CN112957361B - 曲美替尼在制备抗沙粒病毒的抗病毒制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及曲美替尼在制备抗沙粒病毒的抗病毒制剂中的应用，属于药物应用技术领域。具体为曲美替尼在制备抑制或杀灭沙粒病毒的抗病毒制剂中的应用。本发明提供曲美替尼的新的应用，扩大其应用范围，特别地，曲美替尼可以用于沙粒病毒的抗病毒制剂，杀灭或抑制沙粒病毒，继而可以治疗沙粒病毒感染以及其感染导致的疾病。

Description

曲美替尼在制备抗沙粒病毒的抗病毒制剂中的应用

技术领域

本发明涉及药物应用技术领域，具体而言，涉及曲美替尼在制备抗沙粒病毒的抗病毒制剂中的应用。

背景技术

哺乳动物沙粒病毒(Mammarenavirus)属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)沙粒病毒科(Arenaviridae)。依据抗原性，血清学，地理学和基因同源性，哺乳类沙粒病毒分为两类：旧世界沙粒病毒(old world arenavirus)和新世界沙粒病毒(new worldarenavirus)。

旧世界沙粒病毒中，有两种病毒可以导致出血热疾病，分别是拉沙热病毒(Lassavirus，LASV)和卢约病毒(Lujo virus，LUJV)。LASV会导致拉沙出血热，疾病在西非地区流行。根据世界卫生组织报道，每年约有100,000至300,000人感染拉沙热，约5000人死亡。LUJV感染会导致卢约出血热，病例首次在南非地区发现。LASV和LUJV是四级病原。旧世界沙粒病毒还包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)，该病毒感染会造成淋巴细胞性脉络丛脑膜炎，案例在欧洲、美洲、澳大利亚和日本均有报道，LCMV是二级病原。

新世界沙粒病毒主要流行于南美洲。新世界沙粒病毒中五种病毒可以导致出血热疾病。分别是胡宁病毒(Junín virus，JUNV)、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus，GTOV)、马丘波病毒(Machupo virus，MACV)、沙比亚病毒(Sabiá virus，SBAV)和查帕雷病毒(Chaparevirus，CHAPV)。JUNV导致阿根廷出血热，南美洲有500万人口存在患病风险。GTOV会导致委内瑞拉出血热，疾病的死亡率为23％，约99％的患者在瓜纳瑞托地区居住。MACV会导致玻利维亚出血热。首例病例在玻利维亚东北部被发现，疾病死亡率约为20％。SBAV会导致巴西出血热，首例病例在巴西圣保罗市被发现。CHAPV会导致查帕雷出血热，首例病例在玻利维亚科恰班巴省被发现，以上五种新世界沙粒病毒均为四级病原。

沙粒病毒的GP介导沙粒病毒进入，沙粒病毒GP分为三部分：稳定的信号肽(stablesignal peptide，SSP)、负责受体结合的GP1和负责膜融合的GP2。成熟的GP以同源三聚体的形式镶嵌在病毒包膜表面，形成包膜糖蛋白复合体(Glycoprotein complex，GPC)。因为四级病原研究受限，研究者可以使用骨架为水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)，包膜糖蛋白是沙粒病毒GPC的假病毒和重组病毒来模拟沙粒病毒的进入过程，在P2实验室中研究沙粒病毒的进入过程。如果药物抑制包膜糖蛋白为沙粒病毒GPC的假病毒和重组病毒，但是不抑制包膜糖蛋白为VSV糖蛋白的假病毒和重组病毒，说明药物具有抑制沙粒病毒入侵的能力。

目前没有获得批准的特异性抑制沙粒病毒的药物。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供曲美替尼在制备抗沙粒病毒的抗病毒制剂中的应用。本发明提供曲美替尼的新的应用，扩大其应用范围，特别地，曲美替尼可以用于沙粒病毒的抗病毒制剂，杀灭或抑制沙粒病毒，继而可以治疗沙粒病毒感染以及其感染导致的疾病。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种曲美替尼在制备抑制或杀灭沙粒病毒的抗病毒制剂中的应用。

第二方面，本发明提供一种曲美替尼在制备治疗沙粒病毒感染或沙粒病毒感染导致的疾病的药物中的应用。

在可选的实施方式中，所述沙粒病毒包括旧世界沙粒病毒或新世界沙粒病毒；

在可选的实施方式中，所述旧世界沙粒病毒包括拉沙热病毒、卢约病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒中的至少一种；

优选地，所述新世界沙粒病毒包括胡宁病毒、瓜纳瑞托病毒、马丘波病毒、沙比亚病毒和查帕雷病毒中的至少一种；

在可选的实施方式中，所述疾病包括出血热或脑膜炎；

优选地，所述脑膜炎为淋巴细胞脉络丛脑膜炎。

在可选的实施方式中，所述药物为抑制沙粒病毒入侵过程的药物。

在可选的实施方式中，所述药物为抑制沙粒病毒的膜融合过程的药物。

在可选的实施方式中，在细胞实验模型中，所述曲美替尼的有效半抑制浓度为0.756μM-10.36μM。

第三方面，本发明提供曲美替尼在制备抑制沙粒病毒入侵过程或抑制沙粒病毒的膜融合过程的抑制剂中的应用。

第四方面，本发明提供曲美替尼在制备抑制拉沙热病毒和/或卢约病毒的膜融合过程的抑制剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供的曲美替尼能够有效抑制沙粒病毒的入侵过程以及包膜糖蛋白介导的膜融合过程，继而能够有效杀灭或者抑制沙粒病毒，继而曲美替尼可以作为杀灭或者抑制沙粒病毒的抗病毒制剂，继而对于沙粒病毒感染以及其感染导致的疾病，例如出血热、脑膜炎等有良好的治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例1提供的曲美替尼抑制多种沙粒病毒假病毒的感染效果的结果图；

图2为本发明实验例2提供的曲美替尼抑制LUJV-GPC重组病毒的感染效果的结果图；

图3为本发明实验例3提供的曲美替尼抑制LCMV病毒感染效果的结果图；

图4为本发明实验例4提供的曲美替尼对细胞活性的影响的结果图；

图5为本发明实验例5提供的曲美替尼曲美替尼对LUJV，LASV膜融合的抑制效果的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

采用的药物：曲美替尼，其结构式为：

构建工具病毒：

1、表达沙粒病毒GPC的具有感染宿主细胞能力的假病毒，病毒携带海参荧光素酶报告基因，通过对海肾荧光素酶的活性进行测量，反应药物抑制病毒进入的效果。具体的分别使用LASV、LUJV、LCMV、JUNV、MACV、GTOV、SBAV和CHAPV的GPC，以及VSV-G制备上述病毒。

2、构建具有复制能力的，包膜糖蛋白为LUJV-GPC，而基因组为水泡性口炎病毒并且基因组中插入GFP的重组病毒。该病毒具有进入和重复感染的能力。

实验使用具有感染复制能力的LCMV活病毒，由实验室通过反向遗传学方法拯救。LCMV属于旧世界沙粒病毒，可以在生物安全二级实验室操作。通过对活病毒效果，进一步的确定药物效果。

实验使用的Vero E6细胞和A549细胞均来源于ATCC。

实验例1抑制多种沙粒病毒假病毒的感染效果

操作方法：

1)实验使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基分别对Vero E6细胞和A549细胞进行培养，并且在实验的前一天分别对细胞进行消化，将细胞以250000cells/mL的细胞密度分别接种到96孔板中。

2)实验当天使用2％DMEM培养基对曲美替尼进行稀释，对LASV，LUJV和VSV的使用浓度均为：75μM，15μM，3μM，0.6μM，0.12μM，0.024μM。对LCMV，JUNV，GTOV，MACV，SBAV和CHAPV的使用浓度均为：100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM，1.5625μM，0.78125μM，0.390625μM，而后将30μl曲美替尼转移至细胞孔中，药物与细胞共孵育1h。

3)1h后将病毒稀释。将20μL病毒稀释液置于细胞孔中。病毒感染1h。病毒为含有沙粒病毒LASV，LUJV，LCMV，JUNV，GTOV，MACV，SBAV，CHAPV GPC的假病毒和包膜糖蛋白为VSV-G的假病毒。

4)对96孔板进行换液操作，更换为不含药物的2％胎牛血清DMEM培养基。

5)24h后通过收集Luc酶活性判断药物抑制活性。其中2％胎牛血清DMEM培养基培养的细胞的感染率为100％，以Luc酶活性为指标计算药物处理后的病毒抑制效果。

检测结果参见图1，根据图1可知，(1)曲美替尼对包膜表面含有LASV，LUJV，LCMV，JUNV，GTOV，MACV，SBAV和CHAPV的假病毒具有剂量依赖的抑制能力。

(2)LASV，LUJV，LCMV，JUNV，GTOV，MACV，SBAV和CHAPV的半有效抑制浓度依次为0.756μM、1.25μM和4.822μM、2.899μM、10.36μM、9.147μM、7.77μM、4.023μM。

(3)随药物浓度的提升，药物对病毒的抑制效果逐步升高。

综上可知，曲美替尼对在不同浓度下对VSVpv的抑制效果均小于20％，且没有明显的剂量关系，说明药物对VSVpv无效。进一步说明药物靶向沙粒病毒，抑制沙粒病毒的入侵过程。

实验例2抑制LUJV-GPC重组病毒的感染效果

操作方法：

1)实验使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基对Vero E6细胞和A549细胞进行培养，并且在实验的前一天对细胞进行消化，将细胞以250000cells/ml的细胞密度接种到96孔板中。

2)实验当天使用2％胎牛血清的DMEM培养基对曲美替尼进行稀释，稀释至使用浓度：75μM，15μM，3μM，0.6μM，0.12μM，0.024μM。后将30μL药物转移至细胞孔中，药物与细胞共孵育1h。

3)1h后将病毒以MOI＝0.1的用量稀释。将20μL病毒稀释液置于细胞孔中。病毒感染1h。

4)对96孔板进行换液操作换为含有对应浓度药物的2％胎牛血清DMEM培养。

5)24h后通过收集海肾荧光素酶活性或GFP荧光强度判断药物抑制活性。其中2％胎牛血清DMEM培养基培养的细胞的感染率为100％。以GFP荧光强度减少水平为指标计算药物处理后的病毒抑制效果。

检测结果参见图2，根据图2可知，曲美替尼对病毒具有抑制效果，对包膜糖蛋白为LUJV-GPC的具有复制能力的病毒的半数有效抑制浓度为0.817μM。且随着药物浓度的提高，药物对LUJV重组病毒的抑制效果得到提升。曲美替尼在Vero E6和A549两种细胞中都具有剂量依赖的抑制效果，说明药物对病毒的抑制效果不是细胞特异性的。

实验例3：抑制LCMV病毒感染效果

操作方法：

1)实验使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基对Vero E6细胞进行培养，并在实验前一天对细胞进行消化接种。

2)将细胞以250000cells/mL的密度进行稀释，每孔500μL接种到24孔板中。

3)实验当天首先使用不同稀释浓度的曲美替尼200μL与细胞孵育1h。曲美替尼稀释浓度分别为75μM，15μM，3μM，0.6μM，0.12μM，0.024μM。

4)孵育1h后以MOI＝0.1感染细胞，细胞感染1h后吸出原培养基，更换为含有药物的培养基。

5)感染24h后使用TRIzol裂解液对细胞进行裂解，并且收样。收样后对细胞进行RNA的提取，并将RNA反转为cDNA。

6)对病毒的cDNA进行荧光定量PCR检测，得到病毒的感染率，并计算得到药物对该病毒的抑制效果。

检测结果参见图3，根据图3可知，对LCMV活病毒具有计量依赖的抑制效果，半数有效抑制浓度为3.919μM。随着药物浓度的提高，药物对LCMV活病毒的抑制效果得到提升。药物对LCMV活病毒和对LCMV假病毒的抑制效果接近，暗示药物靶向作用于病毒的进入阶段。

实验例4曲美替尼对细胞活性的影响

操作方法：

1)对细胞进行计数，以25000cells/mL的浓度，将细胞均匀铺至96孔板。

2)实验当天使用2％胎牛血清DMEM培养基对药物进行相应浓度的稀释。稀释浓度为50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM。

4)吸去原本培养基更换为含有药物的培养基，培养24h。

5)24h后吸去含有药物的培养基，更换为5mg/ml MTT溶液。培养4-5h。

6)吸去MTT溶液使用50μL DMSO对细胞中的有色物质进行溶解。

7)使用酶标仪对吸光度进行测量，其中2％胎牛血清DMEM培养基培养的细胞的活性为100％以吸光度为指标计算药物处理下的细胞活性。

检测结果参见图4，根据图4可知，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM，1.5625μM药物处理后,细胞活性均在70％以上。

实验例5膜融合实验：曲美替尼对LUJV，LASV膜融合的抑制效果

操作方法：

1)使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基对293T细胞进行培养，在实验的前一天用胰酶对细胞进行消化。

2)对293T细胞进行计数以35000cells/mL的浓度将细胞铺至24孔板中。

3)在抑制LUJV-GPC介导的膜融合实验中使用lipo 2000对以pCAGGS质粒为载体的LUJV-GPC以及以pcDNA-3.1为载体的CD63膜表面表达突变质粒，以及pEGFP-N1质粒各250ng每孔的浓度进行转染。并且使蛋白表达24h。

4)在抑制LASV-GPC介导的膜融合实验中使用lipo 2000对以pCAGGS质粒为载体的LASV-GPC，以及pEGFP-N1质粒各250ng每孔的浓度进行转染。并且使蛋白表达24h。

5)实验第二天使用2％胎牛血清DMEM培养基对药物进行稀释，将药物-曲美替尼稀释至75μM的浓度。将稀释好的药物加入细胞孔中孵育1h。

6)1h后移除含有药物的培养基使用柠檬酸和DMEM配置的pH为5.0的酸化液对细胞进行酸化。

7)2-3h后使用荧光显微镜进行观察和拍照，记录细胞膜融合情况。

结果参见图5，根据图5可知，0μM表示不增加药物的情况，由细胞膜表面GPC所介导的膜融合正常进行。细胞的边际消失，形成膜融合后的胞合体。在75μM的药物浓度下，LASV-GPC所介导的膜融合在药物处理后，融合泡变小，并且出现完整细胞形态的被完全抑制膜融合过程的细胞。而LUJV-GPC的膜融合则完全被抑制，没有胞合体的产生。说明曲美替尼对LUJV和LASV的膜融合过程有抑制作用。

综合上述实验结果可知：(1)曲美替尼可以在微摩尔级别抑制沙粒病毒LASV、LUJV、LCMV、JUNV、GTOV、MACV、SBAV和CHAPV的感染。曲美替尼在Vero E6和A549两种不同物种来源的细胞上，对糖蛋白为LUJV-GPC的重组病毒均有抑制效果。同时实验发现曲美替尼对LCMV活病毒在微摩尔级别具有抑制效果。

(2)曲美替尼在对沙粒病毒起作用的浓度下，细胞活性高于70％，说明曲美替尼可以靶向通过抑制病毒的感染起到抑制沙粒病毒的作用。并且说明药物是安全有效的抗沙粒病毒感染的药物。

(3)曲美替尼对LUJV和LASV的包膜糖蛋白所介导的膜融合过程具有抑制作用，说明药物可以抑制LUJV和LASV的膜融合过程。

(4)曲美替尼可以通过抑制沙粒病毒的进入阶段，抑制沙粒病毒感染宿主细胞，继而扩大了曲美替尼的使用范围。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种曲美替尼在制备抑制或杀灭沙粒病毒的抗病毒制剂中的应用，其特征在于，所述抗病毒制剂为抑制沙粒病毒入侵过程的药剂或者所述抗病毒制剂为抑制沙粒病毒的膜融合过程的药剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述沙粒病毒包括旧世界沙粒病毒或新世界沙粒病毒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述旧世界沙粒病毒包括拉沙热病毒、卢约病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒中的至少一种；

所述新世界沙粒病毒包括胡宁病毒、瓜纳瑞托病毒、马丘波病毒、沙比亚病毒和查帕雷病毒中的至少一种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，在细胞实验模型中，所述曲美替尼的有效半抑制浓度为0.756μM-10.36μM。

5.曲美替尼在制备抑制沙粒病毒入侵过程或抑制沙粒病毒的膜融合过程的抑制剂中的应用。

6.曲美替尼在制备抑制拉沙热病毒和/或卢约病毒的膜融合过程的抑制剂中的应用。

Images