TWI332843B

TWI332843B - Immunogenic composition

Info

Publication number: TWI332843B
Application number: TW092130228A
Authority: TW
Inventors: Mayeresse Yves; Stephenne Jean
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2002-11-01
Filing date: 2003-10-30
Publication date: 2010-11-11
Also published as: CA2503946C; NZ539613A; NZ539706A; CA2503946A1; EP2395073B1; JP2006504801A; PL376950A1; MXPA05004528A; AU2003278166A1; NO20051998D0; US8409587B2; KR101058978B1; PT1556477T; DK1556477T3; NO344759B1; DE60311526D1; MY145693A; NO20180874A1; US8449865B2; WO2004039399A1

Description

1332843 玖、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種免疫組合物，其包含一種保有免疫性之非活化小兒麻痺病毒（IPV)之乾燥固體或高黏性液體調配物。本發明亦包括一種疫苗，其包含一種〖p V之乾燥固體或向黏性液體調配物。本發明另—種態樣係一種用於將非活化的小兒麻痺病毒（IPV)保存為乾燥固體或高黏性液體之方法。該方法包含藉由將IP V及細菌多醣體溶解或懸浮於 t疋劑溶液中以製備樣本，並使該樣本受到溫度及壓力的處理，以使溶劑從該樣本消失。維持或調整壓力及溫度的條件以移除溶劑，使樣本乾燥成為一種固體或高黏性液體。該調配物可於使用前沖調（reconstituted)或直接使用。【先前技術】 IPV是一種已知的疫苗成份，但其係被調配成液體，例如 Infandx penta®〇已知冷凍乾燥ιρν的方法與抗原性的喪失具有關聯性，而難以調配出一種含有乾燥形式的ιρν之疫苗。乾燥疫苗調配物以為人所知，特別是在細菌多醣體的例子中b型流行性感冒嗜血桿菌（Hib)之pRp多醣體通常被調配成乾燥固體’例如在！nfanrix hexa®中（W0 99/48525)。乾燥的IPV調配物係有利的原因有數個。乾燥調配物具有良好的貯存性且可增加含有IPV之疫苗的保存期限β使Ip v 乾燥的可能性也使得IPV成為更具選擇性的疫苗組份，並使 IPV調配在新的組合疫苗中，這在以前是無法做到的。某些疫苗含有在使用前立即混合的液體及乾燥固體組份（例如 O:\89\89024.DOC -6- 1332843

Infaimx hexa®)t> Infanrix hexa®含有乾燥的 mb組份，其係在使用别與DTPa-HepB-IPV—起沖調。藉由將lpv與mb調配在—起成為一種乾燥固體’可能就可以將另一種與IPV不相容的成份，加入疫苗的液體部份。該技藝中已知數種疫苗組份的技藝。傳統上，這可用先製造物質溶液在冷凍樣本的冷凍乾燥法做到。在第一乾燥 /月守藉由於減壓狀態下從冰昇華來移除大部份的水分，形成有孔洞的「糕狀物」。當壓力及溫度改變時，接下來通常是第二乾燥期，水分從該乾燥的糕狀物蒸發。所得到的冷珠乾燥樣本要比液體調配物更具有改善的安定性。但是，冷凌乾燥的方法既長且是製造方法中之速限步驟。當許多樣本在大型乾燥器單元中經過批次冷康乾燥後所造成的產物變化性，也是一個問題。冷康乾燥器的棚架狀態於不同位置时有所不同，這會造成樣本在不同情況下以不同速度受料隸燥。料如活性料之㈣特定生物材料而t ’在冷;東乾燥過程中，會明顯喪失活性（胸〇944)ACS SympGslum 567:12G_133)。許多冷綠燥的物質在常溫下仍然是不安定的（Carpenter等人（i994)acs

Symposium 567 ； 134-147) 〇冷康方法中所造成的破壞可藉由使用如多元醇之類的抗動劑規避至某㈣度。6知藉由避免在處理及煮沸去水時冷康樣本以進-步改良冷凌乾燥的方法（w〇96/4gg77;us 6306345)。這個方法涉及劁借尤.s 及氣備在適合溶劑中之玻璃基質形成材料與要被保存的樣本之混合物洞1整體》谷劑從該混合

O:\W\39024.DOC 1332843 物？备發以獲得漿液，將該漿液曝露於足以將該漿液煮沸及移除殘餘溶劑的壓力及溫度下。 US5,766’520描述有相似的方法，其中該方法涉及部份移除水份以形成黏稠的液體並將該漿液受到真空處理以使其沸騰，再進一步於實質上低於l〇(rc之溫度下乾燥。這個方法受限於習知冷凍乾燥的一些問題。在大型冷凍乾燥器中貫施個方法時，樣本會依其等所在之棚架的位置不同，而以不同的速率乾燥，使得不同的樣本在乾燥過程十所喪失不同的活性量。如此會造成同一批次中缺乏一致性。到目前為止，未曾有人報告過製造出保有高度抗原性及/ 或免疫性之IPV乾燥固體疫苗調配物的成功例子。【發明内容】因此，本發明揭示一種包含有IPV與安定劑之免疫組合物，其係調配成乾燥組成物或高黏性液體，而於沖調後產生對抗小兒麻痺病毒的免疫反應。安定劑的存在對於抗原的保存而言是具有重要性的，而多元醇則表現出其有效性。IPV以在細菌多醣體的存在下乾燥為較佳，這使得原始杬原的抗原性及免疫性獲得高度的保留。本發明包括保存含有IPV組合物的方法，以存在有多元醇與細菌多醣體為較佳，其中IPV的抗原性及/或免疫性受到保留。在多醣體的存在下冷凍乾燥ipV要比僅僅冷凍乾燥IPV更可使ιρν之抗原保留獲得改善。此外，Hib的免疫性亦藉由與IPV調配在一起成為乾燥固體或高黏性液體調配物而受到加強。特別疋田即恰與液體DTP(描述如下）沖調在一起時，發明人發

O:\89\89024.DOC -8- 1332843 現Hlb的力價不會像在缺乏IPV的情X下被DTP疫苗的氫氧化鋁組份所降低。所用的乾燥方法亦影響Ipv之抗原性及/或免疫性的保留。用於乾燥IPV的泡朱乾燥法，在保留IPV的抗原性來說，要比習知的冷凍乾燥技術更有效果。令人驚訝的是，包含有V東；/驟之/包;;末乾燥法不會造成抗原性的喪失，反而造成快速有效之保存法的發展。本發明另_較佳方法係藉由在無冷凍或泡沫產生的情況下乾燥含有IPV之樣本，造成乾燥調配物（以高黏度液體調配物為較佳）的形成，以保留高度的IPV抗原性及/或免疫性。本發明提供一種IPV的乾燥調配物，其會具有貯存安定的好處。乾燥調配物可在施用前快速而容易地沖調。在使用丰父佳的泡沫乾燥法時，泡沫塊狀物是因為該塊狀物有較大的表面區域而特別容易沖調。 IPV與Hib的乾燥固體或高黏性液體調配物的其他好處包括加強H i b組份的免疫性。已知多組份疫苗中之疫苗調配物的其他部分會干擾Hib的免疫性（W〇96/4〇242、w〇 97/00697)。將IPV包括在具有Hib的疫苗調配物中可解決這個問題，特別是乾燥的；[PV_Hib組份與白喉、破傷風與百曰咳組份在使用前混合時。雖然在細菌多醣體的存在下，可用習知的冷凍乾燥法冷凍乾燥IPV ’但疋仍以使用泡沫乾燥技術或不涉及冷凍或泡沫形成之溫和乾燥法為較佳。這個方法甚至可以保留更高的IP V杬原性及/或免疫性，且所得的塊狀物亦易於快速沖 O:\89\89024.DOC -9- 1332843 調。此種方法亦具有比標準的冷束乾燥劑技術更快速且更具能量效果之錢。因為冷;東乾燥的步驟常是疫苗製造方法中的速限步驟，所以使用這個較佳方法可以獲得更高的疫苗產量而無需另外投資卫廠。在這個較佳泡泳乾燥法中加入冷;東步驟亦改善批量的重現性。詳細說明本發明之免痦性組合物本發明包括免疫性組合物’其係調配成乾燥固體或高黏性液體調配物且包含ipv與安定劑，其中ιρν之抗原性及/ 或免疫性於沖調後獲得保留。IPV之乾躁固體及高㈣液體調配物可產生免疫反應，以對抗小兒麻痺病毒病毒，該免疫反應以保護性免疫反應為較佳，且以沖調及接種後產生該免疫反應為較佳。 IPV係定義為不活化的小兒麻痒病毒（以包含疫苗技藝中之標準株的第！、2' 3型為較佳，且以沙克小兒麻痒疫；為最佳）。IPV疫苗劑量含有20_80(以4〇或8〇為較佳）之第抗原單位（Mahoney)、4 -1 6(以8或1 6為較佳）之第2型D抗原單位（MEF-1)與20-64(以32或64為較佳）第3型之D-抗原單位之 (Saukett)。在以本發明方法進行乾燥時，以保留有未受乾燥法處理的對照樣本之抗原性量的至少4〇%、5〇%、6〇%、7〇0/。、8〇〇/。、 90%' 95%、或98%之第i、2型或第i、2、3型全部之小兒麻痒病毒抗原為較佳；以第1型；第2型；第3型；第1及2型，· 第1及3型’第2及3型；或第1、2及3型受到保留為更佳。這 O:\89\89024.DOC -10- 1332843 可以在將乾燥固體或高黏性液體沖調成水溶液後，藉由任何適σ之包含有用多源及/或單源對抗小兒麻痺病毒第丨、2 及/或3型病毒的抗體&EUSA之方法測定的。以保留有未受乾燥法處理的對照樣本之抗原性量的至少 40 4 50 4、60%、70〇/〇、80%、90%、95¾、或 98%之第 1、 2型或第1、2、3型全部之小兒麻痒病毒抗原為較佳；以第1 型；第2型；第3型；第！及2型；第型；第2及3型；或第1 2及3型焚到保留為更佳。這可以在將乾燥固體或高黏性液體沖調成水溶液後，藉由任何適合之方法測定的。在較佳方法中，乾燥調配物係沖調成水溶液，但並接種至動物（以大白鼠為較佳）體中。在一段適當的時間之後，從接受接種的動物|ί收集抗企清，I測定血清轉換_，以達到相較於未經乾燥之對照樣本係為至少〇 4、〇 5、〇 6、〇.7、 0 · 8或0.9之相對力價為較佳。乾燥固體組合物是一種經冷凍乾燥、昇華、蒸發之方法移除溶劑以使溶劑餘留小於或等於i5%、、 10%、？％' 5%、4%(以3%、2%為較佳而以ι%為更佳）之調配物。用語"乾燥固體"包含具有固體外觀之玻璃物、橡穆體或結晶固體。可用上述任何方法製造這樣的乾燥固體。以昇華或煮沸或蒸發（以蒸發為較佳）移除溶劑。高黏性液體係定義為—種溶劑含量少於或等於"、12、具有之溶劑含量少至足以使活性劑在代保持在安定狀雄下歷時3'6、9、12或24個月，且讓活㈣保留至少4〇、5()、

OrS89\89024.DOC -11 - 1332843 60%(以70、80、90、95%較佳）之抗原性及/或免疫性超過該段時間。高黏性液體從未暴露於涉及泡沫形成之泡泡的形成。高黏性液體以具有乾燥外觀但玻璃狀物且可非常慢地流動過一段數曰之時間（以數週為較佳，以數月為更佳）為較佳。本發明之免疫組合物係調配成乾燥固體或高黏性液體調配物’其包含IPV及安定劑，並以包含有細菌多醣體為較佳。安定劑係下列任一組合物。細菌多醣體包含源自於任何細菌的莢膜多醣體，以一或多種之腦膜炎雙球菌、b型流行性感冒嗜血桿菌、肺炎雙球菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、金色葡萄球菌、表皮葡萄球菌為較佳》以存有呈乾燥固體或高黏性液體之b型流行性感冒嗜血桿菌的PRP莢膜多醣體為較佳。在另一個較佳具體實施例中，免疫組合物包含莢膜多醣體之乾燥固體或高黏性液體調配物，該莢膜多醣體源於一或多種之腦膜炎雙球菌之A、 C、W-135及Y(腦膜炎球菌多醋體）血清型。另一較佳具體實施例包含源自肺炎雙球菌之乾燥固體或高黏性液體調配物。肺炎雙球菌莢膜多醣體抗源以選自於下列血清者為較佳.1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及 33F(以選自血清型1、3、4、5、68'7?'9\/''14、18〇19?及23? 為最佳）。另一具體實施例中，含有第〗、π或m型之表皮葡萄球ϋ之莢膜多醣體。另一具體實施例中含有第Ia、Ic、π 或III型之Β群鏈球菌的莢膜多醣體。另—具體實施例中含有 OA89\89024.DOC -12· 1332843 A群鏈球菌之笑膜多㈣，以另外含有至少蛋白質為較佳，以另外含有數型之“蛋白質為更佳。又在本發明之一具體實施例中，細菌多醣體係具有全長且經純化之天然多醣體。在本發明另一具體實施例中，多醣體的尺寸定在2與20倍之間，以2_5倍、5·1〇倍、1〇_15倍或 15-20倍為較佳，藉此使多㈣的尺寸較小以具有更大的可處理性。在一較佳具體實施例中使用到寡醣。寡醣一般含有"於2與20個之間的重複單元。

本發明更包括-種含有多於—種的細菌多_體與ιρν且呈乾燥固體或高黏性液體之免疫組合物。以IPV係與一或多種型流行性感冒嗜血桿菌）pRp多醋體及/或腦膜炎球囷A、C、W及或γ型多聽體及/或肺炎雙球菌多醣體組合為較佳。以該活性劑包含下列者為較佳：IPV及Hib ; IPV 及 MenC ; IPV及 Hib及 MenC ; IPV及 MenA及 C ; IPV及 Hib 及MenA及C ; IPV及及⑽八及c及γ ;或心及脳及⑽ C及Y 〇上述特^之活性劑亦包括-或多種如下所述之肺炎雙球菌的多醣體。上述組合物中，當使用多醣體時，亦可應用寡醣（定義如上）。雖」化些組合物可受冑佐（adjuvanted)(福述如τ )，但仍以未經調佐為較佳或以不含鋁鹽為較佳。以多塘體或寡騎沾人5 嗯、σ至胜肽或包含辅助τ細胞抗原決定位之蛋白質（如下所述）為為較佳。

O:\S9\S9024.DOC -13- 1332843 存在於本發明之免疫組合物中的笑膜多膽體係結合於或未、。:於載體蛋自，該載體蛋自諸如破傷職毒素、破傷風類毒素片段C、白喉類毒素、CRM197'肺炎鏈球菌溶血素（pneim〇lySin)、蛋自質 D(US6342224)。 ^傷風類毒素、自喉毒素及肺炎鏈球m素係經基因突變去毒及/或以化學處理去毒為較佳。本發明之一較佳具體實施例具有結合至破傷風類毒素之Hib。田夕於一種之結合型多醣體存在於本發明之免疫組合物枯，多醣體係結合至相同的載體蛋白或相異的載體蛋白。本發月之較佳具體實施例含有結合至載體蛋白之腦膜炎球菌多醣體。當存在有結合型Hib與腦膜炎球菌多醣體時，其等係結合至相同的載體蛋白或相異的載體蛋白。可藉由已知之結合技術製備多醣體結合物。在一較佳結合技術中，多醣體係經由硫醚鍵偶聯（c〇upled)。此種結合方法是靠帶有1-氰基-4-二甲胺基-吡啶四氟硼酸（CDAp)活化多醋體以形成氰酸酯。因此活化之多醣體可直接偶合或經由一間隔子基群（spacer group)偶合至一個載體蛋白的胺基基群。以用涉及硫醚鍵形成之異配位（heteroligation)化學技術使氰酸酯與己烷二胺偶合以及胺基衍生之多醣體結合於載體蛋白為較佳。該等結合物係描述於PCT公開申請案 WO 93/15760 Uniformed Service University。該結合物亦可藉由 US 4365170(Jennings)與 US 4673547 (Anderson)所述之直接還原胺化法製備。其他方法則描述於 EP-0-161-188 、 EP-208375及 EP-0-477508 。 O:\89\89024.DOC -14- 1332843 另一種方法涉及藉由碳二亞胺縮合作用，用己二酸醯胼 (ADH)將溴化氰活化之衍生多醣體，結合至載體蛋白（Chu c 等人 Infect. Immunity，1 983 245-256)。合併為本發明免疫性組合物之部份的多醣體係可被吸收的或係可被吸收至一佐劑上的，該佐劑以鋁鹽（磷酸鋁或氫氧化鋁）為較佳，以磷酸鋁為最佳。本發明免疫性組合物包括安定劑，其有助於在乾燥過程中免於被破壞。任何下述之安定劑（含形成玻璃體之多元醇）均可加入免疫性組合物中，該免疫性組合物不論為使用本發明方法之乾燥固體或高黏性液體調配物均可β較佳之安定劑包括蔗糖、山梨糖醇、乳糖及海藻糖。藉由本發明方法乾燥之較佳組合劑可與其它抗原以組合疫田之方式組合，其會被乾燥，或其可與用以沖調乾燥組份之液體調配物組合。其他組份包含有IPV及安定劑之本發明乾燥固體或高黏性液體調

的疫苗。

色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。 —或多種下列者的莢膜多醣體：腦菌、Α群鏈球菌、Β群鏈球菌、金黃球菌。在一較佳具體實施例中，免 O:\89\89024.DOC ' 15- 1332843 疫組合物包含衍生自—或多種腦膜炎雙球菌之血清型A、 C、W-135及Y的莢膜多膝神〜 A膜夕_體》另—較佳具體實施例包含有衍生自肺炎雙球g的荚膜多㈣4炎雙球g的莢膜多骑體抗原以選自於也清型1、2 ' 3 ' 4、5、6B、7F、8、9N ' 9V、H)A、11A'12f、14、15b、17f、i8c、i9a、i9f、 20、22F、23F及 33F為較佳（以選自於 i、3、4、5、6b、7f、 ^⑷心挪及咖為最佳卜另一較佳具體實施例含有金黃色葡萄球菌第5、8或336型之英臈多糖體。另一較佳具體實施例含有表皮葡萄球菌第I、11細型之莢臈多醣體。另-較佳具體實施例含有B群鏈球菌之第h、化、^或 III型笑膜多it體。另-較佳具體實施例可含有_鍵球菌之莢膜多醋體，以另外含有至少一M蛋白質為較佳及以多種類型之Μ蛋白質為更佳。本發明之免疫組合物可與蛋白質抗原調配在一起。較佳的肺炎球菌蛋白質抗原是暴露再肺炎球菌外表面的肺炎球囷蛋白質（可在肺炎球菌至少部份之生命循環中被宿主免疫系統識別出來者）’或是由肺炎球菌釋放或分泌之蛋白質。蛋白質以肺炎雙球菌之毒素、黏附素、2_組份訊號轉導物或之脂蛋白質或其等之片段為最佳。以蛋白質包括有 (但不限於）肺炎鏈球菌溶血素為特佳（以用化學處理或突變去毒為較佳）[Mitchell et al. Nucleic Acids Res_ 1990 Jul 11 ; 18(13): 401〇-c〇mparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23 ； 1007(1)： 67-72 O:\89«9024.DOC -16- 1332843

"Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)] ; PspA及其穿膜剪切變異體（US 5804193 -Briles et al.); PspC及其等之穿膜剪切變異體（WO 97/09994 -Briles et al) ; PsaA 及其穿膜剪切變異體（Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec i 64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae");肺炎雙球菌膽驗結合蛋白質及其穿膜剪切變異體；CbpA及其穿膜剪切變異體（WO 97/41151 ； WO 99/51266) ; 3-磷酸甘油醛脫氫酵素（Infect. Immun. 1996 64:3544) ； HSP70 (WO 96/40928) ； PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14);似 M蛋白質（EP 0837130)及黏附素 18627 (EP 0834568)。另一較佳肺炎雙球菌蛋白質抗原係揭露於WO 98/1893 1者，特別是選自於 WO 98/18930及 PCT/US99/30390者。要與本發明免疫組合物調配在一起之較佳腦膜炎球菌蛋白質包括 TbpA(WO93/06861 ; EP 586266 ； WO 92/03467 ； US 5912336) ' TbpB(WO 93/06861 ； EP 586266)、Hsf(WO 99/ 3 1 132)、NspA(WO 96/29412)、Hap(pCT/EP99/02766)、 PorA、PorB、OMP85(亦以 D15 而為人知）（WOOO/23595)、 PilQ(PCT/EP99/03603)、PldA(PCT/EP99/06718)、FrpB (W096/31618參見 SEQ ID NO:38)、FrpA或 FrpC或至少共同保留兩者的至少30、50、100、5 00、750個胺基酸 O:\89\89024.DOC -17- 1332843 (W092/01460) 、LbpA 及 / 或 LbpB(PCT/EP98/05117 ;

Schryvers et al Med. Microbiol. 1999 32: 1 1 17) ' FhaB(WO 98/02547) ' HasR(PCT/EP99/05989) ' lipo02(PCT/EP99/ 083 15)、MltA(WO99/5 7280)及 ctrA(PCT/EP00/0013 5)。可加入腦膜炎球菌蛋白質之純化蛋白質或部份外膜囊泡製備物。

以將免疫組合物與提供對抗一或多種白喉、破傷風及百曰咳桿菌感染之保護的抗原調配在一起為較佳。百日咳組可以是經殺菌的百曰咳桿菌（Pw)或是以非細胞性百曰咳桿菌（Pa)，該非細胞性百日咳桿菌（Pa)含有至少一（以二種或三種全部為較佳）來自PT、FHA及69kDa外膜蛋白之抗原，特定的其他非細胞性疫亦含有凝集素，諸如Fim 2及Fim 3，該等疫苗亦用於本發明是可以推知的。基本上，提供對抗白喉及破傷風的保護之抗原是白喉類毒素及破傷風類毒素。類毒素是經化學方法去活化的毒素（舉例而言用甲醛之後續處理），或以加入一或多個點突變去活化的毒素。本發明另一種免疫組合物提供一種套組，其具有在一容器中的乾燥固體、泡沫玻璃體或高黏性液體及在另一容器中的液體DTPa或DTPw容器。該套組例如係可包含一具有將乾燥及液體組份包含在同一注射氣但在不同室之雙室注射器。然後在當成單一疫苗注射前，立即將乾燥組份與液體疫苗沖調在一起。因此例如本發明之乾燥固體、泡沫玻璃或高黏性液體係與液體DTPa或DTPw疫苗沖調在一起（以立即沖調為較佳）及以作為單一疫苗來施打。DTPa或DTPw疫 OA89\89024.DOC -18- 1332843 苗基本上係至少部份受到鋁鹽調佐，該鋁鹽諸如磷酸鋁及/ 或氫氧化紹（例如 GlaxoSmithKline Biologicals s.a.之 Infanrix®及 Tritanrix®疫苗）。可視需要將免疫組合物與一或多種抗原調配在一起，該等抗原可保護宿主對抗無法分型的流行性感冒嗜血桿菌、 RSV及/或可保護宿主對抗感冒病毒。較佳之無法分型的流行性感冒嗜灰桿菌蛋白質抗原包括Fimbrin蛋白質（US 5766608)及含有來自其之胜汰的融合體（例如LB1 Fusion) (US 5843464 -Ohio State Research Foundation)、OMP26、 P6、蛋白質 D、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl、Hmw2、Hap、及 D15。較佳的感冒病毒抗原包括完整的活性病毒、裂解的感冒病毒、生長在雞蛋或MDCK細胞或Vero細胞的病毒或者完整的感冒病毒體（flu virosomes，如 R. Gluck所述，Vaccine， 1992, 10, 915-920)或其純化的或重組的蛋白質，諸如HA、 NP、ΝΑ或Μ蛋白質，或其等之組合。較佳的RSV(呼吸道融合瘤病毒）抗原包括F醣蛋白質、G 醣蛋白質、ΗΝ蛋白質、Μ蛋白質或其等之衍生物。此技藝中已知含有DTP-Hib之組合疫苗。但是，某些調配物存有一些問題是涉及Hib與其他抗原之單純混合。除非小心調配，否則提高之抗Hib組份的抗體力價會因為與其他疫苗組份發生干擾，而被降到比分別接種相同劑量之Hib所誘發的抗體力價更低。雖然此一技藝已充分了解這個問題且已提出各種解決方式，本發明免疫組合物將Hib與IPV調配 O:\89\89024.DOC -19- 1332843 在起成為乾燥固體或咼黏性液體，以提供另一種解決此問題的方法。本發明免疫組合物可以作為疫苗套組的一部份，其中ipv 及Hib係存在於該套組中的—種組份，而另一組份係如上所述般存於第二組份中，舉例而言，如本文中述的雙室注射器。這兩種組份係在施打疫苗前混合在一起。在這種調配物中，雖然可視需要而調配成液體，但是含有Ipv及Hib之，.且伤以乾燥固體、泡沫玻璃或高黏性液體為較佳。該調配物使抗Hib組份之抗體力價為臨床上所接受以提供對抗1?型流行性感冒嗜血桿菌病原的保護。基本上，組合疫苗的抗體力價至少為85%、90%，以約100%或高於單價疫苗中相同劑量之Hib所者為較佳。本發明疬m 本發明如上所述之免疫組合物以調配成調配成疫苗為較佳。以疫苗含有之佐劑量足以加強對免疫原之免疫反應為較佳。適合的佐劑包括（但不限於）鋁鹽，諸如氫氧化鋁及磷酸鋁、角鯊烯混合物（SAFd)、胞壁醯胜肽、皂素衍生物、分歧桿菌細胞壁製備物、單磷醯脂A'黴菌酸衍生物、非離子P早蔽共聚物界面活性劑、Quil A、霍亂毒素B次單位、 polphosphazene及其衍生物及免疫刺激複合物（ISC〇Ms),諸如 Takahashi 等人所述者，（199〇) Nature 344:873-875。就獸醫使用及製造動物中的抗體而言，可使用Freund佐劑之有絲分裂原組份。本發明之疫苗調配以在使用前沖調為較佳。沖調涉及將 O:\89\89024.DOC -20- 1332843 疫苗液體組份盘本路日日 /、發月之乾燥固體、泡沫玻璃體或高黏性液體的調配物浪人尤_ ^ 在起。本發明亦包含一種具有拒水内 :表面的容器’其含有本發明之免疫組合物或疫苗。使用這種谷器的好處在於其可使乾燥組合物以一種形式定位在管狀物底部而更亦於沖調。將有色染料加人保存樣本中以更易於觀看當本發明乾燥組合物疋有利的。這在使用前沖調以確定乾燥固體或高黏性液體受到徹底沖調時特別重要。以有色染料在中性pH維持其顏色且可與注射至病人體内者相容為較佳。有色染料以酚紅為較佳。 =所有免疫組合物或疫苗而言，免疫原的免疫有效量須依實際經驗決定。須考慮的因素包括免疫性、投藥途徑及要技藥的劑里數3 (無論免疫原是否與佐劑、載體蛋白或其他載體複合或共價結合）。該等因素係為此項技藝所知且係無須過度實驗即可為熟習免疫懸技藝者所能決定。該物質可以不同的濃度存在於本發明之免疫組合物中。基本上，該物質的最小量係須達到所欲使用的量，而最大量是留存於溶液中或均勻懸浮於初始混合物中之最大量。舉例而言，治療劑的最小量以提供單醫治療有效劑量之量為車乂佳。如果在結晶前行成泡珠玻璃體，則亦可使用超飽和溶液。就生物活性物質而言，最小量是沖調時具有生物 =所需之量’而最大量則是無法維持均句懸浮時的量。就:-劑量的單元而言’該量是單一治療施用的量。一般而言’吾人期望每-劑量會包含㈣之蛋白質抗原，以 O:\89\89024.DOC： -21 - 1332843 5-50料為較佳及以5，g為最 1 Λ 〇Λ , 但1、，’田囷多酶體劑詈阜 _〇肫、10-5/ig、5_2 ^或2 51心體」里疋曾的：r门工‘ 。〆物貝的較佳量隨物貝的不同而有所不同，不決定者。 ’、^该項技藝者所能容易本發明方法〜本發明方法是用於保存含有ίρν及安定劑之組合物，以辦侍IPV抗原性受到保存的組又再乾燥為較佳。 4本巾加有㈣多骑體在—較佳具體實施财，本發明方法涉及乾燥IPV 有下列步驟：將Π>ν懸浮或溶解於安定劑的溶液申以製備保存樣本；以保存樣本中存有細菌多騎體及/或形成破璃體的多元醇為較佳；讓保存樣本受到可使溶劑從該保存樣本消失的溫度與壓力處理；及移除溶劑直到保存樣本乾燥形成固體或高黏性液體，其中 JPV之抗原性及/或免疫性受到保留。在一較佳具體實施例中，保存樣本係於乾燥前裝入具有拒水内部的容器中。本發明另一種方法涉及泡沫形成，其含有下列步驟：將IPV懸浮或溶解於安定劑的溶液中以製備保存樣本；以保存樣本中存有細菌多醣體及/或形成玻璃體的多元醇為較佳；讓保存樣本受到可使保存樣本形成泡沫的溫度與壓力處

O:\89\89024.DOC -22- 1332843 理；及移除冷別直到泡沫乾燥形成固體，其中αν之抗原性及/或免疫性受到保留。本發月較佳之泡沬乾燥法係用具有排水性内部表面的容器’該方法含有下列步驟： •㈣v懸浮或溶解於安定劑的溶液中以製備保存樣本，該女疋4^谷液以存有細菌多醣體及/或形成玻璃體的多元醇為較佳； •將保存樣本裝人具有拒水内部表面的容器中； •讓含有保存樣本的容器受到可使保存樣本形成泡床的溫度及壓力處理； •移除浴劑直到泡沫乾燥形成固體，其中ιρν之抗原性及/或免疫性受到保留。上述之本發明泡沫乾燥法可視需要包含有冷凍步驟。可將保存樣本完全或部份冷凍。因此，本發明的某些方法包含下列步驟：將IPV懸浮或溶解於安定劑的溶液中，及冷康該混合物，以製備至少部份冷凍的保存樣本，該安定劑溶液以存有細菌多醣體為較佳； •讓至少部份冷凍保存樣本受到可使該保存樣本形成泡沫的溫度及壓力處理；及 •移除溶劑直到泡沫乾燥形成固體，其中IPV之抗原及/或免疫性受到保存。上述方法的冷床步驟以泮；東（quench freezing)方法進行 O:\89\89024.DOC -23- 而造成冷凍。這會造成。因此，本發明之方法為車乂佳，其中藉由I π p 拔丄精由络發使壓力降低樣本快速冷凍而 - 之才/1»原的消失較少包括下列步驟：將ipv懸浮戎，、交^ ’該安定劑溶液以存成部份冷柬之減壓處合解於安定劑的溶液中有細菌多醣體為較佳；讓保存樣本受至彳π & & 人至丨可使該保存樣本變讓至少部份冷凍保存樣本受溫度及壓力處理；及到可使該保存樣本形成泡沫的其中IPV之抗原及/或免 •移除溶劑直H末乾燥形成固體疫性受到保存。本發明另-用於保存IPV之較佳方法包含下列步驟： •將IPV懸浮或溶解於安定劑的溶液中； •以洛發讓保存樣本受到可使保存樣本的溶劑消失而無發泡情形之溫度及壓力處理，以形成泡泳體，且已無冷;東情形發生為較佳； •移除溶劑直到樣本乾燥形成高黏性液體，纟中IPV之抗原性及/或免疫性受到保留。本發明方法製造一種IPV的調配物，該IPV的調配物可經付起延長的貯存期限而又能維持抗原性及/或免疫性。以 IPV貯存於4°C下而保留有原始抗原性及/或免疫性之至少 40、50、60、70%(以80、90、95¾為較佳），超過一段至少 3、6、9、12、24個月的期限為較佳。將ιρν沖調在適合的水溶液中後用適合的方法（例如上述者）測定抗原性及免疫 O:\89\89024.DOC -24- 1332843 性。 …、冷’東或泡沫形成之乾燥方法，特別適用於要乾操的活性劑因為暴露於與泡 …， α 體尘成有關之冷凍或發泡狀況而容在乾燥過私申喪失活性及/或抗原性者。該方法一特別適用於以形成玻璃體的多元醇之濃度較低為有利的情形，及/ 或適用於以乾_程較短為有利之情形。安定杳1 要用於本發明方法之安定劑以包含形成玻璃體的多元醇為較佳。適合的㈣包括（但m於）所有的多元醇，包括碳尺化口物及非石反水化合物的多元醇。安定性多元醇中以可使舌14被貯存而無變性、凝集或其他方式造成活性實質喪失者為較佳。特別適合的物質包括糖、糖醇及碳水化合物衍生物。形成玻璃體的多元醇以碳水化合物或其衍生物為較佳包括葡萄糖、麥芽果糖（maltul〇se)、異-麥芽果糖、 4果糖（iactuIose)、嚴糖、麥芽糖、果糖、異麥芽糖、麥芽糖醇、礼糖醇、異麥芽糖醇（palaUnit)、海藻糖、棉實糖、水蘇糖、松三糖或右旋糖酐為較佳’以海藻糖 '蔗糖、山 4醇棉實糖、甘露醇、果糖、蔗糖、乳糖醇或異麥芽糖醇為最佳。細菌多醣體係作用如安定劑，且本發明之較佳具體實施例加入細菌多醣體安定劑之組份。細菌多醣體在該具體實把例中扮演安定劑及免疫原的雙重角色。碳水化合物包括（但不限於）單醣 '雙醣、三醣、寡醣及與其等對應之糖醇、聚羥化合物（諸如碳水化合物之生物及化 O:\89\890J4.DOC -25- 1332843 學改質的碳水化合物、羥基澱粉）及糖聚合物。天然與合成的碳水化合物兩者皆適用。合成的碳水化合物包括（但不限於）具有糖苷鍵為硫羥鍵或碳鍵所取代者。D及L兩型之碳水化合物皆可使用。碳水化合物可以是非還原性的或還原性還原性時，以加入Maillard反應抑制劑為較佳。適用於本發明之還原性碳水化合物係習為該項技藝所知者，及包括（但不限於）葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麥芽果糖及乳果糖。非還原性碳水化合物包（但不限於）非還原性聚羥化合物之配糖體，其係選自於糖醇及其他直鏈多元醇。其他可用之碳水化合物包括棉實糖、棉實糖、松三糖、或右旋糖酐、蔗糖 '纖維素二糖（cenibi〇se)、山梨二糖（mannobiose)及糖醇。糖醇配糖體以單糖甞為較佳，以雙醣還原所獲得之化合物為最佳，諸如乳糖、麥芽糖、乳果糖及麥芽果糖。特佳碳水化合物是海藻糖、蔗糖、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異麥芽糖醇及吡喃葡萄糖基丨―、甘露醇。胺基酸係作用如安定劑且可本身即可使用，且以與多元醇組合為較佳。較佳的胺基酸包括甘胺酸、丙胺酸、精氨酸、離氨酸及麵錢，雖然任何胺基酸或胺基酸之組合、胜肽、水解的蛋白質或如血清蛋白之蛋白質都可作為安定劑。以保存樣本含有可抑制本發明乾燥固體或高黏性液體形成晶體在之組份為較佳。鹽類及其他分子包括胺基酸及盼紅抑制結晶形成。 O:\89\89024.DOC -26- 1332843 ;本發明方法中之女疋劑濃度可介於1 %及π。〆。重量/ 體積之間，以 i-5%、5-·、5，％、15_2〇%、2〇 25%或 =0%為較佳，以小於25%(w/v)為最佳。所需之安定劑的置與鹽份存在量成比例。因此，雖然安定劑的量以介於及10%為較佳，但是-需要10%至25% (w/v)之高濃度以乾燥具有高鹽含量樣本。容器不同混合物及不同容II形狀與尺寸可同時進行處理。理想的方式是，所用的容器尺寸係足以含有初始混合物且容納益形成之乾燥調配物的體積。基本上，這是以形成玻璃體的材料質量'容器表面區域及是否形成泡珠體之溫度及壓力狀況來決定。形成玻璃體的材料之質量必須足以產生有黏性的漿液’而視需要而成為泡沫，該質量實際上轉換成每皁位容器表面區域之最小質量。這個比例隨混合物及要用的裔而變化，伯；含β热羽 ι化仁w疋热習該項技藝者可視實際需要根據下列本文中戶斤试；夕4 + 又〒所述之軚序而決定的。這類可使用之容器、包括Wheaton模造瓶及切管（tube_cut)瓶。本發明方法以使用具有拒水性内部表面為較佳。這可透過將疏水性組合物覆蓋在内部表面（例如石夕化）來達成。石夕化係错由熟習該項技藝者所知的方法來達成。在—方法中，容器係㈣膠提高容11㈣，接著透過高溫（基本上是350 C)—鋼爐的處理切化。另—種方式是藉由用排水組合物製造谷器來做到拒水内部表面。

O:\89W9024.DOC -27- 1332843 容器之拒水内部表面使泡沫更可能形成且具有更高的重現性。這樣保存樣本中就可以使用較低濃度的多元醇，如此則可縮短乾燥樣本所需的時間長度、降低MaiUard反應或其他與多元醇交互作用而傷害活性劑之影響。當保存樣本包含有疫苗時，所得到的泡沫玻璃體因存在的多元醇量低而可快速而容易地㈣，且所得到疫苗溶液具有較低黏性而易於施打。拒水性内部表面讓乾燥固體或高黏性液體易於沖調’因為其有助於樣本留在容器底部表面而較易於有效沖調。雖然本文中是使用單數形式，但是可存有多於一種的安疋齊丨夕於種的添加劑及多於一種的物質。熟習該項技藝者很谷易就能決定該等組份的有效量。溶劑將IPV及安定劑懸浮/溶解於水♦以製造水溶液來以製造保存樣本。保存樣本中存在之水分以5至98%之量（以體積計）為較佳，以80-98%(以體積計）為更佳，以85_98%(以體積計）為最佳。可變化溶劑體積且隨要加入之安定劑與物質以及任何添加劑而疋。所需之最小量是需將不同組份溶解的量。但是，亦可使用均勻分布的物質懸浮液。熟習該項技藝者可根據本文中所提供之實施例而容易地決定特定具體實施例中的適合組份量。可將各種添加劑放入保存樣本中。基本上，添加劑促進泡沫的形程及/或乾燥過程及/或有助於物質的溶解。另外，

〇：\89^9〇24.D〇C -28- 1332843 的安定。可存有一或多加4彳有有助於加在固體中之物質種添加劑。例如一個實施例，加始_^ _ 錢鹽以容許較大量的初更表面區域，因此進行揮成及更快速的乾燥。如本文中所使用者， X鹽在製造泡泳玻璃體之狀況下用來揮發的鹽。適合 t揮發性鹽的實施例包括（但不限於）㈣f請及碳酸 t分解形成氣體產物的Μ發揮加強料形成及使乾燥快速之作Ρ這類鹽的實施例碳酸氫鈉及重亞硫酸納。揮發性鹽之存在量以自約〇.〇β5 Μ為較佳。不超過5狀渡度適用於本發明。所得到之泡床玻璃體要比未用揮發鹽/ 泡騰鹽之料玻璃，更具有—致的泡料形且明顯更乾燥。另一種適合的添加劑是泡沫安定劑，其可用於與揮發鹽或分解鹽組合。該泡沫安定劑可以是表面活性組份，諸Ζ 雙性分子（亦即諸如磷脂及界面活性劑）或增加漿液黏性的化學劑，諸如增稠劑，例如瓜爾豆膠（guar gum)及其衍生物。另一種添加劑是Maillard反應的抑制劑。如果物質及/或玻璃體基體-形成物質含有羰基及胺基酸、亞氨基或亞氨基甲'一胺（guanidiiio)基群，則組合物以進一步含有至少一種生理可接受之Maillard反應抑制劑為較佳，該抑制劑的量是可有效地實質預防組合物中的胺基基群與反應性羰基基群縮合。Maillard反應抑制劑可為任何習該技藝中所知者。抑制劑的存在量適足以預防或實質預防胺基基群與反應性幾基基群的縮合。基本上，胺基基群係存在於物質上，且幾 OA89\89024.DOC -29- 1332843 基基群係存在玻璃體機體形成物質上或相反。但是，胺基及羰基基群可是是在物質或碳水化合物之分子内。已知不同類型的化合物具有抑制Maillard反應的作用，因此要用於本文中所述之組合物中。這些化合物一般是競爭性或非競爭性的Maillard反應抑制劑。競爭性抑制劑包括 (但不限於）胺基酸殘基（D及L兩者）、胺基酸殘基組合及胜肽。以離氨酸、精胺酸、組胺酸及色氨酸為特佳。以離氨酸及精胺酸最有效。已知有許多非競爭性抑制劑。這些包括（但不限於）胺基酸胍與其衍生物及雙性黴素 B(amphotericin Β)。ΕΡ-Α-0 433 679 亦描述適合的 Maillard 抑制劑，其包括4-羧基-5,8-二°惡0奎p林（dioxoquinoline)衍生物0 活性劑本發明方法是用來保存非活化小兒麻痺病毒（IPV，以含有此疫苗技藝中的標準第1 ' 2及3型為較佳，以Salk小兒麻痒疫苗為最佳）。IPV含有20-80(以40或8為較佳）之D_抗原單位之第1型（Mahoney)、4-20(以8或16為較佳）之D-抗原單位之第2型（MEF-1)與20-64(以32或64為較佳）之D-抗原單位之第3型（Sankett)。IPV疫苗調配物適於在以水溶液沖調後注射’其較佳是含有其它疫苗組份》藉由本發明方法所加入之細菌多酷體係例如衍生自下述一或多種之荚膜多醋體：腦膜炎雙球菌、b型嗜血桿菌、肺炎雙球菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、金色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，以流行性感冒嗜血桿菌之PRP莢膜多酿體為較 O:\89W024.DOC -30- 丄佳較佳英·膜多聽體亦包括衍味自订生自一或多種腦膜炎雙球菌之血清型A ' c、界_135及丫者。 ^ 其他較佳爽膜多醣體是衍生自肺炎雙球菌者。料雙球菌笑膜多酶體抗原以選自於血清型卜 2、3、4、5'6B、7f、8、9n、9V i〇a、iia、i2f、 14、15B、17F、18C、19A ' 1叩、 w 、20 ' 22F、23F 及 33F 為較佳(以選自於血清型 19F及23F為最佳)。另一較佳具體實施例含有金色葡萄球菌第5、8或336型莢膜多畴體。其他較佳的多聽體包括表皮葡萄球菌第卜η或m型⑽多聽體、第Ia、ic、时m型之b 群鏈球g英膜多膽體。其他較佳的多酿體包括A群鏈球菌笑膜多聰體’以另外含有至少-M蛋白質為較佳，及以含有多型Μ蛋白質更佳。要用本匙明方法保存之較佳活性劑組合包含。以IPV 與細菌多酿體組合在一起為較佳，該細菌多醋體含有一或夕種Hib PRP^ St體及/或月遂炎球菌Α、c' w及，或γ多骑體及/或肺火球菌多醣體。較佳組合包括①乂及Hib ; ιρν及

MenC，IPV及 MenA及 c ; ipv及 Hib及 MenC 或 IPV、Hib、

MenA及C。每種細菌多醣體存在劑量可以是丨_郎g、 5-10/xg、10-20/ig或 2〇_4〇Mg。細菌多聽體係未結合於或結合於載體蛋白質諸如破傷風類f素、破傷風類毒素片段c、白喉類毒素、cRM丨97、肺炎鏈球菌溶灰素或蛋白質D(US6342224 ” 多醋體結合體是靠帶有1-氰基-4-二甲胺基-吡啶四氟硼酸（CDAP)活化多骑體以形成氰酸酯（CDAp)。活化之多醣體

O:\89V89024.DOC -31 - 1332843 可直接偶合或經由一間隔子基群（spacer group)偶合至一個載體蛋白的胺基基群。以用涉及硫醚鍵形成之異配位 (heteroligation)化學技術使氰酸酯與己烷二胺偶合以及胺基衍生之多醣體結合於載體蛋白為較佳。該等結合物係描述於 PCT 公開申請案 W0 93/15760 Uniformed Service University 〇該結合物亦可藉由US 4365170(Jennigs)與US 4673547 (Anderson)所述之直接還原胺化法製備。其他方法則描述於 ΕΡ-0-161-188、ΕΡ-208375及 ΕΡ-0-477508。另一種方法涉及藉由碳二亞胺縮合作用，用己二酸醯肼 (ADH)將溴化氰活化之衍生多醣體，結合至載體蛋白⑴以c 等人 Infect, immunity，1983 245-256)。乾燥方法在一具體實施例中，本發明之方法涉及在安定劑的存在下（且以在細菌性多醣體的的存在下為較佳）乾燥Ipv。在此方法中，該保存樣本受到降低的溫度與壓力之處理。將溫度降低至20°C或〇ec以下，以低於-urc或_2〇°c為更佳，以 -40°C或-60°C為更佳。壓力降低至低於i毫巴，以低於〇5、 0.1之壓力為較佳，以〇.05或〇〇1毫巴為更佳。將降溫與降壓之狀況維持至少10、12、16、2〇小時，以24、36為更佳，以48或72小時為更佳。移除溶劑直到保存樣本乾燥到形成為固體為止。在整個施用過程，固體包括玻璃體、橡膠體及結晶體，其等形成樣本乾燥。此種固體以保留1〇_2〇%或5_ 1〇%之水

O:\89\89024.DOC -32- ⑸2843 含量為更佳，以5-6%、4-5%或3-4%或2_3%為更佳，以12% 或〇-1 %(w/w)為更佳。本么明之較佳的方法涉及使保存樣本受到一種壓力及溫度之處理，以使該樣本開始發泡形成泡沫體。保存樣本的内部溫度會與樣本的外部溫度不同’因為蒸的内熱I·生之故。溫度係以保存樣本的外部條件為對照，舉例而言，當使用大型工業冷凍乾燥器時，係相對於棚架溫度。這通常對應於冷凍乾燥器的溫度設定。本發明較佳的具體實施例藉由降低壓力同時維持溫度狀況來達成上述情況。將壓力調整到8、7、6或以下，以5、4、 3毫巴為較佳，以2、ι·5、1毫巴為更佳，以〇8或〇5毫巴為取佳，同時維持溫度在設定的以上之溫度，以介於1〇1 至15C之間為較佳；15〇c至2〇〇c ;川它至乃它；25。〇至3〇 C ’或30 C至37eC。維持該等條件歷時至少1、2、3、4、$、 8、10、12、16 或 24、25 小時。本發明另一個具體實施例藉由改變溫度同時維持降壓的條件達到泡沫形成。將溫度設定增至2(rc以上，以介於2〇 C 與 30°C ; 30°C 及 4(TC ; 4〇t 及 5CTC ;或 50°C 及 7(TC 之間為更佳’或溫度設定在l〇_5〇°c，以20-40°C為較佳，以25-35 C為更佳。將壓力條件維持在降低的水準或8、7、6、毫巴以下，以5、4、3毫巴為較佳，以2、i .5、i以為更佳，以 0.8或0.5毫巴為更佳。將該等條件維持歷時至少卜2、3'4、 5、8、10、12、16 或 24 小時。

O:\S9\89024 00C -33- 1332843 成泡汰化的玻璃體本發明泡沫乾燥法接下來的步驟涉及移除溶劑直到泡沫乾燥以形成固體。在本發明一具體實施例中，藉由將壓力及溫度條件維持上述施加的情況下來達成上述狀況，以達到泡沫形成。舉例而言，將壓力維持在8、7、6毫巴或以下，以5、4、3毫巴為較佳，以2、ΐ·5、1為更佳，以0.8或0.5毫巴為最佳，同時將溫度設定維持在〇〇c以上之溫度，以介於

2°C 及 10°C、1〇。〇及 2(TC ; 2CTC 及 30X： ; 3(TC 及 35°C、3 5°C 及40°C之間為較佳，以介於之間5〇C及25°C為較佳。維持該等溫度及壓力條件歷時1、2、3、4、5、6、8、10、12、18 小時或更長時間，以獲得一固體，該固體之溶劑含量少於或等於10、8、5、4% (w/w)，以3、2為較佳或以1%(W/W) 為最佳。本發明另一具體實施例將溶劑移除溫度之溫度設定增加至比此方法較早前所維持之溫度的設定更高。好處是可讓溶劑以更快的速率離開樣本，以使本發明方法可以較短的時間完成。舉例而s，溫度設定增加到〇。〇以上，以介於2

C 及 10C，10C 及 20C ; 20°C 及 3〇t： ; 30°c 及 4(TC ; 4(TC 及50 C ; 50 C及60 C之間為較佳，同時將壓力維持在8、7、 6毫巴或以下’以5、4、3毫巴為較佳，以2、15、丨毫巴為更佳，以0.8或0.5毫巴為更佳。維持該等溫度及壓力條件歷時1、2、3、4 5 6 8、1 〇 ' i 2、1 8小時或更長時間，以獲得-固體，該固體之水含量少於或等於1〇、8、5 4〇/〇(w/w)’以3、2為較佳或w1%(w/w)為最佳。 0:細9024 OOC -34- 本發明另-具體實施例將溶劑料時之壓力設定降低至比泡，形成時所採用者更低之較低的壓力設定。這樣做的好處是可讓Lx更快的速率離㈣本，以使本發明方法 :以較短的時間完成。舉例而言，將壓力設定減至5、4、3 更低以2、1 ' 〇·8毫巴為較佳，以〇 5、〇」毫巴為更佳則.G5或G.G1毫巴為最佳，同時將溫度維持在代或 ^上。’以介於1〇°C及2〇HC及3CTC ; 3(TC及35t之間或4 0 C以上為較佳。維持該等溫度及麼力條件歷時卜2、3、 4 5 6、8、1〇、丨2、18小時或更長時間，以獲得—固體，該固體之溶劑含量少於或等於5、4%(W/W)，以3、2為較佳或以1 %(w/w)為最佳。息括冷;東步驟之泡決梦谭本發明方法可視需要來冷; 東樣本。在泡沫乾燥前冷; 東樣本具有增加—批次之各降本間之重現性好處。這是由於所有的樣本係從相同之物理條件來冰;東以開始進行該方法。可整體或部份地冷凍保存樣本。可將保存樣本放在低於〇°c之溫度下歷時-段適當時間以使樣本冷;東而使樣本受到降處理後，視需要進行冷束。以所使用之溫度以-lot、 C或-14 0 °C或以下為較佳歷時 1'2、3、4、5、8、 -15 C ' -20°C ' -30°C ' -40°C ' -70 。可將樣本留在低於〇°C之溫度下 16或更多小時以使冷凍發生。對於相同之樣本，特別是容易受溶劑損傷形成結晶體之等樣本，諸如細胞製備或其他生物系統，以每小時小於或於0_卜G_5、1 2、3 ' 4 ' 5。(：之緩慢速率冷;東樣本為較佳 O:\89\89024.DOC -35- 1332843 藉由立即冷凍更有效地保存其他組合物，舉例而言，藉由在液態氮中急速冷凍。這個方法特別有利於蛋白質或病毒顆粒。蒸發冷凍亦造成快速冷凍樣本。另一種方式是，使樣本受到降壓處理來冷凍保存樣本以使樣本整體或部份受到冷;束。可在A量冷;東乾燥器裝置中於一種棚架溫度下進行這樣的淬冷，該棚架溫度係〇它、⑺ C、15°C、20t：、3(TC、37t或以上，以棚架溫度係介於5 及35。(：之間為較佳，以介於10&2〇t之間為更佳，以為b °C為最佳。可視需要於開始時將壓力降至2〇〇亳巴歷時^、 1〇、20、30、60分鐘之時間或更長，以去除氣體。為了冷凍樣本，將壓力進一步降低至2、i、〇.5、〇 2、〇」毫巴或以下。將此壓力維持歷時至少5、1〇、2〇或3〇分鐘直到樣本全體或部份冷凍為止。泡沫形成及移除溶劑以形成固體後的步驟如上所述。在本發明之較佳具體實施例中，於冷凍乾燥器中冷凍樣本及形成泡沫之步驟係在係在固定溫度下進行，以改變壓力條件為較佳。在另一較佳的具體實施例中，於冷凍乾燥器中冷凍樣本、形成泡沫及移除溶劑以形成固體之步驟係在係在固定 /風度下進行，以改變壓力條件為較佳。以改變壓力條件為較佳。 " 在本發明另一具體實施例中，冷凍樣本、形成泡沫及移除溶劑以形成固體之步驟時之壓力及溫度條件兩者皆不同。 O:\W\89024doc -36- ^32843 本發明方法以使用具有 a 穷祖水内邛表面之容器為較佳。此丁稭由用疏水組合物覆蓋内峻化，可藉由孰習該項技获：”成，舉例而言藉由其一括十 u。哀項技藝者所熟知的方法來達成。部表Γ’藉由拒水組合物製成的容器來達到拒水内容器内存有拒水内部表 1表面使仔泡》末形成更可能發生及更低，而可依Λ此可允許要用於保存樣本之多元醇濃度較反庫U 乾無樣本所需之時間長度 '減少Maiuard 汉應或其他介於多元醇盥作響^中伴存檨… 互作用的有害影夕^ 存樣本包含一種疫苗，得到的固體因為存有之夕疋醇量較低而可快速地沖較低而較易於施打。一到之疫苗溶液之黏性盖ϋϋ束或泡沣报占+锌t 性之特佳方法涉及在安定劑的存在下（且以在細菌夕的存在下為較佳），用一種溫和的方法乾燥㈣，該方法是避免使IPV暴露备Α東 ’、 ipV〇、h…路…、冷，東過m末之形成，藉此使留。 ^的緊迫，並使抗原性受到高度保該方法特別適用於低濃度玻璃體形成多元醇時，舉例而以下，以5%(_以下為較佳，低濃度玻璃體 y夕兀醇係有利的且以較短之乾燥時間為較佳的。除溶劑（蒸發名^燥步驟b、〇:\8Λ89024.ΙΧ)〇 •37- 1332843 力==形成之乾燥法涉及使保存樣本受到而二失，此種處理使保存樣本之溶劑藉由蒸發而‘』冷凍樣本或使樣本發泡以形成泡沫。候1=::的溫度會因為蒸發方法的内熱性而在多數時外部溫度。保存樣本的内部溫度會與樣本的存樣本的外部條件為對照，舉例而言，當使用大型 :乾燥器時’係相對於棚架溫度。這通常對應於冷凍乾燥 β的溫度設定。 ' 可視需要而於本發明方法中加入使保存樣本脫氣之初步 /驟將壓力降至2〇〇毫巴或以下（以介於200及35毫巴之間為較佳），歷時-段至少5分鐘之時間，之後再近—步降壓。

本發明較佳的具體實施例藉由㈣同時控制溫度條件來達成蒸發式乾燥。將壓力調整至3〇、25、2〇1毫巴或以下，以15、12毫巴為較佳，以1〇、8、7、6、5、43、2或1毫巴為最佳，同時將溫度維持在〇〇C以上之溫度，以介於4〇C 至 37°C，4°C 至 UTC，1(TC 至 15°C ; 15°C 至 2(TC ; 2(TC 至 25 °C ; 25°C 至 30°C ;或 3(TC 至 37°C ;或 37°C 至 45°C 之間為較佳。維持此等條件歷時至少1 ' 2 ' 3、4、5、8、1 〇 ' j 2、 16或24小時’以歷時介於2-4小時、4-6小時、6-8小時' 8-12 小時或12-1 8小時之間為較佳》在一特別較佳之具體實施例中’將壓力維持在2毫巴以上且將溫度設定在15°c，以預防樣本冷凍。在一較佳的具體實施例中，將溫度維持在丨5 以及將壓力設定在介於5-10毫巴之間，以6-9毫巴為較佳， O:\89V89024 OOC -38- U02M3 以大約8毫巴為最佳。在使之用杈同咖度5又疋時，可用稍低的 i力且無須料樣本；當使用較低之溫度設力維持在較高水準以預防冷康。以將條件維持—収= 洛發速率慢下來而致樣本溫度與樣本外部之溫度近乎相同為較佳。

=佳的疋’不應冷;東或煮沸保存樣本以形成泡沫及疏鬆之溶劑以形成聚黏性液體或高黏性液體。 A 登除溶劑以形戌高黏枓淡艚。本發明方法的下—個階段涉及移除溶劑直到保存樣本乾燥以形成高黏性液體且無泡泳形成，並以沒有冷; 東為較佳。在本發明一具體實施例中，藉由將壓力及溫度條件維持在第一次蒸發式乾燥所施加的條件即可達成上述情況。舉例而言，將壓力維持在30、25、2〇毫巴或以下，以ΐ5、η 毫巴為較佳’以1〇、8、7、6、5、4、3、2或!毫巴為最佳，同時將溫度設定維持在0艺以上之溫度，以介於5它至37 C、5°C 至 HTC、1〇。〇至 15°C ; 15t 至 2(TC ; 20。(：至 25。(：； 25 C至30 C，或30 C至37°C之間為較佳《就溫度設定在15 。(：而言，將壓力維持在5·10毫巴（以6_9毫巴為較佳，以大約 8毫巴為最佳）歷時介於4-24小時之間（以丨_4、4-8、8-12或 12-16小時為更佳）。將這些溫度與壓力條件維持歷時丨、2、 3、4、5 ' 6、8、10 ' 12、18小時或更長以獲得高黏性液體，該咼黏性液體的溶劑含量小於或等於丨5、丨2%(w/w)，以丨〇、 8、5、4、3 ' 2 或 1 %(w/w)為較佳。 O:\89\89024.DOC -39- 1332843 本發明另一具體實施例將溶劑移除之溫度設定增加至比本方法中較早前所維持者更高的溫度設定。這讓溶劑以更决的速率離開樣本，以使本發明方法可以較短的時間完成。舉例而言，溫度設定增加到以上，以2〇它以上為較佳，以介於及37°C、5。匚及HTC、UTC及2〇。(：、2(TC及。3〇(：之間為較佳；以30°C及4(TC之間為較佳；以40。〇及5〇 C之間為較佳；以5〇〇c&6(rc之間為最佳，同時將壓力維持30、25、20或以下，以15、12為較佳，以1〇、8、7、6、 5 4 3、2或1毫巴為最佳。維持該等溫度及壓力條件歷時 1 2、3、4、5、ό、8、1〇 ' 12 ' 18小時或更長時間，以獲得固體’该固體之溶劑含量少於或等於15、12，以1 〇、8、 5 4 3、2或1 %為更佳。該具體實施例需要的活性劑是要在用於實施該方法之溫度下可具有熱安定性者。本發明一較佳的具體實施例將溶劑移除（步驟c)時之壓力 °又定降至比本方法中較早前（步驟b)所施用者更低的壓力設疋。故樣做可讓溶劑以更快的速率離開樣本，以使本發明方法可以較短的時間完成。其亦可使高比例之溶劑消失。舉例而5，將壓力設定設在7、6或以下，以5、*、3為較佳，以 2、1.5、1為更佳’以〇 8、〇 5、〇 2、〇」、〇〇5、〇〇2、〇·〇1、或0.005毫巴為最佳；同時將溫度維持在〇。〇或以上，以"於 10 C 及 2〇。(：； 2(TC 及 30。(：； 30°C 及 35。(：或 40°C 以上之間為較佳；維持該等溫度及壓力條件歷時卜2、3、4、5、 6 8、10、12、18小時或更長時間；以獲得一固體，該固體之溶劑含量少於或等於15、12，以1〇、8、5、4、3、2或

O:\89\89024.DOC -40- 1332843 l°/〇(w/w)為較佳，以用Kari Fischer電量法水份分析器 (coul〇metric m〇isture analyser)測定者為更佳（Eur ; Biopharm. (2000)50 ； 277-284)〇應以在等於或少於丨8小時之時間内完成步驟…及c)為較佳，以16、14、12小時為較佳，以丨〇、8、6或4小時為最佳。乾燥後的組合物係一種藉由蒸發、煮沸或昇華從組合物移除其中溶劑而留有溶劑含量小於或等於丨5、丨2、丨〇%(w~) 之組合物，以8' 5'4、3、2或1%(W/W)為較佳，以Karl Fischer 法測定者為更佳《較佳溶劑含量的範圍係丨_3%、3_5〇/。、 5-10%或l〇-l5%(w/wp這個用語（組合物）包括高黏性液體以及乾燥後的泡沫化玻璃體及冷凍乾燥固體。高黏性液體係定義為一種物質，其係藉由蒸發但未經煮沸下而將溶劑從該物質移除，而留下的溶劑含量小於或等於15、12、10%(w/w)，以8、5、4、3、2或1%卜&)為較佳，以用Kad ―法測定者為更佳。較佳的溶劑含量範圍係 1-3%、3-5%、5-10%siU(M5%(w/w)。高黏性液體所具有之溶劑含量低到；I以使活性劑於代下保存在安定狀態歷時至少3、6、9、12或24個月，並可讓該活性劑保有其至少4〇、 50、60%之活性或抗原性（以7()、⑼、⑽或抓為更佳）超過這段時期。以高黏性液體具有固體外觀但係玻璃體且可非常缓慢地流動一段2、4、或6天（以1、2、3、4 6、71〇或Π個月為更佳）之時間為較佳。可藉由將含有高黏性液體的貯藏器倒置在室溫下直到觀察到高黏性液體的流動，來測量這極其緩慢的流動。在—較佳的具體實施例中，處於 O:\89\89024.DOC -41 - 1332843 倒置位置的高黏性液體在2、4或6天後不會顯現出流動，以為2、3或4週為較佳，以2、4、6、8、10或12個月為更佳。具黏性液體係定義為移除溶劑時之主要相（primary phase) 的產物’在該相結束時大部份的溶劑已從樣本消失。由於洛發速率因大量蒸發之内熱效應消失而減緩下來以致樣本度回歸到常溫，所以可以辨認出該點。泡床化玻璃體係乾燥後含有玻璃體形成多元醇之組合物，該組合物的形成方法係使保存樣本受到一種可使樣本激烈發泡之溫度與壓力的處理，或經煮沸以在樣本乾燥時會形成泡珠。本專利說明書中所引用之文獻或專利說明書皆以參考的方式併入本文之中。【實施方式】實施例除了另外詳加說明者之外，以下的實施例係用基本技術實施，該等技術係為熟習該項技藝者所熟知的例行作業。該等實施例僅供例示而非用於限制本發明。實施例1.蒸發式冷凍方法本方法係用Heto Drywinner 8-85冷凍-乾燥器來實施，該冷凍-乾燥器中之棚架溫度可調至rc内，濃縮器的最終溫度係85 C，可用排放閥調整壓力，並有6個用於測量產物溫度的熱電偶可供使用》將玄疋劑（10%海藻糖或3.5°/。蔗糖）與活性劑加入水溶液以製造保存樣纟。將樣本放入冷來乾燥器之棚架上，整個

O:\89VS9024.DOC -42- 1332843 方法都將該棚架的溫度固定維持在15<t之溫度設定上。開始時將壓力降至2〇〇毫巴並維持在此—水準歷時1〇分鐘之後進一步降壓。在15毫巴時，溶液因如圖丨所示之蒸發冷卻而開始冷凍。壓力進一步降至〇·β巴以使樣本變成完全冷束。然後增壓至介於〇·8毫巴與3.5毫巴之間，此時形成如水般的泡珠從樣本消失。在此實驗條件下，未在僅含水的對照樣本中看到任何煮沸的情形發生。因&，該樣本可能係透過蒸發而不是透過煮沸來使水分消失。在此條件下達 18小時後’樣本被乾燥且泡泳化的溶液變成料化玻璃體。可實施相似的方法而成功地將棚架溫度保持在其他高於 37°C之溫度設定。實施例2 ·冷束條件的確立將嚴糖溶解於水中形成1%、5%、1〇%及2〇%溶液以製造樣本。將樣本放人冷隸燥器之棚架，整個方法皆將該棚架的溫度維持在饥。開始時就降壓至2〇〇毫巴並維持在此水準歷時1〇分鐘，之後再進-步降屋至50毫巴、5毫巴、25 毫巴、毫巴、0_4毫巴及〇.2毫巴。在每一個麼力水準皆維持20分鐘以使溫度平衡並用熱電偶讀出樣本溫度。將教，偶附接於具有不同餘濃度之樣本，記錄於表㈣溫度係度的平均值。結果無論存有的蔗糖濃度為何， ^ 所有的樣本皆在1·66及1.11 耄巴之間冷凍。不同壓力下測付妁，皿度非常接近從三點曲

0:访 9V89024.DOC -43- 1332843 線預測而來的溫度。因此，蔗糖的存在並未表現出會對不同壓力下的樣本溫度產生大的影響。在本發明之較佳的方法中，必須避免使樣本冷凍。這可精由將壓力維持在2毫巴以上並用15它之棚架溫度來達成。在較低溫度下，應將壓力維持在較高的水準，然而使用較高的溫度可讓壓力進一步降低而無須冷凍樣本。表1

實施例3.用不同之糖濃度形成泡沫樣本的條件製造含有0% 5%、！0%、15%、20%、25%及 5〇% 嚴糖之保存樣本。將樣本放至有棚架的冷凍乾燥器中，且整個方法中皆將棚架溫度維持在的。開始時將壓力降至2⑼毫巴並維持在此水準10分鐘時間，然後進一步降壓。進一步將壓力降至(M毫巴’以讓樣本變成完全冷束 '然後在隨後貫驗中將壓力增至〇.788毫巴、G.812毫巴或3 5毫巴。將這些條件在3.5毫巴及〇.812毫巴之實財維持維持3小時及在毫巴之實驗中維持6小時。評估每_樣本的物理特性。 iii 2表2所示，在3.5毫巴之壓力下，需要5〇%之薦糖濃度以可*地形成泡沫。相對而言，較低的〇 8毫巴之壓力可讓泡

O:\89\89024.DOC -44 - 1332843 沫在10-25%之低蔗糖濃度下可靠地形成《使用較低的蔗糖濃度具有數項好處，例如，對於將保存樣本用於疫苗。因此，用0.8毫巴及10-25%蔗糖含量之方法係較佳的。表2 壓力蔗糖％物理特性 3.5毫巴 20 4/5泡沫化、1/5黏性液體— 3.5毫巴 25 2/5泡沫化、3/5黏性液體 3.5毫巴 50 5/5泡沫化 0.812毫巴 5 結晶體環及泡泡 0.812毫巴 10 全部泡沫化 0.812毫巴 15 全部泡沫化 0.812毫巴 20 全部泡沫化 0.8 12宅巴 25 全部泡沫化 0.788毫巴 5 結晶體環及泡泡 0.788毫巴 20 全部泡沫化 0.788毫巴 25 全部泡沫化 0.788毫巴 50 泡沫與漿液實施例4.使用矽化容器的作用製造含有5%、1〇%、15%及25%蔗糖之保存樣本及並加入瓶中，其中一些瓶經過矽化。在一實驗中，將樣本放入具有棚架的冷凍乾燥器中，該棚架溫度在整個方法中皆維持在15 c。開始時將壓力降至200毫巴並維持在此水準歷時1〇分鐘，之後進一步降壓。進一步將壓力降至2.8毫巴歷時3 小時。在這段期間，壓力於水蒸氣減少時掉到2 〇〇毫巴。評估各樣本的物理條件。在第—個實驗中，將樣本放入具有棚架的冷凍乾燥器中，該棚架溫度在整個方法中皆維持在37£>c。開始時將壓力降至200毫巴並維持在此水準歷時丨〇分鐘，之後進一步降 ^進步將壓力降至2.4毫巴歷時3小時。在這段期間，

O:\89\89024.DOC -45- 1332843 壓力於水蒸氣滅少時掉到U6毫巴。評估各樣本的物理條結果矽化對於樣本的脫氣具有作用》降壓至2〇〇毫巴造成妙化瓶中的樣本脫氣’卻未造成未石夕化之瓶中的樣本脫氣。了經由樣本的發泡看到脫氣現象。瓶的矽化亦使泡沫形成更可能發生及更具重現性（表3)。瓶的矽化可讓泡沫形成在較低多元醇濃度下重現發生。較低的多兀醇濃度縮短了乾燥樣本所需之時間長度，並減少

Maillard反應或與多元隨招中.丈夕兀私知害活性劑之其他交互作用之影響。當涉及的樣本係疫苗眭文田時，廷樣做可降低樣本黏性而易於施打。

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全部為泡沫化全部為泡珠化之實施例5.受到習知方式冷;東乾燥法或以泡珠乾 Hib-IPV的比較要保存的活性劑係㈣流行性感冒嗜血桿菌（服）之pap 多酿體及三株非活化小兒麻痺病毒（IPV)的混合物。將

Hib-IPV溶解於3·15%嚴糖溶液或1〇%海藻糖溶液以製造保存樣本。藉由使用需要在大型冷來乾燥器進行三天之習知方法冷束乾燥樣本’或用實施例丨所描述之料乾燥法，使樣本冷凍乾燥。將樣本重泡至於水中並用犯从分析三株小兒麻痒病毒之抗原性的保留情形。三株多源抗體及三株單源抗體，每株抗體對k每-株病毒，用於個別的eusa。結果以未經冷;東乾燥或Ί末乾燥處理的樣本之讀數百分比呈現。刀析保存樣本在體内的免疫性，是藉由用沖調後的 1则轉種常是小白鼠的群體 '抽去小白鼠的血清並監測

O:\89\S9024.DOC -47- 1332843 抗IPV及Hib多醣體之抗體量，舉例而言，藉由ELISA或西方墨點法監測之。用受到攻毒的小白鼠模式分析保護程度。結果當使用蔗糖或海藻糖作為多元醇時，泡沬乾燥技術要比使用習知的冷凍乾燥技術更能妥善地維持IPV的抗原性。表4 ELISA-第 1/2/3 型％乾燥方法多元醇含量多源單源冷凍乾燥 3.15%蔗糖 46/49/581 25/0/0 泡沫乾燥 3.15%蔗糖 85/97/106 55/68/57 冷;東乾燥 10%海藻糖 47/43/58 泡沫乾燥 10%海藻糖 93/86/84 72/75/87 O:\89\89024.DOC -48- 1 此實驗的冷凍乾燥是在3.15%蔗糖的存在下重複五次且此結果所顯示的是最具代表性的實驗。實施例6.在Hib多醣體的存在下冷凍乾燥後的IPV之保護作用製備含有3.15%蔗糖及IPV或IPV及Hib多醣體之保存樣本混合物。將樣本插入He to Dry winner 8-85冷来-乾燥器並在-32°C之溫度設定下冷凍乾燥40小時，接著繼續在4°C乾燥16小時。將樣本沖調在水中並用ELISA分析三株小兒麻痒病毒之抗原性的保留情形。三株對抗每一株病毒的單源抗體，用個別的ELISA分析比較經沖調與冷凍乾燥後之樣本與未經 1332843 冷束之對照樣本的抗原保留程度。結果以未經冷凍乾燥或泡沫乾燥處理的樣本之讀數百分比呈現。結果如表5所示’具有ιρν之保存樣本中存有Hib多醣體可使得 ipv在冷凍乾燥後之抗原保留性比僅經冷凍乾燥Ipv者要來得大。除了以蔗糖作為安定劑之外，Hib多醣體也具有保存 IP V抗原性之作用。表5 冷束乾燥的組合物多元醇含量 ELISA-第 1/2/3 型％ IPV " 3.15%蔗糖 26/25/0 IPV-Hib 3_15%蔗糖 52/68/0 實施例7.不同安定劑對於冷凍乾燥IP V-Hib之作用製備含有11^-1^1)之樣本，其係使用3.15%蔗糖；2.5%山梨醇、0.8%麩胺酸及0.01% HSA ; MMR安定劑及乳糖；3% 甘胺酸、2%精胺酸及4%蔗糖；或4%嚴糖及2%甘胺酸作為安定劑。此實驗包括樣本與作為安定劑的3.15%蔗糖，用 IPV-Hib之兩倍濃度。在批量冷凍乾燥器中用習知之三天冷凍乾燥循環之方式冷凍乾燥樣本。將樣本沖調在水中並用EUS A分析三株小兒麻痺病毒的抗原保留。將三株多源抗體及三株單源抗體（每株抗體對抗一株病毒）用於個別的ELISA。結果以未經冷凍乾燥或泡沫乾燥處理的樣本之讀數百分比呈現。分析保存樣本在體内的免疫性，是藉由用沖調的Ipv_Hib 接種通常是小白鼠的群體、抽去小白鼠的血清並監測抗Ipv 1332843 及Hib多醣體之抗體量，舉例而言，藉由ELISA或西方墨點法監測之。用受到攻毒的小白鼠模式分析保護程度。結果將IPV劑量從40/8/32 DU/劑量增至80/16/64 DU/劑量會增加IPV抗原保留性，就如表6所示。安定劑的變化亦會影響抗原保留性，用4%蔗糖/2%甘胺酸與2.5%山梨醇/8%麩胺酸 /0.01% HAS產生更高的抗原保留性，就如ELISA之資料所示。表6 安定劑多源ELIS A結果單源ELIS A結果 3.15%蔗糖 50/50/70 25/0/0 2.5%山梨醇 0.8%麩胺酸 0.01%HAS 55/72/72 33/50/0 MMR安定劑乳糖 59/62/65 28/25/0 3.15%蔗糖 IPV-Hib 雙劑 84/92/120 102/138/0 3%甘胺酸 2%精胺酸 4%蔗糖 4%蔗糖 2%甘胺酸 46/62/78 25/50/15 實施例8.冷凍乾燥、泡沫乾燥或有冷凍步驟之泡沫乾燥後的樣本品質之重現性將保存樣本製成包含有IPV、腮腺炎、麻疹、德國麻疹、水痘一帶狀庖疹病毒、CMV、肝炎、HSV1、HSV2、呼吸道融合病毒、登革熱、副黏液病毒（如副流行性感冒、彼衣病毒）及感冒病毒及/或Hib作為活性劑。將活性劑溶解於含 O:\89\89024.DOC -50- 1332843 有多元醇之水溶液中。用如實施例丨所描述之程序中之冷凍步驟的冷凍乾燥、泡沫乾燥，或用如實施例4所描述之程序中無冷珠步驟的泡泳乾燥來保存多重樣本。將樣本沖調在水溶液並分析其等之活性。此可用對天然抗原具有特異性的抗體以實施例5所述之ELISA來完成分析。在活性病毒的例子中，用病毒感染適合的宿主細胞及藉由菌斑形成或免疫細胞化學分析感染性，來確立每一樣本之力價。當免疫組合物或疫苗經泡珠乾燥|，以動物模式測定免疫保留性’該動物模式之建立係藉由用經泡沐乾燥或冷束乾燥之疫苗免疫動物料以補強免疫反應，舉例而言在第一次免疫後第14及28天進行。在免疫計劃的終點時，從動物體分離出血清及測試其抗疫苗之力價，可用標準的分析方法來 /7析，舉例而5藉由EUSA、免疫細胞化學法、西方墨點法免疫H会血清殺菌分析法或凝集分析。棄整結果，首先比較經過冷;東乾燥、有冷束步驟之泡泳乾燥或無冷束步驟之泡泳乾燥後之活性劑的活性。其次，藉由比較樣本文到二種保存方法個別處理後之活性範圍，來評估保存技術之重現性程度。實施例9.又到冷象乾燥保存與泡殊乾燥之活性劑的長期貯存性。製造保存樣本，其包含Ipv、腿腺炎麻療、德國麻療、水癌一帶狀鹿療病毒、CMV、肝炎、贈^⑽、呼吸道融°病、毒^革熱、副黏液病毒（如副流行性感冒、彼衣病毒）及感冒.病毒及/或或腿作為活性劑。將活性劑溶解在

0:访阳9024.DOC -51 - 1332843 含有多元醇之水溶液中。以用如實施例丨之程序的冷凍步驟進行冷凍乾燥、泡沫乾燥，或如實施例4之程序的無冷凍步驟之泡沫乾燥來保存多重樣本。使樣本貯存在37t或23<>(：下歷時7天以熟化（aged)，比較熟化的樣本與保存在4它下之樣本的活性。將樣本沖調在水溶液中並分析其活性。如實施例5所述般用對於天然抗原具有特異性之抗體來完成 ELISA分析m病毒的例子中，用病毒感染適合的宿主細胞及藉由菌斑形成或免疫細胞化學分析感染性，來確立每一樣本之力價。彙整結果，首先比較經過冷凍乾燥、有冷束步驟之泡珠乾燥或無冷凍步驟之泡沫乾燥之活性劑的活性。其次m較樣本受到每組條件處王里後之活性範圍’來評估保存技術之重現性程度。實施例10.無冷珠或泡床形成之乾燥法製備含有5%、10%、丨5%及25%蔗糖之保存樣本並加入瓶中。將樣本放入冷凍乾燥器中，且在整個方法皆將溫度設定在15°C。開始時將壓力降至200毫巴並維持在此一水準歷時10分鐘以脫氣，之後進一步降壓。進—步降壓至8毫巴歷時2至3小時，纟此之㉟，樣本内的熱電偶顯示出樣本溫度因為蒸發冷卻而降至4。。。2_3小時後，樣本溫度回歸到 15 C，顯示在此等溫度與壓力條件下的蒸發係幾近完成的。在本方法的這個階段，樣本未發生煮_成泡沐或發生冷凍，因此樣本中的活性劑係暴露於儘可能小的緊迫下。該樣本呈具有黏性液體的外觀。 OA89\89024.DOC -52· 1332843 藉由進步降麼至Ο·1毫巴並同時將棚架溫度設定在15 C以進步使樣本乾燥。維持此等條件歷時另外丨〇_丨6小時。於此相時，樣本溫度仍在15<t，這是因為蒸發速率減，緩。進-步乾燥而得到之樣本具有固體外觀。如果將樣本放在（合器）内側，樣本含量流動得非常緩慢，超過一段數天的時間，這顯示樣本是一種高黏性的液狀玻璃體。實施例11無冷束或泡朱形成的乾燥IPV免疫性之保留情形以實施例10之方法乾燥後的樣本未遭受到與伴隨泡泳形成而來的發泡或冷;東㈣之緊迫1行實驗以確^該方法用於乾燥IPV時是否可產生高量的抗原保留。進打三個各別的實驗，其中將IPV重新懸浮於具有作為安疋刈之10/。蔗糖或10%海藻糖的水溶液中。將樣本放入矽化瓶中，再將該等瓶放入溫度設定在15t2Het〇 Drywinner 8-85冷;東-乾燥器中。開始時降壓㈣毫巴以使樣本脫氣。 1〇分鐘後，進一步降壓至8毫巴，並保持在此水準歷時兩小值此之際，將溫度設定在饥，並監測#本内的溫度。當水自樣本蒸發時，溫度會降到代，但在快要結束前的兩小時，溫度因蒸發速率減緩而回歸到15t。在此等條件下 /又有發泡或形成泡沫的情形發生。然後將壓力進一步降至 0.1毫巴，並於前兩個實驗中維持此等條件歷時多於16小 N·而於第二個實驗中維持此等條件歷時多於丨〇小時。將樣本沖調於水中並用EUSA評估三株小兒麻痺病毒抗原性的保留程度。用抗第3型IPV之單源抗體以EUsa評估，.’至過冲調、冷凍乾燥後之樣本相較於未受冷凍的對照樣本 OA89\89024.DOC -53- 1332843 將用實施例11中所述的方法進行乾燥之ιρν貯存在4<>c歷卞9個月。將樣本沖調在具有15 之Naci的水中，並用 ELISA分析三株小兒麻痺病毒抗原性的保留情況。三株單源抗體（每株抗體對抗一株病毒）分別用於個別的£LIS A以分析沖調之貯存樣本中抗原性的保留情形。貯存前用來自同批之冲調樣本進行相似的ELISA。比較所有的結果與未蜓乾燥的對照樣本之結果。結果以未經冷凍乾燥或泡沫乾燥處理的樣本之讀數以百分比呈現。結果處理 AA UHr / ,ϊ,ίτ» 抑]工狀肢观a 第1型ELIS A 第2型ELISA 原保留* 第3型ELIS A 乾燥/沖調未貯存 4：L·, KS, / 72% 75% 88% 乾燥/沖調在4°C下9個月 Γ 70% 94% 90% 存歷時至少9月而不會喪失抗原性貯實施例13·乾燥形成高黏性液體並經沖調後的Π»ν與未乾燥的IPV之趙内免疫性的比較用不同的IPV的稀釋液接種Wlstar的大白氣，該ιρν稀釋液係用實施例10所描述之方法在10%蔗糖的存在下，經乾燥後所形成的高黏性液體並經沖調。用IPV的對照樣本接種另一群W1Star的大白鼠，該IPV的對照樣本係以同樣方式製備但未經乾燥。 21天後，取出所有大白鼠的血清，並用第1型第2型及第3型小兒料病毒在個別的免疫沈殺分析中測試血清。 O:\S9\89024.DOC -55- 1332843 結果顯示於表10，其包含a)每一 IPV稀釋液之老鼠反應數目，b)ED50，其係確保50%的大白鼠在用免疫沈澱分析測試時會發生血清轉換所需之劑量及c)乾燥後經沖調之IPV 相較於未乾燥的對照IPV之相對力價。

表10.乾燥形成高黏性液體（JLE0 17/05)再經沖泡後之IPV 相較於来乾燥的對照IPV(JLE097)之免痙性樣本對應號碼 ED50 RP相對力價 JLEO17/05 未稀釋 1/1.25 1/3.125 1/7.81 第1型 10 9 6 5 6.37 0.956 第2型 6 4 3 3 7.14 0.825 第3型 6 8 2 1 18.18 1.051 JLE097 第1型 10 10 10 7 3.33 1.120 第2型 8 6 5 2 3.12 0.951 第3型 7 6 4 1 16.91 1.172 對照第1型 10 8 4 6.37 第2型 7 5 2 2.93 第3型 5 3 0 22.57 JLEO17/05係IPV的批號，該批IPV係經乾燥而形成高黏

性液體接著經過沖調。JLE097係未受乾燥的對照組。表10顯示乾燥後沖調之IPV與未乾燥之對照樣本之兩批次間，用IPV之各稀釋物接種之動物的反應數目是相似的。大體而言，第1型引發最佳的免疫反應，第2型僅在數隻大白鼠引發輕微的免疫反應。第3型引發最微弱的免疫反應。形成高黏性液體之乾燥過程並不會破壞IPV在體内引發免疫沈澱性抗體之能力。讀數為1 .〇之相對力價（RP)說明樣本對於參考樣本引發相同之反應。對三種類型小兒麻痺病 O:\89\89024.DOC -56- 1332843 毒產生RP讀數近於1.0之兩種乾燥樣本說明了乾燥過程不會影響樣品引發免疫反應之能力。實施例14.用蔗糖或海藻糖作為安定劑進行乾燥以形成高黏性液體，對於IP V在體内引發免疫沈澱性免疫反應之作用用如實施例2所述般在10%蔗糖或10%海藻糖存在下受到乾燥然後經沖調之IP V，接種1 0隻大白鼠群。用等量之未經乾燥的IPV作為對照樣本接種另10隻大白鼠群。 2 1天後，收集所有大白鼠的血清，並如實施例5所述般，用免疫中和試驗分析已提高之對抗第1、2及3型各小兒麻痺病毒的抗體的免疫中和抗體量。計算各樣本所引發的力價相較於未經乾燥之對照樣本所引發的力價之相對力價。表11.在蔗糖與海藻糖中乾燥之比較批號蔗糖存在量第1/2/3型在體内之相對力價 Karl Fischer 所測之溼度％期限 (小時) Jle017 10%海藻糖 0.95/0.82/1.05 nd 7 31CO3/01 10%蔗糖 0.69/1.20/0.97 4.6% 18 31CO3/02 10%海藻糖 0.60/0.94/0.9 11.5% 18 03D02/01 10%蔗糖 0.74/1.05/0.96 5.9% 12 03D02/02 10%海藻糖 0.58/0.98/1.06 10.6% 12 以Karl Fischer法測量，當用蔗糖作為安定劑時有將近5% 的溼度殘留，用海藻糖作為安定劑時有將近10%的的溼度殘留，因此用蔗糖作為安定劑之樣本中的水含量要比用海藻糖作為安定劑時之樣本中的水含量更低。蔗糖與海藻糖皆可在進行乾燥法時有效安定IPV，藉此使沖調後的IPV對於不同類型中大部份的小兒麻痺病毒產生 O:\89\89024.DOC -57- 1332843 接近1 · 0之相對力價的讀數。相當容易失去其免疫性的第3 型小兒麻痺病毒之相對力價特別的好。實施例15:以Karl Fischer測量渔度在 Karl Fischer Titrometer(AqUa 30.00-Elektrochemie Halle) 中進行分析》將樣本秤重然後放入設定在8〇。匸之鋼爐中。用氮氣沖樣本然後加入Hydranal試劑（Riedel de Hahn)以用電量法卡式進行分析β 【圖式簡單說明】圖1-含有泡沫乾燥法之不同階段下的保存樣本之瓶的昭片： ’、、、 Α -顯示在冷凍乾燥狀況中成為液體調配物之保存樣本的外觀。 ’、 Β-顯示壓力降至ι5毫巴時之保存樣本的外觀。該等樣本因為各瓶中之狀況不同而以些微不同之速率冷凍。 .4示在0.1毫巴下之保存樣本的外觀，其中所有的已完全冷康。 7 D-顯示壓力增至。.8_3.5毫巴之保存樣本的外觀。使化的破璃狀物形成為保存樣本以及使溶劑蒸發。

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Claims

1332843 ------ 第092130228號專利申嬙案中文申請專利範圍替換丰(98年9月）拾、申請專利範菌： 1 · 種免疫組合物，其包含調配成乾燥組合物的不活化小兒麻痺病毒（IPV)、b型流行性感冒嗜血桿菌（Hib)多醣體或寡糖體及安定劑’其中該IPV之抗原性及/或免疫性於沖調後獲得保留。 2. 如申請專利範圍第丨項之免疫組合物，其包含衍生自腦膜炎雙球菌C之莢膜多醣體或寡醣體。 3. 如申咕專利範圍第丨或2項之免疫組合物，其中該多醣體或券醣係結合於載體蛋白質。 4. 如申请專利範圍第3項之免疫組合物，其中該多醣體或寡糖體係結合至破傷風類毒素。 5. 如申咕專利範圍第丨或2項之免疫組合物，其中該多醣體或券糖體係被吸收到磷酸鋁上。 6·如申請專利範圍第1或2項之免疫組合物，其另外包含衍生自任何腦膜炎雙球菌Α、γ或w或其組合之莢膜多醣體或募醣體。 7. 如申專利範圍第1或2項之免疫組合物，其包含Hib多 Μ或寡體及至少—腦膜炎雙球菌多酷體或寡膽體。 8. 如申叫專利範圍第7項之免疫組合物’其中該多醣體或券聽體係結合至同類型載體蛋白質。 9. 如申β月專利範圍第7項之免疫組合物，其中該多醣體或寡醣體係結合至不同類型載體蛋白質。如申1專利範圍第1或2項之免疫組合物，其更包含酚紅0 89024-981214.DOC 1332843 其中該乾燥後 11. 如申清專利範圍第1或2項之免疫組合物的組合物受到冷凍乾燥。其中該乾燥後其中該乾燥後 12. 如申請專利範圍第1或2項之免疫組合物的組合物是泡沫化玻璃體。 13_如申請專利範圍第丨或2項之免疫組合物的組合物是高黏性液體。 14.如申請專利範圍第13項之免疫組合物，其中該高黏性液體未經冷;東。 15· -種製造疫苗的方法’其包含將如中請專利範圍第1至 14項中任—項之免疫組合物沖調在在水溶液中之步驟。 16•如申請專利範圍第15項之方法，其中該水溶液包含白喉類毒素、破傷風類毒素及百曰咳抗原(非細胞性或整個細胞的）(DTP疫苗）。 Η.如申請專利範圍第16項之方法，其中用氫氧化紹部份調佐該DTP疫苗。 18. 如申請專利範圍第16或17頊乂項之方法，其中該水溶液包含 B型肝炎表面抗原。 19. -種套組，其包含如申請專利範圍第⑴斗項中任一項之免疫組合物與在—第二容器中之液體DTP(非細胞性或整個細胞的）疫苗之套組。 2〇.如_利範圍第19項之套組，其在第二容器中更包含 B型肝炎表面抗原。 21· 一種疫苗’其包含如申請專利範圍第!至14項中任一項之免疫組合物。 89024-981214.DOC -2 - ^32843 22.如申請專利範圍第叫之疫苗，其係在使用前沖調溶液。 23. 一種具有斥水内部表面的容器，其含有如申請專利範圍第21或22項之疫苗。 (種保存包含iPV、Hib多聽體或寡糖體及安定劑之組合物的方法，包含下列步驟： y將IPV及Hlb多ϋ體或寡糖體懸浮或溶解於安定劑之溶液中以製備保存樣本； b) 使保存樣本受到可使溶劑從保存樣本消失的溫度虚壓力處理；及一 c) 移除溶劑直到保存樣本乾燥形成固體或為止，其中的抗原性被保存下來。夜體 25.如申請專利範圍第24 ㉟固弟24項之方法，其卞該保存樣本係在具斥水内部表面的容器中乾燥。 26·=ΙΙ專利範圍第24或25項之方法，其令該保存樣本俘在V驟b)發泡以形成泡沫。 ’、 27. ==圍第26項之方法’其中該樣本在開始進行备方去刖至少部份受到冷凍。 28. 如申請專利範圍第26項之方法，其中 b)時成為至少部份料。其中韻存樣本在步帮 Μ.二申請專利範圍第24項之方法，其中在步驟b)時，該伴子樣本受到之溫度與壓力處理可使保存樣本：： ’’、、發^失而在無冷康或涉及泡珠形成的發泡情形 89024-98l2l4.DOC 30. 30. 下來形成具黏性液體，樣本乾燥形成高黏性液如申請專利範圍第24項菌性多醣體。且在步驟c)時移除溶劑直到保體。之方法，其中該保存樣本包含細 31.如申請專利範圍第3〇項之方法，其中該保存樣本包含源自任何腦膜炎雙耗A、c、MW或其等組合之多醋體或寡糖體。

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