CN102051407B - Hiv-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，其将表达Gag/Gag-Pol的质粒与表达融合蛋白A的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞BRET1ratio的变化，BRET1 ratio下降，则待检样品为早成熟化诱导剂，所述融合蛋白A为由p2/p7连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的融合蛋白，该荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生生物发光共振能量转移1。利用本发明方法能够方便、快速地筛选早成熟化诱导剂，对HIV的治疗药物的筛选提供了新途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种筛选HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法。
背景技术
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染导致人体免疫机能缺陷，而易于发生机会性感染和肿瘤的临床综合征。在过去的20多年里造成2000多万人死亡，目前全世界艾滋病病毒感染者已达4000万左右。艾滋病不仅成为我国严重的卫生健康问题，同时每年造成了上千亿的直接经济损失。据中国卫生部2008年通报，全国累计报告HIV感染者达25万多人，预计则高达约70万人。
目前临床使用的传统的抗艾滋病药物虽在抗HIV-1方面起到了很大的作用，但仍存在一些问题，如在人体内活性不高、口服生物利用度低、易产生耐药性或交叉耐药性及生产成本高等。耐药是病毒的药物作用靶位蛋白变异的结果。因为耐药株经常对一组抗病毒药物耐药，并且同一类药物之间交叉耐药非常常见。因此，急需寻找作用于新靶点的高效低毒的抗艾滋病药物。21世纪以来，研究人员的视线已集中到很多的新的靶点上。
HIV-1基因组由两条单链正链RNA组成，每个基因组约为9.7kb。结构上包括LTR，结构蛋白编码区(gag)，多种酶活性的蛋白编码区(pol)，外膜蛋白(env)编码区以及6个调节基因。gag基因编码病毒的核心蛋白，翻译时先形成一个分子量大约是55kD的前体蛋白(p55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成matrix(MA)、capsid(CA)、p2、nucleocapsid(NC)、p1和p6gag。pol基因产物与各种酶的功能相关，如HIV-1蛋白酶(PR)，逆转录酶(RT)、整合酶(IN)等。Pol基因不能单独翻译，gag基因翻译过程中，会有5％～10％的几率发生特定的移码，使翻译继续下去，得到160kD的Gag-Pol。Gag-Pol在HIV蛋白酶的作用下裂解成MA、CA、p2、NC、移码蛋白(TF)、PR、RT、IN。
HIV-1蛋白酶(protease，PR)是由HIV-1pol基因5’端所编码。该酶含99个氨基酸，属天冬氨酸蛋白酶。全酶为旋光对称的同源二聚体，而二者界面形成酶活性中心。HIV-1PR作为前体蛋白(precursor)Gag-Pol的一部分被翻译出来，前体蛋白形式的PR处于无活性状态。Gag-Pol通过与HIV-1另一前体蛋白Gag相互结合，形成未成熟的病毒颗粒。病毒颗粒装配完成后，在病毒出芽或者出芽后的瞬间，Gag-Pol中的PR被激活，将Gag-Pol和Gag剪切成为较小的成熟结构蛋白和酶(包括逆转录酶和整合酶)，这个过程称为病毒的成熟化。只有经过PR酶切加工形成的成熟病毒颗粒才具有感染性。
目前，针对HIV-1PR的药物研究集中在抑制其活性上，使前体蛋白Gag和Gag-Pol不能被酶切成为结构蛋白和酶，不能形成成熟的病毒颗粒，从而可达到抗病毒的效果。HIV蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor，PI)自1995年应用于临床以来已取得了显著成果，但易产生耐药及交叉耐药，且不能彻底治愈艾滋病。
HIV-1PR活性的严格调控对于病毒的生存至关重要。研究表明，如果Gag-Pol中的PR在装配完成前被激活，会导致前体蛋白Gag-Pol和Gag被提前酶切加工，这一过程被统称为前体蛋白早成熟化(premature)。一旦发生前体蛋白早成熟化，病毒颗粒便无法装配，因此病毒颗粒的产量将显著减少，甚至无病毒颗粒产生。目前，HIV-1病毒装配完成前，细胞内Gag-Pol中PR活性的抑制机制，以及装配完成后，PR被迅速激活的机制尚不清除。尽管如此，如果能干扰HIV-1PR活性的调控机制，特异性的激活前体蛋白中的PR，诱导前体蛋白早成熟化，就可以直接抑制病毒的复制。然而，到目前还没有一种能够用于筛选这种诱导剂的方法。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法。
本发明提供的HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，包括步骤：将表达Gag/Gag-Pol的质粒与表达融合蛋白A的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞BRET1ratio的变化，BRET1ratio下降，则待检样品为早成熟化诱导剂。所述融合蛋白A为由p2/p7连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的融合蛋白。
上述荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生生物发光共振能量转移1(Bioluminescence resonance energy transfer 1，BRET1)。
上述荧光酶可选自：海肾荧光素酶。
相应的荧光酶激发受体可选自：EYFP、EGFP、YFP、GFP。
在发明实例中，一种优选的融合蛋白为EYFP-p2/p7-Rluc。所述表达Gag/Gag-Pol的质粒为pVRC4200质粒。所述表达融合蛋白A的质粒为pEYFP-p2/p7-Rluc。所述宿主细胞为293T细胞。
具体地首先构建表达融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc的质粒pEYFP-p2/p7-Rluc，将其与表达Gag/Gag-Pol的质粒pVRC4200质粒共转染293T细胞，转染24h后，添加样品至转染后的293T细胞，再培养16h，检测细胞BRET1 ratio的变化。如样品对该模型有效，即能够提前激活Gag-Pol中的PR，则BRET1 ratio下降。
本发明运用生物发光共振能量转移1(Bioluminescence resonanceenergy transfer1，BRET1)技术，建立了细胞水平的HIV-1前体蛋白早成熟化激活剂筛选模型。这一模型的原理为在增强的黄色荧光蛋白(EYFP)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase，Rluc)之间插入HIV-1PR的识别序列p2/p7(ATIMMQRG)，表达为融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc，加入Rluc底物coelenterazine h(λem～475nm)，在Rluc与EYFP距离小于
时，催化产生的光波能量转移，激发受体EYFP(λem～535nm)。生物发光共振能量转移比例(BRET1 ratio)＝535nm发射光强度/475nm发射光强度(表达融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc)-535nm发射光强度/475nm发射光强度(只表达蛋白Rluc)。同HIV-1基因组相似，pVRC4200表达Gag和Gag-Pol，两者比例20∶1，可形成病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)。将pEYFP-p2/p7-Rluc质粒与pVRC4200质粒共转染293T细胞，如加入的化合物能够提前激活Gag-Pol中的PR，细胞内的HIV-1PR活性升高，HIV-1PR识别EYFP和Rluc之间的p2/p7序列，酶切融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc，使得EYFP和Rluc分开，距离大于
将无生物发光共振能量转移现象，BRET1ratio将下降。
本发明方法提供了一种用于HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂筛选的方法，利用该方法能够方便、快速地筛选早成熟化诱导剂，对HIV的治疗药物的筛选提供了新途径。
附图说明
图1是pEYFP-p2/p7-Rluc的质粒图谱；
图2是pVRC4200的质粒图谱。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1构建表达载体
应用PCR扩增pEYFP-N1(Clontech公司)质粒中的EYFP基因片段。所用引物：上游引物5′-TAG TAC AAG CTT C GCC ACCATG GTG AGC AAG-3′，下游引物5′-TGA TTA GGA TCC CTTGTA CAG CTC GTC CAT GC-3′。
反应体系：
反应条件：94℃45s，68℃90s，共30个循环。
P2/p7接头：
Sense：5′-GATTCAATTCAGCTACCATAATGATGCAGAGAGGCAATTTTGGTAC-3′，
Anti-sense：5′-CAAAATTGCCTCTCTGCATCATTATGCTAGCTGAATTG-3′
退火反应体系：
70℃水浴10min，室温冷却1-2h。
将EYFP、p2/p7片段插入到真核细胞表达载体pRluc-N2(PerkinElmer)的多克隆位点(HindIII和KpnI)，得到质粒pEYFP-p2/p7-Rluc，表达融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc。
2细胞培养
取293T细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化。待细胞变圆，弃消化液，立即加入含10％FBS的高糖DMEM培养基(HyClone)，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，10cm细胞培养皿接种2.4×106个细胞，培养24h后转染。
3细胞转染
转染步骤按Lipofectamine 2000(Invitrogene)的说明书进行。具体操作如下：用1.5ml高糖DMEM培养基稀释质粒，pEYFP-p2/p7-Rluc和pVRC4200质粒(Dr.Gary Nable馈赠)用量均为1.5μg。用1.5ml高糖DMEM培养基稀释60μl Lipofectamine 2000。室温孵育5min，将含有转染质粒和Lipofectamine 2000的培养基轻轻混匀(总体积为3ml)，室温孵育20min，加到10cm培养皿的细胞培养上清中。
转染后，37℃，5％的CO2培养12h。然后吸去旧的培养基，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化，弃消化液，立即加入含10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打，使细胞分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，用培养基将细胞浓度调整为2.5×105个/ml，四周白色不透明、底部透明、平底的96孔板(Costar)每孔接种150μl细胞悬液。
4样品制备
化合物样品：10mg纯品化合物溶到1ml DMSO中，50％DMSO稀释到1mg/ml，取1.5μl作用于150μl细胞体系，使其终浓度为10μg/ml。
发酵液样品：菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃、190rpm旋转摇床培养4d。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用1ml的DMSO溶解。取10μl加10μl水倍比稀释，取1.5μl作用于150μl细胞体系。
Efavirenz(EFV)由NIH提供，50％DMSO溶解，终浓度为500μM，取1.5μl作用于150μl细胞体系。EFV能加速Gag-Pol的二聚化，导致细胞内被激活的HIV-1PR增多，在本筛选模型里作为阳性化合物。
5样品活性检测
96孔板培养12h后，按以下分组进行操作。
阴性对照组：加入1.5μl 50％DMSO于细胞培养上清中，该组反映pVRC4200质粒表达的Gag-Pol激活的PR对融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc的酶切程度。
阳性药对照组：加1.5μl的500μM EFV于150μl的细胞体系中，使EFV的终浓度为5μM。该组反映EFV提前激活Gag-Pol中的PR的程度。
样品实验组：加药筛选的样品1.5μl于150μl的细胞体系中。该组反映筛选样品提前激活Gag-Pol中的PR的程度。
继续培养16h后，吸去旧的培养基，每孔加入100μL含5μM Rluc底物coelenterazine h的PBS，测定480nm(±10nm)，535nm(±10nm)两处发射光强度，计算BRET1 ratio。
生物发光共振能量转移比率(BRET1 ratio)＝535nm发射光强度/475nm发射光强度(表达融合蛋白EYFP-p2/NC-Rluc)-535nm发射光强度/475nm发射光强度(只表达蛋白Rluc)。
PR激活率＝(样品实验组-阴性对照组)/(阳性组-阴性对照组)×100％
结果，阳性药物对照组的荧光强度显著强于阴性对照组，表明EFV激活了Gag-Pol中的PR导致了前体蛋白的早成熟化。从组合化学库共筛选3000个样品，其中初筛阳性化合物3个，阳性率为0.10％。
序列表
<110>中国医学科学院医药生物技术研究所
<120>HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法
<130>KHP09113512.2
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tagtacaagc ttcgccacca tggtgagcaa g 31
<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tgattaggat cccttgtaca gctcgtccat gc 32
<210>3
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gattcaattc agctaccata atgatgcaga gaggcaattt tggtac 46
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
caaaattgcc tctctgcatc attatgctag ctgaattg 38
Claims (8)
1.HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，其特征在于将表达Gag和Gag-Pol的质粒与表达融合蛋白A的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞BRET1比率的变化，BRET1比率下降，则待检样品为早成熟化诱导剂，
所述融合蛋白A为由p2/p7连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的融合蛋白，该荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生BRET1；所述p2/p7序列为ATIMMQRG。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光酶选自：海肾荧光素酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述荧光酶激发受体选自：EYFP、EGFP、YFP、GFP。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白为EYFP-p2/p7-Rluc。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达Gag和Gag-Pol的质粒为pVRC4200质粒。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达融合蛋白A的质粒为pEYFP-p2/p7-Rluc。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:构建表达融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc的质粒pEYFP-p2/p7-Rluc，将其与表达Gag和Gag-Pol的质粒pVRC4200质粒共转染293T细胞，转染24h后，添加样品至转染后的293T细胞，再培养16h，检测细胞BRET1比率的变化。
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