KR20030032964A - 면역촉진성 올리고디옥시뉴클레오티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 화학식(Ⅰ)을 보유하는 면역촉진성 올리고디옥시핵산 분자(ODN) 및 이런 ODN을 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다:
화학식 Ⅰ
X는 O 또는 S이다,
여기서, NMP는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시이노신-, 디옥시시토신-, 디옥시우리딘-, 디옥시티미딘-, 2-메틸-디옥시이노신-, 5-메틸-디옥시시토신-, 디옥시슈우도우리딘-, 디옥시리보즈푸린-, 2-아미노-디옥시리보즈푸린-, 6-S-디옥시구아닌-, 2-디메틸-디옥시구아노신- 또는 N-이소펜틸-디옥시아데노신-모노인산염(또는 -모노티오인산염)에서 선택되는 2' 디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이고;
NUC는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시이노신-, 디옥시시토신-, 디옥시우리딘-, 디옥시티미딘-, 2-메틸-디옥시이노신-, 5-메틸-디옥시시토신-, 디옥시슈우도우리딘-, 디옥시리보즈푸린-, 2-아미노-디옥시리보즈푸린-, 6-S-디옥시구아닌-, 2-디메틸-디옥시구아노신- 또는 N-이소펜틸-디옥시아데노신에서 선택되는 2' 디옥시뉴클레오시드이며;
a와 b는 a + b가 4 내지 150이라는 조건하에 1 내지 100의 정수이고;
B와 E는 핵산 분자의 5' 또는 3' 말단에서 공통 작용기이다.
Description
백신은 어떤 다른 약물적 개입보다 더 많은 생명(및 자원)을 구할 수 있다(Nossal, 1998). 세계적인 백신 프로그램으로 인하여 많은 치명적 질환의 발병률이 현저하게 감소하고 있다. 이런 견해는 광범위한 질환, 예를 들면 결핵, 디프테리아, 백일해, 홍역, 파상풍에도 적용되지만, AIDS와 같은 대부분의 바이러스 감염을 비롯한 다수의 감염성 질환에 대한 효과적인 백신은 존재하지 않는다. 말라리아 또는 암을 비롯한 연간 수백만명의 생명을 앗아가는 다른 감염성 또는 비-감염성 질환에 대한 효과적인 백신 역시 존재하지 않고 있다. 이에 더하여, 항생제-저항성 박테리아와 미생물의 급격한 출현은 백신이 논리적으로 선택되는 대안적 치료법을 요구하고 있다. 최종적으로, 백신에 대한 필요성은 심혈관 질환, 암 또는 외상보다는 감염성 질환이 여전히 전세계적으로 사망과 장애의 최대 원인이라는 사실에 의해서도 뒷받침된다(Bloom and Widdus, 1998).
면역학적 관점에서, 현재 백신 분야에서 주요 문제점중 한가지는 전통적인백신(및/또는 이들 제형에 포함되는 면역-조절 화합물)이 높은 수준의 항체를 유도하도록 설계되었다는 점이다(Harrow and Lane, 1988). 하지만, 이들 항체는 바이러스, 세포내 박테리아, 특정 기생충, 암에 의해 유발되는 대부분의 질환을 비롯하여 다양한 질환을 예방하는데 단독으로는 효과적이지 못하다. 이런 질환의 예에는 전술한 HIV 바이러스 또는 말라리아의 경우에 플라스모디움 종(Plasmodiumsp.)을 들 수 있다. 다수의 실험 장치에서 체액 아암(arm)보다는 T 세포를 비롯한 면역계의 세포 아암이 이들 증상에 주요한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 전통적인 백신의 단점을 극복할 수 있는 신규하고 혁신적인 기술이 필요하다. 항원 특이적 T 세포를 비롯한 세포 면역계를 안정적으로 유도하는 기술이 주목받고 있는데, 상기 세포 면역계는 병원균 감염된 세포에서 발현되는 분자를 인식한다. 이상적으로, 백신은 정상세포로부터 병든 및/또는 감염된 세포를 구별하는 T 세포 및 이와 동시에 세포외 구획의 병원균을 인식하는 B 세포에 의해 분비되는 항체 모두를 유도하도록 설계된다.
몇몇 기존 백신은 살아있는 약독화된 미생물로 구성되는데, 이런 경우에 유독성의 야생형 균주로 반전될 위험이 존재한다. 특히, 면역저하된 숙주에서 이는 생명을 위협할 수도 있다. 대안으로, 백신은 병원균-유래된 항원 및 이들 항원에 대한 면역 반응을 유도 또는 강화하는 화합물(이들 화합물은 일반적으로 어쥬번트라고 한다)과의 조합으로 투여되는데, 그 이유는 이들 아단위 백신이 단독으로는 효과적이지 못하기 때문이다.
의심할 여지없이 상기 백신들이 귀중한 치료 방법이긴 하지만, 이들의 복합성으로 인하여, 예방접종된 개체의 세포에 의해 발현되는 분자와 교차-반응성을 보이는 백신에 포함되는 항원에 대한 부작용이 초래될 수 있다. 이에 더하여, 백신 조성물의 정확한 규격 및 면역 도입 기전에 대한 통제 당국, 예를 들면 세계 보건 기구(WHO), 식품의약국(FDA), 이들에 대응하는 유럽 기구의 요구사항은 충족하기 쉽지 않다.
항원 제시 세포는 선천성 면역계(innate immune system)에 속하는데, 이는 미생물에 대한 노출직후에 감염을 제한하는 제 1 숙주 방어선으로 진화하였다(Hoffman et al., 1999). 선천성 면역계 세포는 적응성 면역계(adaptive immune system)에 의해 인식되는 좀더 정교하고 특이적인 구조보다는 오히려 표적에서 발현되는 패턴 또는 상대적으로 비-특이적인 구조를 인식한다(Hoffman et al., 1999). 선천성 면역계 세포의 예는 대식세포, 수상돌기 세포, 과립백혈구(예, 호중구), 고유 살해 세포 등이다. 대조적으로, 적응성 면역계 세포는 T 세포의 경우에 펩티드를 비롯한 특이적인 항원 구조 및 B 세포의 경우에 펩티드와 3차원 구조를 인식한다. 적응성 면역계는 선천성 면역계보다 훨씬 더 특이적이고 정교하며, 임의의 병원균/항원에 반복적으로 노출될 때에 증대된다. 계통발생학적으로, 선천성 면역계는 훨씬 오래되었고 매우 원시적인 생물에서도 발견할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 선천성 면역계는 초기 단계의 항원 노출동안 중요한데, 그 이유는 병원균의 억제이외에 선천성 면역계 세포(즉, APC)가 적응성 면역계 세포를 기폭하고 침입자의 제거로 귀결되는 특이적인 면역 반응을 유인하기 때문이다. 요약하면, 선천성 면역계 세포 및 특히 APC는 a) 원시적인 패턴 인식 시스템으로 감염을 억제하고 b) 적응성 면역계 세포를 기폭하여 침입 병원균 또는 다른 표적의 소거를 결과하는 특이적 면역 반응과 기억을 유도함으로써 초기 단계 면역 반응동안 중요한 역할을 수행한다(Roitt et al., 1998). 이들 기전은 종양 세포를 소거 또는 억제하는 데에도 중요하다.
전술한 바와 같이, 선천성 면역계 세포는 각각의 표적에 발현되는 패턴을 인식한다. 예로는 그램-네거티브 박테리아의 경우에 리포폴리사카라이드(LPS), 미코박테리아 글리코리피드, 그램-파지티브 박테리아의 리포테이코산, 곰팡이의 만난, 바이러스의 이중사슬 RNA을 들 수 있다(Hoffmann et al., 1999). 이에 더하여, 이들은 종양 세포에서 단백질의 변형된 당화와 같은 패턴을 인식할 수도 있다.
최근의 발견 결과는 원생동물 또는 저등 진핵생물의 DNA를 포유동물(및 전체는 아니지만 대부분의 척추동물)의 선천성(또는 일부 경우에 적응성) 면역계에 의해 인식되는 추가적인 패턴으로 규정하였다(Krieg, 1996; Lipford et al., 1998).
면역계는 병원균과 숙주 DNA간 구조와 서열용도의 차이로 박테리아를 비롯한 저등 생물을 인식한다. 특히, 비-척추동물로부터 유래된 또는 특정 염기 환경에 비메틸화된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 보유하는 짧은 합성 ODN 형태의 짧은 DNA 사슬이 표적이 된다(Krieg et al., 1995). CpG 모티프는 박테리아 DNA에서는 예상 빈도로 발견되지만 척추동물 DNA에서는 훨씬 적은 빈도로 발견된다(LipLord et al., 1998; Pisetsky, 1999). 이에 더하여, 비-척추동물(즉, 박테리아) CpG 모티프는 메틸화되지 않고, 반면 척추동물 CpG 서열은 메틸화된다. 박테리아 DNA와 척추동물 DNA간 이런 차이는 척추동물이 비-척추동물 DNA를 위험신호로 인지할 수 있도록 한다.
천연 CpG-보유 DNA, ODN 및 CpG 모티프(CpG-ODN)를 보유하는 삼인산염-치환된(인산염과 삼인산염 잔기의 치환) ODN은 면역 세포 증식과 체액 면역 반응의 강력한 활성물질(Krieg et al., 1995)일 뿐만 아니라 강한 세포내 면역 반응(Lipford et al., 1998)을 촉진한다. 비-메틸화된 CpG 모티프를 보유하는 DNA/ODN은 단핵구 세포(수상돌기 세포, 대식세포)와 B 세포를 직접적으로 활성화시킬 수 있다. 유사하게, 고유 살해(NK) 세포는 직접적으로 활성화되지는 않지만 IFN-생산의 현저한 증가로 단핵구-유래된 IL-12(인터루킨 12)에 반응한다. 결과적으로, CpG DNA에 의한 단핵구와 NK 세포의 유도는 Th1-형 반응의 유도 및 세포독성 T 세포의 발달을 촉진한다. 폴리이노신-폴리시티딜산(폴리 I:C)과 같은 이노신과 시토신에 기초한 리보핵산은 Th1-특이적 면역 반응을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이는 IL-1α와 Il-12와 같은 사이토킨을 생산하는 대식세포를 촉진하는 것으로 알려져 있다(Manetti et al., 1995). 이는 또한, 강력한 1형 인터페론 유도물질(Manetti et al., 1995) 및 강력한 NK 세포 촉진물질(Cavanaugh et al., 1996)로 알려져 있다.
하지만, 이런 효과는 이노신과 시티딘 잔기를 보유하는 리보핵산에 국한되었다(WO98/16247).
본 발명의 연자들에 의한 연구에서, 비-메틸화된 CpG 모티프를 보유하는 ODN은 면역계를 촉진하는데 효과적이긴 하지만, 특히 특이성 및 높은 전신 TNF-α발생과 같은 부작용 유도의 측면에서 필연적인 단점을 보이는 것으로 나타났다. 높은전신 TNF-α발생은 독성 쇼크 증상을 유발하는 것으로 알려져 있는데, 이런 증상은 죽음으로 귀결될 수도 있다.
본 발명은 면역촉진성 올리고디옥시핵산(ODN)과 이런 ODN을 함유하는 제약학적 조성물에 관한다.
도 1은 OVA257-264, 폴리-L-아르기닌(pR 60) 및 디옥시이노신 I-함유 올리고디옥시뉴클레오티드(I-ODN) 또는 CpG 1668을 주사한 이후, 난알부민-유래된 펩티드 OVA257-264에 대한 면역 반응을 도시한다. 생쥐는 표시된 혼합물을 뒷발에 주사하였다. 4일후, 배수 림프절 세포는 OVA257-264로 체외 자극하였다. IFN-g-생산 세포수는 24시간후 ELISPOT 분석으로 측정하였다. 결과는 스팟/1x106림프절 세포로 표시한다.
도 2는 OVA257-264, 폴리-L-아르기닌(pR 60) 및 디옥시이노신 I-함유 올리고디옥시뉴클레오티드(I-ODN) 또는 CpG 1668을 주사한 이후, 전신 TNF-α생산의 유도를 도시한다. 생쥐는 표시된 혼합물을 뒷발에 주사하였다. 주사 1시간후, 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채혈하고 혈청을 준비하였다. 상기 혈청에서 TNF-α의 농도는 ELISA로 측정하였다.
도 3은 OVA257-264, 폴리-L-아르기닌(pR 60) 및 디옥시이노신 I-함유 올리고디옥시뉴클레오티드(I-ODN), CpG 1668 또는 GpC를 주사한 이후, 난알부민-유래된 펩티드 OVA257-264에 대한 면역 반응을 도시한다. 생쥐는 표시된 혼합물을 뒷발에 주사하였다. 4일후, 배수 림프절 세포는 OVA257-264, 무관한 펩티드 mTRP2181-188(뮤린 티로시나제 관련된 단백질-2, VYDFFVWL) 또는 pR 60으로 체외 자극하였다. IFN-g-생산 세포수는 24시간후 ELISPOT 분석으로 측정하였다. 결과는 삼중의 표준 편차된 스팟/1x106림프절 세포로 표시한다.
도 4는 OVA257-264, 폴리-L-아르기닌(pR 60) 및 디옥시이노신 I-함유 올리고디옥시뉴클레오티드(I-ODN), CpG 1668 또는 GpC를 주사한 이후, 전신 TNF-α생산의 유도를 도시한다. 생쥐는 표시된 혼합물을 뒷발에 주사하였다. 주사 1시간후, 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채혈하고 혈청을 준비하였다. 상기 혈청에서 TNF-α와 IL-6의 농도는 ELISA로 측정하였다.
도 5는 TRP-2, 폴리-L-아르기닌(pR 60), CpG 1668, 또는 디옥시이노신을 함유하는 임의의 20-mer 서열을 주사한 이후, 난알부민-유래된 펩티드 OVA257-264에 대한 면역 반응을 도시한다. 생쥐는 표시된 혼합물을 뒷발에 주사하였다. 4일후, 배수 림프절 세포는 TRP-2, 무관한 펩티드 OVA257-264또는 pR 60으로 체외 자극하였다. IFN-g-생산 세포수는 24시간후 ELISPOT 분석으로 측정하였다. 결과는 삼중의 표준 편차된 스팟/1x106림프절 세포로 표시한다.
도 6은 흑색종-유래된 펩티드와 함께 I-ODN과 폴리-L-아르기닌(pR 60)의 통합 주사를 도시한다.
도 7은 흑색종-유래된 펩티드와 함께 I-ODN과 pR 60의 통합주사가 전신 TNF-α와 IL-6의 유도를 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 8은 흑색종-유래된 펩티드와 함께 무작위 10-mer I-ODN과 pR 60의 통합 주사를 도시한다.
도 9는 올리고-dIC26-mer및 PR과 함께 난알부민(OVA)의 통합 투여가 OVA-특이적인 IgG 항체의 생산을 강화시킨다는 것을 도시한다. 생쥐는 표시된 혼합물을 뒷발에 피하 주사하였다. 주사후 24일과 115일 시점에 혈청은 수거하고 OVA-특이적 IgG2a(A)와 IgG1(B) 항체에 대하여 ELISA로 스크리닝한다. 결과는 항체 역가로 표시한다.
따라서, 본 발명의 목적은 CpG 서열에 기초한 ODN에서와 같은 급격한 부작용을 보이지 않는 적절하고 신규한 ODN을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 공지된 ODN을 함유하는 제약학적 조성물의 부작용을 감소시키고 동물, 특히 사람을 비롯한 포유동물의 예방접종에 적합하고 효과적인 면역촉진 특성을 갖는 안전하고 관용적인 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.
이런 목적은 화학식(Ⅰ)을 보유하는 면역촉진성 올리고디옥시핵산 분자(ODN)에 의해 해결된다:
X는 O 또는 S이다,
여기서, NMP는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시이노신-, 디옥시시토신-, 디옥시우리딘-, 디옥시티미딘-, 2-메틸-디옥시이노신-, 5-메틸-디옥시시토신-, 디옥시슈우도우리딘-, 디옥시리보즈푸린-, 2-아미노-디옥시리보즈푸린-, 6-S-디옥시구아닌-, 2-디메틸-디옥시구아노신- 또는 N-이소펜틸-디옥시아데노신-모노인산염(또는 -모노티오인산염)에서 선택되는 2'-디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이고;
NUC는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시이노신-, 디옥시시토신-, 디옥시우리딘-, 디옥시티미딘-, 2-메틸-디옥시이노신-, 5-메틸-디옥시시토신-, 디옥시슈우도우리딘-, 디옥시리보즈푸린-, 2-아미노-디옥시리보즈푸린-, 6-S-디옥시구아닌-, 2-디메틸-디옥시구아노신- 또는 N-이소펜틸-디옥시아데노신에서 선택되는 2'-디옥시뉴클레오시드이며;
a와 b는 a + b가 4 내지 150이라는 조건하에 1 내지 100의 정수이고;
B와 E는 핵산 분자의 5' 또는 3' 말단에서 공통 작용기이다.
놀랍게도, 디옥시이노신 잔기를 보유하는 ODN(I-ODN)은 CpG 모티프를 보유하는 ODN에 필적하는 또는 이를 상회하는 면역 조절 효과를 보인다. 게다가, 본 발명에 따른 ODN은 임의의 항원이나 항원 단편에 대하여 CpG 모티프보다 좀더 특이적인 반응을 유인한다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 ODN은 부작용 유도, 특히 전신 TNF-α또는 IL-6의 유도를 감소시켰다.
RNA 분자를 보유하는 이노신, 예를 들면 폴리-IC 또는 WO98/16247에 언급된 분자에서 일정한 면역촉진 효과가 보고되긴 했지만, 디옥시이노신 잔기를 보유하는 디옥시핵산 분자가 훌륭한 면역촉진 ODN인 것으로 판명되었다.
이에 더하여, 본 발명에 따른 I-ODN은 특이적인 CpG 모티프에 의존하는 ODN과는 대조적으로 특이적인 모티프 또는 CpG 올리고뉴클레오티드(EP0 468 520 A2,WO96/02555, WO98/18810, WO98/37919, WO98/40100, WO98/52581, WO99/51259, WO99/56755)에 대하여 공지된 팰린드롬 서열에 의존하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 I-ODN의 한 작용기는 CI 모티프(및 전술한 참고문헌에서 밝힌 ODN, 여기서 하나 또는 복수의 구아노신 잔기는 본 발명에 따른 ODN의 적절한 구체예에서 밝힌 디옥시이노산 잔기로 대체된다)를 보유할 수 있다. 하지만, 이런 모티프가 본질적인 면역촉진 특성에 반드시 필요한 것은 아닌데, 그 이유는 CI 또는 IC 환경에 이노신이 위치하지 않는 I-ODN 역시 면역조절 특성을 보이기 때문이다.
따라서, 본 발명에 따른 I-ODN은 가급적 단일 사슬 형태로 제공되는 디옥시이노신 잔기를 보유하는 DNA 분자이다.
본 발명에 따른 I-ODN은 재조합 방법으로 분리하거나 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 후자의 경우에, 본 발명에 따른 I-ODN은 표준 화학적 변환으로 합성할 수 있는 변형된 올리고뉴클레오티드, 예를 들면 메틸포스포네이트 또는 다른 인산염 기초한 변형 올리고(가령, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 포스포로디티오레이트를 보유할 수도 있다. 다른 비-인산염 기초한 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수도 있지만(Stirchak et al., MAR 17(1989), 6129-6141), 모노인산염 또는 모노티오인산염이 본 발명에 사용하기 적합한 2'-디옥시뉴클레오티 모노인산염이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 I-ODN의 NMP는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시이노신-, 디옥시시토신-, 디옥시우리딘-, 디옥시티미딘-, 2-메틸-디옥시이노신-, 5-메틸-디옥시시토신-모노인산염 또는 -모노티오인산염(일반적으로,티오인산염 작용기의 인산염은 디옥시리보즈의 5'에 위치한다)에서 선택된다. CPG 모티프에 기초한 ODN에서는 이런 모티프가 필수적으로 비메틸화되어야 하지만, 본 발명에 따른 ODN에서는 그럴 필요가 없는데, 그 이유는 예로써 2-메틸-디옥시이노신 또는 5-메틸-디옥시시토신 잔기가 본 발명에 따른 ODN의 면역조절 특성에 전반적으로 부정적인 효과를 나타내지 않기 때문이다. 대안으로, 2-디옥시-형태의 NMP 대신에 다른 불활성 작용기, 예를 들면 -F, -NH2, -CH3, 특히 -CH3이 리보즈 작용기의 2-위치에 존재할 수도 있다. 물론, -OH와 SH기는 본 발명에 따른 I-ODN이 리보즈, 특히 이노신 NMP에 대한 리보즈 잔기의 2-위치에 존재하는 경우에 배제된다.
본 발명에 따른 ODN의 길이는 선행 기술에 따라 사용되는 표준 ODN의 범위이내가 된다. 따라서, 4미만과 150이상의 전장을 갖는 분자는 점진적으로 감소하는 면역학적 잠재력을 보인다. ODN은 바람직하게는 10 내지 60개, 특히 15 내지 40개의 염기(뉴클레오시드)를 보유하는데, 이는 이들 적절한 구체예에서 화학식 Ⅰ의 a + b가 10 내지 60, 바람직하게는 15 내지 40이 된다는 것을 의미한다.
반면에, 선행 기술에서 면역조절활성을 보유한 것으로 알려진 이노신과 시티딘을 보유하는 리보핵산은 크고 200,000을 훨씬 초과하는 분자량을 갖는 상대적으로 불확정된 폴리핵산[Sigma Chemicals로부터 상업적으로 구매가능한 폴리이노신-폴리시티딜산은 220,000 내지 460,000(적어도 500-1000 C+I 잔기)의 분자량을 갖는다]이다. 본 발명에 따른 분자는 잘 정의된 길이와 조성을 갖는 훨씬 짧은 길이의 DNA 분자로, 산물로 쉽게 재현할 수 있다.
좀더 바람직하게는, 화학식 Ⅰ에 따른 I-ODN의 NMP를 보유하는 디옥시이노신은 1 내지 4개의 황 원자를 갖는 모노티오인산염이고, 추가적인 NMP, 특히 모든 추가적인 NMP 역시 뉴클레오시드 모노티오인산염으로 존재하는데, 그 이유는 이런 ODN이 좀더 높은 뉴클레아제-저항성을 보이기 때문이다[본 발명의 경우에 "모노티오인산염"에서 "모노"는 인산염과 관련한다, 다시 말하면 한 개의 인산염 작용기(한 개의 인 원자)가 각 NMP에 존재한다]. 바람직하게는, 본 발명에 따른 NMP에서 X1과 X2의 적어도 한가지는 S이고 X3과 X4의 적어도 한가지는 O이다. 바람직하게는, X3과 X4는 O이다[X3은 예로써 NMP-리보즈의 인산염 작용기 또는 3'-작용기로부터 유래될 수 있다(NMP의 합성)].
바람직하게는, 본 발명에 따른 ODN은 다음과 같은 서열을 보유한다:
hhh wdi dhh h;
nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn;
nhh wdi din hhh hdi ndi nh;
nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn; 또는
nhh wdi did hhh hdi ddi dh,
여기서, n은 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시시토신- 또는 디옥시티미딘-모노인산염(또는 -모노티오인산염)에서 선택되는 2'-디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이고;
h는 디옥시아데노신-, 디옥시시토신- 또는 디옥시티미딘-모노인산염(또는 -모노티오인산염)에서 선택되는 2'-디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이며;
i는 디옥시이노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이고;
w는 디옥시아데노신- 또는 디옥시티미딘-모노인산염(또는 -모노티오인산염)에서 선택되는 2' 디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이며;
d는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신- 또는 디옥시티미딘-모노인산염(또는 -모노티오인산염)에서 선택되는 2'-디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이다;
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 I-ODN에는 특정 모티프(예, CpG 또는 팰린드롬)가 반드시 필요한 것은 아니다. 하지만, CI 모티프를 보유하는 ODN이 바람직한데, 적절한 구체예에서 화학식 Ⅰ에 따른 ODN은 3'에서 2'-디옥시이노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염에 접하는 적어도 한 개의 2'-디옥시시토신-모노인산염 또는 -모노티오인산염을 보유하고 5'-CI 3'-모티프를 형성한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 ODN은 다음과 같은 하나 또는 복수의 서열을 보유한다.
gacitt;
iacitt;
gaictt;
iaictt.
여기서, a는 디옥시아데노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이고;
g는 디옥시구아노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이며;
i는 디옥시이노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이고;
c는 디옥시시토신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이며;
t는 디옥시티미딘-모노인산염 또는 -모노티오인산염이다.
본 발명에 따른 I-ODN은 특히, 제약 분야, 예를 들면 동물 또는 사람에 대한 약물로 사용하는데 적합하다. 이들은 백신 조성물에서 또는 백신 조성물과 함께 면역조절 약물로서 사용하는데 적합하다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 ODN으로 구성되는 제약학적 조성물에 관한다.
본 발명에 따른 적절한 제약학적 조성물이 백신이기 때문에, 이런 조성물은 본 발명에 따른 ODN이외에 항원을 포함해야 한다. 예방접종된 개인의 보호/면역 반응을 유인하는 항원의 잠재력은 본 발명에 따른 ODN과의 병용에서, 특히 이들의 면역촉진 활성으로 인해 강하게 증가한다.
백신은 전혀 상이한 항원을 함유할 수 있다. 항원의 예는 완전히 죽은 생물, 예를 들면 불활화된 바이러스나 박테리아, 곰팡이, 원생 동물 또는 암세포이다. 항원은 이들 생물/조직 또는 단백질(또는 가장 단순한 형태의 단백질) 소분획물(subfraction)로 구성될 수도 있다. 항원은 당화된 단백질 또는 펩티드 형태로 면역계에 의해 인식될 수 있고 폴리사카라이드 또는 지질 자체이거나 이들을 보유할 수도 있다. 예로써 세포독성 T 세포(CTL)가 주조직접합성 복합체(MHC)와 결합된 일반적으로 짧은 8-11 아미노산 길이의 펩티드를 인식한다는 점에서 짧은 펩티드를 사용할 수 있다(Rammensee et al., Immunogenetics 41, (1995), 178-228). B 세포는 대략 15개 아미노산에서 출발하는 좀더 긴 펩티드를 인식한다(Harrow et al., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)). T 세포 에피토프와는 대조적으로, B 세포 항원의 3차원적 구조 역시 항체에 의한 인식에 중요할 수 있다. 지속적인 항원-특이적 면역 반응을 얻기 위하여, 필요한 면역계의 모든 세포가 포함되는 면역 캐스케이드를 유인하는 데에는 어쥬번트가 효과적이다. 기본적으로, 어쥬번트는 항원 제시 세포(APC)에 작용한다. 이들 세포는 먼저 항원과 직면하고, 이후 가공된 또는 변형된 항원을 면역 주효체에 제시한다. 중간단계 세포형이 참여할 수도 있다. 적절한 특이성을 갖는 주효체 세포만이 생산적 면역 반응에서 활성화된다. 어쥬번트는 또한 항원과 동시-주입된 다른 인자를 국소적으로 보유할 수도 있다. 이에 더하여, 어쥬번트는 다른 면역세포에 대한 유인물질로 작용하거나 또는 면역계에 대한 촉진물질로서 국소적으로 및/또는 전신적으로 작용할 수도 있다.
적절한 구체예에 따라, T 세포 에피토프를 항원으로 사용한다. 대안으로, T 세포 에피토프와 B 세포 에피토프의 조합을 사용한다.
본 발명의 조성물에 사용되는 항원은 엄격하지 않다. 또한, 상이한 항원의 혼합물을 본 발명에서 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는, 바이러스나 박테리아 병원균, 곰팡이 또는 기생충으로부터 유래된 단백질이나 펩티드를 이런 항원(파생된 항원, 당화되거나 지질화된 항원, 폴리사카라이드 또는 지질 포함)으로 사용한다. 다른 바람직한 항원 공급원은 종양 항원이다. 바람직한 병원균은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), A와 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 엡스테인 바르 바이러스(EBV), 인플루엔자 바이러스, 로타바이러스, 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클라미이다 뉴우모니아스(Chlamydia pneumonias), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 스트렙토코커스 뉴모니아스(Streptococcus pneumonias), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 말라리아 종(Plasmodium sp.)(예, 열대열 말라리아, 삼임열 말라리아 등), 아스페르길루스 종(Aspergillus sp.) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에서 선택된다. 항원은 암세포에 의해 발현되는 분자(종양 항원)일 수도 있다. 유도 과정에는 병원균/암 세포로부터 특정 단백질의 정제, 병원균의 불활화 및 이런 단백질의 단백분해적ㆍ화학적 유도 또는 안정화가 포함된다. 동일한 방식으로, 종양 항원(암 백신) 또는 자가면역 항원 역시 본 발명에 따른 제약학적 조성물에 사용할 수 있다. 이런 조성물로 종양 예방접종 또는 자가면역 질환에 대한 치료를 실시할 수 있다.
펩티드 항원의 경우에, 펩티드 미미토프(mimitope)/작용제/초작용제/길항제, 면역학적 특성에 영향을 주지 않는 특정 위치에서 변화된 펩티드 또는 비-펩티드 미미토프/작용제/초작용제/길항제(Sparbier and Walden, 1999)가 본 발명에 사용된다. 펩티드 항원은 또한, 다가양이온성 화합물 또는 면역조절 화합물과의 상호작용을 용이하게 하기 위하여 카르복시 말단 또는 아미노 말단에 신장(elongation)을 보유한다. 자가면역 질환의 치료에 펩티드 항원을 활용할 수 있다.
항원은 또한, 항원 제시를 강화하고 항원이 항원 제시 세포로 향하도록 하는 분자를 포함하도록 유도할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 제약학적 조성물은 자가면역 질환에 관여하는 단백질이나 단백질 단편 및 펩티드에 대한 내성을 제공하는 역할을 한다. 상기 구체예에 사용된 항원은 면역 관용을 유도하거나 또는 자가면역 과정에 관여하는 에피토프에 대한 면역 반응을 하향-조절하는 역할을 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백신 형태의 제약학적 조성물은 다가양이온성 중합체, 적절하게는 다가양이온성 펩티드, 특히 폴리아르기닌, 폴리리신 또는 항균성 펩티드를 추가로 함유한다.
본 발명에 사용되는 다가양이온성 중합체는 WO93/30721에 따라 특징적인 효과를 보이는 임의의 다가양이온성 중합체일 수 있다. 바람직한 다가양이온성 화합물은 기본 폴리펩티드, 유기 다가양이온, 기본 폴리아미노산 또는 이들의 혼합물에서 선택된다. 이들 폴리아미노산은 적어도 4개의 아미노산 잔기의 사슬 길이를 가져야 한다(Glodman et al, 1983). 특히, 폴리리신, 폴리아르기닌 및 8이상, 적절하게는 20개이상의 아미노산 잔기 범위에서 20%이상, 적절하게는 50%이상의 기본 아미노산을 보유하는 폴리펩티드와 같은 펩티드 결합을 보유하는 물질 또는 이들의 혼합물이 바람직하다. 다른 바람직한 다가양이온과 이들의 제약학적 조성물은 WO97/30721(예, 폴리에틸렌이민)과 WO99/38528에 기술되어 있다. 바람직하게는, 이들 조성물은 20 내지 500개 아미노산 잔기, 적절하게는 30 내지 200개 잔기를 보유한다.
이들 다가양이온성 화합물은 화학적으로 혹은 재조합으로 생산하거나, 또는 천연 공급원으로 유도할 수 있다.
양이온성(폴리) 펩티드는 또한 특성이 검증된 다가양이온성 항생-항균성 펩티드일 수도 있다(Ganz and Lehrer, 1999; Hancock, 1999). 이들 (폴리)펩티드는 원핵 생물, 동물 또는 식물로부터 기원하거나, 또는 화학적으로 혹은 재조합으로 생산할 수 있다(Andreu and Rivas, 1998; Ganz and Lehrer, 1990; Simmaco et al., 1998). 펩티드는 디펜신(defensin) 군에 속할 수도 있다(Ganz, 1999; Ganz and Lehrer, 1999). 이런 펩티드의 서열은 예로써 다음의 인터넷 주소 아래의 항균 서열 데이터에서 찾을 수 있다: http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag1.html
이런 숙주 방어 펩티드 또는 방어물질 역시 본 발명에 적합한 다가양이온 중합체이다. 일반적으로, 최종 산물로서 APC(수상돌기 세포 포함)에 의해 매개되는 적응성 면역계의 활성화(또는 하향-조절)를 가능하게 하는 화합물이 다가양이온성 중합체로 사용된다.
카텔리시딘 유도된 항균펩티드 또는 이들의 유도체(A 1416/2000), 특히 포유동물 카텔리시딘, 적절하게는 사람, 소 또는 생쥐로부터 유래된 항균 펩티드; 또는 신경 활성 화합물, 예를 들면 (사람) 성장 호르몬이 본 발명에서 다가양이온 물질로서 사용되는데 적합하다.
천연 공급원으로부터 유래된 다가양이온성 화합물에는 HIV-REV 또는 HIV-TAT [유도된 양이온성 펩티드, 안테나페디아(antennapedia) 펩티드, 키토산 또는 키틴의 다른 유도체] 또는 생화학적 혹은 재조합적 생산으로 이들 펩티드나 단백질로부터 유래된 다른 펩티드가 포함된다. 다른 바람직한 다가양이온성 화합물은 카텔린 또는 카텔린과 관련되거나 이로부터 유래된 물질이다. 가령, 생쥐 카텔린은 아미노산 서열 NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH을 보유하는 펩티드이다. 관련되거나 유래된 카텔린 물질은 적어도 15-20개 아미노산 잔기를 보유하는 카텔린 서열의 전체 또는 일부를 포함한다. 유도에는 고유 아미노산의 20개 표준 아미노산을 제외한 다른 아미노산의 치환 또는 변경이 포함될 수 있다. 게다가, 추가적인 양이온성 잔기가 이런 카텔린 분자에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 이들 카텔린 분자는 항원 및 본 발명에 따른 면역학적 ODN과 결합시킨다. 하지만, 이들 카텔린 분자는 추가적인 어쥬번트의 첨가없이 항원에 대한 어쥬번트로서 효과적인 것으로 확인되었다. 따라서, 추가적인 면역활성 물질과 함께 또는 이런 면역활성 물질없이 백신 제형에 효과적인 어쥬번트로 이런 카텔린을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 사용되는 다른 적절한 다가양이온 물질은 3 내지 7개의 소수성 아미노산의 링커에 의해 분리되는 적어도 2개의 KLK-모티프를 보유하는 합성 펩티드이다(A 1789/2000).
본 발명에 따른 제약학적 조성물의 면역조절 효과가 각 단일 성분의 개별적인 첨가로부터 기대되는 효과 또는 항원과 함께 ODN 또는 다가양이온의 첨가로부터 기대되는 효과보다 훨씬 현저하다는 것은 놀라운 사실이다.
화학식 I에서 B와 E는 핵산 분자의 5' 및/또는 3' 말단에 대한 공통 작용기이다. 이런 작용기에 대한 예는 당업자에게 자명하다(참조: "Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach"(1991), ed. Eckstein, Oxford University Press). 바람직하게는, 본 발명에 따른 I-ODN에서 B 및/또는 E는 -H, -CH3, -COH, -COCH3, -OH, -CHO, 인산염, 삼인산염, 황산염이나 티오황산염 작용기, 또는 특히 C1-C6의 알킬 길이 및/또는 말단 아미노기(상기 아미노기는 본 발명에 따른 I-ODN의 추가적인 라벨링에 사용할 수 있다, 예: -PO4-(CH2)n-NH2또는 -PO4-(CH2)n-NH2-라벨)를 보유하는 포스포알킬 작용기에서 독립적으로 선택된다. B로는 뉴클레오티시드, 적절하게는 전술한 2'디옥시뉴클레오티드(즉, 인산염 또는 삼인산염 작용기가 없슴)가 특히 바람직하다. 대안으로, 이들 작용기는 다른 분자, 특히 담체 분자 또는 라벨에 대한 링커 작용기를 포함할 수 있다. 고체 표면, 입자 또는 라벨에 결합되는 형태의 ODN에서, 이들 표면, 입자, 라벨 역시 B 및/또는 E 작용기의 일부가 된다.
화학식 I에 따른 분자의 임의 이온화된(염) 형태 또는 호변이성(tautomeric) 형태 역시 이런 화학식 I에 포함된다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물은 활성 성분(제약학적 활성 물질), 특히 백신에 이용가능한 물질을 추가로 함유할 수 있다. 이런 추가적인 활성 성분의 바람직한 예는 사이토킨, 항염증성 물질, 항균 물질 또는 이들의 조합이다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물은 또한, 부형제, 특히 제약학적으로 수용가능한 담체, 완충제, 안정제 또는 이들의 조합을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물에서 성분의 상대적 함량은 개별 항원의 필요성 및 이런 조성물이 투여되는 동물/사람에 상당히 의존한다. 따라서, 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 1 pg 내지 10g, 바람직하게는 1 ng 내지 1g, 좀더 바람직하게는 100 ng 내지 10 ㎎, 가장 바람직하게는 10 ㎎ 내지 1 ㎎이다. 항원과 다가양이온은 유사한 용량으로 투여할 수 있는데, 1회 예방접종당 1 내지 10,000 ㎎ 항원과 0.1 내지 1,000 ㎎ 다가양이온이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 환자, 특히 예방접종 후보에게 예로써 1주, 2주 또는 1개월 간격으로 효과량을 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물로 치료받는 환자는 반복적으로 또는 1회만 접종할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 용도는 특히, 특정 항원에 대한 보호가 없는 사람 또는 동물의 활성 예방접종이다.
본 발명에 따른 조성물의 투여 경로는 중요하지는 않지만, 예로써 피하, 근육내, 피내 또는 경피 주사 및 경구 섭취가 적합하다.
또한, 예로써 항원/다가양이온 조성물과 면역촉진 물질을 분리 주사함으로써 본 발명의 조성물을 별개로 투여하는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명은 항원과 다가양이온 중합체를 함유하는 조성물을 제 1 성분으로 하고 면역 촉진이나 화학적 유도 물질을 함유하는 조성물을 제 2 성분으로 하여 구성되는 키트에 관한다.
상기 성분은 동일 부위 또는 동일 시점에 투여할 수 있다, 하지만 상이한 부위 또는 상이한 시점이나 상이한 기간동안 투여하는 것도 가능하다. 또한, 조성물이나 성분의 전신 또는 국소 투여를 각각 변화시키는 것도 가능하다.
본 발명의 세부적인 내용은 다음의 실시예 및 첨부된 도면으로 상술하지만,이들은 본 발명을 제한하지 않는다.
모든 실시예에서, 삼인산염-치환된 ODN(삼인산염 잔기가 인산염을 대체, 이후 "삼인산염 치환된 올리고디옥시뉴클레오티드")을 사용하였는데, 그 이유는 이런 ODN이 더 높은 뉴클레아제-저항성을 보이기 때문이다(Ballas et al., 1996; Krieg et al., 1995; Parronchi et al., 1999).
실시예 1
상이한 I-ODN과 폴리-L-아르기닌(pR 60)의 통합 주사는 난알부민-유래된 펩티드에 대한 면역 반응을 상승적으로 강화시킨다.
생쥐C57BI/6(Harlan/Olac)
펩티드 OVA257-264-펩티드(SIINFEKL), 닭 난알부민의 1군
MHC(H-2kb)-제한된 에피토프(Rotzschke et al.,
1991)는 표준 고형상 F-moc 화학적 합성으로
합성하고, HPLC 정제하고, 질량 분광법으로
순도를 분석하였다.
용량: 300 ㎎/생쥐
폴리-L-아르기닌(pR 60)평균적으로 60개 아르기닌 잔기의 중합도를
갖는 폴리-L-아르기닌; Sigma Chemicals
용량: 100 ㎎/생쥐
CpG-ODN 1668CpG 모티프를 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc atg acg ttc ctg atg ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
I-ODN 1디옥시이노신을 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc ati aci ttc ctg atg ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
I-ODN 2디옥시이노신을 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc atg aci ttc ctg atg ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
I-ODN 3디옥시이노신을 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc ati aci ttc cti ati ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
실험군(군당 5마리)
1. OVA257-264
2. OVA257-264+ pR 60
3. OVA257-264+ CpG 1668
4. OVA257-264+ I-ODN 1
5. OVA257-264+ I-ODN 2
6. OVA257-264+ I-ODN 3
7. OVA257-264+ CpG 1668 + pR 60
8. OVA257-264+ I-ODN 1 + pR 60
9. OVA257-264+ I-ODN 2 + pR 60
10. OVA257-264+ I-ODN 3 + pR 60
0일에 생쥐는 전술한 화합물을 함유하는 100 ㎖ 전체 부피(개별 발(footpad)마다 50 ㎖)를 각 뒷발에 주사한다. 동물은 주사후 4일째 죽이고, 슬와(popliteal) 림프절을 수거한다. 림프절은 70 ㎜ 셀 여과기에 통과시키고, 5% 우태아혈청(FCS, Sigma Chemicals)을 함유하는 DMEM 배지(GIBCO BRL)로 2회 세척한다. 세포는 DMEM /5%/FCS에서 3x106세포/㎖로 조정한다. IFN-g ELISPOT 분석은 전술한 바와 같이 삼중으로 실시한다(Miyahira et al., 1995). 상기 방법은 항원-특이적 T 세포를 정량하는데 광범위하게 사용되는 과정이다. 림프구는 중간 기본-대조군, OVA257-264-펩티드 또는 콘카나발린 A(Con A)로 체외 자극한다. 단일 IFN-g 생산 T 세포를 나타내는 스팟은 계수하고, 기본 스팟 수는 모든 시료에서 감한다. Con A로 자극한 이후 탐지되는 많은 숫자의 스팟은 사용된 림프구의 건전한 상태를 시사한다. 각 생쥐 실험군에서, 1x106세포당 스팟 수는 도 1에 도해한다.
주사 1시간후, 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채혈하고 혈청을 준비하고, 상기 혈청에서 ELISA로 전신 TNF-α의 유도를 측정한다(도 2).
실시예 2
디옥시-이노신에 의한 구아노신의 치환은 특히 폴리-L-아르기닌(pR 60)과 결합되 는 경우에 비-면역원성 GpC-서열을 고도 면역원성 GpC-서열로 전환시킨다.
생쥐C57BI/6(Harlan/Olac)
펩티드 OVA257-264-펩티드(SIINFEKL), 닭 난알부민의 1군
MHC(H-2kb)-제한된 에피토프(Rotzschke et al.,
1991)는 표준 고형상 F-moc 화학적 합성으로
합성하고, HPLC 정제하고, 질량 분광법으로
순도를 분석하였다.
용량: 300 ㎍/생쥐
폴리-L-아르기닌 60(pR 60)평균적으로 60개 아르기닌 잔기의 중합도를
갖는 폴리-L-아르기닌; Sigma Chemicals
용량: 100 ㎍/생쥐
CpG-ODN 1668CpG 모티프를 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc atg acg ttc ctg atg ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
CpG-ODN 비-면역원성 CpG 모티프를 보유하는 티오인
산염 치환된 ODN: tcc atg agc ttc ctg atg ct는
NAPS GmbH, Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
I-ODN 9디옥시이노신을 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc atg aic ttc ctg atg ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
I-ODN 10디옥시이노신을 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc ati aic ttc cti ati ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
실험군(군당 5마리)
1. OVA257-264
2. OVA257-264+ pR 60
3. OVA257-264+ CpG 1668
4. OVA257-264+ CpG
5. OVA257-264+ I-ODN 9
6. OVA257-264+ I-ODN 10
7. OVA257-264+ CpG 1668 + pR 60
8. OVA257-264+ CpG + pR 60
9. OVA257-264+ I-ODN 9 + pR 60
10. OVA257-264+ I-ODN 10 + pR 60
0일에 생쥐는 전술한 화합물을 함유하는 100 ㎕ 전체 부피(개별 발(footpad)마다 50 ㎕)를 각 뒷발에 주사한다. 동물은 주사후 4일째 죽이고, 슬와 림프절을 수거한다. 림프절은 70 ㎛ 셀 여과기에 통과시키고, 5% 우태아혈청(FCS, Sigma Chemicals)을 함유하는 DMEM 배지(GIBCO BRL)로 2회 세척한다. 세포는 DMEM /5%/FCS에서 3x106세포/㎖로 조정한다. IFN-g ELISPOT 분석은 전술한 바와 같이 삼중으로 실시한다(Miyahira et al., 1995). 상기 방법은 항원-특이적 T 세포를정량하는데 광범위하게 사용되는 과정이다. 림프구는 중간 기본-대조군, OVA257-264-펩티드, 무관한 펩티드 mTRP-2181-188(뮤린 티로시나제 관련된 단백질-2, VYDFFVWL), pR 60, 콘카나발린 A(Con A)로 체외 자극한다. 단일 IFN-g 생산 T 세포를 나타내는 스팟은 계수하고, 기본 스팟 수는 모든 시료에서 감한다. Con A로 자극한 이후 탐지되는 많은 숫자의 스팟은 사용된 림프구의 건전한 상태를 시사한다. 각 생쥐 실험군에서, 1x106세포당 스팟 수는 도 3에 도해하고, 체외-자극된 삼중의 표준 편차를 제시한다.
주사 1시간후, 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채혈하고 혈청을 준비하고, 상기 혈청에서 사이토킨-특이적 ELISA로 전신 TNF-α와 IL-6의 유도를 측정한다(도 4).
실시예 3
디옥시이노신을 보유하는 임의의 20-mer 서열과 흑색종-유래된 펩티드의 통합 주사는 상기 펩티드에 대한 강한 면역 반응을 유도하고, 이는 폴리-L-아르기닌(pR 60)의 보조-투여에 의해 더욱 강화될 수 있다.
생쥐C57BI/6(Harlan/Olac)
펩티드 TRP-2-펩티드(VYDFFVWL), 생쥐 티로시나제
관련된 단백질-2의 Ⅰ군 MHC(H-2kb)-제한된
에피토프(Bllom et al., 1997)는 표준 고형상
F-moc 화학적 합성으로 합성하고, HPLC
정제하고, 질량 분광법으로 순도를 분석하였다. 용량: 300 ㎍/생쥐
폴리-L-아르기닌 60(pR 60)평균적으로 60개 아르기닌 잔기의 중합도를
갖는 폴리-L-아르기닌; Sigma Chemicals
용량: 100 ㎍/생쥐
CpG-ODN 1668CpG 모티프를 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc atg acg ttc ctg atg ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
wdi 삼인산염 치환된 ODN: nhh hhh wdi nhh hhh hhh
wn은 NAPS GmbH, Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
wdidin삼인산염 치환된 ODN: nhh hhh wdi nhh hhh hhh
wn은 NAPS GmbH, Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
wdid 삼인산염 치환된 ODN: nhh hhh wdi dhh hhh hhh
wn은 NAPS GmbH, Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
wdidid 삼인산염 치환된 ODN: nhh wdi did hhh hdi ddi
dh는 NAPS GmbH, Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
실험군(군당 5마리)
1. TRP-2
2. TRP-2+ pR 60
3. TRP-2+ CpG 1668
4. TRP-2+ wdi
5. TRP-2+ wdidin
6. TRP-2+ wdid
7. TRP-2+ wdidid
8. TRP-2+ CpG 1668 + pR 60
9. TRP-2+ wdi + pR 60
10. TRP-2+ wdidin + pR 60
11. TRP-2 + wdid + pR 60
12. TRP-2 + wdidid + pR 60
0일에 생쥐는 전술한 화합물을 함유하는 100 ㎕ 전체 부피(개별 발(footpad)마다 50 ㎕)를 각 뒷발에 주사한다. 동물은 주사후 4일째 죽이고, 슬와 림프절을 수거한다. 림프절은 70 ㎛ 셀 여과기에 통과시키고, 5% 우태아혈청(FCS, SigmaChemicals)을 함유하는 DMEM 배지(GIBCO BRL)로 2회 세척한다. 세포는 DMEM /5%/FCS에서 3x106세포/㎖로 조정한다. IFN-g ELISPOT 분석은 전술한 바와 같이 삼중으로 실시한다(Miyahira et al., 1995). 상기 방법은 항원-특이적 T 세포를 정량하는데 광범위하게 사용되는 과정이다. 림프구는 중간 기본-대조군, TRP-2-펩티드, 무관한 OVA257-264-펩티드, pR 60, 콘카나발린 A(Con A)로 체외 자극한다. 단일 IFN-g 생산 T 세포를 나타내는 스팟은 계수하고, 기본 스팟 수는 모든 시료에서 감한다. Con A로 자극한 이후 탐지되는 많은 숫자의 스팟은 사용된 림프구의 건전한 상태를 시사한다. 각 생쥐 실험군에서, 1x106세포당 스팟 수는 도 5에 도해하고, 체외-자극된 삼중의 표준 편차를 제시한다.
실시예 4
상이한 I-ODN과 폴리-L-아르기닌(pR 60)의 통합 주사는 흑색종-유래된 펩티드에 대한 면역 반응을 상승적으로 강화시킨다.
실험군(군당 5마리)
1. TRP-2181-188
2. TRP-2181-188+ pR 60
3. TRP-2181-188+ CpG 1668
4. TRP-2181-188+ I-ODN 2
5. TRP-2181-188+ CpG 1668 + pR 60
6. TRP-2181-188+ I-ODN 2 + pR 60
0일에 생쥐는 전술한 화합물을 함유하는 100 ㎕ 전체 부피(개별 발(footpad)마다 50 ㎕)를 각 뒷발에 주사한다. 동물은 주사후 4일째 죽이고, 슬와 림프절을 수거한다. 림프절은 70 ㎛ 셀 여과기에 통과시키고, 5% 우태아혈청(FCS, Sigma Chemicals)을 함유하는 DMEM 배지(GIBCO BRL)로 2회 세척한다. 세포는 DMEM /5%/FCS에서 3x106세포/㎖로 조정한다. IFN-g ELISPOT 분석은 전술한 바와 같이 삼중으로 실시한다(Miyahira et al., 1995). 상기 방법은 항원-특이적 T 세포를 정량하는데 광범위하게 사용되는 과정이다. 림프구는 중간 기본-대조군, TRP-2181-188-펩티드, 무관한 OVA257-264-펩티드, 콘카나발린 A(Con A)로 체외 자극한다. 단일 IFN-생산 T 세포를 나타내는 스팟은 계수하고, 기본 스팟 수는 모든 시료에서 감한다. Con A로 자극한 이후 탐지되는 많은 숫자의 스팟은 사용된 림프구의 건전한 상태를 시사한다. 각 생쥐 실험군에서, 1x106세포당 스팟 수는 도 6에 도해하고, 체외-자극된 삼중의 표준 편차를 제시한다.
주사 1시간후, 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채혈하고 혈청을 준비하고, 상기 혈청에서 특이적인 ELISA로 전신 TNF-α와 IL-6의 유도를 측정한다(도 7).
실시예 5
임의의 10-mer I-ODN과 폴리-L-아르기닌(pR 60)의 통합 주사는 흑색종-유래된 펩티드에 대한 면역 반응을 상승적으로 강화시킨다.
실험군(군당 5마리)
1. TRP-2181-188
2. TRP-2181-188+ pR 60
3. TRP-2181-188+ CpG 1668
4. TRP-2181-188+ ODN 17
5. TRP-2181-188+ CpG 1668 + pR 60
6. TRP-2181-188+ ODN 17 + pR 60
0일에 생쥐는 전술한 화합물을 함유하는 100 ㎕ 전체 부피(개별 발(footpad)마다 50 ㎕)를 각 뒷발에 주사한다. 동물은 주사후 4일째 죽이고, 슬와 림프절을 수거한다. 림프절은 70 ㎛ 셀 여과기에 통과시키고, 5% 우태아혈청(FCS, Sigma Chemicals)을 함유하는 DMEM 배지(GIBCO BRL)로 2회 세척한다. 세포는 DMEM /5%/FCS에서 3x106세포/㎖로 조정한다. IFN-g ELISPOT 분석은 전술한 바와 같이 삼중으로 실시한다(Miyahira et al., 1995). 상기 방법은 항원-특이적 T 세포를 정량하는데 광범위하게 사용되는 과정이다. 림프구는 중간 기본-대조군, TRP-2181-188-펩티드, 무관한 OVA257-264-펩티드, 콘카나발린 A(Con A)로 체외 자극한다. 단일 IFN-생산 T 세포를 나타내는 스팟은 계수하고, 기본 스팟 수는 모든 시료에서 감한다. Con A로 자극한 이후 탐지되는 많은 숫자의 스팟은 사용된 림프구의 건전한 상태를 시사한다. 각 생쥐 실험군에서, 1x106세포당 스팟 수는 도 8에 도해하고, 체외-자극된 삼중의 표준 편차를 제시한다.
생쥐C57BI/6(Harlan/Olac)
펩티드 TRP-2-펩티드(VYDFFVWL), 생쥐 티로시나제
관련된 단백질-2의 Ⅰ군 MHC(H-2kb)-제한된
에피토프(Bllom et al., 1997)는 표준 고형상
F-moc 화학적 합성으로 합성하고, HPLC
정제하고, 질량 분광법으로 순도를 분석하였다.
용량: 100 ㎍/생쥐
폴리-L-아르기닌 60(pR 60)평균적으로 60개 아르기닌 잔기의 중합도를
갖는 폴리-L-아르기닌; Sigma Chemicals
용량: 100 ㎍/생쥐
CpG-ODN 1668CpG 모티프를 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc atg acg ttc ctg atg ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
ODN 17디옥시이노신을 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: hhh wdi dhh h는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
(h=CAT, w=AT, d=GAT)
용량: 10 nmol/생쥐
생쥐C57BI/6(Harlan/Olac)
펩티드 TRP-2-펩티드(VYDFFVWL), 생쥐 티로시나제
관련된 단백질-2의 Ⅰ군 MHC(H-2kb)-제한된
에피토프(Bllom et al., 1997)는 표준 고형상
F-moc 화학적 합성으로 합성하고, HPLC
정제하고, 질량 분광법으로 순도를 분석하였다.
용량: 100 ㎍/생쥐
폴리-L-아르기닌 60(pR 60)평균적으로 60개 아르기닌 잔기의 중합도를
갖는 폴리-L-아르기닌; Sigma Chemicals
용량: 100 ㎍/생쥐
CpG-ODN 1668CpG 모티프를 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc atg acg ttc ctg atg ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
I-ODN 2디옥시이노신을 보유하는 티오인산염 치환된
ODN: tcc atg aci ttc ctg atg ct는 NAPS GmbH,
Gottingen으로 합성하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
실시예 6
올리고-디옥시IC
26-mer
과 폴리-L-아르기닌(pR)의 통합 주사는 난알부민(OVA)-특이적 체액 반응을 강화시킨다.
생쥐C57BI/6(Harlan/Olac)
난알부민(OVA)계란으로부터 유래된 난알부민, V 등급, Sigma
Chemicals, A-5503, Lot 54H7070
용량: 50 ㎍/생쥐
폴리-L-아르기닌(pR)평균적으로 60개 아르기닌 잔기의 중합도를
갖는 폴리-L-아르기닌; Sigma Chemicals,
P-4664, Lot 68H5903
용량: 100 ㎍/생쥐
올리고-디옥시 IC, 26-mer올리고-dIC26-mer는 4 μmol 스케일로 표준
(올리고-dIC26-mer)포스포아마이드 화학법으로 합성하고 HPLC
(NAPS Gottingen, Germany)로 정제하였다.
용량: 5 nmol/생쥐
실험군(군당 54리)
1. OVA + 올리고-dIC26-mer+ pR
2. OVA + 올리고-dIC26-mer
3. OVA + pR
4. OVA
0일에 생쥐는 전술한 화합물을 함유하는 100 ㎕ 전체 부피(개별 발(footpad)마다 50 ㎕)를 각 뒷발에 주사한다. 주사후 24일째, 혈청은 수거하고 ELISA로 OVA-특이적 항체의 존재를 스크리닝한다. 이들 결과는 올리고-dIC 및 pR과 병용된 OVA의 주사가 개별 물질 단독과 병용된 OVA의 주사와 비교하여 OVA-특이적 IgG 항체의 생산을 강화시킨다는 것을 보여준다(도 13A, B). 흥미롭게도, IgG2a와 IgG1의 역가가 올리고-dIC/pR과 병용된 OVA의 단일 주사 직후에 증가하였는데, 이는 Th1과 Th2 세포 모두가 관여한다는 것을 의미한다. 하지만, 115일후에는 OVA 및 올리고-dIC/pR로 주사된 생쥐의 혈청에서 증가된 IgG2a 수준만 관찰되었다.
이들 데이터는 올리고-dIC 및 pR과 OVA의 통합 주사가 OVA-특이적 체액 반응을 강화시킨다는 것을 입증한다. 이런 반응은 초기 단계에서 Th1-과 Th2-유도된 항체 이소타입의 산출 및 이후 주로 Th1-유도된 항체로 특징지어진다.
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Claims (17)
- 다음의 화학식(Ⅰ)을 보유하는 면역촉진성 올리고디옥시핵산 분자(ODN):화학식 ⅠX는 O 또는 S이다,여기서, NMP는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시이노신-, 디옥시시토신-, 디옥시우리딘-, 디옥시티미딘-, 2-메틸-디옥시이노신-, 5-메틸-디옥시시토신-, 디옥시슈우도우리딘-, 디옥시리보즈푸린-, 2-아미노-디옥시리보즈푸린-, 6-S-디옥시구아닌-, 2-디메틸-디옥시구아노신-, 또는 N-이소펜틸-디옥시아데노신-모노인산염 혹은 -모노티오인산염에서 선택되는 2' 디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이고;NUC는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시이노신-, 디옥시시토신-, 디옥시우리딘-, 디옥시티미딘-, 2-메틸-디옥시이노신-, 5-메틸-디옥시시토신-, 디옥시슈우도우리딘-, 디옥시리보즈푸린-, 2-아미노-디옥시리보즈푸린-, 6-S-디옥시구아닌-, 2-디메틸-디옥시구아노신- 또는 N-이소펜틸-디옥시아데노신에서 선택되는2' 디옥시뉴클레오시드이며;a와 b는 a + b가 4 내지 150이라는 조건하에 1 내지 100의 정수이고;B와 E는 핵산 분자의 5' 또는 3' 말단에서 공통 작용기이다.
- 제 1 항에 있어서, NMP는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시이노신-, 디옥시시토신-, 디옥시우리딘-, 디옥시티미딘-, 2-메틸-디옥시이노신-, 5-메틸-디옥시시토신-모노인산염 또는 -모노티오인산염에서 선택되는 것을 특징으로 하는 ODN.
- 제 1 항 또는 2 항에 있어서, a + b는 10 내지 60, 바람직하게는 15 내지 40인 것을 특징으로 하는 ODN.
- 제 1 항 내지 3 항중 어느 한 항에 있어서, X1과 X2의 적어도 한가지는 S이고 X3과 X4의 적어도 한가지는 O이며, NMP는 뉴클레오시드-모노티오인산염인 것을 특징으로 하는 ODN.
- 제 1 항 내지 4 항중 어느 한 항에 있어서, 다음과 같은 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 ODN:hhh wdi dhh h;nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn;nhh wdi din hhh hdi ndi nh;nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn; 또는nhh wdi did hhh hdi ddi dh,여기서, n은 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 디옥시시토신-, 또는 디옥시티미딘-모노인산염 혹은 -모노티오인산염에서 선택되는 2'-디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이고;h는 디옥시아데노신-, 디옥시시토신-, 또는 디옥시티미딘-모노인산염 혹은 -모노티오인산염에서 선택되는 2'-디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이며;i는 디옥시이노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이고;w는 디옥시아데노신-, 또는 디옥시티미딘-모노인산염 혹은 -모노티오인산염에서 선택되는 2'-디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이며;d는 디옥시아데노신-, 디옥시구아노신-, 또는 디옥시티미딘-모노인산염 혹은 -모노티오인산염에서 선택되는 2'-디옥시뉴클레오시드 모노인산염 또는 모노티오인산염이다.
- 제 1 항 내지 5 항중 어느 한 항에 있어서, 3'에서 2'-디옥시이노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염에 접하는 적어도 한 개의 2'-디옥시시토신-모노인산염 또는 -모노티오인산염을 보유하는 것을 특징으로 하는 ODN.
- 제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 있어서, 다음의 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 ODN:gacitt;iacitt;gaictt;iaictt.여기서, a는 디옥시아데노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이고;g는 디옥시구아노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이며;i는 디옥시이노신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이고;c는 디옥시시토신-모노인산염 또는 -모노티오인산염이며;t는 디옥시티미딘-모노인산염 또는 -모노티오인산염이다.
- 제 1 항 내지 7 항중 어느 한 항에 있어서, 다음의 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 ODN:wdi;wdidin;wdid;wdidid,여기서, w, d, I, n은 상기 정의한 바와 동일하다.
- 제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 있어서, B와 E는 -H, -CH3, -COH, -COCH3, -OH, -CHO, -PO4, -PSO3, -PS2O2, PS3O, -PS4, -SO3, -PO4-(CH2)1-6-NH2또는 -PO4-(CH2)1-6-NH2-라벨에서 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 ODN.
- 약물, 특히 면역조절 약물로 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 ODN의 용도.
- 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 ODN으로 구성되는 제약학적 조성물.
- 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물:- 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 ODN;- 항원.
- 제 11 항 또는 12 항에 따른 제약학적 조성물에서, 다가양이온 중합체, 바람직하게는 다가양이온 펩티드, 특히 폴리아르기닌, 폴리리신 또는 항균 펩티드, 특히 카텔린-유래된 항균 펩티드; 또는 신경 활성 화합물, 특히 사람 성장 호르몬을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 11 항 내지 13 항중 어느 한 항에 따른 제약학적 조성물에서, 활성 성분, 특히 사이토킨, 항염증성 물질, 항균 물질 또는 이들의 조합을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 11 항 내지 14 항중 어느 한 항에 따른 제약학적 조성물에서, 부형제, 특히 제약학적으로 수용가능한 담체, 완충제, 안정제 또는 이들의 조합을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 제 11 항 내지 15 항중 어느 한 항에 따른 제약학적 조성물에서, 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 하나 또는 복수의 ODN을 바람직하게는 1 ng 내지 1g, 좀더 바람직하게는 100 ng 내지 10 ㎎, 가장 바람직하게는 10 ㎎ 내지 1 ㎎ 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
- 백신 제조에 사용되는 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 ODN의 용도.
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