KR20050084626A

KR20050084626A - 건조 공정

Info

Publication number: KR20050084626A
Application number: KR1020057007734A
Authority: KR
Inventors: 이브스 메이어레세
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2002-11-01
Filing date: 2003-10-30
Publication date: 2005-08-26
Also published as: ATE352316T1; ES2649048T3; WO2004039417A3; US20110159038A1; US8409587B2; CY1119362T1; PT1556477T; DK2395073T3; CA2503871C; NO342741B1; SI1556477T1; PL213647B1; JP4579156B2; AU2003278166B2; KR101058978B1; CA2503871A1; PL215237B1; EP1556477A2; NO20052010D0; LT2395073T

Abstract

본 발명은 생물학적 샘플 및 다른 불안정한 샘플이 고 점성 액체로서 보존될 수 있도록 이들을 건조시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 활성제를 안정화제의 용액에 용해/현탁시켜 보존 샘플을 제조하는 단계, 보존 샘플을, 동결이나 버블링으로 포말을 형성하지 않으면서 증발에 의해 보존 샘플이 용매를 유리시키는 그러한 온도 및 압력 조건하에 두는 단계 및 보존 샘플이 건조되어 고 점성 액체를 형성할 때까지 용매를 제거하는 단계를 포함한다.

Description

건조 공정 {DRYING PROCESS}

본 발명은 생물학적 샘플 및 다른 불안정한 샘플의 보존, 그렇게 보존된 샘플 및 상기 샘플을 보존하는 신규한 방법에 관한 것이다. 신규한 방법은 활성제를 포함하는 샘플 및 안정화제를 컨테이너에 첨가하고, 샘플을, 샘플의 동결이나 버블링으로 포말을 형성하지 않으면서 증발에 의해 용매의 유리를 야기하는 그러한 온도 및 압력 조건하에 두는 것을 포함한다. 후속하여, 제 2 건조기 동안, 압력 및 온도 조건을 유지시키거나 조정하여 용매가 제거되고 보존 샘플이 건조되어 고 점성 액체를 형성한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 보존된 조성물 및 특히 보존된 백신 조성물을 제공한다.

불안정한 샘플, 특히 생물학적 샘플의 안정성을 연장시켜 저장 수명을 늘릴 필요가 있다. 전통적으로, 이것은 물질의 용액을 제조하고 샘플을 동결시키는 동결 건조 공정을 사용하여 수행되어 왔다. 제 1 건조기 동안, 대부분의 물은 감압 조건하에 얼음으로부터 승화에 의해 제거되고 다공성 '케이크'가 형성된다. 이후, 일반적으로 압력 및 조건을 변화시켜 고체 '케이크'로부터 물을 증발시키는 제 2 건조기가 이어진다. 생성된 동결건조된 샘플은 액체 제형에 비해 개선된 안정성을 지닌다. 그러나, 동결 건조 공정은 장시간이고 고가여서 생산 과정에서 속도 제한 단계가 될 수 있다.

또한 동결 건조는 몇몇 활성제의 활성 또는 항원성의 손실을 초래할 수 있다. 생 바이러스와 같은 특정 생물학적 재료에 대하여, 동결 건조 공정 동안 활성히 현저하게 손실될 수 있다 [참고문헌: Pikal (1994) ACS Symposium 567:120-133). 수많은 동결 건조된 물질들이 주위 온도에서 여전히 불안정하다 [참고문헌: Carpenter 등 (1994) ACS Symposium 567:134-147).

동결 공정에 의해 초래된 손상은 폴리올과 같은 안정화제를 사용하여 어느 정도까지 회피될 수 있다. 또한 동결건조 공정에 대한 추가의 개선이 공정 동안 샘플을 동결시키는 것을 회피하고 비등에 의해 물을 제거함으로써 이루어져 왔다 [참고문헌: WO96/40077; US6306345]. 이 방법은 보존되는 샘플과 함께 적합한 용매 중의 유리-매트릭스 형성 재료의 혼합물을 제조하고, 혼합물로부터 벌크 용매를 증발시켜 시럽을 수득하고, 시럽을 시럽의 비등을 초래하기에 충분한 압력 및 온도에 노출시키고 잔여 용매를 제거하는 것을 포함한다. 이와 유사한 방법들을 포말 건조 기술로서 언급할 수 있다. 상기 기술은 '비등' 단계 동안 버블의 형성 및 파열로 인한 스트레스에 보존되는 샘플을 노출시킬 것이다. 특히 불안정한 물질이 보존되는 경우, 이는 활성의 손실을 초래할 수 있다.

유사한 방법이 미국 특허 제 5,766,520호에 기술되어 있으며, 이 방법은 부분적으로 물을 제거시켜 점성 유체를 형성하고, 추가로 시럽을 진공하에 두어 '비등'시키고, 실질적으로 100℃ 미만의 온도에서 건조시키는 것을 포함한다. 이 방법은 여전히 통상적인 동결-건조의 몇몇 문제점을 지닌다. 공정이 대규모 동결-건조기에서 수행될 때, 샘플은 선반 상의 이의 위치에 따라 상이한 속도로 건조될 것이고, 이는 건조 공정 동안 상이한 양의 활성을 손실한 다른 샘플들을 야기한다. 이는 회분내의 일관성을 결여시킨다.

트레할로오스는 이의 안정화 특성에서 유리한 폴리올이다. 트레할로오스는 몇몇 식물 및 동물에서 건조 손상의 방지와 관련이 있는 것으로 최초로 발견된 천연 발생의, 불활성인, 비환원성 및 비독성의, 유리-형성 이당류이다. 트레할로오스는 부분적인 이유이지만 비교적 높은 유리 전이 온도(무수 상태에서 약 120℃)를 지니기 때문에 건조 및 이에 후속한 저장 동안 단백질, 바이러스 및 식품을 포함하는 많은 종류의 물질의 변성을 방지하는데 유용하다 [참고문헌: US4891319; US5149653; US5026566). 트레할로오스는 또한 효소를 안정화한다 [참고문헌: Argall and Smith (1993) Biochem. Mol. Biol. Int. 30;491]. 트레할로오스 및 많은 종류의 안정화 폴리올은 또한 동결-건조된 샘플, 특히 샘플이 동결-건조 공정 동안 활성을 손실하기 쉬운 경우에 이의 보존을 향상시키는데 유용한 것으로 발견되었다. 동결건조 기술에서 유용한 그밖의 당류로는 수크로오스 및 락토오스가 있다.

본 발명은 특히 활성제가 대부분의 통상적인 건조 공정 동안 불안정하고 활성을 손실하기 쉬운 경우에 활성제를 보존하는 개선된 방법에 관한 것이다. 이 방법은 활성제를 안정화제의 용액에 용해/현탁시켜 보존 샘플을 제조하는 단계; 보존 샘플이 동결되거나 버블링되어 포말을 형성하지 않으면서, 증발에 의해 용매를 유리시키는 온도 및 압력 조건하에 보존 샘플을 두는 단계; 및 보존 샘플이 건조되어 고 점성 액체를 형성할 때까지 용매를 제거하는 단계를 포함한다.

이 방법은 매우 온화한 방법이며 활성제를 동결 또는 비등에 노출시키지 않으므로, 샘플을 상기 스트레스 중 어느 하나 또는 둘 모두에 노출시키는 통상적인 동결 건조 및 포말 건조 기술에 비해 유리하다. 보존되는 활성제가 불안정할 때, 본 발명의 방법을 이용하면 활성 및/또는 항원성의 보유를 증가시킨다. 이는 용매, 바람직하게는 물 또는 수용액에서 건조된 활성제를 재구성하여, 표준 검정(예를 들어, ELISA)에 의해 활성 또는 항원성을 측정하고, 건조되지 않은 샘플 또는 동결 건조 또는 포말 건조 기술에 의해 건조된 다음 재구성된 샘플로 수득된 결과와 비교함에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 IPV(비활성화 폴리오 바이러스, 주사가능한 폴리오 백신 중의 면역원)를 건조시키는 것이 특히 유리하다. IPV는 액체 제형으로서 공지된 백신으로 존재한다 [참고문헌: WO99/48525]. IPV의 고체 제형을 백신으로 사용하려는 시도는 표준 동결 건조 방법이 IPV 항원성의 손실을 초래하기 때문에 문제가 되어 왔다. 본 발명의 방법은, 본 발명의 방법에 요구되는 시간을 부분적으로 감소시키기 때문에 폴리오 바이러스 항원을 보다 높게 보유시킨다.

본 발명의 방법은 진행 주기가 보다 짧고 냉장을 덜 요구하여 보다 에너지 효율적이기 때문에 보통의 동결 건조에 비해 유리하다. 건조 공정은 종종 공정의 속도 제한 단계이므로, 본 발명의 방법을 이용하면 감소된 비용으로 보다 높은 수준의 생산을 야기한다.

도면의 설명

도 1 - 뒤집힌 바이알에서 고 점성 액체의 사진

본 발명의 방법은 활성제를 보존하기 위해 사용되며,

- 활성제를 안정화제의 용액에 현탁시키거나 용해시켜 보존 샘플을 제조하고;

- 보존 샘플을 동결시키거나 버블링시켜 포말을 형성하지 않으면서 증발에 의해 용매를 유리시키는 그러한 온도 및 압력 조건에 보존 샘플을 두어 점성 액체를 형성하는 단계를 포함하고;

- 임의로 점성 액체가 건조되어 고 점성 액체를 형성할 때까지 용매를 제거하는 추가의 단계를 포함한다.

활성제 보존 방법은 활성제의 연장된 저장에 견딜 수 있어서 그 동안 활성제의 활성 및/또는 항원성 및/또는 면역원성을 유지시키는 활성제의 형태를 제공한다. 바람직하게는 활성제가 4℃에서 적어도 3, 6, 9, 12, 24개월의 저장 기간 동안에 원래 활성, 항원성 및/또는 면역원성의 40, 50, 60, 70% 이상, 바람직하게는 80, 90, 95%를 보유한다. 항원성 또는 면역원성은 하기 기술되는 표준 검정에 의해 측정될 수 있다.

이 방법은 특히 용액 중에 저장되거나 동결 또는 버블링에 노출되어 포말을 형성할 때 신속하게 활성을 잃는 불안정한 생성물의 저장 수명을 연장시키는데 유용하다.

불안정한 생성물은 용액 중에 저장 및/또는 동결 및/또는 버블링에 수반되는 포말 형성과 같은 스트레스에 노출시 활성 및/또는 항원성 및/또는 면역원성을 잃는 경향이 있다.

보다 낮은 농도(예컨대, 3%-5% w/v)의 유리 형성 폴리올이 유리하고 단시간의 건조 공정(4, 6, 8, 10 또는 12시간)이 바람직한 경우의 사용을 위해 특히 적용될 수 있다.

점성 액체는 대부분의 용매가 샘플로부터 손실되는 말미에서, 제 1 용매 제거기의 생성물로서 정의된다. 이 점은 증발 속도가 느려져서 벌크 증발의 흡열 효과가 손실됨에 따라 샘플의 온도가 주위 온도로 되돌아오기 때문에 인지될 수 있다.

고 점성 액체는 제 1 건조기의 끝에서 생성된 점성 액체가 제 1 건조기가 끝난 이후 추가 시간 동안 감소된 압력에 노출되고 나서 생성된다. 고 점성 액체는, 바람직하게는 칼 피셔(Karl Fischer) 전기량 수분 분석기(Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50;277-284)에 의해 측정된, 15, 12, 10, 8, 5, 4, 3, 2 또는 1%(w/w) 미만이거나 이와 동일한 용매 함량을 지닌다. 용매 함량의 바람직한 범위는 1-3%, 3-5%, 5-10% 또는 10-15%(w/w)이다. 고 점성 액체는 활성제가 3, 6, 9, 12 또는 24개월 동안 40, 50, 60% 이상, 바람직하게는 70, 80, 90, 95%의 활성 및/또는 항원성 및/또는 면역성을 보유하게 하면서, 이 기간 동안 4℃에서 안정한 상태로 보존되기에 충분히 낮은 용매 함량을 지닌다. 바람직하게는, 고 점성 액체가 고체 외형을 지니나, 고무이거나 유리이고, 바람직하게는 유리이며 2, 4 또는 6일, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4주, 보다 바람직하게는 2, 4, 6, 8, 10 또는 12개월에 걸쳐 매우 천천히 흐를 수 있다. 극도로 느린 흐름은 고 점성 액체를 함유하는 용기를 뒤집어서 고 점성 액체의 흐름이 관찰될 때까지 실온에 방치함에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 고 점성 액체는 뒤집힌 상태에서 2, 4 또는 6일 후, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4주 후, 보다 바람직하게는 2, 4, 6, 8, 10 또는 12개월 후 흐르는 것처럼 보이지 않을 것이다. 바람직하게는, 고 점성 액체가 맑고, 투명한 외형을 지닌다.

보존 샘플의 제조

임의의 안정화제가 본 발명의 제 1 단계에 사용되기에 적합하다. 적합한 재료는 탄수화물 및 비탄수화물 폴리올을 포함하는 모든 폴리올이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 안정화 폴리올이, 활성제가 변성, 응집 또는 다른 수단에 의한 실질적인 활성의 손실 없이 저장될 수 있게 한다. 특히 적합한 물질로는 당류, 당 알코올 및 탄수화물 유도체가 있다. 바람직하게는, 유리 형성 폴리올이 글루코오스, 말투로오스, 이소-말투로오스, 락투로오스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 이소-말토오스, 말티톨, 락티톨, 팔라티니트, 트레할로오스, 라피노오스, 스타치오스, 멜레지토오스 또는 덱트스란을 포함하는 탄수화물 또는 이의 유도체이고, 가장 바람직하게는 트레할로오스, 수크로오스, 소르비톨, 라피노오스, 만니톨, 락토오스, 락티톨 또는 팔라티니트이고, 가장 바람직하게는 수크로오스, 소르비톨, 락토오스 또는 트레할로오스이다.

세균성 다당류는 안정화제 및 면역원 둘 모두로서 작용할 수 있기 때문에 면역원성 조성물에서 안정화제로서 사용되기에 특히 유리하다.

탄수화물로는 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당 및 이의 상응하는 당 알코올, 탄수화물 유도체와 같은 폴리히드록실 화합물 및 화학적으로 개질된 탄수화물, 히드록시에틸 전분 및 당 공중합체가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 천연 및 합성 탄수화물 둘 모두가 적합하게 사용된다. 합성 탄수화물로는 티올 또는 탄소 결합에 의해 대체된 글리코시딕 결합을 지니는 것들이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 탄수화물의 D 및 L 형태 둘 모두가 사용될 수 있다. 탄수화물은 비환원성이거나 환원성일 수 있다. 환원성 탄수화물이 사용될 때, 메일라드(Maillard) 반응의 억제제를 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용하기 적합한 환원성 탄수화물은 당 분야에 공지된 것들이고, 글루코오스, 말토오스, 락토오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 만노오스, 말투로오스 및 락투로오스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비환원성 탄수화물은 당 알코올 및 다른 직쇄 폴리알코올로부터 선택된 폴리히드록실 화합물의 비환원성 글리코시드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 유용한 탄수화물로는 라피노오스, 스타치오스, 멜레지토오스, 덱스트란, 수크로오스, 셀리비오스, 만노비오스 및 당 알코올이 있다. 당 알코올 글리코시드는 바람직하게 모노글리코시드, 특히 락토오스, 말토오스, 락투로오스 및 말투로오스와 같은 이당류의 환원에 의해 수득된 화합물이다.

특히 바람직한 탄수화물은 트레할로오스, 수크로오스, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 팔라티니트 및 글루코피라노실-1->6-만니톨이다.

아미노산이 안정화제로서 작용할 수 있고, 단독으로, 바람직하게는 폴리올과 함꼐 사용될 수 있다. 비록 임의의 아미노산, 또는 아미노산, 펩티드, 가수분해된 단백질 또는 혈청 알부민과 같은 단백질의 조합물이 안정화제로서 작용할 수 있으나, 바람직한 아미노산은 글리신, 알라닌, 아르기닌, 라이신 및 글루타민이다.

본 발명의 방법에 사용된 안정화제의 농도는 1% 내지 50% 중량/부피, 바람직하게는 1-5%, 5-10%, 15-20%, 20-25% 또는 25-50% 중량/부피, 가장 바람직하게는 15% 또는 10% (w/v) 미만이거나 이와 동일할 수 있다. 요구되는 안정화제의 양은 존재하는 염의 양에 비례한다. 따라서, 안정화제의 수준이 2% 내지 10%인 것이 바람직할지라도, 10% 내지 25%의 더 높은 농도가 높은 염 함량(100mM, 200mM, 300mM, 400mM 또는 500mM 이상)을 지니는 샘플을 건조시키기 위해 요구될 수 있다.

바람직하게는, 보존 샘플이 본 발명의 고 점성 액체예서 결정 형성을 억제할 수 있는 성분을 함유할 것이다. 아미노산 및 페놀 레드를 포함하는 염 및 그밖의 분자가 결정 형성을 억제한다.

컨테이너

상이한 혼합물 및 다양한 형태 및 크기의 컨테이너가 동시에 프로세싱될 수 있다. 이상적으로는, 사용되는 컨테이너의 크기가 초기 혼합물을 함유하고 이의 형성된 고체 부피를 수용하기에 충분하다. 통상적으로 이는 유리 형성 재료의 질량, 컨테이너의 표면적 및 유리 형성 조건에 의해 결정된다. 유리 형성 재료의 질량은 실제로 컨테이너 표면의 단위 면적 당 최소 질량으로서 해석되는 점성 시럽을 제공하기에 충분하여야 한다. 이 비는 혼합물 내지 혼합물 및 사용되는 컨테이너까지 다양하나, 본원에 기술된 방법에 따라 당업자에 의해 경험적으로 용이하게 결정된다. 위튼(Wheaton) 주형 및 튜브-절단된 바이알을 포함하는 임의의 바이알이 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 바람직하게 용매 차단제, 바람직하게는 발수 내부 표면을 지니는 컨테이너를 사용한다. 이는 소수성 조성물로 내부 표면을 코팅하는, 예를 들어 실리콘화에 의해 달성된다. 실리콘화는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 달성된다. 한 방법에서, 컨테이너는 실리콘의 에멀젼으로 컨테이너 내부를 채우고, 통상적으로 350℃의 고온에서 오븐으로 프로세싱함에 의해 실리콘화된다. 선택적으로, 발수 내부 표면은 발수 조성물로 이루어진 컨테이너에 의해 달성된다.

컨테이너의 발수 내부 표면은 물이 컨테이너의 측면상에 덜 수집되기 때문에 공정의 건조된 생성물이 용이하게 재구성되게 한다.

본원에서 단독의 형태가 사용될 수 있으나, 하나 이상의 유리 매트릭스-형성 재료, 하나 이상의 첨가제, 및 하나 이상의 물질이 존재할 수 있다. 이들 성분들의 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다.

용액

안정화제 및 활성제가 혼합되는 용매는 수성, 유기성, 또는 둘 모두의 혼합물일 수 있다. 소수성 물질(들)을 혼입시킨 유리를 형성하면서, 유리 매트릭스-형성 재료를 용해하기에 충분한 수성 용매 및 소수성 물질을 용해하기에 충분한 유기 용매를 사용할 수 있다.

용매의 선택은 혼입되는 임의의 첨가제 및/또는 물질의 특성 뿐 아니라, 유리 매트릭스 형성을 위해 선택된 재료의 특성에 의존할 것이다. 용매는 임의의 첨가제 및/또는 물질 뿐 아니라 유리 매트릭스-형성 재료를 충분히 용해시키기에 충분한 부피 및 특성을 지녀야 한다. 물질이 친수성 재료이면, 액체는 유독한 용매 상호작용으로 인한 활성의 여하한 잠재적인 손실을 피하기 위해 바람직하게 수성일 것이다. 바람직하게는, 수성 용매는 물 및 생물학적 완충 용액을 포함하나 이에 제한되지 않는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 수성 용매이다. 바람직하게는 수성 용매가 5 내지 98 부피%, 보다 바람직하게는 80 내지 98 부피%, 가장 바람직하게는 85 내지 98 부피%의 양으로 존재한다.

용매의 부피는 다양할 수 있고, 임의의 첨가제 뿐 아니라 혼입되는 유리 매트릭스-형성 재료 및 물질에 의존할 것이다. 요구되는 최소 부피는 다양한 성분들을 용해시키는데 필요한 양이다. 그러나, 균질하게 분산된 물질(들)의 현탁액을 또한 사용할 수 있다. 특정 구체예에서 성분의 적합한 양은 본원에 제공된 실시예에 비추어 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

다양한 첨가제가 보존 샘플에 도입될 수 있다. 바람직한 첨가제는 메일라드 반응의 억제제이다. 바람직하게는, 물질 및/또는 유리 매트릭스-형성 재료가 카르보닐 및 아미노, 이미노 또는 구아니디노기를 함유하고, 조성물이 추가로 하나 이상의 생리적으로 허용되는 메일라드 반응의 억제제를 조성물에서 아미노기 및 반응성 카르보닐기의 축합을 실질적으로 예방하기에 유효한 양으로 함유한다. 메일라드 반응의 억제제는 당 분야에 공지된 여하한 것일 수 있다. 억제제는 아미노기 및 반응성 카르보닐기의 축합을 예방하거나, 실질적으로 예방하기에 충분한 양으로 존재한다. 통상적으로, 아미노기는 물질상에 존재하고, 카르보닐기는 유리 매트릭스 형성 재료상에 존재하거나. 혹은 그 반대이다. 그러나, 아미노산 및 카르보닐기는 물질 또는 탄수화물내에서 분자내에 존재할 수 있다.

메일라드 반응에 대해 억제 효과를 나타내어 본원에 기술된 조성물에 사용될 수 있는 다양한 부류의 화합물이 공지되어 있다. 이러한 화합물은 일반적으로 메일라드 반응의 경쟁적이거나 비경쟁적인 억제제이다. 경쟁적인 억제제로는 아미노산 잔기(D 및 L 둘 모두), 아미노산 잔기 및 펩티드의 조합물이 있으나, 이애 제한되지 않는다. 특히 바람직한 것은 라이신, 아르기닌, 히스티딘 및 트립토판이다. 라이신 및 아르기닌이 가장 효과적이다. 공지된 수많은 비경쟁적인 억제제가 있다. 이들은 아미노구아니딘 및 유도체 및 아포테리신 B를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 EP-A-0 433 679호는 4-히드록시-5,8-디옥소퀴놀린 유도체를 포함하는 적합한 메일라드 억제제에 대해 기술한다.

본 발명의 방법에 따른 건조된 생성물을 용이하게 시각화할 수 있도록 보존샘플에 착색된 염료를 포함시키는 것이 바람직하다. 이것은 특히 재구성 동안 고 점성 액체가 사용 전에 완전히 재구성되었는지를 확인하기 위해 중요하다. 바람직하게는, 착색된 염료가 중성 pH에서 이의 색채를 유지하며, 환자에게 주입하기에 적합하다. 가장 바람직하게는 착색된 염료가 페놀 레드이다.

증발의 의한 용매의 유리 (증발식 건조 - 단계 b)

본 발명의 방법은 보존 샘플을 동결시키거나 버블링시켜 포말을 형성하지 않으면서, 증발에 의해 용매를 유리시키는 압력 및 온도 조건에 보존 샘플을 두는 것을 포함한다.

보존 샘플내의 온도는 때때로 증발 공정의 흡열 특성으로 인해 샘플 외부의 온도와 상이할 것이다. 온도에 대해서는 보존 샘플에 대한 외부 조건을 참조하는데, 예를 들어 선반의 온도에 대해서는 대규모 산업 동결 건조기를 사용한다. 이는 대체로 동결 건조기의 설정 온도에 상응한다.

임의로 보존 샘플을 탈기시키는 예비 단계가 본 발명의 방법에 존재한다. 압력은 압력이 추가로 감소되기 전 5분 이상의 기간 동안 200mBar 이하까지 감소되고, 바람직하게는 200 내지 35mBar로 감소된다.

본 발명의 바람직한 구체예는 온도 조건을 조절하면서 압력을 감소시킴에 의해 증발식 건조를 달성한다. 0℃ 이상, 바람직하게는 5 내지 37℃, 4 내지 10℃, 10 내지 15℃; 15 내지 20℃; 20 내지 25℃; 25 내지 30℃; 30 내지 37℃ 또는 37 내지 45℃의 온도에서의 설정 온도를 유지하면서, 압력은 30, 25, 20 이하로, 바람직하게는 15, 12, 가장 바람직하게는 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1mBar로 조정된다. 이러한 조건은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 또는 24시간, 바람직하게는 2-4시간, 4-6시간, 6-8시간, 8-12시간 또는 12-18시간 동안 유지된다. 특히 바람직한 구체예에서, 압력은 샘플의 동결을 예방하기 위해 온도가 15℃로 설정될 때 2mBar 이상으로 유지된다. 바람직한 구체예에서, 온도는 15℃에서 유지되고, 압력은 5-10mBar, 보다 바람직하게는 6-9mBar, 가장 바람직하게는 약 8mBar로 설정된다. 보다 높은 설정 온도가 사용되는 경우, 샘플을 동결시키지 않는 다소 낮은 압력이 가능하고, 보다 낮은 설정 온도가 사용되는 경우, 압력은 동결을 예방하는 보다 높은 수준으로 유지되어야 한다. 바람직하게는 이러한 조건을 충분한 기간 동안 유지시켜 샘플의 온도가 샘플의 외부 온도와 대략 동일해지도록 증발 속도를 느리게 하였다.

바람직하게는 보존 샘플이 동결되거나 버블링/비등되어 포말을 형성하지 않고, 용매를 유리시켜 점성 액체 또는 고 점성 액체를 형성한다.

고 점성 액체를 형성하기 위한 용매의 제거

본 발명의 방법의 후속하는 단계는 보존 샘플이 건조되어 고 점성 액체를 형성할 때까지 용매를 제거하는 것을 포함한다. 샘플은 제 2 건조기 동안 동결되거나 버블링되어 포말을 형성하지 않는다.

고 점성 액체는 바람직하게는 칼 피셔 전기량 수분 분석기를 사용하여 측정시 15, 12, 10 이하, 보다 바람직하게는 8, 5, 4, 3, 2 또는 1%(w/w)의 용매 함량을 지니는 재료로서 정의된다. 고 점성 액체는 충분히 낮은 용매 함량을 지녀서, 활성제가 이의 활성 및/또는 항원성 및/또는 면역원성의 40, 50, 60 이상, 바람직하게는 70, 80, 90, 95%를 보유하게 하면서 적어도 3, 6, 9, 12 또는 24개월 동안 4℃에서 안정한 상태로 보존된다. 바람직하게는, 고 점성 액체가 고체 및/또는 투명한 외형을 지니나, 유리이고, 2, 4 또는 6일, 바람직하게는 2, 3 또는 4주, 보다 바람직하게는 2, 4, 6, 8, 10 또는 12개월의 기간에 걸쳐 매우 천천히 흐를 수 있다. 극도로 느린 흐름은 고 점성 액체를 함유하는 용기를 뒤집어서 고 점성 액체의 흐름이 관찰될 때까지 실온에 방치함에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 고 점성 액체는 뒤집힌 상태에서 2, 4 또는 6일 후, 바람직하게는 2, 3 또는 4주 후, 보다 바람직하게는 2, 4, 6, 8, 10 또는 12개월 후에 흐르는 것처럼 보이지 않을 것이다.

본 발명의 한 구체예에서, 이는 제 1 증발식 건조 단계에서 적용된 압력 및 온도 조건을 유지시킴에 의해 달성된다. 예를 들어, 0℃ 이상, 바람직하게는 5 내지 37℃, 5 내지 10℃, 10 내지 15℃; 15 내지 20℃; 20 내지 25℃; 25 내지 30℃; 또는 30 내지 37℃의 온도에서의 설정 온도를 유지하면서, 압력은 30, 25, 20 이하, 바람직하게는 15, 12, 가장 바람직하게는 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1mBar로 유지된다. 15℃의 설정 온도에서 5-10mBar, 바람직하게는 6-9mBar, 가장 바람직하게는 약 8mBar의 압력이 4-24시간, 바람직하게는 1-4, 4-8, 8-12 또는 12-16시간 동안 유지된다. 이러한 온도 및 압력 조건이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18시간 이상 유지되어, 바람직하게는 칼 피셔 전기량 수분 분석기에 의해 측정시, 15, 12 이하, 바람직하게는 10, 8, 5, 4, 3, 2 또는 1%(w/w)의 용매 함량을 지니는 고 점성 액체를 수득한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 용매 제거 동안에 공정에서 초기에 유지된 것보다 높은 설정 온도까지 설정 온도를 증가시킨다. 이는 용매가 신속한 속도로 샘플을 떠나게 하므로 본 발명의 방법이 단시간에 완료될 수 있다. 예를 들어, 설정 온도는, 압력을 30, 25, 20 이하, 바람직하게는 15, 12, 가장 바람직하게는 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1mBar로 유지하면서, 0℃이상, 보다 바람직하게는 20℃ 이상, 바람직하게는 5 내지 37℃, 5 내지 10℃, 10 내지 20℃; 20 내지 30℃; 보다 바람직하게는 30 내지 40℃; 보다 바람직하게는 40 내지 50℃; 가장 바람직하게는 50 내지 60℃로 증가한다. 이러한 온도 및 압력 조건을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 또는 18시간 이상으로 유지하여, 바람직하게는 칼 피셔 전기량 수분 분석기에 의해 측정시 15, 12, 10, 8, 5, 4, 3, 2 또는 1%(w/w) 이하의 용매 함량을 지니는 고체를 수득한다. 이 구체예는 본 방법을 성공적으로 수행하기 위해 사용된 온도에서 활성제가 열에 안정할 것을 요구한다.

본 발명의 바람직한 구체예는 용매 제거 (단계 c) 동안에 공정에서 (단계 b) 초기에 사용된 것보다 낮은 설정 압력까지 설정 압력을 감소시킨다. 이는 용매가 신속한 속도로 샘플을 떠나게 하므로 본 발명의 방법이 단시간에 완료될 수 있다. 이는 또한 높은 비율로 용매가 유리되게 할 수 있다. 예를 들어, 설정 압력은, 온도를 0℃이상, 바람직하게는 10 내지 20℃; 20 내지 30℃; 30 내지 35℃ 또는 40℃ 이상으로 유지하면서 7, 6 이하, 바람직하게는 5, 4, 3, 보다 바람직하게는 2, 1.5, 1, 가장 바람직하게는 0.8, 0.5, 0.1, 0.1, 0.05, 0.02, 0.01 또는 0.005mBar 이하로 설정된다. 이러한 온도 및 압력 조건을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 또는 18시간 이상으로 유지하여, 바람직하게는 칼 피셔 전기량 수분 분석기에 의해 측정시 15, 12 이하, 바람직하게는 10, 8, 5, 4, 3, 2 또는 1%(w/w)의 용매 함량을 지니는 고체를 수득한다 [참고문헌: Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; 277-284].

바람직하게는 단계 b 및 c) (또는 b) 단독)가 18시간 이내, 바람직하게는 16, 12, 10시간, 가장 바람직하게는 8, 6, 5 또는 4시간에 완료되어야 한다.

활성제

본 발명의 방법은 임의의 활성제를 보존하는데 유용하나, 다른 보존 공정 동안 활성 및/또는 항원성 및/또는 면역원성을 잃는 불안정한 활성제의 경우에 특히 유용하다.

본 발명의 방법을 사용하여 보존되는 활성제는 세포, 세포구성성분 조성물, 세균, 외막 소포 조제물 및 바이러스, 바이러스 성분 또는 바이러스 유사 입자로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 시스템을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 단백질, 펩티드, 아미노산, 폴리핵산, 올리고누클레오티드, 다당류, 올리고당, 다당류-단백질 컨쥬게이트, 올리고당-단백질 컨쥬게이트와 같은 분자를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 보존될 수 있는 활성제의 예로는 항염증성 약물, 진통제, 정신분열증 치료제(tranquilliser), 항불안 약물, 항연축제, 항우울제, 항정신병제, 마약 길항제, 항파킨슨병제, 콜린성 작용제, 화학치료제, 면역억제제, 항바이러스제, 항균제, 식욕 억제제, 항콜린성제, 항메트릭제(antimetric), 항히스타민제, 항편두통제, 심혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제, 호르몬제, 피임제, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관제, 아편유사제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 약제학적으로 유효한 물질과 같은 임의의 바이오활성 물질이 있다.

또한 적합한 제제는 치료제 및 예방제를 포함한다. 이들은 임의의 치료학적으로 유효한 생물학적 개질제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 물질로는 세포구성성분 조성물, 세포, 세균, 외막 소포 조제물, 바이러스, 및 지질, 유기물, 단백질 및 펩티드(합성 및 천연), 펩티드 의태체, 호르몬(펩티드, 스테로이드 및 코르티코스테로이드), D 및 L 아미노산 중합체, 올리고당, 다당류, 누클레오티드, 올리고누클레오티드 및 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산, 단백질 핵산 하이브리드, 소분자 및 이의 생리적으로 활성인 유사체를 포함하나 이에 제한되지 않는 분자가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 개질제는 천연원으로부터 유래되거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있고, 유사체, 작용제 및 동족체를 포함한다.

또한 본원에서 사용된 "단백질"은 펩티드 및 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 단백질은 효소, 바이오약제, 성장 호르몬, 성장 인자, 인슐린, 항체, 모노클로날 및 폴리클로날 둘 모두와 이의 단편, 인터페론, 인터루킨 및 시토킨을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 기술된 방법에 의해 제조된 치료적 핵산-기재 제제가 또한 본 발명에 포함된다. 본원에서 사용된 "핵산"은 당 분야에 공지된 임의의 치료적으로 유효한 핵산으로서, DNA, RNA 및 이의 생리적으로 활성인 유사체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 누클레오티드는 유전자를 엔코딩하거나 재조합 DNA의 분야에 공지된 임의의 벡터로서, 플라스미드, 레트로바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이제 제한되지 않는다.

예방적으로 활성인 물질 및 이의 담체의 보존이 또한 본 발명에 포함된다. 바람직한 조성물은 백신과 같은 면역원을 포함한다. 백신은 경구 투여될 수 있거나, 재구성 후 주입될 수 있다. 적합한 백신은 생 및 약독화된 바이러스, 항원을 엔코딩하는 누클레오티드 벡터, 생 및 약독화된 세균, 단백질, 다당류, 올리고당 및/또는 지질다당류 항원, 항원 플러스 애쥬번트 및 담체에 커플링된 항원 및/또는 합텐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 것은 디프테리아, 파상풍, 백일해, 보툴리눔, 콜레라, 뎅기열, 간염 A, B, C 및 E, 헤모필루스 인플루엔자 b(Haemophilus influenzae b), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노르호에아(Neisseria gonorrhoeae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 그룹 B 연쇄구균, 그룹 A 연쇄구균, 헤르페스 바이러스, 헬리코박테리움 파일로리(Helicobacterium pylori), 인플루엔자, 일본 뇌염, 수막구균 A, B, C, Y, W, 홍역, 이하선염, 파필로마 바이러스, 폐렴 연쇄구균, 폴리오 바이러스, 비활성화된 폴리오 바이러스(IPV-바람직하게는 백신 분야에서의 표준으로서 타입 1, 2 및 3을 포함함, 가장 바람직하게는 소크(Salk) 폴리오 백신), 풍진, 로타바이러스, 호흡기 합포성 바이러스, 시겔라, 투베르쿨로시스, 바리셀라-조스터 바이러스, 황열병 및 이의 조합에 효과적인 백신이다. 백신의 항원 성분은 또한 분자 생물학 기술에 의해 제공되어 병원체로부터 유래된 단백질의 하나 이상의 부분을 함유하는 재조합 펩티드 또는 융합 단백질을 생성할 수 있다. 예를 들어, 콜레라 독소의 항원 및 B 서브유닛을 함유하는 융합 단백질이 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다 [참고문헌: Sanches 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 481-485]. 백신은 특히 단일-용량 조성물에 혼입시키기에 적합하다. 이들은 주위 조건하에 무기한으로 안정하고, 접종 직전에 무균 희석제에 재용해될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 면역원성 조성물은 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 혈청군 A, C, W-135 및 Y 중의 하나 이상으로부터 유래된 캡슐형 다당류를 포함할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된 캡슐형 다당류를 포함할 것이다. 폐렴 연쇄구균의 캡슐형 다당류 항원은 바람직하게 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F (가장 바람직하게는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구체예는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형의 PRP 캡슐형 다당류를 함유할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 타입 5, 타입 8, 336 또는 PNAG 캡슐형 다당류를 함유할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)의 타입 I, 타입 II, 타입 III 또는 PIA 캡슐형 다당류를 함유할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 그룹 B 연쇄구균의 타입 Ia, 타입 Ic, 타입 II 또는 타입 III 캡슐형 다당류를 함유할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 그룹 A 연쇄구균의 캡슐형 다당류를 함유하고, 바람직하게는 추가로 하나 이상의 M 단백질을 포함하며, 보다 바람직하게는 M 단백질의 다중형을 포함할 것이다.

본 발명의 한 구체예에서, 세균성 다당류는 전장의, 정제된 원시 다당류이다. 본 발명의 선택적인 구체예에서, 다당류는 2 내지 20회, 바람직하게는 2-5회, 5-10회, 10-15회 또는 15-20회 사이징되어, 보다 다루기 쉽도록 크기가 작아진다. 바람직한 구체예에서 올리고당을 사용한다. 올리고당은 통상적으로 2 내지 20개의 반복 유닛을 함유한다.

다당류 및 올리고당은 비컨쥬게이션되거나 하기 기술된 대로 컨쥬게이션될 수 있다.

상기 활성제의 둘 이상의 조합물이 본 발명의 보존 방법을 사용하여 보존될 수 있다. 백신의 일부 또는 전부가 본 발명의 보존 방법을 사용하여 보존될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 보존되는 바람직한 활성제는 IPV(폴리오 바이러스 균주의 비활성화된 혼합물)를 포함한다. IPV, 특히 타입 3 성분은 동결 건조 또는 포말 건조 및 후속하는 재구성에 이은 항원의 손실이 나타내는 바와 같이, 통상적인 동결 건조 및 포말 건조 기술에 민감하다.

IPV는 비활성화된 폴리오 바이러스(바람직하게는 백신 분야에서의 표준으로서 타입 1, 2 및 3을 포함함, 가장 바람직하게는 소크 폴리오 백신)로서 정의된다. IPV의 백신 용량은 20-80, 바람직하게는 타입 1의 40 또는 80 D-항원 유닛 (Mahoney), 4-16, 바람직하게는 타입 2의 8 또는 16 D-항원 유닛(MEF-1) 및 20-64, 바람직하게는 타입 3의 32 또는 64 D-항원 유닛(Saukett)을 함유한다.

본 발명의 방법에 의해 건조시, 폴리오 바이러스의 타입 1, 2 및 3 중의 하나, 둘 또는 세 개 모두의 항원성이 보유되는 것이 바람직하다; 보다 바람직하게는 타입 1; 타입 2; 타입 3; 타입 1 및 타입 2; 타입 1 및 타입 3; 타입 2 및 타입 3; 또는 타입 1, 타입 2 및 타입 3의 항원성이 건조 공정을 거치지 않은 기준 샘플의 항원성의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 수준으로 보유된다. 이것은 수용액에서 고 점성 액체의 재구성에 이어, ELISA에 의한 것을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해, 폴리오 바이러스 타입 1, 2 및/또는 3에 대한 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체를 사용하여 측정될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 건조시, 폴리오 바이러스의 타입 1, 2 및 3 중의 하나, 둘 또는 세 개 모두의 면역원성이 보유되는 것이 바람직하다; 보다 바람직하게는 타입 1; 타입 2; 타입 3; 타입 1 및 타입 2; 타입 1 및 타입 3; 타입 2 및 타입 3; 또는 타입 1, 타입 2 및 타입 3의 면역원성이 건조 공정을 거치지 않은 기준 샘플의 면역원성의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 수준으로 보유된다. 이것은 수용액에서 고 점성 액체의 재구성에 이어, 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 방법에서, 고 점성 액체는 수용액에서 재구성되고, 동물, 바람직하게는 랫트에게 접종된다. 적합한 기간 후, 접종된 동물로부터 항혈청을 수집하고 혈청전환을 시험한다. 바람직하게는 건조되지 않은 기준 샘플과 비교하여, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9 이상의 상대 효능이 달성된다.

바람직하게는, IPV는 하나 이상의 Hib(헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형) PRP 다당류 또는 올리고당 및/또는 수막구균 A, C, W 및/또는 Y 다당류 또는 올리고당 및/또는 폐렴 연쇄구균 다당류 또는 올리고당과 조합된다. 가장 바람직하게는, 활성제가 IPV 및 Hib; IPV 및 MenC; IPV, Hib 및 MenC; Hib 및 MenC; IPV 및 MenA 및 C; Hib 및 MenA 및 C; IPV, Hib, MenA 및 C; Hib, MenC 및 Y; 또는 IPV, Hib, MenC 및 Y를 포함한다.

상기 열거된 활성제가 또한 하기 기술되는 하나 이상의 폐렴 연쇄구균 캡슐형 다당류를 포함할 수 있다.

다당류가 사용된 상기 조성물에서, 올리고당이 또한 사용될 수 있다 (하기 정의됨).

이들 조성물이 애쥬번트화될 수 있으나 (하기 기술됨), 이들은 애쥬번트화되지 않거나 알루미늄염을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

바람직하게는 다당류 또는 올리고당이 T-헬퍼 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 담체 단백질에 컨쥬게이션된다 (하기 기술됨).

추가 성분들

본 발명에 방법에 의해 건조된 바람직한 조합물은 건조된 성분들을 재구성하는데 사용될 수 있는 건조된 제형 또는 바람직하게는 액체 제형인 조합 백신에서 다른 항원과 조합될 수 있다. 상기 문단에서 활성제와 함께 조합되는 바람직한 항원은 하나 이상의 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 전세포 백일해(Pw), 무세포 백일해(Pa)(하기 기술됨), 간염 B 표면 항원, 간염 A 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자 b 다당류, 나이세리아 다당류, 나이세리아 메닝기티디스 혈청형 B 단백질, 폐렴 연쇄구균 다당류, 폐렴 연쇄구균 단백질 또는 하기 나열되는 임의의 항원을 포함한다. 세균의 다당류는 하기 기술되는 파상풍 톡소이드, 파상풍 톡소이드 단편 C, 디프테리아 톡소이드, CRM197, 뉴모라이신, 단백질 D(US6342224)와 같은 담체 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 보존되는 활성제는 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 헤모필루스 인플루엔자 b(Haemophilus influenzae b), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 그룹 A 연쇄구균, 그룹 B 연쇄구균, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 중의 하나 이상으로부터 유래된 캡슐형 다당류와 함께 제형화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 면역원성 조성물은 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 혈청군 A, C, W-135 및 Y 중의 하나 이상으로부터 유래된 캡슐형 다당류를 포함할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된 캡슐형 다당류를 포함할 것이다. 폐렴 연쇄구균의 캡슐형 다당류 항원은 바람직하게 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F (가장 바람직하게는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구체예는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형의 PRP 캡슐형 다당류를 함유할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 타입 5, 타입 8, 336 또는 PNAG 캡슐형 다당류를 함유할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)의 타입 I, 타입 II, 타입 III 또는 PIA 캡슐형 다당류를 함유할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 그룹 B 연쇄구균의 타입 Ia, 타입 Ic, 타입 II 또는 타입 III 캡슐형 다당류를 함유할 것이다. 추가의 바람직한 구체예는 그룹 A 연쇄구균의 캡슐형 다당류를 함유하고, 바람직하게는 추가로 하나 이상의 M 단백질을 포함하며, 보다 바람직하게는 M 단백질의 다중형을 포함할 것이다.

상기 캡슐형 다당류는 컨쥬게이션되지 않거나 파상풍 톡소이드, 파상풍 톡소이드 단편 C, 디프테리아 톡소이드, CRM197, 뉴모라이신, 단백질 D(US6342224)와 같은 담체 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다. 파상풍 톡소이드, 디프테리아 독소 및 뉴모라이신은 유전적 돌연변이 및/또는 바람직하게는 화학적 처리에 의해 무독화된다.

다당류 컨쥬게이트는 임의의 공지된 커플링 기술에 의해 제조될 수 잇다. 예를 들어, 다당류는 티오에테르 결합을 통해 커플링될 수 있다. 이러한 컨쥬게이션 방법은 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)를 지니는 다당류의 활성에 의존하여 시아네이트 에스테르를 형성한다. 활성화된 다당류는 따라서 담체 단백질 상의 아미노기에 직접 또는 스페이서기를 통해 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 시아네이트 에스테르는 헥산 디아민과 커플링되고, 아미노-유도체화된 다당류는 티오에테르 결합의 형성을 수반하는 헤테로결찰 화학을 사용하여 담체 담백질에 컨쥬게이션된다. 이러한 컨쥬게이트는 WO93/15760 유니폼드 서비시즈 유니버시티의 PCT 공개 출원에 기술되어 있다.

또한 컨쥬게이트는 US 4365170 (Jennings) 및 US 4673574 (Anderson)에 기술된 직접 환원성 아민화 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 방법이 EP-0-161-188, EP-208375 및 EP-0-477508에 기재되어 있다.

추가의 방법은 아디프산 히드라지드(ADH)로 유도체화된 시아노겐 브로마이드 활성화된 다당류를 카르보디이미드 축합에 의해 단백질 담체에 커플링하는 것을 포함한다 [참고문헌: Chu C. 등 Infect. Immunity, 1983 245-256].

바람직한 폐렴 연쇄구균 단백질 항원은 폐렴 연쇄구균의 외부 표면에 노출된 (폐렴 연쇄구균의 생활 주기의 적어도 일부 동안 숙주의 면역 시스템에 의해 인지될 수 있는) 폐렴 연쇄구균 단백질이거나, 폐렴 연쇄구균에 의해 분비되거나 방출된 단백질이다. 가장 바람직하게는, 단백질이 독소, 부착소, 2-성분 시그날 변환기 또는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)의 지단백질 또는 이의 단편이다. 특히 바람직한 단백질로는 뉴모라이신 (바람직하게는 화학적 처리 또는 돌연변이에 의해 무독화된) [참고문헌: Mitchell 등 Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18 (13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell 등 Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007 (1) : 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli : rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid). WO 90/06951 (Panton 등), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (US 5804193 - Briles 등); PspC 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (WO 97/09994 - Briles 등); PsaA 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); 폐렴 연쇄구균 콜린 결합 단백질 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체; CbpA 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (WO 97/41151; WO 99/51266); 글리세르알데히드-3-포스페이트-탈수소효소 (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato 등 FEMS Microbil Lett 1998, 164:207-14); M 유사 단백질 (EP 0837130) 및 부착소 18627 (EP 0834568)이 있으나, 이제 제한되지 않는다. 추가의 바람직한 폐렴 연쇄구균 단백질 항원은 WO 98/18931에 기재된 것들, 특히 WO 98/18930 및 PCT/US99/30390에서 선택된 것들이다.

본 발명의 면역원성 조성물과 제형화되는 바람직한 나이세리아 단백질로는 TbpA (WO93/06861; EP586266; WO92/03467; US5912336), TbpB (WO93/06861; EP586266), Hsf (WO99/31132), NspA (WO96/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (또한 D15로서 공지됨)(WO00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (W096/31618 참조: 서열 번호: 38), FrpA 또는 FrpC 또는 둘 모두에 공통으로 30, 50, 100, 500, 750개 이상의 아미노산이 보존된 부분 (W092/01460), LbpA 및/또는 LbpB (PCT/EP98/05117; Schryvers 등 Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (W098/02547), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), MltA (W099/57280) 및 ctrA (PCT/EPOO/00135)가 있다. 나이세리아 단백질은 외막 조제물의 일부로서의 정제된 단밸질로서 첨가되는 것이 바람직하다.

백신은 디프테리아, 파상풍 및 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 감염 중의 하나 이상에 대해 보호를 제공하는 항원과 제형화되는 것이 바람직하다. 백일해 성분은 PT, FHA 및 69kDa 퍼택틴으로부터의 하나 이상의 항원 (바람직하게는 둘 또는 세 개 모두)을 함유하는 치사된 전세포 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)(Pw) 또는 무세포 백일해(Pa)일 수 있다. 특정의 다른 무세포 백신이 또한 Fim2 및 Fim 3과 같은 응집원을 함유하고, 본 발명에서 이들 백신의 사용이 또한 고려된다. 통상적으로, 디프테리아 및 파상풍에 대한 보호를 제공하는 항원은 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드이다. 톡소이드는 화학적으로 비활성화된 독소이거나 (예를 들어, 포름알데히드로 처리함에 따른) 하나 이상의 점 돌연변이의 도입에 의해 비활성화된 독소이다.

선택적으로, 본 발명의 고 점성 액체는 한 컨테이너에 고 점성 액체 유리를 지니고, 또다른 컨테이너에 액체 DTPa 또는 DTPw를 지니는 키트로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는, 예를 들어 동일한 시린지이나 별도의 쳄버에 건조 성분 및 액체 성분을 함유하는 이중 쳄버 시린지를 포함할 수 있다. 이후 건조되는 성분들은 단일 백신으로 주입되기 직전에 액체 백신으로 재구성된다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 고 점성 액체 조성물은 액체 DTPa 또는 DTPw 백신으로 재구성되어 (바람직하게는 일시적으로) 단일 백신으로서 투여된다. DTPa 또는 DTPw 백신은 통상적으로 적어도 부분적으로 수산화 알루미늄으로 애쥬번트화된다 (예를 들어 글락소스미스클라인 바이올로지칼즈 에스.에이.의 Infanrix 및 Tritanrix 백신).

이 백신은 또한 비유형성 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), RSV에 대해 숙주를 보호할 수 있는 하나 이상의 항원 및/또는 인플루엔자 바이러스에 대해 숙주를 보호할 수 있는 하나 이상의 항원을 포함하거나 포함하지 않을 수 잇다.

바람직한 비유형성 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 단백질 항원은 핌브린(Fimbrin) 단백질 (US 5766608) 및 그로부터의 펩티드를 포함하는 융합물 (예컨대, LBI 융합물) (US 5843464-Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, 단백질 D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap 및 D15를 포함한다.

바람직한 인플루엔자 바이러스 항원은 전 바이러스, 생 바이러스 또는 비활성화된 바이러스, 난세포에서 성장시킨 분할 인플루엔자 바이러스 또는 MDCK 세포, 또는 베로(Vero) 세포 또는 전 인플루엔자 바이로좀 (R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920에 기술됨) 또는 이의 정제된 단백질 또는 재조합 단백질, 예컨대 HA, NP, NA 또는 M 단백질, 또는 이의 조합물을 포함한다.

바람직한 RSV (호흡기 합포성 바이러스) 항원은 F 당단백질, G 당단백질, HN 단백질, M 단백질 또는 이의 유도체를 포함한다.

본 발명의 항원성 조성물이 단일 종의 세균으로부터의 하나 이상의 캡슐형 다당류를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 항원성 조성물은 또한 하나 이상의 세균종으로부터 유래된 캡슐형 다당류를 포함할 수 있다.

면역원성 조성물 및 백신

추가로 본 발명의 측면은 본 발명의 고 점성 액체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 포함한다.

바람직하게는, 면역원성 조성물 또는 백신은 면역원에 대한 면역 반응을 개선시키기에 충분한 양의 애쥬번트를 함유한다. 적합한 애쥬번트로는 알루미늄염, 스쿠알렌 혼합물 (SAF-1), 뮤라밀 펩티드, 사포닌 유도체, 미코박테리움 세포벽 조제물, 모노포스포릴 지질 A, 미콜린산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 게면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴포스파젠 및 유도체, 및 Tkahashi 등 (1990) Nature 344:873-875에 기술된 것들과 같은 면역자극성 복합체 (ISCOM)가 있으나, 이제 제한되지 않는다. 동물에서의 수의적 용도 및 항체를 생성하기 위해, 프로인트 애쥬번트의 미토겐 성분이 사용될 수 있다.

모든 면역원성 조성물 또는 백신에 대하여, 면역원의 면역적 유효량은 경헝적으로 결정되어야 한다. 고려되는 인자로는, 면역원이 애쥬번트 또는 담체 단백질 또는 다른 담체에 복합될지 또는 공유적으로 부착될지와 무관하게, 면역원성, 투여 경로 및 투여되는 면역 투여의 횟수가 있다. 이러한 인자들은 백신 분야에 공지되어 있고, 과도한 실험없이 이들을 결정하는 것은 충분히 면역학자의 기술내에 있다.

활성제는 본 발명의 고 점성 액체 또는 백신에서 다양한 농도로 존재할 수 있다. 통상적으로, 물질의 최소 농도는 의도하는 용도를 달성하기에 필요한 양인 반면, 최대 농도는 용액에 보유되거나 초기 혼합물내에 균질하게 현탁될 최대량이다. 예를 들어, 치료제의 최소량은 바람직하게 단일 치료적 유효 용량을 제공하는 양이다. 바이오활성 물질에서, 최소 농도는 재구성시 바이오활성을 위해 필요한 양이고, 최대 농도는 균질한 현탁액이 유지될 수 없는 지점에 존재한다. 단일 투여되는 유닛의 경우, 이 양은 단일 치료적 적용의 양이다. 일반적으로 각 용량은 1-100㎍, 바람직하게는 5-50㎍ 및 가장 바람직하게는 5-25㎍의 단백질 항원을 포함할 것으로 예상된다. 세균성 다당류의 바람직한 용량은 10-20㎍, 10-5㎍, 5-2.5㎍ 또는 2.5-1㎍이다. 물질의 바람직한 양은 물질마다 다르나 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

활성제를 포함하는 고 점성 액체

본 발명의 또다른 측면은 바람직하게는 본 발명의 방법을 사용하여 수득될 수 있거나 수득되는 활성제를 포함하는 고 점성 액체이다. 활성제는 본 발명의 방법을 사용한 건조 및 후속하는 재구성 이후에 이의 활성 및/또는 항원성 및/또는 면역원성을 보유하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 활성제의 활성, 항원성 또는 면역원성의 적어도 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%가 보유된다. 이는, 예를 들어 상기 기술된 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 고 점성 액체는 글루코오스, 말투로오스, 이소-말투로오스, 락투로오스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 소르비톨, 이소-말토오스, 말티톨, 락티톨, 팔라티니트, 트레할로오스, 라피노오스, 스타치오스, 멜레지토오스 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된 유리 형성 폴리올을 포함한다.

본 발명의 고 점성 액체는 상기 기술된 임의의 활성제를 함유할 수 있다. 고 점성 액체에 의해 보존된 활성제는 생물학 시스템, 예를 들어 세포, 세포구성성분 조성물, 세균, 외막 소포 조제물 및 바이러스를 포함할 수 있다. 선택적으로 또는 추가로 단백질, 펩티드, 아미노산, 폴리핵산, 올리고누클레오티드, 다당류, 올리고당, 다당류-단백질 컨쥬게이트, 올리고당-단백질 컨쥬게이트의 분자를 포함할 수 있다. 이는 또한 둘 이상의 상기 활성제를 포함하는 조합물을 포함할 수 있다.

바람직한 구체예는 바람직하게 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 고 점성 액체를 포함하며, 활성제는 백신 또는 백신 성분이거나 이들을 포함한다. 백신의 바람직한 성분은 상기 기술되어 있고, IPV, 보다 바람직하게는 IPV 및 세균성 다당류, 바람직하게는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b 및 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) A, C, W 및 Y로부터의 다당류 또는 올리고당을 포함한다.

바람직한 백신 성분은 IPV (폴리오 바이러스 균주의 비활성화된 혼합물)를 포함한다. 바람직하게는, IPV를 Hib PRP 다당류 및/또는 수막구균 A, C, W 및/또는 Y 다당류 및/또는 폐렴 연쇄구균 다당류 (상기 기술됨) 중의 하나 이상과 조합하고, 보다 바람직하게는 IPV 및 Hib; IPV 및 MenC; IPV, Hib 및 MenC; Hib 및 MenC; IPV 및 MenA 및 C; Hib 및 MenA 및 C; IPV, Hib, MenA 및 C; Hib, MenC 및 Y; 또는 IPV, Hib, MenC 및 Y를 조합한다.

다당류를 사용한 상기 조성물에, 올리고당이 또한 사용될 수 있다 (상기 정의됨).

상기 조성물이 애쥬번트화될 수 있으나 (상기 정의됨), 바람직하게는 애쥬번트화되지 않거나 바람직하게는 알루미늄염을 포함하지 않는다.

바람직하게는 다당류 또는 올리고당이 T-헬퍼 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 담체 단백질에 컨쥬게이션된다 (상기 기술됨).

본 발명의 고 점성 액체는 건조된 성분들을 재구성하는데 사용될 수 있는 건조된 제형 또는 바람직하게는 액체 제형인 조합 백신에서 다른 항원과 조합되는 것이 바람직하다. 본 발명의 컨테이너의 내용물과 조합되는 바람직한 항원은 하나 이상의 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 전세포 백일해(Pw), 무세포 백일해(Pa)(상기 기술됨), 간염 B 표면 항원, 폐렴 연쇄구균 다당류, 폐렴 연쇄구균 단백질, 나이세리아 다당류, 나이세리아 단백질을 포함한다. 세균성 다당류는 파상풍 톡소이드, 파상풍 톡소이드 단편 C, 디프테리아 톡소이드, CRM197, 뉴모라이신, 단백질 D(US6342224)와 같은 담체 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다.

추가로 본 발명의 측면은 수용액에서 고 점성 액체를 재구성하는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법이다. 바람직한 구체예에서, 수용액은 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드 및 백일해 (무세포 또는 전세포) 항원을 포함하고, 추가로 간염 B 표면 항원을 포함하거나 포함하지 않는다. DTP 백신은 알루미늄염, 바람직하게는 수산화 알루미늄 또는 인산 알루미늄으로 적어도 부분적으로 애쥬번트화되거나 애쥬번트화되지 않는다.

본 발명의 또다른 구체예는 첫번째 컨테이너에 본 발명의 고 점성 액체를 보유하고 두번째 컨테이너에 액체 DTP (무세포 또는 전세포)를 포함하는 백신을 포함하는 키트이다. 상기 기술된 대로 이중 쳄버 시린지를 사용할 수 있다.

본 특허 명세서내에 인용된 모든 참고문헌 또는 특허 출원은 본원에 참조로서 포함된다.

하기 실시예는 달리 상세하게 기술되는 것을 제외하고, 널리 공지되고 당업자에게 일상적인 표준 기술을 이용하여 수행된다. 본 실시예는 예시를 위한 것이며, 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1. 동결 조건의 확정

물에 수크로오스를 용해시켜 1%, 5%, 10% 및 20%의 용액을 제공함으로써 샘플을 제조하였다. 샘플을 선반 온도가 1℃ 이내로 조절될 수 있고, 응축기의 최종 온도가 -85℃이며, 압력이 블리드 밸브로 조절되고 생성물 온도를 측정하기 위해 6개의 열전쌍을 이용할 수 있는 헤토 드라이위너(Heto Drywinner) 8-85 동결 건조기에 놓았다. 선반의 설정 온도는 공정을 통털어 15℃에서 유지되었다. 압력을 초기에 200mBar로 감소시켜 10분 동안 이 수준에서 유지시킨 후 추가로 50mBar, 5mBar, 2.5mBar, 0.75mBar, 0.4mBar 및 0.2mBar까지 감소시켰다. 각 압력 수준을 20분 동안 유지시켜 온도가 평형이 되게하고, 열전쌍을 사용하여 샘플의 온도를 읽었다. 열전쌍을 상이한 수크로오스 농도를 지니는 샘플에 부착하였고, 표 1에 기록된 온도는 온도의 평균 수치이다.

결과

존재하는 수크로오스의 농도와 무관하게, 모든 샘플은 1.66 내지 1.11mBar에서 동결되었다. 상이한 압력에서 측정된 온도는 삼중 점 곡선으로부터 예상된 것들에 매우 근접하였다. 따라서, 수크로오스의 존재는 상이한 압력에서 샘플의 온도에 큰 영향을 미치지 않는다.

샘플의 동결을 피하기 위해, 압력을 15℃의 선반 온도에 대해 2mBar 이상으로 유지시켜야 한다. 보다 낮은 온도에서, 압력은 더 높은 수준으로 유지되어야 하는 반면, 보다 높은 온도의 이용은 압력이 샘플을 동결시키지 않으면서 추가로 감소되도록 할 것이다.

표 1

압력	측정 온도	이론적 온도	액체/동결
1000mBar	15℃		액체
50mBar	15℃		액체
5mBar	1℃	1℃	액체
2.5mBar	-5℃	-7℃	액체
0.75mBar	-21℃	-21℃	동결
0.4mBar	-22℃	-27℃	동결
0.2mBar	-27℃	-32℃	동결

실시예 2. 동결시키거나 포말을 형성하지 않고 건조시키는 방법

5%, 10%, 15% 및 25%의 수크로오스를 함유하는 보존 샘플을 제조하여 바이알에 첨가하였다. 샘플을 공정을 통털어 설정 온도가 15℃인 동결 건조기내에 놓았다. 압력을 먼저 200mBar로 감소시키고, 추가로 압력을 낮추기 전에 탈기시키기 위해 이 수준에서 10분 동안 유지하였다. 샘플 내부의 열전쌍이 샘플 온도가 증발식 냉각으로 인해 4℃까지 감소되었음을 나타내는 시간 동안 압력을 추가로 2 내지 3시간 동안 8mBar까지 감소시켰다. 2-3시간 후, 샘플의 온도가 15℃로 회복되며, 이는 상기 온도 및 압력 조건하에 증발이 거의 완료되었음을 나타낸다. 공정의 이 단계 동안, 샘플은 샘플내의 활성제가 가능한 한 스트레스에 노출되지 않도록 비등하여 포말을 형성하거나 동결되지 않았다. 샘플은 점성 액체의 외형을 지닌다.

추가로 선반의 설정 온도를 15℃로 유지하면서, 압력을 추가로 0.1mBar까지 감소시킴에 의해 샘플의 건조를 달성하였다. 이러한 조건은 추가 10 내지 16시간 동안 유지되었다. 이 단계 동안, 샘플 온도는 증발 속도를 느리게 했기 때문에 15℃에서 유지되었다. 추가의 건조가 일어났고, 생성된 샘플은 고체 외형을 지녔다. 샘플이 이의 측면에 배치될 때, 샘플 내용물은 샘플이 높은 점도의 액체 유리임을 나타내는 기간에 걸쳐서 속력을 매우 느리게 늦춘다. 도 1은 고 점도 액체의 외형을 도시한다.

실시예 3. 동결 또는 포말 형성 없이 건조 후 IPV 면역원성의 보유

상기 샘플에는 포말 형성을 수반하는 버블링 또는 동결과 관련된 스트레스가 가해지지 않았다. 이 방법이 IPV를 건조시키기 위해 사용될 때 높은 수준의 항원 보유를 나타내는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다.

세 개의 분리된 실험을 수행하였고, 여기서 IPV를 안정화제로서 10% 수크로오스 또는 10% 트레할로오스를 지니는 수용액에 재현탁하였다. 샘플을 헤토 드리아위너 8-85 동결-건조기에 정위된 실리콘화 바이알에 놓고, 온도를 15℃로 설정하였다. 압력을 먼저 35mBar로 감소시켜 샘플을 탈기시켰다. 10분 후, 압력을 추가로 8mBar까지 감소시키고, 이 수준에서 2시간 동안 유지하였다. 이 기간 동안 설정 온도를 15℃에서 유지하고, 샘플내의 온도를 모니터링하였다. 물이 샘플로부터 증발하기 때문에, 온도는 4℃까지 떨어지나, 2시간에 가까워질수록 증발 속도가 느려짐에 따라 온도가 15℃로 회복되었다. 상기 조건하에서 버블링 또는 포말 형성이 발생하지 않았다. 이후 압력을 추가로 0.1mBar까지 감소시키고, 이러한 조건을 처음 두 실험에서 16시간 이상으로 유지하였으며, 세 번째 실험에서는 10시간 이상으로 유지하였다.

물에서 샘플을 재구성하고, ELISA를 사용하여 세 개의 폴리오 바이러스 균주의 항원성의 보유를 평가하였다. 타입 3 IPV에 대한 모노클로날 항체를 ELISA에 사용하여, 재구성된 동결건조된 샘플에서의 항원 보유 수준을 동결되지 않은 기준 샘플과 비교하였다. 결과는 건조 공정을 거치지 않은 샘플에 대해 주어진 판독치의 백분율로서 표시된다.

결과

건조된 샘플은 고체 외형을 지녔으나, 컨테이너가 뒤집혔다면 며칠의 기간에 걸쳐 건조된 샘플이 흐를 수 있었기 때문에 고 점성 액체/유리의 형태로 보였다.

표 2. 모노클로날 항체를 사용하여 ELISA에 의해 측정된 타입 3 IPV 항원의 보유 (포말 형성 또는 동결 없이 건조)

제형	제 1 실험(18시간 주기)	제 2 실험(18시간 주기)	제 3 실험(12시간 주기)
당 없음	0%
2.5% 수크로오스	0%
10% 수크로오스	75%	78%	91%
10% 트레할로오스	82%	79%	93%

타입 3 IPV 항원 보유의 상기 수준은, 타입 3에 대한 모노클로날 항체가 사용된 동일한 ELISA 포맷에서 매우 낮은 수치가 일반적으로 발견되었던 하기 도시된 동결 건조 결과에 비해 매우 유리하게 대조되었다.

표 3. 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 사용하여 ELISA에 의해 측정된 타입 1, 2 및 3 IPV 항원의 보유 (동결 건조)

건조 방법	폴리올 함량	ELISA-형 1/2/3 %
건조 방법	폴리올 함량	폴리클로날	모노클로날
동결 건조	3.15% 수크로오스	46/49/58^*	19/25/0
동결 건조	10% 트레할로오스	47/43/58	25/0/0

* 3.15% 수크로오스 존재하의 동결 건조 실험을 5회 반복하였고, 도시된 결과는 하나의 대표적인 실험으로부터 수득된 것이다.

실시예 4. 고 점성 액체/유리로서 저장된 건조된 IPV의 장기간 저장 안정성

실시예 3에 기술된 방법을 이용하여 건조된 IPV를 4℃에서 9개월 동안 저장하였다. 이 샘플을 150mM NaCl을 지니는 물에서 재구성하고, ELISA를 사용하여 세 개의 폴리오 바이러스 균주의 항원성의 보유를 평가하였다. 각 균주에 대해 하나씩, 세 개의 모노클로날 항체를 개별적인 ELISA에 사용하여, 재구성된 저장 샘플에서의 항원 보유 정도를 평가하였다. 저장 이전의 동일한 회분으로부터의 재구성된 샘플에 대하여 유사한 ELISA를 수행하였다. 모든 결과를 건조되지 않은 기준 샘플과 비교하였다. 결과는 건조 공정을 거치지 않은 샘플에 대해 주어진 판독치의 백분율로서 표시된다.

결과

표 4. 9개월 동안 고 점성 액체로서 저장 후 IPV 항원의 보유

처리	타입 1 ELISA	타입 2 ELISA	타입 3 ELISA
건조/재구성저장되지 않음	72%	75%	88%
건조/재구성4℃에서 9개월	70%	94%	90%

따라서, 실시예 3에 기술된 방법에 의해 건조된 IPV는 4℃에서 9개월 이상 동안 항원성의 손실 없이 저장되었다.

실시예 5. 건조되지 않은 IPV와 비교하여 건조되어 고 점성 액체를 형성하고 재구성된 IPV의 생체내에서의 면역원성의 비교

10마리의 위스타르 랫트의 그룹을, 실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 10% 수크로오스의 존재하에 건조되어 고 점성 액체를 형성하고, 재구성된 IPV의 다양한 희석물로 접종하였다. 추가로, 10마리의 위스타르 랫트의 그룹을 동일한 방법으로 제조되나 건조되지 않은 IPV의 기준 샘플로 접종하였다.

21일 후, 모든 랫트로부터 혈청을 수득하고, 혈청을 타입 1, 타입 2 및 타입 3 폴리오 바이러스를 사용하여 개별적인 면역침전 검정으로 시험하였다.

표 5에 도시된 결과는 a) 각 IPV 희석물에 반응하는 랫트의 수, b) 면역침전 검정에 의해 측정시 50%의 랫트가 혈청전환되는데 요구되는 용량인 ED50 및 c) 건조되지 않은 기준 IPV와 비교하여 건조 및 재구성된 IPV의 상대 효능을 포함한다.

표 5. 건조되지 않은 기준 IPV(JLE097)과 비교하여 건조되어 고 점도 액체(JLEO17/05)를 형성하고 재구성된 IPV의 면역원성

샘플		반응물 수			ED50	RP (상대효능)
	희석되지 않음	1/1.25	1/3.125	1/7.81
JLEO17/05
타입 1	10	9	6	5	6.37	0.956
타입 2	6	4	3	3	7.14	0.825
타입 3	6	8	2	1	18.18	1.051
JLE097
타입 1	10	10	10	7	3.33	1.120
타입 2	8	6	5	2	3.12	0.951
타입 3	7	6	4	1	16.91	1.172
기준
타입 1		10	8	4	6.37
타입 2		7	5	2	2.93
타입 3		5	3	0	22.57

JLEO17/05는 건조되어 고 점성 액체를 형성하고 후속하여 재구성된 IPV 회분이다. JLE097은 건조되지 않은 기준이다.

표 5는 IPV의 각 희석물로 접종된 반응물의 수가 건조 및 재구성된 IPV 및 건조되지 않은 기준 샘플의 두 회분간에 유사하다는 것을 보여준다. 일반적으로, 타입 1 IPV는 최고의 면역 반응을 유도하였고, 타입 2는 다소 적은 랫트에서 면역 반응을 유도하였다. 타입 3은 가장 약한 면역 반응을 유도하였다.

건조시켜 고 점성 액체를 형성하는 공정은 생체내에서 면역침전 항체를 유도하는 IPV의 능력을 감소시키지 않는다. 1.0으로 판독된 상대 효능(RP)은 샘플이 기준 샘플과 동등한 반응을 유도함을 나타낸다. 건조된 샘플 둘 모두는 세 타입 모두의 폴리오 바이러스에 대해 1.0에 근접한 RP 판독치를 제공하였고, 이는 건조 공정이 면역 반응을 유도하는 샘플의 능력에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.

실시예 6. 안정화제로서 수크로오스 또는 트레할로오스를 사용하여 고 점성 액체를 형성하는 건조가 생체내에서 면역침전 면역 반응을 유도하는 IPV의 능력에 미치는 영향

10마리의 위스타르 랫트의 그룹을 실시예 2에 기술된 대로 10%의 수크로오스 또는 10%의 트레할로오스의 존재하에 건조되고, 이후 재구성된 IPV로 접종하였다. 추가로, 10마리의 위스타르 랫트의 그룹을 기준 샘플로서 건조되지 않은 동일한 양의 IPV로 접종하였다.

21일 후, 모든 랫트로부터 혈청을 수집하고, 실시예 5에 기술된 대로, 면역중화 검정을 사용하여 타입 1, 타입 2 및 타입 3 폴리오 바이러스 각각에 대해 생성된 면역중화 항체의 양을 평가하였다.

면역 반응을 건조되지 않은 기준 샘플에 의해 유도된 면역 반응과 비교함에 의해 각 샘플에 대해 상대 효능을 산출하였다.

결과는 표 6에 도시한다.

표 6. 수크로오스 및 트레할로오스에서의 건조 비교

로트 번호	존재하는 당	생체내에서의 상대 효능타입 1/타입 2/타입 3	습도 %칼 피셔	기간(시간)
Jle017	10% 트레할로오스	0.95/0.82/1.05	nd	7
31CO3/01	10% 수크로오스	0.69/1.20/0.97	4.6%	18
31CO3/02	10% 트레할로오스	0.60/0.94/0.9	11.5%	18
03D02/01	10% 수크로오스	0.74/1.05/0.96	5.9%	12
03D/02/02	10% 트레할로오스	0.58/0.98/1.06	10.6%	12

샘플에 남아있는 물의 양은 칼 피셔 전기량 수분 분석기에 의해 측정시, 트레할로오스를 안정화제로서 사용할 때 대략 10%인 것과 비교하여 수크로오스를 안정화제로서 사용할 때 대략 5%의 잔여 습도로 낮아진다.

수크로오스 및 트레할로오스 둘 모두가 건조 공정 동안 IPV를 안정화시키는 효과적이어서, 재구성된 IPV는 상이한 유형의 폴리오 바이러스 대부분에 대하여 1.0에 근접한 상대 효능 판독치를 제공하였다. 상대 효능은 면역원성을 비교적 쉽사리 잃는 타입 3 폴리오 바이러스에 특히 대해 양호하였다.

실시예 7. 칼 피셔에 의한 습도의 측정

티트로미터(titrometer)(Aqua 30.00 - Elektrochemie Halle)에서 분석을 수행하였다. 샘플을 칭량하고, 80℃로 설정된 오븐에 놓았다. 샘플을 질소 기체로 플러싱하고, 전기량에 의해 분석을 수행하기 위해 히드라날(hydranal) 시약(Riedel de Hahn)을 첨가하였다.

Claims

a) 안정화제의 용액에 활성제를 용해/현탁시켜 보존 샘플을 제조하는 단계;

b) 보존 샘플을, 동결이나 포말 형성이 수반되는 버블링 없이, 증발에 의해 보존 샘플이 용매를 유리시키게 하는 온도 및 압력 조건에 두어 점성 액체를 형성하는 단계를 포함하여, 활성제를 보존하는 방법.
제 1항에 있어서,

c) 추가로 보존 샘플을 점성 액체가 건조되어 고 점성 액체를 형성하는 온도 및 압력 조건에 두는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 압력이 단계 b) 동안 20mBar 이하로 감소됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 보존 샘플의 외부 온도가 단계 b) 동안 5 내지 37℃임을 특징으로 하는 방법.
제 2항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 보존 샘플의 외부 온도가 단계 c) 동안 5 내지 37℃임을 특징으로 하는 방법.
제 2항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 보존 샘플의 외부 온도가 단계 b)에 있을 때보다 단계 c) 동안 더 높음을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 보존 샘플의 외부 온도가 단계 c) 동안 20℃를 초과하여 증가됨을 특징으로 하는 방법.
제 2항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 압력이 단계 b) 동안의 압력과 비교하여 단계 c)에서 감소됨을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 압력이 단계 c) 동안 1mBar 이하로 감소됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 4시간 미만으로 완료됨을 특징으로 하는 방법.
제 2항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 및 c)가 12시간 미만으로 완료됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 있어서, 안정화제가 글루코오스, 말투로오스, 이소-말투로오스, 락투로오스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 소르비톨, 이소-말토오스, 말티톨, 락티톨, 팔라티니트, 트레할로오스, 라피노오스, 스타치오스, 멜레지토오스 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된 유리 형성 폴리올을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 안정화제가 수크로오스임을 특징으로 하는 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 안정화제의 농도가 15% 미만임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 보존 샘플이 페놀 레드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 보존 샘플이 용매 차단 내부 표면을 지니는 컨테이너에서 건조됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 단백질, 펩티드, 아미노산, 폴리누클레오티드, 올리고누클레오티드, 다당류, 올리고당, 다당류-단백질 컨쥬게이트 및 올리고당-단백질 컨쥬게이트로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 세포, 세포구성성분 조성물(subcellular composition), 세균, 바이러스, 바이러스 성분 및 바이러스 유사 입자로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 시스템을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 활성제가 IPV (비활성화된 폴리오 바이러스)를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 18항 또는 제 19항에 있어서, 활성제가 Hib (헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형) 다당류 또는 올리고당을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 18항 내지 제 20항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) C 다당류 또는 올리고당을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 백신을 포함함을 특징으로 하는 방법.
활성제의 항원성 또는 활성이 보존된 활성제를 포함하는 고 점성 액체.
제 23항에 있어서, 제 1항 내지 제 22항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 고 점성 액체.
제 23항 또는 제 24항에 있어서, 글루코오스, 말투로오스, 이소-말투로오스, 락투로오스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 소르비톨, 이소-말토오스, 말티톨, 락티톨, 팔라티니트, 트레할로오스, 라피노오스, 스타치오스, 멜레지토오스 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된 유리 형성 폴리올을 포함함을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 25항에 있어서, 유리 형성 폴리올이 수크로오스임을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 23항 내지 제 26항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 단백질, 펩티드, 아미노산, 폴리누클레오티드, 올리고누클레오티드, 다당류, 올리고당, 다당류-단백질 컨쥬게이트 및 올리고당-단백질 컨쥬게이트로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함함을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 23항 내지 제 27항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 세포, 세포구성성분 조성물, 세균, 바이러스, 바이러스 성분 및 바이러스 유사 입자로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 시스템을 포함함을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 23항 내지 제 28항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 백신을 포함함을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 23항 내지 제 29항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 IPV를 포함함을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 23항 내지 제 30항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 세균성 다당류 또는 올리고당을 포함함을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 31항에 있어서, 활성제가 바람직하게는 담체 단백질에 컨쥬게이션된 Hib (헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b) 다당류 또는 올리고당을 포함함을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 23항 내지 제 32항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성제가 바람직하게는 담체 단백질에 컨쥬게이션된 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 혈청군 C 다당류 또는 올리고당을 포함함을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 23항 내지 제 33항 중의 어느 한 항에 있어서, 용매 차단 내부 표면을 지니는 컨테이너내에 유지됨을 특징으로 하는 고 점성 액체.
제 23항 또는 제 24항의 고 점성 액체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신.
제 23항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 고 점성 액체를 수용액에서 재구성하는 단계를 포함하여, 백신을 제조하는 방법.
제 36항에 있어서, 수용액이 디프테리아 항원, 파상풍 항원 및 백일해 항원(무세포 또는 전세포)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, DTP 백신이 적어도 부분적으로 수산화 알루미늄으로 애쥬번트화됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 컨테이너에 유지된 제 23항 내지 제 34항 중의 어느 한 항의 고 점성 액체 및 제 2 컨테이너에 함유된 액체 백신 성분을 포함하는 키트.