NO331382B1

NO331382B1 - Farmasoytisk formulering som omfatter eksendin-4.

Info

Publication number: NO331382B1
Application number: NO20013468A
Authority: NO
Inventors: Orville G Kolterman; Andrew Young; Italien James J L
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-01-14
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2011-12-12
Also published as: NO20013468L; CY2007013I1; ES2244416T5; EP1609478A1; EP1140145B2; DE122007000001I1; LU91343I2; DE60021166T3; AU3581900A; BRPI0007820B8; CA2356706C; AU2005200206A1; NL300282I1; ATE299031T2; NZ512663A; BR0007820A; CN100356978C; DK1140145T4; US6902744B1; JP4426727B2

Abstract

Nye eksendin- og eksendinagonistforbindelses-formuleringer og doseringer og fremgangsmåter for administrering derav er tilveiebragt. Disse formuleringer og fremgangsmåter er anvendbare for behandling av diabetes og tilstander som vil dra fordel av nedsatt plasmaglukose eller utsatt og/eller forsinket gastrisk tømming eller inhibering av næringsinntak.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye eksendin-formuleringer som er bioaktive og kan avleveres via injiserbare ruter. Disse formuleringer er anvendbare i behandlingen av diabetes, inkluderende type I og II diabetes, i behandlingen av lidelser som vil ha nytte av administreringen av midler som er anvendbare i forbindelse med å utsette og/eller nedsette gastrisk tømming eller redusere næringsinntak.

Den etterfølgende beskrivelse inkluderer informasjon som kan være nyttig for å forstå den foreliggende oppfinnelse. Det er ikke en innrømmelse at noe av den informasjon tilveiebragt heri er kjent teknikk overfor de foreliggende oppfinnelser, eller relevant, heller ikke at noen av de spesifikt eller implisitt angitte publikasjoner er kjent teknikk.

Eksendinene er peptider som er funnet i spyttsekresjonene til Gilaøgle (giftøgle) og den meksikanske "vorteøgle", reptiler som er opprinnelig hjemmehørende i Arizona og nordre Mexico. Eksendin-3 [SEQ. ID. NO. 1: His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2]er til stede i spyttsekresjoner fra Heloderma horridum (meksikansk vorteøgle), og eksendin-4 [SEQ. ID. NO. 2: His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2]er til stede i spyttsekresjonen fra Heloderma suspectum (Gilaøgle) (Eng, J., et al. J. Biol. Chem., 265:20259-62, 1990, Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05, 1992). Aminosyresekvensen til eksendin-3 er vist i fig. 1. Aminosyresekvensen til eksendin-4 er vist i fig. 2. Eksendin-4 ble først ment å være en (eventuelt toksisk) komponent i giften. Det fremgår nå at eksendin-4 er uten toksisitet, og at den i stedet dannes i spyttkjertlene til Gilaøgle.

Eksendinene har noe sekvenslikhet med flere medlemmer av den glukagonlignende peptidfamilie, med den høyeste homologi, 53%, til GLP-1[7-36]NH2[SEQ. ID. NO. 3] (Goke et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55, 1993). GLP-1[7-36]NH2 er også kjent som proglukagon[78-107], eller simpelthen "GLP-1" anvendes oftest heri. GLP-1 har en insulinotropisk effekt, og stimulerer insulinsekresjon fra pankreatiske beta-celler. GLP-1 er også blitt rapportert til å inhibere glukagonsekresjon fra pankreatiske alfa-celler (Ørsov, et al., Diabetes, 42:658-61, 1993, D.AIessio, et al., J. Clin. Invest., 97:133-38, 1996). Aminosyresekvensen til GLP-1 er vist i fig. 3. GLP-1 er blitt rapportert til å inhibere gastrisk tømming (Willms B, et al., J Clin Endocrinol Metab 81 (1):327-32, 1996, Wettergren A, et al., Dig Dis Sei 38 (4):665-73, 1993), og magesyresekresjon (Schjoldager BT, et al., Dig Dis Sei 34 (5):703-8, 1989, 0'Halloran DJ, et al., J. Endocrinol 126 (1): 169-73, 1990, Wettergren A, et al, Dig Dis Sei 38 (4):665-73, 1993)). GLP-1 [7-37], som haren ytterligere glycinrest i sin karboksyterminus, stimulerer også insulinsekre-sjonen i mennesker (Ørsov, et al., Diabetes, 42:658-61, 1993). En transmembran G-protein adenylat-syklasekoplet reseptor som i det minste delvis sies å være ansvarlig for den insulinotropiske effekt av GLP-1 har som rapportert blitt klonet fra en beta-cellelinje (Thorens, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:8641-45, 1992).

GLP-1 har vært sentrum for signifikant undersøkelse i de senere år på grunn av rapporterte virkninger som amplifikasjon av stimulert insulinproduksjon (Byrne MM, Goke B. Lessons from human studies with glucagon-like peptid-1: Potential of the gut hormone for clinical use. I: Fehmann HC, Goke B. Insulinotropic Gut Hormone Glucagon-Like Peptide 1. Basel, Switzerland: Karger, 1997:219-33), inhiberingen av gastriske tømming (Wettergren A, et al., Truncated GLP-1 (proglukagon 78-107-amid) inhibits gastric and pancreatic functions in man, Dig. Dis. Sei. 1993 Apr,38(4):665-73), inhiberingen av glukagon sekresjon (Creutzfeldt WOC, et al., Glucagonostatic actions and reduction of fasting hyperglycemia by exogenous glucagon-like peptide 1(7-36) amide in type I diabetic patients, Diabetes Care 1996,19(6):580-6), og en påstått rolle i appetittkontroll (Turton MD, et al., A role for glucagon-like peptide-1 in the central regulation of feeding, Nature 1996 Jan,379(6560):69-72). GLP-1 er også blitt rapportert til å gjenopprette øyglukose-sensitivitet i aldrende rotter, gjenopprette deres glukosetoleranse til den hos yngre rotter (Egan JM, et al., Glucagon-like peptide-1 restores acute-phase insulin release to aged rats, Diabetologia 1997 June 40(Suppl 1):A130). Den korte varighet av biologisk virkning av GLP-1 in vivo er et trekk hos peptidet som har hindret dets utvikling som et terapeutisk middel.

Farmakologiske studier har vist både likheter og forskjeller mellom eksendin-4 og GLP-1. Eksendin-4 kan som rapportert virke ved GLP-1 reseptorer på insulin-utskillende (3TC1 celler, ved dispergerte acinære celler fra marsvinpankreas, og ved parietalceller fra magen. Peptidet er også rapportert til å stimulere somato-statinfrigjøring og inhibere gastrinfrigjøring i isolerte mager (Goke, et al., J. Biol. Chem. 268:19650-55,1993, Schepp et al., Eur. J. Pharmacol., 69:183-91, 1994, Eissele, et al., Life Sei., 55:629-34, 1994). Eksendin-3 og eksendin-4 ble som rapportert funnet til å stimulere cAMP produksjon i, og amylasefrigjøring fra, acinære pankreasceller (Malhotra, R., et al., Regulatory Peptides, 41:149-56, 1992, Raufman, et al., J. Biol. Chem. 267:21432-37, 1992, Singh, et al., Regul. Pept. 53:47-59, 1994). Eksendin-4 har også en signifikant lengre virknings- varighet enn GLP-1. I et forsøk ble f.eks. glukosenedsettelse ved eksendin-4 i diabetiske mus rapportert til å vedvare i flere timer, og, avhengig av dosen, i opptil 24 timer (Eng J. Prolonged effect of exendin-4 on hyperglycemia of db/db mus, Diabetes 1996 May, 45(Suppl 2):152A (abstract 554)). Basert på deres insulinotropiske aktiviteter, er anvendelse av eksendin-3 og eksendin-4 for behandlingen av diabetes mellitus og forebygging av hyperglykemi blitt foreslått (Eng, US patent nr. 5 424 286). C-terminalt trunkerte eksendinpeptider som eksendin-4[9-39], et karboksyamidert molekyl, og fragmenter 3-39 til 9-39 er blitt rapportert til å være potente og selektive antagonister av GLP-1 (Goke, et al., J. Biol. Chem. 268:19650-55, 1993, Raufman, J.P., et al., J. Biol. Chem. 266:2897-902, 1991, Schepp et al., Eur. J. Pharm., 269:183-91, 1994, Montrose-Rafizadeh, et al., Diabetes, 45(Suppl. 2):152A, 1996). Eksendin-4[9-39] sies å blokkere endogen GLP-1 in vivo, resulterende i redusert insulinsekresjon. Wang, et al., J. Clin. Invest., 95:417-21, 1995, D'Allesio, et al., J. Clin. Invest., 97:133-38, 1996). En reseptor som tilsynelatende er ansvarlig for den insulinotropiske effekt av GLP-1 i rotter er som rapportert blitt klonet fra pankreas celleøyer fra rotte (Thorens, B., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:8641-8645, 1992). Eksendiner og eksendin-4[9-39] sies å binde til den klonede rotte GLP-1 reseptor (pankreatisk p-celle GLP-1 reseptor fra rotte (Fehmann HC, et al., Peptides 15 (3):453-6,1994) og human GLP-1 reseptor (Thorens B, et al., Diabetes 42 (11): 1678-82, 1993)). I celler transfektert med den klonede GLP-1 reseptor, er eksendin-4 rapportert som en agonist, dvs. den øker cAMP, mens eksendin[9-39] er identifisert som en antagonist, dvs. den blokkerer de stimulerende virkninger av eksendin-4 og GLP-1. Id.

Eksendin-4[9-39] er også rapportert til å virke som en antagonist av full-lengde eksendinene, og inhiberer stimulering av acinære pankreasceller ved eksendin-3 og eksendin-4 (Raufman, et al., J. Biol. Chem. 266:2897-902, 1991, Raufman, et al., J. Biol. Chem. 266:21432-37, 1992). Det er også rapportert at eksendin[9-39] inhiberer stimuleringen av plasmainsulinnivået ved eksendin-4, og inhiberer de somatostatinfrigivelses-stimulerende og gastrinfrigivelses-inhiberende aktiviteter av eksendin-4 og GLP-1 (Kolligs, F., et al., Diabetes, 44:16-19, 1995, Eissele et al., Life Sei., 55:629-34, 1994). Eksendin[9-39] er blitt anvendt til å undersøke den fysiologiske relevans av sentral GLP-1 i kontroll av næringsinntak (Turton, M.D. et al. Nature 370:69-72, 1996). GLP-1 administrert ved intracerebroventrikulær injeksjon inhiberer næringsinntak i rotter. Denne metthetsinduserende effekt av GLP-1 avlevert ICV er rapportert til å inhiberes ved ICV injeksjon av eksendin[9-39] (Turton, supra). Det er imidlertid blitt rapportert at GLP-1 ikke inhiberer næringsinntak i mus når administrert ved perifer injeksjon (Turton, M.D., Nature 379:69-72, 1996, Bhavsar, S.P., Soc. Neurosci. Abstr. 21:460 (188.8), 1995).

Resultatene fra en undersøkelse om eksendiner er species-homologen av pattedyr GLP-1 ble rapportert av Chen og Drucker som klonet eksendingenet fra Gilaøgle (J. Biol. Chem. 272(7):4108-15 (1997)). Observasjonen om at Gilaøgle også har separate gener for proglukagoner (hvorfra GLP-1 er prosessert), som er mere lik pattedyr proglukagon enn eksendin, indikerer at eksendiner ikke er species-homologer av GLP-1.

Midler som tjener til å utsette gastrisk tømming har funnet en plass innen medisin som diagnostiske hjelpemidler i forbindelse med gastrointestinale radiologiske undersøkelser. Glukagon er f.eks. et polypeptidhormon som produseres ved hjelp av alfa-cellene i pankreatiske Langerhanske celleøyer. Det er et hyperglykemi-middel som mobiliserer glukose ved aktivering av hepatisk glykogenolyse. Det kan i mindre grad stimulere sekresjonen av pankreatisk insulin. Glukagon anvendes i behandlingen av insulinindusert hypoglykemi, f.eks. når administrering av glukose intravenøst ikke er mulig. Da glukagon imidlertid reduserer motiliteten av gastrointestinalkanalen anvendes det også som et diagnostisk hjelpemiddel i gastrointestinale radiologiske undersøkelser. Glukagon har blitt anvendt i en rekke studier for å behandle forskjellige smertefulle gastrointestinale lidelser assosiert med spasme. Daniel et al. (Br. Med. J., 3:720, 1974) rapporterte raskere symptomatisk lindring av akutt divertikulitt i pasienter behandlet med glukagon sammenlignet med dem som var blitt behandlet med analgesika eller antispasmemodika. En redegjørelse av Glauser, et al. (J. Am. Coll. Emergency Physns, 8:228, 1979) beskrev lindring av akutt øsofagus-næringsobstruksjon etter glukagonterapi. I et annet studium lindret glukagon signifikant smerte og ømhet i 21 pasienter med gallekanalsykdom sammenlignet med 22 pasienter behandlet med placebo (M.J. Stower, et al., Br. J. Surg., 69:591-2, 1982).

Fremgangsmåter for å regulere gastrointestinal motilitet ved anvendelse av amylinagonister er beskrevet i internasjonal søknad nr. PCT/US94/10225, publisert 16. mars 1995.

Fremgangsmåter for å regulere gastrointestinal motilitet ved anvendelse av eksendinagonister er beskrevet i US patentsøknad nr. 08/908 867, innsendt 8. august 1997 med tittel "Methods for Regulating Gastrointestinal Motility", hvis søknad er en continuation-in-part av US patentsøknad nr. 08/694 954, innsendt 8. august 1996.

Fremgangsmåter for å redusere næringsinntak ved anvendelse av eksendinagonister er beskrevet i US patentsøknad nr. 09/003 869, innsendt 7. januar 1998, med tittel "Use of Exendin and Agonists Thereof for the Reduction of Food Intake", med prioritet fra US søknad nr. 60/034 905, innsendt 7. januar 1997, 60/055 404 innsendt 7. august 1997, 60/066 442 innsendt 14. november 1997 og 60/066 029 innsendt 14. november 1997.

Eksendiner er også blitt rapportert til å ha inotropiske og diuretiske effekter som angitt i internasjonal søknad nr. PCT/US99/02554, innsendt 5. februar 1999, med prioritet fra søknad nr. 60/075 122, innsendt 13. februar 1998.

Nye eksendinagonistforbindelser er beskrevet i PCT-søknad nr. PCT/US98/16387, innsendt 6. august 1998 med tittel "Novel Exendin Agonist Compounds", med prioritet fra US patentsøknad nr. 60/055 404, innsendt 8. august 1997.

Andre nye eksendinagonister er beskrevet i PCT-søknad nr. PCT/US98/24210, innsendt 13. november 1998 med tittel "Novel Exendin Agonist Compounds", med prioritet fra US-søknad nr. 60/065 442 innsendt 14. november 1997.

Ytterligere nye eksendinagonister er beskrevet i PCT-søknad nr. PCT/US98/ 24273, innsendt 13. november 1998, med tittel "Novel Exendin Agonist Compounds", med prioritet fra US-søknad nr. 60/066 029, innsendt 14. november 1997.

WO 9830231 vedrører eksendinpeptider eller agonister derav til bruk for å redusere inntaket av mat.

WO 9746584 vedrører eksendinanaloger til bruk for behandling av diabetes.

Siden forekomsten av de første terapeutisk aktive peptider og proteiner fremstilt ved genteknologi, har der vært et stadig økende behov om å kunne avlevere disse legemidler ved hjelp ruter annet enn den parenterale. Dette er imidlertid blitt hindret ved selve egenskapene til peptider og proteiner som setter dem i en særstilling fra de små legemiddelmolekyler som er omfattende brukt i dag. Disse egenskaper inkluderer molekylstørrelse, tilbøyelighet til proteolytisk nedbrytning, hurtig plasma-clearance, spesielle dose-respons kurver, immunogenitet, bio-kompatibilitet og peptidenes og proteinenes tendenser til å gjennomgå aggre-gering, adsorpsjon og denaturering.

Det er generelt forstått at administreringen av peptidlegemidler ved hjelp av ruter annet enn subkutan eller intravenøs injeksjon, eller intravenøs infusjon, ofte ikke er praktisk på grunn av f.eks., i tilfellet av oral administrering, både enzymatisk nedbrytning og ikke-absorpsjon i gastrointestinalkanalen. Der fortsetter således å eksistere et behov for utviklingen av alternative metoder for den ubekvemme, noen ganger smertefulle, injeksjon for å administrere peptidlegemidler slik som eksendiner og peptideksendinagonistanaloger angitt over.

I henhold til ett aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse nye eksendin-4 formuleringer og doseringer derav som utviser fordelaktige egenskaper som inkluderer effektene med å nedsette gastrisk tømming og nedsette plasmaglukosenivåer. Dette aspekt av oppfinnelsen inkluderer således formuleringer av eksendin-4 som omfatter eksendin-4 blandet sammen med en buffer slik som en acetatbuffer, et iso-osmolalitets-modifiserende middel slik som mannitol og som også inneholder et preserveringsmiddel slik som m-kresol. Formuleringen har en pH mellom 4,0 og 6,0 (foretrukket mellom 4,0 og 5,0). Disse og ytterligere trekk ved oppfinnelsen er definert ved de i kravene anførte trekk.

Oppfinnelsen inkluderer således parenterale flytende doseringsformer som omfatter henholdsvis fra 0,005 til 0,4%, mere spesielt fra 0,005 til 0,02%, eller fra 0,005 til 0,05% (vekt/volum) av eksendin-4 i et vandig system sammen med fra 0,02 til 0,5% (vekt/volum) av en acetatbuffer, for å oppnå en pH i sluttblandingen fra pH 4,0 til 6,0, eller mere spesielt fra 4,0 til 5,0, så vel som fra 1,0 til 10%

(vekt/volum) av mannitol som flerverdig alkohol iso-osmolalitetsmodifiserende

middel. Opp til omtrent 0,9% saltoppløsning kan være til stede. Dette fører til en isotonisk eller en iso-osmolar oppløsning i en vandig kontinuerlig fase. Fra 0,005 til 1,0% (vekt/volum) av et anti-mikrobielt preserveringsmiddel slik som m-kresol er også til stede. Formuleringen kan emballeres i en flerbruksbeholder. En tilstrekkelig mengde vann for injeksjon kan tilsettes for å oppnå den ønskede konsentrasjon av oppløsningen. Natriumklorid såvel som andre eksipienser kan også om ønsket være til stede. Slike eksipienser må imidlertid opprettholde den totale stabilitet av den aktive bestanddel. Mannitol vil også være effektiv for å

stabilisere protein mot denaturering bevirket ved økt temperatur og ved frysing-tining eller frysetørkingsprosesser.

Formuleringen kan omfatte opp til 50 mg/ml av eksendin-4 i 30 mM acetatbuffer (pH omtrent 4,5) og mannitol, med et preserveringsmiddel.

Videre og innenfor oppfinnelsesrammen er foretrukne doseringer for eksendin-4 når gitt ved injeksjon. Formuleringer for eksendin-4 med sammenlignbar potens er således tilveiebragt for administreringen ved injeksjon på fra 0,1 til 0,5 ug pr. kg, gitt fra en til tre ganger pr. dag. Typisk, for pasienten med diabetes som veier i området fra omtrent 70 kg (gjennomsnitt for type 1 diabetiker) til omtrent 90 kg (gjennomsnitt for type 2 diabetiker), vil dette for eksempel resultere i den totale administrering av fra 10 til 120 ug pr. døgn i en enkeltdose eller i oppdelte doser. Dersom administrert i oppdelte doser, administreres dosene foretrukket to eller tre ganger pr. døgn, og mere foretrukket to ganger pr. døgn.

I en foretrukket injeksjonsprosedyre administreres eksendin-4 parenteralt, mere foretrukket ved injeksjon, f.eks. ved perifer injeksjon. Fra 1 ug til 30 ug til 1 mg av eksendin-4 administreres foretrukket pr. døgn. Mere foretrukket administreres fra 1-30 ug til 500 ug, eller fra 1-30 ug til 50 ug av eksendin-4 pr. døgn. Mest foretrukket, avhengig av vekten til individet og potensen til den administrerte forbindelse, administreres fra 3 ug til 50 ug av eksendin-4 pr. døgn. Foretrukne doser basert på pasientvekt strekker seg fra 0,005 ug/kg pr. dose til 0,2 ug/kg pr. dose. Mere foretrukket vil doser basert på pasientvekt strekke seg fra 0,02 ug/kg pr. dose til 0,1 ug/kg pr. dose. Mest foretrukket vil doser basert på pasientvekt strekke seg fra 0,05 \ sg/ kg pr. dose til 0,1 ug/kg pr. dose. Disse doser administreres fra 1 til 4 ganger pr. døgn, foretrukket fra 1 til 2 ganger pr. døgn. Doser av eksendin-4 vil normalt være lavere dersom de gis ved kontinuerlig infusjon. Doser av eksendin-4 vil normalt være høyere dersom de gis ved ikke-injeksjonsmetoder, som ved oral, bukkal, sublingval, nasal, pulmonal eller hudplaster-avlevering.

Den farmasøytiske formulering ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å behandle diabetes (inkluderende type 1 og type 2 diabetes), obesitas og andre tilstander som vil ha fordel av administrering av en terapi som kan nedsette gastrisk tømming, nedsette plasmaglukosenivåer og redusere næringsinntak. Formuleringen ifølge oppfinnelsen kan også anvendes for behandling av individer for å øke insulinsensitivitet. Eksendin-4 formuleringer og doseringer beskrevet heri kan anvendes for å øke sensitiviteten til et individ overfor endogent eller eksogent insulin.

Andre trekk og fordeler ved den foreliggende oppfinnelse vil fremgå fra den etterfølgende beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer derav, og fra kravene.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse og som anvendt heri, er de etterfølgende betegnelser definert til å ha de følgende betydninger dersom annet ikke er uttrykkelig angitt. "Farmasøytisk aksepterbart salt" inkluderer salter av forbindelsene avledet fra kombinasjonen av frie forbindelser og en organisk eller uorganisk syre. I praksis vil bruk av saltformen være ensbetydende med bruk av baseformen. Forbindelsene er anvendbare i både fri baseform og saltform, idet begge former betraktes til å være innenfor oppfinnelsesrammen.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser aminosyresekvensen for eksendin-3 [SEQ. ID. NO. 1].

Fig. 2 viser aminosyresekvensen for eksendin-4 [SEQ. ID. NO. 2].

Fig. 13 viser effekten av eksendin-4 (administrert i.p. to ganger daglig) på

næringsinntak (a), forandring i kroppsvekt (b) (initial kroppsvekt 441 39 g), eller forandring i hemoglobin Aic(c) (7,68 ± 0,20% ved 0 uker).

Dose-responser (høyre felt) er for gjennomsnittet i løpet av de siste 2 uker av 6 ukers behandling. Fig. 14 viser plasmaglukosekonsentrasjonen (a), glukoseinfusjonshastigheten som er nødvendig for å opprettholde euglykemi (b) og plasmalaktatkonsentrasjon (c) i klemmeprosedyrer utført på ZDF rotter som på forhånd er behandlet i 6 uker med de spesifiserte doser av eksendin-4 (i.p. to ganger daglig). Dose-responser for glukoseinfusjonshastigheten og plasmalaktatkonsentrasjonen er basert på gjennomsnitts-verdier oppnådd mellom 60 og 180 minutter av klemmeprosedyren. Fig. 16 og 17 viser glukosenedsettende resultater fra det kliniske studium beskrevet i eksempel 12.

Eksendin-3 og eksendin-4 er naturlig forekommende peptider isolert fra spyttsekresjoner fra Gilaøgle og meksikansk vorteøgle. Dyreforsøk av eksendin-4 har vist at dets evne til å nedsette blodglukose vedvarer i flere timer. Eksendin-4, et 39-aminosyre polypeptid, syntetiseres ved anvendelse av fast-fase syntese som beskrevet heri, og dette syntetiske material er blitt vist til å være identisk med det native eksendin-4.

Forskjellige aspekter av den ikke-kliniske farmakologi til eksendin-4 er blitt studert. Hjernen binder eksendin-4 hovedsakelig til area postrema og nucleus tractus solitarius regionen i bakhjernen og til det subfornikale organ i forhjernen. Eksendin-4 binding er blitt observert i rotte- og musehjernen og nyrene. Strukturene hvortil eksendin-4 binder i nyrene er ukjent.

En rekke andre forsøk har sammenlignet de biologiske virkninger av eksendin-4 og GLP-1 og vist et mere gunstig spekter av egenskaper for eksendin-4. En enkel subkutan dose av eksendin-4 nedsatte plasmaglukose i db/ db (diabetisk) og ob/ ob (diabetisk fedme) mus med opp til 40%. I "Diabetic Fatty Zucker" (ZDF) rotter nedsatte 5 ukers behandling med eksendin-4 HbA1c(et mål på glykosylert hemoglobin anvendt for å evaluere plasmaglukosenivåer) med opp til 41%. Insulinsensitivitet var også forbedret med 76% etter 5 ukers behandling i ZDF obesitas rotter. I glukose-intolerant primater, ble doseavhengige nedganger i plasmaglukose også observert. Se også eksempel 6 som beskriver resultatene fra et forsøk som indikerer at eksendin er mere potent og/eller effektivt enn GLP-1 i å amplifisere glukosestimulert insulinfrigjøring. Eksempel 8 beskriver videre arbeid som viser at den evnen som eksendin-4 har til å nedsette glukose in vivo var 3430 ganger sterkere enn den til GLP-1.

En insulinotropisk virkning av eksendin-4 er også blitt observert i gnagere, med forbedret insulinrespons overfor glukose på mer enn 100% i ikke-fastede Harlan Sprague Dawley (HSD) rotter, og med opp til -10 ganger i ikke-fastede db/ db mus. Høyere forbehandlings-plasmaglukosekonsentrasjoner var assosiert med større glukosenedsettende effekter. Den observerte glukosenedsettende effekt av eksendin-4 synes således å være glukoseavhengig, og minimal dersom dyrene allerede er euglykemiske. Eksendin-4 behandling er også forbundet med forbedring i glykemiske kjennetegn og i insulinsensitivitet, som beskrevet i eksempler 9 og 13.

Eksendin-4 dose gjorde avhengighetsmessig den gastriske tømming langsommere i HSD rotter og var -90 ganger mere potent enn GLP-1 for denne virkning. Eksendin-4 er også blitt vist til å redusere næringsinntak i NIH/Sw (Swiss) mus etter perifer administrering, og var minst 1000 ganger mere potent enn GLP-1 for denne virkning. Eksendin-4 reduserte plasmaglukagonkonsentrasjoner med omtrent 40% i bedøvede ZDF rotter under hyperinsulinemi-, hyperglykemi-klemmebetingelser, men påvirket ikke plasmaglukagonkonsentrasjoner under euglykemiske forhold i normale rotter. Det vises til eksempel 4. Eksendin-4 er blitt vist til dose-avhengighetsmessig å redusere kroppsvekt i ZDF obesitas rotter, mens det observerte fall i tynne ZDF rotter synes å være forbigående.

Gjennom effekter på økning og gjenoppretting av insulinsekresjon, såvel som inhibering av glukagonsekresjon, vil eksendin-4 være anvendbar i mennesker med type 2 diabetes som opprettholder evnen til å utskille insulin. Dens virkninger på næringsinntak, gastrisk tømming, andre mekanismer som modulerer nærings-absorpsjon og glukagonsekresjon understøtter også anvendbarheten av eksendin-4 i behandlingen av for eksempel obesitas, type 1 diabetes og mennesker med type 2 diabetes som har nedsatt insulinsekresjon.

Toksikologien til eksendin-4 er blitt undersøkt i enkeldosestudier i mus, rotter og aper, i studier med gjentatt doser (opp til 28 påfølgende daglige doser) i rotter og aper og in vitro tester for mutagenitet og kromosomale endringer. Til nå har ingen dødsfall forekommet, og der er ikke blitt observert behandlingsrelaterte forandringer i hematologi, klinisk kjemi eller makroskopiske eller mikroskopiske vevs-forandringer. Eksendin-4 ble demonstrert til å være ikke-mutagen, og bevirket ikke kromosomale avvik ved de testede konsentrasjoner (opp til 5000Mg/ml).

Til støtte for undersøkelsen av de ikke-kliniske farmakokinetikker og metabolismen til eksendin-4, er en rekke immunoassays blitt utviklet. En radioimmunoassay med begrenset sensitivitet (-100 pM) ble anvendt i initiale farmakokinetiske studier. En to-sete IRMA assay for eksendin-4 ble deretter validert med en lavere kvantifiseringsgrense på 15 pM. Det vises til eksempler 5 og 7. Biotilgjengelig-heten av eksendin-4, gitt subkutant, ble funnet til å være omtrent 50-80% ved anvendelse av radioimmunoassayen. Dette var tilsvarende det som sees etter intraperitoneal administrering (48-60%). Topp-plasmakonsentrasjoner (Cmaks) forekom mellom 30 og 43 minutter (Tmaks)- Både Cmaksog AUC verdier var ensformig relatert til dose. Den tilsynelatende terminale halveringstid for eksendin-4 gitt subkutant var omtrent 90-110 minutter. Denne var signifikant lengre enn de 14-41 minutter som sees etter intravenøs dosering. Tilsvarende resultater ble oppnådd ved anvendelse av IRMA assayen. Nedbrytningsstudier med eksendin-4 sammenlignet med GLP-1 indikerer at eksendin-4 er relativt resistent overfor nedbrytning.

Undersøkelse av strukturaktivitetsammenhengen (SAR) for å evaluere strukturer som kan relatere til den antidiabetiske aktivitet til eksendin, for eksempel dets stabilitet overfor metabolisme, og for å forbedre dets fysiske egenskaper, særlig når det gjelder peptidstabilitet og mottakelighet for alternative avleveringssystemer, har ført til oppdagelsen av eksendinagonistpeptidforbindelser.

Fremstilling av forbindelser

Forbindelsene som utgjør aktive bestanddeler i formuleringene og doseringene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved anvendelse av standard fast-fase peptidsynteseteknikker og foretrukket en automatisert eller semi-automatisert peptidsyntetisator. Fremstillingen av eksendin-4 er beskrevet i det etterfølgende eksempel 2.

Ved anvendelse av automatiserte eller semiautomatiserte peptidsynteseteknikker, blir typisk en a-N-karbamoyl-beskyttet aminosyre og en aminosyre festet til den voksende peptidkjede på en harpiks koblet ved romtemperatur i et inert løsnings-middel som dimetylformamid, N-metylpyrrolidinon eller metylenklorid i nærvær av koblingsmidler som dicykloheksylkarbodiimid og 1-hydroksybenzotriazol i nærvær av en base som diisopropyletylamin. Den a-N-karbamoyl-beskyttende gruppe fjernes fra den resulterende peptid-harpiks ved anvendelse av et reagens som trifluoreddiksyre eller piperidin, og koblingsreaksjonen gjentas med den neste ønskede N-beskyttede aminosyre som skal adderes til peptidkjeden. Passende N-beskyttende grupper er vel kjent innen teknikken, hvor t-butyloksykarbonyl (tBoc) og fluorfenylmetoksykarbonyl (Fmoc) er foretrukne heri.

Løsningsmidlene, aminosyrederivatene og 4-metylbenzhydryl-aminharpiksen anvendt i peptidsyntetisatoren kan oppnås fra Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). De etterfølgende sidekjede-beskyttende aminosyrer kan oppnås fra Applied Biosystems, Inc.: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(CI-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt) og Fmoc-Gln(Trt). Boc-His(BOM) kan oppnås fra Applied Biosystems, Inc. eller Bachem Inc. (Torrance, CA). Anisol, dimetylsulfid, fenol, etanditiol og tioanisol kan oppnås fra Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl). Air Products and Chemicals (Allentown, PA) fremskaffer HF. Etyleter, eddiksyre og metanol kan anskaffes fra Fischer Scientific (Pittsburgh, PA).

Fast-fase peptidsyntese kan gjennomføres med en automatisk peptidsyntetisator (Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster Citry, CA) ved anvendelse av NMP/HOBt (Valg 1) systemet og tBoc eller Fmoc kjemi (se, Applied Biosystems User's Manual for the AB I 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B July 1, 1988, del 6, s. 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) med endestabilisering ("capping"). Boc-peptid-harpikser kan spaltes med HF (-5°C til 0°C, 1 time). Peptidet kan ekstraheres fra harpiksen ved å alternere vann og eddiksyre, og filtratene frysetørkes. Fmoc-peptidharpiksene kan spaltes i henhold til standard metoder (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, s. 6-12). Peptider kan også samles ved anvendelse av en Advanced Chem Tech Synthesizer (Model MPS 350, Louisville, Kentucky).

Peptider kan renses ved RP-HPLC (preparativ og analytisk) anvendelse av et Waters Delta Prep 3000 system. En C4, C8 eller C18 preparativ kolonne (10 u, 2,2 x 25 cm, Vydac, Hesperia, CA), kan anvendes for å isolere peptider og renhet kan bestemmes ved anvendelse av en C4, C8 eller C18 analytisk kolonne (5 u, 046 x 25 cm, Vydac). Løsningsmidler (A=0,1 % TFA/vann og B=0,1% TFA/CH3CN) kan avleveres til analysekolonnen i en strømningsmengde på 1,0 ml/min. og til den preparative kolonne ved 15 ml/min. Aminosyreanalyser kan utføres på Waters Pico Tag systemet og prosesseres ved anvendelse av Maxima programmet. Peptider kan hydrolyseres ved dampfase sur hydrolyse (115°C, 20-24 timer). Hydrolysater kan derivatiseres og analyseres ved standard metoder (Cohen, et al., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, s. 11-52, Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). Hurtig-atom-bombardementanalyser kan gjennomføres ved M-Scan, Incorporated (West Chester, PA). Massekalibrering kan utføres ved anvendelse av cesiumjodid eller cesiumjodid/glyserol. Plasmadesorpsjonsioniseringsanalyse ved anvendelse av "time of flight" deteksjon kan gjennomføres på et Applied Biosystems Bio-lon 20 massespektrometer. Elektrospray-massespektroskopi kan gjennomføres på en VG-Trio maskin.

Aktive peptidbestanddelsforbindelser som er anvendbare i formuleringer og doseringer ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved anvendelse av rekombi-nante DNA-teknikker, ved anvendelse av metoder som nå er kjent innen teknikkens stand. Se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor (1989).

Anvendbarhet

Formuleringene og doseringene beskrevet heri er anvendbare i betraktning av deres farmakologiske egenskaper. Formuleringene og doseringene er spesielt effektive som eksendiner og eksendinagonister, og utviser aktivitet som midler for å nedsette blodglukose, og for å regulere gastrisk motilitet og forsinke gastrisk tømming, som vist ved evnen til å redusere post-prandiale glukosenivåer i pattedyr.

Formulering og administrering

Eksendin- og eksendinagonistformuleringer og doseringer er anvendbare i betraktning av deres eksendin-lignende effekter, og kan passende tilveiebringes i form av formuleringer egnet for parenteral (inkluderende intravenøs, intramuskulær og subkutan) administrering. Formuleringer og doseringer som er anvendbare i alternative avleveringsruter inkluderer oral, nasal, bukkal, sublingval og pulmonal.

Forbindelser som er anvendbare kan tilveiebringes som parenterale preparater for injeksjon eller infusjon. De kan generelt, f.eks. suspenderes i en inert olje, passende en vegetabilsk olje som sesamolje, jordnøttolje, olivenolje, eller annen aksepterbar bærer. De er foretrukket suspendert i en vandig bærer, f.eks. en isotonisk bufferoppløsning med en pH på 3,0 til 7,0, mere foretrukket fra 4,0 til 6,0, og særlig foretrukket fra 4,0 til 5,0. Disse preparater kan steriliseres ved konven-sjonelle steriliseringsteknikker, eller de kan sterilfiltreres. Preparatene kan inneholde farmasøytisk aksepterbare hjelpestoffer etter behov for å approksimere fysiologiske tilstander, som pH buffermidler. Anvendbare buffere inkluderer f.eks. natriumacetat/eddiksyrebuffere. Den ønskede isotonisitet kan oppnås ved anvendelse av natriumklorid eller andre farmsøytisk aksepterbare midler som dekstrose, borsyre, natriumtartrat, propylenglykol, polyoler (som mannitol og sorbitol), eller andre uorganiske eller organiske oppløste produkter. Natriumklorid er spesielt foretrukket for buffere inneholdende natriumioner.

Eksendin- og eksendinagonistforbindelser kan også utformes som farmasøytisk aksepterbare salter (f.eks. syreaddisjonssalter) og/eller komplekser derav. Farmasøytisk aksepterbare salter er ikke-toksiske salter ved den konsentrasjon hvorved de administreres. Fremstillingen av slike salter kan forenkle den farmakologiske bruk ved å endre de fysisk-kjemiske egenskaper til preparater uten å forhindre at preparatet utviser sin fysiologiske effekt. Eksempler på anvendbare endringer i fysiske egenskaper inkluderer nedsettelse av smeltepunkt for å lette transmukosal administrering og øke solubiliteten for å lette administreringen av høyere konsentrasjoner av legemiddelet.

Farmasøytisk aksepterbare salter inkluderer syreaddisjonssalter som dem inneholdende sulfat, hydroklorid, fosfat, sulfamat, acetat, citrat, laktat, tartrat, metansulfonat, etansulfonat, benzensulfonat, p-toluensulfonat, cykloheksylsulfamat og kinat. Farmasøytisk aksepterbare salter kan oppnås fra syrer som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, sulfamsyre, eddiksyre, sitronsyre, melkesyre, vinsyre, malonsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, benzensulfonsyre, p-toluensulfon-syre, cykloheksylsulfamsyre og kininsyre. Slike salter kan f.eks. fremstilles ved å reagere frie syrer eller baseformer av produktet med en eller flere ekvivalenter av den passende base eller syre i et løsningsmiddel eller medium hvor saltet er uoppløselig, eller i et løsningsmiddel som vann som deretter fjernes i vakuum eller ved frysetørking eller ved å bytte ionene av et eksisterende salt med et annet ion på en passende ionebytterharpiks.

Generelt kan bærere eller eksipienser også anvendes for å forenkle administrering av en dosering. Eksempler på bærere og eksipienser inkluderer kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat, forskjellige sukkere som laktose, eller typer av stivelse, cellulose-derivater, gelatin, vegetabilske oljer, polyetylenglykoler og fysiologisk kompatible løsningsmidler.

Om ønsket kan oppløsninger av de ovennevnte doseringspreparater fortykkes med et fortykningsmiddel som metylcellulose. De kan fremstilles i emulgert form, enten vann i olje eller olje i vann. Hvilke som helst av en rekke forskjellige farmasøytisk aksepterbare emulgeringsmidler kan benyttes som f.eks. inkluderer akasiepulver, en ikke-ionisk surfaktant (som Tween) eller en ionisk surfaktant (som alkalipolyeteralkoholsulfater eller sulfonater, f.eks. et Triton).

Generelt fremstilles formuleringer og doseringspreparater ved å blande bestand-delene i henhold til generelt aksepterte prosedyrer. De valgte komponenter kan f.eks. blandes på enkel måte i en blander eller annen standard anordning for å produsere en konsentrert blanding som deretter kan innstilles til sluttkonsentra-sjonen og viskositet ved tilsetning av vann eller fortykningsmiddel og eventuelt buffer for å regulere pH eller en ytterligere oppløst substans for å regulere tonisitet.

Andre farmasøytisk aksepterbare bærere og deres formulering er beskrevet i standard formuleringsskrifter, f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences av E.W. Martin. Se også Wang, Y.J. og Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988).

For anvendelse av legen vil forbindelsene tilveiebringes i doserings-enhetsform inneholdende en mengde av en eksendinagonist, med eller uten annet terapeutisk middel, f.eks. et glukosenedsettende middel, et gastrisk tømmemodulerende middel, et lipidnedsettende middel eller et næringsinntak-inhiberende middel. Terapeutisk effektive mengder av en eksendinagonist for anvendelse ved regulering av blodglukose eller ved regulering av gastrisk tømming og ved tilstander hvor gastrisk tømming fordelaktig forsinkes eller reguleres er dem som nedsetter post-prandiale blodglukosenivåer, foretrukket høyst omtrent 8 eller 9 mM eller slik at blodglukosenivået reduseres som ønsket. I diabetisk eller glukose-intolerante individer er plasmaglukosenivåer høyere enn i normale individer. I slike individer kan fordelaktig reduksjon eller "utjevning" av post-prandiale blodglukosenivåer oppnås. Som fagkyndig på området vil se, vil en effektiv mengde terapeutisk middel variere med en rekke faktorer som inkluderer pasientens fysiske tilstand, blodsukkernivået eller nivået av inhibering av gastrisk tømming som skal oppnås, eller det ønskede nivået av næringsinntakreduksjon, og andre faktorer.

Slike farmasøytiske preparater er anvendbare til å bevirke økt insulinsensitivitet i et individ og kan likeledes anvendes ved sykdommer, slik som diabetes, hvor økt sensitivitet overfor insulin er fordelaktig.

De effektive daglige doser av forbindelsene er beskrevet. Den eksakte dose for administrering kan bestemmes av den behandlende lege og kan videre avhenge av effektiviteten til den spesielle eksendin- eller eksendinagonistforbindelsen som anvendes, såvel som av alder, vekt og tilstand til individet. Den optimale administreringsmåte for forbindelser til en pasient avhenger av faktorer som er kjent innen teknikken slik som den spesielle sykdom eller lidelse, den ønskede effekt og typen pasient. Mens forbindelsene typisk vil anvendes for å behandle humane pasienter, kan de også anvendes for å behandle tilsvarende eller identiske sykdommer i andre vertebrater som andre primater, gårdsdyr som svin, kveg og fjærfe, og sportsdyr og kjeledyr som hester, hunder og katter.

Oppfinnelsen vedrører som nevnt formuleringer av eksendin-4 som omfatter eksendin-4 blandet sammen med en acetatbuffer, et iso-osmolalitetsmodifiserende middel slik som mannitol og som inneholder et preserveringsmiddel slik som m-kresol, hvor nevnte formulering har pH på mellom 4,0 og 6,0 (foretrukket mellom 4,0 og 5,0).

Formuleringen som best understøtter en parenteral flytende doseringsform er en hvor den eller de aktive bestanddeler er stabil med passende bufferkapasitet for å opprettholde pH i oppløsningen i løpet av produktets tilsiktede lagringstid. Doseringsformen bør enten være en isotonisk og/eller en iso-osmolar oppløsning for enten å understøtte stabiliteten til den aktive bestanddel eller nedsette smerten med injeksjon eller begge. Anordninger som avleverer svært små injeksjonsvolumer vil imidlertid ikke kreve at formuleringen enten er isotonisk og/eller iso-osmolar. Dersom doseringsformen er emballert som en enhetsdose, da kan et preserveringsmiddel være inkludert, men det er ikke nødvendig. Dersom imidlertid doseringsformen er emballert i en flerbruksbeholder, da er et preserveringsmiddel nødvendig.

Disse doseringsformer inkluderer henholdsvis fra 0,005 til 0,4%, mere spesielt fra 0,005 til 0,02%, eller fra 0,005 til 0,05% (vekt/volum) av den aktive bestanddel eksendin-4 i et vandig system sammen med fra 0,02 til 0,5% (vekt/volum) av en acetatbuffer for å oppnå en pH i sluttblandingen fra pH 4,0 til 6,0, eller mere spesielt fra omtrent 4,0 til 5,0, så vel som fra 1,0 til 10% (vekt/volum) av et flerverdig alkohol iso-osmolalitetsmodifiserende middel slik som mannitol. Opp til omtrent 0,9% saltoppløsning kan være inkludert. Dette fører til en isotonisk eller en iso-osmolar oppløsning i en vandig kontinuerlig fase. Fra 0,005 til 1,0%

(vekt/volum) av et anti-mikrobielt preserveringsmiddel slik som m-kresol er også til stede. Formuleringen kan emballeres i en flerbruksbeholder. En tilstrekkelig mengde vann for injeksjon tilsettes for å oppnå den ønskede konsentrasjon i oppløsningen. Natriumklorid, såvel som andre eksipienser, kan også være til stede, om ønsket. Slike eksipienser må imidlertid opprettholde den totale stabilitet til den aktive bestanddel.

Mannitol vil også være effektiv for å stabilisere protein mot denaturering bevirket ved økt temperatur og ved frysing-tining eller frysetørkingsprosesser.

Den flytende formulering ifølge oppfinnelsen bør være i alt vesentlig isotonisk og/eller iso-osmolar. En isotonisk oppløsning kan defineres som en oppløsning som har en konsentrasjon av elektrolytter, eller en kombinasjon av elektrolytter og ikke-elektrolytter som vil utøve ekvivalent osmotisk trykk som det trykk inn i hvilket den innføres, her f.eks. tilfellet av parenteral injeksjon av formuleringen, et patte-dyrvev. Likeledes kan en iso-osmolar oppløsning defineres som en oppløsning som har en konsentrasjon av ikke-elektrolytter som vil utøve ekvivalent osmotisk trykk som det trykk inn i hvilket den innføres. Som anvendt heri betyr "i alt vesentlig isotonisk" innen ± 20% av isotoniskhet, foretrukket innen ± 10%. Som anvendt heri betyr "i alt vesentlig iso-osmolar" innen ± 20% av iso-osmolalitet, foretrukket innen ± 10%. Det utformede produkt for injeksjon er inkludert i en beholder, typisk f.eks. en ampulle/glass, patron, pre-fylt sprøyte eller engangspenn.

Den formulering som best understøtter en enhetsdose parenteral frysetørket doseringsform er en hvor den aktive bestanddel er rimelig stabil, med eller uten passende bufringskapasitet for å opprettholde pH i oppløsningen over den tilsiktede lagringstid til det rekonstituerte produkt. Doseringsformen bør inneholde et svellemiddel for å lette kakedannelse. Svellemiddelet kan også virke som et tonisitetsmiddel og/eller et iso-osmolalitetsmodifiserende middel ved rekonstituering for enten å lette stabilitet for den aktive bestanddel og/eller nedsette smerte ved injeksjon. Som angitt i det foregående, vil det for anordningen som avleverer svært små injeksjonsvolumer ikke kreves at formuleringen er isotonisk og/eller iso-osmolar. En surfaktant kan også være fordelaktig for kakens egenskaper og/eller forenkle rekonstituering.

Disse doseringsformer inkluderer fra 0,005 til 0,4%, mere spesifikt fra 0,005 til 0,02%, eller 0,005 til 0,05% (vekt/volum) av den aktive bestanddel eksendin-4. Bufferen som anvendes kan den være inkludert i den frysetørkede substans eller i rekonstitueringsløsningsmiddelet. Formuleringen og/eller rekonstituerings-løsningsmiddelet kan derfor inneholde, individuelt eller samlet fra 0,02 til 0,5%

(vekt/volum) av en acetatbuffer for å oppnå en pH i sluttblandingen fra pH 4,0 til 6,0, eller mere spesielt fra 4,0 til 5,0. Svellemiddelet omfatter fra 1,0 til 10%

(vekt/volum) av det flerverdige alkohol iso-osmolalitetsmodifiserende middel (som beskrevet over). Opp til 0,9% saltoppløsning kan være til stede. Dette fører til en isotonisk eller en iso-osmolar oppløsning i den rekonstituerte vandige fase. En surfaktant, foretrukket fra 0,1 til 1,0% (vekt/volum) av polysorbat 80 eller annen ikke-ionisk detergent kan være inkludert. Som angitt i det foregående kan natriumklorid såvel som andre eksipienser også være til stede i den frystetørkede enhetsdoseringsformulering, om ønsket. Slike eksipienser må imidlertid opprettholde den totale stabilitet av den aktive bestanddel. Formuleringen vil fryse-

tørkes innen de identifiserte valideringsparametre for å opprettholde stabiliteten til den aktive bestanddel.

Den flytende formulering ifølge oppfinnelsen bør, før frysetørking, være i alt vesentlig isoton og/eller iso-osmolar. Enten før frysetørking eller for å muliggjøre dannelse av isotoniske og/eller iso-osmolare oppløsninger etter rekonstituering. Formuleringen bør anvendes innen den periode som er etablert ved studier av lagringstid for både den frystetørkede form og etter rekonstituering. Det fryse-tørkede produkt er inkludert i en beholder, typisk f.eks. en ampulle/glass. Dersom andre beholdere anvendes slik som en patron, pre-fylt sprøyte eller engangspenn, kan rekonstitueringsløsningsmiddelet også være inkludert.

Som med den parenterale væske og de frysetørkede enhetsdoseringsformule-ringer beskrevet over, er formuleringen som best understøtter en multi-dose parenteral frysetørket doseringsform en hvor den aktive bestanddel er rimelig stabil med passende bufferkapasitet for å opprettholde pH i oppløsningen over den tilsiktede "i-bruk" lagringstid for produktet. Doseringsformen bør inneholde et svellemiddel for å lette kakedannelse. Svellemiddelet kan også virke som et tonisitetsmiddel og/eller et iso-osmolalitetsmodifiserende middel ved rekonstituering for enten å lette stabiliteten til den aktive bestanddel eller nedsette smerten ved injeksjon eller begge. Igjen kan anordninger som avleverer svært små injeksjonsvolumer ikke kreve at formuleringen er enten isotonisk og/eller iso-osmolar. Et preserveringsmiddel er imidlertid nødvendig for å lette multippel bruk ved pasienten.

Disse doseringsformer inkluderer henholdsvis fra 0,005 til 0,4%, mer spesielt fra 0,005 til 0,02% eller fra 0,005 til 0,05% (vekt/volum) av den aktive bestanddel eksendin-4. Bufferen som anvendes kan den være inkludert i den frysetørkede substans eller i rekonstitueringsløsningsmiddelet. Formuleringen og/eller rekonstitueringsløsningsmiddelet kan derfor inneholde individuelt eller samlet fra 0,02 til 0,5% (vekt/volum) av en acetatbuffer for å oppnå en pH i sluttblandingen fra pH 4,0 til 6,0, særlig fra 4,0 til 5,0. Svellemiddelet omfatter fra 1,0 til 10%

(vekt/volum) av det flerverdige alkohol iso-osmolalitetsmodifiserende middel slik som mannitol. Opp til 0,9% saltoppløsning kan være til stede. Dette fører til en isotonisk eller iso-osmolar oppløsning i den rekonstituerte vandige fase. En surfaktant, foretrukket fra 0,1 til 1,0% (vekt/volum) av polysorbat 80 eller annen ikke-ionisk detergent kan være inkludert. Fra 0,005 til 1,0% (vekt/volum) av et anti-mikrobielt preserveringsmiddel slik som m-kresol er også til stede.

Formuleringen kan emballeres i en flerbruksbeholder. Natriumklorid, så vel som andre eksipienser, kan også være til stede, om ønsket. Igjen må imidlertid slike eksipienser opprettholde den totale stabilitet til den aktive bestanddel. Formuleringen bør frysetørkes innen de identifiserte valideringsparametre for å opprettholde stabilitet for den aktive bestanddel. Den flytende formulering ifølge oppfinnelsen bør være i alt vesentlig isoton og/eller iso-osmolar enten før frysetørking eller for å muliggjøre dannelse av isotoniske og/eller iso-osmolare oppløsninger etter rekonstituering. Formuleringen bør anvendes innen perioden etablert ved lagringstidsstudier på både den frysetørkede form og etter rekonstituering. Det frysetørkede produkt er inkludert i en beholder, typisk f.eks. en ampulle/glass. Dersom andre beholdere anvendes slik som en patron, pre-fylt sprøyte eller engangspenn, kan rekonstitueringsløsningsmiddelet også være inkludert.

Oppfinnelsen inkluderer også foretrukne doseringer for eksendin-4 når gitt ved injeksjon, og når gitt ved andre ruter. Formuleringer for eksendin-4 kan således fremstilles for administrering ved injeksjon og inkluderer fra 0,1 til 0,5 ug pr. kg, gitt fra en til tre ganger pr. døgn. For pasienten med diabetes som veier i området omtrent 70 kg (gjennomsnitt for type 1 diabetikere) til omtrent 90 kg (gjennomsnitt for type II diabetikere), vil dette typisk f.eks. resultere i den totale administrering av fra 10 til 120 ug pr. døgn i en enkeltdose eller flere doser. Dersom administrert i flere doser administreres dosene foretrukket to eller tre ganger pr. døgn, og mere foretrukket to ganger pr. døgn.

I en foretrukket injeksjonsprosedyre administreres eksendin-4 parenteralt, mere foretrukket ved injeksjon, f.eks. ved perifer injeksjon. Fra 1 ug-30 ug til 1 mg av eksendinet administreres foretrukket pr. døgn. Mere foretrukket administreres fra 1-30 ug til 500 ug, eller fra 1-30 ug til 50 ug av eksendinet pr. døgn. Mest foretrukket, avhengig av individets vekt og potensen til den administrerte forbindelse, administreres fra 3 ug til 50 ug av eksendinet pr. døgn. Doser av eksendin-4 vil normalt være lavere når gitt ved kontinuerlig infusjon. Doser av eksendin-4 vil normalt være høyere når gitt ved ikke-injeksjonsmetoder.

Kliniske studier

Som beskrevet i eksempel 10 i det etterfølgende, ble et dobbelt-blind, placebo-kontrollert stigende enkeltdosestudium som undersøker sikkerhet, tolererbarhet og farmakokinetikker av subkutan eksendin-4 i friske frivillige gjennomført. Fem subkutane enkeltdoser av eksendin-4 (0,01, 0,05, 0,1, 0,2 eller 0,3 ug/kg) ble studert i 40 friske frivillige individer av hankjønn i fastende tilstand. Maksimale eksendin-4 plasmakonsentrasjoner ble oppnådd mellom en og to timer etter-dosering med liten forskjell blant de undersøkte dosene. Undersøkelse av dataene indikerer en doseavhengig økning for Cmaks- Der var ingen alvorlige negative virkninger rapportert i dette studium.

I de friske frivillige av hankjønn som deltok i dette studium, ble eksendin-4 godt tolerert ved subkutane doser opp til og inkluderende 0,1 ug/kg. En nedgang i plasmaglukosekonsentrasjon ble også observert ved denne dose. Ved doser på 0,2 ug/kg og høyere, var de mest vanlig observerte negative virkninger hodepine, kvalme, oppkast, svimmelhet og postural hypotensjon. Der var et forbigående fall i plasmaglukosekonsentrasjon etter administrering av doser på 0,05 ug/kg og over.

Eksempel 12 i det etterfølgende beskriver et ytterligere studium av dose-respons-sammenhengen for den glukosenedsettende effekt av eksendin-4 ved doser mindre enn 0,1 ug/kg. Fjorten individer [gjennomsnittlig (±SE) alder 55 ± 2, gjennomsnittlig BMI (30,2 ± 1,6 kg/m<2>)] med type II diabetes behandlet med diett orale hypoglykemimidler ble studert etter fjerning av orale midler i 10-14 dager. Vurderinger ble gjort etter randomisert, subkutan injeksjon av placebo, 0,01, 0,02, 0,05 og 0,1 pg/kg eksendin-4 på separate dager etter faste over natten. Injeksjoner ble gitt umiddelbart før inntak av et standardisert Sustacal måltid

(7 kcal/kg) etterfulgt av samling av plasmaglukoseprøver ved hyppige intervaller under de påfølgende 300 minutter.

Den glykemiske respons ble kvantifisert som den tidsbelastede gjennomsnittlige (±SE) forandring i plasmakonsentrasjon i løpet av 5-timers perioden. Responsen strekte seg fra +42,0±7,9 mg/dl økning over den fastende glukosekonsentrasjon for placebo sammenlignet med en 30,5±8,6 mg/dl nedsettelse under den fastende glukosekonsentrasjon med 0,1 ug/kg eksendin-4.

ED50for denne glukosenedsettende effekt var 0,038 ug/kg. Eksendin-4-doser mindre enn 0,1 ug/kg synes å disassosiere de glukosenedsettende effekter fra de gastrointestinale bivirkninger. Eksempel 12 viser at eksendin-4 ikke bare var godt tolerert ved doser mindre enn 0,1 ug/kg, men at disse doser vesentlig nedsatte postprandiale plasmaglukosekonsentrasjoner (ED50på 0,038 ug/kg) i mennesker med type II diabetes.

For å understøtte forståelsen av den foreliggende oppfinnelse er de etterfølgende eksempler inkludert som beskriver resultatene fra en rekke forsøk.

REFERANSEEKSEMPEL 1 - FREMSTILLING AV EKSENDIN-3

His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser- NH2

[SEQ. ID. NO. 1].

Det ovennevnte amiderte peptid ble satt sammen på 4-(2'-4'-dimetoksyfenyl)-Fmoc aminometylfenoksyacetamidnorleucin MBHA harpiks (Novabiochem, 0,55 mmol/g) ved anvendelse av Fmoc-beskyttede aminosyrer (Applied Biosystems, Inc.). Generelt ble enkeltkoblings-sykluser anvendt gjennom syntesen og Fast Moe (HBTU aktivering) kjemi ble anvendt. Avbeskyttelse (fjerning av Fmoc gruppe) av den voksende peptidkjede ble oppnådd ved anvendelse av piperidin. Endelig avbeskyttelse av den fullstendige peptidharpiks ble oppnådd ved anvendelse av en blanding av trietylsilan (0,2 ml), etanditiol (0,2 ml), anisol (0,2 ml), vann (0,2 ml) og trifluoreddiksyre (15 ml) i henhold til standard metoder (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc.). Peptidet ble presipitert i eter/vann (50 ml) og sentrifugert. Presipitatet ble rekonstituert i iseddik og frysetørket. De fryse-tørkede peptid ble oppløst i vann. Rå-renhet var omtrent 75%.

Anvendt i rensetrinn og analyser i referanseeksempel 1 og eksempel 2 ble løsningsmiddel A (0,1% TFA i vann) og løsningsmiddel B (0,1% TFA i ACN).

Oppløsningen som inneholdt peptid ble påført på en preparativ C-18 kolonne og renset (10% til 40% løsningsmiddel B i løsningsmiddel A i løpet av 40 minutter). Renhet av fraksjoner ble bestemt isokratisk ved anvendelse av en C-18 analytisk kolonne. Rene fraksjoner ble samlet som tilveiebragte det ovenfor identifiserte peptid. Analytisk RP-HPLC (gradient 30% til 60% løsningsmiddel B i løsnings-middel A i løpet av 30 minutter) av det frysetørkede peptid ga produktpeptid med en observert retensjonstid på 19,2 minutter.

EKSEMPEL 2 - FREMSTILLING AV EKSENDIN-4

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser- NH2

[SEQ. ID. NO. 2].

Det ovennevnte amiderte peptid ble samlet på 4-(2'-4'-dimetoksyfenyl)-Fmoc aminometylfenoksyacetamidnorleucin MBHA harpiks (Novabiochem, 0,55 mmol/g) ved anvendelse av Fmoc-beskyttede aminosyrer (Applied Biosystems, Inc.), spaltet fra harpiksen, avbeskyttet og renset på tilsvarende måte som eksendin-3 som beskrevet i referanseeksempel 1. Anvendt i analysen var løsningsmiddel A (0,1% TFA i vann) og løsningsmiddel B (0,1% TFA i ACN). Analytisk RP-HPLC

(gradient 36% til 46% løsningsmiddel B i løsningsmiddel A i løpet av 30 minutter)

av det frysetørkede peptid ga produktpeptid med en observert retensjonstid på 14,9 minutter. Elektrospray-massespektrometri (M): beregnet 4186,6, funnet 8186,0 til 4186,8 (fire lotter).

EKSEMPEL 3 - EKSENDIN-4 ER ET SIRKULERENDE MÅLTIDS-RELATERT

PEPTID I GILAØGLEN

Dette forsøk undersøkte om eksendin-4 har en metabolsk rolle i selve Gilaøglen. For å undersøke om eksendin-4 forekom i blodet til Gilaøglen som reaksjon på foring, ble blodprøver tatt fra et dyr som hadde fastet i 7 uker, før og 30 minutter etter inntak av en liten rotte. Plasma ble analysert for full-lengde eksendin-4 ved anvendelse av en immunoradiometrisk analyse med monoklonale antistoffpar rettet mot epitoper ved N- og C-termini av eksendin-4. Fastende eksendin-4 plasmakonsentrasjoner var 76 pg/ml, nær den nedre grense for kvantifisering. Etter spising steg denne verdi 300-ganger til 23120 pg/ml.

I et annet forsøk ble serieprøver tatt fra to dyr som hadde fastet fem uker før og etter inntak av en eller to små rotter (47-49 g). Eksendin-4 plasmakonsentrasjon steg 23- til 36-ganger (til 4860, 8340 pg/ml) umiddelbart etter spising, som var konsistent med en direkte passering av eksendin-4 fra spyttkjertelen til blod. Etter spising av en annen rotte (t=30 min.), steg eksendin-4 plasmakonsentrasjonen i en Gilaøgle videre til 27209 pg/ml. Eksendin-4 plasmakonsentrasjon ble redusert med t>2 på henholdsvis 5,00 og 5,33 timer. Som konklusjon forekom eksendin-4, kjent til å stamme fra spyttkjertelen til Gilaøglen, i en høy konsentrasjon i blodet umiddelbart etter spising. Dette kan representere et måltidsrelatert signal til å inhibere videre spising og fremme lagring av næringsstoff.

EKSEMPEL 4 - EKSENDIN-4 NEDSETTER GLUKAGONSEKRESJON

UNDER HYPERGLYKEMISK CLAMP I DIABETISKE "FATTY ZUCKER"ROTTER

Absolutt eller relativ hyperglukagonemi er ofte et trekk ved type I og type 2 diabetes mellitus, og suppresjonen av overdreven glukagonsekresjon er en potensiell fordel for terapi ved anvendelse av glukagonostatiske midler. I dette eksempel ble effekten av eksendin-4 på glukagonsekresjon i bedøvede "Diabetic Fatty Zucker" (ZDF) rotter undersøkt. Ved anvendelse av en hyperinsulinemisk, hyperglykemisk clamp protokoll ble faktorer som tenderer til å innvirke på glukagonsekresjon holdt konstant. Plasmaglukose ble clamped ved -34 mM 60 min. før begynnende intravenøse infusjoner av saltoppløsning (n=7) eller eksendin-4 (0,21 ug + 2,1 ug/ml/t, n=7). Plasmaglukagonkonsentrasjon målt før disse infusjoner var tilsvarende i begge grupper (henholdsvis 306 ± 30 pM, versus 252 ± 32 pM, n.s.).

Gjennomsnittlig plasmaglukagonkonsentrasjon i rotter med eksendin-4 infusjon var halvparten av den i rotter med infusjon av saltoppløsning i de siste 60 minutter av clamp (henholdsvis 165 ± 18 pM, versus 298 ± 26 pM, P<0,002). Hyperglykemisk clamp protokollen muliggjør også måling av insulinsensitivitet. Glukoseinfusjonshastighet under clamp ble økt med 111 ± 7% i eksendin-4-behandlede rotter versus kontrollrotter (P<0,001). Med andre ord utviste eksendin-4 en glukagono-statisk effekt i ZDF rotter under hyperglykemisk clamp studier, en effekt som vil være av terapeutisk fordel i diabetiske mennesker.

EKSEMPEL 5 - FARMAKO-KINETIKKER AV EKSENDIN-4 I ROTTE ETTER

INTRAVENØS, SUBKUTAN OG INTRAPERITONEAL ADMINISTRERING

Dette eksempel beskriver arbeid for å definere plasma-farmakokinetikker av eksendin-4 i rotter (hver -350 g kroppsvekt) etter 2,1, 21, 210 ug/rotter i.v. bolus, s.c. og i.p. administrering og 2,1, 21, 210 ug/t/rotte i.v. infusjon (3 t). Serieprøver av plasma (-120 ul) ble analysert ved anvendelse av en validert immunoradiometrisk assay (IRMA). Denne sandwich-type assay anvender musebaserte monoklonale antistoffer som reagerer med eksendin-4, men som ikke reagerer med GLP-1 eller testede metabolitter av eksendin-4 eller GLP-1. Den nedre kvantifiseringsgrense var 15 pM (63 pg/ml). Den estimerte VA for eksendin-4 var 18-41 min. for i.v. bolus, 28-49 for i.v. kontinuerlig, 90-216 min. for s.c. og 125-174 min. for i.p. injeksjon. Biotilgjengelighet var 65-76% for s.c. og i.p. injeksjon. Clearance bestemt fra i.v. infusjon var 4-8 ml/min. Både Cmaksog AUC verdier innen hver administreringsrute var proporsjonal med dose. Fordelingsvolum var 457-867 ml. Clearance og biotilgjengelighet var ikke doseavhengig. Cmaks(eller steady-state plasmakonsentrasjon, Css) er vist i den etterfølgende tabell.

EKSEMPEL 6 - SAMMENLIGNING AV DE INSULINOTROPISKE VIRKNINGER AV EKSENDIN-4 OG GLUKAGONLIGNENDE PEPTID-I (GLP-1) UNDER EN INTRAVENØS GLUKOSEEKSPONERING I ROTTER

Dette forsøk sammenligner de insulinotropiske virkninger av syntetisk eksendin-4 og GLP-1 in vivo etter en intravenøs (i.v.) glukoseeksponering i rotter. Sprague-Dawley rotter (-400 g) ble bedøvet med halotan og utstyrt med kanyle i femoralarterien og saphenusvenen. Etter en 90-min. restitusjonsperiode, ble saltoppløsning eller peptid (hver 30 pmol/kg/min.) administrert i.v. (1, ml/t i 2 timer, n=4-5 for hver gruppe). Tretti minutter etter begynnende infusjon ble D-glukose (5,7 mmol/kg, 0,8 ml) injisert i.v. I saltoppløsningsbehandlede, eksendin-4-behandlede og GLP-1-behandlede rotter var plasmaglukosekonsentrasjoner tilsvarende før injeksjon (9,310,4, 9,791 0,3,10,3 t 0,4 mM), økte ved tilsvarende mengder etter glukoseinjeksjon (21,7, 21,3, 23,7 mM), og resulterte i en tilsvarende 60-min. glukose AUC (henholdsvis 987 139, 907130, 10,961 68 mM.min.). Dvs. at den glykemiske stimulus var tilsvarende i hver behandlingsgruppe. Plasmainsulinkonsentrasjon i saltoppløsningsbehandlede rotter økte 3,3-ganger med glukoseeksponeringen (230153 til topp på 7651188 pM). Med eksendin-4 infusjon var økningen i plasmainsulinkonsentrasjon 6,8-ganger (363 160 til 24861 365 pM). Med GLP-1 var økningen i plasmainsulinkonsentrasjon 2,9-ganger (391 127 til 1145 1169 pM), som var tilsvarende den oppnådd i saltoppløsningsbehandlede rotter. 60-min. insulin AUC i saltoppløsningsbehandlede rotter var 2416 nM.min., økte 2,8-ganger i eksendinbehandlede rotter (6718 nM.min., P<0,003 versus saltoppløsning, P<0,02 versus GLP-1) og med 20% i GLP-1-behandlede rotter (n.s. versus saltoppløsning). Amplifikasjon av glukosestimulert insulinfrigjøring ved eksendin-4 ble også testet ved infusjonshastigheter på 3 og 300 pmol/kg/min. og vist til å være doseavhengig. Således er eksendin-4 mere potent og/eller effektivenn GLP-1 for amplifikasjon av glukosestimulert insulinfrigjøring i intakte rotter.

EKSEMPEL 7 - UTVIKLING OG VALIDERING AV EN

IMMUNORADIOMETRISK ASSAY (IRMA) FOR KVANTIFISERING AV EKSENDIN-4 I PLASMA OG DETS ANVENDELSE PÅ PREKLINISK TOKSISITET OG FASE I KLINISKE EVALUERINGER

En sensitiv og spesifikk sandwich-type immunoradiometrisk (IRMA) assay ble utviklet for kvantifisering av eksendin-4 plasmakonsentrasjon ved anvendelse av syntetisk eksendin-4 som immunogenet. Et musavledet monoklonalt antistoff gjenkjenner en C-terminal epitop på eksendin-4 (innfangings-antistoff), men kryss-reagerer ikke med GLP-1. Det andre antistoff (detektorantistoff merket med<125>l) gjenkjenner en N-terminal epitop på eksendin-4 og GLP-1, og krever et terminalt histidin for binding. Således vil analysen sett under ett ikke detektere GLP-1 (7-36)NH2, GLP-1 (7-36)COOH eller eksendin(3-39). Analyse- validering i plasma fra rotte, ape, hund, kanin og mennesker viste inter- og intra-assay variasjonskoeffisienter på henholdsvis <20% og <10%, nøyaktighet på ±15% med lave, middels og høye målkontroller, og nedre og øvre kvantifiseringsgrenser på henholdsvis 62,8 og 2512 pg/ml. Plasmaprøver fra 28-dag subkutane toksisitet-evalueringer av eksendin-4 i rotter og aper og et fase I klinisk studium i normale individer ble evaluert ved anvendelse av IRMA. Cmaks verdiene i de undersøkte dyr er vist i den etterfølgende tabell. Humane prøver fra subkutan administrering av 0,05, 0,1, 0,2 og 0,3 ug/kg ga Cmaksverdier på 90, 224, 370 og 587 pg/ml.

EKSEMPEL 8 - SAMMENLIGNING AV GLP-1

RESEPTORBINDING/-AKTIVERING OG

GLUKOSENEDSETTENDE EFFEKT AV GLP-1 OG EKSENDIN-4

Eksendin-4 ble syntetisert ved fast-fase peptidsynteseteknikker og sammenlignet med syntetisk GLP-1 med hensyn til in vitra binding til, og aktivering av, GLP-1 reseptorer, og in viva med hensyn til nedsettelse av plasmaglukose i diabetiske db/ db mus. I et plasmamembranpreparat av en insulinom-rottecellelinje (RINmSf) som uttrykker GLP-1 reseptoren, ble peptidene analysert for deres evne til å binde og deplassere radioaktivt merket GLP-1 og for deres evne til stimulere produksjonen av cAMP. Den relative rekkefølge av bindingspotens ble funnet til å være GPL-1 > eksendin-4. Den relative rekkefølge av cyklaseaktivering var GLP-1 =eksendin-4. Affiniteter, som vist i den etterfølgende tabell, avviker over et 4- til S-ganger område. I motsetning, avviker den in vivo glukosenedsettende potens over et 3430-ganger område. Eksendin-4 var 3430-ganger mere potent enn GLP-1. In vivo potensen av eksendin-4 matcher ikke potensen ved GLP-1 reseptoren, og er sannsynligvis kulimineringen av en opphopning avegenskaper.

EKSEMPEL 9 - SAMMENLIGNING AV GLYKEMISKE KJENNETEGN OG

INSULINSENSITIVITET I PARVIS FOREDE OG EKSENDIN-4-BEHANDLENDE DIABETISKE "FATTY ZUCKER" (ZDF) ROTTER

Dette eksempel tester om de fordelaktige effekter av eksendin-4 i ZDF rotter var sekundære med hensyn til forandringer i næringsinntak. Det sammenligner effekter oppnådd med eksendin-4 med effekter observert i saltoppløsningsbehandlede matchede dyr som konsumerte den samme mengde for som ble spist ZDF rotter injisert subkutant to ganger daglig med 10 ug eksendin-4. Plasmaglukose og HbAIc ble målt ukentlig i 6 uker. En dag etter den siste behandling ble dyrene bedøvet med halotan og underkastet en hyperinsulinemi (50 mU/kg/min.) euglykemisk clamp. Endringer i HbAIc i løpet av 6 uker avvek mellom behandlingsgrupper (P<0,001 ANOVA), med økning i ad Hb forede (n=5) og parvis-forede (n=5) rotter, men avtok i eksendin-4-behandlede rotter (n=5). Tilsvarende, avvek forandringer i plasmaglukose mellom behandlingsgrupper (p<0,002 ANOVA), med økning i ad Hb forede og parvis-forede ZDF-rotter, og nedsettelse i ZDF-rotter behandlet med eksendin-4. I den siste timen av 3-timers clamp protokoll, var glukoseinfusjonshastigheten i eksendin-4-behandlede rotter tilbøyelig til å være høyere enn i henholdsvis parvis forede (+105%) og ad Hb forede (+20%) kontroller, (10,14 ± 11,43 n=5, 8,46 ± 10,87 n=4, 4,93 ± 2,02 mg/kg/min. n=3, n.s. P=0,09 ANOVA). En annen indeks for insulinsensitivitet, plasmalaktatkonsentrasjon, avviker signifikant mellom behandlingsgrupper (p<0,02 ANOVA) og var lavest i eksendin-4-behandlede rotter. Således er eksendin-4 behandling assosiert med forbedring i glykemi-kjennetegn og i insulinsensitivitet som delvis, men ikke fullstendig, matches i kontroller foret med den samme mengde for, som indikerer at forbedringer i metabolsk kontroll med eksendin-4 i ZDF-rotter i det minste delvis skyldes mekanismer ut over kalorirestriksjon.

EKSEMPEL 10 - KLINISKE STUDIER OG STIMULERING AV ENDOGEN

INSULINSEKRESJON VED SUBKUTAN SYNTETISK EKSENDIN-4 I FRISKE FRIVILLIGE SOM HADDE FASTET OVER NATTEN

I et dobbel-blind, placebo-kontrollert stigende enkeldose klinisk forsøk for å undersøke sikkerhet og tolererbarhet og farmako-kinetikker av syntetisk eksendin-4, ble eksendin-4 utformet for subkutan injeksjon evaluert i friske frivillige av hankjønn mens effekter på plasmaglukose og insulinkonsentrasjoner ble vurdert. Fem enkle subkutane doser av eksendin-4 (0,01, 0,05, 0,1, 0,2 eller 0,3 ug/kg) ble studert i 40 friske frivillig av hankjønn i den fastende tilstand. Maksimale eksendin-4 plasmakonsentrasjoner ble oppnådd mellom I og 2 timer etter dosering med liten forskjell blant de undersøkte doser. Undersøkelse av data indikerer en doseavhengig økning for Cmaks- Der var ingen alvorlige negative hendelser rapportert i dette studium og i de friske frivillige av hankjønn som deltok i dette studium, og eksendin-4 ble godt tolerert ved subkutane doser opp til og inkluderende 0,1 ug/kg. Et fall i plasmaglukosekonsentrasjon ble også observert ved denne dose. Ved doser på 0,2 ug/kg og høyere, var de mest vanlig observerte bivirkninger hodepine, kvalme, oppkast, svimmelhet og postural hypotensjon. Der var et forbigående fall i plasmaglukosekonsentrasjon etter administrering av doser på 0,05 ug/kg og høyere.

Førti friske, tynne (gjennomsnittlig BMI (±SE) 22,7 ± 1,2) individer med alder 18-40 år ble tilfeldig plassert i 5 grupper. Innen hver gruppe på 8 individer fikk 6 tildelt eksendin-4 og 2 placebo (PBO). Eksendin-4 (0,01, 0,05, 0,1, 0,2 eller 0,3 ug/kg) eller placebo ble administrert etter fasting over natten og plasma eksendin-4, glukose og insulin- konsentrasjoner ble målt sammen med sikkerhet og tolererbarhet. Ingen spørsmål vedrørende sikkerhet ble observert. Doser < 0,1 ug/kg ble tolerert såvel som PBO mens 0,2 og 0,3 ug/kg utløste en doseavhengig økning i kvalme og brekninger. Topp- plasmakonsentrasjoner av eksendin-4 steg på doseavhengig måte og etter 0,1 ug/kg vedvarte eksendin-4 immunreaktivitet i 360 min. Plasmaglukose avtok etter alle doser, unntatt 0,01 ug/kg, nådde et lavpunkt ved 30 min. og vendte tilbake til basislinjen innen 180 min. Individer som mottok 0,3 pg/kg mottok en kaloridrikk 30 min. etter dosering, som utelukket sammenligning av deres data. Gjennomsnittlig forandring i plasmaglukose (0-180 min): (0,03 ± 0,07, -0,07 ± 0,08, -0,38 ± 0,14, -0,85 ± 0,13 og 0,83 ± 0,23 mmol/l for PBO, henholdsvis 0,01, 0,05, 0,1 og 0,2 ug/kg, P < 0,02 versus PBO). Den laveste plasmaglukose som ble målt var 3,4 mmol/l. Tilsvarende gjennomsnittlige forandringer i plasmainsulin (0-120 min.) var 0,43 ± 0,59, 2,37 ± 0,58, 2,28 ± 0,66, 4,91 ± 1,23 og 14,00 ± 13,34 uU/ml, p ± 0,01 versus PBO for 0,01 og 0,2 pg/kg gruppene. Således, i friske frivillige som hadde fastet over natten representerte subkutan injeksjon av eksendin-4 (1) ingen sikkerhetsrisiko, (2) ble godt tolerert ved doser < 0,1 ug/kg, (3) førte til eksendin-4 immunoreaktivitet i plasma i opp til 6 timer, (4) økte plasmainsulin og nedsatte plasmaglukose på en doseavhengig måte uten å indusere hypoglykemi.

EKSEMPEL 12 - ET ENKELT-BLIND, PLACEBOKONTROLLERT STUDIUM

PÅ METABOLSKE EFFEKTER AV EN REKKE DOSER AV SYNTETISK EKSENDIN-4 GITT VED SUBKUTAN INJEKSJON TIL MENNESKER MED TYPE 2 DIABETES MELLITUS

Dette eksempel beskriver resultatene fra et to-delt, enkel-blind, placebokontrollert studium for å undersøke de metabolske effekter av en rekke doser av syntetisk eksendin-4 gitt ved den subkutane rute til individer med type II diabetes mellitus. Individene involvert i studiet var individer diagnostisert med type II diabetes og som ble kontrollert med diett og/eller med orale hypoglykemimidler (OHA'er) og med HbAickonsentrasjon >7,0%, men <12,0% ved screeningbesøket.

Studiet begynte med et screeningsbesøk, hvoretter individene som tar OHA'er ble instruert til å stanse denne medikasjon og komme til klinikken omtrent 14 dager senere når effekten av OHA hadde forsvunnet. Individer som deltok i dellankom klinikken på ettermiddagen før den første dose og begynte de tre eller fire fastsatte doseringsdager. Hver dosering var fastsatt til 24 timers mellomrom.

Etter samtykke og screening ble individer tilfeldig bestemt til å motta syntetisk eksendin-4 eller placebo. I den første del av studiet ble seks individer holdt ved en "in-patient" klinisk forskningsenhet i tre til fire dager og tildelt fra en til fire behandlingssekvenser, hvor de skulle motta hver av de etterfølgende doser: placebo eller syntetisk eksendin-4 ved 0,1 eller 0,01, eller eventuelt 0,001 ug/kg. Doser ble administrert subkutant etter faste over natten. Et standardisert flytende måltid ble gitt 15 minutter etter injeksjon av studiemedisineringen. Tabellen i det etterfølgende viser doseringsfortegnelsen for del 1:

I den andre del av studiet, omtrent tre dager etter at del 1 var ferdig, ble åtte individer også holdt ved en "in-patient klinisk forskningsenhet i fire dager. Individene var individer som var forskjellige fra dem som deltok i del 1. Studieprosedyrene og hendelsesplanene under del 2 var overensstemmende med dell. Dosene ble bestemt etter at effekten på glukose i del 1 var analysert.

Fordi der ikke var noen signifikant effekt sett ved 0,01 g/kg under del 1, ble individer dosert i henhold til den etterfølgende fortegnelse i del 2:

Individer som deltok i del 2 begynte deres dosering etter gjennomgåelse av dataene fra dell på samme måte. Alle individer vendte tilbake til klinikken 4 til 6 dager etter de forlot "in-patient" enheten for en sikkerhets-revurdering.

Det syntetiske eksendin-4 anvendt for studiet var en klar fargeløs steriloppløsning for subkutan injeksjon, utformet i natriumacetatbuffer (pH 4,5) og inneholdende 4,3% mannitol som et iso-osmolalitetsmodifiserende middel. Styrken på den syntetiske eksendin-4 injeksjon var 0,1 mg/ml. En 1 ml oppløsning ble innført i 3 ml rør med gummikorker. Placebooppløsning ble fremstilt fra den samme sterile formulering, men uten legemiddelsubstansen, syntetisk eksendin-4.

Resultatene fra studiet er vist i figurer 16 og 17. De indikerer den evnen som de forskjellige doser av eksendin-4 (0,2 ug/kg, 0,05 ug/kg og 0,1 ug/kg) har til å nedsette blodglukose i mennesker med type 2 diabetes.

EKSEMPEL 13

Dette eksempel beskriver et forsøk for å bestemme en doserespons for de insulin-sensibiliserende effekter av eksendin-4 og agonister derav i ZDF rotter. Eksendin-4 anvendt i disse studier ble oppnådd fra Bachem (Torrance, CA, Cat H8730, Lot 506189) American Peptides (Sunnyvale, CA, Cat 30157, Lot K1005ITI) og fra egen fast-fase syntese (lot AR1374-11, peptidinnholld 93,3%). Trettini ZDF hannrotter/Gmi™- (fa/fa) (alder 116±20 dager, vekt 441 ±39 g) ble fordelt i 5 behandlingsgrupper: kun saltoppløsningsinjeksjoner (n=9), eksendin-4 injeksjoner 0,1, 1, 10 eller 100 ug (n=9, 10, 6, 5, henholdsvis). Avdisse ble 35 rotter anvendt i hyperinsulinemisk, euglykemisk clamp studier (n=9, 7, 9, 5, 5, henholdsvis). Blodprøver ble tatt fra enden av den topisk bedøvede hale (Hurricane merke, 20% topisk benzokainoppløsning, Beutlich, Waukegan, IL) av bevisste rotter som hadde fastet over natten før behandling og ved ukentlige intervaller i 5 uker under behandling for analyse av hemoglobin A1c(DCA2000 lateks immuno-agglutineringsinhibering, Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY). Kroppsvekt ble målt daglig.

Etter 6 ukers behandling, -16 timer etter den siste eksendin-4 etter saltoppløsningsdose, og etter faste over natten, ble hyperinsulinemisk, euglykemisk clamp (DeFronzo RA, Tobin JD, Andres R: Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. AmerJ Physiol 237: E214-23,1979) utført på halotan-bedøvede rotter. Rotter ble termoregulert, trakeotomisert og kateterisert via saphenusvenen for infusjon av 20% D-glukose og insulin, og via femoralarterien for blodprøvetaking og måling av blodtrykk (P23XL transducer, Spectramed, Oxnard, CA, universal amplifier, Gould, Valley View, OH, A/D conversion, DataTranslation, Wilmington, DE). Insulin (Humulin-R, Eli Lilly, Indianapolis, IN) ble infusert ved 50 mU/kg/min., begynnende ved t=-30 min. og fortsettelse inntil t=+180 min. Glukose ble innført ved infusjon i en variabel takt for å opprettholde euglykemi, bestemt ved glukoseprøvetaking og analyse ved 5 min. intervaller (immobilisert glukoseoksidasemetode, YSI 2300-Stat Analyzer, Yellow Springs, OH). Gjennomsnittlig plasmaglukose i løpet av damps var 103,9 mg/dl (gjennomsnittlig variasjonskoeffisient var 5,8%). Glukoseinfusjonshastighetsdata for analyser ble tatt fra t=60-180 min. når responser hadde nærmet seg steady state. Plasmalaktatdata, oppnådd fra en immobilisert laktatoksidasesensor innlemmet i glykoseanalysatoren, ble også samlet.

Injeksjon ble gitt intraperitonealt ved -8 a.m. og 4 p.m., mandag til og med fredag, og ved -10 a.m. på lørdag og søndag.

Parvise statistiske analyser ble utført ved anvendelse av Studenfs t-test rutiner (Instat v3,0, GraphPad Software, San Diego, CA) ved anvendelse av P<0,05 som signifikansnivået. Dose-responsanalyser anvendte 4-parameter logistisk regresjon og generelle effekter ble testet ved anvendelse av en-veis ANOVA (Prism v3,0, GraphPad Software, San Diego, CA).

Resultatene viste at i ZDF rotter behandlet med forskjellige doser av eksendin-4 i 6 uker, var der en doseavhengig reduksjon i næringsinntak (ED500,14 ug ± 0,15 log, se fig. 13a), og i kroppsvekt (ED500,42 ug ± 0,15 log, se fig. 13b) på opp til 27 ± 2 g, som representerer en 5,6 ± 0,5% nedgang i kroppsvekt i forhold til

saltoppløsningsinjiserte kontroller.

I denne gruppen av rotter fremkom det diabetiske forløp som progressivt, da hemoglobin AIC steg initialt i alle grupper. Injeksjon av eksendin-4 synes ikke desto mindre å stanse og reversere stigningen i hemoglobin A1cpå doseavhengig måte (se fig. 13c). Eksendin-4 doseresponsen for effekt på hemoglobin AIC målt under de siste to uker av behandling var generelt signifikant (P=0,05 ANOVA) og spesifikk ved 1 ug og 100 ug dose, (henholdsvis P<0,005, P<0,02). Et lignende mønster ble observert i forbindelse med fastende plasmatriglyserider i de siste 2 uker av behandling, hvor plasmakonsentrasjoner var signifikant reduserte ved alle doser med mellom 51% og 65% (P<0,002 ANOVA).

Trettifem av de 39 rottene som gikk inn i studiet gikk videre til en hyperinsulinemisk, euglykemisk clamp -16 timer etter deres siste behandling. Initial fastende plasma- glukosekonsentrasjoner, høyere i saltoppløsnings-behandlede (489±28 mg/dl) enn eksendinbehandlede rotter, falt med insulinin-fusjon og var deretter faste ved tilsvarende plasmaglukosekonsentrasjoner (105,6 ml/dl ved 60-180 min., gjennomsnittlig variasjonskoeffisient 4,6%, se fig. 14a). Glukoseinfusjonshastighet som var nødvendig for å opprettholde euglykemi ble doseavhengig økt ved forbehandling med eksendin-4 (ED501,0 ug ± 0,41 log, se fig. 14b). Eksendin-4 behandling økte glukoseinfusjonshastighet med opp til 48%

i forhold til saltoppløsningsbehandlede kontroller.

Plasmalaktatkonsentrasjon før og under clamp prosedyren ble doseavhengig redusert ved først behandling med eksendin-4 (ED504 ug ± 0,25 log, se fig. 14c). Denne effekt, som representerer opp til en 42% reduksjon i gjennomsnittlig plasmalaktatkonsentrasjon mellom 60 og 180 minutter av clamp, synes primært å skyldes en reduksjon i pre-clamp (basal) laktatkonsentrasjon, idet økninger i plasmalaktat under hyperinsulinemi var tilsvarende i alle behandlingsgrupper. Der var ingen behandlingsrelaterte forskjeller i gjennomsnittlig arterietrykk som målt før eller under clamp prosedyrer.

Den omtrentlige 50% økning i insulinsensitivitet observert etter kronisk administrering av eksendin-4 var både viktig og overraskende i betraktning av observasjoner om at eksendin-4 har ingen akutt effekt i insulinsensitive vev in vitro (dvs. ingen effekt på basal eller insulinstimulert innlemmelse av radioaktivt merket glukose i glykogen i isolert soleusmuskel, eller i lipid i isolerte adiposytter, pittner et al., upublisert). Skjønt muligheten for økningen i insulinsensitivitet i noen grad kan ha kommet fra forbedret alvkemikontroll og redusert glukosetoksisitet ikke kan oversees, er det blitt rapportert at økningen i insulin- sensitivitet fra forskjellige anti diabetiske terapier, inkluderende dem som ikke er klassifisert som insulinsensibiliserende, er ganske variabel og det er blitt rapportert at akutt behandling med GLP-1 ikke synes å umiddelbart endre insulinsensitivitet i mennesker (Orskov L, Holst JJ, Moller J, Orskov C, Moller N, Alberti KG, Schmitz O: GLP-1 does not acutely affect insulin sensitivity in healthy man. Diabetologia 39:1227-32, 1996, Ahren B, Larsson H, Holst JJ: Effects of glucagon-like peptide-1 on islet function and insulin sensitivity in noninsulindependent diabetes mellitus. J Clin EndoGrinol Metab 82:473-8, 1997, UK Prospective Diabetes Study Group: Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33). Lancet 352:837-53, 1998). Således synes kronisk administrering av eksendin-4 å være assosiert med økninger i insulinsensitivitet som er så høy som, om ikke høyere enn, dem observert med andre terapier, inkluderende insulinsensibiliserende legemidler som tiazolidindioner og metformin.

REFERANSEEKSEMPEL 2

Fremstilling av amidert peptid med SEQ. ID. No. 9

Det ovenfor identifiserte peptid ble satt sammen på 4-(2'-4'-dimetoksyfenyl)-Fmoc-aminometylfenoksyacetamidnorleucin MBHA harpiks (Novabiochem, 0,55 mmol/g) ved anvendelse av Fmoc-beskyttede aminosyrer (Applied Biosystems, Inc.). Generelt ble enkelkoblings-sykluser anvendt gjennom syntesen og Fast Moe (HBTU aktivering) kjemi ble benyttet. I noen posisjoner var imidlertid kobling mindre effektivenn forventet og dobbelkoblinger var nødvendig. Spesielt krevde alle rester ASP9, Thr7og Phe6dobbelkobling. Avbeskyttelse (fjerning av Fmoc-gruppe) av den voksende peptidkjede ved anvendelse av piperidin var ikke alltid effektiv. Dobbel avbeskyttelse var nødvendig i posisjoner Arg2oVahg og LeuH. Endelig avbeskyttelse av den ferdige peptidharpiks ble oppnådd ved anvendelse av en blanding av trietylsilan (0,2 ml), etanditiol (0,2 ml), anisol (0,2 ml), vann (0,2 ml) og trifluoreddiksyre (15 ml) i henhold til standard metoder (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc.). Peptidet ble presipitert i eter/vann (50 ml) og sentrifugert. Precipitatet ble rekonstituert i iseddik og frysetørket. Det frysetørkede peptid ble oppløst i vann. Rå-renhet var omtrent 55%.

I rensetrinn og analyser ble løsningsmiddel A (0,1% TFA i vann) og løsningsmiddel B (0,1 % TFA i ACN) anvendt.

Oppløsningen som inneholdt peptid ble påført på en preparativ C-18 kolonne og renset (10% til 40% løsningsmiddel B i løsningsmiddel A i løpet av 40 minutter). Renhet til fraksjoner ble bestemt isokratisk ved anvendelse av en C-18 analytisk kolonne. Rene fraksjoner ble samlet og fremskaffet det ovenfor identifiserte peptid. Analytisk RP-HPLC (gradient 30% til 60% løsningsmiddel B i løsningsmiddel A i løpet av 30 minutter) av det frysetørkede peptid ga produktpeptid med en observert retensjonstid på 14,5 minutter. Elektrospray-massespektrometri (M): beregnet 4131,7, funnet 4129,3.

EKSEMPLER A TILE

Anvendte reagenser

GLP-1 [7-36]NH2 (GLP-1) ble fremskaffet fra Bachem (Torrance, CA). Alle andre peptider ble fremstilt ved anvendelse av syntesemetoder som dem beskrevet heri. Alle kjemikalier var av den beste kommersielle kvalitet. cAMP SPA immunoassay ble tilveiebragt fra Amersham. Radioligandene ble tilveiebragt fra New England Nuclear (Boston, MA). RINm5f celler (American Type Tissue Collection, Rockville, MD) ble dyrket i DME/F12 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og 2mM L-glutamin. Celler ble dyrket ved 37°C og 5% C02/95% fuktig luft og medium ble erstattet hver 2. til 3. dag. Celler ble dyrket til konfluens og deretter høstet og homogenisert ved anvendelse av en Polytron homogenisator. Cellehomogenater ble lagret i frossen tilstand ved -70°C inntil bruk.

EKSEMPEL A - GLP1 RESEPTORBINDINGSSTUDIER

Reseptorbinding ble bestemt ved å måle deplasement av [<125>I]GLP-1 eller [<125>l]eksendin(9-39) fra RINm5f membraner. Analysebuffer inneholdt 5 ug/ml

bestatin, 1 ug/ml fosforamidon, 1 mg/ml bovint serumalbumin (fraksjon V), 1 mg/ml bacitracin og 1 mM MgCI2i 20 mM HEPES, pH 7,4. For å måle binding ble 30 ug membranprotein (Bradford proteinanalyse) resuspendert i 200 ul analysebuffer og inkubert med 60 pM [<125>I]GLP-1 eller [<125>l]eksendin(9-39) og umerkede peptider i 120 minutter ved 23°C i 96 brønns plater (Nagle Nunc, Rochester, NY). Inkubasjoner ble terminert ved hurtigfiltrering med kald fosfatbufret saltoppløsning, pH 7,4, gjennom polyetylenimin-behandlede GF/B glassifberfiltere (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) ved anvendelse av en Tomtec Mach II platehøster (Wallac Inc., Gaithersburg, MD). Filtere ble tørket, kombinert med scintillasjonsvæske og radioaktivitet ble bestemt i en Betaplate væskescintillasjonsteller (Wallac Inc.).

Peptidprøver ble kjørt i forsøkene som duplikat-punkter ved 6 fortynninger over et konsentrasjonsområde fra 10"<6>M til 10"<12>M for å danne responskurver. Den biologiske aktivitet av en prøve uttrykkes som en IC50verdi og beregnes fra rådataene ved anvendelse av et iterativt kurve-tilpasningsprogram ved anvendelse av en 4-parameter logistikkligning (Prizm, GraphPAD Software).

EKSEMPEL B - CYKLASEAKTIVERINGSSTUDIUM

Analysebuffer inneholdt 10 uM GTP, 0,75 mM ATP, 2,5 mM MgCI2, 0,5 mM fosfokreatin, 12,5 U/ml kreatinkinase, 0,4 mg/ml aprotinin, 1 uM IBMX i 50 mM HEPES, PH 7,4. Membraner og peptider ble kombinert i 100 ml analysebuffer i 96 brønns filter-bunnplater (Millipore Corp., Bedford, MA). Etter 20 minutters inkubasjon ved 37°C ble analysen terminert ved overføring av supernatant ved filtrering inn i en ny 96 brønns plate ved anvendelse av en Millipore vakuum-manifold. Supernatant cAMP-innhold ble kvantifisert ved SPA immunoassay. Peptidprøver ble kjørt i analysen som triplikat-punkter ved 7 fortynninger over et konsentrasjonsområde fra 10"<6>M til 10"<12>M for å danne responskurver. Den biologiske aktivitet til en spesiell prøve ble uttrykt som en EC50verdi, beregnet som beskrevet i det foregående.

EKSEMPEL C - BESTEMMELSE AV BLODGLUKOSENIVÅER I DB/DB MUS

C57BLKS/J-m-db mus som var minst 3 måneder gamle ble anvendt for studiet. Musene ble oppnådd fra The Jackson Laboratory og ble akklimatisert i minst en uke før bruk. Musene ble holdt i grupper på ti ved 22°C ± 1°C med en 12:12 lys:mørke syklus, og med lys på fra kl. 6.00. Alle dyrene ble fratatt for 2 timer før basislinje-blodprøver ble tatt. Omtrent 70 ul blod ble tatt fra hver mus via øyepunksjon, etter en lett anestesi med metofan. Etter samling av basislinje-blodprøver, for å måle plasmaglukosekonsentrasjoner, mottok alle dyr subkutane injeksjoner av enten vehikkel (10,9% NaCI), eksendin-4 eller testforbindelse (1 ug) i vehikkel. Blodprøver ble tatt igjen ved anvendelse av den samme prosedyre, nøyaktig en time etter injeksjonene, og plasmaglukosekonsentrasjoner ble målt. For hvert dyr, ble % forandring i plasmaverdi, fra basislinje-verdi, beregnet.

EKSEMPEL D - DOSE-RESPONS BESTEMMELSE AV

BLODGLUKOSENIVÅER I DB/DB MUS

C57BLKS/J-m-db/db mus som var minst 3 måneder gamle ble anvendt i dette studium. Musene ble oppnådd fra The Jackson Laboratory og ble akklimatisert i minst en uke før bruk. Musene ble holdt i grupper på ti ved 22°C ± 1°C med en 12:12 lys:mørke syklus, hvor lys ble satt på kl. 06.00. Alle dyrene ble fratatt for 2 timer før det ble tatt basislinje-blodprøver. Omtrent 70 ul blod ble tatt fra hver mus via øyepunksjon, etter en lett anestesi med metofan. Etter samling av basislinje-blodprøver, for å måle plasmaglukosekonsentrasjoner, mottok alle dyr subkutane injeksjoner av enten vehikkel, eksendin-4 eller testforbindelse i konsentrasjoner som indikert. Blodprøver ble tatt igjen ved anvendelse av den samme prosedyre, nøyaktig en time etter injeksjonene, og plasmaglukosekonsentrasjoner ble målt. For hvert dyr, ble % forandring i plasmaverdi, fra basislinje-verdi beregnet, og en doseavhengig sammenheng ble evaluert ved anvendelse av Graphpad Prizm software.

EKSEMPEL E - GASTRISK TØMMING

Det følgende studium ble og kan gjennomføres for å undersøke effektene av eksendin-4 og/eller en eksendinagonistforbindelse på gastrisk tømming i rotter. Dette forsøk fulgte en modifikasjon av metoden til Scarpignato, et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 246:286-94, 1980. Harlan Sprague Dwaley (HSD) hannrotter ble anvendt. Alle dyrene ble holdt ved 22,7 ± 0,8°C i en 12:12 timers lys:mørke syklus (forsøk utføres under lyssyklusen) og ble foret og fikk vann ad libitum (Diet LM-485, Teklad, Madison, Wl). Eksendin-4 ble syntetisert i henhold til standard peptidsyntesemetoder. Fremstillingen av eksendin-4 er som beskrevet i referanseeksempel 2. Bestemmelsen av gastrisk tømming ved hjelp av metoden beskrevet i det etterfølgende ble utført etter en faste på -20 timer for å sikre at magen ikke inneholdt noe kymus som ville interferere med de spektrofoto-metriske absorbansmålinger.

Bevisste rotter mottok, ved magesonde, 1,5 ml av en kalorifattig gel som inneholdt 1,5% metylcellulose (M-0262, Sigma Chemical Co, St Louis, MO) og 0,05% fenolrød-indikator. Tyve minutter etter innføring via magesonde ble rottene bedøvet ved anvendelse av 5% halotan, magen ble eksponert og avklemt ved de pylore og nedre øsofagus-sfinktere ved anvendelse av arterieklemmer, fjernet og åpnet i en alkalisk oppløsning som ble tildannet opp til et fast volum. Mageinnhold ble utledet fra intensiteten av fenolrødt i den alkaliske oppløsning, målt ved hjelp av absorbans ved en bølgelengde på 560 nm. I separate forsøk på 7 rotter ble både mage og tynntarm fjernet og åpnet i en alkalisk oppløsning. Mengden fenolrødt som kunne oppnås fra den øvre gastrointestinalkanalen innen 20 minutter fra magesondetilførsel var 89±4%, idet fargestoff som synes å binde uforenelig med tarmkanal-luminaloverflaten kan ha svart for balansen. For å gjøre greie for maksimal fargeutvinning på mindre enn 100%, ble % mageinnhold som var igjen etter 20 minutter uttrykt som en fraksjon av de gastriske innhold gjen-vunnet fra kontrollrotter som var avlivet umiddelbart etter sondetilførsel i det samme forsøk. Prosent gjenværende gastrisk innhold = (absorbans ved 20 min.)/(absorbans ved 0 mm) x 100.

Claims

1. Farmasøytisk formulering, karakterisert vedat den omfatter fra 0,005% til 0,4% (vekt/volum) eksendin-4, fra 0,02% til 0,5% (vekt/volum) av en acetatbuffer, fra 1,0% til 10% (vekt/volum) mannitol og fra 0,005% til 1,0% (vekt/volum) m-kresol, hvor nevnte formulering har en pH mellom 4,0 og 6,0.

2. Formulering som angitt i krav 1, hvori eksendin-4 er til stede i en konsentrasjon på mellom 0,005% og 0,05% (vekt/volum).

3. Formulering som angitt i krav 1 eller 2, hvori pH er mellom 4,0 og 5,0.

4. Formulering som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4, som er egnet for: (a) administrering via injeksjon for å oppnå en dose fra 0,1 til 0,5 ug per kilogram av eksendin-4; (b) administrering via injeksjon for å oppnå en dose fra 1 ug til 1 mg av eksendin-4 per døgn.

5. Formulering som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 3, som er egnet for administrering via injeksjon for å oppnå en dose fra 0,005 ug/kg per dose til 0,2 ug/kg per dose av eksendin-4.

6. Formulering som angitt i ett eller flere av de foregående krav for anvendelse for å øke et individs sensitivitet overfor eksogent eller endogent insulin.