de 30 min. După îndepărtarea solventului, reziduului s-a dizolvat în CH₂CI₂ și soluția s-a spălat de două ori cu 1M KHSO₄ (pH 2) și o dată cu soluția de NaCI saturată și s-a uscat (MgSO₄). îndepărtarea solventului sub vid a dat 4,3 g (randament 100%) (R)-3 (fert-butoxicarbonil)amino-2-metilpropan-1 -ol sub forma unui ulei viscos care s-a folosit direct în etapa următoare fără altă purificare (> 95 % puritate prin analiză RMN); IR v_max, 3356,1976,1686,1523,1456 cm¹; Ή RMN δ 4,82 (NH; br s), 3,54 (1-H; dd, -11,4/4,2), 3,31 (1-H/3-H; m), 3,25 (3-H; dd, -14,1/6,6), 1,77 (2-H; m), 1,44 (CMe₃; s), 0,87 (2-Me; d, 6,9).

La o soluție de alcool (R) -3- (terț-butoxicarbonil) amino- 2-metilpropan-1-ol (2,2 g, 12 mmoli) și periodat de sodiu (7,5 g, 35 mmoli) în tetraclorură de carbon (25 ml), acetonitril (25 ml) și apă (38 ml) s-a adăugat triclorură de ruteniu hidratată (51 mg, 0,25 mmoli) și amestecul a fost agitat la 25°C, timp de 1h. Amestecul s-a diluat cu CH₂CI₂ (IOO ml), iar apoi s-a filtrat prin Celită. Filtratul s-a bazificat (pH 9) cu soluție 2M K₂CO₃, și stratul apos s-a spălat cu eter. Stratul apos s-a acidulat cu 1M KHSO₄ la pH 2, la 0°C și s-a extract CH₂CI₂(20 ml x 3). Extractele combinate s-au spălat cu soluție saturată de NaCI și s-au uscat (MgSO₄). Prin îndepărtarea solventului sub vid s-au obținut 2,0 g (randament (85%) acid (R)-3-(tert-butoxicarbonil)amino-2- metilpropanoic (Z) sub forma unui solid lipicios. Z pur (1,75 g, 74%) s-a cristalizat din eter, p.t. 69,5-70,5°C; [a]_D -18,4° (c 2, MeOH); EIMS m/z (intensitatea relativă) 147 (60; M⁺-Me2C=CH2), 130 (12), 74 (29), 57 (100); HREIMS m/z 147,0517 (C5H9NO4, Δ+1,4 mmu); IR vmax 3322-2400, 2797,1711,1654,1413cm-1;'H RMN a conformerului majoritar δ 5,00 (NH; br s), 3,32 (3-H; m), 3,24 (3-H¹; m), 2,71 (2-H; m), 1,44 (CMe3; s), 1,20(2-Me; d); ¹³C RMN conformeri majoritar/minoritar(raport 2:1) δ 180,7/179,5 (1), 156,0/157,7 (BOC CO), 79,5/81,0 (CMe₃), 42,7/44,0 (3), 39,9/40,2 (2), 28,3/28,3 (CMe₃), 14,6/14,6 (2-Me). Analize. Găsit: C, 53,04; H, 8,62, Calculat pentru C₉H₁₇NO₄: C, 53,18; H, 8,43.

3610

3615

3620

3625

3630

3635

3640

3645

3650

3655

RO 118931 Β1

3660

3665

3670

3675

3680

3685

3690

3695

3700

La o soluție de 2,66 g acid L-leucic (20 mmoli) și 1, 74 g of bicarbonat de sodiu (20 mmoli) în 30 ml apă, la 0°C, s-au adăugat 30 ml soluție în CH₂CI₂ a 6,44 g clorură de tetrabutil ammoniu (20 mmoli) și 1,74 ml bromură de alil (20 mmoli) și 1,74 ml bromură de alil (20 mmoli). După agitare intensă timp de 24 h s-a evaporat CH₂CI₂. S-au adăugat aproximativ 50 ml apă și stratul apos s-a extras de patru ori cu Et₂O. Soluția eterică s-a uscat pe sulfat de sodiu anhidru și apoi s-a evaporat. Reziduul s-a trecut printr-o coloană scurtă cu Si rezultând 3,21 g (2S)-2-hidroxi-4- metilpentanoat de alil (AA) (randament 93%) sub forma unui ulei incolor, [a]_D -8,4° (c 1,1, CHCI₃); IR v_max, 3464, 2957, 1732,1203,1140,1087 cm¹; ¹H RMN δ 5,92 (alil 2-H; m), 5,34 (alil 3-Hz; dd, 17,4/1,1), 5,28 (alil 3-H_E; dd, 10,5/1,1), 4,67 (alil 1-H₂; d, 5,7), 4,23 (2-H; brs), 2,64 (OH; brs), 1,89 (4-H; m), 1,57 (3-H₂; m), 0,96 (5-H₃; d,

6,5), 0,95 (4-Me; d, 6,7); ¹³C RMN δ 175,3 (1), 131,4 (alil C-2), 118,6 (3), 68,9 (2), 65,7 (alil C-1), 43,2 (3), 24,1(4), 23,0 (5), 21,3 (4-Me).

La o soluție de 1,74 g Z (8,55 mmoli), 1,34 g AA (8,0 mmoli), și 64 mg DMAP în 12 ml CH₂CI₂ uscat, la 0°C, s-a adăugat în picături 8 ml soluție de DCC (2,47 g, 12 mmoli) în CH₂CI₂. Soluția limpede s-a agitat la 0°C, timp de 30 min, iar apoi la 23°C, timp de 3 h. Precipitatul alb s-a filtrat, solventul s-a evaporat și reziduul s-a redizolvat în Et₂O. Soluția eterică s-a spălat succesiv cu 0,5N HCI rece, bicarbonat de sodiu și soluție saturată de clorură de sodiu. Stratul eteric s-a uscat (Na₂SO₄), apoi s-a evaporat și produsul s-a purificat prin cromatografie rapidă pe coloană (silicagel) rezultând 2,62 g (randament 92%) (2S,2'R)-2- [3' (tert-butoxicarbonil)amino-2'-metil-propanoil-oxi]-4- metilpentanoat de alil (AB) sub forma unui ulei incolor, [a]_D -51,3° (c 3,41, CHCI₃); EIMS m/z (intensitate relativă) 301 (5,2), 284 (4,0), 258 (1,5), 228 (43,5), 170 (41,8), 130 (74,5), 112 (100); HREIMS m/z 301,1532 (C_I4H₂₃NO₆, Δ-0,7 mmu, M-Me₂C=CH₂), 284,1496 (C₁₄H₂₂NO₅, Δ+0,2 mmu);IR v_max 3395, 2962,1747,1715,1515,1251, 1175,1083 cm’¹,¹H RMN unitatea C δ 5,17 (NH; brs), 3,42 (3-H; m), 3,22(3-H'; m), 2,78 (2-H, m), 1,43 (CMe3; br s), 1,21 (2-Me; d, 7,1); unitatea D δ 5,90 (alil 2-H; m), 5,33 (alil 3 Hz; d, 16,3), 5,27 (alil 3-HE; d, 10,3), 5,09 (2-H; dd, 9,7/3,7), 4,63 (alil 1 -H2; m), 1,80 (3-H2; m), 1,64 (4-H; m), 0,96 (5-H3; d, 6,5), 0,94 (4-Me; d, 7,3), ¹³C RMN unitatea C δ 174,7 (1), 156,0 (BOC CO), 79,2 (CMe3), 43,1 (3), 40,3 (2), 28,3 (CMe₃),

14.5 (2 Me); unitatea D δ 170,4 (1), 131,4 (alil C-2), 119,0 (alil C-3), 70,9 (2), 65,9 (alil C-1),

39.6 (3), 24,7 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me).

La 10 ml soluție formată din 282 mg (0,8 mmoli) de tetrakis (trifenilfosfine)palladiu în THF uscat, s-au adăugat, treptat, 688 μ\ (8 mmol) morfolină uscată. După agitare, timp de 40 min, solventul s-a evaporat și s-au adăugat 100 ml CH₂CI₂. Soluția s-a spălat succesiv cu 2N Hcl și apă. Stratul organic s-a filtrat și filtratul s-a extras de două ori cu soluție saturată de bicarbonat de sodiu. După spălare cu CH₂CI₂, stratul apos s-a acidulat la pH=3 cu KHSO₄rece, la 0°C, iar apoi s-a extras de trei ori cu eter. Extractul eteric uscat s-a evaporat rezultând 250 mg de acid (2S,2'R)-2-[3^,(te/ț-butoxicarbonil)amino-2'-metilpropanoil-oxi] -4-metilpentanoic (AC) (randament 100%) sub forma unui solid ceros, [a]D -47,9° (c 4,7, CHCI3); EIMS m/z (intensitate relativă) 261 (12), 244 (18), 217 (28), 198 (17), 188 (100), 160 (61); HREIMS m/z 261,1221 (CUH19NO6, Δ-0,8 mmu, M-Me2C=CH2), 244,1221 (CuH^NOg, Δ-3,6 mmu); IR vmax, 3376, 2960, 1738, 1518, 1174, 786 cm’¹.¹H RMN (CDCI3+D₂O) unitatea C δ 3,49 (H-3; dd, -13,8/3,5), 3,12(3-H; dd, -13,8/8,7), 2,68 (2-H; m), 1,43 (CMe₃; br s), 1,21 (2-Me; d, 7,1); unitatea D δ 5,12 (2-H; dd, 9,6/3,5), 1,90-1,68 (3H/4-H; m), 0,97 (5-H; d, 6,1), 0,94 (4-Me; d, 6,0), ¹³C RMN unitatea C δ 174,6 sau 174,8 (1), 156,1 (BOC CO),

79.5 (CMe₃), 43,0 (3), 40,4 (2), 28,3 (CMe₃), 14,5 (2-Me); unitatea D δ 174,6 sau 174,8 (1),

70.5 (2), 39,5 (3), 24,7 (4), 23,0 (5), 21,4 (4-Me).

Compusul AD

Alcoolul W (34,8 mg, 0,056 mmol), compound AC (26,8 mg, 0,085 mmol) și DMAP (1,74 mg) s-au dizolvat în 283 μ\ diclormetan. La acest amestec, s-au adăugat 666 μ\ soluție în diclormetan a DDC (17,5 mg, 0,085 mmol). Amestecul de reacție s-a agitat peste noapte.

3705

RO 118931 Β1

3710

Solventul s-a evaporat cu un curent de azot, s-a adăugat eter și precipitatul alb s-a filtrat. Filtratul s-a spălat, succesiv, cu 0,5 N HCI, soluție saturată de bicarbonat de sodiu, și soluție saturată de clorură de sodiu. Concentrarea și cromatografia (coloană cu silicagel, 25% EtOAc/hexan) a dat 46 mg compus AD (90%); [a]_D -11,85°(CHCI₃, c 2,0); IR v_max 3369,2961,

1737,1511,1252,1174,1066, 813, 756 cm-¹,¹H RMN (500 MHz) δ unitatea A 7,25 (10-H/ 14-H, dt, 8,5, 2,1), 6,84 (11-H/13-H, dt, 8,5, 2,1), 6,76 (3-H, ddd, 15,5, 6,5, 6,4), 6,34 (8-H, d, 15,6), 5,88 (2-H, bd, 15,5), 5,86 (7-H, dd 15,6,8,7), 5,04 (5, m), 3,80 (OMe, s), 2,56 (6-H, m), 2,52 (4-H, m), 1,10 (6-Me, d, 6,8); unitatea B 7,19 (5-H, d, 2,1), 7,05 (9-H, dd, 8,5, 2,1),

6,83 (8-H, d, 8,5), 6,55 (NH, bd, 7,3), 5,04 (2-H, m), 4,78/4,70 (CH₂CC1₃, ABq, -11,8), 3,85 (OCH₃, S), 3,19 (3-H, dd, 6,3, -13,8), 3,08 (3-H¹, dd, 6,8, -13,8); unitatea C 5,14 (NH, bt,

6,3), 3,32 (3-H, m), 3,20 (3-H‘, m), 2,73 (2-H, m), 1,42 (CMe₃, s), 1,18 (2-Me, d, 7,0); unitatea D 4,93 (2-H, dd, 10,0, 3,7), 1,67 (3-H/4-H, m), 1,55 (3-H‘, m), 0,86 (5-H, d, 6,5), 0,83 (4-Me-H, d, 6,5), ¹³C RMN δ unitatea A 165,4 (1), 159,1 (12), 139,3 (3), 131,1 (9), 129,7 (7), 128,5 (8), 127,3 (10,14), 125,4 (2), 114,0 (11, 13), 76,5 (5), 55,3 (OMe), 41,1 (6), 33,4 (4), 16,7 (6-Me); unitatea B 170,5 (1), 154,1 (7), 131,2 (5), 128,9 (4), 128,5 (9), 122,4 (6), 112,1(8), 94,3 (CCI₃), 74,6 (CH₂CCI₃), 56,1 (OMe), 53,2 (2), 36,6 (3); unitatea C 175,2 (1), 156,0 (BOCCO), 79,3 (CMe₃), 43,1 (3), 40,4 (2), 28,3 (C), 14,4 (2-Me); unitatea D 170,1(1),

71,4 (2), 39,5 (3), 24,7 (4), 22,9 (5), 21,4 (4-Me).

Criptoficină 81

Compusul AD (46 mg, 0,05 mmol) s-a amestecat cu praf de Zn activat (178 mg, exces) în 1,3 ml HOAc. Amestecul s-a supus ultrasonicării timp de 45 min, iar apoi s-a agitat încă 90 min. S-au adăugat aproximativ 30 ml diclormetan. Solidul s-a filtrat și filtratul s-a evaporat sub vid. Reziduul s-a dizolvat în 1,1 ml de TFA și soluția s-a agitat încă o oră. TFA s-a evaporat sub vid și s-a adăugat apă. Prin liofilizare, s-a obținut amino acidul liber. Aminoacidul s-a dizolvat în 4,6 ml DMF. La această soluție s-au adăugat 26 μ\ DIEA și FDPP (30 mg 0,075 mmoli, în 2,2 ml DMF). După agitare 6 h, s-a evaporat solventul și s-a adăugat EtOAc. Soluția s-a spălat cu 0,5N HCI și cu soluție saturată de clorură de sodiu. Evaporarea desolventului, urmată de purificare cromatografică (Si, eter) a dat 20,5 mg Criptoficină 81 (61%); [a]_D + 34,9 (CHCIa, c 0,45); IR v^ 3409,3270, 2958,1746,1725,1672,1511,1251, 1175,1066,1025, 972, 816 cm’¹,¹H RMN (500 MHz) δ unitatea A 7,26 (10-H/14-H; dt, 8,6,

2,5), 6,84(11 H/13-H, dt, 8,6, 2,5), 6,68 (3-H, ddd, 15,4, 9,9, 5,6), 6,35 (8-H, d, 15,9), 5,86 (7-H, dd, 15,9, 8,8), 5,77(2-H, dd, 15,4, 0,9), 4,99 (5-H, ddd, 11,2, 6,0,1,7), 3,80 (OCH₃, S), 2,53 (4-H/6-H, m), 2,37 (4-H', ddd, 11,2,9,9,-14,6), 1,12 (6-Me, d, 6,9); unitatea B 7,22 (5-H, d, 2,2), 7,08 (9-H, dd, 8,4, 2,4), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,64 (NH, d, 8,6), 4,81 (2-H, m), 3,86 (OMe, S), 3,13 (3-H; dd, 5,6, -14,5), 3,05 (3-H’, dd, 7,1, -14,5); unitatea C, 6,93 (NH, bdd, 5,8, 5,6), 3,50 (3-H, ddd, 5,2, 3,9, -13,5), 3,28 (3-H¹, ddd, 6,9, 6,7, 13,5), 2,71 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,3); unitatea D 4,84(2-H, dd, 10,1,3,4), 1,67 (3-H/ 4-H; m), 1,38 (3-H¹, m), 0,78 (S-H, d, 6,5), 0,75 (4-Me-H, d, 6,5), ¹³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 165,4 (1), 159,2 (12), 141,4(3), 131,1 (9), 129,6 (7), 128,4 (8), 127,3(10, 14), 125,2(2), 114,1(11, 13), 77,5(5),

55,3 (OMe), 42,2 (6), 36,4 (4), 17,4 (6 Me); unitatea B 171,0 (1), 154,0 (7), 131,2 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,5 (6), 112,1 (8), 56,2 (OMe), 53,5 (2), 35,1 (3); unitatea C 175,6 (1), 41,2 (3), 38,3 (2), 14,0 (2-Me); unitatea D 170,9 (1), 71,6 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (5), 21,3 (4-Me).

Exemplul 15. Sinteza Criptoficinei 82

Compusul AE

Compusul AE este derivatul tert-butildifenilsilil eter (TBDMS) al E.

Compusul AF

Hidroliza compusului AE (150 mg) la AF (125 mg) s-a efectuat cu un randament de

87% folosind procedeul descris anterior pentru hidroliza T la U. ¹H RMN δ 7,69/7,64 (SiPh₂,

3715

3720

3725

3730

3735

3740

3745

3750

3755

2'-H, 6'-H/2-H, 6-H, d, 6,3), 7,41 (SiPh₂, 4'-H/4-H, m), 7,39 (SiPh _a 3‘-H, 4-Me-H/ 3-H,

5-H, m), 6,86 (3-H; dt; 15,5, 7,5), 5,62 (2-H, d, 15,5), 5,30 (7-H/8-H, m), 3,72 (5-H, m), 2,28 (4-H, m), 2,20 (6-H, m), 1,52 (9-H, bd, 7,7), 1,08 (CMe₃, s), 1,00 (6-CH₃, d, 6,7).

Compusul AG

Prepararea lui AG (96 mg) din AF (76 mg, 0,18 mmol) s-a efectuat cu un randament de 70%, folosind procedeul descris anterior pentru prepararea lui V din U.'H RMN δ unitatea A 7,67 (SiPh₂, 2'-H, 6'-H/2-H, 6-H; m), 7,46-7,31 (SiPh₂, 3'-H, 4'-H, 4-Me-H/3-H, 4-H, 5-H, m), 6,62 (3-H, dt, 15,4, 7,6), 5,51/5,48 (2-H, d, 15,4), 5,33 (7/8, m), 3,70 (5-H, m), 2,22 (4-H/6-H, m), 1,61(9, bd, 7,4), 1,06 (CMe₃, S), 0,98 (6-Me, d, 6,8); unitatea B 7,16 (5-H, d,

1,7), 7,00 (9-H, dd, 8,5,1,7), 6,83/6,82 (8-H, d, 8,5), 5,68/5,66 (NH, d, 7,3), 5,03 (2-H, m), 4,78/4,73 (CH₂CCI₃, ABq, -11,9), 3,87 (OMe, S), 3,16 (3-H; m), 3,09 (3-H¹, m), ¹³C RMN δ unitatea A 165,1 (1), 143,0/142,9 (3), 136,0 (SiPh₂, 2', 672, 6), 134,3/133,7 (SiPh₂,171),

132,5 (7), 129,6 (8), 129,6 (SiPh₂,474), 127,5 (SiPh₂, 3', 4-Me/3, 5), 125,7/125,4 (2), 76,3 (5), 41,6 (6), 36,9/36,8 (4), 27,0 (CMe₃), 19,5 (CMe₃), 18,1 (9), 16,4/16,3 (6-Me); unitatea B 170,0 (1), 154,2 (7), 131,0 (5), 128,4 (4/9), 122,5 (6), 112,1(8), 94,2 (CCI₃), 74,7 (CH₂CCI₃), 56,1 (OMe), 52,9 (2) 36,4 (3).

Compusul AH

Prepararea lui AH (53,4 mg) din AG (84 mg, 0,11 mmol) s-a efectuat cu un randament de 92% folosind procedeul descris anterior pentru prepararea lui W din V. Ή RMN δ unitatea A 6,83 (3-H, dt, 15,4, 7,5), 5,80 (2-H, d, 15,4), 5,51 (8-H, m), 5,33 (7-H, dd, 15,2,

8.3) , 3,50 (S-H, m), 2,42 (4-H, m), 2,30 (4-H‘, m), 2,28 (6, m), 1,68 (9, d, 7,3), 0,99 (6-Me, d, 6,7); unitatea B 7,20 (S-H, d, 1,8), 7,03 (9-H, dd, 8,4, 1,8), 6,80 (8-H, d, 8,4), 6,10 (NH, bd, 7,0), 5,07 (2-H, m), 4,80/4,70 (CH₂CCI₃, ABq, -11,5), 3,88 (OCH₃, S), 3,20 (3-H, dd, 5,5, -14,3), 3,10 (3-H', dd, 7,2, -14,3), ¹³C RMN δ unitatea A 165,4 (1), 142,8 (3), 132,2 (7), 127,7 (8), 125,7 (2), 73,6 (5), 42,8 (6), 36,9 (4), 18,1 (9), 16,8 (6-Me); unitatea B 170,2 (1), 154,2 (7) , 131,0 (5), 128,5 (4/9), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,2 (CCI₃), 74,7 (CH₂CCI₃), 56,1 (OMe), 53,1(2), 36,5 (3).

Criptoficină 82

Compusul Al (36,8 mg, randament 86%) s-a preparat din 27,4 mg (0,052 mmol) compus AH folosind procedeul descris anterior pentru AD. Compusul Al (68 mg, 0,083 mmoli) s-a ciclizat la Criptoficină 82 (28,5 mg) folosind procedeul descris anterior, pentru ciclizarea AD la Criptoficină 81; [a]_D +19,9 (CHCI₃, c 2,0), Ή RMN (500 MHz) δ unitatea A 6,65 (3-H, ddd, 15,4, 9,5, 5,6), 5,76 (2-H, d, 15,4), 5,48 (8-H, dq, 15,3, 6,5), 5,27 (7-H, ddd, 15,3, 8,4,

1,5), 4,89 (5 H, ddd, 10,7, 5,6, 1,5), 2,38 (4-H, m), 2,33 (4-H'/6-H, m), 1,66 (9-H, dd, 6,4,

1,5), 1,00 (6-Me, d, 6,9); unitatea B 7,22 (S-H,d, 2,0), 7,08 (9-H, dd, 8,4, 2,0), 6,83 (8-H, d,

8.4) , 5,74 (NH, m), 4,81(2-H, ddd, 8,5, 7,3, 5,6), 3,87 (OMe, S), 3,13 (3-H;dd, 5,6, 14,4), 3,04 (3-H·, dd, 7,3, -14,4); unitatea C, 6,93 (NH, bdd, 6,7, 4,7), 3,52 (3-H, ddd, 4,7, 3,9, -13,5), 3,27 (3-H', ddd, 6,8, 6,7, -13,5), 2,72 (2-H, dqd, 7,1,6,8,3,9), 1,20 (2-Me; d, 7,1); unitatea D 4,88 (2-H, dd, 9,6, 3,4), 1,75 (3-H/ 4-H; m), 1,47 (3-H', m), 0,94 (5-H, d, 6,2), 0,91 (4-Me-H, d, 6,4), ¹³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 165,5 (1), 141,7 (3), 131,4 (7), 127,1 (8) , 125,2 (2), 77,7 (5), 41,5 (6), 36,2 (4), 17,9 (9), 17,2 (6 Me); unitatea B 171,0 (1), 153,9 (7), 131,1 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,5 (2), 35,1 (3); unitatea C 175,5 (1), 41,3 (3), 38,2 (2), 14,0 (2-Me); unitatea D 170,9 (1), 71,5 (2), 39,6 (3),

24,6 (4), 23,0 (5),21,5 (4-Me).

Exemplul 16. Sinteza Criptoficinei 90 și Criptoficinei 91

Procedeu general pentru epoxidarea criptoficinelor de tip stiren

La o soluție de Criptoficină (aproximativ 10 mg/ml) în diclormetan s-au adăugat trei echivalenți de acid m-clorperbenzoic in diclormetan (aproximativ 10 mg/ml). Soluția a fost agitată la temperatura camerei până ce tot materialul introdus s-a consumat. Soluția s-a

RO 118931 Β1 trecut printr-o coloană de silicagel scurtă folosind CH₂CI₂, iar apoi CH₂CI₂:Et₂O 1:4 rezultând un amestec de cei doi epoxizi. Epoxizii s-au separat prin HPLC (C-18,7:3 MeCN:H₂O). Folosind acest procedeu, Criptoficină 82 (5 mg) s-a transformat în 2,2 mg de Criptoficină 90 și 1,2 mg de Criptoficină 91.

Datele spectrale pentru Criptoficină 90

Ή RMN (500 MHz) δ unitatea A 6,67 (3-H, ddd, 15,4, 9,5, 5,8), 5,79 (2-H, d, 15,4), 5,09 (5-H, ddd, 10,4, 4,5, 2,6), 2,84 (8-H, qd, 5,2, 2,2), 2,57 (7-H, dd, 7,6, 2,2), 2,46 (4-H, m), 1,82 (6-H, m), 1,32 (9-H, d, 5,2), 1,03 (6-Me, d, 6,9); unitatea B 7,22 (5-H, d, 2,2), 7,08 (9-H, dd, 8,4, 2,2), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,74 (NH, d, 8,6), 4,81(2 H, ddd, 8,3, 7,4, 5,7), 3,87 (OMe, S), 3,14 (3-H; dd, 5,4, -14,5), 3,03 (3-H’, dd, 7,3, 14,5); unitatea C, 6,95 (NH, bdd,

6,7,4,8), 3,52(3-H, ddd, 4,8, 3,7, -13,4), 3,29 (3-H¹, ddd, 6,7, 6,5, -13,4), 2,74 (2-H, dqd, 7,3,

6,5,3,7), 1,24(2-Me; d, 7,3); unitatea D 4,90 (2-H, dd, 9,9, 3,7), 1,75 (3-H, m), 1,60 (4-H; m), 1,49 (3-H*, ddd, 8,7,3,7, -13,7), 0,95 (S-H, d, 6,5), 0,91(4-Me-H, d, 6,7), ¹³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 165,4 (1), 141,1(3), 125,3 (2), 76,3 (5), 60,0 (7), 56,8 (8), 40,2 (6), 36,5 (4),

17,5 (9), 13,3 (6 Me); unitatea B 171,0 (1), 154,0 (7), 131,1 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,1 (3); unitatea C 175,5 (1), 41,2 (3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,7 (1), 71,4 (2), 39,6 (3), 24,7 (4), 23,0 (5), 21,5 (4-Me).

Datele spectrale pentru Criptoficină 91

Ή RMN δ unitatea A 6,68 (3-H, ddd, 15,4, 9,8, 5,4), 5,78 (2-H, d, 15,4), 5,09 (5-H, ddd, 11,1,3,7,2,0), 2,75 (8-H, m), 2,62 (7-H, dd, 9,5, 2,1), 2,48 (4-H, m), 1,78 (6-H, m), 1,32 (9-H, d, 5,2), 0,99 (6-Me, d, 7,1); unitatea B 7,23 (5-H, d, 1,9), 7,09 (9-H, dd, 8,4,1,9), 6,85 (8-H, d, 8,4), 5,68 (NH, d, 8,4), 4,82 (2-H, m), 3,88 (OMe, S), 3,15 (3 H; dd, 5,4, -14,4), 3,04 (3-H', dd, 7,2, -14,4); unitatea C, 6,95 (NH, bdd, 6,0,4,6), 3,53(3H, ddd, 5,0,4,0, -13,4), 3,29 (3-H‘, ddd, 6,9, 6,7, -13,4), 2,75 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 6,7); unitatea D 4,92 (2-H, dd, 9,8,

3,4), 1,77 (3-H, m), 1,58 (4-H; m), 0,96 (S-H, d, 7,3), 0,92 (4-Me-H, d, 6,7).

Exemplul 17. Sinteza Criptoficinei 97

La o soluție de depsipeptidă ciclică, Criptoficină 53 (9 mg, 0,013 mmoli), dizolvată în dimetilsulfoxid (1 ml), s-a adăugat azidă de sodiu (40 mg) și acid sulfuric concentrat (4 μΙ). Amestecul s-a agitat la 75-85°C, timp de 2 zile. Apoi amestecul de reacție s-a răcit la temperatura camerei, s-a diluat cu Et>0 (15 ml) și stratul organic s-a spălat cu soluție saturată de clorură de sldiu (2 x 20 ml) și H₂O (20 ml). Extractul eteric s-a uscat (sulfat de magneziu) și solventul s-a îndepărtat in vacuo cu obținerea unui solid amorf, fără culoare care a reprezentat preponderent azido-alcoolul, Criptoficină 86. Purificarea s-a efectuat prin cromatografie cu fază inversă (ODS, 10 μΙ 250 x 10 mm, 25% H₂O/MeCN, 3 ml. Min'¹) cu obținerea azido-alcoolului pur, Criptoficină 86, ca un solid amorf fără culoare (7,4 mg, 77%).

Datele spectrale pentru Criptoficină 86 [a]_D -22,0 (c=3,0, CHCI₃); MS (El) m/z 482/484 (ionul cel mai înalt observat, M⁺ -229, 8/3), 625/627 (14/5), 259 (7), 195/197 100/34), 184 (14), 155/157 (82/70), 91 (23), 77 (22); HRMS, m/z 482,1791, C^H^O^CI (Δ 2,9 mmu); MS (FAB) m/z (matrice magică) 712/714 (M⁺+H, 79/36), 686/688 (31/12), 232 (74), 184 (100), ¹H RMN (CDCI₃) δ unitatea A: 7,37-7,42 (10/11/12/13/14-H, bm, W_1/2 = 20), 6,77 (3-H, ddd, 15,2,10,6, 4,4), 5,77 (2-H, dd,

15,2, 1,3), 5,45 (5-H, ddd, 11,0, 4,2, 2,0), 4,55 (8-H, d, 5,7), 3,75 (7-H, dd, 7,3, 5,7), 2,55 (4-H_b, dddd, 14,5,4,4, 2,0,1,3), 2,43 (4-H_a, ddd, 14,5,11,0,10,6), 2,34 (7-OH, s), 1,80 (6-H, ddq, 7,3,4,2,7,0), 0,99 (6-Me, d, 7,0), unitatea B: 7,20 (5-H, d, 2,2), 7,06 (9-H, dd, 8,4,2,2),

6,84 (8-H, d, 8,4), 5,76 (NH, d, 7,7), 4,74 (2-H, ddd, 7,7, 7,5, 5,5), 3,87 (OCH₃, s), 3,10 (3-H_b, dd, 14,5, 5,5),3,06 (3 H_a, dd, 14,5,7,5), unitatea C: 7,22 (NH, dd, 8,4, 3,7), 3,40 (3-Hh, dd, 13,6, 8,4), 3,14 (3 H_a, dd, 13,6, 3,7), 1,23 (2-CH₃, s), 1,16 (2-CH₃, s), unitatea D: 4,85 (2-H, dd, 9,5, 5,1), 1,71 (3-Hb, ddd, 13,6, 9,5, 5,9), 1,59 (4-H, bm, W_1/2 = 25), 1,50 (3-H_a, ddd, 13,6,7,9,5,1), 0,89 (4-CH₃, d, 6,6), 0,85 (5-H₃, d, 6,6); ¹³C RMN (CDCI₃) δ unitatea A:

3810

3815

3820

3825

3830

3835

3840

3845

3850

3855

RO 118931 Β1

165.3 (1), 143,0 (3), 135,1(9), 129,1 (12), 128,9 (11/13), 128,6 (10/14), 124,3 (2), 75,1(7),

74,6 (5), 67,8 (8), 39,3 (6), 34,7 (4), 11,9 (6-Me), unitatea B: 170,5 (1), 154,1 (7), 130,9 (5),

129.7 (4), 128,3 (9), 122,5 (6), 112,4 (8), 56,1 (7-OMe), 54,3 (2), 35,3 (3), unitatea C: 177,8 (I) , 46,5 (3), 42,8 (2), 22,9 (2-Me), 22,7 (2-Me'), unitatea D: 170,2 (1), 71,4 (2), 39,4 (3),

24.7 (4), 22,6 (4-Me), 21,8 (5).

Criptoficina 97

La o soluție de depsipeptidă ciclică, Criptoficina 86 (5,5 mg, 0,008 mmol), dizolvată în Et₂O/CH₂CI₂ (3:1,0,5 ml), s-a adăugat o soluție eterică (0,5 ml) de trifenilfosfină (3 mg, 0,011 mmol). Amestecul s-a agitat trei zile la temperatura camerei. Apoi, solventul a fost îndepărtat sub vid și reziduul s-a dizolvat în CH₂CI₂ și s-a supus la purificarea prin HPLC (coloană CN, 10 p\ 250 x 10 mm, 80% EtOAc/CH₂CI₂, 3ml min'¹) obținându-se Criptoficina 97 pură ca un solid amorf, fără culoare (4,2 mg, 82 %).

UV (MeOH) v_max (ε) 202 (24400), 218 (9400), 284 (2200) nm; MS (El) m/z 667/669 (M⁺, 1 1/3), 639/641 (41/16), 442 (21), 226 (17), 195 (43), 196 (32), 197 (100), 198 (71), 199 (II) , 182/184 (25/16), 155/157 (63/22), 146 (30), 91(40), 77 (29); HRMS, obs m/z 667,3061, C₃₆H₄₆N₃O₇ ³⁵CI (Δ-3,6 mmu), ¹H RMN (CDCI₃) δ unitatea A 7,35 (11 H/13-H; m, W_1/2 = 15 Hz), 7,28 (12-H, m), 7,16 (10-H/14-H; m, W_1/2 = 15 Hz), 6,74 (3 H; ddd, 15,2/9,0/6,1), 5,69 (2-H; d, 15,2), 5,21 (5-H; ddd, 9,2/4,3/4,2), 2,79 (8-H, bs), 2,51 (4-H₂, m), 2,11 (7-H, bd, 6,5), 1,48 (6-H, m), 1,13 (6-Me, d, 6,9); unitatea B: 7,18 (5 H, d, 2,1), 7,04 (9-H, dd, 8,4, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,53 (NH, m), 4,73 (2-H, ddd, 7,6, 5,6, 5,4), 3,87 (OMe, s), 3,09 (3-H_b, dd, 14,7,

5,4), 3,04 (3H_a, dd, 14,7, 7,6), unitatea C: 7,20 (NH, m), 3,40 3-Ηζ, dd, 13,5, 8,6), 3,11 (3-H,, dd, 13,5, 3,3), 1,22 (2 Me, s), 1,15 (2-Me', s), unitatea D: 4,84 (2-H, dd, 10,1, 3,7), 1,71 (3-H_b, m), 1,67 (4-H, bm, W_1/2 = 25), 1,35 (3H_a, m), 0,86 (4-Me, d, 6,7), 0,84 (5-H₃, d, 6,5); ¹³C RMN (CDCI₃) δ unitatea A: 165,0 (1), 142,1 (3), 139,2 (9), 128,8 (11/13), 127,5 (12),

125.4 (10/14), 124,6 (2), 76,6 (5), 42,5 (6), 42,1 (7), 40,5 (8), 36,6 (4), 14,8 (6-Me), unitatea B: 170,2 (1), 154,1 (7), 130,9 (5), 129,5 (4), 128,2 (9), 122,6 (6), 112,4 (8), 56,1 (7 OMe),

54,3 (2), 35,3 (3), unitatea C: 177,9 (1), 46,5 (3), 42,7 (2), 22,8 (2-Me/2-Me'), unitatea D:

170.5 (1), 71,3 (2), 39,5 (3), 24,6 (4), 22,7 (4-Me), 21,3 (5).

Exemplul 18. Sinteza Criptoficinelor 110-112 și 124 Criptoficina 108

La amestecul de Criptoficina 90 și Criptoficina 91 (27 mg, 0,045 mmol) în 0,8 ml tetrahidrofuran s-a adăugat 400 /zi de soluție apoasă de acid periodic (32 mg, 0,14 mmol). Soluția clară a fost agitată la temperatura camerei 5 h. S-a adăugat apă și stratul apos s-a extras de două ori cu acetat de etil. Stratul organic a fost spălat cu apă, s-a uscat și s-a concentrat. Reziduul s-a purificat prin cromatografie în fază inversă pe o coloană ODS (1:1 MeCN:H₂O) rezultând, cu randament de 90%. Criptoficina 108.

Ή RMN (500 MHz) δ unitatea A 9,64(7-H, d, 1,9), 6,67 (3-H, ddd, 15,3, 10,0, 5,4),

5,81 (2-H, dd, 15,3, 0,9), 5,32 (S-H, ddd, 11,0, 6,6, 2,1), 2,65 (6-H, qdd, 7,2, 6,9, 1,9), 2,53 (4-H, m), 2,44 (4-H', m), 1,17 (6-Me, d, 7,2); unitatea B 7,21 (S-H, d, 2,2), 7,08 (9-H, dd, 8,4, 2,2), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,91 (NH, d, 8,4), 4,80 (2-H, m), 3,86 (OMe, S), 3,16 (3-H; dd, 5,4, -14,6), 3,00 (3-H', dd, 7,8, -14,6); unitatea C 7,05 (NH, bdd, 6,9, 5,0), 3,47(3-H, ddd, 4,6,

4,2, -13,5), 3,32 (3-H¹, ddd, 6,9, 6,6, 13,5), 2,73 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,2); unitatea D 4,83 (2-H, dd, 9,5, 3,6), 1,75 (3-H, m), 1,70 (4-H; m), 1,40 (3-H', ddd, 9,5, 3,9, -14,0), 0,93 (5-H, d, 6,6), 0,88 (4-Me-H, d, 6,6), ¹³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 200,6 (7), 165,4 (1),

140.5 (3), 125,6 (2), 73,7 (5), 50,1 (6), 36,1 (4), 10,8 (6-Me); unitatea B 171,1 (1), 154,0 (7), 131,0 (5), 129,9 (4), 128,3 (9), 122,4 (6), 112,3 (8), 56,1 (OMe), 53,8 (2), 35,0 (3); unitatea C 175,6 (1), 41,0 (3), 38,1 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,4 (1), 71,3 (2), 39,3 (3), 24,6 (4), 22,9 (5),21,4 (4-Me).

Criptoficina 108 s-a obținut, de asemenea, prin ozonoliza selectivă din Criptoficina 82 folosind procedeul descris anterior pentru ozonolizele de la E la F.

RO 118931 Β1

Modul de lucru general pentru reacția Wittig

Butii litiu (0,4 ml, 2,5 M în hexan, 1 mmol) s-a adăugat la 10 ml soluție de clorură de ariltrifenilfosfoniu (1 mmol) în THF la -78°C. Amestecul de reacție s-a agitat 15 min la -78°C, iar apoi s-a pus într-o baie cu gheață pentru o oră. La o soluție de Criptoficină 108 (aproximativ 30 mg/ml) în THF, la -78 C, s-au adăugat trei echivalenți din amestecul de mai sus. Soluția s-a agitat 20 min, după care baia de răcire a fost îndepărtată. Când temperatura a ajuns la 25°C, reacția s-a stopat cu soluție apoasă de clorură de amoniu. Amestecul s-a extras de două ori cu acetat de etil. Extractul organic a fost spălat cu apă, s-a uscat și s-a concentrat. Reziduul s-a purificat pe o coloană ODS (65:35 MeCN:H₂O) rezultând un amestec de izomeri E și Z (conținut 8% la 13% izomeri Z în funcție de natura grupării arii; determinat prin analiza RMN). Izomerul E s-a cristalizat din eter.

Criptoficina 110

Reacția Wittig conduce la 5,1 mg analog p-fluorofenil (conținând aproximativ 8% izomer Z) din 7,3 mg Criptoficina 108 (s-a recuperat aproximativ 1 mg aldehidă nereacționată). După cristalizare din eter s-au obținut 4,0 mg Criptoficina 110 pură; [a]_D + 42,4° (MeOH, c

2,1), ¹H RMN δ unitatea A 7,29 (10-H/14-H; dd, 8,6, 5,6), 6,99(11-H/13-H, dt, 8,6, 8,5), 6,68 (3-H, ddd, 15,3, 9,7, 5,6), 6,38 (8-H, d, 15,8), 5,83 (7-H, dd, 15,8, 8,8), 5,78 (2-H, d, 15,3), 5,00 (S-H, ddd, 10,8, 7,3, 1,3), 2,53 (4-H/6-H, m), 2,36 (4-H¹, m), 1,13 (6-CH₃, d, 6,8); unitatea B 7,21 (5-H, d, 1,8), 7,07 (9-H, dd, 8,4,1,8), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,68 (NH, d, 8,5),

4,82 (2-H, m), 3,87 (OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,04 (3-H¹, dd, 7,2, -14,4); unitatea C, 6,95 (NH, bdd, 6,8, 5,9), 3,50 (3-H, td, 4,4, -13,5), 3,28 (3-H', ddd, 6,8, 6,7, -13,5), 2,72 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,2); unitatea D 4,82 (2-H, m), 1,65 (3-H/4-H; m), 1,35 (3-H', ddd,

4,5, 3,8, 10,9), 0,78 (5-H, d, 6,4), 0,74 (4-Me-H, d, 6,4), ¹³C RMN (75 MHz) δ unitatea A

165,4 (1), 162,3 (12, d, ¹JC.F 245,8 Hz), 141,4 (3), 132,9 (9), 130,6 (7), 129,9 (8), 127,6 (10/14, d, ²Jc.f 8,0 Hz), 125,2 (2), 115,5 (11/13, d, ¹Jc__F 21,5 Hz), 77,4 (5), 42,2 (6), 36,4 (4),

17,3 (6-Me); unitatea B 170,9 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,1 (3); unitatea C 175,6 (1), 41,1 (3), 38,3 (2), 14,0 (2-Me); unitatea D 170,9 (1), 71,5 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (5), 21,2 (4-Me).

Criptoficina 111

Reacția Wittig conduce la 43 mg analog p-tolil (conținând aproximativ 9% izomer Z) din 55 mg de Criptofina 108. După cristalizare din eter, rezultă 34 mg Criptoficina 111 pură; [a]_D +44,3° (CHCI₃, c 0,6); EIMS rezoluție ridicată m/z (intensitate relativă %) 652 (2,9, M⁺), 497 (3,6), 412 (23,8), 242 (20), 145 (46), 105 (75); EIMS cu rezoluție înaltă 652,29094 (calculat pentru C36H45CIN2O7, Δ-0,6 mmu, M⁺), ¹H RMN δ unitatea A 7,21 (10-H/14-H; d, 8,0), 7,11 (11-H/13-H, d, 8,0), 6,68 (3-H, ddd, 15,2, 9,6, 5,4), 6,37 (8-H, d, 15,8), 5,95 (7-H, dd, 15,8, 8,6), 5,76 (2-H, d, 15,2), 4,99 (5-H, dd, 10,4, 6,2), 2,51 (4-H/6-H, m), 2,38 (4-H', m), 2,32 (12-Me, s), 1,13 (6-CH3, d, 6,8); unitatea B 7,22 (5-H, d, 2,1), 7,08 (9-H, dd, 8,4,

2,1), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,80 (NH, d, 8,4), 4,81 (2-H, m), 3,86 (OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,03 (3-H', dd, 7,3, -14,4); unitatea C 6,98 (NH, bdd, 6,0, 5,7), 3,49 (3-H, td, 4,6, -13,4), 3,29 (3-H¹, ddd, 6,7, 6,6, -13,4), 2,70 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,2); unitatea D 4,81 (2-H, m), 1,65 (3-H/4-H; m), 1,37 (3 H', m), 0,78 (5-H, d, 5,8), 0,73 (4-Me-H, d, 6,4), ¹³C RMN (75 MHz) δ unitatea A 165,5 (1), 141,5 (3), 137,4 (12), 133,9 (9), 131,7 (7), 129,3 (10/14), 129,0 (8), 126,0 (11/13), 125,1 (2), 77,4 (5), 42,2 (6), 36,4 (4), 21,1(12-Me), 17,3 (6-Me); unitatea B 171,0 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 129,9 (4), 128,4 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,1 (3); unitatea C 175,6 (1), 41,1(3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,9 (1), 71,6 (2), 39,5 (3), 24,5 (4), 22,7 (5), 21,2 (4-Me).

Criptoficina 112

Reacția Wittig conduce la 35 mg analog 2-tienil (conținând aproximativ 13% izomer

Z) din 51 mg de Criptoficina 108. După cristalizare din eter, rezultă 25 mg Criptoficina 111 pură. ¹H RMN (500 MHz) δ unitatea A 7,12 (12-H; d, 4,9), 6,94 (11-H, dd, 4,9, 3,4), 6,90

3910

3915

3920

3925

3930

3935

3940

3945

3950

3955

RO 118931 Β1 (10-H, d, 3,4), 6,68 (3-H, ddd, 15,2, 9,5, 5,3), 6,54 (8-H, d, 15,7), 5,83 (7-H, dd, 15,7, 8,7),

5.78 (2-H, d, 15,2), 4,96 (5-H, dd, 9,5, 6,5), 2,51 (4 H/6-H, m), 2,35 (4-H', m), 1,13 (6-CH₃, d, 6,8); unitatea B 7,21 (5-H, d, 1,6), 7,07 (9-H, dd, 8,4, 1,6), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,74 (NH, d, 7,1), 4,82 (2-H, m), 3,87 (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,5, -14,4), 3,04 (3-H', dd, 7,1, -14,4); unitatea C, 6,97 (NH, bt, 5,8), 3,50 (3-H, ddd, 4,4, 4,3, -13,4), 3,28 (3-H', ddd, 6,8, 6,6, -13,4), 2,71 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,2); unitatea D 4,82 (2-H, m), 1,67 (3-H/4-H; m), 1,39 (3-H', m), 0,80 (5-H, d, 6,4), 0,77 (4-Me-H, d, 6,4).

Criptoficină 124

Reacția Wittig conduce la 131 mg analog p-clorfenil (conținând aproximativ 10% izomerZ) din 153 mg de Criptoficină 108. După cristalizare din eter, rezultă 107 mg Criptoficină 124 pură; [a]_D + 29,2° (CHCI₃, c 0,5); EIMS cu rezoluție înaltă m/z 672,23691 (calculat pentru C3sH₄₂CI₂N₂O₇, Δ 0,0 mmu), ¹H RMN (500 MHz) δ unitatea A 7,26 (10-H/II-H/13-H/14-H, s), 6,68 (3-H, ddd, 15,2, 9,6, 5,4), 6,36 (8 H, d, 15,8), 5,98 (7-H, dd, 15,8, 8,8), 5,77 (2-H, d, 15,2), 5,00 (S-H, bdd, 9,4, 6,3), 2,54 (4-H/6-H, m), 2,38 (4-H', m), 1,13 (6-CH₃, d, 6,8); unitatea B 7,22 (5-H, d, 1,7), 7,07 (9-H, dd, 8,4,1,7), 6,84 (8-H, d, 8,4), 5,73 (NH, bd, 7,8),

4.82 (2-H, m), 3,86 (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,5, -14,4), 3,04 (3-H‘, dd, 7,2, -14,4); unitatea C, 6,97 (NH, bt, 5,8), 3,49 (3-H, td, 4,2, -13,4), 3,29 (3-H¹, ddd, 6,7, 6,6, -13,4), 2,71 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,2); unitatea D 4,81 (2-H, m), 1,65 (3-H/4-H; m), 1,35 (3-H', m), 0,77 (5-H, d, 7,1), 0,75 (4-Me-H, d, 7,1), ¹³C RMN (75 MHz) δ unitatea A 165,4 (1), 141,3 (3), 135,2 (12), 133,2 (9), 130,9 (7), 130,6 (8), 128,7 (11/13), 127,3 (10/14), 125,2 (2), 77,3 (5), 42,2 (6), 36,5 (4), 17,3 (6-Me); unitatea B 170,9 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 129,8 (4), 128,4 (9),

122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,1 (3); unitatea C 175,6 (1), 41,1 (3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,8 (1), 71,5 (2), 39,6 (3), 24,5 (4), 22,8 (5), 21,3 (4-Me).

Exemplu 19. Sinteza Criptoficinelor 115-120, 125 și 126

Criptoficinele 115 și 116

Folosind procedeul general, descris mai sus, pentru epoxidarea Criptoficinelor de tip stiren, Criptoficină 110 (3,5 mg) s-a transformat în 2,0 mg Criptoficină 115 și 1 mg de Criptoficina 116.

Datele spectrale pentru Criptoficină 115 [a]_D +29,1° (MeOH, c 0,8); EIMS m/z (intensitate relativă %) 672 (1,9, M⁺), 412 (5,8), 245 (17), 195 (52), 155 (31), 141 (23), 135 (15), 109 (100); EIMS de înaltă rezoluție 668,2853 (calculat pentru C₃₅H₄₂CIFN₂O₈, Δ+3,4 mmu, M⁺), ¹H RMN (500 MHz) δ unitatea A 7,22 (10-H/14-H; ddt, 8,7, 5,2, 2,0), 7,01 (11-H/13-H, ddt, 8,7, 8,5, 2,0), 6,68 (3-H, ddd,

15,2, 9,7, 5,2), 5,74 (2-H, dd, 15,2, 0,8), 5,15 (5-H, ddd, 11,2, 5,0, 1,8), 3,67 (8 H, d, 2,0), 2,88 (7-H, dd, 7,4, 2,0), 2,54 (4-H, dtd, 5,2, 1,8, -14,4), 2,44 (4-H¹, ddd, 11,2, 9,7, -14,4),

1.79 (6-H, m), 1,13 (6-CH₃, d, 6,8); unitatea B 7,21 (S-H, d, 2,0), 7,06 (9-H, dd, 8,3, 2,0),

6.83 (8-H, d, 8,3), 5,63 (NH, d, 8,4), 4,80 (2-H, ddd, 8,4, 7,2, 5,4), 3,87 (OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,4, -14,4), 3,03 (3-H‘, dd, 7,2, -14,4); unitatea C 6,94 (NH, bdd, 6,7, 5,0), 3,48 (3-H, ddd, 5,0, 3,7, -13,4), 3,30 (3-H¹, ddd, 6,8, 6,7, -13,4), 2,72 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,4); unitatea D 4,83 (2-H, dd, 9,9, 3,6), 1,70 (3-H/4-H; m), 1,35 (3-H', m), 0,87 (5-H, d, 6,5), 0,85 (4-Me-H, d, 6,5), ¹³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 165,3 (1), 162,9 (12, d, ¹JC.F 245,4 Hz), 141,0 (3), 132,5 (9), 127,3 (10/14, d,³Jc_F8,3 Hz), 125,3(2), 115,7 (11/13, d,²J_c._F21,9 Hz), 76,1(5), 63,0 (7),58,3 (8), 40,5 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); unitatea B 170,9 (1), 154,0 (7), 131,0 (5), 129,7 (4), 128,4 (9), 122,5 (6), 112,3 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,0 (3); unitatea C 175,6 (1), 41,1 (3), 38,2 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,7 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,5 (4), 22,9 (5),21,3 (4-Me).

Criptoficină 117 și 118

Folosind procedeul general, descris mai sus, pentru epoxidarea Criptoficinelor de tip stiren, Criptoficină 111 (6,2 mg) s-a transformat în 3,5 mg Criptoficină 117 și 1 mg Criptoficina 118.

RO 118931 Β1

Datele spectrale pentru Criptoficină 117 [a]_D +25,5° (MeOH, c 1,8); EIMS m/z (intensitate relativă %) 668 (4,8, M⁺), 412 (6,2), 280 (11), 173 (9,4), 145 (15), 135 (34), 105 (100); EIMS de înaltă rezoluție m/z 668,28532 (calculat pentru C36H45CIN2O8, Δ+IJmmu, M⁺), ’H RMN (500 MHz) δ unitatea A 7,17/7,13 (10-H/II-H/13-H/14-H, A2B₂, q, 8,0), 6,67 (3-H, ddd, 15,4, 9,8, 5,6), 5,73 (2 H, dd, 15,4, 0,9), 5,14 (5-H, ddd, 11,2, 4,9, 2,0), 3,65 (8-H, d, 2,0), 2,91 (7-H, dd, 7,6, 2,0), 2,54 (4-H, bdd,

5,6, -14,3), 2,44 (4-H', ddd, 10,7, 9,8, -14,3), 2,35 (12-Me, s), 1,77 (6-H, m), 1,14 (6-CH₃, d, 6,9); unitatea B 7,21 (5-H, d, 2,2), 7,07 (9-H, dd, 8,5, 2,2), 6,83 (8-H, d, 8,5), 5,65 (NH, d, 8,5), 4,80 (2-H, ddd, 8,3, 7,4, 5,6), 3,87 (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,6, -14,5), 3,02 (3-H¹, dd, 7,4, -14,5); unitatea C 6,93 (NH, bd, 6,8,5,1), 3,48 (3-H, ddd, 5,1,3,8, -13,2), 3,29 (3-H', ddd, 6,9, 6,8, -13,2), 2,71 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,1); unitatea D 4,82 (2-H, dd, 9,8, 3,6),

1,70 (3-H/4-H; m), 1,33 (3-H', m), 0,85 (5-H, d, 6,5), 0,84 (4-Me-H, d, 6,5), ¹³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 165,3 (1), 141,0 (3), 138,4 (12), 133,7 (9), 129,4 (10/14), 125,6 (11/13),

125,3 (2), 76,2(5), 62,9 (7), 59,0 (8), 40,7 (6), 36,7 (4), 21,1 (12-Me), 13,6 (6-Me); unitatea B 170,9(1), 154,0 (7), 131,0 (5), 129,8 (4), 128,4 (9), 122,4 (6), 112,3 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,1(3); unitatea C 175,5 (1), 41,1(3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,7 (1), 71,3 (2), 39,4 (3), 24,5 (4), 22,8 (5), 21,2 (4-Me).

Datele spectrale pentru Criptoficină 118

Spectrul ¹H RMN este similar cu cel al Criptoficinei 38, cu diferența că multipleții de la 7,30-7,38 ai protonilor fenil au fost înlocuiți printr-un multiplei 4H la 7,14 și un singlet 3H la 2,35 pentru protonii p-tolil.

Criptoficină 119 și 120

Folosind procedeul general, descris anterior, pentru epoxidarea Criptoficinelor de tip stiren, Criptoficină 112 (8 mg) s-a transformat în 1,2 mg Criptoficină 119 și 0,5 mg Criptoficina 120.

Datele spectrale pentru Criptoficină 119 ¹H RMN (500 MHz) δ unitatea A 7,28 (12-H, d, 5,2), 7,11 (10-H, d, 3,3), 7,00 (11 H, dd, 5,2, 3,3), 6,68 (3-H, ddd, 15,1, 9,9, 5,2), 5,76 (2-H, dd, 15,1,1,3), 5,15 (S-H, ddd, 11,2, 5,5, 1,8), 3,94 (8-H, d, 2,0), 3,10 (7-H, dd, 7,5, 2,0), 2,56 (4-H, bdd, 5,2, 14,3), 2,44 (4-H', ddd, 11,2, 9,9, -14,3), 1,76 (6-H, m), 1,13 (6-CH₃, d, 6,8); unitatea B 7,21 (5-H, d, 2,3), 7,07 (9-H, dd, 8,4, 2,3), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,63 (NH, d, 8,4), 4,80 (2-H, ddd, 8,5, 7,4, 5,7), 3,87 (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,7, -14,5), 3,03 (3-H', dd, 7,4, -14,5); unitatea C 6,95 (NH, bd, 6,5,

5.3) , 3,48 (3-H, ddd, 5,3, 3,6, -13,5), 3,31 (3-H', ddd, 6,8, 6,5, -13,5), 2,72 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,3); unitatea D 4,85 (2-H, dd, 10,3, 3,5, 1,70 (3-H/4-H; m), 1,33 (3-H', m), 0,86 (5-H, d, 6,3), 0,85 (4-Me-H, d, 6,3).

Criptoficină 125 și 126

Folosind procedeul general, descris anterior, pentru epoxidarea Criptoficinelor de tip stiren, Criptoficină 124 (47 mg) s-a transformat în 26 mg Criptoficină 125 și 12 mg Criptoficina 126.

Datele spectrale pentru Criptoficină 125 [a]₀ +35,6° (CHCI₃ c=0,9); EIMS de înaltă rezoluție m/z 688,2301 (calculat pentru CasH^C^O^, Δ + 1,7 mmu), ’H RMN (500 MHz) δ unitatea A 7,33 (11-H/13-H, dt, 8,5, 2,0), 7,18(10-H//14-H, dt, 8,5, 2,0), 6,67 (3-H, ddd, 15,1, 9,9, 5,2), 5,73 (2-H, dd, 5,1, 0,9), 5,15 (5-H, ddd, 11,0, 4,7, 1,5), 3,66 (8-H, d, 1,9), 2,87 (7-H, dd, 7,4, 1,9), 2,53 (4-H, m), 2,42 (4-H¹, ddd, 10,6, 10,5, -14,4), 1,78 (6-H, m), 1,12 (6-CH₃, d, 7,0); unitatea B 7,20 (5-H, d,

2,1), 7,06 (9-H, dd, 8,3, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8,3), 5,72 (NH, d, 8,1), 4,79 (2-H, ddd, 8,3, 7,9,

5.4) , 3,86 (OMe, s), 3,12 (3-H; dd, 5,4, -14,5), 3,02 (3 H', dd, 7,4, -14,5); unitatea C 6,97 (NH, bdd, 6,3, 5,5), 3,46 (3-H, ddd, 4,4, 4,1, -13,7), 3,22 (3-H', ddd, 7,0, 6,3, -13,7), 2,70 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,2); unitatea D 4,82 (2-H, dd, 9,9, 3,4), 1,70 (3-H/4-H; m), 1,33

4010

4015

4020

4025

4030

4035

4040

4045

4050 (3-H', m), 0,87 (5-H, d, 6,5), 0,84 (4-Me-H, d, 6,5), ’³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 165,3 (1), 141,0 (3), 135,3 (12), 134,4 (9), 128,9 (11/13), 126,9 (10/14), 125,3 (2), 76,0 (5),

63,1(7), 58,2 (8), 40,4 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); unitatea B 170,9 (1), 154,0 (7), 131,0 (5),

129.8 (4), 128,3 (9), 122,4 (6), 112,3 (8), 56,1 (OMe), 53,7 (2), 35,0 (3); unitatea C 175,6 (1), 41,0 (3), 38,2 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,7 (1), 71,2 (2), 39,4 (3), 24,5 (4), 22,9 (5),

21,3 (4-Me).

Datele spectrale pentru Criptoficină 126 ¹H RMN (300 MHz) unitatea A δ 7,26 (11-H/13-H, d, 8,1), 7,17 (10-H//14-H, d, 8,1),

6,70 (3-H, ddd, 15,1, 9,4, 5,3), 5,81 (2-H, d, 15,1), 5,14 (5-H, bdd, 10,0, 4,5), 3,57 (8-H, bs),

2,85 (7-H, bd, 7,6), 2,66 (4-H, m), 2,59 (4-H', m), 1,77 (6-H, m), 1,04 (6-CH₃, d, 7,0); unitatea B 7,23 (S-H, bs), 7,08 (9-H, bd, 8,4), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,82 (NH, d, 6,8), 4,81 (2-H, ddd,

7,2, 6,8, 5,4), 3,86 (OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,4, -14,1), 3,03 (3-H', dd, 7,4, -14,1); unitatea C 7,03 (NH, bt, 5,7), 3,47(3-H, ddd, 4,0, 3,7, -13,1), 3,34 (3-H', ddd, 6,8, 6,4, -13,1), 2,72 (2-H, m), 1,24 (2-Me; d, 7,0); unitatea D 4,90 (2-H, dd, 10,0, 2,5), 1,74 (3-H/4-H; m), 1,45 (3-H¹, m), 0,91 (5-H, d, 6,5), 0,86 (4-Me-H, d, 6,5), ¹³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 165,4 (1), 141,3 (3), 135,6 (12), 134,1 (9), 128,8 (11/13), 126,8 (10/14), 125,2 (2), 76,8 (5), 63,3 (7), 55,6 (8), 40,8 (6), 36,7 (4), 13,4 (6-Me); unitatea B 170,9 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 129,8 (4) , 128,4 (9), 122,3 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,7 (2), 35,0 (3); unitatea C 175,7 (1), 41,0 (3), 38,2 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,8 (1), 71,4 (2), 39,3 (3), 24,6 (4), 23,1(5), 21,3 (4-Me).

Exemplul 20. Sinteza Criptoficinelor 121-123 și 127

Compusul AJ

La o soluție de BOC-L-leucin monohidrate (1,245 g, 5 mmoli) în 30 ml CHgC^ anhidru s-a adăugat EDC solid (1-clorhidrat de (3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimidă) (0,53 g,

2,75 mmoli), sub azot, cu agitare la 0°C. După agitare la 0°C timp de 1,5h amestecul s-a concentrat sub 5°C și reziduul s-a diluat cu 35 ml EtOAc rece și s-a spălat succesiv cu două porții a (10 ml) fiecare de soluție apoasă 5% KHSO₄, soluție apoasă 5% NaHCO₃ și soluție saturată de clorură de sodiu. S-a separat faza organică, s-a uscat (MgSO₄) la 5°C și s-a evaporat sub 5°C. Uleiul rezidual s-a diluat cu THF răcit cu gheață (5 ml) și s-a adăugat la o soluție de compus (295 mg, 0,5 mmoli) în THF anhidru răcit cu gheață (5 ml). S-au adăugat apoi la amestec câteva cristale de DMAP și s-a lăsat să ajungă la 25°C peste noapte. S-a adăugat soluție apoasă 5% NaHCO₃ (5 ml) și amestecul bifazic rezultat s-a agitat puternic la 25°C timp de 2h. S-a adăugat EtOAc (40 ml), faza apoasă s-a extras cu EtOAc (2 x 20 ml) și straturile organice combinate s-au spălat cu apă și soluție saturată de clorură de sodiu, s-au uscat (Na₂SO₄), s-au filtrat și evaporat. Reziduul s-a filtrat prin silica gel cu 25% EtOAC în hexani obținându-se compusul M sub forma unui ulei incolor (385 mg, randament 96%) :[a]_D 13,6° (c= 0,63, CHCCIg); EIMS m/z (intensitate relativă) 805/803/801 (M+, 1%), 568/570/ 572/574 (9/10/6/2), 523/525/527 (5/6/1), 418/420/422/424 (15/15/6/2), 341/343/345/347 (58/ 70/35/9), 307/309/311 (29/22/10), 224/227/228/229 (10/100/31/14), 208/210/211/2'12 (20/ 83/45/54); HREIMS m/z 800,2218 (C₃₅H₄₈ ^01^(¾. Δ-5,3 mmu); ¹H RMN (CDCI,) unitatea A δ 7,21-7,35 (Ph-H₅; m), 6,77 (3-H; ddd, 6,7/6,7/15,3), 6,4 (8 H; d, 15,8), 6,05 (7-H; dd, 8,7/

15,8), 5,9 (2-H; d, 15,3), 5,0 (5-H; m), 2,6 (6-H; m), 2,55 (4-H₂; m), 1,17(6-Me; d, 6,7); unitatea Β δ 7,22 (5-H; s), 7,05 (9-H: d, 8,1), 6,84 (8 H; d, 8,1), 6,55 (NH; d, 7,8), 5,0 (2-H; ddd, 5,5/7,1/7,8), 4,68-4,8 (CH₂CCI₃; ABq, 11,9), 3,86 (OMe; s), 3,2 (3-H; dd, 5,5/14,0), 3,06 (3-H': dd, 7,1/14,0); unitatea D δ 4,8 (NH; d), 4,2 (2-H; m), 1,65 (4-H; m), 1,55 (3-H; m), 1,4 (CMe₃); s), 1,37 (3-H'; m), 0,85 (4-Me; d, 6,5), 0,8 (5-H; d, 6,5); ¹³C RMN unitatea A δ 165,4(1), 139,3 (3), 137,0 (9), 131,5 (8), 130,5 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (12), 126,2 (10/12),

125.8 (2), 76,2 (5), 40,8 (6), 33,4 4), 16,8 (6-Me); unitatea Β δ 170,0 (1), 154,2 (7), 131,0 (5) , 129,0 (9), 122,5 (6), 112,2 (8), 94,4 (CCI₃) 74,7 (CH₂CCI₃), 56,1 (OMe), 53,3 (2), 36,5 (3) , unitatea D δ 173,2 (1), 155,7 (BOC-CO), 80,0 Me₃), 52,4 (2), 41,2 (3), 28,3 (CMe₃), 24,8 (4) , 22,8 (4-Me), 21,6 (5).

RO 118931 Β1

Compusul AK

Compusul AJ (115 mg, 0,134 mmoli) s-a dizolvat în TFA (3 ml) și s-a lăsat la 25°C timp de 1 h. Solventul a fost îndepărtat și reziduul s-a evaporat din CH₂CI₂, apoi din toluen obținându-se un solid amorf. Acest solid s-a dizolvat în THF anhidru (5 ml) și s-a adăugat suficientă dietilizopropilamină pentru a aduce pH-ul soluției la pH 8 - 9 când o fracție de soluție s-a spotulat pe hârtie pH umedă. Soluția s-a răcit la 0°C cu agitare și s-a adăugat o soluție de compus AL în THF (3 ml). Pentru a prepara compusul AL, compusul Z (55 mg, 0,27 mmoli) s-a dizolvat în THF (3 ml) și dietilizopropilamină (0,046 ml, 0,27 mmoli). La acest amestec, după răcire la -15°C, s-a adăugat clorură de pivaloil (0,033 ml, 0,27mmoli), în picături și soluția s-a agitat la -15°C timp de 10 min și la 0°C timp de 20 min. Suspensia rezultată s-a transferat apoi în soluție de compus AJ în THF. Amestecul s-a agitat la 0°C și s-a lăsat să ajungă la 25°C peste noapte. După 12 h, la 25°C s-a adăugat soluție apoasă 5% de NaHCO₃ și amestecul rezultat s-a agitat puternic la 25°C timp de 1,5 h. S-a adăugat EtOAC (40 ml) și s-au separat fazele. Faza apoasă s-a extras cu cantități suplimentare de EtOAC (2x 10ml). Extractele organice combinate s-au spălat cu soluție apoasă 5% de NaHCO₃ (20 ml), soluție apoasă 5% de KHSO₄ (20 ml) și soluție saturată de clorură de sodiu, s-au uscat (Na₂SO₄) și s-au evaporat. Uleiul rezidual s-a cromatografiat pe silicagel, eluat cu 35% EtOAc în hexan obținându-se compusul AK sub forma unei spume incolore (98 mg, randament 83%): [a]_D -8,3 (c 0,88, CHCI₃); ’H RMN (CDCI₃) unitatea A δ 7,28-7,35 (Ph-H₄; m), 22(H-12;m), 6,75 (H-3; ddd, 6,4/6,4/15,4), 6,4(H-8; d, 15,9), 6,04 (H-7; dd, 8,6/15,9), 5,95 (H-2; d, 15,4), 5,0 (H-5; m), 2,6 (H-4; m), 1,1 (6-Me; d, 6,8); unitatea Β δ 7,22 (H-5, d, 1,5), 7,15 (NH; d, 7,6), 7,05 (H-9; dd, 1,5/8,2), 6,85 (H-8; d, 8,2), 5,0 (H-2; m), 4,8-4,68 (CH₂CCI₃; ABq, 12), 3,86 (OMe; s), 3,2 (H-3; m), 3,1 (H-3'; dd, 7,2/14,1); unitatea C δ 5,0 (NH; m), 3,2 (H2-3; m), 2,55 (H-2; m), 1,1 (2-Me; d, 7,1); unitatea D δ 6,12 (NH; m), 4,4 (H-2; m), 1,65 (H-4; m), 1,55 (H-3; m), 1,4 (H-3¹; m), 0,86 (4-Me; d, 6,8), 0,81 (5-H; d, 6,8); ¹³C RMN (CDCI₃) unitatea A δ 165,8(1), 138,9(3), 131,5(8), 130,4(7), 128,6(11/13), 127,4(12), 126,2(10/14), 125,8 (2), 76,3(5), 33,6(4), 16,6(6-Me); unitatea Β δ 170,2(1), 154,1(7),136,9 (4),131,2(5), 128,6(9), 122,3(6), 112,2(8), 94,4(CC13), 74-5(CH₂CC1₃), 56,1 (OMe), 53,4(2), 36,6(3); unitateaC δ 175,4(1), 156,3(BOC-CO), 79,S(OCMe₃), 43,6(3), 41,3(2), 15,1(2-Me); unitatea D δ 172,6(1), 51,3(2), 40,5(3), 24,5(4), 22,7(4-Me), 21,5(5).

Criptoficină 121

Compusul AK (73 mg, 0,082 mmol) s-a dizolvat în AcOH (3,5 ml), s-a adăugat praf de Zn activat (400 mg) și suspensia rezultată s-a supus sonicării timp de 45 min. După agitare la 25°C încă 1,5 h, amestecul s-a diluat cu CH₂CI₂ (5ml) și s-a filtrat prin Celită^R. Solidele s-au spălat cu CH2CI2 suplimentar (IO ml) și filtratul rezultat s-a evaporat. Reziduul, fără altă purificare, s-a dizolvat în TFA (3 ml), s-a menținut la 25°C, timp de 1 h și solventul s-a îndepărtat sub vid. Reziduul s-a evaporat în mod repetat din CH2CI2, apoi din toluen până ce s-a obținut un solid incolor. Acest solid s-a dizolvat în DMF uscat (3 ml), s-a adăugat FDPP (43 mg, 0,108 mmoli) urmată de o cantitate suficientă de dietilizopropilamină pentru a aduce pH-ul soluției la pH 8 - 9, când o parte aliquotă s-a spotulat pe hârtie pH umedă. După agitare la 25°C timp de 16 h, amestecul s-a diluat cu eter (40 ml) și s-a spălat cu soluție apoasă 5% de KHSO4 (2 x I ml), soluție apoasă 5% de NaHCO3 (15 ml) și soluție saturată de clorură de sodiu. După uscare (Na2SO4) și evaporare, reziduul s-a purificat prin HPLC cu fază inversă pe silicagel C-18 (Econosil C-18, 22 x 250 mm), eluând cu CH3CN/apă 65:35 la 6 ml/min. Fracția eluată la tR48 min. s-a colectat și s-a evaporat obținându-se un solid amorf (26 mg, randament 50%): [a]D + 46,5° (c 0,81, CHCI3); EIMS m/z 637/639 (M⁺, 1%), 449/451 (2/1), 420 (5), 411/413 (7/5), 227/228 (9/7), 195 (10), 184 (15), 167/168/169 (40/86/29), 155/157 (100/26), 91 (85), 69 (86); HREIMS m/z 637,2864 (C^H^CINgOg, Δ + 5,5 mmu); Ή RMN unitatea A δ 7,21- 7,35 (Ph-H5; m), 6,75 (H-3; ddd, 4,2/10,8/16), 6,4 (H-8; d, 16),

4110

4115

4120

4125

4130

4135

4140

4145

4150

RO 118931 Β1

6,04 (H-7; dd, 8,8/16), 5,75 (H-2; d, 16), 5,1 ((H-5; m), 2,55 (H-4; m;H-6; m), 2,35 (H-4¹; m); unitatea Β δ 7,18 (H-5; d, 2), 7,05 (H-9; dd, 2,0/8,3), 6,85 (H-8; d, 8,3), 5,7 (NH; d, 7,2), 4,7 (H-2; ddd, 4,9/7,2/7,7), 3,86 (OMe; s), 3,1 (H-3; dd, 4,9/14,4), 3,0 (H-3'; dd.7,7/ 14,4); unitatea C δ 7,25 (NH; m), 3,5 (H-3; m), 3,4 (H-3'; m), 2,55 (H-2; m), 1,2 (2-Me; d, 7,2); unitatea D δ 5,8 (NH; d, 7,2), 4,4 (H2; m), 1,55 (H-4; m), 1,38 (H2-3; dd, 7,2/7,7), 0,76 (4-Me; d, 6,6), 0,74 (H-5; d, 6,6): ¹³C RMN (CDCI₃) unitatea A δ 165,1 (1), 141,9 (3), 136,8 (9), 131,7 (8), 130,2 (7), 128,5 (11/13), 127,3 (14), 126,1(10/12), 125,1(2), 76,5 (5), 42,3 (6),

36,3 (4), 17,2 (6-Me); unitatea Β δ 171,0 (1), 154,1 (7), 130,8(5), 129,6 (4), 128,4 (9), (122,5(6), 112,4 (8), 56,2 (OMe), 54,4 (2), 35,4 (3); unitatea C δ 175,8 (1), 41,0 (3), 38,6 (2),

14,8 (2-Me); unitatea D δ 173,2 (1), 51,1(2), 40,9 (3), 24,7 (4), 23,4 (4-Me), 21,5 (5).

Criptoficină 122 și 123

La o soluție (0°C) de Criptoficină 121 (20 mg, 0,032 mmol) în CH₂CI₂ (1,3 ml) anhidru s-a adăugat, sub agitare, 99% mCPBA (17 mg, 0,1 mmoli) într-o porțiune. S-a adăugat apoi toluen anhidru (0,7 ml) și amestecul rezultat s-a agitat la 25°C, timp de 72 h. Solventul s-a evaporat sub vid și solidul rezultat s-a purificat prin HPLC cu fază inversă pe C-18 silicagel (Econosil^R C-18, 22 x 250 mm), eluând cu CH3CN/apă 65:35 la 6 ml min'¹, Criptoficină 122 (9mg, 44 %) s-a eluat la tR 37,5 min și Criptoficină 123 (5 mg, 23%) s-a eluat la t_R 40 min.

Criptoficină 122 [a]_D +35,0 (c 1, CHCIg); EIMS m/z 653/655 (1,6/0,7, M⁺), 411/413 (20/5), 280/282 (39/19), 252/254 (13/8), 223/225/227 (19/10/23), 211/213 (18/6), 195/197 (51/13), 184/186 (49/11), 176/168/169(20/16/21), 155/156/157 (95/59/42), 139/141/143 (60/40/24), 135/135 (30/11), 129/131(40/29), 91(100);HREIMS m/z 653,2906 (COCINA, Δ-3,8 mmu); Ή RMN (d₆-acetonă) unitatea A δ 6,65 (H-3; ddd, 38/11,0/15,0), 5,9 (H-2; dd, 1,9/15,0), 5,25 (H-5; ddd, 1,9/4,9/11,5), 3,82 (H-8; d, 2,0), 3,0 (H-7; dd, 2,0/7,7), 2,65 (H-4; dddd, 2,0/2,0/ 3,8/14,5), 2,4 (H-4’; ddd, 11,0/11,5/14,5), 1,85 (H6; dqd, 4,9/7,4/7,7), 1,1 (6-Me; d, 6,9); unitatea Β δ 7,45 (NH; d, 7,9), 7,22 (H-9; dd, 2,0/8,4), 7,0 (H-8; d, 8,4), 4,45 (H-2; ddd, 3,6/ 7,9/11,2), 3,84 (OMe; s), 3,2 (H-3; dd, 3,6/14,5), 2,75 (H-3'; dd, 11,2/14,5); unitatea C δ 7,8 (NH; d, 8,8), 3,65 (H-3; ddd, 3,3/8,8/13,2), 3,1 (H-3’; ddd, 2,1/2,1/13,2), 2,55 (H-2; m); unitatea D δ 7,35 (NH; d, 8,1), 4,25 (H-2; ddd, 4,8/8,1/10,8), 1,65 (H-4; m), 1,45 (H-3; ddd, 5,1/10,8/13,7), 1,35 (H3‘; 4,8/9,0/13,7), 0,8 (4-Me/ H-5; d, 6,5); ¹³C RMN unitatea A δ 165,9(1), 140,8(3), 138,6(9), 129,4(11/13), 129,2(12), 126,7(2), 126,6(10/14), 76,0(5), 63,9(7), 59,3(8), 41,2(6), 37,7(4), 13,9(6-Me); unitatea Β δ 171,9(1), 154,6(7), 132,5(4), 131,4(5), 129,0(9), 122,4(6), 113,3(8), 56,9(2), 65,4(OMe), 36,4(3); unitatea C δ 177,2(1), 41,3(3), 38,9(2), 15,7(2-Me); unitatea D δ 174,2(1), 51,7(2), 40,6(3), 25,3(4), 23,1 (4-Me), 21,5(5).

Criptoficină 123 [a]_D +25,2° (c 0,58, CHCI₃); Ή RMN (CDCI₃) unitatea A δ 7,21-7,35 ((Ph-H₅; m), 6,75 (H-3; ddd, 4,1/10,9/14,1), 5,85 (H-2; dd, 1,4/15,2), 5,25 (H-5; m), 3,6 (H-8; d, 2,0), 2,9 (H-7; dd, 2,0/7,8), 2,7 (H-4; m), 2,55 (H-4'; m), 1,75 (H-6; m), 1,05 (6-Me; d, 7,1), unitatea Β δ 7,18(H-5;d,2,0), 7,05 (H-9; dd, 2,0, 8,5), 6,85 (H-8; d, 8,5), 5,95 (NH; d, 7,7), 4,7 (H-2;ddd, 4,9/7,7/8,1), 3,86 (OMe;s), 3,15 (H-3; dd, 4,9/14,5), 3,05 (H-3¹; dd, 8,1/14,5); unitatea C δ 7,25 (NH; m) 3,55 (H-3; ddd, 4,6/8,7/13,3), 3,15 (H-3'; ddd, 3,0/3,1/13,3), 2,55 (H-2; m), 1,2 (2-Me; d, 7,3); unitatea D δ 6,0 (NH; d, 8,2), 4,45 (H-2; m), 1,6 (H-4; m), 1,55 (H₂-3; m), 0,88 (4-Me;d, 7,1), 0,87 (5-H; d, 7,1).

Criptoficină 127

Criptoficină 122 (5 mg, 0,0075 mmol) s-a dizolvat în CHCI₃ (2ml) și s-a răcit la -40°C sub N₂. S-a adăugat clorură de trimetilsilil (0,02 ml, 0,157 mmol) în picături, și amestecul rezultat s-a agitat la -40°C timp de Ih. Solventul s-a evaporat și reziduul s-a filtrat pe silicagel

RO 118931 Β1 cu 15% EtOH în dietileter obținându-se Criptoficină 127 (4 mg, randament 77%): [a]_D +28,6 (c 1,16, CHCI₃); EIMS m/z 653(0,5; M⁺-HCI); 411(2); 182/184(22/26); 153/155(68/40); 135 (31); 107/108/109(55/22/31); 91/92(100/30); 79/81 (45/35);HREIMS m/z 653, 2841 (C^H^³⁵CIN₃O₇, Δ 2,6 mmu); ’H RMN (CHCI₃) unitatea A δ 7,3-7,4 (Ph-H5; m), 6,75 (H-3; ddd, 4,2/10,9/15,0), 5,8 (H-2; dd, 1,5/15,0), 5,2 (H-5; ddd, 1,9/9,9/9,9), 4,65 (H-8; d, 9,6), 4,0 (H-7; brd, 9,6), 2,65 (H4; m), 2,48 (11-6; m), 2,35 (H-4‘; ddd, 10,9/11,2/14,5), 1,02(6-Me; d, 7,0); unitatea Β δ 7,18 (H-5; d, 2,2), 7,05 (H-9; dd, 2,2/8,6), 6,85 (H-8; d, 8,6), 6,05 (NH; d,

7.7) , 4,65 (H-2; ddd, 4,7/7,7/8,6), 3,86 (OMe; s), 3,15 (H-3; dd, 4,7/14,6), 2,9 (H-3'; dd, 8,6/14,6); unitatea C δ 7,25 (NH; brdd, 4,1/5,7), 3,4 (H2-3; m), 2,55 (H-2; m), 1,15 (2-Me; d, 7,5); unitatea D δ 6,2 (NH; d, 8,2), 4,45(H-2; m), 1,65 (H-4; m), 1,55(H₂-3; m), 0,93 (4-Me; d, 6,8), 0,92 (5-Me; d, 6,8); ¹³C RMN (CDCI₃) unitatea A δ 165,4(1), 142,4(3), 138,8(9), 128,8(11/13), 128,2(12), 128,0 (10/14), 124,0 (2), 75,6(5), 73,9(7), 62,1(8), 38,6(6), 36,4 (4), 8,5(6-Me); unitatea Β δ 171,1(1), 154,0(7), 130,8(5), 129,8(4), 128,2(9), 122,4 (6), 112,4 (8), 56,1 (OMe), 54,5(2), 35,4(3); unitatea C δ 175,8(1), 41,1(3), 38,8(2), 14,8(2-Me); unitatea D δ 173,2(1), 51,1(2), 40,9(3), 25,0(4), 22,8(5), 21,8(4-Me).

Exemplu 2. Sinteza Criptoficinelor 128 și 130-134

Criptoficină 128,130 și 131

Un amestec brut 2:1 de 5,7 mg Criptoficină 117 și 118 s-a dizolvat în CHCI₃ (0,5 ml) și s-a tratat cu clorură de trimetilsilil (5 μΙ), la -60°C, timp de 3 h. Amestecul de clorohidrină rezultat s-a separat prin HPLC cu fază inversă în Criptoficină 128, Criptoficină 130, și Criptoficina 131. Prin purificare prin HPLC cu fază normală s-a obținut Criptoficină 128 (2,1 mg).

Datele spectrale pentru Criptoficină 128 [a]₀ +51,4° (CHCI₃, c 0,4); IR v_max 3408, 3281,2958,1747,1731, 1668,1538,1505, 1258,1179,1067, 910, 733 cm’¹; EIMS m/z (intensitate relativă %) 668 (0,3, M⁺ HCI), 500 (1,2), 445 (4,2), 407 (6), 318 (12), 274 (17), 240 (33), 199 (29), 155 (31), 141 (23), 135 (15), 109 (100); EIMS de înaltă rezoluție 668,2851 (calculat pentru C^H^CI^Og, A+1,3mmu, M⁺-HCI), ¹H RMN (500 MHz) δ unitatea A A 7,27 (10-H/14-H, d, 8,0), 7,18 (11-H/13-H, d, 8,0), 6,69 (3-H, ddd, 15,2, 9,6, 5,4), 5,79 (2-H, dd, 15,2, 0,8), 5,10 (5 H, ddd, 11,0, 8,4,1,7), 4,63(8-H, d, 9,6), 3,99(7-H, bd, 9,6), 2,67 (4-H, bdd, 5,4,14,2), 2,49 (6-H, dqd, 7,6, 7,6,1,7), 2,36 (4-H¹, td, 10,7, -14,2), 2,35 (12-Me, s), 1,04 (6-CH₃, d, 7,1); unitatea B 7,23 (5-H, d,

2,1), 7,09 (9-H, dd, 8,5, 2,1), 6,84 (8-H, d, 8,5), 5,83 (NH, d, 8,6), 4,80 (2-H, ddd, 8,2, 7,5,

5.7) , 3,87 (OMe, s), 3,16 (3-H; dd, 5,6,14,4), 3,00 (3-H¹, dd, 7,5, -14,4); unitatea C 6,94 (NH, bt, 5,8), 3,53 (3-H, ddd, 5,4, 4,1,13,5), 3,24 (3-H¹, ddd, 6,9, 6,6, -13,5), 2,74 (2-H, m), 1,22 (2-Me; d, 7,3); unitatea D 4,92 (2-H, dd, 9,9, 3,2), 1,75 (3-H/4-H; m), 1,47(3-H', m), 0,94 (5-H, d, 6,4), 0,92 (4-Me H, d, 6,4), ¹³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 165,6 (1), 141,6 (3), 139,2 (12), 135,3 (9), 129,7 (10/14), 127,9 (11/13), 125,2 (2), 76,4 (5), 74,0 (7), 62,0 (8),

38,4 (6), 36,3 (4), 21,1 (12-Me), 8,6(6-Me); unitatea B 171,1 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 130,0 (4), 128,4 (9), 122,4 (6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,0 (3); unitatea C 175,3 (1), 41,3 (3), 38,3 (2), 14,0 (2-Me); unitatea D 170,6 (1), 71,3 (2), 39,7 (3), 24,7 (4), 23,1 (5), 21,5 (4-Me).

Datele spectrale pentru Criptoficină 130 ¹H RMN (300 MHz) δ unitatea A 7,27 (10-H/14-H, d, 7,8), 7,16 (11-H/13-H, d, 7,8), 6,69 (3-H, ddd, 15,1,9,6, 5,2), 5,75 (2-H, d, 15,1), 5,40 (5-H, ddd, 10,6, 3,0,1,8), 5,05 (8-H, d, 5,9), 3,74 (7-H, ddd, 10,5, 5,4, 5,2), 2,59 (4-H, m), 2,55 (6-H, m), 2,37 (4-H‘, m), 2,33 (12-Me, s), 1,06 (6-CH₃, d, 6,9); unitatea B 7,21 (S-H, bs), 7,07 (9-H, bd, 8,4), 6,83 (8-H, d,

8,4), 5,77 (NH, d, 6,6), 4,80 (2-H, m), 3,87 (OMe, s), 3,12 (3-H; dd, 5,6, -14,4), 3,02 (3-H', dd, 7,2, -14,4); unitatea C 7,00 (NH, bt, 6,5), 3,47 (3-H, ddd, 4,3,4,0, -13,3), 3,24 (3-H', ddd,

6,7, 6,6, -13,3), 2,72 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,3); unitatea D 4,80 (2-H, m), 1,70 (3-H/4-H; m), 1,42(3-H’, ddd, 7,9, 4,7, -13,0), 0,91 (5-H, d, 6,4), 0,86 (4-Me-H, d, 6,4), ¹³C RMN (125

4205

4210

4215

4220

4225

4230

4235

4240

4245

4250

RO 118931 Β1

MHz) unitatea A 165,5 (1), 142,1 (3), 138,8 (12), 135,2 (9), 129,5 (10/14), 127,5 (11/13),

124,8 (2), 77,8 (5), 74,2 (7), 67,2 (8), 39,4 (6), 34,6 (4), 21,1 (12-Me), 12,3 (6-Me); unitatea

B 171,0 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 129,5 (4), 128,4 (9), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,6 (2), 35,0

4255 (3)' unitatea C 175,6 (1), 41,1 (3), 38,3 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,3 (1), 71,5 (2), 39,5 (3), 24,6 (4),22,7 (5),21,6 (4-Me).

Datele spectrale pentru Criptoficină 131

Ή RMN (300 MHz) δ unitatea A 7,18 (10-H/II-H/13-H/14-H, s), 6,64 (3-H, ddd, 15,2,

9.8, 5,4), 5,70 (2-H, d, 15,2), 5,06 (5-H, bt, 9,1), 4,86 (8-H, d, 9,7), 4,06 (7-H, bd, 9,7), 2,54

4260 (4-H, bdd, 5,2, -14,2), 2,37 (12-Me, s), 2,13 (4-H', m), 1,85 (6-H, m), 0,97 (6-CH₃, d, 6,6);

unitatea B 7,21 (5-H, d, 2,1), 7,07 (9-H, dd, 8,4, 2,1), 6,83 (8-H, d, 8,4), 5,66 (NH, d, 10,0), 4,79 (2-H, bq, 7,7), 3,87 (OMe, s), 3,14 (3-H; dd, 5,6, 14,4), 3,02 (3-H¹, dd, 7,2, -14,4); unitatea C 6,93 (NH, bt, 6,2), 3,51 (3-H, ddd, 5,0,4,2,13,5), 3,27 (3-H', ddd, 6,7,6,4, -13,5), 2,73 (2-H, m), 1,23 (2-Me; d, 7,3); unitatea D 4,86 (2-H, dd, 9,7, 3,4), 1,75 (3-H/4-H; m), 4265 1,46(3-H', m), 0,94 (5-H, d, 6,0), 0,93 (4-Me H, d, 6,4).

Criptoficină 132,133 și 134

Un amestec de Criptoficină 124 și izomer Z (134 mg, 0,199 mmol) s-a dizolvat în diclormetan (6 ml) și s-a lăsat să reacționeze cu acid m-clorperbenzoic (103 mg, 0,598 mmol) la temperatura camerei, timp de 36 h. S-a adăugat tampon fosfat (IO ml, pH 8) pentru a în4270 depărta acidul clorbenzoic generat în timpul reacției. După 30 min stratul apos s-a înlocuit cu dimetil sulfură (50 μΙ) și cu o cantitate mică de de tampon fosfat (10 ml). S-a continuat agitarea 30 min. Stratul organic s-a separat, solventul s-a evaporat și reziduul s-a uscat sub vid 12 h, Amestecul brut, preponderent Criptoficinele 125 și 126 s-au dizolvat în CHCI₃ (5 ml) și s-a tratat cu exces de clorură de trimetilsilil (50 μΙ) la -60°C, timp de 3 h. Solventul s-a 4275 evaporat și reziduul s-a purificat prin HPLC cu fază inversă (Econosil ODS silicagel, 250 mm x 22 mm, 35% H₂O/CH₃CN, 6 ml/min) rezultând Criptoficină 134 (t_R 52,5 min, 9 mg, 6%). Criptoficină 133 parțial pură (t_R 61 min, 32 mg, 22%) și Criptoficină 132 brută (t_R 67,5 min, 72 mg). Purificarea în continuare prin HPLC cu fază normală (Econosil silicagel, 250 mm x 10 mm, 56% EtOAc/hexane, 3 ml/min) a dat Criptoficină 132 pură (65mg, 45%).

4280 Datele spectrale pentru Criptoficină 132 [a]_D +60,1 (CHCI₃, c=l,l); EIMS m/z (intensitate relativă %) 688 (1,6, M⁺ HCI), 412 (10), 261(11), 195 (57), 184 (28), 165 (28), 155 (92), 135 (85); EIMS de înaltă rezoluție m/z 688,23563 (calc. Pentru C₃₅H₄₂CI₂N2O₈, Δ-3,8 mmu, M⁺-HCI), ¹H RMN (500 MHz) δ unitatea A 7,33 (10-H/11-H/13-H/14-H, s), 6,67 (3-H, ddd, 15,2, 9,9, 5,1), 5,79 (2-H, dd, 15,2,1,1), 4285 5,10 (5-H, ddd, 11,1, 8,1, 1,5), 4,63 (8-H, d, 9,5), 3,98 (7-H, bd, 9,3), 2,62 (4-H, bdd, 5,1,

-14,2), 2,47 (6-H, dqd, 7,4, 7,4, 1,5), 2,40 (4-H', td, 10,8, -14,2), 2,35 (12-Me, s), 1,02 (6-CH₃, d, 7,0); unitatea B 7,21 (5-H, d, 2,1), 7,06 (9-H, dd, 8,4, 2,1), 6,82 (8-H, d, 8,4), 6,04 (NH, d, 8,5), 4,74 (2-H, td, 8,0, 5,4), 3,85 (OMe, s), 3,13 (3-H; dd, 5,3, -14,4), 2,95 (3-H', dd,

7.8, -14,4); unitatea C 7,00 (NH, bt, 5,9), 3,48 (3-H, ddd, 5,0, 3,9, -13,4), 3,23 (3-H', ddd,

4290 6,6, 6,3, -13,4), 2,71 (2-H, m), 1,21 (2-Me; d, 7,2); unitatea D 4,91 (2-H, dd, 9,7, 3,4), 1,75 (3-H/4-H; m), 1,45(3-H', m), 0,92 (5-H, d, 6,6), 0,91(4-Me-H, d, 6,6), ¹³C RMN (125 MHz) δ unitatea A 165,7 (1), 141,6 (3), 137,3 (12), 134,8 (9), 129,4 (11/13), 129,0 (10/14), 125,2 (2),

76,4 (5), 74,0 (7), 61,4 (8), 38,4 (6), 36,2 (4), 8,7(6-Me); unitatea B 171,1 (1), 153,9 (7), 131,0 (5), 130,1 (4), 128,4 (9), 122,3(6), 112,2 (8), 56,1 (OMe), 53,8 (2), 34,9 (3); unitatea 4295 C 175,3 (1), 41,0 (3), 38,1 (2), 14,1 (2-Me); unitatea D 170,6 (1), 71,3 (2), 39,7 (3), 24,7 (4), 23,1 (5), 21,5 (4-Me).

Datele spectrale pentru Criptoficină 134

Spectrul ¹H RMN este similar cu cel al criptoficinei 27, cu diferența că doi multipleți de la 7,31 (10/14) și 7,36-7,40 (11/12/13) ai protonilor fenil s-au înlocuit cu doi dubleți la 7,26 ! 4300 (10/14) și 7,36 (11/13) ai protonilor p-clorfenil.

RO 118931 Β1

Exemplul 22. Relația Structură-Activitate (SAR) și evaluarea în vivo

Citotoxicitățile Criptoficinelor 1, 3 și 8 ale noilor Criptoficine față de liniile de celule tumorale umane KB și LoVo sunt prezentate în tabelul 6. Criptoficina 51 și Criptoficina 3 prezintă citotoxicități comparabile (IC₅₀ 3,5-5,8 nM). Criptoficina 52 (IC_M 43-70 pM), cu toate acestea este mai puțin citotoxică decât Criptoficina 1 (IC^ 9-29 pM), și Criptoficina 55 (33-47 pM) este mai puțin citotoxică decât Criptoficina 8 (IC^ 9-19 pM). Citotoxicitatea IC₅₀ pentru Criptoficinele 117,122,125,127,128 și 132 sunt comparabile cu cele pentru Criptoficinele

1,8, 52 și 55, deși, datele nu permit momentan comparații mai în profunzime.

Criptoficina 52 este activă in vivo, dar necesită un dozaj triplu comparativ cu Criptoficina 1. Activitatea in vivo a Criptoficinei 52 față de tumorile solide de origine murinică și față de trei tumori solide umane este prezentată în tabelul 7. în mod similar, Criptoficina 55 a fost activă in vivo, dar, de asemenea, a necesitat o doză totală triplă comparativ cu Criptoficina 8. Activitatea in vivo a Criptoficinei 55 față de 6 tumori solide de origine murină și 4 tumori solide umane este prezentată în tabelul 8. Datele in vivo par a se corela cu cele in vitro.

Criptoficinele 117,125,128 și 132 sunt active in vivo față de adenocarcinomul pancreatic de origine murină (Pane 03). Criptoficinele 117 și 132 par a fi mai puțin potente, adică necesită doze totale mai mari decât criptoficinele 1 și respectiv 8. Datele sunt prezentate în tabelul 9.

Valorile T/C care sunt mai mici de 42% sunt considerate a fi active conform standardelor NCl; valorile T/C care sunt mai mici de 10% sunt considerate a prezenta activitate și activitate clinică potențială excelentă conform standardelor NCl. Omorârea log totală este definită ca T-C/3,2 Td în care T este timpul mediu în zile ca tumorile grupului tratat să atingă 750 mg, C este timpul mediu în zile ca tumorile grupului de control să atingă 750 mg și Td este timpul de dublare al volumului tumorii (T.H.Corbett ș.a., Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, pg.35-87; Kluwer: Norwell, 1992), Valorile omorâre log totală de > 2,8, 2,0 - 2,8, Norwell, 1992). Valorile omorâre log totală de > 2,8, 2,0-2,8,1,3-1,9, 0,7-1,2 și <0,7 cu durata tratamentului cu medicament de 5-20 zile sunt notate ++++, +++, ++, + și respectiv, - (inactiv). O activitate de la +++ la ++++, care este un indiciu al activității clinice, este necesară pentru a se produce regresul parțial sau total al tumorilor solide cu o mărime de 100-300 mg transplantate la șoareci. Criptoficina 52 prezintă valori ale T/C de la 0 la 14% pentru tumorile murine și de 4,1 la 16 pentru tumorile umane și valori ale omorârii log totală de la 1,1 la 2 pentru tumorile murine și de la 0 la 3,2 pentru tumorile umane. Criptoficina 1 prezintă valori T/C de la 0 la 27% și valori ale omorârii log de la <1 la 2. Criptoficina 55 prezintă valori T/C de la 0 la 4,4% și valori ale omorârii log de la 2,1 la >4,6 (vindecări) pentru toate experimentele cu excepția celui din coloana 26 care prezintă o valoare a omorârii log totală de 1,2. Criptoficina 8 prezintă valori T/C în majoritate de 0% și valori ale omorârii log >2,8 (câteva vindecări așa cum se prezintă în tabelul

10. Criptoficinele 117 și 125 par a avea valori T/C și ale omorârii log totale care sunt comparabile cu cele ale altor criptoficine de tip epoxid, adică criptoficinele 1 și 52, în timp ce criptoficinele 128 și 132 au valori ale T/C și omorâre log totală comparabile cu cele ale altor criptoficine de tip cloroficină, adică criptoficinele 8 și 55.

Toate publicațiile și cererile de brevet citate în prezenta descriere, dar care nu au fost specificate a fi incluse ca referințe, sunt incluse ca referințe în prezenta descriere.

Deși invenția a fost descrisă oarecum în detaliu în scopul ilustrării și exemplele au fost prezentate pentru claritate și înțelegere, este evident specialiștilor în domeniu că anumite modificări pot fi făcute fără a ieși din spiritul și sfera de protecție a prezentei invenții.

4305

4310

4315

4320

4325

4330

4335

4340

4345

RO 118931 Β1

Tabelul 1

Datele privind citotoxicitatea criptoficinelor și analogilor semisintetici. Sunt incluse și datele Corbet/Valeriote pentru 5-fluorouracil, etoposidă (VP-16) și taxol.

Compus	tip de citotoxicitate (Diferențiat în Unități zonale)	KB IC₅₀ng/ml	LoVo IC₅₀ng/ml
/zG/ disc	Corbet Evaluare³	jwg/ disc	Evaluare^bValeriot
1	12,5	E/T(>400)^c		N	0,005	0,003
2	25	E/T(>400)^c		N	0,007	0,0002
3	25	E/T(>400)^c		N	0,3	0,5
4	20	E/T(>400)^c		N	1,3	0,5
5	2,9	E/T(>600)^c		N	0,02	0,02
6	250				>100	>100
7					>750	80
8	30	E/T(>500)^c	30	N	0,0002	0,01
9					15	Nedeterminată
10					>100	>100
12					>100	>100
14					1,8	3
5-FU	2,5	M/T(>400)^d	22,5	LL(>400)
VP-167	5	L(350),T(350)^d	5	LL(260)
Taxol	0,2	M/H/T(400)^d

^aL= selectiv leucemia (de exemplu ^zL1210 - ^ZC38 și ^zL1210 - ^zL1210 - ^ZHB > zu)

M = selectiv tumoare solidă murină, de exemplu - Z_L1210 > 250 zu)

H = selectiv uman solid (e.g. Z_H8 - Z_LI210 > 250 zu)

E = leucemia și linii de celule tumorale solide (zona de inhibiție > 250 zu).

T = selectiv tumoare (e.g. Z_L1210 - Z_LMI, Ζ^θ - Z_LMI și Z_HB - Z^, > 250 zu)

I = inactiv (zona de inhibiție <250) b_N = neselectiv față de tumoare (leucemie) și linii de celule normale (CFU-GM)

LL = selectiv la leucemie limfocitică (Z_L1210 - Zc_Fu._GM > 250 zu)

Ml = selectiv la leucemia acută mielogenetică (Aml) (Z_AMI - Ζ^θ.^ 250 ZU).

^Cselectiv față de liniile de celule sensibile și rezisente față de medicament Z_C38 - Z_LM1, Z_M17 - Z_LMl și Z_H8 - Z_LMi) ^dSelectiv numai față de linii de celule sensibile față de medicament.

Tabelul 2

Citotoxicitatea in vivo a criptoficinelor

Criptoficină	kbic₅₀ng/ml	LoVoIC₅₀ng/ml	SCOV3 IC₅₀ng/ml
1	0,025	0,001	0,26
2	0,023	0,021	0,18

RO 118931 Β1

Tabelul 2 (continuare)

Criptoficină	kbic₅₀ng/ml	LoVo IC₅₀ng/ml	SCOV3 IC₅₀ng/ml
3	1,8	0,6	2,8
4	6	2,5	21
5	12	2	7,4
8	0,01	0,0022	0,15
13	18	3
15			12
16	0,08	0,02	0,64
17	4,7	5,9	11
18	15	4,5	23
19	9,8	5,9	41
21	0,01	0,0003	0,029
22	0,89	0,4	1,7
24	0,12	0,095	0,3
26	19	9,8	95
28	1,5	0,75	6,1
29	1	0,49	3,4
30	11	8	21
31	0,53	0,062	1,9
35	0,055	0,01	0,092
40	9,0	1,0	1,7
43	0,72	0,8	1,1
45	2,3	2,4	1,6
49	1,4	1,9	1,1
50	0,17	0,17	0,2
54	0,80	2,2	2,2

Tabelul 3

4390

4395

4400

4405

4410

4415

Activitatea in vivo a criptoficinei 1

Exp. nr.	SC Tumoarea	nr. din inj. iv	mg/kg Doza totală	% Pierderi greut. corp	T/C	Log. omor.	Vindecare s
1560	Colon 38	8	10,3	creștere	6%	1,5	0/5
1694	Pane 03	8	16,0	creștere	0%	2,0	0/5

4420

RO 118931 Β1

Tabelul 3 (continuare)

Exp. nr.	SC Tumoarea	nr. din inj. iv	mg/kg Doza totală	% Pierderi greut. corp	T/C	Log. omor.	Vindecare s
1636	Colon 31	7	28,1	-11%	7%	1,3	0/5
1720	16/c mam	5	13,2	-1%	5%	1,4	0/5
1733	16/Taxol mam	5	16,5	0%	2%	1,8	0/4
1833	M17/0 (sens.adr.)	5	5,4	-10%	23%	<1	0/5
1749	Pane 02	5	11,0	-5%	20%	1,1	0/5
1596	Celulă umană Sm L.DMS273 SCID	6	7,3	0%	27%	<1	0/5
1806	MX-1 Sân uman	8	12	-3%	3%	2,0	0/5
1823	H125 Adenoplămân uman	8	14,4	-15% 1/5 morti 1	9%	1,1	0/5
1841	LINCaP Prostată umană	6	6,5	-6%	26%	<1	0/5

Tabelul 4 Activitatea in vivo a analogilor de criptoficină

Exp. nr.	Agentul	SC Tumoarea	nr. de inj.iv	mg/kg Doza totală	% Pierderi greut. corp Nadir	T/C	Log. omor.	Vindecare s
1813	Criptoficina-2	P03	10	37	-2%	44%	<1	0/5
1843	Criptoficina-3	P03	4	28/5	-9%	54%	<1	0/5
1769	Criptoficina-5	C38	15	45	-2%	>100%	Nu	0/5
1825	Criptoficina-8	P03	11	106	-6%	4%	4,6	0/5

RO 118931 Β1

Tabelul 4 (continuare)

Exp. nr.	Agentul	SC Tumoa- rea	nr. de inj.iv	mg/kg Doza totală	% Pierderi greut. corp Nadir	T/C	Log. omor.	Vindecare s
1885	Criptoficina-8	Mam 16/C	7	21,3	-4,5%	6%	2,5	0/5
1887 B	Criptoficina-8	C38	6	30	-2%	0%	2,8	1/5
1900	Criptoficina-8	Colon 51	9	67,5	-1%	7%	1,8	0/5
1843	Criptoficina-15	P03	5	18	-7%	83%	Nu	0/5
1878	Criptoficina-16	P03	9	82	-1%	89%	Nu	0/5
1813	Criptoficina-21	P03	9	27	-11% (1/5 morți)	61%	Nu	0/5
1843	Criptoficina-35	P03	7	23	-2%	11%	1,3	0/5

4465

4470

4475

4480

Timp de 48 h s-au tratat celule cu concentrații diferite de compuși indicați în continuare. Apoi s-a determinat numărul de celule, așa cum se arată în secțiunea de metode și s-a calculat valoarea IC₅₀ pentru fiecare compus. Valorile reprezintă media ± SEM din trei experiențe.

Tabelul 5

4485

Citotoxicitatea agenților antimicotici față de celulele SKOV3și SKVLB1

Compusul	Linia de celule
SKOV3	SKVLB1	Factor de rezistență
	IC₅₀(nM)
Vinblastina	0,35 ± 0,25	4200±170	12000
Taxol	1 ±0,4	8000 ± 2000	8000
Criptoficine	0,007 ± 0,002	0,60 ±0,19	86

4490

4495

Tabelul 6

Date referitoare la citotoxicitatea criptoficinelor in vitro

Criptoficină	KB IC₅₀ nM	LoVo IC₅₀nM	Criptoficină	KB IC₅₀ nM	LoVoIC₅₀nM
1	0,0092	0,0104	5	3,1-4,6	1,9-5,8
8	0,019	0,0091	51	3,5	5,2

4500

RO 118931 Β1

Tabelul 6 (continuare)

4505

4510

4515

Criptoficină	KB IC₅₀ nM	Lo Vo IC₅₀nM	Criptoficină	KB IC₅₀ nM	Lo Vo IC₅₀nM
52	0,043	0,070	53	4,2	5,5
55	0,033	0,047	57	0,064	0,27
58	0,048	0,20	61	21	15
81	5,5	5,7	82	310	45
90	0,34	0,30	91	30	34
97	3,6	5,7	110	4,6	5,3
111	4,8	3,2	112	5,4	6,2
115	0,039	0,048	117	0,036	0,031
118	2,3	1,2	119	4,4	6,1
120	4,6	6,4	122	0,021	69
125	0,05	0,006	127	0,176	0,075
128	0,023	2,5	132	0,082	0,037

O	m	o
C\J	CM	co
in	tn	in

LO CO IO

in curs co σ> co

O CC

O	LO	O
	xT	io
LO	IO	io

co co O) co

O oc m m m χίο CD in xf

ΙΩ co in xfr o rm Xt

£0 ω σ> οο

Ο

0C

u. Q CQ

CB

Ε

CB Ο <Zh

CB

Fără tumoră Ziua 14	0/5	co δ	5 5 5 în i δ	5 5 5 CO ij iî	5 5 5 ir ir δ
T/C în %	1	0% 9% 30%	0% 12% 35%	x° x° x° CP CP CP* O O O	0% 0% 37%
Dimensiunea medie a tumorii în ziua a 14 (Interval)	830 (393-1458)	0 (un șoarece) 75 (0-256) 247 (80-415)	0 (0-63) 101 (0-126) 295 (264-467)	0 (totul zero) 0 (totul zero) 0 (totul zero)	0 (totul zero) 0 (totul zero) 304(108-505)
% pierdere sau câștig În greutate corporală (zile)	+6,8% (12)	-20% (12) -8,2(13) -2,4 (8)	0% (10) -1,68 (10) 0% (8)	-15,2% (10) - 5,7 (6) 0% (12)	-5,7% (10) - 3,3% (8) 1,7% (10)
Medicament Morți		co co o	5 o o o	xf T- o O	^r ^r o o o
Doza totală mg/kg	t	7,0 13,5 6,75	in CM °	57 32,5 16,25	o O io CO O) Tj7“
Nr. de inf. IV	1	T- CD CO	r- r-	co 'i	CO CD CD
Agent	Fără Rx	Cripto#117 1 1	Cripto#125 1 1	Cripto#128 1 1	Cripto#132 1 1
Cușcă	-	CM CO +	IO CD b-	(O O) °	1- CM CO

CO CB 5 Ν

CB Φ L— Φ

C cB

C +5

CL

ω Ο

C. φ Ε ω ο TJ φ Ε

L0	o	io	o
r-	00	co	CD
IO	m	in	lO

Ο ’σ>

CB C D

JD

CB Ε ο

₍C

CB ϊ_ ca ο.

CL CB

E ₍c co σ> co

O oc

LO CD ΙΩ •st

O o co 'St in o co st

O co St

Vindecare

0/5

5/5 4/5

0/5

2/5(d 20) 1/5(d 20)

0/6 0/5

0/5

1/06 (d25) 0/5

0/5

omorâre în masă

4,6

co 04

2,5

3,0

>4,5 >4,5

2,3

>2 >2

CM CD co” cm”

2,6

>2 1,8

co cm

2,2

T/C în %

O

00

o

o o

o

o o

O o

o

o ®

50% ILS

r-

% Pierderi sau creșteri în greutate corporală

CD 1

1

-4,5

+2

O CD 1 1

in 1

-3,5

OJ co O 1-' 1

CD

-3,5 -6

-11%

CD t

Doză totală mg/kg

106

09

21,3

30

132 88

100

80 60

33,1 36,9

65

125 67,5

σ>

67,5

Nr.de inf. Iv.

T“

CM

co

- -

o

CD CD

σ> σ>

r-

O) CD

l'·'·

CD

SC Tumoarea

Pane 03

Mam 16/C

Colon 38

Colon 38 l

Colon 26

Ovar-115

Mam 17/Adr

Mam 16/C/Adr

Pane 02

IV P388 Leuk

IO c o o O

Exp. nr.

18268

1817

1886a

1887B

1234 l

1355

2007

1994

1990

2001 1031

1974

1924

CD

CO σ> co

O

CC

L- Φ (/>	>(0 <0
Φ k—	u o
o	CL u_
D	O
CO	o
ω	Φ

Φ	CO
Ό	D
Φ	Φ k_
Q_	O) c
•sP o^·	<—

co
<0	CD

o
>co	O)
N	E
O
Q

c

Φ X» k2 z jo io δ

σ> co io ·+ o io

CM xf co co io δ δ jo jo δ δ

JO JO δ δ to IO IO δ δ δ io io io xt CM

tJ· ιΩ A CO* co oo δ σ>“ + +

Xi CO co δ

I I

IO

co co

ω	«	ω
CE	CE	CE
Q.	CL	0.
jo	JO	JO
δ	δ	δ

IO to xt δ σ> io r- γ-

οο co

S io co o S IO oo co oo

CO CD CO

Ol o in s xt

CO Φ 1_ Λ O E Ξ3

Φ CO *ω o λα.

c <o E o ΣΕ

Z> ω φ φ ω o i— CL

CM IO cn co co σ>

co rσ>

o oo CD o> rOi

o CM co xt

IO CM co xt o CO co xt

RO 118931 Β1

Claims

Revendicări

1. Derivați de criptoficină, caracterizați prin aceea că au următoarea structură:

4635

4640

4645

Ar este metil sau fenil sau orice grupare aromatică, simplă sau heteroaromatică, substituită sau nesubstituită;

R₃ este un halogen, o grupare SH, amino, monoalchilamino, dialchilamino, trialchilamoniu, alchiltio, dialchilsulfoniu, sulfat sau fosfat;

R₂ este OH sau SH; sau

R, și R₂ pot fi legate între ele cu formarea unei legături între C₁₈ și C₁₉

R, și R₂ pot fi legate între ele cu formarea unui ciclu epoxidic, unui ciclu aziridinic, unui ciclu episulfidic, unui ciclu sulfat sau unui ciclu monoalchilfosfat; sau

R₃ este o grupare alchil inferioară;

R₄ și R₅ sunt hidrogen, sau

R₄ și R_s pot fi legate între ele cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄;

R₆ este o grupare benzii, hidroxibenzil, alcoxibenzil, halohidroxibenzil, dihalohidroxibenzil, haloalcoxibenzil sau dihaloalcoxibenzil;

R₇, R₈, Rg și R₁₀ sunt fiecare independent H sau o grupare alchil inferior; iar

X și Y sunt fiecare independent O, NH sau alchilamino.
2. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că R₈ este etil, propil, izopropil, butii, izobutil, pentil sau izopentil.
3. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că R₇ este etil, propil, izopropil, butii, izuobutil, pentil sau izopentil.
4. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că R₇ este H, R₈ este metil, R₃ este rnetil, X și Y nu sunt amândoi O.
5. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că R₃ este etil, propil, izopropil, butii, izobutil, pentil sau izopentil.
6. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că R_g este metil, etil, propil, butii, izobutil, pentil sau izopentil.
7. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că R₁₀ este metil, etil, propil, butii, izobutil, pentil sau izopentil.
8. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că R₇ și R₈ sunt alchil inferior.
9. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că R₇ și R₀ sunt metil.
10. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că cel puțin una din grupările atașate de C₃, C₆, C₁₀, C₁₆, C₁₇, și C₁₈ are stereoizomerie R.
11. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că cel puțin din una din grupările atașate de C₃, C₆, C₁₀, C₁₆, C₁₇, și C₁₈ are stereoizomerie S.

4650

4655

4660

4665

4670

4675

4680

RO 118931 Β1
12. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃, R₇ și R₈ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, Rg este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
13. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃, R; și F% sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
14. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S, S-epoxidic, R₃, R₇ și R_esunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
15. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, este S-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃, R₇ și R₈ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
16. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R, R-epoxidic, R₃, R₇ și R₈sunt metil, R₄ și R₅ sunt hidrogen, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
17. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, este S-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃, R₇ și R₈ sunt metil, R₄ și R₅ sunt hidrogen, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
18. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R, R-episulfidic, R₃, R₇ și R₈sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
19. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-metoxifenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ Și O™. Reeste 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R_e și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
20. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este metil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între θ13 Ș* θ14> R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R_e și R_1o sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
21. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este metil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄₎ R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
22. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este metil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
23. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-aziridinic, R₃ și R₇ și R₈sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₁₀ este hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.

RO 118931 Β1

4730
24. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-fluorfenil, Rt și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
25. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-tolil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
26. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-tienil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
27. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-fluorfenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R₇sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
28. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-fluorfenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇sunt metil, R₄ și R_s sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C_14> Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
29. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-tolil, R₁ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
30. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-tolil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R_s sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
31. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este 2-tienil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R_z sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
32. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este 2-tienil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R_w sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
33. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄și R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X este oxigen și Y este un azot care are un singur hidrogen.
34. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X este oxigen și Y este un azot care are un singur hidrogen.

4735

4740

4745

4750

4755

4760

4765

4770

4775
35. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R,_o sunt hidrogen, iar X este oxigen și Y este un azot care are un singur hidrogen.
36. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-clorfenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₈ și C₁₉, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
37. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-clorofenil, R, și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu R,R-epoxidic, R₃ și R₇sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
38. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-clorofenil, R₁ și R₂ sunt legați împreună cu formarea unui ciclu S,S-epoxidic, R₃ și R₇sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, Rg este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉ este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X este oxigen și Y este un azot care are un singur hidrogen.
39. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este fenil, R, este S-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și Ry sunt metil, R, și sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_g este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X este oxigen și Y este un azot care are un singur hidrogen.
40. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-tolil, Ri este S-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_geste izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
41. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-tolil, R, este R-clor, R₂ este S-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R₅ sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R_e este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_geste izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
42. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, Ar este p-tolil, R, este R-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și R_s sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_geste izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
43. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-clorfenil, R, este S-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R_geste izobutil, R_e și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
44. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-clorfenil, R, este R-clor, R₂ este S-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.
45. Derivat de criptoficină, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că Ar este p-clorfenil, R, este R-clor, R₂ este R-hidroxil, R₃ și R₇ sunt metil, R₄ și Rg sunt legați împreună cu formarea unei duble legături între C₁₃ și C₁₄, R₆ este 3-cloro-4-metoxibenzil, R₉este izobutil, R₈ și R₁₀ sunt hidrogen, iar X și Y sunt oxigen.

RO 118931 Β1
46. Procedeu de preparare a unui derivat de criptoficină, așa cum este definit în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde următoarele etape:

- alegerea unei E alchene substituită alilic;

- rearanjarea E alchenei alilic substituite, prin reacția de rearanjare stereospecifică Witting;

- transformarea acestui compus într-un prim δ aminoacid sau δ-hidroxi acid;

- cuplarea primului acid la un al dolea α-aminoacid cu obținerea primei subunități;

- cuplarea unui al treilea β-aminoacid cu un al patrulea α-hidroxi acid sau a-aminoacid pentru obținerea celei de-a doua subunități; și

- cuplarea primei subunități cu cea de-a doua subunitate cu obținerea derivatului de criptoficină.
47. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că aceasta conține un derivat de criptoficină, așa cum este definit în revendicarea 1, într-o cantitate eficientă terapeutic, împreună cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic, și suplimentar cel puțin un agent antineoplazic.
48. Utilizarea derivaților de criptoficină definiți în revendicarea 1, pentru inhibarea proliferării unei celule de mamifer hiperproliferative, având un fenotip rezistent la medicamente, pentru ameliorarea unei stări patologice care se caracterizează prin formarea de neoplasme aparținând grupului format din neoplasme mamare, neoplasme pulmonare cu celule mici, neoplasme pulmonare de alt tip decât cele cu celule mici, neoplasm colorectal, leucemie, melanom, adenocarcinomul pancreatic, neoplasm al sistemului nervos central (SNC), ovarian, de prostată, sarcomul țesutului moale sau osos, neoplasme ale capului și gâtului, neoplasm gastric care include neoplasm pancreatic și esofagian, neoplasm de stomac, mielom, neoplasm de vezică urinară, neoplasm renal, neoplasm neuroendrocrin care include și neoplasm de tiroidă precum și boala Hodgkin și neoplasmul non-Hodgkinian.