NO344867B1

NO344867B1 - Isolert antistoff eller fragment derav som binder IL-17 reseptor A, farmasøytisk sammensetning derav, polynukleotid som koder for antistoffet, et plasmidet som inneholder polynukleotidet, en celle som omfatter plasmidet, en fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet, og dets anvendelse ved behandling av en sykdom eller patologisk tilstand assosiert med IL-17 reseptor A aktivering.

Info

Publication number: NO344867B1
Application number: NO20091736A
Authority: NO
Inventors: Joel Tocker; Jacques Peschon; David Fitzpatrick; James F Smothers; Christopher Mehlin; Ai Ching Lim
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2020-06-08
Also published as: HUS1800005I1; HUE032421T2; HUE033216T2; US10208122B2; US20100028345A1; AU2007314519A1; CY1118994T1; IL197636B; IL228672A; US9073999B2; ES2616210T3; MY187263A; US7833527B2; US20080220479A1; US7767206B2; IL197636A0; EP3165539A1; EP2487188A2; JP2010505416A; CY2018001I2

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder IL-17-reseptor-A (IL-17RA eller IL-17R)-antistoffer, polynukleotidsekvenser som koder for antistoffene og sammensetninger av antistoffene for anvendelse ved behandling av sykdommer som formidles ved IL-17-reseptor-A-aktivering via én eller flere IL-17-ligander.

Oppfinnelsens bakgrunn

IL-17A er et inflammatorisk cytokin som opprinnelig ble påvist som et transkript som selektivt uttrykkes av aktiverte T-celler. IL-17RA uttrykkes over alt og har blitt vist å binde IL-17A med en affinintet på tilnærmet 0,5 nM (Yao et al, 1995, Immunity, 3:811-821). Ytterligere fem IL-17-lignende ligander (IL-17B-IL-17F) og ytterligere fire IL-17RA-lignende reseptorer (IL-17RB-IL-17RE) har blitt påvist (Kolls og Linden, 2004, Immunity, 21:467-476).

IL-17RC har blitt vist å binde IL-17A og IL-17F. Observasjonen av at IL-17RA-mangel og IL-17RA-antistoffnøytralisering fjerner både IL-17A- og IL-17F-funksjonen tyder på at IL-17RC ikke kan overføre et IL-17A- eller IL-17F-signal i fravær av IL-17RA (Toy et al., 2006, J. Immunol., 177:36-39; McAllister et al., 2005, J. Immunol., 175:404-412). I tillegg fører tvungen ekspresjon av IL-17RC i IL-17RA-manglende celler ikke til en gjenvinning av IL-17A- eller IL-17F-funksjonen (Toy et al., 2006, J. Immunol., 177:36-39).

IL-17A og IL-17F uttrykkes hovedsakkelig av aktiverte CD4<+>-hukommelses-T-celler (Kolls og Linden, 2004, supra). Det har blitt foreslått at en IL-17A-produserende, patogen CD4+-T-celleundergruppe, ThIL-17, ekspanderes i nærvær av IL-23 (Langrish et al., 2005, J. Exp. Med., 201:233-240). I tillegg har både IL-15- og TNF-superfamilimedlemmet OX40L blitt vist å indusere ekspresjonen av IL-17A (Nakae et al., 2003b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:5986-5990; Ziolkkowska et al., 2000, J. Immunol., 164:2832-2838). IL-6 og TGF-beta induserer også ekspresjonen av IL-17A.

IL-17A og IL-17F binder og aktiverer IL-17RA. IL-17RA har blitt vist å være viktig i reguleringen av immunresponser. Aktivering av IL-17RA fører til dannelse av cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer og andre proteiner som bidrar til symptomene og/eller patologien til en rekke sykdommer. IL-17A er et inflammatorisk cytokin som induserer dannelsen av cytokiner og andre mediatorer som fører til sykdommer og fysiologiske virkninger som betennelse, bruskdegradering og benresorpsjon. IL-17A spiller også en rolle i en rekke betennelsestilstander, inkludert artritt (reumatoid artritt), psoriasis, inflammatorisk tarmsykdom, multippel sklerose og astma. (Li et al., 2004, Huazhong Univ. Sci. Technolog. Med. Sci., 24:294-296; Fujino et al., 2003, Gut., 52:65-70; Kauffman et al., 2004, J.

Invest. Dermatol., 123:1037-1044; Mannon et al., 2004, N. Engl. J. Med., 351:2069-2079; Matusevicius et al., 1999, Mult Scler, 5, 101-104; linden et al., Eur Respir J., 2000, mai; 15(5):973-7; Molet et al., 2001, J. Allergy Clin. Immunol., 108:430-438). Nyere undersøkelser tyder på at IL-17F spiller en rolle i induksjonen av inflammatoriske responser (Oda et al., 2006, American J. Resp. Crit. Care Medicine, 15. januar, 2006, Numasaki et al., 2004, Immunol Lett., 95:97-104).

Aspekter av oppfinnelsen tilveiebringer antigenbindende proteiner som spesifikt binder IL-17RA og inhiberer den IL-17RA-aktivering som formidles av IL-17-familiemedlemmer, for eksempel IL-17A og/eller IL-17F, som beskrevet mer fullstendig her.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser en fylogenetisk dendrogramanalyse av CDR (komplementaritetsbestemmende områder) i de tunge variable (VH)- og variable lette kjede (VL)-domenene i forskjellige IL-17R-antigenbindende proteiner (antistoffer).

Figur 2 viser en sammenstilling av aminosyresekvensene i CDR i de tunge variable (VH)-domenene i forskjellige IL-17R-antigenbindende proteiner (antistoffer). CDR1-, CDR2-og CDR3-området er fremhevet.

Figur 3 viser en sammenstilling av aminosyresekvensene til CDR i de lette variable (VL)-domenene i forskjellige IL-17R-antigenbindende proteiner (antistoffer). CDR1-, CDR2-og CDR3-området er fremhevet.

Figur 4 viser at den gjennomsnittlige kliniske poengsum for IL-17RA-/-mus (”knockout”-mus eller KO-mus) er mye lavere enn for villtype (WT)-mus i en CIA-modell for artritt.

Figur 5 viser forsinkelsen av begynnelsen av eksperimentell, autoimmun encefalomyelitt (EAE) for IL-17RA-”knockout”-mus sammenlignet med villtype mus i en myelin oligodendrocyttglykoprotein (MOG)-indusert modell.

Figur 6 viser redusert klinisk poengsum i IL-17RA-”knockout”-mus sammenlignet med villtype mus i en MOG-indusert modell.

Figur 7 viser at IL-17RA-”knockout”-mus har et redusert totalt antall inflammatoriske celler i BAL-væske sammenlignet med villtypen i en ovalbuminindusert modell for astma.

Figur 8 viser at IL-17RA-”knockout”-mus har et redusert antall eosinofile celler (Figur 8A), neutrofile celler (Figur 8B) og lymfocytter (Figur 8C) i bronkoalveolær lavage (BAL)-væske sammenlignet med villtype mus i en ovalbuminindusert modell for astma. Figur 8D viser ingen endring av makfofagtallet i BAL-væske, verken i WT-mus eller IL-17RA-”knockout”-mus (naive og OVA-eksponerte).

Figur 9 viser en doseavhengig inhibering med et IL-17RA-mAb i en villtype (WT) kollagenindusert artritt (CIA)-modell. P<0,05 ble observert ved sammenligning av gruppene behandlet med 100 μg henholdsvis 300 μg 17RA-mAb sammenlignet med kontrollbehandlingsgruppen (dag 13, 15 og 16). Figur 10 viser resultatene fra en terapeutisk behandling med IL-17RA-mAb. Resultatene viser en stabilisering av den gjennomsnittlige kliniske poengsum i villtype mus i en standard CIA-modell for artritt.

Disse resultatene viser at IL-17RA-inhibering med et IL-17RA-antigenbindende protein kan være terapeutisk nyttig ved behandling av reumatoid artritt (RA), særlig for bevaring av leddbein og brusk.

Figur 11 viser at terapeutisk behandling med anti-IL-17RA-mAb stabiliserte den gjennomsnittlige kliniske poengsum i TNFR p55/p75-”knockout”-mus i en standard CIA-modell for artritt. Disse resultatene viser at IL-17RA-inhibering med et IL-17RA-antigenbindende protein kan være terapeutisk nyttig ved behandling av RA, særlig for bevaring av leddbein og brusk. Det er verdt å merke seg at IL-17RA-inhibering kunne stabilisere sykdommen i en modell, uavhengig av TNF-signalisering.

Figur 12 viser at eksempler på humane IL-17RA-mAb (AMH14/AML14, AMH22/AML22, AMH19/AML19 og AMH18/AML18) kunne inhibere cynomolgus-IL-17-indusert IL-6-dannelse fra JTC-12-celler (en nyrecellelinje fra cynomolgusape). Linjen (------) viser den positive kontrollverdi for cynomolgus-IL-17 i kombinasjon med TNF-alfa. Linjen (-.-.-) viser den positive kontrollverdi for cynomolgus-TNF-alfa. Linjen (…..) viser verdien for mediumkontrollen.

Figur 13 viser sekvensvariasjonen i rammeverkområdene i SEKV. ID. Nr.: 40 (AML14) sammenlignet med kimlinje-aminosyrerester og virkning på IC50-verdiene.

Figur 14 viser at to varianter med aminosyrerester tilbakeført til kimlinje aminosyrerestene (se Figur 13) hadde redusert IL-17A-inhiberende aktivitet sammenlignet med AMH14/AML14, noe som viser at en viss variasjon i rammeverkområdene ble tolerert, men at noen aminosyrerester kan påvirke aktiviteten. Linjen (-----) viser den positive kontrollverdi for IL-17-stimulering i fravær av antistoff (tilnærmet 4062 pg/ml).

Figur 15 viser at de to variantene som hadde fått aminosyrerester tilbakeført til kimlinje-aminosyrerestene (se Figur 13), hadde redusert IL-17-F-inhiberende aktivitet (i kombinasjon med TNF-alfa) sammenlignet med AMH14/AML14.

Figurene 16A og 16B viser resultatene fra multipleksgruppering av IL-17RA-antistoffer. Skraverte verdier viser antistoffpar som kan bindes til IL-17RA samtidig, noe som tyder på at disse antistoffene bindes til forskjellige nøytraliserende determinanter. Innrammede verdier viser antistoffer paret mot seg selv.

Figur 17 viser muse-IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 432) og de 5 domenene, A, B, C, D, E og F, som erstattet de tilsvarende i den humane IL-17RA-sekvens.

Figurene 18A-18B viser aminosyresekvensene til humant IL-17RA, muse-IL-17RA og menneske/mus-kimere IL-17RA-proteiner.

Figur 19 er en tabell som oppsummerer evnen til IL-17RA-mAb til å binde de forskjellige kimere proteinene. Skraverte verdier viser hvor IL-17RA-mAb har mistet evnen til å binde den angjeldende kimer (n.d. betyr ikke bestemt).

Figur 20 viser aminosyrerestene som ble erstattet med en argininrest i SEKV. ID. Nr.: 431.

Figur 21 viser titreringskurver for bindingen av forskjellige IL-17RA-mAb til D152R-IL-17RA-mutanten.

Figur 22 er en oppsummering av argininskanning, gruppering og kimerdata for forskjellige IL-17RA-mAb.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Seksjonsoverskriftene som anvendes her er kun for organisatoriske formål, og skal ikke oppfattes som begrensende for hva som er beskrevet i seksjonene.

Standardteknikker kan anvendes for rekombinant DNA, oligonukleotidsyntese, vevsdyrkning og transformasjon, proteinrensing osv. Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker kan utføres ifølge produsentens spesifikasjoner eller som de vanligvis utføres innen faget, eller som beskrevet her. De påfølgende fremgangsmåtene og teknikkene kan vanligvis utføres ifølge konvensjonelle fremgangsmåter som er velkjente innen faget, og som beskrevet i forskjellige generelle og mer spesifikke referanser som siteres og diskuteres i beskrivelsen. Se for eksempel Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.. Med mindre spesifikke definisjoner gis, er nomenklaturen som anvendes i forbindelse med analytisk kjemi, organisk kjemi og medisinsk og farmasøytisk kjemi samt laboratoriefremgangs-måtene og teknikkene forbundet med disse, nomenklatur, fremgangsmåter og teknikker som er velkjente og alminnelig anvendt innen faget. Standardteknikker kan anvendes for kjemisk syntese, kjemisk analyse, farmasøytisk fremstilling, utforming og administrering og behandling av pasienter.

IL-17A, IL-17F og IL-17RA

De biologiske aktivitetene av IL-17A og IL-17F avhenger av IL-17RA, som vist her ved anvendelse av både celler og mus som genetisk mangler IL-17RA og med nøytraliserende mAb (monoklonale antistoffer) rettet mot IL-17RA (se eksemplene nedenfor).

”IL-17-reseptor-A” eller ”IL-17RA” (som benyttet om hverandre her, så vel som IL-17-reseptor og IL-17R for å vise til samme reseptor), betyr som begrepet anvendes her, den celleoverflatereseptor og reseptorkompleksene (slik som IL-17RA-IL-17RC-kompleks), som binder IL-17A og IL-17F og som en følge av dette utløser en signaloverføringsvei i cellen. IL-17RA-proteiner kan også omfatte varianter. IL-17RA-proteiner kan også omfatte fragmenter, for eksempel det ekstracellulære domenet som mangler hele eller en del av transmembrandomenet og/eller det intracellulære domenet, så vel som fragmenter av det ekstracellulære domenet. Kloning, karakterisering og fremstilling av IL-17RA beskrives for eksempel i US patentskrift nr. 6 072 033. Aminosyresekvensen til humant IL-17RA er vist i SEKV. ID. Nr.: 430. Løselige former av huIL-17RA omfatter det ekstracellulære domenet, eller den modne form uten signalpeptidet, eller et fragment av det ekstracellulære domenet som har bevart evnen til å binde IL-17A og/eller IL-17F, eller en heteromer versjon av IL-17A og/eller IL-17F. Andre former av IL-17RA omfatter muteiner og varianter som er minst mellom 70% og 99% homologe med den native IL-17RA med SEKV. ID. Nr.: 403, og som beskrevet i US patentskrift nr. 6 072 033, så lenge som den angjeldende IL-17RA har bevart evnen til å binde IL-17A og/eller IL-17F eller en heteromer versjon av IL-17A og/eller IL-17F. Begrepet ”IL-17RA” omfatter også post-translasjonelle modifikasjoner av IL-17RA-aminosyresekvensen. Post-translasjonelle modifikasjoner omfatter for eksempel N- og O-koblet glykosylering.

IL-17RA-antigenbindende proteiner

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer antigenbindende proteiner, spesifikt et isolert antistoff eller fragment derav som omfatter en lett kjede CDR1 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 224, en lett kjede CDR2 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 225, en lett kjede CDR3 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID Nr.: 226, en tung kjede CDR1 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 146, en tung kjede CDR2 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 147, og en tung kjede CDR3 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 148 hvor nevnte antistoff eller fragment derav binder til human IL-17 reseptor A. Oppfinnelsen omfatter om ønskelig posttranslasjonelle modifikasjoner. Aspekter av oppfinnelsen kan omfatte antistoffer som spesifikt bindes til humant IL-17RA og inhiberer IL-17A og/eller IL-17F fra å bindes til og aktivere IL-17RA, eller et heteromerkompleks av IL-17RA og IL-17RC. Aspektet av oppfinnelsen kan omfatte antistoffer som spesifikt bindes til humant IL-17RA og inhiberer en IL-17A/IL-17F-heteromer fra å bindes til og aktivere IL-17RA eller et heteromert kompleks av IL-17RA og IL-17RC. I beskrivelsen skal henvisninger til inhibering av IL-17A og/eller IL-17F forstås til også å omfatte inhibering av heteromerer av IL-17A og IL-17F. Aspekter av oppfinnelsen kan omfatte antistoffer som spesifikt bindes til humant IL-17RA og delvis eller fullstendig inhiberer IL-17RA fra å danne enten et homomert eller heteromert, funksjonelt reseptorkompleks, for eksempel et IL-17RA-IL-17RC-kompleks. Aspekter av oppfinnelsen kan omfatte antistoffer som spesifikt bindes til humant IL-17RA og delvis eller fullstendig inhiberer IL-17RA fra å danne enten et homomert eller heteromert, funksjonelt reseptorkompleks, slik som IL-17RA/IL-17RC-kompleks, og som ikke nødvendigvis inhiberer IL-17A, IL-17F og/eller en IL-17A/IL-17F-heteromer fra å bindes til IL-17RA eller et heteromert IL-17RA-reseptorkompleks.

De antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen bindes spesifikt til IL-17RA. ”Bindes spesifikt” betyr som anvendt her, at det antigenbindende proteinet fortrinnsvis binder IL-17RA fremfor andre proteiner. I noen utførelser betyr ”bindes spesifikt” at de IL-17RA-antigenbindende proteinene har en høyere affinitet for IL-17RA enn for andre proteiner. For eksempel er likevekts dissosiasjonskonstanten <10<-7 >til 10<-11 >M, <10<-8 >til <10<-10 >M eller <10<-9 >til <10<-10 >M.

Det skal forstås at da det vises til de forskjellige utførelsene av IL-17RA-antistoffene som er beskrevet her, omfatter dette også IL-17RA-bindende fragmenter av disse. Et IL-17RA-bindende fragment omfatter hvilket som helst av antistoffragmentene eller antistoffdomenene som er beskrevet her, som har bevart evnen til spesifikt å bindes til IL-17RA. Disse IL-17RA-bindende fragmentene kan foreligger i hvilket som helst av støtteverkene som er beskrevet her. Disse IL-17Ra-bindende fragmentene kan også ha evnen til å inhibere aktiveringen av IL-17RA, som beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

I utførelser i hvilke det IL-17RA-antigenbindende proteinet er anvendt for terapeutiske formål, kan en egenskap ved et IL-17RA-antigenbindende protein være at det kan inhibere bindingen av IL-17A og/eller IL-17F til IL-17RA og én eller flere biologiske aktiviteter forbundet med eller formidlet av IL-17RA. Slike antistoffer anses som nøytraliserende antistoffer grunnet deres evne til å inhibere binding av IL-17A og/eller IL-17F til IL-17RA og i IL-17RA-signalisering og/eller IL-17RA-assosiert, biologisk aktivitet. I dette tilfellet binder et antigenbindende protein IL-17RA spesifikt og kan inhibere bindingen av IL-17A og/eller IL-17F til IL-17RA med en hvilken som helst verdi mellom 10 og 100%, for eksempel med minst tilnærmet 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% eller mer (for eksempel ved å måle binding i en in vitro-kompetitiv bindingsanalyse som beskrevet her). IL-17RA-antistoffer kan for eksempel analyseres for nøytraliserende evne ved å analysere dem for dannelsen av IL-6 i en analyse med fibroblaster fra human forhud (HFF) (se for eksempel Eksempel 8 og 9), eller hvilken som helst annen egnet analyse som er kjent innen faget. For illustrerende formål alene, omfatter eksempler på annen biologisk aktivitet forbundet med IL-17RA (f. eks. analyseavledninger) for analyse av inhibering av IL-17RA-signalisering og/eller biologisk aktivitet forbundet med IL-17RA in vitro- og/eller in vivo-måling av én eller flere av IL-8, CXCL1, CXCL2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1 β, TNF α, RANK-L, LIF, PGE2, IL-12, MMP (slik som for eksempel MMP3 og MMP9), GRO α, NO og/eller C-telopeptid og lignende.

Utførelser av antigenbindende proteiner omfatter en støtteverkstruktur, som definert på forskjellige steder her, med ett eller flere komplementaritetsbestemmende områder (CDR). Utførelser omfatter antistoffer som omfatter det isolerte antistoffet eller fragmentet derav ifølge krav 1, hvor antistoffet omfatter en lett kjede variabelt domene aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 40 og en tung kjede variabelt domene aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 14, hvor antistoffet eller fragmentet derav binder human IL-17 reseptor A.

Andre eksempler på støtteverk som kan omfattes er: fibronektin, neokarzinostatin CBM4-2, lipokaliner, T-cellereseptor, protein-A-domene (protein Z), Im9, TPR-proteiner, zinkfinger domener, pVIII, pankreatisk polypeptid fra fugl, GCN4, WW-domene, Srchomologidomene 3, PDZ-domener, TEM-1-beta-laktamase, tioredoksin, stafylokokk nuklease, PHD-fingerdomener, CL-2, BPTI, APPI, HPSTI, ekotin, LACI-D1, LDTI, MTI-II, skorpiontoksiner, defensin-A-peptid fra insekter, EETI-II, Min-23, CBD, PBP, cytokrom b-562, Ldl-reseptordomener, gamma-krystallin, ubikitin, transferrin og/eller lektinlignende domener av C-type.

I en annen variant kan det antigenbindende proteinet omfatte en aminosyresekvens som er minst 80%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med en tung kjede aminosyresekvens med SEKV. ID. Nr.: 14, eller en lett kjede aminosyresekvens med SEKV. ID. Nr.: 40.

Aspekter av oppfinnelsen kan omfatte antistoffer som omfatter en tung kjedes variable område med SEKV. ID. Nr.: 14, med ikke flere enn 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 aminosyreaddisjoner, -delesjoner eller –substitusjoner. Aspekter av oppfinnelsen kan omfatte antistoffer som omfatter en lett kjedes variable område med SEKV. ID. Nr.: 40 med ikke flere enn 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 aminosyreaddisjoner, -delesjoner eller –substitusjoner.

Aspekter av oppfinnelsen omfatter en rekke forskjellige utførelser, inkludert følgende eksemplifiserende utførelser: Utførelse 1: et isolert antistoff som omfatter et monoklonalt antistoff eller et IL-17-reseptor-A-bindende fragment derav, som ikke fullt ut er et museantistoff og som spesifikt binder IL-17-reseptor A og inhiberer IL-17-A fra å bindes til og aktivere denne reseptoren hvor antistoffet omfatter en lett kjede CDR1 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 224, en lett kjede CDR2 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr. 225, en lett kjede CDR3 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 226, en tung kjede CDR1 aminosyresekvens som omfatter EKV. ID: Nr. 146, en tung kjede CDR2 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 147 og en tung kjede CDR3 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 148. Utførelse 2: antistoffet ifølge utførelse 1, hvor antistoffet videre inhiberer IL-17F fra å bindes til og aktivere reseptoren. Utførelse 3: antistoffet ifølge Utførelse 1 eller utførelse 2, hvor antistoffet er valgt fra gruppen som består av: a. et humanisert antistoff, b. et kimert antistoff, c. et rekombinant antistoff, d. et enkeltkjedet antistoff, e. et diastoff, f. et triastoff, g. et tetrastoff, h. et Fabfragment, i. et F(ab’)2-fragment, j. et IgD-antistoff, k. et IgE-antistoff, l. et IgM-antistoff, m. et IgG1-antistoff, n. et IgG2-antistoff, o. et IgG3-antistoff og p. et IgG4-antistoff.

Utførelse 4: antistoffet ifølge utførelse 3, hvor antistoffet omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av:

A. a. en lett kjedes variable domenesekvens som er minst 80% identisk med en lett kjedes variable domenesekvens i AML14 (SEKV ID Nr.: 40),

b. en tung kjedes variable domenesekvens som er minst 80% identisk med en tung kjedes variable domene sekvens i AMH14 (SEKV ID Nr.: 14), eller

c. den lette kjedes variable domene ifølge (a) og den tunge kjedes variable domene ifølge (b); og

B. a. et lett kjede-CDR1, -CDR2, -CDR3 og et tung kjede-CDR1, -CDR2, -CDR3 med et lett kjede-CDR1 (SEKV ID Nr.: 224), -CDR2 (SEKV ID Nr.: 225), -CDR3 (SEKV ID Nr.: 226) og et tung kjede-CDR1 (SEKV ID Nr.: 146), -CDR2 (SEKV ID Nr.: 147), -CDR3 (SEKV ID Nr.: 148) fra antistoff AM-14 hvor antistoffet spesifikt binder IL-17-reseptor A.

Utførelse 5: antistoffet ifølge utførelse 4, hvor antistoffet omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av:

en lett kjedes variable domene og en tung kjedes variable domene fra AML14/AMH14 (SEKV. ID. Nr.: 40/SEKV. ID. Nr.: 14) hvor antistoffet spesifikt binder IL-17-reseptor A.

En ytterliger utførelse: en farmasøytisk sammensetning som omfatter antistoffet ifølge utførelse 4.

En ytterliger utførelse: et isolert antistoff som er valgt fra gruppen som består av: a) et antistoff som består av en tung kjedesekvens ifølge SEKV ID Nr.: 427 og en lett kjedesekvens ifølge SEKV. ID. Nr.: 429,

b) et antistoff som omfatter en tung kjedesekvens ifølge SEKV ID Nr.: 427 og en lett kjedesekvens ifølge SEKV ID Nr.: 429,

c) et antistoff eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav, som omfatter en tung kjedesekvens ifølge SEKV ID Nr.: 427 og en lett kjedesekvens ifølge SEKV ID Nr.: 429,

d) et antistoff eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav, som omfatter en lett kjedes variabelt områdesekvens ifølge SEKV ID Nr.: 40, og en tung kjedes variabelt områdesekvens ifølge SEKV ID Nr: 14,

e) et antistoff eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav, som omfatter et tung kjede-CDR1 ifølge SEKV ID Nr.: 146, et tung kjede-CDR2 ifølge SEKV ID Nr.: 147, et tung kjede-CDR3 ifølge SEKV ID Nr: 148, et lett kjede-CDR1 ifølge SEKV ID Nr: 224, et lett kjede-CDR2 ifølge SEKV ID Nr: 225 og et lett kjede-CDR3 ifølge SEKV ID Nr: 226.

En ytterligere utførelse 20: antistoffet ifølge foregående utførelse, hvor antistoffet er en farmasøytisk sammensetning.

Som en generell struktur, omfatter de antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen (a) et støtteverk, og (b) CDRer. Et ”komplementaritets-bestemmende område” eller ”CDR” viser, som anvendt her, til et område i et bindende protein som omfatter de viktigste overflatekontaktpunktene for antigenbinding. Utførelser av oppfinnelsen omfatter CDRer innlagt i en støtteverksstruktur i det antigenbindende proteinet. Støtteverkstrukturen i de antigenbindende proteinene kan være rammeverket fra et antistoff eller et fragment eller en variant derav, eller kan være fullstendig syntetisk av natur. Eksempler på forskjellige støtteverkstrukturer i de antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen beskrives videre her nedenfor.

De antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen omfatter støtteverkområder og CDRer. Et antigenbindende protein ifølge oppfinnelsen kan ha seks CDRer (som naturlig forekommende antistoffer har), for eksempel ett tung kjede-CDR1 (”H-CDR1”) og ett tung kjede-CDR2 (”H-CDR2”) og et tung kjede-CDR3 (”H-CDR3”) og ett lett kjede-CDR1

(”L-CDR1”) og ett lett kjede-CDR2 (”L-CDR2”) og ett lett kjede-CDR3 (”L-CDR3”).

Begrepet ”naturlig forekommende” anvendt i beskrivelsen i forbindelse med biologiske materialer som peptider, polypeptider, nukleinsyrer, vertsceller og lignende viser til materialer som finnes i naturen. I naturlig forekommende antistoffer omfatter et H-CDR1 typisk fra tilnærmet fem (5) til tilnærmet sju (7) aminosyrer, H-CDR2 omfatter typisk fra tilnærmet seksten (16) til tilnærmet nitten (19) aminosyrer og H-CDR3 omfatter typisk fra tilnærmet tre (3) til tilnærmet tjuefem (25) aminosyrer. L-CDR1 omfatter typisk fra tilnærmet ti (10) til tilnærmet sytten (17) aminosyrer, L-CDR2 omfatter typisk tilnærmet sju (7) aminosyrer og L-CDR3 omfatter typisk fra tilnærmet sju (7) til tilnærmet ti (10) aminosyrer. Spesifikke CDRer i de forskjellige antistoffene ifølge oppfinnelsen gis i Tabell 1 og i Sekvenslisten.

Den generelle strukturen og de generelle egenskapene til CDRer i naturlig forekommende antistoffer er beskrevet innen faget. Kort beskrevet er i et tradisjonelt antistoff-rammeverk, CDRer innlagt i et rammeverk i den tunge og lette kjedens variable område, hvor de utgjør områdene som stort sett er ansvarlige for antigenbinding og –gjenkjenning. Et variabelt område omfatter minst tre tung kjede- eller lett kjede-CDR, se supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, se også Chothia og Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-883), i et rammeverkområde (betegnet rammeverkområdene 1-4, FR1, FR2, FR3 og FR4 av Kabat et al., 1991, supra, se også Chothia og Lesk, 1987, supra). Se nedenfor. De CDRer som tilveiebringes av den foreliggende oppfinnelse kan imidlertid ikke bare anvendes for å definere det antigenbindende domenet i en tradisjonell antistoffstruktur, men kan også legges inn i en rekke andre støtteverkstrukturer, som beskrevet her.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan omfatte hvilket som helst konstant område som er kjent innen faget. Den lette kjedens konstante område kan for eksempel være et kappaeller lambda-type lett kjede konstant område av, f. eks. et humant kappa- eller lambdatype lett kjede konstant område. Den tunge kjedens konstante område kan for eksempel være et alfa-, delta-, epsilon-, gamma- eller mu-type tung kjede konstant område, f. eks. et humant alfa-, delta-, epsilon-, gamma- eller mu-type tung kjede konstant område. Den lette eller tunge kjedens konstante område er et fragment, et derivat, en variant eller et mutein av et naturlig forekommende, konstant område.

Oppfinnelsen tilveiebringer et antigenbindende protein som spesifikt binder

IL-17RA, hvor det antigenbindende proteinet omfatter et lett kjede-CDR1, -CDR2, -CDR3 og et tung kjede-CDR1-, -CDR2 og –CDR3, lett kjedens CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 224), CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 225), CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 226) og tung kjedens CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 146), CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 147), CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 148) i antistoff AM-14, og fragmenter, derivater, muteiner og varianter derav.

CDRer omfatter også konsensus-sekvenser avledet fra grupper av beslektede monoklonale antistoffer. Antistoffene kan være beslektet ved både sekvenshomologi og funksjon, som vist i eksemplene. Som beskrevet her, viser en ”konsensus-sekvens” til aminosyresekvenser som har konserverte aminosyrer som er felles for et antall sekvenser, og variable aminosyrer som varierer i gitte aminosyresekvenser. CDR-konsensussekvensene omfatter CDRer som tilsvarerer hvert av H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 og L-CDR3.

Konsensus-sekvenser ble bestemt ved anvendelse av standard fylogenetisk analyse av CDRer som tilsvarerer VH (dvs. variable tung kjededomener osv.) og VL i anti-IL-17RA-antistoffer. To forskjellige tilnærminger ble benyttet. I en første tilnærming ble konsensussekvensene bestemt ved å holde CDRer kontinuerlige i samme sekvens tilsvarende et VH-eller VL. I en andre tilnærming ble konsensus-sekvensene bestemt ved uavhengig sammenstilling av de forskjellige CDR-typene, dvs. H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 og L-CDR3 i de IL-17RA-antigenbindende proteinene som er beskrevet her.

I den første tilnærmingen ble, kort beskrevet, aminosyresekvenser som tilsvarerer de fullstendige variable domenene i enten VH eller VL konvertert til FASTA-format for enkel prosessering av sammenlignende sammenstillinger og utledning av fylogeni. Deretter ble rammeverkområder i disse sekvensene erstattet med en kunstig linkersekvens (GGGAAAGGGAAA, SEKV. ID. Nr.: 448) slik at en undersøkelse av CDRer alene kunne utføres uten å innføre en skjev vektfordeling av aminosyreposisjonene grunnet tilfeldige begivenheter (f. eks. ubeslektede antistoffer som tilfeldigvis har arvet et felles kimlinjerammeverk), samtidig som CDRer ble holdt kontinuerlig i den samme sekvens tilsvarende et VH eller VL. VH- eller VL-sekvenser i dette format ble så undersøkt ved sekvenssammenstilling ved anvendelse av et program som benytter en standard ClustalW-lignende algoritme (se Thompson et al., 1994, Nu8cleic Acids Res., 22:4673-4680). En gap-dannelse straff på 8,0 ble benyttet sammen med en gap-forlengelse straff på 2,0. Dette programmet fremstilte også fylogrammer (fylogenetisk tre-illustrasjon) basert på sekvenslikhets sammenstillinger ved anvendelse av enten UPGMA (uveid, pargruppe fremgangsmåte som anvender aritmetiske gjennomsnitt) eller ”Neighbor-Joining”-fremgangsmåter (se Saitou og Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution, 4:406-425) for å konstruere og illustrere likheter og særpreg mellom sekvensgrupper via en sammenligning av grenmengder og grupperinger. De to metodene ga resultater som lignet hverandre, men UPGMA-avledede trær ble til slutt anvendt, siden denne fremgangsmåten benytter et enklere og mer konservativt sett av antagelser. UPGMA-avledede trær vises i Figur 1, hvor grupper av sekvenser som lignet hverandre ble definert til å ha færre enn 15 substitusjoner per 100 aminosyrerester (se figurteksten i tre-illustrasjonene for skala) blant de enkeltvise sekvensene i gruppen, og ble anvendt for å definere samlinger av konsensus-sekvenser. De opprinnelige sekvenssammen-stillingene som ble fremstilt ble benyttet for en empirisk undersøkelse og dokumentering av forekomsten av aminosyrer som toleres i hver posisjon i en konsensus-gruppe, og vises i Figur 2 og 3. Konsensus-sekvenser for gruppene av sekvenser som ligner hverandre, ble så fremstilt for hver CDR. Aminosyrer som varierte i hver gruppe ble betegnet med Xn i hver konsensus-sekvens.

H-CDR1-konsensus-sekvensene inkluderer aminosyresekvenser som er valgt fra gruppen som består av: a) X1YGIS (SEKV. ID. Nr.: 453), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av R, S og G, b) X1YX2MX3 (SEKV. ID. Nr.: 454), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av D og S, X2 er valgt fra gruppen som består av Y og S, og X3 er valgt fra gruppen som består av S og N, og c) SYGMX2 (SEKV. ID. Nr.: 455), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av H og Q.

H-CDR2-konsensus-sekvensene inkluderer aminosyresekvenser valgt fra gruppen som består av: a) WISX1YX2GNTX3YAQX4X5QG (SEKV. ID. Nr.: 456), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av A og T, X2 er valgt fra gruppen som består av N, S og K, X3 er valgt fra gruppen som består av N og K, X4 er valgt fra gruppen som består av K og N og X5 er valgt fra gruppen som består av L og F, b) X1X2SX3X4X5SX6IX7YADSVKG (SEKV. ID. Nr.: 457), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av Y, I og F, X2 er valgt fra gruppen som består av I og S, X3 er valgt fra gruppen som består av S og A, X4 er valgt fra gruppen som består av S og R, X5 er valgt fra gruppen som består av G, S og ingen aminosyre, X6 er valgt fra gruppen som består av T og I og X7 er valgt fra gruppen som består av Y og H, og c) VIWYDGX1X2KX3YADSVKG (SEKV. ID. Nr.: 458), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av S og N, X2 er valgt fra gruppen som består av N og K og X3 er valgt fra gruppen som består av H og Y.

H-CDR3-konsensus-sekvensene inkluderer aminosyresekvenser valgt fra gruppen som består av: a) X1QLX2X3DY (SEKV. ID. Nr.: 459), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av R og K, X2 er valgt fra gruppen som består av Y, V og A og X3 er valgt fra gruppen som består av F og L, og b) X1QLX2FDY (SEKV. ID. Nr.: 460), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av R og K og X2 er valgt fra gruppen som består av Y og V.

L-CDR1-konsensus-sekvensen inkluderer en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: a) RASQX1IX2X3X4LX5 (SEKV. ID. Nr.: 461), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av G, S og A, X2 er valgt fra gruppen som består av R og S, X3 er valgt fra gruppen som består av S, I og N, X4 er valgt fra gruppen som består av W og Y og X5 er valgt fra gruppen som består av A og M, b) RASQSX1X2X3X4LA (SEKV. ID. Nr.: 462), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av W og Y, X2 er valgt fra gruppen som består av I og S, X3 er valgt fra gruppen som består av S og T, X4 er valgt fra gruppen som består av N og S og X5 er valgt fra gruppen som består av A og N, og c) RASQSVX1S2NLX3 (SEKV. ID. Nr.: 463), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av Y og S, X2 er valgt fra gruppen som består av S og R og X3 er valgt fra gruppen som består av A og V.

L-CDR2-konsensus-sekvensen inkluderer en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av: a) AASSX1QS (SEKV. ID. Nr.: 464), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av L og F, b) AASX1LQS (SEKV. ID. Nr.: 465), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av S og T, c) X1X2STRAX3, hvor X1 er valgt fra gruppen som består av G og D, X2 er valgt fra gruppen som består av A og T og X3 er valgt fra gruppen som består av T og A, og d) GASTRAX1 (SEKV. ID. Nr.: 466), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av A, T og N.

L-CDR3-konsensus-sekvensene inkluderer aminosyresekvenser valgt fra gruppen som består av: a) LQHX1SYX2X3T (SEKV. ID. Nr.: 467), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av K og N, X2 er valgt fra gruppen som består av P og N og X3 er valgt fra gruppen som består av L, F og P, b) QX1X2X3X4X5PX6T (SEKV. ID. Nr.: 468), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av Q og K, X2 er valgt fra gruppen som består av A, S og Y, X3 er valgt fra gruppen som består av N, Y og S, X4 er valgt fra gruppen som består av N, S og R, X5 er valgt fra gruppen som består av F, T, Y og A og X6 er valgt fra gruppen som består av R og F, c) QQYDX1WPLT (SEKV. ID. Nr.: 469), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av N, T og I, og d) QX1YX2X3WX4X5X6T (SEKV. ID. Nr.: 470), hvor X1 er valgt fra gruppen som består av H og Q, X2 er valgt fra gruppen som består av I, Y, N og K, X3 er valgt fra gruppen som består av N og S, X4 er valgt fra gruppen som består av T og R, X5 er valgt fra gruppen som består av K, ingen aminosyre og T og X6 er valgt fra gruppen som består av W og ingen aminosyre.

Figurene 1, 2, 3, 16A, 16B, 19 og 22 viser at et klart mønster i dataene foreligger mellom sekvenshomologien i CDR-domenene og antistoffenes funksjon, bestemt ved gruppering basert på krysskonkurranse og bestemmelsen av hvor antistoffene bindes til IL-17RA. Følgelig har en struktur/funksjonssammenheng for klasser av antistoffer blitt etablert for IL-17RA-antistoffene beskrevet her.

I en andre tilnærming ble CDR-konsensus-sekvenser bestemt for hvert enkelt CDR, uavhengig av deres kontinuerlige sammenheng i den samme sekvens som tilsvarer en VH eller VL. I denne tilnærmingen ble konsensus-sekvensene bestemt ved å sammenstille H-CDR1-, H-CDR2-, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- og L-CDR3-sekvensene i grupper, dvs. ved å sammenstille de enkelte H-CDR1-sekvensene i de IL-17RA-antigenbindende proteinene som er beskrevet her for å bestemme en H-CDR1-konsensus-sekvens, ved å sammenstille de enkelte H-CDR2-sekvensene i de IL-17RA-antigenbindende proteinene som er beskrevet her for å bestemme en H-CDR2-konsensus-sekvens, ved å sammenstille de enkelte H-CDR3-sekvensene i de Il-17RA-antigen-bindende proteinene som er beskrevet her for å bestemme en H-CDR3-konsensus-sekvens, ved å sammenstille de enkelte L-CDR1-sekvensene i de IL-17RA-antigenbindende proteinene som er beskrevet her for å bestemme en L-CDR1-konsensus-sekvens, ved å sammenstille de enkelte L-CDR2-sekvensene i de IL-17RA-antigenbindende proteinene som er beskrevet her for å bestemme en L-CDR2-konsensus-sekvens, og ved å sammenstille de enkelte L-CDR3-sekvensene i de Il-17RA-antigen-bindende proteinene som er beskrevet her for å bestemme en L-CDR2-konsensussekvens. Likhetene mellom sekvensene i de enkelte CDR-sekvensene ble identifisert.

Konsensus-sekvenser for gruppene av sekvenser som lignet hverandre for hvert CDR ble så fremstilt. Aminosyrer som varierte innen hver gruppe ble betegnet med Xn i hver konsensus-sekvens.

Oppfinnelsen tilveiebringer et antigenbindende protein som spesifikt binder

IL-17Ra, hvor det antigenbindende proteinet omfatter minst tre H-CDR-områder med SEKV. ID. Nr.: 107-146, 147, 148, og minst tre L-CDR-områder ifølge et hvilket som helst av SEKV. ID. Nr.: 224, 225, 226.

Som bemerket her, omfatter de antigenbindende proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse en støtteverkstruktur i hvilken én eller flere CDR(er) ifølge oppfinnelsen kan inntransplanteres. Slekten av IL-17RA-antigenbindende proteiner omfatter underslekten antistoffer, som definert på forskjellige steder her. Aspekter inkluderer utførelser i hvilke støtteverkstrukturen er en tradisjonell, tetramer antistoffstruktur. Følgelig inkluderer de antigenbindende proteinkombinasjonene som er beskrevet her de ekstra komponentene (rammeverk, J- og D-områder, konstante områder osv.) som utgjør en tung kjede og/eller en lett kjede.

Utførelser inkluderer anvendelse av humane støtteverkbestanddeler. Et eksempel på en utførelse av et variabelt VH-område transplantert inn i en tradisjonell antistoffstøtteverkstruktur vises i SEKV. ID. Nr.: 427, og et eksempel på en utførelse av et variabelt VL-område inntransplantert i en tradisjonell antistoff-støtteverkstruktur vises i SEKV. ID. Nr.: 429. Det skal naturligvis forstås at hvilken som helst antistoff-støtteverk-struktur som er kjent innen faget kan benyttes.

I et aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse antistoffer som omfatter en lett kjedes variable område av AML14 og en tung kjedes variable område av AMH14 og fragmenter derav. Antistoffer ifølge oppfinnelsen inkluderer for eksempel antistoffer som omfatter AML14/AMH14 (SEKV. ID. Nr.: 40/SEKV. ID. Nr.: 14), så vel som IL-17RA-bindende fragmenter derav.

I én utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antistoff som omfatter en lett kjedes variable domene som omfatter en sekvens av aminosyrer som skiller seg fra sekvensen i en lett kjedes variable domene AML14 i kun 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 eller 2 aminosyrerester, eller 1 aminosyrerest, hvor hver slik sekvensforskjell uavhengig av de andre er enten en delesjon, insersjon eller substitusjon av en aminosyrerest. I en annen utførelse omfatter den lette kjedens variable domene en sekvens av aminosyrer som er minst 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med sekvensen i en lett kjedes variable domene av AML14. I en annen utførelse omfatter den lette kjedens variable domene en sekvens av aminosyrer som kodes av en nukleotidsekvens som er minst 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% eller 99% identisk med en nukleotidsekvens som koder for en lett kjedens variable domene av AML14. I en annen utførelse omfatter den lette kjedens variable domene en sekvens av aminosyrer som kodes av et polynukleotid som hybridiserer under betingelser med moderat stringens til den komplementære sekvens til et polynukleotid som koder for en lett kjedes variable domene av AML14. I en annen utførelse omfatter den lette kjedens variable domene en sekvens av aminosyrer som kodes av et polynukleotid som hybridiserer under betingelser med moderat stringens til den komplementære sekvens til et lett kjede polynukleotid som foreligger i AML14-polynukleotidsekvensen (SEKV ID Nr.: 93).

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et antistoff som omfatter en tung kjedes variable domene som omfatter en sekvens av aminosyrer som skiller seg fra sekvensen i en tung kjedes variable domene av AMH14 i kun 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 eller 2 aminosyrerester, eller 1 aminosyrerest, hvor hver slik sekvensforskjellig uavhengig av de andre er enten en delesjon, insersjon eller substitusjon av en aminosyrerest. I en annen utførelse omfatter den tunge kjedes variable domene en sekvens av aminosyrer som er minst 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med sekvensen i en tung kjedes variable domene av AMH14. I en annen utførelse omfatter den tunge kjedens variable domene en sekvens av aminosyrer som kodes av en nukleotidsekvens som er minst 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med en nukleotidsekvens som koder for en tung kjedes variable domene av AMH14. I en annen utførelse omfatter den tunge kjedens variable domene en sekvens av aminosyrer som kodes av et polynukleotid som hybridiserer under moderat stringente eller stringente betingelser til den komplementære sekvens til et polynukleotid som koder for en tung kjedes variable domene av AMH14. I en annen utførelse omfatter den tunge kjedens variable domene en sekvens av aminosyrer som kodes av et polynukleotid som hybridiserer under moderat stringente eller stringente betingelser til den komplementære sekvens til et tung kjede polynukleotid som foreligger i AMH14-polynukleotidsekvensene (SEKV. ID. Nr.: 67).

I forskjellige utførelser omfatter følgelig de antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen støtteverk fra tradisjonelle antistoffer, inkludert humane og monoklonale antistoffer, bispesifikke antistoffer, diastoffer, minostoffer, domene antistoffer, syntetiske antistoffer (noen ganger her betegnet ”antistoff etterlignende forbindelser”), kimere antistoffer, antistoff fusjoner (noen ganger betegnet ”antistoff konjugater”) og fragmenter av alle disse. De ovenfor beskrevne CDRer og kombinasjoner av CDRer kan inntransplanteres i alle de påfølgende støtteverk.

Som anvendt her viser begrepet ”antistoff” til de forskjellige formene av monomere eller multimere proteiner som omfatter én eller flere polypeptidkjeder som spesifikt bindes til et antigen, som beskrevet på forskjellige steder her. Antistoffer kan fremstilles ved rekombinante DNA-teknikker. Antistoffer kan fremstilles ved enzymetisk eller kjemisk spalting av naturlig forekommende antistoffer. I et annet aspekt er antistoffet valgt fra gruppen som består av: a) et humant antistoff, b) et humanisert antistoff, c) et kimert antistoff, d) et monoklonalt antistoff, e) et polyklonalt antistof, f) et rekombinant antistoff, g) et antigenbindende antistoffragment, h) et enkeltkjedet antistoff, i) et diastoff, j) et triastoff, k) et tetrastoff, l) et Fab-fragment, m) et F(ab’)2-fragment, n) et IgD-antistoff, o) et IgE-antistoff, p) et IgM-antistoff, q) et IgA-antistoff, r) et IgG1-antistoff, s) et IgG2-antistoff, t) et IgG3-antistoff og u) et IgG4-antistoff.

Et variabelt område omfatter minst tre tung eller lett kjede-CDRer, se supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service, N.I.H., Bethesda, MD, se også Chothia og Lesk, 1987, J. Mol. Bil., 196:901-917, Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-883), som er innlagt i et rammeverkområde (betegnet rammeverkområdene 1-4, FR1, FR2, FR3 og FR4 av Kabat te al., 1991, supra, se også Chothia og Lesk, 1987, supra). Se nedenfor.

Tradisjonelle, strukturelle antistoffenheter omfatter typisk en tetramer. Hver tetramer består typisk av to identisk par av polypeptidkjeder, hvor hvert par har en ”lett” (som typisk har en molekylvekt på tilnærmet 25 kDa) og en ”tung” kjede (som typisk har en molekylvekt på tilnærmet 50-70 kDa). Den aminoterminale delen av hver kjede omfatter et variabelt område på tilnærmet 100 til 110 eller flere aminosyrer som primært er ansvarlig for antigengjenkjenningen. Den karboksyterminale delen av hver kjede definerer et konstant område, som primært er ansvarlig for effektorfunksjon. Humane lette kjeder klassifiseres som kappa- og lambda-lette kjeder. Tunge kjeder klassifiseres som mu, delta, gamme, alfa eller epsilon og definerer antistoffets isotype som IgM, IgD, IgG, IgA henholdsvis IgE. IgG har flere underklasser, inkludert IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4. IgM har underklasser inkludert IgM1 og IgM2. Utførelser av oppfinnelsen inkluderer alle slike klasser av antistoffer som inkorporerer de variable domenene eller CDRene i de antigenbindende proteinene som er beskrevet her.

Innenfor lette og tunge kjeder er de variable og konstante områdene sammenbundet via et ”J”-område på tilnærmet tolv (12) eller flere aminosyrer, hvor den tunge kjeden også omfatter et ”D”-område på tilnærmet ti (10) aminosyrer. Se generelt Paul, W., red., 1989, Fundamental Immunology, kap. 7, andre utgave, Raven Press, N.Y. De variable områdene i hvert lett/tung kjedepar danner det antigenbindende setet. Støtteverk ifølge oppfinnelsen omfatter slike områder.

Noen naturlig forekommende antistoffer, for eksempel antistoffer som finnes i kameler og lamaer, er dimerer som består av to tunge kjeder og omfatter ikke lette kjeder. Muldermans et al., 2001, J. Biotechnol., 74:277-302, Desmyter et a., 2001, J. Biol. Chem., 276:26285-26290. Krystallografiske undersøkelser av et kamel-antistoff har vist at CDR3-områdene danner en overflate som interagerer med antigenet og som følgelig er avgjørende for antigenbindingen, som for de mer typiske, tetramere antistoffene. Oppfinnelsen omfatter dimere antistoffer som består av to tunge kjeder eller fragmenter derav, som bindes til og/eller inhiberer den biologiske aktiviteten av IL-17RA.

De variable områdene i de tunge og lette kjedene viser vanligvis den samme generelle strukturen med relativt konserverte rammeverkområder (FR) som bindes sammen av tre hypervariable områder, dvs. de komplementaritetsbestemmende områdene eller CDRene. CDRene er de hypervariable områdene i et antistoff (eller antigen-bindende protein som skissert her) som er ansvarlige for antigengjenkjenning og –binding. CDRene fra de to kjedene i hvert par sammenstilles ved hjelp av rammeverkområdene, noe som muliggjør binding til en spesifikk epitop. Fra N-enden til C-enden omfatter både lette og tunge kjeder domenene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Fordelingen av aminosyrer på hvert domene er i samsvar med definisjonene i Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917, Chothia et al., 1989, Nature, 342:878-883. Støtteverk ifølge oppfinnelsen inkluderer slike områder.

CDRer utgjør de viktigste overflatekontaktpunktene for antigenbinding. Se for eksempel Chothia og Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917. Videre kan CDR3 i den lette kjeden, og særlig, CDR3 i den tunge kjeden, utgjøre de viktigste determinantene for antigenbinding i den lette og tunge kjedens variable områder. Se for eksempel Chothia og Lesk, 1987, supra, Desiderio et al., 2001, J. Mol. Biol., 310:603-615, Zu og Davis, 2000, Immunity, 13:37-45, Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:26285-26290 og Muyldermans, 2001, J. Biotechnol., 74:277-302. I noen antistoffer ser den tunge kjedes CDR3 ut til å utgjøre det viktigste kontaktarealet mellom antigenet og antistoffet. Desmyter et al., 2001, supra. In vitro-seleksjonsskjemaer i hvilke CDR3 alene varieres, kan anvendes for å variere bindingsegenskapene til et antistoff. Muyldermans, 2001, supra, Desiderio et al., 2001, supra.

Naturlig forekommende antistoffer omfatter typisk en signalsekvens som styrer antistoffet til den cellulære reaksjonsveien for proteinsekresjon og som ikke foreligger i det modne antistoffet. Et polynukleotid som koder for et antistoff ifølge oppfinnelsen kan kode for en naturlig forekommende signalsekvens eller en heterolog signalsekvens, som beskrevet nedenfor.

I én utførelse er det antigenbindende proteinet et monoklonalt antistoff som omfatter seks (6) av de beskrevne CDRene, som skissert her (se Tabell 1). Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan være av hvilken som helst type, inkludert IgM, IgG (inkludert IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgD, IgA eller IgE. I en spesifikk utførelse er det antigenbindende proteinet et antistoff av IgG-type. I en enda mer spesifikk utførelse, er det antigenbindende proteinet et antistoff av IgG2-type.

I noen utførelser, for eksempel dersom det antigenbindende proteinet er et antistoff med komplette tunge og lette kjeder, er de foreliggende CDRene alle fra samme art, f. eks. fra menneske. Alternativt, for eksempel i utførelser hvor det antigenbindende proteinet inneholder færre enn seks CDRer fra sekvensene som er skissert ovenfor, kan andre CDRer være enten fra andre arter (f. eks. muse-CDRer) eller andre humane CDRer enn de som er vist i sekvensene. For eksempel kan det anvendes humane H-CDR3 og L-CDR3-områder fra sekvensene som er identifisert her, mens H-CDR1, H-CDR2, L-CDR1 og L-CDR2 om ønskelig er valgt fra andre arter, fra andre humane antistoffsekvenser eller kombinasjoner av disse. For eksempel kan CDRer ifølge oppfinnelsen erstatte CDR-områdene i kommersielt relevante, kimere eller humaniserte antistoffer.

Spesifikke utførelser benytter støtteverkbestanddeler i de antigenbindende proteinene som er humane komponenter.

I noen utførelser kan imidlertid støtteverkbestanddelene være en blanding fra forskjellige arter. Dersom det antigenbindende proteinet er et antistoff, kan følgelig et slikt antistoff være et kimert antistoff og/eller et humanisert antistoff. Generelt viser både ”kimere antistoffer” og ”humaniserte antistoffer” til antistoffer som kombinerer områder fra mer enn én art. For eksempel omfatter ”kimere antistoffer” tradisjonelt variable områder fra en mus (eller i noen tilfeller, rotte), og konstante områder fra et menneske.

”Humaniserte antistoffer” viser vanligvis til ikke-humane antistoffer i hvilke rammeverksområdene i de variable domenene har blitt byttet ut med sekvenser som finnes i humane antistoffer. I et humanisert antistoff kodes vanligvis hele antistoffet bortsett fra CDRene av et polynukleotide av humant opphav, eller det er identisk med et slikt antistoff, bortsatt fra i CDR-områdene. CDR-områdene, av hvilke noen eller alle kodes av nukleinsyrer med opphav i en ikke-menneskelig organisme, transplanteres inn i betaplaterammeverket i et humant, variabelt antistoffområde for fremstilling av et antistoff hvis spesifisitet bestemmes av de inntransplanterte CDRene. Fremstillingen av slike antistoffer beskrives for eksempel i WO 92/11018, Jones, 1986, Nature, 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536. Humaniserte antistoffer kan også fremstilles ved anvendelse av mus med et genetisk modifisert immunsystem. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog., 20:639-654. I den foreliggende oppfinnelse er de identifiserte CDRene humane, og følgelig omfatter både humaniserte og kimere antistoffer i denne sammenheng noen ikke-humane CDRer, for eksempel kan det fremstilles humaniserte antistoffer som omfatter CDRH3 og CDRL3-områder, mens ett eller flere av de andre CDR-områdene har opphav i en annen art.

I én utførelse er det IL-17RA-antigenbindende proteinet et multispesifikt antistoff, fortrinnsvis et bispesifikt antistoff, også noen ganger betegnet ”diastoffer”. Disse er antistoffer som bindes til to (eller flere) forskjellige antigener. Diastoffer kan fremstilles på en rekke forskjellige måter som er kjente innen faget (Holliger og Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol., 4:446-449), f. eks. fremstilles kjemisk eller fra hybride hybridomer.

Et IL-17RA-antigenbindende protein som er et ministoff er beskrevet. Ministoffer er minimaliserte antistofflignende proteiner som består av et scFv koblet til et CH3-domene. Hu et al., 1996, Cancer Res., 56:3055-3061.

I én utførelse er det IL-17RA-antigenbindende proteinet et domeneantistoff, se for eksempel US patentskrift nr. 6 248 516. Domeneantistoffer (dAb) er funksjonelle bindingsdomener fra antistoffer som tilsvarer de variable områdene i enten den tunge (VH) eller den lette kjeden (VL) i humane antistoffer. dAb har en molekylvekt på tilnærmet 13 kDa, eller mindre enn 1/10 av størrelsen til et komplett antistoff. dAb uttrykkes godt i en rekke forskjellige verter, inkludert bakterieverter, gjærverter og pattedyr cellesystemer. I tillegg er dAb svært stabile og bevarer aktiviteten, selv etter å ha blitt utsatt for ublide betingelser, slik som frysetørking eller varmedenaturering. Se for eksempel US patentskrift nr.

6 291 158, 6 582 915, 6 593 081 og 6 172 197, US patentsøknad nr. 2004/0110941, europeisk patentskrift nr. 0368684, US patentskrift nr. 6 696 245, WO 04/058821, WO 04/003019 og WO 03/002609.

I én utførelse er det IL-17RA-antigenbindende proteinet et antistoffragment, dvs. et fragment av et hvilket som helst av antistoffene som er skissert her som har bevart bindingsspesifisiteten for IL-17RA. I forskjellige utførelser omfatter de antigenbindende proteinene for eksempel F(ab)-fragmenter, F(ab’)-fragmenter, F(ab’)2-fragmenter, Fvfragmenter eller enkeltkjede Fv-fragmenter. Som et minimum omfatter et antistoff, som begrepet anvendes her, et polypeptid som kan bindes spesifikt til IL-17RA og som omfatter hele eller en del av en lett eller tung kjedes variable område, slik som ett eller flere CDRer.

Ytterligere eksempler på IL-17RA-bindende antistoffragmenter inkluderer (i) Fabfragmentet, som består av VL-, VH-, CL- og CH1-domener, (ii) Fd-fragmentet, som består av VH- og CH1-domener, (iii) Fv-fragmentet, som består av Vl- og VH-domener fra et enkelt antistoff, (iv) dAb-fragmentet (Ward et al., 1989, Nature, 341:544-546) som består av en enkelt variabel, (v) isolerte CDR-områder, (vi) F(ab’)2-fragmenter, et bivalent fragment som omfatter to sammenkoblede Fab-fragmenter, (vii) enkeltkjede Fv-molekyler (scFv), hvor et VH-domene og et VL-domene er sammenkoblet via en peptidlinker som gjør det mulig for de to domenene å assosiere for dannelse av et antigenbindende sete (Bird et al., 1988, Science, 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883), (viii) bispesifikke, enkeltkjede Fv-dimerer (WO/1993/011161) og (ix) ”diastoffer” eller ”triastoffer”, multivalente eller multispesifikke fragmenter som er konstruert ved genfusjon (Tomlinson et al., 2000, Methods Enzymol., 326:461-479, WO 94/13804, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448). Antistoff-fragmentene kan være modifiserte. For eksempel kan molekylene stabiliseres ved innføring av disulfidbroer som sammenbinder VH- og VL-domener (Reiter et al., 1996, Nature Biotech., 14:1239-1245). Aspekter av oppfinnelsen inkluderer utførelser i hvilke ikke-CDR-bestanddelene i disse fragmentene er humane sekvenser.

I én utførelse er det IL-17RA-antigenbindende proteinet et fullt ut humant antistoff. I denne utførelsen, som skissert ovenfor, omfatter spesifikke strukturer komplette avbildede tunge og lette kjeder som omfatter CDR-områdene. Andre utførelser benytter ett eller flere av CDR-områdene ifølge oppfinnelsen, mens de andre CDR-områdene, rammeverkområdene, J- og D-områdene, konstante områder osv. kommer fra andre humane antistoffer. For eksempel kan CDR-områdene ifølge oppfinnelsen erstatte CDRer i en rekke humane antistoffer, fortrinnsvis kommersielt relevante antistoffer.

Enkeltkjede antistoffer kan dannes ved å sammenkoble tunge og lette kjeders variable domene (Fv-område)-fragmenter via en aminosyrebro (en kort peptidlinker), slik at det dannes en enkelt polypeptidkjede. Slike enkeltkjede Fv (scFv) har blitt fremstilt ved å fusjonere DNA som koder for en peptidlinker mellom DNA som koder for de to variabelt domene-polypeptidene (VL og VH). De resulterende polypeptidene kan foldes tilbake på seg selv og danne antigenbindende monomerer, eller de kan danne multimerer (f. eks. dimerer, trimerer eller tetramerer), avhengig av mengden av fleksible linkere mellom de to variable domenene (Kortt et al., 1997, Prot. Eng., 10:423, Kortt et al., 2001, Biomol. Eng., 18:95-108). Ved å kombinere forskjellige VL- og VH-omfattende polypeptider, kan man danne multimere scFv som binder til forskjellige epitoper (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng., 18:31-40). Teknikker som er utviklet for fremstilling av enkeltkjede antistoffer omfatter teknikkene som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 946 778, Bird, 1998, Science, 242:423, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879, Ward et al., 1989, Nature, 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol., 178:379-87. Enkeltkjede antistoffer som er avledet fra antistoffer som tilveiebringes her (inkludert scFv som for eksempel omfatter variabelt domene-kombinasjonene fra AML14/AMH14 (SEKV. ID. Nr.: 40/SEKV. ID. Nr.: 14)), omfattes av den foreliggende oppfinnelse.

I én utførelse er det IL-17RA-antigenbindende proteinet et antistoff fusjonsprotein (noen ganger her betegnet et ”antistoffkonjugat”). Konjugatpartneren kan være et protein eller ikke-protein, hvor konjugatet med ikke-protein vanligvis er fremstilt ved anvendelse av funksjonelle grupper i det antigenbindende proteinet (se diskusjonen vedrørende kovalent modifisering av de antigenbindende proteinene) og i konjugatpartneren. For eksempel er linkere kjente innen faget, for eksempel er homo- eller hetero-bifunksjonelle linkere velkjente (se 1994, Perice Chemical Company katalog, teknisk seksjon vedrørende krysslinkere, s. 155-200).

I én utførelse er det IL-17RA-antigenbindende proteinet en antistoffanalog, noen ganger betegnet ”syntetiske antistoffer”. For eksempel benytter en rekke nyere arbeider enten alternative proteinstøtteverk eller kunstige støtteverk med inntransplanterte CDRer. Slike støtteverk inkluderer for eksempel mutasjoner som er introdusert for å stabilisere det bindende proteins tredimensjonale struktur, så vel som fullt ut syntetiske støtteverk bestående for eksempel av biokompatible polymerer. Se for eksempel Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, bind 53, hefte 1:121-129. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog., 20:639-654. I tillegg kan antistoff-etterlignende peptider (”PAM”) anvendes, så vel som arbeid basert på antistoffetter-lignende forbindelser som anvender fibronektinbestanddeler som et støtteverk.

Som kjent innen faget kan en rekke forskjellige programmer anvendes for å bestemme graden av sekvensidentitet eller likhet som et protein eller en nukleinsyre har med en kjent sekvens.

Med ”protein” menes, som uttrykket anvendes her, minst to kovalent sammenbundne aminosyrer, og begrepet inkluderer proteiner, polypeptider, oligopeptider og peptider. I noen utførelser er de to eller flere kovalent sammenbundne aminosyrene sammenbundet via peptidbindinger. Proteinet kan bestå av naturlig forekommende aminosyrer og peptidbindinger, for eksempel når proteinet er fremstilt rekombinant ved anvendelse av ekspresjonssystemer og vertsceller, som skissert nedenfor. Alternativt kan proteinet inkludere syntetiske aminosyrer (f. eks. homofenylalanin, citrullin, ornitin og norleucin), eller peptidetterlignende strukturer, dvs. ”peptid- eller proteinanaloger”, slik som peptoider (se Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367), som kan være resistente ovenfor proteaser eller andre fysiologiske betingelser og/eller lagringsbetingelser. Slike syntetiske aminosyrer kan inkorporeres spesielt når det antigenbindende proteinet syntetiseres in vitro ved konvensjonelle fremgangsmåter som er velkjente innen faget. I tillegg kan en hvilken som helst kombinasjon av peptidetterlignende, syntetiske og naturlig forekommende aminosyrerester/strukturer anvendes. ”Aminosyre” inkluderer også iminosyrerester, slik som prolin og hydroksyprolin. Aminosyrens ”R-gruppe” eller ”sidekjede” kan foreligge i enten (L)- eller (S)-konfigurasjon. I en spesifikk utførelse foreligger aminosyrene i (L)- eller (S)-konfigurasjon.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen rekombinante antigenbindende proteiner som binder en IL-17-RA, i noen utførelser en rekombinant, human IL-17RA eller en del derav. I denne sammenheng er et ”rekombinant protein” et protein som er fremstilt ved anvendelse av rekombinante teknikker ved anvendelse av hvilke som helst teknikker og fremgangsmåter som er kjente innen faget, dvs. ved ekspresjon av en rekombinant nukleinsyre som beskrevet her. Fremgangsmåter og teknikker for fremstilling av rekombinante proteiner er velkjente innen faget. Utførelser av oppfinnelsen inkluderer rekombinante antigenbindende proteiner som binder villtype-IL-17RA og varianter derav.

”Som i det vesentliger består av” betyr at aminosyresekvensen kan variere med tilnærmet 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 eller 15% relativt til den angitte SEKV. ID. Nr.: sekvensen og fortsatt bevare biologisk aktivitet, som beskrevet her.

I noen utførelser er de antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen isolerte proteiner, eller i det vesentlige rene proteiner. Et ”isolert” protein er ikke ledsaget av i det minste noe av det materialet som det normalt er assosiert med i sin naturlige tilstand, og utgjør for eksempel minst tilnærmet 5% eller minst tilnærmet 50% vekt/vekt, av det totale proteinet i en gitt prøve. Det skal forstås at det isolerte protein kan utgjøre fra 5 til 99,9% (vekt/vekt) av det totale proteininnhold, avhengig av omstendighetene. For eksempel kan proteinet fremstilles i signifikant høyere konsentrasjon ved anvendelse av en induserbar promoter eller en promoter med høy ekspresjon, slik at proteinet dannes i et forhøyet konsentrasjonsnivå. Definisjonen inkluderer fremstillingen av et antigenbindende protein i et bredt utvalg av organismer og/eller vertsceller som er kjente innen faget.

For aminosyresekvenser bestemmes sekvensidentitet og/eller likhet ved anvendelse av standard teknikker som er kjente innen faget, inkludert algoritmen for lokal sekvensidentitet til Smith og Waterman, 1981, Adv. Appl. MAth., 2:482, algoritmen for sekvensidentitetsammenstilling til Needleman og Wunsch, 1070, J. Mol. Biol., 48:443, fremgangsmåten for søk etter likhet ifølge Pearson og Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444, datamaskinimplementeringer av disse algoritmene (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), sekvensprogrammet Best Fit, som er beskrevet av Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res., 12:387-395, fortrinnsvis ved anvendelse av standardinnstillinger eller ved inspeksjon. Fortrinnsvis beregnes prosentidentitet ved hjelp av FastDB basert på følgende parametere: en mis-match straff på 1, en gap-straff på 1, en gap-lengdestraff på 0,33 og en sammenkoblingsstraff på 30, ”Current Methods in Sequence Comparison and Analysis”, Macromoleculre Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, s. 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Et eksempel på en anvendbar algoritme er PILEUP. PILEUP fremstiller en flersekvenssammenstilling av en gruppe av beslektede sekvenser ved anvendelse av progressive, parvise sammenstillinger. Programmet kan også fremstille et tre som viser grupperingssammenhengene som anvendes for fremstilling av sammenstillingen. PILEUP anvender en forenkling av den progressive sammenstillingsfremgangsmåten til Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol., 35:351-360, fremgangsmåten ligner den som er beskrevet av Higgings og Sharp, 1989, CABIOS, 5:151-153. Anvedbare PILEUP-parametere omfatter en standard gap-straff på 3,0, en standard gap-lengdestraff på 0,10 og veide endegap.

Et annet eksempel på en anvendbar algoritme er BLAST-algoritme, som er beskrevet i: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410, altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 og Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787. Et spesielt anvendbart BLAST-program er programmet WU-BLAST-2, som ble anskaffet fra Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480. WU-BLAST-2 anvender flere søke-parametere, av hvilke de fleste settes til standardverdiene. De justerbare parameterne innstilles med følgende verdier: overlappstrekk = 1, overlapp-fraksjon = 0,125, ordterskel (T) = II. Parameterne HSP S og HSP S2 er dynamiske verdier som fastsettes av programmet selv, avhengig av sammensetningen av den angjeldende sekvens og sammen-setningen av databasen som sekvensen av interesse sammenlignes med, imidlertid kan verdiene justeres for å øke sensitiviteten.

En ytterligere anvendbar algoritme er BLAST med gap, som rapportert av Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res., 25:3389-3402. BLAST med gap anvender substitusjonsmatrisen BLOSUM-62, en terskelparameter T innstilt til 9, to-treffs fremgangsmåten for utløsning av forlengelser uten gap, plass for et gap med lengde k på 10+k, Xu innstilt til 16 og Xg innstilt til 40 for databasesøk stadie og til 67 for algoritmenes utsendingstrinn.

Sammenstillinger med gap utløses av en poengsum som tilsvarer tilnærmet 22 bits.

Vanligvis er aminosyrehomologien, -likheten eller –identiteten mellom de enkelte CDR-variantene minst 80% sammenlignet med sekvensene som vises her, mer typisk med fortrinnsvis økende homologi eller identitet på minst 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% og nesten 100%. På tilsvarende måte er ”prosent (%) nukleinsyresekvensidentitet” relativ til nukleinsyresekvensen til de bindende proteinene som identifiseres her definert som prosentandelen av nukleotidrester i en kandidatsekvens som er identiske med nukleotidrestene i den kodende sekvens for det antigenbindende protein. En spesifikk fremgangsmåte benytter BLASTN-modulen fra WU-BLAST-2 innstilt til standard parametere med et overlappstrekk og en overlapp-fraksjon innstilt til 1 henholdsvis 0,125.

Vanligvis er nukleinsyresekvenshomologien, -likheten eller –identiteten mellom nukleotidsekvensene som koder for de enkelte CDR-variantene og nukleotidsekvensene som vises her minst 80%, mer typisk med fortrinnsvis øket homologi eller identitet på minst 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% eller nesten 100%.

En ”CDR-variant” er således én med den angitte homologien, likheten eller identiteten med utgangs-CDRet ifølge oppfinnelsen, og har den samme biologiske funksjonen, inkludert minst 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% av spesifisiteten og/eller aktiviteten til utgangs-CDRet.

Selv om setet eller området for innføring av en aminosyresekvensvariasjon er bestemt på forhånd, må mutasjonen i seg selv ikke være bestemt på forhånd. For eksempel for å optimalisere virkningen av en mutasjon i et gitt sete, kan tilfeldig mutagenese utføres i målkodonet eller målområdet og de uttrykte antigenbindende protein-CDR-variantene analyseres for den optimale kombinasjonen av den ønskede aktiviteten.

Teknikker for innføring av substitusjonsmutasjoner i på forhånd bestemte seter i DNA med en kjent sekvens er velkjente, for eksempel M13-primermutagenese og PCR-mutagenese. Analysen av mutatene utføres ved anvendelse av analyse av antigenbindende proteinaktiviteter, slik som IL-17RA-binding.

Aminosyresubstitusjoner er vanligvis av enkeltvise aminosyrerester, insersjoner vil vanligvis ha en lengde på fra tilnærmet én (1) til rundt tyve (20) aminosyrerester, selv om betydelig lengre insersjoner kan tåles. Delesjoner varierer fra tilnærmet én (1) til rundt tyve (20) aminosyrerester, selv om delesjoner i noen tilfeller kan være mye større.

Substitusjoner, delesjoner, insersjoner eller en hvilken som helst kombinasjon av disse kan anvendes for å komme fram til et ytterligere derivat eller en endelig variant. Vanligvis utføres disse endringene på noen få aminosyrer, for a minimalisere endringen av molekylet, særlig immunogenisitet og spesifisitet av antigenbindende proteins. Imidlertid kan større endringer tolereres under visse omstendingheter. Konservative substitusjoner er vanligvis utført samsvar med følgende skjema, vist som Tabell 2.

Tabell 2

Opprinnelig aminosyrerest Eksempler på substitusjoner

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln, His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn, Gln

Ile Leu, Val

Leu Ile, Val

Lys Arg, Gln, Glu

Met Leu, Ile

Phe Met, Leu, Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp, Phe

Val Ile, Leu

Vesentlige endringer i funksjon eller immunologisk identitet utføres ved å velge substitusjoner som er mindre konservative enn de som vises i Tabell 2. For eksempel kan substitusjoner utføres som i mer signifikant grad påvirker: strukturen til polypeptidryggraden i endringsområdet, for eksempel alfa-heliks- eller beta-platestrukturen, molekylets ladning eller hydrofobisitet i målsetet; eller volumet av sidekjeden. De substitusjonene som generelt forvents å gi de største endringer av polypeptidets egenskaper er de i hvilke (a) en hydrofil aminosyrerest, f. eks. seryl eller treonyl erstatter (eller erstattes med) en hydrofob aminosyrerest, f. eks. leucyl, isoleucyl, fenylalanyl, valyl eller alanyl, (b) cystein eller prolin erstatter (eller erstattes med) hvilken som helst annen aminosyrerest, (c) en aminosyrerest med en elektropositiv sidekjede, f. eks. lysyl, arginyl eller histidyl, erstatter (eller erstattes med) en elektronegativ aminosyrerest, f. eks. glutamyl eller aspartyl, eller (d) en aminosyrerest med en voluminøs sidekjede, f. eks. fenylalanin, erstatter (eller erstattes med) en aminosyre uten sidekjede, f. eks. glysin.

Variantene viser vanligvis den samme kvalitative biologiske aktiviteten og vil utløse den samme immunrespons som den naturlig forekommende analogen, selv om varianter også selekteres for å modifisere egenskapene til de antigenbindende proteinene etter behov. Alternativt kan varianten utformes slik at den biologiske aktiviteten til det antigenbindende proteinet endres. For eksempel kan glykosyleringsseter endres eller fjernes, som diskutert her. En slik modifikasjon av de IL-17RA-antigenbindende proteinene, inkludert antistoffer, er et eksempel på et derivat. Et ”derivat” av et polypeptid er et polypeptid (f. eks. et antistoff) som har blitt modifisert kjemisk, f. eks. ved konjugering til en annen kjemisk gruppe, for eksempel polyetylenglykol, albumin (f. eks. humant serumalbumin), ved fosforylering og ved glykosylering.

Andre derivater av IL-17RA-antistoffer inkluderer kovalente eller aggregative konjugater av IL-17RA-antistoffer eller fragmenter derav til andre proteiner eller polypeptider, slik som ved ekspresjon av rekombinante fusjonsproteiner som omfatter heterologe polypeptider fusjonert til N-enden eller C-enden av et IL-17Ra-antistoff polypeptid. For eksempel kan det konjugerte peptid være et heterologt signalpolypeptid (eller lederpeptid), f. eks. ledersekvensen fra alfa-faktor fra gjær, eller et peptid, slik som en epitopmerkelapp. IL-17RA-antistoffholdige fusjonsproteiner kan omfatte peptider som er addert for å forenkle rensing eller påvisning av IL-17RA-antistoffet (f. eks. poly-His).

Et IL-17RA-antistoff polypeptid kan også kobles til FLAG-peptidet DYKDDDDK (SEKV. ID. Nr.: 447) som beskrevet i Hopp et al., Bio/Technology, 6:1204, 1988, og US patentskrift nr.

5 011 912. FLAG-peptidet er svært antigent og tilveiebringer en epitop som bindes reversibelt av et spesifikt, monoklonalt antistoff (mAb), noe som muliggjør hurtig analyse og enkel rensing av uttrykt, rekombinant protein. Reagenser som er anvendbare for fremstilling av fusjonsproteiner i hvilke FLAG-peptidet er fusjonert til et gitt polypeptid, er kommersielt tilgjengelige (Sigma, St. Louis, MO).

Oligomerer som inneholder ett eller flere IL-17RA-antistoffpolypeptider kan benyttes som IL-17RA-antagonister. Oligomerer kan foreligge i form av kovalent eller ikkekovalent sammenbundne dimerer, trimerer eller høyere oligomerer. Oligomerer som omfatter to eller flere IL-17RA-antistoffpolypeptider er tiltenkt til anvendelse, hvor ett eksempel er en homodimer. Andre oligomerer inkluderer heterodimerer, homotrimerer, heterotrimerer, homotetramerer, heterotetramerer osv..

Én utførelse er rettet mot oligomerer som omfatter flere IL-17RA-antistoff polypeptider som er sammenbundet via kovalente eller ikke-kovalente interaksjoner mellom peptidgrupper som er fusjonert til IL-17RA-antistoff polypeptidene. Slike peptider kan være peptidlinkere (avstandsgivere) eller peptider som har evnen til å fremme oligomerisering. Leucin-”zippere” og visse polypeptider avledet fra antistoffer er blant de peptider som kan fremme oligomerisering av IL-17RA-antistoff polypeptider som er koblet til dem, som beskrevet i mer detalj nedenfor.

I spesielle utførelser omfatter oligomerene fra to til fire IL-17RA-antistoff polypeptider. IL-17RA-antistoffgruppene i oligomeren kan foreligge i hvilken som helst av formene som er beskrevet ovenfor, f. eks. varianter eller fragmenter. Oligomerene omfatter fortrinnsvis IL-17RA-antistoff polypeptider som har IL-17RA-bindende aktivitet.

I én utførelse fremstilles en oligomer ved anvendelse av polypeptider som er avledet fra immunglobuliner. Fremstilling av fusjonsproteiner som omfatter visse heterologe polypeptider fusjonert til forskjellige deler av antistoff-avledede polypeptider (inkludert Fc-domenet), har blitt beskrevet, f. eks. av Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA, 88:10535, Byrn et al., 1990, Nature, 344:677 og Hollenbaugh et al., 1992, ”Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, s. 10.19.1 – 10.19.11.

Én utførelse av den foreliggende oppfinnelse er rettet mot en dimer som omfatter to fusjonsproteiner fremstilt ved å fusjonere et IL-17RA-bindende fragment av et IL-17RA-antistoff til et Fc-område fra et antistoff. Dimeren kan for eksempel fremstilles ved å innsette en genfusjon som koder for fusjonsproteinet i en egnet ekspresjonsvektor, uttrykke genfusjonen i vertsceller som er transformert med den rekombinante ekspresjonsvektoren og la det uttrykte fusjonsproteinet settes seg sammen, stort sett på samme måte som antistoffmolekyler, hvoretter interkjede-disulfidbindinger dannes mellom Fc-delene for å gi dimeren.

Begrepet ”Fc-polypeptid” som anvendt her inkluderer native og muteine former av polypeptider avledet fra et antistoff Fc-område. Avkortede former av slike polypeptider som inneholder hengsleområdet, som fremmer dimerisering, er også inkludert. Fusjonsproteiner som omfatter Fc-grupper (og oligomerer dannet av disse) byr på fordelen med enkel rensing med affinitetskromatografi over Protein A- eller Protein G-kolonner.

Ett egnet Fc-polypeptid, som er beskrevet i PCT-publikasjon WO 93/10151, er et enkeltkjedet polypeptid som strekker seg fra det N-terminale hengselområde til den native C-enden av Fc-området i et humant IgG-antistoff. Et annet anvendbart Fc-polypeptid er Fcmuteinet som er beskrevet i US patentskrift nr. 5 457 035 og i Baum et al., 1994, EMBO J., 13:3992-4001. Aminosyresekvensen til dette muteinet er identisk med aminosyresekvensen til den native Fc-sekvens som er beskrevet i WO 93/10151, bortsett fra at aminosyre 19 har blitt endret fra Leu til Ala, aminosyre 20 har blitt endret fra Leu til Glu og aminosyre 22 har blitt endret fra Gly til Ala. Muteinet viser redusert affinitet for

Fc-reseptorer.

I andre utførelser kan den variable del av den tunge og/eller lette kjeden i et IL-17RA-antistoff innføres i stedet for den variable delen i et antistoffs tunge og/eller lette kjede.

Alternativt er oligomeren et fusjonsprotein som omfatter flere IL-17R-antistoff polypeptider med eller uten peptidlinkere (avstandsgivende peptider). Blant de anvendbare peptidlinkerene er linkerene beskrevet i US patentskrift nr. 4 751 180 og 4 935 233.

En annen fremgangsmåte for fremstilling av oligomere IL-17R-antistoffderivater involverer anvendelse av en leucin-”zipper”. Leucin-”zipper”-domener er peptider som fremmer oligomerisering av proteinene som de finnes i. Leucin-”zippere” ble opprinnelig påvist i flere DNA-bindende proteiner (Landschulz et al., 1988, Science, 240:1759), og har siden blitt funnet i en rekke forskjellige proteiner. Blant de kjente leucin-”zippere” er naturlig forekommende peptider og derivater derav som dimeriserer eller trimeriserer. Eksempler på leucin-”zipper”-domener som er egnede for fremstilling av løselige oligomere proteiner beskrives i PCT-patentsøknad WO 94/10308, og leucin-”zippere” som er avledet fra lungesurfaktantprotein D (SPD), som er beskrevet i Hoppe et al., 1994, FEBS Letters, 344:191. Anvendelse av en modifisert leucin-”zipper” som tillater stabil dimerisering av et heterologt protein som er fusjonert til ”zipperen” beskrives i Franslow et al., 1994, Semin. Immunol., 6:267-78. I én tilnærming uttrykkes rekombinante fusjonsproteiner som omfatter et IL-17RA-antistoffragment eller –derivat fusjonert til et leucin-”zipper”-peptid i egnede vertsceller, og de løselige, oligomere IL-17RA-antistoffragmentene eller –derivatene som dannes gjenvinnes fra dyrknings-supernatanten.

Kovalente modifikasjoner anses også som derivater av de IL-17RA-antigenbindende proteinene og omfattes av den foreliggende oppfinnelse, og innføres vanligvis, men ikke alltid etter translasjonen. For eksempel innføres flere typer av kovalente modifiseringer av det antigenbindende proteinet i molekylet ved å la spesifikke aminosyrerester i det antigenbindende proteinet reagere med et organisk derivatiseringsmiddel som kan reagere med valgte sidekjeder eller den N- eller C-terminale aminosyrerest.

Cysteinylrester får vanligvis reagere med α-haloacetater (og tilsvarende aminer), slik som kloreddiksyre eller kloracetamid, for å gi karboksymetyl-, eller karboksyamidometylderivater. Cysteinylrester derivatiseres også ved reaksjon med bromtrifluoraceton, α-brom- β-(5-imidozoyl)propionsyre, kloracetylfosfat, N-alkylmale-imider, 3-nitro-2-pyridyldisulfid, metyl-2-pyridyldisulfid, p-klormerkuribenzoat, 2-klormerkuri-4-nitrofenol eller klor-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol.

Histidylrester derivatiseres ved reaksjon med dietylpyrokarbonat ved pH 5,5-7,0, siden dette middel er relativt spesifikt for histidyl sidekjeden. Para-bromfenacylbromid er også anvendbart, denne reaksjonen utføres fortrinnsvis i 0,1 M natriumkakodylat ved pH 6,0.

Lysinylrester og aminoterminale aminosyrerester får reagere med ravsyre-anhydrid eller andre karboksylsyreanhydrider. Derivatisering med disse midlene gjør at lysinylrestenes ladning reverseres. Andre egnede reagenser for derivatisering av alfa-aminoholdige aminosyrerester omfatter imidoestere, slik som metylpikolinimidat, pyridoksalfosfat, pyridoksal, klorborhydrid, trinitrobenzensulfonsyre, O-metylisourea, 2,4-pentandion og en transaminasekatalysert reaksjon med glyoksylat.

Aginylrester modifiseres ved reaksjon med ett eller flere konvensjonelle reagenser, blant disse kan nevnes fenylglyoksal, 2,3-butandion, 1,2-sykloheksandion og ninhydrin. Derivatisering av argininrester krever at reaksjonen utføres under alkaliske betingelser, grunnet den funksjonelle guanidingruppens høye pKa. Disse reagensene kan videre reagere med lysingrupper, så vel som med epsilon-aminogruppen i arginin.

Spesifikk modifisering av tyrosylrester kan innføres, med spesiell interesse for innføring av spektrummerking i tyrosylrester ved reaksjon med aromatiske diazoniumforbindelser eller tetranitrometan. Vanligvis anvendes N-acetylimidazol og tetranitrometan for dannelse av O-acetyltyrosylrester henholdsvis 3-nitroderivater. Tyrosylrester jodineres ved anvendelse av <125>I eller <131>I for fremstilling av merkede proteiner for anvendelse i radioimmun analyser, hvor kloramin-T-fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor er egnet.

Karboksylsidegrupper (aspartyl eller glutamyl) modifiseres selektivt ved reaksjon med karbodiimider (R’—N=C=N—R’) hvor R og R’ om ønskelige er forskjellige alkylgrupper, slik som 1-sykloheksyl-3-(2-morfolinyl-4-etyl)-karbodiimid eller 1-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)karbodiimid. Videre kan aspartyl- og glutamylrester omdannes til asparaginyl- og glutaminylrester ved reaksjon med ammoniumioner.

Derivatisering med bifunksjonlle midler er nyttig for kryssbinding av antigenbindende proteiner til et vannuløselig støttemiddel eller en overflate for anvendelse i en rekke forskjellige fremgangsmåter. Alminnelig anvendte kryssbindingsmidler omfatter f. eks. 1,1-bis(diazoacetyl)-2-fenyletan, glutaraldehyd, N-hydroksysuksinimidestere, for eksempel estere med 4-azidosalicylsyre, homobifunksjonelle imidoestere, inkludert disuksinimidylestere slik som 3,3’-ditiobis(suksinimidylpropionat) og bifunksjonelle maleimider, slik som bis-N-maleimido-1,8-oktan. Derivatiseringsmidler som metyl-3-[(pazido-fenyl)ditio]propio-imidat gir lysaktiverbare intermediater som kan danne kryssbindinger i nærvær av lys. Alternativt benyttes reaktive, vannuløselige støttemidler som cyanogen-bromidaktiverte karbohydrater og de reaktive substratene som beskrevet i US patentskrift nr. 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537 og 4 330 440 for immobilisering av proteiner.

Glutaminyl- og asparaginylrester deamideres ofte til den tilsvarende glutamylresten, henholdsvis aspartylresten. Alternativt deamideres disse aminosyrestene etter mildt sure betingelser. Begge former av disse aminosyrerestene omfattes av oppfinnelsen.

Andre modifikasjoner omfatter hydroksylering av prolin og lysin, fosforylering av hydroksylgruppene i seryl- eller treonylrester, metylering av α-aminogruppene i sidekjeden til lysin, arginin og histidin (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, s. 79-86), acetylering av den N-terminale aminogruppe og amidering av en eventuell C-terminal karboksylgruppe.

En annen type av kovalent modifisering av det antigenbindende proteinet som omfattes av den foreliggende oppfinnelse omfatter å endre proteinets glykosyleringsmønster. Som kjent innen faget, kan glykosyleringsmønsteret avhenge av både proteinets sekvens (f. eks. nærvær eller fravær av spesielle glykosylerings aminosyrerester, diskutert nedenfor) eller av vertscellen eller organismen som proteinet produseres i. Spesielle ekspresjonssystemer diskuteres nedenfor.

Glykosylering av polypeptider er typisk enten N-koblet eller O-koblet. N-koblet viser til tilkobling av karbohydratgruppen til sidekjeden i en asparaginrest. Tripeptidsekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, hvor X er en hvilken som helst aminosyre bortsett fra prolin, er gjenkjenningssekvenser for enzymatisk tilkobling av karbohydratgruppen til asparagin sidekjeden. Nærvær av en av disse tripeptid-sekvensene i et polypeptid danner følgelig et mulig glykosyleringssete. O-koblet glykosylering viser til tilkobling av et av sukkerne N-acetylgalaktosamin, galaktose eller xylose til en hydroksyaminosyre, vanligvis serin eller treonin, selv om 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksylysin også kan anvendes.

Addering av glykosyleringsseter til det antigenbindende proteinet oppnås enkelt ved å endre aminosyresekvensen, slik at den inneholder én eller flere av de ovenfor beskrevne tripeptidsekvensene (for seter for N-koblet glykosylering). Endringen kan også innføres ved å addere eller substituere én eller flere serin- eller treoninrester til utgangssekvensen (for seter for O-koblet glykosylering). For enkelthets skyld endres aminosyresekvensen til det antigenbindende proteinet fortrinnsvis ved endring på DNA-nivå, fortrinnsvis ved å mutere DNA som koder for mål-polypeptidet i på forhånd bestemte baser, slik at det dannes kodoner som vil translateres til de ønskede aminosyrene.

En annen måte å øke antall karbohydratgrupper på det antigenbindende proteinet er ved kjemisk eller enzymatisk kobling av glykosider til proteinet. Disse fremgangsmåtene er fordelaktige ved at de ikke krever fremstilling av proteinet i en vertscelle som har evnen til N- og O-koblet glykosylering. Avhengig av den benyttede koblingsmåten kan sukkeret eller sukkerne kobles til (a) arginin og histidin, (b) frie karboksylgrupper, (c) frie sulfhydrylgrupper, slik som i cystein, (d) frie hydroksylgrupper, slik som i serin, treonin eller hydroksyprolin, (e) aromatiske aminosyrerester, slik som fenylalanin, tyrosin eller tryptofan, eller (f) amidgruppen i glutamin. Disse fremgangsmåtene beskrives i WO 87/05330, offentliggjort 11. september, 1987, og i Aplin og Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., s. 259-306.

Fjerning av karbohydratgrupper som foreligger i utgangsformen av det antigenbindende proteinet kan oppnås kjemisk eller enzymatisk. Kjemisk deglykosylering krever behandling av proteinet med forbindelsen trifluormetansulfonsyre eller en ekvivalent forbindelse. Denne behandlingen fører til avspalting av de fleste eller alle sukkere, bortsett fra koblingssukkeret (N-acetylglukosamin eller N-acetylgalaktosamin), mens polypeptidkjeden forblir intakt. Kjemisk deglykosylering beskrives av Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 og av Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131. Enzymatisk avspalting av karbohydratgrupper fra polypeptider kan oppnås ved anvendelse av en rekke endo- og exo-glykosidaser, som beskrevet av Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol., 138:350. Glykosylering i mulige glykosyleringsseter kan forhindres ved anvendelse av forbindelsen tunikamycin som beskrevet av Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem., 257:3105. Tunikamycin blokkerer dannelsen av protein-N-glykosidbindinger.

En annen type av kovalent modifisering av det antigenbindende proteinet omfatter kobling av det antigenbindende proteinet til forskjellige ikke-protein polymerer, inkludert forskjellige polyoler, slik som polyetylenglykol, polypropylenglykol eller polyoksyalkylener, på den måte som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192 eller 4 179 337. I tillegg kan, som kjent innen faget, aminosyresubstitusjoner innføres i visse posisjoner i det antigenbindende proteinet for å forenkle tilkoblingen av polymerer som PEG.

I noen utførelser omfatter den kovalente modifisering av de antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen addisjon av én eller flere merkingsgrupper.

Begrepet ”merkingsgruppe” betyr hvilken som helst påvisbar merking. Eksempler på egnede merkingsgrupper omfatter følgende: radioaktive isotoper eller radionuklider (f. eks. <3>H, <14>C, <15>N, <35>S, <90>Y, <99>Tc, <111>In, <125>I, <131>I), fluorescerende grupper (f. eks. FITC, rodamin, lantanidfosforer), enzymatiske grupper (f. eks. pepperrotperoksidase,

β-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), kjemiluminescerende grupper, biotinylgrupper eller på forhånd bestemte polypeptidepitoper som gjenkjennes av en sekundær rapportør (f. eks. par av leucin-”zipper”-sekvenser, bindingsseter for sekundære antistoffer, metallbindende domener, epitopmerkelapper). I noen utførelser kobles merkingsgruppen til det antigenbindende proteinet ved hjelp av avstandsgivende armer av forskjellig lengde, slik at mulig sterisk hindring reduseres. Forskjellige fremgangsmåter for merking av proteiner er kjente innen faget og kan anvendes ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse.

Generelt kan merkingsgrupper inndeles i forskjellige klasser avhengig av analysen i hvilken de skal påvises: a) isotopmerking, som kan være radioaktive isotoper eller tunge isotoper, b) magnetisk merking (for eksempel magnetiske partikler), c) redoks-aktive grupper, d) optiske fargestoffer, enzymatiske grupper (for eksempel pepperrotperoksidase, β-glaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), e) biotinylerte grupper og f) på forhånd bestemte polypeptid-epitoper som gjenkjennes av en sekundær rapportørt (for eksempel par av leucin-”zipper”-sekvenser, bindingsseter for sekundære antistoffer, metallbindende domener, epitopmerkelapper osv.). I noen utførelser er merkingsgruppen koblet til det antigenbindende proteinet ved hjelp av avstandsgivende armer med forskjellige lengder, for å redusere mulig sterisk hindring. Forskjellige fremgangsmåter for merking av proteiner er velkjente innen faget og kan anvendes ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse.

Spesifikke merkingsgrupper omfatter optiske fargestoffer, inkludert kromoforer, fosforer og fuorofurer, hvor de siste i mange tilfeller er spesifikke. Fluoroforer kan enten være ”lav-molekylære” fluoroforer eller protein fluoroforer.

Med ”fluorescensmerking” menes et hvilket som helst molekyl som kan påvises via sine iboende fluorescensegenskaper. Egnede fluoresceringsmerkingsgrupper omfatter fluorescein, rodamin, tetrametylrodamin, eosin, erytrosin, koumarin, metylkoumariner, pyren, Malacitt-grønt, stilben, Lucifer-gul, Cascade BlåJ, Texas rød, IAEDANS; EDANS, BODIPY FL, LC Rød 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Rød 705, Oregon-grønn, Alexa-Fluor-fargestoffene (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade blå, Cascade gul og R-fykoerytrin (PE) (MOlecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamin og Texas rød (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburg, PA). Egnede optiske fargestoffer, inkludert fluorofforer, beskrives i Molecular Probes Handbook av Richard P. Haugland.

Egnede fluorescerende proteinmerkingsgrupper omfatter også grønt fluorescerende protein, inkludert en Renilla-, Ptilosarcus- eller Aequorea-type av GFP (Chalfie et al., 1994, Science, 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank aksesjonsnummer U55762), blått, fluorescerende protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., 1801 de Maisonneuve Blv. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9, Stauber, 1998, Biotechniques, 24:462-471, Heim et al., 1996, Curr. Biol., 6:178-182), forsterket gult, fluorescerende protein (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferase (Ichiki et al., 1993, J. Immunol., 150:5408-5417), β-galaktosidase (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2603-2607) og Renilla (WO 92/15673, WO 95/07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, US patentskrift nr. 5 292 658, 5 418 155, 5683 888, 5 741 668, 5 777 079, 5 804 387, 5 874 304, 5 876 995, 5 925 558).

Polynukleotider som koder for IL-17RA-antigenbindende proteiner

Omfattet av oppfinnelsen er nukleinsyrer som koder for IL-17RA-antigenbindende proteiner, inkludert antistoffer, som definert her. Polynukleotidsekvensene til den tunge kjedens variable områder AMH14 finnes i SEKV ID Nr.: 67, og polynukleotidsekvensene for den lette kjedens variable områder AML14 finnes i SEKV. ID. Nr.: 93. SEKV. ID. Nr. for polynukleotidsekvensene som koder for H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 og L-CDR3 gis i Tabell 1.

Aspekter av oppfinnelsen omfatter polynukleotidvarianter (f. eks. grunnet degenererthet) som koder for aminosyresekvensene som er beskrevet her.

Aspekter av oppfinnelsen omfatter en rekke utførelser, inkludert følgende eksemplifiserende utførelser: et isolert polynukleotid, hvor polynukleotider koder for et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av:

A. a. en lett kjedes variable domene sekvens som er minst 80% identisk med en lett kjedes variable domene sekvens i AML14 (SEKV ID Nr.: 40),

b. en tung kjedes variable domene sekvens som er minst 80% identisk med en tung kjedes variable domene sekvens i AMH14 (SEKV ID Nr.: 14), eller

c. den lette kjedens variable domene ifølge (a) og den tunge kjedens variable domene ifølge (b), og

B. et lett kjede-CDR1, -CDR2, -CDR3 og et tung kjede-CDR1, -CDR2, -CDR3 med følgende sekvenser:

a. et lett kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 224), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 225), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 226) og et tung kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 146), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 147), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 148) fra antistoff AM-14, hvor polypeptidet spesifikt binder IL-17-reseptor A.

Beskrevet er et polynukleotid som hybridiserer under stringente betingelser til den komplementære sekvens med full lengde av

a. en lett kjedes variable domenekodende polynukleotid og en tung kjedes variable domenekodende polynukleotid for AML14/AMH14 (SEKV. ID. Nr.: 93/SEKV. ID. Nr.: 67).

Også beskrevet er et polynukleotid som hybridiserer under stringente betingelser til den komplementære sekvens med full lengde av

a. et lett kjede-CDR1-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 384, -CDR-2-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 385, -CDR2-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 386 og et tung kjede-CDR1-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 305,

-CDR2-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 306 og –CDR3-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 307 fra antistoff AM-14.

En utførelse ifølge oppfinnelsen inkluderer et polynukleotide som koder for et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens av:

a. en lett kjedes variable domene og en tung kjedes variable domene fra AML14/AMH14 (SEKV. ID. Nr.: 40/SEKV. ID. Nr.: 14).

En ytterligere utførelse inkluderer et polynukleotid som koder for et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens av:

a. et lett kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 224), -CDR2 (SEKV ID Nr.: 225), -CDR3 (SEKV ID Nr.: 226) og et tung kjede-CDR1 (SEKV ID Nr.: 146), -CDR2 (SEKV ID Nr.: 147), -CDR3 (SEKV ID Nr.: 148) fra antistoff AM-14.

En ytterligere utførelse inkluderer a:

En ytterligere utførelse inkluderer:

a. et lett kjede-CDR1-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 384, -CDR-2-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 385, -CDR2-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 386 og et tung kjede-CDR1-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 305, -CDR2-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 306 og –CDR3-kodende polynukleotid ifølge SEKV. ID. Nr.: 307 fra antistoff AM-14.

En ytterligere utførelse av oppfinnelsen inkluderer: et plasmid som omfatter polynukleotidet ifølge oppfinnelsen, plasmidet kan være en ekspresjonsvektor.

En ytterligere utførelse inkluderer: en isolert celle som omfatter ekspresjonsvektoren ifølge oppfinneslsen.

Den isolerte cellen er valgt fra gruppen som består av: a. en prokaryot celle, b. en eukaryot celle, c. en pattedyrcelle, d. en insektscelle og e. en CHO-celle. En ytterligere utførelse inkluderer: en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff ifølge oppfinnelsen som spesifikt binder IL-17-reseptor A som omfatter å inkubere den isolerte cellen ifølge oppfinnelsen under betingelser som tillater ekspresjon av antistoff. Antistoffet kan være valgt fra gruppen som består av: a. et humanisert antistoff, b. et kimert antistoff, c. et rekombinant antistoff, d. et enkeltkjedet antistoff, e. et diastoff, f. et triastoff, g. et tetrastoff, h. et Fab-fragment, i. et F(ab’)2-fragment, j. et IgD-antistoff, k. et IgE-antistoff, l. et IgM-antistoff, m. et IgG1-antistoff, n. et IgG2-antistoff, o. et IgG3-antistoff og p. et IgG4-antistoff.

En utførelse av oppfinnelsen inkluderer et polynukleotid som koder for antistoffet ifølge oppfinnelsen og hvor antistoffet består av:

a) et antistoff som består av en tung kjedesekvens ifølge SEKV. ID. Nr.: 427 og en lett kjedeseknvens ifølge SEKV. ID. Nr.: 429,

b) et antistoff som omfatter en tung kjedesekvens ifølge SEKV. ID. Nr.: 427 og en lett kjedesekvens ifølge SEKV. ID. Nr.: 429,

c) et antistoff eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav som omfatter en tung kjedesekvens ifølge SEKV. ID. Nr.: 427 og en lett kjedesekvens ifølge SEKV. ID. Nr.: 429,

d) et antistoff eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav som omfatter en lett kjedes variabelt områdesekvens ifølge SEKV. ID. Nr.: 40, og en tung kjedes variabelt områdesekvens ifølge SEKV. ID. Nr.: 14,

e) et antistoff eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav som omfatter et tung kjede-CDR1 ifølge SEKV. ID. Nr.: 146, et tung kjede-CDR2 ifølge SEKV. ID. Nr.: 147, et tung kjede-CDR3 ifølge SEKV. ID. Nr.: 148, et lett kjede-CDR1 ifølge SEKV. ID. Nr.: 224, et lett kjede-CDR2 ifølge SEKV. ID. Nr.: 225 og et lett kjede-CDR3 ifølge SEKV. ID. Nr.: 226, og hvor antistoffet spesifikt binder IL-17-reseptor A.

En ytterligere utførelse inkluderer polynukleotidet ifølge den foregående utførelsen, hvor antistoffet er kodet av et polynukleotid valgt fra gruppen som består av:

a) en tung kjedes kodende polynukleotidsekvens som består av SEKV. ID. Nr.: 426 og en lett kjedes kodende polynukleotidsekvens som består av SEKV. ID. Nr.: 428, b) en tung kjedes kodende polynukleotidsekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 426 og en lett kjedes kodende polynukleotidsekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 428, c) en polynukleotidsekvens som koder for en tung kjede eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav og som omfatter SEKV. ID. Nr.: 426 og en polynukleotidsekvens som koder for en lett kjede eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav og som omfatter SEKV. ID. Nr.: 428,

d) en polynukleotidsekvens som koder for en tung kjedes variable område eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav og som omfatter SEKV. ID. Nr.: 67 og en polynukleotidsekvens som koder for en lett kjedes variable område eller et IL-17-reseptor A-bindende fragment derav og som omfatter SEKV. ID. Nr.: 93,

e) et lett kjedes CDR1-kodende polynukleotid som omfatter SEKV. ID. Nr.: 384, -CDR2-kodende polynukleotid som omfatter SEKV. ID. Nr.: 385, -CDR3-kodende polynukleotid som omfatter SEKV. ID. Nr.: 386 og et tung kjedes CDR1-kodende polynukleotid som omfatter SEKV. ID. Nr.: 305, -CDR2-kodende polynukleotid som omfatter SEKV. ID. Nr.: 306, -CDR3-kodende polynukleotid som omfatter SEKV. ID. Nr.: 307.

Plasmidet ifølge oppfinneslsen kan inkludere polynukleotidet ifølge en hvilken som helst utførelse. Den isolerte cellen ifølge oppfinnelsen inkluderer en ekspresjonsvektor som omfatter polynukleotidet ifølge en hvilken som helst utførelse. Cellen kan være en CHO-celle. Okså inkludert i oppfinnelsen er et isolert antistoff som omfatter et antistoff produsert av CHO-celle ifølge krav 9, hvor antistoffet omfatter en tung kjede kodet av en sekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 426 og en lett kjede som kodes av en sekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 428.

Nukleotidsekvenser som tilsvarerer aminosyresekvensene som er beskrevet her og som skal anvendes som prober eller primere for isolering av nukleinsyrer, eller som søkesekvenser for databasesøk kan oppnås ved ”tilbake translasjon” av aminosyresekvensene eller ved påvisning av områder med aminosyreidentitet med polynukleotider for hvilke den kodende DNA-sekvens har blitt identifisert. Den velkjente polymerase-kjedereaksjon (PCR)-fremgangsmåten kan benyttes for isolering og amplifisering av en DNA-sekvens som koder for et IL-17RA-antigenbindende protein eller en ønsket kombinasjon av polypeptidfragmenter av et IL-17RA-antigenbindende protein. Oligonukleotider som definerer de ønskede endene i kombinasjonen av DNA-fragmenter benyttes som 5’- og 3’-primer. Oligonukleotidene kan i tillegg inneholde gjenkjenningsseter for restriksjons endonukleaser for å forenkle innsettingen av den amplifiserte kombinasjon av DNAfragmenter i en ekspresjonsvektor. PCR-teknikker beskrives i Saiki et al., Science, 239:487 (1988), Recombinant DNA Methodology, Wu et al., red., Academic Press, Inc., San Diego (1989), s. 189-196, og PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., red., Academic Press, Inc. (1990).

Nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen omfatter DNA og RNA i både enkelttrådet og dobbelttrådet form, så vel som de tilsvarende komplementære sekvensene. DNA inkluderer for eksempel cDNA, genomisk DNA, kjemisk syntetisert DNA, DNA amplifisert ved PCR og kombinasjoner av disse. Nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen inkluderer fullengde gener eller cDNA-molekyler, så vel som en kombinasjon av fragmenter derav. Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis avledet fra humane kilder, men oppfinnelsen inkluderer også nukleinsyrer avledet fra ikke-humane arter.

En ”isolert nukleinsyre” er en nukleinsyre som har blitt separert fra nabo genetiske sekvenser som foreligger i genomet til organismen som nukleinsyren ble isolert fra, dersom det dreier seg om nukleinsyrer isolert fra naturlig forekommende kilder. For nukleinsyrer som for eksempel er syntetisert enzymatisk fra et templat eller kjemisk, slik som PCR-produkter, cDNA-molekyler eller oligonukleotider, kan det forstås at nukleinsyrene som dannes ved slike prosesser er isolerte nukleinsyrer. Et isolert nukleinsyremolekyl viser til et nukleinsyremolekyl i form av et separat fragment eller som en bestanddel av en større nukleinsyrekonstruksjon. Nukleinsyrene er i det vesentlige frie for kontaminerende endogent materiale. Nukleinsyremolekylet har fortrinnsvis blitt avledet fra DNA eller RNA som minst én gang har blitt isolert i det vesentlige i ren form og i en mengde eller konsentrasjon som tillater identifisering, manipulering og gjenvinning av nukleotidsekvensene som det består av ved hjelp av standard biokjemiske fremgangsmåter (slik som fremgangsmåtene som er skissert i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Slike sekvenser tilveiebringes og/eller konstrueres fortrinnsvis i form av en åpen leseramme som ikke er avbrutt av interne, ikke-translaterte sekvenser eller introner, som typisk foreligger i eukaryote gener. Sekvenser av ikke-translatert DNA kan foreligge 5’ eller 3’ for en åpen leseramme dersom de ikke interfererer med manipuleringen eller ekspresjonen av det kodende området.

Nukleinsyrer som hybridiserer under moderat stringente betingelser, mer foretrukket svært stringente betingelser til nukleinsyrer som koder for IL-17Ra-antigenbindende proteiner er beskrevet her. De basale parametere som påvirker valget av hybridiseringsbetingelser og retningslinjer for formulering av egnede betingelser beskrives i Sambrook, Fritsch og Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., kapitel 9 og 11, og Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., red., John Wiley & Sons, Inc., seksjon 2.10g 6.3-6.4), og kan lett fastsettes av gjennomsnittsfagfolk basert på for eksempel lengden og/eller basesammensetningen av angjeldende DNA. En måte å oppnå moderat stringente betingelser på, omfatter anvendelse av en forvask løsning som inneholder 5 x SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) og en hybridiseringsbuffer med tilænrmet 50% formamid, 6 x SSC og en hybridiserngstemperatur på tilnærmet 55 <o>C (eller andre lignende hybridiseringsløsninger, slik som en løsning som inneholder tilnærmet 50% formamid med en hybridiseringstemperatur på tilnærmet 42 grader celsius), og vaskebetingelser på tilnærmet 60<o>C i 0,5 x SSC, 0,1% SDS. Vanligvis defineres svært stringente betingelser som hybridiseringsbetingelser som beskrevet ovenfor, men ved vask ved tilnærmet 68 <o>C, 0,2 x SSC, 0,1% SDS. SSPE (1 x SSPE er 0,15 M NaCl, 10 mM NaH2PO4 og 1,25 mM EDTA, pH 7,4) kan erstatte SSC (1 x SSC er 0,15 M NaCl og 15 mM natriumcitrat) i hybridiseringsog vaskebuffer, vaske utføres i 15 minutter etter fullført hybridisering. Det skal forstås at vasketemperaturen og stoppkonsentrasjonen under vasken kan justeres etter behov for å oppnå en ønsket grad av stringens ved å benytte de basale prinsipper som styrer hybridiseringsreaksjoner og dupleksstabiliteter, som kjent blant fagfolk og som beskrevet videre nedenfor (se for eksempel Sambrook et al., 1989). Dersom en nukleinsyre hybridiseres til en målnukleinsyre med ukjent sekvens, antas hybridlengden å være den samme som lengden av den hybridiserende nukleinsyre. Dersom nukleinsyren med kjent sekvens hybridiseres kan hybridlengden bestemmes ved å sammenstille nukleinsyrenes sekvenser og påvise området eller områdene med optimal sekvenskomplementaritet.

Hybridiseringstemperaturen for hybrider som forventes å være mindre enn 50 basepar lange, bør være 5-10 <o>C under hybridets smeltetemperatur (Tm), hvor Tm bestemmes ved hjelp av følgende ligninger: For hybrider med en lengde på under 18 basepar, brukes ligningen Tm (grader C) = 2(# A T-baser) 4(#G C-baser). For hybrider på mer enn 18 basepar, benyttes ligningen Tm (grader C) = 81,5 16,6 (log10[Na<+>]) 0,41 (%G C) – (600/N), hvor N er entall baser i hybridet og [Na<+>] er konsentrasjonen av natriumioner i hybridiseringsbufferen ([Na<+>] for 1 x SSC = 0,165 M). Hver av de hybridiserende nukleinsyrene har fortrinnsvis en lengde på minst 15 nukleotider (eller mer foretrukket minst 18 nukleotider, minst 20 nukleotider, minst 25 nukleotider, minst 30 nukleotider, minst 40 nukleotider, eller mest foretrukket minst 50 nukleotider), eller minst 25% (mer foretrukket minst 50%, minst 60%, minst 70%, minst og fortrinnsvis minst 80%) av lengden til nukleinsyren som den hybridiserer til, og har minst 60% sekvensidentitet (mer foretrukket minst 70%, minst 75%, minst 80%, minst 81%, minst 82%, minst 83%, minst 84%, minst 85%, minst 86%, minst 87%, minst 88%, minst 89%, minst 90%, minst 91%, minst 92%, minst 93%, minst 94%, minst 95%, minst 96%, minst 97%, minst 98% eller minst 99% og mest foretrukket minst 99,5%) med nukleinsyren som den hybridiserer til, hvor sekvensidentitet bestemmes ved å sammenligne sekvensen til de hybridiserende nukleinsyrene etter sammenstilling slik at overlapp og identitet maksimaliseres, samtidig som sekvensgap minimaliseres, som beskrevet i mer detalj ovenfor.

Variantene fremstilles vanligvis ved setespesifikk mutagenese av nukleotider i DNA som koder for det antigenbindende proteinet ved anvendelse av kassett- eller PCR-mutagenese eller andre teknikker som er velkjente innen faget for fremstilling av DNA som koder for varianten, og deretter ekspresjon av det rekombinante DNA i cellekultur som skissert her. Imidlertid kan antigenbindende proteinfragmenter som omfatter CDR-varianter og har opp til tilnærmet 100-150 aminosyrerester fremstilles ved in vitro-syntese ved anvendelse av etablerte teknikker. Variantene viser vanligvis den samme kvalitative biologiske aktiviteten som den naturlig forekommende analogen, f. eks. binding til IL-17RA og inhibering av signalisering, selv om man også kan velge varianter som har modifiserte egenskaper, noe som vil skisseres mer fullstendig nedenfor.

Som fagfolk vil forstå, kan det, grunnet den genetiske kodes degenererthet, fremstilles et ekstremt stort antall nukleinsyrer som alle koder for CDRer (og tung kjeder, lett kjeder eller andre bestanddeler av det antigenbindende proteinet) ifølge foreliggende oppfinnelse. Etter å ha identifisert en gitt aminosyresekvens, kan fagfolk følgelig fremstille et hvilket som helst antall av forskjellige nukleinsyrer ved ganske enkelt å modifisere sekvensen i ett eller flere kodoner på en måte som ikke endrer det kodede proteins aminosyresekvens.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også ekspresjonssystemer og konstruksjoner i form av plasmider, ekspresjonsvektorer, transkripsjons- eller ekspresjonskassetter som omfatter minst ett polynukleotid som beskrevet ovenfor. I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen vertsceller som omfatter slike ekspresjonssystemer eller konstruksjoner.

Typisk vil ekspresjonsvektorer som anvendes i hvilke som helst av vertscellene inneholde sekvenser for opprettholdelse av plasmidet og for kloning og ekspresjon av eksogene nukleotidsekvenser. Slike sekvenser, under ett betegnet ”flankerende sekvenser”, i visse utførelser, vil typisk omfatte én eller flere av følgende nukleotidsekvenser: en promoter, én eller flere enhancersekvenser, et replikasjonsorigo, en transkripsjonstermineringssekvens, en komplett intronsekvens som inneholder et donor- og akseptor spleisesete, en sekvens som koder for en ledersekvens for polypeptidsekresjon, et ribosombindingssete, en polyadenyleringssekvens, et polylinker område for innsetting av nukleinsyren som koder for polypeptidet som skal uttrykkes og et seleksjonsmarkørelement. Alle disse sekvensene diskuteres nedenfor.

Om ønskelig kan vektoren inneholde en ”merkelapp”-kodende sekvens, dvs. et oligonukleotidmolekyl som foreligger i den 5’ eller 3’ ende av sekvensen som koder for det IL-17RA-antigenbindende proteinet, hvor oligonukleotidsekvensen koder for polyHis (slik som heksaHis) eller en annen ”merkelapp”, slik som FLAG, HA (hemaglutinin fra influensavirus) eller myc, for hvilke kommersielt tilgjengelige antistoffer finnes. Denne merkelappen fusjoneres typisk til polypeptidet ved ekspresjon av polypeptidet og kan fungere som et middel for affinitetsrensing eller påvisning av det IL-17RA-antigenbindende proteinet fra vertscellen. Affinintetsrensing kan for eksempel oppnås ved kolonne-kromatografi med antistoffer mot merkelappen som affinitetsstøtte-middel. Om ønskelig kan merkelappen deretter fjernes fra det rensede IL-17RA-antigen-bindende proteinet ved hjelp av forskjellige midler, slik som ved anvendelse av visse peptidaser for spalting.

Flankerende sekvenser kan være homologe (dvs. fra samme art og/eller stamme som vertscellen), heterologe (dvs. fra en annen art enn vertscellearten eller –stammen), hybride (dvs. en kombinasjon av flankerende sekvenser fra mer enn én kilde), syntetiske eller native. Følgelig kan kilden for en flankerende sekvens være en hvilken som helst prokaryot eller eukaryot organisme, hvilken som helst vertebrat eller invertebrat organisme, eller hvilken som helst plante, forutsatt at den flankerende sekvensen er funksjonell i, og kan aktiveres av, vertscellemaskineriet.

Flankerende sekvenser som er anvendbare i vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan oppnås ved hvilken som helst av flere fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Flankerende sekvenser som er anvendbare her vil typisk tidligere ha blitt påvist ved kartlegging og/eller restriksjons-endonukleasekutting og kan følgelig isoleres fra den ønskede vevskilde ved anvendelse av de egnede restriksjons-endonukleasene. I noen tilfeller kan den fullstendige nukleotidsekvens til en flankerende sekvens være kjent. Her kan den flankerende sekvens syntetiseres ved anvendelse av fremgangsmåtene som er beskrevet her for nukleinsyresyntese eller kloning.

Uavhengig av hvorvidt hele eller bare en del av den flankerende sekvensen er kjent, kan den oppnås ved anvendelse av polymerase-kjedereaksjonen (PCR) og/eller ved gjennomsøking av et genomisk bibliotek med en egnet probe, slik som et oligonukleotid og/eller et flankerende sekvensfragment fra samme art, eller en annen art. Dersom den flankerende sekvens ikke er kjent, kan et DNA-fragment som inneholder en flankerende sekvens isoleres fra et større DNA-stykke som kan inneholde for eksempel en kodende sekvens, eller til og med ett eller flere andre gener. Isoleringen kan oppnås ved restriksjons-endonukleasekutting for dannelse av det ønskede DNA-fragmentet, fulgt av isolering ved anvendelse av agarosegelrensing, Qiagen-kolonnekromatografi (Chatsworth, CA), eller andre fremgangsmåter som er kjente blant fagfolk. Valget av egnede enzymer for å oppnå dette formålet vil være åpenbar for en gjennomsnitts fagperson.

Et replikasjonsorigo er typisk en del av slike prokaryote ekspresjonsvektorer som er anskaffet kommersielt, og replikasjonsorigo bidrar til amplifiseringen av vektoren i en vertscelle. Dersom den valgte vektoren ikke inneholder replikasjonsorigosete, kan man syntetisere ett kjemisk basert på kjent sekvens og ligere det inn i vektoren. For eksempel er replikasjonsorigo fra plasmidet pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) egnet for de fleste gram-negative bakterier, og forskjellige virus origo-er (f. eks. fra SV40, polyoma, adenovirus, vesikulært stomatittvirus (VSV) eller papillomavirus som HPV eller BPV) er anvendbare for kloningsvektorer i pattedyrceller. Vanligvis er replikasjonsorigobestanddelen ikke nødvendig for pattedyr-ekspresjonsvektorer (for eksempel anvendes SV40-origo ofte, kun fordi det også inneholder den tidlige viruspromoteren).

En transkripsjonstermineringssekvens ligger typisk 3’ for enden av et polypeptidkodende område og bidrar til å terminere transkripsjonen. Vanligvis er en transkripsjonsterminseringssekvens i prokaryote celler et G-C-rikt fragment fulgt av en poly-T-sekvens. Selv om sekvensen lett kan klones fra et bibliotek eller til og med anskaffes kommersielt som en del av en vektor, kan den også lett syntetiseres ved anvendelse av fremgangsmåter for nukleinsyresyntese, slik som fremgangsmåtene som er beskrevet her.

Et seleksjonsmarkørgen koder for et protein som er nødvendig for overlevelse og vekst av en vertscelle som dyrkes i et selektivt dyrkningsmedium. Typiske seleksjonsmarkørgener koder for proteiner som (a) gir resistens ovenfor antibiotika eller andre toksiner, f. eks. ampicillin, tetrasyklin eller kanamycin for prokaryote vertsceller, (b) komplementerer auxotrofiske mangler i cellen, eller (c) tilfører nødvendige næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra kompliserte eller definerte medier. Spesifikke seleksjonsmarkører er kanamycinresistensgenet, amplicillin resistensgenet og tetrasyklin resistensgenet. Et neomycin resistent gen kan også med fordel anvendes for seleksjon i både prokaryote og eukaryote vertsceller.

Andre selekterbare gener kan anvendes for amplifisering av genet som skal uttrykkes. Amplifisering er en prosess i hvilken gener som er nødvendige for dannelsen av et protein som er avgjørende for vekst eller overlevelse av cellen, repeteres i tandem i kromosomene til påfølgende generasjoner av rekombinante celler. Eksempler på egnede selekterbare markører for pattedyrceller inkluderer genet for dihydrofolatreduktase (DHFR) og promoterløse tymidinkinase-gener. Transformerte pattedyrceller plasseres under seleksjonstryk, hvor kun transformantene på en unik måte er tilpasset overlevelse grunnet seleksjonsgenet som foreligger i vektoren. Seleksjonstrykk innføres ved å dyrke de transformerte cellene under betingelser hvor konsentrasjonen av seleksjonsmiddelet i mediet gradvis økes, noe som fører til en amplifisering av både seleksjonsgenet og DNA som koder for et annet gen, slik som et antigenbindende proteinantistoff som bindes til IL-17RA-polypeptidet. Som en følge av dette, syntetiseres en økt mengde av et polypeptid, slik som et IL-17RA-antigenbindende protein, fra det amplifiserte DNA.

Et ribosombindingssete er vanligvis nødvendig for translasjonsinitiering av rnRNA og særpreges ved en Shine-Dalgarno-sekvens (prokaryoter) eller en Kozak-sekvens (eukaryoter). Elementet ligger typisk 3’ for promoteren og 5’ for sekvensen som koder for polypeptidet som skal uttrykkes.

I noen tilfeller, slik som hvor glykosylering er ønsket i et eukaryot vertscelle ekspresjonssystem, kan man manipulere de forskjellige pre- eller pro-sekvensene for å forbedre glykosyleringen eller utbyttet. Man kan for eksempel endre peptidasespaltingssetet i et gitt signalpeptid eller innføre pro-sekvenser, noe som også kan påvirke glykosyleringen. Det endelige proteinprodukt kan i -1-posisjon (relativt til den første aminosyren i det modne protein) ha én eller flere ekstra aminosyrer som kommer til uttrykk som kanskje ikke har blitt fullstendig fjernet. Det endelige proteinprodukt kan for eksempel ha én eller to aminosyrerester funnet i peptidase spaltingssetet koblet til aminoenden.

Alternativt kan anvendelsen av noen enzymspaltingsseter føre til en noe forkortet form av det ønskede polypeptid, dersom enzymet kutter i et slikt område i det modne polypeptid.

Ekspresjons- og kloningsvektorer ifølge oppfinnelsen vil typisk inneholde en promoter som gjenkjennes av vertsorganismen og som er operativt koblet til molekylet som koder for det IL-17RA-antigenbindende proteinet. Promotere er ikke-transkriberte sekvenser som ligger oppstrøms (dvs. 5’) for startkodonet i et strukturelt gen (vanligvis innen tilnærmet 100 til 1000 bp) og som kontrollerer transkripsjonen av det strukturelle genet. Promotere inndeles konvensjonelt i to grupper: induserbare promotere og konstitutive promotere. Induserbare promotere utløser et forhøyet transkripsjonsnivå av DNA som de kontrollere som respons på en endring i dyrkningsbetingelsene, slik som nærvær eller fravær av et næringsstoff eller endret temperatur. Konstitutive promotere transkriberer derimot genet som de er operativt koblet til enhetlig, dvs. med liten eller ingen kontroll over genekspresjonen. Et stort antall promotere som gjenkjennes av en rekke forskjellige mulige vertsceller er velkjente. En egnet promoter kobles operativt til DNA som koder for tung kjede eller lett kjede som inngår i et IL-17RA-antigenbindende protein ifølge oppfinnelsen ved at promoteren fra utgangs-DNA fjernes ved restriksjonsenzymkutting og den ønskede promotersekvens innsettes i vektoren.

Egnede promotere for anvendelse med gjærverter er også velkjente innen faget. Gjær-enhancere kan med fordel anvendes med gjær-promotere. Egnede promotere for anvendelse med pattedyrs vertsceller er velkjente og inkluderer for eksempel promotere oppnådd fra genomene til virus, slik som polyomavirus, fuglekoppevirus, adenovirus (slik som adenovirus 2), bovint papillomavirus, fuglesarkom virus, cytomegalo virus, retrovirus, hepatitt-B-virus og, mest foretrukket, apevirus 40 (SV40). Andre egnede pattdyrspromotere inkluderer heterologe pattedyrspromotere, for eksempel varmesjokk promotere og aktinpromoteren.

Ytterligere promotere som kan være av interesse inkluderer for eksempel: SV40 tidlig promoter (Benoist og Chambon, 1981, Nature, 290:304-310), CMV-promoter (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. USA, 81:659-663), promoteren som foreligger i den lange 3’ enderepetisjon i Rous sarkomvirus (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22:787-797), tymidinkinasepromoteren fra herpes-virus (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1444-1445), promotersekvensen og regulatoriske sekvenser fra metallotionin genet, Prinster et al., 1982, Nature, 296:39-42), og prokaryote promotere, slik som betalaktamasepromoteren (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3727-3731), eller tac-promoteren (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25). Også av interesse er følgende dyre-transkripsjonskontrollområder, som viser vevsspesifisitet og som har blitt benyttet i transgene dyr: elastase I-genkontrollområdet, som er aktivt i acinar-celler i bukspyttkjertelen (Swift et al., 1984, Cell, 38:639-646, Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409, MacDonald, 1987, Hepatology, 7:425-515), kontrollområdet fra insulingenet, som er aktivt i beta-celler i bukspyttkjertelen (Hanahan, 1985, Nature, 315:115-122), immunglobulin genkontroll-området, som er aktivt i lymfoide celler (Grosschedl et al., 1984, Cell, 38:647-658, Adames et al., 1985, Nature, 318:533-538, Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-1444), kontrollområdet fra muse-brysttumorvirus, som er aktivt i testikkelceller, brystceller, lymfoide celler og mastceller (Leder et al., 1986, Cell, 45:485-495), albumin genkontroll-området, som er aktivt i lever (Pinkert et al., 1987, Genes and Dvel., 1:268-276), alfa-feto-proteingenkontrollområdet som er aktivt i lever (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-1648, Hammer et al., 1987, Science, 253:53-58), alfa-1-antitrypsin genkontroll-området, som er aktivt i lever (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel., 1:161-171), beta-globin-genkontrollområdet, som er aktivt i myeloide celler (Mogram et al., 1985, Nature, 315:338-340, Kollias et al., 1986, Cell, 46:89-94), kontrollområdet fra genet for myelin-basisk protein, som er aktivt i oligodendrocyttceller i hjernen (Readhead et al., 1987, Cell, 48:703-712), kontrollområdet fra genet for myosin-lett kjede-2, som er aktivt i skjellettmuskel (Sani, 1985, Nature, 314:283-286) og kontrollområdet fra genet for gonadotropinfrigjørende hormon, som er aktivt i hypotalamus (Mason et al., 1986, Science, 234:1372-1378).

En enhancersekvens kan settes inn i vektoren for å øke transkripsjonen av DNA, som koder for lett kjede eller tung kjede som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein ifølge oppfinnelsen, i høyere eukaryoter. Enhancere er cis-bindende DNA-elementer, vanligvis med en lengde på tilnærmet 10-300 bp, som virker på promoteren for å øke transkripsjonen. Enhancere er relativt orienterings- og posisjonsuavhengige og har blitt funnet i posisjoner som ligger både 5’ og 3’ for transkripsjonsenheten. Flere enhancersekvenser som er tilgjengelige fra pattedyrsgener er kjente (f. eks. globin, elastase, albumin, alfa-feto-protein og insulin). Typisk anvendes imidlertid en enhancer fra et virus. SV40-enhancere, cytomegalovirus tidlig promoter-enhancer, polyoma-enhanceren og adenovirus enhancere som er kjente innen faget er eksempler på enhancerelementer for aktivering av eukaryote promotere. Selv om en enhancer kan plasseres i vektoren enten 5’ eller 3’ for en kodende sekvens, plasseres den typisk i et sete 5’ for promoteren. En sekvens som koder for en egnet nativ eller heterolog signalsekvens (ledersekvens eller signalpeptid) kan innføres i en ekspresjonsvektor for å fremme ekstracellulær sekresjon av antistoffet. Valget av signalpeptid eller ledersekvens avhenger av typen av vertsceller som antistoffet skal fremstilles i, og en heterolog signalsekvens kan erstatte den native signalsekvensen. Eksempler på signalpeptider som er funksjonelle i pattedyr vertsceller inkluderer følgende: signalsekvensen for interleukin-7 (IL-7), som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 965 195, signalsekvensen for interleukin-2-reseptor, som er beskrevet i Cosman et al., 1984, Nature, 312:768, signalpeptidet fra interleukin-4-reseptor, som er beskrevet i EP patentskrift nr. 0367 566, signalpeptidet fra type I interleukin-1-reseptor, som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 968 607, og signalpeptidet fra type II interleukin-1-reseptor, som er beskrevet i EP patent nr. 0 460 846.

Ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen kan konstrueres fra en utgangsvektor, slik som en kommersielt tilgjengelig vektor. Slike vektorer kan, men behøver ikke inneholde alle de ønskede flankerende sekvenser. Dersom én eller flere av de flankerende sekvensene som er beskrevet her ikke allerede foreligger i vektoren, kan de oppnås enkeltvis og ligeres inn i vektoren. Fremgangsmåter som anvendes for oppnåelse av de flankerende sekvensene er velkjente blant fagfolk.

Etter at vektoren har blitt konstruert og et nukleinsyremolekyl som koder for en lett kjede, en tung kjede eller en lett kjede og en tung kjede som inngår i en IL-17RA-antigenbindende sekvens har blitt satt inn i det ønskede setet i vektoren, kan den ferdigstilte vektoren settes inn i en egnet vertscelle for amplifisering og/eller ekspresjon av polypeptidet. Transformasjonen av en ekspresjonsvektor for et IL-17RA-antigenbindende protein inn i en valgt vertscelle kan oppnås ved velkjente fremgangsmåter, inkludert transfeksjon, infeksjon, kalsiumfosfat-ko-utfelling, elektroporering, mikroinjeksjon, lipofeksjon, DEAE-dekstranformidlet transfeksjon eller andre kjente teknikker. Hvilken fremgangsmåte som velges vil delvis være en funksjon av typen av vertscelle som skal anvendes. Disse fremgangsmåtene og andre egnede fremgangsmåter er velkjente blant fagfolk og beskrives for eksempel i Sambrook et al., 2001, supra.

En vertscelle, dersom den dyrkes under egnede betingelser, syntetiserer et IL-17RA-antigenbindende protein, som deretter kan høstes fra dyrkningsmediet (dersom vertscellen skiller det ut til mediet) eller direkte fra vertscellen som danner det (dersom det ikke skilles ut). Valget av en egnet vertscelle vil avhenge av forskjellige faktorer, slik som det ønskede ekspresjonsnivå, polypeptid modifikasjoner som er ønskelige eller nødvendige for aktivitet (slik som glykosylering eller fosforylering) og lettheten av foldig til et biologisk aktivt molekyl. En vertscelle kan være eukaryot eller prokaryot.

Pattedyrcellelinjer som er tilgjengelige som verter for ekspresjon er velkjente innen faget og inkluderer for eksempel immortaliserte cellelinjer som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection (ATCC), og en hvilken som helst cellelinje som anvendes i et ekspresjonssystem som er kjent innen faget kan anvendes for fremstilling av det rekombinante polypeptidene ifølge oppfinnelsen. Generelt transformeres vertscellen med en rekombinant ekspresjonsvektor som omfatter DNA som koder for et ønsket anti-IL-17RA-antistoff polypeptid. Blant vertscellene som kan benyttes er prokaryoter, gjærceller og høyere eukaryote celler. Prokaryoter omfatter gram-negative og gram-positive organismer, for eksempel E. coli eller bacilli. Høyere eukaryote celler omfatter insektsceller og etablerte cellelinjer med opphav i pattedyr. Eksempler på egnede pattedyr vertscellelinjer inkluderer COS-7-cellelinjen av apenyreceller (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell, 23:175), L-celler, 293-celler, C127-celler, 3T3-celler (ATCC CCL 163), kinahamster ovarieceller (CHO)-celler eller derivater av disse, slik som Veggie CHO og beslektede cellelinjer som vokser i serumfritt medium (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology, 28:31), HeLa-celler, BHK (ATCC CRL 10) cellelinjer og cellelinjen CVI/EBNA, avledet fra nyrecellelinjen CVI fra afrikansk grønnape (ATCC CCL 70) som beskrevet av McMahan et al., 1991, EMBO J., 10: 2821, humane embryonale nyreceller, slik som 293, 293 EBNA eller MSR 293, de humane epiderm cellene A431, humane Colo205-celler, andre transformerte primatcellelinjer, normale diploide celler, cellestammer oppnådd ved in vitro-dyrking av primærvev, primæreksplantater, HL-60, U937, HaK-celler eller Jurkat-celler. Om ønskelig kan pattedyrcellelinjer slik som Hep&2/3B, KB, NIH 3T3 eller S49 anvendes for ekspresjon av polypeptider dersom det er ønskelig å anvende polypeptidet i forskjellige signaloverførings- eller rapportøranalyser. Alternativt er det mulig å fremstille polypeptidet i lavere eukaryoter, slik som gjær, eller i prokaryoter, slik som bakterier. Egnede gjærarter omfatter Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyes pombe, Kluyveromyces-stammer, Candida eller hvilken som helst gjærstamme som kan uttrykke heterologe polypeptider. Egnede bakteriestammer omfatter Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium eller hvilken som helst bakteriestamme som kan uttrykke heterologe polypeptider. Dersom polypeptidet fremstilles i gjær eller bakterier, kan det være ønskelig å modifisere polypeptidet som dannes i disse, for eksempel ved fosforylering eller glykosylering i ønskede seter, for å oppnå det funksjonelle polypeptidet. Slik kovalent tilkobling kan oppnås ved anvendelse av kjente kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter. Polypeptidet kan også fremstilles ved operativ kobling av den isolerte nukleinsyre ifølge oppfinnelsen til egnede kontroll-sekvenser i én eller flere insekts ekspresjonsvektorer og benytte et insektsekspresjonssystem. Materialer og fremgangsmåter for baculovirus/insektscelleekspresjonssystemer er kommersielt tilgjengelige i kjent form fra for eksempel Invitrogen, San Diego, Calif., USA (settet MAXBAC), og slike fremgangsmåter er velkjente innen faget, som beskrevet i Summers og Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987) og Luckow og Summers, Bio/Technology, 6:47 (1988). Cellefrie translasjonssystemer kan også benyttes for fremstilling av polypeptider ved anvendelse av RNA oppnådd fra nukleinsyrekonstruksjoner som er beskrevet her. Egnede klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterielle vertsceller, sopp-vertsceller, gjærvertsceller og pattedyrs-vertsceller beskrives av Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboraotry Manual, Elsevier, New York, 1985). En vertscelle som omfatter en isolert nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis operativt koblet til minst én ekspresjonskontrollsekvens, er en ”rekombinant vertscelle”.

I visse utførelser kan cellelinjer velges ved å avgjøre hvilke cellelinjer som har et høyt ekspresjonsnivå og som konstitutivt danner antigenbindende proteiner med IL-17RA-bindende egenskaper. I en annen utførelse kan en cellelinje fra en B-cellelinje som ikke danner sitt eget antistoff, men som har evnen til å danne og skille ut et heterologt antistoff, velges.

Identifisering av domener i humant IL-17Ra som nøytraliserende antistoffer bindes til

Eksemplene 14-17 beskriver forskjellige undersøkelser for påvisning av domener i humant IL-17RA som nøytraliserende IL-17RA-mAb bindes til. Disse domenene betegnes nøytraliserende determinanter. En nøytraliserende determinant er et kontinuerlig strekk i IL-17RA som, når det muteres, påvirker bindingen av minst ett av de nøytraliserende antistoffene som er beskrevet her på negativ måte. En nøytraliserende determinant omfatter minst én epitop. En nøytraliserende determinant kan ha primær-strukturelle, sekundær-strukturelle, tertiær-strukturelle og/eller kvarternær-strukturelle egenskaper. Et nøytraliserende antistoff er et hvilke som helst av antistoffene som er beskrevet her som spesifikt binder humant IL-17RA og inhiberer bindingen av IL-17A og/eller IL-17F, og derved inhiberer IL-17RA-signalisering og/eller biologisk aktivitet. Eksempler på nøytraliserende antistoffer inkluderer antistoffer som omfatter AML1/AMH1 (SEKV. ID. Nr.: 27/SEKV. ID. Nr.: 1), AML2/AMH2 (SEKV. ID. Nr.: 28/SEKV. ID. Nr.: 2), AML3/AMH3 (SEKV. ID. Nr.: 29/SEKV. ID. Nr.: 3), AML4/AMH4 (SEKV. ID. Nr.: 30/SEKV. ID. Nr.: 4), AML5/AMH5 (SEKV. ID. Nr.: 31/SEKV. ID. Nr.: 5), AML6/AMH6 (SEKV. ID. Nr.: 32/SEKV. ID. Nr.: 6), AML7/AMH7 (SEKV. ID. Nr.: 33/SEKV. ID. Nr.: 7), AML8/AMH8 (SEKV. ID. Nr.: 34/SEKV. ID. Nr.: 8), AML9/AMH9 (SEKV. ID. Nr.: 35/SEKV. ID. Nr.: 9), AML10/AMH10 (SEKV. ID. Nr.: 36/SEKV. ID. Nr.: 10), AML11/AMH11 (SEKV. ID. Nr.: 37/SEKV. ID. Nr.: 11), AML12/AMH12 (SEKV. ID. Nr.: 38/SEKV. ID. Nr.: 12), AML13/AMH13 (SEKV. ID. Nr.: 39/SEKV. ID. Nr.: 13), AML14/AMH14 (SEKV. ID. Nr.: 40/SEKV. ID. Nr.: 14), AML15/AMH15 (SEKV. ID. Nr.: 41/SEKV. ID. Nr.: 15), AML16/AMH16 (SEKV. ID. Nr.: 42/SEKV. ID. Nr.: 16), AML17/AMH17 (SEKV. ID. Nr.: 43/SEKV. ID. Nr.: 17), AML18/AMH18 (SEKV. ID. Nr.: 44/SEKV. ID. Nr.: 18), AML19/AMH19 (SEKV. ID. Nr.: 45/SEKV. ID. Nr.: 19), AML20/AMH20 (SEKV. ID. Nr.: 46/SEKV. ID. Nr.: 20), AML21/AMH21 (SEKV. ID. Nr.: 47/SEKV. ID. Nr.: 21), AML22/AMH22 (SEKV. ID. Nr.: 48/SEKV. ID. Nr.: 22), AML23/AMH23 (SEKV. ID. Nr.: 49 eller SEKV. ID. Nr.: 50/SEKV. ID. Nr.: 23), AML24/AMH24 (SEKV. ID. Nr.: 51/SEKV. ID. Nr.: 24), AML25/AMH25 (SEKV. ID. Nr.: 52/SEKV. ID. Nr.: 25), AML26/AMH26 (SEKV. ID. Nr.: 53/SEKV. ID. Nr.: 26), så vel som IL-17Ra-bindende fragmenter derav, og kombinasjoner derav.

Ytterligere utførelser av nøytraliserende antistoffer ifølge oppfinnelsen inkluderer antistoffer som spesifikt bindes til humant IL-17RA og inhiberer IL-17A og/eller IL-17F fra å binde til å aktivere IL-17RA eller et heteromert kompleks av IL-17RA og IL-17RC.

Ytterligere utførelser inkluderer antistoffer ifølge oppfinnelsen som spesifikt bindes til humant IL-17RA og inhiberer en IL-17A/IL-17F-heteromer fra å bindes til og aktivere IL-17RA, eller et heteromert kompleks av IL-17RA og IL-17RC. Ytterligere utførelser inkluderer antistoffer i henhold til oppfinnelsen som spesifikt bindes til humant IL-17RA og delvis eller fullstendig inhiberer IL-17RA fra å danne enten et homomert eller heteromert, funksjonelt reseptorkompleks, slik som for eksempel et IL-17RA-IL-17RC-kompleks.

Ytterligere utførelser inkluderer antistoffer som spesifikt bindes til humant IL-17RA og delvis eller fullstendig inhiberer IL-17RA fra å danne enten et homomert eller heteromert, funksjonelt reseptorkompleks, slik som for eksempel IL-17RA/IL-17RC-kompleks, og som ikke nødvendigvis inhiberer IL-17A og/eller IL-17F eller en IL-17A/IL-17F-heteromer fra å binde til IL-17RA eller et heteromert IL-17RA-reseptorkompleks.

Figurene 16A og 16B viser at antistoffene A: AMH11/AML11, B: AMH4/AML4, C: AMH8/AML8, D: AMH7/AML7, E: AMH6/AML6, F: AMH10/AML10, og G: AMH18/AML18, konkurrerte med hverandre om binding til humant IR-17RA og inngikk i en definert gruppe (gruppe 1). Generelt konkurrerte antistoffene I: AMH22/AML22, J: AMH23/AML23, K:

AMH14/AML14, L: AMH19/AML19, M: AMH12/AML12, N: AMH17/AML17, O: AMH16/AML16, med hverandre om binding til humant IL-17RA og falt følgelig i en annen gruppe (gruppe 3). Generelt sagt, konkurrerte antistoffene i gruppe 1 ikke med antistoffene i gruppe 3.

Antistoff H: AMH1/AML1, hadde et unikt konkurransemønster og utgjorde gruppe 2, men ligner mest på gruppe 3. Antistoff P: AMH26/AML26, utgjorde gruppe 4 og viste liten krysskonkurranse med noen av de andre antistoffene, noe som tyder på en nøytraliserende determinant som er unik for dette antistoffet. Antistoffene Q: AMH21/AML21, og R:

AMH20/AML20, viste begge unike konkurransemønstere, men med betydelige likheter med gruppe 3-antistoffer, og utgjorde gruppe 5 henholdsvis 6. Denne fremgangsmåten påviste grupper av antistoffer som bindes til forskjellige nøytraliserende determinanter og tilveiebringer bevis for flere arter innenfor en underslekt av krysskonkurrerende antistoffer.

Eksempel 16 beskriver anvendelsen av menneske/mus-kimere IL-17RA-proteiner for å påvise nøytraliserende determinanter i humant IL-17RA. Figur 19 viser at minst tre nøytraliserende determinanter ble påvist, basert på områdene som påvirket bindingen av nøytraliserende IL-17RA-antistoffer, nemlig domene B som strekker seg over aminosyrene 75-96 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), domene C, som strekker seg over aminosyrene 128-154 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431) og domene D, som strekker seg over aminosyrene 176-197 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431). Domene B, som strekker seg over aminosyrene 75-96 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431) påvirket på negativ måte bindingen av de nøytraliserende antistoffene AMH1/AML1 og AMH23/AML23. domene C, som strekker seg over aminosyrene 128-154 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), påvirker på negativ måte bindingen av de nøytraliserende antistoffene AMH22/AML22 og AMH23/AML23. Domene D, som strekker seg over aminosyrene 176-197 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), påvirker på negativ måte bindingen av de nøytraliserende antistoffene AMH1/AML1, AMH22/AML22, AMH14/AML14, AMH19/AML19, AMH23/AML23, AMH21/AML21 og AMH20/AML20. Domene B, C og D anses følgelig som nøytraliserende determinanter.

Eksempel 17 beskriver anvendelsen av argininskanningsteknikker for videre avgrensning av domenene i humant IL-17R som de nøytraliserende IL-17RA-antistoffene bindes til. En oppsummering av alaninskanningen, grupperingen og resultater for kimerer er vist i Figur 22. Arginin skanningsmetodologien påviste flere nøytraliserende determinanter: AMH18/AML18 bandt et domene som trekker seg over aminosyrene 220-284 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH1/AML1 bandt et domene som er fokusert på aminosyrerest 152 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH22/AML22 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 152-198 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH14/AML14 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 152-297 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH19/AML19 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 152-186 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH23/AML23 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 97-297 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH26/AML26 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 138-270 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH21/AML21 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 113-198 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431) og AMH20/AML20 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 152-270 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431).

Alle aminosyrerester som vises i Figur 22 har blitt vist å i signifikant grad å redusere eller i det vesentlige fjerne bindingen av et nøytraliserende, monoklonalt, humant antistoff som spesifikt bindes til humant IL-17RA.

Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt bindes til IL-17RA og konkurrerer om binding med hvilket som helst av antistoffene AMH3/AML3, AMH20/AML20, AMH22/AML22, AMH23/AML23, AMH14/AML14, AMH21/AML21, AMH19/AML19, AMH12/AML12, AMH17/AML17 eller AMH16/AML16, eller en hvilken som helst undergruppe av disse.

Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt bindes til IL-17R og som konkurrerer om binding med hvilket som helst av antistoffene AMH22/AML22, AMH23/AML23, AMH14/AML14, AMH19/AML19, AMH12/AML12, AMH17/AML17 eller AMH16/AML16, eller en hvilken som helst undergruppe av disse.

Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke bindes spesifikt til et kimert polypeptid som består av SEKV. ID. Nr.: 434. Utførelser omfatter et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav, som spesifikt binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke spesifikt bindes til et kimert polypeptid som består av SEKV. ID. Nr.: 435.

Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav, som spesifikt binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke spesifikt bindes til et kimert polypeptid som består av SEKV. ID. Nr.: 436.

Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 75-96 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav, som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 128-154 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 176-197 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 152-297 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 220-284 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav, som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 152-198 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 152-186 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 97-297 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav, som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 138-270 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav, som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 113-198 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav, som spesifikt binder en nøytraliserende determinant som omfatter aminosyrene 152-270 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA.

Ytterligere beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke binder IL-17RA med en aminosyre substituert med arginin i hvilken som helst av posisjonene E97R, E113R, S115R, H138R, D152R, D154R, E156R, K166R, Q176R, S177R, D184R, E186R, S198R, H215R, S220R, T228R, T235R, E241R, H243R, L270R, Q284R, H297R i SEKV. ID. Nr.: 431, slik som et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke binder IL-17RA med en aminosyresubstituert arginin i hvilken som helst av posisjonene D152R, D154R, E156R, D184R, E186R, H297R i SEKV. ID. Nr.: 431, slik som et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke binder IL-17RA med en aminosyre substituert med arginin i posisjon D152R i SEKV. ID. Nr.: 431.

Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en epitop definert ved hvilken som helst av aminosyrene D152, D154, E156, D184, E186, H297 i SEKV. ID. Nr.: 431. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en epitop definert med minst to aminosyrer valgt fra gruppen som består av D152, D154, E156, D184, E186, H297 i SEKV. ID. Nr.: 431. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en epitop definert ved minst tre aminosyrer valgt fra gruppen som består av D152, D154, E156, D184, E186, H297 i SEKV. ID. Nr.: 431. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en epitop definert ved minst fire aminosyrer valgt fra gruppen som består av D152, D154, E156, D184, E186, H297 i SEKV. ID. Nr.: 431. Beskrevet her er et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en epitop definert ved minst fem aminosyrer valgt fra gruppen som består av D152, D154, E156, D184, E186, H297 i SEKV. ID. Nr.: 431, slik som et antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en epitop definert ved aminosyrene D152, D154, E156, D184, E186, H297 i SEKV. ID. Nr.: 431.

a. en tung kjedes variable domene sekvens som er minst 80% identisk med en tung kjedes variable domene sekvens fra AMH12, 14, 16, 17, 19 og 22 (SEKV. ID. Nr.: 12, 14, 16, 17, 19 henholdsvis 22),

b. den lette kjedens variable domene ifølge (a) og den tunge kjedens variable domene ifølge (b), hvor antistoffet spesifikt bindes til humant IL-17RA,

B. et isolert antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav som omfatter a. et lett kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 218), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 219), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 220) og et tung kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 140), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 141), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 142) fra antistoff AM-12,

b. et lett kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 224), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 225), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 226) og et tung kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 146), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 147), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 148) fra antistoff AM-14,

c. et lett kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 230), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 231), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 232) og et tung kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 152), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 153), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 154) fra antistoff AM-16,

d. et lett kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 233), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 234), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 235) og et tung kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 155), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 156), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 157) fra antistoff AM-17,

e. et lett kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 239), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 240), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 241) og et tung kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 161), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 162), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 163) fra antistoff AM-19,

f. et lett kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 248), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 249), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 250) og et tung kjede-CDR1 (SEKV. ID. Nr.: 170), -CDR2 (SEKV. ID. Nr.: 171), -CDR3 (SEKV. ID. Nr.: 172) fra antistoff AM-22, hvor antistoffet spesifikt bindes til humant IL-17RA, og

C. et isolert antistoff eller et IL-17A-bindende fragment derav som omfatter a. en lett kjedes variable domene og en tung kjedes variable domene fra AML12/AMH12 (SEKV. ID. Nr.: 38/SEKV. ID. Nr.: 12),

b. en lett kjedes variable domene og en tung kjedes variable domene fra AML14/AMH14 (SEKV. ID. Nr.: 40/SEKV. ID. Nr.: 14),

c. en lett kjedes variable domene og en tung kjedes variable domene fra AML16/AMH16 (SEKV. ID. Nr.: 42/SEKV. ID. Nr.: 16),

d. en lett kjedes variable domene og en tung kjedes variable domene fra AML17/AMH17 (SEKV. ID. Nr.: 43/SEKV. ID. Nr.: 17),

e. en lett kjedes variable domene og en tung kjedes variable domene fra AML19/AMH19 (SEKV. ID. Nr.: 45/SEKV. ID. Nr.: 19), hvor antistoffet spesifikt bindes til humant IL-17RA.

Ytterligere beskrevet er et isolert, monoklonalt antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav, som er valgt fra gruppen som består av:

a) et monoklonalt antistoff som spesifikt binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke bindes spesifikt til et kimert polypeptid som består av SEKV. ID. Nr.: 434,

b) et monoklonalt antistoff som spesifikt binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke bindes spesifikt til et kimert polypeptid som består av SEKV. ID. Nr.: 435, og

c) et monoklonalt antistoff som spesifikt binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke bindes spesifikt til et kimert polypeptid som består av SEKV. ID. Nr.: 436.

Ytterligere beskrevet er et isolert, monoklonalt antistoff eller IL-17RA-bindende fragment derav som spesifikt binder en nøytraliserende determinant valgt fra gruppen som består av:

a) et polypeptid som omfatter aminosyrene 75-96 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA,

b) et polypeptid som omfatter aminosyrene 128-154 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA,

c) et polypeptid som omfatter aminosyrene 176-197 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA,

d) et polypeptid som omfatter aminosyrene 152-297 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA,

e) et polypeptid som omfatter aminosyrene 220-284 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA,

f) et polypeptid som omfatter aminosyrene 152-198 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA,

g) et polypeptid som omfatter aminosyrene 152-186 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA,

h) et polypeptid som omfatter aminosyrene 97-297 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA,

i) et polypeptid som omfatter aminosyrene 138-270 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA,

j) et polypeptid som omfatter aminosyrene 113-198 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA, og

k) et polypeptid som omfatter aminosyrene 152-270 i SEKV. ID. Nr.: 431 for humant IL-17RA.

Ytterligere beskrevet er et isolert, monoklonalt antistoff eller et IL-17RA-bindende fragment derav, som spesifikt binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men som ikke spesifikt binder IL-17RA med en av følgende aminosyresubstitusjoner: E97R, E113R, S115R, H138R, D152R, D154R, E156R, K166R, Q176R, S177R, D184R, E186R, S198R, H215R, S220R, T228R, T235R, E241R, H242R, L270R, Q284R eller H297R i SEKV. ID. Nr.: 431, et slikt antistoff kan spesifikt binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men ikke spesifikt binder IL-17RA med en av følgende aminosyresubstitusjoner: D152R, D154R, E156R, D184R, E186R eller H297R i SEKV. ID. Nr.: 431 eller antistoffet spesifikt binder humant IL-17RA ifølge SEKV. ID. Nr.: 431, men ikke spesifikt binder IL-17RA med asparaginsyreresten i posisjon 152 i SEKV. ID. Nr.: 431 erstattet med en arginin, eller antistoffet spesifikt binder en epitop som er definert ved hvilken som helst av aminosyrene D152, D154, E156, D184, E186 eller H297 i SEKV. ID. Nr.: 431, eller antistoffet spesifikt binder en epitop som er definert ved minst to av følgende aminosyrer D152, D154, E156, D184, E186 eller H297 i SEKV. ID. Nr.: 431, eller antistoffet spesifikt binder en epitop som er definert med minst tre av følgende aminosyrer D152, D154, E156, D184, E186 eller H297 i SEKV. ID. Nr.: 431, eller antistoffet spesifikt binder en epitop som er definert med minst fire av følgende aminosyrer D152, D154, E156, D184, E186 eller H297 i SEKV. ID. Nr.: 431, eller antistoffet spesifikt binder en epitop som er definert med minst fem av følgende aminosyrer D152, D154, D156, D184, E186 eller H297 i SEKV. ID. Nr.:431, eller antistoffet spesifikt binder en epitop definert med aminosyrene D152, D154, E156, D184, E186, H297 i SEKV. ID. Nr.: 431.

Anvendelse av IL-17RA-antigenbindende proteiner for diagnostiske og terapeutiske formål

De IL-17RA-antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i diagnostiske analyser, for eksempel bindingsanalyser for påvisning og/eller kvantifisering av IL-17RA som uttrykkes i et vev eller en celle. De IL-17RA-antigenbindende proteinene kan anvendes i forskning for ytterligere undersøkelse av rollen til IL-17RA i sykdom. De IL-17RA-antigenbindende proteinene kan anvendes for videre undersøkelse av rollen til IL-17RA i dannelsen av homomere og/eller heteromere reseptorkomplekser og rollen til disse kompleksene i sykdom. De IL-17RA-antigenbindende proteinene kan anvendes for en videre undersøkelse av rollen til IL-17RA-aktivering til homomere og/eller heteromere IL-17-ligandkomplekser. De IL-17RA-antigenbindende proteinene kan anvendes for en videre undersøkelse av rollen til IL-17RA-aktivering til homomere og/eller heteromere IL-17lligandkomplekser og hvordan disse homomere og/eller heterodimere IL-17-ligandkompleksene henger sammen med sykdom.

De IL-17RA-antigenbindende proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved forebyggelse eller behandling av sykdommer eller tilstander som er forbundet med IL-17A- og/eller IL-17F-aktivitet. En sykdom eller tilstand som er forbundet med IL-17A og/eller IL-17F betyr hvilken som helst sykdom, tilstand eller patologi hvis begynnelse i en pasient skyldes eller forverres av interaksjonen mellom IL-17A og/eller IL-17F med IL-17RA. Omfanget av sykdommen, tilstanden eller patologien kan også forhøyes eller reduseres ved å modulere interaksjonen til IL-17A og/eller IL-17F med IL-17RA eller et heterologt kompleks som omfatter IL-17RA og IL-17RC.

Antigenbindende proteiner ifølge oppfinnelsen som spesifikt bindes til IL-17RA kan anvendes ved behandling av IL-17RA-medierte sykdommer i en pasient med behov for dette. Alle aspekter av de IL-17RA-antigenbindende proteinene som er beskrevet i den foreliggende beskrivelse kan anvendes for fremstilling av et medikament for behandling av de forskjellige tilstandene og sykdommene som er beskrevet her. I tillegg kan det IL-17RA-antigenbindende proteinet ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt for å inhibere IL-17RA fra å danne et kompleks med sin ligand, f. eks. IL-17A og/eller IL-17F eller hvilket som helst annet medlem av IL-17-ligandfamilien som binder IL-17RA eller et heterologt kompleks som omfatter IL-17RA og IL-17RC, hvorved den biologiske aktiviteten av IL-17RA moduleres i en celle eller et vev. Antigenbindende proteiner som bindes til IL-17RA kan således modulere og/eller inhibere interaksjonen med andre bindende forbindelser, og kan følgelig ha terapeutisk anvendbarhet for lindring av IL-17RA-medierte sykdommer. IL-17RA-antigenbindende proteiner kan inhibere IL-17A og/eller IL-17F fra å binde IL-17RA, noe som kan føre til et brudd i den IL-17RA-induserte signaloverføringskaskade.

Et forhøyet nivå av IL-17A og/eller deltagelse av IL-17A-medierte signaler i patogenesen av sykdommer har blitt påvist i en rekke tilstander og sykdommer. Kolls og Linden, 2004, supra, Miossec, 2003, P. Arthritis Rheum., 48:594-601), WO 2005/063290, Cannetti et al., 2003, J. Immunol., 171:1009-1015, Charles et al., 1999, J. Immunol., 163:1521-1528, Cunnane et al., 2000, Online J. Rheumatol., 27:58-63, Yoshimoto, 1998, J. Immunol., 161: 3400-3407), (WO 2005/063290) (Niederau, 1997, Online NLM) (WO 2004/002519) (Tsutsui et al., 2000, supra). (Chabaud, 2001, Arth & Rheumatism, 44:1293). Følgelig sies IL-17RA å influere patologien for disse og andre sykdommer eller tilstander som er beskrevet her.

Som beskrevet her, inhiberer et surrogat rotte anti-muse-IL-17RA-antistoff sykdomsforløpet og reduserer degraderingen av bein og brusk i både en profylaktisk og terapeutisk kollagenindusert artrittmodell i gnagere (se eksemplene nedenfor). Som ytterligere bevis for virkningen av å avbryte IL-17A/IL-17RA-signalveier er IL-17RA-”knockout”-mus resistente ovenfor kollagenindusert artritt, og IL-17RA-antistoffbehandling er effektiv i artritt indusert i TNFR-”knockout”-mus, noe som viser en TNF-uavhengig virkning (se Eksempel 6).

Inhibering av IL-17RA ved anvendelse av de antigenbindende proteinene som er beskrevet her, representerer en ny og effektiv mekanisme for inhibering av symptomene og patologien til betennelsessykdommer og autoimmune sykdommer, nærmere bestemt den betennelse og leddegradering som opptrer i reumatoid artritt (RA). Prekliniske resultater og resultater fra RA-pasientvev tyder på evnen til å ha virkning i pasienter hvor TNF-inhibitorbehandling ikke virker og gir ytterligere fordeler i kombinasjon med TNF-inhibitorer, IL-6-inhibitorer og IL-1-inhibitorer.

De antigenbindende proteinene som er beskrevet her kan anvendes i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med hvilken som helst av én eller flere TNF-inhibitorer for behandling eller forebyggelse av sykdommene og forstyrrelsene som er beskrevet her, for eksempel alle former løselige TNF-reseptorer, inkludert etanercept (for eksempel ENBREL), så vel som alle former for monomere eller multimere p75- og/eller p55-TNF-reseptormolekyler og fragmenter derav, anti-human TNF-antistoffer, for eksempel Infliximab (for eksempel REMICADE) og D2E7 (for eksempel HUMIRA) og lignende. Slike TNF-inhibitorer omfatter forbindelser og proteiner som blokkerer in vivo-syntesen eller ekstracellulær frigjøring av TNF. Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelsen av et IL-17RA-antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etter-behandling eller samtidig behandling) med én eller flere av følgende TNF-inhibitorer: TNF-bindende proteiner (løselig TNF-reseptortype-I og løselig TNF-reseptortype-II (”sTNFR”) som definert heri), anti-TNF-antistoffer, granulocytt kolonistimulerende faktor, thalidomid, BN 50730, tenidap, E 5531, tiapafant PCA 4248, nimesulid, panavir, rolipram, RP 73401, peptidT, MDL 201, 449A, (1R,3S)-cis-1-[9-(2,6-diaminopurinyl)]-3-hydroksy-4-syklopentenhydroklorid, (1R,3R)-trans-1-(9-(2,6-diamino)-purin]-3-acetoksysyklopentan, (1R,3R)-trans-1-[9-adenyl)-3-azidosyklopentanhydroklorid og (1R,3R)-trans-1-(6-hydroksypurin-9-yl)-3-azidosyklopentan. TNF-bindende proteiner er beskrevet innen faget (EP 308 378, EP 422 339, GB 2 218 101, EP 393 438, WO 90/13575, EP 398 327, EP 412 486, WO 91/03553, EP 418 014, JP 127 800/1991, EP 433 900, US patentskrift nr. 5 136 021, GB 2 246 569, EP 464 533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, EP 512 528, EP 526 905, WO 93/07863, EP 568 928, WO 93/21946, WO 93/19777, EP 17 563, WO 94/06476 og PCT internasjonal patentsøknad publisert som WO1998/01555.

For eksempel beskriver EP 393 438 og EP 422 339 aminosyresekvensen og nukleinsyresekvensen til en løselig TNF-reseptortype I (også betegnet ”sTNFR-I” eller ”30kDA TNF-inhibitor”) og en løselig TNF-reseptor type II (også betegnet ”sTNFR-II” eller ”40kDa TNF-inhibitor”), under et betegnet som ”sTNFR”, så vel som modifiserte former av disse (f. eks. fragmenter, funksjonelle derivater og varianter). EP 393 438 og EP 422 339 beskriver også fremgangsmåter for isolering av genene som er ansvarlige for koding av inhibitorene, kloning av genet i egnede vektorer og celletyper og ekspresjon av genet for fremstilling av inhibitorene. I tillegg har også polyvalente former (dvs. molekyler som omfatter mer enn én aktiv gruppe) av sTNFR-I og sTNFR-II også blitt beskrevet. I én utførelse kan den polyvalente form konstrueres ved kjemisk sammenkobling av minst én TNF-inhibitor og en annen gruppe ved hjelp av hvilken som helst klinisk aksepterbar linker, for eksempel polyetylenglykol (WO 92/16221 og WO 95/34326), ved hjelp av en peptidlinker (Neve et al., (1996), Cytokine, 8(5):365-370 ved kjemisk kobling til biotin og så binding til avidin (WO 91/03553) og endelig ved å kombinere kimere antistoffmolekyler (US patentskrift nr. 5 116 964, WO 89/09622, WO 91/16437 og EP 315062).

Anti-TNF-antistoffer omfatter Fab-antistoffet MAK 195F (Holler et al. (1993), 1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147), det monoklonale anti-TNF-antistoff CDP 571 (Rankin et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:334-342), det monoklonale muse-antistoff mot tumornekrosefaktor BAY X 1351 (Kieft et al. (1995), 7<th >European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, s. 9), det monoklonale anti-TNF-antistoff CenTNF cA2 (Elliott et al. (1994), Lancet, 344:1125-1127 og Elliott et al., (1994), Lancet, 344:1105-1110).

De antigenbindende proteinene som er beskrevet her kan anvendes i kombinasjon med alle former for IL-1-inhibitorer, for eksempel, men kineret (for eksempel ANAKINRA). Interleukin-1-reseptorantagonist (IL-1ra) er et humant protein som virker som en naturlig inhibitor av interleukin-1. Interleukin-1-reseptorantagonister så vel som fremgangsmåter for fremstilling av fremgangsmåter for anvendelse av den beskrives i US patentskrift nr. 5 075 222, WO 91/08285, WO 91/17184, AU 9173636, WO 92/16221, WO 93/21946, WO 94/06457, WO 94/21275, FR 2706772, WO 94/21235, DE 4219626, WO 94/20517, WO 96/22793 og WO 97/28828. Proteinene omfatter glykosylerte så vel som ikke-glykosylerte IL-1-reseptorantagonister. Nærmere bestemt beskrives tre foretrukne former av IL-1ra (IL-1ra α, IL-1ra β og IL-1rax) som alle kodes av samme DNA-kodende sekvens og varianter derav, i US patentskrift nr. 5 075 222. Fremgangsmåter for fremstilling av IL-1-inhibitorer, nærmere bestemt IL-1ras, beskrives også i 5 075 222-patentskriftet. En annen klasse av interleukin-1-inhibitorer omfatter forbindelser som spesifikt kan forhindre aktivering av cellulære reseptorer for IL-1. Slike forbindelser omfatter IL-1-bindende proteiner, for eksempel løselige reseptorer og monoklonale antistoffer. Slike forbindelser omfatter også monoklonale antistoffer mot reseptorene. Ytterligere en klasse av interleukin-1-inhibitorer omfatter forbindelser og proteiner som blokkerer in vivo-syntesen og/eller den ekstracellulære frigjøring av IL-1. Slike forbindelser omfatter midler som påvirker transkripsjonen av IL-1-gener eller prosesseringen av IL-1-preproteiner.

De antigenbindende proteinene som er beskrevet her kan anvendes i kombinasjon med alle former for CD28-inhibitorer, for eksempel abatacept (for eksempel ORENCIA).

De antigenbindende proteinene som er beskrevet her kan anvendes i kombinasjon med alle former for IL-6 og/eller IL-6-reseptor-inhibitorer, for eksempel abatacept (for eksempel ACTEMRA).

Det antigenbindende proteinene kan anvendes i kombinasjon med ett eller flere cytokiner eller lymfokiner, én eller flere hematopoietiske faktorer og/eller et antiinflammatorisk middel.

Behandling av sykdommene og forstyrrelsene som er beskrevet her kan omfatte anvendelse av førstelinje legemidler for kontroll av smerte og betennelse i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med behandling med ett eller flere av de andre antigenbindende proteinene som tilveiebringes her. Disse legemidlene er klassifisert som ikke-steroide, antiinflammatoriske legemidler (NSAID). Sekundære behandlingsformer omfatter kortikosterioder, langsomtvirkende antireumatiske legemidler (SAARD) eller sykdomsmodifiserende (DM) legemidler. Informasjon vedrørende de påfølgende forbindelsene kan finnes i The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16. utgave, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, N.J. (1992) og i Pharmaprojects, PJB Publications, Ltd.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein og ett eller flere NSAID for behandling av sykdommene og forstyrrelsene som er beskrevet her. Den antiinflammatoriske virkning av NSAID skyldes i det minste delvis inhibering av prostaglandinsyntesen (Goodman og Gilman i ”The Pharmacological Basis of Therapeutics”, MacMillan, 7. utgave (1985)). NSAID kan oppdeles i minst 9 grupper: (1) salicylsyrederivater, (2) propionsyrederivater, (3) eddiksyrederivater, (4) fenaminsyre-derivater, (5) karboksylsyrederivater, (6) smørsyrederivater, (7) oksikamer, (8) pyrazoler og (9) pyrazoloner.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) ved ett eller flere salicylsyrederivater, én eller flere prodroge estere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav. Slike salisylsyrederivater, prodrogeestere og farmasøytisk aksepterbare salter derav omfatter: acetaminosalol, aloksiprin, aspirin, benorylat, bromsaligenin, kalsiumacetyl-salicylat, kolinmagnesiumtrisalicylat, magnesiumsalicylat, kolinsalicylat, diflusinal, etersalat, fendosal, gentisinsyre, glykolsalicylat, imidazolsalicylat, lysinacetylsalicylat, mesalamin, morfolinsalicylat, 1-naftylsalicylat, olsalazin, parsalmid, fenylacetylsalicylat, fenylsalicylat, salacetamid, salicylamid-O-eddiksyre, salsalat, natriumsalicylat og sulfasalazin. Strukturelt beslektede salicylsyrederivater med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper omfattes også i denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere propionsyrederivater eller prodrogeestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav. Propionsyrederivatene, prodrogeestrene og de farmasøytisk aksepterbare saltene derav omfatter: alminoprofen, benoksaprofen, bukloksinsyre, karprofen, deksindoprofen, fenoprofen, funoksaprofen, fluprofen, flurbiprofen, furkloprofen, ibuprofen, ibuprofen-aluminium, ibuproksan, indoprofen, isoprofen, ketoprofen, loksoprofen, miroprofen, naproksen, naproksen-natrium, oksaprozin, pketoprofen, pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, protizininsyre, pyridoksiprofen, suprofen, tiaprofensyre og tioksaprofen.

Strukturelt beslektede propionsyrederivater med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper omfatter også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere eddiksyrederivater eller prodrogeestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav. Eddiksyrederivatene, prodrogeestrene og de farmasøytisk aksepterbare salter derav omfatter: acemetacin, alklofenac, amfenac, bufexamac, cinmetacin, klopirac, delmetacin, diklorfenac-kalium, diklofenac-natrium, etodolac, felbinac, fenklofenac, fenklorac, fenklozinsyre, fentiazac, furofenac, glukametacin, ibufenac, indometacin, isofezolac, isoksepac, lonazolac, metiazinsyre, oksametacin, oksipinac, pimetacin, proglumetacin, sulindac, talmetacin, tiaramid, tiopinac, tolmetin, tolmetinnatrium, zidometacin og zomepirac. Strukturelt beslektede eddiksyrederivater med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, underbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere fenaminsyrederivater eller prodroger, eller farmasøytisk aksepterbare salter derav. Fenaminsyrederivatene, prodrogeestrene og de farmasøytisk aksepterbare salter derav omfatter: enfenaminsyre, etofenamat, flufenaminsyre, isoniksin, meklofenaminsyre, meklofenamat-natrium, medofenaminsyre, mefenaminsyre, nifluminsyre, talniflumat, terofenamat, tolfenaminsyre og ufenamat. Strukturelt beslektede fenaminsyrederivater med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere karboksylsyrederivater eller prodroger eller farmasøytisk aksepterbare salter derav. Karboksylsyrederivatene, prodrogeestrene eller de farmasøytisk aksepterbare salter derav som kan anvendes omfantter: klidanac, diflunisal, flufenisal, inoridin, ketorolac og tinoridin. Strukturelt beslektede karboksylsyrederivater med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere smørsyrederivater eller prodrogeestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav. Smørsyrederivatene, prodrogeestrene og de farmasøytisk aksepterbare salter derav omfatter: bumadizon, butibufen, fenbufen og xenbucin. Strukturelt beslektede smørsyrederivater med lignende analgetiske og anti-inflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere oksikamer eller prodrogeestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav. Oksikamene, prodrogeestrene og de farmasøytisk aksepterbare salter derav omfatter: droksikam, enolikam, isoksikam, prioksikam, sudoksikam, tenoksikam og

4-hydroksyl-1,2-benzotiazin-1,1-dioksid-4-(N-fenyl)-karboksamid. Strukturelt beslektede oksikamer med lignende analgetiske og anti-inflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med én eller flere pyrazoler eller prodrogesestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav. Pyrazolene, prodrogeestrene og de farmasøytisk aksepterbare salter derav, som kan anvendes, omfatter: difenamizol og epirizol. Strukturelt beslektede pyrazoler med lignende analgetiske og anti-inflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen akn være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere pyrazoloner eller prodrogeestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav. Pyrazolonene, prodrogeestrene og de farmasøytisk aksepterbare salter derav som kan anvendes omfatter: apazon, azapropazon, binzpiperylon, feprazon, mofebutazon, morazon, oksyfenbutazon, fenylbutazon, pipbuzon, propylfenazon, ramifenazon, suksibuzon og tiazolinobutazon. Strukturelt beslektede pyrazoloner med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere av følgende NSAID: ε-acetamodikaproinsyre, S-adenosylmetionin, 3-amino-4-hydroksysmørsyre, amixetrin, anitrazafen, antrafenin, bendazac, bendazaclysinat, benzydamin, beprozin, proberamol, bukolom, bufezolac, ciprokazon, kloksimat, dazidamin, debokxamet, detomidin, difenpiramid, difenpyramid, difisalamin, ditazol, emorfazon, fanetizolmesylat, fenflumizol, floktafenin, flumizol, flunikxin, fluprokazon, fopirtolin, fosfosal, guaimesal, guaiazolen, isonixirin, lefetamin-HCl, leflunomid, lofemizol, lotifazol, lysinkloniksinat, meseklazon, nabumeton, niktindol, nimesulid, orgotein, orpanoksin, oksaceprol, oksapadol, paranylin, perisoksal, perisoksalcitrat, pifoksim, piproksen, pirazolac, pirfenidon, prokazon, proksazol, tielavin-B, tiflamizol, timegadin, tolektin, tolpadol, tryptamid og forbindelsene som betegnes med kodenummeret fra produsenten, for eksempel 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-benzoyl-1-indankarboksylsyre), TVX2706, U60257, UR2301 og WY41770.

Strukturelt beslektede NSAID med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper som disse NSAID omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere kortikosterioder eller prodrogeestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav ved behandling av sykdommene og forstyrrelsene som er beskrevet her, inkludert akutt og kronisk betennelse, slik som reumatiske sykdommer, graft versus hostsykdom og multippel sklerose. Kortkosterioder, prodrogeestere og farmasøytisk aksepterbare salter derav omfatter hydrokortison og forbindelse som er avledet fra hydrokortison, for eksempel 21-acetoksypregnenolon, alklomeraso, algeston, amcinonid, beklometason, betametason, betametasonvalerat, budesonid, kloroprednison, klobetasol, klobetasolpropionat, klobetason, klobetasonbutyrat, klokortolon, klorprednol, kortikosteron, kortison, kortivazol, deflazakon, desonid, desoksimerason, deksametason, diflorason, fiflukortolon, difluprednat, enokolson, fluazakort, flukloronid, flumetason, flumetasonpivalat, flucinolonacetonid, flunisolid, flucinonid, flurocinolonacetonid, fluorkotinbutyl, fluokortolon, flukortolonheksanoat, diflukortolonvalerat, fluormetolon, fluperolonacetat, fluprednidenacetat, fluprednisolon, flurandenolid, formokortal, halcinonid, halometason, haloprednonacetat, hydrokortamat, hydrokortison, hydrokortisonacetat, hydrokortison-butyrat, hydrokortisonfosfat, hydrokortison-21-natriumsuksinat, hydrokortisontebutat, mazipredon, medryson, meprednison, metylprednisolon, mometasonfuorat, parametason, prednikarbat, prednisolon, prednisolon-21-dieryaminoacetat, prednisolon-natriumfosfat, prednisolonnatriumsuksinat, prednisolon-natriu-21-m-sulfobenzoat, prednisolon-natrium-21-stearoglykolat, prednisolonteburat, prednisolon-21-trimetylacetat, prednison, predniva, prednyliden, prednyliden-21-dietylaminoacetat, triksokortol, triamcinolon, triamcinolonacetonid, triamcinolonbenetonid og triamcinolonheksacetonid. Strukturelt beslektede kortikosterioder med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelse kan være rettet mot anvendelsen av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere langsomtvirkende antireumatiske medikamenter (SAARD) eller sykdomsmodifiserende antireumatiske medikamenter (DMARD) eller prodrogeestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav, ved behandling av sykdommen og forstyrrelsene som er beskrevet her, inkludert akutt og kronisk betennelse slik som reumatiske sykdommer, graft versus host-sykdom og multippel sklerose. SAARD eller DMARD, prodrogeestere og farmasøytisk aksepterbare salter derav omfatter: allokupreidnatrium, auranofin, aurotioglukose, aurotioglykanid, azatioprin, brekinarnatrium, bucillamin, kalsium-3-aurotio-2-propanol-1-sulfnat, klorambucil, klorokin, klobuzarit, kuproksolin, syklofosfatmid, syklosporin, dapson, 15-deoksyspergualin, diacerein, glukosamin, gullsalter (for eksempel syklokin gullsalt, gull-natriumtiomalat, gullnatriumtiosulfat), hydroksoklorokin, hydroksyklorokinsulfat, hydroksyrea, kebuzon, levamisol, lobenzarit, melittin, 6-merkaptopurin, metotreksat, miziribin, mykofenolatmofetil, myoral, nitrogenmustard, D-penicillamin, pyridinolimidazoler, for eksempel SKNF86002 og SB203580, rapamycin, tioler, tymopoietin og vinkristin. Strukturelt beslektede SAARD eller DMARD med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med én eller flere COX2-inhibitorer eller prodrogeestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav ved behandling av sykdommene og forstyrrelsene som er beskrevet her, inkludert akutt og kronisk betennelse. Eksempler på COX-2-inhibitorer, prodrogeestere eller farmasøytisk aksepterbare salter derav, omfatter for eksempel celecoxib. Strukturelt beslektede COX2-inhibitorer med lignende analgetiske og antiinflammatoriske egenskaper omfattes også av denne gruppen. Eksempler på COX-2-selektive inhibitorer omfatter etoricoxib, valdecoxib, celecoxib, licofelon, lumiracoxib, rofecoxib og lignende.

Den foreliggende oppfinnelsen kan være rettet mot anvendelse av et antigenbindende protein i kombinasjon (forbehandling, etterbehandling eller samtidig behandling) med ett eller flere antimikrobielle midler eller prodroger eller farmasøytisk aksepterbare salter derav ved behandling av sykdommene og forstyrrelsene som er beskrevet her, inkludert akutt og kronisk betennelse. Antimikrobielle midler omfatter for eksempel de brede klassene av penicilliner, cefalospironer og andre beta-laktamer, aminoglykosider, azoler, kinoloner, makrolider, rifamyciner, tetracykliner, sulfonamider, linkosamider og polymyxiner. Penicillinene omfatter for eksempel penicillin G, penicillin V, miticillin, nafcillin, oksacillin, kloxacillin, dikloxacillin, floksacillin, ampicillin, ampicillin/-sulbaktam, amoksicillin, amoksicillin/klavulanat, hetacillin, syklacillin, bakampicillin, karbenicillin, karbenicillinindanyl, tikarcillin, tikarcillin/klavulanat, azlocillin, mezolicillin, peperacillin og mecillinam. Cefalosporinenen og andre beta-laktamer omfatter, for eksempel cefalotin, cefapirin, cefaleksin, cefradin, cefazolin, cefradroksil, cefaklor, cefamandol, cefotetan, cefoksitin, ceruroksim, cefonicid, ceforadin, cefiksim, cefotaksim, moksalaktam, cefizoksim, cetriakson, cefoperazon, ceftazidim, imipenem og aztreonam. Aminoglykosidene omfatter for eksempel streptomycin, gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin, kanamycin og neomycin. Azolene omfatter for eksempel fluconazol.

Kinolonenen omfatter for eksempel nalidiksinsyre, norfoksacin, enoksacin, ciprofoksacin, ofloksacin, sparfloksacin og temafloksacin. Makrolidene omfatter for eksempel erytromycin, spiramycin og azitromycin. Rifamycinene omfatter for eksempel rifampin. Tetrasyklinene omfatter for eksempel spisyklin, klortetrasyklin, klomosyklin, demeklosyklin, deoksysyklin, guamesyklin, lymesyklin, meklosyklin, metasyklin, minosyklin, oksy-tetrasyklin, penimepisyklin, pipasyklin, rolitetrasyklin, sanksyklin, senosilin og tetrasyklin.

Sulfonamidene omfatter sulfaniliamid, sulfametoksazol, sulfacetamid, sulfadiazin, sulfisoksazol og ko-trimoksazol (trimetoprim/sulfametoksazol). Likosamidene omfatter for eksempel klindamycin og linkomycin. Polymyksinene (polypeptider) omfatter for eksempel polymyksin B og kolistin.

Den mest sitert aktiviteten av IL-17A in vitro er induksjonen av neutrofilmobiliserende cytokiner og kjemokiner via stromaceller (f. eks. GM-CSF, IL6, IL8). Disse aktivitetene forsterkes kraftig i nærvær av TNF (Ruddy et al., 2004). På lignende måte forsterkes også de biologiske aktiviteter av IL-17F ved samtidig stimulering med TNF. Av spesiell betydning når det gjelder en patogen rolle for IL-17A i den bruskdestruksjon og beinerosjon som er forbundet med reumatoid artritt, er at IL-17A induserer ekspresjonen av NO, MMP, PGE2 og RANKL og spiller en rolle i antigenspesifikk T- og B-celleaktivering (Kolls og Linden, 2004, supra, Lubberts et al., 2005, Arthritis, Res. Ther., 7:29-37). Følgelig kan de antigenbindende proteinene anvendes for inhibering av IL-17A- og/eller IL-17F/IL-17RA-signalveien og påfølgende dannelse av NO, MMP, PGE2 og/eller RANKL og behandling av sykdommer forbundet med oppregulering via IL-17A og/eller IL-17F av NO, MMP, PGE2 og/eller RANKL, så vel som andre proinflammatoriske mediatorer som er beskrevet her.

I tillegg til nærvær av forhøyet nivå av IL-17A i leddvæske fra pasienter med reumatoid artritt, tyder flere typer av bevis på at IL-17A er et viktig patogent cytokin i artritt. For det første, forsterker administrering av IL-17A til leddene til mus symptomene på kollagenindusert artritt (Lubberts et al., 2003, J. Immunol., 170:2655-2662). For det andre inhiberer løselig IL-17RA.Fc nedbrytning av kollagen i synovialtilfører og beineksplantat-kulturer fra pasienter med RA og svekker symptomene på kollagenindusert artritt i mus (Chaubaud og Miossec, 2001, Arthritis Rheum., 44:1293-1303) (Lubberts et al., 2001, J. Immunol., 167:1004-1013)). Som forventet ut fra lav-affinintetsinteraksjonen mellom IL-17F og IL-17R nøytraliserer IL-17R-Fc ikke aktiviteten av IL-17F, så disse virkningene er spesifikke for antagonisme av IL-17A. For det tredje er mus som mangler IL-17A resistente ovenfor IL-1-indusert artritt og har undertrykket kollagenindusert artritt (Nakae et al., 2003a, J. Immunol., 171:6173-6177, Nakae et al., 2003b, supra). Disse resultatene viser at IL-17A-signalisering via IL-17RA er en viktig mediator av betennelse og leddskade ved artritt. De antigenbindende proteinene kan anvendes for inhibering av IL-17A- og/eller IL-17F/IL-17RA-aktivitet og derved redusere betennelsen og leddskaden i artritt.

I reumatoid artritt har et forhøyet nivå av modent IL-17A blitt påvist i serum og leddvæske fra pasienter. I noen undersøkelser ble IL-17A-nivået vist å korrelere med sykdomsaktiviteten og responsen på sykdomsmodifiserende behandling. Et ekstremt forhøyet serumnivå av IL-17A har gjennomgående blitt målt ved systemisk juvenil idiopatisk artritt og den nært beslektede Stills sykdom i voksne. WO 2005/063290, Cannetti et al., 2003, J. Immunol., 171:1009-1015, Charles et al., 1999, J. Immunol., 163: 1521-1528, Cunnane et al., 2000, Online J. Rheumatol, 27:58-63, Yoshimoto, 1998, J. Immunol., 161:3400-3407. De antigenbindende proteinene kan anvendes for inhibering av IL-17A og/eller IL-17F/IL-17RA-aktivitet og derved behandle systemisk, juvenil idiopatisk artritt og Stills sykdom hos voksne.

Forskjellige andre autoimmune sykdommer har blitt assosiert med et forhøyet nivå av IL-17A, enten i sykt vev eller i serumet. Disse omfatter systemisk lupus erytematosus, atopisk dermatitt, myastenia gravis, type I diabetes og sarkoidose. IL-17A kan også delta i astma og GvHD. De antigenbindende proteinene som er beskrevet her kan anvendes for å redusere virkningene av IL-17A- og/eller IL-17F/IL-17RA-signalveien i disse sykdommene.

De antigenbindende proteinene kan anvendes for å redusere IL-17RA-aktivitet, inkludert administrering av et antigenbindende protein. Fremgangsmåter for inhibering av binding av og/eller signalisering fra IL-17A og/eller IL-17F til IL-17RA som omfatter administrering av det antigenbindende proteinet ifølge oppfinnelsen til IL-17RA er beskrevet. Det antigen-bindende proteinet kan inhibere binding av og/eller signalisering fra IL-17A og IL-17F til IL-17RA. Det antigenbindende proteinet kan inhibere binding av og/eller signalisering fra IL-17A, men ikke IL-17F, til IL-17RA. Det antigenbindende proteinet kan inhibere binding av og/eller signalisering fra IL-17F og ikke IL-17A, til IL-17RA. Det antigenbindende proteinene kan anvendes ved behandling av følgende, sympomene og/eller patologien som er forbundet med IL-17Ra-aktivitet, som omfatter administrering av et antigenbindende protein. De antigenbindende proteinene kan anvendes for å inhibere dannelsen av ett eller flere av et inflammatorisk cytokin, et kjemokin, en matriks-metalloproteinase eller et annet molekyl som er forbundet med IL-17RA-aktivering, inkludert administrering av et antigenbindende protein. De antigenbindende proteinene kan anvendes i fremgangsmåter for inhibering av dannelsen av molekyler, slik som for eksempel: IL-6, IL-8, CXCL1, CXCL2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1 β, TNF α, RANK-L, LIF, PGE2, IL-12, MMP (slik som for eksempel, MMP3 og MMP9), GRO α, NO og/eller C-telopeptid og lignende, som omfatter administrering av et antigen-bindende protein. De antigenbindende proteinene inhiberer profinflammatoriske og proautoimmune immunresponser og kan anvendes ved behandling av sykdommer som er forbundet med aktiviteten til IL-17A- og/eller IL-17F/IL-17RA-signalveien.

Antistoffer som bindes spesifikt til humant IL-17RA og som helt eller delvis inhiberer IL-17RA fra å danne enten et homodimert eller heterodimert, funksjonelt reseptorkompleks, slik som for eksempel IL-17RA/IL-17RC-kompleks, og inhiberer ikke nødvendigvis IL-17A og/eller IL-17F eller en IL-17A/IL-17F-heterodimer fra å binde til IL-17RA eller et heteromert IL-17RA-reseptorkompleks. Sykdomstilstander som er forbundet med IL-17RC er følgelig også forbundet med IL-17RA, grunnet det faktum at IL-17RC ikke kan signalisere uten IL-17RA. Se for eksempel You, Z. et al., Cancer Res., 2006, 1. januar, 66(1):175-83 og You, Z. et al., Naoplasia, 2007, juni, 9(6):464-70.

Oppfinnelsen tilveiebringer de IL-17RA-antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen for anvendelse ved behandlingen av IL-17RA-assosiert sykdom. De IL-17RA-antigenbindende proteinene kan bli anvendt ved behandlingen av sykdommer som inkluderer for eksempel betennelse, autoimmun sykdom, artritt, reumatoid artritt, juvenil artritt, juvenil reumatoid artritt, pauciartikulær juvenil reumatoid artritt, polyartikulær juvenil reumatoid artritt, juvenil reumatoid artritt med systemisk begynnelse, juvenil ankyloserede spondylitt, juvenil psoriatisk artritt, juvenil skleroderma, juvenil systemisk lupus erytematosus, pauciartikulær reumatoid artritt, poly-artikulær reumatoid artritt, reumatoid artritt med systemisk begynnelse, ankyloserende spondylitt, dermatomyositt, psoriatisk artritt, skleroderma, polymyositt, sarkoidose, psoriasis, plakk-psoriasis, atopisk dermatitt, aterosklerose, systemisk lupus erytematosus (SLE), inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykom, ulcerøs kolitt, cøliaki, multippel sklerose (MS), astma, KOLS, og GVHD .

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffet ifølge oppfinnelsen for anvendelse ved behandling av sykdommene ovenfor, som ytterligere omfatter å administrere en andre behandling som omfatter en farmasøytisk sammensetning. Den andre farmasøytiske sammensetningen kan være valgt fra gruppen som består av: TNF-inhibitorer, løselige TNF-reseptorer, etanercept, ENBREL, løselig TNF-reseptor type-I og løselig TNF-reseptor type-II, monomere eller multimere p75- og/eller p55-TNF-reseptormolekyler og fragmenter derav, anti-TNF-antistoffer, infliximab, REMICADE, D2E7 eller HUMIRA, IL-1-inhibitorer, IL-1-reseptorinhibitorer, CD28-inhibitorer, ikke-steroide antiinflmmatoriske legemidler (NSAID), langsomtvirkende antireumatiske legemidler (SAARD) og sykdomsmodifiserende antireumatiske legemidler (DMARD). En fremgangsmåte for inhibering av dannelsen av minst ett cytokin, ett kjemokin, én matriks-metalloporoteinase eller ett annet molekyl som er forbundet med IL-17RA-aktivering er beskrevet her som omfatter administrereing av antistoffet ifølge oppfinnelsen til en pasient med behov for dette, cytokinet, kjemokinet, matriks-metalloproteinasen eller det andre molekyl er valgt fra gruppen som består av: IL-6, IL-8, CXCL1, CXCL2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1 β, TNF α, RANK-L, LIF, PGE2, IL-12, MMP3, MMP9, GRO α, NO og C-telopeptid.

Kronisk virus hepatitt rammer over 500 millioner mennesker verden over, inkludert tilnærmet 10 millioner i de forente stater og Europa med kronisk hepatitt-C-infeksjon. En signifikant andel av pasientene med kronisk hepatitt utvikler progressiv leverfibrose og/eller hepatocellulært karsinom. Selv om virus hepatittvaksiner er tilgjengelige eller under utvikling, bygger dagens behandling av infiserte individer på lange kurer med en kombinasjon av antivirus legemidler og interferon-alfa (INF- α). INF- α anses å være gunstig ved behandling av virushepatitt grunnet molekylets påviste antivirus, immunologiske aktiviteter og antiproliferative virkninger på fibroblaster, men varigheten og nivået av anvendelsen begrenses av alvorlige bivirkninger.

Nyere resultater beskriver hvordan INF- α kan være direkte apoptotisk for Th17-celler (American Association for Immunlogists, sammendrag nr. 42.8, 12-16 mai, 2006, Boston). Th17-celler er en spesiell undergruppe av CD4+-T-celler som er ansvarlig for dannelse av IL-17A og IL-17F som respons på IL-23 (Harrington et al., Nature Imm, 2005, bind 6, nr. 11, 1123-1132 og Park et al., Nature Imm, 2005, bind 6, nr. 11, 1133-1141). Vi tror at dette antyder en ny virkningsmekanisme for INF- α i kronisk, virus hepatitt som ikke omfatter en direkte virkning av INF- α på virus eller fibroblaster, men indirekte virkninger på Th17-celler. Det har videre nylig blitt oppdaget at tumorvekstfaktor-beta (TGF- β) og/eller IL-6 (se for eksempel Kimera, A. et al., PNAS USA, 2007, 17. juli, 104(29):12099-104), som begge er profibrotiske cytokiner, også induserer utviklingen av Th17-celler ved oppregulering av IL-23-reseptorekspresjonen, noe som medfører responsivitet ovenfor IL-12 ((Mangan et al., Nature, 2006, bind 441, nr. 11, 231-234). Responsivitet ovenfor IL-23 induserer diffenrensieringen av naive CD4+-T-celler til TH17-celler. Som nevnt ovenfor er TH17-cellene ansvarlige for frigjøring av IL-17A og IL-17F, og IL-17A vites å ha forskjellige stimulerende virkninger på fibroblaster i en rekke vev og organer. Sett samlet tror vi at inhibering av IL-17RA – IL17A/IL-17F-signalveien kan by på terapeutiske fordeler for progressiv fibrose forbundet med kronisk, virus hepatitt.

En tilleggsfordel ved å inhibere IL-17RA – IL-17A/IL-17F-signalveien ved behandling av virus hepatitt er at man kan redusere INF- α-dosen som tilføres til pasienten og følgelig begrense de skadelige bivirkningene som er forbundet med INF- α-behandling. En ytterligere fordel ved å inhibere IL-17RA – IL-17A/IL-17F-signalveien ved behandling av virus hepatitt, er muligheten for å oppnå en synergistisk, terapeutisk virkning med IFN- αbehandling i kombinasjon med behandling med en IL-17RA – IL-17A/IL-17F-antagonist terapi eller andre antagonister, som beskrevet i mer detalj nedenfor.

Aspekter av antistoffet ifølge oppfinnelsen er følgelig rettet mot det anvendelse ved behandling av patologien forbundet med virus hepatitt ved å inhibere interaksjonen mellom IL-17RA og IL-17A og/eller IL-17F, inhibering av fibrose ved å inhibere interaksjonen mellom IL-17RA og IL-17A og/eller IL-17F, behandling av fibrose assosiert med virus hepatitt ved å inhibere interaksjonen mellom IL-17RA og IL-17A og/eller IL-17F.

Antagonister av IL-17RA - IL-17A og/eller IL-17F-signalveien kan anvendes for å inhibere interaksjonen mellom IL-17RA og IL-17A og/eller IL-17F. Antagonister av IL-17RA - IL-17A-signalveien omfatter de IL-17RA-antigenbindende proteinene følge oppfinnelsen, så vel som IL-17RA-proteiner (så vel som biologisk aktive fragmenter og fusjonsproteiner derav, slik som IL-17RA-Fc-fusjonsproteiner), så vel som antigenbindende proteiner, slik som antistoffer og biologisk aktive fragmenter derav, som bindes til IL-17A og inhiberer IL-17A fra å aktivere IL-17RA, så vel som antigenbindende proteiner, slik som antistoffer og biologisk aktive fragmenter derav, som bindes til IL-17F og inhiberer IL-17F fra å aktivere IL-17RA.

Beskrevet her er fremgangsmåter for behandling av patologien som er forbundet med virus hepatitt ved å antagonisere IL-23 – IL-23-reseptor (IL-23R)-signalveien, inhibering av fibrose ved å antagonisere IL-23 – IL-23R-signalveien, behandling av fibrose assosiert med virus hepatitt ved å antagonisere IL-23 – IL-23R-signalveien. Ved å antagonisere IL-23 – IL-23R-signalveien forhindrer man IL-23-indusert differensiering av TH17-cellene og begrenser derved til syvende og sist mengden av IL-17A og IL-17F i sirkulasjonen, noe som kan redusere patologien forbundet med virus hepatitt. Antagonister av IL-23 – IL-23R-signalveien omfatter antigenbindende proteiner, slik som antistoffer og biologisk aktive fragmenter derav, som bindes til IL-23 og blokkerer IL-23 fra å aktivere IL-23R. Andre antagonister av IL-23 – IL-23R-signalveien omfatter antigenbindende proteiner, slik som antistoffer og biologisk aktive fragmenter derav, som bindes til IL-23R og blokkerer IL-23 fra å aktivere IL-23R. Andre antagonister av IL-23 – IL-23R-signalveien omfatter IL-23R-proteiner så vel som biologisk aktive fragmenter og fusjonsproteiner derav, slik som IL-23R-Fc-fusjonsproteiner, som binder IL-23 og blokkerer IL-23 fra å aktivere IL-23R.

Beskrevet her er fremgangsmåter for behandling av patologien forbundet med virus hepatitt ved å antagonisere TGF- β - TGF- βRI/TGF- βRII-signalveien, inhibering av fibrose ved å antagonisere TGF- β - TGF- βRI/TGF- βRII-signalveien, behandling av fibrose assosiert med virus hepatitt ved å antagonisere TGF- β - TGF- βRI/TGF- βRII-signalveien. Ved å antagonisere TGF- β - TGF- βRI/TGF- βRII-signalveien forhindrer man den TGF- β-induserte utvikling av TH17-celler og begrenser derved til syvende og sist mengden av IL-17A og IL-17F i sirkulasjonen, noe som kan redusere patologien forbundet med virus hepatitt.

Antagonister av TGF- β - TGF- βRI/TGF- βRII-signalveien inkluderer antigen-bindende proteiner slik som antistoffer og biologisk aktive fragmenter derav, som bindes til TGF- β og blokkerer TGF- β fra å aktivere TGF- βRI og/eller TGF- βRII. Andre antagonister av TGF- β -TGF- βRI/TGF- βRII-signalveien inkluderer antigenbindende proteiner slik som antistoffer og biologisk aktive fragmenter derav, som bindes til TGF- βRI eller TGF- βRII og blokkerer TGF- β fra å aktivere TGF- βRI eller TGF- βRII.

Beskrevet her er fremgangsmåter for behandling av patologien forbundet med virus hepatitt ved å antagonisere IL-6 – IL-6R-signalveien, inhibering av fibrose ved å antagonisere IL-6 – IL-6R-signalveien, behandling av fibrose forbundet med virus hepatitt ved å antagonisere IL-6 – IL-6R-signalveien. Ved å antagonisere IL-6 – IL-6R-signalveien kan man redusere patologien forbundet med virus hepatitt. Antagonister av IL-6 – IL-6R-signalveien inkluderer antigenbindende proteiner, slik som antistoffer og biologisk aktive fragmenter derav, som bindes til IL-6 og blokkerer IL-6 fra å aktivere IL-6R. Andre antagonister av IL-6 – IL-6R-signalveien inkluderer antigenbindende proteiner slik som antistoffer og biologisk aktive fragmenter derav, som bindes til IL-6R og blokkerer IL-6 fra å aktivere IL-6R.

Beskrevet her er kombinasjonsbehandling ved anvendelse av antagonistene av IL-17RA – IL-17A/IL-17F-signalveien, IL-23 – IL-23R-signalveien, TGF- β - TGF- βRI/TGF- βRIIsignalveien og/eller IL-6 – IL-6R-signalveien som er nevn ovenfor i kombinasjon med hverandre, så vel som i kombinasjon med heptittbehandling som er anerkjent innen faget, for eksempel interferon, fortrinnsvis INF- α. Alle permutasjoner av disse kombinasjonene omfattes.

Beskrevet her er kombinasjonsbehandling ved anvendelse av antagonistene av IL-17RA – IL-17A/IL-17F-signalveien, IL-23 – IL-23R-signalveien, TGF- β - TGF- βRI/TGF- βRII-signalveien og/eller IL-6 – IL-6R-signalveien som er nevnt ovenfor i kombinasjon med hverandre, så vel som i kombinasjon med hepatitt-behandlinger som er anerkjent innen faget, for eksempel interferon, fortrinnsvis INF- α, så vel som med antivirus midler, for eksempel adefovir dipivoksil, asykliske analoger av deoksyadenosin-monofosfat (adefovir, tenofovir, disoproksilfumarat), (-)-enantiomeren av deoksycytidin-analogen 2’-deoksy-3’-tiacytidin (lamivudin), karbosykliske deoksyguanosinanaloger (entecavir), L-nukleosier ( β-L-2’-deoksytymidin, β-L-2’-deoksycytidin og β-L-2’-deoksy-adenosin), [(-)- β-2’,3’-dideoksy-5-fluor-3’-tiacytidin] (emtricitabin), 1- β-2,6-diamino-purindioksolan (DAPD, amdoksovir), 2’-fluor-5-metyl- β-L-arabinofuranosyluridin (L-FMAU, clevudin), famciclovir og/eller penciclovir. Alle permutasjoner av disse kombinasjonene omfattes.

Diagnostiske fremgangsmåter

De antigenbindende proteinene beskrevet her kan anvendes for diagnostiske formål for påvisning, diagnose eller oppfølging av sykdommer og/eller tilstander som er forbundet med IL-17A eller IL-17RA. Oppfinnelsen tilveiebringer påvisning av nærvær av IL-17RA i en prøve ved anvendelse av klassiske immunhistologiske fremgangsmåter som er kjente blant fagfolk (se for eksempel Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, bind 15 (red. R.H. Burdon og P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam), Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, s. 147-158 (CRC Press, Inc.), Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol., 101:976-985, Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol., 105:3087-3096). Påvisningen av IL-17RA kan utføres in vivo eller in vitro.

Diagnostiske anvendelser beskrevet her omfatter anvendelse av de antigenbindende proteinene for påvisning av ekspresjon av IL-17RA og binding av ligandene til IL-17RA. Eksempler på fremgangsmåter som er anvendbare for påvisning av nærvær av IL-17RA omfatter immunanalyser, for eksempel enzymkoblet immun-absorpsjonsanalyse (ELISA) og radioimmunanalyse (RIA).

For diagnostiske anvendelser vil det antigenbindende proteinet typisk være merket med en påvisbar merkingsgruppe. Anvendbare merkingsgrupper omfatter for eksempel: radioaktive isotoper eller radionuklider (f. eks. <3>H, <14>C, <15>N, <35>S, <90>Y, <99>Tc, <111>In, <125>I, <131>I), fluorescerende grupper (f. eks. FITC, rodamin, lantanidfosforer), enzymatiske grupper (f. eks. pepperrotperoksidase, β-glaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), kjemiluminiscerende grupper, biotinyl-grupper eller på forhånd bestemte polypeptidepitoper som gjenkjennes av en sekundær rapportør (f. eks. par av leucin-”zipper”sekvenser, bindingsseter for sekundære antistoffer, metallbindende domener, epitopmerkelapper). I noen utførelser er merkingsgruppen koblet til antigenbindende protein via avstandsgivende armer av forskjellig lengde, slik at mulig sterisk hindring reduseres.

Forskjellige fremgangsmåter for merking av proteiner er kjente innen faget og kan anvendes ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse.

Beskrevet her er en fremgangsmåte for identifisering av én eller flere celler som uttrykker IL-17RA. Det antigenbindende proteinet er merket med en merkingsgruppe, og binding av det merkede antigenbindende protein til IL-17RA påvises. Bindingen av det antigenbindende proteinet til IL-17RA kan bli påvist in vivo. Det antigenbindende protein-IL-17RA isoleres og måles ved anvendelse av teknikker som er kjente innen faget. Se for eksempel Harlow og Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (red. 1991 og regelmessige oppdateringer), John E. Coligan, red., 1993, Current Protocols In Immunology, New York: John Wiley & Sons.

Beskrevet her er en fremgangsmåte for påvisning av nærvær av et analysemolekyl som konkurrer om binding til IL-17RA med de antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen. Et eksempel på en slik analyse kan omfatte påvisning av mengden av fritt antigenbindende protein i en løsning som inneholder en mengde av IL-17RA i nærvær eller fravær av analysemolekylet. En økt mengde fritt antigenbindende protein (dvs. det antigenbindende proteinet ikke bundet til IL-17RA) vil indikere at analysemolekylet kan konkurrere med det antigenbindende proteinet om binding til IL-17RA. Det antigenbindende proteinet er merket med en merkingsgruppe. Alternativt er analysemolekylet merket, og mengden fritt analysemolekyl måles i nærvær og fravær av et antigenbindende protein.

Anvendelsen av de IL-17RA-antigenbindende proteinene i in vitro-analyser for forskningsformål er beskrevet her for eksempel for inhibering av dannelsen av molekyler, for eksempel: IL-6, IL-8, CXCL1, CXCL2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1 β, TNF α, RANK-L, LIF, PGE2, IL-12, MMP (slik som for eksempel MMP og MMP9), GRO α, NO og/eller C-telopeptid. Antistoffer rettet mot IL-17RA kan for eksempel anvendes for rensing av IL-17RA-proteiner ved immunaffinitetskromatografi.

Behandlingsfremgangsmåter: Farmasøytiske sammensetninger, administreringsveier

I noen utførelser tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av ett eller flere av de antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen, sammen med et farmasøytisk aksepterbart fortynningsmiddel, et bærestoff, et solubiliserende middel, et emulsjonsmiddel, et konserveringsmiddel og/eller en adjuvans. I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen sammensetninger for anvendelse i fremgangsmåter ved behandling av en pasient ved å administrere en slik farmasøytisk sammensetning. Uttrykket ”pasient” omfatter mennesker og dyr.

Farmasøytiske sammensetninger som omfatter ett eller flere antigenbindende proteiner kan anvendes for å redusere IL-17RA-aktivitet. Farmasøytiske sammensetninger som omfatter ett eller flere antigenbindende proteiner kan anvendes ved behandling av følgende, symptomene og/eller patologien som er forbundet med IL-17RA-aktivitet.

Farmasøytiske sammensetninger som omfatter ett eller flere antigenbindende proteiner kan anvendes ved inhibering av binding av og/eller signalisering fra IL-17A og/eller IL-17F til IL17RA som omfatter administrering av det antigenbindende proteinet ifølge oppfinnelsen til IL-17RA. I visse utførelser injiserer det antigenbindende proteinet binding av og/eller signalisering fra IL-17A og IL-17F til IL-17RA. I andre utførelser kan farmasøytiske sammensetninger som omfatter ett eller flere antigenbindende proteiner anvendes ved inhibering av binding av og/eller signalisering fra IL-17A, men ikke IL-17F, til IL-17RA. I andre utførelser kan farmasøytiske sammensetninger som omfatter ett eller flere antigenbindende proteiner anvendes ved inhibering av binding av og/eller signalisering fra IL-17F og ikke IL-17A til IL-17RA. Aspekter av oppfinnelsen omfatter antistoffer som spesifikt bindes til humant IL-17RA og inhiberer IL-17A og/eller IL-17F fra å bindes til og aktivere IL-17RA eller et heteromert kompleks mellom IL-17RA og IL-17RC. Aspekter av oppfinnelsen omfatter antistoffer som spesifikt bindes til humant IL-17RA og inhiberer en IL-17A/IL-17F-heteromer fra å bindes til og aktivere IL-17RA eller et heteromert kompleks mellom IL-17RA og IL-17RC. Når det vises til inhibering av IL-17A og/eller IL-17F i den foreliggende beskrivelse, skal det forstås at dette også omfatter inhibering av heteromerer av IL-17A og IL-17F. Aspekter av oppfinnelsen omfatter antistoffer som spesifikt bindes til humant IL-17RA og delvis eller fullstendig inhiberer IL-17RA fra å danne enten et homomert eller heteromert, funksjonelt reseptorkompleks, for eksempel et IL-17RA-IL-17RC-kompleks. Aspekter av oppfinnelsen omfatter antistoffer som spesifikt bindes til human-IL-17RA og delvis eller fullstendig inhiberer IL-17RA fra å danne enten et homodimert eller heterodimert, funksjonelt reseptorkompleks, for eksempel et IL-17RA/IL-17RC-kompleks, og inhiberer ikke nødvendigvis IL-17A og/eller IL-17F eller en IL-17A/IL-17F-heterodimer fra å bindes til IL-17RA eller et heteromert IL-17RA-reseptorkompleks.

Farmasøytiske sammensetninger som omfatter ett eller flere antigenbindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved behandling av følgende: symptomene og/eller patologien som er forbundet med IL-17RA-aktivitet. Farmasøytiske sammensetninger som omfatter ett eller flere antigenbindende proteiner kan anvendes ved inhibering av dannelsen av ett eller flere av et inflammatorisk cytokin, et kjemokin, en matriks-metalloproteinase eller et annet molekyl som er assosiert med IL-17RA-aktivering som omfatter administrering av et IL-17RA-antigenbindende protein. Farmasøytiske sammensetninger som omfatter ett eller flere antigenbindende proteiner kan anvendes ved inhibering av dannelsen av IL-6, IL-8, GM-CSF, NO, MMP, PGE2 RANKL og/eller C-telopeptid.

Farmasøytiske sammensetninger som omfatter ett eller flere antigenbindende proteiner ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved behandling av sykdommer og tilstander som omfatter, for eksempel betennelse, autoimmun sykdom, artritt, reumatoid artritt, juvenil artritt, juvenil reumatoid artritt, pauciartikulær juvenil reumatoid artritt, polyartikulær juvenil reumatoid artritt, juvenil reumatoid artritt med systemisk begynnelse, juvenil ankyloserede spondylitt, juvenil psoriatisk artritt, juvenil skleroderma, juvenil systemisk lupus erytematosus, pauciartikulær reumatoid artritt, polyartikulær reumatoid artritt, reumatoid artritt med systemisk begynnelse, ankyloserende spondylitt, dermatomyositt, psoriatisk artritt, skleroderma, polymyositt, sarkoidose, psoriasis, plakk-psoriasis, atoisk dermatitt, aterosklerose, systemisk lupus erytematosus (SLE), inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykom, ulcerøs kolitt, cøliaki, multippel sklerose (MS), astma, KOLS, og GVHD.

Aksepterbare formuleringsmaterialer er fortrinnsvis ikke-toksiske for mottageren i de benyttede doser og konsentrasjoner. I spesifikke utførelser tilveiebringes farmasøytiske sammensetninger som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av IL-17RA-antigenbindende proteiner iføølge oppfinnelsen.

Aksepterbare formuleringsmaterialer er fortrinnsvis ikke-toksiske for mottageren i de benyttede doser og konsentrasjoner. I visse utførelser kan den farmasøytiske sammensetningen inneholde formuleringsmaterialer for modifisering, bevaring eller konservering av for eksempel preparatets pH, osmolaritet, viskositet, klarhet, farge, isotonisitet, duft, sterilitet, stabilitet, oppløsningshastighet eller frigjøringshastighet, absorpsjon eller penetrasjon. I slike utførelser omfatter egnede formuleringsmaterialer for eksempel aminosyrer (slik som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin), antimikrobielle midler, antioksidanter (slik som askorbinsyre, natriumsulfitt eller natriumhydrogensulfitt), buffere (slik som borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrater, fosfater eller andre organiske syrer), massegivende midler (slik som mannitol eller glysin), chelateringsmidler (slik som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)), kompleksdannende midler (slik som koffein, polyvinylpyrrolidon, beta-syklodekstrin eller hydroksypropyl-beta-syklodekstrin), fyllstoffer, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater (slik som glukose, mannose eller dekstriner), proteiner (slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner), fargestoffer, smaksstoffer og fortynningsmidler, emulsjonsmidler, hydrofile polymerer (slik som polyvinylpyrrolidon), lav-molekylære polypeptider, saltdannende mot-ioner (slik som natrium), konserveringsmidler (slik som benzalkoniumklorid, benzosyre, salicylsyre, timerosal, fenetylalkohol, metylparaben, propylparaben, klorheksidin, sorbinsyre eller hydrogenperoksid), løsemidler (slik som glyserol, propylenglykol eller polyetylenglykol), sukkeralkoholer (slik som mannitol eller sorbitol), suspensjonsmidler, surfaktanter eller fuktningsmidler (slik som pluronics, PEG, sorbitanestere, polysorbater, slik som polysorbat 20, polysorbat, triton, trometamin, lecitin, kolesterol, tyloksapal), stabilitetsfremmende midler (slik som sukkrose eller sorbitol), tonisitetsgivende midler (slik som alkalimetall halider, fortrinnsvis natrium- eller kaliumklorid, mannitol, sorbitol), tilførselsbærere, fortynningsmidler, eksipienser og/eller farmasøytiske adjuvanser. Se Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. utgave (A.R. Genrmo, red.), 1990, Mack Publishing Company.

Den optimale farmasøytiske sammensetningen bestemmes av en fagperson, avhengig av, for eksempel, den påtenkte administreringsvei, administreringsformatet og den ønskede dose. Se for eksempel Remingtons Pharmaceutical Sciences, supra. Slike sammensetninger kan påvirke den fysiske tilstand, stabiliteten, in vivo-frigjøringshastigheten og in vivo-clearance hastigheten av de antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen. Den primære bærer eller det primære bærerstoff i en farmasøytisk sammensetning kan være enten vandig eller ikke-vandig av natur. For eksempel kan en egnet bærer eller et egnet bærestoff være vann for injeksjon, fysiologisk saltløsning eller kunstig cerebrospinalvæske, muligens tilsatt andre materialer som er vanlige i sammensetninger for parenteral tilførsel. Nøytralbufret saltvann eller saltvann blandet med serumalbumin er andre eksempler på bærere. Farmasøytiske sammensetninger kan omfatte Tris-buffer med pH tilnærmet 7,0-8,5 eller acetatbuffer med pH tilnærmet 4,0-5,5 og kan videre omfatter sorbitol eller en egnet erstatning for sorbitol. Sammensetninger av IL-17RA-antigenbindende protein fremstilles for lagring ved å blande den valgte bestanddel med den ønskede renhetsgrad med valgfrie formuleringsmidler (Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra) i form av en frysetørket kake eller en vandig løsning.

Videre kan det IL-17RA-antigenbindende proteinprodukt utformes som et lyofilisat ved anvendelse av egnede eksipienser, slik som sukkrose.

De farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan velges for parenteral administrering. Alternativt kan sammensetningene velges for inhalering eller for administrering via fordøyelseskanalen, slik som oralt. Fremstillingen av slike farmasøytisk aksepterbare sammensetninger ligger innen teknikkens stand.

Formuleringsbestanddelene foreligger fortrinnsvis i konsentrasjoner som er akseptable for administreringssetet. I visse utførelser anvendes buffere for å holde sammensetningen ved en fysiologisk pH eller en noe lavere pH, typisk innenfor et pH-område fra tilnærmet 5 til tilnærmet 8.

Dersom man tenker seg parenteral administrering, kan de terapeutiske sammensetningene for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse foreligge i form av en pyrogenfri, parenteralt akseptabelt vandig løsning som omfatter det ønskede IL-17RA-antigenbindende protein i et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Spesielt godt egnet bærestoff for parenteral injeksjon er sterilt, destillert vann i hvilket det IL-17RA-antigenbindende proteinet er formulert som en steril, isoton løsning konservert på egnet vis. Fremstillingen kan omfatte formulering av det ønskede molekylet med et middel, slik som injiserbare mikrokuler, bioeroderbare partikler, polymere forbindelser (slik som polymelkesyre eller polyglykolsyre), kuler eller liposomer som kan gi en kontrollert eller vedvarende frigjøring av produktet, som kan administreres ved depotinjeksjon. I visse utførelser kan hyaluronsyre også anvendes, og dette har virkningen at en forlenget levetid i sirkulasjonen fremmes. Implanterbare legemiddel tilførsels-innretninger kan anvendes for innføring av det ønskede antigenbindende protein.

Farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan utformes for inhalering. I disse utførelsene formuleres de IL-17RA-antigenbindende proteinene fortrinnsvis som et tørt, inhalerbart pulver. Det kan også formulers inhaleringsløsninger av det IL-17RA-antigenbindende proteinet med en drivgass for aerosoltilførsel. Løsninger kan nebuliseres. Pulmonal administrering og formuleringsfremgangsmåter for dette beskrives videre i internasjonal patentsøknad publisert som WO1994/020069 som beskriver pulmonal administrering av kjemisk modifiserte proteiner. Det omfattes også at formuleringer kan administreres oralt. IL-17RA-antigenbindende proteiner som administreres på denne måten kan formuleres med eller uten bærestoffer som sedvanlig anvendes ved formulering av faste doseringsformer som tabletter og kapsler. I visse utførelser kan en kapsel formuleres til å frigjøre den aktive del av formuleringen på det punkt i mage-tarmkanalen hvor biotilgjengeligheten er maksimal og den pre-systemiske degradering er minimal. Andre midler kan inngå for å fremme absorpsjonen av det IL-17RA-antigenbindende protein.

Fortynningsmidler, smaksstoffer, vokser med lavt smeltepunkt, vegetabilske oljer, smøremidler, suspensjonsmidler, tablettdesintegrerende midler og bindestoffer kan også benyttes.

En farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis utformet til å omfatte en effektiv mengde av ett eller flere IL-17RA-antigenbindende proteiner i blanding med ikke-toksiske eksipienser som er egnet for fremstilling av tabletter. Ved å løse tablettene i sterilt vann eller et annet egnet bærestoff, kan løsninger fremstilles i enhetsdose form. Egnede eksipienser omfatter for eksempel inerte fortynningsmidler, slik som kalsiumkarbonat, natriumkarbonat eller natriumbikarbonat, laktose eller kalsiumfosfat, eller bindemidler, slik som stivelse, gelatin eller akasie, eller smøremidler slik som magnesiumstearat, stearinsyre eller talkum.

Andre farmasøytiske sammensetninger vil være åpenbare for fagpersonen, inkludert formuleringer som omfatter IL-17RA-antigenbindende proteienr i formuleringer for vedvarende eller kontrollert tilførsel. Teknikker for formulering av en rekke andre midler for vedvarende eller kontrollert administrering, for eksempel liposombærere, bioeroderbare mikropartikler eller porøse kuler og depot-injeksjoner er også kjente blant fagfolk. Se for eksempel internasjonal patentsøknad publisert som WO1993/015722, som beskriver kontrollert frigjøring fra porøse, polymere mikropartikler for administrering av farmasøytiske sammensetninger. Sammensetninger for vedvarende frigjøring kan inbefatte semipermeable, polymere støttemidler i form av utformede gjenstander, slik som filmer eller mikrokapsler. Støttemidler for vedvarende frigjøring kan omfatte polyestere, hydrogeler, polylaktider (som beskrevet i US patentskrift nr. 3 773 919 og europeisk patentsøknad EP 058481), kopolymerer av L-glutaminsyre og gamma-etyl-L-glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers, 2:547-556), poly-(2-hydroksyetylinetakrylat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 og Langer, 1982, Chem. Tech., 12:98-105), etylenvinylacetat (Langer et al., 1981, supra) eller poly-D(-)-3-hydroksysmørsyre (europetisk patentsøknad EP 133 988). Sammensetninger for vedvarende frigjøring kan også omfatte liposomer, som kan fremstilles ved hvilken som helst av flere fremgangsmåter som er kjente innen faget. Se for eksempel Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692, og de europeiske patentsøknadene EP 036 676, EP 088 046 og EP 143 949.

Farmasøytiske sammensetninger som anvendes for in vivo-administrering foreligger typisk som sterile sammensetninger. Sterilisering kan oppnås ved filtrering gjennom sterilfiltrerings-membraner. Dersom sammensetningen er frysetørket, kan sterilisering ved anvendelse av denne fremgangsmåten utføres enten før eller etter frysetørking og rekonstituering. Sammensetninger for parenteral administrering kan lagres i frysetørket form eller i løsning. Parenterale sammensetninger plasseres generelt i en beholder med en åpning for steril tilgang, for eksempel en pose for intravenøse løsninger eller en medisinflaske med en kork som kan gjennomtrenges av en hypoderm kanyle.

Selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som kan anvendes som farmasøytiske sammensetninger er beskrevet her, og som beskrevet i internasjonal patentsøknad publisert som WO2006/138181. Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein, i hvilke den totale saltkonsentrasjon er lavere enn 150 mM.

Selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein er beskrevet som videre omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein og én eller flere polyoler og/eller én eller flere surfaktanter. Selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein kan omfatte et IL-17RA-antigenbindende protein i hvilke den totale saltkonsentrasjon er lavere enn 150 mM, og som videre omfatter én eller flere eksipienter, inkludert for eksempel farmasøytisk aksepterbare salter, osmotisk balanserende midler (tonisitetsmidler), surfaktanter, polyoler, antioksidanter, antibiotika, antimykotiske midler, massegivende midler, lyoprotektanter, anti-skum midler, chelateringsmidler, konserveringsmidler, fargestoffer og analgetiske midler. Selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein kan omfatte et IL-17RA-antigenbindende protein, og ett eller flere andre farmasøytisk aktive midler.

Selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigen-bindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein ifølge oppfinnelsen er beskrevet, i hvilke det IL-17RA-antigenbindende proteinet har en bufferkapasitet per enhetsvolum per pH-enhet som minst tilsvarer tilnærmet: 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,50, 8,00, 10,0, 15,0, 20,0, 30,0, 40,0, 50,0, 75,0, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 70, 1 000, 1 500, 2 000, 2 500, 3 000, 4 000 eller 5 000 mM natriumacetatbuffer i rent vann over pH-området fra 5,0 til 4,0 eller fra 5,0 til 5,5, eller minst 2,0 mM, minst 3,0 mM, minst 4,0 mM, minst 5,0 mM, minst 7,5 mM, minst 10 mM eller minst 20 mM.

Selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigen-bindende protein er beskrevet i hvilke bufferkapasiteten per enhetsvolum per pH-enhet i formuleringen, idet det ikke tas hensyn til proteinets bufferkapasitet, kan være lik eller mindre enn bufferkapasiteten til 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,0 eller 5,0 mM natriumacetatbuffer i rent vann over pH-området fra 4,0 til 5,0 eller fra 5,0 til 5,5, eller om ønskelig lavere enn buffer-kapasiteten til 1,0 mM, om ønskelig lavere enn bufferkapasiteten til 2,0 mM, om ønskelig lavere enn bufferkapasiteten til 2,5 mM, om ønskelig lavere enn bufferkapasiteten til 3,0 mM og om ønskelig lavere enn bufferkapasiteten til 5,0 mM.

Selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigen-bindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein ifølge oppfinnelsen er beskrevet, i hvilke bufferkapasiteten til det IL-17RA-antigenbindende proteinet over området fra pluss eller minus 1 pH-enhet blant uformingens pH er minst tilnærmet: 1,00 1,50, 1,63, 2,00, 3,00, 4,00, 5,00, 6,50, 8,00, 10,0, 15,0, 20,0, 30,0, 40,0, 50,0, 75,0, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 700, 1 000, 1 500, 2 000, 2 500, 3 000, 4 000 eller 5 000 mEkv per liter per pH-enhet, om ønskelig minst tilnærmet 1,00, om ønskelig minst tilnærmet 1,50, om ønskelig minst tilnærmet 1,63, om ønskelig minst tilnærmet 2,00, om ønskelig minst tilnærmet 3,00, om ønskelig minst tilnærmet 5,0, om ønskelig minst tilnærmet 10,0 og om ønskelig minst tilnærmet 20,0. Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein, hvor formuleringens bufferkapasitet per enhetsvolum per pH-enhet over området fra pluss eller minus 1 pH-enhet fra formuleringens pH, idet det ikke tas hensyn til bufferkapasiteten til det IL-17RA-bindende protein, er lik eller lavere enn bufferkapasiteten til 0,50, 1,00, 1,50, 2,00, 3,00, 4,00, 5,00, 6,50, 8,00, 10,0, 20,0 eller 25,0 mM natriumacetatbuffer i rent vann over pH-området fra 5,0 til 4,0 eller fra 5,0 til 5,5.

Beskrevt her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigen-bindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein, hvor proteinet over et område fra pluss eller minus 1 pH-enhet fra en ønsket pH tilveiebringer minst tilnærmet 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% eller 99,5% av formuleringens bufferkapasitet, om ønskelig minst tilnærmet 75%, om ønskelig minst tilnærmet 85%, om ønskelig minst tilnærmet 90%, om ønskelig minst tilnærmet 95%, om ønskelig minst tilnærmet 99% av formuleringens bufferkapasitet.

Beskrevt her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigen-bindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein, hvor konsentrasjonen av det IL-17RA-antigenbindende proteinet er mellom tilnærmet: 20 og 400, 20 og 300, 20 og 250, 20 og 200 eller 20 og 150 mg/ml, om ønskelig mellom tilnærmet 20 og 400 mg/ml, om ønskelig mellom tilnærmet 20 og 250 og om ønskelig mellom tilnærmet 20 og 150 mg/ml.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein, i hvilke den pH som opprettholdes av buffervirkningen av det IL-17RA-antigenbindende proteinet er mellom tilnærmet: 3,5 og 8,0, 4,0 og 6,0, 4,0 og 5,5 eller 4,0 og 5,0, om ønskelig mellom tilnærmet 3,5 og 8,0 og om ønskelig mellom tilnærmet 4,0 og 5,5.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigen-bindende protein som omfatter en IL-17RA-antigenbindende protein, i hvilke saltkonsentrasjonen er lavere enn: 150 mM, 125 mM, 100 mM, 75 mM, 50 mM eller 25 mM, om ønskelig 150 mM, om ønskelig 125 mM, om ønskelig 100 mM, om ønskelig 75 mM, om ønskelig 50 mM og om ønskelig 25 mM.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigen-bindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein, og ett eller flere farmasøytisk aksepterbare salter, polyoler, surfaktanter, osmotisk balanserende midler, tonisitetsmidler, antioksidanter, antibiotika, antimykotiske midler, massegivende midler, lyoprotektanter, anti-skummemidler, chelateringsmidler, konserveringsmidler, fargestoffer, analgetiske midler eller andre farmasøytiske midler.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein og én eller flere farmasøytisk aksepterbare polyoler i en mengde som er hypoton, isoton eller hyperton, fortrinnsvis tilnærmet isoton, spesielt foretrukket isoton, for eksempel én eller flere av sorbitol, mannitol, sukkrose, trehalose eller glyserol, om ønskelig tilnærmet 5% sorbitol, 5% mannitol, 9% sukkrose, 9% trehalose eller 2,5% glyserol.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som omfatter en IL-17RA-antigenbindende protein og som videre omfatter en surfaktant, fortrinnsvis én eller flere av polysorbat 20, polysorbat 80, andre fettsyreestere av sorbitan, polyetoksylater og poloksamer 188, fortrinnsvis polysorbat 20 eller polysorbat 80, om ønskelig tilnærmet 0,001 til 0,1% polysorbat 20 eller polysorbat 80, om ønskelig tilnærmet 0,002 til 0,02% polysorbat 20 eller polysorbalt 80, eller om ønskelig fra 0,002 til 0,02% polysorbat 20 eller polysorbat 80.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein, hvor formuleringen er steril og egnet for behandling av et humant eller ikke-humant individ.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein og et løsemiddel, hvor det IL-17RA-antigenbindende proteinet har en bufferkapasitet per enhetsvolum per pH-enhet som minst tilsvarerer bufferkapasiteten av 4,0 mM natriumacetat i vann over området fra pH 4,0 til 5,0, eller fra pH 5,0 til 5,5, hvor bufferkapasiteten per enhetsvolum av formuleringen, idet man ikke tar hensyn til det IL-17RA-antigenbindende protein, er lik med eller lavere enn bufferkapasiteten til 2,0 mM natriumacetat i vann over de samme pH-områder, fortrinnsvis bestemt på samme måte.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein og et løsemiddel, hvor proteinets bufferkapasitet ved formuleringens pH er minst 1,63 mEkv per liter for en pH-endring av formuleringen på pluss eller minus 1 pH-enhet, hvor buffer-kapasiteten til formuleringen, idet det ikke tas hensyn til proteinet, er lik eller lavere enn 0,81 mEkv per liter ved formuleringens pH for en pH-endring på pluss eller minus 1 pH-enhet.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigen-bindende protein som omfatter et IL-17RA-antigenbindende protein, hvor formuleringen foreligger i form av frysetørket materiale som etter rekonstituering gir en formulering i samsvar med hvilket som helst av de ovenfor nevnte eller påfølgende punkter.

Beskrevet her er selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigen-bindende protein i et sett som omfatter én eller flere beholdere som inneholder en selv-bufrende formulering av IL-17RA-antigenbindende protein eller en frysetørket selv-bufrende formulering av IL-17RA-antigenbindende protein i samsvar med hvilket som helst av punktene ovenfor eller nedenfor og instruksjoner vedrørende anvendelsen derav.

I én utførelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en selv-bufrende formulering av IL-17RA-antigenbindende protein eller en frysetørket formulering derav ifølge hvilket som helst av punktene ovenfor eller nedenfor, som omfatter fjerning av gjenværende buffer ved anvendelse av et mot-ion.

Beskrevet her er en fremgangsmåte for fremstilling av en selv-bufrende formulering av IL-17RA-antigenbindende protein eller en frysetørket formulering derav ifølge hvilket som helst av punktene ovenfor eller nedenfor, som omfatter fjerning av gjenværende buffer ved anvendelse av én eller flere av følgende i nærvær av et mot-ion: kromatografi, dialyse og/eller tangentstrøm filtrering.

Beskrevet her er en fremgangsmåte for fremstilling av en selv-bufrende formulering av IL-17RA-antigenbindende protein eller en frysetørket formulering derav ifølge et hvilket som helst av punktene ovenfor eller nedenfor, som omfatter fjerning av gjenværende buffer ved anvendelse av tangentstrømfiltrering.

Beskrevet her er en fremgangsmåte for fremstilling av en selv-bufrende formulering av IL-17RA-antigenbindende protein eller en frysetørket formulering derav ifølge et hvilket som helst av punktene ovenfor eller nedenfor, som omfatter trinnet å dialysere mot en løsning ved en pH som ligger under preparatets pH og, om nødvendig, påfølgende justering av pH ved tilsetning av fortynnet syre eller fortynnet base.

Som diskutert ovenfor tilveiebringer disse selv-bufrende proteinsammensetninger av IL-17RA-antigenbindende proteiner, fortrinnsvis farmasøytiske proteinsammensetninger av IL-17RA-antigenbindende proteiner, som omfatter, i tillegg til det IL-17RA-antigenbindende proteinet én eller flere eksipienser, slik som eksipiensene som har blitt beskrevet i denne seksjonen eller annensteds her. Eksipienser kan anvendes i oppfinnelsen i denne sammenheng for et bredt valgt av formål, slik som justering av formuleringers fysiske, kjemiske eller biologiske egenskaper, slik som justering av viskositeten, og/eller fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen for forbedring av effektiviteten og/eller for stabilisering av slike formuleringer, og fremgangsmåter mot degradering og ødeleggelse grunnet for eksempel belastninger som opptrer under fremstillingen, transporten, lagringen, klargjøringen før bruk, tilførselen og deretter.

En rekke oversikter er tilgjengelige vedrørende proteinstabilisering og formuleringsmaterialer og fremgangsmåter som er anvendbare i denne sammenheng, slik som Arakawa et al., ”Solvent interactions in pharmaceutical formulations”, Pharm RRes., 8(3): 285-91 (1991), Kendrick et al., ”Physical stabilization of proteins in aqueous solution” i Rational Design of Stable Protein Formulations: Theory and Practice, Carpenter og Manning, red., Pharmaceutical Biotechnology, 13: 61-84 (2002), og Randolph et al., ”Surfactant-protein interactions”, Pharm Biotechnol., 13: 159-75 (2002), særlig når det gjelder deler som omhandler eksipienser og fremgangsmåter for selvbufrende proteinformuleringer i samsvar med den foreliggende oppfinnelse, særlig når det gjelder proteinbaserte, farmasøytiske produkter og fremgangsmåter for veterinær- og/eller humanmedisinsk anvendelse.

Forskjellige eksipienser som er anvendbare i oppfinnelsen er opplistet i Tabell 3 og beskrives videre nedenfor.

Tabell 3 Typer av eksipienser og deres funksjon

Salter kan, i samsvar med visse utførelser av oppfinnelsen, anvendes for, for eksempel å justere en selv-bufrende formulerings ionestyrke og/eller isotonisitet og/eller for å forbedre løseligheten og/eller den fysiske stabilitet av et selv-bufrende protein eller en annen bestanddel i et selv-bufrende proteinsammensetning i samsvar med oppfinnelsen.

Som kjent kan ioner stabilisere proteiners native tilstand ved å bindes til ladede aminosyrerester på proteinets overflate og ved å skjerme ladede og polare grupper i proteinet og redusere styrken av deres elektrostatiske interaksjoner, tiltrekkende og frastøtende interaksjoner. Ioner kan også stabilisere et proteins denaturerte tilstand ved spesielt å bindes til peptidbindinger (-CONH) i det denaturerte protein. Videre kan ionisk interaksjon med ladede og polare grupper i et protein også redusere intermolekylære elektrostatiske interaksjoner og derved forebygge eller redusere aggregering av proteinet og uløselighet.

Forskjellige ioner har signifikant forskjellige virkninger på proteiner. En rekke kategoriske rangeringer av ioner og deres virkninger på proteiner har blitt utviklet, og disse kan anvendes ved en formulering av selv-bufrende proteinsammensetninger i samsvar med oppfinnelsen. Ett eksempel er Hofmeister-serier, som rangerer ioniske og polare, ikkeioniske løste stoffer ut fra virkningen på proteiners konformasjonsstabilitet i løsning.

Stabiliserende løste stoffer beregnes ”kosmotrope”. Destabiliserende løste stoffer betegnes kaotrope. Kosmotroper anvendes vanligvis i høye konsentrasjoner (f. eks. >1 molar ammoniumsulfat) for å utfelle proteiner fra løsning (”utsalting”). Kaotroper anvendes vanligvis for denaturering og/eller solubilisering av proteiner (”innsalting”). Den relative effektiviteten av ioner for ”innsalting” og ”utsalting” definerer deres posisjon i Hofmeisterserien.

I tillegg til deres nytteverdi og ulemper (som diskutert ovenfor), er salter også effektive for å redusere protienformuleringers viskositet og kan anvendes i oppfinnelsen for dette formål.

For å bevare isotonisiteten i en parenteral formulering i samsvar med foretrukne utførelser av oppfinnelsen, for å forbedre proteinets løselighet og/eller stabilitet, for å forbedre viskositetsegenskapene, for å unngå uheldige saltvirkninger på proteinets stabilitet og aggregering og for å forhindre saltformidlet proteindegradering, er saltkonsentrasjonen i selv-bufrende formuleringer i samsvar med forskjellige foretrukne utførelser av oppfinnelsen lavere enn 150 mM (når det gjelder monovalente ioner) og 150 mEvk/liter for multivalente ioner. I denne sammenheng er den totale saltkonsentrasjon i disse spesielt foretrukne utførelser av oppfinnelsen fra tilnærmet 75 mEkv/l til tilnærmet 140 mEkv/l.

Frie aminosyrer kan i samsvar med forskjellige utførelser av oppfinnelsen anvendes i selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein som massegivende midler, stabilisatorer og antioksidanter, så vel som for andre standard anvendelser.

Aminosyrer som inngår i de selv-bufrende formuleringene av IL-17RA-antigenbindende protein tilfører imidlertid ikke buffervirkning. Av denne grunn benyttes aminosyrer med signifikant bufferkapasitet enten ikke, de benyttes ikke ved en pH rundt hvilken de har signifikant bufferaktivitet, eller de benyttes i lav konsentrasjon, slik at deres bufferkapasitet i formuleringen følgelig er ikke er signifikant. Dette gjelder spesielt histidin og andre aminosyrer som ofte anvendes som buffere i farmasøytiske formuleringer.

Ut fra betraktningene ovenfor kan lysin, prolin, serin og alanin anvendes for stabilisering av proteiner i en formulering. Glysin er nyttig ved frysetørking for å sikre en korrekt kakestruktur og korrekte kakeegenskaper. Arginin kan være nyttig for å inhibere proteinaggregering, både i flytende og frysetørkede formulering. Metionin er anvendbar som antioksidant.

Polyoler omfatter sukkere, f. eks. mannitol, sukkrose, sorbitol og polyhydriske alkoholer, slik som for eksempel glyserol og propylenglykol, og, for diskusjonsformålene her, polyetylenglykol (PEG) og beslektede forbindelser. Polyoler er kosmotrope. De er anvendbare stabiliseringsmidler i både flytende og frysetørkede formulering for beskyttelse av proteiner mot fysiske og kjemiske degraderingsprosesser. Polyoler er også anvendbare for justering av formuleringers tonisitet.

Blant polyolene som er anvendbare i valgte utførelser av oppfinnelsen er mannitol, som ofte anvendes for å sikre en strukturell stabilitet av kaken i frysetørkede formulering. Mannitol sikrer kakens strukturelle stabilitet. Forbindelsen anvendes vanligvis sammen med en lyoprotektant, f. eks. sukkrose. Sorbitol og sukkrose er blant de foretrukne midlene for justering av tonisiteten og som stabilisatorer for beskyttelse mot fryse/tine-stress under transport eller ved fremstilling av større mengder under fremstillingsprosessen.

Reduserende sukkere (som inneholder frie aldehyd- eller ketongrupper), slik som glukose og laktose, kan glysere lysin- og argininrester på overflaten. Disse er følgelig vanligvis ikke blant de foretrukne polyolene for anvendelse i samsvar med oppfinnelsen. I tillegg er sukkere som danner slike reaktive molekyler, slik som sukkrose, som hydrolyseres til fruktose og glukose under sure betingelser, og som følgelig fremmer glysering, også ikke blant de foretrukne aminosyrene ifølge oppfinnelsen i denne sammenheng. PEG er anvendbart for stabilisering av proteiner og som kryoprotektant og kan anvendes i oppfinnelsen i denne sammenheng, slik som det er i RECOMBINATE.

De selv-bufrende formuleringene av IL-17RA-antigenbindende protein kan videre omfatte surfaktanter. Proteinmolekyler kan være mottaglige for adsorpsjon til overflater og denaturering og påfølgende aggregering i luft-væske grenseflater, faststoff-væske grenseflater og væske-væske grenseflater. Disse virkningene skaleres vanligvis invert med proteinkonsentrasjonen. Disse skadelige interaksjonene skalerer vanligvis invert med proteinkonsentrasjonen og forverres typisk ved fysisk agitasjon, slik som agitasjon som oppstår under transport og håndtering av et produkt.

Surfaktanter anvendes rutinemessig for å forhindre, minimalisere eller redusere overflateabsorpsjon. Egnede surfaktanter i oppfinnelsen i denne sammenheng omfatter polysorbat 20, polysorbat 80, andre fettsyreestere av sorbitan, polyetoksylater og poloksamer 188.

Surfaktanter anvendes også ofte for å kontrollere proteiners konformasjonsstabilitet. Anvendelsen av surfaktanter i denne sammenheng er proteinspesifikk, siden en gitt surfaktant typisk vil stabilisere noen proteiner og destabilisere andre.

Polysorbater er utsatt for oksidativ degradering og inneholder ofte, som de leveres, tilstrekkelige mengder av peroksider til å medføre oksidasjon av aminosyre sidekjder i proteiner, særlig metionin. Følgelig bør polysorbater anvendes forsiktig og bør, dersom de anvendes, benyttes i sin laveste effektive konsentrasjon. I denne sammenheng er polysorbater et eksempel på den generelle regel at eksipienser bør anvendes i sin laveste effektive konsentrasjon.

De selv-bufrende formuleringene av IL-17RA-antigenbindende protein kan videre omfatte én eller flere antioksidanter. I en viss grad kan skadelig oksidasjon av proteiner forhindres i farmasøytiske formuleringer ved å opprettholde et egnet nivå av oksygen i omgivelsene og en egnet temperatur, og ved å unngå eksponering ovenfor lys. Eksipienser som er antioksidanter kan også anvendes for å forhindre oksidativ degradering av proteiner.

Blant anvendbare og antioksidanter i denne sammenheng er reduksjonsmidler, oksygen/fri radikal-fjernere og chelateringsmidler. Antioksidanter for anvendelse i terapeutiske proteinformuleringer i samsvar med oppfinnelsen er fortrinnsvis vannløselige og bevarer aktiviteten gjennom produktets lagringstid. EDTA er en foretrukket antioksidant i samsvar med oppfinnelsen i denne sammenheng, og kan anvendes i oppfinnelsen på stort sett den samme måte som forbindelsen har blitt anvendt i formuleringer av sur fibroblast vekstfaktor og i produkter som KINERET og ONTAK.

Antioksidanter kan skade proteiner. For eksempel kan reduksjonsmidler, særlig glutation, bryte intramolekylære disulfidbindinger. Antioksidanter for anvendelse i oppfinnelsen er følgelig valgt slik at man blant annet eliminerer eller i tilstrekkelig grad reduserer muligheten for at de selv skal kunne skade proteiner i formuleringen.

Formuleringer kan omfatte metallioner som er protein ko-faktorer og som er nødvendige for dannelse av protein koordinasjonskomplekser, slik som sink, som er nødvendig for dannelse av disse insulinsuspensjoner. Metallioner kan også inhibere noen prosesser som degraderer proteiner. Imidlertid katalyserer metallioner også fysiske og kjemiske prosesser som degraderer proteiner.

Magnesiumioner (10 – 120 mM) kan anvendes for å inhibere isomerisering av asparaginsyre til isoasparaginsyre. Ca<2+>-ioner (opp til 100 mM) kan øke stabiliteten av human deoksyribonuklease (rhDNase, Pulmozyme). Mg<+2>, Mn<+2 >og Zn<+2 >kan imidlertid destabilisere rhDNase. På tilsvarende måte kan Ca<+2 >og Sr<+2 >stabilisere Faktor VIII, som kan destabiliseres av Mg<+2>, Mn<+2 >og Zn<+2>, Cu<+2 >og Fe<+2>, og aggregeringen kan økes av Al<+3>-ioner.

De selv-bufrende formuleringene av IL-17RA-antigenbindende protein kan videre omfatte ett eller flere konserveringsmidler. Konserveringsmidler er nødvendige ved utvikling av parenterale fler-doseformuleringer som omfatter mer enn ett uttak fra samme beholder. Primærfunksjonen er å inhibere mikrobiell vekst og sikre produktets sterilitet gjennom lagringstiden eller anvendelsestiden for legemiddelproduktet. Alminnelig anvendt konserveringsmidler omfatter benzylalkohol, fenol og m-kresol. Selv om konserveringsmidler har en lang historie med anvendelse sammen med lavmolekylære parenterale midler, kan utviklingen av proteinformuleringer som omfatter konserveringsmidler være utfordrende. Konserveringsmidler har nær sagt alltid en stabiliserende virkning (aggregering) på proteiner, og dette har blitt en viktig faktor som begrenser anvendelsen av dem i fler-dose proteinformuleringer. Til nå har de fleste proteinlegemidler blitt utformet for engangsbruk. Dersom fler-doseformuleringer er mulige, har de imidlertid den ekstra fordel at de gjør det enklere for pasienten og øker markedsføringsmulighetene. Et godt eksempel er humant veksthormon (hGH), hvor utviklingen av konserverte formuleringer har ført til kommersialisering av mer hendige injeksjons-penn formuleringer for flere gangers bruk. Minst fire slike penn-inretninger som inneholder konserverte formuleringer av hGH er i dag tilgjengelige på markedet. NORDITROPIN (flytende, Novo Nordisk), NUTROPIN AQ (flytende, Genentech) & Genotropin (frysetørket, to-kammer patron, Pharmacia / Upjohn) inneholder fenol, mens SOMATROPE (Eli Lilly) er formulert med m-kresol.

Flere aspekter må tas i betraktning under formuleringen og utviklingen av konserverte doseringsformer. Den effektive konserverende konsentrasjon i legemiddelproduktet må optimaliseres. Dette krever analyse av et gitt konserveringsmiddel i doseringsformen innenfor konsentrasjonsområder som sikrer anti-mikrobiell effektivitet uten å redusere proteinstabiliteten. For eksempel ble tre konserveringsmidler med hell analysert under utviklingen av en flytende formulering av interleukin-1-reseptor (Type 1) ved anvendelse av differensiell skannende kalorimetri (DSC). Konserveringsmidlene ble rangert basert på virkningen på stabiliteten i konsentrasjoner som ofte anvendes i markedsførte produkter.

Som forventet er utviklingen av flytende formuleringer som inneholder konserveringsmidler mer utfordrende enn frysetørkede formulering. Frysetørkede produkter kan frysetørkes uten konserveringsmidler og rekonstitueres med et fortynningsmiddel som inneholder konserveringsmiddel på anvendelsestidspunktet. Dette reduserer tiden som konserveringsmiddelet er i kontakt med proteinet, og minimaliserer i signifikant grad den medfølgende risiko for stabiliteten. For flytende formuleringer må den konserverende effektivitet og stabiliteten opprettholdes over hele produktets lagringstid (~18 til 24 måneder). Et viktig punkt å merke seg er at konserverende effektivitet må påvises i den endelige formuleringen som inneholder det aktive legemidlet og alle eksipiens komponenter.

Selv-bufrende formuleringer av IL-17RA-antigenbindende protein vil vanligvis utformes for blant annet spesifikke administreringsveier og -fremgangsmåter, for spesifikke administreringsdoser og administreringshyppigheter, for spesifikke behandlinger av spesifikke sykdommer med et område av biotilgjengelighet og varighet.

Formuleringer kan følgelig utformes i samsvar med oppfinnelsen for administrering via hvilken som helst egnet administreringsvei, inkludert for eksempel oral, aural, oftalmisk, rektal og vaginal administrering og for parenteral administrering, inkludert intravenøs og intraarteriell injeksjon, intramuskulær injeksjon og subkutan injeksjon.

Sammensetninger i samsvar med oppfinnelsen kan fremstilles ved anvendelse av velkjente, rutinemessige fremgangsmåter for fremstilling, formulering og anvendelse av proteiner, fortrinnsvis farmasøytiske proteiner. Fremgangsmåter for fremstilling av sammensetningene som omfatter anvendelse av mot-ioner for fjerning av gjenværende bufringsmidler er beskrevet. I denne sammenheng er begrepet mot-ion hvilken som helst polar eller ladd bestanddel som bidrar til å fjerne buffer fra sammensetningen under fremstillingen. Mot-ioner som er anvendbare i denne sammenheng omfatter for eksempel glysin, klorin, sulfat og fosfat. Begrepet mot-ion anvendes i denne sammenheng for å betegne mye det samme som forskyvningsion.

Gjenværende bufringsmidler kan fjernes ved anvendelse av mot-ionene i denne sammenheng ved anvendelse av en rekke forskjellige velkjente fremgangsmåter, inkludert standard fremgangsmåter for dialyse og membran-diffusjonsbaserte fremgangsmåter med høy yteevne, for eksempel tangentstrøm diafiltrering. Fremgangsmåter for fjerning av gjenværende buffer ved benyttelse av et mot-ion kan i denne sammenheng, også i noen tilfeller utføres ved anvendelse av størrelseseksklusjonskromatografi.

Sammensetninger kan fremstilles med en prosess som omfatter dialyse mot en bufferfri løsning ved en pH som ligger under pH i preparatet som inneholder det selvbufrende protein. Den bufferfrie løsningen kan omfatte mot-ioner, særlig mot-ioner som fremmer fjerning av gjenværende buffer og som ikke på uheldig måte påvirker det selvbufrende proteinet i formuleringen. Etter dialyse kan preparates pH justeres til den ønskede pH ved anvendelse av fortynnet syre eller fortynnet base.

Sammensetninger i samsvar med oppfinnelsen kan fremstilles ved en prosess som omfatter tangentstrøm diafiltrering mot en bufferfri løsning ved en pH som ligger under pH i preparatet som inneholder det selv-bufrende proteinet. Den bufferfrie løsningen kan omfatte mot-ioner, fortrinnsvis mot-ioner som fremmer fjerning av gjenværende buffer og som ikke på uheldig måte påvirker det selv-bufrende proteinet eller formuleringen av det. Etter diafiltrering kan preparatets pH justeres til den ønskede pH ved anvendelse av en fortynnet syre eller en fortynnet base.

Etter at den farmasøytiske sammensetningen har blitt formulert, kan den lagres i sterile beholdere som en løsning, suspensjon, gel eller emulsjon, som faststoff, som krystaller eller som et dehydrert eller frysetørket pulver. Slike formuleringer kan lagres enten i en form som er klar for bruk eller i en form (f. eks. frysetørket) som rekonstitueres før administrering. Beskrevet er også sett for fremstilling av en enkeltdose-enhet for administrering. Settene kan hver inneholde både en første beholder med et tørket protein og en andre beholder med en vandig Formulering. Sett kan inneholde ferdig filtersprøyter med ett eller flere kammere (f. eks. sprøyter med væske og lyo-sprøyter).

Den terapeutisk effektive mengde av et farmasøytisk sammensetning som inneholder et IL-17RA-antigenbindende protein som skal benyttes vil for eksempel avhenge av den terapeutiske sammenheng og de terapeutiske formål. En fagperson vil forstå at et egnet doseringsnivå for behandling vil delvis avhenge av det administrerte molekylet, indikasjonen som det IL-17RA-antigenbindende proteinet anvendes for, administreringsveien og pasientens størrelse (kroppsvekt, kroppsareal eller organstørrelse) og/eller tilstand (alder og generell helsetilstand). I visse utførelser kan klinikeren titrere dosen og modifisere administreringsveien for å oppnå den optimale, terapeutiske virkningen. En typisk dose kan variere fra tilnærmet 0,1 μg/kg opp til tilnærmet 30 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene som er nevnt ovenfor. I spesifikke utførelser kan dosen variere fra 0,1 μg/kg opp til tilnærmet 30 mg/kg, om ønskelig fra 1 μg/kg opp til tilnærmet 30 mg/kg eller fra 10 μg/kg opp til tilnærmet 5 mg/kg.

Doseringshyppigheten vil avhenge av de farmakokinetiske egenskapene til det IL-17RA-antigenbindende proteinet som foreligger i den benyttede formuleringen. Typisk vil en kliniker tilføre sammensetningen inntil man oppnår en dose som gir den ønskede virkningen. Sammensetningen kan følgelig administreres som en enkelt dose, eller som to eller flere doser (som kan, men ikke må, inneholde den samme mengde av det ønskede molekylet) over tid, eller som en kontinuerlig infusjon ved hjelp av en implantert innretning eller et kateter. En videre forfining av den egnede dosen utføres rutinemessig av gjennomsnitt-fagfolk og ligger innenfor omfanget av oppgaver som rutinemessig utføres av disse. Egnede doser kan fastsettes ved anvendelse av egnede dose-responsresultater. I visse utførelser kan de antigenbindende proteinene ifølge oppfinnelsen tilføres til pasienter over et lengre tidsrom. Kronisk administrering av et antigenbindende protein ifølge oppfinnelsen minimaliserer den uønskede immunresponsen eller allergiske responsen som ofte er assosiert med antigenbindende proteiner som ikke fult ut er humane, for eksempel et antistoff fremlagt mot et humant antigen i et ikke-humant dyr, for eksempel et ikke fult ut humant antistoff eller et ikke-humant antistoff som er dannet i en ikke-human art.

Administreringsveien for det farmasøytiske preparat er i samsvar med kjente fremgangsmåter, for eksempel oralt, med intravenøs, intraperitoneal, intracerebral (intraparenkymal), intracerebroventrikulær, intramuskulær, intraokkulær, intraarteriell, intraportal eller intralesjonal injeksjon, ved systemer for vedvarende frigjøring eller ved hjelp av implanteringsinnretninger. I visse utførelser kan sammensetningene tilføres ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig ved infusjon, eller via en implanteringsinnretning.

Sammensetningen kan også administreres lokalt ved implantering av en membran, en svamp eller et annet egnet materiale som det ønskede molekylet er absorbert til eller innkapslet i. I visse utførelser kan, dersom en implanteringsinnretning anvendes, innretningen implanteres i hvilket som helst egnet vev eller organ, og administreringen av det ønskede molekylet kan skje ved diffusjon, som en bolus ved tidsbestemt frigjøring eller ved kontinuerlig administrering. Det kan også være ønskelig å anvende farmasøytiske sammensetninger av IL-17RA-antigenbindende proteiner i samsvar med oppfinnelsen ex vivo. I slike tilfeller eksponeres celler, vev eller organer som har blitt fjernet fra pasienten for farmasøytiske sammensetninger av IL-17RA-antigenbindende protein, hvoretter cellene, vevene og/eller organene implanteres tilbake til pasienten.

Nærmere bestemt kan IL-17RA-antigenbindende proteiner administreres ved implantering av visse celler som har blitt genetisk modifisert ved anvendelse av fremgangsmåter som dem som er beskrevet her, slik at de uttrykker og utskiller polypeptidet. I visse utførelser kan slike celler være dyreceller eller humane celler og kan være autologe, heterologe eller xenogeneiske. I visse utførelser kan cellene være immortaliserte. I andre utførelser kan cellene, for å redusere faren for en immunologisk respons, være innkapslet, slik at man unngår infiltrasjon av omliggende vev. I andre utførelser er innkapslingsmaterialene typisk biokompatible, semi-permeable, polymere rom eller membraner som tillater frigjøring av proteinproduktet/ene, men forhindrer ødeleggelse av cellene via pasientens immunsystem eller andre skadelige faktorer fra de omliggende vev.

EKSEMPLER

Eksempel 1

IL-17RA-”knockout”-mus ble fremstilt som beskrevet i Ye et al., 2001, J. Exp. Med., 194:519-527 og analysert i en standard modell for kollagenindusert artritt (CIA). Kort beskrevet ble genomiske kloner som kodet for muse-IL-17R isolert fra et 129-avledet lambda-bibliotek ved anvendelse av en muse-IL-17R-cDNA-probe og kartlagt ved hjelp av en kombinasjon av PCR, restriksjonskutting og sekvensanalyse ved anvendelse av deponerte, genomiske sekvenser som tilsvarte IL-17R-lokus på muse-kromosom 6 (GenBank/EMBL/DDBJ-aksesjonsnr. AC018559). En genstyrings-vektor ble konstruert ved å erstatte 5.7 kb av genomisk sekvens inneholdende eksonene 4-11 (tilsvarende nukleotidene 445-1 172 i muse-IL-17R-cDNA) med en PGKneo-kassett. En tymidinkinasekassett (MC-TK) ble satt inn i vektorens 5’ ende. 129-avledede embryonale stamceller (ES-celler) ble elektroporert med den målstyrende vektoren og selektert i nærvær av G418 og ganciclovir som beskrevet. ES-kloner som bar en ønsket mutasjon i IL-17R ble påvist ved hjelp av en kombinasjon av PCR og genomisk Southern blot-analyse og ble injisert i C57BL/6-blastocyster. De resulterende hannkimerene ble krysset med C57BL/6-hunnmus for fremstilling av mus som var heterozygote for IL-17R-mutasjonen (IL-17R<+/->), og disse ble så krysset med hverandre for fremstilling av IL-17R-manglende mus (IL-17R KO). Disse musene ble forflyttet til en C57BL/6-bakgrunn ved hjelp av fem på hverandre følgende tilbakekrysninger med C57BL/6-mus.

IL-17RA-”knockout”-mus viste reduserte gjennomsnittlige kliniske poeng i CIA-modellen, som vist i Figur 4 (se også Kolls et al., 2001, J. Ex. Med., 194:519-527, Lubberts et al., 2005, supra). I tillegg viste IL-17RA-”knockout”-mus kun 5% forekomst av sykdom, mens villtype mus viste 71% forekomst av sykdom.

Eksempel 2

Histopatologien i CIA-induserte IL-17RA -/- -mus og IL-17RA-uttrykkende mus ble sammenlignet for å bestemme sammenhengen mellom indusert artritt og fravær av IL-17RA-signalisering.

Musene ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 1. Dyrene ble avlivet i en alder på 15-20 uker, og histopatologien i ledd fra de avlivede dyrene ble så undersøkt. Histopatologien for bein og brusk fra IL-17RA -/- -”knockout”-mus og IL-17A/IL-17R-uttrykkende mus (WT C57/BL6 (nr. 2-18)) viste erosjon av subkondral beinet i talus og markant forstyrrelse av leddarkitekturen i tarsale-metatarsale ledd (erosjon av subkondralt bein og leddbrusk), så vel som reaktiv periosteal beindannelse (osteofytose). Histopatologien i ankelledd fra mus som manglet IL-17RA -/- i en eksperimentelt indusert CIA-modell, viste lite leddbetennelse og erosjon av leddbrusk og ben. Den histopatologiske analyse av et ankelledd fra bakpoten til IL-17RA-uttrykkende mus viste derimot markant, kronisk aktiv betennelse. Den signifikant reduserte forekomst av leddbetennelse og erosjon av bein og ledd sammenlignet med WT-mus impliserer videre IL-17RA og IL-17RA-signalisering i betennelse og erosjon.

Eksempel 3

En modell av MOG (myelinoligodendrocytt-glykoprotein)-peptid-indusert EAE i mus som manglet IL-17RA viste en forsinket begynnelse av artritt, så vel som en total reduksjon av kliniske poeng sammenlignet med WT-mus.

IL-17RA-”knockout”-mus ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 1. Figur 5 viser forekomsten og medianverdien for påbegynnelse av artritt som funksjon av tiden for både IL-17RA -/- -mus og IL-17RA-villtype mus. 15 av de 15 IL-17RA-uttrykkende villtypemusene viste symptomer på artritt med en gjennomsnittlig påbegynnelse etter 13 dager. I motsetning til dette viste 14 av 15 IL-17RA -/- -mus symptomer på artritt med en gjennomsnittlig påbegynnelse etter 22 dager (p<0,0001 sammenlignet med villtypen).

De kliniske poengene for IL-17RA -/- ”knockout”-mus viser en lavere gjennomsnittlig, klinisk poengsum med senere påbegynnelse enn for villtype mus. Figur 6 viser reduserte kliniske poeng i IL-17RA -/- -”knockout”-mus sammenlignet med villtype mus i en MOG-indusert modell. IL-17RA -/- -”knockout”-populasjonen viste en signifikant senere påbegynnelse av artritt enn den IL-17RA-uttrykkende villtypepopulasjonen. Videre hadde IL-17RA -/- -”knockout”-populasjonen lavere gjennomsnittlig kliniske poeng for påbegynt artritt ved alle tidspunkter. Den senere gjennomsnittlige påbegynnelsen av artritt og lavere middelverdi for kliniske poeng for artritt som observeres i IL-17RA -/- -mutanter sammenlignet med IL-17RA-uttrykkende villtype dyr impliserer videre IL-17RA-signalisering i betennelse og erosjon.

Eksempel 4

Ovalbuminsensitiviserte og –behandlede IL-17RA- KO-mus viser en signifikant reduksjon av inflammatoriske celler i BAL (bronkoalveolær lavage)-væske sammenlignet med villtype mus. IL-17RA-KO-mus ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 1, og så tilført ovalbumin intranasalt. Antall inflammatoriske celler i IL-17RA-KO-populasjonen ble sammenlignet med den IL-17RA-uttrykkende villtypepopulasjon. Figur 7 viser at IL-17RA-KO-mus har et redusert totalantall av inflammatoriske celler i BAL-væske enn IL-17RA-uttrykkende villtype mus i en ovalbuminindusert astmamodell etter tredje eksponering.

IL-17RA-KO-musepopulasjonen ble sammenlignet med IL-17RA-uttrykkende villtypemus for forekomst av eosinofile celler (A), neutrofile celler (B), lymfocytter (C) og makrofager (D) i BAL-væske i en ovalbuminindusert astmamodell. Figurene 8A-8D viser at IL-17RA-KO-mus har er redusert antall av eosinofile celler (8A), neutrofile celler (8B) og lymfocytter (8C) i BAL-væske sammenlignet med den IL-17RA-uttrykkende villtypepopulasjon. Ingen endringer hva det gjelder antall makrofager i BAL-væske (8D) ble bemerket, verken i villtype mus eller i IL-17RA-KO-mus (naive og OVA-behandlede). Disse resultatene tyder på at IL-17RA-signalisering er viktig i reguleringen av immunmedierte betennelsesresponser.

Eksempel 5

IL-17RA-antistoffet ble vist å redusere forekomsten av artritt i en CIA (kollagenindusert artritt)-musemodell ved profylaktisk og terapeutisk administrering. IL-17RA-inhibering reduserte klinisk artritt på både en profylaktisk og terapeutisk måte for flere modeller av CIA.

Det nøytraliserende muse-IL-17RA-surrogat-mAb administrert profylaktisk reduserte den gjennomsnittlige, kliniske poengsum i en villtype-CIA-modell på en doseavhengig måte. Figur 9 viser den doseavhengig inhibering med IL-17RA-mAb i en villtype-CIA-modell. Musene ble behandlet med enten IL-17RA-mAb eller kontroll-Ig på mandag, onsdag og fredag i 2,5 uker etter forsterkerinjeksjonen. Administrering av 100 μg og 300 μg IL-17RA-antistoff førte til en lavere klinisk poengsum 18 dager etter boostring enn sammenlignet med isotype-kontroll-Ig.

En reduksjon av beintapet og bruskerosjonen i leddet var forbundet med en reduksjon av den gjennomsnittlige kliniske poengsum for dosen på 300 μg av IL-17RA-mAb. Histopatologisk analyse og radiografisk bildeanalyse ble sammenlignet med IgG-kontrollen. For begge analysemåter viste ankelleddet i den bakre poten hos CBA/1-hannmus behandlet med et Il-18R-mAb (isotype-kontroll) en markant betennelse: subkondreal beinerosjon i talus, markant forstyrrelse av leddarkitekturen for tarsale-metatarsale ledd (erosjon av subkondrealt bein og leddbrusk), og reaktiv periosteal beindannelse (osteocytose). I sterk motsetning til dette viste ankelleddet i bakpoten hos en DBA/1-mus behandlet med 300 μg anti-IL-17RA-mAb veldefinerte leddrom, fravær av vev og fravær av periostealt, reaktivt bein eller lytiske lesjoner, noe som viser redusert beintap og bruskerosjon.

Eksempel 6

IL-17RA-inhibering ble også vist å være effektiv i en CIA-modell når doseringen ble innledet etter forekomsten av kliniske tegn (dvs. en terapeutisk doseringsprotokoll) i en villtypemodell og en TNFR p55/p75-KO-modell. Behandlingen ble innledet tilnærmet 6-7 dager etter kollagentilførsel i begge modeller. Figur 10 viser at terapeutisk behandling med anti-IL-17RA-mAb stabiliserte den gjennomsnittlige kliniske poengsum i begge villtype mus. Figur 11 viser at terapeutisk behandling med anti-IL-17RA-mAb stabiliserte den gjennomsnittlige kliniske poengsum i TNFR p55/p75-KO-modeller. Musene ble behandlet med enten et anti-IL-17RA-mAb, anti-IL-1R-mAb eller kontroll-Ig på mandag, onsdag og fredag i 2 uker etter tilfeldig fordeling på terapeutiske behandlingsgrupper. Disse resultatene er representative for 2 uavhengige eksperimenter utført i både villtype- og TNFR p55/p75-KOCIA-modeller. Administrering av anti-IL-17RA-mAb ga en redusert klinisk poengsum sammenlignet med kontroll-IgG i CIA-induserte villtype mus. Overraskende nok stabiliserte den virkningen av anti-IL-17RA-mAb i TNF p55/p75-KO-modellen CIA uavhengig av TNF-signalisering. Disse resultatene tyder på at behandling med IL-17RA-antigenbindende protein kan virke på individer som ikke responderer på anti-TNF-behandling.

Kombinasjonsbehandling med et anti-IL-17RA-antigenbindende protein og anti-TNF-behandling kan være mer gunstig enn hver av disse behandlingene alene.

Eksempel 7

Utviklingen av fullt ut humane, monoklonale antistoffer rettet mot human-IL-17RA ble utført ved anvendelse av Abgenix (nå Amgen Fremont Inc.) XENOMOUSE-teknologi (US patentskrift nr. 6 114 598, 6 162 963, 6 833 268, 7 049 426, 7 064 244, Green et al., 1994, Nature Genetics, 7:13-21, Mendez et al., 1997, Nature Genetics, 15:146-156, Green og Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med., 188:483-495)). Tabell 4 viser de deler av IL-17RA-proteinet som ble anvendt som immunogen og cellelinjer som ble anvendt for fremstilling og analyse av anti-IL-17RA-antistoffer.

Tabell 4

IgG2-XENOMOUSE-mus ble immunisert/boostret med IL-17RA-Fc (gruppe 1) og IL-17RA-FLAG-polyHis (gruppe 2). Serumtiteret ble målt ved ELISA, og musene med de beste titerene ble fusjonert for fremstilling av hybridomer. De resulterende polynklonale supernatantene ble analysert for binding til IL-17RA ved ELISA, og de positive supernatantene ble analysert for binding til IL-17RA-CHO-celler ved FMAT. Positive supernatanter ble analysert videre. IgG2-XENOMOUSE-mus ble immunisert med følgende immunogener: IL-17RA-Fc (gruppe 3) og IL-17RA-FLAG-pHis (gruppe 4), og ble analysert etter ytterligere immuniseringer.

Eksempel 8

Anti-IL-17RA-antistoffene ble karakterisert. Ikke-klonale hybridom-supernatanter ble fremstilt i volumer på 1-2 ml (Ig-konsentrasjonen ble ikke bestemt for disse supernatantene). De ikke-klonale anti-IL-17RA-hybridomsupernatantene ble i utgangspunktet analysert ved FACS for evne til å inhibere binding av biotinylert humant IL-17A til CHO-celler som overuttrykte humant IL-17RA og en annen CHO-cellelinje som over-uttrykte cynomolgus-IL-17RA. Ikke-klonale supernatanter som fullstendig eller nesten fullstendig inhiberte bindingen av humant IL-17A til CHO-huIL-17RA og CHO-cynoIL-17RA ble så analysert i flere fortynninger i en analyse av IL-17A-indusert sekresjon av cytokin/kjemokin ved anvendelse av en cellelinje av fibroblaster fra human forhud (HFF). Ikke-klonale anti-IL-17RA-supernatanter ble inkubert med HFF-celler (5000 celler/brønn i 96-brønners plater) i 30 minutter ved 36<o>C og så stimulert over natten med enten IL-17A (5 ng/ml) alene eller IL-17F (20 ng/ml) og TNF-alfa (5 ng/ml). Supernatanter fra fibroblast-kulturene ble så analysert ved ELISA for nærvær av enten IL-6 eller GRO-alfa. Ikke-klonale anti-IL-17RA-hybridomer ble valgt for subkloning basert på yteevnen i CHO-IL-17RA-FACS-analysen og HFF-bioanalysen. Et eksempel på utvelgelsen vises i Tabellene 5, 6 og 7.

Tabell 5

, ,

I Tabell 5 ble ikke-klonale anti-IL-17RA-hybridomsupernatanter analysert for binding til IL-17RA. Den første halvpart av Tabell 5 viser %positive og gjennomsnittlig fluorescensitensitet (MFI) i resultater fra væskestrømscytometri (dvs. FACS). %Positive viser inhibering av binding av biotin-huIL-17A til huIL-17RA<+>-CHO-celler ved de ikke-klonale hybridomsupernatantene. MFI-kolonnen viser inhibering av binding av biotinylert huIL-17A til cyno-IL-17RA<+>-CHO-celler ved de ikke-klonale hybridom supernatantene. Den andre halvparten av Tabell 5 viser HFF-bindingsintensiteten for de ikke-klonale supernatantene og mAb målt som %intensitet av IL-6-produksjon. De første 2 kolonnene viser en IL-17A/HFF-bioanalyse med ikke-klonale hybridomsupernatanter, mens de siste 4 kolonnene er gjentatte IL-17A/HFF-bioanalyseresultater med ikke-klonale hybridomsupernatanter.

Tabell 6

Tabell 6 viser resultater fra analysen av ikke-klonale IL-17RA-hybridomsupernatanter. Kolonnen %positive og kolonnen MFI viser resultater fra væskestrøms cytometri (FACS). Kolonnen %positive viser inhibering av binding av biotin-huIL-17A til huIL-17RA<+>-CHO-celler ved de ikke-klonale hybridomsupernatantene. MFI-kolonnen viser inhibering av binding av biotinylert huIL-17A til cyno-IL-17RA<+>-CHO-celler ved de ikkeklonale hybridomsupernatantene. De første 2 HFF-bioanalysekolonnene er IL-17A/HFF-bioanalyse med ikke-klonale hybridomsupernatanter, mens de siste 4 bioanalysekolonnene er resultater fra gjentatt IL-17A/HFF-bioanalyse med valgte ikke-klonale hybridomsupernatanter. En rekke supernatanter ble valgt for subkloning.

Tabell 7

Tabell 7 viser resultater fra analyse av ikke-klonale anti-IL-17RA-hybridomsupernatanter. De første to kolonnene er resultater fra væskestrømscytometri (FACS). Kolonnen %positive viser inhibering av binding av biotin-huIL-17A til huIL-17RA<+>-CHO-celler ved de ikke-klonale hybridomsupernatantene. MFI-kolonnen viser inhibering av binding av biotinylert huIL-17A til cynomolgus-IL-17RA<+>-CHO-celler ved de ikke-klonale hybridomsupernatantene. De siste tre kolonnene viser resultater fra IL-17A/HFF-bioanalyse med ikke-klonale hybridomsupernatanter. Supernatetene 6, 18, 19 og 21 ble valgt for subkloning.

Tabell 8

ND = ikke bestemt

Tabell 8 viser IC50-verdier fra IL-17A/HFF-bioanalysen og KD-verdier fra lavresolusjons BIACORE for subklonede hybridomer. Lavere IC50- og KD-verdier i IL-17A/HFF IL-17RA-bindingsanalysene viste at IL-17RA-mAb inhiberte bindingen av IL-17A til IL-17-reseptor A. Antistoffer ble valgt for videre karakterisering basert på lave KD-verdier for inhibering av binding av IL-17A til humant IL-17RA.

Eksempel 9

Humane IL-17RA-mAb-kloner med tung kjede- og lett kjedesekvensene (AMH22/AML22), (AMH19/AML19), (AMH18/AML18) og (AMH14/AML14) ble valgt for videre karakterisering ved bioanalyse. Tabell 9 nedenfor viser IC50-verdier for de valgte Ab i HFF-bioanalyse og en bioanalyse med primære lungefibroblaster mot både IL-17A og IL-17F.

Tabell 9

De valgte humane mAb inhiberte bindingen av IL-17A til IL-17RA. I tillegg til de lavere IC50-verdiene som ble observert for binding av IL-17A til IL-17RA viste de valgte, humane mAb reduserte IC50-vrdier for inhibering av bindingen av IL-17F til IL-17RA (kolonne nr. 2). Følgelig inhiberer de valgte humane mAb både IL-17A – IL-17RA-binding og IL-17F – IL-17RA-binding.

Eksempel 10

Humane IL-17RA-mAb valgt som eksempel, ble analysert i en cynomolgusbioanalyse ved benyttelse av den cynomolgusavledede nyreepitelcellelinjen JTC-12 stimulert med cyanomolgus-IL-17A. Figur 12 viser IL-17RA-mAb med tung kjede- og lett kjedesekvensene (AMH22/AML22), (AMH19/AML19), (AMH18/AML18) og (AMH14/AML14) i inhiberingen av cynomolgus-IL-17A-indusert IL-6-produksjon fra JTC-12-celler. Linjen (---) viser den positive kontrollverdi for cynomolgus-IL-17 i kombinasjon med TNF-alfa. Linjen (-.-.-) viser den positive kontrollverdi for cynomolgus-TNF-alfa. Linjen viser verdien for mediumkontrollen. JTC-12-cellene ble preinkubert i 30 minutter med anti-IL-17RA-mAB og så stimulert over natten med cynomolgus-IL-17A (5 ng/ml) og human TNF-alfa (5 ng/ml). Figur 12 viser at alle antistoffer kunne inhibere cynomolgus-IL-17A fra å bindes til IL-17RA og inhibere IL-17RA-aktivering, bestemt ved IL-6-produksjonen fra JTC-12-cellene. IL-17RA-antistoffet (AMH14/AML14) kunne antagonisere cynomolgus-IL-17A-indusert IL-6-produksjon fra JTC-12-celler med en IC50 på tilnærmet 1,2 nM.

Eksempel 11

In vitro-bindingen av IL-17RA-mAb ble analysert. Bindingsaffininteten av IL-17RA-antistoffer ble målt ved overflate plasmonresonans ved anvendelse av et BIACORE 3000-instrument og standardfremgangsmåter som er kjente innen faget. Antistoffkandidater ble bundet til CM4-brikker derivatisert med anti-humant IgG (H L)-antistoff fra (Jackson Immuno Research, Bar Harbor, ME). En CM4-brikke belagt med anti-humant IgG (H L)-antistoff fra geit, men uten innfanget antistoff ble anvendt som referanse. Løselig huIL-17RA-FLAG-polyHis (SEKV. ID. Nr.: 431) i et konsentrasjonsområde fra 0,46 til 1000 nM fikk strømme over brikkene i 2 minutter (assosiasjonsfasen), fulgt av en 15-30 minutters disossiasjonsfase. FLAG-peptidet Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEKV. ID. Nr.: 447), som er beskrevet i Hopp et al., Bio/Technology, 6:1204, 1988 og US patentskrift nr. 5 011 912, tillater en hurtig analyse og enkel rensing av uttrykt rekombinant protein. Reagenser som er anvendbare for fremstilling av fusjonsproteiner i hvilke FLAG-peptidet er fusjonert til et gitt polypeptid, er kommersielt tilgjengelige (Sigma, St. Lous, MO).

Eksperimentene ble utført ved 25 <o>C med en gjennomstrømmingshastighet på 50 ul/min. Resultatene ble tilpasset en 1:1-modell lokal Rmaks ved anvendelse av BIAEVAL SOFTWARE (v4.1).

Tabell 10

Tabell 10 viser at KD for de humane mAb-klonene var av størrelsesorden 10<-10 >til 10<-9>, hvor klonen med tung kjede- og lett kjedesekvensene (AMH14/AML14) hadde den høyeste affinitet. De kinetiske data for alle de humane monoklonale antistoffene var i samsvar med likevektsresultatene. Antistoffet med den variable tung kjede- og lett kjedesekvens (AMH14/AML14, SEKV. ID. Nr.: 14 henholdsvis SEKV. ID. Nr.: 40) hadde den høyeste affinitet for IL-17RA, så vel som den langsomste av-hastighet.

Eksempel 12

Det agonistiske potensial av et humant IL-17RA-mAb med den variable tung kjedeog lett kjedesekvens (AMH14/AML14) ble analysert in vitro. IL-17RA-mAb (AMH14/AML14) ble analysert for agonistiske virkninger på HFF-celler. IL-17RA-mAb med tung kjede- og lett kjedesekvensene (AMH14/AML14) ble også analysert under betingelser med kryssbinding til anti-humant F(ab’)<2 >fra geit, anti-humant IgG fra geit og anti-humant-IgG fra mus før inkubering på HFF-celler. Rekombinant IL-17RA-mAb AMH14/AML14 i en konsentrasjon på 0, 0,1, 0,5, 1, 1,5 og 10 μg/ml, alene og på forhånd kryssbundet til anti-humant IgG fra mus (Zymed/Invitrogen, San Diego, CA), anti-humant F(ab’)<2 >fra geit (geit-a-h-Fab) og anti-humant IgG fra geit (geit a-h-IgG) ble inkubert over natten med HFF-celler. GRO-alfa ble analysert ved ELISA. IL-17A alene fungerte som positiv kontroll for GRO-alfa-dannelse i dette eksperimentet. Disse resultatene er representative for 2 uavhengige eksperimenter. IL-17RA-mAb (AMH14/AML14) alene hadde ingen virkning på HFF-celler. Forutgående kryssbinding av anti-IL-17RA-mAb (AMH14/AML14) hadde ingen virkning på GRO-alfaproduksjonen fra HFF-celler. Disse resultatene viser at anti-IL-17RA-mAb (AMH14/AML14), enten alene eller på forhånd kryssbundet og inkubert med HFF-celler, var ute av stand til å indusere en GRO-alfa-respons og følgelig ikke er et agonistisk mAb for IL-17RA.

Eksempel 13

Virkningen av kimlinje (GL)-endringene i IL-17RA-mAb AMH14/AML14 ble analysert i HFF-bioanalysen. Figur 13 viser sekvensvariasjonen i rammeverkområdene i SEKV. ID. Nr.: 40 (AML14) sammenlignet med kimlinje aminosyrerestene og virkningen på IC50-verdiene. SEKV. ID. Nr.: 40 (AML40) inneholder fire ikke-kimlinje aminosyrerester i rammeverket, to i FR2 og to i FR3. Standard-fremgangsmåter for seterettet mutagenese ble anvendt for fremstilling av kimlinjeversjonene A og B av AMH14/AML14. Disse variantene ble analysert i IL-17A- og IL-17F-HFF-bioanalyse: HFF-celler ble preinkubert i 30 minutter med forskjellige anti-IL-17RA-mAb og så stimulert over natten med IL-17 (5 ng/ml).

Figur 14 viser at de to variantene som hadde fått tilbakeført aminosyrerestene til kimlinjesekvensen (se Figur 13) hadde redusert IL-17RA-inhiberende aktivitet som innlemmet AMH14/AML14, noe som viser at en viss variasjon i rammeverkområdene ble tolert, men at noen aminosyrerester kan påvirke aktiviteten. Linjen (----) viser den positive kontrollverdi for IL-17-stimulering i fravær av antistoff (tilnærmet 4062 pg/ml). Kontrollen med medium alene ga en verdi på tilnærmet 71 pg/ml.

Figur 15 viser at de to variantene som hadde fått aminosyrerestene tilbakeført til kimlinjesekvensen (se Figur 13) hadde redusert IL-17F-inhiberende aktivitet sammenlignet med AMH14/AML14, noe som viser at en viss variasjon i rammeverkområdene ble tolerert, men at noen aminosyrerester kan påvirke aktiviteten. Den positive kontrollverdi for IL-17F i kombinasjon med TNF-alfa-stimulering i fravær av antistoff var tilnærmet 10 994 pg/ml, verdien for TNF-alfa alene var tilnærmet 1534 pg/ml og kontrollen med medium alene ga en verdi på tilnærmet 55 pg/ml.

Eksempel 14

Undersøkelser ble utført for å faststlå hvor de forskjellige IL-17RA-antigenbindende proteinene (i form av humane antistoffer) bindes til humant IL-17RA. «ForteBio» Octet System er et av flere systemer og teknikker som er tilgjengelige for måling av antistoffbinding. Fremgangsmåtene som ble anvendt for analyse av antistoffbindingen fulgte i det vesentlige produsentens anbefalinger. For mer informasjon, se www.fortebio.com. Kort beskrevet ble streptavidinsensorer («ForteBio») fuktet på forhånd i 10 minutter i PBSAT (1% BSA/PBS 0,05% Tween20 (polyoksyetylensorbitan monolaurat). Biotinylert AMH14/AML14 i en konsentrasjon på 10 ug/ml i PBSAT ble påført sensorene i 900 sekunder. En ny basallinje ble fremstilt over 600 sekunder i PBSAT. Villtype-IL-17RA-FLAG-polyHis (SEKV. ID. Nr.: 431) i en konsentrasjon på 10 ug/ml i PBSAT ble så bundet til sensorene i 900 sekunder. En ny basallinje ble etablert over 600 sekunder i PBSAT. 200 nM av følgende mAb, AMH22/AML22, AMH19/AML19 og AMH18/AML18 ble assosiert i 900 sekunder, fulgt av dissosiasjon over 900 sekunder i PBSAT. Resultatene viste at AMH18/AML18 ikke konkurrerte med AMH14/AML14 om binding, noe som viser at AMH14/AML14 og AMH18/AML18 bindes til forskjellige nøytraliserende determinanter. AMH22/AML22 og AMH19/AML19 bandt seg ikke i nærvær av AMH14/AML14, noe som tyder på at disse tre antistoffene bindes til samme nøytraliserende determinant eller til nøytraliserende determinanter som ligner hverandre, og følgelig anses å gruppere sammen.

Eksempel 15

Krysskonkurranseundersøkelser ble utført for å bestemme IL-17RA-bindingsegenskapene til forskjellige IL-17RA-antistoffer. En modifikasjon av multipleks grupperingsfremgangsmåten som er beskrevet av Jia et al., ble anvendt (se Jia et al., J. Immun. Meth., 2004, 288:91-98). Fremgangsmåten benyttet en Bio-Plex arbeidsstasjon og Bio-Plex-programvare (BioRad, Hercules, CA), så vel som reagenser fra LUMINEX Corp. (Austin, TX). Produsentenes basale fremgangsmåter ble fulgt, bortsett fra hvor annet bemerkes nedenfor (se www.bio-rad.com og www.luminexcorp.com for detaljer). Hver kulekode av streptavidinbelagte LUMINEX-kuler (LUMINEX, #L100-L1XX-01, hvor ”XX” står for kulekoden) ble inkubert i 150 ul 50 ug/ml biotinylert, monovalent anti-human IgG-innfangningsantistoff fra mus (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, produkt nr. 555785) i 1 time ved romtemperatur i mørket, og så vasket tre ganger med PBSAT. Belegget av anti-humant IgG fra mus ble evaluert og kulene kvantifisert ved FACS. Hver kulekode ble inkubert separat med 10 ul anti-IL-17RA-antistoff i 1 time ved romtemperatur, og så vasket. Kulene ble slått sammen og fordelt i en 96-brønners filterplate (Millipore, Billerica, MA, produkt nr. MSBVN1250). 80 ul 2 ug/ml IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431) ble tilsatt til halvparten av brønnene og buffer til den andre halvparten, og platen ble inkubert ved romtemperatur i 1 time og så vasket med PBSAT. 10 ul av et anti-IL-17RA-antistoff ble tilsatt til 1 brønn med IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431) og en brønn uten IL-17RA og inkubert ved romtemperatur i 1 time, hvoretter platen ble vasket med PBSAT. Et irrelevant, humant-IgG (Jackson Labs, Bar Harbor, ME, produkt nr. 009-000-003) inngikk som negativ kontroll. 50 ul PE-konjugert, monovalent anti-humant IgG fra mus (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ nr. 555787) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i 1 time, og så vasket med PBSAT. Det PE-merkede monovalente antistoff vil påvise nærvær av det andre mAb-antistoff som er tilsatt til brønnen, men ikke det første mAb innfanget av det monovalente anti-humant-IgG-antistoff fra mus. Kulene ble resuspendert i 120 ul PBSAT, og minst 100 begivenheter/kulekode ble oppsamlet i Bio-Plex-arbeidsstasjonen ifølge produsentens anbefalte fremgangsmåte.

Den mediane fluorescensintensitet (MFI) for antistoffparet uten IL-17RA ble subtrahert fra MFI-signalet for den tilsvarende reaksjonsblanding inneholdende IL-17RA for normalisering for bakgrunnsstøy. Kriteriene for å avgjøre hvorvidt to antistoffer krysskonkurrerer med hverandre og følgelig ”grupperes” sammen, var et spørsmål om å bestemme i hvilken grad det andre antistoff kunne påvises. Dersom den normaliserte MFI var høyere enn den høyste av følgende tre verdier, ble anti-IL-17RA-antistoffene ansett å bindes samtidig til IL-17RA og ble ansett å foreligge i forskjellige grupper (dvs. at antistoffene ikke konkurrerer med hverandre): den normaliserte MFI er mer enn 3 ganger MFI-verdien for antistoffet i par med seg selv, 3 ganger MFI-verdien for antistoffet i par med en huIgG-kontroll eller en MFI på 300. Vanligvis binder antistoffer som tilskrives forskjellige grupper, forskjellige deler av IL-17RA, mens antistoffer som tilskrives samme gruppe eller de samme gruppene binder deler av IL-17RA som ligner hverandre.

Figur 16A og 16B viser resultatene fra multipleksgruppering av anti-IL-17RA-antistoffer. Skraverte verdier viser antistoffpar som bindes til IL-17RA samtidig, noe som tyder på at disse antistoffene bindes til forskjellige nøytraliserende determinanter.

Innrammede verdier viser antistoffer i par med seg selv, med krysskonkurranse. Følgende monoklonale, humane antistoffer som inneholdt i angitte variable tungkjed-e og lett kjededomener ble analysert: A: AMH11/AML11, B: AMH4/AML4, C: AMH8/AML8, D: AMH7/AML7, E: AMH6/AML6, F: AMH10/AML10, G: AMH18/AML18, H: AMH1/AML1, I:

AMH22/AML22, J: AMH23/AML23, K: AMH14/AML14, L: AMH19/AML19, M: AMH12/AML12, N: AMH17/AML17, O: AMH16/AML16, P: AMH26/AML26, Q: AMH21/AML21 og R: AMH20/AML20.

Figur 16A og 16B viser også at antistoffene A: AMH11/AML11, B: AMH4/AML4, C: AMH8/AML8, D: AMH7/AML7, E: AMH6/AML6, F: AMH10/AML10 og G: AMH18/AML18 konkurrerte med hverandre om binding til humant IL-17RA og følgelig inngår i en definert gruppe (Gruppe 1). Generelt konkurrerte antistoffene I: AMH22/AML22, J: AMH23/AML23, K: AMH14/AML14, L: AMH19/AML19, M: AMH12/AML12, N: AMH17/AML17 og O: AMH16/AML16 med hverandre om binding til humant IL-17RA og inngår følgelig i en definert gruppe (Gruppe 3). Generelt sagt konkurrerte antistoffene i Gruppe 1 ikke med antistoffene i Gruppe 3.

Antistoff H: AMH1/AML1 var unikt i sitt konkurransemønster og utgjorde Gruppe 2, men ligner med på Gruppe 3. Antistoff P: AMH26/AML26 utgjorde Gruppe 4 og viste lite krysskonkurranse med noen av de andre antistoffene, noe som tyder på en nøytraliserende determinant som er unik for dette antistoff. Antistoffene Q: AMH21/AML21 og R:

AMH20/AML20 viste hver for seg unike konkurransemønstere, men med betydelig likhet med Gruppe 3-antistoffer og utgjorde Gruppe 5 henholdsvis 6. Disse resultatene tilveiebringer bevis for flere arter innen en undergruppe av krysskonkurrerende antistoffer.

Eksempel 16

Som beskrevet ovenfor ble antistoffer som binder humant IL-17RA og inhiberer eller nøytraliserer bindingen av IL-17A og/eller IL-17F fremstilt og karakterisert. For å identifisere de nøytraliserende determinantene i humant IL-17RA som disse forskjellige IL-17RA-antistoffene bindes til, ble det konstruert en rekke kimere menneske/mus-IL-17RA-proteiner. Denne fremgangsmåten utnytter ikke-kryssreaktiviteten mellom de forskjellige IL-17RA-antistoffene og muse-IL-17RA. For hver kimer ble et eller to områder i det ekstracellulære domenet i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431) erstattet med tilsvarende områder fra muse-IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 432). Figur 17 viser muse-IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 432) og de fem domenene, A, B, C, D, E og F, som erstatter de tilsvarende domenene i den humane IL-17RA-sekvens. Slike teknikker er kjente innen faget, se for eksempel Stemmer, W.P.C. et al., 1995, Gene, 164:49-53.

Seks enkeltområdekimerer og 8 dobbeltområdekimerer ble fremstilt i pTT5-vektorer. De kimere konstruksjonene A til F (enkeltområde kimerer) ble fremstilt syntetisk ved PCR ved hybridisering av 65-mer ”sense” og ”antisense”-oligonukleotider som strekker seg over proteinet fra et Sal1-sete som ligger 5’ for initieringskodonet til et Not1-sete som ligger 3’ for termineringskodonet. Templatet som ble anvendt i den første PCR-runden var en blanding av oligonukleotider (”sense” og ”antisense”) som spenner over området fra Sal1-setet til Not1-setet. PCR ble utført i 2 trinn som følger:

Dobbeltkimere konstruksjoner ble fremstilt ved kutting av kimerene A til D med restriksjonsenzymene Sal1 og Sac1 og en 3-veis ligering med de Sac1- og Not1-kuttede kimerene E og F med pTT5 som ekspresjonsvektor. Kimerene huIL-17RA-FLAG-polyHis (SEKV. ID. Nr.: 431) og muIL-17RA-FLAG-polyHis (SEKV. ID. Nr.: 432) ble uttrykt transient ved anvendelse av 2936-E-celler (tilgjengelige fra National Research Council of Canada (NRCC), se NRCC-dokument L-11565 for ytterligere informasjon) som vertsceller i rulleflasker. Slike teknikker for transient ekspresjon er velkjente innen faget, se for eksempel Durocher, Y. et al., 2002, Nucleic Acid Res., 15. januar, 30(2):E9.

Supernatantene ble renset ved anvendelse av en HisTrap HP-kolonne ifølge produsentens generelle retningslinjer (GE Healthcare, Piscataway NJ) og eluert ved anvendelse av en standard imidazolgradient (se produsentens anbefalte fremgangsmåter). Renset protein ble avsaltet over i PBS, pH 7,2.

Kimerene ble sammenstilt ved anvendelse av standard analyseverktøy, for eksempel ClustalW (EMBL-EBI). De resulterende, kimere proteinene vises i Figurene 18A-18D. Idet det vises til Figurene 17 og 18A-18D, er Kimer A (SEKV. ID. Nr.: 433) ekstracellulært domene fra humant IL-17RA med musedomene A, Kimer B (SEKV. ID. Nr.: 434) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene B, Kimer C (SEKV. ID. Nr.: 435) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene C, Kimer D (SEKV. ID. Nr.: 436) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene D, Kimer E (SEKV. ID. Nr.: 437) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene E, Kimer F (SEKV. ID. Nr.: 438) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene F, Kimer G (SEKV. ID. Nr.: 439) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene G, Kimer H (SEKV. ID. Nr.: 440) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene B og E, Kimer I (SEKV. ID. Nr.: 441) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene C og E, Kimer J (SEKV. ID. Nr.: 442) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene B og E, Kimer K (SEKV. ID. Nr.: 443) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene A og F, Kimer L (SEKV. ID. Nr.: 444) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene B og F, Kimer M (SEKV. ID. Nr.: 445) er det ekstra-cellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene C og F og Kimer N (SEKV. ID. Nr.: 446) er det ekstracellulære domenet fra humant IL-17RA med musedomene D og F.

Ved anvendelse av fremgangsmåter som tilsvarerer dem beskrevet i Eksempel 15, ble multipleksanalyse ved anvendelse av en Bio-Plex arbeidsstasjon og Bio-Plex programvare (BioRad, Hercules, CA) utført for identifisering av nøytraliserende determinanter i humant IL-17RA ved analyse av den differensielle binding av forskjellige humane IL-17RA-mAb til kimere proteiner sammenlignet med villtype-IL-17RA-proteiner. 12 kulekoder av pentaHis-belagte kuler (Qiagen, Valencia, CA, se www.1.qiagen.com) ble anvendt for innfanging av histidinmerket protein. De 12 kulekodene tillot multipleksing av 11 kimere, humane IL-17RA og villtype human-IL-17RA.

For fremstilling av kulene ble 100 ul villtype-IL-17RA-supernatant fra en kultur med transient ekspresjon og 100 ul 2,5 ug/ml kimert protein bundet til penta-His-belagte kuler over natten ved 4<o>C eller i 2 timer ved romtemperatur under kraftig omristing. Kulene ble vasket ifølge produsentens fremgangsmåter og de 12 kulesetene ble slått sammen og fordelt på 2 eller 3 kolonner i en 96-brønners filterplate (Millipore, Billerica, MA, produkt nr. MSBVN1250) for analysepunkter i duplikat heholdsvis triplikat. 100 ul anti-IL-17RA-antistoff i 4-gangers fortynninger ble tilsatt til brønnene, inkubert i 1 time ved romtemperatur og vasket. 100 ul av en 1:100 fortynning av PE-konjugert anti-humant IgG-Fc (Jackson Labs, Bar Harbor, ME, produkt nr. 109-116-170) ble tilsatt til hver brønn, inkubert i 1 time ved romtemperatur og vasket. Kulene ble resuspendert i 1% BSA, omrystet i 3 minutter og avlest i Bio-Plex-arbeidsstasjonen. Antistoffbindingen til kimert IL-17RA-protein ble sammenlignet med antistoffbindingen til villtype humant IL-17RA fra samme porsjon. En titrering av antistoff over en tilnærmet 5 logaritmeskala ble utført. Den mediane fluorescensintensitet (MFI) for de kimere proteinene ble fremstilt som prosent av det maksimale signal med villtype human-IL-17RA. Mutasjoner (dvs. musedomener) som øker EC50 (uttrykt i nM) for IL-17RA-mAb med 3-ganger eller mer (beregnet ved hjelp av GRAPHPAD PRISM) ble ansett å ha negativ virkning på IL-17RA-mAb-bindingen. Ved hjelp av disse fremgangsmåtene ble de nøytraliserende determinanter for forskjellige IL-17RA-antistoffer identifisert.

Figur 19 er en tabell som oppsummerer evnen til IL-17RA-mAb til å binde de forskjellige kimere proteinene. Skraverte verdier angir hvor IL-17RA-mAb ikke oppfylte kriteriene for binding til det angjeldende kimere protein (”n.d.”, dvs. ”ikke bestemt”, betyr at kimeren ikke ble analysert). Som beskrevet ovenfor er EC50-verdiene tilveiebragt. En verdi på 0 angir at antistoffbindingen var fjernet. Den understrekede verdien ble tilskrevet en EC50-verdi ved hjelp av GRAPHPAD PRISM, selv om titreringskurven i det vesentlige var flat. Tabell 11 viser kontrollverdiene for analysen i nM.

Tabell 11

Som Figure 19 viser, ble minst tre nøytraliserende determinanter identifisert, basert på områdene som påvirket bindingen av nøytraliserende IL-17RA-antistoffer, nemlig Domene B, som strekker seg over aminosyrene 75-96 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), Domene C som strekker seg over aminosyrene 128-154 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431) og Domene D som strekker seg over aminosyrene 176-197 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431). Domene B som strekker seg over aminosyrene 75-96 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431) påvirket negativt bindingen av de nøytraliserende antistoffene AMH1/AML1 og AMH23/AML23. Domene C som strekker seg over aminosyrene 128-154 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), påvirket negativt bindingen av de nøytraliserende antistoffene AMH22/AML22 og AMH23/AML23. Domene D, som strekker seg over aminosyrene 176-197 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), påvirket negativt bindingen av de nøytraliserende antistoffene AMH1/AML1, AMH22/AML22, AMH14/AML14, AMH19/AML19, AMH23/AML23, AMH21/AML21 og AMH20/AML20. Bindingsegenskapene til IL-17RA-antistoffene når det gjelder hvor antistoffene bindes til humant IL-17RA ble bekreftet ved hjelp av dobbeltkimerene. Følgelig anses Domene B, C og D som nøytraliserende determinanter.

Eksempel 17

Som beskrevet ovenfor, ble antistoffer som binder humant IL-17RA og inhiberer eller nøytraliserer bindingen av IL-17A og/eller IL-17F fremstilt og karakterisert. For identifisering av de nøytraliserende determinantene i humant IL-17RA som de forskjellige IL-17RA-antistoffene bindes til, ble det konstruert en rekke mutante IL-17RA-proteiner med argininsubstitusjoner i valgte aminosyreposisjoner i humant IL-17RA. Arginin-skanning er en fremgangsmåte som er anerkjent innen faget for evaluering av hvor antistoffer eller andre proteiner bindes til et annet protein, se for eksempel Nanevicz, T. et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625 og Zupnick, A. et al., 2006, J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473. Vanligvis er argininsidekjeden positiv ladet og relativt voluminøs sammenlignet med andre aminosyrer, noe som kan forstyrre bindingen av antistoff til et område i antigenet hvor mutasjonen er innført. Argininskanning er en fremgangsmåte som avgjør hvorvidt en aminosyre utgjør en del av en nøytraliserende determinant og/eller en epitop.

95 aminosyrer fordelt gjennom hele det ekstracellulære domenet i humant IL-17Ra ble valgt for mutasjon til arginin. Utvelgelsen var rettet mot ladede eller polare aminosyrer for å maksimalisere muligheten for at aminosyreresten foreligger på overflaten og reduserer sannsynligheten for at mutasjonen fører til feilfoldet protein. Figur 20 viser aminosyrerestene som ble erstattet med en argininrest i SEKV. ID. Nr.: 431. Ved anvendelse av standardteknikker som er kjente innen faget, ble ”sense”- og ”antisense”-oligonukleotider som inneholdt de muterte aminosyrerestene utformet basert på kriterier som gis i fremgangsmåten i settet STRATAGENE QUICKCHANGE II (Stratagene/Agilent, Santa Clara, CA). Mutagenese av villtype (WT) huIL-17RA-Flag-pHis ble utført ved anvendelse av et QUICKCHANGE II-sett (Stratagene). Alle kimere konstruksjoner ble konstruert slik at de kodet for en FLAG-histidin-merkelapp (6 histidiner) i karboksyenden av det ekstracellulære domenet, for å forenkle rensing ved hjelp av poly-His-merkelappen.

Multipleksanalyse ved anvendelse av Bio-Plex-arbeidsstasjonen og Bio-Plexprogramvare (BioRad, Hercules, CA) ble utført for identifisering av nøytraliserende determinanter i humant IL-17RA ved å analysere den differensielle binding av forskjellige humane IL-17RA-mAb til argininmutanter sammenlignet med villtype-IL-17RA-proteiner. 12 kulekoder av pentaHis-belagte kuler (Qiagen, Valencia, CA, se www.qiagen.com) ble anvendt for innfanging av histidinmerket protein. De 12 kulekodene tillot multipleksing av 11 IL-17RA-argininmutanter og villtype-humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431).

For fremstilling av kulene ble 100 ul villtype IL-17RA-supernatant og IL-17RA-argininmutant supernatant fra kulturer med transient ekspresjon bundet til penta-Hisbelagte kuler over natten ved 4<o>C eller i 2 timer ved romtemperatur under kraftig omrysting. Kulene ble vasket ifølge produsentens fremgangsmåte, og de 12 kulesetene ble slått sammen og fordelt på 2 eller 3 kolonner i en 96-brønners filterplate (Millipore, Bellerica, MA, produkt nr. MSBVN1250) for analysepunkter i duplikat, henholdsvis i triplikat.

100 ul anti-IL-17RA-antistoff i 4-gangers fortynninger ble tilsatt til brønnene, inkubert i 1 time ved romtemperautr og vasket. 100 ul av en 1:100 fortynning av PE-konjugert antihumant IgG-Fc (Jackson Labs, Bar Harbor, ME, produkt nr. 109-116-170) ble tilsatt til hver brønn, inkubert i 1 time ved romtemperatur og vasket. Kulene ble resuspendert i 1% BSA, omristet i 3 minutter og avlest i Bio-Plex-arbeidsstasjonen. Antistoffbindingen til IL-17RA-argininmutantprotein ble sammenlignet med antistoff-bindingen til villtypehumant IL-17RA fra samme porsjon. En titrerng av antistoff over en tilnærmet 5 logaritmisk skala ble utført. Den mediane fluorescensintensitet (MFI) for IL-17RA-argininmutantproteinene ble fremstilt grafisk som % av det maksimale signal fra villtypehumant IL-17RA. De mutanter for hvilke signalet fra alle antistoffer ligger under 30% av villtype-IL-17RA ble ansett som enten å ha en for lav proteinkonsentrasjon på kulen, grunnet dårlig ekspresjon i den transiente kultur, eller muligens feiltolket og ble utelukket fra analyse: disse var T51R, K53R, S55R, H64R, D75R, E110R, Q118R, T121, E123R, S147R, H148R, E158R, T160R, H163R, K191R, T193R, E213R, H251R, T269R, H279R og D293R. Mutasjoner (dvs. argininsubstitusjoner) som ga økt EC50 for IL-17RA-mAb med 3-ganger eller mer (beregnet ved hjelp av GRAPHPAD PRISM) ble ansett å ha negativ virkning på bindingen av IL-17RA-mAb. Ved hjelp av disse fremgangsmåtene ble nøytraliserende determinanter og epitoper for forskjellige IL-17RA-antistoffer identifisert.

Figur 21 viser titreringskurver for bindingen av forskjellige IL-17RA-mAb til IL-17RA-mutanten D152R (dvs. at apsaraginsyre i posisjon 152 i SEKV. ID. Nr.: 431 ble mutert til arginin). Antistoffene AMH1/AML1, AMH22/AML22, AMH14/AML14, AMH19/AML19, AMH23/AML23, AMH21/AML21 og AMH20/AML20 mistet evnen til å binde IL-17RA-mutanten D152R. Antistoffene AMH18/AML18 og AMH26/AML26 ble bare marginant påvirket, men oppfylte ikke grensekriteriene.

En oppsummering av resultatene fra argininskanning, gruppering og fra kimerer vist i Figur 22. Argininskanningsmetodologien påviste flere nøytraliserende determinanter: AMH18/AML18 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 220-284 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH1/AML1 bandt et domene som er fokusert på aminosyrest 152 i human humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH22/AML2 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 152-198 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH19/AML19 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 152-186 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH23/AML23 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 97-297 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH26/AML26 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 138-270 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431), AMH21/AML21 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 113-198 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431) og AMH20/AML20 bandt et domene som strekker seg over aminosyrene 152-270 i humant IL-17RA (SEKV. ID. Nr.: 431).

Alle aminosyrerester som vises i Figur 22 har blitt vist å eliminere bindingen av et nøytraliserende, humant, monoklonalt antistoff som spesifikt bindes til humant IL-17RA.

Claims

Patentkrav

1. Isolert antistoff eller fragment derav

k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter omfatter en lett kjede CDR1 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 224, en lett kjede CDR2 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 225, en lett kjede CDR3 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID Nr.: 226, en tung kjede CDR1 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 146, en tung kjede CDR2 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 147, og en tung kjede CDR3 aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 148, hvor nevnte antistoff eller fragment derav binder til human IL-17 reseptor A.

2. Isolert antistoff eller fragment derav ifølge krav 1, hvor antistoffet omfatter en lett kjedes variabelt domene aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 40 og en tung kjedes variabelt domene aminosyresekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 14, hvor nevnte antistoff eller fragment derav binder til human IL-17 reseptor A.

3. Isolert antistoff eller fragment derav ifølge krav 1, hvor antistoffet eller fragmentet derav omfatter en tung kjedesekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 427 og en lett kjedesekvens som omfatter SEKV. ID: Nr.: 429, hvor nevnte antistoff eller fragment derav binder til human IL-17 reseptor A.

4. Antistoff eller fragment derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor antistoffet er et IgG2 antistoff.

5. Farmasøytisk sammensetning,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter antistoffet eller fragmentet derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4.

6. Et isolert polypeptid,

k a r a k t e r i s e r t v e d a t polypeptidet koder for antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4.

7. Plasmid,

k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter polynukleotidet ifølge krav 6.

8. Plasmid ifølge krav 7, hvor plasmide er en ekspresjonsvektor.

9. Isolert celle, som omfatter ekspresjonsvektoren ifølge krav 8, hvor cellen er valgt fra gruppen som består av:

a. en prokaryot celle,

b. en eukaryot celle,

c. en pattedyrcelle,

d. en insektscelle og

e. en CHO-celle.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, som omfatter å inkubere den isolerte cellen ifølge krav 9 under betingelser som tillater cellen å uttrykke antistoffet.

11. Antistoff eller fragment derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 eller den farmasøytiske sammensetninge ifølge krav 5 for anvendelse ved behandling av en sykdom eller en patologisk tilstand assosiert med IL-17 reseptor A aktivering, hvor sykdommen eller den patologiske tilstanden er valgt fra gruppen bestående av betennelse, autoimmun sykdom, artritt, reumatoid artritt, juvenil artritt, juvenil reumatoid artritt, pauciartikulær reumatoid artritt, pauciartikulær juvenil reumatoid artritt, polyartikulær reumatoid artritt, polyartikulær juvenil reumatoid artritt, juvenil reumatoid artritt med systemisk begynnelse, ankyloserede spondylitt, juvenil ankyloserede spondylitt, psoriatisk artritt, juvenil psoriatisk artritt, psoriasis, plakk-psoriasis, reumatoid artritt med systemisk begynnelse, dermatomyositt, atoisk dermatitt, skleroderma, juvenil skleroderma, polymyositt, sarkoidose, aterosklerose, systemisk lupus erytematosus (SLE), juvenil systemisk lupus erytematosus, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykom, ulcerøs kolitt, cøliaki, multippel sklerose (MS), astma, KOLS, og transplantat mot vert sykdom (GVHD).

12. Antistoff eller fragment derav for anvendelse ifølge krav 11, hvor anvendelsen videre omfatter administrering av en andre behandling som omfatter en farmasøytisk sammensetning.

13. Isolert antistoff, som omfatter et antistoff prrodusert av CHO cellen ifølge krav 9, hvor antistoffet omfatter en tung kjedesekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 426 og en lett kjedesekvens som omfatter SEKV. ID. Nr.: 428.

14. Farmasøytisk sammensetning som omfatter antistoffet ifølge krav 13