NO342741B1 - Fremgangsmåte for konservering av et aktivt agens, svært viskøs væske, immunogen sammensetning eller vaksine, fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine samt kit. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å tørke biologiske og andre ustabile prøver slik at de kan konserveres som en svært viskøs væske. Fremgangsmåten omfatter trinnene med å fremstille en konserveringsprøve ved å oppløse/suspendere et aktivt agens i en løsning av et stabiliserende agens, utsette konserveringsprøven for slike temperatur og trykkbetingelser at konserveringsprøven taper løsningsmiddel ved evaporasjon uten frysing eller bobling for å danne et skum og fjerne løsningsmiddel til konserveringsprøven tørker og danner en svært viskøs væske.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for konservering av et aktivt agens, svært viskøs væske, immunogen sammensetning eller vaksine, fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine samt kit.

Foreliggende oppfinnelse angår følgelig konservering av biologiske og andre ustabile prøver, slike konserverte prøver og en ny fremgangsmåte for å konservere slike prøver. Den nye fremgangsmåten omfatter å tilsette en prøve omfattende et aktivt agens omfattende et biologisk system valgt fra gruppen bestående av virus, viruskomponenter og viruslignende partikler og et stabiliserende agens til en beholder, underlegge prøven slike temperatur- og trykkbetingelser at det bevirkes tap av løsningsmiddel ved evaporasjon uten å fryse prøven eller boble for å danne et skum. Deretter, under en sekundær tørkefase, blir trykk- og temperaturbetingelser opprettholdt eller justeres slik at løsningsmiddel fjernes og konserveringsprøven ("preservation sample") tørker og danner en svært viskøs væske. Ytterlige tilveiebrakt ved foreliggende oppfinnelse er sammensetninger konservert ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og spesielt vaksinesammensetninger.

Det eksisterer et behov for å øke stabiliteten og følgelig holdbarheten for ustabile prøver, spesielt biologiske prøver. Tradisjonelt har dette blitt gjennomført ved anvendelse av frysetørkingsmetoden hvor det fremstilles en løsning av substansen og prøven fryses. Under den primære tørkefasen, fjernes det meste av vannet ved sublimasjon fra is under betingelser med redusert trykk og en porøs "kake" dannes. Dette etterfølges vanligvis av en sekundær tørkefase når trykket og temperaturen endres og vann evaporeres fra den faste "kaken". Den resulterende lyofiliserte prøven har forbedret stabilitet sammenlignet med en flytende formulering. Frysetørkingsmetoden er imidlertid langvarig, kostbar og kan være det hastighetsbegrensende trinnet i en produksjonsprosess.

Frysetørking kan også føre til tap av aktivitet eller antigenisitet for noen aktive agenser. For visse biologiske materialer slik som levende virus, kan det være betydelig tap av aktivitet under frysetørkingsprosessen (Pikal (1994) ACS Symposium 567: 120-133). Mange frysetørkede substanser er fortsatt ustabile ved romtemperatur (Carpenter et al (1994) ACS Symposium 567; 134-147).

Skade forårsaket av frysetørkingsprosessen kan omgås i noen grad ved anvendelse av stabiliserende agenser slik som polyoler. Ytterligere forbedringer av lyofiliseringsprosessen har også blitt gjort ved å unngå å fryse prøven under prosessen og fjerne vann ved koking (W096/40077; US6306345). Denne metoden omfatter å fremstille en blanding av et glassmatrise-dannende materiale i et egnet løsningsmiddel sammen med prøven som skal konserveres, evaporere størstedelen av løsningsmiddel fra blandingen for å oppnå et sukkerholdig ekstrakt, eksponere det sukkerholdige ekstraktet for et trykk og en temperatur tilstrekkelig til å forårsake koking av det sukkerholdige ekstraktet og fjerne gjenværende løsningsmiddel. Metoder lik denne kan refereres til som skum-tørkingsteknikker. Slike teknikker vil utsette prøven som skal konserveres for belastninger på grunn av dannelse og bristing av bobler under "kokingstrinnet". Spesielt der hvor ustabile substanser skal konserveres kan dette føre til tap av aktivitet.

En lignende metode ble beskrevet i US5,766,520, hvor fremgangsmåten omfatter å delvis fjerne vannet for å danne en viskøs væske og videre utsette det sukkerholdige ekstraktet for vakuum for å få det til å "koke" og ytterligere tørke ved temperaturer vesentlig lavere enn 100°C. Denne metoden lider fremdeles av noen av problemene ved konvensjonell frysetørking. Når prosessen utføres i et stort frysetørkeapparat, vil prøver tørke ved forskjellige hastigheter avhengig av deres posisjon på hyllen og dette fører til at ulike prøver mister ulik mengde aktivitet under tørkeprosessen. Dette fører til mangel på ensartethet i en batch.

Trehalose er et polyol som er foretrukket på grunn av dets stabiliserende egenskaper. Trehalose er et naturlig forekommende, inert, ikke-reduserende og ikke-toksisk, glassdannende disakkarid som initielt ble funnet å være assosiert med forhindring av tørkeskade i noen planter og dyr. Trehalose er nyttig for å forhindre denaturering av et stort mangfold av substanser inkludert proteiner, virus og matvarer under tørking og påfølgende lagring delvis fordi det har relativt høy glassomvandlingstemperatur (ca. 120°C i vannfri tilstand) (US4891319; US5149653; US5026566). Trehalose stabiliserer også enzymer (Argall og Smith

(1993) Biochem. Mol. Biol. Int. 30; 491). Trehalose og et stort mangfold av stabiliserende polyoler har også blitt funnet å være nyttige ved forbedring av konservering av frysetørkede prøver, spesielt i tilfeller hvor prøven har tendens til å tape aktivitet under frysetørkingsprosessen. Andre sukkere nyttige i lyofiliseringsteknikker inkluderer sukrose og laktose.

DE3819539 beskriver en fremgangsmåte for dyrking av celler, spesielt for lys og elektron mikroskopi som inkluderer tørking av prøven ved "kritisk punkttørking". Kritisk punkttørking omfatter økning av temperatur og trykk til en forbindelse over dets kritiske verdier, men det er ingen beskrivelse av en metode hvor trykket blir redusert under 30 mbar.

US 4,863,865 beskriver en metode for konservering av material ved kuldelagring ved underkjøling. Metoden involverer dispergering av materialet i et oljemedium og avkjøling av dispersjonen til en lagringstemperatur slik at den vandige fasen blir avkjølt under dets normale frysepunkt (0°C) uten at frysing foregår.

US 5,149,653 beskriver en metode for konservering av levende virus ved anvendelse av tørking i nærvær av trehalose, men beskriver ikke tørking av et aktivt middel ved et trykk under 30 mbar.

Foreliggende oppfinnelse angår følgelig en forbedret fremgangsmåte for konservering av et aktivt agens, omfattende et biologisk system valgt fra gruppen bestående av virus, viruskomponenter og viruslignende partikler,

spesielt dersom det aktive agenset er ustabilt og har tendens til å tape aktivitet under en mer konvensjonell tørkeprosess. Fremgangsmåten omfatter trinnene med å fremstille en konserveringsprøve ved å oppløse/suspendere et aktivt agens i en løsning av et stabiliserende agens; underlegge konserveringsprøven slike temperatur- og trykkbetingelser at konserveringsprøven mister løsningsmiddel ved evaporasjon, uten at prøven fryses eller bobler for å danne et skum; og fjerne løsningsmiddel helt til konserveringsprøven tørker slik at den danner en svært viskøs væske.

Fremgangsmåten er svært mild og eksponerer ikke det aktive agenset forfrysing eller koking og er derfor fordelaktig fremfor konvensjonell frysetørking og skum-tørkingsteknikker hvilke ville utsette prøven for én av eller begge disse belastningene. Når det aktive agenset som skal konserveres er ustabilt, fører anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse til økt bibeholdelse av aktivitet og/eller antigenisitet. Dette kan måles ved å rekonstituere det tørkede aktive agenset i løsningsmiddel, foretrukket vann eller en vandig løsning, og måle aktiviteten eller antigenisiteten ved en standardanalyse (for eksempel ved ELISA) og sammenligne resultatene med de oppnådd med enten en utørket prøve eller med prøver tørket ved frysetørking eller skum-tørkingsteknikker, og deretter rekonstituert.

Det er spesielt fordelaktig å tørke IPV (inaktivert poliovirus, immunogenet i injiserbar poliovaksine) ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. IPV er til stede i kjente vaksiner som en flytende formulering (W099/48525). Problemer har oppstått ved forsøk på å anvende en fast formulering av IPV i en vaksine siden standard frysetørkingsmetoder fører til tap av IPV-antigenisitet. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse fører til mye høyere bibeholdelse av poliovirus-antigenene, delvis på grunn av den reduserte tiden som kreves ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er fordelaktig fremfor normal frysetørking siden syklusen for kjøring er kortere og krever mindre avkjøling noe som gjør den mer energieffektiv. Siden tørkeprosessen ofte er det hastighetsbegrensende trinnet i en prosess, fører anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse til høyere produksjonsnivåer til reduserte kostnader.

Beskrivelse av figurer

Figur 1- Fotografi av væsken med høy viskositet i flasker som er snudd opp ned.

Detaljert beskrivelse

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig en fremgangsmåte for konservering av et aktivt agens, idet den omfatter trinnene med å:

a) fremstille en konserveringsprøve ved å oppløse/suspendere et aktivt agens i en løsning med et stabiliserende agens; b) utsette konserveringsprøven for en temperaturbetingelse over 0°C og en trykkbetingelse under 30 mbar slik at konserveringsprøven taper

løsningsmiddel ved evaporasjon, uten frysing eller bobling involvert i skumdannelse, for å danne en viskøs væske, idet det aktive middelet omfatter et biologisk system valgt fra gruppen bestående av virus, viruskomponenter og viruslignende partikler.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre, at den ytterligere omfatter et trinn med

å:

c) ytterligere utsette konserveringsprøven for slike temperatur- og trykkbetingelser slik at den viskøse væsken tørker for å danne en svært

viskøs væske, hvor den svært viskøse væsken har et løsningsmiddelinnhold som er mindre enn eller lik 15% (v/v).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre at trykket reduseres til 20 mbar eller

lavere under trinn b).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 1-3, idet temperaturen utenfor konserveringsprøven er mellom 5°C og 37°C under trinn b).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 2-4, idet

temperaturen utenfor konserveringsprøven er mellom 5°C og 37°C i trinn c).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 2-5, idet temperaturen utenfor konserveringsprøven er høyere under trinn c) enn den er i trinn b).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge krav 6, idet temperaturen utenfor konserveringsprøven økes til over 20°C under trinn c).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 2-7, idet

trykket er redusert i trinn c) sammenlignet med trykket under trinn b).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge krav 8, idet trykket

reduseres til 1 mbar eller lavere under trinn c).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 1-9, idet

trinn b) fullføres på mindre enn fire timer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 2-10, idet

trinnene b) og c) fullføres på mindre enn 12 timer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 1-11, idet det stabiliserende middelet omfatter en glassdannende polyol, valgt fra gruppen bestående av glukose, maltulose, iso-maltulose, laktulose, sukrose, maltose, laktose, sorbitol, iso-maltose, maltitol, laktitol, palatinit, trehalose, raffinose, stakyose, melezitose og dekstran.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge krav 12, idet det

stabiliserende agenset er sukrose.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre at konsentrasjonen av stabiliserende

agens er mindre enn 15%.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 1-14, idet

konserveringsprøven omfatter fenolrød.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 1-15, idet konserveringsprøven tørkes i en beholder med en løsningsmiddelavvisende indre overflate.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-16, idet det aktive agenset omfatter IPV (inaktivert poliovirus).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge kravene 1-17, idet

det aktive middelet omfatter en vaksine.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en svært viskøs væske, idet den omfatter et aktivt middel hvor antigenisiteten eller aktiviteten til det aktive middelet er konservert oppnåelig ved fremgangsmåten ifølge kravene 1-18, idet den svært viskøse væsken har et løsningsmiddelinnhold mindre enn eller lik 15% (v/v) og hvor det aktive middelet omfatter et biologisk system valgt fra gruppen bestående av virus, viruskomponenter og viruslignende partikler.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en svært viskøs væske ifølge krav 19,

idet den omfatter en glassdannende polyol valgt fra gruppen bestående av glukose, maltulose, iso-maltulose, laktulose, sukrose, maltose, laktose, sorbitol, iso-maltose, maltitol, laktitol, palatinit, trehalose, raffinose, stakyose, melezitose og dekstran.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en svært viskøs væske ifølge krav 20,

idet den glassdannende polyolen er sukrose.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en svært viskæs væske ifølge krav 19-21, idet det aktive agens omfatter en vaksine.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en svært viskøs væske ifølge krav 19-22, idet den er inneholdt i en beholder med en løsningsmiddel-frastøtende indre overflate.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en immunogen sammensetning eller vaksine, idet den omfatter den svært viskøse væsken ifølge kravene 19-22 og en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, idet den omfatter trinnet med å rekonstituere den svært viskøse væsken ifølge krav 19-22 i en vandig løsning.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge krav 25, idet den vandige løsningen omfatter difteriaantigen, tetanusantigen og pertussisantigen (acellulær eller helcelle).

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte ifølge krav 26, idet DTP-vaksinen er i det minste delvis tilsatt adjuvans med aluminiumhydroksid.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre kit, idet det omfatter den svært viskøse væsken ifølge kravene 19-22 inneholdt i en første beholder og en flytende vaksinekomponent i en andre beholder.

En fremgangsmåte for å konservere et aktivt agens ifølge oppfinnelsen fremstiller en form av det aktive agenset som er i stand til å tåle forlenget lagring under hvilken aktiviteten og/eller antigenisiteten og/eller immunogenisiteten av det aktive agenset opprettholdes. Foretrukket bibeholder det aktive agenset minst 40, 50, 60, 70, foretrukket 80, 90, 95% av dets opprinnelige aktivitet, antigenisitet og/eller immunogenisitet over en periode på minst 3, 6, 9,12, 24 måneders lagring ved 4°C. Antigenisitet eller immunogenisitet kan måles ved standardanalyser som beskrevet nedenfor.

Fremgangsmåten er spesielt nyttig for å forlenge holdbarheten for ustabile produkter som raskt mister aktivitet når de lagres i løsning eller når de eksponeres for frysing eller bobling for å danne et skum.

Et ustabilt produkt har tendens til å tape aktivitet og/eller til å tape antigenisitet og/eller tape immunogenisitet, etter lagring i løsning og/eller frysing og/eller ved utsettelse for belastninger slik som de omfattet i bobling under skumdannelse. Den er spesielt egnet for anvendelse hvor en lavere konsentrasjon (for eksempel 3%-15% vekt/volum) av den glassdannende polyolen er fordelaktig og en kortere tørkeprosess (mindre enn 4, 6, 8,10 eller 12 timer) er foretrukket.

En viskøs væske er definert som produktet fra den primære fasen av fjerning av løsningsmiddel, ved slutten av hvilken det meste av løsningsmiddelet har blitt tapt fra prøven. Dette punktet kan gjenkjennes fordi hastigheten av evaporasjon saktnes slik at prøvens temperatur vender tilbake til romtemperatur ettersom den endoterme effekten av masse-evaporasjon tapes.

En svært viskøs væske fremstilles etter at den viskøse væsken fremstilt ved slutten av den primære tørkefasen har blitt eksponert for redusert trykk for en ytterligere tidsperiode etter slutten av den primære tørkefasen. En svært viskøs væske har et løsningsmiddelinnhold mindre enn eller lik 15, 12, 10, 8, 5, 4, 3, 2 eller 1% (vekt/vekt), foretrukket som bestemt ved Karl Fischer coulometrisk fuktighetsanalysator (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; 277-284). Foretrukne områder for løsningsmiddelinnhold er 1-3%, 3-5%, 5-10% eller 10-15% (vekt/vekt). Den svært viskøse væsken har et tilstrekkelig lavt løsningsmiddelinnhold slik at det aktive agenset konserveres i en stabil tilstand i minst 3, 6, 9,12 eller 24 måneder ved 4°C, og tillater det aktive agenset å bibeholde minst 40, 50, 60 foretrukket 70, 80, 90, 95% av dets aktivitet og/eller antigenisitet og/eller immunogenisitet over denne perioden. Foretrukket har den svært viskøse væsken et fast utseende men er en gummi eller glass, foretrukket glass og er i stand til flyte svært sakte over en periode på 2, 4 eller 6 dager, foretrukket 1,2,3 eller 4 uker, mer foretrukket 2, 4, 6, 8, 10 eller 12 måneder. Den særdeles sakte flyten kan måles ved å snu opp ned på en beholder inneholdende den svært viskøse væsken og etterlate den ved romtemperatur inntil den svært viskøse væsken observeres å flyte. I en foretrukket utførelsesform vil den svært viskøse væsken ikke vise seg å flyte etter 2, 4 eller 6 dager, foretrukket 1,2, 3, eller 4 uker, mer foretrukket 2, 4, 6, 8, 10 eller 12 måneder i en vendt posisjon. Foretrukket har den svært viskøse væsken et klart, transparent utseende.

Fremstilling av konserveringsprøven

Hvilket som helst stabiliserende agens er egnet for anvendelse i det første trinnet ifølge foreliggende oppfinnelse. Egnede materialer omfatter, men er ikke begrenset til, alle polyoler, inkludert karbohydrat og ikke-karbohydrat-polyoler. Foretrukket tillater det stabiliserende polyolet det aktive agenset å lagres uten vesentlig tap av aktivitet ved denaturering, aggregering eller andre metoder. Spesielt egnede materialer inkluderer sukkere, sukkeralkoholer og karbohydratderivater. Foretrukket er den glassdannende polyolen et karbohydrat eller derivater derav, inkludert glukose, maltulose, iso-maltulose, laktulose, sukrose, maltose, laktose, iso-maltose, maltitol, laktitol, palatinit, trehalose, raffinose, stakyose, melezitose eller dekstran, mest foretrukket trehalose, sukrose, sorbitol, raffinose, mannitol, laktose, laktitol eller palatinit, mest foretrukket sukrose, sorbitol, laktose eller trehalose.

Bakterielle polysakkarider er spesielt fordelaktige for anvendelse som et stabiliserende middel i en immunogen sammensetning siden de kan tjene både som et stabiliserende middel og et immunogen.

Karbohydrater omfatter, men er ikke begrenset til, monosakkarider, disakkarider, trisakkarider, oligosakkarider og deres tilsvarende sukkeralkoholer, polyhydroksylforbindelser slik som karbohydratderivater og kjemisk modifiserte karbohydrater, hydroksyetylstivelse og sukker kopolymerer. Både naturlige og syntetiske karbohydrater er egnet for anvendelse. Syntetiske karbohydrater omfatter, men er ikke begrenset til, de som har glykosidbindingen erstattet med en thiol eller karbonbinding. Både D og L-former av karbohydratene kan anvendes. Karbohydratet kan være ikke-reduserende eller reduserende. Når et reduserende karbohydrat anvendes, er tilsetning av inhibitorer for Maillard-reaksjonen foretrukket.

Reduserende karbohydrater egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er de som er kjent på området og omfatter, men er ikke begrenset til, glukose, maltose, laktose, fruktose, galactoase, mannose, maltulose og laktulose. Ikke-reduserende karbohydrater omfatter, men er ikke begrenset til, ikke-reduserende glykosider av polyhydroksylforbindelser valgt fra sukkeralkoholer og andre rettkjedede polyalkoholer. Andre nyttige karbohydrater omfatter raffinose, stakyose, melezitose, dekstran, sukrose, cellibiose, mannobiose og sukkeralkoholer. Sukkeralkoholglykosidene er foretrukket monoglykosider, spesielt forbindelsene oppnådd ved reduksjon av disakkarider slik som laktose, maltose, laktulose og maltulose.

Spesielt foretrukne karbohydrater er trehalose, sukrose, sorbitol, maltitol, laktitol, palatinit og glukopyranosyl-1—►6-mannitol.

Aminosyrer kan virke som stabiliserende midler og kan anvendes alene eller i kombinasjon med et polyol. Foretrukne aminosyrer omfatter glysin, alanin, arginin, lysin og glutamin selv om hvilken som helst aminosyre, eller en kombinasjon av aminosyrer, peptid, hydrolysert protein eller protein slik som serumalbumin kan virke som et stabiliserende middel.

Konsentrasjonen av det stabiliserende middelet anvendt i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan være mellom 1% og 50% vekt/volum, foretrukket 1-5%, 5-10%, 5-10%, 15-20%, 20-25% eller 25-50%, mest foretrukket mindre enn eller lik 15% eller 10% (vekt/volum). Mengden av stabiliserende middel nødvendig er proporsjonal med mengden av salter til stede. Derfor, selv om nivåer av stabiliserende middel mellom 2% og 10% er foretrukket, kan høyere konsentrasjoner på 10% til 25% være nødvendig for å tørke prøver med et høyt salt (over 100mM, 200mM, 300mM, 400mM eller 500mM)-innhold.

Foretrukket vil konserveringsprøven inneholde en komponent i stand til å inhibere krystalldannelse i den svært viskøse væsken ifølge foreliggende oppfinnelse. Salter og andre molekyler inkludert aminosyrer og fenolrød hemmer krystalldannelse.

Beholder

Ulike blandinger og forskjellige beholderformer og størrelser kan behandles samtidig. Ideelt er størrelsen av anvendt beholder tilstrekkelig til å inneholde den initielle blandingen og romme volumet av det faste stoffet dannet derav. Dette bestemmes typisk av massen av det glassdannende materialet, overflatearealet av beholderen og betingelsene for glassdannelsen. Massen av glassdannende materiale må være tilstrekkelig til å gi viskøs sukkeroppløsning som omsetter i praksis som en minimal masse per enhet areal av beholderoverflate. Denne ratioen varierer fra blanding til blanding og beholder som anvendes, men bestemmes enkelt empirisk av fagfolk på området etter fremgangsmåtene fremlagt heri. Hvilke som helst av slike ampuller kan anvendes, inkludert "Wheaton moulded" og "tube-cut vials".

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse anvender foretrukket beholdere med et løsningsmiddel-frastøtende, foretrukket en vannfrastøtende indre overflate. Dette oppnås ved å dekke den indre overflaten med en hydrophob sammensetning, for eksempel ved silikonisering. Silikonisering oppnås ved fremgangsmåter som er velkjente for fagfolk på området. I én metode silikoniseres beholderen ved å dekke det indre av beholderen med en emulsjon av silikon, fulgt av bearbeidelse gjennom en ovn ved høy temperatur, typisk 350°C. Alternativt oppnås den vannavstøtende indre overflaten ved at beholderen er fremstilt av en vannavstøtende sammensetning.

Den vann-avstøtende indre overflaten av beholderen gjør det tørkede produktet fra prosessen lettere å rekonstituere siden mindre av vannet samler seg på sidene av beholderen.

Selv om enkeltstående former kan anvendes heri, kan mer enn ett glassmatrise-dannende materiale, mer enn ett additiv og mer enn én substans være til stede. Effektive mengder av disse komponentene bestemmes enkelt av fagfolk på området.

Løsning

Løsningsmiddelet som det stabiliserende agenset og aktive agenset blandes inn i kan være vandig, organisk eller en blanding av begge. Tilstrekkelig vandig løsningsmiddel til å oppløse det glassmatrise-dannende materialet og tilstrekkelig organisk løsningsmiddel til å oppløse en hydrofob substans kan anvendes, og tillater dannelse av glass omfattende hydrofob(e) substans(er).

Valg av løsningsmiddel vil avhenge av karakteren av materialet som er valgt for dannelse av glassmatrise, så vel som karakteren av ethvert tilsetningsstoff og/eller substans som skal inkorporeres. Løsningsmiddelet skulle være av en karakter og av tilstrekkelig volum til å bevirke adekvat solubilisering av det glassmatrise-dannende materialet så vel som ethvert tilsteningsstoff og/eller substans. Dersom substansen er et hydrofilt materiale, vil væsken foretrukket være vandig for å unngå eventuelt potensielt tap av aktivitet på grunn av ødeleggende løsningsmiddel-interaksjoner. Foretrukket omfatter det vandige løsningsmiddelet hvilket som helst egnet vandig løsningsmiddel kjent på området, inkludert, men ikke begrenset til, vann og biologiske bufferløsninger. Foretrukket er det vandige løsningsmiddelet til stede i en mengde på 5 til 98% med hensyn til volum, mer foretrukket 80-98% med hensyn til volum, mest foretrukket 85-98% med hensyn til volum.

Volumet av løsningsmiddel kan variere og vil avhenge av det glassmatrise-dannende materialet og substansen som skal inkorporeres så vel som eventuelle tilsetningssoffer. Minimumsvolumet som kreves er en mengde nødvendig for å oppløse de forskjellige komponentene. Imidlertid kan homogent dispergerte suspensjoner av substansen(e) også anvendes. Egnede mengder av komponentene i spesielle utførelsesformer kan lett bestemmes av fagfolk på området i lys av eksemplene gitt heri.

Forskjellige tilsetningsstoffer kan innføres i konserveringsprøven. Et foretrukket tilsetningsstoff er en inhibitor for Maillard-reaksjonen. Dersom substansen og/eller det glassmatrise-dannende materialet inneholder karbonyl og amino, imino eller guanidino-grupper, inneholder sammensetningene foretrukket videre minst én fysiologisk akseptabel inhibitor for Maillard-reaksjonen i en mengde effektiv for å vesentlig forhindre kondensering av aminogrupper og reaktive karbonylgrupper i sammensetningen. Inhibitoren for Maillard-reaksjone kan være hvilken som helst kjent på området. Inhibitorer er til stede i en mengde tilstrekkelig til å forhindre, eller vesentlig forhindre, kondensering av aminogrupper og reaktive karbonylgrupper. Typisk er aminogruppene til stede på substansen og karbonylgruppene er til stede på det glassmatrise-dannende materialet, eller omvendt. Imidlertid kan aminosyrene og karbonylgruppene være intramolekylære innenfor enten substansen eller karbohydratet.

Forskjellige klasser av forbindelser er kjent å fremvise en inhiberende virkning på Maillard-reaksjonen og derav å være nyttige i sammensetningene beskrevet heri. Disse forbindelsene er generelt enten konkurrerende eller ikke-konkurrerende inhibitorer for Maillard-reaksjonen. Konkurrerende inhibitorer omfatter, men er ikke begrenset til, aminosyrerester (både D og L), kombinasjoner av aminosyrerester og peptider. Spesielt foretrukket er lysin, arginin, histidin og tryptofan. Lysin og arginin er de mest effektive. Det er mange kjente ikke-konkurrerende inhibitorer. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, aminoguanidin og derivativer og amfotericin B. EP-A-0 433 679 beskriver også egnede Maillard-inhibitorer som omfatter 4-hydroksy-5,8-dioksoquinolin-derivater.

Det er fordelaktig å innlemme et fargestoff i konserveringsprøven for å tillate lettere visualisering av det tørkede produktet av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette er spesielt viktig under rekonstituering for å sikre at den svært viskøse væsken er grundig rekonstituert før bruk. Foretrukket bibeholder fargestoffet sin farge ved en nøytral pH og er kompatibel med injeksjon inn i en pasient. Mest foretrukket er fargestoffet fenolrød.

Tap av løsningsmiddel ved evaporasjon ( evaporativt tørkingstrinn b)

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter å utsette konserveringsprøven for slike trykk og temperaturbetingelser slik at konserveringsprøven taper løsningsmiddel ved evaporasjon, uten at prøven fryser eller bobler for å danne et skum.

Temperaturen inne i konserveringsprøven vil, til tider, være forskjellig fra den utenfor prøven på grunn av den endoterme karakteren av evaporasjonsprosessen. Referenser til temperatur er til betingelsene utenfor konserveringsprøven, for eksempel, der hvor et stort industrielt frysetørkeapparat anvendes, til temperaturen av hyllen. Dette samsvarer vanligvis med temperaturinnstillingen for frysetørkeapparatet.

Eventuelt er et forberedende trinn med avgassing av konserveringsprøven fremlagt i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Trykket reduseres til eller under 200mBar, foretrukket mellom 200 og 35mBar, i en periode på minst 5 minutter før trykket reduseres ytterligere.

I en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås evaporativ

tørking ved å redusere trykket mens temperaturbetingelsene kontrolleres. Trykket justeres til eller under 30, 25, 20, foretrukket 15, 12, mest foretrukket 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 eller 1 mbar, mens temperaturinnstillingen opprettholdes ved en temperatur over 0°C, foretrukket på mellom 5°C til 37°C, 4°C til 10°C, 10°C til 15°C;15°C til 20°C; 20°C til 25°C; 25°C til 30°C; 30°C til 37°C eller 37°C til 45°C. Disse betingelsene opprettholdes i minst 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 eller 24 timer, foretrukket i mellom 2-4 timer, 4-6 timer, 6-8 timer, 8-12 timer eller 12-18 timer. I en spesielt foretrukket utførelsesform, opprettholdes trykket over 2mbar hvor temperaturinnstillingen er 15°C for å forhindre frysing av prøven. I en foretrukket utførelsesform opprettholdes temperaturen ved 15°C og trykket er innstilt til mellom 5-10 mBar, mer foretrukket 6-9mBar, mest foretrukket omkring 8 mBar. Der det anvendes en høyere temperaturinnstilling, er litt lavere trykk mulig uten å fryse prøven og der det anvendes en lavere temperaturinnstilling, skulle trykket opprettholdes ved det høyere nivået for å forhindre frysing. Foretrukket opprettholdes betingelsene i en tilstrekkelig lang tidsperiode slik at evaporasjonshastigheten har saktnet slik at prøvens temperatur er omtrent den samme som den utenfor prøven.

Foretrukket fryses eller bobles/kokes ikke konserveringsprøven for å danne et skum og taper løsningsmiddel for å danne en viskøs væske eller en svært viskøs væske.

Fjerning av løsningsmiddel for å danne en svært viskøs væske

Et påfølgende trinn i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter å fjerne løsningsmiddel helt til konserveringsprøven tørker for å danne en svært viskøs væske. Prøven hverken fryses eller bobles for å danne et skum under den sekundære tørkefasen.

En svært viskøs væske er definert som et materiale med et løsningsmiddelinnhold mindre enn eller lik 15, 12, 10, mer foretrukket 8, 5, 4, 3, 2 eller 1% (vekt/vekt) foretrukket målt ved anvendelse av en Karl Fischer coulometrisk fuktighetsanalysator. Den svært viskøse væsken har et tilstrekkelig lavt løsningsmiddelinnhold slik at det aktive agenset konserveres i en stabil tilstand i minst 3, 6, 9, 12 eller 24 måneder ved 4°C, og tillater det aktive agenset å bibeholde minst 40, 50, 60, foretrukket 70, 80, 90, 95% av dets aktivitet og/eller antigenisitet og/eller immunogenisitet i denne perioden. Foretrukket har den svært viskøse væsken et fast, og/eller klart utseende men er et glass og er i stand til å flyte svært sakte over en periode på 2, 4 eller 6 dager, foretrukket 2, 3 eller 4 uker, mer foretrukket 2, 4, 6, 8, 10 eller 12 måneder. Den særdeles langsomme flyten kan måles ved å vende en beholder inneholdende den svært viskøse væsken og etterlate den ved romtemperatur inntil den svært viskøse væsken observeres å flyte. I en foretrukket utførelsesform vil den svært viskøse væsken ikke vise seg å flyte etter 2, 4 eller 6 dager, foretrukket 2, 3 eller 4 uker, mer foretrukket 2, 4, 6, 8, 10 eller 12 måneder i en posisjon hvor den er snudd opp ned.

I én utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås dette ved å opprettholde trykk- og temperaturbetingelsene ved de anvendt i det første evaporative tørkingstrinnet. For eksempel opprettholdes trykket ved eller under 30, 25, 20, foretrukket 15, 12, mest foretrukket 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 eller 1 mbar, mens temperaturinnstillingen opprettholdes ved en temperatur over 0°C, foretrukket på mellom 5°C til 37°C, 5°C til 10°C, 10°C til 15°C; 15°C til 20°C; 20°C til 25°C; 25°C til 30°C; eller 30°C til 37°C. For en temperaturinnstilling på 15°C, opprettholdes et trykk på 5-10mBar, foretrukket 6-9mBar, mest foretrukket omkring 8mBar i mellom 4-24 timer, foretrukket 1-4, 4-8, 8-12 eller 12-16 timer. Disse temperatur- og trykkbetingelsene opprettholdes i 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 timer eller mer for å oppnå en svært viskøs væske med et løsningsmiddelinnhold mindre enn eller lik 15, 12, foretrukket 10, 8, 5, 4, 3, 2 eller 1% (vekt/vekt) foretrukket målt ved en Karl Fischer coulometrisk fuktighetsanalysator.

I en annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse økes temperaturinnstillingen under fjerning av løsningsmiddel til en høyere temperaturinnstilling enn den opprettholdt tidligere i prosessen. Dette tillater løsningsmiddelet å forlate prøven ved en raskere hastighet slik at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan fullføres på kortere tid. For eksempel økes temperaturinnstillingen til over 0°C, mer foretrukket over 20°C, foretrukket mellom 5°C og 37°C, 5°C og 0°C, 10°C og 20°C; 20°C og 30°C; mer foretrukket 30°C og 40°C; mer foretrukket 40°C og 50°C; mest foretrukket 50°C og 60°C mens trykket opprettholdes ved eller under 30, 25, 20, foretrukket 15, 12, mest foretrukket 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 eller 1 mbar. Disse temperatur- og trykkbetingelsene opprettholdes i minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8,10, 12 eller 18 timer eller mer for å oppnå et fast stoff med løsningsmiddelinnhold mindre enn eller lik 15, 12, 10, 8, 5, 4, 3, 2 eller 1% (vekt/vekt) foretrukket målt ved en Karl Fischer coulometrisk fuktighetsanalysator. Denne utførelsesformen krever at det aktive agenset er varmestabilt ved temperaturen som anvendes for at fremgangsmåten skal utføres på en vellykket måte.

I en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse reduseres innstillingen av trykket under fjerning av løsningsmiddel (trinn c) til en lavere trykkinnstilling enn den anvendt tidligere i prosessen (trinn b). Dette tillater løsningsmiddelet å forlate prøven ved en raskere hastighet slik at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan fullføres på kortere tid. Det tillater også at en større andel av løsningsmiddelet tapes. For eksempel settes trykkinnstillingen ved eller nedenfor 7, 6, foretrukket 5, 4, 3, mer foretrukket 2, 1,5, 1, mest foretrukket 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01 eller 0,005mbar, mens temperaturen opprettholdes ved eller over 0°C, foretrukket mellom 10°C og 20°C; 20°C og 30°C; 30°C og 35°C eller over 40°C. Disse temperatur- og trykkbetingelsene opprettholdes i minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8,10, 12 eller 18 timer eller mer for å oppnå et fast stoff med løsningsmiddelinnhold mindre enn eller lik 15, 12, foretrukket 10, 8, 5, 4, 3, 2 eller 1% (vekt/vekt) foretrukket som bestemt ved en Karl Fischer coulometrisk fuktighetsanalysator (Eur. J. Pharm.Biopharm. (2000) 50; 277-284).

Foretrukket skulle trinnene b) og c) (eller b) alene) fullføres i løpet av en tid lik eller mindre enn 18 timer, foretrukket 16, 12, 10 timer, mest foretrukket 8, 6, 5 eller 4 timer.

Aktivt agens

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttig for å konservere hvilket som helst aktivt agens om det enn er spesielt nyttig i tilfellet av ustabile aktive agenser som taper aktivitet og/eller antigenisitet og/eller immunogenisitet under konserveringsprosessen.

Det aktive agenset som skal konserveres ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et biologisk system valgt fra gruppen bestående av vimser, viruskomponenter eller viruslignende partikler.

Egnede aktive agenser er terapeutiske og profylaktiske midler. Disse omfatter, vimser og kan avledes fra naturlige kilder eller fremstilles ved rekombinante eller syntetiske metoder og omfatter analoger, agonister og homologer.

Som anvendt heri refererer "protein" også til peptider og polypeptider. Slike proteiner omfatter, men er ikke begrenset til, enzymer, biolegemidler, veksthormoner, vekstfaktorer, insulin, antistoffer, både monoklonale og polyklonale og fragmenter derav, interferoner, interleukiner og cytokiner.

Terapeutiske nukleinsyre-baserte midler, hvor det aktive middelet omfatter et biologisk system valgt fra gruppen bestående av virus, viruskomponenter

og viruslignende partikler,

fremstilt ved fremgangsmåtene beskrevet heri er også omfattet av foreliggende oppfinnelse. Som anvendt heri, omfatter "nukleinsyrer" hvilke som helst terapeutisk effektive nukleinsyrer kjent på området omfattende, men ikke begrenset til DNA, RNA, og fysiologisk aktive analoger derav. Nukleotidene kan kode for gener eller kan være hvilken som helst vektor kjent på området for rekombinant DNA inkludert, men ikke begrenset til, plasmider, retrovirus og adeno-assosierte vimser.

Konservering av aktive agens som er profylaktisk aktive og bærere derav er videre omfattet av foreliggende oppfinnelse. Foretrukne sammensetninger omfatter immunogener slik som vaksiner. Vaksiner kan være for oral administrering eller kan være for injeksjon etter rekonstituering. Egnede vaksiner omfatter, men er ikke begrenset til, levende og attenuerte vimser, nukleotidvektorer som koder for antigener, protein, polysakkarid, oligosakkarid og/eller lipopolysakkarid-antigener, antigener pluss adjuvanser og antigener og/eller haptener koblet til bærere. Spesielt foretrukket er vaksiner virksomme mot Hepatitt A, B, C og E, herpesvirus, papillomavirus, poliovirus, inaktivert poliovirus (IPV - foretrukket omfattende typene 1, 2 og 3 som er standard innen vaksineområdet, mest foretrukket Salk polio-vaksinen), rubella, rotavirus, respiratorisk syncytialvirus, varicella-zoster virus, gul feber og kombinasjoner derav. Den antigene komponenten av vaksiner kan også fremstilles ved molekylærbiologiske teknikker for å fremstille rekombinante peptider eller fusjonsproteiner inneholdende én eller flere deler av et protein avledet fra et patogen. For eksempel har fusjonsproteiner inneholdende et antigen og B-subenheten av koleratoksin blitt vist å indusere en immunrespons til antigenet. Sanches et al (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:481-485. Vaksiner er spesielt egnet for inkorporering inn i enkelt dose-sammensetningen. De er stabile i det uendelige under omgivelsesbetingelser og kan oppløses igjen i sterilt fortynningsmiddel umiddelbart før inokulering.

Kombinasjoner av to eller flere av de ovennevnte aktive agensene kan konserveres ved anvendelse av fremgangsmåten for konservering ifølge foreliggende oppfinnelse. En del av eller hele vaksinen kan konserveres ved anvendelse av fremgangsmåten for konservering ifølge foreliggende oppfinnelse.

Et foretrukket aktivt agens som skal konserveres ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter IPV (en inaktivert blanding av poliovirus-stammer). IPV, spesielt type 3-komponenten, er følsom for konvensjonell frysetørking og skumtørkings-teknikker som vist ved tapet av antigener etter frysetørking eller skumtørking og etterfølgende rekonstituering. IPV er definert som inaktivert poliovirus (foretrukket omfattende typene 1, 2 og 3 som er standard på vaksineområdet, mest foretrukket Salk polio-vaksinen). En vaksinedose av IPV inneholder 20-80, foretrukket 40 eller 80 D antigen-enheter av type 1 (Mahoney), 4-16, foretrukket 8 eller 16 D antigen-enheter av type 2 (MEF-1) og 20-64, foretrukket 32 eller 64 D antigen-enheter av type 3 (Saukett).

Ved tørking ved en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse bibeholdes foretrukket antigenisiteten av 1, 2, eller alle 3 av typene 1, 2 og 3 av poliovirus; mer foretrukket bibeholdes antigenisiteten av type 1; type 2; type 3; type 1 og type 2; type 1 og type 3; type 2 og type 3; eller type 1, type 2 og type 3 på et nivå på minst 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av antigenisiteten for en referanseprøve som ikke har blitt underlagt tørkeprosessen. Dette kan måles, etter rekonstituering av den svært viskøse væsken i en vandig løsning, ved hvilken som helst egnet metode inkludert ved ELISA ved anvendelse av polyklonale og/eller monoklonale antistoffer mot poliovirus type 1, 2 og/eller 3.

Ved tørking ved en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse bibeholdes foretrukket immunogenisiteten av 1, 2, eller alle 3 typene 1, 2 og 3 av poliovirus; mer foretrukket bibeholdes immunogenisiteten av type 1; type 2; type 3; type 1 og type 2; type 1 og type 3; type 2 og type 3; eller type 1, type 2 og type 3 ved et nivå på minst 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av immunogenisiteten av en referanseprøve som ikke har blitt underlagt tørkeprosessen. Dette kan måles etter rekonstituering av den svært viskøse væsken i en vandig løsning, ved hvilken som helst egnet metode. I en foretrukket fremgangsmåte rekonstitueres den svært viskøse væsken i en vandig løsning og inokuleres inn i et dyr, foretrukket en rotte. Etter en passende tidsperiode, oppsamles antisera fra de inokulerte dyrene og serokonversjon undersøkes. Foretrukket oppnås en relativ potens på minst 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 eller 0,9, sammenlignet med en utørket referanseprøve.

Foretrukket kombineres IPV med ett eller flere av Hib ( Haemophilus influenzae type b) PRP-polysakkarid eller oligosakkarid og/eller meningokokk A, C, W og/eller Y-polysakkarider eller oligosakkarid og/eller pneumokokkpolysakkarider eller oligosakkarid. Mest foretrukket omfatter de aktive agensene IPV og Hib; IPV og MenC; IPV, Hib og MenC; Hib og MenC; IPV og MenA og C; Hib og Men A og C; IPV, Hib, Men A og C; Hib, Men C og Y; eller IPV, Hib, Men C og Y.

De ovennevnte spesifiserte aktive agensene kan også omfatte ett eller flere pneumokokk-kapselpolysakkarider som beskrevet nedenfor.

I de ovennevte sammensetningene hvor polysakkarider anvendes kan oligosakkarider også benyttes (som definert nedenfor).

Selv om disse sammensetningene kan tilsettes adjuvans (som beskrevet nedenfor), er de foretrukket uten adjuvans eller omfatter foretrukket ikke aluminiumsalter.

Foretrukket er polysakkaridene eller oligosakkaridene konjugert til et peptid eller bærerprotein omfattende T-hjelperepitoper (som beskrevet nedenfor).

Ytterligere komponenter

De foretrukne kombinasjonene, tørket ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan kombineres med andre antigener i en kombinasjonsvaksine som er uttørket eller er foretrukket en flytende formulering som kan anvendes til å rekonstituere de tørkede komponentene. Foretrukne antigener som kan kombineres med de aktive agensene i avsnittet ovenfor omfatter ett eller flere av difteritoksoid, tetanustoksoid, helcelle-pertussis (Pw), acellulær pertussis (Pa)

(som beskrevet nedenfor), Hepatitt B-overflateantigen, Hepatitt A-virus, Haemophilus influenzae b-polysakkarider, neisseria-polysakkarider, N. meningitidis serotype B-proteiner, pneumokk-polysakkarider, pneumokokk-proteiner eller hvilke som helst av antigenene listet opp nedenfor. Bakterielle polysakkarider kan konjugeres til et bærerprotein slik som tetanustoksoid, tetanustoksoid fragment C, difteritoksoid, CRM197, pneumolysin, Protein D (US6342224) som beskrevet nedenfor.

Aktive agenser omfattende et biologisk system valgt fra gruppen bestående av virus, viruskomponenter og viruslignende partikler konservert ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres med kapselpolysakkarider avledet fra én eller flere av Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, gruppe A streptokokker, gruppe B streptokokker, Staphylococcus aureus eller Staphylococcus epidermidis. I en foretrukket utførelsesform ville den immunogene sammensetningen omfatte kapselpolysakkarider avledet fra én eller flere av serogruppepene A, C, W-135 og Y fra Neisseria meningitidis. En ytterligere foretrukket utførelsesform ville omfatte kapselpolysakkarider avledet fra Streptococcus pneumoniae. Pneumokokk kapselpolysakkarid-antigenene er foretrukket valgt fra serotypene 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F (mest foretrukket fra serotypene 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F og 23F). En ytterligere foretrukket utførelsesform ville inneholde PRP-kapselpolysakkaridene fra Haemophilus influenzae type b. En ytterligere foretrukket utførelsesform ville inneholde Type 5, Type 8, 336 eller PNAG-kapselpolysakkaridene fra Staphylococcus aureus. En ytterligere foretrukket utførelsesform ville inneholde Type I, Type II, Type III eller PIA-kapselpolysakkaridene fra Staphylococcus epidermidis. En ytterligere foretrukket utførelsesform ville inneholde Type la, Type le, Type II eller Type III kapselpolysakkaridene fra gruppe B-streptokokker. En ytterligere foretrukket utførelsesform ville inneholde kapselpolysakkaridene fra gruppe A-streptokokker, foretrukket ytterligere omfattende minst ett M-protein og mer foretrukket multiple typer av M-protein.

I én utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er de bakterielle polysakkaridene fullengde, som er rensede native polysakkarider. I en alternativ utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse, er polysakkaridene skjært til mellom 2 og 20 ganger, foretrukket 2-5 ganger, 5-10 ganger, 10-15 ganger eller 15-20 ganger, slik at polysakkaridene er mindre i størrelse for større påvirkelighet. Oligosakkarider anvendes i en foretrukket utførelsesform. Oligosakkarider inneholder typisk mellom 2 og 20 repeterte enheter.

Slike kapselpolysakkarider kan være ukonjugerte eller konjugert til et bærerprotein slik som tetanustoksoid, tetanustoksoid fragment C, difteritoksoid, CRM197, pneumolysin, Protein D (US6342224). Tetanustoksin, difteritoksin og pneumolysin detoksifiseres enten ved genetisk mutasjon og/eller foretrukket ved kjemisk behandling.

Polysakkaridkonjugatet kan fremstilles ved hvilken som helst koblingsteknikk. Polysakkaridet kan for eksempel kobles via en thioeterbinding. Denne konjugasjonsmetoden er avhengig av aktivering av polysakkaridet med 1-cyano-4-dimetylaminopyridiniumtetrafluorborat (CDAP) for å danne en cyanat-ester. Det aktiverte polysakkaridet kan så kobles direkte eller via en spacer-gruppe til en aminogruppe på bærerproteinet. Foretrukket kobles cyanat-esteren med heksandiamin og det amino-avledede polysakkaridet konjugeres til bærerproteinet ved anvendelse av heteroligeringskjemi omfattende dannelsen av thioeterbindingen. Slike konjugater er beskrevet i PCT publisert søknad W093/15760 Uniformed Services University.

Konjugatene kan også fremstilles ved direkte reduktive amineringsmetoder som beskrevet i US 4365170 (Jennings) og US 4673574 (Anderson). Andre metoder er beskrevet i EP-0-161-188, EP-208375 og EP-0-477508.

En ytterligere metode omfatter kobling av et cyanogenbromid-aktivert polysakkarid derivatisert med adipinsyre-hydrazid (ADH) til proteinbæreren ved Karbodiimid-kondensering (Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256).

Foretrukne pneumokokkprotein-antigener er de pneumokokkproteinene som er eksponert på den ytre overflaten hos pneumokokker (i stand til å bli gjenkjent av en verts immunsystem under i det minste del av livssyklusen for pneumokokker), eller er proteiner som sekreteres eller frigjøres av pneumokokker. Mest foretrukket er proteinet et toksin, adhesin, 2-komponent signaltransduserer, eller lipoprotein fra Streptococcus pneumoniae, eller fragmenter derav. Spesielt foretrukne proteiner omfatter, men er ikke begrenset til: pneumolysin (foretrukket detoksifisert ved kjemisk behandling eller mutasjon) [Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18 (13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 og 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007 (1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties". WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA og transmembrandelesjonsvarianter derav (US 5804193 - Briles et al.) ; PspC og transmembrandelesjonsvarianter derav (WO 97/09994 - Briles et al.); PsaA og transmembrandelesjonsvarianter derav (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64 (12):5255-62 "Sequence heterogenity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae") ; pneumokokk-kolinbindende proteiner og transmembrandelesjonsvarianter derav; CbpA og transmembrandelesjonsvarianter derav (WO 97/41151; WO 99/51266); glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); M-lignende protein, (EP 0837130) og adhesin 18627, (EP 0834568). Ytterligere foretrukne pneumokokkproteiner er de som er fremlagt i WO 98/18931, spesielt de selektert i WO 98/18930 og PCT/US99/30390.

Foretrukne neisseriaproteiner som kan formuleres med den immunogene sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter TbpA (WO93/06861; EP586266; WO92/03467; US5912336), TbpB (WO93/06861; EP586266), Hsf (W099/31132), NspA (W096/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (også kjent som D15) (WO00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (W096/31618 se SEKV ID NR:38), FrpA eller FrpC eller en konservert del felles for begge på minst 30, 50, 100, 500, 750 aminosyrer (WO92/01460), LbpA og/eller LbpB (PCT/EP98/05117; Schryvers et al Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (WO98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), Iipo02 (PCT/EP99/08315), MltA (WO99/57280) og ctrA (PCT/EP00/00135). Neisseria-proteiner tilsettes foretrukket som rensede proteiner som del av et yttermembran-preparat.

Vaksinen formuleres foretrukket med antigener som gir beskyttelse mot én eller flere av Difteri, Tetanus og Bordetella perfuss/s-infeksjoner.

Pertussiskomponenten kan være drepte helcelle B. pertussis (Pw) eller acellulær pertussis (Pa) som inneholder minst ett antigen (foretrukket to eller alle tre) fra PT, FHA og 69kDa pertaktin. Visse andre acellulære vaksiner inneholder også agglutinogener slik som Fim2 og Fim 3 og disse vaksinene er også medregnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse. Antigenene som gir beskyttelse mot difteri og tetanus er typisk difteritoksoid og tetanustoksoid. Toksoidene er kjemisk inaktiverte toksiner (for eksempel etter behandling med formaldehyd) eller toksiner inaktivert ved innføring av én eller flere punktmutasjoner.

Alternativt kan den svært viskøse væsken ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes som et kit med det svært viskøse flytende glasset i én beholder og flytende DTPa eller DTPw i en annen beholder. Slike kit kan for eksempel omfatte en sprøyte med todelt kammer hvor de tørkede og flytende komponentene er inneholdt i den samme sprøyten men i forskjellige kammere. Den tørkede komponenten rekonstitueres deretter med den flytende vaksinen umiddelbart før injeksjon som en enkelt vaksine. Følgelig rekonstitueres, for eksempel, den svært viskøse væske-sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse med den flytende DTPa eller DTPw-vaksinen (foretrukket ekstemporert) og administreres som en enkelt vaksine. DTPa eller DTPw-vaksinen er typisk tilsatt adjuvans i det minste delvis aluminiumhydroksid (for eksempel Infanrix® og Tritanrix®-vaksiner fra GlaxoSmithKline Biologicals s.a.).

Vaksinen kan også eventuelt omfatte én eller flere antigener som kan beskytte en vert mot "non-typeable" Haemophilus influenzae, RSV og/eller ett eller flere antigener som kan beskytte en vert mot influensavirus.

Foretrukne "non-typeable" H. influenzae proteinantigener omfatter Fimbrin-protein (US 5766608) og fusjoner omfattende peptider derfra (for eksempel LB1-fusjon)

(US 5843464 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, protein D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap og D15.

Foretrukne influensavirus-antigener omfatter hele, levende eller inaktivert virus, kløyvede influensavirus, dyrket i egg eller MDCK-celler, eller Vero-celler eller hele influensavirosomer (som beskrevet av R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) eller rensede eller rekombinante proteiner derav, slik som HA, NP, NA, eller M-proteiner, eller kombinasjoner derav.

Foretrukne RSV (Respiratorisk syncytialvirus)-antigener omfatter F - glykoproteinet, G-glykoproteinet, HN-proteinet, M-proteinet eller derivater derav. Det skulle forstås at antigene sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte ett eller flere kapselpolysakkarider fra en enkelt bakterieart. Antigene sammensetninger kan også omfatte kapselpolysakkarider avledet fra én eller flere bakteriearter.

Immunoqene sammensetninger og vaksiner

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter immunogene sammensetninger eller vaksiner omfattende den svært viskøse væsken ifølge foreliggende oppfinnelse og en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

Foretrukket inneholder den immunogene sammensetningen eller vaksinen en mengde av en adjuvans tilstrekkelig til å øke immunresponsen til immunogenet. Egnede adjuvanser omfatter, men er ikke begrenset til, aluminiumsalter, squalen-blandinger (SAF-1), muramylpeptid, saponinderivater, mykobakterie-cellevegg-preparater, monofosforyl lipid A, mykolsyre-derivater, ikke-ioniske block kopolymer-surfaktanter, Quil A, koleratoksin B-subenhet, polphosphazene og derivater, og immunstimulerende komplekser (ISCOMs) slik som de beskrevet av Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875. For veterinær anvendelse og for fremstilling av antistoffer i dyr kan mitogene komponenter av Freunds adjuvans anvendes.

Som for alle immunogene sammensetninger eller vaksiner, må de immunologisk virksomme mengdene av immunogenene bestemmes empirisk. Faktorer som må tas i betraktning omfatter immunogenisiteten, hvorvidt immunogenet vil bli sammensatt med eller kovalent bundet til en adjuvans eller bærerprotein eller andre bærere, administreringsruterog antall immuniserende doseringer som skal administreres. Slike faktorer er kjent på vaksineområdet og det er godt innenfor immunologers ferdigheter å foreta slike bestemmelser uten overdreven eksperimentering.

Det aktive agenset kan være til stede i varierende konsentrasjoner i den svært viskøse væsken eller vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse. Minimumskonsentrasjonen av substansen er typisk en mengde nødvendig for å oppnå dens tiltenkte anvendelse, mens maksimumskonsentrasjon er den maksimale mengden som vil forbli i løsning eller homogent suspendert inne i den initielle blandingen. For eksempel er minimumsmengden av et terapeutisk agens foretrukket en som vil gi en enkelt terapeutisk effektiv dosering. For bioaktive substanser er minimumskonsentrasjonen en mengde nødvendig for bioaktivitet ved rekonstituering og maksimumskonsentrasjonen er ved det punktet ved hvilket en homogen suspensjon ikke kan opprettholdes. I tilfellet av enkelt-doserte enheter, er mengden den for en enkelt terapeutisk anvendelse. Generelt er det forventet at hver dose vil omfatte 1-100ug protein-antigen, foretrukket 5-50ug og mest foretrukket 5-25ug. Foretrukne doser av bakterielle polysakkarider er 10-20ug, 10-5ug, 5-2,5ug eller 2,5-1 ug. Den foretrukne mengden av substansen varierer fra substans til substans men kan lett bestemmes av fagfolk på området.

Svært viskøs væske omfattende et aktivt agens

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er en svært viskøs væske omfattende et aktivt agens som foretrukket er oppnåelig eller oppnås ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Det aktive agenset bibeholder foretrukket sin aktivitet og/eller antigenisitet og/eller immunogenisitet etter tørking ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og senere rekonstituering. Foretrukket bibeholdes minst 40, 50, 60, 70, 80, 90 eller 95% av det aktive agensets aktivitet, antigenisitet eller immunogenisitet. Dette kan bestemmes ved hvilken som helst egnet metode, for eksempel som beskrevet ovenfor.

Svært viskøse væsker ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatter foretrukket en glassdannende polyol valgt fra gruppen bestående av glukose, maltulose, iso-maltulose, laktulose, sukrose, maltose, laktose, sorbitol, iso-maltose, maltitol, laktitol, palatinit, trehalose, raffinose, stakyose, melezitose og dekstran.

Svært viskøs væske ifølge foreliggende oppfinnelse kan inneholde et biologisk system, for eksempel vimser. Det kan ytterligere omfatte molekyler, for eksempel proteiner, peptider, aminosyrer, polynukleinsyrer, oligonukleotider, polysakkarider, oligosakkarider, polysakkarid-proteinkonjugater, oligosakkarid-proteinkonjugater. Det kan også omfatte kombinasjoner av omfattende to eller flere av de ovennevte aktive agensene.

Foretrukne utførelsesformer omfatter en svært viskøs væske foretrukket oppnådd eller oppnåelig ved en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse hvori det aktive agenset er eller omfatter en vaksine eller vaksinekomponent. Foretrukne komponenter av vaksinen er beskrevet ovenfor og inkluderer IPV, mer foretrukket IPV og bakterielle polysakkarider, foretrukket polysakkarider eller oligosakkarider fra Haemophilus influenzae b og Neisseria meningitidis A, C, W og Y.

Foretrukne vaksinekomponenter omfatter IPV (en inaktivert blanding av poliovirus-stammer). Foretrukket kombineres IPV med ett eller flere av Hib PRP-polysakkarider og/eller meningokokk A, C, W og/eller Y-polysakkarider og/eller pneumokokk-polysakkarider (som beskrevet ovenfor), mer foretrukket IPV og Hib; IPV og MenC; IPV, Hib og MenC; IPV og MenA og C; IPV, Hib, Men A og C; eller IPV, Hib, Men C og Y.

I de ovennenevnte sammensetningene hvor polysakkarider anvendes, kan også oligosakkarider benyttes (som definert ovenfor).

Selv om disse sammensetningene kan omfatte adjuvans (som beskrevet ovenfor), er de foretrukket uten adjuvans eller omfatter foretrukket ikke aluminiumsalter.

Polysakkaridene eller oligosakkaridene er foretrukket konjugert til et peptid eller bærerprotein omfattende T-hjelperepitoper (som beskrevet ovenfor).

Den svært viskøse væsken ifølge foreliggende oppfinnelse kombineres foretrukket med andre antigener i en kombinasjonsvaksine som eventuelt er uttørket eller foretrukket flytende formuleringer som kan anvendes for å rekonstituere de tørkede komponentene. Foretrukne antigener som kan kombineres med innholdene av beholderen ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer én eller flere av difteritoksoid, tetanustoksoid, helcelle pertussis (Pw), acellulær pertussis (Pa)

(som beskrevet ovenfor), Hepatitt B-overflateantigen, pneumokokk-polysakkarider, pneumokokk-proteiner, neisseria-polysakkarider, neisseria-proteiner. Bakterielle

polysakkarider kan konjugeres til et bærerprotein slik som tetanustoksoid, tetanustoksoid fragment C, difteritoksoid, CRM197, pneumolysin, Protein D (US6342224) som beskrevet ovenfor.

Et ytterligere aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine omfattende trinnet med å rekonstituere den svært viskøse væsken i en vandig løsning. I en foretrukket utførelsesform omfatter den vandige løsningen difteritoksoid, tetanustoksoid og Pertussis (acellulær eller helcelle)-antigener og omfatter eventuelt ytterligere hepatitt B-overflateantigen. DTP-vaksinen er eventuelt i det minste delvis tilsatt adjuvans i form av et aluminiumsalt, foretrukket aluminiumhydroksid eller aluminiumfosfat.

En annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er et kit omfattende den svært viskøse væsken ifølge foreliggende oppfinnelse inneholdt i en første beholder og en vaksine omfattende flytende DTP (acellulær eller helcelle) i en andre beholder. En sprøyte med todelt kammer kan anvendes som beskrevet ovenfor.

Eksempler

Eksemplene nedenfor er utført ved anvendelse av standardteknikker, som er velkjente og rutinemessige for fagfolk på området, unntatt hvor det er beskrevet i detalj på annen måte. Eksemplene er illustrerende, men begrenser ikke foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1. Etablering av frysebetingelser

Prøver ble fremstilt ved å oppløse sukrose i vann for å gi løsninger på 1 %, 5%, 10% og 20%. Prøver ble plassert inn i et Heto Drywinner 8-85 frysetørkeapparat i hvilket hylle-temperaturen kan reguleres til innenfor 1°C, den endelige temperaturen for kondenseren er -85°C, trykk reguleres med en lufteventil og 6 termoelementer er tilgjengelige for å å måle produktemperaturen. Hylle-temperaturinnstillingen ble opprettholdt ved 15°C gjennom hele prosessen. Trykket ble initielt redusert til 200mBar og opprettholdt på dette nivået i 10 minutter før trykket ble ytterligere redusert til 50mBar, 5mBar, 2,5mBar, 0,75mBar, 0,4mBar og 0,2mBar. Hvert trykknivå ble opprettholdt i 20 minutter for å tillate temperaturen å ekvilibrere og prøvens temperatur ble avlest ved anvendelse av et termoelement. Termoelementer ble festet til prøver med ulike sukrosekonsentrasjoner og temperaturene registrert i tabell 1 er gjennomsnittsverdier av temperaturene.

Resultater

Alle prøver frøs mellom 1,66 og 1,11 mbar, uten hensyn til konsentrasjonen av sukrose til stede. Temperaturene målt ved forskjellige trykk var svært nær de predikert fra trippelpunkt-kurven. Derfor har ikke tilstedeværelsen av sukrose stor effekt på temperaturen av prøvene ved forskjellige trykk.

For å unngå frysing av prøven, skulle trykket opprettholdes over 2mBar for en hylle-temperatur på 15°C. Ved lavere temperaturer skulle trykket opprettholdes ved et høyere nivå mens anvendelse av en høyere temperatur ville tillate trykket å reduseres ytterligere uten at prøvene fryser.

Eksempel 2. Fremgangsmåte for tørking uten frysing eller skumdannelse

Konserveringsprøver inneholdende 5%, 10%, 15% og 25% sukrose ble fremstilt og tilsatt til flasker ("vials"). Prøver ble plassert i et frysetørkeapparat ved en

temperaturinnstilling på 15°C gjennom hele prosessen. Trykket ble initielt redusert til 200mBar og opprettholdt på dette nivået i 10 minutter for å tillate avgassing før ytterligere reduksjon av trykket. Trykket ble ytterligere redusert til 8mbar i to til tre timer under hvilket tidsrom termoelementer inne i prøvene viste at prøvetemperaturen ble redusert til 4°C på grunn av evaporativ kjøling. Etter 2-3 timer vendte temperaturen av prøvene tilbake til 15°C, noe som indikerer at evaporasjon under disse temperatur og trykkbetingelsene var nær komplettering. Under dette trinnet i fremgangsmåten, kokte ikke prøven for å danne et skum eller frøs slik at et aktivt agens i prøven er eksponert for så lite stress som mulig. Prøven har et utseende som viskøs væske.

Ytterligere tørking av prøvene ble oppnådd ved å redusere trykket ytterligere til 0,1mbarmens hylle-temperaturinnstillingen ble holdt på 15°C. Disse betingelsene ble opprettholdt i ytterligere 10-16 timer. Under denne fasen forble prøvetemperaturen ved 15°C siden hastigheten av evaporasjon var langsom. Ytterligere tørking fant sted og den resulterende prøven hadde et fast utseende. Dersom prøven ble anbrakt på siden, saktnet prøveinnholdene svært langsomt, over en periode på dager noe som viser at prøven er et flytende glass med høy viskositet. Figur 1 viser utseendet av væsken med høy viskositet.

Eksempel 3 Bibeholdelse av IPV-immunogenisitet etter tørking uten frysing eller skumdannelse

Slike prøver har ikke blitt utsatt for belastninger forbundet med boblingen som følger skumdannelse eller frysing. Eksperimenter ble utført for å bestemme hvorvidt denne fremgangsmåten fremstilte et høyt nivå av antigen-bibeholdelse når den ble anvendt for å tørke IPV.

Tre separate eksperimenter ble utført i hvilke IPV ble resuspendert i en vandig løsning med 10% sukrose eller 10% trehalose som det stabiliserende agenset. Prøvene ble anbrakt i silikoniserte flasker som ble plassert inn i et Heto Drywinner 8-85 frysetørkeapparat og temperaturen ble innstilt på 15°C. Trykket ble initielt redusert til 35mBarfor å avgasse prøven. Etter 10 minutter ble trykket ytterligere redusert til 8mBar og ble holdt på dette nivået i to timer. Under denne perioden ble temperaturinnstillingen holdt ved 15°C og temperaturen inntil prøven ble registrert. Ettersom vann fordampet fra prøven sank temperaturen til 4°C men mot slutten av de to timene gikk temperaturen tilbake til 15°C da hastigeten av evaporasjon saktnet. Ingen bobling eller skumdannelse oppsto under disse betingelsene. Trykket ble så redusert ytterligere til 0,1 mbar og disse betingelsene ble opprettholdt i ytterligere 16 timer i de første to eksperimentene og i ytterligere 10 timer i det tredje eksperimentet.

Prøvene ble rekonstituert i vann og en ELISA ble anvendt for å vurdere bibeholdelsen av antigenisitet for de tre poliovirus-stammene. Det monoklonale antistoffet mot type 3 IPV, ble anvendt i en ELISA for å vurdere graden av antigen-bibeholdelse i den rekonstituerte, frysetørkede prøven sammenlignet med en referanseprøve som ikke hadde blitt frosset. Resultater er presentert som en prosentandel av avlesningen gitt for en prøve som ikke hadde gjennomgått en tørkingsmetode.

Resultater

De tørkede prøvene hadde utseende som fast stoff imidlertid viste de seg å være i form av en svært viskøs væske/glass siden, over en periode på dager, den tørkede prøven var i stand til å flyte dersom beholderen ble snudd opp ned.

Disse nivåene av bibeholdelse av type 3 IPV-antigen sammenlignes svært fordelaktig med frysetørkingsresultatene vist nedenfor hvor svært lave verdier vanligvis ble funnet i det samme ELISA-formatet når et monoklonalt antistoff mot type 3 ble anvendt.

Eksempel 4 Stabilitet ved langtidslagring av tørket IPV lagret som en svært viskøs væske/glass.

IPV tørket ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 3 ble lagret ved 4°C i 9 måneder. Prøvene ble rekonstituert i vann med 150mM NaCI og en ELISA ble anvendt for å vurdere bibeholdelsen av antigenisitet for de tre poliovirus-stammene. Tre monoklonale antistoffer, ett mot hver stamme, ble anvendt i separate ELISA'erfor å vurdere graden av antigen-bibeholdelse i den rekonstituerte lagrede prøven. En lignende ELISA hadde blitt utført på rekonstituerte prøver fra den samme batchen før lagring. Alle resultatene ble sammenlignet med en referanseprøve som ikke hadde blitt tørket. Resultater er presentert som en prosentandel av avlesningen gitt for en prøve som ikke hadde gjennomgått en tørkingsmetode.

Resultater

Derfor kan IPV som har blitt tørket ved fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 3 lagres ved 4°C i minst 9 måneder uten tap av antigenisitet.

Eksempel 5 Sammenligning av immunogenisiteten in vivo av IPV etter tørking for å danne en svært viskøs væske og rekonstituering sammenlignet med utørket IPV

Grupper på 10 Wistar-rotter ble inokulert med forskjellige fortynninger av IPV som hadde blitt tørket i nærvær av 10% sukrose for å danne en svært viskøs væske ved anvendelse av fremgangsmåten fremlagt i eksempel 2 og rekonstituert. Ytterligere grupper på 10 Wistar-rotter ble inokulert med referanseprøver av IPV som hadde blitt fremstilt på samme måte men som ikke hadde blitt tørket.

Etter 21 dager ble sera tatt fra alle rottene og seraene ble testet i separate immunpresipiteringsanalyser ved anvendelse av Type 1, Type 2 og Type 3 poliovirus.

Resultater er vist tabell 5 som inneholder:- a) antallet av responderende rotter for hver IPV-fortynning, b) ED50 som er dosen som kreves for å sikre at 50% av rottene serokonvert som vurdert ved immunpresipiteringsanalysen og c) den relative potensen av det tørkede og rekonstituerte IPV sammenlignet med den utørkede referanse-IPV.

JLEO 17/05 er en IPV-batch som ble tørket for å danne en svært viskøs væske og senere rekonstituert. JLE097 er den utørkede referansen.

Tabell 5 viser at antallet respondanter inokulert med hver fortynning av IPV er likt mellom de to batchene av tørket og rekonstituert IPV og den utørkede referanseprøven. Generelt frembrakte Type 1 IPV den beste immunresponsen, og Type 2 frembrakte en immunrespons i litt færre rotter. Type 3 frembrakte den svakeste immunresponsen.

Fremgangsmåten for tørking for å danne en svært viskøs væske svekker ikke IPVs evne til å frembringe immunpresipiterende antistoffer in vivo. En relativ potens (RP)-avlesning på 1,0 indikerer at prøven frembringer en ekvivalent respons til referanseprøven. Begge tørkede prøver produserer RP-avlesninger på nær 1,0 for alle tre typer av poliovirus noe som indikerer at tørkeprosessen ikke påvirker prøvens evne til å frembringe en immunrespons.

Eksempel 6 Effekt av tørking for å danne en svært viskøs væske ved anvendelse av sukrose eller trehalose som stabiliserende middel på IPVs evne til å frembringe en immunopresipiterende immunrespons in vivo

Grupper på 10 Wistar-rotter ble inokulert med IPV som hadde blitt tørket i nærvær av enten 10% sukrose eller 10% trehalose som beskrevet i eksempel 2, og så rekonstituert. Ytterligere grupper på 10 Wistar-rotter ble inokulert med en ekvivalent mengde IPV som ikke hadde blitt tørket, som referanseprøven

Etter 21 dager ble sera oppsamlet fra alle rottene og en immuno nøytralisasjons-analyse, som beskrevet i Eksempel 5 ble anvendt for å vurdere mengden av immuno-nøytraliserende antistoff som hadde blitt frembrakt mot hver av Type 1, Type 2 og Type 3 poliovirus.

Relative potenser ble beregnet for hver prøve ved å sammenligne immunresponsen med den frembrakt ved den utørkede referanseprøven.

Resultater er vist i Tabell 6.

Mengden av vann som er igjen i prøver var lavere når sukrose ble anvendt som stabiliserende middel med omtrent 5% gjenværende fuktighet sammenlignet med omtrent 10% når trehalose ble anvendt som det stabiliserende middelet målt ved en Karl Fischer coulometrisk fuktighetsanalysator.

Både sukrose og trehalose var effektive for å stabilsere IPV under tørkeprosessen slik at det rekonstituerte IPV ga relative potensavlesninger nær 1,0 for de fleste av de ulike typene av poliovirus. De relative potensene var spesielt god for Type 3 poliovirus som taper sin immunogenisitet relativt lett.

Eksempel 7: Måling av fuktighetsgrad ved Karl Fischer

Analyse ble utført i et Karl Fischer titrometer (Aqua 30.00-Elektrochemie Halle). Prøven ble veid av og anbrakt i ovnen ved en innstilling på 80°C. Prøven ble skylt med nitrogengass og deretter tilsatt til hydranal reagens (Riedel de Hahn) for å utføre analysen ved coulometri.

Claims (28)

1. Fremgangsmåte for konservering av et aktivt agens, karakterisert vedat det omfatter trinnene med å: a) fremstille en konserveringsprøve ved å oppløse/suspendere et aktivt agens i en løsning med et stabiliserende agens; b) utsette konserveringsprøven for en temperaturbetingelse over 0°C og en trykkbetingelse under 30 mbar slik at konserveringsprøven taper løsningsmiddel ved evaporasjon, uten frysing eller bobling involvert i skumdannelse, for å danne en viskøs væske, idet det aktive middelet omfatter et biologisk system valgt fra gruppen bestående av virus, viruskomponenter og viruslignende partikler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere omfatter et trinn med å: c) ytterligere utsette konserveringsprøven for slike temperatur- og trykkbetingelser slik at den viskøse væsken tørker for å danne en svært viskøs væske, hvor den svært viskøse væsken har et løsningsmiddelinnhold som er mindre enn eller lik 15% (v/v).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat trykket reduseres til 20 mbar eller lavere under trinn b).

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-3,karakterisert vedat temperaturen utenfor konserveringsprøven er mellom 5°C og 37°C under trinn b).

5. Fremgangsmåte ifølge kravene 2-4,karakterisert vedat temperaturen utenfor konserveringsprøven er mellom 5°C og 37°C i trinn c).

6. Fremgangsmåte ifølge kravene 2-5,karakterisert vedat temperaturen utenfor konserveringsprøven er høyere under trinn c) enn den er i trinn b).

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat temperaturen utenfor konserveringsprøven økes til over 20°C under trinn c).

8. Fremgangsmåte ifølge kravene 2-7,karakterisert vedat trykket er redusert i trinn c) sammenlignet med trykket under trinn b).

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat trykket reduseres til 1mbar eller lavere under trinn c).

10. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-9,karakterisert vedat trinn b) fullføres på mindre enn fire timer.

11. Fremgangsmåte ifølge kravene 2-10,karakterisert vedat trinnene b) og c) fullføres på mindre enn 12 timer.

12. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-11,karakterisert vedat det stabiliserende middelet omfatter en glassdannende polyol, valgt fra gruppen bestående av glukose, maltulose, iso-maltulose, laktulose, sukrose, maltose, laktose, sorbitol, iso-maltose, maltitol, laktitol, palatinit, trehalose, raffinose, stakyose, melezitose og dekstran.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat det stabiliserende agenset er sukrose.

14. Fremgangsmåte ifølge kravene 12-13,karakterisert vedat konsentrasjonen av stabiliserende agens er mindre enn 15%.

15. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-14,karakterisertve dat konserveringsprøven omfatter fenolrød.

16. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-15,karakterisert vedat konserveringsprøven tørkes i en beholder med en løsningsmiddelavvisende indre overflate.

17. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-16,karakterisert vedat det aktive agenset omfatter IPV (inaktivert poliovirus).

18. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 -17,karakterisert vedat det aktive middelet omfatter en vaksine.

19. Svært viskøs væske,karakterisert vedat at den omfatter et aktivt middel hvor antigenisiteten eller aktiviteten til det aktive middelet er konservert oppnåelig ved fremgangsmåten ifølge kravene 1-18, idet den svært viskøse væsken har et løsningsmiddelinnhold mindre enn eller lik 15% (v/v) og hvor det aktive middelet omfatter et biologisk system valgt fra gruppen bestående av virus, viruskomponenter og viruslignende partikler.

20. Svært viskøs væske ifølge krav 19,karakterisert vedat den omfatter en glassdannende polyol valgt fra gruppen bestående av glukose, maltulose, iso-maltulose, laktulose, sukrose, maltose, laktose, sorbitol, iso-maltose, maltitol, laktitol, palatinit, trehalose, raffinose, stakyose, melezitose og dekstran.

21. Svært viskøs væske ifølge krav 20,karakterisert vedat den glassdannende polyolen er sukrose.

22. Svært viskæs væske ifølge krav 19-21,karakterisert vedat det aktive agens omfatter en vaksine.

23. Svært viskøs væske ifølge krav 19-22,karakterisert vedat den er inneholdt i en beholder med en løsningsmiddel-frastøtende indre overflate.

24. Immunogen sammensetning eller vaksine,karakterisert vedat den omfatter den svært viskøse væsken ifølge kravene 19-22 og en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

25. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine,karakterisert veda t den omfatter trinnet med å rekonstituere den svært viskøse væsken ifølge krav 19-22 i en vandig løsning.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25,karakterisert vedat den vandige løsningen omfatter difteriaantigen, tetanusantigen og pertussisantigen (acellulær eller helcelle).

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisert vedat DTP-vaksinen er i det minste delvis tilsatt adjuvans med aluminiumhydroksid.

28. Kit,karakterisert vedat det omfatter den svært viskøse væsken ifølge kravene 19-22 inneholdt i en første beholder og en flytende vaksinekomponent i en andre beholder.