NO329492B1 - Anvendelse av immunstimulerende oligodeoksynukleinsyremolekyler for fremstilling av immunstimulerende, farmasoytiske sammensetninger og farmasoytiske sammensetninger som inneholder de samme. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår immunstimulerende

oligodeoksynukleinsyremolekyler (i det etterfølgende kalt ODN-molekyler) og farmasøytiske sammensetninger inneholdende disse.

Vaksiner kan redde flere liv (og ressurser) enn noe annet medisinsk intervensjon (Nossal, 1998). På grunn av verdensomspennende vaksinasjonsprogrammer har forekomsten av mange fatale sykdommer blitt dramatisk redusert. Skjønt dette gjelder for en rekke forskjellige sykdommer slik som tuberkulose, difteri, kikhoste, meslinger og stivkrampe, så er det ingen effektiv vaksine for tallrike andre infiserende sykdommer, blant annet de fleste virusinfeksjoner slik som AIDS. Det er heller ingen effektiv vaksine for andre sykdommer, enten disse er infiserende eller ikke-infiserende som hvert år krever millioner av liv, og eksempler er malaria eller kreft. I tillegg vil den raske utviklingen av antibiotikaresistente bakterier og mikroorganismer gjøre det meget ønskelig å kunne utvikle alternative vaksinebehandlinger. Endelig er det store behovet for vaksiner illustrert ved det faktum at infeksjonssykdommer, snarere enn kardiovaskulære sykdommer eller kreft eller skader, fremdeles er den viktigste årsaken til død og uførhet i verden (Bloom og Widdus, 1998).

Sett fra et immunologisk standpunkt er ett av hovedproblemene ved utviklingen av vaksiner i dag, at tradisjonelle vaksiner (og/eller immunmodulerende forbindelser som inneholder disse preparater), er utformet for å indusere høye nivåer av antistoffer (Harrow og Lane, 1998). Antistoffene som sådan er imidlertid ikke effektive for å hindre en rekke forskjellige sykdommer, f.eks. de fleste sykdommer som er forårsaket av virus, intracellulære bakterier, visse parasitter og kreft. Eksempler på slike sykdommer, men ikke begrenset til disse, er de ovennevnte HIV-virus eller plasmodiumarter i forbindelse med malaria. I tallrike eksperimentelle systemer er det blitt vist at den cellulære delen av immunsystemet, heri inngår blant annet T-celler, snarere enn den humorale delen, er viktig for disse indikasjonene. Det er derfor viktig å utvikle ny teknologi for å unngå de begrensninger som forefinnes i vanlig kjente vaksiner. Fokus må derfor rettes inn mot teknologi som pålitelig induserer det cellulære immunsystemet, heri inngår blant annet antigenspesifikke T-celler, som gjenkjenner molekyler som er uttrykt på patogeninfiserte celler. Ideelt bør vaksinen utformes slik at den induserer både T-celler som gjenkjenner syke og/eller infiserte celler fra normale celler, og samtidig gjenkjenner antistoffer som er utskilt av B-celler som gjenkjenner patogener utenfor cellene.

Det finnes i dag flere vaksiner som består av levende svekkede organismer, hvor det er en risiko for at den svekkede organismen vender tilbake til den virulente villtypen. Spesielt i verter eller pasienter med svekket immunsystem, kan dette være et livstruende scenario. Alternativt kan vaksine administreres som en kombinasjon av patogenavledede antigener sammen med forbindelser som induserer eller bedrer immunreaksjonene mot disse antigenene (disse forbindelsene blir vanligvis betegnet som «adjuvante»), ettersom disse underenhetsvaksinene som sådan generelt ikke er effektive.

Skjønt det er ingen tvil om at de ovennevnte vaksiner er meget verdifulle medisinske behandlinger, så har de den ulempen at de på grunn av sin kompleksitet kan frembringe alvorlige bivirkninger, f.eks. i forhold til antigenene som forefinnes i vaksinen som kan utøve tverr-reaktivitet med molekyler som er uttrykt av celler hos de vaksinerte individene. I tillegg kan det være vanskelig å oppfylle de krav som er reist fra regulerende myndigheter, f.eks. Verdens Helseorganisasjon (WHO), the Food and Drug Administration (FDA), og deres europeiske motparter, for en eksakt spesifikasjon av vaksinesammensetningen og de mekanismer som ligger under for en induksjon av immunitet.

Antigenpresenterende celler hører til det naturlige eller medfødte immunsystemet som er blitt utviklet som et første linje vertsforsvar som begrenser infeksjonene på et tidlig tidspunkt etter eksponering overfor mikroorganismer (Hoffmann et al., 1999). Celler i det medfødte eller naturlige immunsystemet gjenkjenner mønsteret eller relativt ikke-spesifikke strukturer som er uttrykt på sine mål, snarere enn mer sofistikerte og spesifikke strukturer som gjenkjennes av det adaptive immunsystemet (Hoffmann et al., 1999). Eksempler på celler i det naturlige immunsystemet er makrofager og dendrittiske celler, men også granulocytter (f.eks. nøytrofiler), naturlige dreperceller og andre. I motsetning til dette gjenkjenner celler i det adaptive immunsystemet spesifikke antigene strukturer, slik som peptider, i forbindelse med T-celler, og peptider, så vel som deres tredimensjonale strukturer, noe som er tilfelle med B-celler. Det adaptive immunsystemet er det langt mer spesifikt og sofistikert enn det naturlige immunsystemet, og blir forbedret ved gjentatte eksponeringer overfor et gitt patogen/antigen. Fylogenetisk eller utviklingsmessig er det naturlige immunsystemet langt eldre og er til stede allerede i meget primitive organismer. Ikke desto mindre er det naturlige immunsystemet kritisk under den første fasen av antigeneksponering, som i tillegg til å inneholde patogener, så vil celler i det naturlige immunsystemet, det vil si antigenpresenterende celler, stimulere celler i det adaptive immunsystemet, og således utløse spesifikke immunreaksjoner som fører til eliminasjon av de inntrengende mikroorganismer. Summa summarum så spiller cellene i det naturlige immunsystemet, og da spesielt antigenpresenterende celler, en kritisk rolle under induksjonsfasen av immunreaksjonene, ved a) å angripe induksjonen ved hjelp av et primitivt mønstergjenkjennelsessystem, og b) stimulere celler i det adaptive immunsystemet, noe som fører til spesifikke immunreaksjoner og utvikling av hukommelse, noe som resulterer i en eliminasjon av inntrengende patogener eller andre mål (Roitt et al., 1998). Disse mekanismene kan også være viktig for å eliminere eller angripe tumorceller.

Som nevnt ovenfor så gjenkjenner celler i det medfødte eller naturlige immunsystemet mønstre som blir uttrykt på sine respektive mål. Eksempler er lipopolysakkarider (LPS) i tilfellet med gram-negative bakterier, myobakterielle glykolipider, lipoteicholinsyrer i forbindelse med grampositive bakterier, mannaner fra gjær og dobbelttrådede RNA-molekyler fra virus (Hoffmann et al., 1999). I tillegg kan de gjenkjenne mønstre, slik som endrede glykosyleringer av proteiner på tumorceller.

Nye oppdagelser beskriver DNA-molekyler fra protozoer eller lavere eukaryoter som et ytterligere mønster som gjenkjennes av det naturlige (men muligens også av det adaptive) immunsystemet i pattedyr (og mest sannsynlig i alle vertebrater)

(Krieg, 1996; Lipford et al., 1998).

Immunsystemet gjenkjenner lavere organismer, slik som bakterier, sannsynligvis på grunn av strukturelle og sekvensbruksforskjeller mellom patogenen og vertens DNA. Spesielt målsøkt eller angrepet blir spesielle korte strekninger av DNA som er avledet fra ikke-vertebrater, eller i form av korte syntetiske oligodeoksynukleinsyremolekyler som inneholder ikke-metylerte cytosin-guanin dinukleotider (CpG) i en viss basesammenheng (Krieg et al., 1995). Det er funnet CpG-motiver med den forventede frekvens i bakterielt DNA, men med langt lavere frekvens i DNA fra vertebrater (LipLord et al., 1998; Pisetsky, 1999). I tillegg er ikke-vertebrat (f.eks. bakterielt) CpG-motiv ikke metylert, mens dette er tilfelle med vertebrat CpG-sekvenser. Disse forskjellene mellom bakterielt DNA og vertebrat DNA, gjør at sistnevnte gjenkjenner ikke-vertebrat DNA som et faresignal.

Naturlig CpG-holdig DNA, ODN-molekyler så vel som tiofosfat-substituerte (hvor tiofosfatgruppene er byttet ut for fosfat) ODN-molekyler som inneholder CpG-motiver (CpG-ODN), er ikke bare sterke aktivatorer av immuncelleoppformering og humorale immunreaksjoner (Krieg et al., 1995), men stimulerer også sterke cellulære immunreaksjoner (for en oversikt se Lipford et al., 1998). DNA/ODN-molekyler som inneholder ikke-metylerte CpG-motiver, kan direkte aktivere monocykliske celler (dendrittiske celler, makrofager) og B-celler. På samme måte blir naturlige dreper (NK) celler ikke direkte aktivert, men reagerer overfor monocytt-avledet IL-12 (interleukin 12), med en markant økning av deres IFN-y-produksjon (Chace et al., 1997). Som en konsekvens av dette vil induksjonen av monocyttene og NK-cellene av CpG DNA, fremme induksjonen av Th 1-type reaksjoner og en utvikling av cytotoksiske T-celler.

Ribonukleinsyre som er basert på inosin og cytosin, på lignende måte som polyinosin-polycytidilinsyre (poly I:C), er kjent for å fremme Th 1-spesifikke immunreaksjoner. De er kjente for å stimulere makrofager slik at disse fremstiller cytokiner så som IL-la og IL-12 (Manetti et al., 1995), og de er dessuten kjente som sterke interferon type 1-induserende forbindelser (Manetti et al., 1995), og som en sterk NK-cellestimulator (Cavanaugh et al., 1996).

Denne effekten er imidlertid strengt begrenset til ribonukleinsyre som inneholder inosin og cytidinresidua (WO 98/16247).

Den kjente teknikken er også omtalt i US 5691136 A, WO 9855495 A2 og i US 3906092 A.

Undersøkelser som er utført av foreliggende søkere har vist at ODN-molekyler som inneholder ikke-metylerte CpG-motiver, skjønt de effektivt stimulerer immunsystemet, har vesentlige ulemper, derav spesielt med hensyn til spesifisitet (høy bakgrunn) og induksjon av sideffekter, så som høy systemisk TNF-a-link. Høy systemisk frigjøring av TNF-a er kjent for å frembringe toksisk sjokksyndrom, som kan forårsake død hos utsatte pasienter.

Det er derfor en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe anvendelse av egnede nye ODN-molekyler som ikke har slike drastiske bivirkninger av den type som kan observeres hos ODN-molekyler basert på CpG-sekvenser. Det er videre en hensikt å redusere bivirkningene for farmasøytiske sammensetninger som inneholder kjente ODN-molekyler, og tilveiebringe sikre, effektive og godt aksepterbare farmasøytiske sammensetninger med effektive immunstimulerende egenskaper, som er egnet for vaksinasjon av dyr, spesielt pattedyr, heriblant mennesker.

Denne hensikt er oppfylt ved et immunstimulerende oligodeoksynukleinsyremolekyl (ODN) med den struktur som er vist ved hjelp av formel (I)

hvor enhver X er O eller S,

hvor

enhver NMP er et 2' deoksynukleosid monofosfat eller monotiofosfat, valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksyinosin-, deoksycytosin-, deoksyuridin-, deoksytymidin-, 2-metyl-deoksyinosin-, 5-metyl-deoksycytosin-, deoksypseudouridin-, deoksyribosepurin-, 2-amino-deoksyribosepurin-, 6-S-deoksyguanin-, 2-dimetyl-deoksyguanosin- eller N-isopentenyl-deoksyadenosin-monofosfat eller -monotiofosfat,

NUC er et 2' deoksynukleosid valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksyinosin-, deoksycytosin-, deoksyuridin-, deoksytymidin-, 2-metyl-deoksyinosin-, 5-metyl-deoksycytosin-, deoksypseudouridin-, deoksyribosepurin-, 2-amino-deoksyribosepurin-, 6-S-deoksyguanin-, 2-dimetyl-deoksyguanosin- eller N-isopentenyl-deoksyadenosin,

a og b er tall fra 0 til 100, med den forutsetning, at a + b er mellom 4 og 150,

B og E er vanlige grupper for 5' eller 3' endene i nukleinsyremolekyler.

Det er overraskende funnet at ODN-molekyler som inneholder deoksyinosinresidua (I-ODN-molekyler), har en immunostimulerende effekt som lar seg sammenligne med, eller i mange tilfeller er enda bedre enn for ODN-molekyler som inneholder CpG-motiver. Videre gir ODN-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse mer spesifikke immunreaksjoner overfor et gitt antigen eller et antigenfragment enn CpG ODN-molekyler. I tillegg har ODN-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse en redusert induksjon av skadelige bireaksjoner, da spesielt induksjon av systemisk TNF-a eller IL-6.

Mens det er blitt beskrevet immunostimulerende effekter for inosinholdige RNA-molekyler, så som poly-IC eller de molekyler som er nevnt i WO 98/16247, så har det overraskende vist seg at deoksynukleinsyremolekyler som inneholder deoksyinosinresidua, kan være gode immunostimulerende ODN-molekyler.

I tillegg vil I-ODN-molekyler i motsetning til ODN-molekyler som er basert på det spesifikke CpG-motivet, ikke være avhengig av et spesifikt motiv, eller en palindromisk sekvens, slik det er beskrevet for CpG-oligonukleotider (se f.eks. EP 0 468 520 A2, WO 96/02555, WO 98/18810, WO 98/37919, WO 98/40100, WO 98/52581, WO 99/51259 og WO 99/56755). En gruppe I-ODN-molekyler omtalt heri kan derfor fortrinnsvis inneholde et CI-motiv (og derfor vil bli ODN-molekyler som er beskrevet i de nevnte referanser, hvor ett eller flere guanosinresidua har blitt erstattet med deoksyinosinresidua, være foretrukne utførelser av de foreliggende ODN-molekyler). Dette er ikke nødvendig for dets prinsipielle immunstimulerende egenskap, ettersom I-ODN-molekyler med et inosin, som ikke er plassert i en CI-eller IC-sammenheng, også viser gode immunostimulerende egenskaper. I-ODN-molekyler her er følgelig et DNA-molekyl som inneholder et deoksyinosinresidua, og som fortrinnsvis er tilveiebrakt i en enkelttrådet form. I-ODN som omtalt her kan være isolert ved hjelp av rekombinante metoder eller kan være kjemisk syntetisert. I sistnevnte tilfelle vil I-ODN-molekylet også kunne inneholde modifiserte oligonukleotider som kan være syntetisert ved å bruke standard kjemiske anordninger, så som metylfosfonater eller andre fosforbaserte modifiserte oligonukleotider, så som fosfotriestere, fosfoamidater og fosfoditiorater. Andre ikke-fosforbaserte modifiserte oligonukleotider kan også anvendes (Stirchak et al, MAR 17 (1989), 6129-6141), men det er foretrukket at monofosfater og monotiofosfater er de foretrukne 2'deoksynukleosidmonofosfater som brukes i foreliggende oppfinnelse.

NMP-molekylene i I-ODN-molekylene er her fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av dekoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksyinosin-, deoksycytosin-, deoksyuridin-, deoksytymidin-, 2-metyl-deoksyinosin-, 5-metyl-deoksycutosin-monofosfat eller -monotiofosfat (som vanlig er fosfatet eller tiofosfatgruppen 5' i forhold til deoksyribosen). Mens det er vesentlig for ODN-molekyler basert på CpG-motivet, at dette er umetylert, så er dette overraskende ikke tilfelle for ODN-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor f.eks. 2-metyl-deoksyinosin eller 5-metyl-deoksycytosinresiduene, vanligvis ikke har en negativ effekt på de immunostimulerende egenskapene for ODN-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse. Istedenfor 2-deoksyformene av NMP-molekylene, så kan alternativt andre, da spesielt inerte grupper være tilstede i 2-posisjonen på ribosegruppen, så som f.eks. -F, -NH2, -CH3, da spesielt -CH3. I-ODN-molekylene kan selvsagt ikke inneholde -OH og SH-grupper i 2'-innstillingne på ribosen, da spesielt riboseresiduene i inosin NMP-molekylet.

Lengden på ODN-molekyler ligger her innenfor det vanlige kjente standardområdet for ODN-molekyler slik dette tidligere er kjent. Molekyler med en total lengde som er under 4 eller lengre enn 150 viser derfor gradvis nedsatt immunostimulerende effekt. Foretrukne ODN-molekyler inneholder mellom 10 og 60, da spesielt mellom 15 og 40 baser (nukleosider), noe som gjør at a + b i formel I er mellom 10 og 60, fortrinnsvis mellom 15 og 40 i disse foretrukne utførelsene.

Mens tidligere kjente ribonukleinsyremolekyler som inneholder inosin og cytidin og som er immunostimulerende, har vært store og relativt udefinerte polynukleinsyrer med molekyler langt over 200000 (en kommersielt tilgjengelig poly-inosin-polycytidylsyre fra Sigma Chemicals har en molekylvekt som varierer mellom 220000 og 460000 (og inneholder minst mellom 500 og 1000 C+I residua). Molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse er DNA-molekyler som er mye kortere og har en vel definert lengde og sammensetning, og som lar seg lett reprodusere i produkter.

Det er videre foretrukket at den deoksyinosininneholdende NMP-gruppen i I-ODN-molekyler med formel I er et monotiofosfat med ett til fire svovelatomer, og at også ytterligere NMP-grupper, da spesielt alle ytterligere NMP-grupper er til stede som nukleosidmonotiofosfater, fordi slike ODN-molekyler har høyere nukleaseresistens (det er underforstått i foreliggende oppfinnelse at begrepet «mono» i

«monotiofosfater» relaterer seg til fosfatet, dvs. at én fosfatgruppe (et fosforatom) er tilstede i hver NMP-gruppe). Det er foretrukket at minst én av X i og X2 er S, og at minst én av X3 og X4 er O i NMP-grupper i foreliggende oppfinnelse. Det er foretrukket at X3 og X4 er O. (X3 kan på grunn av syntesen av NMP-gruppen være avledet f.eks. fra fosfatgruppen, eller fra 3'-gruppen i NMP-ribosen).

ODN-molekyler inneholder her fortrinnsvis sekvensen

hvor

enhver n er et 2'-deoksynukleosidmonofosfat eller monotiofosfat valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytosin- eller deoksytymidin-monofosfat eller -monotiofosfat,

enhver h er et 2'-deoksynukleosidmonofosfat eller monotiofosfat, valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksycytosin- eller deoksytymidin-monofosfat eller

-monotiofosfat,

i er deoksyinosin-monofosfat eller -monotiofosfat,

enhver w er et 2'-deoksynukleosidmonofosfat eller monotiofosfat, valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin- eller deoksytymidin-monofosfat eller -monotiofosfat, og

enhver d er et 2'-deoksynukleosidmonofosfat eller monotiofosfat, valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin- eller deoksytymidin-monofosfat eller -monotiofosfat.

Som nevnt ovenfor så er et spesifikt motiv (så som CpG eller et palindrom) ikke nødvendig i I-ODN-molekyler i foreliggende oppfinnelse. ODN-molekyler som inneholder et CI-motiv er imidlertid foretrukket, slik at i en foretrukket utførelse, så inneholder ODN-molekylet med formel I, minst ett 2'deoksycytosin-monofosfat eller -monotiofosfat 3'-tilstøtende til et 2'-deoksyinosin-monofosfat eller

-monotiofosfat, slik at det dannes et 5'-CI 3'-motiv.

Foretrukne ODN-molekyler i den foreliggende oppfinnelse inneholder én eller flere av de følgende sekvenser:

hvori

a er deoksyadenosin-monofosfat eller -monotiofosfat,

g er deoksyguanosin-monofosfat eller -monotiofosfat,

i er deoksyinosin-monofosfat eller -monotiofosfat,

c er deoksycytosin-monofosfat eller -monotiofosfat og

t er deoksytimidin-monofosfat eller -monotiofosfat.

I-ODN-molekylene i foreliggende oppfinnelse er spesielt egnet for anvendelse innen farmasien, dvs. de kan anvendes som medisiner for dyr og mennesker. De er spesielt tilpasset til å virke som et immunostimulerende middel, da spesielt i eller sammen med andre vaksinesammensetninger eller preparater.

Foreliggende oppfinnelse angår derfor også en farmasøytisk sammensetning som inneholder et ODN-molekyl som spesifisert her.

Ettersom den foretrukne farmasøytiske sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse er en vaksine, så bør denne sammensetningen inneholde et antigen foruten ODN-molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette antigenets evne til å frembringe en beskyttelse eller en immunreaksjon i det vaksinerte individet blir sterkt forbedret ved å kombinere det med ODN-molekyler i foreliggende oppfinnelse, spesielt på grunn av deres immunostimulerende aktivitet.

En vaksine kan inneholde en rekke forskjellige antigener. Eksempler på antigener er helt drepte organismer, så som inaktiverte virus eller bakterier, sopp, protozoer eller endog kreftceller. Antigenene kan også bestå av subfraksjoner av disse organismene eller vev, eller proteiner, eller kan i sin mest enkle form være peptider. Antigenene kan også bli gjenkjent av immunsystemet i form av glykosylerte proteiner eller peptider, og kan også være eller kan inneholde polysakkarider eller lipider. Korte peptider kan brukes, ettersom f.eks. cytotoksiske T-celler (CTL) gjenkjenner antigener i form av korte, vanligvis 8-11 aminosyrer, lange peptider sammen med det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) (Rammensee et al., Immunogenetics 41, (1995), 178-228). B-celler gjenkjenner lengre peptider som starter med ca. 15 aminosyrer (Harrow et al., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). I motsetning til T-celleepitoper så kan også den tredimensjonale strukturen på B-celleantigener være viktige for å gjenkjenne antistoffer. For å oppnå en vedvarende antigen-spesifikk immunreaksjon, kan adjuvanser være fordelaktig for å utløse immunkaskader som innbefatter alle cellene i immunsystemet. Primært virker adjuvansene, men er ikke begrenset på grunn av sin virkningsmåte, på såkalte antigenpresenterende celler (APC). Disse cellene vil først reagere med antigenet eller antigenene hvoretter det bearbeidede eller umodifiserte antigenet eksponeres eller presenteres for immuneffektoren. Intermediære celletyper kan også inngå. Bare effektceller med passende spesifisitet blir aktivert i en produktiv immunreaksjon. Adjuvansen kan også lokalt beholde antigenene og samtidig injisere andre faktorer. I tillegg kan adjuvansen virke som et kjemotiltrekkende middel for andre immunceller, eller kan virke lokalt og/eller systemisk som et stimulerende middel for immunsystemet.

Ifølge en foretrukket utførelse blir T-celleepitoper brukt som antigenene. Alternativt er det også foretrukket å bruke en kombinasjon av T-celleepitoper og B-celleepitoper.

De antigener som kan brukes i foreliggende sammensetninger er ikke kritiske. Det er selvsagt også mulig å bruke blandinger av forskjellige antigener ifølge foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis blir det brukt proteiner eller peptider avledet fra et viralt eller et bakterielt patogen, eller fra sopp eller parasitter, som antigenene (heri inngår derivatiserte antigener eller glykosylerte eller lipiderte antigener eller polysakkarider eller lipider). Andre foretrukne kilder for antigener er tumorantigener. Foretrukne patogener er valgt fra det humane immunsviktviruset (HIV), hepatitt A og B virus, hepatitt C virus (HCV), rous sarkomavirus (RSV), Epstein Barr virus (EBV), influensavirus, Rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumonias, Chlamydia trakomatis, Myobakterium tuberculosis, Streptococcus pneumonias, Bacillus antracis, Vibrio colera, Plasmodium sp. (Pl. falciparum, Pl. vivax etc), Aspergillus sp. eller Candida albicans. Antigener kan også være molekyler som er uttrykt av kreftceller (tumorantigener). Derivatiseringsprosessen kan innbefatte rensingen av et spesifikt protein fra patogen/kreftcellene, inaktivering av patogenet så vel som den proteolytiske eller kjemiske derivatiseringen eller stabiliseringen av et slikt protein. På samme måte kan tumorantigener (kreftvaksiner) elle autoimmune antigener brukes i de farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse. Med slike sammensetninger kan det utføres en tumorvaksinasjon eller en behandling av autoimmunologiske lidelser.

I forbindelse med peptidantigener innbefatter også foreliggende oppfinnelse anvendelsen av peptidminitoper (agonister/superagonister/antagonister eller peptider som i visse posisjoner er forandret uten at dette forandrer deres immunologiske egenskaper, eller ikke-peptidminitoper/agonister/superagonister/antagonister (en oversikt er gitt i Sparbier og Walden, 1999). Peptidantigener kan også inneholde forlengelser, enten ved karboksy- eller aminoterminusgruppen i peptidantigenet, noe som letter interaksjonen med de polykationiske forbindelsene eller immunostimulerende forbindelser. For behandlingen av autoimmunologiske sykdommer eller lidelser, kan det også anvendes peptidantagonister.

Antigener kan også være derivatisert slik at de innbefatter molekyler som bedrer antigenpresentasjonen og målsøkingen for antigener til antigenpresenterende celler.

I én utførelse av oppfinnelsen vil den farmasøytiske sammensetningen tjene til å bedre toleransen overfor proteiner eller proteinfragmenter og peptider som inngår i autoimmunologiske sykdommer. Antigener som brukes i slike utførelser tjener til å dempe immunsystemet eller nedregulere immunreaksjonene mot epitoper som inngår i autoimmune prosesser.

Den farmasøytiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse, da spesielt i form av en vaksine, innbefatter videre fortrinnsvis en polykationisk polymer, fortrinnsvis et polykationisk peptid, da spesielt polyarginin, polylysin eller et antimikrobielt peptid.

Den eller de polykationiske forbindelser som brukes ifølge foreliggende oppfinnelse kan være enhver polykationisk forbindelse som viser den karakteristiske effekt som er angitt i WO 97/308721. Foretrukne polykationiske forbindelser er valgt fra basiske polypeptider, organiske polykationer, basiske polyaminosyrer eller blandinger av disse. Disse polyaminosyrene bør ha en kjedelengde på minst fire aminosyreresidua (se: Tuftsin som beskrevet i Goldman et al. (1983)). Spesielt foretrukket er stoffer som inneholder peptidiske bindinger, f.eks. polylysin, polyarginin og polypeptider som inneholder mer enn 20 %, spesielt mer enn 50 %, av basiske aminosyrer i et antall på mer enn 8, spesielt mer enn 20, aminosyreresidua eller blandinger av slike. Andre foretrukne polykationer og deres farmasøytiske sammensetninger er beskrevet i WO 97/30721 (f.eks. polyetylenimin) og WO 99/38528. Det er foretrukket at disse polypeptidene inneholder mellom 20 og 500 aminosyreresidua, spesielt mellom 30 og 200 residua.

Disse polykationiske forbindelsene kan fremstilles kjemisk eller rekombinant, eller kan være avledet fra naturlige kilder.

Kationiske (poly)peptider kan også være polykationiske anti-bakterielle mikrobielle peptider med de egenskaper som er angitt i (Ganz og Lehrer, 1999; Hancock, 1999). Disse (poly)peptidene kan være av prokaryotisk elle animalsk eller planteopprinnelse, eller kan være produsert kjemisk eller rekombinant (Andreu og Rivas, 1998; Ganz og Lehrer, 1999; Simmaco et al., 1998). Peptidene kan også høre til gruppen av defensiner (Ganz, 1999; Ganz og Lehrer, 1999). Sekvenser for slike peptider, kan f.eks. finnes i den antimikrobielle sekvensdatabasen som har følgende internettadresse:

http:// www. bbcm. univ. trieste. it/~ tossi/ pagl. html

Slike vertsforsvarspeptider eller defensiver, er også en foretrukket form for den polykationiske polymeren ifølge foreliggende oppfinnelse. Generelt er det fordelaktig å anvende en forbindelse som muliggjør en sluttproduktaktivering (eller nedregulering) av det adaptive immunsystemet, fortrinnsvis mediert eller kontrollert av antigenpresenterende celler (herved inngår dendrittiske celler), som den polykationiske polymeren.

Spesielt foretrukket for anvendelse som et polykationisk stoff ifølge foreliggende oppfinnelse, er katelicidinavledede antimikrobielle peptider eller derivater av disse (A 1416/2000), da spesielt antimikrobielle peptider avledet fra pattedyrkatelicidin, fortrinnsvis fra menneske, storfe eller mus, eller neuroaktive forbindelser, så som et (humant) veksthormon.

Polykationiske forbindelser avledet fra naturlige kilder innbefatter HIV-REV eller HIV-TAT (avledede kationiske peptider, antenneapediapeptider, chitosan eller andre derivater av chitin) eller andre peptider avledet fra disse peptidene eller proteinene ved biokjemisk eller rekombinant produksjon. Andre foretrukne polykationiske forbindelser er katelin og relaterte eller avledede stoffer fra katelin.

F.eks. er musekatelin et peptid som har aminosekvensen

NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH. Beslektede eller avledede katelinstoffer inneholder hele eller deler av katelinsekvensen med minst 15-20 aminosyreresidua. Avledningene eller omformingene kan innbefatte substitusjon eller modifikasjon av de naturlige aminosyrer med andre aminosyrer som ikke er blant de 20 standard aminosyrene. Videre kan kationiske grupper eller residua innføres i slike katelinmolekyler. Disse katelinmolekylene blir fortrinnsvis kombinert med antigenet og det immunogene ODN-molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse katelinmolekylene har imidlertid også overraskende vist seg å være effektive som en adjuvans for et antigen uten tilsetting av ytterligere adjuvanser. Det er derfor mulig å bruke slike katelinmolekyler som effektive adjuvanser i vaksinepreparater eller sammensetninger, med eller uten ytterligere immunaktiverende stoffer.

Et annet foretrukket polykationisk stoff som kan brukes ifølge foreliggende oppfinnelse er et syntetisk peptid som inneholder minst to KLK-motiver, skilt av en såkalt linker med fra 3-7 hydrofobe aminosyrer (A 1789/2000).

Det var meget overraskende at den immunostimulerende effekten for den farmasøytiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse var signifikant høyere enn det som kunne forventes ut fra tilføyelsen av effektene fra hver enkelt komponent, eller endog tilføyelsen av disse effektene i ODN-molekylet eller polykationet med antigenet.

B og E i formel I er vanlige kjente grupper for 5' og/eller 3' endene i nukleinsyremolekyler. Eksempler på slike grupper er lett tilgjengelig for fagpersoner (se f.eks. «Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach»

(1991), red. Eckstein, Oxford University Press). For I-ODN-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse blir B og/eller E fortrinnsvis valgt uavhengig av hverandre fra -H, -CH3, -COCH3, -OH, -CHO, et fosfat, tiofosfat, sulfat eller en tiosulfatgruppe, eller en fosfoalkylgruppe, da spesielt med en alkyllengde fra C1-C6, og/eller med en terminal aminogruppe (aminogruppen kan f.eks. brukes for ytterligere å merke I-ODN-molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. -P04-(CH2)n-NH2, eller -P04-(CH2)n-NH-markør). Spesielt foretrukket som B er nukleosider, da spesielt de 2'deoksynukleotidene som er nevnt ovenfor (dvs. uten fosfat eller tiofosfatgruppen). Alternativt kan disse gruppene også inneholde linkergrupper til andre molekyler, da spesielt bærermolekyler eller markører. I slike former av ODN-molekylene, hvor sistnevnte er bundet til faste overflater eller partikler eller markører, kan disse overflatene, partiklene, markørene etc, også være en del av B- og/eller E-gruppene.

Det er selvsagt underforstått at enhver ionisert (salt) form eller tautomer form av molekylene med formel I, inngår i denne formel I.

Den farmasøytiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan ytterligere innbefatte andre aktive bestanddeler (farmasøytisk aktive stoffer), da spesielt stoffer som lar seg bruke i vaksinesammenheng. Foretrukne utførelser av slike ytterligere aktive bestanddeler er cytokiner, antiinflammatoriske stoffer, antimikrobielle stoffer eller kombinasjoner av disse.

Den farmasøytiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan selvsagt også inneholde andre hjelpestoffer, da spesielt en farmasøytisk akseptabel bærer, bufferstoffer, stabilisatorer eller kombinasjoner av disse.

De relative mengder av bestanddelene i den foreliggende farmasøytiske sammensetningen er sterkt avhengig av egenskapene til det individuelle antigenet, og det dyr eller det menneske som skal anvende sammensetningen. Den farmasøytiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder derfor fortrinnsvis ett eller flere ODN-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis 1 pg til 10 g, fortrinnsvis 1 ng til 1 g, mer foretrukket 100 ng til 10 mg, spesielt 10 mg til 1 mg. Antigenet så vel som den polykationiske polymeren kan anvendes i lignende doser, og et variasjonsområde fra 1-10000 mg antigen og 0,1-1000 mg polykation pr. vaksinasjon er foretrukket.

De foreliggende sammensetninger kan anvendes for behandling av en pasient, f.eks. en vaksinasjonskandidat, i effektive mengder, f.eks. ved ukentlige, fjortendagers eller månedlige mellomrom. Pasienter som skal behandles med de foreliggende sammensetninger kan også være vaksinert én eller flere ganger. En foretrukket anvendelse av foreliggende oppfinnelse er en aktiv immunisering, da spesielt av mennesker eller dyr som er uten beskyttelse mot det spesifikke antigenet. Administrasjonsveien for den foreliggende sammensetningen er ikke kritisk, og egnet er det mulig å bruke subkutan, intramuskulær, intradermal eller transdermal injeksjon så vel som oralt inntak.

Det er også mulig å anvende den foreliggende sammensetningen separat, dvs. å injisere det immunostimulerende stoffet skilt fra sammensetningen som inneholder antigenet/polykationet. Den foreliggende oppfinnelse angår derfor også et sett som innbefatter en sammensetning som inneholder antigenet og den polykationiske polymeren som én komponent, og en sammensetning som inneholder det immunostimulerende eller kjemotaktiske stoffet som en annen komponent.

Komponentene kan anvendes på det samme stedet eller på det samme tidspunktet, men anvendelsen eller administreringen kan også skje på forskjellige steder på forskjellige tidspunkter, eller i forskjellige tidsperioder. Det er også mulig å variere den systemiske eller lokale anvendelsen av sammensetningen eller komponentene henholdsvis.

Foreliggende oppfinnelse gjelder således anvendelse av et

oligodeoksynukleinsyremolekyl (ODN) med en struktur som vist ved formel (I)

hvor enhver X er O eller S,

hvor

enhver NMP er et 2' deoksynukleosid monofosfat eller monotiofosfat, valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksyinosin-, deoksycytosin-, deoksyuridin-, deoksytymidin-, 2-metyl-deoksyinosin-, 5-metyl-deoksycytosin-, deoksypseudouridin-, deoksyribosepurin-, 2-amino-deoksyribosepurin-, 6-S-deoksyguanin-, 2-dimetyl-deoksyguanosin- eller N-isopentenyl-deoksyadenosin-monofosfat eller -monotiofosfat,

NUC er et 2' deoksynukleosid valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksyinosin-, deoksycytosin-, deoksyuridin-, deoksytymidin-, 2-metyl-deoksyinosin-, 5-metyl-deoksycytosin-, deoksypseudouridin-, deoksyribosepurin-, 2-amino-deoksyribosepurin-, 6-S-deoksyguanin-, 2-dimetyl-deoksyguanosin- eller N-isopentenyl-deoksyadenosin,

a og b er hele tall fra 0 til 100, med den forutsetning, at a + b er mellom 4 og 150, B og E er vanlige grupper for 5' eller 3' endene i nukleinsyremolekyler, for fremstilling av en immunostimulerende farmasøytisk sammensetning.

I tillegg gjelder oppfinnelsen farmasøytisk sammensetninger som er kjennetegnet ved at de omfatter et ODN som definert ovenfor.

Detaljer ved den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet ved hjelp av de følgende eksempler og figurer. Fig. 1 viser immunreaksjonen mot det ovalbumin-avledede peptidet OVA257-264 etter injeksjonen av OVA257-264, poly-L-arginin (pR 60) og deoksyinosin I-holdig oligodeoksynukleotider (I-ODN) eller CpG 1668.1 de bakre fotsålene ble mus injisert med blandinger som angitt på figuren. Fire dager senere ble drenerende lymfeknuteceller stimulert ex vivo med OVA257-264- Antallet IFN-g-produserende celler ble bestemt 24 timer senere ved hjelp av en ELISPOT-prøve. Resultatene er uttrykt som antall punkter/lxlO<6> lymfeknuteceller. Fig. 2 viser induksjonen av systemisk TNF-a produksjon etter injeksjon av OVA257-264, poly-L-arginin (pR 60) og I-holdig oligodeoksynukleotider (I-ODN) eller CpG 1668. De bakre fotsålene hos mus ble injisert med blandinger som angitt. En time etter injeksjonen ble det tatt ut blodprøver fra halevenen, og serum ble fremstilt. Konsentrasjonen av TNF-a i sera ble bestemt ved å bruke en ELISA. Fig. 3 viser immunreaksjonen mot det Ovalbumin-avledede peptidet OVA257-264 etter injeksjon av OVA257.264, poly-L-arginin (pR 60) og dekoksyinosin-holdige oligodeoksynukleotider (I-ODN), CpG 1668 eller GpC. De bakre fotsålene hos mus ble injisert med blandinger som angitt. Fire dager ble drenerende lymfeknuteceller stimulert ex vivo med OVA257-264, et irrelevant peptid mTRP2i8i_i88 (musetyrosinasebeslektet protein-2, VYDFFVWL), eller pR 60. Antallet IFN-G-produserende celler ble bestemt 24 timer senere ved å bruke en ELISPOT-prøve. Resultatene er uttrykt som antallet flekker/1 x IO6 lymfeknuteceller med standardavvik i tre paralleller. Fig. 4 viser induksjonen av systemisk TNF-a produksjon etter injeksjon av OVA257-264, poly-L-arginin (pR 60) og I-holdig oligodeoksynukleotider (I-ODN), GpC eller CpG 1668. De bakre fotsålene hos mus ble injisert med blandingene slik det er angitt på figuren. En time etter injeksjonen ble blod tatt ut fra halevenen, og serum ble fremstilt. Konsentrasjonen av TNF-a og IL-6 i sera ble bestemt ved å bruke cytokin-spesifikke ELISA-prøver. Fig. 5 viser immunreaksjonen mot det ovalbumin-avledede peptidet OVA257-264 etter injeksjonen av TRP-2, poly-L-arginin, CpG 1668 eller vilkårlige 20-mer sekvenser som inneholdt deoksyinosin. De bakre fotsålene hos mus ble injisert med blandinger som angitt. Fire dager senere ble drenerende lymfeknuteceller stimulert ex vivo med TRP-2, et irrelevant peptid, OVA257-264 eller pR 60. Antallet IFN-g produserende celler ble bestemt senere ved å bruke en ELISPOT-prøve. Resultatene er uttrykt som antall flekker pr. lxlO<6> lymfeknuteceller med standardavvik i tre paralleller. Fig. 6 viser den samlede injeksjonen av I-ODN og poly-L-arginin (pR 60) sammen med et melanom-avledet peptid. Fig. 7 viser at den samlede injeksjonen av I-ODN og pR 60 sammen med et melanom-avledet peptid, reduserer induksjonen av systemisk TNF-a og IL-6. Fig. 8 viser den samlede injeksjonen av et vilkårlig 10-mer I-ODN og pR 60 sammen med et melanom-avledet peptid. Fig. 9 viser at den samlede anvendelsen av ovalbumin (OVA) med oligo-dIC26-mer og pR bedrer produksjonen av OVA-spesifikke IgG-antistoffer. Fotsålene hos mus ble subkutant injisert med blandinger som angitt. På dag 24 og 115 etter injeksjonen ble sera og screenet ved hjelp av ELISA for OVA-spesifikt IgG2a (A) og IgG2 (B) antistoffer. Resultatene er vist som antistofftitreringsverdiene.

EKSEMPLER

I alle eksperimentene ble det brukt tiofosfat-substituerte ODN-molekyler (hvor tiofosfatresidua var brukt istedenfor fosfat, og i det etterfølgende betegnet «tiofosfatsubstituerte oligodeoksynukleotider»), ettersom slike ODN-molekyler har høyere nukleaseresistens (Ballas et al., 1996; Krieg et al., 1995; Parronchi et al., 1999).

Eksempel 1

Den samlede injeksjonen av forskjellige I-ODN-molekyler og poly-L-arginin (pR 60) bedrer synergistisk immunreaksjonen mot et ovalbumin-avledet peptid.

Mus C57BI/6 (Harlan/Olac)

Peptid OVA257-264-peptid (SIINFEKL), en MHC klasse I (H-2Kb)-begrenset epitop av kylling ovalbumin (Rotzschke et al., 1991), som var syntetisert ved å bruke standard fastfase F-moc kjemisk syntese, HPLC-renset og analysert ved hjelp av massespektroskopi for renhet. Dose: 300 mg/mus Poly-L-arginin60 Poly-L-arginin med en midlere polymeriseringsgrad på 60 (pR60) argininresidua; SIGMA Chemicals. Dose: 100 mg/mus CpG-ODN 1668 tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler inneholdende et CpG-motiv: tcc at g acg ttc etg atg ct, ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. Dose: 5 nmol/mus I-ODN 1 tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler som inneholdt deoksyinosin: tcc ati aci ttc etg atg ct, som ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. Dose: 5 nmol/mus I-ODN 2 tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler inneholdende deoksyinosin: tcc atg aci ttc etg atg ct, ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. Dose: 5 nmol/mus I-ODN 3 tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler inneholdende deoksyinosin: tcc ati aci ttc eti ati ct, som ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. Dose: 5 nmol/mus

Eksperiment<g>rupper (5 mus pr. gruppe)

1. OVA257-264 2. OVA257-264<+> pR 60 3. OVA257-264 + CpG 1668 4. OVA257-264<+> I-ODN 1 5. OVA257.264<+> I-ODN 2 6. OVA257-264 + I-ODN 3 7. OVA257-264 + CpG 1668 + pR 60 8. OVA257.264<+> I-ODN 1 + pR 60 9. OVA257-264 + I-ODN 2 + pR 60 10. OVA257-264 + I-ODN 3 + pR 60

På dag 0 ble musene i hver bakre fotsåle injisert med et totalt volum på 100 u.1 (50

u.1 pr. fotsåle) som inneholdt de ovennevnte forbindelsene. Dyrene ble avlivet 4

dager etter injeksjonen, og de popliteale lymfeknutene ble innhøstet. Lymfeknutene

ble ført gjennom en 70 u.m cellesil og vasket to ganger med DMEM-medium (GIBCO BRL) som inneholdt 5 % fosterkalveserum (FCS, SIGMA Chemicals). Cellene ble justert til 3xl0<6> celler pr. ml DMEM/5 %/FCS. En IFN-g ELISPOT analyse ble utført i tre paralleller som beskrevet (Miyahira et al., 1995). Denne fremgangsmåten er meget anvendt ettersom den muliggjør kvantifiseringen av antigen-spesifikke T-celler. Lymfocyttene ble stimulert ex vivo med rent medium som en bakgrunnskontroll, OVA257-264-peptid eller Concanavalin A (Con A). Flekker som representerte enkle IFN-g produserende T-celler, ble tellet, og antall

bakgrunnsflekker ble fratrukket alle prøvene. Det høye antall flekker som ble påvist etter stimuleringen i Con A (data ikke vist) indikerer at de brukte lymfocyttene var i god tilstand. For hver eksperimentgruppe av mus, er antallet flekker pr. lxl0<6> celler vist på fig. 1.

En time etter injeksjonen ble blod tappet fra halevenen og serum ble fremstilt for å bestemme induksjonen av systemisk TNF-a, ved å bruke en ELISA-analyse (fig. 2).

Eksempel 2

Hvis guanosin byttes ut med desoksy-inosin, så gjør dette at den ikke-immunogene GpC-sekvensen blir sterkt immunogen, spesielt ved en kombinasjon med poly-L-arginin (pR60).

Eksperimentgrupper (5 mus pr. gruppe)

OVA257-264

OVA257-264 + pR 60

OVA257-264 + CpG 1668

OVA257-264 <+> GpC

OVA257-264 + I-ODN 9

OVA257-264 + I-ODN 10

OVA257-264 + CpG 1668 + pR 60

OVA257-264 + GpC + pR 60

OVA257-264 + I-ODN 9 + pR 60

OVA257-264 + I-ODN 10 + pR 60

På dag 0 ble musene i hver bakre fotsåle injisert med et totalt volum på 100 u.1 (50 u.1 pr. fotsåle) som inneholdt de ovennevnte forbindelsene. Dyrene ble avlivet 4 dager etter injeksjonen, og de popliteale lymfeknutene ble innhøstet. Lymfeknutene ble ført gjennom en 70 u.m cellesil og vasket to ganger med DMEM-medium (GIBCO BRL) som inneholdt 5 % fosterkalveserum (FCS, SIGMA Chemicals). Cellene ble justert til 3xl0<6> celler pr. ml DMEM/5 %/FCS. En IFN-g ELISPOT analyse ble utført i tre paralleller som beskrevet (Miyahira et al., 1995). Denne fremgangsmåten er meget anvendt ettersom den muliggjør kvantifiseringen av antigen-spesifikke T-celler. Lymfocyttene ble stimulert ex vivo i tre paralleller med medium (bakgrunnskontroll), OVA257-264 peptid, et irrelevant peptid mTRP-2i8i-i88 (musetyrosinaserelatert protein-2, VYDFFVWL), pR 60 og Concanavalin A (Con A). Flekker som representerte enkle IFN-g produserende T-celler ble tellet, og antallet bakgrunnsflekker ble fratrukket alle prøver. Det høye antall flekker som ble påvist etter stimulering med Con A (data ikke vist), indikerer at de brukte lymfocyttene var i god tilstand. For hver eksperimentgruppe av mus er antallet flekker/1 x IO6 celler vist på fig. 3, og standardavviket for ex vivo-stimulerte lymfocytter i tre paralleller, er også angitt. En time etter injeksjonen ble det tatt en blodprøve fra halevenen, og serum ble fremstilt for å bestemme induksjonen av systemisk TNF-a og IL-6, ved å bruke cytokin-spesifikke ELISA-analyser (fig. 4).

Eksempel 3

Den samlede injeksjonen av vilkårlige 20-mer sekvenser som inneholdt deoksyinosin og et malanom-avledet peptid, induserer en sterk immunreaksjon mot peptidet som ytterligere kan bedres ved en samtidig anvendelse av poly-L-arginin (pR 60).

Mus C5 7B1 16 (Harlan/Olac)

Peptid TRP-2-peptid (VYDFFVWL), en MHC-klasse I (H-2K<b>)-begrenset epitop av musetyrosinasebeslektet protein-2 (Bllom et al., 1997) ble syntetisert til standard fast fase F-moc syntese, HPLC-renset og analysert ved hjelp av massespektroskopi for renhet. Dose: 300 u.g/mus

Poly-L-arginin 60 Poly-L-arginin med en midlere polymeriseringsgrad på 60 (pR60) argininresidua; SIGMA Chemicals. Dose: 100 u.g/mus CpG-ODN 1668 tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler som inneholdt et CpG-motiv: tcc at g acg ttc etg atg ct, ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen, Dose: 5 nmol/mus

wdi tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler: nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. Dose: 5 nmol/mus

wdidin tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler: nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. Dose: 5 nmol/mus

wdid tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler: nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. Dose: 5 nmol/mus

wdidid tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler: nhh wdi did hhh hdi ddi dh ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. Dose: 5 nmol/mus

Eksperimentgrupper (5 mus pr. gruppe)

1. TRP-2

2. TRP-2 + pR 60

3. TRP-2 + CpG 1668

4. TRP-2 + wdi

5. TRP-2 + wdidin

6. TRP-2 + wdid

7. TRP-2 + wdidid

8. TRP-2 + CpG 1668 + pR 60

9. TRP-2 + wdi + pR 60

10. TRP-2 + wdidin + pR 60

11. TRP-2 + wdid + pR 60

12. TRP-2 + wdidid + pR 60

På dag 0 ble musene i hver bakre fotsåle injisert med et totalt volum på 100 u.1 (50 u.1 pr. fotsåle) som inneholdt de ovennevnte forbindelsene. Dyrene ble avlivet 4 dager etter injeksjonen, og de popliteale lymfeknutene ble innhøstet. Lymfeknutene ble ført gjennom en 70 u.m cellesil og vasket to ganger med DMEM-medium (GIBCO BRL) som inneholdt 5 % fosterkalveserum (FCS, SIGMA Chemicals). Cellene ble justert til 3xl0<6> celler pr. ml DMEM/5 %/FCS. En IFN-g ELISPOT analyse ble utført i tre paralleller som beskrevet (Miyahira et al., 1995). Denne fremgangsmåten er meget anvendt ettersom den muliggjør kvantifiseringen av antigen-spesifikke T-celler. Lymfocyttene ble stimulert ex vivo i tre paralleller med medium (bakgrunn), TRP-2-peptid, et irrelevant OVA257-264-peptid, pR 60 og Concanavalin A (Con A). Flekker som representerte enkle IFN-g produserende T-celler ble tellet, og antallet bakgrunnsflekker ble fratrukket alle prøver. Det høye antall flekker som ble påvist etter stimulering med Con A (data ikke vist), indikerer at de brukte lymfocyttene var i god tilstand. For hver eksperimentgruppe av mus er antallet flekker/lxlO<6> celler vist på fig. 5, og standardavviket for ex vivo-stimulerte lymfocytter i tre paralleller, er også angitt.

Eksempel 4

Den samlede injeksjon av I-ODN og poly-L-arginin (pR 60) bedrer synergistisk immunreaksjonen mot et melanom-avledet peptid.

Eksperimentgrupper (5 mus pr. gruppe)

1. TRP-2i8l-188 2. TRP-218i.,88 + pR 60

3. TRP-2 is i-i ss <+> CpG 1668

4. TRP-2,si-188 + I-ODN 2

5. TRP-2i8i-i88 + CpG 1668 + pR 60

6. TRP-2i8i-i88 + I-ODN 2 + pR 60

På dag 0 ble musene i hver bakre fotsåle injisert med et totalt volum på 100 u.1 (50 u.1 pr. fotsåle) som inneholdt de ovennevnte forbindelsene. Dyrene ble avlivet 4 dager etter injeksjonen, og de popliteale lymfeknutene ble innhøstet. Lymfeknutene ble ført gjennom en 70 u.m cellesil og vasket to ganger med DMEM-medium (GIBCO BRL) som inneholdt 5 % fosterkalveserum (FCS, SIGMA Chemicals). Cellene ble justert til 3xl0<6> celler pr. ml DMEM/5 %/FCS. En IFN-g ELISPOT analyse ble utført i tre paralleller som beskrevet (Miyahira et al., 1995). Denne fremgangsmåten er meget anvendt ettersom den muliggjør kvantifiseringen av antigen-spesifikke T-celler. Lymfocyttene ble stimulert ex vivo i tre paralleller med medium (bakgrunnskontroll), TRP-2isi-m-peptid, et irrelevant OVA257-264 peptid og Concanavalin A (Con A). Flekker som representerte enkle IFN-y produserende T-celler ble tellet, og antallet bakgrunnsflekker ble fratrukket alle prøver. Det høye antall flekker som ble påvist etter stimulering med Con A (data ikke vist), indikerer at de brukte lymfocyttene var i god tilstand. For hver eksperimentgruppe av mus er antallet flekker/lxlO<6> celler vist på fig. 6, og standardavviket for ex vivo-stimulerte lymfocytter i tre paralleller, er også angitt.

En time etter injeksjonen ble det tatt en blodprøve fra halevenen, og serum ble fremstilt for å bestemme induksjonen av systemisk TNF-a og IL-6, vd å bruke cytokin-spesifikke ELISA-analyser (fig. 7).

Eksempel 5

Den samlede injeksjonen av vilkårlig 10-mer I-ODN og poly-L-arginin (pR 60) bedrer synergistisk immunreaksjonen mot et melanom-avledet peptid.

Eksperi m ent grupper (5 mus pr. gruppe)

1. TRP-2,8,.,88

2. TRP-2i8i-i88 <+> pR 60

3. TRP-2i8M88 + CpG 1668

4. TRP-2i8i-i88 <+> ODN 17

5. TRP-2i8i-i88 + CpG 1668 + pR 60

6. TRP-2,81-188 + ODN 17 + pR 60

På dag 0 ble musene i hver bakre fotsåle injisert med et totalt volum på 100 u.1 (50 jul pr. fotsåle) som inneholdt de ovennevnte forbindelsene. Dyrene ble avlivet 4 dager etter injeksjonen, og de popliteale lymfeknutene ble innhøstet. Lymfeknutene ble ført gjennom en 70 u.m cellesil og vasket to ganger med DMEM-medium (GIBCO BRL) som inneholdt 5 % fosterkalveserum (FCS, SIGMA Chemicals). Cellene ble justert til 3xl0<6> celler pr. ml DMEM/5 %/FCS. En IFN-g ELISPOT analyse ble utført i tre paralleller som beskrevet (Miyahira et al., 1995). Denne fremgangsmåten er meget anvendt ettersom den muliggjør kvantifiseringen av antigen-spesifikke T-celler. Lymfocyttene ble stimulert ex vivo i tre paralleller med medium (bakgrunnskontroll), TRP-2] si-iss-peptid, et irrelevant OVA257-264 peptid og Concanavalin A (Con A). Flekker som representerte enkle IFN-y produserende T-celler ble tellet, og antallet bakgrunnsflekker ble fratrukket alle prøver. Det høye antall flekker som ble påvist etter stimulering med Con A (data ikke vist), indikerer at de brukte lymfocyttene var i god tilstand. For hver eksperimentgruppe av mus er antallet flekker/1 x IO6 celler vist på fig. 8, og standardavviket for ex vivo-stimulerte lymfocytter i tre paralleller, er også angitt.

Mus C57B1/6 (Harlan/Olac)

Peptid TRP-2-peptid (VYDFFVWL), en MHC-klasse I (H-2K<b>)-begrenset epitop av musetyrosinasebeslektet protein-2 (Bllom et al., 1997) ble syntetisert til standard fast fase F-moc syntese, HPLC-renset og analysert ved hjelp av massespektroskopi for renhet. Dose: 100 u.g/mus

Poly-L-arginin 60 Poly-L-arginin med en midlere polymeriseringsgrad på 60 (pR60) argininresidua; SIGMA Chemicals. Dose: 100 u.g/mus CpG-ODN 1668 tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler som inneholdt et CpG-motiv: tcc at g acg ttc etg atg ct, ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen, Dose: 5 nmol/mus

ODN 17 tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler inneholdende deoksyinosin: hhh wdi dhh h, ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. (h = CAT, w = AT, d = GAT) Dose: 10 nmol/mus

Mus C57B1/6 (Harlan/Olac)

Peptid TRP-2-peptid (VYDFFVWL), en MHC-klasse I (H-2K<b>)-begrenset epitop av musetyrosinasebeslektet protein-2 (Bllom et al., 1997) ble syntetisert til standard fast fase F-moc syntese, HPLC-renset og analysert ved hjelp av massespektroskopi for renhet. Dose: 100 u.g/mus

Poly-L-arginin 60 Poly-L-arginin med en midlere polymeriseringsgrad på 60 (pR60) argininresidua; SIGMA Chemicals. Dose: 100 (ig/mus CpG-ODN 1668 tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler som inneholdt et CpG-motiv: tcc at g acg ttc etg atg ct, ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen, Dose: 5 nmol/mus

I-ODN 2 tiofosfatsubstituerte ODN-molekyler inneholdende deoksyinosin: tcc atg aci ttc etg atg ct, ble syntetisert av NAPS GmbH, Gottingen. Dose: 5 nmol/mus

Eksempel 6

Den samlede anvendelsen av oligo-deoksyIC26-mcr og poly-L-arginin (pR) bedrer

den ovalbumin (OVA)-spesifikke humorale reaksjonen.

Mus C57B1/6 (Harlan/Olac)

Ovalbumin (OVA) Ovalbumin fra kyllingegg, kvalitet V,

SIGMA Chemicals, A-5503, Lot 54H7070 Dose: 5 u.g/mus

Poly-L-arginin (pR) Poly-L-arginin med en midlere polymeriseringsgrad på 60 argininresidua;

SIGMA Chemicals, P-4663, Lot 68H5903 Dose: 100 u.g/mus

Oligo-deoksy IC, 26-mer (oligo-dIC26-mer) oligo-dIC26-mer ble syntetisert ved standard fosfoamidsyntese i en 4 u.mol skala og renset ved hjelp av HPLC (NAPS, Gottingen, Tyskland) Dose: 5 nmol/mus Eksperiment<g>rupper (4 mus pr. gruppe)

1. OVA + 0lig0-dIC26-mer <+> pR

2. OVA + 0lig0-dIC26-mer

3. OVA + pR

4. OVA

På dag 0 ble musene i hver bakre fotsåle injisert med et totalt volum på 100 u.1 (50

ul pr. fotsåle) som inneholdt de ovenfor angitte forbindelser. 24 dager etter injeksjon ble serum oppsamlet og undersøkt ved hjelp av ELISA for nærvær av OVA-spesifikke antistoffer. Disse resultatene viser at injeksjonen av OVA i kombinasjon med oligo-dIC og pR bedret produksjonen av OVA-spesifikke IgG antistoffer sammenlignet med en injeksjon av OVA med hver av stoffene alene (fig. 13A, B). Interessant nok øket titeringsverdien for både IgG2a og IgGl ved en enkelt injeksjon av OVA med oligo-dIC/pR, noe som antyder at både Thl og Th2 celler var involvert. Etter 115 dager var imidlertid bare de forhøyede IgG2a-nivåene fremdeles påvisbare i sera hos mus injisert med OVA og oligo-dIC/pR.

Disse data viser at den samlede injeksjonen av OVA med oligo-dIC og pR, bedrer

den OVA-spesifikke humorale reaksjonen. Denne reaksjonen eller responsen er karakterisert ved en produksjon av både Thl- og Th2-induserte antistoffisotyper i en tidlig fase, men senere i alt vesentlig Thl-induserte antistoffer.

REFERANSER

Andreu, D;, and Rivas, L. (1998). Animal antimicrobial peptides: an overview. Biopolymers 47, 415-433.

Ballas, Z. K., Rasmussen, W. L., and Krieg, A. M. (1996). Induction of NK activity in murine and human cells by CpG mofcif in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J Immunol 157, 1840-1845.

Bloom, B. R., and widdus, R. (1998). Vaccine visions and their global impact. Nat Med 4, 480-484.

Bloom, K. B., Perry-Lalley, D., Robbins, P. F., Li, Y., el-Garoil, M., Rosenberg, S. A., and Yang, J. C. (1997). Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B 16 melanoma. J Exp Med 185, 453-459.

Buschle, M.# Schmidt, W., Berger, M., Schaffner, G., Kurzbauer, R., Killisch; 1., Tiedemarm, J.K., Trska, B., Kirlappos, H., Mechtler, K., Schilcher, F., Gabler, C, and Birntsiel, M. L.

(1998). Chemically defined, cell-free cancer vaccines; use of tumor antigen-derived peptides or polyepitope proteins for vaccina-tion. Gene Ther. Mol. Biol. 1, 309-321

Buschle, M., Schmidt, W., Zauner, W., Mechtler, X., Trska, B., Kirlappos, H., and Birnstiel, M.L. (1997). Transloading of tumor antigen-derived peptides into antigen-presenting cells. Proe.

Nati. Acad. Sei. USA 94, 3256-3261

Cavanaugh, P.F., Jr., Ho, Y-K, and Bardos, T.J. (1996). The activation of murine macrophages and natural killer cells by the Par-tially fchiolated double stranded RNA poly (1). mercapto poly(C).

Res.Comm.Mol.Pathol.Pharmacol. 91, 131-147

Chace, J. H., Hooker, N. A., Mildenstein, K. L., Krieg, A. M., and Cowdery, J. S. (1997). Bacterial DNA-induced NK cell IFN-gamma production is dependent on macrophage secretion of IL- 12.

Clin immunol Immunopathol 84, 185-193. •

Davis, H. -L., Weeranta, R., Waldschmidt, T. J., Tygrett, L.,

Schorr, J., and Krieg, A. M. (1998). CpG DNA ia a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J Immunol 160, 870-876.

Deng, G. M., Nilsson, 1. M., Verdrengh, M., Collins, L. V., and Tarkowski, A. (1999). Intra-articularly localized bacterial DNA containing CpG motifs induces arthritis. Nat Med 5, 702-705.

Ganz, T. (1999). Defensins and host defensé [comment]. Science 286,, 420-421.

Ganz, T., and Lehrer, R. 1. (1999). Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and applications. Mol Med Today 5, 292-297.

Hancock, R. E. (1999). Host defence (cationic) peptides: what is their future clinical potential? Drugs 57, 469-473.

Harlow, E., and Lane, D. (1988). Antibodi.es: a laboratory manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory).

Hartmann, G., Weiner, G. J., and Krieg, A. M. (1999). CpG DNA: A potent signal for growth, activation, and maturation of human dendritic cells. Proe Nati Acad Sei USA 96, 9305-9310.

Hoffmann, J. A., Kafatos, f. c, Janeway, C. A., and Ezekowitz, R. A. (1999). Phylogenetic perspectives in innate immunity. Scir ence 284, 1313-1318.

Klinman, D. M., Yi, A. K., Beaucage, S. L.r Conover, J., and Krieg, A. M. (1996). CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. Proe Nati Acad Sei U S A 93, 2879-2883.

Krieg, A. M. (1999). CpG DNA: a novel iitimunomodulator Hetter]. Trends Microbiol 7, 64-5.

Krieg, A. J9. (1996). An innate immune defense mechanism based on the recognition of CpG motifs in microbial DNA. J Lab Clin Med 128, 128-133.

Krieg, A. M., Yi, A. K., Matson, S-, Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A., Teasdale, R., Koretzky, G. A., and Klinman, D. M. (1995). CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374, 546-549.

Krieg, A. M., Yi, A. K., Schorr, J., and Davis, H. L. (1998). The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines. Trends Microbiol 6, 23-27.

Lethe, B., van den Eynde, B.,van Pel, A., Corradin, G., and Boon, T. (1992). House tumor rejection antigens P815A and P815B: two epitopes carried by a single peptide. Eur J Immunol 22, 2283-2288.

Liljeqvist, S./ and Stahl, S. (1999). Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. J Biotechnol 73, 1-33.

Lipford, G. B., Heeg, K., and Wagner, H. (1998). Bacterial DNA as immune cell activator. Trends Microbiol 6, 496-500.

Manetti, R., Annunziato, F., Tomasevic, L., Gianno, v., Parronchi, P., Romagnani, S. and Maggi, E. (1995). Polyinosinic acid: polycytidylic acid promotes T helper type 1-specific immune responses by stimulating macrophage production of interferon-a and interleukin-12. Eur. J. Immunol. 25, 2656-2660

Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., and Coffman, R. L. (1986). Two types of murine helper T cell clone. 1. Definition according to profiles of Iymphokine activities and secreted proteins. J Immunol 136, 2348-2357.

Nossal, G. (1998). Living up to the legacy. Nat Med 4, 475-476

Oxenius, A., Martinic, MM., Hengartner, H., and Klenerman, P.

(1999). CpG-containing oligonucleotides are efficient adjuvants for induction of protective antiviral immune responses with T-cell peptide vaccines. J Virol 73, 4120-4126. Paillard, F. (1999). CpG: the double-edged sword [cornment"J . Hum Gene Ther 10, 2089.-2090.

Pamer, E. G., Harty, J. T., and Bevan, M. J. (1991). Precise prediction of a dominant class I MHC-restricted epitope of Listeria monocytogenes. Nature 353, 852-855.

Parronchi, P., Brugnolo, F., AnnunziatQ, F.r Manuelli, C, Sam-pognaro, S., Mavilia, C, Romagnani, S., and Maggi, E.' (1999). Phosphorothioate oligodeoxynucleotides promote the in vitro de-velopment of human allergen-specific CD4+ T cells into Thl effec-tors. J Immunol 163. 5946-5953.

Pisetsky, D. S. (1997). Immunostimulatory DNA: a clear and present, danger? Nat Med 3, 829-831. .Pisetsky, D. S. (1999). The influence of base seguence on the immunostimulatory properties of DNA. Immunol Res 19, 35-46.

Rammensee, H.G., Friede, T., Stevanoviic S. (1995), MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics 41, 178-228

Rodrigues, M., Nussenzweig, R. S., Romero, P., and Zavala, F.

(1992). The in vivo cytotoxLc activity of CD8+ T cell clones cor-relates with their levels of expression of adhesion molecules. J Exp Med 175, 895-905.

Roitt, 1., Brostoff, J., and Male, D. (1998). Immunology (London: Mosby international Ltd): Rotzschke, 0., Falk, K., Stevanovic, S., Jung, G., Walden, P., and Rammensee, H. G. (1991). Exact prediction of a natural T cell epitope. Eur J Immunol 21, 2891-2894.

Schmidt, W., Buschle, M., Zauner, W., Kirlappos, H., Mechtler, K., Trska, B., and Bimstiel, M.L. (1997). Cell-free tumor antigen peptide-based cancer vaccines. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94, 3262-3267

Schwartz, D. A., Quinn, T. j., Thorne, P. S., Sayeed, S., Yi, A.

K., and Krieg, A. M. {1997). CpG motifs in bacterial DNA cause inflammation in the lower respiratory tract, J Clin invest 100, 68-73.

Shimonkevitz, R., Colon, S., Kappler, J. W., Marrack, P., and Grey, H. M. (1984) . Antigen recognition by H2-resctricted T cells 11. A tryptic ovalbumin peptide that substitutes for processed antigen. J Immunol 133, 2067-2074.

Simmaco, M., Mignogna, G., and Barra, D. (1998). Antimicrobial peptides from amphibian skin: what do they tell us? Biopolymers 47, 435-450.

Sparbier, K., and Walden, P. (1999). T cell receptor specificity and mimotopes. Curr Opin Immunol 11, 214-218.

Sparwasser, T., Koch, E. S., Vabulas, R. M., Heeg, K., Lipford, G. B., Ellwart, J. W., and Wagner, H. (1998). Bacterial DNA and immunostimulatory CpG oligonucleotides trigger maturation and activation of murine dendritic cells. Eur J Immunol 28, 2045-2054.

Sparwasser, T., Miethke, T., Lipford, G., Borschert', K., Hacker, H. , Heeg, K., and Wagner, H. (1997). Bacterial DNA causes septic shock [letter]. Nature 386, 336-337.

Sparwasser, T., Miethke, T., Lipford, G., Erdmann, A., Hacker, H., Heeg, K., and Wagner, H.. (1997). Macrophages sense pathogens via DNA mot)&: induction oftumor necrosis factor-alpha-mediated shock. EuxJ Immunol 27, 1671-1679.

Weiner, G. J., Liu, H. M., Wooldridge, J. E., Dahle, C. E., and Krieg, A. M. (1997). Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG moti f- are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization. Proe Nati Acad Sei USA 94, 10833-10837.

Yew, N. S., Wang, K. X., Przybylska, M., Bagley, R. G., Stedman, M., Marshall, J., Scheule, R. K., and Cheng, S. H. (1999). Con-tribution of plasmid DNA to inflammation in the lung after administration of cationic lipid:pDNA complexes. Hum Gene Ther 10; 223-234.

Claims (16)

1. Anvendelse av et oligodeoksynukleinsyremolekyl (ODN) med en struktur som vist ved formel (I) hvor enhver X er O eller S, hvor enhver NMP er et 2' deoksynukleosid monofosfat eller monotiofosfat, valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksyinosin-, deoksycytosin-, deoksyuridin-, deoksytymidin-, 2-metyl-deoksyinosin-, 5-metyl-deoksycytosin-, deoksypseudouridin-, deoksyribosepurin-, 2-amino-deoksyribosepurin-, 6-S-deoksyguanin-, 2-dimetyl-deoksyguanosin- eller N-isopentenyl-deoksyadenosin-monofosfat eller -monotiofosfat, NUC er et 2' deoksynukleosid valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksyinosin-, deoksycytosin-, deoksyuridin-, deoksytymidin-, 2-metyl-deoksyinosin-, 5-metyl-deoksycytosin-, deoksypseudouridin-, deoksyribosepurin-, 2-amino-deoksyribosepurin-, 6-S-deoksyguanin-, 2-dimetyl-deoksyguanosin- eller N-isopentenyl-deoksyadenosin, a og b er hele tall fra 0 til 100, med den forutsetning, at a + b er mellom 4 og 150, B og E er vanlige grupper for 5' eller 3' endene i nukleinsyremolekyler, for fremstilling av en immunostimulerende farmasøytisk sammensetning.
2. 2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor enhver NMP er valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksyinosin-, deoksycytosin-, deoksyuridin-, deoksytymidin-, 2-metyl-deoksyinosin-, 5-metyl-deoksycytosin-monofosfat eller -monotiofosfat.
3. 3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor a + b er mellom 10 og 60, fortrinnsvis mellom 15 og 40.
4. 4. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-3, hvor minst én av Xi og X2 er S, og minst én av X3 og X4 er O, og fortrinnsvis at enhver NMP er et nukleosid-monotiofosfat.
5. 5. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-4, hvor nevnte ODN inneholder sekvensen hvor enhver n er et 2'-deoksynukleosidmonofosfat eller monotiofosfat valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytosin- eller deoksytymidin-monofosfat eller -monotiofosfat, enhver h er et 2'-deoksynukleosidmonofosfat eller monotiofosfat, valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksycytosin- eller deoksytymidin-monofosfat eller -monotiofosfat, i er deoksyinosin-monofosfat eller -monotiofosfat, enhver w er et 2'-deoksynukleosidmonofosfat eller monotiofosfat, valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin- eller deoksytymidin-monofosfat eller -monotiofosfat, og enhver d er et 2'-deoksynukleosidmonofosfat eller monotiofosfat, valgt fra gruppen bestående av deoksyadenosin-, deoksyguanosin- eller deoksytymidin-monofosfat eller -monotiofosfat.
6. 6. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-5, hvor nevnte ODN inneholder minst ett 2'deoksycytosin-monofosfat eller -monotiofosfat 3'-tilstøtende et 2'-deoksyinosin-monofosfat eller -monotiofosfat, særlig et deoksyinosin-deoksycytosin 26-mer.
7. 7. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-6, hvor nevnte ODN inneholder sekvensen hvori a er deoksyadenosin-monofosfat eller -monotiofosfat, g er deoksyguanosin-monofosfat eller -monotiofosfat, i er deoksyinosin-monofosfat eller -monotiofosfat, c er deoksycytosin-monofosfat eller -monotiofosfat og t er deoksytimidin-monofosfat eller -monotiofosfat.
8. 8. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-7, hvor nevnte ODN inneholder sekvensen hvor w, d, i og n er som definert ovenfor.
9. 9. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-8, hvor B og E uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av -H, -CH3, -COH, -COH3, -OH, -CHO, -PO4, -PSO3, PS2O2, -PS3O, -PS4, -SO3, -P04-(CH2)i-6-NH2 eller -P04-(CH2)i.6-NH-merket.
10. 10. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-9, hvor nevnte immunostimulerende farmasøytiske sammensetning er en vaksine.
11. 11. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert ved å omfatte et ODN som definert i ethvert av kravene 1-9.
12. 12. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 11,karakterisert ved ytterligere å omfatte et antigen.
13. 13. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 11 eller 12,karakterisert ved at det ytterligere omfatter en polykationisk polymer, fortrinnsvis et polykationisk peptid, da spesielt polyarginin, polylysin eller et antimikrobielt peptid, da spesielt et katellcidin-avledet antimikrobielt peptid, et syntetisk peptid innholdende 2 KLK-motiver adskilt med et koblingsstykke på 3-7 hydrofobe aminosyrer, eller et veksthormon, spesielt et humant veksthormon.
14. 14. Farmasøytisk sammensetning ifølge ethvert av kravene 11-13, karakterisert ved ytterligere å omfatte aktive bestanddeler, da spesielt cytokiner, antiinflammatoriske stoffer, antimikrobielle stoffer eller kombinasjoner av disse.
15. 15. Farmasøytisk sammensetning ifølge ethvert av kravene 11-14, karakterisert ved at den ytterligere inneholder hjelpestoffer, da spesielt en farmasøytisk akseptabel bærer, bufferstoffer, stabilisatorer eller kombinasjoner av disse.
16. 16. Farmasøytisk sammensetning ifølge ethvert av kravene 11-15, karakterisert ved at den inneholder fra 1 ng til 1 g, fortrinnsvis 100 ng til 10 mg, spesielt 10 mg til 1 mg av ett eller flere ODN-molekyler ifølge ethvert av kravene 1-9.