NO345996B1

NO345996B1 - A beta 1-42-spesifikke monoklonale antistoffer med terapeutiske egenskaper.

Info

Publication number: NO345996B1
Application number: NO20082134A
Authority: NO
Inventors: Ruth Greferath; David Hickman; Andreas Muhs; Andrea Pfeifer; Claude Nicolau
Original assignee: Ac Immune Sa
Priority date: 2005-12-12
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2021-12-13
Also published as: BRPI0619748A8; BRPI0619748B1; CL2011000010A1; JP2009519708A; KR101505201B1; SI2361638T1; HK1204579A1; EP2808032A1; PH12011502389A1; ES2454253T3; PT2361638E; US20100297132A1; EP1959996A2; HRP20140251T1; BRPI0619748A2; US7772375B2; MX2008007477A; KR101591223B1; JP2014039561A; PH12011502389B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter og blandinger for terapeutisk og diagnostisk anvendelse ved behandlingen av sykdommer og forstyrrelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloidlignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe av lidelser og abnormiteter assosiert med amyloid-protein, som f.eks. Alzheimers sykdom.

Amyloidose er ikke en enkelt sykdom, men snarere en variert gruppe av progressive sykdomsprosesser som kjennetegnes ved ekstracellulære vevsavleiringer av et voksaktig, stivelseslignende protein betegnet amyloid, som akkumuleres i ett eller flere organer eller kroppssystemer. Etter som amyloidavleiringene bygges opp begynner de å gripe inn i den normale funksjon av organet eller kroppssystemet. Det finnes minst 15 forskjellige typer amyloidose. Hovedformene er primær amyloidose uten kjent forløper, sekundær amyloidose som følge av annen tilstand, og arvelig amyloidose.

Sekundær amyloidose forekommer hos mennesker som har en kronisk infeksjon eller inflammatorisk sykdom, som f.eks. tuberkulose, en bakterieinfeksjon kalt familiær middelhavsfeber, beninfeksjoner (osteomyelitt), reumatoid artritt, tynntarmsinflammasjon (granulomatøs ileitt), Hodgkins sykdom og lepra.

Amyloidavleiringer inneholder typisk tre komponenter. Amyloidproteinfibriller som utgjør ca.90% av amyloidmaterialet, omfatter én av flere forskjellige typer proteiner. Disse proteinene er i stand til folding til såkalte ”beta-foldede” arkprofiler, en unik proteinkonfigurasjon som oppviser bindingsseter for Kongorødt som resulterer i amyloidproteinets unike fargende egenskaper. Dessuten er amyloidavleiringer nært forbundet med amyloid P (pentagonal) komponenten (AP), et glykoprotein relatert til normalt serumamyloid P (SAP) og med sulfaterte glykosaminglykaner (GAG), komplekse karbohydrater av bindevev.

Mange aldringssykdommer er basert på eller assosiert med, amyloidlignende proteiner og kjennetegnes til dels av oppbyggingen av ekstracellulære avleiringer av amyloid eller amyloid-lignende materiale som bidrar til patogenesen, så vel som progresjonen av sykdommen.

Disse sykdommene inkluderer, men er ikke begrenset til, neurologiske forstyrrelser så som Alzheimers sykdom (AD), inklusivt sykdommer eller tilstander som kjennetegnes av et tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset. Andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloidlignende proteiner er progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose, Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon.

Selv om patogenesen for disse sykdommene kan være forskjellig, inneholder deres karakteristiske avsetninger ofte mange felles molekylære bestanddeler. I betydelig grad kan dette tilskrives den lokale aktivering av proinflammatoriske veier som derved fører til den samtidige avleiring av aktiverte komplementkomponenter, akuttfase-reaktanter, immunmodulatorer og andre inflammatoriske mediatorer (McGeer et al., 1994).

Alzheimers sykdom (AD) er en neurologisk lidelse som primært antas å forårsakes av amyloide plakk, en akkumulering av unormal avleiring av proteiner i hjernen. Den mest hyppige type av amyloid som finnes i hjernen til angrepne individer, er sammensatt primært av Aβ fibriller. Vitenskapelige indikasjoner viser at en økning i produksjonen og akkumuleringen av beta-amyloidprotein i plakk, fører til nervecelledød, hvilket bidrar til utviklingen og progresjonen av AD. Tap av nerveceller i strategiske hjerneområder forårsaker deretter reduksjon i neurotransmittere og nedsatt hukommelse. De proteiner som hovedsakelig er ansvarlig for oppbyggingen av plakk, inkluderer amyloid forløperprotein (APP) og to preseniliner (presenilin I og presenilin II). Suksessiv spaltning av amyloid forløperproteinet (APP), som uttrykkes konstitutivt og kataboliseres i de fleste celler av enzymene β- og γ-sekretase fører til frigjøringen av et 39 til 43 aminosyrers Aβ-peptid. Nedbrytningen av APP øker sannsynligvis deres tilbøyelighet til aggregering i plakk. Det er spesielt Aβ(1-42) fragmentet som har en sterk tilbøyelighet av å bygge aggregater som følge av to meget hydrofobe aminosyrerester i dets C-ende. Fragmentet Aβ(1-42) antas derfor å være sterkt involvert og ansvarlig for initieringen av nevrittisk plakkdannelse i AD og til derfor å ha et høyt patologisk potensiale. Det er derfor behov for spesifikke antistoffer som kan målsøke og spre amyloid plakkdannelse.

Symptomene på AD manifesterer seg langsomt og det første symptom kan være kun svak glemsomhet. På dette trinn kan individer glemme nylige hendelser, aktiviteter, navn på kjente mennesker eller ting og være ute av stand til å løse enkle regneproblemer. Etter som sykdommen utvikles er symptomer lettere registrerbare og blir tilstrekkelig alvorlige til å få mennesker med AD eller deres familiemedlemmer til å søke medisinsk hjelp. Mellomtrinnsymptomer på AD omfatter forglemmelse av hvorledes enkle oppgaver, så som kroppspleie, foretas, og problemer med å snakke, forstå, lese eller skrive utvikles. AD-pasienter på senere stadier kan bli engstelige eller aggressive, kan forsvinne hjemmefra og til slutt trenge fullstendig pleie.

For tiden er den eneste avgjørende måte å diagnostisere AD å identifisere plakk og sammenfiltringer i hjernevev ved en obduksjon etter vedkommendes død. Leger kan derfor bare gi en diagnose av ”mulig” eller ”sannsynlig” AD, mens personen fremdeles er i live. Ved å benytte dagens metoder kan leger diagnostisere AD korrekt opptil 90% ved å benytte diverse hjelpemidler for å diagnostisere ”sannsynlig” AD. Legene stiller spørsmål angående personens generelle helsetilstand, senere medisinske problemer og opplysninger om eventuelle vanskeligheter personen har med å foreta daglige aktiviteter. Adferdstester av hukommelse, problemløsning, oppmerksomhet, telling og tale, gir informasjon om kognitiv degenerasjon, og medisinske tester så som tester av blod, urin eller spinalvæske, samt skanninger av hjernen, kan gi noe ytterligere informasjon.

Behandlingen av AD består i medikamentbaserte og ikke-medikamentbaserte behandlinger. Behandlinger rettet mot endring av den underliggende årsak til sykdommen (forsinkelse eller reversering av progresjonen) har hittil stort sett vært uten hell. Medisiner som gjenoppretter mangelen (defekt) eller feilfunksjonering i de kjemiske budbringere i nervecellene (neurotransmittere), særlig kolinesteraseinhibitorer (ChEI) som f.eks. tacrin og rivastigmin, har vist seg å forbedre symptomer. ChEI hindrer den enzymatiske nedbrytning av neurotransmittere og øker derved mengden av kjemiske budbringere som er tilgjengelige for overføring av nervesignaler i hjernen.

For enkelte personer i de tidlige og midlere stadier av sykdommen kan medikamentene tacrin (COGNEX<®>, Morris Plains, NJ), donepezil (ARICEPT<®>, Tokio, JP), rivastigmin (EXELON<®>, East Hanover, NJ) eller galantamin (REMINYL<®>, New Brunswick, NJ) bidra til å hindre at enkelte symptomer forverres i en begrenset tid. Et annet medikament memantin (NAMENDA<®>, New York, NY) har vært godkjent for behandling av moderat til alvorlig AD. Medikamenter er også tilgjengelige mot de psykiatriske manifestasjoner av AD. Noen medisiner kan også bidra til kontroll av adferdssymptomer ved AD, så som søvnløshet, agitasjon, problemer med å gå seg vill, angst og depresjon. Behandling av disse symptomene gjør pasienten ofte mer komfortabel og gjør behandlingen lettere for omsorgspersonalet. På tross av betydelige behandlingsfremskritt som viser at denne klasse av midler konsekvent er bedre enn placebo, fortsetter dessverre sykdomsutviklingen, og den gjennomsnittlige effekt på mental funksjon har bare vært moderat. Mange av medikamentene som benyttes ved AD-medisinering, som for eksempel ChEI, har også bivirkninger som inkluderer gastrointestinal dysfunksjon, levertoksisitet og vekttap.

Andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, akkumuleringen og avleiringen av amyloid-lignende protein er svak kognitiv svekkelse, Lewylegeme demens (LBD), amyotrofisk lateralsklerose (ALS), inklusjonslegeme myositt (IBM) og maculadegenerasjon, særlig aldersrelatert maculadegenerasjon (AMD).

Mild kognitiv svekkelse (MCI) er en generell betegnelse som oftest defineres som en hårfin, men målbar, hukommelsesforstyrrelse. En person med MCI opplever større hukommelsesproblemer enn hva som normalt forventes ved aldring, men oppviser ikke andre symptomer på demens, så som svekket vurderings- eller resonneringsevne. MCI er en tilstand som ofte gjenspeiler et preklinisk stadium av AD.

Avleiringen av β-amyloid i den entorinale korteks (EC) antas å spille en nøkkelrolle ved utviklingen av mild, kognitiv svekkelse (MCI) hos eldre. Dette er i tråd med den observasjon at CSF-A Aβ(1-42) nivåer avtar signifikant når AD blir klinisk åpenbar. I motsetning til CSF-Aβ(1-42) er CSF-tau-nivåer signifikant forhøyet i MCI-stadiet, og disse verdiene fortsetter deretter å være forhøyde, hvilket indikerer at økte nivåer av CSF-tau kan bidra til å påvise MCI-individer som kan forventes å utvikle AD.

Lewylegeme demens (LBD) er en neurodegenerativ lidelse som kan forekomme hos personer eldre enn 65 år og som i alminnelighet forårsaker symptomer på kognitiv (tenkning) svekkelse og abnorme adferdsendringer.

Symptomer kan inkludere kognitiv svekkelse, neurologiske tegn, søvnforstyrrelse og autonom dysfunksjon. Kognitiv svekkelse er det fremtredende trekk ved LBD i de fleste tilfeller. Pasienter har rekurrente episoder med forvirring som progressivt forverres. Svingingene i kognitiv evne assosieres ofte med skiftende grad av oppmerksomhet og årvåkenhet. Kognitiv svekkelse og tankeflukt kan variere innenfor minutter, timer eller dager.

Lewylegemer dannes fra fosforylerte og ufosforylerte neurofilamentproteiner. De inneholder det synaptiske protein alfa-synuklein så vel som ubikvitin som er involvert i elimineringen av skadede eller unormale proteiner. I tillegg til Lewylegemer kan det også foreligge Lewyneuritter, som er inklusjonslegemer i celleprosessene i nervecellene. Amyloide plakk kan dannes i hjernen til pasienter som lider av DLB, selv om de har tendens til å være færre i antall enn hva som ses hos pasienter med Alzheimers sykdom. Neurofibrillære sammenfiltringer, det andre mikropatologiske kjennemerke på AD, er ikke et hovedkarakteristikum ved DLB, men er ofte tilstede i tillegg til amyloide plakk.

Amyotrofisk lateralsklerose (ALS) kjennetegnes ved degenerering av øvre og nedre motoriske neuroner. Hos enkelte ALS-pasienter kan demens eller afasi forekomme (ALS-D). Denne demens er oftest en frontotemporal demens (FTD) og mange av disse tilfellene har ubikvitin-positive, tau-negative inklusjoner i neuroner i gyrus dentatus og overflatelag av de frontale og temporale lober.

Inklusjonslegeme myositt (IBM) er en forkrøplende sykdom som vanligvis finnes hos personer over 50 år, hvor muskelfibere utvikler inflammasjon og begynner å forsvinne, men hvor hjernen spares og pasientene beholder hele deres intellekt. To enzymer som er involvert i produksjonen av amyloid-β-protein ble funnet å være forhøyd inne i muskelcellene til pasienter med denne mest vanlige, progressive muskelsykdom hos eldre, hvor amyloid-β også er forhøyd.

En annen sykdom som er basert på eller assosiert med, akkumuleringen og avleiringen av amyloid-lignende protein er maculadegenerasjon.

Maculadegenerasjon er en vanlig øyesykdom som forårsaker ødeleggelse av macula, som er det midtre området av retina (det papirtynne vev på baksiden av øyet, hvor lysfølsomme celler sender visuelle signaler til hjernen). Skarpt, klart, ”rett frem” syn bearbeides av macula. Skade på macula resulterer i utviklingen av blinde flekker og sløret eller forvrengt syn. Aldersrelatert maculadegenerasjon (AMD) er en hovedårsak til synssvekkelse i USA, og for personer over 65 år er det den ledende årsak til legal blindhet blant hvite. Ca.1,8 millioner amerikanere fra 40 år og eldre har fremskreden AMD og ytterligere 7,3 millioner mennesker med intermediær AMD har betydelig risiko for synstap. Myndighetene anslår at det i 2020 vil være 2,9 millioner mennesker med fremskreden AMD. Offere for AMD blir ofte overrasket og frustrert over å finne hvor lite som er kjent om årsakene og behandlingen av denne blindende tilstand.

Det finnes to former av maculadegenerasjon: tørr maculadegenerasjon og våt maculadegenerasjon. Den tørre formen hvor maculacellene langsomt begynner å nedbrytes diagnostiseres i 85% av tilfellene av maculadegenerasjon. Begge øyne er vanligvis affisert av tørr AMD, selv om ett øye kan miste synet, mens det andre øye forblir uberørt. Druser, som er gule avleiringer under retina, er tidlige tegn på tørr AMD. Risikoen for å utvikle fremskreden tørr AMD eller våt AMD øker etter som antallet eller størrelsen av drusene øker. Tørr AMD kan fortsette å forårsake synstap uten å gå over i den våte form av sykdommen, og det er også mulig at tørr AMD på et tidlig stadium plutselig går over i den våte form.

Den våte form resulterer selv om den bare står for 15% av tilfellene, i 90% av blindheten og anses som fremskreden AMD (det finnes ikke noe tidlig eller midlere trinn av våt AMD). Våt AMD har alltid først vært i den tørre form av sykdommen. Etter som den tørre form forverres begynner enkelte å få unormal blodkarvekst bak macula. Disse karene er meget sprø og vil lekke væske og blod (derfor ”våt” maculadegenerasjon) som forårsaker hurtig skade på macula.

Den tørre form av AMD vil til å begynne med ofte forårsake svakt sløret syn. Særlig vil synsenteret bli sløret, og dette området blir større ettersom sykdommen utvikler seg. Det merkes ingen symptomer dersom bare ett øye er angrepet. Ved våt AMD kan rette linjer synes bølgede og tap av sentralsyn kan hurtig inntre.

Diagnosen maculadegenerasjon innebærer i alminnelighet en utvidet øyeundersøkelse, visuell skarpsyntest og en undersøkelse av baksiden av øyet ved å benytte en prosedyre som kalles fundoskopi for å hjelpe til å diagnostisere AMD, og dersom det er mistanke om AMD, kan fluorescein-angiografi også foretas.

Dersom tørr AMD når det fremskredne stadiet finnes for tiden ingen behandling som forhindrer tap av synet. En bestemt høydoseformulering av antioksydanter og sink kan imidlertid forsinke eller forhindre intermediær AMD fra å utvikle seg til det fremskredne stadium. Macugen<® >(pegaptanib-natriuminjeksjon), laserfotokoagulering og fotodynamisk terapi kan kontrollere den abnorme blodkarvekst og blødning i macula, som er til hjelp for enkelte som har våt AMD. Syn som allerede er tapt vil imidlertid ikke bli gjenopprettet gjennom disse teknikker.

Dersom syn allerede er tapt eksisterer hjelpemidler mot svakt syn som kan bidra til å forbedre livskvaliteten.

Et av de tidligste tegn på aldersrelatert maculadegenerasjon (AMD) er akkumuleringen av ekstracellulære avleiringer kjent som druser, mellom den basale lamina av det retinale pigmenterte epitel (RPE) og Bruch’s membran (BM). Nylige studier foretatt av Anderson et al. har bekreftet at drusen inneholder amyloid-beta. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243-256).

Pågående forskning viderefører studier som undersøker miljømessige, genetiske og diettfaktorer som kan bidra til AMD. Nye behandlingsstrategier utforskes også, herunder retinacelletransplantater, medikamenter som vil forhindre eller forsinke utviklingen av sykdommen, strålebehandling, genterapier, en datachip-implantert i retina som bidrar til å stimulere syn, samt midler som vil forhindre veksten av nye blodkar under macula.

En viktig faktor å ta i betraktning når nye medikamenter utvikles, er lett anvendbarhet for pasientene. Peroral medikamentadministrering, nærmere bestemt tabletter, kapsler og softgel, står for 70% av alle doseringsformer som inntas på grunn av bekvemmelighet for pasienten. Medikamentutviklere er enige om at pasienter foretrekker peroral administrering frem for å utsette seg selv for injeksjoner eller andre mer invasive former av medikamentadministrering.

Formuleringer som resulterer i sjelden dosering (dvs.1 gang per dag eller forsinket frigjøring) er også å foretrekke. Lettheten ved administrering av antibiotika i perorale doseringsformer resulterer i en økning av pasientetterlevelse under behandling.

Det som trengs er effektive metoder og blandinger for utvikling av sterkt spesifikke og høyt effektive antistoffer, som er en forutsetning dersom antistoffer skal fremskaffes i en peroral doseringsform. Fortrinnsvis vil slike antistoffer gjenkjenne spesifikke epitoper på forskjellige antigener, så som amyloidprotein.

Det som også trengs er derfor effektive blandinger og fremgangsmåter for å møte de komplikasjoner som er forbundet med sykdommer og forstyrrelser som forårsakes av, eller assosieres med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og forstyrrelser assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose, inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser så som Alzheimers sykdom (AD), inklusivt sykdommer eller tilstander som kjennetegnes av et tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset så vel som andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose;

Creutzfeld Jacobs sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon. Det som spesielt trengs er spesialiserte og høyt effektive antistoffer som kan motvirke de fysiologiske manifestasjoner av sykdommen, så som dannelsen av plakk assosiert med aggregasjon av fibere av amyloidet eller amyloid-lignende peptid.

Anti-amyloide antistoffer utløst ved inokuleringen av Aβ1-42 blandet med Freunds komplette eller ukomplette adjuvans har vist seg i stand til å redusere amyloidbelastningen i transgene mus for human Alzheimers sykdom (Schenk et al., 1999).

Intraperitoneal inokulering av tetrapalmitoylert Aβ1-16 rekonstituert i liposomer, til NORBA transgene mus, utløste betydelige titere av anti-amyloide antistoffer, som også viste seg i stand til å solubilisere amyloidfibere og plakk in vitro og in vivo. (Nicolau et al., 2002).

US 2003/108551 A1 (Nicolau et al.) beskriver monoklonale antistoffer fremstilt mot palmitoylerte Aβ1-42-aggregater, nevnte antistoffer solubliserer Aβ1-42-fibre som bestemt ved Th-T-test. Det beskrives også hybridomaer som produserer nevnte antistoffer. Nicolau et al. beskriver også anvendelsen av nevnte antistoffer for behandlingen av amyloid-assosiert sykdom slik som Alzheimers sykdom.

WO 0118169 A2 (Ramot University Authority for Applied Research & Industrial Development Ltd.) beskriver en fremgangsmåte for immunisering mot plakkdannende sykdommer ved anvendelse av displayteknologi.

EP 1741783 A1 (Juridicial Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute) beskriver et humant anti-amyloid<2>-peptid (heretter beskrevet som “A<2>”) og et fragment derav omfattende en variabel region av et humanavledet anti-A<2>-antistoff og som binder A<2 >og inhiberer aggregering av A<2>-molekyler.

En mulig mekanisme for hvorledes oppløsningen av amyloide plakk og fibere foregikk ble foreslått av Bard et al., (2000), som fremførte den konklusjon, basert på deres data, at antistoffene opsoniserte plakkene, som senere ble ødelagt av makrofagene i mikroglia. De Mattos et al., (2001) antydet at et Mab rettet mot det sentrale domene av β-amyloid var i stand til å binde og fullstendig sekvestrere plasma-amyloid. De hevdet at nærværet at disse mAb i kretsløpet forskjøv likevekten av Aβ mellom hjerne og plasma i favør av den perifere utskilling og katabolisme i stedet for avleiring inne i hjernen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye fremgangsmåter og blandinger som omfatter høyt spesifikke og høyt effektive antistoffer som har evne til spesifikt å gjenkjenne og binde til spesifikke epitoper, fra et utvalg av β-amyloide antigener. De antistoffer som muliggjøres gjennom foreliggende oppfinnelse, er særlig egnet til behandling av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller assosieres med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe sykdommer og lidelser som er assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose, inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser så som Alzheimers sykdom (AD), herunder sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved et tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebra hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset, så vel som andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner, så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld-Jacob sykdom, arvelig cerebral hemoragi med amylidose, Dutch type, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inkusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon for bare å nevne noen få.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten nye fremgangsmåter og blandinger for å beholde eller øke den kognitive hukommelseskapasitet i et pattedyr som oppviser en amyloid assosiert sykdom eller tilstand, og som omfatter administrering til et dyr, særlig et pattedyr, nærmere bestemt et menneske som har behov for slik behandling, en terapeutisk effektiv mengde av et monoklonalt antistoff i henhold til oppfinnelsen. Det beskrives også heri nye fremgangsmåter for å beholde eller øke den kognitive hukommelseskapasitet i et pattedyr som oppviser en amyloid assosiert sykdom eller tilstand, og som omfatter administrering til et dyr, særlig et pattedyr, nærmere bestemt et menneske som har behov for slik behandling, en terapeutisk effektiv mengde av et monoklonalt antistoff som beskrevet heri.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURER OG SEKVENSER

Figur 1: Peptider avledet fra Aβ-sekvensene 1-15, 1-16 og 1-16(∆14), 22-35 og 29-40

Figur 2: Binding av mACI-01-Ab7 C2 monoklonalt antistoff til amyloider ved western blott og dot blot

Figur 3: Binding av mACI-01-Ab7 C2 monoklonalt antistoff til amyloidfibere vist ved transmisjons-elektronmikroskopi

Figur 4: Resultater av hode-mot-hode forsøk mellom Th-T fluorescensanalyse og fastfase NMR av U-<13>C Tyr10- og Val12-merket β-amyloid 1-42 peptid

SEKV.ID.NR:1: Antigent peptid Aβ1-15

SEKV.ID.NR:2: Antigent peptid Aβ1-16

SEKV.ID.NR:3 Antigent peptid Aβ1-16(∆14)

SEKV.ID.NR:4 Antigent peptid Aβ22-35

SEKV.ID.NR:5: Antigent peptid Aβ29-40

SEKV.ID.NR:6: Antigent peptid Aβ1-17

SEKV.ID.NR:7: Aminosyresekvens av mus C2 lett kjede variabel region SEKV.ID.NR:8: Aminosyresekvens av mus C2 tung kjede variabel region SEKV.ID.NR:9: Nukleotidsekvens av mus C2 lett kjede variabel region SEKV.ID.NR:10: Nukleotidsekvens av mus C2 lett kjede variabel region inklusivt signalsekvenser

SEKV.ID.NR:11: Nukleotidsekvens av mus C2 tung kjede variabel region SEKV.ID.NR:12: Nukleotidsekvens av mus C2 tung kjede variabel region inklusivt signalsekvenser

SEKV.ID.NR:13-20: Aminosyresekvensvarianter av epitopregion på Aβ-peptidet SEKV.ID.NR:21: Aminosyresekvens av mus C2 lett kjede

SEKV.ID.NR:22: Aminosyresekvens av mus C2 tung kjede

Foreliggende oppfinnelse gjør bruk av antigenpresentasjoner som resulterer i en forbedret eksponering og stabilisering av en foretrukket antigenkonformasjon, som til slutt resulterer i antistoffer med unike egenskaper.

Foreliggende oppfinnelses omhandler et antistoff eller funksjonell del derav, som er i stand til å gjenkjenne og binde en spesifikk epitop av amyloid beta, hvor nevnte antistoff eller funksjonelle del derav omfatter et epitopbindende fragment av et monoklonalt antistoff oppnådd fra hybridomcellelinjen FP 12H3 C2, deponert 1. desember, 2005 som DSM ACC2750.

Spesielt er nevnte monoklonale antistoff eller funksjonelle del derav produsert av hybridomcellelinjen FP 12H3 C2, deponert 1. desember, 2005 som DSM ACC2750.

I et spesifikt aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er antstoffet ifølge oppfinnelen eller funksjonelle deler derav et monoklonalt antistoff, eller et kimært antistoff.

Spesielt omfatter hvilket antistoff eller funksjonelle del derav de komplementærbestemmende regionene (CDR-er) til et monoklonalt antistoff oppnådd fra hybridomcellelinje FP 12H3-C2, deponert 1. desember, 2005 som DSM ACC2750.

Foreliggende oppfinnelses videre omhandler et polynukleotid omfattende en nukleotidsekvens som koder for et antistoff eller funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen.

Også omfattet av den foreliggende oppfinnelse er en cellelinje, spesielt en hybridomcellelinje, som produserer et antistoff eller funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen.

I et spesifikt aspekt av foreliggende oppfinnelse er nevnte cellelinje hybridomcellelinje FP 12H3 C2, deponert 1. desember, 2005, som DSM

ACC2750.

Også tilveiebragt av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff eller funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen, omfattende å dyrke cellelinjen, spesielt hybridomcellelinjen FP 12H3 C2, deponert 1. desember, 2005, som DSM ACC2750.

I et spesifikt aspekt av foreliggende oppfinnelse er et antistoff eller funksjonell del derav tilveiebragt ifølge oppfinnelsen og fremstilt av nevnte fremgangsmåte.

En utforelsesform av oppfinnelsen omhandler en sammensetning omfattende antistoffet eller funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen, og eventuelt ytterligere omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer.

I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er sammensetninen tilveiebragtfor anvendelse ved behandlingen av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med amyloid eller amyloid-lignende proteiner inklusivt amyloidose.

Spesielt er sammensetningen ifølge oppfinnelsen for anvendelse til:

(a) å redusere plakkbelastningen eller å redusere mengden plakk i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand; eller

(b) å redusere mengden plakk i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand; eller (c) å minske den totale mengde løselig Aβ i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand; eller

(d) forebyggelse, behandling eller lindring av virkningen av amyloidose, inklusivt, men ikke begrenset til:

(i) nevrologiske forstyrrelser så som Alzheimers sykdom (AD); (ii) sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet, som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type), og Guam Parkinson demenskomplekset; og

(iii) progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose, Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes, senil kardial amyloidose, endokrine tumorer, og maculadegenerasjon; eller

(e) oppretthold eller økning av kognitiv hukommelseskapasitet i et pattedyr som oppviser en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand.

Foreliggende oppfinnelse videre omhandler en blanding omfattende et antistoff eller funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen og, eventuelt, et ytterligere biologisk virkestoff benyttet ved medisineringen av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med amyloid eller amyloid-lignende proteiner og/eller en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I en annen utførelsesform an foreliggende oppfinnelse er anvendelse av et monoklonalt antistoff og/eller en funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen eller en sammensetning eller en blanding ifølge oppfinnvelsen tilveiebragt for fremstillingen av et medikament til behandling eller lindring av virkningen av amyloidose inklusivt men ikke begrenset til:

(a) nevrologiske forstyrrelser så som Alzheimers sykdom (AD);

(b) sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet, som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type), og Guam Parkinson demenskomplekset; og

(c) progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose, Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateral-sklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose, endokrine tumorer, og maculadegenerasjon.

Foreliggende oppfinnelse videre omhandler en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff eller en funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen, eller en sammensetning eller en blanding ifølge oppfinnelsen for anvendelse til behandling eller lindring av virkningen av amyloidose inklusivt, men ikke begrenset til:

(a) nevrologiske forstyrrelser så som Alzheimers sykdom (AD);

(c) progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose, Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateral-sklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes, senil kardial amyloidose, endokrine tumorer, og maculadegenerasjon.

I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for diagnostisering av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand hos en pasient omfattende påvisning av den immunspesifikke binding av et monoklonalt antistoff eller et aktivt fragment derav til en epitop av amyloidproteinet i en prøve som omfatter trinnene:

(a) bringe prøven som mistenkes for å inneholde amyloidantigenet i kontakt med et antistoff eller funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen, hvilket antistoff eller funksjonell del derav binder en epitop av amyloidproteinet;

(b) la antistoffet eller funksjonelle delen derav bindes til amyloidantigenet for å danne et immunologisk kompleks;

(c) påvise dannelsen av det immunologiske komplekset; og

(d) korrelere nærvær eller fravær av det immunologiske komplekset med nærvær eller fravær av amyloidantigen i prøven.

Foreliggende oppfinnelse videre tilveiebringer en fremgangsmåte for diagnostisering av en predisposisjon for en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand i en pasient omfattende påvisning av den immunspesifikke binding av et monoklonalt antistoff eller et aktivt fragment derav til en epitop av amyloidproteinet i en prøve som omfatter trinnene:

(a) bringe prøven som mistenkes for å inneholde amyloidantigenet i kontakt med et antistoff eller funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen, hvilket antistoff eller funksjonelle del derav binder en epitop av amyloidproteinet;

(c) påvise dannelsen av det immunologiske komplekset; og

(d) korrelere nærvær eller fravær av det immunologiske komplekset med nærvær eller fravær av amyloidantigen i prøven; og

(e) sammenligne mengden av nevnte immunologiske kompleks med en normal kontrollverdi,

hvor en økning i mengden av nevnte aggregat sammenlignet med en normal kontrollverdi indikerer at nevnte pasient er under risiko for utvikling av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand.

I et spesifikt aspekt omhandler foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for monitorering av minimalt gjenværende sykdom i en pasient etter behandling med et antistoff eller funksjonell del derav eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter:

(c) påvise dannelsen av det immunologiske komplekset; og

hvor en økning i mengden av nevnte aggregat sammenlignet med en normal kontrollverdi indikerer at nevnte pasient fremdeles lider av en minimalt gjenværende sykdom.

I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for å forutsi responsen til en pasient som behandles med et antistoff eller funksjonell del derav eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen tilveiebragt omfattende:

(c) påvise dannelsen av det immunologiske komplekset; og

(d) korrelere nærvær eller fravær av det immunologiske komplekset med nærvær eller fravær av amyloidantigen i prøven;

(e) sammenligne mengden av nevnte immunologiske kompleks før og etter påbegynt behandling,

hvor en minskning i mengden av nevnte aggregat indikerer at nevnte pasient har høyt potensiale for respons på behandlingen.

I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et testsett for påvisning og diagnose av amyloid-assosierte sykdommer og tilstander tilveiebragt omfattende et antistoff eller funksjonell del derav ifølge oppfinnelsen.

I et aspekt beskrives et antistoff som inkluderer et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, eller nærmere bestemt, et monoklonalt antistoff som inkluderer et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som er utviklet mot en supramolekylær antigenkonstruksjon omfattende et antigenpeptid som tilsvarer aminosyresekvensen av β-amyloidpeptidet, særlig av β-amyloidpeptid Aβ1-15, Aβ1-16 og Aβ1-

16(∆14), modifisert med en hydrofob del, som for eksempel palmitinsyre eller en hydrofil del, som for eksempel polyetylenglykol (PEG) eller en kombinasjon av begge, hvor nevnte hydrofobe og hydrofile del er kovalent bundet til hver av endene av det antigene peptid gjennom minst én, særlig én eller to aminosyrer som for eksempel lysin, glutaminsyre og cystein eller enhver annen aminosyre eller aminosyreanalog som kan tjene som en forbindelse for kobling av den hydrofobe og hydrofile del til peptidfragmentet. Når PEG benyttes som den hydrofile del er de frie PEG-endene kovalent bundet til fosfatidyletanolamin eller en annen forbindelse egnet til å virke som det forankrende element, for eksempel for å innleire den antigene konstruksjon i et liposoms dobbeltlag.

Videre fremlagt heri er et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som gjenkjenner den native konformasjon av amyloid ved at det spesifikt binder til amyloide oligomerer og fibere, men ikke til lineariserte amyloider.

I et aspekt tilveiebringes et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som beskrevet ovenfor, hvor antistoffet eller fragmentet binder til en Aβ-monomer med en bindingsaffinitet på minst ca.1 x 10<-6 >til minst ca.1 x 10<-8>, særlig minst ca.1 x 10<-6 >til minst ca.1 x 10<-7>, mer spesielt minst ca.1 x 10<-7 >til minst ca.1 x 10<-8>, enda mer spesielt minst ca.1 x 10<-7 >til ca.4 x 10<-7>, men som fortrinnsvis ikke oppviser noen vesentlig kryssreaktivitet med amyloid forløperprotein (APP).

I et annet aspekt beskrives et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som beskrevet ovenfor, hvor antistoffet eller fragmentet binder til en Aβ-fiber, fibrill eller filament med en bindingsaffinitet på minst ca.1 x 10<-7 >til minst ca.1 x 10<-9>, særlig minst ca.1 x 10<-7 >til minst ca.1 x 10<-8>, mer spesielt minst ca.1 x 10<-8 >til minst ca.1 x 10<-9>, enda mer spesielt minst ca.1 x 10<-8 >til minst ca.5 x 10<-8>, men som fortrinnsvis ikke oppviser noen vesentlig kryssreaktivitet med amyloid forløperprotein (APP).

I et annet aspekt oppviser antistoffet, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som ovenfor beskrevet, en bindingsaffinitet til en Aβ-fiber, fibrill eller filament som er minst 5 ganger, særlig minst 10 ganger, mer spesielt minst 15 ganger, høyere enn bindingsaffiniteten til en Aβ-monomer.

Antistoffene som beskrevet heri er i stand til å inhibere, in vitro og in vivo, aggregasjonen av amyloidogene, monomere peptider, nærmere bestemt βamyloid monomere peptider som, for eksempel, Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, til høymolekylære polymere amyloid-fibriller eller filamenter.

I et spesifikt aspekt inhiberer et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle eller deler derav, hvor antistoffet etter inkubering med amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, inhiberer aggregasjonen av Aβ-monomerer til høymolekylære polymere fibriller.

I et ytterligere aspekt beskrives et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering, særlig etter ko-inkubering i et molart konsentrasjonsforhold på opptil 1:100, mer spesielt i et molart konsentrasjonsforhold på mellom 1:30 og 1:100, men spesielt i et molart konsentrasjonsforhold på 1:100, med amyloide monomere peptider, særlig βamyloide monomere peptider, som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, inhiberer aggregasjonen av Aβ-monomerer til høymolekylære polymere fibriller. Særlig utgjør nevnte inhibering minst 50%, særlig minst 65%, mer spesielt minst 75%, enda mer spesielt minst 80%, men helt spesielt minst 85-90% eller mer sammenlignet med de respektive amyloidpeptid-monomerene inkubert i buffer (kontroll).

Særlig foretas ko-inkuberingen av antistoff som beskrevet heri med amyloide monomere peptider i 24 timer til 60 timer, særlig i 30 timer til 50 timer, mer spesielt i 48 timer ved en temperatur på mellom 28°C og 40°C, særlig mellom 32°C og 38°C, mer spesielt ved 37°C.

Videre beskrevet heri er et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt et funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering i 48 timer ved 37°C et molart konsentrasjonsforhold på 1:100 med et amyloid monomert peptid, nærmere bestemt et β-amyloid monomert peptid som for eksempel Aβ-monomert peptid 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt et Aβ1-42 monomert peptid, kan inhibere aggregeringen av amyloid monomerene, særlig aggregeringen av β-amyloid monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt av det Aβ1-42 monomere peptid, til høymolekylære polymere fibriller eller filamenter med minst 85%, særlig med minst 89%, og mer spesielt med minst 95% sammenlignet med de respektive amyloidpeptid monomerer inkubert i buffer (kontroll).

I et spesifikt aspekt beskrives et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som oppviser høy spesifisitet for Aβ-1-42 monomere peptider, men oppviser i det vesentlige ingen eller bare mindre kryssreaktivitet overfor Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40 og/eller Aβ1-41 monomere peptider, særlig et antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet er opptil 100 ganger, særlig 50 til 100 ganger, mer spesielt 80 til 100 ganger, men helt spesielt 100 ganger mer følsomt for amyloidpeptid Aβ1-42 sammenlignet med Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41 og opp til 1000 ganger, særlig 500 til 1000 ganger, mer spesielt 800 til 1000 ganger, men helt spesielt 1000 ganger mer følsomt for amyloidpeptid Aβ1-42 sammenlignet med Aβ1-38, og således i stand til å inhibere in vitro og in vivo, aggregeringen av amyloidogene monomere peptider, men spesielt av amyloidpeptid Aβ1-42.

I et annet spesifikt aspekt har et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, en høy bindingssensitivitet overfor amyloidpeptid Aβ1-42 og er i stand til å påvise Aβ1-42 fibere i en konsentrasjon ned til minst 0,001 µg, men særlig i et konsentrasjonsområde på mellom 0,5 µg og 0,001 µg, mer spesielt mellom 0,1 µg og 0,001 µg, men helt spesielt i en konsentrasjon på 0,001 µg.

I et meget spesifikt aspekt bveskrives et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet er i stand til å påvise Aβ1-42 fibere ned til en minimal konsentrasjon på 0,001 µg og Aβ1-40 fibere ned til en minimal konsentrasjon på 0,1 µg og Aβ1-38 fibere ned til en minimal konsentrasjon på 1 µg fibermengder.

Binding av antistoffene som ovenfor beskrevet, til amyloidogene monomere peptider, men særlig til amyloidformen (1-42) fører til inhibering av aggregasjonen av monomere amyloidogene peptider til høymolekylære fibriller eller filamenter. Gjennom inhiberingen av aggregasjonen av amyloidogene monomere peptider er antistoffene som beskrevet heri i stand til å forhindre eller hemme dannelsen av amyloide plakk, særlig den amyloide form (1-42) som er kjent for å bli uløselig ved endring av sekundær konformasjon og for å være den vesentlige del av amyloide plakk i hjernen til plagede dyr eller mennesker.

Det aggregasjonsinhiberende potensiale til antistoffet som beskrevet heri kan bestemmes etter en hvilken som helst egnet kjent metode, særlig ved tetthetsgradient-ultrasentrifugering etterfulgt av en SDS-PAGE sedimenteringsanalyse på en preformet gradient og/eller ved en tioflavin T (Th-T) fluorescensanalyse.

Videre beskrevet er antistoffer som etter ko-inkubering med preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter dannet ved aggregasjonen av amyloide monomere peptider, nærmere bestemt β-amyloide monomere peptider, som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 142 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, er i stand til å desaggregere nevnte høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter.

I et annet aspekt beskrives et antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering i et molart konsentrasjonsforhold på opptil 1:100, mer spesielt i et molart konsentrasjonsområde på mellom 1:30 og 1:100, men helt spesielt et molart konsentrasjonsområde på 1:100, med preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter dannet ved aggregasjonen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, er i stand til å desaggregere de preformede polymere fibriller eller filamenter med minst 35%, særlig minst 40%, spesielt minst 50%, enda mer spesielt minst 60%, men helt spesielt med minst 70% eller mer.

Særlig ko-inkuberes antistoffet som beskrevet heri med amyloide preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter i 12 timer til 36 timer, særlig i 18 timer til 30 timer, mer spesielt i 24 timer ved en temperatur på mellom 28°C og 40°C, særlig mellom 32°C og 38°C, mer spesielt ved 37°C.

I et spesifikt aspekt beskrives et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering i 24 timer ved 37°C i et molart konsentrasjonsforhold på 1:100 med preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter dannet ved aggregasjonen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, er i stand til å desaggregere nevnte preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter med minst 35%, særlig med minst 40%, mer spesielt minst 50%, enda mer spesielt med minst 60%, men helt spesielt med minst 70% eller mer sammenlignet med de respektive preformede amyloide polymere fibriller eller filamenter inkubert med en kontrollbærer (amyloid alene) (kontroll).

Desaggregeringspotensialet av antistoffet som beskrevet heri kan bestemmes etter en hvilken som helst egnet kjent metode, særlig ved tetthetsgradient-ultrasentrifugering etterfulgt av en SDS-PAGE sedimenteringsanalyse på en preformet gradient og/eller ved en tioflavin T (Th-T) fluorescensanalyse.

Videre beskrevet er antistoffer eller funksjonelle deler derav som er konformasjonelt sensitive.

I et aspekt beskrives et antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering med preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter dannet ved aggregasjonen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, er i stand til å indusere en overgang av β-platekonformasjonen mot en α-heliks og/eller en random coil konformasjon, men særlig en random coil konformasjon og særlig en random coil konformasjon på et gitt sted i molekylet, spesielt i omgivelsene av Val12 av Aβ-proteinet, som fører til en økning av random coil konformasjonen på bekostning av β-plate-konformasjonen, og en forbedret solubilisering av de preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter. Særlig utgjør minskningen av β-plate-konformasjonen minst 30%, særlig minst 35% og mer spesielt minst 40% og mer sammenlignet med de respektive preformede amyloide polymere fibrillene eller filamenter inkubert i buffer (kontroll).

Særlig ko-inkuberes antistoffet som beskrevet heri med amyloide preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter i 12 timer til 36 timer, særlig 18 til 30 timer, mer spesielt 24 timer ved en temperatur på mellom 28°C og 40°C, særlig mellom 32°C og 38°C, mer spesielt ved 37°C.

Særlig beskrives et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering i 24 timer ved 37°C i et molart konsentrasjonsforhold på 1:100, med preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter dannet ved aggregasjonen av amyloide monomere peptider, særlig βamyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, er i stand til å indusere en overgang av β-plate-konformasjonen til en α-heliks og/eller en random coil konformasjon, men særlig en random coil konformasjon, enda mer spesielt en random coil konformasjon på et gitt sted i molekylet, spesielt i omgivelsene til Val12 av Aβ-proteinet, som fører til en økning av random coil konformasjonen på bekostning av β-plate-konformasjonen, hvor sistnevnte reduseres med minst 30%, særlig med minst 35% og mer spesielt med minst 40% og mer sammenlignet med de respektive preformede amyloide polymere fibrillene eller filamentene inkubert i buffer. (kontroll).

Antistoffets evne til å indusere en konformasjonell overgang kan bestemmes etter en hvilken som helst egnet kjent metode, særlig ved fastfase 13C NMR spektroskopi, men særlig ved å måle de integrale intensiteter av konformasjonene av Val 12 Cβ i Aβ-peptidet, særlig Aβ-peptidene 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt i det Aβ1-42 monomere peptid.

Gjennom desaggregeringen av amyloidogene polymere fibriller eller filamenter er antistoffene som beskrevet heri i stand til å forhindre eller forsinke dannelsen av amyloide plakk, hvilket fører til en lindring av de symptomer som er assosiert med sykdommen og en forsinkelse eller reversering av dens utvikling.

Ytterligere beskrevet heri er et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som beskrevet ovenfor, hvor antistoffet er i stand til å minske den totale mengde av Aβ i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en sykdom eller tilstand som fører til økt konsentrasjon av Aβ i hjernen.

I et annet aspekt beskrives et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som beskrevet ovenfor, hvor antistoffet er i stand til å bryte opp plakk, hvorved plakkbelastningen i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en sykdom eller tilstand som fører til økt plakkbelastning i hjernen, minskes. Antistoffet som beskrevet heri inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, minsker plakkbelastningen i hjernen med minst 20%, særlig med minst 25%, mer spesielt med minst 30% og helt spesielt endog mer enn 30%.

I nok et annet aspekt beskrives et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som beskrevet ovenfor, hvor antistoffet er i stand til å solubilisere plakk, hvilket fører til en reduksjon av mengden plakk i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en sykdom eller tilstand som fører til en økt plakkbelastning i hjernen. Nevnte antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, reduserer mengden plakk i hjernen med minst 10%, særlig med minst 15%, mer spesielt med minst 20%.

Det er underforstått at antistoffet som beskrevet heri kan oppvise én, to eller flere av de spesifikke egenskapene som ovenfor er beskrevet, i forskjellige kombinasjoner.

I et aspekt beskrives for eksempel antistoffer, men spesielt monoklonale antistoffer, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav er beskrevet, hvor antistoffene er bifunksjonelle ved at de oppviser både en aggregasjonsinhiberende egenskap så vel som en desaggregasjonsegenskap, som ovenfor definert, særlig forbundet med en høy grad av konformasjonssensitivitet.

I nok et annet aspekt beskrives et bifunksjonelt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, men spesielt et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering med amyloide monomere peptider, særlig β-amyloid monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, inhiberer aggregasjonen av Aβ-monomerene til høymolekylære polymere fibriller eller filamenter, og som dessuten etter koinkubering med preformede høymolekylære polymere amyloide fibriller eller filamenter dannet ved aggregasjonen av amyloide monomere peptider, særlig βamyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, er i stand til å desaggregere de preformede polymere fibrillene eller filamentene.

I et spesifikt aspekt skjer ko-inkuberingen av det bifunksjonelle antistoff som beskrevet heri, men spesielt det bifunksjonelle monoklonale antistoff som beskrevet heri med henholdsvis amyloide monomere peptider og preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter, ved et molart konsentrasjonsforhold på opptil 1:100, særlig et forhold på mellom 1:30 og 1:100 og mer spesielt med et forhold på 1:100.

Særlig foretas ko-inkuberingen av antistoffet som beskrevet heri med amyloide monomere peptider i 24 timer til 60 timer, særlig 30 timer til 50 timer, mer spesielt 48 timer, ved en temperatur på mellom 28°C og 40°C, særlig mellom 32°C og 38°C, mer spesielt ved 37°C, mens ko-inkuberingen med amyloide preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter foretas i 12 timer til 36 timer, særlig i 18 til 30 timer, mer spesielt i 24 timer ved en temperatur på mellom 28°C og 40°C, særlig mellom 32°C og 38°C, mer spesielt ved 37°C.

I nok et annet spesifikt aspekt er det bifunksjonelle antistoff som beskrevet heri, særlig det bifunksjonelle monoklonale antistoff som beskrevet heri, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, i stand til å desaggregere de preformede polymere fibriller eller filamenter med minst 10%, særlig med minst 25%, mer spesielt med minst 35%, enda mer spesielt med minst 50%, men helt spesielt med minst 60-70% eller mer.

I nok et annet spesifikt aspekt inhiberer det bifunksjonelle antistoff som beskrevet heri, særlig det bifunksjonelle monoklonale antistoff som beskrevet heri, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, aggregasjonen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider med minst 50%, særlig med minst 65%, mer spesielt med minst 75%, enda mer spesielt med minst 80%, men helt spesielt med minst 85-90% eller mer sammenlignet med de respektive amyloide peptidmonomerene inkubert i buffer (kontroll).

Særlig beskrives et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet medierer inhibering av polymerisering av amyloide monomere peptider, nærmere bestemt β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβmonomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider og/eller induserer solubilisering av preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter dannet ved aggregeringen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβmonomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, gjennom spesifikk og direkte binding av antistoffet til Aβfibrene, som fører til en overgang av sekundær konformasjon.

Videre beskrevet heri er et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt et funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet direkte og spesifikt binder til β-amyloide fibere som for eksempel fibere omfattende Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt fibere omfattende Aβ1-42 monomere peptider og/eller induserer solubilisering av preformede høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter dannet ved aggregeringen av amyloide monomere peptider, særlig βamyloide monomere peptider, som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39; 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, ved målsøking og spesifikk binding til en epitop i en epitopregion av β-amyloidproteinet, særlig en epitopregion av Aβ-polypeptidet avgrenset av aminosyrerestene aan-aam hvor n er et heltall mellom 2 og 16, særlig mellom 5 og 16, mer spesielt mellom 8 og 16, enda mer spesielt mellom 10 og 16, og hvor m er et heltall mellom 3 og 25, særlig mellom 3 og 23, særlig mellom 3 og 20, særlig mellom 3 og 17, særlig mellom 6 og 17, mer spesielt mellom 9 og 17, enda mer spesielt mellom 11 og 17, hvor n og m ikke kan være identiske tall og n alltid må være et lavere tall enn m hvor differansen mellom n og m ≥2.

I et spesifikt aspekt er n et heltall mellom 13 og 15, men spesielt 14, og m er et heltall mellom 22 og 24, men spesielt 23.

Bindingen av antistoffet som beskrevet heri kan indusere en konformasjonsovergang i nevnte protein, særlig en overgang av β-plate-konformasjonen mot en α-heliks og/eller en random coil konformasjon, men særlig en random coil konformasjon, enda mer spesielt en random coil konformasjon i en gitt lokalisering i molekylet, særlig i omgivelsen av Val12 av Aβ-proteinet.

Videre beskrevet heri er et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet inkorporerer i det minst én av de ovenfor nevnte egenskaper, og er valgt innen gruppen bestående av aggregasjonsinhibering, desaggregasjon, induksjon av konformasjonell overgang, gjenkjenning av direkte binding til en epitop, særlig en konformasjonell dyskontinuerlig epitop i 14-23-, særlig i 14-20-regionen, forhindring eller forsinkelse av dannelsen av amyloide plakk, minskning av den totale mengde løselig Aβ i hjernen, minskning av plakkbelastningen i hjernen, reduksjon av mengden plakk i hjernen, bibehold eller økende kognitiv hukommelseskapasitet, men spesielt en kombinasjon av to eller flere av nevnte egenskaper.

Også beskrevet heri er et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet inkorporerer minst 2, særlig minst 3, mer spesielt minst 4, enda mer spesielt minst 5, 6, 7 eller 8, men spesielt alle av de ovennevnte egenskaper.

Videre beskrevet heri er et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som oppviser høy spesifisitet for Aβ1-42 monomere peptider, men som oppviser i det vesentlige ingen eller kun ubetydelig kryssreaktivitet overfor Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40 og/eller Aβ1-41 monomere peptider, særlig et antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, inklusivt et funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet er opptil 100 ganger, særlig 50 til 100 ganger, mer spesielt 80 til 100 ganger, men helt spesielt 100 ganger mer følsomt for amyloidpeptid Aβ1-42 sammenlignet med Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41 og opptil 1000 ganger, særlig 500 til 1000 ganger, mer spesielt 800 til 1000 ganger, men helt spesielt 1000 ganger mer følsomt for amyloidpeptid Aβ1-42 sammenlignet med Aβ1-38, og som således er i stand til å inhibere in vitro og in vivo aggregeringen av amyloidogene monomere peptider, men spesielt av amyloidpeptid Aβ1-42.

I et annet aspekt beskrives et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som har en høy bindingsaffinitet overfor amyloidpeptid Aβ1-42 og er i stand til å påvise Aβ1-42 fibere i en konsentrasjon ned til minst 0,001 µg, men særlig i et konsentrasjonsområde på mellom 0,5 µg og 0,001 µg, nærmere bestemt mellom 0,1 µg og 0,001 µg, men spesielt i en konsentrasjon på 0,001 µg.

I et meget spesifikt aspekt beskrives et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet er i stand til å påvise Aβ1-42 fibere ned til en minimumskonsentrasjon på 0,001 µg, og Aβ1-40 fibere ned til en minimumskonsentrasjon på 0,1 µg og Aβ1-38 fibere ned til en minimumskonsentrasjon på 1 µg fibermengder.

I henhold til et spesifikt aspekt beskrives et antistoff eller et fragment derav som gjenkjenner og binder til minst ett distinkt bindingssete, særlig til minst to distinkte bindingsseter på β-amyloidproteinet.

I et spesifikt aspekt beskrives et antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet gjenkjenner og binder til minst ett distinkt bindingssete, særlig til minst to distinkte bindingsseter på β-amyloidproteinet, hvor nevnte minst ene eller nevnte minst to distinkte bindingsseter omfatter henholdsvis minst én aminosyrerest og minst to påfølgende aminosyrerester som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, hvor, i et spesifikt aspekt, den minst ene rest som omfatter det første distinkte bindingssete er Leu og de minst to påfølgende aminosyrerester som omfatter det andre distinkte bindingssetet, er -Phe-Phe- innleiret i den følgende kjernesekvens:

- Xaa1 – Xaa2 – Xaa3 – Leu – Xaa4 –Phe – Phe – Xaa5- Xaa6 – Xaa7 -hvor

Xaa1 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende His, Asn, Gln Lys og Arg;

Xaa2 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Asn og Gln;

Xaa3 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Lys, His, Asn, Gln og Arg;

Xaa4 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe og Ile;

Xaa5 er aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, Ser og lle;

Xaa6 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp;

Xaa7 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp.

Særlig beskrives et antistoff eller et fragment derav som gjenkjenner og binder til minst ett distinkt bindingssete, særlig til minst to distinkte bindingsseter på β-amyloidproteinet, hvor nevnte minst ene eller nevnte minst to distinkte bindingsseter omfatter henholdsvis minst én aminosyrerest og minst to påfølgende aminosyrerester som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, hvor i et spesifikt aspekt, den minst ene rest som utgjør det første distinkte bindingssetet er Leu og de minst to påfølgende aminosyrerester, som utgjør det andre distinkte bindingssetet, er –Phe-Phe- innleiret i den følgende kjernesekvens:

Xaa1 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende His, Asn, Gln Lys og Arg;

Xaa2 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Asn og Gln;

Xaa5 er aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, Ser og lle;

Xaa6 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp;

Xaa7 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp.

I et annet aspekt beskrives et antistoff eller et fragment derav, hvor Xaa1 er His eller Arg, men særlig His;

Xaa2 er Gln eller Asn, men særlig Gln;

Xaa3 er Lys eller Arg, men særlig Lys;

Xaa4 er Val eller Leu, men særlig Val;

Xaa5 er Ala eller Val, men særlig Ala;

Xaa6 er Glu eller Asp, men særlig Glu; og

Xaa7 er Asp eller Glu, men særlig Asp.

I henhold til et annet aspekt beskrives et antistoff eller et fragment derav, som gjenkjenner og binder til minst ett distinkt bindingssete, særlig til minst to distinkte bindingsseter, mer spesielt til minst tre distinkte bindingsseter på βamyloidproteinet, hvor nevnte ene eller de nevnte minst to eller minst tre distinkte bindingsseter hver omfatter i det minste én, særlig minst to påfølgende aminosyrerester som hovedsaklig er involvert i bindingen av antistoffet.

Særlig binder antistoffet som beskrevet heri eller et fragment derav til minst to distinkte bindingsseter på β-amyloidproteinet, hvor nevnte minst to distinkte bindingsseter hver omfatter minst to påfølgende aminosyrerester som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, hvor nevnte minst to distinkte bindingsseter er lokalisert i tett nærhet til hverandre på antigenet, adskilt med minst én aminosyrerest som ikke er involvert i antistoffbinding eller til en betydelig mindre grad, sammenlignet med nevnte minst to påfølgende aminosyrerester, som således danner en konformasjonell diskontinuerlig epitop.

I et annet aspekt beskrives et antistoff eller et fragment derav som beskrevet heri, som gjenkjenner og binder til minst ett distinkt bindingssete, særlig til minst to distinkte bindingsseter, mer spesielt til minst tre distinkte bindingsseter på β-amyloidproteinet, hvor nevnte distinkte bindingsseter omfatter henholdsvis minst én og minst to påfølgende aminosyrerester, som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, hvor den minst ene, og de minst to påfølgende aminosyrer, som er adskilt med minst én aminosyrerest som ikke er involvert i antistoffbinding eller til betydelig mindre grad sammenlignet med aminosyrerestene som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, henholdsvis er – His- og –Lys-Leu-, innleiret i den følgende kjernesekvens:

- His - Xaa2 – Lys – Leu - Xaa3 – Xaa4 – Xaa5 - Xaa6 – Xaa7 – Xaa8 - hvor Xaa2 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Asn og Gln;

Xaa3 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe og Ile;

Xaa5 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe og Ile;

Xaa6 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, Ser og Ile;

Xaa7 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp;

Xaa8 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp, og hvor nevnte aminosyrerester Xaa2, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8 ikke er involvert i antistoffbinding eller i betydelig mindre grad sammenlignet med –His- og –Lys-Leu-bindingssete.

I et annet aspekt beskrives et antistoff eller et fragment derav som gjenkjenner og binder til minst ett distinkt bindingssete, særlig til minst to distinkte bindingsseter, mer spesielt til minst tre distinkte bindingsseter på βamyloidproteinet, hvor nevnte distinkte bindingsseter omfatter henholdsvis minst én og minst to påfølgende aminosyrerester, som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, hvor de minst to påfølgende aminosyrerester, som representerer et første bindingssete, er –Phe-Phe- og den minst ene aminosyrerest er –His- innleiret i den følgende kjernesekvens:

- Xaa1 – His - Xaa3 – Xaa4 – Xaa5- Xaa6 – Phe – Phe - Xaa7 – Xaa8 – Xaa9 -hvor

Xaa1 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende His, Asn, Gln, Lys og Arg,

Xaa3 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Asn og Gln;

Xaa4 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende His, Asn, Gln, Lys og Arg;

Xaa5 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, Ser og Ile,

Xaa6 er aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu og Ile; Xaa7 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu og Ile; Xaa8 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp, Xaa9 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp, og hvor nevnte aminosyrerester Xaa1, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8 og Xaa9 ikke er involvert i antistoffbinding eller i betydelig mindre grad sammenlignet med His- og –Phe-Phe-bindingssetet.

I et spesifikt aspekt, involverer den første av minst to påfølgende aminosyrerester som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, -Lys- og –Leu-, og den andre av de minst to påfølgende aminosyrerester involverer –Phe-Phe- innleiret i den følgende kjernesekvens:

- Xaa1 – Xaa2 – Lys – Leu - Xaa4 – Phe – Phe - Xaa5 – Xaa6 – Xaa7 -hvor

Xaa1 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende His, Asn, Gln Lys og Arg;

Xaa2 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Asn og Gln;

Xaa5 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, Ser og Ile;

Xaa6 er aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp;

Xaa7 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp, og hvor nevnte aminosyrerester Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6 og Xaa7 ikke er involvert i en antistoffbinding eller i betydelig mindre grad, sammenlignet med –Lys-Leu- og –Phe-Phe-bindingssetet.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen, tilveiebringes et antistoff eller et fragment derav, hvor

Xaa1 er His eller Arg, men særlig His;

Xaa2 er Gln eller Asn, men særlig Gln;

Xaa4 er Val eller Leu, men særlig Val;

Xaa5 er Ala eller Val, men særlig Ala;

Xaa6 er Glu eller Asp, men særlig Glu; og

Xaa7 er Asp eller Glu, men særlig Asp.

I et ytterligere aspekt binder antistoffet eller et fragment derav som beskrevet heri, til minst tre distinkte bindingsseter på β-amyloidproteinet, hvor nevnte minst tre distinkte bindingsseter henholdsvis omfatter minst én aminosyrerest og minst to påfølgende aminosyrerester, hvor restene hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, hvor nevnte minst tre distinkte bindingsseter er lokalisert i tett nærhet til hverandre på antigenet, separert med minst én aminosyrerest som ikke er involvert i antistoffbinding eller i betydelig mindre grad, sammenlignet med henholdsvis nevnte minst ene aminosyrerest og nevnte minst to påfølgende aminosyrerester, som derved danner en konformasjonell diskontinuerlig epitop.

I et spesifikt aspekt involverer den første av de minst to påfølgende aminosyrerestene som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, -Lys-Leu-, og den andre av de minst to påfølgende aminosyrerestene involverer –Phe-Phe-, og den tredje minst ene aminosyrerest involverer -His- innleiret i den følgende kjernesekvens:

-His - Xaa2 – Lys – Leu – Xaa4 – Phe – Phe – Xaa5 – Xaa6 – Xaa7 – hvor

Xaa2 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Asn og Gln;

Xaa4 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe og Ile:

Xaa6 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp, Xaa7 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp, og hvor nevnte aminosyrerester Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7 ikke er involvert i antistoffbinding eller i betydelig mindre grad, sammenlignet med -His-, -Lys-Leu- og –Phe-Phe-bindingssetet.

I et annet aspekt beskrives et antistoff eller et fragment derav hvor Xaa2 er Gln eller Asn, men særlig Gln;

Xaa4 er Val eller Leu, men særlig Val;

Xaa5 er Ala eller Val, men særlig Ala;

Xaa6 er Glu eller Asp, men særlig Gln; og

Xaa7 er Glu eller Asp, men særlig Asp.

I et spesifikt aspekt involverer den første av de minst to påfølgende aminosyrerester som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, -Lys-Leu-, og den andre av de minst to påfølgende aminosyrerester involverer –Phe-Phe-, og den tredje minst ene aminosyrerest involverer –Asp- innleiret i den følgende kjernesekvens:

- Xaa1 – Xaa2 – Lys – Leu - Xaa4 – Phe – Phe - Xaa5 – Xaa6 – Asp -hvor

Xaa1 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende His, Asn, Gln, Lys og Arg;

Xaa2 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Asn og Gln;

Xaa6 er aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp, og hvor nevnte aminosyrerester Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6 og Xaa7 ikke er involvert i antistoffbinding eller i betydelig mindre grad, sammenlignet med – Asp-, -Lys-Leu og –Phe-Phe-bindingssetet.

Også beskrevet heri er et antistoff eller et fragment derav,

hvor

Xaa1 er His eller Arg, men særlig His;

Xaa2 er Gln eller Asn, men særlig Gln;

Xaa4 er Val eller Leu, men særlig Val;

Xaa5 er Ala eller Val, men særlig Ala; og

Xaa6 er Glu eller Asp, men særlig Glu.

I et ytterligere spesifikt aspekt beskrives et antistoff eller et fragment derav som beskrevet heri, som binder til 4 distinkte bindingsseter på β-amyloidproteinet, hvor nevnte 4 distinkte bindingsseter omfatter henholdsvis én aminosyrerest og to påfølgende aminosyrerester, hvor restene hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, hvor nevnte 4 distinkte bindingsseter er lokalisert i tett nærhet til hverandre på antigenet, adskilt med minst én aminosyrerest som ikke er involvert i antistoffbinding eller i betydelig mindre grad, sammenlignet med nevnte ene aminosyrerest og nevnte to påfølgende aminosyrerester av de 4 distinkte bindingssetene som derved danner en konformasjonell diskontinuerlig epitop.

Særlig er den første av de to påfølgende aminosyrerestene som hovedsakelig er involvert i bindingen av antistoffet, –Lys-Leu-, og den andre av de minst to påfølgende aminosyrerestene er –Phe-Phe-, den første av den enkeltstående aminosyrerest er –His- og den andre av de enkeltstående aminosyrerestene er -Asp- innleiret i den følgende kjernesekvens:

-His - Xaa2 – Lys – Leu - Xaa4 – Phe – Phe - Xaa5 – Xaa6 – Asp –

hvor

Xaa2 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Asn og Gln;

Xaa5 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Ala, Val, Leu, Ser og Ile; Xaa6 er en aminosyrerest valgt fra gruppen omfattende Glu og Asp, og hvor nevnte aminosyrerester Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7 ikke er involvert i en antistoffbinding eller i betydelig mindre grad, sammenlignet med –His-, -Asp-, -Lys-Leu- og –Phe-Phe-bindingssetet.

Videre beskrevet heri danner gjenkjennings- og bindingssetene som her definert, en konformasjonell diskontinuerlig epitop lokalisert i en region av βamyloidproteinet mellom aminosyrerestene 12 til 24, særlig mellom restene 14 til 23, nærmere bestemt mellom aminosyrerestene 14 og 20, hvor de tre distinkte gjenkjennings- og bindingssetene omfattende henholdsvis 1 og 2 aminosyrerester, er lokalisert i posisjon henholdsvis 16, 17 og i posisjon 19 og 20 og i posisjon 14, hvor restene hovedsakelig er involvert i bindingen av β-amyloidproteinet og hvor nevnte tre distinkte gjenkjennings- og bindingsseter er adskilt med én aminosyrerest lokalisert i posisjon henholdsvis 15 og 18, hvor aminosyrene ikke er involvert i bindingen av antigenet eller i det minste i betydelig mindre grad.

I et spesifikt aspekt er nevnte påfølgende aminosyrerester, særlig –Lys-Leu- i posisjon 16 og 17 og -Phe-Phe- i posisjon 19 og 20, som hovedsakelig er involvert i bindingen av β-amyloidproteinet, innleiret i den følgende kjerneregion: Val- His- His- Gln- Lys- Leu- Val- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

I et ytterligere spesifikt aspekt er nevnte påfølgende aminosyrerester, særlig –Lys- i posisjon 16, -Leu- i posisjon 17 og –Phe-Phe- i posisjon 19 og 20, og –Hisi posisjon 14, som hovedsakelig er involvert i bindingen av β-amyloidproteinet, innleiret i den følgende kjerneregion:

Val- His- His- Gln- Lys- Leu- Val- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

I et spesifikt aspekt er antistoffet som beskrevet heri utviklet mot et antigenfragment som ikke inneholder nevnte distinkte bindingssete.

Denne forskyvning i epitopregionen kan i det minste delvis være blitt forårsaket av anvendelsen av en supramolekylær antigen konstruksjon som omfatter et antigent peptid tilsvarende aminosyresekvensen av β-amyloidpeptidet, særlig av β-amyloidpeptid Aβ1-16, modifisert med en hydrofil del som for eksempel polyetylenglykol (PEG), hvor nevnte hydrofile del er kovalent bundet til hver av endene av det antigene peptid gjennom minst én, særlig én eller to, aminosyrer som for eksempel lysin, glutaminsyre og cystein eller en hvilken som helst annen egnet aminosyre eller aminosyreanalog som kan tjene som et forbindende ledd for kobling av den hydrofile del til peptidfragmentet som beskrevet nedenfor, i immunseringsprosessen. Når et PEG benyttes som den hydrofile del er de frie PEG-endene kovalent bundet til fosfatidyletanolamin eller en hvilken som helst annen forbindelse egnet til å virke som forankringselementet, for eksempel for å innleire den antigene konstruksjon i dobbeltlaget av et liposom som her beskrevet.

Dessuten kan anvendelsen av lipid A som del av immuniseringsprotokollen ha bidratt til en forskyvning i epitopregionen.

I et spesifikt aspekt beskrives et antistoff som omfatter den lette kjedes variable region (LCVR) i SEKV.ID.NR:7.

I et annet spesifikt aspekt beskrives den lette kjedes variable region (LCVR) i SEKV.ID.NR:7.

I nok et annet spesifikt aspekt tilveiebringes et antistoff som omfatter den tunge kjedes variable region (HCVR) i SEKV.ID.NR:8.

I et ytterligere spesifikt aspekt beskrives den tunge kjedes variable region (HCVR) i SEKV.ID.NR:8.

I et aspekt beskrives et antistoff som omfatter både den tunge kjedes variable region i SEKV.ID.NR:8 og den lette kjedes variable region i

SEKV.ID.NR:7.

Videre beskrevet er også et antistoff som omfatter en lett kjedes variable region (LCVR) eller tung kjede variabel region (HCVR) eller begge, en lett kjede variable region (LCVR) og en tung kjede variabel region (HCVR) som er homolog til hvilken som helst av peptidene angitt i henholdsvis SEKV.ID.NR:7 og 8.

Viderebeskrevet her er et antistoff eller et fragment derav som ovenfor beskrevet, hvor den lette kjedes variable region (LCVR) har en aminosyresekvens som er 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med sekvensen angitt i SEKV.ID.NR:7.

Videre beskrives et antistoff eller et fragment derav som ovenfor beskrevet, hvor den tunge kjedes variable region (HCVR) har en aminosyresekvens som er 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med sekvensen angitt i SEKV.ID.NR:8.

Videre beskrives et antistoff eller et fragment derav som ovenfor beskrevet, hvor den lette kjedes variable region (LCVR) og den tunge kjedes variable region (HCVR) sammen har en aminosyresekvens som er 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med sekvensen angitt i SEKV.ID.NR:7 og 8.

I et annet spesifikt aspekt beskrives den lette kjedes variable region som har en aminosyresekvens som er 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med sekvensen angitt i SEKV.ID.NR:7.

I et ytterligere spesifikt aspekt beskrives den tunge kjedes variable region som har en aminosyresekvens som er 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med sekvensen angitt i SEKV.ID.NR:8.

I et annet aspekt beskrives et polynukleotid som omfatter en nukleotidsekvens som koder for antistoffet som beskrevet ovenfor.

Særlig beskrives et polynukleotid som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et antistoff som beskrevet heri, omfattende:

a) i det minste nukleotidsekvensen av den lette kjedes variable region i SEKV.ID.NR:9,

b) en nukleotidsekvens som adskiller seg fra nukleotidsekvensen av (a) i kodonsekvens som følge av den genetiske kodes degenererthet, c) den komplementære sekvens av (a) og (b) eller

d) et fragment av en nukleotidsekvens av (a), (b) eller (c) som omfatter en sammenhengende strekning av nukleotider valgt fra gruppen bestående av minst 20 sammenhengende nukleotider, minst 25 sammenhengende nukleotider, minst 30 sammenhengende nukleotider, minst 35 sammenhengende nukleotider, minst 40 sammenhengende nukleotider, minst 45 sammenhengende nukleotider og minst 50 sammenhengende nukleotider.

I et annet aspekt beskrives et polynukleotid som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et antistoff som beskrevet heri, omfattende:

a) i det minste nukleotidsekvensen av den lette kjede av SEKV.ID.NR:10,

I nok et annet aspekt beskrives et polynukleotid som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et antistoff som beskrevet heri, omfattende: a) i det minste nukleotidsekvensen av den tunge kjedes variable region av SEKV.ID.NR:11,

d) et fragment av en nukleotidsekvens av (a), (b) eller (c) som omfatter en sammenhengende strekning av nukleotider valgt fra gruppen bestående av minst 20 sammenhengende nukleotider, minst 25 sammenhengende nukleotider, minst 30 sammenhengende

nukleotider, minst 35 sammenhengende nukleotider, minst 40 sammenhengende nukleotider, minst 45 sammenhengende nukleotider og minst 50 sammenhengende nukleotider.

I nok et annet aspekt beskrives et polynukleotid som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et antistoff som beskrevet heri, omfattende:

a) i det minste nukleotidsekvensen av den tunge kjede av SEKV.ID.NR:12 eller den komplementære sekvens,

Også omfattet er et polynukleotid som omfatter:

a) nukleotidsekvensen i SEKV.ID.NR:9 som koder for den lette kjedes variable region,

Også omfattet er et polynukleotid som omfatter:

a) nukleotidsekvensen i SEKV.ID.NR:10 som koder for den lette kjede, b) en nukleotidsekvens som adskiller seg fra nukleotidsekvensen av (a) i kodonsekvens som følge av den genetiske kodes degenererthet, c) den komplementære sekvens av (a) og (b) eller

Også omfattet er et polynukleotid som omfatter:

a) nukleotidsekvensen i SEKV.ID.NR:11 som koder for den tunge kjedes variable region,

Også omfattet er et polynukleotid som omfatter:

a) nukleotidsekvensen i SEKV.ID.NR:12 som koder for den tunge kjede, b) en nukleotidsekvens som adskiller seg fra nukleotidsekvensen av (a) i kodonsekvens som følge av den genetiske kodes degenererthet, c) den komplementære sekvens av (a) og (b) eller

Ytterligere beskrives enhver nukleotidsekvens som hybridiserer til:

a. en nukleotidsekvens i henhold til oppfinnelsen og som angitt i henholdsvis SEKV.ID.NR:9, 10, 11 og 12,

b. en nukleotidsekvens som adskiller seg fra nukleotidsekvensen av (a) i kodonsekvens som følge av den genetiske kodes degenererthet,

c. den komplementære sekvens av (a) og (b) eller

d. et fragment av en nukleotidsekvens av (a), (b) eller (c) som omfatter en sammenhengende strekning av nukleotider valgt fra gruppen bestående av minst 20 sammenhengende nukleotider, minst 25 sammenhengende nukleotider, minst 30 sammenhengende nukleotider, minst 35 sammenhengende nukleotider, minst 40 sammenhengende nukleotider, minst 45 sammenhengende nukleotider og minst 50 sammenhengende nukleotider.

Særlig enhver nukleotidsekvens som hybridiserer

under konvensjonelle hybridiseringsbetingelser, særlig under stringente hybridiseringsbetingelser, til en nukleotidsekvens som beskrevet heri og som angitt i henholdsvis i SEKV.ID.NR:9, 10, 11 og 12, særlig til den komplementære

tråd av denne.

I et ytterligere aspekt beskrives enhver nukleotidsekvens som hybridiserer til en nukleotidsekvens som beskrevet heri og som angitt henholdsvis i SEKV.ID.NR:9, 10, 11 og 12, særlig til den komplementære tråd av denne, under konvensjonelle hybridiseringsbetingelser, hvorunder 5xSSPE, 1% SDS, 1xDenhardts løsning benyttes som løsning og/eller hybridiseringstemperaturene er mellom 35°C og 70°C, fortrinnsvis 65°C. Etter hybridisering foretas fortrinnsvis først vasking med 2xSSC, 1% SDS og deretter med 0,2xSSD ved temperaturer mellom 35°C og 70°C, fortrinnsvis 65°C (med hensyn til definisjonen av SSPE, SSC og Denhardts løsning, se Sambrook et al. loc.cit.).

Særlig beskrives enhver nukleotidsekvens som hybridiserer til en nukleotidsekvens som beskrevet heri og som angitt i henholdsvis SEKV.ID.NR:9, 10, 11 og 12, særlig til den komplementære tråd av denne, under stringente hybridiseringsbetingelser, som for eksempel beskrevet i Sambrook et al., supra, nærmere bestemt under stringente hybridiseringsbetingelser hvor hybridisering og vasking skjer ved 65°C som angitt ovenfor.

I et spesifikt aspekt beskrives et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet har de karakteristiske egenskapene til et antistoff produsert av en hybridomcellelinje valgt fra gruppen bestående av FP 12H3, FP 12H3-C2 og FP 12H3-G2 deponert henholdsvis 1. desember 2005 og 9. desember 2005, som henholdsvis DSM ACC2752, DSM ACC 2750 og DSM ACC 2751.

Nærmere bestemt i et aspekt beskrives et antistoff som omfatter et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, produsert av hybridomcellelinjen FP 12H3, deponert henholdsvis 1. desember 2005 og 9. desember 2005, som DSM ACC 2752.

Nærmere bestemt beskrives et monoklonalt antistoff som omfatter et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, produsert av hybridomcellelinjen FP 12H3-C2, deponert henholdsvis 1. desember 2005 og 9. desember 2005, som DSM ACC 2750.

Nærmere bestemt beskrives et monoklonalt antistoff som omfatter et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, produsert av hybridomcellelinjen FP 12H3-G2, deponert henholdsvis 1. desember 2005 og 9. desember 2005, som DSM ACC 2751.

I et annet spesifikt aspekt beskrives et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet har de karakteristiske egenskapene til et antistoff produsert av hybridomcellelinjen ET 7E3 deponert 8. desember 2005, som DSM ACC 2755.

Nærmere bestemt beskrives et monoklonalt antistoff som omfatter et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, produsert av hybridomcellelinjen ET 7E3, deponert 8. desember 2005, som DSM ACC 2755.

I et annet spesifikt aspekt beskrives et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet har de karakteristiske egenskapene til et antistoff produsert av hybridomcellelinjen EJ 7H3 deponert 8. desember 2005, som DSM ACC 2756.

Nærmere bestemt beskrives et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav produsert av hybridomcellelinjen EJ 7H3, deponert 8. desember 2005, som DSM ACC 2756.

Det er et annet formål å beskrive fremgangsmåter og blandinger som omfatter et antistoff som beskrevet heri og som beskrevet ovenfor, til forhindring og/eller terapeutisk behandling og/eller lindring av virkningene av sykdommer og forstyrrelser som forårsakes av eller er assosiert med amyloid eller amyloidlignende proteiner inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og forstyrrelser som er assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose, så som sykdommer inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser som Alzheimers sykdom (AD), inklusivt sykdommer eller tilstander kjennetegnet ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), inklusivt sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet så som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset; så vel som andre sykdommer og tilstander som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og annet, inklusivt maculadegenerasjon, for eksempel ved passiv immunisering av et menneske eller dyr med et antistoff som ovenfor beskrevet.

Et annet formål er å beskrive en fremgangsmåte for bruk av et monoklonalt antistoff og/eller en funksjonell del derav som beskrevet heri, samt blandinger omfattende et antistoff som ovenfor beskrevet, for diagnostisering og terapeutisk behandling av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og lidelser assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose, så som sykdommer inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser så som Alzheimers sykdom (AD), inklusivt sykdommer eller tilstander kjennetegnet ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), inklusivt sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet så som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset; så vel som andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon.

Særlig beskrives en fremgangsmåte for bruk av et monoklonalt antistoff og/eller en funksjonell del derav som beskrevet heri, og blandinger som omfatter et antistoff, særlig et bispesifikt eller bi-effektivt antistoff, men spesielt et bispesifikt eller bi-effektivt monoklonalt antistoff som ovenfor beskrevet, for å redusere og forhindre forekomsten av neurologiske lidelser, inklusivt, men ikke begrenset, til Alzheimers sykdom.

Blandingene som beskrevet heri omfatter et antistoff, særlig et bispesifikt eller bi-effektivt antistoff som ovenfor beskrevet, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, særlig i en terapeutisk effektiv mengde, eller nærmere bestemt, et monoklonalt antistoff, spesielt et bispesifikt eller bi-effektivt monoklonalt antistoff som beskrevet ovenfor, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, særlig i en terapeutisk effektiv mengde, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Særlig omfatter blandingen som beskrevet heri et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet er i stand til å inhibere aggregeringen av amyloide monomere peptider, nærmere bestemt β-amyloide monomere peptider, som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, til høymolekylære polymere amyloide fibriller eller filamenter og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I et ytterligere aspekt beskrives en blanding som omfatter et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering, særlig etter koinkubering i et molart konsentrasjonsforhold opptil 1:100, nærmere bestemt i et molart konsentrasjonsforhold på mellom 1:30 og 1:100, men spesielt i et molart konsentrasjonsforhold på 1:100 med amyloide monomere peptider, særlig βamyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, inhiberer aggregeringen av Aβ-monomerene til høymolekylære polymere fibriller eller filamenter. Særlig utgjør nevnte inhibering minst 50%, særlig minst 65%, mer spesielt minst 75%, enda mer spesielt minst 80%, men helt spesielt minst 85%-90%, eller mer, sammenlignet med de respektive amyloide peptidmonomerer inkubert i buffer (kontroll), og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Særlig foretas ko-inkuberingen av antistoffet som beskrevet heri med amyloide monomere peptider i 48 timer ved en temperatur på 37°C.

Aggregasjonsinhiberingspotensialet til antistoffet som beskrevet heri kan bestemmes ved tetthetsgradient-ultrasentrifugering etterfulgt av en SDS-PAGE sedimenteringsanalyse på en preformet gradient og/eller ved en tioflavin T (Th-T) fluorescensanalyse.

Videre beskrevet heri er en blanding som omfatter et antistoff som er i stand til å desaggregere høymolekylære polymere amyloidfibriller eller filamenter dannet ved aggregeringen av amyloide monomere peptider, nærmere bestemt β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Gjennom desaggregeringen av amyloidogene polymere fibriller eller filamenter er antistoffene som beskrevet heri i stand til å forhindre eller forsinke dannelsen av amyloide plakk, hvilket fører til en lindring av de symptomer som er assosiert med sykdommen og en forsinkelse av dens tilbakevending eller progresjon.

Videre beskrives en blanding som omfatter et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering i et molart konsentrasjonsforhold på mellom 1:30 og 1:100, særlig et forhold på 1:100, med preformede høymolekylære polymere amyloide fibriller eller filamenter dannet ved aggregeringen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, særlig etter ko-inkubering i 24 timer ved en temperatur på 37°C, er i stand til å desaggregere de preformede polymere fibrillene eller filamentene med minst 35%, særlig med minst 40%, mer spesielt med minst 50%, enda mer spesielt med minst 60%, men helt spesielt med minst 70% eller mer, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Desaggregeringsevnen til antistoffet som beskrevet heri kan bestemmes ved tetthetsgradient-ultrasentrifugering etterfulgt av en SDS-PAGE sedimenteringsanalyse på en preformet gradient og/eller ved en tioflavin T (Th-T) fluorescensanalyse.

Videre beskrevet heri er en blanding som omfatter et antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet er konformasjonsfølsomt, særlig i en effektiv mengde, mer spesielt i en terapeutisk effektiv mengde.

I et ytterligere aspekt beskrives en blanding som omfatter et antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering med preformede høymolekylære polymere amyloide fibriller eller filamenter dannet ved aggregeringen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, særlig etter ko-inkubering i 24 timer ved en temperatur på 37°C, er i stand til å indusere en overgang av β-platekonformasjonen til en α-heliks og/eller en random coil konformasjon, men særlig en random coil konformasjon, enda mer spesielt en random coil konformasjon ved en gitt lokalisering i molekylet, spesielt i omgivelsene av Val12 av Aβ-proteinet, som fører til en økning av rabdom coil konformasjonen på bekostning av β-platekonformasjonen og en forbedret solubilisering av de preformede høymolekylære polymere amyloide fibrillene eller filamentene, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff. Særlig utgjør minskningen av β-plate-konformasjonen minst 30%, særlig minst 35% og mer spesielt minst 40% og mer, sammenlignet med de respektive preformede amyloide polymere fibrillene eller filamentene inkubert i buffer (kontroll).

Antistoffets evne til å indusere en overgang i sekundærstrukturen bestemmes ved fastfase 13 CMR spektroskopi, men særlig ved å måle de integrale intensiteter av konformasjonene av Val12 Cβ i Aβ1-42 peptidet.

Videre beskrevet heri er en blanding som omfatter et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, særlig i en terapeutisk effektiv mengde, hvor antistoffet er bifunksjonelt ved at det oppviser både en aggregasjonsinhiberende egenskap så vel som en desaggregerende evne som ovenfor definert, fortrinnsvis i kombinasjon med en høy grad av konformasjonell følsomhet, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I nok et annet aspekt beskrives en blanding som omfatter et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet etter ko-inkubering med amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, inhiberer aggregeringen av Aβmonomerer til høymolekylære polymere fibriller og dessuten etter ko-inkubering med preformede høye polymere amyloide fibriller eller filamenter dannet ved aggregeringen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, er i stand til å desaggregere de preformede polymere fibrillene eller filamentene, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I et spesifikt aspekt skjer ko-inkuberingen av det bifunksjonelle antistoffet som beskrevet heri, men spesielt av det bifunksjonelle monoklonale antistoff som beskrevet heri, med amyloide monomere peptider og preformede høymolekylære polymere amyloide fibriller eller filamenter i et molart konsentrasjonsforhold på opptil 1:100, særlig i et forhold på mellom 1:30 og 1:100 og mer spesielt et forhold på 1:100.

I et ytterligere spesifikt aspekt foretas ko-inkuberingen med amyloide monomere peptider og preformede høymolekylære amyloide fibriller eller filamenter i henholdsvis 48 timer og 24 timer ved en temperatur på 37°C.

I nok et annet spesifikt aspekt tilveiebringes en blanding som omfatter et bifunksjonelt antistoff som beskrevet heri, men spesielt et bifunksjonelt monoklonalt antistoff som beskrevet heri, som er i stand til å desaggregere de preformede polymere fibrillene eller filamentene med minst 10%, særlig med minst 25%, mer spesielt med minst 35%, enda mer spesielt med minst 50%, men helt spesielt med minst 60-70% eller mer, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I nok et annet spesifikt aspekt beskrives en blanding som omfatter et bifunksjonelt antistoff som beskrevet heri, men spesielt et bifunksjonelt monoklonalt antistoff som beskrevet heri, som inhiberer aggregeringen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider med minst 50%, særlig med minst 65%, mer spesielt med minst 75%, enda mer spesielt med minst 80%, men helt spesielt med minst 85-90% eller mer sammenlignet med de respektive amyloide peptidmonomerene inkubert i buffer (kontroll), og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Særlig beskrives en blanding som omfatter et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet medierer inhiberingen av polymerisering av amyloide monomere peptider, nærmere bestemt β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, og/eller induserer solubilisering av preformede høymolekylære polymere amyloide fibriller eller filamenter dannet ved aggregeringen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider, som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, gjennom spesifikk og direkte binding av antistoffet til Aβ-fibere, som fører til en overgang av sekundær konformasjon, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Videre beskrevet heri er en blanding som omfatter et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet direkte og spesifikt binder til β-amyloide fibere som for eksempel fibere omfattende Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt til fibere omfattende Aβ1-42 monomere peptider, og/eller induserer solubilisering av preformede høymolekylære polymere amyloide fibriller eller filamenter dannet ved aggregeringen av amyloide monomere peptider, særlig β-amyloide monomere peptider som for eksempel Aβ-monomere peptider 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 eller 1-43, men spesielt Aβ1-42 monomere peptider, ved målsøking og spesifikk binding til en epitopregion av β-amyloidproteinet, særlig en epitopregion av Aβ-polypeptidet avgrenset av aminosyrerestene aan-aam, hvor n er et heltall mellom 2 og 15, særlig mellom 5 og 15, mer spesielt mellom 8 og 15, enda mer spesielt mellom 10 og 15, og m er et heltall mellom 3 og 17, særlig mellom 6 og 17, mer spesielt mellom 9 og 17, enda mer spesielt mellom 11 og 17, hvor n og m ikke kan være identiske tall og n alltid må være et mindre tall enn m, hvor forskjellen mellom n og m ≥2, og eventuelt, en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Bindingen av antistoffet som beskrevet heri kan indusere en konformasjonell overgang i nevnte protein, særlig en overgang av β-plate-konformasjonen mot en α-heliks og/eller en random coil konformasjon, men særlig en random coil konformasjon, enda mer spesielt en random coil konformasjon i en gitt lokalisering i molekylet, spesielt i omgivelsene av Val12 av Aβ-proteinet.

I et ytterligere aspekt beskrives en blanding som omfatter et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet inkorporerer i det minste én av de egenskaper som ovenfor er nevnt, det vil si aggregasjonsinhibering, desaggregasjon, induksjon av konformasjonell overgang, gjenkjenning av og direkte binding til 4-16 og/eller 14 til 23, men særlig den 14. til 20. epitopregion, men spesielt en kombinasjon av to eller flere av nevnte egenskaper, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I et spesifikt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en blanding som omfatter et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som oppviser høy spesifisitet for Aβ1-42 monomere peptider, men som i det vesentlige oppviser ingen eller kun underordnet kryssreaktivitet overfor Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40 og/eller Aβ1-41 monomere peptider, særlig et antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet er opptil 100 ganger, særlig 50 til 100 ganger, mer spesielt 80 til 100 ganger, men helt spesielt 100 ganger mer følsomt for amyloidpeptid Aβ1-42 sammenlignet med Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41 og opptil 1000 ganger, særlig 500 til 1000 ganger, mer spesielt 800 til 1000 ganger, men helt spesielt 1000 ganger mer følsomt for amyloidpeptid Aβ1-42 sammenlignet med Aβ1-38 og således i stand til å inhibere in vitro og in vivo aggregasjonen av amyloidogene monomere peptider, men spesielt av amyloidpeptid Aβ1-42, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I et annet spesifikt aspekt beskrives en blanding som omfatter et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, som har en høy bindingssensitivitet overfor amyloidpeptid Aβ1-42 og er i stand til å påvise Aβ1-42 fibere i en konsentrasjon på ned til minst 0,001 µg, men særlig i et konsentrasjonsområde på mellom 0,5 µg og 0,001 µg, mer spesielt mellom 0,1 µg og 0,001 µg, men helt spesielt i en konsentrasjon på 0,001 µg, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I et meget spesifikt aspekt beskrives en blanding som omfatter et antistoff, særlig et bifunksjonelt antistoff, men spesielt et monoklonalt antistoff, særlig et bifunksjonelt monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet er i stand til å påvise Aβ1-42 fibere ned til en minimal konsentrasjon på 0,001 µg og Aβ1-40 fibere ned til en minimal konsentrasjon på 0,1 µg og Aβ1-38 fibere ned til en minimal konsentrasjon på 1 µg fibermengder, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Videre beskrevet heri er en blanding som omfatter et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet har de karakteristiske egenskapene til et antistoff produsert av en hybridomcellelinje valgt fra gruppen bestående av FP 12H3, FP 12H3-C2 og FP 12H3-G2 deponert henholdsvis 1. desember 2005 og 9. desember 2005, som henholdsvis DSM ACC2752, DSM ACC 2750 og DSM ACC 2751, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Nærmere bestemt beskrives en blanding som omfatter et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, produsert av hybridomcellelinje FP 12H3, deponert henholdsvis 1. desember 2005 og 9. desember 2005, som DSM ACC 2752, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Mer spesielt beskrives en blanding som omfatter et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, produsert av hybridomcellelinje FP 12H3-C2, deponert henholdsvis 1. desember 2005 og 9. desember 2005, som DSM ACC 2750, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Videre beskrives en sammensetning som omfatter et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, produsert av hybridomcellelinje FP 12H3-G2, deponert henholdsvis 1. desember 2005 og 9. desember 2005, som DSM ACC 2751, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I et annet spesifikt aspekt beskrives en sammensetning som omfatter et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet har de karakteristiske egenskapene til et antistoff produsert av hybridomcellelinje ET 7E3 deponert 8. desember, 2005 som DSM ACC2755, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Videre beskrevet heri en sammensetning som omfatter et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav produsert av hybridomcellelinje ET 7E3, deponert 8. desember 2005 som DSM ACC2755, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I et annen spesifikt aspekt beskrives en sammensetning som omfatter et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, hvor antistoffet har de karakteristiske egenskapene til et antistoff produsert av hybridomcellelinje EJ 7H3, deponert 8. desember 2005 som DSM ACC2756, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Videre beskrevet heri er en sammensetning som omfatter et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav produsert av hybridomcellelinje EJ 7H3, deponert 8. desember 2005 som DSM ACC2756, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

Antistoffet, særlig det monoklonale antistoff som beskrevet heri, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, kan administreres i kombinasjon med andre biologisk aktive substanser og fremgangsmåter for behandling av sykdommer. De andre biologisk virksomme substansene kan være del av den samme sammensetning som allerede omfatter antistoffet som beskrevet heri, i form av en blanding hvor antistoffet og den andre biologisk aktive substans er blandet inn i, eller sammen med, det samme farmasøytisk akseptable løsningsmiddel og/eller bærer, eller kan være fremstilt separat som del av en separat sammensetning som kan administreres separat eller sammen i form av et sett av deler.

Antistoffet, særlig det monoklonale antistoff som beskrevet heri, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, kan administreres samtidig med andre biologiske virkestoffer intermitterende eller suksessivt. For eksempel kan det monoklonale antistoff som beskrevet heri, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, administreres samtidig med et første ytterligere virkestoff eller suksessivt etter eller før administrering av antistoffet. Dersom det velges et bruksskjema hvor mer enn ett ytterligere biologisk virkestoff administreres sammen med det minst ene antistoff som beskrevet heri, kan forbindelsene eller substansene dels administreres samtidig, dels suksessivt i forskjellige kombinasjoner.

Det er et annet formål å beskrive blandinger av antistoffer som omfatter minst ett antistoff som beskrevet heri, eventuelt ett eller flere biologiske virkestoffer, så vel som fremgangsmåter for bruk av individuelle antistoffer eller blandinger derav, inklusivt blandinger som omfatter nevnte antistoffer eller blandinger av antistoffer for forebyggelse og/eller terapeutisk behandling og/eller lindring av effektene av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og lidelser assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose, så som sykdommer inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser som Alzheimers sykdom (AD), inklusivt sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet, som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset; så vel som andre sykdommer som er begrunnet i og/eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon.

Blandingene som beskrevet heri kan i tillegg til et antistoff i henhold til oppfinnelsen, omfatte et biologisk virkestoff, som for eksempel kjente forbindelser benyttet til medisinering av sykdommer og forstyrrelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe sykdommer og lidelser assosiert med amyloid eller amyloid-lignende protein, så som det Aβ-protein som er involvert i Alzheimers sykdom.

Det andre biologiske virkestoff eller forbindelse kan også være et terapeutisk middel som kan benyttes ved behandlingen av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose forårsaket av amyloid β eller benyttes ved medisineringen av andre neurologiske lidelser.

Det andre biologiske virkestoff eller forbindelse kan utøve den biologiske effekt etter den samme eller en lignende mekanisme som antistoffet som beskrevet heri eller etter en ubeslektet virkningsmekanisme eller etter en rekke beslektede og/eller ubeslektede virkningsmekanismer.

Generelt kan det andre biologiske virkestoff omfatte neutron-transmisjonsforsterkere, psykoterapeutiske medikamenter, acetylkolinesterase-inhibitorer, kalsiumkanalblokkere, biogene aminer, benzodiazepin-tranquillizers, acetylkolinsyntese, lagrings- eller frigjøringsforsterkere, acetylkolin-postsynaptiske reseptoragonister, monoaminoksidase-A- eller –B-inhibitorer, N-metyl-D-aspartatglutamatreseptorantagonister, ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter, antioksydanter og serotonerge reseptorantagonister.

Særlig kan blandingen som beskrevet heri omfatte minst ett annet biologisk virkestoff valgt fra gruppen bestående av forbindelser mot oksydativt stress, antiapoptotiske forbindelser, metall-chelatorer, inhibitorer av DNA-reparasjon, så som pirenzepin og metabolitter, 3-amino-1-propansulfonsyre (3APS), 1,3-propandisulfonat (1,3PDS), sekretase-aktivatorer, β- og γ-sekretaseinhibitorer, tauproteiner, neurotransmitter, β-platebrytere, antiinflammatoriske molekyler eller kolinesteraseinhibitorer (ChEI) som f.eks. tacrin, rivastigmin, donepezil og/eller galantamin og andre medikamenter og næringssupplementer, sammen med et antistoff som beskrevet heri og eventuelt, en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I et ytterligere aspekt kan blandingene som beskrevet heri omfatte niacin eller memantin sammen med et antistoff som beskrevet heri, og eventuelt, en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I nok et annet aspekt beskrives blandinger som omfatter ”atypiske antipsykotika” som for eksempel klozapin, ziprasidon, risperidon, aripiprazol eller olanzapin, til behandling av positive og negative psykotiske symptomer, inklusivt hallusinasjoner, delusjoner, tankeforstyrrelser (manifestert ved markert inkoherens, avsporing, manglende sammenheng) og bisarr eller disorganisert adferd, så vel som anhedoni, avflatet affekt, apati og sosial tilbaketrekking, sammen med et antistoff som beskrevet heri, og eventuelt, en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

I et spesifikt aspekt omfatter sammensetningene og blandingene som tidligere beskrevet, henholdsvis antistoffet og det biologiske virkestoff i en terapeutisk effektiv mengde.

Andre forbindelser som kan benyttes hensiktsmessig i blandinger i kombinasjon med antistoffet som beskrevet heri, er for eksempel beskrevet i WO 2004/058258 (se spesielt sidene 16 og 17) inklusivt terapeutiske medikamentsiktemål (side 36-39), alkansulfonsyrer og alkanol-svovelsyrer (side 39-51), kolinesteraseinhibitorer (side 51-56), NMDA reseptorantagonister (side 56-58), østrogener (side 58-59), ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter (side 60-61), antioksydanter (side 61-62), peroksisom-proliferator-aktiverte reseptor-(PPAR) agonister (side 63-67), kolesterolsenkende midler (side 68-75); amyloidinhibitorer (side 75-77), inhibitorer av amyloiddannelse (side 77-78), metall-chelatorer (side 78-79), antipsykotika og antidepressiva (side 80-82), næringssupplementer (side 83-89) og forbindelser som øker tilgjengeligheten av biologiske virkestoffer i hjernen (se side 89-93) og prodrugs (side 93 og 94).

Videre beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff, særlig en fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav som beskrevet heri, hvor fremgangsmåten omfatter utvikling av antistoffer, men særlig monoklonale antistoffer mot en supramolekylær antigenkonstruksjon som omfatter et antigent peptid tilsvarende aminosyresekvensen av β-amyloidpeptidet, særlig av βamyloidpeptid Aβ1-15, Aβ1-16 og Aβ1-16(∆14), modifisert med hydrofobe deler som for eksempel palmitinsyre eller en hydrofil del som for eksempel polyetylenglykol (PEG) eller en kombinasjon av begge, hvor nevnte henholdsvis hydrofobe og hydrofile del er kovalent bundet til hver ende gjennom minst én, særlig én eller to, aminosyrer som for eksempel lysin eller en hvilken som helst annen egnet aminosyre eller aminosyreanalog som kan tjene som en koblingsanordning eller et linkermolekyl for koblingen av nevnte hydrofobe og hydrofile del, som for eksempel glutaminsyre eller cystein.

Også beskrevet er anvendelsen av et monoklonalt antistoff og/eller en funksjonell del derav som her beskrevet ovenfor og/eller en farmasøytisk blanding eller en blanding som omfatter nevnte antistoff, for fremstillingen av et medikament for behandling eller lindring av virkningen av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og lidelser assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose så som sykdommer inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser som Alzheimers sykdom (AD), og sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset; så vel som andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon.

Videre beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding ved å benytte et antistoff som beskrevet heri og/eller en funksjonell del derav, men spesielt et monoklonalt antistoff og/eller en funksjonell del derav eller et funksjonelt likeverdig antistoff for bruk til behandling eller lindring av virkningene av sykdommer og lidelser som er forårsaket av eller assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og lidelser assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose så som sykdommer inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser som Alzheimers sykdom (AD), og sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset; så vel som andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon, som omfatter formulering av et antistoff i henhold til oppfinnelsen i en farmasøytisk akseptabel form.

Antistoffene og/eller funksjonelle deler derav, men spesielt de monoklonale antistoffene og/eller funksjonelle deler derav eller et funksjonelt likeverdig antistoff og sammensetningen og blandingene som omfatter nevnte antistoff som beskrevet heri, kan benyttes til fremstillingen av et medikament til forhindring, behandling eller lindring av de effekter av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og lidelser assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose, inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser så som Alzheimers sykdom (AD), inklusivt sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset; så vel som andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon.

I et ytterligere aspekt beskrives en fremgangsmåte for å redusere plakkbelastningen i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en sykdom eller tilstand som fører til en økt plakkbelastning i hjernen, som omfatter administrering til et dyr, særlig et pattedyr, mer spesielt et menneske som har behov for slik behandling, en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff og/eller en funksjonell del derav, men spesielt av det monoklonale antistoff og/eller en funksjonell del derav eller av et funksjonelt likeverdig antistoff som ovenfor beskrevet, eller en sammensetning eller en blanding som omfatter nevnte antistoff.

Særlig reduseres plakkbelastningen med minst 20%, særlig med minst 25%, mer spesielt med minst 30%, enda mer spesielt med mer enn 30%.

I et ytterligere aspekt beskrives en fremgangsmåte for å redusere den mengde plakk i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en sykdom eller en tilstand som fører til en økt plakkbelastning i hjernen, som omfatter administrering til et dyr, særlig et pattedyr, mer spesielt et menneske med behov for slik behandling, en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff og/eller en funksjonell del derav, men spesielt av det monoklonale antistoff og/eller en funksjonell del derav eller et funksjonelt likeverdig antistoff som ovenfor beskrevet eller en sammensetning eller en blanding som omfatter nevnte antistoff.

Særlig reduseres mengden av plakk i hjernen med minst 10%, særlig med minst 15%, mer spesielt med mer enn 15%.

I nok et annet aspekt beskrives en fremgangsmåte for minskning av den totale mengde løselig Aβ i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en sykdom eller en tilstand som fører til økte konsentrasjoner av løselig Aβ i hjernen, som omfatter administrering til et dyr, særlig et pattedyr, mer spesielt et menneske med behov for slik behandling, en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff og/eller en funksjonell del derav, men spesielt av det monoklonale antistoff og/eller en funksjonell del derav eller et funksjonelt likeverdig antistoff som ovenfor beskrevet eller en sammensetning eller en blanding som omfatter nevnte antistoff.

Det er et formål å beskrive en fremgangsmåte til forhindring, behandling eller lindring av virkningene av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og lidelser assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose, inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser som Alzheimers sykdom (AD), inklusivt sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset; så vel som andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon, ved å administrere et antistoff, men særlig et monoklonalt antistoff eller en sammensetning eller blanding som omfatter et slikt antistoff som beskrevet heri, til et dyr eller et menneske som er rammet av en slik lidelse, som omfatter administrering til et dyr, særlig et pattedyr, nærmere bestemt et menneske med behov for slik behandling, en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff og/eller en funksjonell del derav, men spesielt av det monoklonale antistoff og/eller en funksjonell del derav eller av et funksjonelt likeverdig antistoff som ovenfor beskrevet, eller en sammensetning eller en blanding som omfatter nevnte antistoff.

I et spesifikt aspekt beskrives en fremgangsmåte for å opprettholde eller øke kognitiv hukommelseskapasitet til et dyr, særlig et pattedyr eller et menneske som lider av hukommelsessvikt, ved å administrere til et dyr, særlig et pattedyr eller et menneske som har behov for slik behandling, et antistoff, men særlig et monoklonalt antistoff som beskrevet heri eller en sammensetning eller blanding som omfatter et slikt antistoff som beskrevet ovenfor.

I et annet aspekt beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding ved å benytte et antistoff som beskrevet heri og/eller en funksjonell del derav, men spesielt et monoklonalt antistoff og/eller en funksjonell del derav eller et funksjonelt likeverdig antistoff til forebyggelse, behandling eller lindring av effektene av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og lidelser assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose, så som sykdommer inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser som Alzheimers sykdom (AD), inklusivt sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset; så vel som andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon.

Videre beskrevet heri eren fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding ved bruk av et antistoff som beskrevet heri og/eller en funksjonell del derav, men spesielt et monoklonalt antistoff og/eller en funksjonell del derav eller et funksjonelt likeverdig antistoff for oppretthold eller økning av kognitiv hukommelseskapasitet til et dyr, særlig et pattedyr eller et menneske som lider av hukommelsessvikt, ved å administrere dyret, særlig et pattedyr eller et menneske, et antistoff, men særlig et monoklonalt antistoff eller en sammensetning eller blanding som omfatter et slikt antistoff som ovenfor beskrevet.

Disse og andre formål, trekk og fordeler vil være åpenbare etter en gjennomgang av den etterfølgende detaljerte beskrivelse av den beskrevne utførelsesform og de ledsagende krav.

Betegnelsene ”polypeptid”, ”peptid” og ”protein” benyttes her om hverandre og er definert som et biomolekyl sammensatt av aminosyrer koblet med en peptidbinding.

Betegnelsene ”en”, ”ett” og ”den” er her ment å bety ”én eller flere” og innbefatter flertall om dette ikke strider mot sammenhengen.

Betegnelsene ”påvisning” eller ”påvist” som her benyttet betyr bruk av kjente teknikker for deteksjon av biologiske molekyler, så som immunkjemiske eller histologiske metoder og refererer seg til kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av forekomsten eller konsentrasjonen av det biomolekyl som er gjenstand for undersøkelse.

”Amyloid β, Aβ eller β-amyloid” er en anerkjent betegnelse og refererer seg til amyloide β-proteiner og -peptider, amyloid-β-forløperprotein (APP), så vel som modifikasjoner, fragmenter og eventuelle funksjonelle ekvivalenter. Særlig menes med amyloid β som her benyttet, ethvert fragment dannet ved proteolytisk spaltning av APP, men spesielt de fragmenter som er involvert i eller assosiert med, de amyloide sykdommer inklusivt, men ikke begrenset til, Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41, Aβ1-42 og Aβ1-43.

De strukturer og sekvenser av amyloide β-peptider som er nevnt ovenfor, er velkjent for fagmannen, og fremgangsmåter for fremstilling av nevnte peptider eller for ekstrahering av disse fra hjerne og annet vev er beskrevet for eksempel i Glenner & Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 885-890 (1984). Dessuten er amyloide β-peptider også kommersielt tilgjengelig i forskjellige former.

”Aβ fibrill” eller ”Aβ filament” eller ”amyloide fibriller” er polymere former av monomert protein som danner individuelle eller buntede fibere med konstant fiberdiameter, som er uløselige i vandig miljø og inneholder store mengder av en kryss-β-struktur i deres kjerne; for det meste med beta-tråder perpendikulært til fibrillaksen 1, 2, 3.

”Monomer Aβ” eller ”Aβ monomer” er fullstendig solubilisert amyloid βprotein uten aggregerte komplekser i vandig medium.

”Polymert løselig amyloid” og ”oligomert Aβ” og ”Aβ oligomer” refererer seg til flere aggregerte monomerer av amyloide peptider eller av amyloid-lignende peptider eller av modifiserte eller trunkerte amyloidpeptider eller av andre derivater av amyloide peptider som danner oligomere eller polymere strukturer som er løselige både in vitro i vandig medium og in vivo i pattedyrets eller menneskets kropp, nærmere bestemt i hjernen, men refererer seg særlig til flere aggregerte monomerer av amyloid β (Aβ) eller av modifiserte eller trunkerte amyloid β (Aβ) peptider eller av derivater derav, som er løselige i henholdsvis pattedyr- eller menneskekroppen, nærmere bestemt i hjernen.

Med ”isolert” menes et biologisk molekyl fritt fra i det minste noen av de komponenter som det naturlig opptrer sammen med.

Betegnelsene ”antistoff” eller ”antistoffer” er en anerkjent betegnelse og forstås å referere seg til molekyler eller aktive fragmenter av molekyler som binder til kjente antigener, særlig til immunglobulinmolekyler og til immunologisk aktive deler av immunglobulinmolekyler, dvs. molekyler som inneholder et bindningssete som immunspesifikt binder et antigen. Immunglobulinet i henhold til oppfinnelsen kan være av enhver type (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA og IgY) eller klasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 og IgA2) eller subklasser av immunglobulinmolekyler.

”Antistoffer” er innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse ment å inkludere monoklonale antistoffer, polyklonale, kimære enkeltkjedede bispesifikke eller bi-effektive simianiserte humane og humaniserte antistoffer, så vel som aktive fragmenter derav. Eksempler på aktive fragmenter av molekyler som binder til kjente antigener er Fab og F(ab’)2 fragmenter, inklusivt produktene av et Fab immunglobulin ekspresjonsbibliotek og epitop-bindende fragmenter av hvilke som helst av de antistoffer og fragmenter som er nevnt ovenfor.

Disse aktive fragmentene kan være avledet fra et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse gjennom en rekke teknikker. For eksempel kan rensede monoklonale antistoffer spaltes med et enzym, så som pepsin, og underkastes HPLC gelfiltrering. Den riktige fraksjon som inneholder Fab-fragmenter kan deretter oppsamles og konsentreres ved membranfiltrering og lignende. For videre beskrivelse av generelle teknikker for isolering av aktive antistoff-fragmenter, se for eksempel Khaw, B.A. et al. J. Nucl. Med.23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986.

Et ”humanisert antistoff” refererer seg til en type av manipulert antistoff som har dets CDR avledet fra et ikke-humant donor immunglobulin, hvor de øvrige immunglobulin-avledede deler av molekylet er fra ett (eller flere) humane immunglobuliner. Dessuten kan framework-støttede rester endres for å bibeholde bindingsaffinitet. Fremgangsmåter for å oppnå ”humaniserte antistoffer” er velkjent for fagmannen. Se f.eks. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)).

Et ”humanisert antistoff” kan også oppnås ved en ny genetisk manipuleringsmåte som muliggjør produksjon av affinitets-modnede humanlignende polyklonale antistoffer i store dyr som for eksempel kaniner (http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).

Betegnelsen ”monoklonalt antistoff” er også veletablert på området og refererer seg til et antistoff som er masseprodusert i laboratoriet fra en enkelt klon og som gjenkjenner kun ett antigen. Monoklonale antistoffer fremstilles typisk ved fusjonering av en normalt kortlivet, antistoffproduserende B-celle til en hurtigvoksende celle, så som en cancercelle (iblant omtalt som en ”udødelig” celle). Den resulterende hybridcelle eller hybridom, formerer seg hurtig og danner en klon som produserer store mengder av antistoffet.

I sammenheng med foreliggende oppfinnelse er ”monoklonalt antistoff” også å forstå å omfatte antistoffer som produseres av en moderklon som ikke enda har nådd full monoklonalitet.

”Funksjonelt likeverdig antistoff” er innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse ment å referere seg til et antistoff som i vesentlig grad deler minst én vesentlig funksjonell egenskap med et antistoff nevnt ovenfor og som her beskrevet, omfattende: bindingsspesifisitet for β-amyloidproteinet, særlig til Aβ1-42proteinet og mer spesielt til den 4-16 epitopiske region av Aβ1-42-proteinet, immunreaktivitet in vitro, inhibering av aggregasjon av Aβ1-42 -monomerene til høymolekylære polymere fibriller og/eller desaggregering av preformede Aβ1-42-polymere fibriller og/eller en β-platebrytende egenskap og lindring av virkningen av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller assosieres med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og lidelser assosiert med amyloid plakkdannelse, inklusivt sekundær amyloidose og aldersrelatert amyloidose så som sykdommer inklusivt, men ikke begrenset til, neurologiske lidelser som Alzheimers sykdom (AD), inklusivt sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type); Guam Parkinson demenskomplekset; så vel som andre sykdommer som er basert på eller assosiert med, amyloid-lignende proteiner så som progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose; Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose; endokrine tumorer og andre, inklusivt maculadegenerasjon, når administrert profylaktisk eller terapeutisk. Antistoffene kan være av enhver klasse så som IgG, IgM eller IgA, etc. eller enhver subklasse så som IgG1, IgG2a, etc. og andre subklasser nevnt ovenfor eller kjent på området, men særlig av IgG2 klassen. Dessuten kan antistoffene fremstilles etter en hvilken som helst metode så som fagdisplay, eller fremstilles i en organisme eller cellelinje, inklusivt bakterie-, insekt-, pattedyr- eller annen type celle eller cellelinje som produserer antistoffer med de ønskede egenskaper, så som et humanisert antistoff. Antistoffene kan også dannes ved å kombinere en Fab-del og en Fc-region fra ulike arter.

Betegnelsen ”bispesifikk” eller ”bifunksjonell” og ”bi-effektiv” benyttes i denne sammenheng synonymt for å karakterisere et antistoff som oppviser både en inhiberingsegenskap på amyloid eller amyloid-lignende fiberdannelse så vel som en desaggregeringsegenskap av amyloide eller amyloid-lignende fibere.

Betegnelsen ”antigen” refererer seg til en enhet eller et fragment derav som kan indusere en immunrespons i en organisme, særlig et dyr, nærmere bestemt et pattedyr, inklusivt et menneske. Betegnelsen inkluderer immunogener og regioner som er ansvarlige for antigeniteten eller for antigene determinanter.

I denne sammenheng betyr betegnelsen ”løselig” delvis eller fullstendig oppløst i en vandig løsning.

Dessuten refererer i denne sammenheng betegnelsen ”immunogen” seg til substanser som utløser eller forsterker produksjonen av antistoffer, T-celler og andre reaktive immunceller rettet mot et immunogent agens og som bidrar til en immunrespons i mennesker eller dyr.

En immunrespons inntrer når et individ produserer tilstrekkelige antistoffer, T-celler og andre reaktive immunceller mot administrerte immunogene blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse for å moderere eller lindre den lidelse som skal behandles.

”Polymert løselig amyloid” refererer seg til flere aggregerte monomerer av amyloide peptider eller av amyloid-lignende peptider eller av modifiserte eller trunkerte amyloide peptider eller av andre derivater av amyloide peptider som danner oligomere eller polymere strukturer som er løselig i pattedyrets eller menneskets kropp, nærmere bestemt i hjernen, men særlig refererer det seg til flere aggregerte monomerer av amyloid β (Aβ) eller av modifiserte eller trunkerte amyloide β (Aβ) peptider eller av derivater derav, som er løselig i pattedyr- eller menneskekroppen, nærmere bestemt i hjernen.

Betegnelsen ”hybridom” er kjent på området og forstås av fagmannen og refererer seg til en celle produsert ved en fusjon av en antistoffproduserende celle og en udødelig celle, f.eks. en multippel myelomcelle. Denne hybridcelle er i stand til å frembringe en kontinuerlig tilførsel av antistoff. Se definisjonen av ”monoklonalt antistoff” ovenfor og Eksemplene nedenfor angående en mer detaljert beskrivelse av fusjonsmetoden.

Betegnelsen ”bærer” betyr i denne sammenheng en struktur hvor antigent peptid eller en supramolekylær konstruksjon kan inkorporeres i eller assosieres med, og derved presentere eller eksponere antigene peptider eller del av peptidet til immunsystemet til et menneske eller dyr. Enhver partikkel som hensiktsmessig kan benyttes i dyre- eller humanterapi som for eksempel en vesikkel, en partikkel eller et partikulært legeme, kan benyttes som en bærer i forbindelse med foreliggende oppfinnelse.

Betegnelsen ”bærer” omfatter videre metoder for avlevering hvor supramolekylære antigene konstruksjonssammensetninger som omfatter det antigene peptid, kan transporteres til ønskede steder gjennom avleveringsmekanismer. Ett eksempel på et slikt avleveringssystem gjør bruk av kolloidale metaller så som kolloidalt gull.

Dessuten omfatter betegnelsen ”bærer” avleveringsmekanismer som er kjent for fagmannen og som omfatter, men ikke er begrenset til, KLH (keyhole limpet hemocyanin), bovint serumalbumin (BSA) og andre adjuvanser.

I den supramolekylære antigene konstruksjon som beskrevet heri, kan liposomet ha en dobbeltfunksjon ved at det kan benyttes som en bærer som omfatter den supramolekylære konstruksjon som ovenfor beskrevet før, og, samtidig virke som en adjuvans for å øke eller stimulere immunresponsen til det tilsiktede dyr eller menneske som skal behandles med den terapeutiske vaksine som beskrevet heri. Det er også underforstått at de supramolekylære antigene konstruksjonssammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse ytterligere kan omfatte andre adjuvanser som for eksempel lipid A, alum, kalsiumfosfat, interleukin 1 og/eller mikrokapsler av polysakkarider og proteiner, men særlig et detoksifisert lipid A, så som monofosforyl eller difosforyl lipid A eller alum, ytterligere konserveringsmidler, fortynningsmidler, emulgeringsmidler, stabilisatorer og andre komponenter som er kjent og benyttet i tidligere vaksiner. Ethvert annet system som er kjent på området kan dessuten benyttes i sammensetningen som beskrevet heri. Slike adjuvanser omfatter, men er ikke begrenset til, Freunds inkomplette adjuvans, Freunds komplette adjuvans, polydispergert β-(1,4)-koblet acetylert mannan (”Acemannan”), TITERMAX<® >(polyoksyetylen-polyoksypropylen-kopolymeradjuvanser fra CytRx Corporation), modifiserte lipidadjuvanser fra Chiron Corporation, saponin-derivatadjuvanser fra Cambridge Biotech, drepte Bordetella pertussis, lipopolysakkaridet (LPS) av gramnegative bakterier, store polymere anioner så som dekstransulfat og uorganiske gel så som alum, aluminiumhydroksyd eller aluminiumfosfat.

Bærerproteiner som kan benyttes i de supramolekylære antigenkonstruksjonssammensetningene som beskrevet heri omfatter, men er ikke begrenset til, maltosebindende protein ”MBP”; bovint serumalbumin ”BSA”; ”KLH” (keyhole limpet hemocyanin); ovalbumin; flagellin; tyroglubulin; serumalbumin av enhver art; gammaglobulin av enhver art; syngene celler; syngene celler som er bærer av Ia-antigener; og polymerer av D- og/eller L-aminosyrer.

Betegnelsen ”terapeutisk effektiv mengde” refererer seg til den mengde antistoff som når det administreres til et menneske eller dyr, utløser en immunrespons som er tilstrekkelig til å resultere i en terapeutisk effekt i nevnte menneske eller dyr. Den effektive mengden bestemmes lett av fagmannen ved å følge rutineprosedyrer.

”Homologi” mellom to sekvenser bestemmes ved sekvensidentitet. Dersom to sekvenser som skal sammenlignes med hverandre, adskiller seg i lengde, er sekvensidentitet fortrinnsvis relatert til den prosentdel av nukleotidrestene av den kortere sekvens som er identisk med nukleotidrestene av den lengre sekvens. Sekvensidentitet kan bestemmes konvensjonelt ved bruk av dataprogrammer så som Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Bestfit gjør bruk av den lokale homologi-algoritmen til Smith & Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489 for å finne det segment som har den høyeste sekvensidentitet mellom to sekvenser. Ved bruk av Bestfit eller annet sekvenssammenligningsoppstillingsprogram for å bestemme hvorvidt en bestemt sekvens for eksempel har 95% identitet med en referansesekvens ifølge foreliggende oppfinnelse, justeres parametrene fortrinnsvis slik at prosentandelens identitet beregnes over hele lengden av referansesekvensen og at homologiåpninger på opp til 5% av det totale antall nukleotider i referansesekvensen tillates. Ved bruk av Bestfit blir de såkalte eventuelle parametrene fortrinnsvis stående i deres forhåndsinnstilte (”default”) verdier. De avvik som fremkommer ved sammenligningen mellom en gitt sekvens og de ovenfor beskrevne sekvenser ifølge oppfinnelsen kan forårsakes for eksempel ved addisjon, delesjon, substitusjon, insersjon eller rekombinasjon. En slik sekvenssammenligning kan fortrinnsvis også foretas med programmet ”fasta20u66” (versjon 2.0u66, September 1998 av William R. Pearson and the University of Virginia; se også W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, tilføyde eksempler og http://workbench.sdsc.edu/). For dette formål kan ”default” parameterinnstillingene benyttes.

Betegnelsen ”hybridisere” refererer seg i denne sammenheng til konvensjonelle hybridiseringsbetingelser, fortrinnsvis til hybridiseringsbetingelser hvor 5xSSPE, 1% SDS, 1xDenhardts løsning benyttes som en løsning, og/eller hybridiseringstemperaturer er mellom 35°C og 70°C, fortrinnsvis 65°C. Etter hybridisering foretas vask fortrinnsvis først med 2xSSC, 1% SDS og deretter med 0,2xSSC ved temperaturer mellom 35°C og 70°C, fortrinnsvis ved 65°C (angående definisjonen av SSPE, SSC og Denhardts løsning, se Sambrook et al. loc. cit.). Stringente hybridiseringsbetingelser som for eksempel beskrevet i Sambrook et al., supra, er særlig å foretrekke. Særlig foretrukne stringente hybridiseringsbetingelser foreligger for eksempel dersom hybridisering og vasking skjer ved 65°C som angitt ovenfor. Ikke-stringente hybridiseringsbetingelser, for eksempel med hybridisering og vasking ved 45°C er mindre foretrukket og ved 35°C enda mindre.

Foreliggende oppfinnelse kan lettere forstås ved referanse til den følgende detaljerte beskrivelse av her inkluderte spesifikke utførelsesformer. Selv om foreliggende oppfinnelse har vært beskrevet med referanse til spesifikke detaljer av visse utførelsesformer, er det ikke ment at slike detaljer skal anses som begrensninger av oppfinnelsens ramme.

Også beskrevet heri er antistoffer og funksjonelle deler derav, som er konformasjonelt sensitive antistoffer. Disse antistoffene gjenkjenner spesifikke epitoper på et bredt utvalg av amyloide proteinaktige antigener. Antistoffene er anvendelige for diagnostisk og terapeutisk intervensjon ved sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med, amyloid eller amyloid-lignende proteiner, inklusivt amyloidose, en gruppe av sykdommer og lidelser assosiert med amyloid eller amyloid-lignende protein så som Aβ-proteinet involvert i Alzheimers sykdom.

De antistoffer som her er tilveiebrakt er monoklonale eller polyklonale antistoffer som har bindingsspesifisitet for antigene peptider representative for forskjellige lidelser som er assosiert med amyloidprotein som for eksempel Alzheimers sykdom.

Antistoffene som beskrevet heri fremstilles ved å immunisere et dyr, som f.eks. en mus, rotte, kanin eller en hvilken som helst annen dyreart som kan produsere native eller humane antistoffer med en supramolekylær antigen konstruksjonssammensetning.

Den supramolekylære antigenkonstruksjon som her er angitt omfatter i alminnelighet peptider modifisert for å forsterke antigen effekt, hvor slike peptider modifiseres via pegylering (ved bruk av polyetylenglykol eller modifisert polyetylenglykol), eller modifisert via andre metoder så som med palmitinsyre, polyaminosyrer (f.eks. poly-glysin, poly-histidin), polysakkarider (f.eks. polygalakturonsyre, polymelkesyre, polyglykolid, kitin, kitosan), syntetiske polymerer (polyamider, polyuretaner, polyestere) eller kopolymerer (f.eks. poly(metakrylsyre) og N-(2-hydroksy)-propyl-metakrylamid) og lignende.

Modifikasjon med palmitinsyre (palmitoylering) samtidig som det tilveiebringes en forankring for peptidet i liposom-dobbeltlaget som følge av den relativt reduserte lengde av C16:0 fettsyredelen, fører til at peptidet praktisk talt ligger på liposomoverflaten. Cellene som prosesserer antigenet vil derfor måtte ta opp hele liposomet med peptidet, hvilket i de aller fleste tilfeller resulterer i en relativt langsom immunrespons.

Videre beskrevet heri benyttes et modifisert amyloid 1-15-peptid ved fremstillingen av et antistoff, særlig et monoklonalt antistoff som beskrevet heri. Det modifiserte amyloide 1-15-peptid kan syntetiseres ved å følge fremgangsmåten angitt i Nicolau et. al.2002. Den tilnærming som er rapportert i Nicolau et al., innebærer modifisering av det antigene peptid med en poding på harpiks av en lipofil eller hydrofob del, til de terminale aminosyrerestene av et preformet peptid som resulterer i et produkt av betydelig høy renhet. Særlig knyttes en beskyttet aminosyre, særlig en Fmoc-beskyttet aminosyre, til en harpiks ved å benytte kjent koblingskjemi. Beskyttelsesgruppen fjernes og en andre beskyttet aminosyrerest tilkobles. Standard automatisert peptidsyntese ved bruk av kjent beskyttelseskjemi, særlig Fmoc/tBu-kjemi, og standard sidekjedebeskyttende grupper benyttes deretter for å syntetisere Aβ1-15-antigenpeptidet ved å koble til aminosyrene 1 til 15 av amyloidprotein Aβ1-42 for å fremstille peptidfragmentet med en sekvens angitt i SEKV.ID.NR:1. I et avsluttende trinn kobles to ytterligere beskyttede aminosyrer til det voksende peptidfragment. Mtt-gruppene kan deretter selektivt avspaltes og kobles til palmitinsyre. Etter vask av harpiksen fjernes beskyttelsesgruppen og harpiksen fraspaltes samtidig, etterfulgt av sidekjede-avspaltninger ved bruk av standardmetodikk. Det endelige produkt kan deretter oppnås i høy renhet og identiteten av dette bekreftes ved hjelp av kjent metodikk, som for eksempel elektrospray-massespektrometri.

Den lipofile eller hydrofobe del som beskrevet heri kan være en fettsyre, et triglyserid eller et fosfolipid, hvor fettsyre-karbonskjelettet har minst 10 karbonatomer. Særlig er den lipofile eller hydrofobe del en fettsyre med et karbonskjelett på minst ca.14 karbonatomer og opptil ca.24 karbonatomer, hvor hvert enkelt karbonatomnummer som faller innen dette området også utgjør del av beskrivelsen. Nærmere bestemt har den lipofile eller hydrofobe del et karbonskjelett på minst 14 karbonatomer. Eksempler på hydrofobe deler omfatter, men er ikke begrenset til, palmitinsyre, stearinsyre, myristinsyre, laurinsyre, oljesyre, linolsyre, linolensyre og kolesterol eller DSPE. Den lipofile eller hydrofobe del er palmitinsyre.

For å forsterke immunresponsen, kan en annen forankring/spacer hensiktsmessig anbringes for å gjenopprette peptidet i liposomet, f.eks. polyetylenglykol (PEG).

PEG festes kovalent til en aminosyrerest bundet i begge ender av peptidet, særlig Glu-, Cys- eller Lys-aminosyrerester eller en hvilken som helst annen aminosyrerest som hensiktsmessig kan benyttes for kovalent å binde PEG til peptidet. I den andre enden av kjeden kan en hydrofob del bindes kovalent for å virke som forankringselementet i liposom-dobbeltlaget, som for eksempel fosfatidyl-etanolamin (PEA). Liposomet virker derfor fremdeles som en adjuvans, og det peptid som er tilstrekkelig langt fra dobbeltlaget kan prosesseres alene og øker derved dets immunogenitet sammenlignet med det palmitoylerte antigen.

I enkelte aspekter omfatter de beskrevne supramolekylære antigenkonstruksjonene en peptidsekvens, kovalent bundet til pegylert lysin, én i hver ende. Lengden av PEG- (polyetylenglykol) kjeden kan variere fra n = 8 til n = 150.000 eller mer, særlig fra n = 10 til n = 80.000, mer spesielt fra n = 20 til n = 10.000. I et spesifikt aspekt er lengden av PEG-kjeden ikke mer enn n = 45, særlig mellom n = 5 og n = 40, mer spesielt mellom n = 10 og n = 30 og enda mer spesielt n = 10.

De her beskrevne supramolekylære konstruksjonene kan syntetiseres ved å benytte automatisert peptidsyntese og kjent beskyttelseskjemi, særlig Fmoc/tBukjemi og standard sidekjede-beskyttende grupper. Typisk resulterer pegylering av peptider i blandinger av regioisomerer.

For å oppnå en stedsspesifikk tilkobling av et PEG-lipidkonjugat både til C-og N-enden av Aβ kan det benyttes partielt beskyttede peptider. For de peptidsekvenser som inneholder interne Lys- eller His-rester, tilsettes en ortogonalt beskyttet Lys(ivDde) til hver ende. Et ytterligere Gly kan tilsettes til den C-terminale ende for å lette syntesen. Beskyttelsesgruppen fjernes og N-acetyleres ved å bruke eddiksyreanhydrid etterfulgt av selektiv spaltning av ivDde-gruppene.

En harpiks, særlig en 2-klortritylharpiks, er å foretrekke fordi denne er syrefølsom og således muliggjør isoleringen av beskyttede peptider.

I et spesifikt aspekt foretas koblingsreaksjonen i løsningsfasen. Selektiv spaltning fra harpiksen under milde betingelser frigjør deretter de internt beskyttede peptidene.

Koblinger i løsningsfase ble med hell oppnådd med peptidene avledet fra en β-amyloid proteinsekvens som for eksempel et Aβ1-16 (SEKV.ID.NR:2) til et PEG-molekyl modifisert med en fettsyre – fosfatidylkolin som for eksempel DSPE. Separasjon av de mono- og dikoblede produktene før avbeskyttelsen av den endelige sidekjede, kan oppnås ved å benytte kationbytterkromatografi.

Påfølgende avbeskyttelser av peptid-sidekjeden fører til isolering av de ønskede konjugater med akseptabel renhet. Rensing kan oppnås etter velkjente metoder som for eksempel HPLC, etc.

Denne tilnærming til syntesen av N- og C-terminale lipid-PEG-β-amyloide antigener ved bruk av beskyttede peptider er anvendbar for et bredt utvalg av peptidsekvenser.

Liposomale antigener som beskrevet heri kan deretter fremstilles som beskrevet i Nicolau et al., 2002. Det modifiserte amyloide Aβ-antigenpeptid, særlig det modifiserte PEG- og palmitoylerte Aβ1-15, Aβ1-16, Aβ1-16(∆14), Aβ22-35 og Aβ29-40 antigenpeptid, kan rekonstitueres i en konstruksjon bestående av liposomer, særlig liposomer fremstilt av dimyristoyl-fosfatidylkolin (DMPC), dimyristoylfosfatidyletanolamin (DMPEA), dimyristoyl-fosfatidylglyserol (DMPG) og kolesterol, eventuelt inneholdende monofosforyl lipid A.

I et spesifikt aspekt benyttes liposomer med lipid A som adjuvans for å fremstille anti-amyloidvaksinen. Dimyristoyl-fosfatidylkolin-glyserol og kolesterol blandes, særlig i et molforhold på 0,9:1,0:0,7. En sterk immunmodulator som for eksempel monofosforyllipid A tilsettes deretter i en passende konsentrasjon, særlig i en konsentrasjon på mellom 30 og 50 mg per mmol, mer spesielt 40 mg per mmol fosfolipider. Det modifiserte antigene Aβ-peptid tilsettes deretter i et molforhold mellom peptid og fosfolipider på mellom 1:30 og 1:200, særlig et molforhold på mellom 1:50 og 1:120, mer spesielt 1:100. Løsningsmidler fjernes, for eksempel ved fordampning, og den resulterende film hydratiseres med steril bufferløsning som for eksempel PBS.

Liposomer kan også fremstilles ved ”crossflow” injeksjonsteknikk som beskrevet for eksempel i Wagner et al. (2002) Journal of Liposome Research Bd.12(3), s.259-270. Under injeksjonen av lipidløsninger i et vandig buffersystem har lipider tendens til å danne ”bunnfall”, etterfulgt av et eget arrangement i vesikler. Den oppnådde vesikkelstørrelse avhenger av slike faktorer som lipidkonsentrasjon, omrøringshastighet, injeksjonshastighet og lipidvalget. Fremstilingssystemet kan bestå av en ”crossflow” injeksjonsmodul, beholdere for den polare fase (f.eks. en PBS bufferløsning), en beholder for etanol/lipidløsning og en trykkanordning, særlig en nitrogen-trykkanordning. Mens den vandige eller polare løsning pumpes gjennom ”crossflow” injeksjonsmodulen injiseres etanol/lipidløsningen inn i den polare fase ved påføring av varierende trykk.

Liposomet virker fremdeles som en adjuvans og det peptid som er tilstrekkelig langt fra dobbeltlaget kan prosesseres alene, og øker således immunogeniteten sammenlignet med det palmitoylerte antigen.

Den frie PEG-enden kobles kovalent til et molekyl av fosfatidyletanolamin (hvor fettsyren kan være: myristinsyre, palmitinsyre, stearinsyre, oljesyre, etc. eller en kombinasjon derav) for å virke som forankringselementet. Denne supramolekylære struktur kan forankres ved rekonstituering i liposomer bestående av fosfolipider og kolesterol (fosfatidyletanolamin, fosfatidylglyserol, kolesterol i ulike molforhold). Andre fosfolipider kan benyttes. Lipid A benyttes i en konsentrasjon på ca.40 µg/pmol fosfolipider.

I enkelte aspekter omfatter de palmitoylerte eller pegylerte supramolekylære antigenkonstruksjonene et peptid som har aminosyresekvensen til βamyloid. Peptidene kan også omfatte eller tilsvare hele amyloid beta-peptidet og aktive fragmenter derav. Dessuten kan peptider ytterligere omfatte Aβ1-16 (SEKV.ID.NR:2); Aβ1-16(∆14); (SEKV.ID.NR:3); Aβ1-15 (SEKV.ID.NR:1); og aktive fragmenter derav.

For å utløse og fremstille antistoffer og for å bestemme immunogeniteten av den modifiserte Aβ-antigenstruktur velges et egnet dyr innen gruppen bestående av mus, rotter, kaniner, svin, fugler, etc., men særlig mus, spesielt C57BL/6 mus som immuniseres med det antigene peptid. Immunogeniteten av den antigene konstruksjon bestemmes ved undersøkelse av serumprøver i passende tidsintervaller etter immunisering ved bruk av immunoassay som for eksempel en ELISA bestemmelse.

De monoklonale antistoffene som beskrevet heri kan fremstilles ved å benytte klassiske klonings- og cellefusjonsteknikker som er velkjent på området. Immunogenet (antigenet) av interesse administreres typisk (f.eks. intraperitoneal injeksjon) til villtype eller innavlede mus (f.eks. BALB/c eller spesielt C57BL/6-mus), rotter, kaniner eller andre dyrearter eller transgene mus som kan produsere native eller humane antistoffer. Immunogenet kan administreres alene eller blandes med adjuvans eller uttrykkes fra en vektor (VEE replicon vector, vaccinia) eller som DNA eller som et fusjonsprotein for å indusere en immunrespons.

Fusjonsproteiner omfatter det peptid som en immunrespons ønskes mot, koblet til bærerproteiner som for eksempel beta-galaktosidase, glutation-S-transferase, KLH (keyhole limpet hemocyanin) og bovint serumalbumin. I disse tilfellene tjener peptidene som haptener med bærerproteinene. Etter at dyret er gitt en boosterdose, for eksempel to eller flere ganger, høstes miltceller fra de immuniserte dyrene og hybridomer utviklet ved fusjonering av sensibiliserte miltceller med en myelomcellelinje, så som murine SP2/O myelomceller (ATCC, Manassas, VA) ved å benytte de velkjente prosesser til Kohler & Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)) og Harlow & Lane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988)).

I et spesifikt aspekt administreres den antigene konstruksjon som beskrevet heri, særlig en vaksinesammensetning som omfatter nevnte antigenkonstruksjon i en farmasøytisk akseptabel form, i gjentatte doser, særlig i 1 til 15 doser, mer spesielt i 2 til 10 doser, enda mer spesielt 3 til 7 doser, spesielt i 4 til 6 doser i tidsintervaller på mellom 1 og 10 uker, særlig i tidsintervaller på mellom 1 og 6 uker, mer spesielt i tidsintervaller på mellom 1 og 4 uker og enda mer spesielt i tidsintervaller på mellom 2 og 3 uker. Immunresponsen overvåkes ved å ta serumprøver til et passende tidspunkt etter boosterinjeksjon, særlig 3 til 10 dager etter boosterinjeksjon, mer spesielt 4 til 8 dager etter boosterinjeksjon og mer spesielt 5 til 6 dager etter boosterinjeksjon, og bestemmelse av immunogeniteten av den antigene konstruksjon ved å benytte kjent metodikk, særlig én av de vanlig anvendte immunoassays som for eksempel en ELISA bestemmelse.

Immunisering med den antigene konstruksjon som beskrevet heri, men særlig med en vaksinesammensetning som omfatter den antigene konstruksjon som beskrevet heri i en farmasøytisk akseptabel form, fører til en betydelig immunrespons i det behandlede dyr. Dyr, spesielt mus med terapeutiske titere, velges for en fusjon av antistoff-produserende celler, særlig B-lymfocytter med en kontinuerlig voksende eller udødelig cellelinje, så som en myelomcellelinje.

Cellene induseres til å fusjonere ved tilsetningen av polyetylenglykol. Terapeutiske titere er de som ved en ELISA bestemmelse gir et positivt resultat i en fortynning på mellom 1:4000 og 1:6000, særlig på mellom 1:4500 og 1:5500, nærmere bestemt 1:5000.

De resulterende hybridcellene klones deretter på konvensjonell måte, f.eks. ved å benytte begrensende fortynning, hvorpå de resulterende kloner som produserer de ønskede monoklonale antistoffer, dyrkes.

De således oppnådde hybridomer selekteres kjemisk ved å utplate cellene i et seleksjonsmedium inneholdende hypoksantin, aminopterin og tymidin (HAT).

Hybridomer underkastes deretter screening med henblikk på evnen til å produsere monoklonale antistoffer mot spesifikke amyloid-assosierte sykdommer eller lidelser. Hybridomproduserende antistoffer av interesse klones, ekspanderes og oppbevares nedfryst for fremtidig produksjon. De foretrukne hybridomer produserer et monoklonalt antistoff som har IgG-isotype, mer foretrukket IgG2-isotypen.

Det polyklonale antistoff fremstilles ved å immunisere dyr, så som mus eller kaniner, eller et annet egnet dyr, med supramolekylære antigenkonstruksjonssammensetninger som beskrevet heri. Blodserum uttas deretter fra dyrene og antistoffer i serumet underkastes screening med henblikk på bindingsreaktivitet mot det amyloide antigen.

Antistoffene som beskrevet heri kan fremstilles i en fysiologisk akseptabel formulering og kan omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel og/eller hjelpestoffer ved å benytte kjente teknikker. For eksempel kombineres antistoffet som ovenfor beskrevet, inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, særlig det monoklonale antistoff inklusivt et eventuelt funksjonelt likeverdig antistoff eller funksjonelle deler derav, med en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel og/eller hjelpestoff for å danne en terapeutisk sammensetning. Egnede farmasøytiske bærere, fortynningsmidler og/eller hjelpestoffer er velkjent på området og omfatter for eksempel fosfatbuffrede saltløsninger, vann, emulsjoner så som olje/vann-emulsjoner, forskjellige typer fuktemidler, sterile løsninger, etc.

Formulering av den farmasøytiske blanding som beskrevet heri kan skje i henhold til standardmetodikk kjent for fagmannen.

Sammensetningene som beskrevet heri kan administreres til et individ i form av et faststoff, en væske eller aerosol i en passende farmasøytisk effektiv dose. Eksempler på faste sammensetninger er piller, kremer og implanterbare doseringsenheter. Piller kan administreres peroralt. Terapeutiske kremer kan administreres topisk. Implanterbare doseringsenheter kan administreres lokalt, for eksempel ved et tumorsete, eller kan implanteres for systemisk frigjøring av den terapeutiske sammensetning, for eksempel subkutant. Eksempler på flytende sammensetninger er formuleringer tilpasset intramuskulær, subkutan, intravenøs, intraarteriell injeksjon og formuleringer for topisk og intraokulær administrering. Eksempler på aerosolformuleringer er inhalator-formulering for administrering til lungene.

Sammensetningene kan administreres på vanlige administrasjonsmåter. Generelt kan sammensetningen administreres topisk, peroralt, rektalt, nasalt, interdermalt, intraperitonealt eller parenteralt (for eksempel intravenøst, subkutant eller intramuskulært). Dessuten kan sammensetningen inkorporeres i matrikser med vedvarende frigjøring, så som bionedbrytbare polymerer, hvor polymerene implanteres i nærheten av det sted hvor avleveringen ønskes, for eksempel ved tumorsetet. Metoden inkluderer administrering av en enkelt dose, administrering av gjentatte doser til fastsatte tidsintervaller og vedvarende administrering for en fastlagt tidsperiode.

En matriks med vedvarende frigjøring er i denne sammenheng en matriks fremstilt av materialer, vanligvis polymerer, som er nedbrytbare ved enzymatisk eller syre/base-hydrolyse eller ved oppløsning. Straks den er innført i kroppen utsettes matriksen for enzymer og kroppsvæsker. Matriksen med vedvarende frigjøring velges hensiktsmessig blant bioforlikelige materialer så som liposomer, polylaktider (polymelkesyre), polyglykolid (polymer av glykolsyre), polylaktidkoglykolid (kopolymerer av melkesyre og glykolsyre), polyanhydrider, poly(orto)-estere, polypeptider, hyaluronsyre, kollagen, kondroitinsulfat, karboksylsyrer, fettsyrer, fosfolipider, polysakkarider, nukleinsyrer, polyaminosyrer, aminosyrer som fenylalanin, tyrosin, isoleucin, polynukleotider, polyvinylpropylen, polyvinylpyrrolidon og silikon. En foretrukket bionedbrytbar matriks er en matriks av én av følgende: polylaktid, polyglykolid eller polylaktid-koglykolid (kopolymerer av melkesyre og glykolsyre).

Det er velkjent for fagmannen på angjeldende område at doseringen av blandingen vil avhenge av forskjellige faktorer som for eksempel den tilstand som skal behandles, den bestemte sammensetning som benyttes og andre kliniske faktorer, så som pasientens vekt, størrelse, kjønn og generelle helsetilstand, kroppsoverflate, den bestemte forbindelse eller sammensetning som administreres, andre medikamenter som administreres samtidig og administrasjonsmåten.

Sammensetningen kan administreres i kombinasjon med andre sammensetninger som omfatter et biologisk virkestoff eller forbindelse, særlig minst én forbindelse valgt fra gruppen bestående av forbindelser mot oksydativt stress, antiapoptotiske forbindelser, metall-chelaterende midler, inhibitorer av DNA-reparasjon, så som pirenzepin og metabolitter, 3-amino-1-propansulfonsyre (3APS), 1,3-propandisulfonat (1,3PDS), sekretaseaktivatorer, β- og γ-sekretaseinhibitorer, tau-proteiner, neurotransmittere, β-platebrytere, antiinflammatoriske molekyler, ”atypiske antipsykotika” så som for eksempel clozapin, ziprasidon, risperidon, aripiprazol eller olanzapin eller kolinesterase-inhibitorer (ChEl) så som tacrin, rivastigmin, donepezil og/eller galantamin, og andre medikamenter og næringssupplementer som for eksempel vitamin B12, cystein, en acetylkolinforløper, lecitin, kolin, Ginko biloba, acetyl-L-karnitin, idebenon, propentofyllin eller et xantinderivat, sammen med et antistoff som beskrevet heri og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff, og fremgangsmåter for behandling av sykdommer.

Proteinaktig farmasøytisk virkestoff kan inngå i mengder mellom 1 ng og10 mg per dose. I alminnelighet bør administrasjonsregimet være i området fra mellom 0,1 µg og 10 mg av antistoffet som beskrevet heri, særlig i området 1,0 µg til 1,0 mg, og mer spesielt i et område mellom 1,0 µg og 100 µg, hvor alle tall som faller innenfor disse områdene også utgjør del av oppfinnelsen. Dersom administreringen skjer gjennom kontinuerlig infusjon kan en riktigere dosering være i området mellom 0,01 µg og 10 mg enheter per kilo kroppsvekt per time, hvor alle tall som faller innenfor disse områder også utgjør del av beskrivelsen.

Administrering vil i alminnelighet skje parenteralt, f.eks. intravenøst.

Tilberedninger for parenteral administrering inkluderer sterile vandige eller ikkevandige løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Ikke-vandige løsningsmidler omfatter, uten å være begrenset til dette, propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilsk olje så som olivenolje, og injiserbare organiske estere som f.eks. etyloleat. Vandige løsningsmidler kan velges innen gruppen bestående av vann, alkohol/vandige løsninger, emulsjoner eller suspensjoner inklusivt saltvann og bufferholdige medier. Parenterale bærere omfatter natriumkloridløsning, Ringers dekstrose, dekstrose og natirumklorid, laktatholdige Ringerløsninger eller ikkeflyktige oljer. Intravenøse bærere inkluderer væske- og næringssupplementer, elektrolytt-supplementer (som de basert på Ringers dekstrose) og andre.

Konserveringsmidler som for eksempel antimikrobemidler, antioksydanter, chelateringsmidler, inerte gasser, etc. kan også inngå.

Den farmasøytiske sammensetningen kan videre omfatte proteinaktige bærere som for eksempel serumalbumin eller immunoglobulin, særlig av human opprinnelse. Andre biologisk aktive midler kan inngå i den farmasøytiske blandingen ifølge oppfinnelsen avhengig av dens tiltenkte anvendelse.

I et ytterligere aspekt beskrives fremgangsmåter og sett for påvisning og diagnostisering av amyloid-assosierte sykdommer eller tilstander, for diagnostisering av en predisponering for en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand eller for overvåkning av minimalt gjenværende sykdom hos en pasient eller for å forutsi en pasients respons på en behandling med et antistoff eller en vaksineblanding som ovenfor beskrevet. Disse metodene innbefatter kjente immunologiske metoder som vanligvis benyttes for påvisning eller kvantifisering av substanser i biologiske prøver eller ved en in situ tilstand.

Diagnostisering av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand eller av en predisponering for en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand hos en pasient kan oppnås ved å påvise den immunspesifikke binding av et monoklonalt antistoff eller et aktivt fragment derav, overfor en epitop av amyloidproteinet i en prøve eller in situ, hvilket inkluderer det å bringe prøven eller en bestemt kroppsdel eller kroppsområde mistenkt for å inneholde det amyloide antigen, i kontakt med et antistoff som binder en epitop av amyloidproteinet, hvorved antistoffet kan binde til det amyloide antigen for å danne et immunologisk kompleks, påvisning av dannelsen av det immunologiske kompleks og korrelere nærvær eller fravær av det immunologiske kompleks med nærvær eller fravær av amyloidantigen i prøven eller den bestemte kroppsdel eller område, eventuelt under sammenligning av mengden av nevnte immunologiske kompleks med en normal kontrollverdi, hvor en økning i mengden av nevnte aggregat sammenlignet med en normal kontrollverdi indikerer at pasienten lider av eller risikerer utvikling av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand.

Overvåkning av minimalt gjenværende sykdom hos en pasient etter behandling med et antistoff eller en vaksinesammensetning som beskrevet heri kan oppnås ved å påvise den immunspesifikke binding av et monoklonalt antistoff eller et aktivt fragment derav, til en epitop av amyloidproteinet i en prøve eller in situ, som inkluderer det å bringe prøven eller en bestemt kroppsdel eller kroppsområde mistenkt for å inneholde det amyloide antigen, i kontakt med et antistoff som binder en epitop av amyloidproteinet, slik at antistoffet kan binde til det amyloide antigen for å danne et immunologisk kompleks, påvisning av dannelsen av det immunologiske kompleks og korrelering av nærværet eller fraværet av det immunologiske kompleks med nærvær eller fravær av amyloidantigen i prøven eller den bestemte kroppsdel eller område, eventuelt under sammenligning av mengden av nevnte immunologiske kompleks med en normal kontrollverdi, hvor en økning i mengden av nevnte aggregat sammenlignet med en normal kontrollverdi indikerer at pasienten fremdeles kan lide av en minimalt gjenværende sykdom.

Forutsigelse av en pasients respons på en behandling med en vaksinesammensetning som beskrevet heri kan oppnås ved å påvise den immunspesifikke binding av et monoklonalt antistoff, eller et aktivt fragment derav, til en epitop av det amyloide protein i en prøve eller in situ, hvilket innebærer det å bringe prøven eller en spesifikk kroppsdel eller kroppsområde mistenkt for å inneholde amyloidantigen, i kontakt med et antistoff som binder en epitop av amyloidproteinet, la antistoffet binde til det amyloide antigen for å danne et immunologisk kompleks, påvise dannelsen av det immunologiske kompleks og korrelere nærvær eller fravær av det immunologiske kompleks med nærvær eller fravær av amyloidantigen i prøven eller spesifikke kroppsdel eller område, eventuelt sammenligne mengden av nevnte immunologiske kompleks før og etter påbegynt behandling, hvor en nedgang i mengden av nevnte aggregat indikerer at pasienten har et høyt potensiale for å respondere på behandlingen.

Biologiske prøver som kan benyttes ved diagnostisering av en amyloidassosiert sykdom eller tilstand, for diagnostisering av en predisponering for en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand eller for overvåkning av minimalt gjenværende sykdom hos en pasient eller for å forutsi en pasients respons på en behandling med et antistoff eller en vaksinesammensetning som beskrevet heri og som ovenfor beskrevet, er for eksempel væsker som serum, plasma, saliva, gastriske sekresjoner, slim, cerebrospinal væske, lymfevæske og lignende eller vev- eller celleprøver tatt fra en organisme, så som nervevev, hjerne, kardialt eller vaskulært vev. For bestemmelse av eller fravær av det amyloide antigen i en prøve, kan enhver immunoassay kjent for fagmannen (se Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612)) benyttes, for eksempel tester som gjør bruk av indirekte påvisningsmetoder ved bruk av sekundære påvisningsreagenser, ELISA og immunpresipitasjon og agglutineringstester. En detaljert beskrivelse av disse testene er for eksempel angitt i WO96/13590 til Maertens & Stuyver, Zrein et al. (1988) og WO96/29605.

For in situ diagnose, kan antistoffet eller en aktiv og funksjonell del derav administreres til organismen som skal diagnostiseres, etter fremgangsmåter kjent på området, som for eksempel intravenøs, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intraarteriell injeksjon slik at en spesifikk binding mellom antistoffet som beskrevet heri med en epitopisk region på det amyloide antigen kan skje.

Antistoff/antigenkomplekset kan påvises gjennom en merking koblet til antistoffet eller et funksjonelt fragment derav.

De immunoassays som benyttes for diagnostiske anvendelser eller anvendelser for diagnostisering av en predisponering for en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand eller for overvåkning av minimalt gjenværende sykdom i en pasient eller for forutsigelse av en pasients respons på en behandling med et antistoff eller en vaksinesammensetning ifølge oppfinnelsen, og som beskrevet ovenfor, er i alminnelighet basert på merkede antigener, antistoffer eller sekundære påvisningsreagenser. Disse proteinene eller reagensene kan merkes med forbindelser som i alminnelighet er kjent for fagmannen på området, inklusivt enzymer, radioisotoper og fluorescerende, luminiserende og kromogene substanser, inklusivt fargede partikler, så som kolloidalt gull og latekskuler. Av disse kan radioaktiv merking benyttes for nesten alle typer tester og med de fleste variasjoner. Enzymkonjugerte merkinger er særlig anvendelige når radioaktivitet må unngås eller nå det trengs hurtige resultater. Fluorokromer gir selv om anvendelsen av disse fordrer kostbart utstyr, en meget følsom deteksjonsmetode. Antistoffer som er anvendelige i disse testene omfatter monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer og affinitetsrensede polyklonale antistoffer.

Alternativt kan antistoffet merkes indirekte ved omsetning med merkede substanser som har en affinitet for immunglobulin, så som protein A eller G eller andre antistoffer. Antistoffet kan konjugeres med en andre substans og påvises med en merket tredje substans som har en affinitet for den andre substan konjugert til antistoffet. For eksempel kan antistoffet konjugeres til biotin og antistoff-biotinkonjugatet påvises ved å benytte merket avidin eller streptavidin. Likeledes kan antistoffet konjugeres til et hapten og antistoff-haptenkonjugatet påvises ved å benytte merket anti-hapten antistoff.

Fagmannen på området vil kjenne til disse og andre egnede merkinger som kan benyttes i overensstemmelse med beskrivelsen. Bindingen av disse merkinger til antistoffer eller fragmenter derav, kan oppnås ved å benytte standardteknikker som er alminnelig kjent for fagmannen. Typiske teknikker er beskrevet av Kennedy, J.H. et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31) og Schurs, A. H. W. M., et al.

1977 (Clin. Chim. Acta 81:1-40). Koblingsteknikker nevnt i sistnevnte er glutaraldehydmetoden, periodatmetoden, dimaleimidmetoden og andre.

Dagens immunoassay gjør bruk av en dobbelt antistoffmetode for påvisning av nærværet av en analytt, hvor antistoffet merkes indirekte ved reaktivitet med et andre antistoff som er blitt merket med en påvisbar merking. Det andre antistoff er fortrinnsvis et som binder til antistoffer av det dyr som det monoklonale antistoff skriver seg fra. Dersom det monoklonale antistoff er et museantistoff er med andre ord det merkede andre antistoff et antimus antistoff. For det monoklonale antistoff som skal benyttes i testen beskrevet nedenfor er denne merking fortrinnsvis en antistoffdekket kule, fortrinnsvis en magnetisk kule. For det polyklonale antistoff som skal benyttes i den her beskrevne immunoassay, er merkingen fortrinnsvis et påvisbart molekyl, som f.eks. en radioaktiv, fluorescerende eller elektrokjemiluminiserende substans.

Et alternativt dobbelt antistoffsystem som ofte omtales som hurtigformatsystemer fordi de er egnet til hurtige bestemmelser av nærværet av en analytt, kan også benyttes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. Systemet fordrer høy affinitet mellom antistoffet og analytten. I henhold til et aspekt bestemmes nærværet av amyloidantigenet ved å benytte et antistoff-par, som hver er spesifikt for amyloidantigen. Ett av nevnte antistoff-par omtales her som et ”detektor antistoff” og det andre av nevnte antistoff-par omtales her som et ”oppfangende antistoff”. Det monoklonale antistoff som beskrevet heri kan benyttes som enten et oppfangende antistoff eller et detektorantistoff. Det monoklonale antistoff som beskrevet heri kan også benyttes som både oppfangende og detektorantistoff sammen i en enkelt bestemmelse. Et aspekt gjør således bruk av dobbelt antistoff (sandwich-metoden) for påvisning av amyloidantigen i en prøve av biologisk væske. I denne metode anbringes analytten (amyloidantigen) mellom detektorantistoffet og det oppfangende antistoff, hvor det oppfangende antistoff irreversibelt immobiliseres på en fast bærer. Detektorantistoffet må inneholde en påvisbar merking for å identifisere nærværet av denne antistoff-analytt-sandwich og derved nærværet av analytten.

Eksempler på fastfasesubstanser omfatter, men er ikke begrenset til, mikrotiterplater, reagensrør av polystyren, magnetiske plast- eller glasskuler og objektglass som er velkjent innen området radioimmunoassay og enzymimmunoassay. Fremgangsmåter for kobling av antistoffer til faste faser er også velkjent for fagmannen. Mer nylig har en rekke porøse materialer så som nylon, nitrocellulose, celluloseacetat, glassfibere og andre porøse polymerer vært benyttet som faste bærere.

Videre beskrevet heri er et diagnostisk sett for påvisning av amyloidantigen i en biologisk prøve som omfatter en sammensetning som definert ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører dessuten det sistnevnte diagnosesett som i tillegg til en sammensetning definert ovenfor, også omfatter et påvisningsreagens som definert ovenfor. Betegnelsen ”diagnosesett” refererer seg i alminnelighet til ethvert diagnosesett kjent på området. Nærmere bestemt refererer sistnevnte betegnelse seg til et diagnosesett som beskrevet i Zrein et al. (1998).

Det er nok et annet aspekt å beskrive nye immunprober og testsett for påvisning og diagnostisering av amyloid-assosierte sykdommer og tilstander omfattende antistoffer som beskrevet heri. For immunprober kobles antistoffene direkte eller indirekte til et egnet rapportørmolekyl, f.eks. et enzym eller en radionuklide. Testsettet omfatter en beholder som inneholder ett eller flere antistoffer som beskrevet heri samt instruksjoner for bruk av antistoffene med det formål å binde til amyloidantigen for å danne et immunologisk kompleks og påvise dannelsen av det immunologiske kompleks slik at nærvær eller fravær av det immunologiske kompleks korrelerer med nærvær eller fravær av amyloidantigen.

EKSEMPLER

Antigener benyttet til å utvikle monoklonale mus-antistoffer

_________________________________________________________________

_________________________________________________________________ Tabell 1. Antistoffer og antigenkonstruksjoner benyttet for utvikling av nevnte antistoffer.

EKSEMPEL 1: Fremgangsmåter for fremstilling av palmitoylerte Aβ1-15 supramolekylære antigenkonstruksjoner

Syntese av tetra(palmitoyllysin)-Aβ1-15-peptidantigen

Det palmitoylerte amyloide 1-15-peptid ble syntetisert ved å følge en forbedret, tidligere rapportert metode (Nicolau et al.2002). Denne nye måte involverte poding av palmitinsyre til den terminale Lys-rest av det preformede peptid direkte på harpiks i stedet for trinnvis fastfasesyntese, hvor den modifiserte aminosyre 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc)-Lys(Pal)-OH inkorporeres. Denne nye måten forbedrer koblingseffektiviteten og gir et produkt av betydelig høyere renhet. Den ortogonalt beskyttede aminosyre Fmoc-Lys(Mtt)-OH ble således koblet til en Wang-harpiks ved å benytte [2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluronium-heksafluorfosfat] (HBTU) koblingskjemi. Fmoc-gruppen ble fjernet ved å benytte 20% piperidin i DMF og en andre rest av Fmoc-Lys-(Mtt)-OH ble koblet. Standard automatisert peptidsyntese under bruk av Fmoc/tBu kjemi og standard sidekjede beskyttende grupper ble deretter benyttet for å koble til de neste 15 aminosyrene for å gi en peptidsekvens som angitt i SEKV.ID.NR:1. De siste to aminosyrene som tilslutt ble koblet var Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Mtt-gruppene ble deretter selektivt avspaltet ved bruk av 1% trifluoreddiksyre (TFA) i diklormetan for å frigjøre et peptidfragment og deretter koble til palmitinsyre ved bruk av HBTU. Etter vask av harpiksen ble Fmoc-gruppen fjernet med 20% piperidin i dimetylformamid (DMF) og tilslutt med samtidig harpiksavspaltning og avbeskyttelse av sidekjeder foretatt ved bruk av TFA under standardbetingelser. Utgnidning fra kald dietyleter ga produktet som et hvitt faststoff. Elektrospray-massespektrometri bekreftet identiteten av produktet (m/z forventet: 1097,9 ([M]3+); funnet: 1096,8 ([M-3H]3+), uten at andre tri-, di- eller mono-palmitoylerte peptider ble påvist.

EKSEMPEL 2: Fremgangsmåter for fremstilling av supramolekylære antigenkonstruksjoner

Syntese av pegylert β-amyloidpeptidantigen

For å forsterke immunresponsen har en annen forankring/spacer, f.eks. polyetylenglykol (PEG) vært anvendt for å rekonstituere peptidet i liposomet. PEG ble kovalent koblet til lysinresten bundet til begge ender av peptidet. I den andre enden av kjeden (PEGn=70) ble fosfatidyletanolamin (PEA) kovalent bundet for å virke som forankringselementet i liposom-dobbeltlaget. Liposomet virker derved fremdeles som en adjuvans, og peptidet som er tilstrekkelig langt fra dobbeltlaget, kan prosesseres alene og således øke dets immunogenitet sammenlignet med det palmitoylerte antigen.

De her beskrevne supramolekylære konstruksjonene ble for første gang syntetisert ved å benytte standard Fmoc/tBu aminosyre-sidekjedebeskyttelser. Pegylering av peptider resulterer i alminnelighet i en blanding av regioisomerer. Herunder ble en lettvint metode for stedsspesifikk tilkobling av et PEG-lipidkonjugat til både C- og N-terminalen av Aβ demonstrert ved å benytte partielt beskyttede peptider.

For de peptidsekvenser som inneholder interne Lys- eller His-rester (1-16, 1-16 ∆14, 22-35), ble en ortogonalt beskyttet Lys(ivDde) addert til hver terminal. Et ytterligere Gly ble addert til C-terminalen for å lette syntese. Fmoc-gruppen ble fjernet med 20% piperidin i DMF og N-acetylert ved bruk av eddiksyreanhydrid. Selektiv avspaltning av ivDde-gruppene ble oppnådd med 3% hydrazinhydrat i DMF i én time.2-klortritylharpiksen var å foretrekke fremfor den mer alminnelig anvendte Wang-harpiks siden førstnevnte viste seg å være meget mer resistent overfor hydrazinolyse. Dessuten er 2-klortritylharpiksen ekstremt syrefølsom og muliggjør derfor til forskjell fra Wang-harpiksen, isoleringen av beskyttede peptider. Det var faktisk nødvendig å foreta koblingsreaksjonen i løsningsfasen, siden kobling av det harpiksbundne peptid til det på forhånd aktiverte pegylerte lipidreagens DSPE-PEG-SPA ikke førte til noe koblingsprodukt. Selektiv avspaltning fra harpiksen under milde betingelser (eddiksyre/trifluoretanol/diklormetan, 1:1:8, 1 time, romtemperatur) ga de internt beskyttede peptidene. Koblinger i løsningsfase ble med hell oppnådd med peptidene avledet fra sekvens Aβ1-16 (SEKV.ID.NR:2), til DSPE-PEG-SPA i DMSO og baseoverskudd. Reaksjonene ble deretter avbrutt ved tilsetning av overskudd av etanolamin i 2 timer og løsningen lyofilisert.

For sekvensen 29-40 fordres ingen spesiell beskyttelsesstrategi.

Rensing ved HPLC (halv-preparativ omvendt fase C4 kolonne) ga mellom 50-70% renhet av de N- og C-terminale PEG-lipidkonjugatene, hvis identiteter ble bekreftet ved MALDI (matrix assisted laserdesorption ionization). Hver sekvens viste betydelig variasjon med hensyn til hvor lett koblingsreaksjon fant sted, og betingelser ble justert tilsvarende (temperatur, antall molekvivalenter DSPE-PEG-SPA, tid). For separasjonen av overskudd av DSPE-PEG-SPA fra det ønskede produkt anvendes HPLC-rensing. Separasjon av mono- og di-koblede produkter før den endelige avbeskyttelse av sidekjeder kan oppnås ved å benytte kationbytterkromografi. Påfølgende avbeskyttelse av peptidsidekjeder og separasjon av det avbrutte overskudd av DSPE-PEG-SPA fører til isoleringen av de ønskede konjugater med en akseptabel renhet.

Denne måten for syntesen av N- og C-terminale lipid-PEG-β-amyloidantigener ved bruk av beskyttede peptider er anvendelig for et stort utvalg peptidsekvenser.

EKSEMPEL 3: Antistoffer utløst ved supramolekylære antigenkonstruksjoner

3.1 Fremstilling av m/Ab utviklet mot palmitoylert Aβ1-15 supramolekylær antigenkonstruksjon:

Palmitoylert antigen (ACI-24, Aβ1-15) ble benyttet for immuniseringen av C57BL/6 mus i 2 ukers intervaller.10-12 dyr ble immunisert med hvert antigen (injeksjonsvolum: 200 µL inneholdende 8 nmol peptid). Den siste injeksjon ble foretatt 4 dager før avlivning av dyrene. Etter 5 boosterinjeksjoner av mus med terapeutiske titere (når en 1:5000 fortynning av sera var positiv ved ELISA) ble valgt for en fusjon. Miltceller ble uttatt fra de immuniserte dyrene og hybridomer utviklet ved å fusjonere sensibiliserte miltceller med en myelomcellelinje. Fusjonen av musenes B-lymfocytter fra milten ble foretatt med celler av myelomcellelinje SP2-0. (ATCC, Manassas, VA) ved å benytte de velkjente prosessene til Kohler & Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)) og Harlow & Lane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988)).

Cellene induseres til å fusjonere ved tilsetning av polyetylenglykol. De resulterende hybridcellene dyrkes deretter i 10 ± 14 dager på konvensjonell måte for å muliggjøre klonal vekst. Initial klonal seleksjon ble foretatt ved å benytte begrensende fortynning. IgG-produserende hybridomkloner ble selektert og testet på deres spesifikke binding til Aβ1-42-peptid ved ELISA, og de resulterende kloner som produserte det ønskede monoklonale antistoff, dyrket.

Hybridomer underkastes deretter screening med henblikk på evnen til å produsere monoklonale antistoffer mot spesifikke amyloid-assosierte sykdommer eller lidelser. Etter at moderklonen var identifisert, ble den subklonet fire ganger for å sikre monoklonalitet og la hybridet stabiliseres.

Hybridomproduserende antistoffer av interesse klones, ekspanderes og oppbevares nedfryst for videre produksjon.

Antistoffet ble isotypet med et kommersielt tilgjengelig mus-monoklonalt isotypings-sett, og den stabile klon ble tilpasset til serumfritt medium og anbrakt i en bioreaktor for antistoffproduksjon.

De foretrukne hybridomer produserer et monoklonalt antistoff som har IgG-isotypen, mer foretrukket IgG1-isotypen.

3.2 Fremstilling av mAb utviklet mot pegylerte PEG-Aβ1-16, Aβ4-11, Aβ22-35 og Aβ29-40 supramolekylære antigenkonstruksjoner:

Liposomale antigener ble fremstilt som beskrevet (Nicolau et al., 2002, PNAS, 99, 2332-37). Sekvensene PEG-Aβ1-16, Aβ4-11, Aβ22-35 og Aβ29-40 (Figur 1) ble rekonstituert i en konstruksjon bestående av liposomer fremstilt av dimyristoyl -fosfatidylkolin (DMPC), dimyristoylfosfatidyletanolamin (DMPEA), dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG) og kolesterol (0,9:0,1:0,1:0,7 molforhold) inneholdende monofosforyllipid A (40 mg/mM fosfolipid). Disse antigenene og pegylerte Aβ1-16 ble benyttet for immuniseringen i C57/BL/6 mus i 2 ukers intervaller.10-12 dyr ble immunisert med hvert antigen. Etter 3 til 6 boosterinjeksjoner ble mus med terapeutiske titere (når en 1:5000 fortynning av serumet var positiv ved ELISA) valgt for en fusjon. Miltceller ble høstet fra de immuniserte dyrene og hybridomer utviklet ved fusjonering av sensibiliserte miltceller med en myelomcellelinje.

Fusjonen av musenes B-lymfocytter fra milten ble foretatt med celler av myelomcellelinje SP2-0. (ATCC, Manassas, VA) ved å benytte de velkjente prosesser til Kohler & Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)) og Harlow & Lane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988)).

Cellene induseres til å fusjonere ved tilsetning av polyetylenglykol. De resulterende hybridcellene klones deretter på konvensjonell måte, f.eks. ved bruk av begrensende fortynning. IgG-produserende hybridomkloner ble selektert og testet på deres spesifikke binding til Aβ1-42 -peptidet ved ELISA, og de resulterende kloner som produserer de ønskede monoklonale antistoffer, dyrket.

Hybridomer underkastes deretter screening med henblikk på evnen til å produsere monoklonale antistoffer mot spesifikke amyloid-assosierte sykdommer eller lidelser. Hybridomproduserende antistoffer av interesse klones, ekspanderes og oppbevares nedfryst for fremtidig produksjon. De foretrukne hybridomene produserer et monoklonalt antistoff som har IgG-isotypen, mer foretrukket IgG1-isotypen.

EKSEMPEL 4: Spesifisitetsbestemmelse for antistoff mACI-24-Ab4

For å analysere spesifisiteten av antistoffet mACI-24-Ab4 ble forskjellige konsentrasjoner av preformet amyloid 1-42, 1-40 og 1-38 fibriller blottet over på Hybond ECL nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences). Etter blokkering med 10% tørrmelk og 0,7% Tween 20, ble membraner inkubert med primært antistoff som 20 µg/mL i 2 timer ved RT. Etter vasking ble membraner inkubert med pepperrot-peroksydase-konjugerte sau-anti-mus IgG-antistoff (Amersham Biosciences) i 1 time ved RT, vasket og inkubert med kjemiluminescens-løsning etterfulgt av eksponering av membranen mot røntgenfilm.

For å måle binding av det monoklonale antistoff mACI-24-Ab4 til amyloid β-1-42-fibere, ble Aβ 1-42, 1-40 og 1-38 fibere preformet i syv dager ved 37°C og blottet over på membranen.20 µg/mL antistoff ble benyttet til å måle bindingskapasitet, og det bundne antistoff ble påvist med pepperrot-peroksydase-konjugert sau-anti-mus IgG-antistoff i 20 minutters eksponering.

Som demonstrert ved Dot Blot analyse binder antistoffet mACI-24-Ab4 til forskjellige preformede Aβ-fibere med forskjellig følsomhet. Antistoffet oppviser høyere bindingsfølsomhet for Aβ1-42-fibere enn for Aβ1-40 eller Aβ1-38. Det er i stand til å påvise minst 0,001 µg av Aβ1-42-fibere, mens påvisningsgrensen for antistoffet for Aβ1-40-fibere er minst 0,1 µg og for Aβ1-38 -fibere 1 µg, hvilket betyr at følsomheten er 100 ganger til 1000 ganger mindre for disse typene amyloidfibere. Disse dataene demonstrerer at antistoffet ACI-24-Ab4 er minst 100 ganger mer følsom for den amyloide form (1-42) som er kjent for å bli uløselig ved endring av sekundær konformasjon og som utgjør en vesentlig del av amyloide plakk i hjernen hos AD-pasienter.

EKSEMPEL 5: Binding av AC immune monoklonale antistoff mACI-01-Ab7 C2 til amyloide arter i Western Blot og Dot blot

For å bestemme hvorvidt bindingen av mus-antistoffet mACI-01-Ab7 C2 er avhengig av den native bekreftelse av Aβ, ble det foretatt en sammenligning av bindingen til linearisert amyloid ved Western Blot eller nativt amyloid på Dot Blot (Figurene 2a og 2b).

Amyloide monomerer ble utviklet ved å løse Aβ1-42-peptid i HFIP og løsningsmidlet fordampet under argon. Tørket peptidfilm ble oppbevart ved –80°C inntil bruk. For fremstilling av monomerer ble peptidfilmen resuspendert i DMSO til en konsentrasjon på 2,75 µg/µL og fortynnet i PBS til 1 µg/µL. For fremstilling av oligomerer ble tørket peptidfilm resuspendert i DMSO til 5 mM, ultralydbehandlet og tilsatt PBS for å nå 400 µM amyloid, etterfulgt av tilsetning av SDS til en sluttkonsentrasjon på 0,2%. Etter 6 timers inkubering ved 37°C ble amyloidet fortynnet i vann til en sluttkonsentrasjon på 100 µM og inkubert i ytterligere 18 timer ved 37°C. Amyloid-oligomerene ble utfelt med iskald 33% metanol, 4% eddiksyreløsning i 1 time ved 4°C, sentrifugert ved 16200 g i 10 minutter og pellettene resuspendert i 5 mM Na2H2PO4, 35 mM NaCl, pH 7,4, til en sluttkonsentrasjon på 1 µg/µL. For fremstilling av fibere ble peptidfilm fortynnet i Tris-HCl 50 mM buffer for å oppnå en konsentrasjon på 1 mg/mL amyloid og inkubert ved 37°C i 5 dager. Rørene ble sentrifugert ved 10.000 g i 5 minutter og pelletten resuspendert i 0,1M karbonatbuffer, pH 9,6, for å nå 1 µg/µL.

1 eller 5 µg monomerer, oligomerer eller fibere ble fortynnet i PBS og i ladningsbuffer og avsatt på en 12% SDS-PAGE og gelen overført til nitrocellulosemembraner. Alternativt ble 3 eller 1 µg eller 100 og 10 ng amyloid-arter fortynnet i PBS og overført direkte til nitrocellulosemembranen og membranene tørket ved RT i 1 time. Etter blokkering i 30 minutter med kasein-løsning (Vector), ble membranene inkubert i 30 minutter med mACI-01-Ab7 C2 eller 6E10 (Chemicon) antistoffer fortynnet til 1 µg/mL i kasein-løsning. Etter 3 vaskinger i kasein-løsning ble membranene inkubert ved RT i 30 minutter med HRP-merket geit-anti-mus IgG (Dako Cytomation) fortynnet i kasein-løsning, vasket 3 ganger og fremkalt med DAB-substrat (Dako Cytomation).

Det monoklonale muse-antistoff mACI-01-Ab7 C2 bandt spesifikt til monomerer, oligomerer og fibere i Dot Blot-testen i likhet med den positive kontroll, antistoff 6E10. Derimot påviste ikke mACI-01-Ab7 C2-antistoff lineariserte amyloidarter ved Western blot, i motsetning til 6E10-antistoffet som klart gjenkjente alle lineariserte peptider. Dette resultat viser at bindingen av mACI-01-Ab7 C2 til amyloid er avhengig av den native konformasjon av amyloid.

EKSEMPEL 6: mACI-01Ab7 C2-Aβ1-42 interaksjoner

Interaksjonene mellom AC immune leder-antistoff mACI-01Ab7 C2 (mC2) med amyloidpeptid Aβ1-42 ble studert ved å benytte SRP (surface plasmon resonance). Bindingen av muse-antistoffet mACI-01Ab7 C2 til enten monomerer eller fibere av Aβ1-42 ble bestemt.

Alle SPR-forsøk ble foretatt på et Biacore X instrument (Biacore AB).

Reagenser for immobilisering (EDC, NHS og etanolamin), sensorchips CM5 og SA, så vel som rennende- (running buffer) og prøve-buffer HBS-EP ble anskaffet fra Biacore AB. Natriumacetat (10 mM, pH 5,0) ble benyttet som koblingsbuffer for å øke koblingsutbyttet. Fibrillær Aβ1-42 (Bachem) ble fremstilt ved tilsetning av PBS-buffer til Aβ1-42 til en sluttkonsentrasjon på 3 mg/mL og oppbevaring av glassene ved 37°C i 7 dager. Fibrillær Aβ1-42 ble koblet til en CM5 sensorchip inneholdende en overflatebundet karboksymetyldekstran-matriks. Biotinylert monomert Aβ1-42 (Bachem) ble koblet til en Sensor chip SA bestående av karboksymetyl-dekstran-matriks med kovalent tilkoblet streptavidin. Typisk ble fire eller fem konsentrasjoner mAb analysert ved seriefortynninger ved bruk av rennende buffer. Injeksjoner ble foretatt ved å starte ved den laveste konsentrasjon og sendt over både fc 1 og 2 ved en strømningshastighet på 30 µL/min i 3 min. Strømningskyvette 2 var uderivatisert, og responser ble subtrahert fra fc 1 for å korrigere for instrumentstøy og vesentlige brytningsendringer. Etter fullført injeksjon ble overflatene umiddelbart vasket med rennende buffer i 5 min. For å fjerne gjenværende bundet antistoff fra Aβ1-42-fibriller, ble overflate-regenerering foretatt ved å injisere pulser av 10 nM NaOH. Kinetisk analyse ble foretatt ved bruk av algoritmer for numerisk integrasjon og global analyse ved bruk av BIAevaluation 3.0. De oppnådde kurver for injeksjoner av analytt av forskjellige konsentrasjoner ble lagt over hverandre og basislinjene justert til null. For kurvetilpasning ble alle data samtidig tilpasset til et 1:1 homogent kompleks.

Binding av mus mACI-01-Ab7 C2-antistoff til amyloid ble bestemt å være relativt sterk. Som vist i Tabell 2 bandt mus-antistoffet mACI-01-Ab7 C2 spesifikt til immobiliserte Aβ1-42-fibere med en gjennomsnittlig assosiasjonskonstant (ka) på 3,8 x 10<-4 >M/s, en dissosiasjonskonstant (kd) på 1,1 x 10<-3 >s<-1 >og derfor med den resulterende gjennomsnittlige KD på 3,5 x 10<-8 >M. Assosiasjon av mACI-01-Ab7 C2 til Aβ-monomerer var tilsvarende eller litt sterkere enn gjennomsnittlig ka på 1,6 x 10<-4 >M/s, men dissosiasjonen var hurtigere og ga en KD på 2,5 x 10<-7 >M.

Tabell 2

Eksempel 7: Binding av mACI-01-Ab7 C2 monoklonalt antistoff til amyloidfibere

For å analysere den molekylære bindingsside av antistoffet på preformede fibere, ble det foretatt negativ kontrast TEM (transmission electronic microscopy) (Figur 3a og 3b).

Antistoffet, mACI-01-Ab7 C2, ble koblet med 8 nm kolloidalt gull i henhold til <4,5>. For ko-inkuberingen av amyloid 1-42 (Aβ1-42) fibere, ble 6,65 µM fibere inkubert i 24 timer ved RT med det gull-merkede antistoff i molforholdet 1:100. Deretter ble 5 µL prøve inkubert på det ferske glødnings-utladede Cu-gitteret (mesh 200) dekket med parlodium/C-film i 45 sekunder, vasket 3 ganger med vann og 1 gang med 2% nylig fortynnet og filtrert uranylacetat. Prøver ble farget i 2% uranylacetat i 15-20 sek. Overskudd av farge på gitterne ble suget av og deretter lufttørket. Tre gittere av hver prøve ble fremstilt. Gitterne ble analysert ved transmisjons-elektronmikroskopi Hitachi 7000.

Det monoklonale antistoff, mACI-01-Ab7 C2, binder direkte til Aβ1-42-fibere. Interessant er det at antistoffet ikke oppviser noen symmetrisk binding til aksen av enkeltfibere, men binder til bestemte, men ikke alle, områder av sidegrener av fibernettverket. Det syntes å være antistoffmålets spesifikke regioner innen sidegrenene. Den mulige forklaring er en spesifikk sekundærstruktur som forekommer kun i disse spesifikke sidegrenene. Denne hypotese understøttes av NMR-data som viser at antistoffet induserte overgang ved konformasjon, og det er derfor sannsynlig at dets binding avhenger av en konformasjon av amyloidfibere som omfatter en β-platestruktur.

EKSEMPEL 8: Fraksjonering ved tetthetsgradient ultrasentrifugering

De egenskaper monoklonale antistoffer har til å inhibere Aβ1-42-fiber-polymerisering og desaggregering av Aβ1-42-fibere ble studert ved tetthetsgradient ultrasentrifugering (Rzepecki et al., 2004), som er basert på prinsippet om fordeling mellom resulterende peptidfibere av ulik størrelse etter inkubering med og uten antistoffer, etterfulgt av en SDS-PAGE sedimenteringsanalyse på en preformet gradient (OptiPrep™). Samtidig analyse av populasjoner av preformede Aβ-fibere, desaggregasjon og inhibering av aggregasjonsegenskaper av de koinkuberte antistoffene, samt bindingen av antistoffene til fiberne er åpenbare fordeler ved disse metoder.

De monoklonale antistoffene utviklet mot Aβ1-16 (mACI-01-Ab7 C2), Aβ1-16(∆14) (mACI-02-Ab6), Aβ1-15 (mACI-24-Ab4), Aβ22-35 (mACI-11-Ab9) og Aβ29-40 (mACI-12-Ab11) ble analysert i desaggregeringstester, mens inhiberingen av aggregasjonsegenskaper bare ble studert for det monoklonale antistoff mACI-02-Ab6, mACI-24-Ab4 og mACI-01-Ab7 C2.

For inhiberingen av Aβ1-42-aggregasjon ble Aβ1-42-monomerer inkubert med monoklonale antistoffer i to forskjellige molforhold (molforhold av monomer Aβ1-42 30- eller 100-ganger høyere enn mAb) med Aβ sluttkonsentrasjon på 50 µM. Etter 24 timers inkubering ved 37°C ble prøver lagt over hverandre over en diskontinuerlig gradient av Optiprep™ og rørene ble sentrifugert ved 259.000 g i 3 timer ved 4°C.15 fraksjoner ble høstet (140 µL hver), fraksjon 1 var den minst tette fraksjon fra toppen av gradienten og fraksjon 15 er den tetteste fraksjon fra bunnen av gradienten. Pelletten ble også uttatt. De oppsamlede fraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE med sølvfarging. Konsentrasjonen Aβ1-42 for inhiberingsbestemmelser var fem ganger mindre enn for desaggregeringsbestemmelser som minsker amyloid-aggregasjonskinetikk og sikrer måling innen den lineære fase.

For desaggregeringen av preformede Aβ1-42 -fibriller ved ko-inkubering med mAb (i to ulike molforhold 1:30 og 1:100, mAb monomer Aβ1-42 med Aβ sluttkonsentrasjon på 246 µM), ble prøvene inkubert i 24 timer ved 37°C. Etter 24 timer ble prøvene fraksjonert ved ultrasentrifugering og separert ved SDS-PAGE som beskrevet ovenfor og tidligere (Rzepecki et al., 2004).

8.1 Bestemmelse av Aβ1-42-aggregasjon

Det kunne demonstreres at uten tilsetning av mAb, aggregerte Aβ-peptid etter 24 timers inkuberingstid og det meste av proteinet ble funnet i fraksjonene 13-15, hvilket viser fullstendig polymerisering av Aβ-peptidmonomerene. Vellykket og signifikant inhibering av aggregasjon burde resultere i mindre fibere eller polymert løselig amyloid β (Aβ) protein, som skulle finnes i fraksjoner med lavere tetthet (10-13). Eksakt denne forskyvning i bånd kunne demonstreres i aggregasjonstester inneholdende mACI-01-Ab7 C2 som viste en fordeling av Aβpeptid over fraksjonene 11, 12 og 13.

Dette ble bekreftet i et 2. forsøk hvor mACI-01-Ab7 C2 igjen forårsaket en forskyvning i bånd for den største del (sterkeste bånd) fra 14 til 13 og en signifikant solubilisering av bånd i løpet av fraksjon 14 til pellet. Dette betyr at mACI-01-Ab7 C2 oppviser en sterk evne til å inhibere polymerisering av Aβpeptidmonomerer til fibere og viste en spesifikk binding til Aβ-fiberne (i fraksjon 13).

Lignende observasjoner ble gjort ved bruk av antistoff mACI-24-Ab4 og mACI-02-Ab6. Uten tilsetning av mAb ble Aβ-peptid aggregert etter 24 timers inkubering, og det meste av proteinet ble funnet i fraksjoner fra 13 til pellet (pellet, meget lite i 12), som demonstrerer fullstendig polymerisering av Aβ-peptidmonomerene. Vellykket og signifikant inhibering av aggregasjon skulle ha resultert i mindre fibere eller polymert løselig amyloid β (Aβ) protein, som skulle finnes i fraksjoner med lavere tetthet. I forsøket med inhibering av aggregasjon forårsaket mACI-24-Ab4 en forskyvning i bånd for majoriteten (sterkeste bånd) fra 13 til 11 og 12 og en signifikant solubilisering av båndene i løpet av fraksjon 13 til pellet, mens mACI-02-Ab6 forårsaket en forskyvning i bånd fra 13 til 10, men dessuten en fullstendig inhibering av dannelse av større fibere (fraksjonert i 13 til pellet). Disse data indikerer at både mACI-24-Ab4 og mACI-02-Ab6 oppviser en sterk evne til å inhibere polymerisering av Aβ-peptidmonomerer til fibere og viste en spesifikk binding til Aβ-fiberne (i fraksjon 11 og 12).

I motsetning til dette viste aggregasjonsforsøk inneholdende mACI-11-Ab9, i et molforhold 1:30, større aggregater spredt mellom fraksjoner 12-15 og pellet. I nærvær av mACI-12-Ab11 finnes i molforholdet 1:30, aggregater i fraksjonene 11-15 og pellet, men med sterkest signal i fraksjonene 11 og 12. Dette betyr av mACI-01-Ab7 C2 og mACI-24-Ab4 oppviser den sterkeste evne til å inhibere polymerisering av Aβ-peptidmonomerer til fibere. mACI-12-Ab11 har signifikant mindre inhiberende egenskaper enn mACI-01-Ab7 C2. For å oppnå denne svake inhiberende aktivitet trengtes et tre ganger høyere molforhold. Mindre inhibering kan dessuten observeres sammenlignet med mACI-11-Ab9 som ikke var i stand til å inhibere Aβ-peptidfiber-aggregasjon. Alle mAb oppviste en spesifikk binding til Aβ-fiberne (for mACI-01-Ab7 C2 i fraksjon 11 12; for mACI-11-Ab9 i fraksjon 12 og svak i 13; for mACI-12-Ab11 i fraksjon 11 og 12).

I samtlige inhiberingstester ble peptid påvist i bunnfraksjonene. Det ikkebundne mAb (37 kDa, 95 kDa og større enn 120 kDa) fremkom i den øvre halvdel av gradienten (fraksjonene henholdsvis 3-9 og 4-8).

8.2 Bestemmelse av desaggregasjon av Aβ1-42-fibere

Som følge av den ufullstendige fiberpolymerisering demonstreres fordelingen av Aβ1-42-fibriller alene et bredere område av fraksjoner (11-15).

Demonstrasjon av vellykkede og signifikante desaggregeringsegenskaper av antistoffene når de ko-inkuberes med de preformede fiberne, er derfor vanskeligere enn i aggregasjonsanalysen. Bare forskyvning i majoriteten av fiberne mot fraksjoner av lavere tetthet, men fremdeles innenfor fraksjonsområdet for amyloid alene, ville indikere desaggregasjonsaktivitet. For amyloid alene er hovedbåndet i fraksjon 12. Tilsetning av mACI-01-Ab7 C2 i molforhold 1:100 viste ingen forskyvning av amyloide fibere mot fraksjoner med lavere tetthet (fremdeles mellom fraksjoner 11-15), men med en forskyvning av det sterkere signal i fraksjonsområdet fra 12 til 11, sammenlignet med amyloid alene. På tross av ikkeoptimale omstendigheter for ufullstendig fiberdannelse, indikerer mACI-01-Ab7 C2 lave, men påvisbare desaggregeringsaktiviteter.

I motsetning til dette viste ko-inkuberingen av preformede Aβ1-42-fibriller med mACI-02-Ab6 ingen forskyvning av bånd til fraksjoner med lavere tetthet når de ble inkubert med det samme amyloidpeptid:antistoff-molforhold som mACI-01-Ab7 C2. Bare når det ble benyttet et tre ganger høyere molforhold på 1:30 forskjøv amyloidfibere seg fra 12-15 (amyloid alene uten antistoff ko-inkubering) til fraksjoner 11-15. Det syntes derfor som om at mACI-01-Ab7 C2 hadde litt høyere desaggregeringsegenskaper enn mACI-02-Ab6.

Påvisning av bånd tilsvarende mAb i den nedre halvdel av gradientfraksjon viser binding av mACI-02-Ab6 og mACI-01-Ab7 C2 til Aβ1-42-fibriller (fraksjon 11 til 15 for begge mAb).

Desaggregeringsegenskapene til mACI-01-Ab7 C2 kunne bekreftes i et ytterligere forsøk, hvor fullstendig fiberpolymerisering kunne demonstreres gjennom fordelingen av Aβ1-42-fibriller i fravær av et antistoff i fraksjoner 13 til P (pellet). Her indikerer forskyvning av fibere mot fraksjoner av lavere tetthet desaggregasjonsaktivitet av antistoffet når det ko-inkuberes til preformede fibere. Tilsetning av mACI-01-Ab7 C2 i molforhold 1:100 viste en forskyvning av majoriteten av amyloidfibere fra 13 til 12 og ytterligere en forskyvning av båndet med den laveste tetthet fra 13 mot 11. Derfor indikerer mACI-01-Ab7 C2 også en sterk desaggregasjonsaktivitet.

Påvisningen av bånd tilsvarende mAb i den nedre halvdel av gradientfraksjon viser binding av mACI-01-Ab7 C2 til Aβ1-42-fibriller (fraksjon 11 til P) mens bånd tilsvarende mAb i fraksjoner 4 til 7 indikerer ubundet antistoff.

For å sammenfatte disse resultatene, kunne det med hell vises at det monoklonale antistoff mACI-01-Ab7 C2 som målsøker amyloid Aβ-peptid, binder til preformede fibere og er i stand til å inhibere in vitro aggregasjon fra monomere Aβ-peptider til fibere og desaggregere preformedte fibere.

Lignende observasjoner ble gjort når mACI-24-Ab4 ble brukt. I likhet med aggregasjonsforsøk kunne det demonstreres fullstendig fiberpolymerisering ved fordelingen av Aβ1-42-fibriller alene i fraksjon 12 til P (pellet). Her ville forskyvninger av fibere mot fraksjoner av lavere tetthet indikere desaggregasjonsaktivitet av antistoffet for ko-inkubering til preformede fibere. Tilsetning av mACI-24-Ab4 i molforhold 1:100 viste en forskyvning av majoriteten av amyloidfibere fra 12 til 11. mACI-24-Ab4 indikerer derfor også en sterk desaggregeringsaktivitet.

EKSEMPEL 9: Fluorescensbestemmelse for å måle inhibering av Aβ1-42 filamentaggregasjon og desaggregasjon av preformede Aβ1-42-filamenter ved ko-inkubering med mAb

BIS-ANS fluorescenstest

For å måle inhiberingsegenskapene av mAb ble BIS-ANS (LeVine, 2002) fluorescenstesten, som spesifikt påviser monomeren eller ikke-fibrillær populasjon av Aβ1-42-filamenter benyttet. Før fluorescensmåling ble Aβ1-42 -monomerer preinkubert med enten buffer, tjente som kontroll, eller mAb (molforhold 1:100, mAb vs. Aβ1-42 –peptid) i 14 timer ved 37°C. Relative fluorescensenheter ble automatisk registrert, og resultatet ble uttrykt som prosentvise endringer i forhold til kontrollen.

mACI-02-Ab6 viste en svak inhiberingsevne sammenlignet med kontrollen (125,8 ± 28,5% vs.100 ± 29,5%). mACI-01-Ab7 C2 syntes å ha svak aktivitet (108,0 ± 30,0%) og ingen forbedring sammenlignet med kontrollen kunne observeres med det monoklonale antistoff mACI-11-Ab9 og mACI-12-Ab11 (93,5 ± 21,9% og 73,2 ± 47,7%). Dette resultat bekrefter ultrasentrifugeringsdataene hvor mACI-01-Ab7 C2 oppviser større inhiberingsevne enn mACI-11-Ab9 og mACI-12-Ab11.

EKSEMPEL 10: Fluorescensbestemmelse av tioflavin T (Th-T)

For å måle både inhibering av aggregasjons- så vel som desaggregasjonsegenskaper av mAb ble fluorescensbestemmelsen av tioflavin T (Th-T) benyttet og som spesifikt binder til fibrillære Aβ1-42-molekyler, og fluorescensemisjonsintensiteten deretter korrelert med mengden av Aβ1-42-filamenter forekommende i løsningen.

Før fluorescensmåling ble Aβ1-42-monomerer preinkubert med enten buffer (kontroll) eller mAb (molforhold 1:100, mAb vs. Aβ1-42 -peptid) i 48 timer ved 37°C. Relative fluorescensenheter ble automatisk registrert, og resultater ble uttrykt som prosentvise endringer i forhold til kontroll.

mACI-01-Ab7 C2 oppviste en signifikant inhiberingsevne sammenlignet med kontrollen (11,03 ± 20,7% vs.100 ± 40,5%). Dette resultat bekrefter ultrasentrifugeringsdataene, hvor mACI-01-Ab7 C2 oppviser inhiberingsevne.

For å måle desaggregasjonsegenskapene av mAb ble tioflavin T (Th-T) fluorescenstesten benyttet og som spesifikt binder til fibrillære Aβ1-42-molekyler, og hvor fluorescens-emisjonsintensiteten deretter ble korrelert med den mengde Aβ1-

42 -filamenter som er tilstede i løsningen. Før måling ble Aβ-fibere preformet i 7 dager (ved 37°C i PBS, pH 7,1) og deretter ko-inkubert med mAb eller buffer (negativ kontroll) i 24 timer ved 37°C i et molart forhold på 1:100 (mAb vs. Aβ1-42). Relative fluorescensenheter ble automatisk registrert av en ELISA mikrotiterplateleser, og resultatene ble uttrykt som prosentvise endringer i forhold til kontrollen.

I overensstemmelse med ultrasentrifugeringsdataene viste mACI-01-Ab7 C2 også i Th-T desaggregasjonstesten i to uavhengige forsøk de beste egenskapere med henholdsvis 35 ± 11% og 64,57 ± 13,58% (vs.100,0 ± 15,37%) desaggregasjonsstyrke i forhold til kontrollen.

mACI-24-Ab4 viste også signifikante desaggregasjonsegenskaper (62,99 ± 10,34% vs.100,0 ± 10,03%; p<0,0001) i Th-T-testen.

mACI-11-Ab9 var noe mindre aktiv med 28 ± 14%,mens ACI-02-Ab6 og ACI-12-Ab11 ikke oppviste signifikante desaggregeringsegenskaper (henholdsvis 17 ± 12% og 13 ± 11%).

Ved sammenfatning av ultrasentrifugerings- og fluorescensanalyser viste mACI-01-Ab7 C2, mACI-01-Ab6 og mACI-24-Ab4 bifunksjonelle egenskaper ved å inhibere fiberaggregasjon og forkorte preformede Aβ1-42-filamenter i sentrifugeringsforsøk som kunne bekreftes ved fluorescensanalyse.

Sentrifugeringsforsøk demonstrerte dessuten spesifikk binding av det monoklonale antistoff til amyloidfibere.

mACI-11-Ab9 oppviste signifikant lavere inhiberingsevne ved ultrasentrifugering sammenlignet med mACI-01-Ab7 C2 selv om det var tre ganger sterkere konsentrert, hvilket kunne bekreftes ved BIS-ANS test. For desaggregeringsanalysen viste mACI-01-Ab7 C2 i både sentrifugeringsanalyse og ThT-testegenskaper til å forkorte preformede Aβ1-42-filamenter. Tre ganger høyere konsentrert mACI-02-Ab6 i sentrifugeringsforsøk var også positiv i begge tester, men mye sterkere i sentrifugeringsforsøk.

Fra resultatene ovenfor er det åpenbart at mACI-01-Ab7 C2 og mACI-02-Ab6 er de eneste antistoffer som oppviser aktivitet med hensyn tio bifunksjonalitet ved interagering med Aβ1-42-filamenter, inhibering av aggregasjon og desaggregasjon av preformede fibere.

EKSEMPEL 11: NMR- og fluorescens-karakterisering av interaksjonen av mACI-01-Ab7 C2 monoklonalt antistoff med <13>C-merket β-amyloid 1-42-peptid For å evaluere den potensielle mekanisme som mAb solubiliserer preformede fibere eller inhiberer fiberdannelse etter, ble et hode-mot-hode forsøk mellom Th-T fluorescensanalyse og fastfase NMR av U-<13>C Tyr10- og Val12-merket β-amyloid 1-42-peptid foretatt (Figur 4). Hensikten med denne undersøkelsen var derfor å følge β-plateovergangen ved fastfase NMR-spektroskopi i βamyloidpeptidet og i nærvær av det monoklonale antistoff og direkte sammenligne dette med desaggregasjonskapasiteten målt ved Th-T fluorescensanalyse.

Fastfase NMR-spektroskopi påviser ikke bare en overgang i den sekundære struktur, men den gjør det også mulig å lokalisere de domener av Aβ1-42 -peptidet som dominerer den strukturelle overgang. Fastfase NMR har bevist sin anvendbarhet for problemet idet den har bidratt til strukturbestemmelsen av Aβ1-42 -fiberne (Petkova et al., 2004, Petkova et al., 2002). Særlig er korrelasjonen av det <13>Cα og <13>Cβ kjemiske skift med sekundærstrukturen (Cornilescu et al., 1999, Luca et al., 2001, Iwadate et al., 1999) et verdifullt hjelpemiddel for å teste endringer av sekundærstrukturen i et peptid.

Syntesen av peptidet merket inklusivt et <13>C premerket valin i posisjon 12 (<12>Val) og et <13>C premerket tyrosin i posisjon 10 (<10>Tyr) ble foretatt etter en Fmoc synteseprotokoll. Identitet og renhet av peptidet ble bekreftet ved MALDI massespektroskopi. Det merkede β-amyloidpeptid (1-42) ble benyttet til å utvikle fibere ved å inkubere peptidløsningen i PBS-buffer i 1 uke ved 37°C. Hovedproblemet, den dårlige løselighet av amyloid β-peptidet i PBS-buffer, kunne løses på følgende måte: pH-verdien av PBS-bufferen ble temporært økt med ørsmå mengder ammoniakk for å løse amyloid β-peptidet. Den opprinnelige pH-verdi av PBS-bufferen ble igjen innstilt ved inkubering av prøvene i nærvær av et større PBS-bad ved å utnytte ammoniakkens flyktige karakter.

For å måle effekten av de β-platebrytende antistoffer ble løsninger av fibere inkubert med antistoffet i 24 timer ved 37°C for både NMR- og Th-T-analyse. For sammenligning i sann tid ble en alikvot av den samme løsning benyttet for Th-T fluorescensanalyse, og den gjenværende løsning ble lyofilisert for NMR-målingene.

Etter først å analysere de desaggregerende egenskaper av mACI-01-Ab7 C2 ved ko-inkubering med preformede 13C-merkede amyloide β-fibere ved bruk av Th-T fluorescensanalyse, kunne det vises at mAb desaggregerte fiberne med 38%. Deretter ble NMR-spekteranalyse foretatt.

For å undersøke forskjellene mellom PBS (kontroll) og mAb inkubering, ble hvert spektrum dekonvolvert ved å benytte PeakFit (http://www.systat.com/-products/PeakFit). Linjene stemte godt overens ved anvendelse av en blandet Lorentz/Gauss tilpasningsprosedyre, hvor resultatene av denne er vist i Figur 4. Resultatene er sammenfattet i Tabell 3, men den mest åpenbare forskjell er de integrale intensiteter av de to populasjonene som trengs for tilpasning av dobbelttoppen omkring 30-33 ppm. Toppen ved c33 ppm tilsvarer beta-platekonformasjonen av fiberne, mens den ved 30 ppm er et resultat av random coil konformasjon. Prøven inkubert i PBS oppviste det meste av merkingen i en betaplatekonformasjon (81,7%) (Fig.2 øverst), som reduseres når prøven inkuberes med mACI-01-Ab7 C2 (53,5%) (Fig.4 nederst). Reduksjonen i populasjonen av beta-platekonformasjonen i forhold til random coil konformasjonen, bestemt ved studie av Val 12 Cβ, er av størrelsesorden 35% og er derfor i nær overensstemmelse med den målt ved bruk av fluorescens.

Tabell 3. Sammenligning av de tilpassede parametere for de to konformasjonene av Val 12 Cβ.

De tilpassede kjemiske skift for de to konformasjonene er ganske like, men de integrale intensitetene er meget forskjellige, hvilket reflekterer en reduksjon i den orginale β-platekonformasjon med ca.35% (1-(53,5/81,7)). Dette er i meget nær overensstemmelse med verdien oppnådd fra fluorescensmålingen.

For å sammenfatte disse resultatene kunne det med hell demonstreres at det monoklonale antistoff mACI-01-Ab7 C2 rettet mot den N-terminale 1-16 region av amyloid Aβ-peptid, binder til preformede fibere og er i tilstand til å inhibere in vitro aggregasjon fra monomere Aβ-peptider til fibere og desaggregere preformede fibere, som demonstrert gjennom tettshetsgradient ultrasentrifugeringsforsøk så vel som ved Th-T-fluorescensanalyse. I tillegg kan det ved binding av dette antistoff til preformede fibere induseres en overgang fra beta-platemajoritet til random coil sekundære konformasjonsomgivelser av Val12. Dette kunne være den potensielle mekanisme som fibere kunne solubiliseres etter ved binding av det monoklonale mACI-01-Ab7 C2 antistoff, også på grunn av at den detaljerte analyse av Val 12 Cβ-topp viser reduksjon av beta-platekomponent med 35%, hvilket er i nær overensstemmelse med fluorescensdata (38%).

Eksempel 12: Funksjonalitet av mACI-01-Ab7 C2 på amyloidfibere

12.1 Modifikasjon av konformasjon av Aβ1-42-fibere og initiering av desaggregasjon etter binding av mACI-01-Ab7 C2 antistoffet

For å evaluere den mekanisme som antistoffet er i stand til å desaggregere preformede beta-amyloide (Aβ1-42) fibere etter, ble det foretatt en hode-mot-hode sammenligning av tioflavin-T (Th-T) fluorescensanalyse som målte desaggregering og fastfase NMR (Nuclear Magnetic Resonance) av U-<13>C tyrosin10- og valin12-merket Aβ1-42-peptid for analyse av sekundær konformasjon. Antistoffet solubiliserte 35,4% av de preformede Aβ1-42-fiberne og induserte samtidig en forskyvning i sekundær konformasjon fra beta-plate til random coil. Reduksjonen i populasjonen av beta-platekonformasjon i forhold til random coil er av størrelsesorden 35% og er derfor i nær overensstemmelse med den målt ved å benytte fluorescens-Th-T-analyse. Disse dataene indikerer at bindingen av antistoffet initierer en overgang av den sekundære struktur som potensielt forårsaker en destabilisering av det parallelle intermolekylære arrangement av beta-plater, hvilket bevirker en oppbrytning av langstrakte fibere til mindre fragmenter.

12.2 Konformasjonsavhengig bindingsaffinitet av mACI-01-Ab7 C2 antistoff Siden det er velkjent fra den vitenskapelige litteratur at en del av den antistoff-antigenbindende energi kan benyttes til en energiavhengig modifikasjon av konformasjonen av et antigen <6>, ble det foretatt et sammenligningsforsøk av bindingsaffiniteten av mACI-01-Ab7 C2 antistoffet til det hele Aβ1-42-protein og til et mindre, ni aminosyrer langt, peptid som omfatter antistoffets epitop. For denne sammenligning ble affiniteten av antistoffet mACI-01-Ab7 C2 analysert ved ELISA under bruk av biotinylerte peptider som dekket den fullstendige aminosyresekvens av mACI-01-Ab7 C2’s epitop (aminosyrene 13-21 av Aβ1-42-sekvensen, produsert av Mimotopes og anskaffet fra ANAWA Trading SA) og et biotinylert komplett Aβ1-42 peptid (Bachem). Analysen ble foretatt i henhold til produsenten (Mimotopes) instruksjoner. Antistoffet binder med en 38,40% høyere affinitet til peptidet som omfatter dets spesifikke epitop (aminosyrene 13-21 av Aβ1-42-sekvensen) enn det hele Aβ1-42-protein. Det antydes derfor at forskjellen i bindingsaffinitetsenergi ble benyttet for den energikonsumerende overgang av den sekundære konformasjon av amyloidproteinet til å presentere antigenet i en mer akseptabel posisjon for antistoff interaksjonen. Dette kan forklare hvorfor affiniteten av antistoffet er lavere for det native (hele amyloidproteinet) enn for den isolerte subenhet.

EKSEMPEL 13: Konformasjonsspesifikk binding av mACI-01-Ab7 C2 til forskjellige klasser av amyloidprotein

For å evaluere spesifisiteten av mACI-01-Ab7 C2 til forskjellige stadier av polymerisert amyloidprotein, monomert og polymert løselig amyloid, særlig amyloid β- (Aβ) protein og fibrillformet amyloid, ble det foretatt en ELISA belagt med disse forskjellige stadiene av polymert beta-amyloid. Monomerer ble fremstilt etter en modifisert metode publisert av <7>, polymert løselig amyloid, særlig amyloid β (Aβ) i henhold til <8>, mens fibere ble preformet ved inkubering av amyloid (Bachem, Sveits) med en sluttkonsentrasjon på 1 µg/µL i Tris/HCl, pH 7,4, ved 37°C i 5 dager, etterfulgt av et sentrifugeringstrinn (10.000 rpm i 5 minutter).

Deretter ble amyloidpolymerer belagt på ELISA-plater med en sluttkonsentrasjon på 55 µg/mL, og bindingsaffinitet ELISA ved bruk av et anti-mus IgG monoklonalt antistoff (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) merket med alkalisk fosfat, foretatt. Antistoffet binder med høyere affinitet til polymert løselig amyloid β- (Aβ) protein (IC50 = 2,53nM) enn til fibere (IC50 = 5,27nM) og med lavest affinitet til monomerer (IC50 = 8,3nM). Disse dataene indikerer at antistoffets binding påvirkes ved siden av dets epitop ved konformasjonen av de forskjellige amyloide aggregatene.

EKSEMPEL 14: Epitop kartlegging av monoklonalt antistoff mACI-01-Ab7 C2 Epitop kartlegging av det monoklonale antistoff mACI-01-Ab7 C2 ble foretatt ved ELISA under bruk av tre forskjellige peptidbibliotek. Ett bibliotek omfatter totalt 33 biotinylerte peptider som dekker den fullstendige aminosyre- (aa) sekvens av Aβ1-42 (fremstilt av Mimotopes og anskaffet fra ANAWA Trading SA), det andre bibliotek inneholder biotinylerte peptider ved bruk av peptid 12 (aa12-20 av Aβ) fra det første peptidbibliotek og erstatning av hver aminosyre i sekvensen med alanin (se Tabell 41 nedenfor) og det tredje bibliotek inneholder biotinylerte peptider 13, 14 eller 15 (aa 13-21, 14-22 eller 15-23 av Aβ) og i hvert tilfelle erstatte den siste aminosyren med alanin eller med glycin for aa 21 som allerede er et alanin (se Tabell 5 nedenfor). Et biotinylert komplett Aβ1-42-peptid ble benyttet som positiv kontroll (Bachem). Epitop-kartlegging ble foretatt i henhold til produsentens (Mimotopes) instruksjoner. I korte trekk ble streptavidinbelagte plater (NUNC) blokkert med 0,1% BSA i PBS over natten ved 4°C. Etter vasking med PBS-0,05% Tween 20, ble plater belagt i 1 time ved RT med de forskjellige peptidene fra biblioteket, fortynnet i 0,1% BSA, 0,1% natriumazid i PBS, til en sluttkonsentrasjon på 10 µM. Etter vasking ble platen inkubert i 1 time ved RT med mACI-01-Ab7 C2 antistoffet eller et isotype kontrollmus IgG2b antistoff, fortynnet til 10 µg/mL i 2% BSA, 0,1% natriumazid i PBS. Plater ble på nytt vasket og inkubert med alkalisk fosfatase-konjugert geit antimus IgG i 1 time ved RT. Etter avsluttende vasking ble platene inkubert med fosfatasesubstrat (pNPP) og avlest ved 405 nm under bruk av en ELISA plateleser.

Det ble vist at det monoklonale antistoff mACI-01-Ab7 C2 bandt spesifikt til peptidene 12, 13, 14 og 15 av det første peptidbibliotek. Disse 4 peptidene omfatter aa 12-20 (VHHQKLVFF), 13-21 (HHQKLVFFA), 14-22 (HQKLVFFAE) og 15-23 (QKLVFFAED) av Aβ1-42, hvilket tyder på at epitopet ligger i regionen 12-23 av Aβ. Et andre bibliotek med alaninsubstitusjoner ble benyttet for å bestemme den kritiske aa for binding til peptid 12-20 (VHHQKLVFF). Bindingen av mACI-01-Ab7 C2 antistoffet tapes fullstendig når aa 16, 17, 19 eller 20 erstattes med et alanin, hvilket tyder på at disse aminosyrene er absolutt avgjørende for binding av antistoffet til Aβ. Bindingen av mACI-01-Ab7 C2 antistoffet tapes delvis når aa 15 og 18 byttes ut.

Bindingen gikk også nesten fullstendig tapt når aa 14 ble erstattet med alanin, hvilket indikerer at aa 14 også er meget viktig for binding.

Endelig ble et tredje bibliotek benyttet til å bestemme hvorvidt aa 21, 22 eller 23 er avgjørende for binding til epitopen. Bindingen av antistoffet til aa 15-23 ble redusert når aa 23 ble benyttet i stedet for alanin, hvilket indikerer at aa 23 også er viktig for binding. Bindingen gikk delvis tapt når aa 21 ble benyttet i stedet for glycin og noe tapt når aa 22 ble benyttet i stedet for alanin.

Tabell 4. Sammenfatning av peptider benyttet i det andre bibliotek Aminosyrer som er viktige for binding er kursivert og understreket og aminosyrer som er absolutt avgjørende for binding er kursivert og satt med fete typer og understreket

Tabell 5. Sammenfatning av peptider benyttet i det tredje bibliotek.

Aminosyrer som er viktige for binding er kursivert og understreket og aminosyrer som er absolutt avgjørende for binding er kursivert og satt med fete typer og understreket

EKSEMPEL 15: Påvirkning av passiv vaksinasjon med mACI-01-Ab7 C2 på hjernens amyloidbelastning i individuelle transgene hAPP mus

For å bestemme in vivo kapasiteten av det mACI-01-Ab7 C2 monoklonale antistoff til å binde og skille ut løselig amyloid ut fra hjernen, ble 6 måneder gamle single hAPP mus<9 >kjønns- og alders-overensstemmende, benyttet for en passiv immuniseringsstudie med ulik dose. Løselig amyloidbelastning ble analysert på slutten av studien ved å ta hjernen fra dyrene og foreta en Aβ1-40- og Aβ1-42-spesifikk ELISA (TGC, Tyskland).

8-13 dyr per gruppe fikk med en ukes intervall to injeksjoner av 100, 300 og 1000 µg monoklonalt antistoff i 200 µL PBS, mens injeksjon av kun PBS tjente som kontroll. En dag etter den andre injeksjon ble dyrene avlivet for biokjemisk analyse av løselig amyloidfraksjon. For å kvantifisere mengden humant Aβ 1-40 og humant Aβ 1-42 i den løselige fraksjon av hjernehomogenatene og/eller i cerebrospinalvæske (CSF), ble kommersielt tilgjengelige ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) sett benyttet (h Amyloid β 40 eller β 42 ELISA high sensitive, TGC, Sveits). Denne ELISA ble foretatt i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble standarder (en fortynning av syntetisk Aβ 1-40 eller Aβ 1-42) og prøver fremstilt i en 96-brønns polypropylenplate uten proteinbindingskapasitet (Greiner, Tyskland). Standardfortynningene med sluttkonsentrasjoner på 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 og 15,6 pg/mL og prøvene ble fremstilt i fortynningsmidlet for prøven, levert med ELISA-settet til et sluttvolum på 60 µL. Siden amyloidnivåer øker med alderen av musene og siden den faktiske evaluering fordrer at avlesningene av prøvene er innenfor den lineære del av standardkurven, ble prøvene for Aβ 40 analyse fortynnet 2:3, mens prøvene for Aβ 42 analyse ikke ble fortynnet.

Prøver, standarder og blindprøver (50 µL) ble tilsatt til den anti-Aβ-belagte polystyrolplate (oppfangende antistoff gjenkjenner selektivt den C-terminale ende av antigenet) foruten et selektivt anti-Aβ-antistoffkonjugat (biotinylert deteksjonsantistoff) og inkubert over natten ved 4°C for å muliggjøre dannelse av antistoff-amyloidantistoffkomplekset. Den påfølgende dag ble et streptavidin-peroksydase-konjugat tilsatt, etterfulgt 30 minutter senere ved tilsetning av en TMB/peroksydblanding, hvilket resulterte i omdannelse av substratet til et farget produkt, og fargeintensiteten ble målt ved hjelp av fotometri med en ELISA-leser med 450 nm filter. Kvantifisering av Aβinnholdet i prøvene ble oppnådd ved å sammenligne absorbans med standardkurven fremstilt med syntetisk Aβ 1-40 eller Aβ 1-42. Data ble uttrykt som individuelle endringer i forhold til midlere kontrollverdi (i prosent av kontroll).

Den totale mengde av Aβ 40 i hjernehomogenater kunne reduseres signifikant og stort sett ikke-signifikant for Aβ 42 når en enkelt hAPP mus passivt ble immunisert med to i.p. injeksjoner av monoklonalt antistoff ACI-01-Ab7 C2 i en dose på 300 µg (Aβ 40:-27,3 ± 13,9% med p<0,05; Aβ 42: -8,6 ± 22,4 med p=0,56; uparet Student’s T-test), mens 100 og 1000 µg ikke nådde signifikans. Immunisering med 100 µg fører til en økning av Aβ 40 og Aβ 42 i hjernehomogenater (Aβ 40: 32,3 ± 36,8%; Aβ 42: 38,3 ± 51,4%) mens behandling med 1000 µg utløste den riktige tendens til senkning av amyloidbelastning og kunne være potensielt effektiv med et økt antall dyr per gruppe (Aβ 40: -2,2 ± 26,0%; Aβ 42: -9,3 ± 15,9%). Disse dataene viser at antistoffet mACI-01-Ab7 C2 i en faktisk immuniseringsprotokoll er i stand til å minske den totale mengde løselig Aβ i hjernen for denne murine AD modell. Av interesse er det at det synes som om doseforholdet er forbigående, men flere studier med større grupper må utføres for å oppnå signifikante data.

EKSEMPEL 16: Påvirkning av kronisk passiv administrering av mACI-01-Ab7 C2 på plakkbelastning i dobbelt transgene hAPPxPS1 mus

For å bestemme in vivo evnen til mACI-01-Ab7 C2 monoklonalt antistoff til å binde og redusere amyloidplakk i hjernen, ble 3,5 måneder gamle dobbelt transgene hAPPxPS1 mus<10 >kjønns- og alderstilpassede, benyttet i en 4 måneders lang kronisk passiv immuniseringsstudie. Amyloide plakk ble analysert på slutten av studien ved histokjemi av dyrenes hjerne med binding av tioflavin S.

15 transgene dyr fikk over 16 uker injeksjoner av 500 µg monoklonalt antistoff i PBS. 15 dyr som bare fikk injisert PBS alene, tjente som kontroller. Alle injeksjoner ble gitt intraperitonealt. Ved avlivning ble musene anestetisert og spylt transkardialt med fysiologisk serum ved 4°C for å fjerne blod fra hjernekarene. Deretter ble hjernen tatt ut fra kraniet og bakhjerne og forhjerne separert med et kutt i det koronale/frontale plan. Forhjernen ble delt likt i venstre og høyre hemisfære ved å benytte et midtlinje sagittalsnitt. En hemisfære ble post-fiksert over natten i 4% paraformaldehyd for histologi. Saggital vibratomsnitt (40 µm) ble kuttet for fritt flytende inkubasjoner og oppbevart ved 4°C inntil farging i PBS med 0,1% natriumazid. Fem snitt i ulike nivåer ble farget for tette plakk med tioflavin S. Snitt fra alle anvendte dyr ble randomisert for farging og blind kvantifisering. Bilder ble tatt med et Leica DMR mikroskop forsynt med et Sony DXC-9100P kamera og analysert med en datamaskin ved bruk av Leica Q-Win programvare. Lysintensitet og kondensatorinnstillinger for mikroskopet ble holdt konstant under hele bildeopptaket. Alle oppnådde bilder ble underkastet de samme data-subrutiner for å minske systematisk observatørpåvirkning. Density slice thresholding ble anvendt regelmessig gjennom hele analysen. Subiculum-området ble valgt for automatisk kvantifisering av amyloidbelastning ved tioflavin S fargingen.

Den totale plakkbelastning og antallet plakk i subiculum-området kunne reduseres signifikant når doble hAPP/PS1 mus passivt ble immunisert i 4 måneder som beskrevet ovenfor. Med hensyn til plakkbelastning kunne det oppnås en signifikant minskning på 31% (mACI-01-Ab7 C2: 1,11 ± 0,21% og kontroll: 1,61 ± 0,35%; p=0,003, Mann-Whitney U-test), mens den kronisk passive immunisering signifikant reduserte plakkmengden med 19% (mACI-01-Ab7 C2: 8,73 ± 1,36% og kontroll: 10,78 ± 1,36%; p=0,006, Mann-Whitney U-test), hvilket indikerer at plakksolubilisering forekom i noe mindre grad enn plakk-sprengning.

EKSEMPEL 17: Påvirkning av passiv vaksinering med mACI-01-Ab7 C2 på hukommelseskapasitet i single transgene hAPP mus

For å analysere mACI-01-Ab7 C2 antistoffets evne til in vivo å modifisere eller øke kognitiv funksjonalitet, ble 9 måneder gamle kjønns- og alderstilpassede single hAPP mus benyttet i en passiv immuniseringsstudie. Ikke-spatial gjenkjenning ble målt ved slutten av immuniseringsperioden bestemt ved ny ORT (Object Recogniton Task).

12 dyr per gruppe fikk to intraperitoneale injeksjoner av 400 µg monoklonalt antistoff i 200 µL PBS mens injeksjon av kun PBS tjente som kontroll. En dag etter den andre injeksjon ble kognitiv evne studert i en ny ORT (Object Recogniton Task)<12, 13>. For innlemmelse i studien ble mus anbrakt i 10 minutter i et område for studie av adferd og stilt overfor et nytt ukjent objekt. Utforskningstiden ble registrert. Tre timer senere ble de samme dyrene igjen anbrakt i det samme området for en 2. omgang, med det gamle, tidligere utforskede objekt, og dessuten overfor et nytt objekt. Igjen ble utforskningstiden for begge objekter registrert og den resulterende kognisjonsindeks beregnet som forholdet mellom utforskningstid for det nye objekt i forhold til den totale utforskningstid, og uttrykt som proporsjonale endringer i forhold til kontrollen.

Passiv vaksinasjon med mACI-01-Ab7 C2 fører til en signifikant økning av kognitiv hukommelseskapasitet i single transgene AD-mus (mACI-01-Ab7 C2: 131,6 ± 9,1% og kontroll: 100,0 ± 9,2% med p<0,05; uparet Students T-test og n=12 i hver gruppe).

Deponeringer:

De følgende hybridomcellelinjer ble deponert ved ”Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)” i Braunschweig, Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig i henhold til Budapestavtalen:

_

_ Referanser

Bard F, Cannon C, Barbour R, Burke RL, Games D, Grajeda H, Guido T, Hu K, Huang J, Johnson-Wood K, Khan K, Kholodenko D, Lee M, Lieberburg I, Motter R, Nguyen M, Soriano F, Vasquez N, Weiss K, Welch B, Seubert P, Schenk D, Yednock T. (2000). Nature Med. 6, 916-919.

Barghorn S, Nimmrich V, Striebinger A, Krantz C, Keller P, Janson B, Bahr M, Schmidt M, Bitner RS, Harlan J, Barlow E, Ebert U, Hillen H (2005) Globular amyloid betapeptide oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease. J Neurochem 95:834-847.

Baschong W, Wrigley NG (1990) Small colloidal gold conjugated to Fab fragments or to immunoglobulin G as high-resolution labels for electron microscopy: a technical overview. J Electron Microsc Tech 14:313-323.

Blond and Goldberg, 1987, PNAS March 1, 1987 Vol. 84 | no. 5 1 1147-1151 Cornilescu G, Delaglio F, Bax A. (1999) J.Biomol.NMR; 13: 289-302.

Burdick, D. et a/. Assembly and aggregation properties of synthetic Alzheimer's A4/beta amyloid peptide analogs. J. Biol. Chem. 267, 546-554 (1992).

DeMattos, Bales, KR, Cummins, DJ, Dodart, JC, Paul, SM, Holtzmann, D M (2001). Proc Natl Acad Sci U S A 98, 8850-8855.

Dewachter I, Van DJ, Smeijers L, Gilis M, Kuiperi C, Laenen I, Caluwaerts N, Moechars D, Checler F, Vanderstichele H, Van LF (2000) Aging increased amyloid peptide and caused amyloid plaques in brain of old APP/V717I transgenic mice by a different mechanism than mutant presenilinl . J Neurosci 20:6452-6458.

Dewachter I, Reverse D, Caluwaerts N, Ris L, Kuiperi C, Van den HC, Spittaels K, Umans L, Semeels L, Thiry E, Moechars D, Mercken M, Godaux E, Van Leuven F (2002) Neuronal deficiency of presenilin 1 inhibits amyloid plaque formation and corrects hippocampal long-term potentiation but not a cognitive defect of amyloid precursor protein [V717I] transgenic mice. J Neurosd 22:3445-3453.

Glenner and Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 885-890 (1984)

Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988))

Heneka MT, Sastre M, Dumitrescu-Ozimek L, Dewachter I, Walter J, Klockgether T, Van LF (2005) Focal glial activation coincides with increased BACE1 activation and precedes amyloid plaque deposition in APP[V717I] transgenic mice. J Neuroinflammation 2:22.

Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991)

Iwadate M, Asakura T, Williamson MP. (1999) J.Biomol.NMR; 13: 199-211.

Kirschner.D.A., Abraham, C., & Selkoe.D.J. X-ray diffraction from intraneuronal paired helical filaments and extraneuronal amyloid fibers in Alzheimer disease indicates crossbeta conformation. Proc. Nail. Acad. Sci. U. S. A 83, 503-507 (1986).

Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982)

Kennedy, J. H,, et al. ,1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31)

Kiein WL (2002) Abeta toxicity in Alzheimer's disease: globular oligomers (ADDLs) as new vaccine and drug targets. Neurochem Int 41 (5):345-352.

Kohler and Mllstein (Nature 256: 495-497 (1975))

LeVine, H. Ill, (2002). Arch Biochem Biophys 4Q4, 106-115.

Luca et al., 2001

McGeer et al., 1994

Moechars D, Dewachter I, Lorent K, Reverse D, Baekelandt V, Naidu A, Tesseur I, Spittaels K, Haute CV, Checler F, Godaux E, Cordell B, Van LF (1999) Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain. J Biol Chem 274:6483-6492.

Nelson, R. & Eisenberg,D. Recent atomic models of amyloid fibril structure. Curr. Opin. Struct. Biol.( 2006).

Nicolau, C., Greferath, R., Balaban, T. S., Lazarte, J. E„ and Hopkins, R. J. (2002). Proc Natl Acad Sci U S A 99, 2332-2337.

Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 66:10029-10032 (1989)

Pearson W.R. (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98

Petkova AT, Buntkowsky G, Dyda F, Leapman RD, Yau WM, Tycko R. J. Mol. Biol. 2004; 335: 247-260.

Petkova AT, Ishii Y, Balbach JJ, Antzutkin ON, Leapman RD, Delaglio F, Tycko R. (2002) Proc. Nat .Acad .Sci . U . S . A; 99: 16742-16747.

Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986 Rzepecki, P., Nagel-Steger, L, Feuerstein, S., Linne, U., Molt, O., Zadmard, R., Aschermann, K., Wehner, M., Schrader, T. and Riesner, D. (2004). J Biol Chem 279, 47497-47505.

Sambrook et al. loc. cit.

Schenk D, Barbour R, Dunn W, Gordon G, Grajeda H, Guido T, Hu K, Huang J, Smith, S. O., and Bormann, B. J. (1995). Proc Natl Acad Sci U S A 92, 488-491.

Schenk et a I. , 1999

Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 81 :1-40

Slot JW, Geuze HJ (1985) A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry- Eur J Cell Biol 38:87-93.

Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489

Van dA, l, Wera S, Van LF, Henderson ST (2005) A ketogenic diet reduces amyloid beta 40 and 42 in a mouse model of Alzheimer's disease. Nutr Metab (Lond) 2:28.

Wagner et al (2002) Journal of Liposome Research Vol 12(3), pp 259 - 270

Ye, J., Dave, U. P., Grishin, N. V., Goldstein, J. L, and Brown, M. S. (2000). Proc Natl Acad Sci U S A 97, 5123-5128.

Zrein et al. (1998), Cinincal and Diagnostic Laboratory Immunology, 5(1): 45-49.

Experimental Eye Research 78 (2004) 243-256

WO 2004/058258

W096/1 359

WO96/29605

Hanam E. et al (1996), Amyloid: The international Journal of Experimental and Clinical Investigation, vol. 3, 130-133.

US 2003/108551

WO 2007/064972

Claims

PATENTKRAV

1. Antistoff eller funksjonell del derav, som er i stand til å gjenkjenne og binde en spesifikk epitop av amyloid beta, hvor nevnte antistoff eller funksjonelle del derav omfatter et epitopbindende fragment av et monoklonalt antistoff oppnådd fra hybridomcellelinjen FP 12H3-C2, deponert 1. desember, 2005 som

DSM ACC2750.

2. Monoklonalt antistoff eller en funksjonell del derav, produsert av hybridomcellelinjen FP 12H3-C2, deponert 1. desember, 2005 som

DSM ACC2750.

3. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav eller funksjonelle deler derav, som er et monoklonalt antistoff, eller et kimært antistoff.

4. Humanisert antistoff, eller en funksjonell del derav, hvilket antistoff eller funksjonelle del derav omfatter de komplementærbestemmende regionene (CDR-er) til et monoklonalt antistoff oppnådd fra hybridomcellelinje FP 12H3-C2, deponert 1. desember, 2005 som DSM ACC2750.

5. Polynukleotid omfattende en nukleotidsekvens som koder for et antistoff eller funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1-4.

6. Cellelinje som produserer et antistoff eller funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1-4.

7. Cellelinje ifølge krav 6, som er hybridomcellelinje FP 12H3-C2, deponert 1. desember, 2005, som DSM ACC2750.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff eller funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 omfattende å dyrke cellelinjen ifølge krav 6 eller 7.

9. Antistoff eller funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 fremstilt av fremgangsmåten ifølge krav 8.

10. Sammensetning omfattende antistoffet eller funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, og eventuelt ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.

11. Sammensetning ifølge krav 10 for anvendelse ved behandlingen av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med amyloid eller amyloid-lignende proteiner inklusivt amyloidose.

12. Blanding omfattende et antistoff eller funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, og, eventuelt, et ytterligere biologisk virkestoff benyttet ved medisineringen av sykdommer og lidelser som forårsakes av eller er assosiert med amyloid eller amyloid-lignende proteiner og/eller en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel og/eller et hjelpestoff.

13. Anvendelse av et monoklonalt antistoff og/eller en funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller en sammensetning ifølge krav 10 eller 11, eller en blanding ifølge krav 12, for fremstillingen av et medikament til behandling eller lindring av virkningen av amyloidose inklusivt men ikke begrenset til:

(a) nevrologiske forstyrrelser så som Alzheimers sykdom (AD);

(b) sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet, som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type), og Guam Parkinson demenskomplekset; og (c) progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose, Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes; senil kardial amyloidose, endokrine tumorer, og maculadegenerasjon.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff eller en funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4, eller en sammensetning ifølge krav 10 eller 11, eller en blanding ifølge krav 12 for anvendelse til behandling eller lindring av virkningen av amyloidose inklusivt, men ikke begrenset til:

(a) nevrologiske forstyrrelser så som Alzheimers sykdom (AD);

(b) sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet, som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type), og Guam Parkinson demenskomplekset; og (c) progressiv supranukleær lammelse, multippel sklerose, Creutzfeld Jacob sykdom, Parkinsons sykdom, HIV-relatert demens, ALS (amyotrofisk lateralsklerose), inklusjonslegeme myositt (IBM), aldersdiabetes, senil kardial amyloidose, endokrine tumorer, og maculadegenerasjon.

15. Sammensetning ifølge krav 10 eller 11 for anvendelse til:

(a) å redusere plakkbelastningen eller å redusere mengden plakk i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en amyloidassosiert sykdom eller tilstand; eller

(b) å redusere mengden plakk i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand; eller

(c) å minske den totale mengde løselig Aβ i hjernen til et dyr, særlig et pattedyr, men spesielt et menneske som lider av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand; eller

(i) nevrologiske forstyrrelser så som Alzheimers sykdom (AD);

(ii) sykdommer eller tilstander som kjennetegnes ved tap av kognitiv hukommelseskapasitet, som for eksempel mild kognitiv svekkelse (MCI), Lewylegeme demens, Downs syndrom, arvelig cerebral hemoragi med amyloidose (Dutch type), og Guam Parkinson demenskomplekset; og

16. Cellelinje ifølge krav 6, som er en hybridomcellelinje.

17. Fremgangsmåte for diagnostisering av en amyloid-assosiert sykdom eller tilstand hos en pasient omfattende påvisning av den immunspesifikke binding av et monoklonalt antistoff eller et aktivt fragment derav til en epitop av amyloidproteinet i en prøve som omfatter trinnene:

(a) bringe prøven som mistenkes for å inneholde amyloidantigenet i kontakt med et antistoff eller funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvilket antistoff eller funksjonell del derav binder en epitop av amyloidproteinet;

(c) påvise dannelsen av det immunologiske komplekset; og

18. Fremgangsmåte for diagnostisering av en predisposisjon for en amyloidassosiert sykdom eller tilstand i en pasient omfattende påvisning av den immunspesifikke binding av et monoklonalt antistoff eller et aktivt fragment derav til en epitop av amyloidproteinet i en prøve som omfatter trinnene:

(a) bringe prøven som mistenkes for å inneholde amyloidantigenet i kontakt med et antistoff eller funksjonell del derav ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvilket antistoff eller funksjonelle del derav binder en epitop av amyloidproteinet;

(c) påvise dannelsen av det immunologiske komplekset; og

hvor en økning i mengden av nevnte aggregat sammenlignet med en normal kontrollverdi indikerer at nevnte pasient er under risiko for utvikling av en amyloidassosiert sykdom eller tilstand.

19. Fremgangsmåte for monitorering av minimalt gjenværende sykdom i en pasient etter behandling med et antistoff eller funksjonell del derav eller en sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter:

(c) påvise dannelsen av det immunologiske komplekset; og

20. Fremgangsmåte for å forutsi responsen til en pasient som behandles med et antistoff eller funksjonell del derav eller en sammensetning ifølge hvilket som helst av de foregående krav omfattende:

(c) påvise dannelsen av det immunologiske komplekset; og

21. Testsett for påvisning og diagnose av amyloid-assosierte sykdommer og tilstander omfattende et antistoff eller funksjonell del derav ifølge hvilke som helst av kravene 1-4.