NO317990B1

NO317990B1 - Celleadhesjonsinhibitor samt farmasoytiske sammensetninger inneholdende denne

Info

Publication number: NO317990B1
Application number: NO20006023A
Authority: NO
Inventors: Alan Gill; Wen-Cherng Lee
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2005-01-17
Also published as: SK18102000A3; UA65623C2; CN1307561A; EA200001236A1; CZ20004425A3; PL198189B1; NO20006023D0; EA002988B1; CA2333656A1; ATE256659T1; AU4219299A; CN1148350C; BG105060A; DK1082302T3; SI1082302T1; DE69913687D1; DE69913687T2; IS5737A; EE200000698A; KR20010043906A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye forbindelser som er nyttige for inhibering, forandring eller forebyggelse av celleadhesjon og celleadhesjonsmedierte patologier hvor forbindelsen har struktur som angitt i krav 1. Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske formuleringer som omfatter disse forbindelser. Forbindelsene og de farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan brukes som terapeutiske eller profylaktiske midler. De er spesielt godt egnet for behandling av mange inflammatoriske og autoimmune sykdommer.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Celleadhesjon er en fremgangsmåte ved hvilken celler for-bindes med hverandre, migrerer mot et bestemt mål eller lokaliserer seg innen den ekstracellulære matriks. Som sådann utgjør celleadhesjonen en av de grunnleggende meka-nismer som ligger til grunn for tallrike biologiske feno-mener. F.eks. er celleadhesjon ansvarlig for adhesjonen av hematopoetiske celler til endotelceller og den påfølgende migrasjon av disse hematopoetiske celler ut fra blodkarene og til skadestedet. Dermed spiller celleadhesjonen en rolle i tallrike patologier såsom f.eks. betennelse og immunreaksjoner i pattedyr.

Undersøkelser av den molekylære basis for celleadhesjon har vist at flere celleoverflate-makromolekyler - som sammen er kjent som celleadhesjonsmolekyler eller -receptorer - medierer celle/celle- og celle/matriks-vekselvirkninger. F.eks. er proteiner fra superfamilien som benevnes "integriner", nøkkelmediatorer i adhesive vekselvirkninger mellom hematopoetiske celler og deres mikromiljø {M.E. Hemler, "VLA Proteins in the Integrin Family: Structures, Func-tions, and their Role on Leukocytes", Ann. Rev. Immunol., 8, s. 365 (1990)). Integriner er ikke-kovalente hetero-dimere komplekser som består av to delenheter som benevnes a og p. Det finnes minst 17 forskjellige a-delenheter {al-alO, a-L, a-M, a-D, aX, a-IIB, a-v og a-E) og minst 9 forskjellige p-delenheter (P1-P9) som er blitt identifisert hittil. På grunnlag av typen av sine a- og p-delenhets-komponenter kan hvert integrinmolekyl kategoriseres til en delfamilie.

Integrin <x4pl, også kjent som meget sent antigen-4 ("VLA-4") eller CD49d/CD29, er en leukocyttcelle-overflate-receptor som deltar i et bredt utvalg av både celle/celle-og celle/matriks-adhesive vekselvirkninger (M.E. Hemler, Ann. Rev. Immunol., 8, s. 365 (1990)). Det tjener som en receptor for det cytokin-induserbare endotelcelle-over-flateprotein, vaskulært celleadhesjonsmolekyl-1 ("VCAM-1") samt for det ekstracellulære matriksprotein fibronektin ("FN") (Ruegg et al., J. Cell Biol., 177, s. 179 (1991); Wayner et al., J. Cell Biol., 105, s. 1873 (1987); Kramer et al., J. Biol. Chem., 264, s. 4684 (1989); Gehlsen et al.. Science, 24, s. 1228 (1988)). Anti-VLA-4-monoklonale antistoffer ("mAb^r") har vist seg å inhibere VLA-4-avhen-gige adhesive vekselvirkninger både in vitro og in vivo (Ferguson et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 88, s. 8072

(1991); Ferguson et al., J. Immunol., 150, s. 1172 (1993)). Resultater av in vivo-eksperimenter tyder på at en inhibering av VLA-4-avhengig celleadhesjon kan forebygge, inhibere eller endre flere inflammatoriske og autoimmune patologier (R.L. Lobb et al., "The Pathophysiologic Role of a4 Integrins In Vivo", J. Clin. Invest., 94, s. 1722-1728

(1994)).

For å identifisere den minste aktive aminosyresekvens som er nødvendig for å binde VLA-4, syntetiserte Komoriya et al. diverse overlappende peptider på grunnlag av aminosyre-sekvensen av CS-l-region (den VLA-4-bindende domene) av en bestemt type fibronektin ("The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CS1) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), s. 15075-15079 (1991)). De identifi-serte et 8 aminosyrer langt peptid, nemlig Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, samt to mindre overlappende pentapeptider, Glu-Ile-Leu-Asp-Val og Leu-Asp-Val-Pro-Ser, som hadde inhibitorisk aktivitet mot FN-avhengig celleadhesjon. Disse resultater tydet på at tripeptidet Leu-Asp-Val var den minste sekvens for celleadhesjonsaktivitet. Det ble senere vist at Leu-Asp-Val kun bindes til lymfocytter som uttrykker en aktivert form for VLA-4, hvilket kastet tvil over nytten av et slikt peptid in vivo (E.A. Wayner et al., "Activation-Dependent Recognition by Hematopoietic Cells of the LDV Sequence in the V Region of Fibronectin", J. Cell. Biol., 116 (2), s. 489-497 (1992)). Imidlertid viste seg visse større peptider som inneholdt LDV-sekvensen, senere å være aktive in vivo (T.A. Ferguson et al., "Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Responses In Vivo", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, s. 8072-8076

(1991); og S.M. Wahl et al., "Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, s. 655-662

(1994)). Et cyklisk pentapeptid som kan inhibere både VLA-4- og VLA-5-adhesjonen til FN er også blitt beskrevet (jfr. f.eks. D.M. Nowlin et al., "A Novel Cyclic Penta-peptide Inhibits cc4pi and a5pl Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem., 268 (27), s. 20352-20359 (1993); og PCT-publikasjonen PCT/US91/04862). Dette pentapeptid var basert på tripeptidsekvensen Arg-Gly-Asp fra FN, som hadde vært kjent som et felles motiv i gjenkjennelsesstillingen for flere ekstracellulære matriksproteiner.

Eksempler på andre VLA-4-inhibitorer er blitt beskrevet f.eks. i den samtidig svevende US-patentsøknad 08/37 6.372. USSN 376,372 beskriver lineære peptidylforbindelser som inneholder p-aminosyrer som har celleadhesjonsinhiberende aktivitet. De internasjonale patentsøknader WO 94/15958 og WO 92/00995, beskriver cykliske peptid- og peptidomimetiske forbindelser med celleadhesjonsmodulerende aktivitet. De internasjonale patentsøknader WO 93/08823 og WO 92/08464 beskriver guanidinyl-, urea- og tiourea-holdige celleadhesjonsmodulerende forbindelser. US-patent nr. 5.260.277 beskriver guanidinyl-celleadhesjonsmodulasjonsforbindelser.

Til tross for disse fremskritt finnes det et fortsatt behov for spesifikke inhibitorer av VLA-4-avhengig celleadhesjon med lav molekylvekt som har forbedrede farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper såsom oral biotilgjengelighet og en betydelig virkningsvarighet. Slike forbindelser ville utgjøre nyttige midler for behandling, forandring, forebyggelse eller suppresjon av forskjellige patologier som medieres ved celleadhesjon og VLA-4-binding.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er inhibitorer av VLA-4-integrin og blokkerer dermed bindingen av VLA-4 til sine forskjellige ligander såsom VCAM-1 og regio-ner av fibronektin. Dermed er disse forbindelser nyttige ved inhibering av celleadhesjonsprosesser, omfattende celleaktivering, migrasjon, proliferasjon og differensiering. Disse forbindelser er nyttige for inhibering, forebyggelse og suppresjon av VLA-4-mediert celleadhesjon og patologier forbundet med denne adhesjon, såsom betennelse og immunreaksjoner, omfattende f.eks. multippel sklerose, asthma, allergisk rhinitt, allergisk konjunktivitt, inflammatoriske lungesykdommer, rheumatoid artritt, septisk artritt, type 1-diabetes, organtransplantasjon, restenose, autolog benmargtransplantasjon, inflammatoriske følge-sykdommer av virale infeksjoner, myokarditt, inflammatorisk tarmsykdom omfattende ulcerativ kolitt og Crohns sykdom, bestemte typer toksisk og immun-basert nefritt, dermal kontakt-hypersensitivitet, psoriasis, svulstmetastase, multippelt myeloma og aterosklerose. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske eller profylaktiske midler for å inhibere, endre, forebygge eller undertrykke celleadhesjon. Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske formuleringer som inneholder disse VLA-4-medierte celleadhesjonsinhi-bitorer, og anvendelse av forbindelsene ved fremstilling av sammensetninger for å inhibere celleadhesjon.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 beskriver luftveisresponsiviteten av sau etter behandling med oMePUPA-V. Sau, naturlig følsomme for Ascaris suum, ble behadlet med en aerosol av Ascaris suum-allergen 2 timer etter en aerosoladministrasjon av oMePUPA-V i den angitte dose eller en likeverdig mengde bærerstoff. Den pulmonære mekanikk ble målt på de angitte tidspunkter, og angis som endringen i den spesifikke luftveisresistens sammenlignet med grunnverdien før undersøkel-sen (venstre ruter). Luftveisresistensen mot inhalert karbachol ble bestemt før initieringen av undersøkelsen og 24 timer etter behandlingen med allergen (høyre ruter). Luftveisresponsiviteten angis som PC4oo~forholdet (mengden karbachol som er nødvendig for å heve resistensen med 400%) ved sammenligning av verdiene før og etter behandlingen. Fig. 2: Sau, naturlig følsomme for Ascaris suum, ble behandlet med en aerosoladministrasjon av oMePUPA-V i de angitte doser eller en aerosol av Ascaris suum. Endringen av luftveisresistensen ble målt etter aerosolbehandlingen, og toppen for den spesifikke lungeresistens (cm H20/sek) etter behandlingen ble behandlet med grunnverdiene. <*>=p<0,05 sammenlignet med PBS-kontrollen, énveis variansanalyse, fulgt av Dunnetts test for en multippel sammenligning med en kontrollgruppe. Angir en statistisk signifikant økning av toppen for den spesifikke lungeresistens sammenlignet med PBS-kontrollgruppen. Fig. 3: Sau, naturlig følsomme for Ascaris suum, ble behandlet med en aerosol av Ascaris suum-allegen 24 timer etter den fjerde daglige aerosoladministrasjon av oMePUPA-V (0,03 mg) eller en likeverdig mengde vehikkel (etanol:normalt salin 1:2, øvre rute; Tris:normalt salin 1:499, nedre rute). Den pulmonære mekanikk ble målt på de angitte tidspunkter og angis som endringen i den spesifikke luftveisresistens fra grunnverdien før undersøkelsen {venstre ruter). Luftveisresistensen mot inhalert karbachol ble bestemt før undersøkelsens initiering og 24 timer etter behandling med allergen (høyre ruter). Luftveisresponsiviteten angis som PC^oo-forholdet (mengden karbachol som er nødvendig for å heve resistensen med 400%) ved sammenligning av verdiene før og etter behandlingen. Fig. 4: Balb/c-mus, på forhånd sensitivisert for DNFB, ble behandlet ved påføring av DNFB på dorsalflaten av venstre øre, og bærermateriale på dorsalflaten av høyre øre. 24 timer senere ble ørenes tykkelse målt med et mikrometer. oMePUPA-V ble administrert i de angitte doser 4 timer etter behandlingen med DNFB. Positivkontrollforbindelse (+CTRL) ble gitt i en maksimalt virksom enteral dose. Verdiene er den midlere verdi ± standardavviket av den midlere verdi for 8 dyr. Den øvre rute viser den absolutte ørehevelse. Det nedre panel viser prosent inhibering av ørehevelsen sammenlignet med kontrollen med bærermateriale (VEH). Fig. 5: Analyse av konkurransen mellom oMePUPA-V og en kjent inhibitor under forskjellige aktiveringsbetingelser. Jurkatceller (1,5 x lOVml) i TBS plus 2 mM Mn<2+>, 1 mM Ca<2+ >plus 1 mM Mg<2+>, 1 mM Ca<2+> plus 10 mM Mg<2+>, 10 mM Mg<2+> eller 10 mM Mg<2+> plus 10 ug/ml TS2/16 ble behandlet med kun 5 nM <3>H-kjent inhibitor eller med 5 nM <3>H-kjent inhibitor plus 10 nM BI01591 i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter pelletisert ved sentrifugering, resuspendert i 100 ul TBS plus Mn<2+> og analysert ved scintillasjonstelling. Tellingene av celler som bindes under disse betingelser, måler integrinet som ikke er opptatt med testforbindelse og som derfor er fritt til å binde <3>H-kjent inhibitor.

DETALJERT BESKRIVELSE

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelser som har evnen til å inhibere VLA-4-mediert celleadhesjon ved å inhibere bindingen av ligander til denne receptor. Den foretrukne forbindelse er (R)- N- [[4-[[(2-metylfenylamino)-karbonyl]amino]fenyl]acetyl]-L-prolyl-3-metyl)-p-alanin, heri benevnt "oMePUPA-V", som representeres ved den føl-gende formel I:

Oppfinnelsen skal også omfatte farmasøytisk akseptable derivater, salter og estere av oMePUPA-V.

Forbindelser med formel I kan inneholde ett eller flere asymmetriske sentre, og kan dermed foreligge som racemiske blandinger, enkelte enantiomerer, diastereomere blandinger og enkelte diastereomerer. Foreliggende oppfinnelse skal omfatte alle slike isomere former av forbindelsen med formel I.

Oppfinnelsen som kreves beskyttet, skal også omfatte farma-søytisk akseptable salter av formel I. Begrepet "farmasøy-tisk akseptable salter" viser til salter som fremstilles av farmasøytisk akseptable ikke-toksiske baser eller syrer, omfattende uorganiske eller organiske baser og uorganiske eller organiske syrer. Salter avledet fra uorganiske baser omfatter aluminium-, ammonium-, kalsium-, kobber-, ferri-, ferro-, litium-, magnesium-, mangani-, mangano-, kalium-, natrium-, sink- og lignende salter. Spesielt foretrukne er ammonium-, kalsium-, magnesium-, kalium- og natriumsaltene.

Salter avledet fra farmasøytisk akseptable organiske ikke-toksiske baser omfatter salter av primære, sekundære og tertiære aminer, substituerte aminer omfattende naturlig forekommende substituerte aminer, cykliske aminer og basiske ionbytterharpikser, såsom arginin-, betain-, kof-fein-, kolin-, N,N"-dibenzyletylendiamin-, dietylamin-, 2-dietylaminoetanol-, 2-dimetylaminoetanol-, etanolamin-, etylendiamin-, N-etylmorfolin-, N-etylpiperidin-, gluk-amin-, glukosamin-, histidin-, hydrabamin-, isopropylarain-, lysin-, metylglukamin-, morfolin-, piperazin-, piperidin-, polyaminharpikser, prokain, puriner, teobromin, trietylamin, trimetylarain, tripropylamin, trometamin og lignende.

Når forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse er basisk, kan salter fremstilles fra farmasøytisk akseptable ikke-toksiske salter, omfattende uorganiske og organiske syrer. Slike syrer omfatter eddik-, benzensulfon-, benzo-, kamfer-sulfon-, sitron-, etansulfon-, fumar-, glukon-, glutam-, hydrobrom-, salt-, isetionin-, melke-, malein-, eple-, man-del-, metansulfon-, slim-, salpeter-, pamoin-, pentoten-, fosfor-, rav-, svovel-, vin-, p-toluensulfonsyre og lignende. Spesielt foretrukne er sitron-, hydrobrom-, salt-, malein-, fosfor-, svovel- og vinsyre.

I tillegg omfatter oppfinnelsen esterprodroger, hvor karboksylgruppen av (R)- N- [[4-[[(2-metylfenylamino)-karbonyl]amino]fenyl]acetyl]-L-prolyl-3-metyl)-p*-alanin er forestret med hvilken som helst alkohol. Foretrukne alkoholer er metanol, etanol, propanol, butanol eller rettkjedede eller forgrenede alkyl-Ci-io-alkoholer.

Evnen av forbindelsene med formel I til å antagonisere virkningene av VLA-4 gjør dem nyttige for forebyggelse, behandling eller reversering av symptomene, forstyrrelsene eller sykdommene som induseres av en binding av VLA-4 til sine ligander. Dermed vil disse antagonister inhibere cel-leadhes jonsprosesser omfattende celleaktivering, migrasjon, proliferasjon og differensiering. Slike sykdommer og forstyrrelser omfatter f.eks. asthma, multippel sklerose, allergisk rhinitt, allergisk konjunktivitt, inflammatoriske lungesykdommer, rheumatoid artritt, multippelt myeloma, septisk artritt, type I-diabetes, organtransplantatut-støtning, inflammatorisk tarmsykdom og annet.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan synteti-seres ved bruk av hvilken som helst konvensjonell teknikk, hvorav flere eksemplifiseres heri. Fortrinnsvis synteti-seres disse forbindelser kjemisk utfra lett tilgjengelige utgangsstoffer, såsom a-aminosyrer og deres funksjonelle ekvivalenter. Modulære og konvergerende metoder for syntese av disse forbindelser foretrekkes også. I en konvergerende fremgangsmåte bringes f.eks. store partier av sluttproduktet sammen i de siste trinn av syntesen, heller enn ved en inkrementell tilføyelse av små stykker til en voksende molekylkjede.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også modifiseres ved å tilføye egnede funksjonaliteter for å forsterke selektive biologiske egenskaper. Slike modifika-sjoner er kjent innen faget, og omfatter slike som hever den biologiske penetrasjon inn i et gitt biologisk system (f.eks. blod, lymfesystem, sentralt nervesystem), hever den orale tilgjengelighet, hever løseligheten for å muliggjøre en administrasjon ved injeksjon, endrer metabolismen og endrer utsondringshastigheten. Eksempler på disse modifika-sjoner omfatter, men er ikke begrenset til, forestring med polyetylenglykoler, derivatisering med pivolater eller fettsyresubstituenter, omdannelse til karbamater, hydroksy-lasjon av aromatiske ringer og heteroatom-substitusjon i aromatiske ringer.

Anvendt i foreliggende beskrivelse viser begrepet "pasient" til pattedyr, også mennesker. Begrepet "celle" viser til hvilken som helst celle, fortrinnsvis pattedyrceller, også menneskeceller.

Når de endelig er blitt syntetisert, kan aktiviteten og VLA-4-spesifisiteten av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse bestemmes ved bruk av in vitro- og in vivo-assayer.

F.eks. kan den celleadhesjonsinhiberende aktivitet av disse forbindelser måles ved å bestemme konsentrasjonen av inhibitor som er nødvendig for å blokkere bindingen av VLA-4-uttrykkende celler til fibronektin- eller CS-l-bestrøkne plater. I denne type assay bestrykes mikrotiterbrønner med enten fibronektin (som inneholder CS-l-sekvensen) eller med CS-1. Hvis CS-1 brukes, må dette konjugeres med et bærer-protein, såsom bovint serumalbumin, for å bindes til brøn-nene. Når brønnene er blitt bestrøket, settes deretter forskjellige konsentrasjoner av testforbindelsen til sammen med egnet merkede VLA-4-uttrykkende celler. Alternativt kan testforbindelsen settes til først og få inkubere med de bestrøkne brønner før tilsetningen av cellene. Cellene får inkubere i brønnene i minst 30 minutter. Etter inkubasjonen tømmes og vaskes brønnene. Inhiberingen av bindingen måles ved å kvantifisere fluorescensen eller radioaktiviteten som er bundet til platen for hver av de forskjellige konsentrasjoner av testforbindelse, samt for kontroller som ikke inneholder noen testforbindelse.

VLA-4-uttrykkende celler som kan brukes i dette assay, omfatter Ramos-celler, Jurkat-celler, A375-melanomaceller samt humane perifere blodlymfocytter (PBL'er). Cellene som brukes i dette assay, kan merkes på hvilken som helst egnet måte, f.eks. med fluorescens eller radioaktivitet.

Et direktebindingsassay kan også anvendes for å kvantifisere den inhibitoriske aktivitet av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse. I dette assay konjugeres et VCAM/IgG-fusjonsprotein som inneholder de første to immuno-globulindomener av VCAM (D1D2) bundet over hengselpartiet av et IgGl-molekyl ("VCAM 2D-IgG"), med et markørenzym såsom alkalifosfatase ("AP"). Syntesen av dette VCAM/IgG-fusjonsprotein beskrives i PCT-publikasjonen WO 90/13300. Konjugeringen av dette fusjonsprodukt med et markørenzym oppnås ved fornetningsmetoder som er velkjent innen faget. VCAM/IgG-enzymkonjugatet plasseres deretter i brønnene av en fler-brønners filterplate, såsom hva som foreligger i Millipore Multiscreen Assay System (Millipore Corp., Bed-ford, MA). Forskjellige konsentrasjoner av test-inhibe-ringsforbindelsen settes deretter til brønnene, fulgt av en tilsetning av VLA-4-uttrykkende celler. Cellene, forbindelsen og VCAM/IgG-enzymkonjugatet blandes sammen og får inkubere ved romtemperatur.

Etter inkubasjonen vakuumtømmes brønnene, hvorved cellene og ethvert bundet VCAM etterlates. En kvantifisering av det bundne VCAM bestemmes ved å tilsette et egnet kolorimetrisk substrat for enzymet konjugert med VCAM-IgG, og å bestemme mengden av reaksjonsprodukt. En nedsatt mengde reaksjonsprodukt tyder på en hevet bindingsinhiberende aktivitet. Protokollen for bestemte assayer beskrives i det følgende: For å bestemme den VLA-4-inhibitoriske spesifisitet av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, utføres assayer for andre hovedgrupper av integriner, dvs. p2 og p3, samt andre pl-integriner såsom VLA-5, VLA-6 og a4P7. Disse assayer kan være lignende som adhesjonsinhibisjons- og direktebindingsassayene beskrevet ovenfor, ved bruk av den egnede integrin-uttrykkende celle og tilsvarende ligand. F.eks. uttrykker polymorfonukleære celler (PMN'er) p2-integriner på sin overflate og bindes til ICAM. p3-integriner er omfattet i blodplateaggregasjonen, og en inhibering kan måles i et standard blodplateaggregasjonsassay. VLA-5 bindes spesifikt til Arg-Gly-Asp-sekvenser, mens VLA-6 bindes til laminin. a4P7 er en nylig oppdaget homolog av VLA-4 som også binder fibronektin og VCAM. Spesifisitet med hensyn til a4P7 bestemmes i et bindingsassay som benytter seg av det ovenfor beskrevne VCAM/IgG-enzymmarkørkonjugat og en cellelinje som uttrykker ct4p7 men ikke VLA-4, såsom RPMI-8866 eller JY-celler.

^å-r—V-LA=4=spes-i-f-i-k-ke-,i-nh-i-b-i-torer er blitt identifisert, kan de karakteriseres ytterligere i in vivo-assayer. Ett slikt

assay tester inhiberingen av kontakt-hypersensitivitet i et dyr, som beskrevet av P.L. Chisholm et al., "Monoclonal Antibodies to the Integrin a-4 Subunit Inhibit the Murine Contact Hypersensitivity Response", Eur. J. Immunol., 23, s. 682-688 (1993) og i "Current Protocols in Immunology", J.E. Coligan et al., utg., John Wiley & Sons, NY, 1, s. 4.2.1-4.2.5 (1991). I dette assay gjøres dyrets hud følsom ved å utsette den for et irriterende middel, såsom dinitro-fluorbenzen, fulgt av en lett fysisk irritasjon, såsom å

skrape huden lett med en skarp kant. Etter en bedringsperi-ode gjen-sensitiviseres dyrene ved den samme prosess. Flere dager etter sensitiviseringen utsettes ett øre av dyret for det kjemiske irritasjonsmiddel mens det andre øre behandles med en ikke-irriterende kontrolloppløsning. Kort tid etter

behandling av ørene får dyrene forskjellige doser av VLA-4-inhibitoren ved subkutan injeksjon. In vivo-inhiberingen av celleadhesjonsassosiert betennelse bedømmes ved å måle ørehevelsesresponsen av dyret i det behandlede øre sammenlignet med det ubehandlede. Hevelsen måles ved bruk av krumpasser eller et annet egnet instrument for å måle ørets tykkelse. På denne måte kan man identifisere inhibitorene ifølge foreliggende oppfinnelse som er best egnet for å inhibere betennelse.

Et annet in vivo-assay som kan brukes for å teste inhibitorene ifølge foreliggende oppfinnelse, er saueasthma-assay-et. Dette assay utføres i det vesentlige som beskrevet i W.M. Abraham et al., "<x4-Integrins Mediate Antigen-induced Late Bronchial Responses and Prologed Airway Hyperrespon-siveness in Sheep", J. Clin. Invest., 93, s. 776-787

(1994). Dette assay måler inhiberingen av Ascaris-antigen-induserte sen fase-luftveisresponser og luftveis-hyperresponsiviteten i allergiske sau. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også testes i et blodplate-aggregas j onsassay .

VLA-4-inhibitorene ifølge oppfinnelsen har vist en overraskende gunstig aktivitet og selektivitet. Generelt er disse forbindelser selektive for VLA-4 (>1000 ganger høyere enn for <x407 og a5fil), negative i rutinemessige PanLabs og ikke-GLP Ames-assayer, rene i standard ancillære farmakolo-gitester og virksomme i sauemodellen etter en 1-gang-daglig dosering ved en forutsagt bruksnivå i mennesker på 1 mg/dag eller mindre.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har en overraskende over-legen potens sammenlignet med strukturelt beslektede VLA-4-inhibitorer. F.eks. i Ascaris- f.ølsomme sauer som ble behandlet én gang daglig i fire dager med forstøvet droge ved 0,1 mg/kg og deretter ble behandlet med antigen 24 timer etter den siste dose, svekket tidligere testede forbindelser vesentlig den tidlige respons og blokkerte sen fase-bronkokonstriksjon og utviklingen av ikke-spesifikk hyperresponsivitet. Hvis man antar en bioekvivalens i mennesker, vil en samlet dose på 7 mg være nødvendig for en person med 70 kg kroppsvekt. Videre ble drogene administrert til sauene via et endotrakealt rør med avsettelses-forhold som antas å være 2 ganger høyere enn hva som vanligvis oppnås hos mennesker med orale inhalasjonsanordnin-ger. I tillegg er det sannsynlig at det vil måtte settes til eksipienser til den endelige faste formulering for å optimere anordningens oppfylling og legemiddelleveringen. Disse faktorer antyder et mulig dosekrav for mennesker på 14 mg eller mer, hvilket overskrider den tekniske begrensning på 1-5 mg som kan leveres ved én aktivering fra en tørrpulverinhalasjonsanordning (DPI). Selv om den nødvendige dose kunne leveres ved flere aktiveringer av DPI-anordningen, ville dette representere en kompetitiv ufordelaktighet i asthmamarkedet, hvor de typiske inhalerte steroiddoser er 0,2-1,0 mg.

oMePUPA-V svekket den tidlige respons, blokkerte senfase-bronkokonstriksjon og normaliserte hyperresponsiviteten ved en minste dose på 0,003 mg/kg når dette ble administrert som én enkelt forstøvet dose 2 timer før antigenbehandlin-gen. Videre gir en daglig dose på 0,001 mg/kg i 4 dager med

en antigenbehandling 24 timer etter den siste dose, en mak-simal respons. Dermed er oMePUPA-V 30 til 100 ganger mer potent enn tidligere kjente forbindelser, med dosenivåer i området for de beste markedsførte inhalasjonssteroider. oMePUPA-V samt det nesttidligere syntetiske mellomprodukt er høyt krystallint (jfr. fig. 1, tabell 1).

I tillegg har oMePUPA-V en forbedret metabolsk profil sammenlignet med kjente VLA-4-inhibitorforbindelser. F.eks. etter en aerosoladministrasjon, ble forbindelsene ifølge oppfinnelsen raskt omdannet til en mindre aktiv metabolitt, som var det overveiende produkt som ble isolert fra brono-alveolar lavage-væske (BALF), og var også det overveiende produkt som ble observert i den systemiske sirkulasjon, hvor det oppviste en lengre plasma-halveringstid enn moder-forbindelsen. Mens en rask metabolsk omdannelse til mindre aktive forbindelser er en nyttig strategi for å oppnå en nedsatt systemisk utsettelse, presenterer forbindelser som metaboliseres til biprodukter med liten eller manglende egenaktivitet, færre kompleksiteter i utviklingen, og foretrekkes fra et backup-perspektiv.

De potensielle proteolytiske produkter av oMePUPA-V var inaktive i VLA-4-bindingsassayer, slik at en proteolyse ville generere inaktive produkter uansett. I in vitro-meta-bolismeundersøkelser og i in vivo-PK-undersøkelser på rotte, hund og sau, viste seg imidlertid oMePUPA-V å være proteolytisk stabilt.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres til farmasøytiske sammensetninger som kan administreres oralt, parenteralt, ved inhalasjonsspray, topisk, rektalt, nasalt, bukkalt, vaginalt eller via en implantert beholder. Begrepet "parenteralt" som anvendt heri omfatter subkutane, intravenøse, intramuskulære, intraartikulære, intrasyno-viale, intrasternale, intratekale, intrahepatiske, intra-lesjonale og intrakraniale injeksjons- eller infusjonstek-nikker.

De farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte hvilken som helst av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse eller farmasøytisk akseptable derivater derav sammen med hvilken som helst farma-søytisk akseptabel bærer. Begrepet "bærer" som anvendt heri omfatter akseptable adjuvanser og vehikler. Farmasøytisk akseptable bærere som kan brukes i de farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter, men er ikke begrenset til, ionbyttere, alumina, aluminiumstearat, lecitin, serumproteiner såsom humant serumalbumin, buffer-substanser såsom fosfater, glycin, "sorbic acid", kalium-sorbat, partielle glyceridblandinger av mettede vegetabil-ske fettsyrer, vann, salter eller elektrolytter såsom pro-taminsulfat, dinatriumhydrogenfosfat, kaliumhydrogenfosfat, natriumklorid, sinksalter, kolloidalt silika, magnesium-trisilikat, polyvinylpyrrolidon, cellulosebaserte substan-ser, polyetylenglykol, natriumkarboksymetylcellulose, poly-akrylater, vokser, polyetylen/polyoksypropylen-blokkpoly-merer, polyetylenglykol og ullfett.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan de farmasøytiske sammensetninger foreligge i form av et sterilt injiserbart preparat, f.eks. en steril injiserbar vann- eller olje-basert suspensjon. Suspensjonen kan formuleres ifølge teknikker som er kjent innen faget, ved bruk av egnede disper-sjons- eller fuktemidler og suspensjonsmidler. Det sterile injiserbare preparat kan også være en steril injiserbar oppløsning eller suspensjon i et ikke-toksisk parenteralt akseptabelt fortynnings- eller løsemiddel, f.eks. som en oppløsning i 1,3-butandiol. Blant de akseptable vehikler og løsemidler som kan brukes, er vann. Ringers oppløsning og isotonisk natriumkloridoppløsning. I tillegg brukes sterile, fete oljer konvensjonelt som løsemiddel eller suspen-sjonsmedium. Med denne hensikt kan hvilken som helst mild fet olje brukes, omfattende syntetiske mono- eller diglyce-rider. Fettsyrer såsom oleinsyre og dens glyceridderivater er nyttige ved fremstilling av injiserbare preparater, slik som også naturlige farmasøytisk akseptable oljer såsom oli-venolje eller ricinusolje, spesielt i deres polyoksyety-lerte versjoner. Disse oljeoppløsninger eller -suspensjoner kan også inneholde en langkjedet alkohol som fortynnings-eller dispergeringsmiddel.

De farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres oralt i hvilken som helst oralt akseptabel doseringsform, omfattende, men ikke begrenset til, kapsler, tabletter, vandige suspensjoner eller oppløs-ninger. I tilfellet av tabletter for oral bruk omfatter bærere som er vanlige å bruke, laktose og maisstivelse. Smøremidler, såsom magnesiumstearat, settes vanligvis også til. For en oral administrasjon i kapselform omfatter nyttige tynningsmidler laktose og tørket maisstivelse. Når vandige suspensjoner er ønsket for en oral anvendelse, kombineres den aktive ingrediens med emulgerings- og suspensjonsmidler. Om ønsket kan også bestemte søtstoffer, smaks-stoffer eller fargestoffer settes til.

Alternativt kan de farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen administreres i form av suppositorier for en rektal administrasjon. Disse kan fremstilles ved å blande midlet med en egnet ikke-irriterende eksipiens som er fast ved romtemperatur men flytende ved rektal temperatur og som derfor vil smelte i rektum for å frigi legemidlet. Slike stoffer omfatter kakaosmør, bivoks og polyetylenglykoler.

De farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan også administreres topisk, spesielt når målet for behandlingen omfatter områder eller organer som er lett tilgjengelige ved en topisk påføring, omfattende f.eks. sykdommer i øyet, på huden eller de lavere tarmveier. Egnede topiske formuleringer kan lett fremstilles for hvert av disse områder eller organer.

En topisk påføring for de lavere tarmveier kan utføres i en rektal suppositorieformulering (se ovenfor) eller i en egnet klysterformulering. Topisk-transdermale plastere kan også brukes.

For en topisk anvendelse kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres i en egnet salve som inneholder den aktive komponent suspendert eller oppløst i én eller flere bærere. Bærere for en topisk administrasjon av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, mineralolje, flytende vaselin, hvit vaselin, propylen-glykol, polyoksyetylen, polyoksypropylenforbindelse, emul-geringsvoks og vann. Alternativt kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres i en egnet losjon eller krem som inneholder de aktive komponenter suspendert eller løst opp i én eller flere farmasøytisk akseptable bærere. Egnede bærere omfatter, men er ikke begrenset til, mineralolje, sorbitanmonostearat, polysorbat 60, cetylestervoks, cete-arylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol og vann.

For oftalmisk bruk kan de farmasøytiske sammensetninger formuleres som forstøvede suspensjoner i isotonisk, pH-justert sterilt salin, eller fortrinnsvis som oppløsninger i isotonisk, pH-justert sterilt salin, enten med eller uten et konserveringsmiddel såsom benzylalkoniumklorid. Alternativt kan for oftalmisk bruk, de farmasøytiske sammensetninger formuleres i en salve såsom vaselin.

De farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan også administreres ved nasal aerosol eller inhalasjon ved bruk av en forstøver, en tørrpulverinhalator eller en inhalator med oppmålte doser. Slike sammensetninger fremstilles ifølge teknikker som er velkjent innen faget farmasøytisk formulering, og kan fremstilles som opp-løsninger i salin, ved bruk av benzylalkohol eller andre egnede konserveringsmidler, absorpsjonsfremmere for å bedre biotilgjengeligheten, fluorkarboner og/eller andre konven-sjonelle solubiliserings- eller dispersjonsmidler. I tillegg kan sammensetningene ifølge oppfinnelsen omfatte hvilke som helst farmasøytisk akseptable bærere, såsom f.eks. laktose for tørrpulverformuleringer.

Mengden av aktiv ingrediens som kan kombineres med bærer-materialene for å danne en enkeltdoseringsform, vil variere avhengig av verten som skal behandles, og den bestemte administrasjonsmåte. Det bør imidlertid forstås at en bestemt dosering og behandlingskur for en bestemt pasient vil avhenge av forskjellige faktorer, omfattende aktiviteten av den bestemte forbindelse som brukes, alderen, kroppsvekten, den generelle helsetilstand, kjønnet, kost-holdet, administrasjonstidspunktet, utsondringshastigheten, legemiddelkombinasjoner og skjønnet til den behandlende lege og alvoret av den bestemte sykdom som skal behandles. Mengden av aktiv ingrediens kan også avhenge av et eventuelt terapeutisk eller profylaktisk middel som ingrediensen skal administreres sammen med.

Doseringen og dosehyppigheten av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som virksomt forebygger, undertrykker eller inhiberer celleadhesjon, vil variere avhengig av forskjellige faktorer, såsom naturen av inhibitoren, størrel-sen av pasienten, behandlingens mål, naturen av patologien som skal behandles, den bestemte farmasøytiske sammensetning som brukes og den behandlende leges skjønn. Doserings-nivåer fra 0,001 til 100 mg/kg kroppsvekt pr. dag, fortrinnsvis mellom 0,01 og 50 mg/kg og mer foretrukket ca. 10 mg/kg kroppsvekt pr. dag av den aktive ingrediensforbin-delse er nyttige.

For bruk når en sammensetning for intravenøs administrasjon anvendes, er et egnet doseringsområde fra 0,001 mg til ca.

25 mg/kg, mer foretrukket fra 0,01 mg til 1 mg/kg.

Ifølge en annen utførelse kan sammensetninger som inneholder en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, også omfatte et ytterligere middel valgt fra gruppen omfattende kortikosteroider, bronkodilatorer, antiasthmatiske midler (mastcellestabilisatorer), antiinflammatoriske midler, antirheumatiske midler, immunosuppressive midler, antimetabolitter, immunomodulatorer, antipsoriatiske midler og antidiabetiske midler. Bestemte forbindelser innen hver av disse klasser kan velges fra hvilken som helst av dem som står oppført under den egnede gruppeoverskrift i "Compre-hensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, Eng-land, s. 970-986 (1990). Også omfattet i denne gruppe er forbindelser såsom teofyllin, sulfasalazin og aminosalicylater (antiinflammatoriske midler); cyklosporin, FK-506 og rapamycin (immunosuppressive midler); cyklofosfamid og metotreksat (antimetabolitter); steroider (inhalert, oralt eller topisk) og interferoner (immunomodulatorer) . Videre kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen administreres sammen med ytterligere celleadhesjonsinhibi-torer. Når det administreres ett eller flere ytterligere midler i kombinasjon med VLA-4-inhibitoren ifølge oppfinnelsen, kan de aktive ingredienser formuleres sammen eller alternativt administreres sammen. Administrasjon av ett eller flere aktive midler i kombinasjon med VLA-4-inhibitorene ifølge oppfinnelsen kan foregå i det vesentlige simultant eller sekvensielt. Personer med kunnskaper innen faget kan lett bestemme den mest egnede anvendelse avhengig av midlene som skal leveres, de ønskede resultater, pasienten og tilstanden som skal behandles.

VLA-4-assosiert celleadhesjon spiller en viktig rolle i diverse betennelses-, immun- og autoimmunsykdommer. Dermed kan inhiberingen av celleadhesjon ved hjelp av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes i fremgangsmåter ved behandling eller forebyggelse av betennelses-, immun- og autoimmunsykdommer. Fortrinnsvis velges sykdommene som skal behandles fra asthma, artritt, psoriasis, transplantatutstøtning, multippel sklerose, diabetes og inflammatorisk tarmsykdom.

Disse fremgangsmåter kan benytte seg av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse i en monoterapi eller i kombinasjon med et antiinflammatorisk eller immunosuppres-sivt middel. Slike kombinasjonsterapier omfatter en administrasjon av midlene i én enkelt doseringsform eller i flere doseringsformer som administreres samtidig eller til forskjellige tidspunkter.

EKSEMPLER

Eksempel 1 Fremstilling av oMePUPA- V

oMePUPA-V, (R)- N- [[4-[[(2-metylfenylamino)karbonyl]amino]-fenyl]acetyl]-L-prolyl-3-metyl)-p-alanin, ble fremstilt i en konvergerende syntese fra kommersielt fremstilt suksinimidyl-Boc-(L)-prolin (Boc-Pro-OSu; Bachem) og (R)-benzyl-3-aminobutyrathemisulfat (Celgene Corp.). Kobling av utgangsmaterialene i CH2CI2, i nærvær av Et3N, fulgt av en hydrolyse av Boc-gruppen med 4 N HC1 i dioksan, gav HC1-saltet, som ble omkrystallisert fra CH2Cl2/Et20. Kobling av HCl-saltet med suksinimidyl-2-[4-[2-(metylfenylaminokarbo-nyl) ] aminof enylacetat (MPUPA-OSu), fremstilt fra den tilsvarende syre, MPUPA-OH (Ricerca, Inc.), gav krystallin oMePUPA-V-benzylester, som ble katalytisk hydrogenert (10% Pd/C) i THF/H2O (9:1) for å gi oMePUPA-V. Sluttproduktet ble erholdt i form av et hvitt fast stoff etter omkrystallisasjon fra 20% vandig aceton.

Sammenfatning av de fysiske egenskaper

Kjemisk benevnelse: (R)-W-[[4-[[(2-metylfenylamino)karbonyl] amino]fenyl]acetyl]-L-prolyl-3-metyl)-b-alanin

Empirisk formel: C25H309N4O5

Molekylvekt: 466,53

Utseende: Rent hvitt pulver

Smeltepunkt: 153,6-154,4°C

Syntese av oMePUPA- V

Den syntetiske kjemi som ble brukt for å fremstille oMePUPA-V, er avbildet på skjema 1 og 2. Utgangsstoffene ble erholdt fra kommersielle kilder og kontraktprodusenter: (1) ble fremstilt i stor skala av Ricerca, Inc., Painesville, OH; (3) ble erholdt fra Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA, og (4) fra Celgene Corp., Warren, NJ.

Fremstilling av oMePUPA- V

Generelle analytiske metoder (<1>H-NMR, <13>C-NMR, MS, IR og

HPLC)

<1>H-NMR ble utført enten på et Bruker AC 300- eller på et Varian 500- eller et Varian 600-instument, og prøvene ble ført i enten DMSO-d6 og henvises til som DMSO-de (d 2,4 9 ppm), eller i CDC13 og henvises til som rest-CDCl3 (d 7,24 ppm) .

<13>C-NMR ble utført enten på et Varian 500- eller et Varian 600-instrument, og prøvene ble ført i enten DMSO-d6 og henvises til som DMSO-de (d 40,5 ppm), eller i CDC13 og henvises til som CHCI3 {d 77,0 ppm).

Massespektrene ble utført på et Fisons VG Platform LC-MS-DS Mass Spectrometer System med en Hewlett Packard Model 1500 AutoSampler, og dataen ble behandlet ved bruk av en Fisons VG MassLynx Mass Spectrometer Workstation. HRMS-arbeidet ble utført ved M-Scan (PA) ved bruk av Fast Atom Bombard-ment på et VG Analytical ZAB 2SE high field-massespektro-meter under henvisning til S0P# MS-002, MS-006, MS-012 og MS-023. En cesium-ionpistol ble brukt for å generere ioner for de erholdte massespektra, som ble registrert ved bruk av et PDP-ll-250J-datasystem.

IR-spektra ble utført på et Perkin Eimer 1600 Series FTIR.

Analytisk HPLC-kromatografi ble utført som følger:

1. Kromatogrammer ved bruk av Program 1 (ekvilibrer ved 20% B, injiser prøve, 20% B (1 min.), 20%-70% B (24 min.), 70%-100% B (17 min.)) ble erholdt ved bruk av et Perkin Eimer Series 200 HPLC autosampler-system med en Perkin Eimer 785A UV-detektor (innstilt til 214 nm) og en Applied Biosystems 783A UV-detektor (innstilt til 254 nm) med en PE

Nelson 1020-integrator. Kun areale-prosentverdiene ble rap-portert. 2. Kromatogrammer ved bruk av Program 8 (ekvilibrer ved 15% B, injiser prøve, 15% B (1 min.), 15%-40% B (25 min.), 40% B (10 min.)) ble erholdt ved bruk av et Applied Biosystems 400 Solvent Delivery System med en 783A bølge-lengde-UV-detektor ved bruk av en Waters 717-autosampler. Dataen ble behandlet ved bruk av en Hewlett Packard 3396 Series II-integrator. Integratoren var innstilt med de føl-gende parametre: Svekkelse = 8, Terskel = 5, Arealeutstøt-ning = 10.000, Toppbredde = 0,04; Karthastighet = 0,2.

Alt HPLC-arbeide ble utført ved bruk av en Vydac C-18-kolonne (5 m porestørrelse, 4,5 mm x 25 cm, katalog-nr. 218TP54).

Løsemiddel A: (vann + 0,1% TFA)

Løsemiddel B: (acetonitril + 0,1% TFA)

Strømningshastighet = 1 ml/min

Gradientprogrammene er som følger:

Program 1: ekvilibrer ved 20% B, injiser prøve, 20% B (2 min.), 20%-70% B (25 min.), 100% B (5 min.).

Fysikalsk data for [ 4-[[[( 2- metylfenyl) amino] karbonyl]-amino] fenyl] eddiksyre ( 1, MPUPA- OH; materiale fremstilt av Ricerca Inc.)

Smp. 210-215°C (spaltning);

IR (KBr) 3295 (br.bånd), 3034 (br.bånd), 1707, 1637, 1603, 1551, 1516, 1457, 1414, 1302, 1241, 1189, 1118 cm"<1>;

<X>H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) : d 12,28 (bs, 1 H) , 9,0 (S, 1 H) , 7,91 (s, 1 H), 7,88 (d, J=7,8 Hz, 1 H), 7,43 (d, J«8,4 Hz, 2 H), 7,19 (d, J=8,4 Hz, 2 H), 7,16 (m, 2H), 6,94 (dd, J=7,8 og 8,4 Hz, 1 H), 3,51 (s, 2 H), 2,25 (s, 3 H); <13>C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) : d 173,0 (C) , 152,7 (C), 138,5

(C), 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 128,3 (CH), 127,5 (CH), 126,2 (CH), 122,7 (CH) , 121,0 (CH) , 118,1 (CH) , 40,1

<CH2), 17,9 (CH3);

MS (EI): m/z 285 (M+l)<+> 193, 152, 134, 132, 109, 108, 106, 93, 91, 57;

Analytisk beregnet for Ci6Hi6N203: C 67,59; H 5,67; N 9,85; Funnet: C 67,60; H 5,70; N 10,01.

Fremstilling av suksinimidyl-[ 4-[[[( 2- metylfenyl) amino] karbonyl] amino] fenyl] acetat ( 2, MPUPA- OSu)

Til en suspensjon under tilbakeløp av o-metylfenylurea-fenyleddiksyre (1, MPUPA-OH; 150 g; 0,501 mol; fra Ricerca, Inc.) i acetonitril (600 ml) satte man tionylklorid (41 ml; 0,558 mol) i løpet av 10 minutter under kraftig omrøring. Store mengder HC1 dannedes. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur under kontinuerlig omrøring i 1,5 h. Reaksjonsblandingen ble til en lyserød oppslemming, til hvilken man satte fast N-hydroksysuksinimid (HOSu; 75,5 g; 0,636 mol) i én porsjon. Til denne blanding satte man drå-pevis trietylamin (174 ml) i løpet av 30 minutter mens tem-peraturen av reaksjonsblandingen ble holdt under 60°C med et vannbad. Omrøringen ble fortsatt i 2 timer, og deretter ble destillert vann (500 ml) satt til reaksjonsblandingen. Det faste stoff ble filtrert og vasket med 2 1 destillert vann og med acetonitril (2 x 200 ml), lufttørket og ytterligere tørket over P2O5 under vakuum (ca. 0,1 mmHg) for å gi et råprodukt (175 g; 97% utbytte) i form av et beige pulver. Råproduktet (174 g) ble omkrystallisert fra acetonitril (3,5 1) med avfarging med trekull (10 g) for å gi 129 g MPUPA-OSu (2; 68% utbytte) i form av et hvitt pulver (renhet >99%).

Smp. 211,2-211,8°C;

IR (KBr): 3905-3203 (br.bånd), 1816, 1783, 1654, 1368, 1304, 1244, 1116, 1021 cm"<1>;

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : d 9,04 (s, 1 H) , 7,92 (s, 1 H) , 7,82 (d, 1 H), 7,44 (d, J=8,5 Hz, 2 H), 7,24 (d, J=8,5 Hz, 2 H), 7,15 (m, 2 H), 6,93 (dd, J=7,4 og 7,3 Hz, 1 H), 4,02

(s, 2 H), 2,80 (s, 4 H), 2,23 {s, 3 H) ;

MS (EI, ES+) : m/z 382 [<M+1)<+>], 239, 108, 106.

Fysikalsk data for suksinimidyl- Boc-( L)- prolin ( Boc- Pro-OSu, 3; materiale ervervet fra Bachem Bioscience)

Smp. 132-136°C;

IR (KBr) 3456, 2940, 1731, 1619, 1561, 1541, 1497, 1454, 1395, 1337, 1259, 1202, 1118, 1060 cm"<1>;

<1>H-NMR (300 MHz, CDC13) : d 4,51 (dd, J=3,8 og 8,7 Hz, 1 H), 3,56 (m, 1 H), 3,44 (m, 1 H), 2,80 (s, 4 H), 2,32 (m, 1H), 2,27 (m, 1H), 1,94 (m, 2H), 1,43 (s, 9H);

MS (EI): m/z 335 (M+N2)<+>, 279, 213, 138, 114, 86;

HPLC 97,1%.

Fysikalsk data for benzyl-( R )- 3- aminobutyrathemisulfat ( 4; materiale ervervet fra Celgene Corp.)

Smp. 249,4-249,8°C;

IR (KBr) 3515, 3383, 2989, 2945, 2880, 1821, 1788, 1744, 1701, 1476, 1454, 1421, 1394, 1368, 1260, 1241, 1202, 1159, 1077 cm"<1>;

<X>H-NMR (300 MHz, CDC13) : d 7,85 (bs, 2 H), 7,26 (s, 5 H), 5,06 (ABq, J=12,3 Hz, 2 H) , 4,35 (m, 2 H) , 3,73 (m, 1 H) , 2,92 (dd, J=6,4 og 17,1 Hz, 1 H), 2,66 (dd, J=6,4 og 17,0 Hz, 1 H) , 1,35 (d, J=6,5 Hz, 3 H) ;

MS (EI): m/z 195 (M+3)<+>, 194 (M+2)<+>, 106, 92, 91;

HPLC 99,0%.

Fremstilling av N -( tert- butoksykarbonyl)- L- prolyl- 3- metyl-( R )- p- alaninbenzylester ( 5)

Til en godt omrørt suspensjon av benzyl-i?-3-aminobutyrathemisulfat (4; 66,7 g; 213 mmol) i CH2C12 (200 ml) satte man Boe-(L)-Pro-OSu (3; 53,9 g; 222 mmol) og Et3N (95 ml; 681 mmol). Reaksjonsblandingen fikk omrøres ved romtemperatur i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble fordelt mellom EtOAc (1,5 1) og H20 (250 ml), og det organiske sjikt ble vasket med 10% sitronsyre (3 x 250 ml), H20 (250 ml), mettet natriumbikarbonat (250 ml), H20 (250 ml) og saltvann (3 x 250 ml), tørket over Na2S04 og inndampet først på en rotasjonsfordamper (40°C, -80 mmHg) og deretter under høyvakuum (romtemperatur; 16 h; 0,2 mmHg) for å gi mellomproduktet 5 i form av en viskøs olje (88,1 g) som inneholdt en rest av EtOAc og CH2C12 (ifølge NMR) og som oppviste en renhet på

>98% (HPLC). Dette materiale ble brukt uten ytterligere rensing i den følgende reaksjon.

<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3) : d 7,30 (rn, 5 H) , 6,44 (bs, 1 H) , 5,10 (dd, J=12,3 og 14,1 Hz, 2 H), 4,32 (m, 1H), 4,13 (m, 1H), 3,34 (bs, 2 H), 2,48 (d, J=5,l Hz, 2 H), 2,1 (m, 2 H), 1,75 (bs, 2 H), 1,40 (s, 9H), 1,17 (d, J=6,0 Hz, 3 H);

MS (EI): m/z 413 [M+Na]<+>, 313, 291, 191, 194, 165, 91.

Fremstilling av L- prolyl- 3- metyl-{ R )- p- alaninbenzylester-hydroklorid ( 6)

Til mellomprodukt 5 fra den forrige reaksjon satte man gradvis en oppløsning av 4 N HC1 i dioksan (240 ml). En kraftig dannelse av gass fulgte (forsiktig: eksoterm) . Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur (2 h) og ble deretter inndampet først i en rotasjonsfordamper (45°C; -80 mmHg) og deretter under høyvakuum over natten (romtemperatur; 14 h; -0,2 mmHg) for å gi et ekstremt viskøst materiale, som ble krystallisert fra CH2C12/Et20 (600 ml/700 ml) for å gi 64,0 g (92% samlet utbytte for to trinn) av HCl-saltet 6 i form av et hvitt fast stoff (HPLC: renhet 99,6%) .

Smp. 119,8-120,5°C;

IR (KBr); 3217, 3072, 2904, 2756, 1736, 1681, 1560, 1446, 1387, 1352, 1295, 1244, 1178, 1096 cm"<1>;

<X>H-NMR (500 MHz, CDCI3) : d 10,21 (bs, 1 H), 8,71 (d, J=8,0 Hz, 1 H), 7,77 (bs, 1 H), 7,24 (m, 5 H), 5,00 (s, 2 H), 4,52 (bs, 1 H), 4,22 (tilsynelatende t, J=6,5 Hz, 1 H), 3,33 (bs, 2 H) , 2,67 (dd, J=5,5 og 15,5 Hz, 1 H), 2,44 (m, 2 H), 1,89 (m, 3 H) , 1,15 (d, J^=6,5 Hz, 3 H) ;

<13>C-NMR (125 MHz, CDC13) : d 171,03 (C=0) , 167,67 (C=0) , 135,58 (C), 128,43 (CH), 128,13 (CH), 128,06 (CH), 66,34 (CH2), 59,71 (CH) , 46,55 (CH2) , 43, 34 (CH), 40, 42 (CH2) , 30,50 (CH2), 24,23 (CH2) , 19,92 (CH3) ;

MS (EI): m/z 291 [M-C1]<+>, 199, 194, 160, 139, 92, 91; Analytisk beregnet for Ci6H23N203Cl: C 58,80; H 7,094; N 8,57; Funnet: C 58,95; H 6,99; N 8,46.

Fremstilling av N-[[ 4-[[( 2- metylfenylamino) karbonyl] amino]-fenyl] acetyl]- L- prolyl- 3- metyl)-{ R )- ft- alaninbenzylester ( 7)

Til en oppløsning av HCl-saltet 6 (61,77 g; 189 mmol) i DMF (125 ml) satte man MPUPA-OSu (2; 69,39 g; 181,9 mmol),

fulgt av Et3N (90 ml; pH ca. 10). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 3,5 timer og ble deretter fortynnet med EtOAc (1 1) og ekstrahert med H20 (3 x 250 ml). På dette stadium begynte produktet å felles. En 10% oppløsning av sitronsyre (250 ml) ble satt til det organiske sjikt (forsiktig: eksoterm!), og etter rysting dannedes rikelig feining. Det

faste stoff ble filtrert på en trakt av sintret glass (2 1; M). Det faste stoff ble vasket med sitronsyre (10%; 2 x 250 ml) , H20 (250 ml), mettet natriumbikarbonat (2 x 250 ml), H20 (250 ml) og saltvann (3 x 250 ml) og fikk tørke på trakten med suging (ca. 80 mmHg) over natten (ca. 14 timer) for å gi et hvitaktig fast stoff, som ble omkrystallisert fra THF/Et20 (1 1/1,4 1) for å gi 83,3 g av forbindelse 7 (HPLC: renhet 99,6%) i form av et hvitt fast stoff.

Filtratet ble ytterligere vasket med sitronsyre (10%; 3 x 250 ml), H20 (250 ml), mettet bikarbonat (2 x 250 ml), H20 (250 ml) og saltvann (3 x 250 ml). Med hver påfølgende vandig vasking, feltes ytterligere forbindelse; imidlertid fortsatte man vaskingen mens man var forsiktig med å ikke miste noe av feiningen. Filtrering gav 4,02 g produkt i form av et hvitt fast stoff. Filtratet ble til slutt fortynnet med Et20 (1 1) og filtrert, og det faste stoff ble vasket med Et20 (3 x 100 ml) for å gi ytterligere 1,67 g av det hvite faste stoff. Det samlede utbytte for denne omset-ning var 88%.

Smp. 153-153,5°C;

IR (KBr): 3342, 3307, 3119, 2966, 1737, 1702, 1643, 1590, 1543, 1514, 1455, 1414, 1308, 1238, 1179 cm"<1>;

<1>H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) : en 3:2 blanding av rotamerer (topper for hovedkonformasjonen): d 9,00 (bs, 1 H), 7,91 (bs, 1 H), 7,84 (d, J=8,3 Hz, 1 H), 7,68 (d, J=9, 3 Hz, 1 H), 7,40-7,28 (m, 7H), 7,13 (3 H), 7,06 (d, J^8,8 Hz, 1 H), 6,92 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 5,06 (ABq, J=12,2 Hz, Dn=8,9 Hz, 2 H), 4,18 (dd, J=3,4 og 8,8 Hz, 1 H), 4,10 (kvintett, J=6,8 Hz, 1 H), 3,57 (m, 2 H), 3,50-3,22 (m, 3 H), 2,62-2,37 (m,

2 H), 2,23 (s, 3 H), 2,18-1,68 (m, 3 H), 1,05 (d, J=6, 8 Hz, 3 H) og (topper for mindre konformasjon) : d 9,00 (bs, 1 H), 7,91 (bs, 1 H), 7,84 (d, J=8,3 Hz, 1 H), 8,15 (d, J=8,3 Hz, 1 H), 7,40-7,28 (m, 7 H), 7,13 (3 H), 7,06 (d, J=8,8 Hz, 1 H), 6,92 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 5,01 (ABq, J=12,2 Hz, Dn=19,0 Hz, 2 H), 4,32 (dd, J=2,4 og 8,8 Hz, 1 H), 4,22 (kvintett, c7=6,8 Hz, 1 H) , 3,57 (m, 2 H) , 3,50-3,22 (m, 3 H) , 2,62-2,37 (m, 2 H), 2,23 (s, 3 H), 2,18-1,68 (m, 3 H), 1,10 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ;

<13>C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) : blanding av rotamerer, (topper for hovedkonformasjonen): d 170, 80 (C=0), 170,52 (C=0), 169,18 (C=0), 152,61 (C=0), 138,10 (C), 137,38 (C), 136,04

(C), 136, 04 (C), 130,05 (CH) , 129, 63 (CH) , 129, 47 (CH) , 128,58 (C), 128,28 (CH), 127,89 (CH), 127,85 (C), 126,02

(CH), 122,50 (CH), 117,90 (CH), 117,81 (CH), 65,44 (CH2) , 59,61 (CH), 47, 04 (CH2) , 41,75 (CH) , 40,41 (CH2), 40,00 (CH2), 29,29 (CH2), 24,13 (CH2) , 19,88 (CH3) , 17,78 (CH3) og (topper for den mindre konformasjon): d 170,94 (C=0), 170,52 (C=0), 169,31 (C=0), 152,61 (C=0), 138,10 (C), 137,38 (C) , 136, 04 (C) , 130,05 (CH) , 129,63 (CH) , 129,47 (CH), 128,65 (C), 128,28 (CH), 127,89 (CH), 127,85 (C), 126,02 (CH), 120,940 (CH), 117,90 (CH), 117,81 (CH), 65,44 (CH2), 59,91 (CH), 46,51 (CH2) , 42,01 (CH) , 40,13 (CH2) , 39,84 (CH2), 31,75 (CH2) , 22,11 (CHZ) , 20,05 (CH3) , 17,78 (CH3) ;

MS (EI): m/z 579 [M+Na]<+>, 557, 454, 426, 357, 336, 293, 267, 201;

Analytisk beregnet for C32H36N405: C 69,05; H 6,52; N 10,07; Funnet: C 68,87; H 6,52; N 9,93.

Fremstilling av N-[[ 4-[[( 2- metylfenylamino) karbonyl] amino]-fenyl] acetyl]- L- prolyl- 3- metyl)-( lf)- fl- alanin ( 8; oMePUPA- V)

En oppløsning av OMePUPA-V-OBn (7; 80,18 g) i THF/H20 (9:1; 800 ml) ble hydrogenert ved ca. 55 psi i nærvær av Pd/C (10%; 2,44 g). Etter 25 h ble reaksjonsblandingen filtrert gjennom "Solka Floe" (144 g; Fiber Sales & Development Corp.) på en trakt av sintret glass. Filtratet ble deretter omfiltrert gjennom en annen pute av "Solka Floe" (115 g), konsentrert til ca. 250 ml og gradvis helt i kraftig omrørt toluen (3 1). Suspensjonen ble omrørt i 0,5 h og filtrert (2 1 trakt av sintret glass), og det dannede hvite pulver fikk tørke, først på trakten under suging (ca. 80 mm Hg; 0,5 h) og deretter i en vakuumovn (14 h; 45°C; trykk justert til 25 inHg; vakuum med N2-strøm). De hvite klumper ble krosset (morter og støte) til et fint pulver for å gi 58,3 g (utbytte 87%) oMePUPA-V i form av et hvitt fast stoff. Produktet ble omkrystallisert fra aceton/H20 (320 ml/75 ml). Krystallene ble samlet og tørket først på trakten av sintret glass under suging (1 h; 80 mmHg) og deretter i vakuumovn (25 h; 45°C; trykk justert til 25 inHg; vakuum via N2-strøm) for å gi 47,0 g (84% isolasjon fra omkrystallisasjon) oMePUPA-V i form av et hvitt fast stoff (HPLC: renhet 99,1%).

Smp. 153,6-154,4°C;

IR (KBr): 3354, 3307, 1719, 1643, 1590, 1543, 1514, 1449, 1414, 1308, 1237 cm"<1>;

AH-NMR (600 MHz, DMSO-d6) : 3:2-blanding av rotamerer (topper for hovedkonformasjonen): S 12,21 (bs, 1 H), 8,99 (s, 1 H), 7,91 (s, 1 H), 7,87 (d, J=8, 2 Hz, 1 H), 7,68 (d, J=7,9 Hz, 1 H), 7,40 (d, J=8,6 Hz, 2 H), 7,17 (d, J=5,9 Hz, 2 H), 7,15 (d, J=7,6 Hz, 1 H), 7,12 (dd, J=7,9 og 8,2 Hz, 1 H), 6,94 {dd, J=7,3 og 7,3 Hz, 1 H), 4,22 (dd, J=3, 3 og 8,8 Hz, 1 H), 4,06 (m, J=6,6 Hz, 1 H), 3,47 (dd, 1 H), 3,44 (d, J=15,0 Hz, 1 H), 3,37 {dd, 1 H), 3,29 (d, J=15,4 Hz, 1 H) , 2,46 (dd, 1 H), 2,27 (m, 1 H), 2,25 (s, 3 H), 1,99 (m, 1 H), l,80m (m, 1 H), 1,78 (m, 1 H), 1,76 (m, 1 H), 1,07 (d, J=6,6 Hz, 3 H) og (topper for den mindre konformasjon): S 12,21 (bs, 1 H), 8,99 (s, 1 H), 7,90 (s, 1 H), 7,87 (d, J=8,2 Hz, 1 H), 8,12 (d, J=8,2 Hz, 1 H), 7,40 (d, J=8,6 Hz, 2 H), 7,16 {d, J=5,9 Hz, 2 H), 7,15 (d, J=7,6 Hz, 1 H), 7,12 (dd, J=7,9 og 8,2 Hz, 1 H), 6,94 (dd, J=l, 3 og 7,3 Hz, 1 H), 4,34 (dd, J-=l,8 og 8,4 Hz, 1 H) , 4,18 (m, J=6,6 Hz, 1 H), 3,60 (m, 2 H), 3,59 {m, 1 H), 3,48 (m, 1 H), 2,47 (dd, J=6,6 og 15,4 Hz, 1 H), 2,40 (dd, J=6,6 og 15,4 Hz, 1 H) , 2,25 (s, 3 H), 2,15 (m, 1 H), 1,83 (m, 1 H), 1,91 (m, 1 H), 1,77 (rn, 1 H), 1,12 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; <13>C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) (topper for hovedkonformasjonen): 8 172,4 (C=0), 170,9 (C=0), 169,3 (C=0), 152,6 (C=0), 138,2 (C), 137,5 {C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 129,6 (CH), 128,7 (C), 127,4 (C), 126,1 (CH), 122,6 (CH), 120,9 (CH), 118,0

(CH), 117,9 (CH), 59,7 (CH), 46,6 (CH2) , 41,7 (CH2) , 40,6

(CH2), 40,2 (CH2), 29,4 (CH2) , 22,2 (CH2) , 19,9 (CH3) , 17,9 (CH3) og (topper for den mindre konformasjon): 8 172,5 (C=0), 171,0 (C=0), 160,5 (C=0), 152,7 (C=0), 138,19 (C), 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 129,6 (CH), 128,8 (C), 127,4 {C), 126,1 (CH), 122,6 (CH), 120,9 (CH), 118,0 (CH) , 117,9 (CH), 59,9 {CH), 47,1 (CH2) , 42,0 (CH2) , 39,8 (CH2) , 40,3 (CH2), 31,8 (CH2), 24,2 (CH2) , 20,2 (CH3) , 17,9 (CH3) ; MS (EI): m/z 468 [M+H]<+>, 336, 267, 137;

Analytisk beregnet for C25H3oN405: C 64,36; H 6,48; N 12,01; Funnet: 64,07; H 6,40; N 11,85.

Eksempel 2 Aktivitet i en ovin modell av allergisk pul-monar betennelse

Allergiske sauer som veide mellom 27 og 50 kg ble brukt. Alle sauene hadde tidligere vist seg å utvikle både tidlige og sene bronkiale responser på inhalert forstøvet Ascaris suum-allergen. Sauene var ved bevissthet, og ble holdt fast i en modifisert innkjøpsvogn i liggende stilling med sine hoder immobilisert. Etter topisk anestesi av de nasale pas-sasjer med 2% lidokain ble en ballongkateter ført gjennom ett nesebor inn i lavere øsofag. Dyrene ble intubert med et mansjettforsynt endotrakealrør gjennom det andre nesebor ved bruk av et fleksibelt fiberoptisk bronkoskop som føring. Alle protokoller som ble brukt i denne under-søkelse, var godkjent av Mount Sinai Medical Center Animal Research Committee, som er ansvarlig for å sikre en mennes-kelig behandling og anvendelse av eksperimentdyr. Det pleurale trykk ble bedømt ved bruk av en øsofagealballongkate-ter (fylt med 1 ml luft), som ble plassert 5-10 cm fra gastroøsofageal-krysningspunktet. I denne posisjon varierte det endeekspiratoriske pleurale trykk fra -2 til -5 cmH20. Når ballongen vel var blitt plassert, ble den sikret slik at den holdt seg i samme posisjon under eksperimentets varighet. Det laterale trykk i trakea ble målt med et side-hullkateter (indre diameter 2,5 mm) som ble ført gjennom og plassert distalt for tuppen av endotrakealrøret.

Trakeal- og pleuraltrykk-kateterne ble forbundet med en differensiell trykktransduser (MP45, Validyne, Northridge, CA) for å måle det transpulmonære trykk, som ble definert som differansen mellom trakeal- og pleuraltrykket. Luft-strømmen ble målt ved å forbinde den proksimale ende av endotrakealrøret med en pneumotakograf (Fleisch, Dyna Sciences, Inc., Blue Bell, PA). Signalene av transpulmonært trykk og strømning ble registrert på en flerkanals fysiolo-gisk registreringsanordning som var forbundet med en 80-386 DOS PC for online-beregning av den midlere pulmonære strøm-ningsresistens (Rj,) ved å dividere endringen i transpulmonært trykk med endringen i strømningen ved midtvolum (erholdt ved digital integrasjon). Den midlere verdi for minst fem åndetrekk, frie for svelging, ble brukt for å erholde RL-verdien i cmH20/L/sek. Umiddelbart etter målin-gen av RL-verdien ble det toraciske gassvolum (Vtg) målt i en legemespletysmograf med konstant volum for å erholde den spesifikke lungeresistens (SRL = Rl x Vtg) i LxcmH20/L/sek. Alle væske-doseaerosoler ble generert ved bruk av en éngangs medisinsk luftstrømforstøver ("Raindrop", Puritan Bennett, Lenexa, KS) som gav en aerosol med en massemidlere aerodynamisk diameter på 3,2 um ifølge målinger med en Andersen cascade impactor-anordning. Forstøveren ble forbundet med et dosimetersystem som bestod av en elektro-magnetisk ventil og en kilde for komprimert luft (20 psi). Utgangen fra forstøveren var rettet mot et T-stykke av plast, hvis ene ende var forbundet med den inspiratoriske port av en stempelrespirator (Harvard Apparatus, S. Natick, MA). Den elektromagnetiske ventil ble aktivert i ett sekund i begynnelsen av den inspiratoriske syklus av respiratoren. Aerosoler ble levert i et intervallvolum på 500 ml og en hastighet på 20 åndedrett pr. minutt. For å bedømme en bronkial responsivitet ble kumulative konsentrasjons-responskurver mot karbachol utført ved å måle SRL umiddelbart etter inhalasjon av buffer og etter hver påfølgende administrasjon av 10 åndedrett med økende konsentrasjoner av karbachol (0,25; 0,5; 1,0; 2,0 og 4,0% vekt/vol. i bufret salin). Provokasjonstesten ble avbrutt når SRL økte til over 400% fra verdien etter salinet, eller etter at den høyeste karbakolkonsentrasjon var blitt administrert. Den bronkiale responsivitet ble bedømt ved å bestemme den kumulative karbacholkonsentrasjon (i åndedrettsenheter) som hevet SRL med 400% over verdien etter salinet (PC400) ved interpolasjon fra doseresponskurven. Én åndedrettsenhet (BU) ble definert som ett åndedrett med en 1% vekt/vol. forstøvet karbacholoppløsning.

Doser av oMePUPA-V ble løst opp i enten etanol:normalt salin 1:2, etanol:200 mM natriumfosfat 1:5 eller Tris-buffer. Ved bruk av Tris ble eventuelt nødvendige fortynninger utført ved bruk av normalt salin. Dosene ble fremstilt med 3-5 ml samlet volum.

I alle undersøkelser ble grunnlinje-luftveisresponsiviteten (dvs. PC400) bestemt 3-4 dager før undersøkelsens start. I enkeltdose-forhåndsbehandlingsundersøkelser ble SRL målt og dyrene ble behandlet med forbindelsen eller med vehikkel. SRL ble målt på nytt 2 timer etter behandlingen (rett før allergenbehandlingen), og deretter ble dyrene behandlet med allergen. I flerdoseundersøkelser ble, startende 4 dager før allergenbehandlingen, dyrene behandlet én gang daglig i 4 dager og behandlet med allergen 24 timer etter den siste dose. SRL ble målt før og etter den siste dose av forbindelse eller vehikkelbehandling. I alle undersøkelsene ble SRL målt på nytt umiddelbart etter allergenbehandlingen, hver time fra 1-6 timer etter behandlingen og hver halvtime fra 6,5-8 timer etter allergenbehandlingen. Bestemmelser av luftveisresponsiviteten (PC4oo) etter behandlingen ble utført 24 timer etter allergenbehandlingen.

Verdiene uttrykkes som midlere verdi + standardavvik av den midlere verdi. Endringen av SRL-verdien ble beregnet for hver sau som forskjellen fra grunnlinje-SRL-verdien før behandlingen. Endringer av SRL-verdien etter behandlingen var kjennetegnet ved en tidlig luftveisrespons (EAR) som utviklet seg over en omtrent 0-4 timers periode. Dette ble fulgt av sen luftveisrespons (LAR) som utviklet seg over omtrent 4-8 timers perioden etter allergenbehandlingen. Områder under EAR- og LAR-kurvene ble beregnet for hvert dyr ved bruk av trapeseregelen. Signifikante reduksjoner av området under EAR- eller LAR-kurvene sammenlignet med pla-cebo-kontrolldyrene tok man for å være terapeutiske vir-kininger på allergen-induserte endringer av SRL. Luftveisresponsiviteten mot karbachol (PC4oo) bedømt før og 24 timer etter allergenbehandlingen ble uttrykt som et PC40o-forhold (PC4oo~verdi etter/før behandling) for hver sau. En betydelig økning av PC4oo_forholdet sammenlignet med placebo-kon-trolldyr tok man for å være en terapeutisk virkning. Sammenligninger med placebokontrollen ble gjort ved bruk av énveis variansanalyse fulgt av Dunnetts test (1-halet) for multiple sammenligninger med en kontroll. Sammenligninger som førte til p<0,05, ble tatt for å være statistisk signifikante.

Fig. 1 viser forstøvet oMePUPA-Vs inhibitoriske dose-respons i Ascaris suum-følsomme sau som ble behandlet med antigen 2 h etter doseringen. De venstre ruter viser endringen i den spesifikke lungeresistens SRL, cm^O/sek. De høyre ruter viser luftveisresponsiviteten mot inhalert karbachol (PC4oo-forhold, før/etter behandling) bestemt 24 timer etter behandlingen. oMePUPA-V ved doser på 0,01 og 0,03 mg inhiberte hverken tidlig eller sen luftveisrespons eller endret hyperresponsiviteten mot karbachol 24 timer etter allergenbehandlingen. Doser på 0,1, 1 og 3 mg inhiberte tidlig luftveisrespons og inhiberte maksimalt sen luftveisrespons. Disse doser inhiberte også hyperresponsiviteten mot karbachol 24 timer etter allergenbehandlingen. Den statistiske analyse av denne data vises i tabell 2.

Sau, naturlig følsomme for Ascaris suum, ble behandlet med en aerosol av Ascaris suum-allergen 2 timer etter en aero-soladministras jon av oMePUPA-V i de angitte doser eller 24 timer etter den siste dose av gjentatte daglige administrasjoner over 4 dager av en dose under terskeldosen for oMePUPA-V eller en likeverdig mengde PBS. Pulmonaer mekanikk, beskrevet som endringen i den spesifikke luftveisresistens i forhold til grunnverdien før undersøkelsen, ble målt i 8 timer etter allergenbehandlingen. Tidlig luftveisrespons (0-4 h; EAR) og sen luftveisrespons (4-8 h; LAR) uttrykkes som det midlere areale under A-Spesifikk LungeResistens-kurven mot tid ± standardavvik. Luftveisresistensen mot inhalert karbachol ble bestemt før start av under-søkelsen og 24 timer etter allergenbehandlingen. Luftveisresponsiviteten beskrives som PC4oo~forholdet (mengden karbachol som er nødvendig for å heve resistensen med 400%) ved sammenligning av verdiene før og etter allergenbehandlingen.

<*>=p<0,05 sammenlignet med PBS-kontroll, énveis variansanalyse fulgt av Dunnetts test for en multippel sammenligning med en kontrollgruppe. Viser til en statistisk signifikant nedsatt EAR eller LAR eller en signifikant økning av PC4oo-forholdet sammenlignet med PBS-kontrollgruppen.

Enkeltdoseirritans

Ingen av dosene av oMePUPA-V som ble brukt i undersøkelsen ovenfor, hadde noen irriterende effekt, hvilket gjenspeiles av den manglende forandring i luftveisresistensen sammenlignet med grunnlinjeresistensen, etter en behandling med Ascaris suum-allergen. Dette vises på fig. 2.

Undersøkelser med gjentatte doser

Fig. 3 illustrerer at en 0,03 mg dose av oMePUPA-V, som viste seg å være uvirksom når den ble brukt som akutt enkeltdose-forhåndsbehandling, allikevel virket beskyttende hvis den ble gitt én gang daglig i 4 dager når antigen-behandlingen ble gitt 24 timer etter den siste dose. Den øvre og nedre venstre rute viser at denne virkning viste seg ved bruk av to forskjellige formuleringer. Hyperresponsivitet mot karbachol etter ytterligere 24 timer ble dess-uten maksimalt inhibert, slik det fremgår av den øvre og nedre høyre rute på fig. 3. Den beskyttende virkning av oMePUPA-V var betydelig mot EAR og LAR og mot hyperresponsivitet mot karbachol, og den kvantitative analyse vises i tabell 3.

Resultatene av denne undersøkelse viser at en enkelt forhåndsbehandling med en inhibitor av VLA-4 med liten mole-kylstørrelse, nemlig oMePUPA-V, ved hjelp av en aerosol, kan beskytte mot allergen-induserte tidlige og sene luftveisresponser og mot post-allergen-indusert AHR i den allergiske sauemodell. Ingen irritasjonseffekt på luft-veiene ble observert med noen av dosene av oMePUPA-V som ble gitt som én enkelt forhåndsbehandling. Resultatene viste også at den effektive dose av oMePUPA-V kunne reduse-res med flere behandlinger. Samlet gir denne data tydelige beviser på at VLA-4-adhesjonsbanen spiller en kritisk rolle i de patofysiologiske indikatorer (LAR og AHR) av de forlengede inflammatoriske hendelser som initieres i luft-veiene av allergiske sau etter en allergenprovokasjon.

Sau, naturlig følsomme for Ascaris suum, ble behandlet med en aerosol av Ascaris suum-allergen 24 timer etter den siste dose av gjentatte daglige administrasjoner over 4 dager av en dose under terskeldosen for oMePUPA-V eller en likeverdig mengde PBS. Pulmonær mekanikk, beskrevet som endringen i den spesifikke luftveisresistens i forhold til grunnverdien før undersøkelsen, ble målt i 8 timer etter allergenbehandlingen. Tidlig luftveisrespons (0-4 h; EAR) og sen luftveisrespons (4-8 h; LAR) uttrykkes som det midlere areale under A-Spesifikk LungeResistens-kurven mot tid ± standardavvik. Luftveisresistensen mot inhalert karbachol ble bestemt før start av undersøkelsen og 24 timer etter allergenbehandlingen. Luftveisresponsiviteten beskrives som PC4oo-forholdet (mengden karbachol som er nødvendig for å heve resistensen med 400%) ved sammenligning av verdiene før og etter allergenbehandlingen.

<*>=p<0,05 sammenlignet med PBS-kontroll, énveis variansanalyse fulgt av Dunnetts test for en multippel sammenligning med en kontrollgruppe. Viser til en statistisk signifikant nedsatt EAR eller LAR eller en signifikant økning av PC4oo~forholdet sammenlignet med PBS-kontrollgruppen.

Eksempel 3 Aktivitet i modeller for sinket hypersensi-tivitetstype

Undersøkelser med røde blodceller fra sau

Bestemte patogen-frie Balb/c-mus av hunnkjønn, i en alder fra 8-10 uker, fra Jackson Labs, ble brukt for alle eksperimenter. Dyrene ble foret med for og vann ad libitum. Røde blodceller fra sau (sRBC) i Alsevers oppløsning fra de samme sau, ble erholdt ukentlig fra Charles River Pharm. Services (Southbridge, MA). sRBCene ble pelletisert ved sentrifugering ved 1000 g i 10 minutter ved 4°C, og eventuelt synlig buffy coat ble fjernet. Cellene ble deretter vasket i salin. Cellepelleten ble resuspendert i salin og telt ved bruk av et hemocytometer. Cellene ble fortynnet i fosfatbufret salin (PBS) til 2xl0<8> sRBC pr. ml. På dag 0 ble musene sensitivisert ved en s.c.-injeksjon av 2xl0<7 >sRBC i 100 ul PBS. På dag 5 ble sRBC preparert som ovenfor, men fortynnet i PBS til en endelig konsentrasjon på 4xl0<9 >sRBC pr. ml. Av dette preparat ble 25 ul injisert s.c. inn i høyre bakpotepute.

For en enteral administrasjon av forbindelse ble oMePUPA-V (Lot# 2770-029) formulert i et vehikkel av 60% PEG 400 i 0,02M Tris til en stamkonsentrasjon på 5 mg/ml. Egnede fortynninger ble fremstilt i PEG/Tris-vehiklet og administrert enteralt i et volum på 100 ul. Anti-VLA-4-antistoffet (PS/2) ble fortynnet i salin i en konsentrasjon på 4,3 mg/kg og administrert intraperitonealt i 100 ul. Alle behandlingene ble administrert umiddelbart etter behandlingen med sRBC.

Hevelsen av den ubehandlede (venstre) kontroll-bakpote og den behandlede (høyre) bakpote ble målt ved bruk av en strekk-krumpasser fra Mitutoyo (modell-nr. 304-196, Dyer, Lancaster, PA) 20 timer etter behandlingen av poten. Dataen presenteres som endringen i potens tykkelse, bestemt ved å subtrahere venstre bakpotes tykkelse fra høyre bakpotes tykkelse. Endringer i potenes tykkelse ble sammenlignet ved bruk av to-halet Stundents t-test.

Anti-VLA-4-antistoffet PS/2 inhiberte i en dose på 4,3 mg/kg intraperitonealt hevelsen med ca. 30%, mens oMePUPA-V som ble administrert enteralt i en dose på 20 mg/kg, var uten virkning i denne modell (data ikke vist). Virkningen av oMePUPA-V som ble administrert i en dose på 20 mg/kg ved den enterale rute i sRBC-indusert DTH-modell i mus ble undersøkt, og ingen virkning ble observert.

Eksempel 4 Aktivitet i modeller med sinket hypersensi-tivitetstype

Kontakt- hypersensitivitetsmodell

20 g tunge virusfrie Balb/c-mus av hunnkjønn (Jackson Labo-ratories, Bar Harbor, ME) som ble holdt med 4 i hvert bur i mikroisolatorbur i Biogen's virusfrie dyrefasiliteter og som fikk musefor og springvann ad libitum, ble brukt for alle undersøkelsene. Mus ble anestetisert med ket-amin:xylazin (90:10 mg/kg, i.p.). Et 3 cm2 område av abdo-minalhud, fra brystbeinspissen til pubis, ble frigjort ved grundig barbering av pelsen, og huden ble skrubbet med 70% etanol. Et 25 ul volum av 0,5% DNFB i 4:1 vol/vol aceton: olivenolje-vehikkel påføres jevnt på den blottede abdo-minalhud. Huden ble skrapt lett med påføringspipettens tupp for å fremme en svak betennelse. Musen ble lagt på rygg i sitt bur og fikk komme seg etter anestesien. 24 timer etter den første sensitivisering ble musene igjen sensitivisert med 25 ul 0,5% DNFB i vehikkel på samme abdominalhudplasse-ring, igjen fulgt av en lett skraping med pipettens tupp. Den andre sensitivisering ble utført mens man holdt fast den uanestetiserte mus. På dag 5 (ca. 120 timer etter den opprinnelige sensitivisering) ble en sub-irriterende dose av sensitiviseringsmidlet (0,2% DNFB i 4:1 vol/vol aceton :olivenolje-vehikkel) brukt for å starte en immun-respons. Mus ble anestetisert med 90:10 mg/kg ketyl-amin:xylazin, i.p., og 10 ul 0,2% DNFB ble påført på dorsalflaten av venstre øre. Høyre øre fikk en lignende påfø-ring av 4:1 vol/vol aceton:olivenoljevehiklet. I løpet av den følgende 24 timers periode utvikledes en bifasisk øre-hevelsesrespons, som vist på fig. 4. 24 timer etter behandlingen ble dyrene igjen anestetisert med ketylamin:xylazin, og øretykkelsen av begge ører ble målt med et ingeniørs-mikrometer med en nøyaktighet på 10"<4> cm.

Forbindelser (100 ul) eller egnet vehikkel (dimetylsulfok-sid [DMSO] i isotonisk fosfatbufret salin [PBS], 100 ul) ble administrert oralt ved klyster 4 timer etter oppford-ringen av immunresponsen på dag 5. Grupper på 8 mus ble brukt for hver behandling som ble testet. oMePUPA-V (Batch-nr. 2044-076) ble løst opp i destillert vann ved tilsetning av 0,5% natriumfosfatbuffer, pH 8,8, og 3% DMSO. Ørets hevelsesrespons for hver mus ble beregnet som differansen mellom tykkelsen av det vehikkel-behandlede og det DNFB-behandlede øre 24 timer etter irritantbehandlingen. Den typiske DNFB-induserte ørehevelse var 165-191xl0~<4> cm. Inhiberingen av ørets hevelsesrespons ble bestemt ved sammenligning av behandlede grupper med deres vehikkelkon-trollgruppe. Den statistiske signifikans av differansen blant behandlingsgruppene ble bedømt ved bruk av énveis variansanalyse fulgt av Dunnetts test for multiple sammenligninger med en kontrollgruppe (Systat, SPSS Inc.) ved bruk av p<0,05. Verdiene uttrykkes som den midlere verdi standardavviket av den midlere verdi (SEM).

Fig. 4 sammenligner ørehevelsesresponser målt 24 timer etter en DNFB-behandling av mus som fikk vehikkel (DMSO, PBS), positivkontrollforbindelse (gitt med 0,03 ug/kg) eller 0,03 eller 0,3 mg/kg oMePUPÅ-V, dosert enteralt 4

timer etter DNFB-behandlingeh (øvre rute). Behandlingsindu-sert prosentandel inhibisjon vises i den nedre rute. Begge doser av oMePUPA-V inhiberte signifikant ørehevelsesresponsen i en lignende grad som hva som vises av positiv-kontrollforbindelsen.

Enkeltvis gitte enterale 0,03 eller 0,3 mg/kg-doser av oMePUPA-V gitt 4 timer etter DNFB-behandlingen kan betydelig inhibere ørehevelsesresponsen i en modell for muse-kon-takthypersensitivitet.

Eksempel 5 Biokjemi

5.1 Receptoraffinitet av oMePUPA-V målt ved bruk av VCAM-Ig-alkalifosfatase-konjugat i VCAM-Ig-direktebindingsassay (DBA)

VCAM-Ig ble konstruert og renset som beskrevet (Jakubowski, A., et al., Cell Adhesion and Communication, 3:131-142, 1995). Konjugering til tarm-alkalifosfatase fra kalv for å spalte et kromogent substrat ble utført som beskrevet

(Lobb, R.R., et al., Cell Adhesion and Communication 3:385-397, 1995). Bindingen til VLA-4 ble bedømt på human T-cellelinje, Jurkat (a4pl). VCAM-Ig-AP og oMePUPA-V konkurrerte om bindingen til a4pl på overflaten av disse celler i nærvær av 1 mM Mn<2+>.

I VCAM-Ig-direktebindingsassayet konkurrerer oMePUPA-V med VCAM-Ig-AP om bindingen til Jurkatceller i nærvær av 1 mM MnCl2, konsentrasjonsavhengig, med en ICso-verdi på 8±1 nM (n=9). Resultatene vises i tabell 4.

5.2. Receptoraffinitet av oMePUPA-V ifølge målinger ved bruk av VCAM-Ig-alkalifosfatasekonjugat i renset VLA-4-protein/protein-assayet

VLA-4 ble renset fra et vaskemiddelekstrakt av en høyt uttrykkende delklon av a4-transfiserte K562-celler ved antistoffaffinitetskromatografi og immobilisert på mikro-titerbrønner for å bestemme et protein/protein-kompetitivt bindingsassay. VCAM-Ig-AP ble bundet på den rensede VLA-4-bestrøkne plate i nærvær eller fravær av oMePUPA-V {batch #2) og 1 mM MnCl2. Platene ble avlest ved 405 nm, og dataen ble analysert ved bruk av SoftMax v. 2.32-programvare.

Bindingen av VCAM-Ig-konjugatet til renset VLA-4 ble blokkert fullstendig av et spesifikt nøytraliserende anti-a4-monoklonalt antistoff (HPl/2). To IC50-verdier som ble erholdt for oMePUPA-V i VLA-4-protein/protein-assayet er oppført i tabell 4, sammen med ICso-verdiene som ble erholdt på Jurkatceller fra VCAM-Ig-AP-kompetitivt bindingsassay og CSl-celleadhesjonsassayet.

5.3 Receptoraffinitet av oMePUPA-V ifølge bestemmelser i

CSl-celleadhesjonsassayet

a. Adhesjon av Jurkatceller til CSl/BSA-konjugat

Peptidet NH2-cystein-tyrosin-CSl ble syntetisert og koblet til BSA-SMCC (SMCC er et heterobifunksjonelt fornetnings-middel som reagerer med frie aminogrupper på BSA og det

eneste cystein av det syntetiske peptid) i et CSl/BSA-forhold på 10:1. Brønner ble bestrøket over natten med 100 ul konjugat fortynnet til en endelig konsentrasjon på 1 ug/ml. Den følgende dag ble brønnene blokkert med BSA i PBS i én time og deretter vasket tre ganger.

Den humane T-cellelinje Jurkat ble merket med 2 uM BCECF-AM, et fluorescerende fargestoff ( 2',7',bis-(2-karboksy-etyl)-5)- og -6)-karboksyfluoresceinacetoksymetylester

(Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon; katalog-nr. B-1150)

som internaliseres og avestres, hvorved fargestoffet fanges i levende celler. Jurkatceller (lxlO<5> celler/brønn) i buffer som inneholdt 1 mM Mn<+2>, ble satt til de bestrøkne plater i nærvær av tre gangers serielle fortynnelser av inhibitor. Hver konsentrasjon ble testet in duplo. Etter 30 minutter ved romtemperatur ble platene snudd og vasket tre ganger eller inntil det ikke lenger klebet celler til kon-trollbrønner som kun var bestrøket med BSA. Cellene som klebet fast til CS1, ble kvantifisert i en Cytofluor fluorescerende plateleser ved bruk av en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en emisjonsbølgelengde på 530 nm.

Celler som klebet til CS1/BSA i fravær av forbindelse tjente som 0% inhibisjonskontroll, mens celler som klebet til kun BSA tjente som 100% inhibisjonskontroll. ICso-verdiene ble beregnet ved bruk av Deltagraph-programvare, ver-sjon 5.

Adhesjon av merkede Jurkatceller i nærvær av Mn<+2> ble blokkert fullstendig med EDTA og det nøytraliserende anti-a4pi-mAb HP1/2, hvilket tydet på at bindingen var spesifikk. Tabell 4 oppgir aktiviteten av oMePUPA-V i CSl/BSA-adhesjonsassayet, samt bindingsassayresultatene.

oMePUPA-V er en sterk VLA-4-antagonist i buffere som inneholder Mn<+2>. Den er 80 ganger sterkere når den testes i nærvær av Mn<+2> på isolerte VLA-4 enn på Jurkatceller i bindingsassayet. oMePUPA-V er en funksjonell antagonist, hvilket fremgår av dens evne til å på doseavhengig måte og

fullstendig blokkere adhesjonen av Jurkatceller til CS1. De absolutte verdier i adhesjonsassayet er høyere enn hva som ble observert i bindingsassayene. Dette kan skyldes den flerverdige natur av adhesjon. I alle assayformater demon-strerer inhibisjonen av bindingen med EDTA og HP1/2 en spesifikk binding til VLA-4.

Tabell 4 Receptoraffinitet av oMePUPA-V i nærvær av 1

mM MnCl2 ifølge målinger i VCAM-lg-kompetitivt bindingsassay, CSl-celleadhesjonsassayet og renset VLA-4-protein/protein-assay

6.4 Spesifisitet av oMePUPA-V-inhibering

a. Spesifisitet av oMePUPA-V ifølge bedømmelse ved bruk av JY-celler i VCAM-Ig-direktebindings- og CSl-adhe-sjonsassayer

Bindingen til ot4P7 ble bedømt på JY-celler i nærvær av Mn<+2.> I bindingsassayet konkurrerer VCAM-Ig og oMePUPA-V om bindingen til oc4P7 på JY-celler (jfr. avsnitt 4.1.1 for assayprotokollen). I celleadhesjonsassayet ble oMePUPA-V bedømt for sin evne til å blokkere JY (a4p7)-cellebinding til CSl/BSA-konjugat.

oMePUPA-V blokkerer ikke <x4p7-binding til VCAM-Ig eller CS1/BSA. Anti-p7-Mab, Fib27 (Pharmingen) inhiberte disse vekselvirkninger fullstendig, hvilket tydet på at bindingen var a4p7-spesifikk. Derfor er oMePUPA-V en spesifikk inhibitor for VLA-4. Resultatene vises i tabell 5.

b. Spesifisitet av oMePUPA-V bedømt ved bruk av adhesjonen av K562-celler til brønner bestrøket med Fn-120

Ubehandlede 96-brønners flatbunnede plater av polystyren ble bestrøket med 5 ug/ml Fn-120 over natten ved 4°C. Platene ble vasket to ganger med fosfatbufret salin (PBS) og blokkert med 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time ved romtemperatur. Platene ble vasket to ganger med TBS-buffer som inneholdt 1 mM MnCl2 (assaybuffer). K562-celler ble merket med 2 uM av det fluorescerende fargestoff BCECF-AM (jfr. avsnitt 4.1.3) og bundet til platen i 30 minutter ved romtemperatur. Platene ble snudd og vasket tre ganger, og de fastklebende celler ble kvantifisert i en Cytofluor fluorescerende plateleser ved bruk av en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en emisjonsbølgelengde på 530 nm.

Adhesjonen av K562 til Fn-120 ble fullstendig blokkert av det nøytraliserende anti-a5-antistoff IIA1 (Pharmingen), hvilket tydet på en spesifikk binding via VLA-5. Det fore-kom ingen inhibering av K562-cellebindingen til Fnl20K-fragmentet som skyldtes oMePUPA-V i doser som var såpass høye som 100 uM, Se den følgende tabell 5.

c. Aggregasjonsassayer utført for å bedømme spesifisite-ten av oMePUPA-V

Metoder

Aktiviteten mot gpllbllla ble bedømt ved hjelp av standard blodplateaggregometri ved bruk av blodplate-rik plasma. ADP ble brukt for å initiere en aggregasjon i nærvær av plasma hvor Ca<+2> og Mg<+2> er de overveiende toverdige kationer. GRGDSP ved 100 ug/ml ble brukt som positivkontroll.

Resultater

oMePUPA-V ble testet i tre doser: 1, 10 og 100 uM. Det inhiberte ikke blodplateaggregasjonen som induseres av ADP, ved noen dose. Resultatene er ført opp i tabell 5. OMePUPA-V er høyt spesifikk (> 10.000 ganger) for VLA-4. Det har ingen målbar aktivitet (>100 uM) mot de beslektede integriner ct4P7 og VLA-5 eller mot P3-integrinet gpllbllla.

Tabell 5 Inhibitorisk aktivitet av oMePUPA-V ifølge målinger i ct4 07-VCAM-lg-kompet it i vt bindingsassay, a4(J7- og VLA5-adhesjonsassayer og i blodplateaggregasjonsundersøkelsene

Eksempel 6 Assay av oMePUPA- V for LIBS- induksjon

6.1 Målinger på Jurkat ved bruk av LIBS-antistoff 9EG7

a. LIBS-induksjon av <x4pl-antagonister ble testet in vitro ved FACS-analyse. Jurkat-celler (2xl0<5> pr. brønn) ble forhåndsinkubert ved 37°C i 20 minutter med Tris-bufret salin som inneholdt 2 mM MgCl2 (Mg<+2->TBS) alene eller med serielle fortynnelser av testforbindelser. Prøvene ble overført til et isbad og supplementert med LIBS-antistoff, 9EG7, i en endelig konsentrasjon på 10 ug/ml. Cellene ble vasket to ganger med Mg<+2->TBS og gjensuspendert i en 1:200-fortynning av et FTTC-konjugert geite-anti-rotte-IgG i Mg<+2->TBS og inkubert i 30 minutter ved 4°C. Cellene ble vasket to ganger og gjensuspendert i Mg<+2->TBS. Den midlere fluorescensintensitet (MFI) ble bestemt ved FACS-analyse (Becton Dickinson FACScan). Resultatene uttrykkes som MFI. Dataen ble analysert ved hjelp av Microsoft Excel v5,0- og Deltagraph v4,0-programvare.

Fig. 5 viser at oMePUPA-V induserte blottleggelse av LIBS-epitopen sammenlignet md 2 mM Mg<+2->buffer {rute B). Induk-sjonen var konsentrasjonsavhengig og var av lignende stør-relsesorden som den som observeres med 1 mM Mn<+2> {rute A) . En utelatelse av LIBS-antistoffet og påvisningsantistoffet, eller en utelatelse av kun påvisningsantistoffet, elimi-nerte merkingen (rute B). EDso-verdien for responsen var ca. 20 nM.

Konklusjon

Denne data tyder på at oMePUPA-V induserer den samme kon-formasjonelle endring i VLA-4 som hva som observeres med native ligander. LIBS-verdiene faller generelt innen området som defineres av bindings- og adhesjonsassayene, som er henholdsvis 8 nM og 22 nM for oMePUPA-V.

6.2 Multi-spesies-receptortest

a. Receptoraffiniteten av oMePOPA-V ifølge målinger i VCAM-IG-direktebindingsassay ved bruk av VCAM-Ig-alkalifosfatase-konjugat og perifere blodlymfocytter eller miltceller fra forskjellige arter

PBL'er ble isolert fra perifert blod fra mennesker, sau og hunder ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet for saue-PBL {Abraham, W.M. et al., J. Clin. Invest. 93:776-787, 1994). VCAM-Ig-AP-kompetitivt bindingsassay ble brukt for å sam-menligne bindingen av oMePUPA-V til disse forskjellige cel-letyper.

ICso-verdiene som ble erholdt for oMePUPA-V på perifere blodlymfocytter eller miltceller fra forskjellige spesies i nærvær av Mn<+2> vises i tabell 6. I nærvær av Mn<+2> inhiberer oMePUPA-V med lignende ICso-verdi bindingen av VCAM-Ig til lymfocytter erholdt fra mennesker, rotter, hunder, sau og mus. Det er ingen tegn på noen spesies-spesifisitet. Dette stemmer overens med den høye grad av sekvenskonservering som observeres blant spesies for VLA-4 og dens naturlige ligander CS-1 og VCAM.

Tabell 6 Receptoraffinitet av oMePUPA-V ifølge målinger i VCAM-Ig-kompetitivt bindingsassay ved bruk av VCAM-Ig-alkalifosfatasekonjugat og perifere blodlymfocytter eller miltceller fra forskjellige spesies

Eksempel 7 Receptorkinetikk av oMePUPA- V

7.1 Konkurranseassay ved bruk av en <3>H-kjent inhibitor som

probe

Jurkatceller ble holdt i RPMI-1640-medium plus 10% føtalt bovint serum ved 37°C i en vevkulturinkubator. For bin-dingsstudier ble cellene pelletisert ved sentrifugering, vasket to ganger med TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% bovint serumalbumin, 2 mM glukose, 10 mM HEPES pH 7,4), suspendert med ca. 2 x IO<6> celler/ml i TBS, og telt ved bruk av et Neubauer hemocytometer. Cellene ble ytterligere fortynnet til 1,5 x IO<6> pr. ml i de angitte buffere og un-derkastet de bestemte behandlinger som defineres for hvert eksperiment. Cellene ble deretter pelletisert ved sentrifugering, resuspendert i 100 ul assaybuffer og overført til et scintillasjonsglass som inneholdt 2,9 ml ScintiVerse II (Fisher Scientific). Celleassosiert radioaktivitet ble kvantifisert ved scintillasjonstelling. Antall celler som ble bundet under disse betingelser, måler integrinet som ikke opptas av testforbindelsen og som dermed er fritt til å binde den <3>H-kjente inhibitor. Alle undersøkelsene ble utført i silisiumbehandlede 1,5 ml Eppendorf-rør med et standard 1 ml prøvevolum. Den ikke-spesifikke binding av den <3>H-kjente inhibitor til celler (bakgrunn) ble definert ved å måle inhibitoren som bindes i fravær av metallioner. Antallet spesifikt bundne celler ble beregnet ved å subtrahere det ikke-spesifikke antall fra det samlede antall bundne celler.

En rekke konkurranseundersøkelser ble utført for å verifi-sere at oMePUPA-V og den kjente inhibitor konkurrerer om den samme stilling på VLA-4. Først ble den <3>H-kjente inhibitor blandet med en ekvimolar mengde oMePUPA-V, et 10-foldig overskudd og et 100-foldig overskudd og inkubert med Jurkat-celler, og evnen av den kalde inhibitor til å konkurrere om bindingen av den kjente inhibitor ble bedømt. oMePUPA-V-behandling førte til en doseavhengig inhibering av bindingen av den <3>H-kjente inhibitor. Konsentrasjonen av oMePUPA-V som var nødvendig for å konkurrere med den <3>H-kjente inhibitor om bindingen var 10 ganger høyere enn hva som var nødvendig når kald inhibitor ble brukt som konkur-rent, hvilket stemmer overens med dens lavere affinitet for Mn<+2->aktivert VLA-4. For det andre ble Mn<+2->aktiverte Jurkatceller behandlet med <3>H-kjent inhibitor for å først okkupere VLA-4 med den radioaktive probe, og deretter ble et overskudd kald oMePUPA-V satt til. Påfølgende behandlinger med et overskudd av kald oMePUPA-V eller kjent inhibitor gav resultater som ikke kunne skjelnes fra hverandre med hensyn til deres evne til å forskyve den radioaktive probe. For det tredje ble Mn<+2->aktiverte Jurkatceller behandlet med mettende mengder av oMePUPA-V, og hastigheten med hvilken oMePUPA-V dissosierte, ble målt. Til forskjell fra den forlengede halveringstid av den kjente inhibitor for Mn<+2->aktivert VLA-4, frigis oMePUPA-V raskt fra oMePUPA-V-VLA-4 med en halveringstid på mindre enn 10 minutter. Den store forskjell mellom halveringstiden for oMePUPA-V og den kjente inhibitor tyder på at den lavere affinitet av oMePUPA-V for VLA-4 er et resultat av den ras-kere forskyvningshastighet.

Dissosiasjonsdataen viser at bindingen av oMePUPA-V til VLA-4 er høyt avhengig av aktiveringstilstanden av VLA-4 og at den oppviser den samme selektivitet for aktivering som observeres med den kjente inhibitor. Slik tilfellet også er med Mn<+2->aktivert VLA-4, er halveringstiden av oMePUPA-V-dissosiasjonen fra Mg<+2->aktivert VLA-4 mindre enn 10 minutter; det korteste tidsrom som kan bedømmes i konkurranse-formatet. På den andre side var i nærvær av Mg<+2> plus det aktiverende antistoff TS2/16, halveringstiden lengre (20 min.). Alle de mulige aktiveringstilstander er ikke blitt bedømt i detalj, men imidlertid ble en enkel test utviklet som raskt kan sette lys på forskjellene. I dette assay ble en fast konsentrasjon av oMePUPA-V (10 nM) blandet med 5 nM <3>H-kjent inhibitor, og binding ble utført under disse betingelser under forskjellige aktiveringstilstander. Hvis oMePUPA-V hadde en abnormalt høy eller lav affinitet for VLA-4, ville man kunne påvise dette ifølge forskjellen i mengden av 3H-kjent inhibitor. Forskjellene i prosentande-len 3H-kjent inhibitor som bindes under forskjellige aktiveringstilstander, gir en pekepinn om hva som ville forut-sies basert på de kjente egenskaper av inhibitoren.

Bindingsundersøkelsene verifiserer at oMePUPA-V konkurrerer med den kjente inhibitor om bindingen til VLA-4 i kosentra-sjoner som stemmer overens med dens affinitet, og demon-strerer at de to forbindelser konkurrerer om den samme stilling på integrinet. Likheten av oMePUPA-Vs og den kjente inhibitors binding under forskjellige VLA-4-aktiveringstilstander tyder på at bindingsmekanismen er lignende.

7.2 Assay av oMePUPA-V i Panlabs- og Cerep-tester

oMePUPA-V ble testet i Panlabs Profiling Screen-, Discovery Screen- og Immunoscreen-rekken av radioligand-, enzym- og funksjonelle assayer og i Cerep-membranreceptorrekken.

Ingen signifikant aktivitet ble observert for oMePUPA-V vd 10 uM i noe assay, heller ikke NKl-receptorassayet, hvor kjente inhibitorer viste noe aktivitet.

Cerep rapporterte også at oMePUPA-V ikke viste noen inhibering mot human ACE-proteaseaktivitet. Kilden for ACE-prote-aser var humane endotelceler (HUVEC). <3>H-HGG, satt til HUVEC, ble konvertert til <3>H-hippursyre og glycylglycin av ACE. Kaptopril, en potent ACE-inhibitor, blokkerte omdan-nelsen med en IC50-verdi på 990 pM, mens oMePUPA-V ved 10 uM ikke gjorde dette.

Farmasøytiske egenskaper

oMePUPA-V er et hvitt til elfenbenshvitt krystallint pulver. Det er løselig i DMSO og har en vandig løselighet på 0. 120 mg/ml. Varmebeteendet av oMePUPA-V, undersøkt ved DSC, TGA og varmplatemikroskopi, tyder på at materialet smelter ved omtrent 160°C. Ved ca. 136°C tyder DSC- og TGA-analysene på at oMePUPA-V taper en flyktig urenhet, som kanske kan stemme overens med dehydreringen av et mono-hydrat.

Formulering

Forstøvningsformulering

Produksjonsanvisningene for 100 ml av en 5 mg/ml oMePUPA-V-forstøvningsformulering er oppført i det følgende.

Fremstil 200 ml stambufferoppløsning som følger:

1. Vei inn 0,286 g Trometamin, USP i en egnet beholder. 2. Vei inn 1,67 6 g Natriumklorid, USP i samme beholder.

3. Sett til 200 ml Vann for Injeksjon, USP.

Bland inntil homogen.

1. Vei inn 0,500 g oMePUPA-V i en egnet beholder. 2. Sett til 100 ml av bufferen fremstilt i trinn 1.

3. Bland inntil homogen.

4. Sterilfiltrer inn i en egnet beholder.

5. Forsegl med en egnet forsegling.

Typiske formuleringsegenskaper:

pH: 7,4; osmolaritet: 290 mOsm.

Kvalifikasjonen med preliminærmetoden ble fullført.

Drogesubstansstabilitet

Ingen degradering ble observert i bulkmellomproduktet etter at det var blitt lagret i to uker under de følgende lag-ringsbetingelser: ved 40°C i et lukket glass; ved 50°C i et lukket glass; ved 25°C, RH 60%; og ved 40°C, RH 75%. Etter fire uker ble én eller to spaltningstopper påvisbare ved 40°C og 50 °C, men nivået av hver urenhetstopp var fortsatt under 0,02%.

Oppløsningsstabilitet

a) Forstøvningsformulering, 5 mg/ml i Tris/NaCl, lagret ved romtemperatur i 2 måneder, viste tidlige eluerings-degradasjonstopper med et samlet nivå på 1% (ved 254 nm) og 2-3% (ved 215 nm). b) Oppvarming av forstøvningsformuleringen i kokende vann i 20 minutter nedsatte renheten fra 99,9% til 98,7% ved 254

nm og fra 100% til 93,6% ved 215 nm.

c) 0,2 mg/ml-oppløsningen i Tris/NaCl/vann ved nøytral pH-verdi er stabil ved 2-8°C i minst én uke.

Claims

1. Celleadhesjonsinhiberende forbindelse og farmasøytisk akseptable derivater, ester-prodroger, salter eller isomerer derav.

2. Farmasøytisk sammensetning omfattende en forbindelse ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

3. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 2, ytterligere omfattende et andre middel valgt fra gruppen omfattende kortikosteroider, bronkodilatorer, antiasthmatiske midler, antiinflammatoriske midler, antirheumatiske midler, immunosuppressive midler, antimetabolitter, immunomodulatorer, antipsoriatiske midler og antidiabetiske midler.

4. Farmasøytisk sammensetning omfattende den inhibitoriske forbindelse fra krav 1 og én eller flere celleadhesjonsinhiberende forbindelser.

5. Sammensetning ifølge krav 4, hvor den eller de celle-adhes jonsinhiberende forbindelser er en VLA-4-inhibitor.

6. Anvendelse av farmasøytisk sammensetning ifølge krav 2 ved fremstilling av et medikament egnet til forebyggelse, inhibering eller suppresjon av celleadhesjon i et pattedyr.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor medikamentet er beregnet til forebyggelse, inhibering eller suppresjon av en betennelse.

8. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 ved fremstilling av et farmasøytisk preparat egnet til behandling i et pattedyr av asthma, allergisk rhinitt, multippel sklerose, aterosklerose, inflammatorisk tarmsykdom eller multippelt myeloma.

9. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 ved fremstilling av et farmasøytisk preparat egnet til behandling av multippel sklerose i et pattedyr.

10. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 ved fremstilling av et farmasøytisk preparat egnet til behandling av inflammatoriske tarmforstyrrelser i et pattedyr.

11. Sammensetning ifølge krav 2, hvor esteren i ester-prodrogen er valgt fra metanol, etanol, propanol, butanol og rettkjedede eller forgrenede alkyl-Ci-Cio-alkoholer.