MXPA05004675A - Proceso de secado. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo de secado de muestras biologicas y otras labiles de manera que estas se pueden conservar como un liquido altamente viscoso. El metodo involucra las etapas de preparar una muestra de conservacion disolviendo/suspendiendo un agente activo en una solucion de un agente estabilizador, sometiendo la muestra de conservacion a condiciones de presion y temperatura tales que la muestra de conservacion libera el solvente por medio de evaporacion sin congelado y burbujeo para formar una espuma y eliminar el solvente hasta que se seca la muestra de conservacion para forma un liquido altamente viscoso.

Description

PROC ESO DE SECADO La presente invención se refiere a la conservación de muestras biológicas y otras lábil, a tales muestras conservadas y a un proceso novedoso para conservar tales muestras. El proceso novedoso comprende añadir una muestra que incluye un agente activo y un agente estabilizador a un contenedor, sometiendo la muestra a tales condiciones de presión y temperatura para originar que el solvente se libere por medio de evaporación sin congelar la muestra o burbujear para formar una espuma. De manera subsiguiente, durante una fase de secado secundaria las condiciones de temperatura y presión se mantienen o se ajustan de manera que se remueva el solvente y la muestra de conservación se seque para formar un líquido altamente viscoso. También proporcionadas por la presente invención, se encuentran composiciones conservadas a través del proceso de la presente invención, y en particular las composiciones de vacuna conservadas. Existe una necesidad de ampliar la estabilidad y por ello la vida de anaquel de las muestras lábil, particularmente las muestra biológicas. Tradicionalmente, esto se ha llevado a cabo utilizando el proceso de secado por congelamiento, en el cual se elabora una solución de la sustancia y la muestra se congela. Durante la fase de secado primaria, la mayoría del agua se elimina por medio de sublimación de hielo bajo condiciones de presión reducida, y se forma un 'pastel' poroso. Usualmente, esto es seguido de una fase de secado secundaria cuando la presión y temperatura cambian y el agua se evapora del 'pastel' sólido. La muestra liofilizada resultante ha mejorado la estabilidad comparada a una formulación líquida. Sin embargo, el proceso de secado por congelamiento es demasiado largo, costoso y puede ser la fase que limite la velocidad en un proceso de producción. El secado por congelamiento también puede conducir a la pérdida de actividad o antigenecidad de algunos agentes activos. Para ciertos materiales biológicos tal como virus vivos, puede existir pérdida significativa de la actividad durante el proceso de secado por congelamiento (Pikal (1994) (ACS Symposium 567:120-133). Muchas sustancias secadas por congelamiento todavía son inestables a temperatura ambiente (Carpenter et al (1 994) ACS Symposium 567; 134-147). El daño causado por el proceso de congelamiento se puede evitar en algún grado a través del uso de los agentes estabilizadores, tal como polioles. También se han hecho otros mejoramientos en el proceso de liofilización evitando el congelamiento de la muestra durante el proceso, y eliminando el agua por medio de ebullición (WO96/40077; US6306345). Este método involucra la preparación de una mezcla de una matriz de vidrio formando material en un solvente conveniente, junto con la muestra a ser conservada, evaporar el solvente suelto de la mezcla para obtener un jarabe, exponer el jarabe a una temperatura y presión suficientes para originar la ebullición del jarabe y eliminar el solvente residual. Se puede hacer referencia a métodos similares a este como técnicas de secado de espuma. Tales técnicas expondrán la mezcla para ser conservada a presiones debido a la formación y explosión de burbujas durante la fase de "ebullición". Especialmente cuando las sustancias lábil son para conservarse, esto puede resultar en una pérdida de actividad. Un método similar se describe en ES5, 766,520, en el cual el proceso involucra eliminar parcialmente el agua para formar un fluido viscoso y además someter el jarabe a vacío para originar que éste "hierva", y además secar a temperaturas sustancialmente inferiores que 100°C. Este método todavía sufre de algunos de los problemas del secado por congelamiento convencional. Cuando el proceso se lleva a cabo en un secado por congelamiento grande, las muestras se secarán a diferentes proporciones dependiendo de su posición en el anaquel y esto conduce a muestras diferentes que liberan diferente cantidad de actividad durante el proceso de secado. Esto conduce a una pérdida de consistencia dentro de un grupo. Trehalosa es un poliol que es preferido por sus propiedades estabilizadores. Terehalosa es un disacárido que se forma del vidrio, no tóxico y no reductor inerte que ocurre de manera natural que se encuentra para asociarse con la conservación del daño de desecación en algunas plantas y animales. Trehalosa es útil para evitar la desnaturalización de una amplia variedad de sustancias incluyendo proteínas, viruses y productos alimenticios durante la desecación y almacenamiento subsiguiente parcialmente, debido a que éste tiene una temperatura de transición relativamente alta (ca 120°C en ei estado anhidro) (US4891319; US5149653; US5026566). Trehalosa también estabiliza las encimas (Argall y Smith (1993) Biochem. Mol. Bio. Int. 30; 491 ). Trehalosa y una amplia variedad de polioles estabilizadores también se ha encontrado que son útiles en el mejoramiento de la conservación de las muestras de secado por congelamiento, especialmente en los casos en donde la muestra es propensa a perder la actividad durante el proceso de secado por congelamiento. Otras azúcares útiles en las técnicas de liofilización incluyen sucrosa y lactosa. La presente invención se refiere a un método mejorado de conservar un agente activo, particularmente si el agente activo es lábil o propenso a perder la actividad durante un proceso de secado más convencional. El proceso comprende las etapas de preparar una muestra de conservación disolviendo/suspendiendo un agente activo en una solución de un agente estabilizador; someter la muestra de conservación a tales condiciones de presión y temperatura que la muestra de conservación libere el solvente por medio de evaporación, sin congelar o burbujear la muestra para formar una espuma; y eliminar el solvente hasta que la muestra de conservación se seca para formar un líquido altamente viscoso. El proceso es muy suave y no expone al agente activo a congelamiento o ebullición, y por consiguiente es ventajoso sobre las técnicas de secado de espuma y secado por congelamiento, las cuales sometería a la muestra a una o magas de estas presiones. En donde el agente activo a ser conservado es lábil, el uso del método de la invención conduce a la retención incrementada de la actividad y/o antigenicidad. Esto se puede medir reconstituyendo al agente activo seco en solvente, preferentemente agua o una solución acuosa, y midiendo la actividad o antigenicidad por medio de un ensayo estándar (por ejemplo a través de ELISA) y comparando los resultados con aquel obtenido con, ya sea una muestra no seca, o con muestras secadas por medio de las técnicas de secado por congelamiento o secado por espumado, y luego reconstituidas. Es particularmente ventajoso para secar IPV (virus de polio inactivado, el inmunogen en vacuna de polio inyectable) utilizar el proceso de la invención. El IPV se encuentra presente en vacunas conocidas como una formulación líquida (W099/48525) . Los problemas se han originado problemas intentando utilizar una formulación sólida del IPV en una vacuna dado que los procedimiento de secado por congelamiento estándares conducen a una pérdida de la antigenicidad del IPV. El proceso de la invención conduce a la retención mucho más alta de los antígenos del virus de la polio, debido parcialmente al tiempo reducido requerido por el proceso de la invención. El proceso de la invención es ventajoso sobre el secado por congelamiento normal dado que el ciclo de funcionamiento es más corto y requiere menos refrigeración haciendo esto más energía eficaz. Dado que el proceso de secado es a menudo la fase que limita la velocidad de un proceso, el uso del método de la invención conduce a niveles más altos de producción en costo reducido.

DESCRI PCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 - Fotografía del líqu ido altamente viscoso en frascos invertidos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA El método de la invención se utilizar para conservar un agente activo, y comprende las etapas de: • preparar una muestra de conservación suspendiendo o disolviendo un agente activo en una solución de un agente estabilizador; • someter la muestra de conservación a tales condiciones de temperatura y presión que la muestra de conservación libere el solvente por med io de evaporación, sin congelamiento o burbujeo para formar una espuma, para formar un l íquido viscoso; y opcionalmente incluye una fase adicional de: • elim inar el solvente hasta q ue el l íquido viscoso se seque para formar un líquido altamente viscoso. Un método para conservar un agente activo produce una forma del agente activo q ue es capaz de resistir almacenamiento prologado durante el cual la actividad y/o antigenicidad y/o inmunogenicidad del agente activo se mantiene. Preferentemente el agente activo retiene al menos . 40, 50, 60, 70, preferentemente 80 , 90, 95% de su actividad orig inal, antigenicidad y/o inmunogenicidad sobre un periodo de al menos 3, 6, 9, 1 2, 24 meses de almacenam iento a 4°C. La antigenicidad o antinm unogenicidad se puede medir a través de ensayos estándares que se describen posteriormente. El método es particularmente útil para extender la vida de estante de los productos lábil los cuales rápidamente liberan actividad cuando se almacenen en solución o cuando se exponen a congelamiento o burbujeo para formar una espuma. Un producto lábil es propenso a la pérdida de actividad y/o a la pérdida de antigenicidad y/o pérdida de inmunogenicidad, después del almacenamiento en solución y/o congelamiento, y/o somerito a presiones tal como aquellas involucradas en el burbujeo durante la formación de espuma. Este particularmente es aplicable para utilizar en donde una concentración inferior (por ejemplo 3%-15% w/v) del vidrio que forma poliol es ventajosa y es preferible un proceso de secado más corto (menor que 4, 6, 8, 10, 0 12 horas). Un líquido viscoso se defino como el producto de la fase primaria de la remoción del solvente, al final de la cual la mayoría del solvente se ha perdido de la muestra. Se puede reconocer este punto debido a que la proporción de evaporación se aminora de manera que la temperatura de la muestra regresa a la temperatura ambiente cuando se pierde el efecto endotérmico de la evaporación de grupo. Un líquido altamente viscoso se produce después de que el líquido viscoso producido al final de la fase primaria del secado se ha expuesto a presión reducida por un período adicional de tiempo después del final de la fase primaria de secado. Un líquido altamente viscoso tiene un contenido de solvente menor que o igual a 15, 12, 10, 8, 5, 4, 3, 2, o 1 % (w/w), preferentemente como de determinó por el analizador de humedad coulométrico Kart Fischer (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; 277-284). Los rangos preferidos de contenido de solvente son de 1 -3%, 3-5%, 5-10% o 1 0-15% (w/w). El líquido altamente viscoso tiene un contenido de solvente suficientemente bajo, de tal manera que el agente activo se conserva en un estado estable por al menos 3, 6, 9, 12 o 24 meses a 4°C, permitiendo al agente activo retener al menos 40, 50, 60 preferentemente 60, 80, 90, 95% de su actividad y/o antigenicidad y/o inmunogenicidad en este período. Preferentemente, el líquido altamente viscoso tiene una apariencia sólida pero es un caucho o vidrio, preferentemente un vidrio y es capaz de fluir muy lentamente en un período de 2, 4, o 6 días, preferentemente 1 , 2, 3 o 4 semanas, más preferentemente 2, 4, 6, 8, 1 0 o 12 meses. El flujo extremadamente lento se pude medir invirtiendo un receptáculo que contiene el líquido altamente viscoso y dejando a temperatura ambiente hasta que se observa que fluye el líquido altamente viscoso. En una modalidad preferida, el líquido altamente viscoso no parecerá que fluye después de 2, 4, o 6 días, preferentemente 1 , 2, 3 o 4 semanas, más preferentemente 2, 4, 6, 8, 10 o 12 meses en una posición invertida. Preferentemente, el líquido altamente viscoso tiene una apariencia clara, transparente.

Preparación de la muestra de conservación Cualquier agente estabilizador es conveniente para utilizar en la primera fase de esta invención. Los materiales convenientes incluyen, pero no están limitados a, todos los polioles, incluyendo polioles carbohidratos y no carbohidratos. Preferentemente, el poliol estabilizador permite al agente activo ser almacenado sin pérdida sustancial de actividad por desnaturalización, agregación u otros medios. Materiales particularmente convenientes incluyen azúcares, alcoholes azúcar, y derivados carbohidratos. Preferentemente, el vidrio que forma poliol es un carbohidrato o derivados del mismo, incluyendo glucosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, sucrosa, maltosa, lactosa, iso-maltosa, maltitol, lactitol, palatinito, trehalosa, rafinosa, estaquiosa, melecitosa o dextrano, más preferentemente trehalosa, sucrosa, sorbitol, rafinosa, manitol, lactosa, lactitol o palatinito, más preferentemente sucrosa, sorbitol, lactosa o trehalosa. Los polisacáridos bacteriales son particularmente ventajosos para utilizar como un agente estabilizador en una composición inmunogénica, dado que éstos pueden actuar tanto como un agente estabilizador como un inmunogen. Los carbohidratos incluyen, pero no están limitados a, monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos y sus correspondienes compuesto polihidroxilo, alcoholes de azúcar tal como derivados carbohidrato y cabohidratos químicamente modificados, almidón hidroxietilo y copolímeros azúcar. Tanto los carbohidratos naturales como sintéticos son convenientes para utilizar. Los carbohidratos sintéticos incluyen, pero no están limitados a, aquellos que tienen el enlace glicosídico reemplazado por un enlace de carbono o tiol. Se pueden utilizar tanto las formas D y L de los carbohidratos. El carbhohidrato puede ser reductor o no reductor. En donde se utiliza un carbohidrato reductor, la adición de inhibidores de la reacción aillard, se prefiere. Los carbohidratos reductores convenientes para utilizar en la invención son aquellos conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, glucosa, maltosa, lactosa, fructuosa, galactosa, mañosa, maltulosa y lactulosa. Los carbohidratos no reductores incluyen, pero no están limitados a, glucósidos no reductores de compuestos polihidroxilo elegidos de alcoholes de azúcar y otros polialcoholes de cadena recta. Otros carbohidratos útiles incluyen rafinosa, estaquiosa, melecitosa, dextrano, sucrosa, celibiosa, manobiosa, y alcoholes de azúcar. Los glucósidos de alcohol de azúcar son preferentemente monoglucósidos, en particular los compuestos obtenidos por medio de la reducción de disacáridos tal como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. Los carbohidratos particularmente preferidos son trehalosa, sucrosa, sorbitol, maltitol, lactitol, palantinito y glucopiranosilo-1 ?6-manltol. Los aminoácidos pueden actuar como agentes estabilizadores por sí mismos y preferentemente en combinación con un poliol. Los aminoácidos preferidos incluyen glicina, alanita, arginina, lisina y glutamina aunque cualquier aminoácido, o una combinación de aminoácidos, péptido, proteína hidrolisada o proteína, tal como albúmina de suero puede actuar como un agente estabilizador. La concentración del agente estabilizado utilizado en el proceso de la invención puede ser 1 % y 50% peso/volumen, preferentemente 1 -5%, 5-10%, 5-10%, 15-20%, 20-25% o 25-50%, más preferentemente menor que o igual a 15% o 10% (w/v). Las cantidades del agente estabilizador requerido, son proporcionales a la cantidad de las sales presentes. Por consiguiente, aunque son preferidos los niveles del agente estabilizador entre 2% y 10%, las concentraciones más altas de 1 0% a 25% se pueden requerir para muestras secan con un contenido de sal alto (sobre 1 00mM, 200m , 300mM, 400mM o 500 mM). Preferentemente, la muestra de conservación contendrá un componente capaz de inhibir la formación de cristal en el líquido altamente viscoso de la invención. Las sales y otras moléculas que incluyen aminoácidos y rojo fenol, inhiben la formación de cristal.

Contenedor Las diferentes mezclas y varias formas y tamaños del contenedor se pueden procesar simultáneamente. De manera ideal, el tamaño del contenedor que se utiliza es suficiente para contener la mezcla inicial y acomoda el volumen del sólido formado del mismo. Típicamente, esto se determina a través de la masa del material que forma el vidrio, el área de superficie del contenedor y las condiciones de la formación del vidrio. La masa del material que forma el vidrio debe ser suficiente para proporcionar jarabe, el cual se traslada prácticamente como una masa mínima por área de unidad de la superficie del contenedor. Esta proporción varía de mezcla a mezcla y contenedor utilizado, pero se determina fácilmente de manera empírica por un experto en la materia siguiendo los procedimientos enunciados en la presente. Se puede utilizar cualquiera de tales frasco, incluyendo frasco de corte de tubo y moldeados Wheaton. El proceso de la invención preferentemente utiliza contenedores con un repelente de solvente, preferentemente una superficie interior repelente de agua. Esto se logra cubriendo la superficie interior con una composición hidrofóbica por ejemplo por medio de siliconización. La siliconización se alcanza por medio de procesos que son bien conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. En un método, el contenedor se siliconiza levantando el interior del contenedor con una emulsión de silicona, seguido por procesamiento a través de un horno a temperatura alta, típicamente 350°C. Alternativamente, la superficie interior repelente al agua se alcanza por el contenedor que está elaborado de una composición repelente al agua. La superficie interior repelente al agua del contenedor hace que el producto secado del proceso se reconstituya más fácilmente dado que se recolecta menos agua en los lados del contenedor. Aunque en la presente se pueden utilizar formas singulares, puede estar presente más de un material que forma matriz de vidrio, más de un aditivo, y más de una sustancia. Las cantidades eficaces de estos componentes se determinan fácilmente por uno de experiencia en la materia.

Solución El solvente dentro del cual se mezcla el agente estabilizador y el agente activo, puede ser acuoso, orgánico o una mezcla de ambos. Se puede utilizar el solvente acuoso suficiente para disolver el material que forma la matriz de vidrio y solvente orgánico suficiente para disolver una sustancia hidrofóbica, permitiendo la formación de vidrio que incorpora la sustancia hidrofóbica. La elección del solvente dependerá de la naturaleza del material elegido para la formación de matriz de vidrio, así como la naturaleza de cualquier aditivo y/o sustancia a incorporarse. El solvente debe ser de una naturaleza y de volumen suficiente para efectuar la solubilización adecuada del material que forma la matriz de vidrio, así como cualquier aditivo y/o sustancia. Si la sustancia es un material hidrofílico, preferentemente el líquido será acuoso para evitar cualquier pérdida potencial de actividad debido a las interacciones de solvente deletéreas. Preferentemente, el solvente acuoso incluye cualquier solvente acuoso conveniente conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, agua y soluciones reguladoras biológicas. Preferentemente, el solvente se encuentra presente en una cantidad de 5 a 98% por volumen, más preferentemente 80-98% por volumen, más preferentemente de 85-98% por volumen. El volumen del solvente puede variar dependiendo del material de formación de matriz de vidrio y la sustancia a ser incorporada, así como cualquier aditivo. El volumen mínimo requerido es una cantidad necesaria para solubilizar los diversos componentes. Sin embargo, las suspensiones dispersadas de manera homogénea de la (s) sustancia (s), también se pueden utilizar. Las cantidades convenientes de los componentes en las modalidades específicas se pueden determinan fácilmente por aquellos expertos en la materia a la luz de los ejemplos proporcionados en la presente. Se pueden introducir varios aditivos dentro de la muestra de conservación. Un aditivo preferido es un inhibidor de la reacción Millard. Preferentemente, si la sustancia y/o material de formación de matriz de vidrio contiene grupos carbonilo y amono, imino o guanidino, las composiciones además contienen al menos un inhibidor fisiológicamente aceptable de la reacción Millard en una cantidad eficaz para evitar sustancialmente la condensación de los grupos amino y reactivar los grupos carbonilo en la composición. El inhibidor de la reacción Millard puede ser cualquier conocido en la técnica. El inhibidor se encuentra presente en una cantidad suficiente para prevenir, o sustancialmente evitar, la condensación de los grupos amino y reactivar los grupos carbonilo. Típicamente, los grupos amino se encuentran presentes en la sustancia y los grupos carbonilo se encuentran presentes en el material que forma la matriz de vidrio, o lo contrario. Sin embargo, los aminoácidos y grupos carbonilo pueden ser intramoleculares dentro, ya sea de la sustancia, o del carbohidrato. Se conocen varias clases de compuestos que exhiben un efecto inhibidor en la reacción Millard y, por consiguiente, para ser de uso en las composiciones descritas en la presente. Estos compuestos generalmente son inhibidores ya sea competitivos o no competitivos de la reacción Millard. Los inhibidores competitivos incluyen , pero no están limitados a, residuos aminoácidos (tanto D como L), combinaciones de los residuos aminoácido y péptidos. Particularmente preferidos son lisina, arginina, histidina y triptofano. Lisina y arginina son los más eficaces. Existen muchos inhibidores no competitivos conocidos. Estos incluyen, pero no están limitados a, aminoguanidina y derivados y anfotericina B. EP-A-0 433 679 también describe inhibidores Maillard convenientes, los cuales derivados incluyen 4-hidroxi-5,8-dioxoquinolina Es ventajoso incorporar un tinte de color dentro de la muestra de conservación con el propósito de permitir visualización más fácil del producto secado del método de la invención. Esto es particularmente importante durante la reconstitución para asegurar que el líquido altamente viscoso se reconstituye completamente antes del uso. Preferentemente, el tinte de color mantiene su color en un pH neutral y es compatible con inyección en el paciente. Más preferentemente, el tinte de color es rojo fenol.

Pérd ida de solvente por medio de evaporación (fase b - secado evaporativo) El proceso de la invención involucra someter la muestra de conservación a tales condiciones de presión y temperatura, de manera que la muestra de conservación libera el solvente a través de evaporación, sin congelar o burbujear la muestra para formar una espuma. La temperatura dentro de la muestra de conservación, en momentos, será diferente de aquella externa a la muestra, debido a la naturaleza endotérmica del proceso de evaporación. Las referencias a la temperatura son para las condiciones externas a la muestra de conservación, por ejemplo, en donde se utiliza un secador por congelamiento industrial grande, para la temperatura de anaquel. Esta usualmente corresponde al ajuste de la temperatura del secador por congelamiento. Opcionalmente, una fase preliminar del degassing la muestra de conservación está presente en el método de la invención. La presión se reduce a o debajo de 200mBars, preferentemente entre 200 y 35 mBars, por un período de al menos 5 minutos antes de que la presión se reduzca más. Una modalidad preferida de la invención alcanza secado evaporativo reduciendo la presión mientras se controla las condiciones de temperatura. La presión se ajusta a, o debajo de 30, 25, 20 preferentemente 15, 12, más preferentemente 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mbar, mientras se mantiene el ajuste de temperatura a una temperatura arriba de 0°C, preferentemente de entre 5°C a 37°C, 4°C a 10°C, 10°C a 1 5°C; 15°C a 20; 20°C a 25°C; 25°C a 30°C; 30°C a 37 o 37°C a 45°C. Estas condiciones se mantienen por al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 8, 10, 1 2, 1 6 o 24 horas, preferentemente por entre 2-4 horas, 4-6 horas, 6-8 horas, 8-12 horas o 12-18 horas. En una modalidad particularmente preferida, la presión se mantiene en 15°C y la presión se fija a entre 5-1 0 mBars, más preferentemente 6-9mBars, más preferentemente aproximadamente 8 mBars. En donde se utiliza un ajuste de temperatura más alto, es posible presión ligeramente inferior sin congelar la muestra, y en donde se utiliza un ajuste de temperatura inferior, la presión se debe mantener en el nivel más alto para evitar el congelamiento. Preferentemente, las condiciones se mantienen por un período suficiente de tiempo, de manera que la proporción de evaporación se ha alentado de manera que la temperatura de la muestra es aproximadamente la misma que la externa a la muestra. Preferentemente, la muestra de conservación no se congela o burbujea/hierve para formar una espuma y libera el solvente para formar un líquido viscoso o un líquido altamente viscoso.

Eliminación del solvente para formar un líq uido altamente viscoso Una fase subsiguiente del método de la invención, involucra eliminar el solvente hasta que se seca la muestra de conservación para formar un líquido altamente viscoso. La muestra sin se congela no se burbujea para formar una espuma durante la fase de secado secundaria. Un líquido altamente viscoso se define como un material con un contenido de solvente menor que o igual a 15, 12, 10, más preferentemente 8, 5, 4, 3, 2 o 1 % (w/w), preferentemente se mide utilizando un analizador de humedad coulométrico Karl Fischer. El líquido altamente viscoso tiene un contenido de solvente suficientemente bajo, de tal manera que el agente activo se conserva en un estado estable por al menos 3, 6, 9, 12 o 24 meses a 4°C, permitiendo al agente activo retener al menos 40, 50, 60, preferentemente 70, 80, 90, 95% de su actividad y/o inmunogenicidad y/o antigenicidad en este período. Preferentemente, el líquido altamente viscoso tiene una apariencia sólida y/o transparente, pero es un vidrio y es capaz pero es un vidrio y es capaz de fluir muy lentamente por un período de 2, 4, o 6 días, preferentemente 2, 3 o 4 semanas, más preferentemente 2, 4, 6, 8, 10 o 12 meses. El flujo extremadamente lento se puede medir invirtiendo un receptáculo que contiene el líquido altamente viscoso y dejando a temperatura ambiente hasta que el líquido altamente viscoso se observa que fluye. En una modalidad preferida, el líquido altamente viscoso no parecerá fluir después de 2, 4, o 6 días, preferentemente 2, 3, o 4 semanas, más preferentemente 2, 4, 6, 8, 1 0 o 12 meses en una posición invertida. En una modalidad de la invención, esto se alcanza manteniendo las condiciones de temperatura y presión en aquellas aplicadas en la primera fase de secado evaporativo. Por ejemplo, la presión se mantiene en o debajo de 30, 25, 20 preferentemente 1 5, 12, más preferentemente 10, 8, 7 , 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mbar, mientras que se mantiene el ajuste de temperatura a una temperatura arriba de 0°C, preferentemente entre 5°C a 37°C, de 5°C a 1 0°C, 1 0°C a 1 5°C; 15°C a 20; 20°C a 25°C; 25°C a 30°C; 30°C a 37°C. Para una temperatura que se ajusta a en 1 5°C, una presión de 5-1 0mBars, preferentemente 6-9mBars, más preferentemente aproximadamente 8mBars se mantiene por entre 4-24 horas, preferentemente 1 -4, 4-8, 8-1 2 o 1 2-16 horas. Estas condiciones de temperatura y presión se mantienen por 1 , 2, 3, 4, 5, 8, 1 0, 1 2, 1 8 horas o más, con el propósito de obtener un l íquido altamente viscoso con un contenido de solvente menor q ue o igual a 1 5, 1 2, preferentemente 1 0 , 8, 5, 3, 3, 2 o 1 % (w/w) preferentemente se miden por un analizador de humedad coulométrico Karl Fischer. Otra modalidad de la invención incrementa el ajuste de temperatura durante la eliminación del solvente a un ajuste de temperatura más alto que aquel mantenido anteriormente en la proceso. Esto permite al solvente dejar la m uestra en una proporción más rápida, de manera que el método de la invención se puede completar en un tiem po más corto . Por ejemplo, el ajuste de temperatura se incrementa a arriba de 0°C, más preferentemente arriba de 20°C, preferentemente entre 5°C y 37°C, 5°C y 1 0°C, 10°C y 20°C; 20°C y 30°C ; más preferentemente 30°C y 40°C; más preferentemente de 50°C y 60°C, mientras que se mantiene la presión en o debajo de 30, 25, 20 preferentemente 15, 1 2, más preferentemente 1 0, 8 , 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mbar. Estas condiciones de temperatura y presión se mantienen por al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 8, 1 0, 12, o 1 8 horas o más, con el propósito de obtener un sólido con un contenido de solvente menor que o ig ual a 1 5, 1 2, 1 0, 8, 5, 4, 3, 2 o 1 % (w/w) preferentemente se miden por un analizador de humedad coulométrico Karl Fischer. Esta modalidad requiere que el agente activo sea estable en el calor a la temperatura que se utiliza para el método a llevarse a cabo exitosamente. Una modalidad preferida de la invención, reduce el ajuste de presión durante la eliminación del solvente (paso c) a un ajuste de presión inferior que se utiliza antes en el proceso (paso b) . Esto permite al solvente dejar la muestra a una velocidad más rápida, de manera que el método de la invención se pueda completar en un tiempo más corto. Esto también permite que se pierda una proporción más alta del solvente. Por ejemplo, el ajuste de presión se fija a o debajo de 7.6, preferentemente 5, 4, 3, más preferentemente 2, 1 .5, 1 , más preferentemente 0.8, 0.5, 0.2, 0.1 , 0.05, 0.02, 0.01 , o 0.005mbar, mientras que se mantiene la temperatura en o arriba de 0°C, preferentemente entre 1 0°C y 20°C; 20°C y 30°C; 30°C y 35°C o arriba de 40°C. Estas condiciones de temperatura y presión se mantienen por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 8 , 1 0, 1 2 o 1 8 horas o más, con el propósito de obtener un sólido con un contenido de solvente menor que o igual a 15, 12, preferentemente 1 0 , 8, 5, 4, 3, 2 o 1 % (w/w) preferentemente como se determina por el analizador de humedad coulométrico Karl Fischer (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; 277- 284). Preferentemente, las etapas b) y c) (o b) solas) se deben completar en un tiempo ig ual o menor que 1 8 horas, preferentemente 1 6, 1 2, 10 horas, más preferentemente 8, 6, 5, o 4 horas.

Agente activo El método de la invención es útil para conservar cualquier agente activo, sin embargo, es particularmente útil en el caso de agentes activos lábil que liberan actividad y/o antigen icidad y/o inmunogenicidad d urante otros procesos de conservación. El agente activo a ser conservado utilizando un método de la invención puede comprender un sistema biológico elegido del grupo que consiste de células, composiciones subcelulares, bacterias, viruses y preparaciones de vesícula de membrana externa, com ponentes de virus o partículas similares de virus. Este también puede comprender moléculas, por ejemplos proteínas, péptidos, aminoácidos, ácido polinucleicos, oligonucleótidos, polisacáridos, oligosacáridos, conjugados polisacárido -proteína, conjugados oligosacárido-proteína. Ejemplos de agentes activos q ue se pueden conservar utilizando un método de la invención incluyen cualquier sustancia bioactiva, tal como sustancias farmacéuticamente eficaces, incluyendo, pero no limitado a, medicamentos antiinflamatorios, analgésicos, tranquil izantes, medicamentos antiansiedad, antiespasmódicos, antidepresivos, antim icóticos, tanquilizantes, medicamentos antiansiedad, combatidores de narcóticos, agentes antiparquinson, combatientes colinérgicos, medicamentos quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores, agentes antivirales, agentes antimicrobiales, supresores de apetito, anticolinérgicos, altimétricos, antihistamínicos, agentes antimigraña, coronario, vasodilatadores cerbrales y peroferales, agentes hormonales, anticonceptivos, agentes antitrombóticos, diuréticos, agentes antihipertensión, medicamentos cardiovasculares, opioids, y lo similar. Agentes convenientes también incluyen agentes terapéuticos y profilácticos. Estos incluyen, pero no se limitan a, cualquier modificador biológico terapéuticamente eficaz. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, composiciones subcelulares, células, bacterias, preparaciones de vesícula de membrana externa, viruses y moléculas que incluyen pero no se limitan a, lípidos, orgánicos, proteínas y péptidos (sintéticos y naturales), miméticos péptidos, hormonas (péptido, esteroide y corticoesteroide), polímeros de aminoácidos D y L, oligosacáridos, polisacárdos, nucleótidos, oligonucléotidos y ácidos nuclélcos, incluyendo ADN y RNA, híbridos de ácido nucléico de proteína, pequeña moléculas y análogos fisiológicamente activos de los mismas. Además, los modificadores también se pueden derivar de fuentes naturales o se pueden elaborar a través de medios recombinantes o sintéticos e incluyen análogos, combatidores y homólogos.

Como se utiliza en la presente "proteína" también se refiere a péptidos y polipéptidos. Tales proteínas incluyen, pero no se limitan a, encimas, biofarmacéuticos, hormonas de crecimiento, factores de crecimiento, insulina, anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales y fragmentos de los mismos, interferonas, interleuquinas y citoquinas. Los agentes de base ácido nucleico terapéuticos que se preparan a través de los métodos descritos en la presente, también se abarcan por la invención. Como se utiliza en la presente, "ácidos nucleicos", incluye cualquier ácido nucleico terapéuticamente eficaz conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a, ADN , RNA, y análogos fisiológicamente activos de los mismos. Los nucleótidos pueden codificar genes o pueden ser cualquier vector conocido en la técnica de ADN recombinante, incluyendo, pero no limitado a, plásmidos, retroviruses y viruses adeno-asociados. La conservación de las sustancias que son profilácticamente activas y transportación de las mismas, son además abarcadas por la invención. Las composiciones preferidas incluyen inmunogenes, tal como vacunas. Las vacunas convenientes incluyen, pero no se limitan a, viruses atenuados y vivos, vectores nucleótido que codifican antígenos, bacterias atenuadas o vivas, proteína, polisacárido, antígeno oligosacárido y/o lipopolisacárido, antígenos más auxiliares y antígenos y/o haptenos acoplados a los transportadores. Particularmente preferidas son las vacunas eficaces contra difteria, tétanos, pertusis, botuloino, cólera, Dengue, Hepatitis A, B, C y E, Haemofhilus influenzae b, Strptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Stapohylococcus aureus, Staphyloccocus epidermis, streptococci Grupo B, strptococci Grupo A, virus herpes, Helicobacterium Pylorí, influenza, encefalitis Japonesa, meningococci A, B, C, Y, W, sarampión , paperas, virus del papiloma, neumococci , virus de la polio, virus de la polio inactivado (I PV -preferentemente comprend iendo los tipos 1 , 2 y 3 como es estándar en la técnica de vacuna, más preferentemente la vacuna de polio Salk) , rubéola, rotavirus, virus sincitial respiratorio, Shigella, tuberculosis, virus de baricela-zona, fiebre amarilla y combinaciones de los mismos. El componente antígeno de las vacunas también se puede producir a través de técnicas de biología molecular para producir los péptidos recom binantes o proteínas de fusión que contienen una o más partes de una proteína derivada de un patógeno. Por ejemplo, las proteínas de fusión que contienen un antígeno y la subunidad B de la toxina del cólera, se ha encontrado induce una respuesta inmune para el antígeno. Sanches et al (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 86 :481 -485. Las vacunas son particularmente convenientes para la incorporación dentro de la composición de una sola dosis. Estas son imprecisamente estables bajo condiciones am bientales y se pueden redisolver en un diluyente estéril inmediatamente antes de la inoculación. En una modalidad preferida la composición inm unogénica comprendería polisacáridos capsu lares derivados de uno o más de los serogrupos A, C. W-1 35 e Y de Neisseria meningitidis. Una modalidad preferida adicional com prendería polisacáridos capsulares derivados de Streptococcus pneumoniae. Los antígenos polisacáridos capsulares neumococcales se eligen preferentemente de los serotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 6 B, 7F, 8, 9N, 9V, 1 0A, 1 1 A, 1 2F, 14, 1 5B, 17F, 18C, 1 9A, 1 9F, 20, 22F, 23F y 33F (más preferentemente de los serotipos 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 1 8C, 1 9F y 23F). Una modalidad preferida adicional contendría los polisacáridos capsulares PRP de Haemophilus influenza tipo b. Una modalidad preferida adicional contendría los polisacáridos capsulares del Tipo 5, Tipo 8, 336 o PNAG de Staphylococcus aureus. Una modalidad preferida adicional contendría los polisacáridos capsulares del Tipo I , Tipo I I , Tipo I I I o PIA. Una modalidad preferida adicional contendría los polisacáridos capsulares del Tipo la, Tipo le, Tipo I I o Tipo I I I del Grupos streptococcus B. U na modalidad preferida adicional contendría los polisacáridos capsulares del Grupo A streptococcus, preferentemente además comprendiendo al menos una proteína M y más preferentemente tipos múltiple de proteína M. En una modalidad de la invención, los polisacáridos bacteriales son de long itud total, siendo polisacáridos naturales purificados. En una modalidad alternativa de la invención, los polisacáridos se clasifican según su tamaño de 2 y 20 veces, preferentemente de 2-5 veces, de 5-1 0 veces, 1 0-1 5 veces o 1 5-20 veces, de manera que los polisacáridos son más peq ueños en tamaño para mayor manejabilidad. Los oligosacáridos se utilizan en una modalidad preferida. Los ol igosacáridos típicamente contienen entre 2 y 20 unidades de repetición. Los polisacáridos y oligosacáridos pueden estar no conjugados o conjugados, como se describe posteriormente. Las combinaciones dedos o más de los agentes activos anteriores se pueden conservar utilizando el método de conservación de la invención. Parte o toda una vacuna se puede conservar utilizando el método de conservación de la invención. U n agente activo preferido a conservarse utilizando el proceso de la invención, comprende I PV (una mezcla no activada de cepas de virus de polio). El IPV, particularmente el componente tipo 3, es sensible a las técnicas de secado por congelam iento y secado por espumado convencionales, como se muestra por la pérdida de antígenos después del secado por congelamiento o secado por espumado y reconstitución subsiguiente. El I PV, se define como virus de polio inactivo (preferentemente com prendiendo los tipos 1 , 2 y 3 como es estándar en la técnica de la vacuna, más preferentemente la vacuna polio Salk). Una dosis de vacuna de I PV contiene de 20-80 , preferentemente 40 o 80 unidades de antígeno D del tipo 1 (Mahoney), 4-16, preferentemente 8 o 1 6 unidades de antígeno D del tipo 2 (MEF-1 ) y 20-64, preferentemente 32 o 64 unidades de antígeno D del tipo 3 (Saukett). Cuando se seca por medio de la invención , preferentemente la antigenicidad de 1 , 2, o los 3 tipos 1 , 2, y 3 de virus de polio se retienen; más preferentemente la antigenicidad del tipo 1 ; tipo 2; tipo 3; tipo 1 y tipo 2; tipo 1 y tipo 3; tipo 2 y tipo 3; o tipo 1 , tipo 2 y tipo 3 se retiene en una nivel de al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de la antigenicidad de una muestra de referencia la cual no se ha sometido al proceso de secado. Esto se puede medir, después de la reconstitución del líquido altamente viscoso en una solución acuosa, a través de cualquier método conveniente incluyendo a través de ELISA utilizando anticuerpos policlonales y/o monoclonales contra el virus de polio del tipo 1 , 2 y/o 3. Cuando se seca a través de un método de la invención, preferentemente la ¡nmunogenicidad de 1 , 2, o los 3 de los tipos 1 , 2, y 3 del virus de polio se retienen; más preferentemente la ¡nmunogenicidad del tipo 1 ; tipo 2; tipo 3; tipo 1 y tipo 2; tipo 1 y tipo 3; tipo 2 y tipo 3; o tipo 1 , tipo 2 y tipo 3 se retiene en un nivel de al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de la ¡nmunogenicidad de una muestra de referencia la cual no se ha sometido al proceso de secado. Esto se puede medir, después de la reconstitución del líquido altamente viscoso en una solución acuosa, a través de cualquier método conveniente. En un método preferido, el líquido altamente viscoso se reconstituye en una solución acuosa y se inocula dentro de un animal, preferentemente una rata. Después de un periodo de tiempo conveniente, los antisueros se recolectan de los animales inoculados y se evalúa la seroconversión. Preferentemente, se logra una potencia relativa de al menos 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 o 0.9, comparada a una muestra de referencia no seca.

Preferentemente, el I PV se combina con uno o más de (Haemophilus influenzae tipo b) polisacárido PRP H ib u oligosacárido y/o polisacáridos meningococcal A, C, W y/o Y u oligosacáridos y/o polisacáridos pneumociccal u oligosacáridos. Más preferentemente, los agentes activos comprenden , IPV e Hib; I PV y MenC; IPV, Hib y MenC; H ib y MencC; I PV y MENA y C; Hib y enA y C; I PV, Hib, Men A y C; H ibm Men C e Y; o IPV, H ib, Men C e Y. Los agentes activos particularizados anteriormente también pueden comprender uno o más polisacáridos capsulares neumococcal , como se describe abajo. En las composiciones anteriores, en donde se utilizan polisacáridos, también se pueden emplear oligosacáridos (como se define posteriormente). Aunq ue estas composiciones pueden ser auxiliadas (como se describe posteriormente) , preferentemente éstas no son auxiliadas o preferentemente no comprenden sales de aluminio. Preferentemente, los polisacáridos u oligosacáridos se conjugan a un péptido o transportador de proteína que comprende epítopes T-ayudador (como se describe posteriormente).

Componentes Adicionales Las combinaciones preferidas, secadas a través del proceso de la invención se pueden com binar con otros antígenos en una vacuna de combinación , la cual se desecada o es preferentemente una formulación líquida la cual se puede utilizar para reconstituir los componentes secados. Los antígenos preferidos a combinarse con los agentes activos en el párrafo anterior incluyen uno o más de toxoido de difteria, toxoido de tétanos, pertusis de célula completa (Pw), pertusis acelular (Pa) (como se describe abajo), antígeno de superficie Hepatitis B, virus Hepatitis A, polisacáridos b influenza Haemophilus, polisacáridos neisserial, proteínas B serotipo meningitidis N., polisacáridos neumococcal, proteínas neumococcal y cualquiera de los antígenos enlistados posteriormente. Los polisacáridos bacteriales se pueden conjugar a una proteína transportadora tal como toxoido de téntanos, C fragmento toxoido de tétanos, toxoido de difteria, CRM197, neumolisina, Proteína D (US6342224) como se describe abajo. Los agentes activos conservado utilizando el proceso de la invención se pueden formular con polisacáridos capsulares derivados de uno o más Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Streptococi Grupo A, Streptococci Grupo B, Staphulococcus aureus o Staphulococcus epidermidis. En una modalidad preferida, la composición inmunogénica comprendería polisacáridos capsulares derivados de uno o más de los serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis. Una modalidad preferida adicional comprendería polisacáridos capsulares derivados de Streptococcus pneumoniae. Los antígenos polisacáridos capsulares pneumococcal se eligen preferentemente de los serotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 1 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 1 9A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (más preferentemente de los serotipos 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 1 8C, 19F y 23F) . Una modalidad preferida contendría los polisacáridos capsulares PRP de Haemophilus influenzae tipo b. Una modalidad adicional preferida contendría los polisacáridos capsulares del Tipo 5, Tipo 8, 336 o PNAG de Staphylococcus aureus. Una modalidad adicional preferida contendría los polisacáridos capsulares del Tipo I , Tipo I I, Tipo I I I o P IA de Staphylococcus epidermidis. Una modalidad adicional preferida contendría los pol isacáridos capsulares del Tipo la, Tipo le, Tipo I I o Tipo I I I del Grupo B streptocoocus. Una modalidad adicional preferida contendría los polisacáridos del Grupo A streptococcus, preferentemente además comprendiendo al menos una proteína M y más preferentemente tipos múltiples de proteína M. En una modalidad adicional de la invención, los polisacáridos bacteriales son de longitud total , siendo polisacáridos naturales purificados. En una modalidad alternativa de la invención , los polisacáridos se clasifican según su tamaño de 2 y 20 veces, preferentemente de 2-5 veces, de 5-1 0 veces, 10-1 5 veces o 1 5-20 veces, de manera q ue los polisacáridos son más pequeños en tamaño para mayor manejabilidad . Los oligosacáridos se utilizan en una modalidad preferida. Los oligosacáridos típicamente contienen entre 2 y 20 unidades de repetición. Tales polisacáridos capsulares pueden estar no conjugados o conjugados a una proteína transportadora tal como toxoido de tétanos, C frag mento toxoido de tétanos, toxoido de difteria, C M 97 , neumolisina , Proteína D (US6342224) . La toxina de tétanos, toxina de difteria y neumolosina se destoxifican a través de mutación genética y/o preferentemente por medio de tratamiento químico. El conjugado polisacárido se puede preparar a través de cualquier técnica de acoplamiento conocida. Por ejemplo el polisacárido se puede acoplar a través de un enlace tioéter. Éste método de conjugación depende de la activación del polisacárido con 1 -ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluorborato (CDAP) para formar un éster cianato. El polisacárido activado se puede acoplar así directamente, o a través de un grupo espaciador, a un grupo amino en la proteína transportadora. Preferentemente, el éster cianato se acopla con diamina hexano y el polisacárido derivado de amino se conjuga a la proteína transportadora utilizando química de heteroligación involucrando la formación del enlace tioéter. Tales conjugados se describen en la solicitud publicada PCT WO93/15760 de la Univeridad de Servicios Uniformados. Los conjugados también se pueden preparar por medio de métodos de aminación reductiva, como se describe en US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson). Otros métodos se describen en EP-0-16 -188, EP-208375 y EP-0-0477508.

Un método adicional incluye el acoplamiento de un polisacárido activado por bromuro cianogen derivado con hidrazido de ácido adípico (ADH) para el vehículo de proteína mediante condensación de carbodiimida (Chu C. et al. Infecí. Immunity, 1983 245 256). Los antígenos de proteínas pneumococas preferidos son aquellas proteínas pneumococas que se exponen a la superficie externa del pneumococo (capaz de reconocerse por un sistema inmune de huésped durante al menos parte del ciclo de ida del pneumococo) , o son proteínas que se secretan o liberan por el pneumococo. Más preferentemente, la proteína es una toxina, adhesina, traductor de señal de 2 componentes, o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o frag mentos de los mismos. Las proteínas particularmente preferidas incluyen , pero no se limitan a: pneumolisina (preferentemente detoxificada por tratamiento o mutación química) [Mitchell eí al. , Nucleic Acids Res. 1990 Jul 1 1 ; 1 8(1 3) :4010 "Com parison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae tipos 1 y 2" , Mitchell et al. , Biochim Biophys Acta 1 989 Ene 23; 1 007 (1 ): 67-72 " Expression of the pneumolysing gene in Escherichia coli a rapid purification and biological proteins" , WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Patón eí al.), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA y variantes de supresión de transmembrana del mismo (ELI 58041 93 - Briles eí al. ); PspC y variantes de supresión de transmem brana del m ismo (WO 97/09994-Briles eí al.) ; PsaA y variantes de supresión del mismo (Berry & Patón, Infecí I mmun 1 996 Dic; 64(12):5255-62 "Séq uense heterogeneity of PsaA, una adhesiva putativa de 37 kilo dalton esencial para virulencia de Streptococcus pneumoniae") ; proteínas de unión de colina pneumococo y variantes de supresión de transmembrana del mismo; CbpA y variantes de supresión de transmembrana del mismo (WO 97/41151; WO 99/51266); Glyceraldehyde-3-phosphate-dehidrogenase (Infec. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sánchez-Beato et al., FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); como proteína, (EP 0837130), y adhesina 18627, (EP 0834568). Además los antígenos de proteína pneumococa preferidos son aquellos descritos en WO 98/18931, particularmente aquellos seleccionados en WO 98/18930 y PCT/US99/30390. Las proteínas Neisserial preferidas para formularse con la composición inmunogénica de la invención incluyen TbpA (WO 93/06861; EP 586266; WO92/03467; US5912336), TbpB (WO93/06861; EP586266), Hsf (W099/31 32), NspA (W096/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (también conocido como D15 (WOOO/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PIdA (PCT/EP99/06718), FrpB (W096/31618 véase SEQ ID NO:38), FrpA o FrpC o una parte conservada en común tanto para al menos 30, 50, 100, 500, 750 aminoácidos (WO92/01460), LbpA y/o LbpB (PCT/EP98/05117; Schryvers et al., Med. Microbiol. 199932: 1117), FhaB (WO98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), Iipo02 (PCT/EP99/08315); MltA (WO99/57280), y ctrA (PCT/EP00/00135). Las proteínas neisserial se agregan preferentemente como proteínas purificadas como parte de la preparación de membrana externa. La vacuna se formula preferentemente con antígenos que proporcionan protección contra una o más infecciones de Difteria, Tétano y Bordetella pertussis. El componente pertussis puede matarse completamente por célula B. pertussis (Pw) o pertussis acelular (Pa) que contiene al menos un antígeno (preferentemente dos o todos tres) de PT, FHA y pertactina 69 kDa. Ciertas otras vacunas acelulares también contienen aglutinogenes tales como Fim2 y Fim3 y estas vacunas también se contemplan para utilizarse en la invención . Típicamente, los antígenos que proporcionan la protección contra Difteria y Tétanos son toxoide Difteria y toxoide Tétanos. Los toxoides son toxinas químicamente inactivas (por ejemplo, siguiendo el tratamiento con formaldehído) o toxinas inactivas por la introducción de una o más m utaciones de punto. Alternativamente, el líq uido altamente viscosos de la invención puede proporcionarse como un equipo con el vidrio líquido altamente viscoso en un contenedor y DTPa o DTPw líquido en otro contenedor. Tales eq uipos pueden, por ejemplo, comprender una jeringa de cámara dual con los componentes líquidos y secos contenidos en la m isma jeringa pero en diferentes cámaras. El componente seco se reconstituye así con la vacuna líq uida inmediatamente antes de la inyección como una vacuna única. De esta manera, por ejem plo, la composición líquida altamente viscosa de la invención se reconstituye con la vacuna DTPa o DTPw líquida (preferentemente de manea extemporánea) y se administra como una vacuna única. La vacuna DTPa o DTPw típicamente se auxilia al menos en parte con hidróxido de aluminio (por ejemplo, vacunas I nfanrix® y Triatanrix® de GlaxoSmithKIme Biolog icals s. a.).

La vacuna también puede comprender opcionalmente uno o más antígenos que pueden proteger un huésped contra Haemophilus influenzae no ejemplar, RSV y/o uno o más antígenos que pueden proteger un huésped contra el virus de influenza . Los antígenos de proteína H. Influenzae no ejemplares incluyen proteína Fimbrina (US 5766608) y fusiones que comprenden péptidos de la m isma (por ejemplo, Fusión LB1 ) (US 5843464-Ohio State Research Foundation) , OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1 , Hmw2, Hap, y D 1 5. Los antígenos de virus de influenza preferidos incluyendo virus completos, vivos o inactivos, virus de influenza dividido, crecido en huevos o células MDCK, o célu las Vero o virosomas de gripe total (según se describe por R. Gluck, Vaccine, 1992, 1 0, 91 5-920) o proteínas recombinantes o purificadas de las mismas, tales como proteínas HA, NP, NA, o M, o combinaciones de las mismas. Los antígenos RSV preferidos (Virus Sincitial Respiratorio) incluyen la g licoproteína F, la g licoproteína G, la proteína H N , la proteína M o derivados de los mismos. Deberá apreciarse que las composiciones antigénicas de la invención pueden com prender uno o más polisacáridos capsulares de una especie única de bacteria. Las composiciones antigénicas también pueden comprender polisacáridos capsulares derivados de una o más especies de bacterias.

Com posiciones v Vacunas I nm unogénicas Un aspecto adicional de la invención incluye com posiciones inm u nogénicas o vacu nas que comprenden el l íquido altamente viscoso de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, la composición ¡nmunogénica o vacuna contiene una cantidad de un adyuvante suficiente para mejorar la respuesta inmune al inmunogen. Los adyuvantes adecuados incluyen , pero no se limitan a, sales de aluminio, mezclas de escualeno (SAF-1 ) , péptido muramilo , derivados de saponina, preparaciones de pared celular micobacteria, lípido monofosforilo A, derivados de ácido m icólico, agentes tensoactivos de copolímero de bloq ue no iónico, QuilA, subunidad de toxina B de cólera, polfosfazeno y derivados, y complejos inmunoestimuladores (ISCOMs) tales como aquellos descritos por Takahash i et al. , (1990) Nature 344: 873-875. Para uso veterinario y para la producción de anticuerpos en animales, los componentes mitogénicos del adyuvante Freund pueden utilizarse. Así como con todas las composiciones o vacunas inmunogénicas, las cantidades inmunológicamente efectivas de los inmunogenes deben determinarse empíricamente. Los factores a considerar incluyen la inmunogenicidad , si o no el inmunogen se acomplejará con o se un irá covalentemente a una proteína vehículo o adyuvante u otro veh ículo, vía de administración y el número de dosis inmun izantes a administrar. Tales factores se conocen en la materia de vacunas y se encuentran bien dentro de la experiencia de los inmuólogos para elaborar tales determinaciones sin experimentación indebida. El agente activo puede presentarse en concentraciones variantes en el líquido altamente viscoso o vacuna de la invención. Típicamente, la concentración mínima de la sustancia es una cantidad necesaria para lograr su uso pretendido, mientras que la concentración máxima es la cantidad máxima que permanecerá en solución o se suspenderá de manera homogénea dentro de la mezcla inicial. Por ejemplo, la cantidad mínima de un agente terapéutico es preferentemente uno que proporcionará un dosis única terapéuticamente eficaz. Para sustancias bioactivas, la concentración mínima es una cantidad necesaria para la bioactividad en la reconstitución y la concentración máxima se encuentra en el punto en el cual no puede mantenerse una suspensión homogénea. En el caso de unidades de dosis única, la cantidad es aquella de una aplicación terapéutica única. Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá 1 -1 00 ug de antígeno de proteína, preferentemente 5-50 ug y más preferentemente 5-25 ug. Las dosis preferidas de polisacáridos bacterianos son 10-200 ug, 1 0-5 ug, 5-2.5 ug o 2.5-1 ug. La cantidad preferida de la sustancia varía de sustancia en sustancia pero es fácilmente determinable por un experto en la materia.

Líquido altamente viscoso que comprende un agente activo Otro aspecto de la invención es un líquido altamente viscoso que comprende un agente activo que es preferentemente obtenible o se obtiene utilizando un método de la invención. El agente activo preferentemente retiene su actividad y/o antigenicidad y/o inmunogenicidad siguiendo el secado utilizando el método de la invención y la reconstitución subsecuente. Preferentemente al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 95% de la actividad del agente activo, la antigenicidad o inmunogenicidad se retiene. Esto puede determinarse por cualquier método adecuado, por ejemplo, según se describe anteriormente. Los líquidos altamente viscosos de la invención preferentemente comprenden un polio formador de vidrio seleccionado del grupo que consiste de glucosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, sucrosa, maltosa, lactosa, sorbitol, iso-maltosa, maltilol, lactilol, palatinit, trehalosa, raffinosa, staquiosa, melezitosa y dextrano. El líquido altamente viscoso de la invención puede contener cualquiera de los agentes activos descritos anteriormente. El agente activo conservado por el líquido altamente viscoso puede comprender un sistema biológico, por ejemplo, células, composiciones sub-celulares, bacterias, preparaciones de vesícula de membrana externa y virus. Puede alternativamente o además comprender moléculas, por ejemplo, proteínas, péptidos, aminoácidos, ácido polinucleicos, oligonucleótidos, polisacáridos, oligosacáridos, polisacárido-conjugados de proteína, oligosacárido-conjugados de proteína. También puede comprender combinaciones que comprenden de dos o más agentes de los agentes activos anteriores. Las modalidades preferidas incluyen un líquido altamente viscoso preferentemente obtenido u obtenible mediante un método de la invención en donde el agente activo es o comprende una vacuna o componente de vacuna. Los componentes preferidos de la vacuna se describen anteriormente e incluyen IPV, más preferentemente IPV, y polisacáridos bacterianos, preferentemente polisacáridos u oligosacáridos de Haemophilus influenzae b y Neisseria meningitis, A, C, W, y Y. Los componentes de vacuna preferidos incluyen IPV (una mezcla ¡nactivada de cepas de virus polio). Preferentemente, el IPV se combina con uno o más de polisacárido Hib PRP y/o polisacáridos meningococal A, C, W y/o polisacáridos pneumocococales (según se describe anteriormente), más preferentemente IPV e Hib; IPV y Men C y Y. En las composiciones anteriores en donde se utilizan los polisacáridos, los oligosacáridos pueden también emplearse (según se define anteriormente). A pesar de que estas composiciones pueden auxiliarse (según se describe anteriormente), preferentemente no se auxilian o preferentemente no comprenden sales de aluminio. Preferentemente, los polisacáridos u oligosacáridos se conjugan para un péptido o proteína vehículo que comprende epítopos T-auxiliadores (según se describe posteriormente). El líquido altamente viscoso de la invención preferentemente se combina con otros antígenos en una vacuna de combinación que se disecan opcionalmente o preferentemente form ulaciones líquidas que pueden utilizarse para reconstituir los com ponentes secos. Los antígenos preferidos a combinar con los contenidos del contenedor de la invención incluyen uno o más de toxoide difteria, toxoide tétanos, pertuss de célula completa (Pw), pertuss acelular (Pa) (según se describe anteriormente), antígeno de superficie de Hepatitis B, polisacáridos pneumococales, proteínas pneumococales, polisacáricos neisserial, proteínas neisserial. Los polisacáridos bacterianos pueden conjugarse para una proteína vehículo tal como toxoide tétanos, fragmento de toxoide tétanos C, toxoide difteria, CR 1 97, pneumolisina, Proteína D (US6342224) seg ún se describe anteriormente. Un aspecto adicional de la invención es un método para elaborar una vacuna q ue comprende la etapa de reconstituir el l íq uido altamente viscoso en una solución acuosa. En una modalidad preferida, la solución acuosa comprende antígenos de toxoide Difteria , toxoide Tétanos y Pertussis (cél ula total o acelular) y opcionalmente comprende además antígeno de superficie de hepatitis B. La vacuna DTP es opcionalmente al menos en parte auxiliada con una sal de aluminio, preferentemente hidróxido de aluminio o fosfato de al uminio. Otra modalidad de la invención es un equipo que comprende el l íq uido altamente viscoso de la invención mantenida en un primer contenedor y una vacuna que comprende DTP líqu ida (célu la total o acelular) en un seg u ndo contenedor. Una jeringa de cámara dual puede utilizarse según se describe anteriormente.

Todas las referencias o solicitudes de patente citadas dentro de esta especificación de patente se incorporan para referencia en la presente.

Ejemplos Los ejemplos abajo se llevan a cabo utilizando las técnicas estándares , que se conocen bien y la rutina por aq uellos expertos en la materia, al menos q ue se describa de otra forma a detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 . Establecim iento de condiciones de congelación Las muestras se hicieron al disolver la sucrosa en agua para dar 1 %, 5% , 1 0% y 20% de soluciones. Las muestras se colocaron en un secador por congelación Heto Drywinner 8-85 en el cual la temperatura de almacenamiento puede regular a dentro 1 °C, la temperatura final del condensador es -85°C, la presión se regula con una válvula de purga y 6 termopares se encuentran disponibles para medir la temperatura de producto. La fijación de temperatura de almacenamiento se mantuvo a 1 5°C a lo largo del proceso. La presión se redujo inicialmente a 200 m Barias y se mantuvo a este nivel por 10 minutos antes de reducir la presión más a 50 mM Barias, 5 m Barias, 2.5 m Barias, 0.75 m Barias , 0.4 m Barias y 0.2 m Barias. Cada n ivel de presión se mantuvo por 20 minutos para permitir que la temperatura se eq uilibre y la temperatura de la muestra se leyó utilizando un termopar. Los termopares se unieron a las muestras con diferentes concentraciones de sucrosa y las temperaturas registradas en la tabla 1 son valores promedio de las temperaturas.

Resultados Todas las muestras se congelan entre 1 .66 y 1 .1 1 m barias, irrespectivas de la concentración de sucrosa presente. Las temperaturas med idas en d iferentes presiones fueron muy cercanas a aquellas pronosticadas de la curva de punto triple. Por lo tanto, la presencia de sucrosa no tiene un g ran efecto sobre la temperatura de las muestras a d iferentes presiones. A fin de evitar la congelación de la muestra, la presión deberá mantenerse por arriba de 2m Barias para un temperatura de congelación de 15°C. A temperaturas inferiores, la presión deberá mantenerse a un nivel más alto mientras que el uso de una temperatura superior podría permitir que la presión se reduzca más sin la congelación de las muestras.

Tabla 1 Presión Temperatura Temperatura Líquido/Congelado medida Téorica 1 00 m Barias 15°C Líquido 50 m Barias 15°C Líquido 5 m Barias 1 °C 1 °C Líquido 2.5 m Barias -5°C -7°C Líquido 0.75 m Barias -21 °C -21 °C Congelado 0.4 m Barias -22°C -27°C Congelado 0.2 m Barias -27°C -32°C Congelado Ejemplo 2. Método para secado sin congelación y formación de espuma Las muestras de conservación que contienen 5%, 10%, 15% y 25% de sucrosa se hicieron y se agregaron a frascos. Las muestras se colocaron en un secador por congelación a fijación de temperatura de 15°C a lo largo del proceso. La presión se redujo inicialmente a 200 m Barias y se mantuvo a este nivel por 1 0 minutos para permitir la desgasificación antes de reducir más la presión. La presión se redujo más a 8 m barias por dos o tres horas durante cuyo tiempo los termopares dentro de la muestras mostraron que la temperatura de muestra se redujo a 4°C debido al enfriamiento evaporativo. Después de 2-3 horas, la temperatura de las muestras regresó a 15°C, indicando que la evaporación bajo estas condiciones de presión y temperatura casi se completó. Durante esta etapa del proceso, la muestra no se hirvió para formar una espuma o una congelación de tal forma que un agente activo dentro de la muestra se expone a la menor tensión posible. La muestra tiene la apariencia de líquido viscoso. El secado adicional de las muestras se logró al reducir la presión más a 0.1 m barias mientras que se mantuvo la temperatura de almacenamiento a 15°C. Estas condiciones se mantuvieron por un adicional de 10-1 6 horas. Durante esta fase, la temperatura de muestra permaneció a 1 5°C ya que la velocidad de evaporación fue lenta. El secado adicional tuvo lugar y la muestra resultante tuvo una apariencia sólida. Si la muestra se colocó en su lado, los contenidos de muestra disminuyeron muy lentamente, durante un período de días mostrando que la muestra es un vidrio líquido de viscosidad alta. La Figura 1 muestra la apariencia del líquido de alta viscosidad.

Ejemplo 3. Retención de Inmunogenicidiad IPV después del secado sin congelación o formación de espuma Tales muestras no se han sometido a tensiones asociadas con el burbujeo que logra la formación de espuma o congelación. Los experimentos se realizaron para determinar si este método produjo un nivel alto de retención de antígeno cuando se utilizó para secar I PV. Tres experimentos separados se realizaron en el cual el IPV se volvió a suspender en una solución acuosa con 10% de sucrosa o 1 0% de trehalosa como el agente estabilizador. Las muestras se colocaron en frascos de silicona que se colocaron en un secador por congelación Heto Drywinner 8-85 y la temperatura se fijo a 15°C. La presión se redujo inicialmente a 35 m Barias para desgasificar la muestra. Después de 10 minutos, la presión se redujo más a 8 m Barias y se mantuvo a este nivel por dos horas. Durante este período, la fijación de temperatura se mantuvo a 15°C y la temperatura en la muestra se monitoreó. A medida que el agua se evapora de la muestra, la temperatura goteó a 4°C pero hacia el final de las dos horas, la temperatura regresó a 15°C a medida que la velocidad de evaporación disminuyó. No ocurrió burbujeo ni formación de espuma bajo estas condiciones. La presión se redujo así más a 0.1 m barias y estas condiciones se mantuvieron por 16 horas más en los primeros dos experimentos y por 10 horas más en el tercer experimento. Las muestras se reconstituyeron en agua y una ELISA se utilizó para valorar la retención de antigenicidad de las tres cepas de virus polio. El anticuerpo monoclonal contra el IPV tipo 3, se utilizó en una ELISA para valorar el grado de retención de antígeno en la muestra reconstituida, seca por congelación en comparación a una muestra de referencia que no se había congelado. Los resultados se presentan como un porcentaje de la lectura dada para una muestra que no había superado un procedimiento de secado. Resultados Las muestras secas tuvieron una apariencia sólida sin embargo parecía que estaban en la forma de un vidrio/líquido altamente viscoso ya que, durante un período de días, la muestra seca fue capaz de fluir si el contenedor se invirtió.

Tabla 2. Retención de antígeno I PV tipo 3 según se determina por ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal (secado sin espumación o congelación) Formulación 1 er experimento 2do 3er experimento (18 horas de experimento (18 (12 horas de ciclo) horas de ciclo) ciclo) Sin azúcar 0% 2.5% de 0% glucosa 10% de 75% 78% 91 % sucrosa 10% de 82% 79% 93% trehalosa Estos niveles de retención de antígeno I PV tipo 3 se compara muy favorablemente con los resultados de congelación mostrados abajo en donde los valores muy bajos se encontraron usualmente en el mismo formato ELISA cuando un anticuerpo monoclonal contra el tipo 3 se utilizó.

Tabla 3. Retención de antígenos I PV tipo 1 , 2, y 3 según se determina por ELISA utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales (secado por congelación) Ejemplo 4. Estabilidad de almacenamiento a largo plazo de IPV seco almacenado como un vidrio/líquido altamente viscoso. El I PV seco utilizando el método descrito en el Ejemplo 3 se almacenó a 4°C por 9 meses. Las muestras se reconstituyeron en agua con 1 50 mM de NaCI y u na ELI SA se utilizó para valorar la retención de antigenicidad de las tres cepas de virus polio. Tres anticuerpos monoclonales, uno contra cada cepa, se utilizaron en ELISAs separadas para valorar el grado de retención de antígeno en la m uestra alm acenada reconstituida. Una ELISA similar se había llevado a cabo en muestras reconstituidas del mismo grupo antes del almacenamiento. Todos los resultados se compararon a una muestra de referencia que no se había secado. Los resultados se presentan como un porcentaje de la lectura dada por una muestra que no había superado un proced imiento de secado.

Resultados Tabla 4. Retención de antígenos I PV después del almacenamiento como un l íquido altamente viscoso para 9 meses Ejemplo 5. Comparación de la inm unogenicidad in vivo de I PV después del secado para formar u n líquido altamente viscoso y la reconstitución en comparación a I PV no seco Los g rupos de 1 0 ratas Wistar se inocularon con varias diluciones de I PV que se habían secado en la presencia de 1 0% de sucrosa para formar un l íq uido altamente viscoso utilizando el método descrito en el Ejemplo 2 y reconstituido. Los grupos adicionales de 1 0 ratas Wistar se inocularon con las muestras de referencia de I PV que se había preparado en la misma manera pero que no se había secado. Después de 21 días, se tomaron los sueros de todas las ratas y los sueros se probaron en ensayos de inmunoprecipitación separada util izando virus polio Tipo 1 , Tipo 2 y Tipo 3. Los resu ltados se muestran en la tabla 5 q ue contiene: a) el número de ratas responsivas para cada dilución de I PV, b) el ED50 que es la dosis q ue se req uiere para asegurar q ue 50% de las ratas se seroconvierten según se valor por el ensayo de inmunoprecipitación y c) la potencia relativa del IPV seco y reconstituido en com paración al I PV de referencia no seco.

Tabla 5. I nmunogenicidad de IPV después de secarse para formar un líquido altamente viscoso (JLE017/05) y reconstitución en comparación a un I PV de referencia no seco (JLE097) J LEO1 7/05 es un g rupo I PV q ue se secó para formar un l íquido altamente viscoso y su bsecuentemente se reconstituyó. El JLE097 es la referencia no seca. La Tabla 5 muestra que el número de responsivos inoculados con cada dilución de I PV es similar entre los dos grupos de I PV reconstituido y seco y la muestra de referencia seca. En general , el IPV tipo 1 produjo la mejor respuesta inmune, con el tipo 2 produciendo una respuesta inmune en ratas ligeramente inferior. El tipo 3 produjo la respuesta inmune más débil. El proceso de secado para formar un líquido altamente viscoso no deteriora la habilidad de IPV para prod ucir anticuerpos inmunoprecipitadores in vivo. Una lectura de potencia relativa (RP) de 1 .0 indica q ue la muestra produce una respuesta equivalente a la muestra de referencia. Ambas muestras secas producen lecturas RP de casi 1 .0 para todos los tres tipos de virus de polio indicando q ue el proceso de secado no efectúa la habilidad de la muestra para producir una respuesta inmune.

Ejemplo 6. Efecto de secado par formar un líquido altamente viscoso utilizando sucrosa o trehalosa como agente estabilizador en la habil idad de I PV para producir u na respuesta inmune inmunoprecipitadora in vivo Los grupos de 1 0 ratas Wistar se inocularon con IPV que se había secado en la presencia de ya sea 1 0% de sucrosa o 10% de trehalosa según se describe en el Ejemplo 2 y después se reconstituido. Los grupos adicionales de 1 0 ratas Wistar se inocularon con una cantidad equivalente de I PV que no se había secado, como las muestras de referencia. Después de 21 días, se colectaron los sueros de todas las ratas y un ensayo de inmunoneutralización, según se describe en el Ejemplo 5, se utilizó para valorar la cantidad de anticuerpo inmunoneutralizarod que es había elevador contra cada virus de polio Tipo 1 , Tipo 2 y Tipo 3. Las potencias relativas se calcularon para cada muestra al comparar la respuesta inmune a aquella producida por la muestra de referencia no seca. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 Comparación de secado en sucrosa y trehalosa N úmero de Azú car Potencia % de Duración lote presente relativa in vivo Humedad (horas) Tipo 1 /Tipo Karl Fischer 2/T¡po 3 Jle017 10% de 0.95/0.82/ .05 Nd 7 trehalosa 31 CO3/01 1 0 % de 0.69/1 .20/0.97 4.6% 18 sucrosa 31 CO3/02 1 0 % de 0.60/0.94/0.9 1 1 .5% 18 trehalosa 03 D02/01 1 0% de 0.74/1 .05/0.96 5.9% 12 sucrosa 03 D02/02 1 0 % de 0.58/0.98/1 .06 10.6% 12 trehalosa La cantidad de agua restante en las muestras fue inferior cuando la sucrosa se utilizó como agente estabilizador con aproximadamente 5% de humedad restante en comparación a aproximadamente 1 0% de trehalosa se utilizó como el agente estabilizador medido por un analizador de humedad voltamétrica KarI Fischer. Tanto la sucrosa como trehalosa fueron eficaces en la estabilización de I PV durante el proceso de secado de tal forma que el I PV reconstituido dio las lecturas de potencia relativa aproximándose a 1 .0 para la mayoría de los diferentes tipos de virus de polio. Las potencias relativas fueron particularmente buenas para el virus de polio Tipo 3 que perdió su inmunogenicida relativamente de manera fácil.

Ejemplo 7: Medición de humedad por KarI Fischer El análisis se llevó a cabo en un valorímetro KarI Fischer (Aqua 30.00 - Elektrochemie Halle). La muestra se pesó y se colocó en el horno a una fijación de 80°C. La muestra se niveló con gas nitrógeno y después se agregó a reactivo hidranal (Riedel de Hahn) a fin de realizar el análisis por voltametría.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para conservar un agente activo comprendiendo las etapas de: a) preparar una muestra de conservación al disolver/suspender un agente activo en una sol ución de un agente estabilizador; b) someter la muestra de conservación a tales condiciones de temperatura y presión de tal forma que la muestra de conservación pierde el solvente por evaporación , sin congelación o burbujeo incluido en la formación de espuma, para formar un líquido viscoso. 2. El método según la reivindicación 1 , com prendiendo una etapa de: c) someter además la muestra de conservación a tales condiciones de temperatura y presión de tal forma que el l íquido viscoso se seca para formar un líq uido altamente viscoso. 3. El métodos según la reivindicación 1 o 2, en donde la presión se reduce a 20 m barias o menos durante la etapa b). 4. El método seg ún la reivindicación 1 -3 en donde la temperatura externa para la muestra de conservación es entre 5°C y 37°C durante la etapa b) . 5. El método según la reivindicación 2-4 en donde la temperatura externa a la muestra de conservación es entre 5°C y 37°C durante la etapa c). 6. El método según la reivindicación 2-5 en donde la temperatura externa a la muestra de conservación es más alta durante la etapa c) que en su etapa b). 7. El método según la reivindicación 6, en donde la temperatura externa a la muestra de conservación se aumenta a arriba de 20°C durante la etapa c). 8. El método según la reivindicación 2-7, en donde la presión se reduce en la etapa c) en comparación a la presión durante la etapa b). 9. El método según la reivindicación 8, en donde la presión se reduce a 1 m baria o menos durante la etapa c). 10. El método según la reivindicación 1 -9, en donde la etapa b) se completa en menos de 4 horas. 1 1 . El método según la reivindicación 2-10, en donde las etapas b) y c) se completan en menos de 12 horas. 12. El método según la reivindicación 1 -1 1 , en donde el agente estabilizador comprende un poliol formador de vidrio, seleccionado del grupo que consiste de glucosa, maltosa, iso-maltulosa, lactulosa, sucrosa, maltosa, lactosa, sorbitol, iso-maltosa, maltitol, lactitol, palatinit, trehalosa, rafinosa, staquiosa, melezitosa y dextrano. 13. El método según la reivindicación 12, en donde el agente estabilizador es sucrosa. 14. El método según la reivindicación 12-13, en donde la concentración de agente estabilizador es menor a 15%. 15. El método según la reivindicación 1 -14, en donde la muestra de conservación comprende fenol rojo. 16. El método según las reivindicaciones 1 -15, en donde la muestra de conservación se seca en un contenedor con una superficie interna repelente al solvente. 17. El método según las reivindicaciones 1 -16 en donde el agente activo comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste de proteína, péptido, aminoácido, polinucleótido, oligonucleótido, polisacárido, oligosacárido, conjugado de polisacárido-proteína y conjugado de oligosacárido-proteína. 18. El método según la reivindicación 1 -16, en donde el agente activo comprende un sistema biológico seleccionado del grupo que consiste de células, composiciones subcelulares, bacterias, virus, componentes de virus y virus como partículas. 19. El método según la reivindicación 1 8, en donde el agente activo comprende IPV (virus de polio inactivo). 20. El método según la reivindicación 1 8-19, en donde el agente activo comprende polisacárido u oligosacárido Hib (Haemophilus influenzae tipo b). 21 . El método según la reivindicación 18-20, en donde el agente activo comprende polisacárido u oligosacárido Neisseria meningitidis C. 22. El método según las reivindicaciones 1 -21 en donde al agente activo comprende una vacuna. 23. Un líquido altamente viscoso que comprende un agente activo en donde la antigenicidad o actividad del agente activo se conserva. 24. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 23 obtenible por el método de las reivindicaciones 1 -22. 25. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 23 o 24 comprendiendo un poliol formador de vidrio seleccionado del grupo que consiste de glucosa, maltulosa, ¡so-maltulosa, lactulosa, sucrosa, maltosa, lactosa, sorbitol, iso-maltosa, maltilo, lactilol, palatinit, trehalosa, rafinosa, staquiosa, melezitosa y dextrano. 26. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 25 en donde el poliol formador de vidrio es sucrosa. 27. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 23-26 en donde el agente activo comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste de proteína, péptido, aminoácido, polinucleótido, oligonucleótido, polisacárido, oligosacárido, conjugado de polisacárido-proteína y conjugado de oligosacárido-proteína. 28. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 23-27, en donde el agente activo comprende un sistema biológico seleccionado del grupo que consiste de células, composiciones subcelulares, bacterias, virus, componentes de virus y virus como partículas. 29. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 23-28 en donde al agente activo comprende una vacuna. 30. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 23-29 en donde el agente activo comprende I PV. 31 . El líquido altamente viscoso según la reivindicación 23-30 en donde el agente activo comprende un polisacárido u oligosacárido bacteriano. 32. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 31 , en donde el agente activo comprende polisacárido u oligosacárido Hib (Haemophilus influenzae tipo b), preferentemente conjugado a una proteína vehículo. 33. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 23-32, en donde el agente activo comprende polisacárido u oligosacárido Neissería meningltidis C, preferentemente conjugado a una proteína vehículo. 34. El líquido altamente viscoso según la reivindicación 23-33 mantenido dentro de un contenedor con una superficie interna repelente a la superficie. 35. Una composición inmunogénica o vacuna que comprende el líquido altamente viscoso según la reivindicación 23-24 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 36. Un método para elaborar una vacuna que comprende la etapa de reconstituir el líquido altamente viscoso según la reivindicación 23-35 en una solución acuosa. 37. El método según la reivindicación 36 en donde la solución acuosa comprende antígeno Difteria, antígeno Tétanos y antígenos Pertussis (acelular o célula completa). 38. El método seg ún la reivindicación 37, en donde la vacuna DTP es al menos en parte auxiliada con hidróxido de alum inio. 39. Un equipo comprendiendo el líquido altamente viscoso según las reivind icaciones 23-24 mantenido en un primer contenedor y un com ponente de vacuna l íquida en un segundo contenedor.