NO342593B1 - Pyrimidinderivat virksomt mot kreft - Google Patents

Abstract

Tienopyrimidin av formel (I) og de farmasøytisk akseptable salter derav har aktivitet som inhibitorer for P13K med selektivitet for P110 subtypen, og kan bli bruk til å behandle sykdommer og lidelser som stammer fra uvanlig cellevekt, funksjon eller oppførsel, spesielt dem som er assosiert med P13 kinase så som kreft, immunlidelser, kardiovaskulær sykdom, viral infeksjon, inflammasjon, metabolisme/endokrine sykdommer og nevrologiske lidelser. Fremgangsmåter for syntetisering av forbindelsene er også beskrevet.

Description

Område for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår pyrimidinderivat av formel (I) som angitt i krav 1, fremgangsmåter for fremstilling derav som angitt i krav 6. Forbindelsene har aktivitet som inhibitorer for fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K).

Bakgrunn for oppfinnelsen

Fosfatidylinositol (heretter forkortet som "PI”) er et av et antall fosfolipider funnet i cellemembraner. I de senere år har det blitt klart at PI spiller en viktig rolle i intracellulær signaltransduksjon. På det sene 1980-tall ble en P13 kinase (P13K) funnet å være et enzym som fosforylerer 3-posisjonen av inositolringen av fosfatidylinositol (D. Whitman et al., 1988, Nature, 332, 664).

P13K ble opprinnelig regnet for å være et enkelt enzym, men det har nå blitt klart at et antall av subtyper er til stede i P13K. Hver subtype har sin egen mekanisme for å regulere aktivitet. Tre hovedklasser av P13K har blitt identifisert på basis av sin in vitro substratspesifisitet (B. Vanhaesebroeck, 1997, Trend in Biol. Sci., 22, 267). Substrater for klasse I P13K er PI, PI 4-fosfat (PI4P) og PI 4,5-bifosfat (PI(4,5)P2). Klasse I P13K er videre oppdelt i to grupper, klasse Ia og klasse Ib, ut fra deres aktiveringsmekanisme. Klasse Ia P13K innbefatter P13K p110α, p110β og p110δ subtyper som overfører signaler fra tyrosinkinase-koblede reseptorer. Klasse Ib P13K innbefatter en p110γ subtype aktivert av en G protein-koblet reseptor. PI og PI(4)P er kjent som substrater for klasse II P13K-enzymer. Klasse II P13K innbefatter P13K C2α, 2β og C2γ subtyper som er karakterisert ved å inneholde C2-domener ved C-terminalen. Substratet for klasse III P13K er PI alene.

I P13K subtypene har klasse Ia subtypen blitt mest inngående undersøkt til nå. De tre subtyper av klasse Ia er heterodimerer av en katalytisk 110 kDa subenhet og regulatoriske subenheter av 85 kDa eller 55 kDa. De regulatoriske subenheter inneholder SH2-domener og binder til tyrosinresiduer fosforylert av vekstfaktorreseptorer med en tyrosinkinase-aktivitet eller onkogene produkter for derved å indusere P13K-aktiviteten av den p110 katalytiske subenhet som fosforylerer dets lipidsubstrat. Således er klasse Ia subtypene regnet for å være assosiert med celleproliferasjon og karsinogenese.

WO 01/083456 beskriver en serie av kondenserte heteroarylderivater som har aktivitet som inhibitorer for P13K og som undertrykker kreftcellevekst.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det har nå blitt funnet at et spesielt tienopyrimidin er en kraftig inhibitor av P13K med medikamentliknende fysiokjemiske og farmakokinetiske egenskaper. Forbindelsene oppviser selektivitet for klasse Ia P13K i forhold til klasse Ib, spesielt for P110α subtypen.

Følgelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse en forbindelse som er et tienopyrimidin av formel (I):

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Tioenopyrimidinet av formel (I) er 2-(1H-indazol-4-yl)-6-(4-metansulfonylpiperazin-1-ylmetyl)-4-morfolin—yl-tieno[3,2-d]pyrimidin.

En passende syntesestrategi for å fremstille forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan benytte prekursoren karboksaldehydet av formel (II):

Ved å starte fra denne prekursoren omfatter syntesen å utføre, i vilkårlig rekkefølge, en palladium-fremmet (Suzuki-type) krysskoblingsreaksjon og en reduktiv aminering. Således kan en forbindelse ifølge oppfinnelsen bli fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter:

(a) å behandle en forbindelse av formel (II):

med en borsyre eller ester derav av formel (IV):

(IV)

hvor hver R15 er H eller C1-C6alkyl eller de to gruppene OR15 danner, sammen med boratomet til hvilket de er bundet, en pinacolato boronat estergruppe, i nærvær av en Pd-katalysator. Fremgangsmåten for fremstilling av forbindelsen av formel (I) ifølge oppfinnelsen tar som utgangspunkt å behandle den resulterende forbindelse av formel (III):

med et amin av formel (V):

ved nærvær av et passende reduksjonsmiddel; eller

(b) å behandle en forbindelse av formel (VI):

med en borsyre eller ester derav av formel (IV):

(IV)

hvor hver R15 er H eller C1-C6alkyl eller de to gruppene OR15 danner, sammen med boratomet til hvilket de er bundet, en pinacolato boronat estergruppe, ved nærvær av en Pd-katalysator.

Enda videre fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge oppfinnelsen som definert ovenfor, hvilken fremgangsmåte omfater å behandle en forbindelse av formel (VI):

med en borsyre eller ester derav av formel (IV):

(IV)

hvor hver R15 er H eller C1-C6alkyl eller de to gruppene OR15 danner, sammen med boratomet til hvilket de er bundet, en pinacolato boronat estergruppe, ved nærvær av en Pd-katalysator.

Fremstilling av forbindelsen av formel (VI) kan utføres ved å behandle en forbindelse av formel (II)

med et amin av formel (V)

i nærvær av et egnet reduksjonsmiddel.

Et farmasøytisk akseptabelt salt av et tienopyrimidin av formel (I) kan bli fremstilt ved å bruke konvensjonelle teknikker. Typisk omfatter fremgangsmåten behandling av tienopyrimidinet av formel (I) som definert ovenfor, med en egnet syre i et egnet oppløsningsmiddel.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som definert ovenfor, finner både amineringstrinnet og det Pd-medierte krysskoblende trinn sted under konvensjonelle betingelser. Palladium-katalysatoren kan være enhver som typisk blir brukt for Suzuki-type trysskoblinger så som PdCl2(PPh3)2. Reduksjonsmiddelet er typisk et borhydrid, f.eks. NaBH(OAc)3, NaBH4eller NaCNBH4, spesielt NaBH(OAc)3.

Pinacolato boronatesteren kan f.eks. bli fremstilt ved en fremgangsmåte som beskrevet i hvert av Referanseeksempler 5 og 6 som følger.

En forbindelse av formel (II) som definert ovenfor, kan bli fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter å behandle en forbindelse av formel (VII):

(VII)

med et litieringsmiddel fulgt av N,N’-dimetylformamid (DMF). Reaksjonen blir typisk utført ved å tilsette en oppløsning av litieringsmiddelet i et ikke-polart organisk oppløsningsmiddel, f.eks. et hydrokarbonoppløsningsmiddel så som heksan, til en suspensjon av forbindelsen av formel (IX) i et organisk oppløsningsmiddel så som tetrahydrofuran (THF). Dersom THF blir brukt finner tilsetningen sted ved lav temperatur ved omkring -78ºC. Litieringsmiddelet er typisk en alkyllitiumforbindelse, f.eks. n-butyllitium.

En forbindelse av formel (VII) som definert ovenfor, kan bli fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter behandling av en forbindelse av formel (VIII):

(VIII)

med morfolin i et organisk oppløsningsmiddel. Oppløsningsmiddelet er typisk en alkohol så som metanol. Reaksjonen blir generelt utført ved romtemperatur.

Forbindelsen av formel (VII) kan bli fremstilt ved fremgangsmåen beskrevet i Referanseeksempel 1 eller i analogi med en slik fremgangsmåte.

Et tienopyrimidin av formel (I) kan bli omdannet til et farmasøytisk akseptabelt salt, og et salt kan bli omdannet til den frie forbindelse, ved konvensjonelle metoder. Eksempler på farmasøytisk akseptable salter innbefatter salter med uorganiske syrer så som saltsyre, bromsyre, jodsyre, svovelsyre, salpetersyre og fosforsyre; og organiske syrer så som metansulfonsyre, benzensulfonsyre, maursyre, eddiksyre, trifluoreddiksyre, propionsyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, fumarsyre, eplesyre, melkesyre, malinsyre, tartarsyre, sitronsyre, etansulfonsyre, aparaginsyre og glutaminsyre. Typisk er saltet et mesylat, et hydroklorid, et fosfat, et benzensulfonat eller et sulfat. Mest typisk er saltet et mesylat eller et hydroklorid.

Saltene, f.eks. salter med enhver av de uorganiske eller organiske syrer som er nevnt ovenfor, kan være monosalter eller bis-salter. Således kan mesylatsaltet være monomesylatet eller bis-mesylatet.

Forbindelsene av formel (I) og deres salter kan eksistere som hydrater eller solvater.

En forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse har i biologiske tester blitt funnet å være en inhibitor for P13 kinase. Forbindelsen er selektiv for klasse Ia P13 kinaser i forhold til klasse Ib og oppviser typisk minst en 20 gangers selektivitet for klasse Ia i forhold til klasse Ib P13 kinaser. Spesielt er forbindelsen selektiv for p110αisoformen.

En forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan således bli brukt som en inhibitor for P13 kinase, spesielt av en klasse Ia P13 kinase. Følgelig kan en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse bli brukt til å behandle en sykdom eller lidelse som stammer fra abnormal cellevekst, funksjon eller oppførsel. Slik abnormal cellevekst, funksjon eller oppførsel er typisk assosiert med P13 kinase. Eksempler på slike sykdommer og lidelser er diskutert av Drees et al i Expert Opin. Ther. Patents (2004) 14(5): 703-732. Disse innbefatter kreft, immunlidelser, kardiovaskulær sykdom, viral infeksjon, inflammasjon, metabolisme/endokrine lidelser og nevrologiske lidelser. Eksempler på metabolisme/endokrine lidelser innbefatter diabetes og fedme.

Eksempler på krefttyper som foreliggende forbindelser kan bli brukt til å behandle, innbefatter leukemi, hjernetumorer, nyrekreft, magekreft og hudkreft, blære, bryst, uterus, lunge, tarm, prostata, ovarie og pankreas. En menneske- eller dyrepasient som lider av en immunlidelse, kreft, kardiovaskulær lidelse, viral infeksjon, inflammasjon, enmetabolisme/endokrin lidelse eller en nevrologisk lidelse, kan således bli behandlet ved en metode som omfatter administrasjon til disse av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som definert ovenfor. Tilstanden hos en person kan ved dette bli forbedret eller helbredet.

Sykdommer og tilstander som kan behandles med forbindelsen av formel (I) ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter slag, diabetes, hepatomegali, kardiovaskulær sykdom, Alzheimers sykdom, cystisk fibrose, viral sykdom, autoimmune sykdommer, aterosklerose, restenose, psoriasis, allergiske lidelser, inflammasjon, nevrologiske lidelser, en hormonrelatert sykdom, tilstander assosiert med organtransplantasjon, immunsviktlidelser, destruktive bensykdommer, proliferative lidelser, infeksjonssykdommer, tilsander assosiert med celledød, trombin-indusert blodplateaggregering, kronisk myelogen leukemi (CML), leversykdom, patogene immuntilstander som involverer T-celle-aktivering og CNS-lidelser i en pasient. I en utførelsesform blir en human pasient behandlet med en forbindelse av Formel I og et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel, adjuvant eller vehikkel, hvor nevnte forbindelse av Formel I er til stede i en mengde som påviselig inhiberer P13 kinase-aktivitet.

Krefttyper som kan bli behandlet med forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter bryst, ovarie, underlivs, prostata, testikkel, genito-urinveis, spiserør, strupe, glioblastom, nevroblastom, mage, hud, keratokantom, lunge, epidermiod karsinom, storscellekarsinom, ikke-småcelle lungekarsinom (NSCLC), småcellekarsinom, lunge adenokarsinom, skjelett, tykktarm, adenom, bukspyttkjertel, adenokarsinom, thyroid, follikulært karsinom, udifferensiert karsinom, papillært karsinom, seminom, melanom, sarkom, bærekarsinom, leverkarsinom og gallegang, nyrekarsinom, myeloide lidelser, lymfoide lidelser, hårcelle, munnhule og farynx (oral), leppe, tunge, munn, farynx, tynntarm, tykktarm-endetarm, tykktarm, rektum, hjerne og sentralnervesystem, Hodgkins og leukemi.

Kardiovaskulære sykdommer som kan bli behandlet med forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter restenose, kardiomyalgi, aterosklerose, myokardialt infarkt og kongestiv hjertesvikt.

Nevrodegenerative sykdommer som kan bli behandlet med forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amylotrofisk lateral sklerose, Huntingdons sykdom og cerebral ischemi samt nevrodegenerative sykdommer forårsaket av traumatisk skade, glutamat nevrotoksisitet og hypoksia.

Inflammatoriske sykdommer som bli behandlet med forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter reumatoid artritt, psoriasis, kontakt-dermatitt, og forsinkede hypersensitivitetsreaksjoner.

I tillegg til å ha biokjemisk effekt oppviser en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse fysiokjemiske og farmakokinetiske egenskaper som gjør den spesielt godt egnet for medikamentanvendelse. Dette er f.eks. vist i resultatene av de biologiske assays beskrevet i Eksempel 3 som følger. Spesielt har forbindelsene høy vannoppløselighet ved fysiologisk pH; oppløseligheten er større enn 100 µM. Høy oppløselighet ved fysiologisk pH er ønskelig siden dette fremmer biotilgjengelighet.

Forbindelsen har også høy metabolsk stabilitet som spesielt vist av hepatocytt fjerningsassayet beskrevet i Eksempel 3 hvor forbindelsen ble vist å ha lav hetpatocyttfjerning. Lav hepatocyttfjerning korrelerer med lav grad av levermetabolisme. Det kan følgelig bli observert at forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse har forbedrete fysiokjemiske og farmakokinetiske egenskaper mens den opprettholder biokjemisk effekt som inhibitor for P13 kinase.

En forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli administrert i en mengde doseringsformer, f.eks. oralt så som i form av tabletter, kapsler, sukker- eller filmbelagte tabletter, flytende oppløsninger eller suspensjoner eller parenterale, f.eks. intramuskulære, intravenøse eller subkutane. Forbindelsen kan følgelig bli gitt ved injeksjon eller infusjon.

Dosen avhenger av et antall faktorer innbefattende alder, vekt og tilstand hos pasienten samt administrasjonsruten. Daglige doser kan variere innen vide grenser og vil bli justert til de enkelte behov i hvert spesielle tilfelle. Typisk er imidlertid dosen tilpasset for hver administrasjonsrute når en forbindelse skal administreres alene til voksne mennesker, 0,0001 til 50 mg/kg, vanligst i området 0,0001 til 10 mg/kg kroppsvekt, f.eks. 0,01 til 1 mg/kg. En slik dose kan f.eks. bli gitt fra 1 til 5 ganger daglig. For intravenøse injeksjoner er en egnet daglig dose fra 0,0001 til 1 mg/kg kroppsvekt, fortrinnsvis fra 0,0001 til 0,1 mg/kg kroppsvekt. En daglig dose kan bli administrert som en enkel dose eller i henhold til et oppdelt doseskjema.

Typisk kan en dose til å behandle menneskepasienter ligge i området fra omkring 10 mg til omkring 1000 mg av en forbindelse ifølge oppfinnelsen. En typisk dose kan være omkring 100 mg til omkring 300 mg av forbindelsen. En dose kan bli administrert en gang daglig (QID), to ganger daglig (BID) eller hyppigere avhengig av dens farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper innbefattende absorpsjon, fordeling, metabolisme og ekskresjon av den aktuelle forbindelsen. I tillegg kan toksisitetsfaktorer påvirke doseringen i inntatt daglig eller mindre hyppig for en spesiell tidsperiode. Regimet kan bli gjentatt et antall av behandlingsrunder.

En forbindelse formuleres for anvendelse som en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk sammensetning også omfattende et farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabelt bæremiddel eller fortynningsmiddel. Sammensetningene blir typisk fremstilt ved å følge konvensjonelle metoder og blir administrert i en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk egnet form. Forbindelsen kan bli administrert i enhver konvensjonell form f.eks. som følger:

A) Oralt, f.eks. som tabletter, belagte tabletter, drageer, trocheer, sugetabletter, vandige eller oljebaserte suspensjoner, flytende oppløsninger, dispergerbare pulvere eller granuler, emulsjoner, harde eller myke kapsler eller siruper eller eliksirer. Sammensetninger tiltenkt for oral bruk kan bli fremstilt i henhold til enhver metode som er kjent innen faget for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger, og slike sammensetninger kan inneholde ett eller flere midler valgt fra gruppen bestående av søtningsmidler, smaksstoffer, fargestoffer og preserveringsmidler for å gi farmasøytisk elegante og smakelige preparater.

Tabletter inneholder den aktive bestanddel i blanding med ikke-toksiske, farmasøytisk akseptable eksipienter som er egnet for fremstilling av tabletter. Disse eksipienter kan f.eks. være inerte fortynningsmidler så som kalsiumkarbonat, natriumkarbonat, laktose, dekstrose, sakkarose, cellulose, maisstivelse, potetstivelse, kalsiumfosfat eller natriumfosfat; granulerings- og desintegreringsmidler, f.eks. maisstivelse, algininsyre, alginater eller natriumstivelsesglykolat; bindemidler f.eks. stivelse, gelatin eller akasia; smøremidler f.eks. silika, magnesium- eller kalsiumstearat, stearinsyre eller talkum; brusende blandinger; fargestoffer, søtningsmidler, fuktemidler så som lekitin, polysorbater eller laurylsulfat. Tablettene kan være ubelagte eller de kan bli belagt via kjente teknikker for å forsinke disintegrasjon og adsorpsjon i mage/tarmkanalen og derved gi en vedvarende virkning over en lengre periode. For eksempel kan et tidsforsinkende materiale så som glyserylmonostearat eller glyseryldistearat bli benyttet. Slike preparater kan bli fremstilt på kjent måte, f.eks. ved hjelp av blanding, granulering, tablettering, sukkerbelegging eller filmbeleggende prosesser.

Formuleringer for oral bruk kan også bli presentert som harde gelatinkapsler hvor den aktive bestanddel er blandet med et inert fast fortynningsmiddel, f.eks. kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat eller kaolin, eller også som myke gelatinkapsler hvor den aktive bestanddel er til stede som sådan eller blandet med vann eller en oljeemulsjon, f.eks. peanøttolje, flytende parafin eller olivenolje.

Vandige suspensjoner inneholder de aktive materialer i blanding med eksipienter som er egnet for fremstilling av vandige suspensjoner. Slike eksipienter er suspensjonsmidler, f.eks. natriumkarboksymetylcellulose, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumalginat, polyvinylpyrrolidon, tragakant-gummi og akasiagummi; dispergerings- eller fuktemidler kan være naturlig forekommende fosfatider, f.eks. lekitin, eller kondensasjonsprodukter av et alkylenoksyd med fettsyrer, f.eks. polyoksyetylenstearat, eller kondensasjonsprodukter av etylenoksyd med langkjedete alifatiske alkoholer, f.eks. heptadekaetylenoksycetanol eller kondensasjonsprodukter av etylenoksyd med delvise estere avledet fra fettsyrer og en heksitol så som polyoksyetylensorbitol-monooleat, eller kondensasjonsprodukter av etylenoksyd med delvise estere avledet fra fettsyrer og heksitol anhydrider f.eks. polyokyetylen sorbitan monooleat.

Nevnte vandige suspensjoner kan også inneholde ett eller flere preserveringsmidler, f.eks. etyl eller n-propyl p-hydroksybenzoat, ett eller flere fargestoffer så som sukrose eller sakkarin.

Oljeholdige suspensjoner kan bli formulert ved å suspendere den aktive bestanddel i en vegetabilsk olje, f.eks. arakisolje, olivenolje, sesam- eller kokosnøttolje eller i en mineralolje så som flytende parafin. De oljeholdige suspensjoner kan inneholde et fortykningsmiddel, f.eks. bivoks, hard parafin eller cetylalkohol.

Søtningsstoffer så som dem nevnt ovenfor samt smaksstoffer kan bli tilsatt for å gi et smakelig oralt preparat. Disse sammensetninger kan bli preservert ved denne tilsetningen av en antioksidant så som askorbinsyre. Dispergerbare pulvere og granuler som er egnet for fremstilling av en vandig suspensjon ved tilsetning av vann gir den aktive bestanddel i blanding med et dispergerings- eller fuktemiddel, et suspensjonsmiddel og ett eller flere preservativer. Passende dispergerings- eller fuktemidler og suspensjonsmidler er eksemplifisert av dem allerede nevnt ovenfor. Ytterligere eksipienter, f.eks. søtstoffer, smaks- og fargemidler kan også være til stede.

De farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan også være i form av olje-i-vann-emulsjoner. Oljefasen kan være en vegetabilsk olje f.eks. olivenolje eller arakisoljer, eller en mineralolje f.eks. flytende parafin eller blandinger av disse. Passende emulgeringsmidler kan være naturlig forekommende gummier, f.eks. akasiagummi eller tragakantgummi, naturlig forekommende fosfatider f.eks. soyabønnelekitin, samt estere eller partielle estere avledet fra fettsyrer og heksitolanhydroder, f.eks. sorbitanmonooleat, og kondensasjonsprodukter av nevnte partielle estere med etylenoksyd, f.eks. polyoksyetylensorbitanmonooleat. Emulsjonen kan også inneholde søtnings- og smaksstoffer. Siruper og eliksirer kan bli formulert med søtningsstoffer, f.eks. glyserol, sorbitol eller sukkrose. Spesielt kan en sirup for diabetiske pasienter inneholde som bæremidler kun produkter, f.eks. sorbitol, som ikke metaboliserer til glukose eller som kun metaboliserer i en svært liten mengde til glukose.

Slike formuleringer kan også inneholde en demulgeringsmiddel, et preservativ og smaks- og fargestoffer;

B) Parenteralt, enten subkutant eller intravenøst eller intramuskulært eller intrasternalt, eller ved infusjonsteknikker, i form av sterile injiserbare vandige eller oleaginøse suspensjoner. Denne suspensjon kan bli formulert i henhold til kjent teknikk ved å bruke de egnede dispergerings- eller fuktemidler og suspensjonsmidler som har blitt nevnt ovenfor. Det sterile injiserbare preparat kan også være en steril, injiserbar oppløsning eller suspensjon i et ikke-toksisk, parenteralt akseptabelt fortynnings- eller oppløsningsmiddel, f.eks. en oppløsning i 1,3-butadiol.

Blant de akseptable vehikler og oppløsningsmidler som kan bli benyttet, er vann, Ringers oppløsning og isoton natriumkloridoppløsning. I tillegg blir sterile, fikserte oljer konvensjonelt anvendt som et oppløsningsmiddel eller suspenderende medium. For dette formål kan enhver glatt fiksert olje bli benyttet innbefattende syntetiske mono- eller diglyserider. I tillegg finner fettsyrer så som oleinsyre anvendelse i preparater av injiserbare materialer.

C) Ved inhalering i form av aerosoler eller oppløsninger for nebulisatorer.

D) Rektalt i form av suppositorier fremstilt ved å blande medikamentet med en egnet ikke-irriterende eksipient som er fast ved vanlig temperatur, men flytende ved rektaltemperatur og som følgelig vil smelte i rektum for å frigjøre medikamentet. Slike materialer er kokossmør og polyetylenglykoler.

E) Topisk i form av kremer, salver, geler, kolliriumer, oppløsninger eller suspensjoner.

F) Vaginalt i form av pessarer, tamponger, kremer, geler, pastaer, skum eller sprayformuleringer som inneholder, i tillegg til den aktive bestanddel, slike bærematerialer som er kjent innen faget fr å være passende.

Preparater med vedvarende frigjøring av en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt. Passende eksempler på preparater med vedvarende frigjøing innbefatter semipermeable matriser av faste hydrofobe polymerer inneholdende en forbindelse av Formel I, hvilke matriser er i form av formede artikler, f.eks. filmer eller mikrokapsler. Eksempler på matriser med vedvarende frigjøring innbefatter polyestere, hydrogeler (f.eks. poly(2-hydroksyetyl-metarkylat) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (U.S. patent nr. 3.773.919), kopolymerer av L-glutaminsyre og gammaetyl-L-glutamat, ikke-nedbrytbar etylen-vinyl-acetat, nedbrytbare melkesyreglykolsyre kopolymerer så som LUPERON DEPOTTM (injiserbare mikrokuler bestående av melkesyre-glykolsyre kopolymer og leuprolidacetat) og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre.

En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske midler for behandling av en sykdom eller lidelse beskrevet heri så som en hyperproliferativ sykdom (f.eks. kreft). I visse utførelsesformer blir en forbindelse ifølge oppfinnelsen kombinert i en farmasøytisk kombinasjonsformulering eller et doseringsregime som kombinasjonsterapi, med en andre forbindelse som har anti-hyperproliferative egenskaper eller som er anvendelig til behandling av en hyperproliferativ sykdom (f.eks. kreft). Den andre forbindelsen av den farmasøytiske kombinasjonsformulering har fortrinnsvis komplementære aktiviteter til forbindelsen ifølge oppfinnelsen slik at de ikke påvirker hverandre på ugunstig måte. Slike forbindelser er passende til stede i kombinasjonen i en mengde som er effektiv for det tiltenkte formål. I en utførelsesform omfatter en sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse en forbindelse ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel så som beskrevet heri.

Kombinasjonsterapien kan bli administrert som et samtidig eller sekvensielt regime. Når administrert sekvensielt, kan kombinasjonen bli administrert i to eller flere administreringer. Den kombinerte administrasjon innbefatter koadministrasjon, ved å bruke separate formuleringer eller en enkelt farmasøytisk formulering, samt etterfølgende administrasjon i enhver rekkefølge, hvor det fortrinnsvis er en tidsperiode mens begge (eller alle) aktive midler samtidig utøver sine biologiske aktiviteter.

Passende doser av enhver av de ovenfor nevnte koadministrerte midler er slike som for tiden anvendes og som kan bli senket grunnet den kombinerte virkning (synergi) av det nylig identifiserte middel og andre kjemoterapeutiske midler eller behandlinger.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere beskrevet i Eksemplene som følger:

Referanseeksempel 1: 2,4-diklor-tieno[3,2-d]pyrimidin (VIII)

En blanding av metyl-3-amino-2-tiofenkarboksylat (13,48 g, 85,85 mmol) og urea (29,75 g, 5 eq) ble varmet opp til 190ºC i 2 t. Den varme reaksjonsblandingen ble så helt opp i en natriumhydroksidløsning og ethvert uoppløselig materiale ble fjernet med filtrering. Blandingen ble så surgjort (HCl, 2 N) for å gi 1H-tieno[3,2-d]pyrimidin-2,4-dion (IX) som et hvitt presipitat, som ble samlet opp med filtrering og lufttørket (9,49 g, 66%).

1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) 6,90 (1H, d, J=5.2Hz), 8,10 (1H, d, J=5,2Hz), 11,60-11,10 (2H, br s).

En blanding av 1H-tieno[3,2-d]pyrimidin-2,4-dion 9,49 g, 56,49 mmol) og fosforoksyklorid (150 ml) ble oppvarmet ved tilbakeløp i 6 t. Reaksjonsblandingen ble så avkjølt 1H-tieno[3,2-d]pyrimidin-2,4-dionog helt opp i is/vann med kraftig omrøring for å gi et presipitat. Blandingen ble så filtrert for å gi 2,4-diklor-tieno[3,2-d]pyrimidin (VIII) som et hvitt fast stoff (8,68 g, 75%).

1H NMR (400 MHz, CDCl3) 7,56 (1H, d, J=5,5Hz), 8,13 (1H, d, J=5,5Hz).

Referanseeksempel 2: 2-klor-4-morfolin-4-yl-tieno[3,2-d]pyrimidin (VII)

En blanding av 2,4-diklor-tieno[3,2-d]pyrimidin (VIII) (8,68 g, 42,34 mmol), morfolin (8,11 ml, 2,2 eq) og MeOH (150 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 1 t. Reaksjonsblandingen ble så filtrert, vasket med vann og MeOH for å gi tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (11,04 g, 100%).

1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) 3,74 (4H, t, J=4,9Hz), 3,90 (4H, t, J=4,9Hz), 7,40 (1H, d, J=5,6Hz), 8,30 (1H, d, J=5,6Hz).

Referanseeksempel 3: 2-klor-4-morfolin-4-yl-tieno[3,2-d]pyrimidin-6-karbaldehyd (II)

(

Til en suspensjon av 2-klor-4-morfolin4-yl-tieno[3,2-d]pyrimidin (VII) (1,75 g, 6,85 mmol) i tørr THF (40 ml) ved -78ºC ble det tilsatt en 2,5 M oppløsning av nBuLi i heksan (3,3 ml, 1,2 eq). Etter omrøring i 1 t ble tørr DMF (796 µl, 1,5 eq) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 t ved -78ºC og så oppvarmet sakte til romtemperatur. Etter ytterligere 2 t ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen helt opp i is/vann for å gi et gult presipitat. Dette ble samlet opp med filtrering og lufttørket for å gi tittelforbindelsen (1,50 g, 77%)

1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) 3,76 (4H, t, J=4,9), 3,95 (4H, t, J=4,9), 8.28 (1H, s), 10,20 (1H, s).

Referanseeksempel 4: 2-klor-6-(4-metansulfonyl-piperazin-1-ylmetyl)-4-morfolin-4-yl-tieno[3,2-d]pyrimidin (VI)

N-BOC-piperazin og metansulfonylklorid ble reagert sammen i diklormetan og trietylamin for å gi 4-metansulfonyl-piperazin-1-karboksylsyre tert-butyl-ester. Spalting av BOC beskyttelsesgruppen ved å bruke HCl (2 M) i diklormetan gav 1-metansulfonyl-piperazin-HCl-salt.

En blanding av 2-klor-4-morfolin-4-yl-tieno[3,2-d]pyrimidin-6-karbaldehyd (II) (1,00 g), 1-metansulfonyl-piperazin (750 mg) og trimetylortoformat (3,80 ml) ble omrørt i 1,2-dikloretan (30 ml) i 6 timer ved romtemperatur. Til dette ble det tilsatt natriumtriacetoksyborhydrid (900 mg) og reaksjonsblandingen ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble så stoppet med saltlake, ekstrahert med diklormetan, tørket (MgSO4) og oppløsningsmiddelet fjernet in vakuo. Residuet med triturert med varm etylacetat for å gi tittelforbindelsen (VI) som et hvitt fast stoff (1,01 g).

Referanseeksempel 5: 4-(4,4,5,5-tetrametyl-[1,3,2]dioksaborolan-2-yl)-1H-indazol (IVa) – rute 1

Til en oppløsning av 3-brom-2-metylanilin (5,0 g, 26,9 mmol) i kloroform (50 ml) ble det tilsatt kaliumacetat (1,05 eq, 28,2 mmol, 2,77 g). Eddiksyreanhydrid (2,0 eq, 53,7 mmol, 5,07 ml) ble tilsatt med samtidig kjøling i isvann. Blandingen ble så omrørt ved romtemperatur i 10 minutter hvorpå et hvitt gelatinøst faststoff dannet seg. 18-kron-6 (0,2 eq, 5,37 mmol, 1,42 g) ble så tilsatt fulgt av iso-amylnitritt (2,2 eq, 59,1 mmol, 7,94 ml) og blandingen ble oppvarmet under tilbakeløp i 18 t. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøle seg og ble fordelt mellom kloroform (3 x 100 ml) og mettet vandig natriumhydrogenkarbonat (100 ml). De kombinerte organisk ekstrakter ble vasket med saltlake (100 ml), separert og tørket (MgSO4).

Grovproduktet ble inndampet på silika og renset med kromatografi under eluering med 20%→40% EtOAc-petroleum for å gi 1-(4-brom-indazol-1-yl)-etanon (A) (3,14 g, 49%) som orange fast stoff, og 4-brom-1H-indazol (B) (2,13 g, 40%) som et blekt oransje fast stoff.

A 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 2,80 (3H, s), 7,41 (1H, t, J=7,8Hz), 7,50 (1H, d, J=7,8Hz), 8,15 (1H, s), 8,40 (1H, d, J=7,8Hz).

B: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 7,25 (1H, t, J=7,3Hz), 7,33 (1H, d, J=7,3Hz), 7,46 (1H, d, J=7,3Hz), 8,11 (1H, s), 10,20 (1H, br s),

Til en oppløsning av 1-(4-brom-indazol-1-yl)-etanon (3,09 g, 12,9 mmol) i MeOH (5 ml) ble det tilsatt 6N vandig HCl (30 ml) og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 7 t. MeOH-et ble inndampet og blandingen fordelt mellom EtOAc (2 x 50 ml) og vann (50 ml). De sammenslåtte organiske lag ble vasket med saltlake (50 ml), adskilt og tørket (MgSO4). Oppløsningsmiddelet ble fjernet med inndamping under redusert trykk for å gi 4-brom-1H-indazol (2,36 g, 93%).

Til en oppløsning av 4-brom-1H-indazolet (500 mg, 2,54 mmol) og bis(pinacolato)dibor (1,5 eq, 3,81 mmol) i DMSO (20 ml) ble det tilsatt kaliumacetat (3,0 eq, 7,61 mmol, 747 mg; tørket i tørkepistol) og PdCl2(dppf)2(3 mol%, 0,076 mmol, 62 mg). Blandingen ble avgasset med argon og oppvarmet til 80ºC i 40 t. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøle seg og fordelt mellom vann (50 ml) og eter (3 x 50 ml). De sammenslåtte organiske lag vasket med saltlake (5 ml), separert og tørket (MgSO4). Grovmaterialet ble renset med kromatografi under eluering med 3%→40% EtOAc-petroleum for å gi en ikke-delbar 3:1-blanding av 4-(4,4,5,5-tetrametyl-[1,3,2]diokaborlan-2-yl)-1H-indazol (369 mg, 60%) og indazol (60 mg, 20%); hvor tittelforbindelsen (IVa) ble isolert som en gul gummi som solidifiserte ved oppbevaring for å gi et off-hvitt fast stoff.

1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) 1,41 (12H, s), 7,40 (1H, dd, J=8,4Hz, 6,9Hz), 7,59 (1H, d, J=8,4Hz), 7,67 (1H, d, J=6,9Hz), 10,00 (1H, br s), 8,45 (1H, s), og indazol: 7,40 (1H, t), 7,18 (1H, t, J=7,9Hz), 7,50 (1H, d, J=9,1Hz), 7,77 (1H, d, J=7,9Hz), 8,09 (1H, s). Urenhet ved 1,25.

Referanseeksempel 6: 4-(4,4,5,5-tetrametyl-[1,3,2]dioksoborolan-2-yl)-1H-indazol (IVa) – rute 2

(IVa) (69)

Til en oppløsning av 2-metyl-3-nitroanilin (2,27 g, 14,91 mmol) i eddiksyre (60 ml) ble det tilsatt en oppløsning av natriumnitritt (1,13 g, 1,1 eq) i vann (5 ml). Etter 2 t ble den dyp røde oppløsningen helt opp i is/vann og det resulterende presipitat ble samlet opp med filtrering for å gi 4-nitro-1H-indazol (67) (1,98 g, 81%).

En blanding av 4-nitro-1H-indazol (760 mg, 4,68 mmol) palladium på trekull (10%, kat.) og etanol (30 ml) ble omrørt under en ballong av hydrogen i 4 t. Reaksjonsblandingen ble så filtrert gjennom celitt og oppløsningsmiddelet ble fjernet in vacuo for å gi 1H-indazol-4-ylamin (68) (631 mg, 100%).

En vandig oppløsning av natriumnitritt (337 mg, 4,89 mmol) i vann (2 ml) ble tilsatt dråpevis til en suspensjon av 1H-indazol-4-ylamin (631 mg, 4,74 mmol) i 6 M saltsyre (7,2 ml) ved under 0ºC. Etter omrøring i 30 minutter ble natriumtetrafluorbrat (724 mg) tilsatt til reaksjonsblandingen. En viskøs oppløsning resulterte som ble filtrert og vasket kort med vann for å gi 1H-indazol-4-diazoniumtetrafluorborat-salt (69) (218 mg, 20%) som et dyp rødt fast stoff.

Tørr MeOH (4 ml) ble spylt med argon i 5 minutter. Til dette ble det tilsatt 1H-indazol-4-diazoniumtetrafluorborat-salt (218 mg, 0,94 mmol), bis-pinacolatodibor (239 mg, 1,0 eq.) og [1,1’-bis(difenylfosfino)ferrocen]palladium-(II)-klorid (20 mg). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 5 t og så filtrert gjennom celitt. Residuet ble renset ved å bruke flashkromatografi for å gi den ønskede tittelforbindelsen (IVa) (117 mg).

Referanseeksempel 7: 2-(1H-indazol-4-yl)-4-morfolin-4-yl-tieno[3,2-d] pyrimidin-6-karbaldehyd (III)

En blanding av 2-klor-4-morfolin-4-yl-tieno[3,2-d]pyrimidin-6-karbaldehyd (II) (100 mg, 0,35 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametyl-[1,3,2]dioksaborolan-2-yl)-1H-indazol (70) (95 mg, 0,39 mmol) og natriumkarbonat (112 mg) ble suspendert i toluen (2,5 ml), etanol (1,5 ml) og vann (0,7 ml). Til dette ble det tilsatt bis(trifenylfosfin)palladium(II)klorid (13,5 mg) og reaksjonskammeret ble spylt med argon. Reaksjonsblandingen ble mikrobølgebehandlet ved 120ºC i 1 t og så fordelt mellom DCM og vann, hvor det organiske lag ble vask med saltlake, tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet in vacuo. Det resulterende residuum ble renset ved å bruke flash-kromatografi for å gi tittelforbindelsen (III) (97 mg).

Eksempel 1: 2-(1H-indazol-4-yl)-6-(4-metansulfonyl-piperazin-1-ylmetyl)-4-morfolin-4-yl-tieno[3,2-d]pyrimidin (I)

En blanding av 2-klor-6-(4-metansulfonyl-piperazin-1-ylmetyl)-4-morfolin-4-yltieno[3,2-d]pyrimidin (2,00 g), 4-(4,4,5,5-tetrametyl-[1,3,2]dioksaborolan-2-yl)-1H-indazol (2,26 g), toluen (24 ml), etanol (12 ml), vann (6 ml), natriumkarbonat (1,72 g) og PdCl2(PPh3)2(325 mg) ble varmet opp til 130ºC i mikrobølge i 90 minutter.

Reaksjonsblandingen ble avkjølt, fortynnet med kloroform, vasket med saltlake, tørket (MgSO4) og oppløsningsmiddelet fjernet in vacuo. Residuet ble renset ved å bruke flashkromatografi (etylacetat og så 5% etylacetat/metanol) og så triturering med eter ga den ønskede tittelforbindelsen (1,4 g).

MS-data: (ESI+):MH+514NMR data: (CDCl3): 2,67-2,71 (4H, m), 2,81 (3H, s), 3,29-3,33 (4H, m), 3,89 (2H, s), 3,89-3,93 (4H, m), 4,08-4,12 (4H, m), 7,41 (1H, s), 7,51 (1H, t, J=7,2), 7,60 (1H, d, J=8,3), 8,28 (1H, d, J=7,5), 9,02 (1H, s), 10,10 (1H, br).

Eksempel 2: 2-(1H-indazol-4-yl)-6-(4-metansulfonyl-piperazin-1-ylmetyl)-4-morfolin-4-yl-tieno[3,2-d]pyrimidin bismesylat

Til 2-(1H-indazol-4-yl)-6-(4-metansulfonyl-piperazin-1-ylmetyl)-4-morfolin-4-yltieno[3,2-d]pyrimidin (2,00 g, 3,89 mmol) i diklormetan (50 ml) og metanol (20 ml) ble det tilsatt metansulfonsyre (2 ekv., 505 µl). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur i løpet av hvilken tid et hvitt presipitat gradvis falt ut. Flyktige stoffer ble fjernet in vacuo, residuet ble triturert med dietyleter, oppløsningsmiddelet dekantert og faststoffet tørket under vakuum for å gi tittelforbindelsen (2,70 g).

NMR (400 MHz, DMSO). Innbefatter de følgende signaler

2,32 (s, 6H), 3,00 (s,3H), 3,84-3,86(4H,m). 4,09-4,11(4H,m), 8,8)(1H,s).

Eksempel 3: Biologisk testing

En forbindelse ifølge oppfinnelsen, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble underkastet de følgende serier av biologiske assays:

(i) P13K Biokjemisk Undersøkelse

Forbindelsens inhibering av P13K ble bestemt i et radiometrisk assay ved å bruke renset, rekombinant enzym og ATP ved en konsentrasjon på 1 µM. Forbindelsen ble fortynnet serielt i 100% DMSO. Kinasereaksjonen ble inkubert i 1 t ved romtemperatur og reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av PBS. IC50-verdier ble derpå bestemt ved å bruke sigmoidalt tilpasset doseresponskurve (variabel helning). Forbindelsen hadde en IC50mot P13K på mindre enn 0,1 µM.

(ii) Cellulær Proliferasjonsinhibering

Celler ble sådd ut ved optimal tetthet i en 96 brønners plate og ble inkubert i 4 dager ved nærvær av forsøksforbindelse. Alamar BlueTM ble deretter tilsatt til assaymediet og celler ble inkubert i 6 t før avlesing ved 544 nm eksitering, 590 nm emisjon. EC50-verdier ble regnet ut ved å bruke en sigmoidal doserespons kurvetilpasning. Forbindelsen hadde en EC50på 50 µM eller mindre i området hos de anvendte cellelinjer.

(iii) Caco-2-permeabilitet

Caco-2-celler ble sådd ut på Millipore Multiscreen-plater ved 1 x 105 celler/cm2 og ble dyrket i 20 dager. Undersøkelse av forbindelsespermeabilitet ble deretter utført. Forbindelsene ble påført til den apikale overflate (A) av cellemonolag og forbindelsesinntrengning i det basolaterale (B) rom ble målt. Dette ble utført i motsatt retning (B-A) for å undersøke aktiv transport. En permeabilitetskoeffisient-verdi, Papp, for hver forbindelse, som er et mål for inntrengningshastigheten av forbindelsen over membranen, ble regnet ut. Forbindelser ble gruppert i lavt (Papp</= 1,0 x 106 cm/s) eller høyt (Papp>/= 1,0 x 106 cm/s) absorpsjonspotensiale basert på sammenligning med kontrollforbindelser med etablert human absorpsjon.

For undersøkelse av en forbindelses egenskap å undergå aktiv utstøtning ble forholdet mellom basolateral (B) og apikal (A) (Papp<//= 1,0 x 106 cm/s) transport sammenlignet med A til B bestemt. Verdier av B-A/A-B >/= 1,0 indikerte opptreden av aktiv cellulær utstøtning. De hadde Papp-verdier >/= 1,0 x 106 cm/s.

(iv) Hepatocytt-klaring

Suspensjoner av krytopreserverte humane hepatocytter ble benyttet. Inkuberinger ble uført ved forbindelseskonsentrasjoner på 1 mM eller 3 µM ved en celletetthet på 0,5 x 106 levedyktige celler/ml. DMSO sluttkonsentrasjonen i inkuberingen av 0,25%. Kontrollinkuberinger ble også utført ved fravær av celler for å vise enhver ikke-enzymatisk nedbrytning. Duplikatprøver (50 µl) ble fjernet fra inkuberingsblandingen ved 0, 5, 10, 20, 40 og 60 minutter (kontrollprøve ved kun 60 minutter) og tilsatt til MeOH - inneholdende internstandard (100 µl) – for å avslutte reaksjonen. Tolbutamid. 7-hydroksycumarin, og testosteron ble brukt som kontrollforbindelser. Prøver ble sentrifugert og supernatantene ved hvert tidspunkt slått sammen for analyse med LC-MSMS. Fra en kurve av ln topparealeforhold (opprinnelig forbindelse toppareale/internstandard toppareale) mot tiden, ble utgangsfjerningen (CLint) regnet ut som følger: CLint(µl/min/millioner celler) = V x κ, hvor κ er fjerningshastighetskonstanten oppnådd fra gradienten av ln konsentrasjon nedtegnet mot tiden; V er et volumuttrykk avledet fra inkuberingsvolumet og er uttrykt som µl 106 celler-1.

På basis av lav (CL </= 4,6 µl/min/106 celler), middels (CL >/= 4,6; </= 25,2 µl/min/106 celler) og høy (CL >/= 25,2 µl/min/106 celler) klaring ble forbindelsen ifølge oppfinnelsen bestemt å ha lav hepatocyttklaring.

(v) Cytokrom P450-inhibering

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble undersøkt mot fem CYP450-mål (1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4) ved 10 konsentrasjoner i duplikat med en toppkonsentrasjon på 100 µM som ble brukt. Standard inhibitorer (furafylllin, sulfafenazol, tranylcypromin, quinidin, ketokonazol) ble bruk som kontroller. Plater ble avlest ved å bruke BMG Lab Technologies PolarStar i fluorescensmodus. Forbindelsen oppviste svak aktivitet (IC50>/= 5 µM) mot alle isoformer av CYP450.

(vi) Cytokrom P450-induksjon

Ferskt isolerte humane hepatocytter fra en enkelt donor ble dyrket i 48 t før tilsetning av forsøksforbindelse ved trekonsentrasjoner, og ble inkubert i 72 t. Forsøkssubstrater for CYP3A4 og CYP1A2 ble tilsatt ved 30 minutter og 1 t før slutten av inkuberingen. Ved 72 t ble celler og medium fjernet og graden av metabolisering og hvert forsøkssubstrat mengdebestemt med LC-MS/MS. Forsøket ble kontrollert ved å bruke indusere for de enkelte P450-forbindelser inkubert ved en konsentrasjon i triplikat. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen viste neglisjerbare effekter på induksjon av cytokrom P450-enzymer.

(vii) Plasmaprotein-binding

Oppløsninger av forsøksforbindelse (5 µM, 0,5 % DMSO sluttkonsentrasjon) ble fremstilt i buffer og 10% plasma (v/v i buffer). En 96-brønners HT dialyseplate ble satt sammen slik at hver brønn ble delt i to av en semi-permeabel cellulosemembran. Bufferoppløsningen ble tilsatt til en side av membranen og plasmaoppløsningen til den andre siden; inkuberinger ble så utført ved 37ºC over 2 t i triplikat. Cellene ble derpå helt ut og oppløsningene for hver mengde av forbindelser ble kombinert i to grupper (plasma-fri og plasma-inneholdende) og så analysert med LC-MSMS ved å bruke to sett av kalibreringsstandarder for plasma-fri (6 punkter) og plasma-inneholdende oppløsninger (7 punkter). Verdien for den ubundne fraksjon av forbindelsen ble regnet ut: høyt proteinbundne forbindelser: (>/= 90% bundet) hadde en Fu </= 0,1. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen hadde en Fu-verdi >/= 0,1.

(viii) hERG kanalblokkering

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble evaluert for sin egenskap til å modulere rubidium-utstøtning fra HEK-294-celler som stabilt uttrykker hERG kaliumkanaler, ved å bruke etablert fluks-metodologi. Celler ble preparert i medium innholdende RbCl og ble utsådd i 96-brønners-plater og dyrket over natten for å danne monolag. Utstøtningsforsøket ble initiert ved å aspirere mediet og vaske hver brønn med 3 x 100 µl av preinkuberingsbuffer (inneholdende lav [K+] ved romtemperatur. Etter sluttaspireringen ble 50 µl arbeids stamforbindelse (2x) tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. 50 µl stimuleringsbuffer (inneholdende høy [K+]) ble så tilsatt til hver brønn for å gi forsøksforbindelse sluttkonsentrasjonene. Celleplater ble så inkubert ved romtemperatur i ytterligere 10 minutter. 80 µl supernatant fra hver brønn ble så overført til ekvivalente brønner er en 96-brønners plate og analysert via atomemisjonsspektroskopi. Forbindelsen ble utvalgt som 10pt duplikate IC50-kurver, n=2, fra en toppkonsentrasjon på 100 µM.

Eksempel 4: Tablettsammensetning

Tabletter som hver veier 0,15 g og som inneholder 25 mg av en forbindelse ifølge oppfinnelsen blir fremsilt som følger:

Sammensetning for 10.000 tabletter

Aktiv forbindelse (250 g)

Laktose (800 g)

Maisstivelse (415 g)

Talkumpulver (30 g)

Magnesiumstearat (5 g)

Den aktive forbindelse, laktose og halvdelen av maisstivelsen blandes. Blandingen blir så presset gjennom en sikt 0,5 mm mesh-størrelse. Maisstivelsen (10 g) suspenderes i varmt vann (90 ml). Den resulterende pasta benyttes for granulere pulveret. Granulatet tørkes og brekkes opp i små fragmenter på en sikt med 1,4 mm mesh-størrelse. Den gjenværende mengden av stivelse, talkum og magnesium tilsettes, blandes forsiktig og prosesseres til tabletter.

Eksempel 5: Injiserbar formulering

Formulering A

Aktiv forbindelse 200 mg

Saltsyreoppløsning 0,1 M eller

natriumhydroksidoppløsning 0,1 M q.s. til pH 4,0 til 7,0

Sterilt vann q.s. til 10 ml

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen oppløses i mesteparten av vannet (35º 40ºC) og pH justeres til mellom 4,0 og 7,0 med saltsyren eller natriumhydroksidet etter behov. Porsjonen blir så brakt opp til riktig volum med vann og filtrert gjennom et sterilt mikroporefilter in i en steril 10 ml ravglassampulle (type 1) og forsegles med sterile lukkinger og forseglinger.

Formulering B

Aktiv forbindelse 125 mg

Steril, pyrogenfritt, pH 7 fosfatbuffer, q.s. til 25 ml

Aktiv forbindelse 200 mg Benzylalkohol 0,10 g

Glykofurol 75 1,45 g

Vann for injeksjon q.s. til 3,00 ml

Den aktive forbindelsen oppløses i glykofurolen. Benzylalkoholen tilsettes derpå og oppløses, og vann tilsettes til 3 ml. Blandingen blir så filtrert gjennom et sterilt mikroporefilter og forsegles i sterile 3 ml glassampuller (type 1)

Eksempel 6: Sirupformulering

Aktiv forbindelse 250 mg Sorbitoloppløsning 1,50 g

Glyserol 2,00 g Natriumbenzoat 0,005 g

Smaksstoff 0,0125 ml

Renset vann q.s. til 5,00 ml

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen oppløses i en blanding av glyserolet og mesteparten av det rensede vannet. En vandig oppløsning av natriumbenzoatet blir så tilsatt til oppløsningen fulgt av tilsetning av sorbitaloppløsningen og til slutt smaksstoffet. Volumet justeres med renset vann og blandes godt.

Claims (15)

1. Pa ten tkra v 1. Forbindelse k a r a k t e r i s e r t v e d at den er et tienopyrimidin av formel (I):

   eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
2. 2. Forbindelse ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det farmasøytisk akseptable salt er valgt fra salter med saltsyre, bromsyre, jodsyre, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, maursyre, eddiksyre, trifluoreddiksyre, propionsyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, fumarsyre, maleinsyre, melkesyre, malinsyre, tartarsyre, sitronsyre, etansulfonsyre, asparaginsyre og glutaminsyre.
3. 3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, k a r a k t e r i s e r t v e d at det farmasøytisk akseptable salt er et mono-salt eller et bis-salt.
4. 4. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, k a r a k t e r i s e r t v e d at den er et mono-salt eller et bis-salt med metansulfonsyre, benzensulfonsyre, saltsyre, fosforsyre og svovelsyre.
5. 5. Forbindelse ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den er 2-(1H-indazol-4-yl)-6-(4-metansulfonylpiperazin-1-ylmetyl)-4-morfolin-4-yl-tieno[3,2-d]pyrimidinbismesylat.
6. 6. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at fremgangsmåten omfatter (a) å behandle en forbindelse av formel (III): med et amin av formel

   ved nærvær av et egnet reduksjonsmiddel eller (b) å behandle en forbindelse av formel (VI)

   med en borsyre eller ester derav av formel (IV): (IV)

   hvor hver R15 er H eller C1-C6alkyl eller de to grupper OR15 danner, sammen med boratomet til hvilket de er bundet, en pinacolatoboronat estergruppe, ved nærvær av en Pd-katalysator.
7. 7. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk akseptabelt salt ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at fremgangsmåten omfatter å behandle et tienopyrimidin av formel (I)

   med en passende syre i et egnet oppløsningsmiddel.
8. 8. Farmasøytisk sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel eller fortynningsmiddel samt, som en aktiv bestanddel, en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5.
9. 9. Sammensetning ifølge krav 8, k a r a k t e r i s e r t v e d at den er formulert for oral administrasjon.
10. 10. Forbindelse ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den er for anvendelse i en fremgangsmåte for behandling av et menneske eller et dyr ved terapi.
11. 11. Forbindelse ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den er for anvendelse ved behandling av en sykdom eller lidelse som stammer fra abnormal cellevekst, funksjon eller oppførsel assosiert med P13 kinase.
12. 12. Forbindelse for anvendelse ifølge krav 11, k a r a k t e r i s e r t v e d at sykdommen eller lidelsen er valgt fra kreft, immunsykdommer, kardiovaskulære sykdommer, virale infeksjoner, inflammasjon, metabolisme/endokrine sykdommer og nevrologiske sykdommer.
13. 13. Forbindelse for anvendelse ifølge krav 12, k a r a k t e r i s e r t v e d at kreften er valgt fra faste svulster i tarmen, brystet, hjernen, leveren, ovariene, lungen, hode og hals; gastriske svulster; glioblastoma, melanom, prostata, endometrial, hepatocellulære og tyroide krefttyper, samt kreft i livmor, prostata, testikkel, genitourinær-kanal, spiserør, strupe, glioblastom, nevroblastom, mage, hud, keratokantom, lunge, epidermoid karsinom, storcellekarsinom, ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC), småcellet karsinom, lungeadenokarsinom, ben, tykktarm, adenom, bukspyttkjertel, adenokarsinom, tyroid, follikulært karsinom, udifferensiert karsinom, papillært karsinom, seminom, melanom, sarkom, blærekarsinom, leverkarsinom og galleganger, nyrekarsinom, myeloide sykdommer, lymfoide sykdommer, hårceller, munnhule or farynx (oral), leppe, tunge, munn, farynx, tynntarm, tykktarm-rektum, tykktarm, rektum, hjerne og sentralnervesystem, Hodgkins og leukemi.
14. 14. Sett til behandling av en sykdom eller lidelse som stammer fra assosiert cellevekst, funksjon eller oppførsel assosiert med P13 kinase omfattende: (a) en første farmasøytisk sammensetning omfattende en forbindelse ifølge krav 1; (b) instruksjoner for anvendelse; og (c) en andre farmasøytisk sammensetning hvor den andre farmasøytiske sammensetningen omfatter en andre forbindelse med anti-hyperproliferativ aktivitet og hvor instruksjonene er for samtidig, sekvensiell eller separat administrasjon av nevnte første og andre farmasøytiske sammensetninger til en pasient som har behov for dette.
15. 15. Produkt omfattende (a) en forbindelse ifølge krav 1 og (b) en forbindelse som har anti-hyperproliferativ aktivitet for separat, samtidig eller sekvensiell administrasjon ved profylaktisk eller terapeutisk behandling av kreft.