BRPI0111639B1 - uso de uma molécula de ácido oligodeoxinucléico imunoestimulatório e composição farmacêutica. - Google Patents
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Abstract
"uso de uma molécula de ácido oligodeoxinucléico, e composição farmacêutica contendo a mesma". é descrito uma molécula de ácido oligodeoxinucléico imunoestimulatório (odn) tendo a estrutura de acordo com a fórmula (i):
Description
"USO DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO OLIGODEOXINUCLÉICO IMUNOESTIMULATÓRIO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA" [0001] A presente invenção refere-se a moléculas oligodeoxinucléicas imunoestimulatórias (ODNs) e composições farmacêuticas contendo tais ODNs.
[0002] As vacinas podem salvar mais vidas (e recursos) do que qualquer outra intervenção médica (Nossal, 1998). Devido aos programas mundiais de vacinação a incidência de muitas doenças fatais tem sido drasticamente reduzida. Embora esta idéia seja válida para todo um quadro de doenças, como por exemplo, tuberculose, difteria, coqueluche, sarampo e tétano, não existem vacinas eficazes para várias doenças infecciosas, inclusive para a maioria das infecções virais, tal como a AIDS. Também não existem vacinas eficazes para outras doenças, infecciosas ou não infecciosas, que ceifam vidas de milhões de pacientes por ano, incluindo a malária ou câncer. Além disto, o rápido surgimento de bactérias e microorganismos resistentes a antibióticos exige tratamentos alternativos, sendo as vacinas uma opção lógica. Finalmente, a grande necessidade de vacinas é também ilustrada pelo fato de que as doenças infecciosas, ao invés de distúrbios cardiovasculares, câncer ou lesões, continuam a ser a grande causa de óbitos e incapacidade em todo mundo (Bloom e Widdus, 1998).
[0003] De um ponto de vista imunológico, um dos principais problemas no campo das vacinas hoje em dia é que as vacinas tradicionais (e/ou os compostos imunomoduladores fixados nestas preparações) são formuladas para induzir altos níveis de anticorpos (Harrow e Lane, 1988) . Porém, os anticorpos por si só não são eficazes na prevenção de um grande número de doenças, inclusive a maioria das doenças causadas por virus, bactérias intracelulares, certos parasitas e câncer. Exemplos de tais doenças são, porém não se restringem ao virus HIV acima citado ou espécies de Plasmodium no caso da malária. Em vários sistemas experimentais, demonstrou-se que o braço celular do sistema imune, inclusive as células T, ao invés do braço humoral, é importante para estas indicações. Portanto, são necessárias tecnologias novas e inovadoras para superar as limitações das vacinas convencionais. A meta deve ser dirigida a tecnologias que confiavelmente induzam o sistema celular imune, inclusive células T antigeno-especificas, que reconheçam moléculas expressadas em células infectadas por patógenos. De maneira ideal, são projetadas vacinas que induzem tanto as células T que distinguem doenças e/ou células infectadas de células normais, como, simultaneamente, anticorpos secretados por patógenos reconhecedores de células B em compartimentos extracelulares.
[0004] As diversas vacinas estabelecidas consistem de organismo vivo atenuado, em que há risco de reversão à cepa fenótipo-padrão virulenta. Particularmente, em hospedeiros imunocomprometidos este pode ser um quadro ameaçador.Alternativamente, as vacinas são administradas como uma combinação de antigenos derivados de patógenos juntamente com compostos que induzem ou intensificam as respostas imunes contra estes antigenos (estes compostos são comumente denominados adjuvantes), já que estas vacinas subunitárias, por si só, não são geralmente eficazes.
[0005] Embora não haja dúvidas de que as vacinas acima mencionadas sejam tratamentos médicos valiosos, existe a desvantagem de que, devido a sua complexidade, vários efeitos colaterais possam ser evocados, como por exemplo, aos antígenos fixados na vacina que apresentam reatividade cruzada com as moléculas expressadas pelas células de indivíduos vacinados. Além disto, os requisitos em vigor das autoridades normativas, como por exemplo, a "World Health Organization" (WHO), o "Food and Drug Administration" (FDA), e seus correlativos europeus, para a exata especificação de composição da vacina e dos mecanismos de indução de imunidade, são difíceis de atender.
[0006] Células apresentadoras de antígenos pertencem ao sistema imune inato que evoluiu como defesa de hospedeiro de primeira linha e que limita a infecção logo após exposição a microorganismos (Hoffmann e outros, 1999). As células do sistema imune inato reconhecem padrões ou estruturas relativamente não-específicas expressados em seus alvos, ao invés de estruturas específicas mais sofisticadas, que são reconhecidas pelo sistema imune adaptativo (Hoffman e outros, 1999) . Exemplos de células do sistema imune inato são os macrófagos e as células dendríticas, mas também os granulócitos (ex: neutrófilos) , células matadoras naturais e outras. Ao contrário, as células do sistema imune adaptativo reconhecem estruturas antigênicas especificas, inclusive peptídeos, no caso de células T e peptídeos bem como estruturas tridimensionais no caso das células B. O sistema imune adaptativo é muito mais específico e sofisticado do que o sistema imune inato e melhora mediante exposição repetida a um dado patógeno/antígeno. Filogeneticamente, o sistema imune inato é muito mais antigo e pode ser encontrado já em organismos muito primitivos. Entretanto, o sistema imune inato é crítico durante a fase inicial de exposição antigênica já que, além de conter patógenos, células do sistema imune inato, ou seja, APCs, células preparadas do sistema imune adaptativo e assim disparar respostas imune específicas levando à remoção dos intrusos. Em suma, as células do sistema imune inato e, particularmente, as APCs desempenham um papel critico durante a fase de indução de respostas imunes por a) . conter infecções por meio de um sistema padrão primitivo de reconhecimento e b) . células preparadoras do sistema imune adaptativo levando a respostas e memória imunes especificas resultando na remoção de patógenos intrusos ou de outros alvos (Roitt e outros, 1998). Estes mecanismos podem também ser importantes para remover ou conter células tumorais.
[0007] Conforme acima mencionado, células do sistema imune inato reconhecem padrões expressados em seus respectivos alvos. Exemplos são lipopolissacarideos (LPS) no caso de bactérias gram-negativas, glicolipídeos micobacterianos, ácidos lipoteicóicos de bactérias gram-positivas, manans de levedura e RNAs bifilamentares de vírus (Hoffmann e outros, 1999) . Além disto, eles podem ser padrões reconhecidos, tais como glicosilações alteradas de proteínas em células tumorais.
[0008] Descobertas recentes descrevem DNAs de protozoários ou eucariotas inferiores como um padrão adicional reconhecido pelo sistema imune inato (porém, possivelmente também pelo adaptativo) de mamíferos (e provavelmente da maioria, senão de todos os vertebrados) (Krieg, 1996; Lipford e outros, 1998).
[0009] O sistema imune reconhece organismos inferiores incluindo bactérias provavelmente devido às diferenças de uso estrutural e seqüencial entre patógenos e DNA hospedeiro. Em particular, trechos curtos de DNA, derivados de invertebrados ou na forma de ODNs sintéticos curtos contendo dinucleotideos de citosina-guanina (CpG) não-metilados num determinado contexto base, são atingidos (Krieg e outros, 1995). Modos CpG são encontrados na freqüência esperada em DNA bacteriano, sendo porém muito menos freqüentes em DNA de vertebrados (LipLord e outros, 1998;Pisetsky, 1999). Além disso, modos CpG de invertebrados (ou seja, bacterianos) não são metilados, ao passo que as seqüências CpG de vertebrados o são. Estas diferenças entre DNA bacteriano e DNA de vertebrados permite que os vertebrados reconheçam o DNA de invertebrados como um sinal de perigo.
[0010] DNA natural contendo CpG, ODNs, bem como ODNs tiofosfato-substituidos (troca de resíduos tiofosfato em fosfato) ODNs contendo modos CpG (CpG-ODN) não são apenas ativadores potentes de proliferação de células imunes e respostas humorais imunes (Krieg e outros, 1995), mas também estimulam fortes respostas celulares imunes (revisto em Lipford e outros, 1998). DNA/ODNs contendo modos CpG não-metilados podem ativar diretamente células monocíticas (células dendríticas, macrófagos) e células B. De forma similar, células matadoras naturais (NK) não são diretamente ativadas mas respondem a IL-12 (interleucina 12)monócito-derivada com um aumento marcante em sua produção de IFN-γ (Chace e outros, 1997). Conseqüentemente, a indução de monócitos e células NK por DNA CpG promove a indução de respostas do tipo Thl e o desenvolvimento de células citotóxicas T.
[0011] O ácido ribonucléico baseado em inosina e citosina, como o ácido poliinosínico-policitidílico (poli I:c) é conhecido por promover respostas imunes Thl-especificas. É conhecido por estimular macrófagos a produzirem citocinas tais como IL-α e IL-12 (Manetti e outros, 1995) , sendo também conhecido como um potente indutor tipo 1 de interferon (Manetti e outros, 1995) e um potente estimulador de célula NK (Cavanaugh e outros, 1996).
[0012] Este efeito, porém, ficou estritamente restrito a ácido ribonucléico contendo resíduo inosina e citidina. (W098/16247).
[0013] Investigações conduzidas pelos inventores da presente invenção mostraram que ODNs contendo modos CpG não-metilados, embora sendo eficientes na estimulação do sistema imune, apresentam desvantagens essenciais, especialmente com respeito à especificidade (antecedente alto) e indução de efeitos colaterais, tais como alta geração de TBF-a sistêmico. A alta liberação de TNF-α sistêmico é conhecida por causar síndrome de choque tóxico, que pode levar à morte pacientes acometidos.
[0014] É, portanto, um objeto da presente invenção prover ODNs novos adequados que não causem tais efeitos colaterais drásticos como ODNs baseados em seqüências de CpG. Outro objeto da presente invenção consiste em reduzir os efeitos colaterais de composições farmacêuticas contendo ODNs conhecidos e em prover composições farmacêuticas eficientes e bem toleráveis com propriedades imunoestimulatórias eficientes que sejam adequadas para vacinação de animais, especialmente de mamíferos, inclusive seres humanos.
[0015] Este objeto é resolvido através da molécula de ácido oligodeoxinucléico imunoestimulatório (ODN) tendo a estrutura de acordo com a fórmula (I) qualquer X é 0 ou S, onde qualquer NMP é um monofosfato ou monotiofosfato de 2 'deoxinucleosídeo, selecionado do grupo consistindo de monofosfato ou monotiofosfato de deoxiadenosina, deoxiguanosina, deoxiinosina, deoxicitosina, deoxiuridina, deoxitimidina, 2-metil-deoxiinosina, 5-metil-deoxicitosina, deoxipseudouridina, deoxirribosepurina, 2-amino- deoxirribosepurina, 6-S-deoxiguanina, 2-dimetil- deoxiguanosina ou de N-isopentenil-deoxiadenosina, NUC é um 2'deoxinucleosídeo, selecionado do grupo consistindo de deoxiadenosina, deoxiguanosina, deoxiinosina, deoxicitosina, deoxiuridina, deoxitimidina, 2-metil-deoxiinosina, 5-metil-deoxicitosina, deoxipseudouridina, deoxirribosepurina, 2-amino-deoxirribosepurina, 6-S-deoxiguanina, 2-dimetil- deoxiguanosina, ou N-isopentenil-deoxiadenosina, a e b são números inteiros de 0 a 100 contanto que a + b seja entre 4 e 150, B e E são grupos comuns para as extremidades 5 'ou 3' de moléculas de ácido nucléico.
[0016] Surpreendentemente, verificou-se que ODNs contendo resíduo deoxiinosina mostram um efeito imunoestimulatório comparável ou, mesmo em muitos casos, ainda melhor do que ODNs contendo modos CpGs. Além disso, os ODNs de acordo com a presente invenção produzem mais respostas imunes específicas a um dado antígeno ou fragmento de antígeno do que ODNs CpG. Além do mais, os ODNs de acordo com a presente invenção, reduziram a indução de reações de efeitos colaterais, especialmente a indução de TNF-α ou IL-6 sistêmico.
[0017] Embora certos efeitos imunoestimulatórios tenham sido descritos para moléculas de RNA contendo inosina, tais como poli-IC ou as moléculas mencionadas em WO09/16247, verificou-se surpreendentemente que as moléculas de ácido deoxinucléico contendo resíduo deoxiinosina, podem ser bons ODNs estimuladores.
[0018] Adicionalmente, os Ι-ODNs de acordo com a presente invenção são - ao contrário dos ODNs baseados em modo CpG específico - não dependentes de um modo específico ou de uma seqüência palindrômica, conforme descrito para o oligonucleotídeo CpG (veja, por exemplo, EP 0 468 520 A2, WO96/0255, WO98/18810, W098/37919, W098/40100, W098/52581, W099/51259 e W099/56755, todos incorporados aqui por referência).
[0019] Portanto, um grupo de Ι-ODNs de acordo com a presente invenção, pode preferivelmente conter um modo Cl (e, portanto, os ODNs descritos nestas referências incorporadas, onde um ou mais resíduos guanosina são substituídos por resíduos deoxiinosina são concretizações preferidas dos ODNs da presente invenção). Isto não é necessário para sua propriedade imunoestimulatória principal, já que Ι-ODNs com uma inosina não colocada num contexto Cl ou IC também exibem propriedades imunoestimulatórias.
[0020] O I-ODN de acordo com a presente invenção é, portanto, uma molécula de DNA contendo um resíduo deoxiinosina que é preferivelmente provida na forma de filamento simples.
[0021] O I-ODN de acordo com a presente invenção pode ser isolado através de métodos recombinantes ou quimicamente sintetizado. No último caso, o I-ODN, de acordo com a presente invenção, pode também conter oligonucleotídeos modificados que podem ser sintetizados utilizando transformações químicas padrão, tais como metilfosfonatos ou outros oligonucleotídeos modificados à base de fósforo, tais como fosfotriésteres, fosfoamidatos e fosforoditioratos. Outros oligonucleotídeos modificados em base não fosforosa podem também ser utilizados (Stirchak e outros, MAR 17 (1989), 6129-6141), porém, monofosfatos ou monotiofosfatos sendo preferido o monofosfato de 2'deoxinucleosídeo a ser utilizado na presente invenção.
[0022] Os NMPs dos I-ODNs, de acordo com a presente invenção, são preferivelmente selecionados do grupo consistindo de monofosfato ou monotiofosfato de deoxiadenosina, deoxiguanosina, deoxiinosina, deoxicitosina, deoxiuridina, deoxitimidina, 2-metil-deoxiinosina, 5-metil-deoxicitosina (como é usual, o grupo fosfato ou tiofosfato é 5' da deoxirribose) . Embora seja essencial para os ODNs baseadas no modo CpG que este modo seja não-metilado, surpreendentemente não é este o caso dos ODNs de acordo com a presente invenção, onde, por exemplo, resíduos 2-metil-deoxiinosina ou 5-metil-deoxicitosina não apresentam efeito negativo sobre as propriedades imunoestimulatórias dos ODNs, de acordo com a presente invenção. Alternativamente, ao invés das formas 2-deoxi dos NMPs, também outros grupos especialmente inertes podem estar presente no local-2 do grupo ribose, tal como, por exemplo, -F, -NH2, -CH3, especialmente -CH3. Obviamente, os grupos -OH e SH estão excluídos para os Ι-ODNs de acordo com a presente invenção para estar presente no local-2' da ribose, especialmente o resíduo ribose para NMP de inosina.
[0023] A extensão dos ODNs, de acordo com a presente invenção, está na faixa dos ODNs padrão, utilizados de acordo com o estado da técnica. Portanto, moléculas com uma extensão total inferior a 4 e superior a 150 mostram potencial imunoestimulatório gradualmente decrescente.
[0024] ODNs preferidas contém entre 10 e 60, especialmente entre 15 e 40 bases (nucleosídeos) , implicando que a + b na fórmula I situa-se entre 10 e 60, preferivelmente entre 15 e 40 nestas concretizações preferidas.
[0025] As moléculas de ácido ribonucléico contendo inosina e citidina descritas como imunoestimulatórias no estado da técnica são ácidos polinucléicos grandes e relativamente indefinidos, com pesos moleculares muito acima de 200.000 (um ácido poliinosínico-policitidílico comercializado pela Sigma Chemicals tem um peso molecular variando de 220.000 a 460.000 (pelo menos 500-1000 de resíduos C+I). As moléculas de acordo com a presente invenção são moléculas de DNA de extensão muito mais curta com uma extensão e composição bem definida, sendo altamente reproduzíveis em produtos.
[0026] É também preferido que NMP dos Ι-ODNs contendo deoxiinosina, de acordo com a fórmula I seja um monotiof osf ato contendo de 1 a 4 átomos de enxofre e que também os NMPs adicionais, especialmente todos os NMPs adicionais estejam presentes como monotiofosfatos de nucleosideo, porque tais ODNs exibem resistência a nuclease mais alta (é evidente na presente invenção que "mono" em "monotiofosfatos" refere-se ao fosfato, ou seja, que um grupo fosfato (um átomo de fósforo) está presente em cada NMP) . Preferivelmente, pelo menos um de Xi e X2 é S e pelo menos um de X3 e X4 é 0 nos NMPs, de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, X3 e X4 são 0. (X3 pode ser (devido à síntese de NMP) derivado, por exemplo, do grupo fosfato ou do grupo 3' de NMP-ribose).
[0027] Preferivelmente os ODNs, de acordo com a presente invenção, contém a seqüência hhh wdi dhh h nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn, nhh wdi din hhh hdi ndi nh, nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn ou nhh wdi did hhh hdi ddi dh, onde qualquer n é monofosfato ou monotiofosfato de 2 deoxinucleosídeo, selecionado do grupo consistindo de monofosfato ou monotiofosfato de deoxiadenosina, deoxiguanosina, deoxicitosina ou deoxitimidina, qualquer h é um monofosfato ou monotiofosfato de 2 deoxinucleosídeo, selecionado do grupo consistindo de monofosfato ou monotiofosfato de deoxiadenosina, deoxicitosina ou deoxitimidina, i é monofosfato ou monotiofosfato de deoxiinosina, qualquer w é um monofosfato ou monotiofosfato de 2 deoxinucleosídeo, selecionado do grupo consistindo de monofosfato ou monotiofosfato de deoxiadenosina ou deoxitimidina, e qualquer d é um monofosfato ou monotiofosfato de 2 deoxinucleosídeo, selecionado do grupo consistindo de monofosfato ou monotiofosfato de deoxiadenosina, deoxiguanosina ou deoxitimidina.
[0028] Conforme acima descrito, um modo específico (tal como CpG ou um palíndromo) não é necessário para os I-ODNs de acordo com a presente invenção. Porém, os ODNs contendo um modo Cl são preferidas de forma que numa concretização preferida o ODN, de acordo com a fórmula I, contenha pelo menos um monofosfato ou monotiofosfato de 2'-deoxicitosina monofosfato ou monotiofosfato 3'-adjacente a um 2'-deoxiinosina para formar tal modo 5'-CI 3'.
[0029] ODNs preferidas de acordo com a presente invenção contém uma ou mais da seqüência gacitt, iacitt, gaictt, iaictt, onde a é monofosfato ou monotiofosfato de deoxiadenosina, g é monofosfato ou monotiofosfato de deoxiguanosina, i é monofosfato ou monotiofosfato de deoxiinosina, c é monofosfato ou monotiofosfato de deoxicitosina e t é monofosfato ou monotiofosfato de deoxitimidina.
[0030] Os I-ODNs de acordo com a presente invenção são especialmente adequados para aplicação no campo farmacêutico, podendo, por exemplo, ser aplicados como medicamento num animal ou em seres humanos. São especialmente adaptados para atuar como agente imunoestimulatório, especialmente em ou juntamente com composições de vacina.
[0031] Portanto, a presente invenção também refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um ODN de acordo com a presente invenção.
[0032] Uma vez que a composição farmacêutica preferida de acordo com a presente invenção é uma vacina, esta composição deveria conter um antigeno além do ODN de acordo com a presente invenção. O potencial deste antigeno para elevar a resposta de proteção/imune do indivíduo vacinado é fortemente aumentado quando ele é combinado com os ODNs da presente invenção, especialmente devido à sua atividade imunoestimulatória.
[0033] Uma vacina pode conter toda uma variedade de diferentes antígenos. Exemplos de antigenos são os organismos totalmente inativados, tais como vírus ou bactérias, fungos, protozoários ou até mesmo células cancerosas inativadas. Antígenos podem também consistir de subfrações destes organismos/tecidos, de proteínas, ou, em sua forma mais simples, de peptídeos. Os antígenos podem também ser reconhecidos pelo sistema imune na forma de proteínas ou peptídeos glicosilados e podem também ser ou conter polissacarídeos ou lipídeos. Peptídeos curtos podem ser utilizados desde que, por exemplo, células T citotóxicas (CTL) reconheçam antígenos na forma de peptídeos longos geralmente com 8-11 aminoácidos curtos em conjunto com o complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (Rammensee e outros, Immunogenetics 41, (1995), 178-228). As células B reconhecem peptídeos mais longos iniciando em torno de 15 aminoácidos (Harrow e outros, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)). Ao contrário dos epítopos de célula T, a estrutura tridimensional de antigenos de célula B pode também ser importante para o reconhecimento pelos anticorpos. A fim de obter respostas imunes antígeno-específicas sustentadas, os adjuvantes são úteis para disparar cascatas imunes que envolvem todas as células do sistema imune necessário. Primariamente, os adjuvantes atuam, porém não estão restritos em seu modo de ação, sobre as denominadas células apresentadoras de antigenos (APCs). Estas células geralmente primeiro encontram o(s) antígeno(s) seguido da apresentação de antigeno processado ou não-modifiçado ao efetor imune. Tipos de célula intermediária também podem estar envolvidos. Somente as células efetoras com a apropriada especificidade são ativadas numa resposta imune produtiva. 0 adjuvante pode também reter localmente antigenos e outros fatores co-injetados. Além disso, o adjuvante pode atuar como um quimioatraente para outras células imunes ou pode atuar localmente e/ou sistemicamente como um agente estimulante para o sistema imune.
[0034] De acordo com uma concretização preferida, epitopos de células T são utilizados como antigenos. Alternativamente, uma combinação de epitopos de célula T e epitopos de célula B podem também ser preferidos.
[0035] Os antigenos a ser utilizados nas composições da presente invenção não são críticos. Também as misturas de antigenos diferentes são obviamente possíveis de ser utilizadas de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, proteínas ou peptídeos derivados de um patógeno viral ou bacteriano ou de fungos ou parasitas são utilizados como tais antigenos (inclusive antigenos derivatizados ou antigenos glicosilados ou lipidados ou polissacarideos ou lipideos). Outra fonte preferida de antigenos são antigenos tumorais. Patógenos preferidos são selecionados de virus da imunodeficiência humana (HIV), virus da hepatite A e B, virus da hepatite C (HCV), virus Epstein Barr (EBV), virus da influenza, rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumonias, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumonias, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (Pl. falciparum, Pl. vivax, etc.), Aspergillus sp. ou Candida albicans. Antigenos podem também ser moléculas expressadas por células cancerosas (antigenos tumorais). 0 processo de derivação pode incluir a purificação de uma proteína específica do patógeno/células cancerosas, a inativação do patógeno, bem como a derivatização ou estabilização proteolítica ou química de tal proteína. Da mesma forma, antigenos tumorais (vacinas para câncer) ou antigenos autoimunes podem ser utilizados na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção. Com tais composições, uma vacinação contra tumor ou um tratamento para doenças autoimunes pode ser realizado.
[0036] No caso de antigenos peptídicos, o uso de mimítopos/agonistas/superagonistas/antagonistas peptídicos ou peptídeos alterados em certas posições sem afetar as propriedades imunológicas ou mimítopos/agonistas/superagonistas/antagonistas não-peptídicos (revisto em Sparbier e Walden, 1999) é incluído na presente invenção. Antigenos peptídicos podem também conter alongamentos na terminação carboxi ou na terminação amino do antígeno peptídico, facilitando a interação com o(s) composto(s) policatiônico(s) ou com o(s) composto(s) imunoestimulatório(s). Para o tratamento de doenças autoimunes podem ser aplicados os antagonistas peptidicos.
[0037] Antigenos podem também ser derivatizados para incluir moléculas que aumentam a apresentação de antigenos e o atingimento de antigenos para células apresentadoras de antigenos.
[0038] Numa concretização da invenção, a composição farmacêutica serve para conferir tolerância a proteínas ou fragmentos de proteína e peptídeos envolvidos em doenças autoimunes. Antigenos utilizados nestas concretizações servem para conferir tolerância ao sistema ou efetuar "down-regulation" em respostas imunes contra epítopos envolvidos em processos autoimunes.
[0039] Preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, especialmente na forma de uma vacina, compreende ainda um polímero policatiônico, preferivelmente um peptídeo policatiônico, especialmente poliarginina, polilisina ou um peptídeo antimicrobiano.
[0040] 0(s) composto(s) policatiônico(s) a ser utilizado de acordo com a presente invenção pode ser qualquer composto policatiônico que demonstre o efeito característico de acordo com WO 97/30721. Compostos policatiônicos preferidos são selecionados de polipeptídeos básicos, polications orgânicos, poliaminoácidos básicos ou suas misturas. Estes poliaminoácidos deveríam apresentar uma extensão de cadeia de pelo menos 4 resíduos aminoácidos (consulte: Tuftsin conforme descrito em Goldman e outros (1983)). Especialmente preferidas são as substâncias contendo ligações peptídicas, como a polilisina, poliarginina e polipeptídeos contendo mais de 20%, especíalmente mais de 50% de aminoácidos básicos numa faixa de mais de 8, especialmente mais de 20 resíduos âmínoácídO' ou suâs misturas. Outros polications preferidos e suas composições farmacêuticas são descritos em WQ 97/30721 (ex: polietiXenoimina) e WO 99/38528, Preferivelmente, estes polipeptídeos contém entre 20 e 500 resíduos aminoácido, especialmente entre 30 e 200 resíduos.
[0041] Estes compostos policatiônicos podem ser produzidos química ou recombinantemente ou podem ser derivados de fontes naturais.
[0042] {Poli)peptídeos catiônicos podem também ser peptideos mícrobianos antibacterianos policatiônicos com propriedades conforme observado em (Ganz e Lehrer, 1999; Hancock, 1999). Estes {poli)peptídeos podem ser de origem procariótica, animal ou vegetal ou podem ser produzidos química ou recombinantemente (Andreu e Rivas, 1998; Ganz e Lehrer, 1999; Símmaco e outros, 1998). Peptídeos podem também pertencer k classe de defensinas (Ganz, 1999; Gans e Lehrer, 1999) . Seqüências de tais peptídeos podem ser, por exemplo, encontradas no Banco de Dados de Seqüências Mícrobianas, no seguinte endereço de internet: http: //www.bbcm.univ. trieste . it/-tossi/pagl .htnal [0043] Tais peptídeos de defesa de hospedeiro ou defensivos são também uma forma preferida do polímero policatiônico de acordo com a presente invenção. Geralmente, um composto que permite como ativação de produto final (ou down-regulation) do sistema imune adaptativo, preferivelmente mediado por APCs {inclusive células dendríticas) é utilizado como polímero policatiônico.
[0044] Especialmente preferida para uso como substância policatiônica na presente invenção são peptideos antimicrobianos derivados de catelicidina ou seus derivados (A 1416/2000, aqui incorporados por referência), especialmente os peptideos antimicrobianos derivados de catelicidina de mamífero, preferivelmente de ser humano, bovino ou camundongo, ou compostos neuroativos, tal como hormônio de crescimento (humano).
[0045] Compostos policatiônicos derivados de fontes naturais incluem HIV-REV ou HIV-TAT (peptideos catiônicos derivados, peptideos antenapédicos, quitosana ou outros derivados de quitina) ou outros peptideos derivados destes peptideos ou proteínas através de produção bioquímica ou recombinante. Outros compostos policatiônicos preferidos são a catelina ou substâncias relacionadas a ou derivadas de catelina. Por exemplo, a catelina de camundongo é um peptídeo que possui a seqüência de aminoácido NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH. Substâncias relacionadas a ou derivadas de catelina contém toda ou partes da seqüência catelínica com pelo menos 15-20 resíduos aminoácidos. Derivações podem incluir a substituição ou modificação dos aminoácidos naturais por aminoácidos que não figurem entre os 20 aminoácidos padrão. Além disto, outros resíduos catiônicos podem ser introduzidos em tais moléculas de catelina. Estas moléculas de catelina são preferidas na combinação com o antigeno e o ODN imunogênico de acordo com a presente invenção. Porém, estas moléculas de catelina surpreendentemente demonstraram ser também eficazes como adjuvante para um antigeno sem a adição de adjuvantes adicionais. É, portanto, possível, utilizar tais moléculas de catelina como adjuvantes eficientes em formulações de vacina com ou sem substâncias imunoativadoras adicionais.
[0046] Outra substância policatiônica preferida a ser utilizada de acordo com a presente invenção é um peptideo sintético contendo pelo menos dois modos KLK separados por um ligante de 3 a 7 aminoácidos hidrofóbicos (A 1789/2000, aqui incorporado por referência).
[0047] Foi muito surpreendente que o efeito imunoestimulante da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção se apresentasse significativamente mais alto do que o esperado do acréscimo dos efeitos de cada componente único ou mesmo do acréscimo dos efeitos do ODN ou do polication com o antigeno.
[0048] B e E na fórmula I são grupos comuns de terminações 5" e/ou 3 "de moléculas de ácido nucléico. Exemplos de tais grupos estão prontamente disponíveis para o habilitado na técnica, (consulte, por exemplo "Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach" (1991), ed. Eckstein, Oxford University Press). Para os I-ODNs de acordo com a presente invenção B e/ou E são preferivelmente selecionados independentemente de -H, -CH3, -COCH3, -OH, -CHO, um grupo fosfato, tiofosfato, sulfato ou tiosulfato, ou um grupo fosfoalquila, especialmente com uma extensão de alquila de Ci-C6 e/ou com um grupo amino terminal (o grupo amino pode, por exemplo, ser usado para marcação adicional dos I-ODNs de acordo com a presente invenção, por exemplo, -P04_ (CH2)n-NH2 ou -P04- (CH2) n-NH-marcado) . Especialmente preferidos como B são os nucleosídeos, especialmente os 2'deoxinucleotídeos mencionados acima (ou seja, sem o grupo fosfato ou tiofosfato). Alternativamente estes grupos podem também conter grupos ligantes em outras moléculas, especialmente moléculas portadoras ou marcadores. Em tais formas de ODNs, onde os ODNs são limitados a superfícies, partículas ou marcadores, estas superfícies, partículas, marcadores, etc. são também parte dos grupos V e/ou E.
[0049] Obviamente, qualquer forma ionizada (sal) ou formas tautoméricas das moléculas de acordo com a fórmula I, estão incluídas nesta fórmula I.
[0050] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ainda compreender ingredientes ativos adicionais (substâncias farmaceuticamente ativas), especialmente substâncias que são úteis numa conexão de vacina. Concretizações preferidas destes outros ingredientes ativos são as citocinas, substâncias antiinflamatórias, substâncias antimicrobianas ou suas combinações.
[0051] Obviamente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ainda conter substâncias auxiliares, especialmente um portador farmaceuticamente aceitável, substâncias tamponantes, estabilizantes ou suas combinações.
[0052] As quantidades relativas dos ingredientes na composição farmacêutica da presente invenção são altamente dependentes das necessidades do antígeno individual e do animal/ser humano no qual esta composição deve ser aplicada. Portanto, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção preferivelmente contém uma ou mais ODNs de acordo com a presente invenção, preferivelmente de 1 pg a 10 g, preferivelmente de 1 ng a 1 g, mais preferivelmente de 100 ng a 10 mg, especialmente de 10 mg a 1 mg. O antigeno bem como o polímero policatiônico pode ser aplicado em dosagens similares, sendo preferida uma faixa de 1 a 10.000 mg de antígeno e de 0,1 a 1.000 mg de polication por vacinação.
[0053] As composições da presente invenção podem ser aplicadas a um paciente, como por exemplo, a um candidato a vacinação, em quantidades eficientes, como por exemplo, semanalmente, quinzenalmente ou em intervalos mensais. Pacientes a serem tratados com as composições da presente invenção podem também ser vacinados repetidamente ou uma única vez. Um uso preferido da presente invenção é a imunização ativa, especialmente de seres humanos ou animais sem proteção contra o antígeno específico.
[0054] A via de aplicação para a composição da presente invenção não é crítica, como por exemplo, a injeção subcutânea, intramuscular, intradérmica ou transdérmica é adequada, bem como a administração oral.
[0055] É também possível aplicar a composição da presente invenção separadamente, como por exemplo, injetando-se a substância imunoestimulante separadamente da composição antigênica/policatiônica. A presente invenção também refere-se, portanto, a um kit compreendendo uma composição contendo antígeno e o polímero policatiônico como componente único e uma composição contendo substância imunoestimulante de dhe ou quimiotática como segundo componente.
[0056] Os componentes podem ser aplicados no mesmo local ou horário, porém, uma aplicação em locais ou horários diferentes ou durante um período de tempo diferente também é possível. É também possível variar as aplicações sistêmicas ou locais da composição ou os componentes, respectivamente.
[0057] Detalhes da presente invenção são descritos pelos exemplos e figuras a seguir, não estando porém a invenção a eles limitada.
[0058] A Figura 1 mostra a resposta imune contra OVA257-264 peptidica derivada de ovalbumina após injeção de OVA257-264'/ poli-L-arginina (pR 60) e oligodeoxinucleotideos de deoxiinosina contendo I (I-ODN) ou CpG 1668. Camundongos foram injetados em suas patas traseiras com misturas, conforme indicado. Quatro dias depois, células de gânglios linfáticos drenantes foram estimuladas ex vivo com OVA257-264· O número de células produtoras de IFN-g foi determinado 24 horas depois, utilizando-se um ensaio ELISPOT. Os resultados foram expresssos como o número de manchas/lxlO6 células de gânglio linfático.
[0059] A Figura 2 mostra a indução de produção de TNF-a sistêmico após injeção de OVA257-264? poli-L-arginina (pr 60) e oligodeoxinucleotideo contendo I (I-ODN) ou CpG 1668. Camundongos foram injetados nas patas traseiras com misturas conforme indicado. Uma hora após a injeção, foi coletado sangue da veia da cauda e preparado soro. A concentração de TNF-a nos soros foi determinada utilizando-se ensaio ELISA.
[0060] A Figura 3 mostra a resposta imune contra OVA257-264 peptidica derivada de ovalbumina após injeção de OVA257-264r poli-L-arginina (pR60) e oligodeoxinucleotideo de deoxiinosina contendo I (I-ODN), CpG 1668 ou GpC. Camundongos foram injetados nas patas traseiras com misturas conforme indicado. Quatro dias depois, células de gânglios linfáticos drenantes foram estimuladas ex vivo com OVA257-264? um mTRP2i8i_ 188 peptidico irrelevante (proteina-2 relacionada com tirosinase murino, VYDFFVWL) ou pR 60. O número de células produtoras de TFN-g foi determinado 24 horas depois utilizando um ensaio ELISPOT. Os resultados estão expressos como o número de manchas/lxlO6 células de gânglios linfáticos com desvio padrão de triplicatas.
[0061] A Figura 4 mostra a indução de produção de TNF-a sistêmico após injeção de OVA257-264? poli-L-arginina (pR60) e oligodeoxinucleotideo contendo I (I-ODN), GpC ou CpG 1668. Camundongos foram injetados nas patas traseiras com misturas conforme indicado. Uma hora após a injeção, foi coletado sangue da veia da cauda e preparado soro. A concentração de TNF-a e de IL-6 nos soros foi determinada utilizando-se ELISA citocina-especifica.
[0062] A Figura 5 mostra a resposta imune contra OVA257-264 peptidica derivada de ovalbumina após a injeção de TRP-2, poli-L-arginina, CpG 1668 ou següências randômicas 20-mer contendo deoxiinosina. Camundongos foram injetados nas patas traseiras com misturas conforme indicado. Quatro dias depois, células de gânglios linfáticos drenantes foram estimuladas ex-vivo com TRP-2, uma OVA257-264 peptidica irrelevante ou pR 60. O número de células produtoras de IFN-g foi determinado 24 horas após utilizar um ensaio ELISPOT. Os resultados são expressos como o número de manchas/lxlO6 de células de gânglios linfáticos com desvio padrão de triplicatas.
[0063] A Figura 6 mostra a injeção combinada de I-ODN e poli-L-arginina (pR 60) juntamente com um peptideo derivado de Melanoma.
[0064] A Figura 7 mostra gue a injeção combinada de I-ODN e pR 60 juntamente com um peptideo derivado de melanoma reduz a indução de TNF-α sistêmico e de IL-6.
[0065] A Figura 8 mostra a injeção combinada de um I-ODN randômico 10-mer e pR 60 juntamente com um peptideo derivado de melanoma.
[0066] A Figura 9 mostra gue a aplicação combinada de ovalbumina (OVA) com oligo-dIC26-mer e pR aumenta a produção de anticorpos IgG OVA-especificos. Camundongos foram injetados subcutaneamente na pata com misturas conforme indicado. No 24° e 115° dia após injeção, foram coletados os soros e feita triagem por meio de ELISA para anticorpos IgG2a OVA-específicos (A) e IgGl (B) . Os resultados são apresentados como o titulo de anticorpo.
Exemplos [0067] Em todos os experimentos, foram utilizados ODNs tiofosfato-substituidos (com resíduos tiofosfato substituindo fosfato, adiante designados "oligodeoxinucleotídeos substituídos com tiofosfato") , uma vez que tais ODNs mostram resistência a nuclease mais alta (Bailas e outros, 1996; Krieg e outros, 1995; Parronchi e outros, 1999) .
Exemplo 1 [0068] A injeção combinada de Ι-ODNs e poli-L-arginina (pR 60) diferentes aumenta sinergicamente a resposta imune contra um peptídeo derivado de Ovalbumina Grupos Experimentais (5 camundongos por grupo) 1 . OVA.2 57-264 2 . OVA^si - 264 t pR 60 3. OVA2 51-264 + CpG 1668 4, OVA25 + I-ODN 1 5 * OVA2e,?-264 + I-ODN 2 6. ΟVA232-264 + I-ODN 3 7. OVA231-264 + CpG 1668 + pR 60 8. OVA257-264 + I-ODN 1 + pR 60 9. OVA25!-2ô4 + I-ODN 2 + pR 60 lO.OVAíro^e* + I-ODN 3 + pR 60 [0069] No dia 0, camundongos foram injetados em cada pata traseira com um volume total de 100 ml (50 ml por pata) contendo os compostos acima mencionados. Os animais foram sacrificados 4 dias após a injeção e os gânglios linfáticos popliteos foram coletados. Os gânglios linfáticos foram passados por um filtro de células de 70 mm e lavados duas vezes com meio DMEM (GIBCO BRL) contendo soro de novilho fetal a 5% (FCS, SIGMA Chemicals). As células foram ajustadas para 3xl06 células/ml em DMEM/5%/FCS. Um ensaio ELISPOT de IFN-g foi conduzido em triplicatas conforme descrito (Miyahira e outros, 1995). Este método é um procedimento largamente utilizado, permitindo a guantificação de células T antigeno-especificas. Os linfócitos foram estimulados ex vivo com meio de controle de fundo, OVA257-264_peptideo ou Concanavalina A (Con A).Manchas representando células T produtoras de IFN-g simples foram contadas e o número de manchas de fundo foi subtraído de todas as amostras. O alto número de manchas detectadas após estimulação com Con A (dados não mostrados) indica uma boa condição dos linfócitos utilizados. Para cada grupo experimental de camundongos, o número de manchas/lxlO6 células está ilustrado na Figura 1.
[0070] Uma hora após injeção, foi coletado sangue da veia da cauda e preparado soro para determinar a indução de TNF-a sistêmico utilizando ELISA (Figura 2) .
Exemplo 2 [0071] A substituição de Guanosina por desoxi-Inosina converte a seqüência GpC não-imunogênica numa seqüência altamente imunogênica, especialmente quando combinada com poli-L-arginina (pR60).
Grupos Experimentais (5 camundongos por grupo) OVA^ST -264 OVÁ257-2§4 + pR 60 OVAzsi-iu + CpG 1668 GVA2 37-264 GpC ΟVA237-264 + I-ODN 9 OVA257-264 + I-ODN 10 GVA257-264 t CpG 1668 + pR 60 ΟVA2s7 -2e4 + GpC + pR 60 ΟVA257-264 + I-ODN 9 + pR 60 OVA257-264 + I-ODN 10 + pR 60 [0072] No dia 0, camundongos foram injetados em cada pata traseira com um volume total de 100 μΐ ( 50 μΐ por pata) contendo os compostos acima mencionados. Os animais foram sacrificados 4 dias após a injeção e os gânglios linfáticos popliteos foram coletados. Os gânglios linfáticos foram passados por um filtro de células de 70 μιη e lavados duas vezes com meio DMEM (GIBCO BRL) contendo soro de novilho fetal a 5% (FCS, SIGMA Chemicals). As células foram ajustadas em 3xl06 células/ml em DMEM/FCS 5%. Um ensaio ELISPOT de IFN-g foi conduzido em triplicatas conforme descrito (Miyahira e outros, 1995). Este método é um procedimento largamente utilizado, permitindo a quantificação de células T antígeno-especificas. Os linfócitos foram estimulados ex vivo com meio de controle de fundo, OVA257-264_peptideo, um mTRP-2i8i-i88 peptidico irrelevante (proteína-2 relacionada com tirosinase murino, VYDFFVWL), pR 60 e Concanavalina A (Con A) .Manchas representando células T produtoras de IFN-g simples foram contadas e o número de manchas de fundo foi subtraído de todas as amostras. O alto número de manchas detectadas após estimulação com Con A (dados não mostrados) indica uma boa condição dos linfócitos utilizados. Para cada grupo experimental de camundongos, o número de manchas/lxlO6 células está ilustrado na Figura 3, sendo apresentado o desvio padrão de triplicatas estimuladas ex vivo.
[0073] Uma hora após injeção, foi coletado sangue da veia da cauda e preparado soro para determinar a indução de TNF-a sistêmico e de IL-6 utilizando ELISAs citocina-específicas (Figura 4).
Exemplo 3 [0074] A injeção combinada de seqüências randômlcas 20-mer contendo deoxiinosina e um peptídeo derivado de melanoma induz uma forte resposta imune contra o· peptídeo, que pode ser adicionalmente aumentada pela co-aplicação de poli-L-arginina (pR 60)- Grupos Experimentais (5 camundongos por grupo) 1. TRP-2 2. TRP-2 + pR 60 3. TRP-2 + CpG 1668 4. TRP-2 + wdi 5. TRP-2 + wdidin 6. TRP-2 + wdid 7. TRP-2 + wdidid 8. TRP-2 + CpG 1668 + pR 60 9. TRP-2 + wdi + pR 60 10. TRP-2 + wdidin + pR 60 11. TRP-2 + wdid + pR 60 12. TRP-2 + wdidid + pR 60 [0075] No dia 0, camundongos foram injetados em cada pata traseira com um volume total de 100 μΐ (50 μΐ por pata) contendo os compostos acima mencionados. Os animais foram sacrificados 4 dias após a injeção e os gânglios linfáticos popliteos foram coletados. Os gânglios linfáticos foram passados por um filtro de células de 70 μιη e lavados duas vezes com meio DMEM (GIBCO BRL) contendo soro de novilho fetal a 5% (FCS, SIGMA Chemicals). As células foram ajustadas em 3xl06 células/ml em DMEM/FCS 5%. Um ensaio ELISPOT de IFN-g foi conduzido em triplicatas conforme descrito (Miyahira e outros, 1995). Este método é um procedimento largamente utilizado, permitindo a guantificação de células T antigeno-especificas. Os linfócitos foram estimulados ex vivo com meio (fundo) , TRP-2-peptídeo, um OVA257-264_peptideo irrelevante, PR 60 e Concanavalina A (Con A) .Manchas representando células T produtoras de IFN-g simples foram contadas e o número de manchas de fundo foi subtraído de todas as amostras. O alto número de manchas detectadas após estimulação com Con A (dados não mostrados) indica uma boa condição dos linfócitos utilizados. Para cada grupo experimental de camundongos, o número de manchas/lxlO6 células está ilustrado na Figura 5, sendo apresentado o desvio padrão de triplicatas estimuladas ex vivo.
Exemplo 4 [0076] A injeção combinada de I-ODN e poli-L-arginina (pR 60) aumenta sinergicamente a resposta imune contra um peptídeo derivado de melanoma Grupos Experimentais (5 camundongos por grupo) 1 . TRP — 2181-188 2. TRP-2i8i_i88 + pR 60 3. TRP-2i8i-i88 + CpG 1668 4. TRP-2i8i-i88 + I-ODN 2 5. TRP-2i8i-i88 + CpG 1668 + pR 60 6. TRP-2i8i-i88 + I-ODN 2 + pR 60 [0077] No dia 0, camundongos foram injetados em cada pata traseira com um volume total de 100 μΐ (50 μΐ por pata) contendo os compostos acima mencionados. Os animais foram sacrificados 4 dias após a injeção e os gânglios linfáticos popliteos foram coletados. Os gânglios linfáticos foram passados por um filtro de células de 70 μιη e lavados duas vezes com meio DMEM (GIBCO BRL) contendo soro de novilho fetal a 5% (FCS, SIGMA Chemicals). As células foram ajustadas em 3xl06 células/ml em DMEM/FCS 5%. Um ensaio ELISPOT de IFN-g foi conduzido em triplicatas conforme descrito (Miyahira e outros, 1995). Este método é um procedimento largamente utilizado, permitindo a quantificação de células T antigeno-especificas. Os linfócitos foram estimulados ex vivo com meio de controle (fundo) , TRP-2i8i_i88-peptideo, um OVA257-264“ peptídeo irrelevante, e Concanavalina A (Con A).Manchas representando células T produtoras de IFN-g simples foram contadas e o número de manchas de fundo foi subtraído de todas as amostras. 0 alto número de manchas detectadas após estimulação com Con A (dados não mostrados) indica uma boa condição dos linfócitos utilizados. Para cada grupo experimental de camundongos, o número de manchas/lxlO6 células está ilustrado na Figura 6, sendo apresentado o desvio padrão de triplicatas estimuladas ex vivo.
[0078] Uma hora após injeção, foi coletado sangue da veia da cauda e preparado soro para determinar a indução de TNF-a sistêmico e de IL-6 utilizando ELISAs específicas (Figura 7). Exemplo 5 [0079] A injeção combinada de I-ODN randômico 10-mer e poli-L-arginina (pR 60) aumenta sinergicamente resposta imune contra um peptídeo derivado de melanoma.
Grupos Experimentais (5 camundongos por grupo) 1. TRP-2i81-188 2. TRP-2isi-i88 + PR 60 3. TRP-2i8i-i88 + CpG 1668 4. TRP-2i8i-i88 + ODN 17 5. TRP-2i8i-i88 + CpG 1668 + pR 60 6. TRP-2i8i-i88 + ODN 17 + pR 60 [0080] No dia 0, camundongos foram injetados em cada pata traseira com um volume total de 100 μΐ ( 50 μΐ por pata) contendo os compostos acima mencionados. Os animais foram sacrificados 4 dias após a injeção e os gânglios linfáticos poplíteos foram coletados. Os gânglios linfáticos foram passados por um filtro de células de 70 μιη e lavados duas vezes com meio DMEM (GIBCO BRL) contendo soro de novilho fetal a 5% (FCS, SIGMA Chemicals). As células foram ajustadas em 3xl06 células/ml em DMEM/FCS 5%. Um ensaio ELISPOT de IFN- g foi conduzido em triplicatas conforme descrito (Miyahira e outros, 1995). Este método é um procedimento largamente utilizado, permitindo a quantificação de células T antígeno-específicas. Os linfócitos foram estimulados ex vivo em triplicatas com meio de controle (fundo) , TRP-2i8i_i88-peptídeo, um OVA257-264_peptideo irrelevante, e Concanavalina A (Con A).Manchas representando células T produtoras de IFN-g simples foram contadas e o número de manchas de fundo foi subtraído de todas as amostras. 0 alto número de manchas detectadas após estimulação com Con A (dados não mostrados) indica uma boa condição dos linfócitos utilizados. Para cada grupo experimental de camundongos, o número de manchas/1x1O6 células está ilustrado na Figura 8, sendo apresentado o desvio padrão de triplicatas estimuladas ex vivo.
Exemplo 6 A aplicação combinada de oligo-deoxiIC2€.-rer e poli-L-arginina (pR) aumenta a resposta humoral de ovalbumina{OVA)-específica.
Grupos experimentais (4 camundongos por grupo) 1. OVA + o 1 i g o—d IC 2 & - me r + pR 2. OVA + OlígO-dIC26-raer 3. OVA + pR 4 . OVA
[0081] No dia 0, camundongos foram injetados em cada pata traseira com um volume total de 100 μΐ (50 μΐ por pata) contendo os compostos acima mencionados. No 24 0 dia após injeção, soro foi coletado e triado por ELISA para determinar a presença de anticorpos OVA-específicos. Estes resultados mostram que a injeção de OVA em combinação com oligo-dlC e pR aumentou a produção de anticorpos IgG OVA-específ icos em comparação com injeção de OVA com cada substância isoladamente (Figura 13A, B)» Interessantemente, títulos tanto de IgG2a como de IgGl foram aumentados mediante uma única injeção de OVA cora oligo-dIC/pR, implicando que tanto as células Thl como as Th2 estavam envolvidas. Porém, após 115 dias apenas os níveis aumentados de IgG2a eram ainda detectáveis nos soros de camundongos injetados com OVA e oligo-dIC/pR.
[0082] Estes dados demonstram que a injeção combinada de OVA com oligo-dlC e pR aumenta a resposta humoral OVA-especifica. Esta resposta é caracterizada pela produção tanto de isótipos de anticorpo Thl- e Th2-induzido na fase inicial, mas posteriormente, principalmente por anticorpos Thl-induzidos.
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REIVINDICAÇÕES
Claims (13)
1. Uso de uma molécula de ácido oligodeoxinucléico imunoestimulatório, caracterizada pelo fato de consistir na sequência de oligo-dlC26-mer (SEQ ID NO:30) para preparo de uma composição farmacêutica imunoestimulatório.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a dita composição farmacêutica imunoestimulatória ser uma vacina.
3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um ácido oligodeoxinucléico (ODN), consistindo da sequência de oligo-dlC26-mer (SEQ ID NO:30).
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente pelo menos um antigeno.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de pelo menos um antigeno ser derivado de patógenos virais ou bacterianos, de um fungo ou parasita, e/ou os antigenos serem antigenos de tumor ou antigenos de doenças autoimunes.
6. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de compreender ainda um polímero policatiônico, um peptideo antimicrobiano, um peptideo sintético contendo 2 modos KLK separados por um ligante de 3 a 7 aminoácidos hidrofóbicos, ou um hormônio de crescimento.
7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 6, caracterizada pelo fato de compreender ainda ingredientes ativos adicionais.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de o referido ingrediente ativo adicional ser citocina, substância anti-inflamatória, substâncias antimicrobianas ou combinações das mesmas.
9. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 8, caracterizada pelo fato de conter ainda substâncias auxiliares.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de a referida substância auxiliar ser um portador farmaceuticamente aceitável, substância tamponantes, estabilizantes ou suas combinações.
11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 10, caracterizada pelo fato de conter de 1 ng a 1 g do referido ODN.
12. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 10, caracterizada pelo fato de conter de 100 ng a 10 mg do referido ácido oligodeoxinucléico imunoestimulatório (ODN).
13. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 10, caracterizada pelo fato de conter de 1 mg a 10 mg do referido (ODN).
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B25D | Requested change of name of applicant approved |
Owner name: INTERCELL AG (AT) |
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| B25G | Requested change of headquarter approved |
Owner name: INTERCELL AG (AT) |
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| B11E | Dismissal acc. art. 34 of ipl - requirements for examination incomplete | ||
| B11M | Decision cancelled [chapter 11.13 patent gazette] |
Free format text: O PRESENTE PEDIDO TEVE SEU ARQUIVAMENTO NOTIFICADO NA RPI NO 2224, DE 20/08/2013 (DESPACHO 11.5),DE ACORDO COM O ART. 34 DA LPI. NO ENTANTO, O REQUERENTE ATENDEU AOS PRESSUPOSTOS DO ART. 34 DA LPI, TEMPESTIVAMENTE, ATRAVES DA PETICAO NO 018110006234 DE 21/02/2011 (DECLARACAO NEGATIVA). DESTE MODO, ANULO O REFERIDO ARQUIVAMENTO. |
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| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: INTERCELL AUSTRIA AG (AT) |
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Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI |
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| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 11/04/2017, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
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| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/06/2001 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF |
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| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 22A ANUIDADE. |
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Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2725 DE 28-03-2023 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |