CN102895675B - 靶向HIV-1特异siRNA生物纳米粒及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明获得了一种含有靶向HIV-1特异性siRNA的生物纳米粒，该生物纳米粒具有HIV-1特异基因沉默作用。所述siRNA选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示序列的1～6种。本发明在人CD4+T淋巴细胞和人造血干细胞（Human Hematopoietic Stem Cell,hHSC）中检测了获得的生物纳米粒对HIV活病毒的抑制效率，证实了其可直接作为防治艾滋病的药物。

Description

靶向HIV-1特异siRNA生物纳米粒及其制备和应用

技术领域：

本发明涉及一种具有HIV-1特异基因沉默作用的siRNA生物纳米粒，本发明还涉及所述生物纳米粒的制备方法，以及在制备防治艾滋病药物方面的应用。 

背景技术：

基因治疗是当前艾滋病治疗的新方法。RNA干扰（RNA interference，RNAi）又称为依赖于RNA的基因沉默机制，是通过双链RNA（double-strand RNA，dsRNA）特异性地抑制与其序列同源的靶基因mRNA表达的现象。即在胞质中，双链RNA引发了同源mRNA的降解，故也被称为转录后基因沉默现象（post-transcriptional gene-silencing，PTGS）。 

RNAi治疗AIDS的研究现状 

siRNAs或miRNAs可以特异地结合靶mRNA，引起靶mRNA降解或翻译抑制，最终导致基因特异性沉默。RNAi技术很可能为抗HIV治疗的研究打开突破口。 

基因沉默靶点的确立 

HIV-1基因组编码区由9个开放读框组成，包括3个结构基因（gag、pol、env），2个调节基因（tat、rev）和4个辅助基因（vif、vpr、vpu、nef）。非结构基因曾被认为不是HIV-1病毒复制所必需的“非必需基因”，但是近年来越来越多的研究表明HIV-1的非结构基因在病毒的致病机理、感染性、潜伏上都有着重要的作用，因此本发明将非结构基因作为抗病毒治疗的靶点。HIV-1Tat蛋白不仅参与反式激活病毒的表达，还参与AIDS相关疾病的病理机理，如神经毒性作用、致癌原性、免疫抑制原性等，在HIV-1的病毒复制及致病中都起了重要的作用。Rev蛋白可以与Rev应答元件（Rev response element,RRE）结合，介导未拼接和不完全拼接的mRNA从胞核向胞浆内的转运，促进病毒结构蛋白和酶的合成，引发HIV基因表达由早期向晚期的转换。Vpr可以在病毒复制的早期，反式激活HIV-1LTR，促进病毒基因的表达；介导和增强整合前复合体的核转运；改变细胞基因的表达，诱导细胞周期G2/M期阻滞及细胞凋亡。病毒感染因子（Viral Infectivity Factor，Vif）可以抵抗载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(human protein apoliproteinB mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-like-3G，APOBEC3G)的抗病毒活性， 增强HIV-1毒粒的感染力。 

研究显示，HIV的gag和nef基因均可以通过RNAi进行沉默，RNAi方法治疗艾滋病已经成为艾滋病治疗研究的热点，研究显示通过RNAi方法可以阻止HIV感染及抑制HIV复制。但其技术本身仍存siRNA稳定性差、容易降解、无靶向性等问题。以重组病毒载体方式导入的siRNA虽然稳定性较高，但是又带来导入效率及载体基因整合等问题。 

人间充质干细胞（Human Mesenchymal Stem Cells,hMSC）具有多向分化潜能，自身免疫原性低，取材方便。目前美国FDA已经批准其用于自身免疫疾病及基因治疗载体等多个方面的临床试验。 

发明内容:

本发明的目的是筛选出针对HIV-1非结构基因vpr，tat，vif，rev具有基因沉默作用的siRNAs序列，并将这些siRNAs序列构建到慢病毒载体，在干细胞及其他传代细胞中进行表达，制备一种含有对HIV特异性沉默的siRNA的生物颗粒，以用于制备预防和治疗艾滋病的药物。 

本发明提供了一种靶向HIV-1特异性siRNA慢病毒为载体间充质干细胞内表达的siRNA生物纳米粒，经体外HIV活病毒攻击实验证实，可用于艾滋病毒的感染者和艾滋病患者的治疗。 

本发明有如下创新点： 

其一，本发明首次发现了可使HIV-1非结构基因vpr，tat，vif，rev基因沉默的6个siRNAs序列 

本发明人针对HIV-1病毒基因组的vpr，tat，rev，vif基因的保守区域设计了14条干扰RNA序列，经实验筛选，发现其中以下6条siRNA序列可以特异地靶向HIV-1vpr，tat，vif，rev： 

其二，本发明构建了含有HIV env基因的重组慢病毒载体，筛选到能够稳定表达HIV跨膜蛋白gp120和gp41的hMSC-env细胞系。 

该细胞系已保藏。 

所述细胞系可用于制备siRNA的生物纳米粒。由于gp120蛋白对CD4分子具有亲和性，使制备的siRNA生物纳米粒具有靶向性。 

其三，本发明制备了一种含有HIV特异性siRNA的间充质干细胞生物纳米粒 

该生物纳米粒载有上述靶向HIV-1特异性siRNA，所述siRNA的序列如上表所示的SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6。 

该生物纳米粒还具有以下特征： 

1）大小在10-500nm之间； 

2）具有人间充质干细胞（Human Mesenchymal Stem Cells,hMSC）外膜； 

3）镶嵌病毒的膜蛋白gp120。 

本发明在人CD4+T淋巴细胞和人造血干细胞（Human Hematopoietic Stem Cell,hHSC）中检测了获得的生物纳米粒对HIV活病毒的抑制效率。 

经此实验证实，该生物纳米粒可作为药物直接用于治疗和预防艾滋病。 

其五，本发明提供了上述含有HIV特异性siRNA的间充质干细胞生物纳米粒的制备方法 

方法是：将含有上述siRNA序列（1～6个）的双链DNA构建到永久性表达目的基因的重组慢病毒载体中，在293T细胞中包装出重组慢病毒；用收获的重组病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素筛选出表达siRNA的hMSC细胞系，经筛选表达siRNA的hMSC细胞系可以持续高效的表达siRNA；体外连续收获细胞培养液，超速离心浓缩，获得含有siRNA的生物纳米粒。 

本发明的优点和效果 

本发明结合siRNA的高效性和hMSC的低免疫原性，在提高siRNA的稳定性的同时避免载体整合带来的安全性问题。具体而言，选用针对HIV特异性的siRNA，以携带特异性的siRNA重组慢病毒将其导入到永生化的间充质细胞中，在细胞内转录复制，以吐胞的形式将带有永生化间充质细胞膜的siRNA生物纳米粒分泌到细胞外，经过浓缩纯化后，用于HIV-1的基因治疗。 

本发明方法提供的含有HIV特异性siRNA的生物颗粒具有以下优点： 

1、提高了稳定性 

利用生物膜包被的方式提高了siRNA的稳定性； 

2、提高了安全性，适用范围广 

本方法与现有技术的病毒载体导入方式相比又大大提高了安全性。其中间充质干细胞制备的颗粒具有较为广泛的组织亲和性，同时免疫原性较低，从而适用范围更加广泛； 

3、更具有靶向性 

针对siRNA无靶向性的问题，本发明还构建了稳定表达HIV-1gp120蛋白的永生化的间充质细胞株，由于gp120蛋白对CD4分子具有亲和性使得制备的siRNA生物颗粒具有靶向性。 

4、可抑制HIV活病毒 

本发明在人CD4+T淋巴细胞和人造血干细胞（Human Hematopoietic Stem Cell,hHSC）中检测了获得的生物纳米粒对HIV活病毒的抑制效率，证实了其可直接作为防治艾滋病的药物，以及在HIV基因治疗方面具有的其它潜在价值。 

附图说明：

图1是siRNA/miRNA真核表达载体结构图； 

A:siRNA/miRNA真核表达载体pSR-GFP/Neo； 

B：siRNA/miRNA真核表达载体pcDNA6.2GW/EmGFP-miR）； 

图2为倒置荧光显微镜下观察vpr特异性siRNA对GFP-Vpr融合蛋白表达的抑制情况； 

图3为流式细胞仪检测vpr特异性siRNA对GFP-Vpr融合蛋白表达的抑制作用，图中纵轴为抑制率（%），横轴为siRNA样品编号； 

图4为实时荧光定量PCR技术对vpr mRNA拷贝数进行相对定量； 

图5为vpr特异性siRNA抑制假病毒在TZMBL细胞中的感染力（图中点为蓝斑）； 

图6为倒置荧光显微镜下观察vpr特异性miRNA对Vpr-dsRed融合蛋白表达的抑制作用，图中control中细胞发出红色荧光； 

图7为倒置荧光显微镜下观察tat特异性siRNA对Tat-dsRed融合蛋白表达的抑制作用，图中亮点为细胞发出的红色荧光； 

图8为流式细胞仪检测tat特异性siRNA对Tat-dsRed融合蛋白表达的抑制作用图中纵轴为抑制率（%），横轴为siRNA样品编号； 

图9为Western Blot检测tat特异性siRNA对Tat-dsRed融合蛋白表达的抑制作用， 图中上面条带为tat-red融合蛋白（40KD），下面条带为GAPDH蛋白（39KD）； 

图10为实时荧光定量PCR技术对tat mRNA拷贝数进行相对定量，图中纵轴为抑制率（%），横轴为对照和siRNA样品编号； 

图11为tat特异性siRNA抑制假病毒在TZMBL细胞中的感染力，图中纵轴为抑制率（%），横轴为tat-siRNA样品编号，白色柱状图siRNA量为0.1μg，灰色图siRNA量为0.2μg； 

图12为Western Blot检测tat特异性miRNA对Tat-daRed融合蛋白表达的抑制作用； 

图13为构建的重组慢病毒plvx-shRNA1和plvx-shRNA2； 

图14为建立的稳定表达siRNA间充质干细胞系；生物材料保藏信息： 

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

保藏物名称：稳定表达gp120和gp41的间充质干细胞系hMSC-env 

保藏编号：CGMCC NO.6707 

保藏日期：2012-10-23 

以下实施例中所用的试剂、质粒等来源如下： 

具体实施方式

试剂或者质粒	来源
		pSR-GFP/Neo	OligoEngine公司
pcDNA6.2GW/EmGFP-miR	Invitrogen公司
		Lipofectamine 2000	Invitrogen公司
Opti-MEM培养基	Hyclone公司
		RNeasy Mini Kit	Qiagen公司
pSUPER-shRNA	Oligoengine公司
		Plvx-puro	Clontech公司
Plvx-sh1	Clontech公司
		89.6和NL4-3HIV毒株	NIH

实施例1转染针对HIV-1病毒基因组的siRNA/miRNA的瞬时表达载体 

本实施例采用分子生物学方法构建siRNA/miRNA的瞬时表达载体，用于在培养细胞内表达siRNA/miRNA，具体包括以下步骤： 

1）设计针对HIV-1病毒基因组的siRNA/miRNA序列，具体地，我们针对HIV-1病毒基因组的vpr，tat，rev，vif基因的保守区域设计了14条干扰RNA序列： 

HIV-VR4：gagtgaagctgttagacat 

HIV-VR5：ggatatggctccataactt 

HIV-VR7：agtggaagccataataaga 

HIV-VR14：gctgttagacattttccta 

HIV-LX3：gcttgtaccaattgctatt 

HIV-LX4：gtgttgctttcattgccaa 

HIV-LX6：gactcatcaagcttctcta 

HIV-LX8：gacttactcttgattgtaa 

HIV-LX11：ggtggaatctcctacagta 

HIV-VF7：TATCAAGCAGGACATAACA 

HIV-VF10：AGAGACTGGCATTTGGGTC 

HIV-mi1452：AACAGCTTCACTCTTAAGTTC 

HIV-mi1472：CTGACTTCCTGGATGCTTCCA 

HIV-mi1473：TTTAGGCTGACTTCCTGGATG 

2)人工合成上述s iRNA/miRNA表达序列，并将合成的序列插入到siRNA真核表达载体pSR-GFP/Neo（OligoEngine公司）中，构建重组载体；将成的序列插入到miRNA真核表达载体pcDNA6.2GW/EmGFP-miR（Invitrogen公司）中，构建重组载体。表达载体的结构示意图如图1所示。 

3）将重组载体采用脂质体法转染进入宿主细胞HeLa细胞（美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection，ATCC）。 

脂质体转染法的具体步骤包括：（1）转染前一天铺板，用胰蛋白酶消化收集处于对数生长期的细胞，24孔板每个孔内加入500μl已调好浓度的细胞悬液，即细胞接种量为1.5×105/孔，37℃，5%CO2培养箱中孵育。（2）次日细胞密度达到90%成层，弃掉原培养基，用PBS清洗两次（加液时沿壁加入）。（3）按照Lipofectamine 2000脂质体使用说明书分别配制A、B用液。A液：将1.0-3.0μg用于转染的载体分别加入到50μl Opti-MEM培养基中，瞬离混匀；B液：Lipofectamine 20007μl加入到50μl Opti-MEM培养基中，混匀，静置5分钟；将A液缓慢加入B液中，瞬离混匀后在室温下静置20分钟。（4）将上述复合物100μl加入对应的孔中，每孔补加100μl新鲜Opti-MEM培养基。空白对照组，直接加入200μl Opti-MEM培养基。（5）37℃孵育6h，补加200μl DMEM培养基，继续培养。（6）利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，计数细胞的转染效率达80%。 

实施例2vpr基因特异性siRNA在体外抑制HIV-1vpr基因表达 

本实施例采用荧光显微镜技术、流式细胞技术、实时荧光定量PCR技术检测了vpr基因特异性siRNA在体外对HIV-1vpr基因表达的抑制作用。 

具体实验步骤包括： 

（1）按照实施例1的方法将siRNA表达载体和vpr基因表达载体（带有绿色荧光蛋白标记）共转染至HeLa细胞中。 

（2）48小时后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达程度。 

（3）收获细胞用于流式细胞仪检测，细胞悬液制备的方法如下：弃去24孔板中培养液，用PBS洗2次；加EDTA消化细胞约5分钟；吹散细胞，从壁上吹下后，吸取细胞-EDTA悬液至EP管中；2000rpm，离心约5分钟；加入1ml PBS重悬细胞；细胞悬液经200目尼龙网过滤至小试管中，Beckman公司，Beckman Coulter Altra流式细胞仪进行测定各实验组细胞中表达GFP的细胞数量以及各实验组中表达GFP的细胞占总细胞数的百分比，由下列公式计算抑制率： 

（4）提取细胞总RNA用于实时荧光定量PCR测定mRNA拷贝数。①按照RNeasy MiniKit的操作步骤提取细胞总RNA，其过程如下：PBS洗2次，EDTA消化细胞10分钟，将细胞从壁上吹打下来收于RNase-free的EP管中；离心3000rpm，5分钟，弃上清；向细胞沉淀中加入Buffer RLT（添加1/100的β-巯基乙醇）350μl，振荡混匀；将3中液体加入QIAshredder spin，12000rpm离心2分钟，除去细胞碎片，使液体均质；向上一步中收获的液体中加入70%乙醇350μl，混合均匀，将混匀的液体加入RNeasy mini column中，12000rpm离心15s，弃去流出液；加入Buffer RW1700μl至RNeasy mini column中，12000rpm离心15s洗膜，弃去流出液；加入Buffer RPE 500μl，12000rpm离心15s，弃去流出液；加入Buffer RPE 500μl，12000rpm离心2分钟，弃去流出液；加入RNase-freewater 30μl洗脱，12000rpm，离心1分钟，收集于新的RNase-free EP管中。②去除RNA中残留的DNA污染。方法如下：采用DNase Ⅰ去除RNA中残留的DNA,避免转染的质粒对后续检测的影响。50μl反应体系中包含42.5μl RNA，2.0μl DNase Ⅰ，5.0μl 10×Buffer，0.5μl RNase inhibitor。7℃，消化25分钟。向上述体系中加入1μl 25mM EDTA，65℃反应10分钟，终止酶解反应。③反转录。按照Promega Access RT-PCR System的说明书，将所提取的RNA进行反转录得到cDNA。④应用SYBRGreen试剂盒（购自Stratagene公司）在Stratagene公司，Mx3000P Realtime PCR仪进行荧光定量PCR反应，选择GAPDH 为内参。热循环条件为95℃，10分钟→95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，40个循环→95℃1分钟，55℃30秒，95℃30秒。⑤以样本中GAPDH mRNA拷贝数为内参，按照公式2-△△Ct=2-[（实验组vpr ct-实验组GAPDH ct）-（对照组vpr ct-对照组GAPDH ct）]，计算各实验组的2-△△Ct值，对vpr mRNA拷贝数进行相对定量。 

结果： 

图2显示与对照组相比，VR4组的绿色荧光蛋白表达表达明显减少，VR5、VR7和VR14组绿色荧光蛋白表达也有一定程度的下降，即对GFP-Vpr融合蛋白的表达有较明显的抑制作用。 

图3显示：与对照组相比，VR4对GFP-Vpr表达的抑制作用最强，可达65%；其次为VR14、VR7、VR5。 

图4显示VR4可以在mRNA水平上明显降低gfp-vpr mRNA的拷贝数，即VR4对gfp-vpr融合基因的表达有较强的沉默作用。VR5和VR14的基因沉默作用次之。 

实施例3vpr基因特异性siRNA在体外抑制HIV-1假病毒 

采用NIH AIDS Research&Reference Reagent Program提供的假病毒包装质粒（包括pNL4-3ΔEnv-GFP骨架质粒和HIV-1B亚型包膜质粒#11035）在体外制备HIV-1假病毒，该假病毒具有与HIV-1野生毒株相似的生物学特性，但其危害性远远降低。具体实验步骤包括： 

（1）假病毒的制备：①转染前一天六孔板接种293FT细胞（美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection，ATCC），7×105/孔，转染前细胞达70%汇合度。②将0.5μg pNL4-3ΔEnv-GFP骨架质粒、1μg HIV-1B亚型包膜质粒#11035、1μg shRNA表达载体或空表达载体加入到Opti-MEM（Invitrogen公司）中稀释，向以上混合物中加入混匀的15μl转染试剂Fugene HD（Roche公司），手指轻弹管壁混匀（转染试剂不能沿管壁加入，不能用tip头混匀）。③以上转染混合物室温孵育15-30分钟。④将转染混合物逐滴加入6孔板细胞培养基中，37℃孵箱孵育。⑤转染48小时后，荧光显微镜检测,收获培养上清。 

（2）病毒上清p24含量测定：采用Biomerieux公司的Vironostika HIV-1AntigenMicroelisa system检测培养上清中的HIV-1p24含量。 

（3）将收获的假病毒感染TZMBL细胞（NIH AIDS Research&Reference ReagentProgram），48小时内固定染色，Olympus倒置显微镜下自动扫描，ImagePro Plus软件计数蓝斑数目。分析siRNA对HIV假病毒的抑制作用。 

结果：共转染siRNA表达载体的对照组收取的上清中含有的p24量最多，可达18400.8 pg/ml；而转染VR4的实验组收取的上清中，p24含量最少，仅为546.1pg/ml，比对照组降低97.03%。与对照组相比，VR5和VR14组中p24含量下降程度相近，分别为75.82%和79.78%。 

图5显示对照组包装出的假病毒感染力最强。当稀释32倍后接种TZMBL细胞，仍可产生1084个蓝斑。VR4组的蓝斑数目仅为3.25个，与对照组相比减少了99.7%，即shRNA4明显降低了假病毒的感染力。VR14和VR5的蓝斑数目与对照组相比分别减少了92.8%和70.64%。 

实施例4vpr基因特异性miRNA在体外抑制HIV-1vpr基因表达 

将pVpr-DsRed与pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR以1：5比例共转染HeLa细胞24小时后，于倒置荧光显微镜下观察红色及绿色荧光蛋白的表达。红色荧光蛋白反映了Vpr-DsRed的表达程度，而绿色荧光蛋白则可以反映miRNA的表达程度。图6显示，HIV-mi1452实验组相对于对照组红色荧光变弱且表达荧光的细胞数量减少明显，抑制了Vpr融合的表达。实时荧光定量PCR技术显示HIV-mi1452实验组的vpr mRNA拷贝数仅为对照组的0.2088倍，即HIV-mi1452对gfp-vpr融合基因的表达有较强的沉默作用。 

实施例5vpr基因特异性miRNA在体外抑制HIV-1假病毒 

按照实施例3方法测定各实验组病毒上清中p24含量。转染miR-control的对照组收取的上清所含p24量最多，可达15474.5pg/ml；而转染HIV-mi1452的实验组上清中p24的含量最少，仅为3455.5pg/ml，比对照组降低了77.67%。将收获的各组病毒上清，稀释64倍后，测定各组假病毒在TZMBL细胞中的感染力。对照组产生了960.5个蓝斑，HIV-mi1452组的蓝斑数目为179.25个，与对照组相比减少了81.34%。 

实施例6tat基因特异性siRNA在体外抑制HIV-1tat基因表达 

按照实施例2方法共转染pDsRed-Tat质粒与siRNA表达质粒,采用荧光显微镜技术、流式细胞技术、实时荧光定量PCR技术检测tat基因特异性siRNA在体外对HIV-1tat基因表达的抑制作用。采用Western blot技术检测Tat-Red融合蛋白表达，用双色激光扫描仪（Odyssey）扫描蛋白条带。 

结果：图7显示荧光显微镜下观察，与对照组相比，各实验组的红色荧光蛋白都有较明显的降低，其中TT4组降低最明显。图8显示流式细胞仪检测siRNAs对Tat-Red融合蛋白表达的抑制率LX1、LX3、LX4和LX6组的抑制率分别为67.31%、75.86%、72.85%和76.32%。图9显示当GAPDH蛋白条带亮度差别不大的情况下，各实验组与对照组相比，LX4 号的Tat-Red融合降低最明显，其他各组也有一定程度的降低。图10显示LX1、LX3、LX4和LX6组的tat mRNA拷贝数分别为对照组的0.2033、0.0872、0.0333和0.1037倍，即对mRNA有最显著的降解作用。 

实施例7tat基因特异性siRNA在体外抑制HIV-1病毒 

具体实验步骤包括：96孔板培养的TZMBL细胞（NIH AIDS Research&ReferenceReagent Program）转染pSUPER-shRNA 0.1μg或0.2μg，28h后感染HIV-1假病毒，继续培养46h固定染色，于倒置荧光显微镜下扫描蓝斑。采用ImagePro Plus软件计数各实验孔的蓝斑数目。图11显示了当转染相同质量的pSUPER-shRNA时，与对照组蓝斑数目相比，各实验组都有不同程度的减少，其中LX4组减少最明显。随着pSUPER-shRNA转染质量的增加，各组对蓝斑产生的抑制效率有所增高，如LX4组抑制率由89.62%升高至96.46%。 

实施例8tat基因特异性miRNA在体外抑制HIV-1tat基因表达 

按照实施例2方法共转染pDsRed-Tat质粒与miRNA表达质粒,采用荧光显微镜技术、流式细胞技术、实时荧光定量PCR技术、Western blot技术检测tat基因特异性siRNA在体外对HIV-1tat基因表达的抑制作用。与对照组相比，micro-1472、1473组荧光表达有所降低，流式细胞技术结果显示micro-1472、1473抑制率可达60%以上。图12，Westernblot检测显示GAPDH条带亮度差别不大的情况下，micro-1472、micro-1473组与对照组相比，Tat-Red融合蛋白条带亮度都有所降低。实时荧光定量PCR技术显示micro-1472、micro-1473组的mRNA拷贝数只有对照的0.1735或0.0742倍，对mRNA具有明显的降解作用。 

实施例9rev基因特异性siRNA在体外抑制HIV-1rev基因表达 

按照实施例2方法共转染pDsRed-Vpr质粒与miRNA表达质粒,采用荧光显微镜技术、流式细胞技术、实时荧光定量PCR技术、Western blot技术检测vpr基因特异性siRNA在体外对HIV-1vpr基因表达的抑制作用。与对照组相比，LX11荧光降低最明显，LX8次之，LX6与LX12组亮度也有所降低。流式细胞技术结果显LX11抑制率最高，可达到82.64%，LX8次之，可达到56.83%以上。Western blot检测显示GAPDH条带亮度差别不大的情况下，与对照组相比，LX11组蛋白减少最明显，LX8次之，LX6组蛋白有部分减少。实时荧光定量PCR技术显示LX11对mRNA的降解作用较好，mRNA拷贝数只有对照的0.2011倍，LX8次之为0.2270倍。 

实施例10：含有HIV特异性siRNA的间充质干细胞纳米颗粒的制备 

设计针对HIV-1vpr基因特异性的siRNA，其序列为：5′-gagtgaagctgtt agacat-3′。 

合成含有该siRNA序列对应的双链DNA序列用于重组慢病毒构建，其序列为：5′-gatccccgagtgaagctgttagacatttcaagagaatgtctaacag cttcactcttttta-3′（下划线部分互为反向重复序列，1条为siRNA序列对应的DNA序列）；5′-agcttaaaaagagtgaagctgttagacattctc ttgaaatgtctaacagcttcactcggg-3′（下划线部分互为反向重复序列，1条为siRNA序列对应的DNA序列）。 

将合成的两条DNA片段退火生成双链，同时用BamH I和EcoR I双切慢病毒载体质粒plvx-shRNA1（见图13）。将DNA双链片段和plvx-shRNA1酶切大片段连接、转化并测序鉴定。 

实验前1天，将293T细胞按照4×106的量接种到1个直径10cm2的培养皿中，细胞使用含有10%FBS（无四环素）的DMEM培养液培养。实验当日，将鉴定正确的plvx-shRNA1-siRNA质粒7μg与慢病毒包装质粒混合物36μl及FuGene HD转染试剂75μl共转染293T细胞，转染后48h收获细胞上清，将获得的重组慢病毒分装后置于-80℃保存。 

使用Clontech公司P24定量检测试剂盒对获得的重组病毒滴度进行检测。 

hMSC使用含有10%FBS的α-MEM培养液进行培养，实验前1天，将hMSC接种到六孔板中，次日，细胞达到70-90%满，将获得的重组慢病毒按照MOI 10-20:1的量感染细胞，感染时加入4μg/mL的polybrene，感染后6h细胞换液，感染后24-48h加入嘌呤霉素筛选，继续培养5-7天至对照细胞全部死亡时得到含有重组病毒的hMSC细胞株（见图14）。 

使用RT-PCR方法鉴定得到的hMSC细胞株。 

连续收获hMSC细胞系细胞上清。首先，1500g/min离心20min收获上清；然后10000g/min离心30min，收获上清；再将上清110000g/min离心70min收获沉淀，即为含有siRNA的生物颗粒。 

实施例11稳定表达HIV-1gp120间充质干细胞株的构建 

构建重组慢病毒载体plvx-env 

设计引物两端含有限制性酶切位点xhoI和XbaI，以HIV的标准株为模板，扩增出env的全基因序列，连接到T载体上，形成PGEM-env重组载体。用XhoI和XbaI双酶切慢病毒载体质粒Plvx-puro和PGEM-env。将切割下来具有两个酶粘性末端的env基因和 plvx-puro质粒连接、转化并测序鉴定，筛选出正确的重组慢病毒载体。用Qiagen去内毒素质粒提取试剂盒，提取纯度较高、无内毒素的重组质粒，用于包装慢病毒。 

包装含有重组慢病毒lentivirus-env 

实验前1天，将293T细胞按照4×106的量接种到1个直径10cm的培养皿中，细胞使用含有10%FBS（无四环素）的高糖DMEM培养液培养。实验当日，待细胞密度长到85%-90%时，将提取的高质量的plvx-env质粒7μg与慢病毒包装质粒混合物36μl及FuGene HD转染试剂75μl混匀，孵育30min后共转染293T细胞，转染后72h收获细胞上清，将获得的重组慢病毒分装后置于-80℃保存。 

使用Clontech公司P24定量检测试剂盒对获得的重组病毒滴度进行检测。 

hMSC使用含有10%FBS的α-MEM培养液进行培养，实验前1天，将hMSC接种到六孔板中，次日，细胞达到70-90%满，将获得的重组慢病毒按照MOI 10-20:1的量感染细胞，感染时加入8μg/mL的polybrene，感染后6h细胞换液，感染后24-48h加入嘌呤霉素筛选，继续培养5-7天至对照细胞全部死亡时得到hMSC细胞株 

使用RT-PCR方法鉴定hMSC-env细胞株，用免疫荧光证明hMSC-env细胞株表面能够稳定的表达出gp120和gp41蛋白，证明已经获得能够稳定表达gp120和gp41的hMSC细胞株。 

用微粒子作用于T细胞或者是MT4细胞，验证收集到的微粒子具有靶向性。 

实施例12攻毒试验过程 

1）包装HIV-1毒株 

将高纯度的pNL4-3及89.6质粒转染293T细胞，72hours后收集上清 

1200rpm离心10min，用0.45μm的滤器过滤。 

2）别测定NL4-3及89.6HIV毒株的滴度 

用P24定量试剂盒检测病毒上清液的病毒滴度。 

用HIV-1毒株攻击MT4细胞 

对培养的MT4悬浮细胞进行计数，以1×105/孔接种MT4细胞于12孔细胞板中，37°C 5%CO2孵育。将两种HIV-1毒株NL4-3和89.6按照MOI约0.02的量感染MT4细胞，感染时加入终浓度为8μg/mL的polybrene，感染后6h细胞换液。然后其中一组加入制备的细胞微粒子。在24h、48h、72h小时各收集细胞上清100μl，用P24定量试剂盒，检测上清液中p24的浓度，从而确定细胞微粒子对HIV复制的抑制效果。 

Claims (3)

1.一种具有使HIV-1非结构基因沉默的生物纳米粒，具有以下特征：

1)大小在10-500nm之间；

2)具有人间充质干细胞(Human Mesenchymal Stem Cells,hMSC)外膜；

3)镶嵌病毒的膜蛋白gp120；

4)含有靶向HIV-1特异性siRNA，所述siRNA选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示序列的1～6种。

2.权利要求1所述的生物纳米粒在制备治疗和预防艾滋病药物中的应用。

3.权利要求1所述的生物纳米粒的制备方法，将含有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示序列的1～6种的双链DNA构建到永久性表达目的基因的重组慢病毒载体中，在293T细胞中包装出重组慢病毒；用收获的重组病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素筛选出表达siRNA的hMSC细胞系，经筛选表达siRNA的hMSC细胞系可以持续高效的表达siRNA；体外连续收获细胞培养液，超速离心浓缩，获得含有siRNA的生物纳米粒。