FI68359C - Foerfarande foer framstaellning av en stabil prostacyklinkomposition foer terapeutiskt anvaendning - Google Patents

Description

γοί «« KUULUTUSJULKAISU 6835 9 lJ 'J utlAggningsskrift c Patentti myönnetty 10 09 1985

Patent ceddelat , (51) Kv.lk.*/lnt.CI.‘ A 61 K 3 1 /3^+ SUOMI — FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansdkning 791565 (22) Hakemispäivä — Ansöknlngsdag 16.05.79 (23) Alkupäivä — Glltighetsdag 16.05.79 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvit offentlig ^ g j j yg

Patentti- ja rekisterihallitus /44) Nähtäväksipanon Ja kuul.Julkalsun pvm. — nc Or

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ans&kan utlagd och utl.skrlften publlcerad ·* .10.05 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prioritet 17.05-78

Englant i-England(GB) 20175/78 (71) The Wellcome Foundation Limited, 183~193 Euston Road, London N.W.1, Englanti-England(GB) (72) lan Seymour Watts, Sidcup, Kent, Peter Hugh Marsden, Dartford, Kent, Englant i-Eng 1 and(GB) (fk) Oy Kolster Ab (5^) Menetelmä terapeuttisesti käytettävän stabiilin prostasykliinikoostunnuksen valmistamiseksi - Förfarande för framstälIning av en stabil prostacyklin-komposition för terapeutisk användning

Keksintö koskee terapeuttisesti käytettävää koostumusta, joka aktiivisena aineena sisältää enolieetteriryhmän hydrolysoitumista vastaan stabiloitua prostasykliiniä (PQ^, PGX) , 15-metyyli-prostasykliiniä, 16,16-dimetyyliprostasykliiniä tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa.

Prostasykliini ja sen suolat ovat tärkeitä lääketieteessä, koska niillä on voimakas verihiutaleiden kasaantumista estävä vaikutus ja ne nopeuttavat myös haavojen parantumista ja estävät vatsahaavoja tai niillä on niihin terapeuttinen vaikutus.

Verihiutaleiden kasaantumista estävä vaikutus on käyttökelpoinen esimerkiksi ehkäistäessä tai lievitettäessä verenhyytymien tai veritulppien muodostumista verta kehon ulkopuolella kierrätettäessä, esim. munuaisdialyysissä ja sydän-pulmonaali-kiertämisessä.

Kuitenkin vaikeus, joka koetaan käytettäessä prostasykliiniä ja sen suoloja, on, että prostasykliini ja sen suolat ovat 68359 epästabiileja, erikoisesti vesiliuoksessa ja ne muuttuvat nopeasti ö-okso-PGF^rksi ja sen suoloiksi, jotka ovat farmakologisesti lähes tehottomia ja joilla on hyvin harvoja, mikäli lainkaan, pros-tasykliinin ja sen suolojen edullisia vaikutuksia.

Prostasykliinin ja sen suolojen tiedetään olevan stabiilimpia emäksisissä kuin happamissa tai neutraaleissa väliaineissa. Vaikka stabiilisuuden on todettu paranevan käyttämällä tris-pus-kuria emäksisessä liuoksessa, on prostasykliini silti hajonnut nopeasti. Tämä on merkinnyt, että prostasykliinivalmiste on täytynyt muodostaa juuri ennen käyttöä esim. laskimoinfuusiossa, ja liuoksen farmakologinen aktiivisuus on muuttunut huomattavasti sinä aikana, jolloin se on odottanut käyttöä. Tämä on tehnyt infuusion säätelyn halutulla huolellisuudella vaikeaksi.

Kirjallisuudessa, esim. US-patenteissa 3 851 052 ja 4 058 623 sekä DE-hakemusjulkaisussa 2 451 161, on ehdotettu erilaisia tapoja valmistaa farmaseuttiseen käyttöön soveltuvia stabiloituja prostaglandiinikoostumuksia. Nämä koostumukset ovat kuitenkin yleensä sisältäneet E-sarjan prostaglandiineja, jotka sta-biliteettiominaisuuksiltaan eroavat huomattavasti prostasyklii-neistä.

Nyt on yllättäen keksitty menetelmä, jolla prostasykliinin stabiliteettia voidaan huomattavasti parantaa. Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käytettävän koostumuksen valmistamiseksi, joka koostumus aktiivisena aineena sisältää enolieetteriryhmän hydrolysoimista vastaan stabiloitua prostasykliiniä, 15-metyyli-prostasykliiniä, 16,16-dimetyyliprostasykliiniä tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa ja mahdollisesti farmaseuttisesti hyväksyttävää lisäainetta, kuten mannitolia.

Menetelmälle on tunnusomaista, että prostasykliini, 15-met-yyliprostasykliini, 16,16-dimetyyliprostasykliini tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävä suola sekoitetaan vesifaasissa aminohappoon perustuvaan puskuriin, jossa aminohappo on pääasiallinen puskurihappo ja jonka pH on vähintään 9, minkä jälkeen seos pakaste-kuivataan. Aktiivisena aineena mahdollisesti käytettävä suola on edullisesti natriumsuola.

li 3 68359

Pakastekuivaaminen saa aikaan aktiivisen yhdisteen parantuneen stabiilisuuden. Pakastekuivaus voidaan suorittaa tavanomaisella tavalla esimerkiksi ampullissa tai lääkepullossa.

Prostasykliini ja sen analogit, erikoisesti 15-metyyli-prostasykliini ja 16,16-dimetyyliprostasykliini ja niiden suolat, voidaan valmistaa GB-patenttijulkaisussa 2 021 581 kuvatuilla menetelmillä, joita on käytetty rakeenteeltaan analogisten yhdisteiden valmistamiseksi. Eräässä tällaisessa menetelmässä kaavan (I) mukainen yhdiste, jonka kaava on

X

°°Υ o'\ ϊ / (I)

CJ V

n R1 , . 4 jossa X on bromi- tai jodiatomi; Y on OH, NHR tai OR, jolloin R on 1-4 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä tai farmaseuttisesti 4 hyväksyttävä kationi, kuten natrium, R on 1-4 hiiliatomia sisältävä 4 68359 12 3 alkyyliryhmä; R , R ja R tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä tai 1-4 hiiliatomia sisältävää alkyyliä, erikoisesti metyyliä; esimerkiksi, kun Rx on vety, R ja R tarkoittavat kumpikin metyyliä tai päinvastoin; dehydrogenoidaan emäksellä ja tarvittaessa 4 4 saatu yhdiste, jossa Y on NHR tai OR, jolloin R ja R ovat 1-4 hiiliatomia sisältäviä alkyyliryhmiä, muutetaan halutuksi aktiiviseksi yhdisteeksi.

Puskurissa käytettävä aminohappo on edullisesti rikitön ja edullisin aminohappo on glysiini, erikoisesti, koska se on helposti saatavissa ja, mikäli se on valmistettu synteettisesti, sitä ei tarvitse optisesti erottaa; mutta muita aminohappoja, kuten valii-nia, alaniinia ja arginiinia voidaan myös käyttää.

Aminohapon kokonaisväkevyys (so. sen suolat mukaan lukien) puskurissa on edullisesti niin alhainen kuin mahdollista stabiilin puskurin saamiseksi, esim. 0,02M - 0,03M, edullisesti noin o,025M, koska liian suuren aminohappomäärän läsnäolo pyrkii pienentämään aktiivisen yhdisteen stabiliteettia suurentamalla aktiivisen yhdisteen ja puskurin liuoksen ioniväkevyyttä. Aminohapon on oltava riittävän liukeneva tuottamaan tarvittava puskurikapasiteetti.

Jos natriumkloridia on läsnä puskuriliuoksessa, kuten on edullista, lisätty määrä ei saa olla sellainen, ettei liuos ole farmaseuttisesti hyväksyttävä. Natriumkloridin molaarinen väkevyys on edullisesti suunnilleen sama kuin aminohapon. Liian suuri natrium-kloridimäärä nostaisi aktiivisen yhdisteen ja puskurin liuoksen ioniväkevyyttä haitallisesti ja vaikuttaisi aktiivisen yhdisteen stabiliteettiin haitallisesti. Muita suoloja, esim. kaliumkloridia, voi olla myös läsnä, mikäli ne tai niiden määrä ovat farmaseuttisesti hyväksyttävät.

Puskurin pH on edullisesti 10,2 - 11,6, erikoisesti noin 10,5.

Esimerkkinä prostasykliiniä sisältävän puskuriliuoksen valmistuksesta valmistettiin liuos, joka sisälsi glysiiniä vedessä ja myös hiukan natriumkloridia. Tähän liuokseen lisättiin natriumhydoksidia emäkseksi nostamaan pH halutulle tasolle ja sitten lisättiin prosta-sykliini.

Il 5 68359

Vaikka natriumhydroksidia käytettiin emäksenä yllä mainitussa esimerkissä, voidaan käyttää mitä tahansa emästä, joka on riittävän vahva tuottamaan puskuriliuoksen, jolla on haluttu pH. Luonnollisesti emäksen pitäisi olla sellainen, joka muodostaa farmaseuttisesti hyväksyttävän liuoksen. Käytetyn aminohapon, esimerkiksi glysiinin ja emäksen, esimerkiksi natriumhydroksidin, määrän tulisi olla riittävän pieni stabiloimaan aktiivinen yhdiste halutuksi ajanjaksoksi. Aminohappo- ja/tai emäsylimäärän käyttö johtaa veden retentioon pakastekuivatussa tuotteessa, joka saa aikaan aktiivisen yhdisteen huonontumisen. Kuitenkin liuoksen pH on tärkeä tekijä arvioitaessa farmaseuttista hyväksyttävyyttä.

Jos puskuriliuos on siirrettävä koneeseen esimerkiksi munuaisdia-lyysissä, silloin pH voi olla jopa 12 tai enemmän, mutta jos puskuriliuos on annettava suurena tilavuutena suoneen, esimerkiksi sydän-pulmonaali-kiertämLsessä, silloin suoneen tulevan liuoksen pH:n tulisi edullisesti olla 8,4 - 9 ja tätä tarkoitusta varten puskuriliuoksen pH voidaan alentaa juuri ennen käyttöä.

Muita puskuroivia aineita voi olla läsnä puskuriliuoksessa, mutta niiden määrä ei saa oleellisesti pienentää aktiivisen yhdisteen stabiliteettia liuoksessa. Esimerkiksi läsnä voi olla hiukan karbonaattia, joka on peräisin prostasykliinistä; esim. prosta-sykliinin natriumsuola voi sisältää enintään 5 paino-% natrium-karbonaattia .

Koska aktiivinen yhdiste on farmakologisesti hyvin aktiivinen, sitä tarvitaan erittäin pieni määrä; esimerkiksi vain muutamia mg tarvitaan yhden tunnin infuusioon 70 kg painoiselle henkilölle. Tietyssä puskuriliuoksessa läsnä olevan aktiivisen yhdisteen määrä ennen pakastekuivausta riippuu pakastekuivatun aineen suunnitellusta käytöstä liuosta uudelleen muodostettaessa. Uudelleen muodostaminen voi tapahtua aktiivista yhdistettä sisältämättömällä puskuriliuoksella, niin että aktiivisen yhdisteen suhde puskuroiviin aineosiin voi olla paljon suurempi kuin annettavaksi käytettävässä liuoksessa.

Jos liuos, joka sisältää vain puskuroivia aineita, aktiivista yhdistettä ja natriumkloridia, pakastekuivataan, ei saadun pakastekuivatun aineen fysikaalinen lujuus ja ulkonäkö ole erikoisen tyydyttävä. Sen vuoksi on edullista lisätä lisäainetta pusku- 68359 riliuokseen ennen liuoksen pakastekuivaamista. Edullinen lisäaine on mannitoli. Edullinen lisäkonsentraatio on 25-50 mg/ml puskuri-liuosta. Jos mannitolia käytetään vähemmän kuin 25 mg/ml, lujuus ja ulkonäkö eivät parane riittävästi. Jos käytetään enemmän kuin 50 mg/ml, tapahtuu pieni parannus tai parannusta ei tapahdu ollenkaan ja aktiivisen yhdisteen stabiliteettiin nähden voi ilmetä haittavaikutuksia. Lisäaine muodostaa pakastekuivatulle aineelle kantajamatriisin ja parantaa aineen fysikaalista lujuutta ja ulkonäköä. Kaikkia lisäaineita ei voida käyttää; esimerkiksi niitä, kuten polyvinyylipyrrolidonia, jotka aiheuttavat uudelleen muodostetun aineen huomattavaa vaahtoamista pakastekuivauspullossa, pitäisi välttää. Myös muita, jotka vaikuttavat puskurin pH-arvoon, esim. glysiini itse, pitäisi välttää.

Puskuriliuos voi myös sisältää haluttaessa muita terapeuttisia aineita aktiivisen yhdisteen ohella. Pakastekuivattu tuote voi myös sisältää tällaisia muita terapeuttisia aineita tai niitä voidaan lisätä uudelleen muodostettuun puskuriliuokseen. Tällaiset muut terapeuttiset aineet voivat osittain tai kokonaan korvata lisäaineen.

Puskuriliuoksen valmistuksessa käytetty liuotin on edullisesti injektiovesi (eurooppalainen farmakopea) tai muu vesi, joka soveltuu käytettäväksi infuusioissa tai injektioissa. Muodostettaessa pakastekuivattua ainetta käyttöön, se voidaan liuottaa uudelleen injektioveteen, jonka pH-arvo on yleensä 5,5 - 7, edullisesti 7, tai aminohappopuskuriliuokseen, jonka pH on vähintään 9, edullisesti noin 10,5, tai hieman puskuriliuosta voidaan lisätä injektio vesiliuokseen. Pakastekuivatun aineen uudelleen muodostaminen voi myös tapahtua liuottamalla se infuusioperustaan, kuten infuu-sioon soveltuvaan fysiologiseen suolaliuokseen. Tähän tarkoitukseen on myös mahdollista käyttää glukoosia.

Puskuriliuoksen pakastekuivaaminen voidaan suorittaa millä tahansa tavanomaisella tavalla, siten, että aineen vesipitoisuutta alennetaan sopivassa määrin parantamaan edelleen aktiivisen yhdisteen stabiliteettia.

Terapeuttista vaikutusta varten tarvittavat aktiivisen yhdisteen määrä vaihtelee antotavan mukaan. Sopiva annos nisäkkäälle on 0,01 - 200 mg/kg ruumiin painoa, tavallisesti 0,01 - 10 mg/kg, edullisesti 0,1-1,0 mg/kg ja erikoisesti 0,2 - 0,5 mg/kg.

Il 7 68359

Ampullissa olevan aktiivisen yhdisteen määrä annettavaksi infuusiolla on 0,1 - 1,5 mg/kg, edullisesti 0,5 - 1,0 mg/kg. Ihmisessä käytettynä aktiivinen yhdiste voi olla moninkertaisesti tehokkaampi kuin muissa nisäkkäissä ja sen vuoksi voi olla toivottavaa käyttää annoksia, jota ovat lähellä edellä annettujen annos-alueiden alarajoja.

Ihmis- ja eläinlääketieteelliseen käyttöön voi olla tarkoituksenmukaista käyttää yhdistelmää, johon kuuluu vähintään kaksi säiliötä, esimerkiksi monikomponenttipakkausta varten, jolloin toinen osa pakastekuivatun (lyofilisoidun) aineen puskuroitua aktiivista yhdistettä sisältävä lääkepullo tai ampulli, kuten edellä on kuvattu, ja toinen on lääkepullo tai ampulli, joka sisältää lisämäärän puskuria vesiliuoksessa tai pakastekuivattuna ilman aktiivista yhdistettä. Pakastekuivattu tuote voidaan sitten muodostaa uudelleen puskurin vesiliuoksen kanssa, tai mikäli toisen säiliön sisältö on pakastekuivattu, sopivan vesipitoisen laimentimen kanssa kolmannesta säiliöstä. Uudelleen muodostettu aine voidaan sitten laimentaa edelleen tarvittaessa, jolloin saadaan haluttu annos välittömästi ennen antamista. Täten pakastekuivattu valmiste, joka sisältää esimerkiksi 0,5 mg aktiivista yhdistettä pH:ssa 11,5 voidaan laimentaa 50 tai 500 ml:11a vesipitoista dekstroosi- tai suolaliuosta, jolla on sellainen pH, että saadun liuoksen pH on 10,0 - 10,5.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1

Muodostettiin steriilejä liuoksia, jotka sisälsivät prosta-sykliiniä (0,2 ja 0,4 mg/ml) ja mannitolia (50 mg/ml), käyttäen seuraavia puskureita: glysiini, arginiini, väliini, alaniini, karbonaatti ja tris. Puskuroivien aineosien väkevyydet olivat:

Aminohappopuskuri: 0,025M aminohappo, 0,025M natriumkloridi ja natriumhydroksidi q.s. pH 10,5.

Karbonaattipuskuri: 448 mg/1 natriumbikarbonaattia ja 1614 mg/1 natriumkarbonaattia.

Tris-puskuri (2-amino-2-hydroksimetyyli-l,3-propaanidioli): 6054 mg/1 tris-perustaa ja 2,5 ml 0,1N natriumhydroksidia litraa kohti.

8 68359 5 ml annokset kutakin näistä liuoksista pakastekuivattiin sitten lääkepulloissa jäädyttämällä -40°C:een ja tyhjössä, suorittaen ensimmäisen kuivausvaiheen 0°C:ssa ja toisen kuivausvaiheen 20°C:ssa. Lääkepullojen sulkeminen suoritettiin typpi-ilmakehässä. Pakastekuivatuille tuotteille suoritettiin sitten nopeutettu va-rastointikoe lämpötilassa, joka on ilmoitettu taulukossa I. Taulukossa I esitettyjen aikojen kuluttua saadut tuotteet analysoitiin prostasykliinisältönsä suhteen suuren erotuskyvyn nestekro-matografiällä (HPLC). HPLC suoritettiin pakastekuivatuille valmisteille, jotka oli muodostettu uudelleen 10 mlraan 0,02 % tetramet-yyliammoniumhydroksidiliuosta.

Käytettiin ruostumattomasta teräksestä valmistettua pylvästä, jonka sisähalkaisija oli 25 cm x 4,2 mm ja joka oli täytetty laboratoriovalmisteisella Partisil ODS täyteaineella, joka oli valmistettu jäljempänä kuvatulla tavalla. Pylväs täytettiin julkaisusta Webber ja McKerrel, J. Chromatog., 122, 243 (1976), kuvatulla menetelmällä käyttäen lieteaineen hiilitetrakloridia.

Pylvään täyteaine valmistettiin seuraavasti: 10 ^um Partisil (10 g) kuivattiin tyhjössä 80°C:ssa kahden ja puolen tunnin ajan 250 ml:n pyöreäpohjaisessa kolvissa. Oktadekyylitrikloorisilaania (10 ml) ja kuivaa tolueenia (100 ml) lisättiin ja liuosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen kolmen tunnin ajan sekoittaen melalla käyttämällä palautusjäähdytintä, joka oli varustettu kalsiumklo-ridisuojaputkella. Seoksen annetiin jäähtyä ja sitten se suodatettiin 0,5 yum milliporesuodattimen läpi. Piihappo suodattimessa pestiin 250 ml :11a metanolia liettäen kiinteää ainetta jatkuvasti, sitten 250 ml:11a kuumaa asetonia ja kuivattiin 80°C:ssa tyhjössä noin kahden tunnin ajan. Tuote (11 g) käsiteltiin trimetyylikloo-risilaanilla (10 ml), kuten yllä, palautusjäähdyttäen 45 minuutin ajan, jolloin saatiin lopullinen tuote.

Käytetty liikkuva faasi oli vettä (1200 ml), johon oli liuotettu 5 g boorihappoa ja 5,6 g dinatriumtetraboraattia ja sitten lisätty metanolia (800 ml). Käytetty pylvään lämpötila oli noin 25-30°C ja liikkuvan faasin virtausnopeus oli 3,6 ml/min ja käytetty paine oli 20 MPa. Tuotteiden osoittaminen suoritettiin käyttäen laitetta Pye Unichem LC3 205 nanometrin aallonpituudella, 0,16 aufs ( absorptioyksikköä koko asteikko) 0-100 μq/ml liuoksille.

9 68359 Läsnä olevan prostasykliinin määrä määritettiin huipun korkeusmittauksella ja vertaamalla tunnetun väkevyiseen vertailu-näytteeseen .

Saadut tulokset on esitetty taulukossa I.

Taulukko I

Puskuri HPLC-koe (% prostasykliinijäämä) (0,2 mdf/ml) 66 tuntia 6 päivää (144 tuntia)

7 0°C 60°C 50°C 37°C 26°C

Glysiini 0 0 3 90 96 Ärginiini 45 91 Väliini 86 93

Alaniini 83 97

Karbonaatti 0 2 3,5 45 62

Tris 0 0 jälki jälki 35

Taulukosta I voidaan selvästi nähdä, että normaaleissa va-rastointilämpötiloissa, so. noin 37°C tai alapuolella, aminohappo-puskurit ovat ylivoimaisia verrattuna kahteen muuhun kokeiltuun puskuriin. Vaikka karbonaattipuskuri on huonompi kuin aminohappo-puskuri, on selvää, että jonkin verran karbonaattia voitaisiin hyväksyä aminohappopuskurissa.

Esimerkki 2

Pakastekuivattu prostasykliini-injektio (1 mg)

Prostasykliini 1 000 mg

Mannitoli 50 000 mg

NaCl (0,025M) 2 932 mg

Glysiini (0,025M) 3 760 mg

NaOH q.s. pH:hon 10,5 Käyttämällä yleistä esimerkissä 1 kuvattua menetelmää pakas-tekuivattiin 1 mg prostasykliini-injektio, joka sisälsi yllä mainitut aineosat, jolloin saatiin jäännös, joka sisältää enintään 5 % paino/paino vettä.

68359 10

Esimerkki 3

Prostasykliini-injektion steriili laimennin

Glysiini (0,025M) 94,0 mg

NaCl (0,025M) 73,3 mg

NaOH q.s. pH:hon 10,5

Injektiovettä 50 ml:aan.

Käyttämällä esimerkissä 1 kuvattua yleistä menetelmää yllä mainitut aineosat sisältävää liuosta käytettiin laimentimena.

Keksinnön mukaisesti stabiloituvien prostasykliiniyhdistei-den valmistus A. Sekoitettua PGF2-metyyliesterin (50 mg) liuosta eetterissä (1 ml) käsiteltiin natriumbikarbonaatilla (115,0 mg; 10 mole-kyyliekvivalenttia) ja vedellä (1 ml) ja sitten tipoittain kahden tunnin aikana kaliumtrijodidin vesiliuoksella (0,7 molaarinen; 0,261 ml). Kun oli sekoitettu yli yön, reaktioseosta ravisteltiin eetterin ja natriumtiosulfaatin vesiliuoksen kanssa; eetterifaasi erotettiin, pestiin vedellä, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin jäljelle jäi keltaista kumimaista 5i -jodi-9-deoksi-6 £ ,9o6 -epoksi-prostaglandiini-F^-metyyliesteriä.

Liuos, joka sisälsi 5 £ -jodi-9-deoksi-65,9 oc-epoksi-prosta-glandiini-F^-metyyliesteriä (100 mg) metanolisessa natriummetoksi-dissa, valmistettu natriumista (46 mg) ja kuivasta metanolista (0,70 ml), pantiin syrjään kuivaan typpi-ilmakehään viideksi tunniksi, sitten liuotin poistettiin siitä tyhjössä. Jäljelle jäänyt amorfinen kiinteä aine pestiin bentseenillä, pantiin syrjään yöksi ilmassa ja sekoitettiin IN natriumhydroksidin vesiliuoksen kanssa (0,5 ml), jolloin saatiin värittömien hienojen neulasten suspensio. Kiteet kerättiin, pestiin muutamalla tipalla IN natriumhydroksidin vesiliuosta ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin 9-deoksi-6,9 .χ,-epoksi -Δ5 -prostaglandiini-F^-natriumsuola. Arakidonihapon aiheuttama ihmisen verihiutaleiden kerääntymisen estyminen väkevyydellä 0,2 ng/ml tämän suolan avulla ja sen epästabiilisuus vedessä happamessa pH:ssa, yhdessä muun todistusaineiston kanssa, on yhteensopivaa konfiguraation (5Z)-5,6-didehydro-9-deoksi-6,9^C -epoksi-prostaglandiini-F^ kanssa.

Il 13 11 68359

Suuren erotuskyvyn C NMR-spektri kiteiden liuokselle dimetyylisulfoksidi-dg:ssa osoitti odotetut 20 resonanssia, joiden kemialliset siirtymät olivat täysin yhtäpitävät prostasykliinille varmistetun kemiallisen rakenteen kanssa. Mitään epäpuhtauspiik-kejä ei havaittu.

B. 5i -jodi-9-deoksi-6£ ,9o6 -epoksiprostaglandiini-F. -metyyliesteriä (500 ml) sekoitettiin metanolisen NaOMe:n kanssa, joka oli valmistettu Naista (0,23 g, 10 ekvivalenttia) ja MeOHrsta (3,5 ml), ^-ilmakehässä huoneen lämpötilassa yön ajan; IN NaOH-vesiliuosta (2,5 ml) lisättiin keltaiseen reaktioliuokseen aiheuttamaan esteriryhmän hydrolyysi, ja kahden tunnin kuluttua metanoli haihdutettiin tyhjössä huoneen lämpötilassa. Jäljelle jäänyt vesi-liuos muodosti itsestään haluttua natriumsuolaa olevia värittömiä neulasia, jotka jäähdytettiin (0°C), otettiin talteen, pestiin säästeliäästi IN NaOH-vesiliuoksella, ilmakuivattiin ja varastoitiin tulpitussa putkessa; tämän suolan (383 mg) y max (KBr-tablet- -1 ' ' 13 ti oli 1692 cm (0-C=C ja todettiin vain 20 C resonanssia kohdilla 182,7 (C-l) , 1582 (C-6) , 140,0 ja 134,3 (C-13, 14), 100,7 (C-5), 87,5 (C-15), 80,6 ja 75,5 (C-9, 11),58,0 (C-12),49,0, 45,8, 42,4, 41,9, 37,5, 35,8 (C-18), 31,6, 29,9, 29,3, 26,7 (C-19), 18,4 (C-20) ppm TMS:sta DMSO-D^tssa. Tuote oli natrium(5Z)-5,6-didehydro-9-deoksi-6,9 oc-epoksi-prostaglandiini-F·^. (syn. natrium-prostasykliini).

C. 5 £-jodi-9-deoksi-6£ ,9ού -epoksiprostaglandiini-F^y metyyliesteriä käsiteltiin 1,5-diatsabisyklo-5-noneenilla (DBN) huoneen lämpötilassa ilman liuotinta muutaman tunnin ajan.

DBN ja jodivety poistettiin absorboimalla SiOypylvääseen, joka oli valmistettu SiC^-suspensiosta EtOAc/Et^Nissa 50:1, ja vinyylieetteri eluoitiin samalla liuotinsysteemillä. IR-spektro- _ _1 ' 1 skopia /ohut kalvo, y" max 1738 (C0~Me) ja 1696 cm (=0-C=C)_/, 1 — Δ ' H NMR C,D,-Et-N:ssä 19:1 /i 4,22, tripletti tripleteistä, J6,9 ja 1,0 Hz (C-5 vinyyliprotoni)_7, ja NMR CgDg-Et^N: ssä, 19:1 /erottuvat piirteet olivat resonanssit kohdilla 159,8 (C-l), 155,8 (C-l), 155,8 (C-6), 137,2 ja 130,6 (C-13, 14), 95,3 (C-5), 84,1 (C-15), 77,3 ja 72,2 (C-9, 11) ja 51,1 (Me-esteri) ppm TMS:stä/.

12 68359

Vinyylieetteri(5Z)-5,6-didehydro-9-deoksi-6,9x-epoksipros-taglandiinimetyyliesteri hydrolysoitiin natriumhydroksidin vesi-liuoksella, jolloin saatiin synteettistä natriumprostasykliiniä.

D. (5R,6R)-5-jodi-PG^-metyyliesteri (13,375 g, sisältäen noin 2 % 5S,6S-isomeeriä) otettiin metanoliseen natriummetoksidiin /valmistettu Na:sta (6,23 g) ja MeOH:sta (94 mlW huoneen lämpötilassa Na^-ilmakehässä ja pantiin syrjään huoneen lämpötilassa yöksi. Saatua keltaista liuosta käsiteltiin IN NaOH-vesiliuoksel-la (70 ml), sakka suodatettiin eroon, liuos pantiin syrjään huoneen lämpötilaan kahdeksi tunniksi ja MeOH poistettiin Buchi-haihdutti-messa tyhjössä huoneen lämpötilassa. Jäljelle jäänyttä siirappia käsiteltiin i^O:11a (25 ml) ja edelleen IN NaOH-vesiliuoksella (80 ml), jolloin kiteytyminen tapahtui itsestään tuottaen joukon vanuttuneita kiteitä. Kun oli jäähdytetty 0°C:seen, kiinteä aine kerättiin, pestiin jääkylmällä IN NaOH-vesiliuoksella (noin 40 ml), kunnes pesunesteet olivat värittömiä ja kuivattiin ilmassa (2 päivää) vakiopainoon, jolloin saatiin 10,15 g, sp. 164-166°C (100°C:ssa kuivauksen jälkeen) väritöntä prostasykliinin natriumsuolaa.