JP2002516309A - 新規ＶＬＡ−４阻害剤：ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＯＭｅＰＵＰＡ−Ｖ、（Ｒ）−Ｎ−［［４−［［（２−メチルフェニルアミノ）カルボニル］アミノ］フェニル］アセチル］−Ｌ−プロリル−３−メチル）−β−アラニン、細胞接着阻害剤、医薬組成物、及び細胞接着仲介病理の治療の方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、細胞接着と細胞接着によりもたらされる病状を、阻害、症状改善あ
るいは防止するのに有効な新規化合物に関する。

【０００２】 本発明はまたそれらの化合物を含む製剤と、細胞接着とそれによりもたらされ
る症状の阻害と防止のための使用方法に関する。 これらの化合物と本発明による医薬製剤は治療薬あるいは予防薬として使用す
ることができる。これらは多くの炎症や自己免疫疾患の治療に特に有効である。 本発明の背景 細胞接着は、細胞同士が寄り集まったり、特別な目的に向って移動したり、細
胞外マトリックス内で偏在したりする過程である。しかるに細胞接着は無数の生
物学的現象のうちでも最も基本的な機構の一つである。例えば、細胞接着は、造
血細胞と内皮細胞の接着をつかさどり、さらに造血細胞を血管から損傷のある場
所へと移動させる。しかるに、細胞接着は哺乳類において、炎症や免疫反応等の
病理に大いに関係している。

【０００３】 細胞接着の分子科学的研究のおかけで、多くの細胞表面高分子化合物−細胞接
着分子や受容体と総称される−が細胞相互の、あるいは細胞とマトリックスの相
互作用をつかさどることが明らかになってきている。例えば、“インテグリンス
ーパーファミリー”と呼ばれるタンパク質の一群は、造血細胞とその環境との接
着的相互作用をになっている分子である（Ｍ．Ｅ．Ｈｅｍｌｅｒ， ｐ１の文献
）。

【０００４】 インテグリンは共有結合を持たないヘテロニ量体で、αとβの二つのサブユニ
ットから成る。少なく見積もっても１７の異なるαサブユニット（α１〜α１０
，α−Ｌ，α−Ｍ，α−Ｄ，α−Ｘ，α−Ｄ，α−Ｖ，及びα−Ｅ）とαの異な
るβサブユニット（β１−β９）が現在までに知られて要る。α，βの種類によ
ってそれぞれのインテグリン分子をさらに分類することができる。

【０００５】 インテグリンα４β１は、Ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ−４（“ＶＬ
Ａ−４”）またはＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９とも呼称されるが、白血球の表面に存在
する受容体で、数多くの細胞間、あるいは細胞−マトリックス間の接着的相互作
用にかかわっている。（Ｍ．Ｅ．Ｈｅｍｌｅｒ、「インテグリンファミリーにお
けるＶＬＡ蛋白質：構造、機能および白血球に対するそれらの役割」Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８，ｐ．３６５（１９９０））。

【０００６】 このインテグリンは、サイトカイン誘導性の内皮細胞表面タンパク、血管細胞
接着分子−１（“ＶＣＡＭ−１”）、及び細胞外マトリックスタンパクであるフ
ィブロネクチン（“ＦＮ”）に対する受容体として機能する。（Ｒｕｅｇｇら、
Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１７７，ｐ．１７９（１９９１）；Ｗａｙｎｅｒら
、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０５，ｐ．１８７３（１９８７）；Ｋｒａｍｅ
ｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，ｐ．４６８４（１９８９）；Ｇｅｈ
ｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４，ｐ．１２２８（１９８８））。抗ＶＬＡ−
４モノクローナル抗体（“ｍＡｂ’ｓ”）が、ＶＬＡ−４依存性の接着作用を生
体外実験においても生体内でも、阻害することが示されている（Ｆｅｒｇｕｓｏ
ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８，ｐ．８０７２（１９９
１）；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０，ｐ．１１７２（１
９９３））。生体内における実験結果は、ＶＬＡ−４依存性の接着を阻害するこ
とにより、炎症や自己免疫疾患による症状を予防したり示唆している（Ｒ．Ｌ．
Ｌｏｂｂら、「α４インテグリンのｉｎ ｖｉｖｏでの病態生理学的役割」Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４，ｐｐ．１７２２−２８（１９９４））。

【０００７】 コモリヤ等は、ある種のフィブロネクチンのＣＳ−１領域（ＶＬＡ−４結合場
所）のアミノ酸配列を基に、多種のペプチドを合成し、ＶＬＡ−４結合に必要な
最小のアミノ酸配例を同定しようと試みた。（「選択的にスプライシングされる
フィブロネクチンのタイプＩＩＩセグメント領域内における主細胞型特異的接着
部位（ＣＳ１）の最少必須配列はロイシン−アスパラギン酸−バリンである」Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（２３），ｐｐ．１５０７５−７９（１９９１
））。彼らは、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒという８アミノ酸残基から成るペプチドを、また重複した配列を持つ２つの
５アミノ酸ペプチド（Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ及びＬｅｕ−Ａ
ｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）を、フィブロネクチン依存の細胞接着を阻害す
るペプチドとして同定した。この結果はＬｅｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌというペプチド
単位が細胞接着の必要最小単位であるとの示唆を与えた。その後、Ｌｅｎ−Ａｓ
ｐ−Ｖａｌは活性化されたＶＬＡ−４分子を発現している白血球にしか結合しな
いことが示され、この様なペプチドの生体内での有効性について疑問が提起され
た（Ｅ．Ａ．Ｗａｙｎｅｒら、「造血細胞によるフィブロネクチンのＶ領域にお
けるＬＤＶ配列の活性依存的認識」Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１６（２），
ｐｐ．４８９−４９７（１９９２））。しかしながらある種のより長いペプチド
でＬｅｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（ＬＤＶ配列を含むものが生体内で有効であることが
その後示されている（Ｔ．Ａ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、「２つのインテグリン結合
性ペプチドはｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞を介した免疫応答を排除する」Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，ｐｐ．８０７２−７６（１
９９１）；及びＳ．Ｍ．Ｗａｈｌら、「合成フィブロネクチンペプチドは白血球
の接着及び補充を中断することによってラット関節炎を抑制する」Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４，ｐｐ．６５５−６２（１９９４））。環状の５アミノ
酸ペプチドが、ＶＬＡ−４とＶＬＡ−５のＦＮへの接着を阻害するものとして記
述されている（例えば、Ｄ．Ｍ．Ｎｏｗｌｉｎら、「新規環状ペンタペプチドは
α４β１およびα５β１インテグリンを介した細胞接着を阻害する」Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（２７），ｐｐ．２０３５２−５９（１９９３）；及び
ＰＣＴ公報ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４８６２を参照）。この５アミノ酸ペプチドは
、ＦＮの一部であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐという細胞外マトリックスタンパク
認識領域としてよく知られている配列を基にしている。

【０００８】 他のＶＬＡ−４阻害剤も報告されている。例えばアメリカ合衆国特許０８／３
７６，３７２（参照により援用する）がその一例である。ＵＳＳＮ３７６，３７
２はβ−アミノ酸を含む直鎖状ペプチド様化合物を細胞接着阻害能を持つとして
いる。国際特許（参照により援用する）ＷＯ９４／１５９５８及びＷＯ９２／０
０９９５は環状ペプチドとペプチド様化合物を細胞接着能に影響を及ぼすとして
記述している。また、国際特許（参照により援用する）ＷＯ９３／０８８２３及
びＷＯ９２／０８４６４は、グアニジニル基、尿素基、チオ尿素基を含有する化
合物を細胞接着能を調節するものとして記述している。

【０００９】 合衆国特許Ｎｏ．５，２６０，２７７はグアニジル基を有する細胞接着能調節
化合物を記載している。 これらの進歩にかかわらず、現在でも、薬物動態的にも薬力学的にも経口投与
や長期にわたり接続する作用などすぐれた特長を持つ、ＶＬＡ−４依存性の細胞
接着の特異性な阻害剤が求められている。そのような化合物は、細胞接着とＶＬ
Ａ−４結合が関与している種々の病態を治療したり、改善したり、予防したり、
抑制したりするための有用な薬剤となり得るであろう。 発明の概要 本発明の化合物は、ＶＬＡ−４インテグリンの阻害剤であって、ＶＬＡ−４の
種々の配位子であるＶＣＡＭ−１やフィブロネクチンの結合領域へのＶＬＡ−４
の結合を阻止するものである。しかるにこれらの化合物は、細胞の活性化、移動
、増殖、分化等を含む細胞接着経路を阻害するのに有用である。これらの化合物
は、ＶＬＡ−４によりつかさどられる細胞接着とそれにより引き起こされる病態
、例えば多発性硬化症、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、炎
症性肺疾患、リウマチ様関節炎、感染性関節炎、Ｉ型糖尿病、臓器移植、再狭窄
、自己骨髄移植、ウイルス感染の炎症性後遺症、心筋炎、潰瘍性大腸炎やクロー
ン病を含む炎症性腸疾患、ある種の中毒性や免疫性腎炎、接触皮膚過敏症、乾せ
ん、腫瘍転移、多発性骨髄腫やアテローム性動脈硬化等を例として含む。

【００１０】 本発明の化合物は、単独であるいは他の治療薬か予防薬と併用し、細胞接着を
阻害したり、改善したり、予防したり抑制することができる。本発明はさらにこ
れらのＶＬＡ−４依存性細胞接着阻害剤を含む薬剤（製剤）、及びに細胞接着を
阻害するために本発明の化合物や配合物を使用する方法を提供するものである。 詳細な説明： 本発明は 配位子とその受容体の結合を阻害することによってＶＬＡ−４の関
与する細胞間接続を阻害する化合物を提供する。好ましい化合物は（R)-N-[[4-[
[(2-メチルフェニルアミノ)カルボニル]アミノ]フェニル]アセチル]-L-プロリル
-3-メチル)-β-アラニンであり下記の 構造式 １ によって示され, ここで
はoMePUPA-V と 呼ばれる。本発明は薬剤と許容されるoMePUPA-Vの誘導体、塩
、およびエステルをも含むことを目指している。

【００１１】

【化２】

【００１２】 構造式 １の化合物は一ケ所以上の非対称中心を含有し、従って、ラセミ体、
単一光学対掌体、ジアステレオマー混合物、もしくは個々のジアステレオマーと
して存在しうる。本発明は構造式 １の化合物のこれらの異性体すべてを含むこ
とを目指している。

【００１３】 請求されている発明は薬剤と許容される構造式 １の塩を含むことを目指して
いる。薬剤と許容される塩とは有機及び無機酸と有機及び無機塩を含む薬剤と許
容される無毒性の酸と塩基から調製された塩を示す。無機塩基から誘導された塩
はアルムニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、フェリック、フェラス、リチ
ウム、マグネシウム、マンガン塩、 マンガン性,カリウム、ナトリウム、亜鉛、
その他を含む。特に好ましいのはアンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カ
リウムおよびナトリウムの塩である。

【００１４】 薬剤と許容される無毒性有機塩基 から誘導された塩は第一、第二および第三
アミン、置換アミン類(天然に存在する置換アミンを含む)、環状アミン、および
塩基性イオン交換樹脂、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、N,
N-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール
、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エ
チルモルホリン、Ｎ-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジ
ン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリ
ン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロ
ミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミ
ンその他の塩を含む。

【００１５】 本発明の化合物が 塩基である時は薬剤と許容される有機 及び無機の無毒性
酸から塩を調製できる。この酸とは酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カン
ファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマルサン、グルタミン酸崑
さん、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リ
ンゴ酸、マンデリン酸、メタンスルホン酸、ムコ酸、.硝酸、パモエ酸、版と天
産、リン酸、サクシン酸、硫酸、酒石酸、ｐ-トルエンスルホン酸のごときを含
む。特に好ましいのは クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫
酸、および酒石酸である。

【００１６】 請求されている発明はプロドラッグ、特に、(R)-N-[[4-[[(2-メチルフェニル
アミノ)カルボニル]アミノ]フェニル]アセチル]-L-プロリル-3-メチル)-β-アラ
ニン のカルボキシル基が何らかのアルコールでエステル化されている エステ
ル プロドラッグを含む。このまれるアルコールはメタノール、エタノール、プ
ロパノール、ブタノール、または直鎖もしくは分子鎖アルキルC1-10アルコール
である。

【００１７】 構造式 １の化合物のもつＶＬＡ−４の作用を妨害する能力は、ＶＬＡ−４と
配位子との結合によって誘導される病気、症状、もしくは現象の予防、処理、逆
転に有用である。ゆえにこれらの拮抗体は細胞活性化、細胞移動、細胞増殖と細
胞分化を含む細胞間接続を阻害する。ゆえに本発明の 今一つの側面はＶＬＡ−
４経路が関与する病気や疾患の処理、予防、軽減、もしくは抑制の方法を提供す
ることにある。そのような病気や疾患は, 喘息、多発性硬化症、アレルギー性鼻
炎、アレルギー性結膜炎、炎症性肺疾患、リウマチ性関節炎、多発性ミエローマ
、敗血症性関節炎、1型糖尿病、臓器移植拒絶反応、炎症性腸疾患その他を含む
。

【００１８】 本発明の化合物はここで示される通常の技術でいずれを使用しても合成できる
。望ましいことはこれらの化合物がα−アミノ酸やその機能性均等物のような容
易に入手できる原材料から合成されることである。これらの化合物の合成にはMo
dular 法と convergent 法が望ましい。例えばconvergent 法では成長しつつあ
る分子鎖に段階的に小さな部分を加えていくよりも最終製品の大きな部分が最終
合成段階において接続されるほうが望まれる。

【００１９】 本発明の化合物は選択されたな生物特徴を強調するために適当な機能を加える
ことによって変化させることができる。そのような変化は分野において知られて
おり、特定の生物系（blood, lymphatic system, central nervous system) に
おける生物的導入を向上させるもの, また口腔投与可能性の増大、注射投与を可
能とする可溶性の増加、代謝の変化、と分泌速度の変化を含む。このような変化
はポリエチレングリコールでのエステル化、ピボレートもしくは脂肪酸置換成分 での誘導体化、カルバメートへの変換、芳香環のヒドロキシ化、および芳香環内 のヘテロ原子の置換を含み、かつそれに限定されない。

【００２０】 この請願書をとうして 患者とは 人間も含めた動物を意味する。また細胞と
はすべての細胞、そして望ましくは人間細胞もふくめた動物細胞を意味する。 一旦合成されたらば、本発明の化合物の活性とVLA-4 特異性は in vitro
および in vivo アッセイによって検定できる。

【００２１】 例えばこれらの化合物の細胞接続機能阻害活性はVLA-4表現細胞のフィブロネ
クチンかCS1にコートされたプレートへの結合の阻害に必要な阻害剤の濃度によ
って決定される。このタイプの測定ではマイクロタイターウエルがフィブロネク
チン( CS-1 配列を含む) か CS-1によってコートされる。もしCS-1が使用される
時はウエルによく結合するためにCS-1はウシ血清アルブミンのようなきゃりやー
蛋白質に複合されねばならない。一旦ウエルがコートされたらば、各種の濃度の
試験化合物が適当に標識されたVLA-4表現細胞と共に加えられる。また別法ではV
LA-4表現細胞がくわえられる前に試験化合物が最初に加えられてコートされたウ
エルでインキュベートされる。加えられた細胞最低３０分ウエルのなかでインキ
ュベートされる。インキュベーションの後、ウエルは空けられて洗われる。結合
の阻害は、それぞれの濃度の試験物質のに対応するウエルに結合した放射能か蛍
光の定量測定で計られる。対照は試験物質を含まなかったウエルである。

【００２２】 この測定に使えるVLA-4表現細胞はRamos cells, Jurkat cells, A375 メラノ
ーマ細胞とヒト末梢血リンパ球 (PBLs) をふくむ。この測定につかう細胞はい
かなる適当な方法で標識出きる。例えば蛍光的に、または放射能的な標識が可能
である。

【００２３】 本発明の化合物の阻害活性の定量測定には直接結合方式も使用できる。この測
定方法では IgG1分子 ("VCAM 2D-IgG") の蝶番区域の上部に接続しているVCA
M (D1D2)の２つの イムノグロブリン ドメインを含むVCAM-IgG 融合蛋白がアル
カリホスファターゼ ("AP")のような標識酵素に複合されている。このVCAM-IgG
融合蛋白の合成はPCT WO 90/13300において説明されており、その公開は参照に
より援用される。この融合蛋白と標識酵素は分野でよく知られた架橋反応法によ
って達成される。

【００２４】 VCAM-IgGー酵素複合体はMillipore Multiscreen Assay System (Millipore Co
rp., Bedford, MA)に含まれるマルチウエル濾過プレートに加えられる。各種の
濃度の試験阻害化合物がそれぞれのウエル に加えられた後、VLA-4表現細胞が加
えられる。VCAM-IgGー酵素複合体と細胞と化合物は混合され室温でインキュベー
トされる。

【００２５】 インキュベーションの後, ウエル は真空排水され、細胞と結合したVCAMが残
る。結合したVCAMの定量測定にはVCAM-IgGに複合された酵素に適応する発色基質
を加えて反応生産物の量を計る。反応生産物の減少は結合阻害活性の増大を意味
する。一部の測定法のプロトコールを次に説明する。

【００２６】 本発明の化合物のVLA-4 阻害特異性を評価する為に、他の主なインテグリング
ル−プ、β2 とβ3, さらにVLA-5,とVLA-6と α4β7のようなほかの β1 インテ
グリンを使って測定した。これらの測定法は既に説明された 接続阻害測定法と
直接結合測定法 と類似しており、適当なインテグリンー表現細胞とそれに対応
する配位子が代替えされている。例えば多型核細胞(polymorphonuclear cells)
(PMNs) はァ2 インテグリンをその表面に表現し ICAM.と結合する。β3 インテ
グリンは血小板の凝固に関与し阻害は 通常の血小板凝固測定法で測れる。VLA-
5がArg-Gly-Asp の配列に特異的に結合する一方、VLA-6はラミニンに結合する。
α4β7は最近発見されたVLA-4の相同体でやはりフィブロネクチンと VCAMと結合
する。α4β7の特異性は 上記のVCAM-IgGー酵素複合体とα4β7を表現しVLA-4
を表現しない細胞系、例えばRPMI-8866 か JY 細胞を使っ結合測定て計られた。

【００２７】 VLA-4-特異の阻害剤が 同定されると、つぎに生体内でさらに解析される。測
定法の一つはP.L. Chisholm et al., "Monoclonal Antibodies to the Integrin
a-4 Subunit Inhibit the Murine Contact Hypersensitivity Response", Eur.
J. Immunol., 23, pp. 682-688 (1993) と "Current Protocols in Immunology
", J. E. Coligan, et al., Eds., John Wiley & Sons, New York, 1, pp. 4.2.
1-4.2.5 (1991)におけるように動物における接触過敏症の阻害を検討する。これ
らの公開については参照して援用されている。この測定法では動物の皮膚がジニ
トロフルオロベンゼンのような刺激物にさらされて過敏化され、さらに鋭い角で
皮膚を引っ掻くような軽い物理的な刺激を与えた。回復期の後、動物は再度同じ
方法で過敏化させられた。過敏化処理の数日後 動物の片耳が刺激化合物に露出
され、他の耳は無刺激の溶液で処理された。耳の処理の直ぐ後で各種の投与量の
VLA-4 阻害剤が皮下注射で投与された。生体内の細胞間接続の関与する炎症は動
物の処理された耳と未処理の耳の膨張を計って測定した。膨張はノギスもしくは
たの適当な器具を使って耳の厚さをはかって測定した。このような方法で本発明
の化合物の内で炎症抑制に もっとも適したものを同定できる。

【００２８】 本発明の阻害剤の検討ni使える生体内測定法に羊の喘息測定法がある。この方
法はほぼW. M. Abraham et al., "α4-Integrins Mediate Antigen-induced Lat
e Bronchial Responses and Prolonged Airway Hyperresponsiveness in Sheep"
, J. Clin. Invest., 93, pp. 776-87 (1994), に説明された様に行われた。上
記の公開についてはreferenceにくみこまれている。この測定ではアレルギー性
の羊におけるAscaris antigenに誘導された後期の呼吸気道反応と気道過敏症を
計る。本発明の化合物は血小板凝固測定法においても検討できる。

【００２９】 この発明のVLA-4 阻害剤は予期以上の望ましい活性と特異性を示した。一般的
にはこれらの化合物はVLA-4 に特異的であり（a4b7とa5b1にたいして１０００
倍以上）、PanLabsと non-GLP エームスアッセイにおいて反応なく、普通の付帯
的な薬学試験において問題なく、羊のモデル実験で人体用に推定される１mg/day
かそれ以下の一日一度の投与で効果的だった。

【００３０】 特許請求されている化合物は構造的に関連のある VLA-4 i阻害剤にくらべて予
想以上の有効さを示した。例えばAscarisー敏感性の羊が一日一度 四日間噴霧
剤にされた薬を０．１mg／kg のレヴェルで処理した後、最後の処理から２４時
間以後に刺激したところ、以前に検討した化合物が初期反応をかなり弱め、後期
の気管支収縮と非特異過敏症の発生を防いだ。人間との生物相同性を仮定すれば
７mgの投与量が７０kgの人に必要となる。 さらに羊の場合には 薬は気管支
内管をとおして行われ、その速度は人間が口腔吸入で達成できる速度の２倍と推
定された。加えて、器具への充填および薬剤の配達を最適化するため二、最終的
固形剤型には助剤の添加が必要であろう。これらの要素を考えると人間における
投与必要量は１４mg を越すとかんがえられ、それは典型的な乾燥粉末吸入器（
ＤＰＩ）が一度の操作で投与できる１ー５mgをこしている。

【００３１】 ＤＰＩの複数の操作で必要量の投与はできるが典型的なステロイド投与量が０
。２ー１。０mgである喘息市場においては不利になる。oMePUPA-Vあは最低投与
量の０。０００３mg／kgで抗原に露出する２時間前に一度の噴霧された投与を行
うことで、 初期反応が弱まり後期の気管支収縮が止められ、過敏症が正常化さ
れた。さらに四日間に渡る一日当たり０。００１mg／kgの投与後、最後の投与の
２４時間後に抗原に露出した場合が最良の結果をえた。ゆえにoMePUPA-V は以前
の化合物にくらべて３０乃至１００倍ほど強力であり、その投与量は市販されて
いる最善のステロイド剤と同等である。oMePUPA-V と最後から二つ目の合成中
間剤は高度に結晶性である。（図1, 表1をみよ。） その上、oMePUPA-V は 既知のVLA-4 阻害化合物に比べて改善された代謝性
質を持つ。例えば、噴霧的な処理の後、請願される化合物は遥かに活性の低い代
謝物質に早く転換され、この転換物質が気管支液 （ＢＡＬＦ）内の主要産物で
あり全身の血液循環における主要産物でもあり、またはじめの化合物よりも血清
内で長もちした。急速な代謝による化合物のより低い活性を持つ物質への転換は
生体全体としての露出を減少させる点で望ましいが、活性が非常にひくか全くな
い副産物に変化される物質は開発途上での問題が少なく背後条件からみてのぞま
しい。

【００３２】 予測できる oMePUPA-Vの淡白分解産物はVLA-4結合測定で活性がないので淡白
分解はとにかく非活性物質をつくり出す。しかし、非生体代謝研究でもまたラッ
ト、犬、と羊における生体内ＰＫ実験でも oMePUPA-V は蛋白分解にたいして安
定していることを示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】 本発明の化合物は経口的に、非経口的に、吸入スプレーとして、局所的に、直
腸に、経鼻的に、側頬（バッカル）に、経膣的に又は埋め込まれたレザバーによ
り投与することができる。この明細書において使用される「非経口」とは、皮下
、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、包膜内、肝臓内、病巣内及び頭部
注射、又は輸液を含む。

【００３５】 本発明の医薬組成物は、本発明のどの化合物及びそれらの医薬上許容される誘
導体と、薬学上許容される担体とを含有している。本明細書で使用される「担体
」とは許容される助剤及びベヒクルを含む。本発明の医薬組成物に使用できる医
薬上許容される担体としては、これに限定されるものではないが、イオン交換樹
脂、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レクチン、血清タンパク（例えば、
ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸
、ソルビン酸ナトリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は
電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素ニナトリウム、リン酸水素カリウ
ム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、トリ珪酸マグネシウム、ポ
リビニルピロリドン、セルロース性物質、ポリエチレングリコール、ナトリウム
カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルエステル、ワックス、ポリエチレン
−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及びウー
ル脂肪等である。

【００３６】 本発明によれば、医薬組成物は、滅菌注射製剤、例えば滅菌注射水性又は油
性懸濁液であっても良い。この懸濁液は、適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用
い、公知の技術により処方できる。滅菌注射製剤は、非毒性の非経口的に許容さ
れる希釈剤又は溶剤、例えば１，３−ブタンジオール溶液、を用いた滅菌した注
射用溶液又は懸濁液であっても良い。使用可能な許容できるベヒクル及び溶剤と
しては水、リンガーズ溶液、等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌、固
定油脂（fixed oil)も溶剤又は懸濁媒体として好都合に使用できる。この目的に
は、合成モノ−又はジ−グリセリド類を含むどのような混合固定油脂も使用でき
る。オレイン酸のような脂肪酸及びそのグリセリド誘導体は、天然医薬上許容で
きる油脂（例えばオリーブ油又はひまし油）、特に、それらのポリオキシエチレ
ン化修飾体として、注射製剤に有用である。これらの油脂の溶液又は懸濁液は、
長鎖アルコール希釈剤又は分散剤をさらに含んでいても良い。

【００３７】 本発明の医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、カプセル、錠
剤、水性懸濁液、水溶液のような如何なる経口投与可能な投与形態において経口
投与できる。経口用錠剤の場合、通常使用される担体としては、ラクトース及び
コーンスターチがある。ステアリン酸マグネシウムのような滑剤も典型的には添
加される。カプセル剤形の経口投与については、有用な希釈剤としてはラクトー
ス及び乾燥コーンスターチがある。経口用として水性懸濁液が要求される場合、
活性成分は乳化剤及び懸濁剤と組合せて使用できる。所望であれば、甘味剤、香
味剤、又は着色剤を添加することもできる。

【００３８】 別の態様としては、本発明の医薬組成物は、直腸投与用の坐剤の形態で投与
することもできる。これらは活性成分を、室温で固形でありかつ直腸温度で液体
となる適当な非刺激性の賦形剤と混合して調製できる。それによって、坐剤は直
腸中で溶解され、活性成分が放出される。このような物質としては、ココアバタ
ー、蜜ロウ及びポリエチレングリコールがある。

【００３９】 本発明の医薬組成物は局所投与も可能である。特に、治療すべき目標が局所
適用によって容易にアクセスできる部位又は器官、例えば、目、皮膚又は下部の
腸管である場合に可能である。適切な局所用製剤は、これら部位又は器官のそれ
ぞれに対する使用のために、容易に調製できる。下部の腸管用の局所投与は、直
腸用坐剤（上記参照）の形態で又は適切な浣腸剤の形態で行うことができる。

【００４０】 局所適用としては、１又は２以上の担体中に溶解又は懸濁させた活性成分を
含有する適当な軟膏の形態に処方できる。本発明の局所投与用の担体としては、
これに限定されるものではないが、鉱油、液状ワセリン、白色ワセリン、ポリエ
チレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワ
ックス及び水がある。別の態様としては、医薬組成物は、１又は２以上の薬学的
に許容される担体中に溶解又は懸濁された活性成分を含有する適切なロオーショ
ン又はクリームの形態に処方できる。適切な担体としては、これに限定されるも
のではないが、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチ
ルエステルワックス、セチルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジル
アルコール及び水が含まれる。

【００４１】 眼用使用のためには、医薬組成物を、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤
を含むかまたは含まない、等張性でpH調整した滅菌塩類溶液中の微粉化（micron
ized）懸濁物として、あるいは好ましくは等張性でpH調整した滅菌塩類溶液中の
溶液として、製剤化することができる。あるいは、眼用使用のため、医薬組成物
をワセリンなどの軟膏中に製剤化することができる。

【００４２】 本発明の医薬組成物を、ネブライザー、乾燥粉末吸入、あるいは計量用量吸入
を使用することを介して、鼻用エアロゾルまたは吸入により投与することもでき
る。このような組成物を医薬用製剤の技術分野において周知の技術にしたがって
調製し、そしてベンジルアルコールまたはその他の適した保存剤、生物利用性を
向上するための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／またはその他の従来から
の溶解剤または分散剤を使用して、塩類溶液中の溶液として調製することができ
る。さらに、本発明の組成物は、医薬的に許容可能な担体のいずれか、例えば乾
燥粉末製剤のためのラクトースなどを含んでもよい。

【００４３】 単一用量剤形を生成するための担体物質と組み合わせることができる活性成分
量は、治療する宿主および特定の投与様式に依存して変更することができる。し
かしながら、特定の患者のいずれかに対する特定の用量および治療処方が、使用
される特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食餌、投与時
間、排出速度、薬物組合せ、そして治療する医師の判断および治療されるべき特
定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存しうることを理解すべきである。活性
成分量は、場合により同時に投与される活性成分を含む、治療剤または予防剤に
依存することもできる。

【００４４】 細胞接着を防止し、抑制しまたは阻害するために有効な本発明の化合物の用量
および適用量は、阻害物質の性質、患者のサイズ、治療の目的、治療すべき病理
の性質、使用される特定の医薬組成物、そして治療する医師の判断などの様々な
因子に依存しうる。1日当たり約0.001〜約100 mg/kg体重の用量レベル、好まし
くは約0.01〜約50 mg/kg、そしてより好ましくは1日当たり10 mg/kg体重の活性
成分化合物が有用である。

【００４５】 静脈内投与用の組成物を使用する場合の使用については、適した用量範囲は、
約0.001 mg〜約25 mg/kgであり、より好ましくは約0.01 mg〜約1 mg/kgである。 もう１つの具体例によれば、本発明の化合物を含む組成物は副腎皮質ステロイ
ド、気管支拡張剤、抗喘息剤（肥満細胞安定剤）、抗炎症剤、抗リュウマチ剤、
免疫抑制剤、抗代謝剤、免疫調節剤、抗乾癬剤および抗糖尿病薬からなる群から
選択される追加の薬剤を含むことができる。これらの各クラス内の特異的化合物
は”Comprehensive Medical Chemistry”Pergamon Press, Oxford, England, pp
.970-986(1990)（）（この文献の開示内容は参照により本明細書に取り込まれる
）と題する適当なグループとして列挙されている化合物のいずれからでも選択で
きる。このグループには、また、テオフィリン、スルファザラジンおよびアミノ
サリシレート（抗炎症剤）；シクロスポリン、ＦＫ−５０６，およびラパマイシ
ン（免疫抑制剤）；サイクロフォスファミドおよびメトトレキセート（抗代謝剤
）；ステロイド類（吸入、経口又は外用）およびインテーフェロン類（免疫調節
剤）の様な化合物も含まれる。さらに、本発明の化合物はさらに細胞接着阻害剤
と組み合わせて投与できる。１つ以上の薬剤を特許請求されたＶA−４阻害剤と
組み合わせて投与するときは、活性成分は一緒に配合でき、あるいは組み合わせ
て投与できる。１つ以上の薬剤を本発明のＶA−４阻害剤と組み合わせて投与す
るのは実質的に同時、あるいは連続でよい。当業者は、送達されるべき薬剤、所
望の結果、および処置される患者と状態に応じて最適の適用を容易に決定できる
。

【００４６】 他の態様によれば、本発明は、細胞接着に関連した炎症、及び患者の細胞接着
に関連した免疫性又は自己免疫性応答を予防し、阻害し、又は抑制するための方
法を提供する。ＶＬＡ−４に関連した細胞接着は、多様な炎症、免疫性及び自己
免疫性疾患において中心的な役割を果たす。したがって、本発明の化合物によっ
て細胞接着を阻害することは、炎症、免疫性及び自己免疫性疾患を治療し、又は
予防するための方法において有用であり得る。好ましくは、本発明の方法を用い
て治療されるべき疾患は、喘息、関節炎、乾癬、移植拒絶、多発性硬化症、糖尿
病及び炎症性腸疾患である。

【００４７】 これらの方法は、本発明の化合物を単独治療で、又は抗炎症剤若しくは免疫抑
制剤との組み合わせで使用できる。そのような組み合わせによる治療は、同時期
に又は異なった時期に投与される、一回の投薬形態又は複数回の投薬形態におい
て該薬剤の投与を含む。

【００４８】

【実施例】

実施例１ ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの合成 ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ，（Ｒ）−Ｎ−〔〔４〔（２−メチルフェニルアミノ）カ
ルボニル〕アミノ〕フェニル〕アセチル〕−Ｌ−プロピル−３−メチル）−β−
アラニン，は、商業的に入手可能な二つの化合物、サクシニミジルＢｏｃ−（Ｌ
）−プロリン（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＳｕ，Ｂａｃｈｅｍ）と（Ｒ）−ベンジル−
３−アミノブチラートヘミサルフェート（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、から合成された。

【００４９】 出発物質の縮合はトリエチルアミンの存在下、塩化メチレン中で行ない、ＢＯ
Ｃ保護基の加水分解はねジオキサン中４規定の塩酸によった。その結果、塩化メ
チレン−エーテルから再結晶できる塩酸塩が得られた。この塩酸塩を、サクシニ
ミジル−２−〔４−〔２−（メチルフェニルアミノカルボニル）〕アミノフェニ
ルアセテート（ＭＰＵＰＡ−ＯＳｕ，対応する酸であるＭＰＵＰＡ−ＯＨ（Ｒｉ
ｃｅｒｃａ製）より合成）と縮合させ、結晶性のｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ−ベンジル
エステルを得た。本エステルをＴＨＥ／Ｈ２Ｏ（９：１）中で水素添加し（１０
％ｐｄ／ｃ）、ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖが得られた。この最終化合物は２０％アセト
ン水溶液から再結晶して白色結晶として得られた。 物理的特徴 化合物名： （Ｒ）−Ｎ−〔〔４〔（２−メチルフェニルアミノ）カルボニル
〕アミノ〕フェニル〕アセチル〕−Ｌ−プロピル−３−メチル）−β−アラニン 化合物の分子式： Ｃ２５Ｈ３０Ｎ４Ｏ５ 分子量： ４６６．５３ 外見： 白色粉末 融点： １５３．６−１５４．４℃ スキーム１． ＭＰＵＰＡ−ＯＨ（１）からのＭＰＵＰＡ−ＯＳｕ（２）の合成

【００５０】

【化３】

【００５１】 Ｂｏｃ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−ＯＳｕ（３）とベンジル−（Ｒ）−３
−アミノブチレートヘミサルフェート（４）からのｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ（８）の
合成

【００５２】

【化４】

【００５３】 ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの合成 ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの合成する有機合成はスキーム１と２に示されている。出
発化合物は商業的に入手可能か、あるいは委託合成したる （１）はオハイオ州ペインズビルのＲｉｃｅｒａ社によって大量合成され、（３
）（４）はそれぞれフィラデルフィア州キングオブプルージアのＢａｃｈｅｍ社
とニュージャージー州ウォーレンのＣｅｌｇｅｎｅ社より入手した。 ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの製造 一般分析方法（¹Ｈ ＮＭＲ，¹³Ｃ ＮＭＲ，ＭＳ，ＩＲ及びＨＰＬＣ） ¹Ｈ ＮＭＲはＢｒｕｋｅｒ ＡＣ３００又はＶａｒｉａｎ ５００又はＶａ
ｒｉａｎ ６００のいずれかの機器において実施し、サンプルはＤＭＳＯ−ｄ₆
において処理し、ＤＭＳＯ−ｄ₆（ｄ２．４９ｐｐｍ）を参照したか、又はＣＤＣ
ｌ₃において処理し、残留ＣＨＣｌ₃（ｄ２．７４ｐｐｍ）を参照した。

【００５４】 ¹³Ｃ ＮＭＲはＶａｒｉａｎ ５００又はＶａｒｉａｎ ６００のいずれかの
機器において実施し、サンプルはＤＭＳＯ−ｄ₆において処理し、ＤＭＳＯ−ｄ₆ （ｄ４０．５ｐｐｍ）を参照したか、又はＣＤＣｌ₃において処理し、ＣＤＣｌ₃
（ｄ７７．０ｐｐｍ）を参照した。

【００５５】 質量スペクトルはＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ１５００ Ａ
ｕｔｏＳａｍｐｌｅｒによるＦｉｓｏｎｓ ＶＧ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＬＣ−Ｍ
ｓ−ＤＳ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで実施し、デー
タはＦｉｓｏｎｓ ＶＧ ＭａｓｓＬｙｎｘ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔ
ｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで処理した。ＨＲＭＳ分析はＭ−Ｓｃａｎ（ＰＡ
）においてＶＧ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＺＡＢ ２ＳＥ高電界質量分析計上で
のＦａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔを用いてＳＯＰ＃ＭＳ−００２
、ＭＳ−００６、ＭＳ−０１２及びＭＳ−０２３を参照して実施した。セシウム
・イオン・ガンを用いて、質量スペクトルを得るためのイオンを発生させ、質量
スペクトルをＰＤＰ−１１−２５０Ｊデータ系を用いて記録した。

【００５６】 ＩＲスペクトルはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １６００Ｓｅｒｉｅｓ ＦＴＩ
Ｒ上で記録した。 分析ＨＰＬＣクロマトグラフィーは次のように実施した： １．Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ７８５Ａ ＵＶ検出器（２１４ｍｍに設定）と、
ＰＥ Ｎｅｌｓｏｎ １０２０積分器付きＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ ７８３Ａ ＵＶ検出器（２５４ｍｍに設定）とによってＰｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ２００ ＨＰＬＣオートサンプラー系を用いて、Ｐｒｏ
ｇｒａｍ １（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ＠２０％Ｂ、注入サンプル、２０％Ｂ（
１分間）、２０％〜７０％Ｂ（２４分間）、７０％〜１００％Ｂ（１７分間）を
用いたクロマトグラムを得た。面積％値のみを記録した。 ２．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４００ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、Ｗａｔｅｒｓ ７１７オートサンプラーを
用いる７８３Ａ波長ＵＶ検出器（２５４ｍｍに設定）によって、Ｐｒｏｇｒａｍ
８（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ＠１５％Ｂ、注入サンプル、１５％Ｂ（１分間）
、１５％〜４０％Ｂ（２５分間）、４０％Ｂ（１０分間）を用いたクロマトグラ
ムを得た。データをＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ３３９６ Ｓｅｒｉｅｓ
ＩＩ積分器を用いて処理した。積分器は次のパラメーターによって設定した：
減衰＝８、閾値＝５、エリア・リジェクション(area rejection)＝１００００、
ピーク幅＝０．０４、チャート速度＝０．２． 全てのＨＰＬＣ分析はＶｙｄａｃ Ｃ−１８カラム（５ｍ孔径、４．５ｍｍｘ
２５ｃｍ、ｃａｔ．＃２１８ＴＰ５４）を用いて行った。 溶媒Ａ（水＋０．１％ＴＦＡ） 溶媒Ｂ（アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ） 流量＝１ｍｌ／分 勾配プログラムは次の通りである： プログラム１：Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ＠２０％Ｂ、注入サンプル、２０％Ｂ（
２分間）、２０％〜７０％Ｂ（２５分間）、１００％Ｂ（５分間）。［４−［［［（２−メチルフェニル）アミノ］カルボニル］アミノ］フェニル］
酢酸（１，ＭＰＵＰＡ−ＯＨ；Ｐｉｃｅｒｃａ Ｉｎｃ．によって製造された物
質）に関する物理的データ： ｍｐ．２１０〜２１５℃（分解）； ＩＲ（ＫＢｒ）３２９５（ｂｒ帯），３０３４（ｂｒ帯），１７０７，１６３７
，１６０３，１５５１，１５１６，１４５７，１４１４，１３０２，１２４１，
１１８９，１１１８ｃｍ^-1；¹ Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆）ｄ１２．２８（ｂｓ、１Ｈ），９
．０（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１
Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ
，２Ｈ），７．１６（ｍ，２Ｈ），６．９４（ｄｄ，Ｊ＝７．８，８．４Ｈｚ，
１Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ）；¹³ Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）ｄ１７３．０（Ｃ），１５２．
７（Ｃ），１３８．５（Ｃ），１３７．５（Ｃ），１３０．２（ＣＨ），１２９
．８（ＣＨ），１２８．３（ＣＨ），１２７．５（ＣＨ），１２６．２（ＣＨ）
，１２２．７（ＣＨ），１２１．０（ＣＨ），１１８．１（ＣＨ），４０．１（
ＣＨ₂），１７．９（ＣＨ₃）； ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ２８５（Ｍ＋１）⁺，１９３，１５２，１３４，１３２，１
０９，１０８，１０６，９３，９１，５７； 分析：Ｃ₁₆Ｈ₁₆Ｎ₂Ｏ₃としての計算値：Ｃ，６７．５９；Ｈ，５．６７；Ｎ，９
．８５；実測値：Ｃ，６７．６０；Ｈ，５．７０；Ｎ，１０．０１．スクシンイミジル［４−［［［（２−メチルフェニル）アミノ］カルボニル］ア
ミノ］フェニル］アセテート（２，ＭＰＵＰＡ−ＯＳｕ）の製造 アセトニトリル（６００ｍｌ）中のｏ−メチルフェニルウレアフェニル酢酸（
１，ＭＰＵＰＡ−ＯＨ；１５０ｇ，０．５０１ｍｏｌ；Ｒｉｃｅｒｃａ Ｉｎｃ
．から）の還流懸濁液に、塩化チオニル（４１ｍｌ、０．５５８ｍｏｌ）を１０
分間にわたって激しく撹拌しながら加えた。多量のＨＣｌが発生した。反応混合
物を絶えず撹拌しながら１．５時間かけて室温に冷却した。反応混合物はピンク
色スラリーに変わり、これに固体Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ；７
５．５ｇ、０．６３６ｍｏｌ）を１回で加えた。この混合物に、トリエチルアミ
ン（１７４ｍｌ）を３０分間にわたって滴加し、この間反応混合物の温度を水浴
によって６０℃未満に維持した。撹拌を２時間続け、次に蒸留水（５００ｍｌ）
を反応混合物に加えた。固体を濾過し、２Ｌの蒸留水とアセトニトリル（２ｘ２
００ｍｌ）とによって洗浄し、風乾させ、さらに真空（〜０．１ｍｍＨｇ）下、
Ｐ₂Ｏ₅上で乾燥させて、粗生成物（１７５ｇ、９７％収率）をベージュ色粉末と
して得た。粗生成物（１７４ｇ）をアセトニトリル（３．５Ｌ）から木炭（１０
ｇ）によって脱色して再結晶して、１２９ｇのＭＰＵＰＡ−ＯＳｕ（２；６８％
収率）を白色粉末（純度＞９９％）として得た。 ｍｐ．２１１．２〜２１１．８℃； ＩＲ（ＫＢｒ）：３９０５−３２０３（ｂｒ帯），１８１６，１７８３，１６５
４，１３６８，１３０４，１２４４，１１１６，１０２１ｃｍ^-1；¹ Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆）：ｄ９．０４（ｓ、１Ｈ），７．
８２（ｄ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ
＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１５（ｍ，２Ｈ），６．９３（ｄｄ，Ｊ＝７．４，
７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．０２（ｓ，２Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ）、２．２３
（ｓ、３Ｈ）； ＭＳ（ＥＩ，ＥＳ⁺）ｍ／ｚ３８２［（Ｍ＋１）⁺］，２３９，１０８，１０６． スクシンイミジル Ｂｏｃ−（Ｌ）−プロリン（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＳｕ，３；
Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの物質）に関する物理的データ： ｍｐ．１３２〜１３６℃； ＩＲ（ＫＢｒ）：３４５６，２９４０，１７３１，１６１９，１５６１，１５４
１，１４９７，１４５４，１３９５，１３３７，１２５９，１２０２，１１１８
，１０６０ｃｍ^-1；¹ Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：ｄ４．５１（ｄｄ，Ｊ＝３．８，８
．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５６（ｍ，１Ｈ），３．４４（ｍ，１Ｈ），２．８０（
ｓ，４Ｈ），２．３２（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｍ，１Ｈ），１．９４（ｍ，２
Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）； ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ３３５（Ｍ＋Ｎ₂）⁺，２７９，２１３，１３８，１１４，８
６； ＨＰＬＣ：９７．１％．ベンジル−（Ｒ）−３−アミノブチレートヘミスルフェート（４；Ｃｅｌｇｅｎ
ｅ Ｃｏｒｐ．から得た物質）に関する物理的データ： ｍｐ．２４９．４〜２４９．８℃； ＩＲ（ＫＢｒ）：３５１５，３３８３，２９８９，２９４５，２８８０，１８２
１，１７８８，１７４４，１７０１，１４７６，１４５４，１４２１，１３９４
，１３６８，１２６０，１２４１，１２０２，１１５９，１０７７ｃｍ^-1；¹ Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：ｄ７．８５（ｂｓ，２Ｈ），７．２
６（ｓ，５Ｈ），５．０６（ＡＢｑ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），４．３５（ｍ
，２Ｈ），３．７３（ｍ，１Ｈ），２．９２（ｄｄ，Ｊ＝６．４，１７．０Ｈｚ
，１Ｈ），１．３５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）； ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ１９５（Ｍ＋３）⁺，１９４（Ｍ＋２）⁺，１０６，９２，９
１； ＨＰＬＣ：９９．０％．N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-プロリル-3-メチル-(R)-β-アラニンベンジル
エステル(5)の製造 CH₂Cl₂(200mL)中のベンジル-R-3-アミノブチレートヘミサルフェート(４；66.
7g，213mmol)のよく撹拌した懸濁液に、Boc-(L)-Pro-OSu(３；53.9g，222mmol)
及びEt₃N(95mL，681mmol)を添加した。反応混合物を放置して室温で２時間撹拌
した。反応混合物をEtOAc(1.5L)とH₂O(250mL)との間で分配し、有機層を10%クエ
ン酸(３×250mL)、H₂O(250mL)、飽和重炭酸ナトリウム(250mL)、H₂O(250mL)及び
塩水(３×250mL)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、最初にロータリーエバポレーター(
40℃；〜80mmHg)で、続いて高真空(室温、16時間；0.2mmHg)で濃縮すると、(NMR
により)残存するEtOAcとCH₂Cl₂とを含有する粘稠油状物の中間体５(88.1g)が得
られた。純度＞98%(HPLC)を示した。この物質をさらに精製することなく、以下
の反応で使用した。

【００５７】

【化５】

【００５８】L-プロリル-3-メチル-(R)-β-アラニンベンジルエステル塩酸塩(6)の製造 先の反応からの中間体５に、ジオキサン(240mL)中の4N HClの溶液を徐々に添
加した。気体が激しく発生した(注意：発熱性)。反応混合物を放置して室温で撹
拌(２時間)し、最初にロータリーエバポレーター(45℃，〜80mmHg)で、続いて高
真空で一晩(室温，14時間、〜0.2mmHg)で濃縮すると、非常に粘稠な物質が得ら
れ、これをCH₂Cl₂/Et₂O(600mL/700mL)から結晶化すると白色固体(HPLC純度99.6%
)のHCl塩６ 64.0g(２段階全体で92%収率)が得られた。

【００５９】

【化６】

【００６０】N[[4-[[(2-メチルフェニルアミノ)カルボニル]アミノ]フェニル]アセチル]-L-プ
ロリル-3-メチル)-(R)-β-アラニンベンジルエステル(7)の製造 DMF(125mL)中のHCl塩６(61.77g，189mmol)の溶液に、MPUPA-OSu(２；69.39g，
181.9mmol)、続いてEt₃N(90mL，pH〜10)を添加した。反応混合物を放置して3.5
時間撹拌し、次いでEtOAc(１L)で希釈し、H₂O(３×250mL)で抽出した。この時点
で、生成物が沈澱し始めた。クエン酸の10%溶液(250mL)を有機層に添加し(注意
：発熱性！)、振盪すると、多量の沈澱が形成した。固体を焼結-ガラス漏斗(2L
，M)上で濾過した。この固体をクエン酸(10%，２×250mL)、H₂O(250mL)、飽和重
炭酸ナトリウム(２×250mL)、H₂O(250mL)及び塩水(３×250mL)で洗浄し、吸引濾
過(〜80mmHg)しながら一晩(〜14時間)漏斗上で乾燥すると、オフホワイト色の固
体が得られ、これをTHF/Et₂O(1L/1.4L)で再結晶すると、白色固体の化合物７83.
3g(HPLC純度99.6%)が得られた。

【００６１】 濾液をさらにクエン酸(10%，３×250mL)、H₂O(250mL)、飽和重炭酸ナトリウム
(２×250mL)、H₂O(250mL)及び塩水(３×250mL)で洗浄した。水で洗浄する度にさ
らに化合物が析出したが、洗浄を続ける場合には、沈澱を失わないように留意し
た。濾過により白色固体状の生成物4.02gが得られた。濾液を最終的にEt₂O(１Ｌ
)で希釈し、濾過し、固体をEt₂O(３×100mL)で洗浄すると、白色固体がさらに1.
67g得られた。この反応の全体の収率は88%であった。

【００６２】

【化７】

【００６３】N-[[4-[[(2-メチルフェニルアミノ)カルボニル]アミノ]フェニル]アセチル]-L-
プロリル-3-メチル)-(R)-β-アラニン(８；oMePUPA-V)の製造 THF/H₂O(9:1；800mL)中のOMePUPA-V-OBn(７；80.18g)の溶液をPd/C(10%；2.44
g)の存在下で〜55psiで水素化した。25時間後、反応混合物を焼結-ガラス漏斗上
Solka Floc(登録商標)(144g；Fiber Sales＆Development Corp.)を通して濾
過した。次いで濾液を別のSolka Floc(登録商標)(115g)床を通して再び濾過し
、〜250mLに濃縮し、激しく撹拌しているトルエン(3L)中に徐々に添加した。懸
濁液を0.5時間撹拌し、濾過(2L焼結ガラス漏斗)し、得られた白色粉末を最初に
吸引(〜80mmHg)しながら漏斗上で、続いて真空オーブン(14時間；45℃；N₂流を
流しながら25inHg減圧に調整した圧力)中で乾燥した。白色の塊を砕いて(乳鉢と
乳棒)微粉末にすると、白色固体のoMePUPA-V58.3g(87%収率)が得られた。生成物
をアセトン/H₂O(320mL/75mL)から再結晶した。結晶を集めて、最初に吸引(１時
間、80mmHg)しながら焼結ガラス漏斗上で、続いて真空オーブン(25時間；45℃；
N₂流を流しながら25inHg減圧に調整した圧力)で乾燥すると、白色固体(HPLC純度
99.1%)のoMePUPA-V47.0g(再結晶から84%回収)が得られた。

【００６４】

【化８】

【００６５】 実施例２ 体重２７−５０ｋｇのアレルギー症状を示す羊を用いた。全ての羊は、Ａｓｃ
ａｒｉｓ ｓｕｕｍ（回虫の一種）の噴霧投与に対して初期及び後期の気管支反
応を示すことが過去に示されている。羊は意識のある状態で、改変され買物用カ
ートを用いて腹臥位で頭部固定により２％リドケインによる鼻の局部麻酔の後、
バルーンカテーテルを一方の鼻孔より食道下部へ通した。他の鼻孔にはカフ付き
の気管内チューブをファイバー気管支鏡を案内として挿入した。

【００６６】 本実験で用いられた全てのプロトコールは、マウントサイナイメディカルセン
ター動物研究委員会に於いて承認されている。同委員会は実験動物の人道的飼育
を使用して責任がある。胸腔内圧力は１ｍｌの空気を注入した食道内バルーンカ
テーテル（胃と食道の接合部位より呼息終了時の胸内圧は−２〜５ｃｍＨ２Ｏで
あった。バルーンは一旦挿入されると実験終了時まで同じ位置にとどめ置かれた
。気管内の外圧は、気管内チューブの先端部に置かれた側孔付きカテーテル（内
径２．５ｍｍ）によって測定された。

【００６７】 気管内と胸腔内の圧力測定カテーテルはそれぞれ異なる圧力変換器へと連がれ
た。（ＭＰ４５，カリフォルニア州ノースリッジのバリダイン製）。気管内と胸
腔内の圧力差として定義される肺内外圧差はこのようにして測定された。気流は
気管内チューブの近位を呼吸気流計に連結することにより測定した。（Ｆｌｅｉ
ｓｃｈ，フィラデルフィア州ブルーベルのダイナサイエンス社製）。

【００６８】 肺内外圧差と気流の信号は、肺内外圧差の変化を、（デジタル積分で得られる
）呼吸中心時の容積における気流の変化で割り算し、平均肺内外圧差気流抵抗（
ＲＬ）をオンラインで求めるために８０−３８６ＤＯＳコンピュータに接続され
た多チャンネル生理学レコーダーに記録した。最小でも５回の呼吸がＲＬ（ｃｍ
Ｈ２Ｏ／Ｌ／ｓｅｃ）を求めるために用いられた。ＲＬの測定値後に、気管内ガ
ス体積（Ｖｔｇ）が一定体積プレチスモグラフ法によって測定され、特異的肺抵
抗（ＳＲＬ＝ＲＬ×Ｖｔｇ）が求められた（Ｌ×ｃｍＨ２Ｏ／Ｌ）。

【００６９】 液体のエアロゾル化は使い捨て医療用ネブライザーインドロップ，カンサス州
レネクサ，ピューリタンベネット社製）によって行なわれた。このエアロゾルの
空気動力学的直径はアンダーソンのカスケードインパクターによって求めたとこ
ろ３．２μｍである。ネブライザーは薬量計（ソレノイドバルブと２０ｐｓｉの
圧縮空気より成る）に接続されている。ネブライザーの出口はプラスチック製の
Ｔ字型部品に導かれている。一方の先はピストン式人口呼吸器（マサチューセッ
ツ州ナテイック，ハーバードアパラタス社製）に接続されている。

【００７０】 ソレノイドバルブは、人口呼吸器の吸息相開始時に一秒間だけ開く。エアロゾ
ルは、一呼吸５００ｍｌが、一分間に２０呼吸の割合で放出される。気管支の反
応を見るために、カルバコールを用いた累積濃度反応曲線が求められた。これは
、特異的肺抵抗（ＳＲＬ）を担体吸入直後と、１０呼吸にわたり、増加していく
それぞれの連続したカルバコール投与の直後（０．２５，０．５，１．０，２．
０，及び４．０％Ｗ／Ｖの生理食塩溶液）に行なわれた。この刺激試験はＳＲＬ
が生理食塩水（担体）と比べて４００％以上増加した場合、あるいは最高濃度の
カルバコールが投与された時点で中止された。気管支反応性は担体投与後に比較
してＳＲＬが４００％以上増加した時点（ＰＣ４００）での（呼吸指数で表わさ
れる）累積カルバコール濃度によって示された。一呼吸指数（ＢＵ）とは、１％
のカルバコール溶液（Ｗ／Ｖ）の一呼吸に相当する。

【００７１】 投与するｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖはエタノール：生理食塩水（１：２），エタノー
ル：２００ｍＭリン酸ナトリウム（１：５），もしくはトリスバッファー中に溶
解した。トリスバッファー使用時には、希釈は生理食塩水を用いて行なった。投
与量は、３〜５ｍｌの溶液量として準備された。

【００７２】 全実験において、実験前の基準となる気道反応性（ＰＣ４００）は実験開始の
３〜４日前に決められた。一回投与の治験前テストにおいてＳＲＬが測定され、
動物は本発明の化合物か担体のみを与えられた。ＳＲＬは投与の２時間後に再び
測定され、ただちにアレルゲンが与えられた。複数回投与による実験ではアレル
ゲンが与えられる４日前を開始時として、動物は１日１回治験薬を４日間与えら
れ、最終投与の２４時間後にアレルゲンを与えられた。ＳＲＬは最終薬物（又は
担体）投与の前後に測定された。どの実験においてもＳＲＬはアレルゲン投与の
直後に再測定され、その後１時間から６時間後までは１時間おきに、６．５時間
後から８時間後には半時間おきに測定された。アレルゲン投与後の気道反応性（
ＰＣ４００）は、アレルゲン投与の２４時間後に決定された。

【００７３】 結果は平均±標準偏差として示されている。ＳＲＬの変化量は一匹の羊ごとに
アレルゲン投与前の基準値をもとに計算されている。 アレルゲン投与後のＳＲＬの変化は、０〜４時間の間に起こる初期気道反応（
ＥＡＲ）によって特徴づけられている。この初期変化に続いて４〜８時間後には
後期気道反応（ＬＡＲ）が見られる。ＥＡＲとＬＡＲ曲線の面積がそれぞれの動
物に対して求められた。この面積の有意の減少は、アレルゲンによって引き起こ
されたＳＲＬにおける変化を薬効によっておさえたものと見なされる。アレルゲ
ン投与前後のカルバコールに対する気道反応性（ＰＣ４００）の比は、ＰＣ４０
０比としてそれぞれの羊について求められた。ＰＣ４００比の有意な増加は、ま
た、薬効を示すものである。担体のみを投与した群との比較は（訳不可、ｐ２９
行２３〜２４）。 ｐ＜０．０５を示す結果は、統計学的に有意差があると見なされた。

【００７４】 図１は、エアロゾル化した。ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの阻害用量反応を、投与の２
時間後に羊にＡｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍを与えた系で求めたものである。左側に
特異的肺抵抗ＳＲＬをｃｍＨ２Ｏ／ｓｅｃ単位で示してある。右側は、吸入した
カルバコールの気道反応性（ＰＣ４００比）をＡｓｃａｒｉｓ投与の２４時間後
に求めたものである。ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ投与量が０．０１あるいは０．０３ｍ
ｇである場合には気道反応性（初期、後期とも）は阻害されなかったし、アレル
ゲン投与２４時間後のカルバコールに対する過敏反応も改善されなかった。用量
が０．１，１，及び３ｍｇの場合には、初期気道反応性を阻害し、後期反応性を
完全に阻害した。これらの用量においては、アレルゲン投与２４時間後のカルバ
コール過敏反応性をも阻害した。これらの結果の統計学的解析を表２に示す。

【００７５】

【表２】

【００７６】 上に示した用量でｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖのエアロゾル（ａｅｒｏａｏｌ）を投与
してから２時間後、またはｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの閾値下の用量で若しくはＰＢＳ
の同等量で４日間毎日繰り返して投与した際の最後の投薬から２４時間後に、ア
スカリス・スウム（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）アレルゲンのエアロゾルで羊（
生まれつきアスカリス・スウムに感受性がある）の免疫性をテストした。アレル
ゲン感染後８時間にわたって、肺機構（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｃ
ｓ）（固有気道抵抗（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｉｒｗａｙｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃ
ｅ）の予め調査したベースライン値（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｖａｌｕｅ）からの変
化として報告されている）を測定した。初期気道応答（０−４時間後、ＥＡＲ）
および後期気道応答（４−８時間後、ＬＡＲ）は、Δ固有肺抵抗曲線対時間±ｓ
．ｅ．ｍ．（Δ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｕｎｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃｕｒ
ｖｅ ｖｅｒｓｅｓ ｔｉｍｅ ± ｓ．ｅ．ｍ．）に基づき平均面積（ｍｅａ
ｎ ａｒｅａ）として表される。吸入されたカルバコールに対する気道抵抗は、
調査開始前およびアレルゲン感染２４時間後に測定された。気道応答は感染前の
値と感染後の値を比較することによりＰＣ₄₀₀（４００％だけ抵抗を増加させる
ために必要なカルバコールの量）比として報告されている。 *＝ｐ＜０．０５（ＰＢＳ対照と比較して）、分散（ｖａｒｉａｎｃｅ）の１元
分析、次いで対照群に対する多重比較についてのＤｕｎｎｅｔｔ検定。統計学的
に有意なＥＡＲ又はＬＡＲの減少、あるいはＰＢＳ対照群と比較したＰＣ₄₀₀比
の有意な増加を示す。１回量の刺激性（Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｓｅ Ｉｒｒｉｔａｎｃｙ） アスカリス・スウムアレルゲンを用いた感染の後でベースライン抵抗と比較し
た気道抵抗の変化の欠如によって反映されているように、上記調査において使用
されたｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの用量はいずれも刺激的効果を有していなかった。こ
れを図２に示す。反復用量調査（Ｒｅｐｅａｔｅｄ Ｄｏｓｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ） 図３は、最後の投与から２４時間後に抗原を感染させた時に、もしも毎日１回
４日間投与すれば、０．０３ｍｇ用量のｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ（これは１回量の急
性前処置（ａｃｕｔｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）として使用される場合には
効果がないことが証明された）はやはり保護作用があった。左上部および左下部
のパネルは、２つの異なる処方を用いてこの効果が見られたことを示す。図３の
右上部および右下部のパネルに示されるように、更に２４時間後におけるカルバ
コールに対する過剰応答（ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）もまた最
大限阻害された。ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの保護効果は、ＥＡＲおよびＬＡＲに対し
ても、またカルバコールに対する過剰応答に対しても有意であった。定量的分析
を表３に示す。

【００７７】 この調査の結果は、エアロゾルによるＶＬＡ−４、ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの小さ
な分子の阻害剤を用いた１回の前処置が、アレルギー性の羊モデルにおけるアレ
ルゲン誘導性初期気道応答およびアレルゲン誘導性後期気道応答並びにアレルゲ
ン誘導後のＡＨＲを保護することができる。１回の前処置として与えられたｏＭ
ｅＰＵＰＡ−Ｖの如何なる用量に関しても、気道に対する刺激効果は認められな
かった。また今回の結果は、ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの効果的な用量は多数の処置に
伴って低減され得ることを示した。包括的に言えば、これらのデータは、アレル
ゲン誘発後のアレルギー性羊の気道で惹起された長時間に及ぶ炎症性事象（ｉｎ
ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｖｅｎｔｓ）の病態生理学的指標（ＬＡＲ及びＡＨＲ
）においてＶＬＡ−４粘着性経路（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）が重大
な役割を果たしているという強力な証拠を提供するものである。

【００７８】

【表３】

【００７９】 ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの閾値下の用量で若しくはＰＢＳの同等量で４日間毎日繰
り返して投与した際の最後の投薬から２４時間後に、アスカリス・スウム（Ａｓ
ｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）アレルゲンのエアロゾルで羊（生まれつきアスカリス・
スウムに感受性がある）の免疫性をテストした。アレルゲン感染後８時間にわた
って、肺機構（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）（固有気道抵抗（ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ａｉｒｗａｙｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の予め調査したベー
スライン値（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｖａｌｕｅ）からの変化として報告されている
）を測定した。初期気道応答（０−４時間後、ＥＡＲ）および後期気道応答（４
−８時間後、ＬＡＲ）は、固有肺抵抗曲線対時間±ｓ．ｅ．ｍ．（Ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ Ｌｕｎｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃｕｒｖｅ ｖｅｒｓｅｓ ｔｉｍｅ
± ｓ．ｅ．ｍ．）に基づき平均面積（ｍｅａｎ ａｒｅａ）として表される。
吸入されたカルバコールに対する気道抵抗は、調査開始前およびアレルゲン感染
２４時間後に測定された。気道応答は感染前の値と感染後の値を比較することに
よりＰＣ₄₀₀（４００％だけ抵抗を増加させるために必要なカルバコールの量）
比として報告されている。 *＝ｐ＜０．０５（ＰＢＳ対照と比較して）、分散（ｖａｒｉａｎｃｅ）の１元
分析、次いで対照群に対する多重比較についてのＤｕｎｎｅｔｔ検定。統計学的
に有意なＥＡＲ又はＬＡＲの減少、あるいはＰＢＳ対照群と比較したＰＣ₄₀₀比
の有意な増加を示す。 実施例３ 遅延型過敏症のモデルにおける活性羊赤血球の調査 ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）から入手した８−１０週齢の
特定の病原体のいない雌のＢａｌｂ／ｃマウスをすべての実験に使用した。これ
らの動物には適宜食料と水を与えた。同じ羊由来のアルセバー液（Ａｌｓｅｖｅ
ｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に加えられた羊赤血球（ｓＲＢＣ）をマサチューセ
ッツ州サウスブリッジ（Ｓｏｕｔｈｇｒｉｄｇｅ， ＭＡ）にあるチャールズリ
バーファルムサービスイズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｐｈａｒｍ． Ｓｅ
ｒｖｉｃｅｓ）から毎週入手した。ｓＲＢＣを４℃で１０分間１０００ｇの遠心
分離によって沈殿させ、目視できる軟膜（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）はすべて除去
した。次いでその細胞を生理的食塩水で洗った。この細胞沈殿物（ｃｅｌｌ ｐ
ｅｌｌｅｔ）は生理的食塩水中に再懸濁し、血球計数器を用いて数を数えた。こ
の細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中で２×１０⁸ｓＲＢＣ／ｍＬに希
釈した。０日目に、１００μＬ ＰＢＳ中の２×１０⁷ｓＲＢＣの皮下注射によ
ってマウスに感作させた。５日目に、ｓＲＢＣを前記のようにして調製したが、
ＰＢＳに希釈し最終濃度を４×１０⁹とした。この調製物のうち、２５μＬを右
後足蹠（ｒｉｇｈｔ ｒｅａｒ ｆｏｏｔｐａｄ）に皮下注射した。

【００８０】 コンパウンドの腸内投与のために、ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ（ロット番号２７７０
−０２９）を０．０２Ｍ ＴＲＩＳ中６０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）
４００の賦形剤中で調製し、５ｍｇ／ｍＬのストック濃度とした。ＰＥＧ／ＴＲ
ＩＳ中で適当な希釈剤を調製し、１００μＬの容量で腸内に投与した。抗−ＶＬ
Ａ−４抗体（ＰＳ／２）を生理的食塩水中で４．３ｍｇ／ｋｇの濃度に希釈し、
１００μＬの容量で腹腔内に投与した。すべての処置はｓＲＢＣで感作させた直
後に行った。

【００８１】 足蹠感作を行ってから２０時間後に、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ（型番３０４−１９６
、ダイアー、ランカスター、ペンシルバニア州（Ｄｙｅｒ，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ
，ＰＡ））製のテンションカリパス（ｔｅｎｓｉｏｎ ｃａｌｉｐｅｒ）を用い
て、感作させなかった対照（左）および感作させた（右）後足蹠の腫脹度合を測
定した。データは、右後足の厚さから左後足の厚さを減ずることにより決定され
た足蹠厚さの変化として表される。足蹠厚さの変化はツーテイルドスチューデン
ツティー検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）を
用いて比較した。

【００８２】 ４．３ｍｇ／ｋｇの薬量を腹腔内に投与した抗−ＶＬＡ−４抗体ＰＳ／２は約
３０％腫脹を抑制した。一方、２０ｍｇ／ｋｇの薬量で腸内に投与したｏＭｅＰ
ＵＰＡ−Ｖは、このモデルにおいては効果がなかった（データは示さない）。マ
ウスにおいてｓＲＢＣ誘発ＤＴＨモデルにおいて腸内経路により２０ｍｇ／ｋｇ
の薬量を投与したｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの薬効を検討したが、何らの薬効も観察さ
れなかった。実施例４ 遅延型過敏性のモデルにおける活性 接触過敏性モデル ２０ｇの雌のウィルスを持たないＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，メキシコ州バーハーバー）をバイオジェンの（Ｂｉｏｇ
ｅｎ’ｓ）ウィルスのない動物設備中のマイクロアイソレーターケージの各ケー
ジに４匹ずつ入れ、マウス飼料および水道水を適宜摂取させて、すべての研究に
使用した。マウスをケタミン：キシラジン（９０：１０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内投与
）で麻酔した。体毛をしっかり剃ることで腹部の皮膚から恥骨突起までの３ｃｍ ² パッチ分を露出させ、皮膚を７０％アルコールでごしごしこすった。２５μｌ
の０．５％ＤＮＦＢ（容量比４：１のアセトン：オリーブオイル媒体中）を均一
に裸の腹部皮膚に塗布した。この皮膚をピペットの先端で軽く引っかいて緩和な
炎症を生ぜしめた。このマウスをそのケージ中であお向けにして麻酔から回復さ
せた。最初の感作から２４時間後、マウスを再び２５μｌの０．５％ＤＮＦＢ（
媒体中）で同一の腹部皮膚部位を感作し、再びピペット先端で軽く引っかいた。
この第２の感作は非麻酔マウスを拘束しながら行った。５日目（最初の感作から
約１２０時間）に刺激量以下の感作薬（容量比４：１のアセトン：オリーブオイ
ル媒体中０．２％ＤＮＦＢ）を使用して免疫応答にチャレンジさせた。マウスを
９０：１０ｍｇ／ｋｇのケタミン：キシラジンを腹腔内投与して麻酔し、１０μ
ｌの０．２％ＤＮＦＢを左耳の背部面に塗布した。右耳には容量比４：１のアセ
トン：オリーブオイル媒体を同様に塗布した。続く２４時間において、図４に示
すように二相耳腫脹が見られた。チャレンジから２４時間後、マウスを再びケタ
ミン：キシラジンで麻酔して両耳の耳の厚さをエンジニアーのマイクロメーター
で１０^-4インチの精度で測定した。

【００８３】 適当な媒体（リン酸塩緩衝剤を加えた等脹生理塩水〔ＰＢＳ〕１００μｌ中ジ
メチルスルホキシド〔ＤＭＳＯ〕または化合物（１００μｌ）をガベージ（ｇａ
ｖａｇｅ）で、５日目の免疫応答へのチャレンジ４時間後に経口投与した。一群
８匹のマウスを各試験処置に使用した。ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ（バッチＮｏ．２０
４４−０７６）を０．５％リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．８および３％ＤＭ
ＳＯを添加した蒸留水に溶解した。各マウスについて耳の腫脹応答を、チャレン
ジ２４時間後の媒体投与とＤＮＦＢ投与の耳厚の相違として計算した。典型的な
ＤＮＦＢ誘発耳腫脹は６５〜７５×１０^-4インチであった。耳腫脹応答の阻害は
、処置群と媒体対照群との比較によって決定された。処置群間の相違の統計学的
有意性は、偏差の一方向分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）に続いてｐ
＜０．０５を使用した対照群への複数比較についてのダネットのテスト（Ｄｕｎ
ｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ）（Ｓｙｓｔａｔ，ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．）を使用して評
価した。値は平均値±平均値の標準偏差（ＳＥＭ）として表した。

【００８４】 図４は、媒体（ＤＭＳＯ，ＰＢＳ）、ポジティブコントロール化合物（０．０
３μｇ／ｋｇ）、あるいは０．０３または０．３ｍｇ／ｋｇ ｏＭｅＰＵＰＡ−
ＶをＤＮＦＢ投与（上部パネル）４時間後に腸内投与されたマウスにおけるＤＮ
ＦＢチャレンジ２４時間後に測定された耳腫脹応答を比較したものである。処置
により誘発された阻害％は下部パネルに示されている。ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの両
投与量は有意に耳腫脹応答を阻害しており、その程度はポジティブコントロール
化合物によって示されるものと同様である。ＤＮＦＢチャレンジ４時間後に与え
られたｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの単一の腸内０．０３または０．３ｍｇ／ｋｇ投与量
は、マウス摂取過敏性のモデルにおける耳腫脹応答を有意に阻害できる。 実施例５．生化学 ５．１ ＶＣＡＭ−Ｉｇ直接結合検定（ＤＢＡ）においてＶＣＡＭ−Ｉｇアルカ
リホスファターゼ結合物を使用して測定されたｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの受容体親和
性 ＶＣＡＭ−Ｉｇを報文のように（Ｊａｋｎｂｏｗｓｋｉ，Ａら、 Ｃｅｌｌ
Ａｓｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ３：１３１−１４２
，１９９５）構築し、精製した。色素産生の基質を開裂するため、子牛小腸のア
ルカリホスファターゼに対する結合は報文のとおり行った（Ｌｏｂｂ．Ｒ．Ｒ．
ら、Ｃｅｌｌ Ａｓｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３
：３８５〜３９７，１９９５）。ＶＬＡ−４への結合はヒトＴ細胞株、Ｊｕｒｋ
ａｔ（α４β１）において評価された。ＶＣＡＭ−Ｉｇ−ＡＰとｏＭｅＰＵＰＡ
−Ｖは、１ｍＭＭｎ⁺²の存在下にこれらの細胞の表面上のα４β１への結合に対
して競合した。

【００８５】 ＶＣＡＭ−Ｉｇ直接結合検定において、ｏＭｅＰＵＰＡ−ＶはＶＣＡＭ−Ｉｇ
−ＡＰと、１ｍＭＭｎ⁺²の存在下にＪｕｒｋａｔ細胞への結合について濃度依存
的に競合しており、ＩＣ₅₀は８±１ｎＭ（ｎ＝９）である。結果は表４に示され
ている。 ５．２ 精製されたＶＬＡ−４蛋白質／蛋白質検定においてＶＣＡＭ−Ｉｇアル
カリホスファターゼ結合物を使用して測定されたｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの受容体親
和性 ＶＬＡ−４は、α４トランスフェクトされたＫ５６２細胞の高度発現サブクロ
ーンの洗浄剤抽出物から抗体アフィニティクロマトグラフィーによって精製され
マイクロ滴板のウェルに不動化されて蛋白質／蛋白質競合結合検定を確実にした
、ＶＣＡＭ−Ｉｇ−ＡＰは上記精製されたＶＬＡ−４−被覆プレートにｏＭｅＰ
ＵＰＡ−Ｖ（Ｌｏｔ Ｎｏ，２）および１ｍＭＭｎＣｌ₂の不存在下または存在
下に結合された。プレートを４０５ｎｍで読み、データをＳｏｆｔ Ｍａｘ Ｖ
． ２．３２ソフトウエアを使用して分析した。

【００８６】 ＶＣＡＭ−Ｉｇ結合物の精製ＶＬＡ−４への結合は、特異的中和抗−α４モノ
クローナル抗体（ＨＰ１／２）によって完全にブロックされた。ＶＬＡ−４蛋白
質／蛋白質検定においてｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖについて得られた２つのＩＣ₅₀は表
４に表記してあるが、ＶＣＡＭ−Ｉｇ−ＡＰ競合的結合検定およびＣＳ１細胞接
着検定からＪｕｒｋａｔ細胞について得られたＩＣ₅₀も表記してあるとおりであ
る。 ５．３ ＣＳ１細胞接着検定において評価されたｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖの受容体親
和性 ａ． Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＳ１／ＢＳＡ結合への接着 ペプチドＮＨ₂−システイン−チロシン−ＣＳ−１を合成し、ＢＳＡ−ＳＭＣ
Ｃ（ＳＭＣＣはＢＳＡ上の遊離アミノ基および上記合成ペプチドの唯一のシステ
インと反応するヘテロ二官能基を有する交叉結合剤である）にＣＳ１／ＢＳＡ比
１０：１で結合させた。ウェルを一晩、１００μｌの結合物を最終濃度１μｇ／
ｍｌに希釈したもので被覆した。次の日、これらのウェルをＰＢＳ中ＢＳＡで１
時間ブロックし、３回洗った。

【００８７】 ヒトＴ細胞株、Ｊｕｒｋａｔを２μＭＢＣＥＣＦ−ＡＭ、すなわち蛍光色素（
２’，７’−ビス−（２−カリボキシエチル）−５および６−）カルボキシフル
オレセインアセトキシメチルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉ
ｎｃ．オレゴン州，ユージーン；カタログＮｏ．Ｂ−１１５０）で標識した。こ
の色素は生細胞内で内在化し、脱エステル化し、とり込まれる。Ｊｕｒｋａｔ細
胞（１×１０⁵細胞／ウェル）を１ｍＭＭｎ⁺²を含む緩衝液に入れたものを、上
記被覆されたプレートに阻害剤の連続３倍希釈物の存在下に加えた。各濃度につ
いて併行して２つの検定を行った。室温で３０分後、各プレートを逆さにして、
３回あるいはＢＳＡのみで被覆された対照ウェルに細胞が接着していない状態に
なるまで洗った。ＣＳ１−接着細胞を、励起波長４８５ｎｍおよび放射波長５３
０ｎｍを使用してサイトフルオル（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）蛍光プレートリーダー
で定量した。

【００８８】 化合物の不存在下にＣＳ１／ＢＳＡ接着した細胞は０％阻害対照として役立ち
、ＢＳＡのみに接着している細胞は１００％阻害対照として役立った。ＩＣ₅₀値
はデルタグラフ（Ｄｅｌｔａｇｒａｐｈ）ソフトウエア、バージョン５を使用し
て計算した。

【００８９】 Ｍｎ⁺²の存在下の標識Ｊｕｒｋａｔ細胞の接着はＥＤＴＡおよび中和抗−α４
β１ｍＡｂ，ＨＰ１／２によって完全にブロックされ、このことは結合が特異的
であることを示している。表４はＣＳ１／ＢＳＡ接着検定におけるｏＭｅＰＵＰ
Ａ−Ｖの活性ならびに結合検定結果を示している。

【００９０】 ｏＭｅＰＵＰＡ−ＶはＭｎ⁺²を含有する緩衝液中の有効なＶＬＡ−４アンタゴ
ニストである。それは、単離されたＶＬＡ−４上Ｍｎ⁺²の存在下で検定された場
合、上記結合検定におけるＪｕｒｋａｔ細胞上より８０倍を越える効力を有して
いる。ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖは、ＪｕｒｋａｔのＣＳ１への接着を用量依存的に及
び完全にブロックするその効力によって表されるように機能的アンタゴニストで
ある。上記接着検定における絶対値は上記結合検定において観察されたものを越
えて大である。これは接着の多価特性によるものである。すべての検定フォーマ
ットにおいて、ＥＤＴＡおよびＨＰ１／２による結合の阻害はＶＬＡ−４に対す
る特異的結合を示す。 表４ ＶＣＡＭ−Ｉｇ競合結合検定、ＣＳ１細胞接着検定および精製されたＶＬ
Ａ−４蛋白質／蛋白質検定において測定された、１ｍＭＭｎＣｌ₂存在下のｏＭ
ｅＰＵＰＡ−Ｖの受容体親和性

【００９１】

【表４】

【００９２】 6.4 oMePUPAV阻害の特異性 a. VCAMIg直接結合およびCS1接着アッセイにおいてJY細胞を使用して評価し
た場合のoMePUPAVの特異性 α4β7に対する結合をMn⁺²の存在下においてJY細胞を用いて評価した。結合ア
ッセイにおいて、VCAMIgおよびoMePUPAVはJY細胞上のα4β7に対する結合に関し
て競合する（アッセイ手順について4.1.1節を参照のこと）。細胞接着アッセイ
において、CS1/BSA結合体に対するJY（α4β7）細胞の結合を阻害するその能力
について、oMePUPAVを試験した。

【００９３】 oMePUPAVはVCAMIgまたはCS1/BSAに対するα4β7の結合をブロックしない。抗
β7 Mab、Fib27（Pharmingen）は、これらの相互作用を完全に阻害したが、この
ことから結合がα4β7特異的であることが示された。したがって、oMePUPAVはVL
A4に対する特異的な阻害物質である。結果は表5に作表する。

【００９４】 b. Fn120を用いてコートしたウェルに対するK562細胞の接着を利用して評価
した場合のoMePUPAVの特異性 非処理96ウェルポリスチレン平底プレートを、5μg/mlのFn120を用いて4℃に
て一晩コートした。プレートをリン酸緩衝塩類溶液（PBS）を用いて2回洗浄し、
そして1％ウシ血清アルブミン（BSA）を用いて室温にて1時間ブロッキングした
。プレートを1 mMのMnCl₂（アッセイバッファー）を含有するTBSバッファーを用
いて2回洗浄した。K562細胞を2μMの蛍光色素、BCECFAM（4.1.3節を参照）にて
標識し、そして室温にて30分間プレートに結合させた。プレートを逆さまにし、
そして3回洗浄し、そして接着細胞を励起波長485 nmおよび放出波長530 nmを用
いて、Cytofluor蛍光プレートリーダーにて定量した。

【００９５】 Fn120に対するK562の接着は、中和抗α5抗体、IIA1（Pharmingen）により完全
にブロックされ、このことはVLA5を介した特異的な結合を示した。せいぜい100
μMの用量ではoMePUPAVによりFn120Kフラグメントに対するK562細胞の結合は阻
害されない。

【００９６】 c. oMePUPAVの特異性を評価するために行った凝集アッセイ 方法 gpIIbIIIaに対する活性を、血小板の豊富な血漿を使用する標準的な血小板凝
集測定（aggregometry）により評価した。ADPを使用して、その中でCa⁺²およびM
g⁺²が主要な2価のカチオンである血漿の存在下で凝集を開始した。GRGDSP＠100
ug/mLを陽性対照として使用した。

【００９７】 結果 oMePUPAVを3つの用量、すなわち1、10および100μMで試験した。いずれの用量
においても、ADPにより誘導されたような血小板凝集を阻害しなかった。結果を
表5に列挙する。oMePUPAVはVLA4に対する特異性が高い（＞10,000倍）。oMePUPA
Vは、関連するインテグリン、α4β7およびVLA5に対してまたはβ3インテグリン
、gpIIbIIIaに対して、測定可能な活性（＞100μM）を有さない。

【００９８】

【表５】

【００９９】 実施例６：LIBS誘導に関するoMePUPAVを用いたアッセイ 6.1. LIBS抗体9EG7を用いるJurkatでの測定 a. α4β1アンタゴニストによるLIBS誘導を、FACS解析によりin vitroにてア
ッセイした。2 mM MgCl₂（Mg⁺² TBS）を単独でまたは試験化合物の連続希釈物と
ともに含有するTRIS緩衝塩類溶液を用いて、Jurkat細胞（2×10⁵／ウェル）を37
℃にて20分間あらかじめインキュベーションした。サンプルを氷浴に移し、最終
濃度10μg/mlのLIBS抗体、9EG7を添加した。細胞をMg⁺² TBSで2回洗浄し、そし
てMg⁺² TBS中FITC結合-ヤギ-抗-ラットIgGの1：200希釈物中で再懸濁し、そして
4℃にて30分間インキュベーションした。細胞を2回洗浄し、そしてMg⁺² TBS中で
再懸濁した。平均蛍光強度（MFI）をFACS解析（Becton Dickinson FACScan）に
より測定した。結果をMFIとして表示する。データは、Microsoft Excel v5.0お
よびDeltagraph v4.0ソフトウェアにより解析した。

【０１００】 図5は、2 mM Mg⁺²バッファーと比較した場合に、LIBSエピトープの曝露を誘導
したことを示す（パネルB）。誘導は濃度依存性であり、そして1 mM Mn⁺²を用い
て観察された誘導（パネルA）の規模と同様であった。LIBS抗体および検出用抗
体の省略、または検出用抗体のみの省略により、標識が除去された（パネルB）
。反応のED50は約20 nMであった。

【０１０１】 結論 これらのデータから、oMePUPAVが天然のリガンドにより観察されるのと同一の
VLA4における立体構造的変化を誘導することが示される。LIBS値は、一般的に結
合アッセイおよび接着アッセイにより定義された範囲内に入り、それぞれoMePUP
AVに対して8 nMおよび22 nMである。

【０１０２】 6.2 複数種受容体スクリーニング a. VCAMIgアルカリホスファターゼ結合体および様々な種由来の末梢血リンパ
球または脾細胞を用いてVCAMIg直接結合アッセイにおいて測定した場合のoMePUP
AVの受容体アフィニティー ヒツジPBLについて記載された方法（Abraham, W. M. et al. J. Clin. Invest
. 93:776787, 1994）を使用して、PBLをヒト、ヒツジおよびイヌの末梢血液から
単離した。VCAMIgAP競合結合アッセイを使用して、これらの様々な細胞型に対す
るoMePUPAVの結合を比較した。

【０１０３】 Mn⁺²存在下で様々な種由来の末梢血リンパ球または脾細胞に対するoMePUPAVに
ついて得られたIC50を、表6に示す。oMePUPAVは、Mn⁺²の存在下において、ヒト
、ラット、イヌ、ヒツジ、およびマウスから得られたリンパ球に対するVCAMIgの
結合を、同様のIC50にて阻害する。種特異性については何の証拠も存在しない。
このことは、VLA4およびその天然のリガンドであるCS1およびVCAMについて種間
で観察される配列保存の程度が高いことと矛盾しない。

【０１０４】

【表６】

【０１０５】 実施例７：oMePUPAVの受容体動力学 7.1 ³H既知阻害物質をプローブとして使用する競合アッセイ Jurkat細胞を37℃の組織培養インキュベーター中で10％ウシ胎児血清を添加し
たRPMI1640培地中にて維持した。結合実験のため、細胞を遠心分離によりペレッ
ト化し、TBS（50 mM Tris HCl、150 mM NaCl、0.1％ウシ血清アルブミン、2 mM
グルコース、10 mM HEPES pH 7.4）で2回洗浄し、TBS中約2×10⁶細胞で懸濁し、
そしてNeubauer血球計算器を使用して計測した。細胞を、示したバッファー中で
1.5×10⁶/mlまでさらに希釈し、各実験について定義した特異的な処理に供した
。その後細胞を遠心分離によりペレット化し、100μlのアッセイバッファー中で
再懸濁し、そして2.9 mlのScintiVerse II（Fisher Scientific）を含有するシ
ンチレーションバイアルに移した。細胞結合放射活性を、シンチレーションカウ
ンターにより定量した。これらの条件下で結合したカウントは試験化合物により
占有されていない、そしてしたがって、³H-既知阻害物質に結合しない、インテ
グリンを測定する。すべての実験を標準的な1 mlのサンプル容量を含むシリコナ
イズした1.5 mlエッペンドルフチューブ中で行った。金属イオンの不在下で結合
した阻害物質を測定することにより、細胞に対する³H-既知阻害物質非特異的結
合（バックグラウンド）を決定した。結合した総カウントから非特異的カウント
を差し引きすることにより、結合した特異的カウントを計算した。

【０１０６】 一連の競合実験を行って、oMePUPAVおよび既知の阻害物質がVLA4の同一部位に
競合するすることを証明した。第一に、³H-既知阻害物質を等モル量、10倍過剰
量、100倍過剰量のoMePUPAVと混合し、Jurkat細胞とインキュベーションし、そ
して非放射性阻害物質が既知阻害物質の結合に対して競合する能力を評価した。
oMePUPAV処理により、³H-既知阻害物質結合の用量依存性の阻害が生じた。³H-既
知阻害物質結合と競合するために必要とされるoMePUPAVの濃度は、非放射性のも
のを競合物質として使用する場合に必要とされる濃度の10倍であり、これはMn⁺² 活性化VLA4に対するアフィニティーがより低いことと矛盾しない。第2に、まずV
LA4を放射活性プローブで占有するために、Mn⁺²活性化Jurkat細胞を³H-既知阻害
物質で処理し、そしてその後過剰量の非放射性oMePUPAVを添加した。引き続き行
われる過剰量の非放射性oMePUPAVまたは既知阻害物質を用いる処理は、放射活性
プローブを置換するその能力においては見分けがつかない。第3に、Mn⁺²活性化J
urkat細胞を、飽和量のoMePUPAVで処理し、そしてoMePUPAVが解離する速度を測
定した。Mn⁺²活性化VLA4に対する既知阻害物質の半減期が延長したのとは異なり
、oMePUPAVは10分未満のt_1/2でoMePUPAV-VLA4から放出される。oMePUPAVおよび
既知阻害物質についてt_1/2が大きく異なることから、VLA4に対するoMePUPAVのア
フィニティーがより低いことがそのより速い解離速度という結果となることを示
唆する。

【０１０７】 解離データにより、oMePUPAVのVLA4に対する結合が、VLA4の活性化状態に非常
に依存性であり、そして既知阻害物質で見られる活性化についての同一の選択性
を示すことが、示される。Mn⁺²活性化VLA4に関して、Mg⁺²活性化VLA4からのoMeP
UPAVの解離のt_1/2が、競合形式において評価することができる最短時間点である
10分未満であった。一方、Mg⁺²および活性化抗体TS2/16の存在下において、t_1/2 は延長された（20分間）。可能な活性化状態のすべては、詳細に評価されていな
いが、しかし迅速に相違を強調することができる単純なスクリーニングが案出さ
れた。このアッセイにおいて、固定した濃度のoMePUPAV（10 nM）を、5 nMの³H-
既知阻害物質と混合し、そして様々な活性化状態でのこれらの条件下で結合を行
った。VLA4に対するoMePUPAVのアフィニティーがが異常なほど高いかまたは低い
場合、³H既知阻害物質の量の相違によりこれを検出することができる。異なる活
性化状態下で結合する³H既知阻害物質のパーセンテージの相違は、阻害物質の既
知特性に基づいて推定されうるものに近い。

【０１０８】 結合実験により、VLA4に対する結合について、そのアフィニティーと矛盾しな
い濃度で、oMePUPAVが既知阻害物質と競合することを証明し、そして2つの化合
物がインテグリンの同一部位で競合することを示す。VLA4活性化の様々な状態下
で結合するoMePUPAVおよび既知阻害物質の同一性は、結合メカニズムが同一であ
ることを示唆する。

【０１０９】 7.2 PanlabsスクリーニングおよびCerepスクリーニングにおけるoMePUPAVの
アッセイ oMePUPAVを放射性リガンド、酵素、および機能分析のPanlabs ProfilingScree
n、DiscoveryScreen、そしてImmunoscreenパネルにおいて、そしてCerep膜受容
体パネルにおいて試験した。既知の阻害物質が何らかの活性を示したのに対して
、NK1受容体アッセイを含むいずれのアッセイにおいても、10μMでのoMePUPAVに
ついて顕著な活性は何ら観察されなかった。

【０１１０】 oMePUPAVはヒトACEプロテアーゼ活性に対して何の阻害も示さなかったことも
、Cerepにより報告された。ACEプロテアーゼの供給源は、ヒト内皮細胞（HUVEC
）であった。HUVECに加えた³HHGGは、ACEにより³H馬尿酸およびグリシルグリシ
ンに転換された。強力なACE阻害物質であるカプトプリル（captopril）は、990
pMのIC50でこの転換をブロックしたが、一方10μMのoMePUPAVではブロックしな
かった。

【０１１１】 医薬的特性： oMePUPAVは、白色〜オフホワイトの結晶性粉末である。これはDMSOに溶解性で
あり、そして0.120 mg/mLの水可溶性を有する。DSC、TGAおよび加熱ステージ顕
微鏡により研究されたoMePUPAVの熱挙動から、物質が約160℃にて溶解すること
が示される。約136℃のDSCおよびTGA解析から、oMePUPAVがおそらくは一水化物
の脱水と矛盾しない揮発性不純物を失うことが示唆される。

【０１１２】 製剤 噴霧製剤 100 mLの5 mg/mL oMePUPAV噴霧製剤のための製造の方向性を、以下に列挙する
。 ２００ｍＬのストック緩衝液を下記の通り調製する。

【０１１３】 １． ０．２８６ｇのトロメタミン（ＵＳＰ）を適当な容器中に秤量する。 ２． １．６７６ｇの塩化ナトリウム（ＵＳＰ）をその容器に秤量する。 ３． ２００ｍＬの注射用水（ＵＳＰ）を添加する。 これらを均質になるまで混合する。

【０１１４】 １． ０．５００ｇの ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ を適当な容器に秤量する。 ２． 工程１（上記１〜３）で調製した緩衝液１００ｍＬを添加する。 ３． 均質になるまで混合する。

【０１１５】 ４． 適当な容器中に滅菌ろ過する。 ５． 適当な栓で密封する。 典型的な処方の特性： ｐＨ：７．４，モル浸透圧： 290mOsm 実施例９： 安定性表示ＨＬＬＣ法 カラム： Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８，３μｍ粒子、４．６ｘ１５０ｍｍ ガードカラム：Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８，５μｍ粒子、 ４．６ｘ１２．５ｍｍ 流速： １ｍＬ／：ｍｉｎ カラム温度： ４０℃ 雰囲気温度： ４℃ 移動相： Ａ：水中での０．１％（ｗ／ｖ）トリフロロ酢酸（ＴＦＡ） Ｂ：９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、１０％水中での０．１％ （ｗ／ｖ）ＴＦＡ 勾配： 時 間（分） ％Ｂ ０−３ １５ ３−１８ １５−１００ １８−２１ １００ ２１−２８ １５ 注射液： トリス／ＮａＣｌ／水の液中の０．２ｍｇ／ｍＬ溶液（バルク 中間体）１０μＬ，又は０．１％ＴＦＡ／４５％アセトニトリル 中の０．２ｍｇ／ｍＬ溶液（最終製品）１０μＬ 検出： ＵＶ２５４ｎｍ（一次）、２１５ｎｍ 対照： ２０分間沸騰水中で加熱した ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ 予備的方法認定試験を完了した。 薬品物質安定性： 下記の種々の保存条件下での２週間のバルク中間体としての保存後にも劣化は
観察されなかった。

【０１１６】 ４０℃での密封バイアル中；５０℃での密封バイアル中；２５℃、ＲＨ６０％
； ４０℃，ＲＨ７５％ ４週間後、４０℃及び５０℃において、１つ又は２つの劣化ピークが検出でき
た。しかしながら、各不純物ピークのレベルは０．０２％未満であった。 溶液安定性： ａ）噴霧療法用処方（トリス／ＮａＣｌ中の）５ｍｇ／ｍＬを室温で２カ月間保
存したところ、合計レベル１％（２５４ｎｍ）及び２−３％（２１５ｎｍ）の早
期溶出劣化ピークを示した。 ｂ）噴霧療法用処方を沸騰水中で２０分間加熱することにより、純度は２５４ｎ
ｍで９９．９％から９８．７％に、２１５ｎｍでは１００％から９３．６％に低
下した。 ｃ）トリス／ＮａＣｌ／水中の溶液０．２ｍｇ／ｍＬは中性ｐＨ、２−８℃で少
なくとも１週間は安定である。 本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、クレームした発明について種々
の修飾及び変化を行うことができることは当業者にとって自明である。したがっ
て、クレームの範囲内又はその均等範囲内であることを前提とする、この発明の
修飾及び変化は、本発明によってカバーされることを意図している。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ投与後の羊の気道の反応性。羊はＡｓｃａｒｉｓ ｓｕｕ
ｍ（回虫の一種）に感受性を示すが、ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖか同量の担体のみを噴
霧投与し、２時間後にＡｓｃａｒｉｓを噴霧した。肺の機能は示された時間に測
定し、試験前の値に対しての気道抵抗値の変化量して示した（左側）。 吸入されたキルバコールに対する気道抵抗が試験前とａｓｃａｒｉｓ噴霧後２
４時間後に求められた（右側）。気道の反応性は試験前後のＰＣ４００（抵抗値
を４００％増加させるのに必要なカルバコールの量）の比として示されている。

【図２】 Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍに感受性のある羊にｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖか
Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍを噴霧投与した。気道抵抗の変化を噴霧投与後に求め
、特異的肺抵抗（ｃｍＨ２Ｏ／ｓｅｃ）を試験前の値と比較した。＊印は、ＰＢ
Ｓ担体と比較してＰ＜０．０５で有意であったことを示す。（この先の日本語訳
できず。ｐ４行２７〜２９）

【図３】 Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ感受性の羊に４日間ｏＭｅＰＵＰＡ−Ｖ（０．０３
ｍｇ）を連日噴霧投与後、２４時間のちにＡｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍを噴霧して
与えた。上図ではエタノール：生理食塩水（１：２）を担体として用い、下図で
はトリス：生理食塩水（１：４９９）を用いた。肺機能を示された時間に測定し
、試験前値と比べての特異的気道抵抗の変化として示した（左側）。吸入された
カルバコールに対する気道抵抗を試験前とＡｓｃａｒｉｓ投与後２４時間の時点
で測定した（右側）。気道の反応性は試験前後のＰＣ４００（抵抗値を４００％
増加させるのに必要なカルバコールの量）の比として示されている。

【図４】 ＤＮＦＢに感受性となっているＢａｌｂ／ｃハツカネズミの左耳背側にＤＮＦ
Ｂを与え、右耳背側には担体のみを与えた。２４時間後に耳の厚さを測定した。
ＯｍｅＰＵＰＡ−ＶをＤＮＦＢ投与の４時間後に与えた。陽性対照（＋ＣＴＲＬ
）は経腸投与で最適量を与えた。結果は８匹のハツカネズミを一群として用い、
平均値±標準偏差を示した。上図は耳の厚みの絶対値を示す。下図は担体投与群
（ＶＥＨ）と比較しての耳の厚み増加の％阻止率を示す。

【図５】 種々の活性化条件下におけるＯｍｅＰＵＰＡ−Ｖをと既知阻害剤との競合分析
。ＴＢＳ中のＪｕｒｋａｔ細胞（１．５×１０⁶／ｍｌ）を、２ｍｍのＭｎ²⁺，
１ｍＭのＣａ²⁺と１ｍＭのＭｇ²⁺，１ｍＭのＣａ²⁺と１０ｍＭのＭｇ²⁺と，１０
ｍＭのＭｇ²⁺，もしくは１０ｍＭ Ｍｇ²⁺と１０Ｍｇ／ｍｌ ＴＳ２／１６の存
在下で、５ｎＭのＨ³標識した既知阻害剤のみあるいは５ｎＭのＨ³標識した既知
阻害剤と１０ｎＭのＢＩＯ１５９１と３０分間室温で培養した。細胞を遠心分離
で進め、Ｍｎ²⁺を服務ＴＢＳに再けんだくし、シンチレーションカウンターで測
定した。これらの条件下で検出されるＨ³は、被試験体によって結合されていな
い自由なインテグリン、すなわち既知阻害剤に結合しているインテグリンを表す
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 11/06 11/08 11/08 17/06 17/06 25/00 25/00 29/00 29/00 １０１ １０１ 35/00 35/00 37/02 37/02 37/06 37/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ギル，アラン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01867 −3959，リーディング，ヘザー・ドライブ ６ Ｆターム(参考） 4C069 AA17 BB08 BB39 4C086 AA01 AA02 AA03 BC07 MA01 MA02 MA04 ZA02 ZA45 ZA59 ZA66 ZB11 ZB13 ZB15 ZB21 ZB26 ZB27

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の： 【化１】 細胞接着阻害化合物、並びにその医薬的に受容可能な誘導体、プロドラッグ、塩
   または異性体。
2. 【請求項２】 請求項１の化合物および医薬的に受容可能な担体を含む、医薬組成物。
3. 【請求項３】 コルチコステロイド、気管支拡張剤、抗喘息剤、抗炎症剤、抗リウマチ剤、免
   疫抑制剤、代謝拮抗剤、免疫調節剤、抗乾癬剤、抗糖尿病剤からなるグループか
   ら選択される第２の薬剤を追加的に含む、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 【請求項４】 請求項１の阻害化合物、ならびに１またはそれ以上の細胞接着阻害化合物を含
   む、医薬組成物。
5. 【請求項５】 前記１またはそれ以上の細胞接着阻害化合物が、ＶＬＡ−４阻害剤である、請
   求項５の組成物。
6. 【請求項６】 哺乳動物における細胞接着を予防、阻害または抑制するための方法であって、
   請求項２の医薬組成物の有効量を前記哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法
   。
7. 【請求項７】 前記方法が炎症を予防、阻害または抑制するために使用される、請求項６に記
   載の方法。
8. 【請求項８】 哺乳動物における喘息、アレルギー性リウマチ、多発性硬化症、アテローム硬
   化症、炎症性腸疾患又は多発性骨髄腫を治療するための方法であって、請求項１
   の化合物の治療上有効量を前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
9. 【請求項９】 哺乳動物における多発性硬化症を治療するための方法であって、請求項１の化
   合物の治療上有効量を前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
10. 【請求項１０】 哺乳動物における炎症性腸疾患を治療するための方法であって、請求項１の化
    合物の治療上有効量を前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
11. 【請求項１１】 請求項１の化合物のエステルプロドラッグを含む医薬組成物。
12. 【請求項１２】 エステルが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、並びに直
    鎖状または分岐鎖状のアルキルＣ１−Ｃ１０アルコールから選択される、請求項
    １１の組成物。
13. 【請求項１３】 喘息の症候を治療、予防または改善するための方法であって、請求項１の化合
    物の治療上有効量を喘息に罹患している患者に投与することを含む、前記方法。