Przedmiotem wynalazku jest sposób stabilizowania prostacykliny /PGI2, PGX/ i Jej analogów, takich jak ,15-metyloprostacyklina, 16,16-dimetyloprostacyklina, lub ich farmace¬ utycznie dopuszczalnych soli* Znaczenie prostacykliny i jej soli w leczeniu ludzi i zwierzat polega na jej silnem dzialaniu przeciw agregacji plytek krwi, jak równiez na przyspieszaniu gojenia sie ran oraz zapobieganiu lub leczeniu wrzodów zoladka* Dzialanie zapobiegajace agregacji plytek krwi pozwala na zapobieganie lub lagodzenie procesu tworzenia sie skrzepów lub zatorów w czasie pozaustrojowegc krazenia kr*i, np. podczas dializy w sztucznej nerce i przeplywu przez sztuczne pluco-serce* Prostacykline i jej analogi, zwlaszcza 15-metyloprcstacykline i 1 6,16-dimetyloprosta- cykline, oraz sole tych zwiazków wytwarza sie metoda opisana w holenderskim opisie paten¬ towym nr 7 705 141 dotyczacym wytwarzania zwiazków o strukturze analogicznej* Sposób polega na usuwaniu chlorowcowodoru ze zwiazku o wzorze 1, w którym X oznacza atom bromu lub jodu, Y oznacza grupe OH, NHR4 lub OH, przy czym R oznacza grupe alkilowa o 1-4 atomach wegla, lub farmaceutycznie dopuszczalny kation taki, jak kation sodowy, R oznacza grupe alkilowa o 1-4 atomach wegla, zas & , R i R3 niezaleznie od siebie oznacza¬ ja atom wodoru lub grupe alkilowa o 1-4 atomach wegla, zwlaszcza grupe metylowa* Reakcje 12 3 przeprowadza sie dzialaniem zasady, np* w przypadku gdy R oznacza atom wodoru a R i r oznaczaja grupe metylowa, lub vice ?•rts, a nastepnie ewentualnie przeksztalca sie otrzy¬ many zwiazek, w którego wzorze Y oinaeii grupe NHR4 lub OR, a R i R4 oznaczaja grupe al¬ kilowa o 1-4 atomach wegla, w zadany stlazek czynny* Z prostacyklina i jej solami xw lniane sa jednakze niedogodnosci tego rodzaju, ze za¬ równo ona jak i jej sole sa nietrwale, swlaszcza w roztworze wodnym i szybko przeksztal¬ caja sis w 6-keto-PGF« cC i Jej sole, przedstawione schematycznie wzorem 2, które sa pod wzgledem farmakologicznym prawie calkowicie nieaktywne. Podjeto liczne badania nad zapo¬ bieganiem hydrolizie czesci eterowej enoloeterowego fragmentu czasteczki prostacykliny l»b Jej analogów* Wiadomo, ze prostacyklina i jej sole sa bardziej trwale w srodowisku2 134 004 alkalicznym niz w kwasnym lub obojetnym, PrCbowano zatem uzyskac polepszenie trwalosci sto¬ sujac bufor tris w roztworze alkalicznym, ale mimo to prostacyklina ulegala szybkiemu roz¬ kladowi. To zas oznaczalo, ze w praktyce prostacyklina musiala byc sporzadzana na bardzo krótko przed uzyciem np. do infuzji dozylnej, przy czym aktywnosc farmakologiczna roztworu zmieniala sie znacznie w trakcie czekania na uzycie, uniemozliwiajac w nastepstwie doklad¬ ne kontrolowanie infuzji.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze obecnosc aminokwasu w znacznym stopniu zapobiega hydro¬ lizie czesci eterowej enoloeterowego fragmentu czasteczki i tworzeniu sie wiazania 6-keto w czasteczce proatacykliny lub jej analogów wymienionych powyzej. Dalej okazalo sie, ze obecnosc aminokwasu w kazdym przypadku zapobiega hydrolizie czesci eterowej do ketonu w zwiazkach, które maja enoloeterowe fragmenty czasteczek.Jest to wiec niezwykle cenne odkrycie w dziedzinie chemii, a zwlaszcza tam, gdzie zachodzi koniecznosc stabilizowania eterów.Wedlug wynalazku sposób stabilizowania proatacykliny i jej analogów takich Jak 15- metyloprostacyklina, 16,16-dwumetyloprostacyklina lub ich sole, w postaci preparatu farma¬ ceutycznego w roztworze, zwlaszcza wodnym polega na tym, ze do roztworu proatacykliny lub jej wymienionego analogu dodaje sie farmaceutycznie dopuszczalny bufor na bazie aminokwasu takiego jak glicyna, alanina, arginina lub walina, przy calkowitym stezeniu molowym amino¬ kwasu, lacznie z jego solami, w buforze 0,02-0,03.W buforze stosuje sie aminokwas nie zawierajacy siarki. Najbardziej korzystnym amino¬ kwasem jest glicyna, zwlaszcza dlatego, ze Jest ona latwo dostepna, ponadto w przypadku glicyny syntetycznej nie jest wymagane rozdzielanie izomerów optycznych. Jednakze mozna takze stosowac inne aminokwasy, takie jak walina, alanina i arginina.Korzystnie, calkowite stezenie aminokwasu, to znaczy lacznie z jego solami, w buforze powinno byc na tyle niskie, aby umozliwialo otrzymanie stabilnego buforu, na ogól 0,02 m - 0,03 m, korzystnie okolo 0,025 m, poniewaz obecnosc zbyt duzej ilosci aminokwasu powoduje zmniejszenie stabilnosci zwiazku czynnego w cyniku wzrostu sily jonowej obecnego w roztworze zwiazku czynnego i buforu. Aminokwas musi byc dostatecznie rozpuszczalny, aby zapewnic wy¬ starczajaca, niezbedna pojemnosc buforu.Prostacykllne i jej analogi stosuje sie na ogól w postaci soli sodowej w roztworze o pH co najmniej 9. Aby uzyskac pozadane pH przy sporzadzaniu roztworu mozna dodac mocnej zasady takiej jak wodorotlenek sodu.Roztwór moze równiez zawierac inne sole np. NaCl, w celu zapewnienia jego izotonicz- nosci. W przypadku obecnosci chlorku sodu w roztworze buforu, ilosc jego powinna byc taka, aby roztwór byl farmaceutycznie dopuszczalny. Stezenie molowe chlorku sodu korzystnie jest mniej wiecej takie same jak stezenie aminokwasu. Zbyt duza ilosc chlorku sodu niepozadanie podwyzsza sile Jonowa roztworu prostacykliny lub jej analogów i buforu i niekorzystnie wplywa na stabilnosc prostacykliny. Inne sole takie jak chlorek potasu, takze moga byc obec¬ ne, pod warunkiem, ze sa one farmaceutycznie dopuszczalne i wystepuja w farmaceutycznie dozwolonych ilosciach. ^wiazek czynny i bufor sporzadza sie razem w roztworze w rozpuszczalniku, zazwyczaj wodzie. W roztworze, wartoscia pH jest ta wartosc, która wykazuje roztwór zawierajacy wspom¬ niany zwiazek czynny i bufor.Jesli roztwór sporzadza sie ze zwiazku czynnego i buforu w stanie stalym, Jako wartosc pH buforu rozumie sie wartosc pH mierzona w dowolny z nastepujacych ,sposobów. Jesli sa w stanie zamrozonego roztworu, mierzona wartoscia pH jest ta wartosc, która wykazuje roztwór powstaly przez jego rozmrozenie. S innych przypadkach mierzona wartoscia pH jest ta wartosc, która wykazuje roztwór powstaly przez rozpuszczenie obecnych stalych skladników, zwiazku czynnego i buforu w wodzie do iniekcji o pH 7. W szczególnym przypadku dotyczacym liofili¬ zowanej pozostalosci wspomnianego roztworu, mierzona wartoscia pH jest ta wartosc, która wykazuje roztwór powstaly przez rozpuaiozonie próbki pozostalo8ci w wodzie do iniekcji o pH 7, wkrótce po przygotowaniu liofilizowanej pozostalosci.134 004 3 Korzystnie pH buforu wynosi 10,2 - 11*,6, a zwlaszcza okolo 10,5.Przykladowo, jako roztwór buforu sporzadzonego sposobem wedlug wynalazku, zawierajace¬ go prostacykline, przygotowuje sie roztwór glicyny w wodzie, zawierajacy takze nieco chlorku sodowego* Do roztworu tego dodaje sie wodorotlenku sodowego, jako zasade, w celu podwyzsze¬ nia pH do zadanego poziomu, po czym dodaje sie prostacykline* W podanym przypadku, jako zasade uzyto wodorotlenek sodu, jednakze mozna stosowac kaz¬ da zasade dostatecznie mocna, aby uzyskac roztwór buforowy o zadanym pH* Oczywiscie nalezy uzyc takiej zasady, która daje farmaceutycznie dopuszczalny roztwór, to jest takiej, która nie jest szkodliwa dla biorcy. Ilosc uzytego aminokwasu, np* glicyny i zasady, np. wodoro¬ tlenku sodowego, powinna byc mozliwie najmniejsza, jedynie taka, aby zapewnic trwalosc prostacykliny w zadanym okresie czasu. Zastosowanie nadmiaru albo aminokwasu, albo zasady, albo ich obu, prowadzi do zatrzymywania wody w zliofilizowanym produkcie, co prowadzi do pogorszenia aktywnosci zwiazku. Tak wiec, waznym czynnikiem zapewniajacym to, ze roztwór jest farmaceutycznie dozwolony, jest pH tego roztworu.W przypadku, gdy roztwór buforowy ma zostac wprowadzony do aparatu, np. przy dializie w sztucznej nerce, wtedy pH moze wynosic 12 lub nawet wiecej, natomiast gdy ma on zostac wprowadzony w duzej objetosci do zyly, np. przy przeplywie przez sztuczne pluco-serce, wtedy pH roztworu wplywajacego do zyly korzystnie powinno miescic sie w zakresie od 8,4 - 9 i w tym celu pH roztworu buforowego obniza sie na krótko przed uzyciem* Roztwór buforowy moze zawierac inne czynniki buforujace, ale ilosc ich nie powinna wplywac w zasadniczym stopniu na zmniejszenie stabilnosci zwiazku czynnego w roztworze* I tak, moze byc obecna pewna ilosc weglanu, pochodzacego od prostacykliny* Np* sól sodowa prostacykliny moze zawierac az do 5% wagowych weglanu sodowego* Poniewaz zwiazek czynny wykazuje wysoka aktywnosc farmakologiczna, stosuje sie go w bardzo malych ilosciach. Np. dis przecietnego pacjenta w wadze 70 kg w 1-godzinnej in- fuzji wystarcza tylko kilka miligramów.Ilosc zwiazku czynnego wymagana dla osiagniecia dzialania leczniczego jest ró.*na w zaleznosci od sposobu podawania. Ogólnie, dawka odpowiednia dla ssaków miesci sie w zakre¬ sie 0,01 - 200 mg/kg wagi ciala, zwlaszcza 0,01 - 10 mg/kg, korzystnie 0,1 - 1,0 mg/kg, a szczególnie korzystnie 0,2 - 0,5 mg/kg* Ilosc zwiazku czynnego zawartego w ampulce do podawania w infuzji miesci sie w zakresie 0,1 - 1,5 mg/kg, korzystnie 0,5 - 1,0 mg/kg* Zwiazek czynny do leczenia ludzi, moze byc kilkakrotnie aktywniejszy niz do leczenia Innych ssaków i stosownie do tego moze byc wskazane stosowanie dawek najnizszych w poda¬ nych wyzej zakresach dawkowania* Przyklad. Przygotowano jalowe roztwory prostacykliny /0f2 i 0,4 mg/ml/ 1 mannitu /50 mg/ml/ w nastepujacych buforach: glicynowym, argininowym, walincwym, alani¬ nowym, weglanowym i tria* Czynniki buforujace stosowano w nastepujacym stezeniu molowym: Bufor aminokwasowy: 0,025 m aminokv^c, 0,025 m chlorek sodowy wodorotlenek sodowy q.s., pH 10,5• Bufor weglanowy: 448 mg/lItr wodoroweglanu sodowego i 1614 mg/litr weglanu sodo¬ wego. Bufor tris: 605^ mg/litr zasady tris i 2,5 ml 0,1 n wodorotlenku sodowego na litr. 5 ml porcje kazdego z tych roztworów poddano nastepnie liofilizacji w fiolkach przez zamrozenie w temperaturze -40°C 1 pod zmniejszonym cisnieniem, przeprowadzajac pierwsza faz? suszenia w temperaturze 0°C, • iruga w temperaturze 20°C* Fiolki zamknieto w atmosfe¬ rze azotu* Zliof11izowane produkty bscano nastepnie w przyspieszonym tescie przechowywania w temperaturze uwidocznionej w tablicy* Produkt otrzymany po uplywie es«au wskazanego w tablicy analizowano pod wzgledem zawartosci prostacykliny za pomoce *ysokosprawnej chromatografii cieczowej /HPLC/* Za pomoca HPLC badano zliof 11 lzowar.e preparaty rekonstytuowane w 10 ml 0,025% roztworu wodorotlenku tetrametyloamoniowego.Stosowano kolumne ze stali nierdzewnej o wymiarach 25 cm x 4,2 mm /srednica wewnetrz¬ na/ o wypelnieniu krzemionka Partis11 ODS, przygotowana w laboratorium w sposób opisany po¬ nizej* Kolumne zaladowano metoda tfebbera i Mc*errela, J. Chromatog* 122, 243 /1976/, stosujac do sporzadzenia zawiesiny czterochlorek wegla*4 134 004 1 Material do wypelnienia kolumny przygotowano w sposób nastepujacy: 10 g Partisil'u /10 yum/ osuszono w 250 ml kolbie okraglodennej pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 80°C w ciagu 2 l/2 godziny. Nastepnie dodano 10 ml oktadecylotrichlorosilanu i 100 ml bez¬ wodnego toluenu, po czym otrzymany roztwór ogrzewano w temperaturze wrzenia w ciagu 3 go¬ dzin mieszajac za pomoca mieszadla lopatkowego i stosujac chlodnice zwrotna zaopatrzona w rurke ochronna z chlorkiem wapniowym. Nastepnie mieszanine odstawiono w celu oziebienia i przesaczono przez filtr miliporowy 0,5 /Urn.Krzemionke na filtrze przemyto 250 ml metanolu przy stalym mieszaniu osadu, a nastep¬ nie 250 ml goracego acetonu i osuszono pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 80°C przez okolo 2 godziny. Otrzymano 11 g produktu, który zadano 10 ml trimetylochlorosilanu w sposób jak wyzej opisano i po ogrzewaniu w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 45 minut otrzymano produkt koncowy.Jako faze ruchoma stosowano 1200 ml wody, w której rozpuszczono 5 g kwasu borowego i 7,6 g czteroboranu dwusodowego, a nastepnie dodano 800 ml metanolu* temperatura kolumny byla równa temperaturze otoczenia 25 - 30°C, szybkosc przeplywu fazy ruchomej wynosila 3,6 ml/minute a cisnienie 20 lff&. Produkt wykrywano za pomoca aparatu Pye Unicam LC przy dlugosci fali 205 nm, w przedziale Q,i6 calkowitej skali Jednostek absorbancji, dla roz¬ tworów 0-100 /ug/m.Ilosc obecnej prostacykliny okreslono na podstawie zamierzonej wysokosci piku w po¬ równaniu z próbka porównawcza o znanym stezeniu.Uzyskane wyniki zamieszczono w ponizszej tablicy Tablica Bufor Glicyna Arginina | WalIna | Alanina Weglan L trla J *» % pozostalej prostacykliny w HPLC badaniu za pomoca 66 godzin 70°C 0 *•- 0 0 60°C 0 2 0 I I 50°C 3 45* 86* 83* 3,5 slad I 37°C 90 91x/ 93^ 97V 45 1 6 dni 1 /144 godzinyA 26°C 1 96 | 62 1 slad J 35 J Badano prostacykline 0,2 mg/ml w innych warunkach niz glicyne i bufory• Z danych zamieszczonych w powyzszej tablicy wynika jasno, ze w normalnej temperatu¬ rze przechowywania, to Jest w temperaturze 37°C lub nizszej, bufory aminokwasowe, wykazy¬ waly wyzszosc nad dwoma innymi buforami badanymi. Aczkolwiek bufor weglanowy byl gorszy od aminokwaaowego, jest widoczne, ze mozna tolerowac w buforze aminokwasowym niewielka ilosc weglanów.Zastrzezenia patentowe !• Sposób stabilizowania prostacykliny i jej analogów takich jak 15-metyloprosta- cyklina, 16,1 6-dwumetyloprostacyklina lub ich sole w postaci preparatu farmaceutycznego w roztworze, zwlaszcza wodnym, znamienny tym, ze prostacykline lub Jej ana¬ logi sporzadza sie w roztworze z dodatkiem farmaceutycznie dopuszczalnego buforu na bazie aminokwasu takiego, jak glicyna, w ilosci odpowiadajacej calkowitemu stezeniu molowemu 0,02 - 0,03 aminokwasu lacznie z jego solami w buforze*134 004 5 2* Sposób wedlug zastrz* 1, z nam* lenny tym, ze prostacykline lub Jej analogi stosuje sie w postaci soli sodowej, w roztworze o pH co najmniej 9* t 9 tym, t y ze stosuje sie bufor w roz- ze stosuje sie bufor, który ze stosuje sie bufor o cal- ze jako mocna zasade stosu- 3* Sposób wedlug zastrz* 1, znamienny tworze o pH w zakresie 10,2 - 11,6* 4* Sposób wedlug zastrz*1 , znamienny zawiera glicyne i mocna zasade. 5« Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny kowitym stezeniu molowym 0,025 glicyny wraz z jego solami 6. Sposób wedlug zastrz. 5f znamienny ty je sie wodorotlenek sodowy* 7. Sposób stabilizowania prostacykliny i jej analogów takich jak 15-metyloprosta- cyklina, 16,16-dwumetyloprostacyklina lub ich sole w postaci preparatu farmaceutycznego w roztworze, zwlaszcza wodnym, znamienny tym, ze prostacykline lub jej ahalogi sporzadza sie w roztworze farmaceutycznie dopuszczalnego buforu na bazie amino¬ kwasu takiego jak alanina, arginina lub walina w ilosci odpowiadajacej calkowitemu steze¬ niu molowemu 0,02 - 0,03 aminokwasu lacznie z jego solami w buforze* 8* Sposób wedlug zastrz* 7, znamienny tym, ze prostacykline lub jej analogi stosuje sie w postaci soli sodowej w roztworze o pH co najmniej 9* 9* Sposób wedlug zastrz* 8, znamienny tym, ze stosuje sie bufor w roz¬ tworze o pH w zakresie 10,2 - 11,6* 10* Sposób wedlug zastrz* 7, znamienny zawiera aminokwas i mocna zasade* 11* Sposób wedlug zastrz* 10, znamienny o calkowitym stezeniu molowym 0,025 aminokwasu wraz z 12* Sposób wedlug zastrz* 10, znamienny stosuje sie wodorotlenek sodowy* tym, ze stosuje sie bufor, który tym, ze stosuje sie bufor jego solami, tym, ze jako mocna zasade o- COY Hzór 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL