NO319016B1 - Akariogen sukkererstatning og framgangsmate for framstilling av samme - Google Patents
Akariogen sukkererstatning og framgangsmate for framstilling av samme Download PDFInfo
- Publication number
- NO319016B1 NO319016B1 NO19950194A NO950194A NO319016B1 NO 319016 B1 NO319016 B1 NO 319016B1 NO 19950194 A NO19950194 A NO 19950194A NO 950194 A NO950194 A NO 950194A NO 319016 B1 NO319016 B1 NO 319016B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- sequence
- protein
- amino acid
- dna
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 235000021092 sugar substitutes Nutrition 0.000 title description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 title description 2
- 108010047540 sucrose isomerase Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 23
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 230000001013 cariogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 114
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 74
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 67
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 58
- PVXPPJIGRGXGCY-DJHAAKORSA-N 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-alpha-D-fructofuranose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](O)(CO)O1 PVXPPJIGRGXGCY-DJHAAKORSA-N 0.000 claims description 52
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 36
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 32
- 241001622809 Serratia plymuthica Species 0.000 claims description 32
- SVBWNHOBPFJIRU-UHFFFAOYSA-N 1-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-fructose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1(O)C(O)C(O)C(O)CO1 SVBWNHOBPFJIRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- NMXLJRHBJVMYPD-IPFGBZKGSA-N trehalulose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(O)CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMXLJRHBJVMYPD-IPFGBZKGSA-N 0.000 claims description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 20
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 20
- 108010025855 palatinase Proteins 0.000 claims description 18
- 241000556426 Erwinia rhapontici Species 0.000 claims description 17
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 2
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001573 invertase Substances 0.000 claims description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims 5
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 claims 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 abstract description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 34
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 34
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 34
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 25
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 20
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 12
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 12
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 12
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000586779 Protaminobacter Species 0.000 description 6
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 5
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVXPPJIGRGXGCY-TZLCEDOOSA-N 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-fructofuranose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)C(O)(CO)O1 PVXPPJIGRGXGCY-TZLCEDOOSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 2
- 241000083686 [Pseudomonas] mesoacidophila Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 2
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 2
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 2
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 2
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 2
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- DVWJFTGEISXVSH-CWVFEVJCSA-N (1R,3S,5S,7Z,11R,12S,13Z,15Z,17Z,19Z,21R,23S,24R,25S)-21-[(2R,3S,4S,5S,6R)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-12-ethyl-1,3,5,25-tetrahydroxy-11-methyl-9-oxo-10,27-dioxabicyclo[21.3.1]heptacosa-7,13,15,17,19-pentaene-24-carboxylic acid Chemical compound CC[C@H]1\C=C/C=C\C=C/C=C\[C@@H](C[C@@H]2O[C@@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)C[C@@H](O)C[C@@H](O)C\C=C/C(=O)O[C@@H]1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](N)[C@@H]1O DVWJFTGEISXVSH-CWVFEVJCSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- -1 E.coli Chemical compound 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000005385 Intramolecular Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010031311 Intramolecular Transferases Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001640 fractional crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000021579 juice concentrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003445 sucroses Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229930183279 tetramycin Natural products 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår en forbedret framgangsmåte for framstilling av ikke-kariogent sukker, særlig trehalulose og/eller palatinose, ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi.
Bakgrunn
De ikke-kariogene sukker-erstatningsstoffene palatinose (isomaltulose) og trehalulose framstilles i storskala fra sakkarose ved en enzymatisk omlagring ved anvendelse av immobiliserte bakterie-celler (f.eks. artene Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici, Serratia plymuthica). På denne måten blir den al —* p2 glykosidiske binding mellom begge monosakkaridenhetene av disakkaridet sakkarose isomerisert til en al —> 6 binding ved palatinose hhv. en al —>al binding ved trehalulose. Denne omdanning av sakkarose til begge ikke-kariogene disakkaridene forløper ved katalyse med det bakterielle enzymets sakkarose-isomerase, også kalt sakkarose-mutase. Alt etter organismene som anvendes framskaffes en produktblanding fra denne reaksjonen, som ved siden av de søkte akariogene disakkaridene palatinose og trehalulose også inneholder visse andeler av uønskete monosakkarider (glukose og/eller fruktose). Disse monosakkarid-andelene er et vesentlig teknisk problem, da det kreves kostbare renseprosedyrer (som regel fraksjonerte krystallisasjoner) for å skille disse. ;Formål ;Et formål med oppfinnelsen er følgelig å undertrykke dannelsen av monosakkarider ved isomerisering av sakkarose til trehalulose og/eller palatinose i størst mulig grad. Et annet formål med oppfinnelsen er å framskaffe organismer, som framskaffer palatinose og/eller trehalulose i høyere utbytte enn kjente organismer. ;Oppfinnelsen ;Disse formål oppnås med rekombinante DNA-molekyler, organismer transformert med rekombinante DNA-molekyler, rekombinante proteiner såvel som en forbedret framgangsmåte for framstilling av akariogent sukker, særlig palatinose og/eller trehalulose, som angitt i patentkravene. ;I en utførelse er oppfinnelsen relatert til en DNA-sekvens, som er kjenneteknet ved at den koder for et protein med en sakkarose-isomerase-aktivitet, og omfatter (a) nukleotidsekvenser ifølge sekvens nr. 1, 2, 3, 9, 11 eller 13, eventuelt uten det signalpeptid-kodende område, (b) en nukleotidsekvens ifølge sekvensene under (a) innen rammen av degraderingen av den genetiske koden, eller ;(c) en med sekvensen ifølge (a) og/eller (b) hybridiserende nukleotidsekvens. ;I forbindelse med oppfinnelsen omfatter begrepet "protein med en sakkarose-isomerase-aktivitet" slike proteiner som muliggjør isomerisering av sakkarose til andre disakkarider, hvorved al —* P2 glykosidbinding mellom glukose og fruktose i sakkarose blir overført i en andre glykosidisk binding mellom to monosakkarid-enheter, særlig en al —► 6 binding og/eller en al —» al binding. Det er særlig foretrukket at begrepet "protein med en sakkarose-isomerase-aktivitet" omfatter et protein med evne til å isomerisere sakkarose til palatinose og/eller trehalulose. Dermed utgjør andelen av palatinose og trehalulose, som dannes ved isomerisering av sakkarose, fortrinnsvis >2%, helst >20%, og aller helst >50%, av alle disakkarider.
Nukleotidsekvensen illustrert ved sekvens nr. 1 koder for det fullstendige sakkarose-isomerase av mikroorganismen Protaminobacter rubrum (CBS 547,77) inklusive signalpeptidområdet. Nukleotidsekvensen illustrert ved sekvens nr. 2 koder for det N-terminale avsnitt av sakkarose-isomerase av mikroorganismen Erwinia rhapontici (NCPPB 1578) inkludert signalpeptidområdet. Nukleotidsekvensen illustrert ved sekvensnr. 3 koder for et avsnitt av sakkarose-isomerase av mikroorganismen SZ 62 (Enterobacter spee).
Området av sekvens nr. 1 som koder for signalpeptidet strekker seg fra nukleotid 1-99.1 sekvens nr. 2 er det signalpeptid-kodende området fra nukleotid 1 til 108. DNA-sekvensen ifølge
oppfinnelsen omfatter også nukleotidsekvensene vist i sekvensene nr. 1 og 2 uten det signalpeptid-kodende området, da signalpeptidet som regel kun er nødvendig for den korrekte lokalisering av det 'modne<9> proteinet i et bestemt celleområde (for eksempel i det periplasmatiske rom mellom den ytre og indre membran, i den ytre membran eller i den indre membran) eller for den ekstracellulære eksport, ikke bare for den enzymatiske aktivitet som sådan. Den foreliggende oppfinnelsen omfatter videre det 'modne' protein (uten signalpeptid) kodende sekvenser i operativ forbindelse med heterologe signalsekvenser, særlig med prokaryotiske signalsekvenser, hovedsakelig slik som beskrevet av E.L. Winnacker i "Gene und Klone, Eine Einfiihrung in die Gentechnologie", VCH-Verlagsgesellschaft, Weinheim, DE (1985), på side 256.
Nukleotidsekvensen nr. 9 koder for en variant av isomerase fra protaminobacter rubrum. Nukleotidsekvens nr. 11 koder for det fullstendige isomerase av isolat SZ 62. Nukleotidsekvens nr. 13 koder for stordelen av isomerase av mikroorganismen MX-45 (FERM 11808 hhv. FERM BP 3619).
Ved siden av nukleotidsekvensene vist i sekvens nr. 1,2, 3, 9, 11 eller 13 og nukleotidsekvenser tilsvarende av en av disse sekvensene innenfor rammen av degeneringen av den genetiske koden, omfatter den foreliggende oppfinnelsen også ytterligere en DNA-sekvens, som hybridiserer med en av disse sekvensene, forutsatt at den koder for et protein som kan isomerisere sakkarose. Begrepet "hybridisering" brukt i denne sammenheng anvendes i henhold til Sambrook m.fl (Molecular Press
[1989], 1.101-1.104). I henhold til den foreliggende oppfinnelsen er det snakk om en hybridisering når det observeres nok et positivt hybridiseringssignal etter vasking i 1 time med I x SSC og 0.1% SDS ved 55°C, fortrinnsvis ved 62°C og aller helst ved 68°C, særlig i 1 time i 0.2 x SSC og 0.1% SDS ved 55°C, fortrinnsvis ved 62°C og aller helst ved 68°C. En nukleotidsekvens som under en slik vaskebetingelse hybridiserer med en nukleotidsekvens vist i sekvens nr. 1 eller 2 eller med en tilsvarende nukleotidsekvens innenfor rammen av degenerering av den genetiske koden, omfattes av oppfinnelsen.
Fortrinnsvis omfatter DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen
(a) en nukleotidsekvens vist i sekvens nr. 1, 2,3,9,11 eller 13, eventuelt uten det signalpeptid-kodende området, eller
(b) en nukleotidsekvens med minst 70% identitet med en av sekvensene i (a).
Fortrinnsvis oppviser DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen også en nukleotidsekvens med minst 80% identitet med det konserverte delområdet av nukleotidsekvensene i sekvens nr. 1, 2, 3, 9, 11 eller 13. Disse konserverte delområdene er særlig nukleotid 139-186, 256-312, 328-360,379^420 og/ eller 424-444 i sekvens nr. 1.
I en svært foretrukket utførelsesform oppviser DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen en nukleotidsekvens med minst 80% identitet, særlig minst 90% identitet med delområdene
(a) nukleotid 139-155 og/eller
(b) nukleotid 625-644
av nukleotidsekvensen vist i sekvens nr. 1.
Oligonukleotider, som er avledet av sekvensområdene foran, har vist seg å kunne tjene som primer for PCR-amplifisering av isomerase-fragmenter av det genomiske DNA hos et flertall testete mikroorganismer, f.eks. Protaminobacter rubrum (CBS 547, 77), Erwinia rapontici (NCPPB 1578), Isolat SZ 62 og Pseudomonas mesoacidophilia MX-45 (FERM 11808).
Til dette formål er følgende oligonukleotider spesielt foretrukket, eventuelt anvendt i form blandinger, hvorved basene som er angitt i parentes er valgfrie:
01igonukleotidI(17nt):
5'-TGGTGGAA(A,G)GA(G,A)GCTGT-3'
Oligonukleotid II (20 nt):
5,-TCCCAGTTCAG(G,A)TCCGGCTG-3,
Oligonukleotid I er avledet fra nukleotidene 139-155 fra sekvens nr. 1 og oligonukleotid II er avledet fra sekvens nr. 1 komplementer med nukleotid 625-644. Forskjellene mellom de delområdene av DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen med identitet og sekvensene betegnet som oligonukleotid I og II er fortrinnsvis hver maksimalt 2 nukleotider og særlig foretrukket hver maksimalt 1 nukleotid.
I en annen spesielt foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen oppviser DNA-sekvensen en nukleotidsekvens med minst 80% identitet, særlig minst 90% identitet med delområdene av
(c) nukleotid 995-1013 og/eller
(d) nukleotid 1078-1094
i sekvens nr. 1.
Oligonukleotider, som er avledet av sekvensområdene angitt foran, hybridiserer med sakkarose-isomerasegener fra organismene Protaminobacter rubrum og Erwinia rhapontici. Det er særlig foretrukket å anvende følgende oligonukleotider, eventuelt i form av blandinger, hvorved basene angitt i parentes er valgfrie:
Oligonukleotid III er avledet fra nukleotidene 995-1013 fra sekvens nr. 1, og oligonukleotid IV er avledet fra nukleotidene 1078-1094 i sekvens nr. 1. Forskjellene mellom delområdene av DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen med identitet og sekvensene betegnet som oligonukleotid III og IV er fortrinnsvis hver maksimalt 2 nukleotider og aller helst hver maksimalt 1 nukleotid.
Nukleotidsekvenser ifølge oppfinnelsen framskaffes særlig fra mikroorganismene fra slektene Protaminobacter, Erwinia, Serratia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium og Klebsiella. Spesifikke eksempler på slike mikroorganismer er Protaminobacter rubrum (CBS 547,77), Erwinia rhapontici (NCPPB 1578), Serratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285), Leuconstoo mesenteroides NRRL B-521f (ATCC 1083a), Pseudomonas mesoacidophila MX-45 (FERM 11808 hhv. FERM BP 3619) Agrobacterium radiobacter MX-232 (FERM 12397 hhv. FERM BP 3620), Klebsiella-underarter og Enterobacter-arter. Nukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen kan på enkel måte isoleres og karakteriseres fra slektene av de aktuelle mikro organismer ved for eksempel å anvende nukleotidene fra ett eller flere av de konserverte områdene av sekvensnr. 1, 2, 3, 9, 11 og 13 med standard forsterknings- og/eller hybridiserings-teknikker. Fortrinnsvis blir nukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen utvunnet ved en PCR-amplifisering av det genomiske DNA hos de aktuelle organismer ved anvendelse av oligonukleotid I og II. På denne måten oppnås et delfragment av de aktuelle sakkarose-isomerase-genene, som videre kan anvendes som hybridiseringsprobe for isolering av de komplette gener fra et genbibliotek av de aktuelle mikroorganismer. Alternativt kan nukleotidsekvensene utvinnes ved framstilling av et genbibliotek fra hver av de aktuelle organismene og direkte screening av dette genbiblioteket med oligonukleotidene I, II, III og/eller IV.
I et annet henseende angår oppfinnelsen en vektor, som inneholder minst en kopi av DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen. Denne vektoren kan være en vilkårlig prokaryotisk eller eukaryotisk vektor, som oppviser en DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis under regulering av et ekspreksjonssignal (promotor, operator, enhancer osv.). Eksempler på prokaryotiske vektorer er kromosomale vektorer slik som Bakteriofager (f.eks. Bacteriofag X) og extrakromosomale vektorer slik som plasmider, hvorved sirkulære plasmidvektorer er særlig foretrukket. Egnete prokaryotiske vektorer er beskrevet av f.eks. Sambrook m.fl nevnt foran, jft. kapittel
1-4.
Et særlig foretrukket eksempel på en vektor ifølge oppfinnelsen er plasmidet pHWS 88, som bærer et sakkarose-isomerase-gen fra Protaminobacter rubrum under regulering av den regulerbare tac-promotoren. Plasmidet pHWS 88 ble deponert den 16/12-1993 i den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSM), Mascheroder Weg lb, DE-38124 Branunschweig med deponeringsnr. DSM 8824 i henhold til Budapest-konvensjonen.
I nok en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er vektoren ifølge oppfinnelsen et plasmid, som foreligger i vertscellen med et kopiantall på mindre enn 10, helst med et kopiantall på 1 til 2, per vertscelle. Eksempler på slike vektorer er på den ene siden kromosomale vektorer, slik som Bacteriofag X eller F-plasmid. Framstillingen av F-plasmider, som inneholder sakkarose-isomerase-genene, kan eksempelvis framskaffes ved transformering av en F-plasmid-holdig E.coli-stamme med et sakkarose-isomerase-holdig transposon og påfølgende seleksjon av rekombinante celler, i hvilke transposonet er integrert i F-pIasmidet. Et eksempel på et slikt rekombinant transposon er plasmidet pHWS 118, som inneholder transposon Tn 1721 Tet og framstilt ved kloning av et av de sakkarose-isomerase-gen-holdige DNA-fragmenter fra det ovennevnte plasmid pHWS 88 i transposon pJOE 103 (DSM 8825).
På den andre siden kan vektoren ifølge oppfinnelsen også være en eukaryotisk vektor, for eksempel en gjærvektor (f.eks. Yip, Yep osv.) eller en vektor egnet for høyerestående celler (f.eks en plasmidvektor, viral vektor, plantevektor). Slike vektorer bør være tilgjengelige for fagmannen innen området molekylærbiologi, og disse er derfor ikke beskrevet nærmere her. En kan i denne sammenheng spesielt vise til Sambrook m.fl nevnt foran, jfr. kapittel 16.
I et annet henseende er oppfinnelsen relatert til en celle som er transformert med en DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen. I én utførelsesform er denne cellen en prokaroytisk celle, fortrinnsvis en gram-negativ prokaryotisk celle, særlig en Enterobakterie-celle. Derved kan en på den ene side anvende en celle som ikke inneholder noe aigent sakkarose-isomerase-gen, slik som E.coli, og på den andre siden kan det anvendes celler som allerede inneholder et slikt gen i deres kromosom, for eksempel mikroorganismene nevnt foran som kilder for sakkarose-isomerase-gen. Foretrukne eksempler på egnete prokaryotiske celler er E.coli-, Protaminobacter rubrum- eller Erwinia rhapontici-celler. Transformasjon av prokaryotiske celler med exogene nukleinsyresekvenser bør være tilgjengelig for fagmannen innen molekylærbiologi (se f.eks. Sambrook et al., nevnt foran, kapittel 1-4).
I nok en utførelsesform av oppfinnelsen kan cellen ifølge oppfinnelsen imidlertid også være en eukaryotisk celle, slik som en soppcelle (f.eks. gjær), en animalsk eller vegetabilsk celle. Framgangsmåte for transformering hhv. transfeksjon av eukaryotiske celler med exogene nukleinsyresekvenser bør være tilgjengelig for fagmannen innen området molekylærbiologi og krever derfor ingen nærmere beskrivelse her (se for eksempel Sambrook et al, kap. 16).
Oppfinnelsen angår også et protein med en sakkarose-isomerase-aktivitet slik som definert foran, som er kodet fra en DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen. Dette proteinet omfatter fortrinnsvis (a) en egnet aminosyresekvens fra sekvens nr. 4, 5, 6, 10, 12 eller 14, eventuelt uten signalpeptidområdet, eller (b) en aminosyresekvens med minst 80% identitet med sekvensen ifølge (a).
Aminosyresekvensen vist i sekvens nr. 4 omfatter det fullstendige sakkarose-isomerase fra Protamonibacter rubrum. Signalpeptidet strekker seg fra aminosyre 1 til 33. Det 'modne' proteinet begynner med aminosyre 34. Aminosyresekvensen vist i sekvens nr. 5 omfatter det N-terminale avsnitt av sakkarose-isomerase fra Erwinia rhapontici. Signalpeptidet strekker seg fra aminosyre 1 til 36. Det 'modne' proteinet begynner med aminosyre 37. Aminosyresekvensen vist i sekvens nr. 6 omfatter et avsnitt av sakkarose-isomerase fra mikroorganismen SZ 62.1 figur 1 er det vist en sammenlikning mellom aminosyrekvensene av isomerasene fra P. Rubrum,E. Rhapontici og SZ 62.
Aminosyresekvensen sekvens nr. 10 omfatter en variant av isomerase fra P.rubrum. Aminosyre-sekvensen med sekvens nr. 12 omfatter det fullstendige isomerase fra SZ 62. Dette enzymet har en høy aktivitet ved 37°C og produserer kun en svært liten andel av monosakkarider. Aminosyre-sekvensen med sekvens nr. 14 omfatter en vesentlig del av isomerase fra MX-45. Dette enzymet produserer omlag 85% trehalulose og 13% palatinose.
Det er særlig foretrukket at proteinet ifølge oppfinnelsen oppviser en aminosyresekvens med minst 90% identitet med konserverte delområdet av aminosyresekvensene vist i sekvens nr. 4, 5, 6, 10, 12 eller 14, særlig i delområdene av
(a) aminosyre 51 -149,
(b) aminosyre 168-181,
(c) aminosyre 199-250,
(d) aminosyre 351-387 og/eller
(e) aminosyre 390-420
av aminosyrene vist i sekvens nr. 4.
Ved hjelp av de ovennevnte DNA-sekvenser, vektorer, transformerte celler og proteiner er det på enkel måte mulig å framskaffe en sakkarose-isomerase-aktivitet uten forstyrrende enzymatisk bi-aktivitet.
Hertil kan en på den ene siden framskaffe sakkarose-isomerase med hjelp av rekombinant DNA-teknologi som bestanddel av et ekstrakt fra vertsorganismen eller i isolert og renset form (for eksempel ved ekspresjon i E.coli). Dette fortrinnsvis rensete og isolerte sakkarose-isomerase-enzym kan anvendes f.eks. i immobilisert form til teknisk framstilling av akariogent sukker, slik som trehalulose og/eller palatinose ved omsetning av sakkarose i en enzymreaktor. Immobiliseringen av enzymer bør være tilgjengelig for fagmannen og er derfor ikke beskrevet nærmere her.
På den andre siden kan framstilling av akariogent sukker fra sakkarose også skje i en fullstendig mikroorganisme, fortrinnsvis i immobilisert form. Ved kloning av de ovenenvnte sakkarose-isomerase-gener i en organisme med eller uten redusert palatinose- og/eller trehalulose-metabolisme (dvs. i en organisme som ikke er i stand til å utføre signifikant oppbygning av de ovennevnte sukkere), kan en oppnå en ny organisme som ved innføring av exogent DNA er i stand til å framstille akariogene disakkarider uten nevneverdig dannelse av monosakkarider. For innføring av sakkarose-isomerase kan en på den ene siden anvende en organisme som ikke kan utnytte palatinose og/eller trehalulose (f.eks. E.coli, Bacillus, gjær) og på den andre siden en organisme som i prinsippet var i stand til å utnytte palatinose og/eller trehalulose, men som ved tilfeldig eller selektert mutasjon oppviser et redusert palatinose- og/eller trehalulose-metabolisme.
Begrepet "redusert palatinose- og/eller trehalulose-metabolisme" viser i denne sammenheng til en celle av den aktuelle organisme som ved utnyttelse av sakkarose oppnår akariogene disakkarider som C-kilde, som kun i begrenset omfang kan utnyttes metabolsk, f.eks. siden de bygges opp som monosakkarider. Fortrinnsvis oppnår organismen mindre enn 2.5%, helst mindre enn 2% og aller helst mindre enn 1% glukose pluss fruktose på basis av summen av akariogene disakkarider og monosakkarid-bygge-produkter ved en temperatur på 15-65°C, særlig 25-55°C.
I et annet henseende er oppfinnelsen relatert til en celle, som inneholder minst en kodende DNA-sekvens for et protein med sakkarose-isomerase-aktivitet og et redusert palatinose- og/eller trehalulose-metabolisme som definert foran. En slik celle oppnår større andeler av de ikke-kariogene disakkarider trehalulose og/eller palatinose og reduserte mengder av de forstyrrende biproduktene glukose eller fruktose.
I nok en uførelsesform av oppfinnelsen kan reduksjonen av palatinose- og/eller trehalulose-metabolisme skje ved delvis eller fullstendig inhibering av ekspresjonen av invertase- og/eller palatinase-gener, som er ansvarlig for den intracellulære oppbygging av palatinose og/eller trehalulose. Denne inhiberingen av gen-ekspresjon kan for eksempel skje ved målrettet mutasjon og/eller fjerning av de aktuelle gener. En målrettet mutasjon av palatinase-genene i sekvens nr. 7 eller palatinose-hydrolase-genene i sekvens nr. 15 kan for eksempel skje ved innføring av en vektor egnet for kromosomal rekombinasjon, som bærer et mutert palatinase-gen, og seleksjon av organismer hvor en slik rekombinasjon har funnet sted. Prinsippet ved seleksjon gjennom genetisk rekombinasjon er beskrevet av E.L. Winnacker, Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (1985), VCH-Verlagsgesellschaft Weinheim, Tyskland, side 320.
Videre kan organismene ifølge oppfinnelsen med redusert palatinose- og/eller trehalulose-metabolisme også oppnås med uspesifikk mutasjon av egnete utgangsorganismer og seleksjon av palatinase-defekt-mutanter. Et eksempel på en slik palatinse-defekt-mutant er Proaminobacter rubrum-stamme SZZ 13, som ble deponert den 29/3-1994 hos den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSM), Mascheroder Weg lb, DE-38124 Braunschweig, med nr. DSM 9121 i henhold til Budapest-konvensjonen. Denne mikroorganismen ble framstilt ved uspesifikk mutasjon av naturlige P.rubrum-type celler med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin og utmerket seg ved at den ikke kan spalte de akariogene sukrene trehalulose og palatinose til glukose og fruktose. Utvelgelsen av slike mutanter kan utføres med f.eks. MacConkey-palatinase-medier eller minimal-salt-medier med palatinose eller glukose som eneste C-kilde. Mutantene, som vokser i MacConkey-palatinose-mediet (MacConkey-Agar-Base fra Difoo Laboratories, Detroit, Michigan, USA (40 g/l) og 20 g/l palatinose) eller fra minimal-salt-medier med glukose som eneste C-kilde, men ikke fra tilsvarende medier med palatinose som eneste C-kilde, identifiseres som palatinase-defekt-mutanter.
Foreliggende oppfinnelse angår dessuten en framgangsmåte for å isolere nukleinsyresekvenser, som koder for et protein med sakkarose-isomerase-aktivitet, hvorved et genbibliotek fra en donor organisme, som inneholder en DNA-sekvens som koder for et protein med sakkarose-isomerase-aktivitet, settes inn i en egnet vertsorganisme, klonene i genbiblioteket undersøkes og de klonene som inneholder en nukleinsyre som koder for et protein med sakkarose-isomerase-aktivitet isoleres. Nukleinsyrene som koder for sakkarose-isomerase-aktivitet og som er isolert på denne måten kan igjen anvendes til innføring i celler som beskrevet foran, til framstilling av nye produsent-organ ismer som framskaffer akariogent sukker.
Med denne framgangsmåten velges som vertsorganisme fortrinnsvis en organisme som ikke har noen egne funksjonelle gener for palattnose-metabolisme, særlig slike som ikke har noen funksjonelle palatinase- og/eller invertase-gen. En foretrukket vertsorganisme er E.coli. For å lette karakteriseringen av palatinose-produserende kloner kan en, ved undersøkelse av klonene i genbiblioteket, sakkarose-spaltende kloner og de deri inneholdende DNA-sekvensene som stammer fra donororganismen isoleres og transformeres i en E.coli-stamme som ikke utnytter galaktose, som anvendes som screening-stamme for klonene i genbiblioteket.
På den andre siden kan undersøkelsen av klonene i genbiblioteket mht. DNA-sekvensene, som koder for et protein med en sakkarose-isomerase-aktivitet, også skje ved anvendelse av nukleinsyreprober, avledet fra sekvens nr. 1, 2, 3, 9, II eller 13, som koder for sakkarose-isomerase-genet fra Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici og isolatet SZ 62. Det er særlig foretrukket å anvende et DNA-fragment utvunnet som primer ved PCR-reaksjon med oligonukleotidene I og II hhv. oligonukleotid III og/eller IV, som probe.
Oppfinnelsen angår også en framgangsmåte for framstilling av akariogent sukker, særlig trehalulose og/eller palatinose, som er kjeneteknet ved at en til framstilling av sukker anvender
(a) et protein med sakkarose-isomerase-aktivitet i isolert form,
(b) en organisme, som koder for et protein med sakkarose-isomerase-aktivitet, eller en som er transformert med minst en kopi av denne DNA-sekvens-holdige vektor, (c) en organsisme, som inneholder minst en DNA-sekvens som koder for et protein med en sakkarose-isomerase-aktivitet og et redusert palatinose-og/eller trehalulose-metabolisme, og/eller (d) et ekstrakt fra en slik celle hhv. en slik organisme.
Utføringen av framgangsmåten følger generelt ved at en bringer proteinet, organismen hhv. ekstraktet i kontakt med et egnet medium med sakkarose under slike betingelser at de i det minste delvis utfører en omdanning av sakkarose til akariogene disakkarider med hjelp av sakkarose-isomerase. Til slut blir de akariogene disakkaridene utvunnet fra mediet eller organismen og renset på kjent måte.
I en foretrukket utførelsesform av denne framgangsmåten blir organismen, proteinet eller ekstraktet anvendt i immobilisert form. Immobiliseringen av proteinet (i ren form eller i ekstrakt) skjer fortrinnsvis ved kopling av reaktive sidegrupper (f.eks. NH2-grupper) på en egnet bærer. Immobiliseringen av celler skjer for eksempel i en natriumalginat/kalsiumalginat-løsning. Et over-blikk over egnete framgangsmåter for immobilisering av celler og proteiner er gitt av f.eks. I. Chibata (Immobilized Enzymes, John Wiley and Sons, NY, London 1978).
Ved å anvende en celle transformert med sakkarose-isomerase-genet kan produksjonshastigheten av akariogent sukker økes sammenliknet med kjente organismer ved å øke antall genkopier i cellen og/eller ved å øke ekspresjons-hastigheten ved en kombinasjon med sterke promotorer. Videre kan en ved å transformere en celle, som i utgangspunktet ikke, eller bare i begrenset omfang, kan realisere akariogent sukker, med sakkarose-isomerase-genet oppnå en transformert celle med hvilken akariogent sukker, særlig palatinose og/eller trehalulose kan utvinnes, med lite eller ingen biprodukter.
Ved å anvende en mikroorganisme med redusert palatinose- og/eller trehalulose-metabolisme, som allerede inneholder et funksjonelt sakkarose-isomerase-gen, er transformasjon med et exogent sakkarose-isomerase-gen ikke vesentlig, men kan gjennomføres for å bedre utbytte.
Oppfinnelsen angår dessuten nok en DNA-sekvens, som koder for et protein med palatinase-hhv. palatinose-hydrolase-aktivitet og omfatter:
(a) en nukleotidsekvens ifølge sekvens nr. 7 eller 15,
(b) en nukleotidsekvens tilsvarende sekvensene under under (a) innenfor rammen av degenereringen av den genetiske koden, eller
(c) en nukleotidsekvens som hybridiserer med sekvensene i (a) og/eller (b).
Oppfinnelsen er også relatert til en vektor, som inneholder minst en kopi av de ovennevnte DNA-sekvensene og en celle, som er transformert med en DNA-sekvens eller en vektor som nevnt foran. Likeså er oppfinnelsen relatert til et protein med palatinse-aktivitet, som er kodet fra en DNA-sekvens, som angitt foran, og som fortrinnsvis oppviser en av aminosyresekvensene illustrert i sekvens nr. 8 eller 16.
Palatinase vist i sekvens nr. 8 fra P.rubrum skiller seg fra kjente sakkarose-spaltende enzymer ved at det spalter sakkarose-isomere som ikke spaltes av kjente enzymer, særlig palatinose.
Aminosekvensen vist i sekvens nr. 16 omfatter et palatinase-hydrolase fra MX-45, som spalter palatinose ved dannelse av fruktose og glukose. Genet som koder for dette enzymet er illustrert i sekvens nr. 15 og er lokalisert i genomen av MX-45 på 5'-siden av isomerasegenet vist i sekvens nr. 13.
Oppfinnelsen er i det etterfølgende beskrevet ved hjelp av de følgende sekvensprotokoller og figurer, der
sekvens nr. I viser nukleotidsekvensen for genet som koder for sakkarose-isomerase fra Protaminobacter rubrum; sekvensen som koder for signalpeptidet ender ved nukleotid nr. 99,
sekvens nr. 2 viser det N-terminale avsnitt av nukleotidsekvensen for det sakkarose-isomerase-kodende gen fra Erwinia rhapontici; sekvensen som koder for signalpeptidet ender ved nukleotid nr. 108,
sekvens nr. 3 viser et avsnitt av nukleotidsekvensen for de sakkarose-isomerase-kodende gen fra isolat SZ 62,
sekvens nr. 4 viser aminosyresekvensen for sakkarose-isomerase fra Protaminobacter rubrum,
sekvens nr. 5 viser det N-terminale avsnitt av aminosyresekvensen for sakkarose-isomerase fra Erwinia rhapontici,
sekvens nr. 6 viser et avsnitt av aminosyresekvensen for sakkarose-isomerase fra isolat SZ 62, sekvens nr. 7 viser nukleotidsekvensen for palatinase-gen fra Protaminobacter rubrum,
sekvens nr. 8 viser aminosyresekvensen for palatinase fraProtaminobacter rubrum,
sekvens nr. 9 viser nukleotidsekvensen for en variant av sakkarose-isomerase-genet fra P.rubrum,
sekvens nr. 10 viser den tilsvarende aminosyresekvens,
sekvens nr. 11 viser en fullstendig nukleotidsekvens av sakkarose-isomerase-genet fra SZ 62, sekvens nr. 12 viser den tilsvarende aminosyresekvens,
sekvens nr. 13 viser den vesentlige del av sakkarose-isomerase-genet fra Pseudomonas mesoacidophila (MX-45),
sekvens nr. 14 viser den tilsvarende aminosyresekvens,
sekvens nr. 15 viser palatinose-hydrolase-genet fra Pseudomonas mesoacidophilia (MX-45), sekvens nr. 16 viser den tilsvarende aminosyresekvens,
figur 1 viser en sammenlikning av aminosyresekvensene mellom sakkarose-isomerasene fra Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici og isolatet SZ 62,
figur 2 er et kloningsskjema for framstilling av det rekombinante plasmid pHWS 118, som inneholder sakkarose-isomerase-genet på transposon Tn 1721,
figur 3 er et skjema for framstilling av E.coli-transkonjugater, som inneholder sakkarose-isomerase-genet på et F-plasmid, og
figur 4 viser en sammenlikning mellom sakkaridene oppnådd fra P.rubrum-type celler (ville) og cellene av P.rubrum mutant 9ZZ 13.
Følgende eksempler har til hensikt å belyse oppfinnelsen nærmere.
Eksempel 1
Isolering av sakkarose-isomerase-gener fra Protaminobacter rubrum.
Hele DNA fra organismen Protaminobacter rubrum (CBS 574,77) ble fordøyet partielt med Sau3A I. Fra den resulterende fragmentblanding ble fragmentsamlinger med størrelse på omlag 10 kBp utvunnet ved eluering etter gel-elektroforetisk separasjon og forbundet med et derivat av Lambda EMBL4-vektor-derivat JL RESII (J. Altenbucner, Gene 123 (1993), 63-38) åpnet med BamHI. Ved transfeksjon av E.coli og omdanning av plasmidets fag i henhold tit referansen foran ble det framstilt et genbibliotek. En screening av kanamycin-resistente kolonier i dette genbiblioteket ble utført med det radioaktivt merkete oligonukleotid S214 avledet fra sekvensen av N-terminus av det modne isomerase ved hybridiseing:
Til slutt ble det utført en isolering av plasmid-DNA fra de positivt reagerende kolonier etter tilsvarende kultivering. Fra ett av disse plasmid pKAT 01 oppnådd på denne måten ble det etter oppføring av et restriksjonskart sekvensielt egnete substanser og dermed ble den komplette nukeotidsekvens, vist i sekvens nr. 1, som koder for isomerase oppnådd. Aminosyresekvensen avledet på denne måten tilsvarer helt og holdent peptidsekvensen oppnådd ved sekvensiering (Edmann-oppbygging) av det modne isomerase. I det ikke-kodende 3'-området av dette isomerase-genet befinner det seg en kutteposisjon for SacI, i det ikke-kodende 5'-området en kutteposisjon for Hindlll. Dette gjør det mulig å foreta underkloning av det intakte isomerasegenet i vektoren pUCBM 21 (dervat av vektoren pUC 12, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Tyskland), som på forhånd var blitt forspaltet med de ovennevnte enzymer. Det resulterende plasmid fikk betegnelsen pHWS 34.2 og tildeler E.coli-cellene evne til å syntetisere sakkarose-isomerase.
En variant av sakkarose-isomerase-genet fra P.rubrum besitter nukleotidsekvensen vist i sekvens nr. 9.
Eksempel 2
Kloning og ekspresjon av sakkarose-isomerase fra P.rubrum i E.coli.
1. Framstilling av plasmidet pHWS88
Fra plasmidet pHWS 34.2 ble det ikke-kodende 5'-området av sakkarose-isomerase-genet fjernet ved anvendelse av et oligonukleotid S434 med sekvens
5'- CGGAATTCTTATGCCCCGTCAAGGA-3' ved samtidig innføring av en EcoRI-kutteposisjon (GAATTC). Dette derivatet av isomerase-genet ble behandlet med BstE II, den overhengende BstE II-ende behandlet (abgedaut) med Sl-nuklease og til slutt etter-fordøyd med EcoRI. Isomerase-genene behandlet på denne måten ble klonet med vektoren pBTacI forbehandlet med EcoRI og Smal (Boehringer Mannheim GnbH, Mannheim, Tyskland). Den resulterende vektor pHWS 88
(DSM 8824) inneholdt det modifiserte isomerasegen med en av de forannevnte EcoRI-restriksjons-posisjonene før ATG-startkodonet og 3'-området av isomerasegenet til den Sl-forkortete BstE II-kutteposisjonen. Denne vektoren tildeler ved induksjon med IPTG av disse cellene som bærer dette plasmidet en evne til å framstille isomerase så vel som resistens mot ampicillin (50-100 ug/ml). Fortrinnsvis anvendes E.coli-vertsceller for å oppnå isomerase, som overproduserer lac-repressor.
2. Framstilling av plasmidet pHWSl 18. :Tn 1721 Tet
Genkassetten for sakkarose-mutase ble bygget inn i et transposon. Dette skjedde ved innkloning av et SphI/HindIII-DNA-fragment fra plasmidet pHWS88, som bærer sakkarose-mutase-genet under kontroll av tac-promotoren, i plasmidet pJOE105, på hvilket transposonet Tn 1721 befinner seg. Plasmidet pJOE105 ble deponert i henhold til Budapest-konvensjonen den 16/12-93 hos DSM med deponeringsnr. DSM 8825. Det resulterende plasmidet pHWSl 18, på hvilket sakkarose-mutase-genet befant seg under kontroll av den regulerbare tac-promotoren, ble anvendt for å transformere en F'-plasmid-holdig E.coli-stamme. Figur 2 viser kloningsskjemaet for framstilling av pHWS 118 fra pHWS88 og pJOE 105.
Framstillingen av E.coli-transkonjugater, som inneholdt sakkarose-mutase-genet, forløp i henhold til skjemaet beskrevet i figur 3. Dessuten ble først den F'-bærende E.coli-stamme CSH36 (J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring HarborLaboratory (1972), side 18), som bærer fenotype Lac+ formidlet med F'-plasmidet, krysset med den nalidixinsyre-resistente E.coli-stammen JM108 (Sambrook et al, nevnt foran, side A9-A13). Ved seleksjon på minimal-medium tilsatt laktose, prolin og nalidixinsyre ble det oppnådd et F'-lac-bærende transkonjugat. Dette ble dessuten transformert med lq-plasmidet FDX500 (Brinkmann et al,' Gene 85 (1989), 109-114), for å muliggjøre en kontroll av sakkarose-mutase-genet med tac-promotoren.
Transkonjugatet behandlet på denne måten ble transformert med det sakkarose-mutase-gen-bærende transposon-plasmid pHWS 118. For seleksjon av transkonjugatene ble det foretatt krysning i den streptomycin-resistente E.coli-stammen HB101 (Boyer und Roulland-Dussoix, J.Mol.Biol. 41
(1969), 459-472). Overføringen av tetramycin-resistansen formidlet med transposomet var kun
mulig etter transposisjon av det modifiserte Tn 1721 Tet av det ikke-konjugerbare og ikke-mobiliser-bare plasmidet pHWSl 18 på det kojugerbare F'-plasmidet. Overdragelsen av F'-plasmidet med det modifiserte transposon i HB 101 ble selektert på LB-plater med streptomycin og tetracyclin og etter-festet på ampicillin- og nalidixinsyre-plater.
3. Ekspresjon av sakkarose- isomerase i E. coli
Forsøk mht enzymproduksjon av slike F'-plasmid-bærende E.coli-celler viste at det kunne framstilles sakkarose-mutase-protein. F'-plasmid-holdige HB 101-celler, som ikke bar noe ekstra lac-repressor-plasmid (f.eks. Kl/l eller Kl/10), produserte sakkarose-mutase-protein med og uten induktor isopropyl-p-D-thiogalactosid (IPTG) i like mengder. Produktiviteten av tre transkonjugater Kl/l, Kl/10 og Kl/4 er illustrert i tabellen nedenfor.
Under framstilling av et sakkarose-mutase-protein kunne det observeres en normal vekst av E.col t-cellene.
Når innføringen av sakkarose-mutase-genet i F'-plasmidet ble utført i nærvær av det repressor-kodende plasmid pFDX500 (sml. transkonjugat Kl/4), ble enzymproduksjonen kontrollerbar med induktoren IPTG. Mens det uten IPTG ikke kunne måles noen enzymatisk aktivitet, kunne det 4 timer etter induksjon oppnås en produksjon av sakkarose-mutase-proteinet på omlag 1.6 U/mg.
Det kunne ikke observeres noen ugunstig effekt på veksten av cellene. Etter en 4 timer lang induksjon oppnådde de plasmid-bærende E.coli-cellene en densitet på omlag 3 OD60o-
Det ble målt en sakkarose-mutase-aktivitet i transformert E.coli på inntil 1.6 U/mg. Syntese-effektiviteten er sammenliknbar med den som oppnås med P.rubrum. Analyse av de produserte enzymene med SDS-gelelektroforse ga ingen hentydninger om noe inaktivt proteinaggregat. Båndene for sakkarose-mutase-proteinet var bare svakt synlig med Coomassie-farging og bare tydelig detekterbar med 'Westernblut'. Styrken av proteinbåndet og den målte enzymatiske aktivitet var korrelerbar ved produksjonen av sakkarose-mutase i E.coli.
Eksempel 3
Isolering av sakkarose-isomerase-gener fra Erwinia rhapontici
Det ble på samme måte som i eksempel 1 oppnådd et genbibliotek ved restriksjonsspalting av total-DNA fra Erwinia rhapontici (NCPPB 1578).
Ved anvendelse av primer-blandingen ^-TGGTGGAAAGAAGCTGTO' og
G G
5-TCCCAGTTCAGGTCCGGCTG-3' ble det oppnådd et DNA-fragment ved PCR-
A
amplifisering, med hjelp av hvilket de mutase-gen-holdige kolonier kunne identifiseres ved hybridisering.
På denne måten ble det funnet en positiv klon pSST2023 som inneholdt et 1305 nukleotid langt fragment av Erwinia-isomerase-genet. Nukleotidsekvensen for dette fragmentet er vist i sekvens nr. 2.
Ved sekvens-sammenlikning med protaminobacter-genet ble det for hele gen-avsnittet og betraktning av signalpeptidområdet funnet en identitet på 77.7% og en likhet på 78%, på aminosyre-nivå en identitet på 83.4% og en likhet på 90.3%.
Sekvensforskjellen konsentrerte seg hovedsakelig i signalpeptidområdet. Derfor skulle det for sammenlikning utelukkende foretas en betraktning av det enzym-kodende området, uten signalpeptid, som var ansvarlig for den egentlige mutase-aktiviteten. Med utgangspunkt i dette ble det på nukleotid-planet registrert en identitet og liket på 79%. Aminosyre-sekvens-sammenlikningen (figur 1) i dette avsnittet oppviste 87.9% identiske aminosyrer. Av 398 aminosyrer (dette tilsvarer 71% av det totale enzym) av Erwinia-mutase er 349 like med Protaminobacter. Av 48 ombyttete aminosyrer oppviser 25 en sterk likhet, slik at det totalt på aminosyreplanet var en likhet på 94%. Aminosyre-ombyttene konsentrerer seg hovedsakelig om området mellom aminosyre 141 og 198. Foran dette området ligger en rekke på 56 konserverte aminosyrer. Også andre avsnitt oppviser en svært høy konservering (se figur 1).
Disse data viser at for det klonete og sekvensierte avsnittet totalt foreligger en svært sterk konservering av begge mutasene fra Erqinia og Protaminobacter.
Identitet av det klonete mutasegen fra Erwinia
For et rehybridiserings-eksperiment med genomisk Erwinia-DNA ble det som probe valgt det omlag 500 bp store SspI/EcoRI-fragment fra pSST2023. Dette fragmentet ble etter digoxigenin-markering brakt til hybridisering med Erwinia-DNA ved høyere stringens (68°C). Med SspI/EcoRI-snittet Erwinia-total-DNA ble det framskaffet et entydig hybridiseringssignal i forventet mengde på omlag 500 bp. Erwinia-DNA, som utelukkende ble snittet med Sspl, ga et hybridiseringssignal på omlag 2 kb.
Gjennom en vellykket rehybridisering av pSST2023 med genomisk Erwinia-DNA kunne det verifiseres at mutaseområdet klonet i pSST2023 stammet fra Erwinia rhapontici.
Kloning av det C- terminale deljragmentet av Erwinia- mutase
Det klonete N-terminale delfragment av Erwinia-mutase-genet innehar en størrelse på 1.3 kb og oppviser nukleotidsekvensen vist i sekvens nr. 2. Da en kan gå ut fra at det totale Erwinia-gen har en nærmest identisk størrelse som det kjente protaminobacter-genet (1.8 kb), mangler det et omlag 500 bp-avsnitt i det C-terminale området av Erwinia-genet.
For kloning av Erwinia-C-terminus ble det valgt det omlag 2 kb store Sspl-fragment fra Erwinia-total-DNA. I 'Southernblut' leverer dette fragmentet med en digoxigenin-markert DNA-probe av pSST2023 et entydig signal. Dette 2 kb Sspl-fragment skjærer over med området på 3'-enden, som allerede er klonet i pSST2023, med omlag 500 kb. Dens størrelse skal være tilstrekkelig til fullstendig kloning av det manglende genavsnittet på omlag 500 bp. For å identifisere den søkte klon er den digoxigenin-markerte fragmentprobe SspI/EcoRI fra pSST2023 egnet.
Eksempel 4
Framstilling av en protaminobacter-palatinase-defekt-mutant
Celler av Protaminobacter rubrum (CBS 547,77) ble i henhold til framgangsmåten av Adelberg et al (Biochem. Biophys. Research Commun. 18 (1965),788) modifisert ifølge eksperimentene av Miller, J. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 125-179 (1972)) mutagenisert med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Til utvelgelse av palatinase-defekt-mutantene ble det brukt MacConkey-palatinose-medium (MacConkey-Agar-Base (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA), 40 g/l ved tilsats av 20 g/l palatinose, sterilfiltrert, 25 mg/l kanamycin) og minimaltsaltmedier (10.5 g K2HP04,4.5 g KH2HP04, 1 g (NrL^SCu, 0.5 g natrium-citrat x 2 H20, 0.1 g MgS04x7H20, 1 mg thiamin, 2 g palatinose eller glukose, 25 mg kanamycin og 15 g agar per liter, pH 7.2). Mutanter av P.rubrum, som er hvite på MacConkey-palatinose-medium eller vokser på minimalsaltmedium med glukose i motsetning til tilsvarende medium med palatinose, ble identifisert som palatinase-defekt-mutanter. I celleekstrakter av mutantene kan enzymaktiviteten for spalting av palatinose i glukose og fruktose (palatinase-aktivitet), i motsetning til den ville typen ikke påvises. Dersom en dyrker disse cellene i minimaliseringsmedium med 0.2% sakkarose som eneste C-kilde, så kan det i motsetning til den ville celletypen, med hvilke palatinose kun påvises transient i tidsrommet fra 4 til 11 timer etter start av kultivering, påvises en varig akkumulering av palatinose (isomaltulose). Kulturer som hadde stått over natta i like medier inneholdt i tilfellet med den ville celletypen ingen palatinose, men i tilfellet med mutanten SZZ13 (DSM 9121) framstilt på denne måten var det imidlertid et innhold av palatinse på >0.08% (se figur 4).
Eksempel 5
Immobilisering av mikroorganisme-celler.
Fra en vaksinering (Abimpfung) av den tilsvarende stamme ble det awasket celler med 10 ml av et sterilt næringssubstrat bestående av 8kg saftkonsentrat fra en sukkerfabrikk (tørrstoffinnhold = 65%), 2kg maispressvann, 0.1 kg diammoniumhydrogenfosfat og 89.9 kg destillert vann, pH 7.2. Denne suspensjonen tjente som vaksine (Impfgut) for skyttelmaskin-forkulturen i 1 liters-kolbe med 200 ml næringsløsning med sammensetning som angitt foran. Etter en inkubasjonstid på 30 timer ved 29°C ble med 10 kolber (totalinnhold 2 liter) 18 liter næringsløsning med sammensetning som angitt foran vaksinert i en 30 liter fermentator og fermentert ved 29°C ved tilførsel av 20 liter luft per minutt og en rørehastighet på 350 opm.
Etter at det ble oppnådd et kimantall på minst 5 x 109 kim per ml ble fermenteringen avbrutt og cellene separert fra fermenteringsløsningen ved sentrifugering. Cellene ble dermed suspendert i en 2% natriumalginatløsning og immobilisert ved inndrypping av suspensjonen i en 2% kalsiumklorid-løsning. De oppnådde immobilisatkulene ble vasket med vann og er lagringsbestandige i flere uker ved +4°C.
Celler av palatinase-defekt-mutant SZZ 13 (DSM 9121) oppviser bedre katalytiske egenskaper med hensyn til deres produktsammensetning enn sammenliknbare celler av den kjente mikroorganismen Protaminobacter rubrum (CBS 547,77) og Erwinia rhapontici (BCPPB 1578).
Det ble foretatt en evaluering av hele celler og råekstrakt av SZZ 13 såvel som av et immobilisat av SZZ 13 i kalsiumalginat framstilt i henhold til det ovenstående med hensyn på deres produktsammensetning i aktivitetstesten. Før den egentlige aktivitetstesten ble immobilisatet strømmet over i en 0.1 M kalsiumfosfatbuffer med pH 6.5.
Aktivitetsmålinger ved 25°C viste at det ikke ble funnet noe fruktose eller glukose med mutanten SZZ 13, mens det med ville P.rubrum-celler i totalceller 2.6% og i råekstrakt 12.0% ble funnet fruktose og glukose (på basis av det totale mono- og disakkarid). Med E.rhapontici ble det funnet glukose og fruktose i en mengde av 4% i totalceller og i råekstrakt 41% .
Eksempel 6
Isolering av sakkarose-isomerase-genet fra andre organismer
Ved partiell fordøying av genomisk DNA fra isolat SZ62 (Enterobacter spee), organismen Pseudomonas mesoacidophilia (MX-45) eller av en annnen mikroorganisme og innføring av det oppnådde fragment i egnete E.coli-vektorer og transformasjon ble det framskaffet et genbibliotek, hvis klon inneholdt genomiske avsnitt mellom 2 og 15 kb av donororganismen.
Av E.coli-celler, som bærer dette plasmidet, ble det ved plettering på McConkey-palatinose-medium, valgt slike som oppvise en rødfarging av kolonien. Plasmid-DNA inneholdt i disse cellene blir overført i en E.coli-mutant, som ikke kan vokse på galaktose som eneste C-kilde (f.eks. ED 8654, Sambrook et al, se foran, side A9-A13). Disse transformerte cellelinjene er for identifisering av palatinoseprodusenter i genbiblioteket av DNA for donororganismen, framstilt som beskrevet foran.
For identifisering av de søkte palatinose-dannende klonene ble cellene i genbiblioteket isolert og dyrket på minimalsaltmedier med galaktose og sakkarose. Etter replika-utplating av koloniene på plater med det samme medium, ble cellene drept med toluol. Deretter ble cellene av screening-stammen spredt som en plen i minimalsalt-bløt-agar uten C-kildetilførsel, over koloniene i genbiblioteket, og inkubert. Det oppstod signifikant vekst av cellene av screening-stammen kun på stedet hvor cellene i genbiblioteket hadde produsert palatinose. Ved prøving av cellene av replikat-kontrollen ble det funnet isomerase innhold.
Denne E.coli-klonen idenfisert på denne måten er ikke vekstdyktig på palatinose som eneste C-kilde i mediet, viser i testen med alle cellene eller i celleekstrakt ingen evne til å spalte sakkarose, men danner under disse betingelsene og uten tilsats av sakkarose til mediet ved uttrekket palatinose.
Alternativt kan isomerase-kolonene også identifiseres ved anvendelse av et PCR-fragment ved anvendelse av en prosedyre i henhold til eksempel 3.
Dersom en anvender plasmid-DNA av den slik identifiserte E.coli-klonen som prober for hybridisering på filtre med immobilisert DNA fra donororganismen, kan genområdet som bærer isomerasegenet, påvises og målrettet stilles disponibelt.
På denne måten ble det identifisert en klon, som inneholdt en nukleotidsekvens som vist i sekvens nr. 3 med aminosyresekvensen avledet fra denne og vist i sekvens nr. 6. Likeså ble det funnet en isomeraseklon fra DNA i bakteriestammen Pseudomonas mesoacidophilia MX-45 (FERM 11808).
Den fullstendige nukleotid- og aminosyresekvens av sakkarose-isomerase fra SZ 62 er illustrert i sekvens nr. 11 og 12. En hovedandel av nukleotid- og aminosyresekvensen av sakkarose-isomerase fra MX-45 er vist i sekvens nr. 13 og 14.
Eksempel 7
Kloning av et palatinse-gen
Protaminobacter rubrum-genbiblioteket framstilt i eksempel 1 ble screenet med den fra sekvensen av N-terminus av det isolerte palatinase avledete radioaktivt markerte oligonukleotid-blanding S433 med sekvensen CA(G,A)TT(C,T)GG(T,C)TA(C,T)GG-3'.
Det ble funnet en positiv klon, fra hvilken et plasmid med betegnelsen pKAT 203b ble isolert.
E.coli-celler som bærer plasmidet pKAT203 er egnet til stoffutveksling av palatinose. Spaltingen av palatinose i glukose og fruktose, som kan påvises i aktivitetstesten, lar seg anta en "palatinase".
Ved sekvensiering av pKAT203-DNA med oligonukleotidet S433 som primer kan det oppnås en DNA-sekvens, som etter oversetting til aminosyresekvensdata kan avleses som kjente N-terminale aminosyrer. Gjennom et tilsluttende sekvensiseringsforløp ble det oppnådd en åpen leseramme.
Sekvensbestemmelse av " palatinase "- genet
For videre sekvensiering av "palatinase"-genet ble delfragmenter fra plasmidet pKAT 203 valgt fra restriksjonskartet, subklonet i M13-fagsystem og sekvensiering av enkelttrådet fag-DNA med
'universal-primer' 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'.
Dersom en kombinerer de oppnådde DNA-sekvensdata for de enkelte fragmenter ved over-våking av overlappende området, kan en framskaffe en gjennomgående leseramme for "palatinase"
Oversettingen av denne DNA-sekvensen i aminosyredata ga et protein med 453 aminosyrer (sekvens nr. 8) og en derav avledet molvekt på omlag 50 000 Da. Dette samsvarer med funnet, at det ved anriking av "palatinase"-aktivitet kunne oppnås en proteinfraksjon som oppviste et bånd ved omlag 48.000 Da i SDS-gel. I naturlig gel kunne den palatinosespaltende aktivitet tilskrives en størrelse på omlag 150.000 Da.
Identitetssammenlikning med andre kjente proteiner
Sammenlikning av aminosyre-sekvensen avledbar fra DNA-sekvensen, med data i en genbank (SwissProt), avslørte en identitet med melibiase fra E.coli (MelA) (i to deler: identitet 32%).
Eksempel 8
Kloning av et palatinose-hydrolase-gen fra P.mesoacidophilia MX-45
Fra genbiblioteket framstilt i eksempel 6 av mikroorganismen P.mesoacidophilia MX-45 ble det isolert et gen med nukleotidsekvens som vist i sekvens nr. 15. Dette genet koder for et protein med aminosyresekvens som vist i sekvens nr. 16. Proteinet er et palatinose-hydrolase, som katalyserer spalting av palatinose ved dannelse av fruktose og glukose.
Claims (28)
1. DNA-sekvens, karakterisert ved at den omfatter (a) en nukleotidsekvens valgt fra gruppen i) sekvens nr. 1, 2, 3, 9,11 eller 13, som koder for et protein med sakkarose-isomerase-aktivitet, eventuelt uten det signalpeptid-kodende område, eller ii) sekvens nr. 7 eller 15, som koder for et protein med palatinase- og/eller trehalulase-aktivitet, (b) en nukleotidsekvens tilsvarende sekvensene under under (a) innenfor rammen av degenereringen av den genetiske koden, etler (c) en nukleotidsekvens som hybridiserer med sekvensen ifølge (a) og/eller (b) ved vasking i 1 time med 1 x SSC og 0,1 % DSD ved 55°C.
2. DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter (a) en nukleotidsekvens ifølge sekvens nr. 1, 2, 3, 9, 11 eller 13, eventuelt uten det signalpeptid-kodende området, eller (b) en nukleotidsekvens med minst 80% identitet med sekvensen ifølge (a), og som koder for et protein med den samme biologiske aktiviteten.
3. DNA-sekvens ifølge et krav 1 eller 2, karakterisert ved at den oppviser en nukleotidsekvens med minst 80% identitet med delområdene av (a) nukleotid 139-155 og/elter (b) nukleotid 625-644,
av nukleotidsekvensen ifølge sekvens nr. 1, og som koder for et protein med den samme biologiske aktiviteten.
4. DNA-sekvens ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den oppviser en nukleotidsekvens med minst 80% identitet med delområdene av (c) nukleotid 995-1013 og/eller (d) nukleotid 1078-1094,
av nukleotidsekvensen ifølge sekvens nr. 1, og at den koder for et protein med den samme biologiske aktiviteten.
5. Vektor, karakterisert ved at den inneholder minst en kopi av en DNA-sekvens ifølge et av kravene 1 til 4.
6. Vektor ifølge krav 5, karakterisert ved at den er en prokaryotisk vektor.
7. Vektor ifølge krav 5 eller 6, karakterisert ved at den er et sirkulært plasmid.
8. Vektor ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at den foreligger i en vertscelle i et kopiantall pd mindre enn 10.
9. Vektor ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at den inneholder sakkarose-isomerase-genet under kontroll av en regulerbar promotor.
10. Vektor ifølge et av kravene 5-9, karakterisert ved at den er plasmid pHWS 88 (DSM 8824).
11. Celle, karakterisert ved at den er transformert med en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 4, eller en vektor ifølge et av kravene 5 til 10.
12. Celle ifølge krav 11, karakterisert ved at den er en prokaryotisk celle, fortrinnsvis en gram-negativ prokaryotisk celle, og/eller en enterobakterie-celle.
13. Celle ifølge krav 12, karakterisert ved at den er en Escherichia coli-, Protaminobacter rubrum eller Erwinia rhapontici-celle.
14. Protein med en sakkarose-isomerase- eller palatinase og/eller trehalulose-aktivitet, karakterisert ved at den er kodet fra en DNA-sekvens ifølge et av kravene 1 til 4.
15. Protein ifølge krav 14, karakterisert ved at den oppviser en aminosyresekvens ifølge sekvens nr. 8 eller 16.
16. Protein ifølge krav 15, karakterisert ved at det omfatter (a) en aminosyresekvens ifølge sekvens nr. 4, 5,6,10,12 eller 14, eventuelt uten signalpeptidområdet, eller (b) en aminosyresekvens med minst 80% identitet med sekvensene ifølge (a), og som koder for et protein med den samme biologiske aktiviteten.
17. Protein ifølge krav 14 eller 16, karakterisert ved at det oppviser en aminosyresekvens med minst 90% identitet med delområdene (a) aminosyre 51-149, (b) aminosyre 168-181. (c) aminosyre 199-250, (d) aminosyre 351-387, og/eller (e) aminosyre 390-420,
av aminosyresekvensen ifølge sekvens nr. 4, og at den koder for et protein med den samme biologiske aktiviteten.
18. Celle, karakterisert ved at den inneholder minst en DNA-sekvens i samsvar med krav 1- 4, som koder for et protein med en sakkarose-isomerase-aktivitet og oppviser en redusert palatinose-og/eller trehalulose-metabolisme.
19. Celle ifølge krav 18, karakterisert ved at delvis eller fullstendig inhibering av ekspresjon av invertase- og/eller palatinose-genene resulterer i redusering av palatinose- og/eller trehalulose-metabolismen.
20. Celle ifølge krav 18 eller 19, karakterisert ved at den er protaminobacter rubrum mutanten SZZ 13 (DSM 9121).
21. Framgangsmåte for isolering av nukleinsyrer, som koder for et protein med en sakkarose-isomerase-aktivitet, karakterisert ved at det etableres et genbibliotek av en donororganisme som inneholder en DNA-sekvens som koder for et protein med sakkarose-isomerase-aktivitet, i en egnet vertsorganisme, hvorved klonene i genbiblioteket undersøkes og de klonene som inneholder en nukleinsyre som koder for et protein med sakkarose-isomerase-aktivitet, isoleres.
22. Framgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at det som vertsorganisme anvendes E.coli.
23. Framgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at, ved undersøking av klonene i genbiblioteket, isoleres sakkarose-spaltende kloner og de deri inneholdende DNA-sekvensene som stammer fra donororganismen og transformeres i en E.coli-stamme som ikke utnytter galaktose, som anvendes som screening-stamme for klonene i genbiblioteket.
24. Framgangsmåte ifølge krav 21 eller 22, karakterisert ved at undersøkingen av klonene i genbiblioteket følger ved anvendelse av nukleinsyreprober, som er avledet fra sekvens nr. 1,2,3,9, 11 eller 13.
25. Framgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at det som nukleinsyreprobe anvendes et DNA-fragment, som framskaffes ved PCR-forsterkning av DNA fra donororganismen ved anvendelse av oligonukleotid-blandingen
26. Framgangsmåte for framstilling av ikke-kariogent sukker, særlig trehalulose og/eller palatinose, karakterisert ved at det for framstilling av sukret anvendes et protein ifølge et av kravene 14 til 16, en organisme ifølge et av kravene 11 til 13 eller 17 til 19, eller et ekstrakt av slike organismer.
27. Framgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at organismen, ekstraktet eller proteinet anvendes i immobilisert form.
28. Anvendelse av protein ifølge et av kravene 14 til 17 eller organismer ifølge et av kravene 11 til 13 eller 18 til 20, for framstilling av ikke-kariogent sukker, særlig trehalulose og/eller palatinose.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4401451 | 1994-01-19 | ||
| DE4414185A DE4414185C1 (de) | 1994-01-19 | 1994-04-22 | Saccharose-Isomerase und Herstellung von akariogenen Zuckerersatzstoffen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO950194D0 NO950194D0 (no) | 1995-01-19 |
| NO950194L NO950194L (no) | 1995-07-20 |
| NO319016B1 true NO319016B1 (no) | 2005-06-06 |
Family
ID=25933131
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO944793A NO944793D0 (no) | 1994-01-19 | 1994-12-12 | Akariogen sukkererstatning og framgangsmåte for framstilling av samme |
| NO19950194A NO319016B1 (no) | 1994-01-19 | 1995-01-19 | Akariogen sukkererstatning og framgangsmate for framstilling av samme |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO944793A NO944793D0 (no) | 1994-01-19 | 1994-12-12 | Akariogen sukkererstatning og framgangsmåte for framstilling av samme |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5786140A (no) |
| EP (1) | EP0740706B1 (no) |
| JP (1) | JP4301529B2 (no) |
| AT (1) | ATE307206T1 (no) |
| AU (2) | AU688848B2 (no) |
| BR (1) | BR9500271B1 (no) |
| CA (1) | CA2140613A1 (no) |
| DE (3) | DE4447472C2 (no) |
| DK (1) | DK0740706T3 (no) |
| FI (2) | FI950187A (no) |
| IL (1) | IL112329A (no) |
| NO (2) | NO944793D0 (no) |
| WO (1) | WO1995020047A2 (no) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69731016T2 (de) * | 1996-03-04 | 2005-10-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Herstellung einer Trehalulose enthaltende Polysaccharidzusammensetzung. |
| US7465571B1 (en) | 1996-05-22 | 2008-12-16 | Verenium Corporation | Endoglucanases |
| US5789228A (en) * | 1996-05-22 | 1998-08-04 | Diversa Corporation | Endoglucanases |
| EP1263971A1 (de) * | 2000-02-14 | 2002-12-11 | IPK Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Verfahren zur beeinflussung der pollenentwicklung durch veränderung des saccharosestoffwechsels |
| AU2001237381A1 (en) * | 2000-02-14 | 2001-08-20 | Ipk Institut Fur Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung | Use of palatinase and trehalulase sequences as nutritive markers in transformed cells |
| DE10006462B4 (de) * | 2000-02-14 | 2005-02-24 | IPK-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Produktion nicht-kariogener Zucker in transgenen Pflanzen |
| US7235712B1 (en) * | 2000-02-15 | 2007-06-26 | Agency For Science, Technology And Research | Bacterial isolates of the genus Klebiella, and an isomaltulose synthase gene isolated therefrom |
| KR100379672B1 (ko) * | 2000-08-24 | 2003-04-11 | 주식회사 바이오앤진 | 어위니아 라폰티치 유래 유전자를 통한 이소말툴로스합성효소의 발현 생산방법 |
| AUPQ976800A0 (en) * | 2000-08-29 | 2000-09-21 | University Of Queensland, The | Novel polypeptides and polynucleotides and uses therefor |
| AU2001281609B2 (en) * | 2000-08-29 | 2007-08-02 | The University Of Queensland | Isomaltulose synthase |
| DE10047286B4 (de) * | 2000-09-20 | 2005-06-09 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt | Isomalt produzierende transgene Pflanze |
| AU2003246353A1 (en) * | 2002-07-04 | 2004-01-23 | Sungene Gmbh And Co. Kgaa | Methods for obtaining pathogen resistance in plants |
| US7572950B2 (en) | 2002-07-04 | 2009-08-11 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Methods for obtaining pathogen resistance in plants |
| AU2003902253A0 (en) | 2003-05-12 | 2003-05-29 | The University Of Queensland | Method for increasing product yield |
| DE102005052210A1 (de) * | 2005-10-26 | 2007-05-03 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Mikrobiologisch stabilisiertes Bier |
| US20100064389A1 (en) * | 2007-02-08 | 2010-03-11 | Basf Plant Science Gmbh | Polynucleotides Encoding Truncated Sucrose Isomerase Polypeptides for Control of Parasitic Nematodes |
| US9127287B2 (en) | 2008-06-11 | 2015-09-08 | Syngenta Participations Ag | Compositions and methods for producing fermentable carbohydrates |
| DE102009053566B4 (de) | 2009-11-11 | 2014-08-14 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Mikroorganismen mit gesteigerter Sucrosemutaseaktivität |
| DE102009060935A1 (de) * | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt, 68165 | Sucrosemutase mit verbesserter Produktspezifität |
| CA2909440C (en) * | 2012-04-17 | 2021-01-19 | Agtive Bio-Sciences Private Limited | A method of production of rare disaccharides |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0028900B1 (en) * | 1979-11-07 | 1984-02-08 | TATE & LYLE PUBLIC LIMITED COMPANY | Production of isomaltulose |
| US4390627A (en) * | 1981-10-26 | 1983-06-28 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of the sucrose mutase in whole cells of protaminobacter rubrum |
| DE3241788A1 (de) * | 1982-11-11 | 1984-05-17 | Süddeutsche Zucker AG, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung von 1-0-(alpha)-d-glucopyranosido-d-fructose und verwendung als suessungsmittel |
| DE3528752A1 (de) * | 1985-04-27 | 1986-10-30 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Kontinuierliches verfahren zur enzymatischen herstellung von isomaltulose |
| JPH03160995A (ja) * | 1989-11-21 | 1991-07-10 | Meito Sangyo Kk | トレハルロースの製造法 |
| JP2756360B2 (ja) * | 1990-10-31 | 1998-05-25 | 三井製糖株式会社 | トレハルロースおよびパラチノースの製造法 |
| US5229276A (en) * | 1990-10-31 | 1993-07-20 | Mitsui Sugar Co., Ltd. | Process for preparing trehalulose and isomaltulose |
-
1994
- 1994-04-22 DE DE4447472A patent/DE4447472C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-22 DE DE4447471A patent/DE4447471C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-12 NO NO944793A patent/NO944793D0/no unknown
-
1995
- 1995-01-13 IL IL11232995A patent/IL112329A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-01-17 FI FI950187A patent/FI950187A/fi not_active Application Discontinuation
- 1995-01-18 US US08/374,155 patent/US5786140A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-18 WO PCT/EP1995/000165 patent/WO1995020047A2/de active IP Right Grant
- 1995-01-18 AU AU15349/95A patent/AU688848B2/en not_active Expired
- 1995-01-18 DK DK95906961T patent/DK0740706T3/da active
- 1995-01-18 AT AT95906961T patent/ATE307206T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-01-18 DE DE59511023T patent/DE59511023D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-18 EP EP95906961A patent/EP0740706B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-19 NO NO19950194A patent/NO319016B1/no unknown
- 1995-01-19 CA CA002140613A patent/CA2140613A1/en not_active Abandoned
- 1995-01-19 JP JP02468695A patent/JP4301529B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-19 BR BRPI9500271-5A patent/BR9500271B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-02-03 AU AU11554/95A patent/AU1155495A/en not_active Abandoned
-
1996
- 1996-07-18 FI FI962891A patent/FI962891A/fi unknown
-
1997
- 1997-01-21 US US08/785,396 patent/US5985622A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI962891A0 (fi) | 1996-07-18 |
| FI950187A0 (fi) | 1995-01-17 |
| NO950194L (no) | 1995-07-20 |
| AU1155495A (en) | 1995-07-27 |
| CA2140613A1 (en) | 1995-07-20 |
| DK0740706T3 (da) | 2006-02-13 |
| BR9500271A (pt) | 1995-10-17 |
| ATE307206T1 (de) | 2005-11-15 |
| BR9500271B1 (pt) | 2011-11-01 |
| DE4447472C2 (de) | 1996-04-11 |
| EP0740706B1 (de) | 2005-10-19 |
| NO944793D0 (no) | 1994-12-12 |
| WO1995020047A3 (de) | 2001-09-13 |
| DE4447471C2 (de) | 1995-12-21 |
| IL112329A (en) | 2005-08-31 |
| AU688848B2 (en) | 1998-03-19 |
| US5985622A (en) | 1999-11-16 |
| US5786140A (en) | 1998-07-28 |
| FI962891A (fi) | 1996-07-18 |
| AU1534995A (en) | 1995-08-08 |
| WO1995020047A2 (de) | 1995-07-27 |
| NO950194D0 (no) | 1995-01-19 |
| DE4447472A1 (de) | 1995-09-14 |
| DE59511023D1 (de) | 2006-03-02 |
| JPH07250693A (ja) | 1995-10-03 |
| IL112329A0 (en) | 1995-03-30 |
| EP0740706A1 (de) | 1996-11-06 |
| JP4301529B2 (ja) | 2009-07-22 |
| FI950187A (fi) | 1995-07-20 |
| DE4447471A1 (de) | 1995-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO319016B1 (no) | Akariogen sukkererstatning og framgangsmate for framstilling av samme | |
| JP5274476B2 (ja) | コリネバクテリウム属菌株から発現されたアラビノース異性化酵素及びそれを用いたタガトースの製造方法 | |
| TW201839140A (zh) | 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法 | |
| CN104903457A (zh) | 3-差向异构酶 | |
| CN112063666B (zh) | 一种重组蔗糖异构酶在转化蔗糖制备异麦芽酮糖中的应用 | |
| CN112574977B (zh) | 一种低聚半乳糖生产专用酶及其制备与应用 | |
| KR100872695B1 (ko) | Ｇｒａｓ 미생물로부터 발현된 식품안전형 호열성아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의제조방법 | |
| KR20180111679A (ko) | 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 | |
| KR100374449B1 (ko) | 효소를인코우드하는디엔에이(dna),재조합디엔에이(dna)와효소,형질전환체및이들의제조방법과용도 | |
| CN113151211A (zh) | 一种α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体及利用该突变体制备3-岩藻糖基乳糖的应用 | |
| KR100427529B1 (ko) | 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 재조합형 열안정성 효소 | |
| KR100374448B1 (ko) | 효소를인코우드하는디엔에이(dna),재조합디엔에이(dna)와효소,형질전환체및이들의제조방법과용도 | |
| JP2014140361A (ja) | ケトース３−エピメラーゼ酵素 | |
| JP4259169B2 (ja) | 新規α−１，２−マンノシダーゼおよびその遺伝子、ならびに該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造方法 | |
| AU708538B2 (en) | Sucrose metabolism mutants | |
| CN112342178A (zh) | 重组微生物、其制备方法及在生产塔格糖中的应用 | |
| US6884611B2 (en) | Preparation of acariogenic sugar substitutes | |
| KR100387302B1 (ko) | 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 재조합형 효소 | |
| KR101736245B1 (ko) | 강화된 수크로스 뮤타제 활성을 가지는 미생물 | |
| JP2995289B2 (ja) | セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 | |
| JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| KR100316464B1 (ko) | 신규한 재조합 아스퍼질러스 엔도이눌리나아제의 유전자, 그 발현벡터 및 그를 이용한 형질전환 미생물 | |
| JP4686090B2 (ja) | マンノースイソメラーゼ遺伝子 | |
| JP2000279172A (ja) | 新規なインドール酸化酵素をコードするｄｎａとその利用 | |
| JPH0741500A (ja) | サイクロイヌロオリゴサッカライド フラクタノトランスフェラーゼ活性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を含有する形質転換体による環状イヌロオリゴ糖の製造方法 |