EA002988B1 - (r)-n-[[4-[[(2-метилфениламино)карбонил]амино]фенил]ацетил]-l-пропил-3- метил- бета-аланин и его применение в качестве ингибитора клеточной адгезии, опосредуемой интегрином альфа4бета1 - Google Patents

Abstract

Описываются oMePUPA-V, (R)-N-[[4-[[(2-метилфениламино)карбонил]амино]фенил]ацетил]-L-пролил-3-метил-β-аланин, ингибитор клеточной адгезии, фармацевтические композиции и способы лечения патологий, опосредуемых клеточной адгезией.

Description

Настоящее изобретение относится к новым соединениям, которые полезны для ингибирования, изменения или предотвращения клеточной адгезии и патологий, опосредуемых клеточной адгезией. Данное изобретение также относится к фармацевтическим готовым формам препаратов, включающим эти соединения, и к способам их применения для ингибирования и предотвращения клеточной адгезии и патологий, опосредуемых клеточной адгезией. Соединения и фармацевтические композиции данного изобретения могут использоваться в качестве терапевтических или профилактических агентов. Они особенно хорошо подходят для лечения многих воспалительных и аутоиммунных заболеваний.

Предпосылки изобретения

Клеточная адгезия представляет собой процесс, в ходе которого клетки ассоциируются друг с другом, мигрируют в направлении специфической мишени или локализуются в пределах внеклеточной матрицы. Сама по себе клеточная адгезия составляет один из фундаментальных механизмов, лежащих в основе большого числа биологических явлений. Например, клеточная адгезия отвечает за адгезию кроветворных клеток с эндотелиальными клетками и последующую миграцию этих кроветворных клеток из кровеносных сосудов и к участку повреждения. Как таковая клеточная адгезия играет роль во множестве патологий, таких как, например, воспалительные и иммунные реакции у млекопитающих.

Исследования молекулярной основы клеточной адгезии выявили, что различные макромолекулы на поверхности клетки - в целом известные как клеточно-адгезионные молекулы или рецепторы - опосредуют межклеточные или клеточно-матричные взаимодействия. Например, белки суперсемейства, называемого «интегринами», являются ключевыми медиаторами адгезионных взаимодействий между кроветворными клетками и окружающей их микросредой (М.Е. Нет1ег, «УЬА Рго!ешк ίη 1Нс 1Щедпп Ратйу: 81гпс1игс5. Рппс11опк апб Тйей Ко1е оп Ьеикосу!ек, Апп. Веу. 1ттипо1., 8, р. 365 (1990)). Интегрины представляют собой нековалентные гетеродимерные комплексы, состоящие из двух субъединиц, называемых α и β. Существует, по меньшей мере, 17 различных α субъединиц (α1α10, α-Ь, α-М, α-Ό, α-Χ, α-ΙΙΒ, α-ν и α-Ε) и, по меньшей мере, 9 различных β субъединиц (β1β9), которые идентифицированы на сегодняшний день. На основе типа компонентов субъединиц α и β молекула каждого интегрина может быть отнесена к подсемейству.

Интегрин α4β1, также известный как самый поздний антиген-4 (уегу 1а1е аи!1деп-4-УЕА4) или ΟΌ49ά/ΟΌ29, представляет собой поверхностный рецептор клетки лейкоцита, который участвует в большом числе как межклеточ ных, так и клеточно-матричных адгезионных взаимодействий (М.Е. Нет1ег, Апп. Неу. 1ттипо1., 8, р.365 (1990)). Он служит в качестве рецептора для поверхностного белка индуцируемой цитокином эндотелиальной клетки, адгезионной молекулы-1 васкулярных клеток (уакси1аг се11 абйекюп, то1еси1е-1-'ХСАМ-1), а также для внеклеточного матричного белка фибронектина (ΡΝ) (Виедд е! а1., 1. Се11 Вю1., 177, р. 179 (1991); Уаупег е! а1., 1. Се11 Вю1., 105, р. 1873 (1987); Кгатег е! а1., 1. Вю1. СЬет., 264, р.4684 (1989); ОеЫкеп е! а1.. 8с1епсе, 24, р. 1228 (1988)). Показано, что моноклональные антитела анти^ЬА-4 (тАЬ к) ингибируют νΕ-Λ-4зависимые адгезивные взаимодействия как ш уйго, так и ш у|уо (Регдикоп е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8сг, 88, р. 8072 (1991); Регдикоп е! а1., 1. 1ттипо1., 150, р.1172 (1993)). Результаты опытов ш у|уо подтверждают, что ингибирование УЬА-4-зависимой клеточной адгезии может предотвращать, ингибировать или изменять некоторые воспалительные и аутоиммунные патологии (В.Ь. ЬоЬЬ е! а1., ТЬе Ра!йорйукю1одю Во1е о£ α4 1п!едгшк 1п V^νо. ЕС1т. 1пуек!., 94, рр.1722-28 (1994)).

Для того чтобы идентифицировать минимальную активную аминокислотную последовательность, необходимую для связывания с ν^4, Котопуа с соавторами синтезировали ряд перекрывающихся пептидов на основе аминокислотной последовательности С8-1 области (УЬА-4-связывающий домен) конкретных видов фибронектина (ТЬе М1шта1 Еккепба1 8ес.|иепсе £ог а Март Се11 Туре-8ресйгс Абйекюп 8йе (С81) УйЫп !Ье А1!егпабуе1у 8рЬсеб Туре III Соппесбпд 8едтеп! Эотат о£ Р1Ьгопес!т 1к Ееисше-Акрагбс Ааб^айпе, 1. Вю1. СЬет., 266 (23), стр. 15075-79, (1991)). Они идентифицировали 8-аминокислотый пептид, О1и-11е-Ееи-АкрVа1-Р^о-8с^-Т11^. а также два более мелких перекрывающихся пентапептида, О1и-11е-Ееи-Акрν;·ι1 и ^си-Λкр-Vа1-Р^о-8с^. которые обладают ингибирующей активностью в отношении ΡΝзависимой адгезии клеток. Эти результаты означают, что трипептид Ееи-Акр^а1 является минимальной последовательностью для клеточно-адгезионной активности. Позднее было показано, что Ьеи-Акр^а1 связывается только с лимфоцитами, которые экспрессируют активированную форму УЬА-4, что вызывает сомнения в возможности использования такого пептида 1п у|уо (Е.А. Уау пег е! а1., Асбуа!юпПерепбеп! Весодпйюп Ьу Нета!оро1ебс Се11к о£ !Ье ΕΌν 8ес.|иепсе ш 1Ье ν Ведюп о£ Р1Ьгопес!ш, ЕСе11. Вю1., 116 (2), стр. 489-497 (1992)). Однако впоследствии было показано, что некоторые более крупные пептиды, содержащие последовательность ΕΌν, являются активными т у1уо (Т.А. Регдикоп е! а1., Т\со 1п!едгш Втбтд Рерббек АЬгода!е Т-се11-Меб1а!еб 1ттипе Векропкек т У1уо, Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А, 88,. стр. 8072-76 (1991); и 8.М. УаЬ1 е! а1., 8уп!йе!1с Р1

ЬгопесОп Рерббек 8ирргекк АгШпбк ίη Ва1к Ьу ΙηΙΟΓΓίιρΙίηβ Ьеикосу1е Абйекюп апб ВестийтепР', I. С1ш. 1пте51.. 94, рр. 655-62 (1994)). Также описан циклический пентапептид, который может ингибировать адгезию как УЪА-4, так и УЪА-5 с ΡΝ (см., например, И.М. Νο\ν1ίπ е1 а1., А Nоνе1 Сусйс РегИарерббе ИйиЬйк α4β1 апб α5β 1 1п1едгт-теб1а1еб Се11 Абйекюп, !Вю1. Сйет., 268 (27), стр. 20352-59 (1993); а также публикацию РСТ РСТ/и8 91/04862). Данный пентапептид основан на трипептидной последовательности Атд-С1у-Акр из ΡΝ, которая известна как основной лейтмотив при распознавании сайта для некоторых внеклеточных матричных белков.

Примеры других ингибиторов УЪА-4 приводятся, например, в находящейся совместно на рассмотрении патентной заявке США 08/376372 и XVО 98/04913, которые специально включены в качестве справочного материала. В υδδΝ 376372 описаны линейные пептидильные соединения, содержащие β-аминокислоты, которые обладают ингибирующей активностью в отношении клеточной адгезии. Международные патентные заявки νθ 94/15958 и νθ 92/00995, специально включенные в качестве справочного материала, описывают циклический пептид и пептидомиметические соединения с активностью, модулирующей адгезию клеток. В международных патентных заявках νθ 93/08823 и νθ 92/08464 (включены в качестве справочного материала) описываются гуанидинил-, мочевину- и тиомочевинусодержащие соединения, модулирующие клеточную адгезию. В патенте США № 5260277 (также включен в качестве справочного материала) описываются гуанидинильные соединения, модулирующие клеточную адгезию.

Несмотря на эти достижения, все еще остается потребность в низкомолекулярных специфических ингибиторах УЪА-4-зависимой адгезии клеток, которые обладают улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами, такими как пероральная биодоступность и значительная продолжительность действия. Такие соединения могли бы дать полезные агенты для лечения, изменения, предотвращения и подавления различных патологий, опосредуемых клеточной адгезией и связыванием УЪА-4.

Сущность изобретения

Соединения настоящего изобретения являются ингибиторами УЪА-4 интегрина, блокируя тем самым связывание УЪА-4 с его различными лигандами, такими как УСАМ-1 и области фибронектина. Таким образом, данные соединения полезны в процессах ингибирования клеточной адгезии, в том числе клеточной активации, миграции, пролиферации и дифференцировки. Эти соединения полезны для ингибирования, предотвращения и подавления опосредуемой УЪА-4 клеточной адгезии и патологий, связанных с этой адгезией, таких как воспалительные и иммунные реакции, включая, например, рассеянный склероз, астму, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, воспалительные легочные заболевания, ревматоидный артрит, септический артрит, диабет 1-го типа, трансплантацию органов, рестеноз, аутотрансплантацию костного мозга, воспалительные последствия вирусных инфекций, миокардит, воспалительное заболевание пищеварительного тракта, в том числе неспецифический язвенный колит и болезнь Крона, некоторые типы токсического и иммунного нефрита, повышенную дермальную чувствительность, псориаз, опухолевый метастаз, множественную миелому и атеросклероз. Соединения данного изобретения могут использоваться по одному или в сочетании с другими терапевтическими или профилактическими агентами для ингибирования, изменения, предотвращения или подавления клеточной адгезии. Настоящее изобретение также предлагает фармацевтические готовые формы препаратов, содержащие данные ингибиторы УЪА-4-опосредуемой клеточной адгезии, и способы применения соединений и композиций настоящего изобретения для ингибирования клеточной адгезии.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана восприимчивость дыхательных путей овец после лечения оМеРиРА-У. Овец, чувствительных от природы к Аксапк киит, провоцируют аэрозолем аллергена Аксапк киит через 2 ч после введения аэрозоля оМеРиРА-У в указанных дозах или эквивалентного количества носителя. В указанные периоды времени измеряют механику легочного дыхания и записывают в виде изменения удельного сопротивления дыхательных путей в сравнении с предшествующим исследованию базовым значением (левая группа графиков). Устойчивость или сопротивление дыхательных путей вдыхаемому карбахолу определяют до начала исследования и через 24 ч после провокации аллергеном (правая группа графиков). Восприимчивость дыхательных путей приводят в виде отношения РС₄₀₀ (количество карбахола, требуемое для увеличения устойчивости на 400%) путем сравнения величин до провокации и после провокации.

Фиг. 2. Овец, чувствительных от природы к Аксапк киит, провоцируют введением аэрозоля оМеРиРА-У в указанных дозах или аэрозоля Аксапк киит. Изменения в устойчивости дыхательных путей измеряют после аэрозольной провокации и пиковую удельную легочную устойчивость (в см Н2О/с) после провокации сравнивают с базовыми значениями.

* = р <0,05 в сравнении с РВ 8-контролем, односторонний дисперсионный анализ, с последующим тестом Даннетта для множественного сравнения с контрольной группой. Показывает статистически значимое увеличение пиковой удельной легочной устойчивости в сравнении с РВ8 (фосфатно-солевой буферный раствор) контрольной группой.

Фиг. 3. Овец, чувствительных от природы к Акеапк киит, провоцируют аэрозолем аллергена Акеапк киит через 24 ч после четвертого ежедневного введения аэрозоля оМеРИРА-У (0,03 мг) или эквивалентного количества носителя (этанол:обычный физиологический раствор, 1:2, верхний график; Тпк:обычный физиологический раствор, 1:499, нижний график). В указанное время измеряют механику легочного дыхания и выражают в виде изменения удельной устойчивости дыхательных путей от базового значения перед исследованием (левые графики). Устойчивость дыхательных путей к вдыхаемому карбахолу определяют до начала исследования и через 24 ч после провокации аллергеном (правые графики). Восприимчивость дыхательных путей записывают в виде отношения РС₄₀₀ (количество карбахола, требуемого для увеличения устойчивости на 400%) сравнением значений до провокации и после провокации.

Фиг. 4. Мышей Ва1Ь/е, предварительно сенсибилизированных к ΌΝΡΒ (динитрофторбензол), провоцируют путем нанесения ΌΝΡΒ на тыльную поверхность левого уха и носителя на тыльную поверхность правого уха. Спустя 24 ч измеряют толщину каждого уха с помощью микрометра. оМеРИРА-У вводят в указанных дозах через 4 ч после провокации ΌΝΡΒ. Соединение положительного контроля (+КОНТ) дают в максимально эффективной кишечной дозе. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего для 8 животных. Верхний график показывает абсолютное опухание уха. Нижний график показывает процент ингибирования опухания уха по сравнению с контролем с использованием носителя (УЕН).

Фиг. 5. Анализ конкуренции между оМеРИРА-У и известным ингибитором при различных условиях активации. 1игка!-клетки (1,5х10⁶/мл) в ТВ8 плюс 2 мМ Мп²⁺, 1 мМ Са²⁺ плюс 1 мМ Мд²'. 1 мМ Са²⁺ плюс 10 мМ Мд²⁺, 10 мМ Мд²⁺ или 10 мМ Мд²⁺ плюс 10 мкг/мл Т82/16, обрабатывают 5 нМ ³Н-известного ингибитора одного или 5 нМ ³Н-известного ингибитора плюс 10 нМ ΒΙΟ 1591 в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки затем пеллетизируют центрифугированием, снова суспендируют в 100 мкл ТВ8 плюс Мп²⁺ и анализируют с помощью сцинтилляционного подсчета. Количество импульсов, связанное в этих условиях, определяет интегрин, который не занят испытуемым соединением и, следовательно, свободен для связывания с ³Н-известным ингибитором.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает соединения, которые способны ингибировать УЪА-4 опосредуемую клеточную адгезию ингибированием связывания лигандов с рецептором. Предпочтительным соединением является (К)Ш[[4-[[(2-метилфениламино)карбонил]амино] фенил]ацетил]-Ь-пролил-3-метил-в-аланин, обозначаемый здесь как «оМеРИРА-У» и представленный следующей формулой I:

Изобретение также охватывает фармацевтически приемлемые производные, соли и эфиры оМеРИРА-У.

Соединения формулы I содержат один или более асимметричных центров и, следовательно, могут быть в виде рацемических смесей, отдельных энантиомеров, диастереомерных смесей и индивидуальных диастереомеров. Настоящее изобретение предполагает охват всех таких изомерных форм соединения формулы I.

Заявляемое изобретение также подразумевает, что в его объем входят фармацевтически приемлемые соли соединения формулы I. Понятие «фармацевтически приемлемые соли» относится к солям, получаемым из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований или кислот, включая органические и неорганические основания и органические или неорганические кислоты. Соли, получаемые из неорганических оснований, включают соли алюминия, аммония, кальция, меди, железа (III), железа (II), лития, магния, марганца (III), марганца (II), калия, натрия, цинка и т.д. Особенно предпочтительными являются соли аммония, кальция, магния, калия и натрия.

Соли, получаемые из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, в том числе природных замещенных аминов, циклических аминов и основных ионообменных смол, таких как аргинин, бетаин, кофеин, холин, Ν,Ν'дибензилэтилендиамин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, Ν-этилморфолин, Ν-этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лизин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиперидин, полиаминные смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин, трометамин и др.

Когда соединение настоящего изобретения является основным, соли могут получаться из фармацевтически приемлемых нетоксичных кислот, включая неорганические и органические кислоты. Такими кислотами являются уксусная, бензолсульфоновая, бензойная, камфорсульфоновая, лимонная, этансульфоновая, фумаровая, глюконовая, глутаминовая, бромисто-водород002988 ная, соляная, изэтионовая, молочная, малеиновая, яблочная, миндальная, метансульфоновая, слизевая, азотная, памовая, пантотеновая, фосфорная, янтарная, серная, винная, п-толуолсульфоновая кислота и аналогичные. Особенно предпочтительными являются лимонная, бромисто-водородная, соляная, малеиновая, фосфорная, серная и винная кислоты.

Кроме того, заявляемое изобретение охватывает пролекарства, в частности сложноэфирные пролекарства, в которых карбоксильная группа (Κ)-Ν- [ [4- [ [(2-метилфениламино)карбонил]амино] фенил| ацетилЦЬ-пролил-З-метил-βаланина этерифицирована любым из спиртов. Предпочтительными спиртами являются метанол, этанол, пропанол, бутанол или С1-10 алкиловые спирты с линейными или разветвленными цепочками.

Способность соединений формулы I антагонизировать действию УЪЛ-4 делает их полезными для предотвращения, лечения или реверсии симптомов, расстройств или заболеваний, индуцируемых связыванием УЪЛ-4 с их лигандами. Так, данные антагонисты ингибируют процессы клеточной адгезии, в том числе клеточной активации, миграции, пролиферации и дифференцировки. Таким образом, согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предоставляются способы лечения, предотвращения, изменения или подавления нарушений или заболеваний, опосредуемых УЪЛ-4. Такими заболеваниями и нарушениями являются, например, астма, рассеянный склероз, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, воспалительные легочные заболевания, ревматоидный артрит, множественная миелома, септический артрит, диабет 1-го типа, отторжение трансплантированного органа, воспалительное заболевание кишечника и др.

Соединения данного изобретения могут синтезироваться с использованием любого обычного приема, несколько примеров которых приведены в описании. Предпочтительно эти соединения химически синтезируются из легкодоступных исходных материалов, таких как αаминокислоты и их функциональные эквиваленты. Модулярные и конвергентные методы синтеза этих соединений также являются предпочтительными. При конвергентном подходе, например, крупные отрезки конечного продукта доставляются вместе на последней стадии синтеза, вместо того, чтобы добавлять небольшие фрагменты к растущей молекулярной цепочке.

Соединения данного изобретения могут также модифицироваться присоединением соответствующих функциональных групп для усиления селективных биологических свойств. Такие модификации известны в данной области и включают видоизменения, которые повышают биологическую проницаемость в данную биологическую систему (например, в кровь, лимфати ческую систему, центральную нервную систему), повышают пероральную доступность, повышают растворимость, чтобы обеспечить возможность введения путем инъекции, меняют метаболизм и скорость выведения. Примерами таких модификаций являются, но не ограничиваются ими, этерификация полиэтиленгликолями, получение производных с помощью пиволатов или жирнокислотных заместителей, превращение в карбаматы, гидроксилирование ароматических колец и гетероатомное замещение в ароматических кольцах.

Во всем описании термин «пациент» относится к млекопитающим, в том числе к человеку. А понятие «клетка» относится к любой клетке, предпочтительно к клеткам млекопитающих, включая клетки человека.

После синтеза активность и УЪА-4специфичность соединений настоящего изобретения может быть определена с использованием исследований ίη νίίτο и ίη νίνο.

Например, ингибирующая клеточную адгезию активность этих соединений может быть измерена путем определения концентрации ингибитора, требуемой для блокирования связывания УЪА-4-экспрессирующих клеток с планшетами, покрытыми фибронектином или С81. При испытании этого типа лунки микротитровального планшета покрывают или фибронектином (содержащим С8-1 последовательность) или С8-1. Если используется С8-1, то он должен быть конъюгирован с белком носителя, таким как бычий сывороточный альбумин, для того, чтобы прикрепить его к лункам. После покрытия лунок добавляют варьируемые концентрации испытуемого соединения вместе с подходящим образом мечеными УЬА-4-экспрессирующими клетками. Альтернативно можно сначала добавлять испытуемое соединение и дать ему возможность инкубироваться с покрытыми лунками перед добавлением клеток. Клетки оставляют инкубироваться в лунках, по меньшей мере, на 30 мин. После инкубации лунки опустошают и промывают. Ингибирование связывания измеряют путем количественного определения флуоресценции или радиоактивности, связанной с планшетом, для каждой из различных концентраций испытуемого соединения, а также для контроля, не содержащего испытуемое соединение.

Клетки, экспрессирующие УЪА-4, которые могут быть использованы в этом испытании, включают Ваток клетки, ,1игка1 клетки, клетки А375 меланомы, а также лимфоциты периферической крови (РВЬ) человека. Клетки, используемые в данном испытании, могут метиться любым подходящим способом, например, флуоресцентно или могут иметь радиоактивную метку.

Для количественного определения ингибирующей активности соединении изобретения может также использоваться метод непосредст венного или прямого связывания. В данном анализе белок слияния, УСЛМ-1дС. содержащий первые два иммуноглобулиновых домена УСАМ (И1И2), присоединенные выше междоменной области молекулы 1дС1 (УСАМ2И1дС), конъюгируется с маркерным ферментом, таким как щелочная фосфатаза («АР»). Синтез данного белка слияния УСАМ-1дС описан в РСТ публикации XVО 90/13300, содержание которой включено в качестве справочного материала. Конъюгирование данного белка слияния с маркерным ферментом достигается методами поперечной сшивки, хорошо известными в данной области.

УСАМ-1дС-ферментый конъюгат затем помещают в лунки многолуночного фильтрационного планшета, такого как планшет, содержащийся в системе М1Шроге МиЙ1ксгееп Аккау 8ук1ет (Мййроге Согр., ВебГогб, МА). Затем в лунки добавляют различные концентрации испытуемого ингибирующего соединения последующим добавлением клеток, экспрессирующих УЪА-4. Клетки, соединение и УСАМ-1дСферментный конъюгат смешивают вместе и оставляют инкубироваться при комнатной температуре.

После инкубации лунки вакуумно дренируются, оставляя клетки и любые связанные УСАМ. Количественный анализ связанных УСАМ определяют путем добавления соответствующего колориметрического субстрата для фермента, конъюгированного с УСАМ-1дС, и определения количества продукта реакции. Уменьшенное количество продукта реакции указывает на повышенную ингибирующую связывание активность. Протокол некоторых анализов описан ниже.

Для того чтобы оценить УЪА-4 ингибирующую специфичность соединения настоящего изобретения, проводят анализ на других основных группах интегринов, т.е. β2 и β3, а также других β1 интегринов, таких как УЪА-5, УЪА-6 и α4β7. Эти анализы могут быть аналогичны анализам ингибирования адгезии и непосредственного связывания, описанным выше, с заменой соответствующей интегрин-экспрессирующей клетки и соответствующего лиганда.

Например, полиморфно-ядерные клетки (РМЫ) экспрессируют β2 интегрины на своей поверхности и связываются с 1САМ. Интегрины β3 вовлечены в агрегацию тромбоцитов, и ингибирование может быть измерено с помощью стандартного анализа агрегации тромбоцитов. УЪА-5 специфично связывается с последовательностями Агд-С1у-Акр, тогда как УЪА-6 связывается с ламинином. α4β7, представляет собой недавно открытый гомолог УЪА-4, который также связывается с фибронектином и УСАМ. Специфичность относительно α4β7 определяют с помощью анализа связывания, в котором используют описанный выше маркерный конъю гат УСАМ-1дС-фермент и линию клеток, которые экспрессируют α4β7, но не УЪА-4, такую как клетки ВМР1-8866 или ΙΥ.

После идентификации УЪА-4-специфичных ингибиторов их можно дополнительно охарактеризовать в анализах ίη νί\Ό. В одном из таких анализов испытывается ингибирование контактной гиперчувствительности у животных, в таком, как описан Р.Ъ. С1ик1ю1т е1 а1., Мопос1опа1 АпйЬоб1ек Ю Не Iп!едге1 η α-4 8иЬипй ΙηЫЬй Не Миппе Соп1ас1 НурегкепкШгйу Векропке, Еиг. 1. 1ттипо1., 23, рр. 682-688 (1993), и в Сшгеп! Рго1осо1 ш 1ттипо1оду, ЕЕ. Сойдап, е1 а1., Ебк., 1ойп ΧνίΕγ & 8опк, Иете Υо^к, 1, рр. 4.2.1-4.2.5 (1991), содержание которых включены в качестве справочного материала. В данном анализе кожу животного сенсибилизируют путем воздействия раздражителя, такого как динитрофторбензол, с последующим легким физическим раздражением, таким как легкое почесывание кожи острой кромкой. После периода выздоровления животных повторно сенсибилизируют, следуя той же методике. Через несколько дней после сенсибилизации одно ухо животного подвергают воздействию химического раздражителя, тогда как другое ухо обрабатывают нераздражающим контрольным растворителем. Вскоре после обработки ушей животным вводят различные дозы ингибитора УЪА-4 путем подкожной инъекции. 1п у|уо ингибирование воспаления, связанного с клеточной адгезией, оценивают измерением реакции опухания обработанного уха животного относительно необработанного. Опухание измеряют с использованием штангенциркуля или другого подходящего инструмента для измерения толщины уха. Таким образом, можно идентифицировать те ингибиторы изобретения, которые наиболее хорошо подходят для ингибирования воспаления.

Еще один метод ш у|уо, который может применяться для испытания ингибиторов данного изобретения, представляет собой анализ астмы у овец. Данный анализ проводят по существу так, как описано в работе №.М. АЬгайат е1 а1. а.4-1п1едппк Меб1а1е Апйдеп-шбисеб Ьа1е ВгопсЫа1 Векропкек апб Рго1опдеб Λίπνην Нуреггекропкшепекк ш 8йеер, 1. С1ш. 1пуекЪ 93. рр. 776-87 (1994), содержание которой включено в качестве справочного материала. В этом анализе измеряют ингибирование индуцированной антигеном Аксапк ответной реакции дыхательных путей поздней фазы и гиперчувствительности дыхательных путей у аллергических овец. Соединения данного изобретения могут быть также испытаны в анализе агрегации тромбоцитов.

Ингибиторы УЪА-4 изобретения показали поразительно благоприятную активность и селективность. В целом эти соединения селективны для УЪА-4 (более чем в 1000 раз в сравнении с α4β7 и α5β1), дают отрицательный результат в обычных исследованиях РаиИаЬ и обычном пои-бЬР тесте Эймса, безупречны в стандартных дополнительных фармакологических тестах и эффективны на модели овец после введения один раз в день согласно предписанному уровню применения на людях 1 мг/день или менее.

Заявленные соединения обладают неожиданно превосходной активностью в сравнении со структурно родственными УИА-4 ингибиторами. Например, у Лксапк-чувствительных овец, обрабатываемых один раз в день в течение четырех дней с помощью распыленного лекарственного средства в дозе 0,1 мг/кг и затем обработанных антигеном через 24 ч после введения последней дозы лекарства, ранее испытанные соединения по существу смягчали раннюю реакцию и блокировали бронхостеноз поздней фазы и развитие неспецифической гипервосприимчивости. С учетом биоэквивалентности для человека потребуется суммарная доза для пациента весом 70 кг в 7 мг. Кроме того, лекарство вводилось овцам через эндотрахеальную трубку при дозах отложения, которые оцениваются в 2 раза больше, чем обычно достигаемые у человека с помощью пероральных ингаляторных устройств. Кроме того, вероятно, что потребуется добавление наполнителей (эксципиентов) к конечной твердой рецептуре, чтобы оптимизировать процесс заполнения устройства и доставку лекарства. Данные факторы предполагают возможную дозу, требуемую человеку, 14 мг или более, которая превышает технический предел 1-5 мг, который может доставляться однократным приведением в действие ингалятора сухого порошка (ЭР1). Хотя необходимая доза могла бы доставляться с помощью многократного приведение в действие ΌΡΙ, это являлось бы недостатком на рынке астматических препаратов, где обычные дозы ингалируемого стероида составляют 0,2-1,0 мг.

оМеРИРЛ-У ослабляет раннюю реакцию, блокирует бронхостеноз поздней фазы и нормализует гипервосприимчивость при минимальной дозе 0,003 мг/кг при введении в виде однократной распыленной дозы за 2 ч до провокации антигеном. Более того, суточная доза в 0,001 мг/кг в течение 4 дней при провокации антигеном через 24 ч после последней дозы дает максимальную реакцию. Таким образом, оМеРИРАV в 30-100 раз более активен, чем предшествующие соединения, и имеет уровень доз в пределах наилучших продаваемых ингалируемых стероидов. оМеРИРА-У, так же как и предпоследнее промежуточное соединение синтеза, имеет высокую степень кристалличности (см. фиг. 1, табл. 1).

Кроме того, оМеРИРА-У имеет улучшенный метаболический профиль по сравнению с известными соединениями ингибиторами УЪА4. Например, после аэрозольного введения заявленные соединения быстро превращаются в менее активный метаболит, который является преобладающим продуктом, выделяемым бронхоальвеолярной промывной жидкостью (БАБЕ), и также преобладающим продуктом, обнаруживаемым в большом круге кровообращения, где он проявляет более длительный период полувыведения из плазмы, чем исходное соединение. Хотя быстрое метаболическое превращение в менее активные соединения является полезной стратегией для достижения пониженного системного воздействия, соединения, которые метаболизируются в побочные продукты почти или совсем не обладающие активностью, создают меньше сложностей при разработке и являются предпочтительными с точки зрения возможных перспектив.

Потенциальные протеолитические продукты оМеРИРА-У являются неактивными в анализах УИА-4-связывания, поэтому протеолиз будет приводить к неактивным продуктам, не заслуживающим внимания. Тем не менее, исследования метаболизма ίη У11го. а также ίη угуо фармакокинетические исследования на крысах, собаках и овцах показали, что оМеРИРА-У является протеолитически стабильным.

Таблица 1

Свойства оМеРИРА-У в сравнении с ранее известными ингибиторами.

Свойства	Известные соединения	оМеРИРА-У
1С50 против связывания УИА-4-УСАМ-1ц	1,5 нМ	2,7 нМ
1С50 против связывания а4в7-УСАМ-1д	2,7 мкМ	>100 мкМ
1С50 против адгезии α5β 1-ΕΝ	>100 мкМ	>100 мкМ
Минимальная эффективная доза на модели овец:
- однократная доза	0,1 мг/кг	0,003 мг/кг
- повторяемая доза	0,03-0,1 мг/кг	0,001 мг/кг
Кристалличность	Отсутствует	Есть
Фармаскрининг ίη уйго в 85 тестах	1 слабый выпад	Безупречен
АСЕ-активность	АСЕ-субстрат	Безупречен
Глюкуронидирование	Низкие уровни	Плановое
Тест Эймса (мутагенность)	Безупречны	Безупречен
Вспомогательная фармакология (побочные эффекты)	Безупречны
Системное воздействие (10 мг аэрозольная доза овцы)	40 нг/мл х ч	Закончены
Метаболический профиль	Активные метаболиты

Пероральная доступность	<1%	<1%
Стабильность в объеме (40°С, ОН 75%)	«нестабильны»	Стабилен >4 недель
Стабильность в препарате (40°С)	0,2% разложения/день	Стабилен >4 недель

Соединения настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде готовых форм фармацевтических композиций, которые могут вводиться перорально, парентерально, с помощью спреев для ингаляции, локально, ректально, назально, трансбуккально, вагинально или через имплантируемый резервуар. Понятие «парентерально», которое используется в данном описании, включает подкожное, внутривенное, внутримышечное, интраартикулярное или внутрисуставное, внутригрудинное, внутриоболочечное, внутрипеченочное введение, введение внутрь повреждения и внутричерепное введение с помощью инъекций или вливания.

Фармацевтические композиции данного изобретения включают любое из соединений настоящего изобретения или его фармацевтически приемлемое производное вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Понятие «носитель», используемое в данном описании, включает фармацевтически приемлемые адъюванты и растворители. Фармацевтически приемлемые носители, которые могут использоваться в фармацевтических композициях изобретения, включают, но не ограничиваются ими, ионообменники, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, вторичный кислый фосфат натрия, кислый фосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидную двуокись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блоксополимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

В соответствии с настоящим изобретением фармацевтические композиции могут быть в форме стерильных инъецируемых препаратов, например, стерильных инъецируемых водных или масляных суспензий. Суспензии могут быть приготовлены в соответствии с известными в данной области приемами с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильные инъецируемые препараты могут также представлять стерильные растворы или суспензии для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, как раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут применяться, находятся вода, раствор

Рингера и изотонический раствор хлористого натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспензионной среды удобно применяются стерильные нелетучие масла. Для данной цели может применяться любое легкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, полезны при получении препаратов для инъекций, как и природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, в особенности в виде их полиоксиэтилированных производных. Эти масляные растворы или суспензии также могут содержать длинноцепочечный спиртовый разбавитель или дисперсант.

Фармацевтические композиции данного изобретения могут вводиться в любой перорально приемлемой лекарственной дозированной форме, включающей, но, не ограниченной ими, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения, носителями, которые обычно используются, являются лактоза и кукурузный крахмал. Обычно добавляются смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсул полезными разбавителями являются лактоза и высушенный кукурузный крахмал. Если для перорального применения требуются водные суспензии, активный ингредиент смешивается с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При желании, могут также добавляться некоторые подслащивающие, вкусовые и красящие агенты.

Альтернативно, фармацевтические композиции данного изобретения могут вводиться в форме свечей для ректального применения. Они могут приготавливаться смешением агента с подходящим нераздражающим эксципиентом, который является твердым при комнатной температуре, но жидким при ректальной температуре, и поэтому будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарства. К таким материалам относятся масло какао, пчелиный воск и полиэтиленгликоли.

Фармацевтические композиции изобретения также могут вводиться местно или топически, особенно когда целью лечения являются области или органы, легко доступные для местного введения, включая, например, заболевания глаз, кожи или нижней области кишечного тракта. Подходящие препараты для местного применения легко приготавливаются для каждого из этих участков или органов.

Местное применение в нижней области кишечного тракта может осуществляться с использованием лекарственных форм в виде све чей (см. выше) или подходящих препаратов для клизм. Могут также использоваться местные трансдермальные пластыри.

Для местного применения фармацевтические композиции могут быть приготовлены в виде подходящей мази, содержащей активный компонент, суспендированный или растворенный в одном или более носителях. Носители для местного введения соединений настоящего изобретения включают, но не ограничиваются ими, минеральное масло, вазелиновое масло, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, полиоксипропиленовые соединения, эмульгирующий воск и воду. Альтернативно, фармацевтические композиции могут быть сформированы в виде подходящего лосьона или крема, содержащего активные компоменты, суспендированные или растворенные в одном или более фармацевтически приемлемых носителях. Подходящими носителями являются, но не ограничиваются ими, минеральное масло, моностеарат сорбитана, полисорбат 60, цетиловые эфиры воска, цетариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и вода.

Для применения на глазах фармацевтические композиции могут быть приготовлены в виде тонкоизмельченных суспензий в изотоническом стерильном физиологическом растворе с установленным значением рН, или предпочтительно в виде растворов в изотоническом физиологическом растворе с установленным значением рН или с добавлением или без добавления консерванта, такого как бензилалконийхлорид. Альтернативно, глазные фармацевтические композиции могут быть получены в виде мази, такой как вазелин.

Фармацевтические композиции данного изобретения могут также вводиться в виде назального аэрозоля или ингаляции с использованием распылителя, ингалятора сухого порошка или дозирующего ингалятора. Такие композиции готовят в соответствии с хорошо известными в области фармацевтических препаратов приемами, и могут быть получены в виде растворов в физиологическом растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, промоторов абсорбции для усиления биодоступности, фторуглеродов и/или других общепринятых солюбилизирующих или диспергирующих агентов. Кроме того, композиции изобретения могут включать любые фармацевтически приемлемые носители, такие как, например, лактоза, для сухих порошковых препаратов.

Количество активного ингредиента, которое может сочетаться с материаламиносителями для приготовления однократной дозированной формы, меняется в зависимости от реципиента, подвергаемого лечению, и конкретного способа введения. Следует понимать, однако, что конкретная дозировка и схема приема лекарственного препарата для любого конкретного пациента будет зависеть от ряда факторов, в том числе активности конкретно используемого соединения, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, режима питания, времени введения, скорости выведения, лекарственного сочетания, а также от мнения лечащего врача и серьезности заболевания. Количество активного ингредиента может также зависеть от терапевтического или профилактического агента, если он используется, с которым этот ингредиент вводится совместно.

Дозировка и уровень дозы соединений настоящего изобретения, эффективные для предотвращения, подавления или ингибирования клеточной адгезии, будут зависеть от ряда факторов, таких как природа ингибитора, вес пациента, цель лечения, природа патологии, подвергаемой лечению, используемая конкретная фармацевтическая композиция, а также мнение лечащего врача. Полезны уровни доз примерно между 0,001 и 100 мг/кг веса тела в день, предпочтительно между 0,01 и 50 мг/кг и более предпочтительно примерно 10 мг активного соединения в день на кг веса тела в день.

В тех случаях, когда используются композиции для внутривенного введения, подходящий интервал доз составляет приблизительно от 0,001 мг до 25 мг/кг, более предпочтительно примерно от 0,01 мг до 1 мг/кг.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения композиции, содержащие соединения настоящего изобретения, могут также включить дополнительный агент, выбранный из группы, включающей кортикостероиды, бронхолитические средства, антиастматические средства (стабилизаторы тучных клеток), противовоспалительные средства, противоревматические средства, иммунодепрессанты, антиметаболиты, иммуномодуляторы, средства против псориаза и противодиабетические средства. Конкретные соединения, относящиеся к каждому из этих классов, могут быть выбраны из любых соединений, перечисленных в соответствующей группе в издании: «Сотргейеп51уе Меб1С1па1 СйетМгу». Регдатоп Ргсбб. ОхГогб. Епд1апб, стр. 970-986 (1990) (включено в качестве справочного материала). Также в данную группу входят такие соединения, как теофиллин, сульфазалазин и аминосалицилаты (противовоспалительные средства); циклоспорин, РК506 и рапамицин (иммунодепрессанты); циклофосфамид и метотрексат (антиметаболиты); стероиды (ингалируемые, пероральные или топические) и интерфероны (иммуномодуляторы). Кроме того, соединения изобретения могут вводиться в сочетании с дополнительными ингибиторами клеточной адгезии. При введении одного или нескольких дополнительных агентов в сочетании с заявленными УЕА-4-ингибиторами, активные ингредиенты могут рецептурироваться вместе, или, альтернативно, могут вводиться в сочетании. Введение одного или более актив ных агентов в сочетании с ингибиторами УЬЛ4, заявленного изобретения может быть, по существу, одновременным или последовательным. Квалифицированные в данной области специалисты могут легко определить наиболее подходящий метод применения в зависимости от вводимых агентов, желаемого результата, пациента и его состояния.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение предлагает способы предотвращения, ингибирования или подавления ассоциированного с клеточной адгезией воспаления и ассоциированных с клеточной адгезией иммунных или аутоиммунных реакций у пациента. Ассоциированная с УЬА-4 клеточная адгезия играет центральную роль при различных воспалениях, иммунных и аутоиммунных заболеваниях. Таким образом, ингибирование клеточной адгезии с помощью соединений настоящего изобретения может быть использовано в способах лечения или предотвращения воспалительных, иммунных и аутоиммунных заболеваний. Предпочтительно заболевания, которые можно лечить способами настоящего изобретения, выбираются из таких заболеваний, как астма, артрит, псориаз, отторжение трансплантата, рассеянный склероз, диабет и воспалительное заболевание кишечника.

В этих способах соединения настоящего изобретения могут использоваться в монотерапии или в сочетании с противовоспалительными агентами или иммунодепрессантами. Такая комбинационная терапия включает введение агентов в разовой дозированной форме или в виде множественных дозированных форм в одно и то же или в различное время.

Примеры

Пример 1. Получение оМеРИРА-У.

оМеРИРА-У, (К.) -Ν- [ [4 - [ [(2 -метилфениламино)карбонил]амино]фенил]ацетил]-Ь-пролил-3-метил-в-аланин, получают по конвергентной схеме синтеза из промышленно производимых сукцинимидил Вое-(Ь)-пролина (ВосРго-О8и; Васйеш) и полусульфата (К)-бензил-Заминобутирата (Се1депе Согр.). Сочетание исходных веществ в СН₂С1₂ в присутствии Εΐ₃Ν с последующим гидролизом бутоксикарбонильной (Вос) группы 4н. НС1 в диоксане давало НС1-соль, которая перекристаллизовывалась из смеси СН₂С1₂/Е1₂О. Сочетание НС1-соли с сукцинимидил-2-[4-[2-(метилфениламинокарбонил)]амино]фенилацетатом (МРИРА-О8и), полученным из соответствующей кислоты МРИРА-ОН (Кгсегса, 1пс.), давало кристаллический бензиловый эфир оМеРИРА-У, который каталитически гидрировался (10% Рб/С) в смеси ТГФ/Н₂О (9:1), давая оМеРИРА-У. Конечный продукт получался в виде белого твердого вещества после перекристаллизации из 20%-го водного ацетона.

Краткое описание физических характеристик Химическое название: (Β)-Ν-[[4-[[(2метилфениламино)карбонил]амино]фенил] ацетил]-Ь-пролил-3-метил-в-аланин.

Эмпирическая формула: С25Н₃₀ЩО₅ Молекулярный вес: 466,53 Внешний вид: чистый белый порошок Температура плавления: 153,6-154,4°С Схема 1

Получение МРИРА-О8и (2) из МРИРА-ОН (1)

Схема 2

Синтез оМеРИРА-У (8) из Вос-(Ь)-Рго-О8и (3) и полусульфата бензил-(К)-3-аминобутирата (4) .

* у^С0>В'сН^|_г,ТТА ⁸⁰¹

А* (нХЛ ^я°“ ^т^^2часа

н. НСИДиоксан седел комн, т-ра, 2 часа

92% (2 стадии)

2. ДМФ. ТЕА, комн, т-ра, 3,5 часа

.. СН, Н

^СОзВп

Асн,

68%

2. Перекристаллизация из20% води, ацетона, 84%

СО.Н Асн, н

Синтез оМеРИРА-У

Химический синтез, используемый для получения оМеРИРА-У, представлен на схемах 1 и 2. Исходные материалы получают из коммерческих источников и от производителей по контракту: (1) приготовлен в большом фирмой Βίсегса, 1пс., РатекуШе, ОН; (3) получен от фирмы Васйеш Вюкаепсе, 1пс., Кшд о! Ргикща, РА и (4) получен от фирмы Се1депе Согр., Ааггеп, N1.

Получение оМеРИРА-У:

Общие аналитические методы ('Н ЯМР, ¹³С ЯМР, масс-спектрометрия, ИК-спектрометрия и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)).

Спектроскопию ¹Н ЯМР проводят или на приборе Вгикег АС 300, Уапап 500, или Уапап 600, образцы анализируют либо в ДМСО-бб относительно сигнала ДМСО-б₆ (δ 2,49 м.д.), либо в СЭС1₃ относительно сигнала остаточного СНС1₃ (δ 7,24 м.д.).

Спектроскопию ¹³С ЯМР проводят либо на приборе Уапап 500, либо на приборе Уапап 600, образцы анализируют либо в ДМСО-б6 относительно сигнала ДМСО-б₆ (δ 40,5 м.д.), либо в СЭС1₃ относительно сигнала СЭС1₃ (δ 77,0 м.д.).

Масс-спектры записывают на массспектрометрической системе Икопк УС Р1аГогт ЬС-М8-О8 с автоматическим пробоотборником Не\\'1е11 Раскагб Мобе1 1500, и данные обрабатывают с использованием рабочей станции для масс-спектрометрии Είκοηκ УС МаккЬупх. Массспектры высокого разрешения (НКМ8) определяют с использованием бомбардировки быстрыми атомами при М-сканировании (РА) на высокопольном масс-спектрометре УС Апа1у 11са1 ΖΑΒ 28Е относительно 8ОР # М8-002, М8006, М8-012 и М8-023. Для генерирования ионов используют цезиевую пушку, полученные масс-спектры записывают с использованием системы обработки данных ΡΌΡ-11-250Ε

ИК-спектры записывают на Регкш-Е1тег 1600 8епе5 ГПК

Аналитическую ВЭЖХ проводят следующим образом.

1. Хроматограммы с использованием программы 1 (уравновешивание при 20% В, ввод образца, 20% В (1 мин), 20-70% В (24 мин), 70100% В (17 мин)) получают с использованием автоматической системы отбора проб для ВЭЖХ Регкт Е1тег 8епе5 200 с УФ-детектором Регкш Е1тег 785А (установленным на 214 нм) и с УФ-детектором Аррйеб Вюкуйетк 783А ИУ (установленным на 254 нм) с интегратором РЕ №1§οη 1020. Приводится только процент площади.

2. Хроматограммы с использованием программы 8 (уравновешивание при 15% В, ввод образца, 15% В (1 мин), 15-40% В (25 мин), 40% В (10 мин)) получают с использованием системы подачи растворителя Аррйеб Вюкуйетк 400 с УФ-детектором 783А с использованием автоматического пробоотборника \Уа1ег5 717. Данные обрабатывают с использованием интегратора Не^1ей Раскагб 3396 8епе5 II. На интеграторе устанавливают следующие параметры: Затухание = 8, Порог = 5, Отклонение площади = 10000, Ширина пика = 0,04, Скорость диаграммы = 0,2.

Все работы с использованием ВЭЖХ проводят с использованием колонки Уубас С-18 (размер пор 5т, 4,5 мм х 25 см, каталожный номер #218ТР54).

Растворитель А: (вода+0,1% трифторуксусной кислоты (ТГА).

Растворитель В: (ацетонитрил+0,1% ТГА).

Скорость потока: 1 мл/мин.

Используют следующие градиентные программы.

Программа 1: (уравновешивание при 20% В, ввод образца, 20% В (2 мин), 20-70% В (25 мин), 100% В (5 мин).

Физические данные для [[4-[[(2метилфенил)амино] карбонил] амино] фенил] уксусной кислоты (1, МРИРА-ОН, вещество, производимое фирмой Кгсегса 1пс.):

Т. пл.: 210-215°С (разл.).

ИК-(КВг): 3295 (ушир. полоса), 3034 (ушир. полоса), 1707, 1637, 1603, 1551, 1516, 1457, 1414, 1302, 1241, 1189, 1118 см^-1.

' Н ЯМР (600 МГц, ДМСО-б₆), δ, м.д: 12,28 (ушир. с, 1Н), 9,0 (с, 1Н), 7,91 (с, 1Н), 7,88 (д,

1=7,8 Гц, 1Н), 7,43 (д, 1=8,4 Гц, 2Н), 7,19 (д, 1=8,4 Гц, 2Н), 7,16 (м, 2Н), 6,94 (дд, 1=7,8, 8,4 Гц, 1Н), 3,51 (с, 2Н), 2,25 (с, 3Н).

¹³С ЯМР (150 МГц, ДМСО-б₆), δ, м.д: 173,0 (С), 152,7 (С), 138,5 (С), 137,5 (С), 130,2 (СН),

129,8 (СН), 128,3 (СН), 127,5 (СН), 126,2 (СН), 122,7 (СН), 121,0 (СН), 118,1 (СН), 40,1 (СН₂),

17,9 (СН₃);

МС (Е1): т/ζ 285 (М+1)⁺, 193, 152, 134, 132, 109, 108, 106, 93, 91, 57;

Элементный анализ. Вычислено для С1₆Н₁₆Ы₂О₃: С 67,59, Н 5,67, N 9,85. Найдено: С 67,60, Н 5,70, N 10,01.

Получение сукцинимидил-[4-[[[(2-метилфенил)амино]карбонил]амино]фенил]ацетата (2, МРИРА-О8и).

К кипящей суспензии о-метилфенилмочевины-фенилуксусной кислоты (1, МРИРА-ОН, 150 г, 0,501 моль, от фирмы Кгсегса 1пс.) в ацетонитриле (600 мл) на протяжении 10 мин при энергичном перемешивании добавляют тионилхлорид (41 мл, 0,558 моля). Выделяется большое количество НС1. Реакционную смесь при непрерывном перемешивании в течение 1,5 ч охлаждают до комнатной температуры. Реакционная смесь становится розовой суспензией, к которой одной порцией добавляют твердый Νгидроксисукцинимид (НО8и, 75,5 г, 0,636 моля). К данной смеси по каплям добавляют триэтиламин (174 мл) в течение 30 мин, при этом температуру реакционной смеси поддерживают ниже 60°С с помощью водяной бани. Перемешивание продолжают в течение 2 ч и затем к реакционной смеси добавляют дистиллированную воду (500 мл). Твердое вещество отфильтровывают и промывают 2 л дистиллированной воды и ацетонитрилом (2 х 200 мл), сушат на воздухе и затем сушат над Р₂О₅ под вакуумом (~0,1 мм рт.ст.), получая сырой продукт (175 г, выход 97%) в виде бежевого порошка. Сырой продукт (174 г) перекристаллизовывают из ацетонитрила (3,5 л) с углем (10 г) для обесцвечивания, получая 129 г МРИРА-О8и (2, выход 68%) в виде белого порошка (чистота >99%).

Т.пл.: 211,2-211,8°С.

ИК-(КВг): 3904-3203 (ушир. полоса), 1816, 1783, 1654, 1368, 1304, 1244, 1116, 1021 см^-1.

' Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-сР). δ, м.д: 9,04 (с, 1Н), 7,92 (с, 1Н), 7,82 (д, 1Н), 7,44 (д, 1=8,5 Гц, 2Н), 7,24 (д, 1=8,5 Гц, 2Н), 7,15 (м, 2Н), 6,93 (дд, 1=7,4, 7,3 Гц, 1Н), 4,02 (с, 2Н), 2,80 (с, 4Н),

2,23 (с, 3Н).

МС (Е1, Е8⁺): т/ζ 382 [(М+1)⁺], 239, 108, 106;

Физические данные для сукцинимидилВос-(Ь)-пролина (Вос-Рго-О8и, 3, вещество, получаемое от фирмы Васйет Вюкаепсе):

Т. пл.: 132-136°С.

ИК (КВг): 3456, 2940, 1731, 1619, 1561, 1541, 1497, 1454, 1395, 1337, 1259, 1202, 1118, 1060 см^-1.

'|| ЯМР (300 МГц, СБС1з), δ, м.д: 4,51 (дд, 1=3,8, 8,7 Гц, 1Н), 3,56 (м, 1Н), 3,44 (м, 1Н), 2,80 (с, 4Н), 2,32 (м, 1Н), 2,27 (м, 1Н), 1,94 (м, 2Н), 1,43 (с, 9Н).

МС (ΕΙ): т/ζ 335 (Μ+Ν₂)⁺, 279, 213, 138, 114, 86;

ВЭЖХ: 97,1%.

Физические данные для полусульфата бензил-(В)-3-аминобутирата (4, вещество, получаемое от фирмы Сс1с.|спс Согр.):

Т. пл.: 249,4-249,8°С.

ИК (КВг): 3515, 3383, 2989, 2945, 2880, 1821, 1788, 1744, 1701, 1476, 1454, 1421, 1394, 1368, 1260, 1241, 1202, 1159, 1077 см^-1.

'Н ЯМР (300 МГц, СБС1₃), δ, м.д: 7,85 (ушир. с, 2Н), 7,26 (с, 5Н), 5,06 (АВ кв., 1=12,3 Гц, 2Н), 4,35 (м, 2Н), 3,73 (м, 1Н), 2,92 (дд, 1=6,4, 17,1 Гц, 1Н), 2,66 (дд, 1=6,4, 17,0 Гц, 1Н),

1,35 (д, 1=6,5 Гц, 3Н).

МС (ΕΙ): т/ζ 195 (М+3)⁺, 194 (М+2)⁺, 106, 92, 91;

ВЭЖХ: 99,0%.

Получение бензилового эфира Ы-(третбутоксикарбонил)-Ь-пролил-3-метил-(В)-валанина (5).

К хорошо перемешиваемой суспензии полусульфата бензил-(В)-3-аминобутирата (4; 66,7 г, 213 ммоля) в СН₂С1₂ (200 мл) добавляют Вос(Ь)-Рго-О8и (3; 53,9 г, 222 ммоля) и Εΐ₃Ν (95 мл, 681 ммоль). Реакционную смесь оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь распределяют между ЕЮАс (1,5 л) и Н₂О (250 мл) и органический слой промывают 10%-й лимонной кислотой (3 х 250 мл), Н₂О (250 мл), насыщенным раствором бикарбоната натрия (250 мл), Н2О (250 мл) и рассолом (3 х 250 мл), сушат №ь8О₄ и концентрируют сначала на роторном испарителе (40°С; ~80 мм рт.ст.) и затем в высоком вакууме (комнатная температура, 16 ч, 0,2 мм рт.ст.), получая промежуточное соединение 5 в виде вязкого масла (88,1 г), которое содержит остаточный ЕЮАс и СН₂С1₂ (согласно ЯМР) и имеет чистоту >98% (ВЭЖХ). Это вещество используют в последующей реакции без дополнительной очистки.

'Н ЯМР (300 МГц, СБС1₃), δ, м.д: 7,30 (м, 5Н), 6,44 (ушир. с, 1Н), 5,10 (дд, 1 = 12,3, 14,1 Гц, 2Н), 4,32 (м, 1Н), 4,13 (м, 1Н), 3,34 (ушир. с, 2Н), 2,48 (д, 1=5,1 Гц, 2Н), 2,1 (м, 2Н), 1,75 (ушир. с, 2Н), 1,40 (с, 9Н), 1,17 (д, 1 = 6,0 Гц, 3Н).

МС (ΕΙ): т/ζ 413 |М-\з|'. 313, 291, 191, 194, 165, 91.

Получение гидрохлорида бензилового эфира Е-пролил-3-метил-(В)-в-аланина (6).

К промежуточному соединению 5 из предыдущей реакции постепенно добавляют раствор 4н. НС1 в диоксане (240 мл). Наблюдается сильное выделение газа (осторожно, реакция экзотермическая). Реакционную смесь оставля ют перемешиваться при комнатной температуре (2 ч) и затем концентрируют сначала на роторном испарителе (45°С; ~80 мм рт.ст.), а затем в высоком вакууме в течение ночи (комнатная температура, 14 ч, ~0,2 мм рт.ст.), получая крайне вязкое вещество, которое перекристаллизовывают из ΕΠ₂Ο₂/Εΐ₂0 (600 мл/700 мл), получая 64,0 г (общий выход 92% для двух стадий) НС1-соли 6 в виде белого твердого вещества (чистота по данным ВЭЖХ 99,6%).

Т. пл.: 119,8-120,5°С.

ИК (КВг): 3217, 3072, 2904, 2756, 1736, 1681, 1560, 1446, 1387, 1352, 1295, 1244, 1178, 1096 см^-1.

'Н ЯМР (500 МГц, СБС1₃), δ, м.д: 10,21 (ушир. с, 1Н), 8,71 (д, 1=8,0 Гц, 1Н), 7,77 (ушир. с, 1Н), 7,24 (м, 5Н), 5,00 (с, 2Н), 4,52 (ушир. с, 1Н), 4,22 (кажущийся триплет, 1=6,5 Гц, 1Н),

3,33 (ушир. с, 2Н), 2,67 (дд, 1=5,5, 15,5 Гц, 1Н),

2,44 (м, 2Н), 1,89 (м, 3Н), 1,15 (д, 1=6,5 Гц, 3Н).

¹³С ЯМР (125 МГц, СБС1₃), δ, м.д: 171,03 (С=О), 167,67 (С=О), 135,58 (С), 128,43 (СН), 128,13 (СН), 128,06 (СН), 66,34 (СН₂), 59,71 (СН), 46,55 (СН2), 43,34 (СН), 40,42 (СН2), 30,50 (СН2), 24,23 (СН2), 19,92 (СН3).

МС (ΕΙ): т/ζ 291 [М-С1]⁺, 199, 194, 160, 139, 92, 91;

Элементный анализ. Вычислено для С₁₆Н₂₃Ы₂О₃С1: С 58,80, Н 7,094, N 8,57. Найдено: С 58,95, Н 6,99, N 8,46.

Получение бензилового эфира Ν-[[4-[[(2метилфениламино)карбонил]амино]фенил] ацетил]-Ь-пролил-3 -метил-(В)-в-аланина (7).

К раствору НС1-соли 6 (61,77 г, 189 ммоля) в ДМФ (125 мл) добавляют МРИРА-О8и (2; 69,39 г, 181,9 ммоля) и затем Εΐ₃Ν (90 мл, рН ~10). Реакционную смесь оставляют перемешиваться в течение 3,5 ч, затем разбавляют ΕЮАс (1 л) и экстрагируют Н2О (3 х 250 мл). В этот момент продукт начинает выпадать в осадок. К органическому слою добавляют 10%-й раствор лимонной кислоты (250 мл) (осторожно, экзотермическая реакция) и при встряхивании образуется обильный осадок. Твердое вещество фильтруют через воронку со спекшимся стеклом (фильтр Шотта) (объем 2 л, М). Твердое вещество промывают лимонной кислотой (10%, 2 х 250 мл), Н₂О (250 мл), насыщенным бикарбонатом натрия (2 х 250 мл), Н2О (250 мл) и рассолом (3 х 250 мл) и оставляют сушиться на воронке при отсасывании (~80 мм рт.ст.) в течение ночи (~14 ч). Получают не совсем белое твердое вещество, которое перекристаллизовывают из смеси ТГФШьО (1 л/1,4 л), получая 83,3 г соединения 7 (чистота по данным ВЭЖХ 99,6%) в виде белого твердого вещества.

Фильтрат дополнительно промывают лимонной кислотой (10%, 3 х 250 мл), Н₂О (250 мл), насыщенным бикарбонатом (2 х 250 мл), Н2О (250 мл) и рассолом (3 х 250 мл). С каждой последующей промывкой водой выпадает до полнительное количество осадка, однако, промывку продолжают, проявляя осторожность, чтобы не потерять осадок. Фильтрование дает 4,02 г продукта в виде белого твердого вещества. Фильтрат наконец разбавляют Εΐ₂Θ (1 л), фильтруют и твердое вещество промывают ЕьО (3 х 100 мл), получая дополнительную порцию (1,67 г) белого твердого вещества. Общий выход для данной реакции составляет 88%.

Т.пл.: 153-153,5°С.

ИК (КВг): 3342, 3307, 3119, 2966, 1737, 1702, 1643, 1590, 1543, 1514, 1455, 1414, 1308, 1238, 1179 см^-1.

'Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-й₆), смесь ротамеров 3:2, (пики основной конформации), δ м.д,: 9,00 (ушир. с, 1Н), 7,91 (ушир. с, 1Н), 7,84 (д, 1=8,3 Гц, 1Н), 7,68 (д, 1=8,3 Гц, 1Н), 7,40-7,28 (м, 7Н), 7,13 (3Н), 7,06 (д, 1=8,8 Гц, 1Н), 6,92 (т, 1=7,3 Гц, 1Н), 5,06 (АВ-квартет, 1=12,2 Гц, Ии=8,9 Гц, 2Н), 4,18 (дд, 1=3,4 Гц, 8,8 Гц, 1Н),

4.10 (квинтет, 1=6,8 Гц, 1Н), 3,57 (м, 2Н), 3,503,22 (м, 3Н), 2,62-2,37 (м, 2Н), 2,23 (с, 3Н), 2,18-

1,68 (м, 3Н), 1,05 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); и δ, м.д (пики второстепенной конформации): 9,00 (ушир. с, 1Н), 7,91 (ушир. с, 1Н), 7,84 (д, 1=8,3 Гц, 1Н),

8,15 (д, 1=8,3 Гц, 1Н), 7,40-7,28 (м, 7Н), 7,13 (3Н), 7,06 (д, 1=8,8 Гц, 1Н), 6,92 (т, 1=7,3 Гц, 1Н), 5,01 (АВ-квартет, 1=12,2 Гц, Ии=19,0 Гц, 2Н), 4,32 (дд, 1=2,4 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 4,22 (квинтет, 1=6,8 Гц, 1Н), 3,57 (м, 2Н), 3,50-3,22 (м, 3Н), 2,62-2,37 (м, 2Н), 2,23 (с, 3Н), 2,18-1,68 (м, 3Н),

1.10 (д, 1=6,8 Гц, 3Н).

¹³С ЯМР (125 МГц, ДМСО-й₆), смесь ротамеров, δ, м. д. (пики основной конформации):

170,80 (С=О), 170,52 (С=О), 169,18 (С=О), 152,61 (С=О), 138,10 (С), 137,38 (С), 136,04 (С), 130,05 (СН), 129,63 (СН), 129,47 (СН), 128,58 (С), 128,28 (СН), 127,89 (СН), 127,85 (С), 126,02 (СН), 122,50 (СН), 117,90 (СН), 117,81 (СН),

65,44 (СН₂), 59,61 (СН), 47,04 (СН₂), 41,75 (СН), 40,41 (СН₂), 40,00 (СН₂), 29,29 (СН₂), 24,13 (СН₂), 19,88 (СН₃), 17,78 (СН₃); и δ, м.д (пики второстепенной конформации): 170,94 (С=О), 170,52 (С=О), 169,31 (С=О), 152,61 (С=О),

138.10 (С), 137,38 (С), 136,04 (С), 130,05 (СН), 129,63 (СН), 129,47 (СН), 128,65 (С), 128,28 (СН), 127,89 (СН), 127,85 (С), 126,02 (СН), 120,940 (СН), 117,90 (СН), 117,81 (СН), 65,44 (СН2), 59,91 (СН), 46,51 (СН2), 42,01 (СН), 40,13 (СН₂), 39,84 (СН₂), 31,75 (СН₂), 22,11 (СН₂), 20,05 (СН₃), 17,78 (СН₃);

МС (ΕΙ): т/ζ 579 [М+Иа]⁺, 557, 454, 426, 357, 336, 293, 267, 201;

Элементный анализ. Вычислено для С₃₂Н₃₆И₄О₅: С 69,05, Н 6,52, N 10,07. Найдено: С 68,87, Н 6,52, N 9,93.

Получение №[[4-[[(2-метилфениламино) карбонил] амино] фенил] ацетил]-Ь-пролил-3метил)-(Я)-в-аланина (8; оМеРИРЛ-У).

Раствор оМеРИРЛ-У-ОВп (7; 80,18 г) в смеси ТГФ/Н₂О (9:1, 800 мл) гидрируют при давлении 55 фунтов/дм² (3,87 кг/см³) в присутствии Рй/С (10%, 2,44 г). Через 25 ч реакционную смесь фильтруют через 8о1ка Е1ос® (144 г; ИЬег 8а1е§ & Эеуе1ортеп1 Согр.) на фильтре Шотта. Фильтрат повторно фильтруют через еще один слой 8о1ка Е1ос® (115 г), концентрируют до объема ~250 мл и постепенно выливают в толуол (3 л) при энергичном перемешивании. Суспензию оставляют перемешиваться в течение 0,5 ч, фильтруют (через фильтр Шотта объемом 2 л) и полученный порошок сушат, сначала на фильтре с отсасыванием (~80 мм рт.ст., 0,5 ч) и затем в вакуумной печи (14 ч, 45°С, давление доводят до 25 мм рт.ст. потоком Ν₂). Белые комки измельчают (ступка и пестик) в тонкий порошок, получая 58,3 г (выход 87%) оМеРИРЛ-У в виде белого твердого вещества. Продукт перекристаллизовывают из смеси ацетон/Н2О (320 мл/75 мл). Кристаллы собирают и сушат сначала на фильтре Шотта с отсасыванием (1 ч, 80 мм рт.ст.) и затем в вакуумной печи (25 ч, 45°С, давление доводят до 25 мм рт.ст. потоком Ν₂), получая 47,0 г (84% выделено при кристаллизации) оМеРИРЛ-У в виде белого твердого вещества (чистота по данным ВЭЖХ 99,1%).

Т. пл.: 153,6-154,4°С.

ИК (КВг): 3354, 3307, 1719, 1643, 1590, 1543, 1514, 1449, 1308, 1237 см^-1.

'Н ЯМР (600 МГц, ДМСО-йб), смесь ротамеров 3:2, δ, м.д. (пики основной конформации): 12,21 (ушир. с, 1Н), 8,99 (с, 1Н), 7,91 (с, 1Н),

7,87 (д, 1=8,2 Гц, 1Н), 7,68 (д, 1=7,9 Гц, 1Н), 7,40 (д, 1=8,6 Гц, 2Н), 7,17 (д, 1=5,9 Гц, 2Н), 7,15 (д, 1=7,6 Гц, 1Н), 7,12 (дд, 1=7,9, 8,2 Гц, 1Н), 6,94 (дд, 1=7,3, 7,3 Гц, 1Н), 4,22 (дд, 1=3,3, 8,8 Гц, 1Н), 4,06 (м, 1=6,6 Гц, 1Н), 3,47 (дд, 1Н), 3,44 (д, 1=15,0 Гц, 1Н), 3,37 (дд, 1Н), 3,29 (д, 1=15,4 Гц, 1Н), 2,46 (дд, 1Н), 2,27 (м, 1Н), 2,25 (с, 3Н), 1,99 (м, 1Н), 1,80 (м, 1Н), 1,78 (м, 1Н), 1,76 (м, 1Н), 1,07 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); и δ, м.д. (пики второстепенной конформации): 12,21 (ушир. с, 1Н), 8,99 (с, 1Н), 7,90 (с, 1Н), 7,87 (д, 1=8,2 Гц, 1Н), 8,12 (д, 1=8,2 Гц, 1Н), 7,40 (д, 1=8,6 Гц, 2Н), 7,16 (д, 1=5,9 Гц, 2Н), 7,15 (д, 1=7,6 Гц, 1Н), 7,12 (дд, 1=7,9, 8,2 Гц, 1Н), 6,94 (дд, 1=7,3, 7,3 Гц, 1Н),

4,34 (дд, 1=1,8, 8,4 Гц, 1Н), 4,18 (м, 1=6,6, 1Н),

3,60 (м, 2Н), 3,59 (м, 1Н), 3,48 (м, 1Н), 2,47 (дд, 1=6,6 Гц, 15,4 Гц, 1Н), 2,40 (дд, 1=6,6, 15,4 Гц, 1Н), 2,25 (с, 3Н), 2,15 (м, 1Н), 1,83 (м, 1Н), 1,91 (м, 1Н), 1,77 (м, 1Н), 1,12 (д, 1=6,6 Гц, 3Н).

¹³С ЯМР (150 МГц, ДМСО-й₆), смесь ротамеров, δ, м.д. (пики основной конформации):

172,4 (С=О), 170,9 (С=О), 169,3 (С=О), 152,6 (С=О), 138,2 (С), 137,5 (С), 130,2 (СН), 129,8 (СН), 129,6 (СН), 128,7 (С), 127,4 (С), 126,1 (СН), 122,6 (СН), 120,9 (СН), 118,0 (СН), 117,9 (СН), 59,7 (СН), 46,6 (СН₂), 41,7 (СН₂), 40,6 (СН2), 40,2 (СН2), 29,4 (СН2), 22,2 (СН2), 19,9 (СН₃), 17,9 (СН₃); и δ, м.д. (пики второстепенной конформации): 172,5 (С=О), 171,0 (С=О),

160,5 (С=О), 152,7 (С=О), 138,19 (С), 137,5 (С),

130.2 (СН), 129,8 (СН), 129,6 (СН), 128,8 (С),

127,4 (С), 126,1 (СН), 122,6 (СН), 120,9 (СН), 118,0 (СН), 117,9 (СН), 59,9 (СН), 47,1 (СН₂), 42,0 (СН₂), 39,8 (СН₂), 40,3 (СН₂), 31,8 (СН₂),

24.2 (СН₂), 20,2 (СН₃), 17,9 (СН₃);

МС (ΕΙ): т/ζ 468 [М+№]⁺, 336, 267, 137;

Элементный анализ для (С₂₅Н₃₀^О₅). Вычислено, %: С 64,36, Н 6,48, N 12,01. Найдено, %: С 64,07, Н 6,40, N 11,85.

Пример 2. Активность на модели аллергического легочного воспаления у овец.

Ислользовали аллергических овец весом между 27 и 50 кг. Было показано предварительно, что все овцы проявляли как раннюю, так и позднюю бронхиальные реакции на ингалированный распыленный аллерген Аксапк киит. Овцы находились в сознании и удерживались в модифицированной тележке для покупок в распростертом состоянии с неподвижными головами. После местной анестезии носовых проходов 2%-м лидокаином, через одну ноздрю в нижнюю часть пищевода продвигался катетербаллон. Животных интубировали с помощью эндотрахеальной трубки с надувной манжетой через другую ноздрю с использованием гибкого бронхоскопа с волоконной оптикой в качестве направляющего зонда. Все протоколы испытаний, используемые при этом исследовании, одобрены Μοιιηΐ 8ίη;·ιί Ме±са1 С’егИег Ашта1 ЕсксагсН С’оттШсс. который отвечает за обеспечение гуманного отношения и использование экспериментальных животных. Плевральное давление оценивалось с использованием катетера-баллона в пищеводе (заполненного 1 мл воздуха), который располагался на 5-10 см от желудочно-пищеводного соединения. В этом положении конечное плевральное давление при выдохе составляло в интервале от -2 до -5 см Н2О. После размещения баллона его закрепляли так, чтобы он оставался в этом же положении в течение всего опыта. Боковое давление в трахее измерялось с помощью катетера с боковым отверстием (внутренний диаметр 2,5 см), продвинутого через эндотрахеальную трубку и расположенного на расстоянии от верхнего ее конца.

Катетеры трахеального и плеврального давления соединялись с дифференциальным датчиком давления (МР45, ναΐίάνηο, ΝοΠίιπάβο, СА) для измерения транслегочного давления, которое определяется как разница между трахеальным и плевральным давлением. Прохождение воздуха измерялось путем соединения проксимального конца эндотрахеальной трубки с пневматографом (Б1е1ксй, Эуна 8с1епсек, 1пс., В1ие Ве11, РА). Сигналы транслегочного давления и проходимость дыхательных путей регистрировались на многоканальном физиологическом регистрирующем устройстве, которое связано с персональным компьютером 80-386 ΌΟ8 для оперативного расчета среднего сопротивления легких протоку (В_ъ) делением изменения транслегочного давления на изменение протока при среднем дыхательном объеме (полученном с помощью цифровой интеграции). Среднее значение, по меньшей мере, пяти дыханий, свободных от искусственного глотания, использовали для получения В_ъ, в см Н₂О/л/с. Сразу же после измерения определяли грудной газовый объем (ν_ί8) в плетизмографе постоянного объема тела для получения удельного сопротивления легких (8В_Ъ = х ν_ί8) в л х см Н₂О/л/с.

Все жидкие дозы аэрозолей получались с использованием одноразового медицинского распылителя с насадкой (ΡαίηάΓορ®·, Ригйаи Веиией, Ьеиеха, К8), который давал аэрозоль со среднемассовым аэродинамическим диаметром 3,2 мкм, определяемым с помощью каскадного импактора Андерсона. Распылитель соединялся дозирующей системой, состоящей из электромагнитного клапана и источника сжатого воздуха (20 фунтов/кв.дюйм или 1,41 кг/см). Выпуск распылителя направлялся в пластиковую Тобразную деталь, один конец которой был присоединен к дыхательному отверстию клапанного респиратора (Наггагй АррагаШк, 8.№шск, МА). Электромагнитный клапан активировался в течение одной секунды в начале дыхательного цикла респиратора. Аэрозоли подавались при дыхательном объеме 500 мл и скорости 20 вдохов в минуту. Для оценки бронхиальной восприимчивости строились кривые кумулятивной концентрационной реакции на карбахол путем измерения 8В_Ь сразу же после ингаляции буфера и после каждого последовательного введения с 10 вдохами повышающихся концентраций карбахола (0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 вес.%/об. в буферном физиологическом растворе). Провокационный тест прекращался, когда 8В_Ъ увеличивался на более чем 400% от уровня после введения физиологического раствора или после введения наиболее высокой концентрации карбахола. Бронхиальная восприимчивость оценивалась путем определения кумулятивной концентрации карбахола (в единицах дыхания), которая повышала 8И|. на 400% относительно величины после введения физиологического раствора (РС400) путем интерполяции по кривой дозареакция. Одна единица дыхания определялась как один вдох 1 вес.%/об. распыленного раствора карбахола.

Дозы οМеРυРА-V растворялись в смеси этанол:обычный физиологический раствор 1:2, или этанол:200 мМ фосфата натрия 1:5, или в Тпк-буфере. При использовании Тпк-буфера любые необходимые разбавления осуществлялись с использованием обычного физиологического раствора. Дозы приготавливались в 3-5 мл общего объема.

Во всех исследованиях базовое значение восприимчивости дыхательных путей (т.е. РС400) определяли за три-четыре дня до начала исследования. При исследовании предварительной обработки однократной дозой измеряли 8В_Ъ и животных обрабатывали соединением или растворителем. 8В_Ъ измеряли повторно через 2 ч после обработки (непосредственно перед провокацией) и затем животных провоцировали аллергеном. В исследовании с использованием многократных доз, начиная за 4 дня до провокации аллергеном, животных обрабатывали один раз в день в течение 4 дней и провоцировали аллергеном через 24 ч после введения последней дозы. 8К.|, измеряли до и после введения последней дозы соединения или после обработки растворителем. Во всех исследованиях 8В_Ъ измеряли сразу же после провокации аллергеном, ежечасно в течение 1-6 ч после провокации и каждые полчаса в течение 6,5-8 ч после провокации аллергеном. Постпровокационные определения восприимчивости дыхательных путей (РС_4Оо) проводили через 24 ч после провокации аллергеном.

Полученные значения выражены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Изменение 8Е|, вычисляли для каждой овцы в виде разницы от предпровокационного базового значения 8В_Ъ. Послепровокационные изменения в значении 8Е_Ъ характеризовались ранней реакцией дыхательных путей (ЕЛВ), которая развивавалась в течение приблизительно 0-4-часового периода. За ней следует поздняя реакция дыхательных путей (ЬАВ), которая развивалась в течение приблизительно 4-8часового периода после провокации аллергеном. Площади под кривыми ЕЛВ и ЬЛВ вычислялись для каждого животного с использованием правила трапеций. Значительные уменьшения площади под кривыми ЕЛВ и ЬАВ по сравнению с плацебо-контролем, принимались как терапевтическое воздействие на индуцирован ные аллергеном изменения 8В_Ъ. Восприимчивость дыхательных путей к карбахолу (РС₄₀₀), оцененную до и через 24 ч после провокации аллергеном, выражали в виде отношения РС₄₀₀ (пост/предпровокационные значения РС₄₀₀) для каждой овцы. Значительное повышение отношения РС400 по сравнению с плацебо-контролем считалось терапевтическим эффектом. Сравнения с плацебо-контролем проводились с использованием одностороннего дисперсионного анализа последующим тестом Даннетта для множественного сравнения с контролем. Сравнения, которые приводили к р <0,05, считались статистически значимыми.

Фиг. 1 показывает зависимость от аэрозолизованной ингибирующей дозы оМеРИРА-У ответной реакции, наблюдаемой у чувствительных к Аксапк киит овец, провоцированных через 2 ч после введения дозы. Левые графики демонстрируют изменение удельного легочного сопротивления 8В_Ь, см Н₂О/с. Правые графики показывают восприимчивость дыхательных путей к ингалированному карбахолу (отношение РС400 пред/постпровокационное значение), определенную через 24 ч после провокации. оМеРИРА-У при дозах 0,01 и 0,03 мг не ингибировали раннюю или позднюю реакцию дыхательных путей или не изменяли гипервосприимчивость к карбахолу через 24 ч после провокации аллергеном. Дозы 0,1, 1 и 3 мг ингибируют раннюю реакцию дыхательных путей и максимально ингибировали позднюю реакцию дыхательных путей. Эти дозы также ингибировали гипервосприимчивость к карбахолу через 24 ч после провокации аллергеном. Статистический анализ этих данных представлен в табл. 2.

Таблица 2

Обработка	Доза, мг	Растворитель	η	ЕЛЕ (Δ8ΕΒ х ч)	ЬАВ (Δ8ΕΒ х ч)	РС400 (пост/пред)
Введение дозы за 2 ч до провокации аллергеном
РР8			12	5,85±0,62	4,85±0,69	0,49±0,03
оМеРИРА-У	0,01	Ε1ΘΗ:Ν8	2	6,87±0,05	5,11±1,46	0,44±0,04
	0,03	Ε1ΘΗ:Ν8	2	10,62+3,91	3,98±0,23	0,43±0,00
	0,10	Ε1ΘΗ:Ν8	4	2,54±0,74*	0,67+0,17*	1,18±0,11*
	1,00	ЕЮН:РВ8	2	2,14±0,70	0,27±0,34*	1,05±0,11*
	3,00	ЕЮН:РВ8	2	2,47±0,62	0,68±0,07*	1,07±0,08*

N8 - обычный физиологический раствор * = р <0,05 в сравнении с РВ 8-контролем, односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом Даннетта для множественного сравнения с контрольной группой. Показывает статистически значимое уменьшение ЕАВ или ЬАВ в сравнении с контрольной группой с введением РВ8.

Овец, от природы чувствительных к Аксапк киит, провоцировали аэрозолем аллергена Аксапк киит через 2 ч после введения аэрозоля оМеРИРА-У в указанных дозах или через 24 ч после последней дозы повторяемого ежедневного введения в течение 4 дней подпороговой дозы оМеРИРА-У или эквивалентного количества РВ8. Механику легочного дыхания, описывае мую как изменение удельного сопротивления дыхательных путей от базового значения до проведения исследования, измеряют в течение 8 ч после аллергической провокации. Раннюю реакцию дыхательных путей (0-4 ч, ЕАВ) и позднюю реакцию дыхательных путей (4-8 ч, ЬАВ) выражают в виде средней площади под кривой зависимости Δ удельного легочного со противления от времени ± з.е.т. (стандартная ошибка среднего). Сопротивление дыхательных путей ингалируемому карбахолу определяли до начала исследований и через 24 ч после провокации аллергеном. Восприимчивость дыхательных путей приводится в виде отношения РС_4Оо (количество карбахола, требуемое для повышения сопротивления на 400%) при сравнении предпровокационной и постпровокационной величин.

Раздражающее действие разовой дозы.

Ни одна из доз оМеРИРА-У, использовавшихся в описанном выше исследовании, не оказывала раздражающего действия, о чем свидетельствует отсутствие изменения сопротивления дыхательных путей по сравнению с базовым сопротивлением после провокации аллергеном Л5еап5 8иит. Это показано на фиг. 2.

Изучение повторяемых доз.

На фиг. 3 видно, что доза оМеРИРЛ-У 0,03 мг, которая, как было показано, не эффективна, когда используется в качестве разовой дозы при экстренном предварительном введении, тем не менее, обладает защитным действием, если ее вводить один раз в день в течение 4 дней, когда провокацию антигеном проводят через 24 ч после введения последней дозы. Верхний и нижний левые графики показывают, что этот эффект наблюдался при использовании двух различных препаратов. Гипервосприимчивость к карбахолу после дополнительных 24 ч также ингибировалась максимально, как показано на верхнем и нижнем правых графиках фиг. 3. Защитное действие оМеРИРА-У было значительным против ЕАВ и ЬАВ и относительно гипервосприимчивости к карбахолу. Количественный анализ представлен в табл. 3.

Результаты данного исследования показывают, что разовое предварительное введение небольшой молекулы ингибитора УЪА-4, оМеРИРА-У, с помощью аэрозоля, может защищать индуцируемых аллергеном ранних и поздних реакций дыхательных путей и от индуцируемой после провокации аллергеном гипервосприимчивости дыхательных путей (АНВ) на модели аллергических овец. Никакого раздражающего действия на дыхательные пути не наблюдалось при введении любой из доз оМеРИРА-У, даваемых в виде разового предварительного введения. Результаты показали также, что эффективная доза оМеРИРА-У может быть уменьшена за счет многократных обработок. Суммарно эти данные дают веское свидетельство того, что адгезия УИА-4 играет ключевую роль в патофизиологических показателях (ЬАВ и АНВ) длительных воспалительных событий, которые инициируются в дыхательных путях аллергических овец после провокации аллергеном.

Таблица 3

Обработка	Доза, мг	Растворитель	η	ЕАВ (А8ЬВ х ч)	ЬАВ (А8ЬВ х ч)	РС400 (пост/пред)
Введение дозы один раз в день в течение 4 дней, провокация через 24 ч после введения последней дозы
РВ8			8	4,33+0,81	4,96±0,40	0,38±0,03
оМеРИРА-У	0,03	Ε1ΟΗ:Ν8	4	1,53±0,34*	0,59±0,16*	1,06±0,04*
	0,03	Τήδ:Ν8	4	1,40±0,35*	0,02±0,06*	1,04±0,04*

* = р <0,05 в сравнении с РВ 8-контролем, односторонний дисперсионный анализ, с последующим тестом Даннетта для множественного сравнения с контрольной группой. Показывает статистически значимое уменьшение ЕАВ или ЬАВ или значительное увеличение отношения РС₄₀₀ в сравнении с контрольной группой с использованием РВ8.

Овец, от природы чувствительных к Азеапз 8иит, провоцировали аэрозолем аллергена Л8саг18 8иит через 24 ч после введения последней дозы при повторяемом ежедневном введении в течение 4 дней подпороговой дозы оМеРИРЛ-У или эквивалентного количества РВ8. Механику легочного дыхания, описываемую как изменение удельного сопротивления дыхательных путей от базового значения до проведения исследования, измеряли в течение 8 ч после провокации аллергеном. Раннюю реакцию дыхательных путей (0-4 ч, ЕАВ) и позднюю реакцию дыхательных путей (4-8 ч, ЬАВ) выражают в виде средней площади под кривой зависимости удельного легочного сопротивления от времени ± з.е.т. Сопротивление дыхательных путей к ингалированному карбахолу определялось до инициирования исследования и через 24 ч после провокации аллергеном. Восприимчивость дыхательных путей приводится в виде отношения РС₄₀₀ (количество карбахола, требуемое для повышения сопротивления на 400%) при сравнении значений до провокации и после провокации.

Пример 3. Активность на моделях аллергической реакции замедленного типа.

Исследования эритроцитов овец.

Во всех опытах использовали свободных от специфических патогенов самок мышей Ва1Ь/с в возрасте 8-10 недель, полученных от 1аск8ои ЬаЬз. Животным дают пищу и воду без ограничений. Эритроциты овец (зВВС) в растворе Элсевера (Акеуег'з 8о1и!юи) от одних и тех же овец получали еженедельно от Сйаг1ез В1уег Рйагт. 8егуюе5 (8ои1йЬпбде, МА). зВВС пеллетизировали центрифугированием при 1000 д в течение 10 мин при 4°С и любую видимую лейкоцитную пленку удаляли. Клетки затем промывали в физиологическом растворе. Пеллеты клеток повторно суспендировали в физиологическом растворе и подсчитывались с использованием гемоцитометра. Клетки разбавлялись фосфатно-солевым буфером (РВ8) до концентрации 2х10⁸ кКВС на мл. На 0 день мышей сенсибилизировали подкожной инъекцией 2х10⁷ кКВС в 100 мкл РВ8. На 5-й день приготавливали кКВС как описано выше, но разбавляли в РВ8 до конечной концентрации 4х10⁹ кКВС/мл. Из этого препарата 25 мкл инъецировали подкожно в подушечку правой задней лапы.

Для введения в кишечник соединения, оМеРИРА-У (партия #2770-029) преобразовывался в готовую форму препарата в растворителе - 60% РЕС400 в 0,02М ТШ8 - до исходной концентрации 5 мг/мл. Соответствующие разведения готовили в растворителе РЕС/ТК18 и вводили энтерально в объеме 100 мкл. Анти-УИА-4 антитело (Р8/2) разбавляли физиологическим раствором в концентрации 4,3 мг/кг и вводили внутрибрюшинно в 100 мкл. Все обработки проводились сразу же после провокации овец кКВС.

Опухание непровоцированной контрольной (левой) и провоцированной (правой) подушечек задних лап измеряли с использованием натяжного толщиномера (Мби1оуо, модель #304-196, Иуег, Иапсак!ег, РА) через 20 ч после провокации подушечки лапы. Полученные данные представляют в виде изменения толщины подушечки, определяемого путем вычитания толщины левой задней лапы из толщины правой задней лапы. Изменения толщины подушечек сравнивали с использованием двухстороннего критерия Стьюдента.

Антитело анти-УИА-4 Р8/2 в дозе 4,3 мг/кг (внутрибрюшинно) ингибировало опухание приблизительно на 30%, тогда как оМеРИРА-У, введенный энтерально в дозе 20 мг/кг, на данной модели не проявлял никакого действия (данные не представлены). Изучалась эффективность оМеРИРА-У, вводимого в дозе 20 мг/кг через кишечник, на ИТН модели, индуцированной &КВС, на мышах, и при этом не наблюдалось никакой эффективности.

Пример 4. Активность на моделях гиперчувствительности замедленного типа (ΌΊΉ).

Модель контактной гиперчувствительности.

Во всех исследованиях использовали свободных от вирусов самок мышей Ва1Ь/с (1асккоп ИаЬога!опек, Ваг НагЬог, МЕ), содержавшихся по четыре на клетку в клетках микроизолятора в устройстве для животных, свободных от биогенных вирусов, и получавших без ограничений корм для мышей и питьевую воду. Мышей анестезировали смесью кетамин:ксилазин (90:10 мг/кг, внутрибрюшинно). Участок брюшной кожи площадью 3 см², мечеобразный по направлению к лобку, открывался тщательным выбриванием шерсти, и кожу протирали 70% этанолом. На обнаженную брюшную кожу равномерно наносился 25 мкл 0,5 об./% ИИЕВ в растворителе, состоящем из ацетона и оливкового масла, 4:1 об./об. Кожу слегка царапали кончиком пипетки, чтобы спровоцировать небольшое воспаление. Мышей укладывали навзничь в их клетках и давали им отойти от анестезии. Через 24 ч после начальной сенсибилизации мышей снова сенсибилизировали 25 мкл 0,5%-го ΌΝΕβ в растворителе на том же участке брюшной кожи, после чего снова слегка царапали кончиком пипетки. Вторую сенсибилизацию проводили на мышах без анестезии. На 5-й день (приблизительно через 120 ч после начальной сенсибилизации) субраздражающую дозу сенсибилизирующего вещества (0,2% ИИЕВ в растворителе ацетон:оливковое масло, 4:1 об./об.) использовали для провокации иммунной реакции. Мышей анестезировали смесью кетамин: ксилазин (90:10 мг/кг, внутрибрюшинно) и по 10 мкл 0,2%-го раствора ИИЕВ наносили на тыльную поверхность левого уха. На правом ухе проводили аналогичное нанесение растворителя ацетон:оливковое масло, 4:1 об./об. На протяжении последующих 24 ч развивалась двухфазная реакция опухания уха, как показано на фиг. 4. Через 24 ч после провокации мышей снова анестезировали смесью кетамин:ксилазин и измеряли толщину обоих ушей с использованием инженерного микрометра с точностью до 10^-4 дм (2,54 х 10^-4 см).

Соединения (100 мкл) или соответствующий растворитель (Диметилсульфоксид, ДМСО) в изотоническом фосфатно-солевом буферном растворе (РВ8) (100 мкл), вводили перорально с помощью желудочного зонда через 4 ч после провокации иммунной реакции на 5-й день. Для каждой проводимой обработки использовали группы из 8 мышей. оМеРИРА-У (партия № 2044-076) растворяли в дистиллированной воде с добавлением 0,5% натрийфосфатного буфера, рН=8,8, и 3% ДМСО. Реакцию распухания уха у каждой из мышей вычисляли как разницу между толщиной уха после обработки растворителем и толщиной уха после провокации ИИЕВ через 24 ч после провокации. Обычно индуцированное ИМЕВ распухание уха составляло 65-75 х 10^-4 дм (165-191 х 10^-4 см). Ингибирование реакции распухания уха определяли путем сравнения обработанной группы животных с контрольной группой, обработанной растворителем. Статистическую значимость разницы среди обработанных групп оценивали с использованием одностороннего дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта для множественных сравнений с контрольной группой (8уЧа1, 8Р88 Шс.) с использованием р <0,05.

Полученные величины выражались в виде средних значений ± стандарная ошибка.

На фиг. 4 представлено сравнение реакций распухания уха, которые были измерены через 24 ч после провокации ΌΝΡΒ на мышах, которые получали растворитель (ДМСО, ΡΒ8), соединение положительного контроля (даваемое в дозе 0,03 мкг/кг) или 0,03 или 0,3 мг/кг оМеРИРА-У, вводимое энтерально (через тонкую кишку) через 4 ч после провокации ΌΝΡΒ (верхний график). Процент ингибирования, вызванного обработкой, представлен на нижнем графике. Обе дозы оМеРИРА-У значительно ингибировали реакцию распухания уха до степени, близкой к степени, проявляемой положительным контрольным соединением.

Разовые тонкокишечные дозы в 0,03 или 0,3 мг/кг оМеРИРА-У, даваемые через 4 ч после провокации ΌΝΡΒ, могут значительно ингибировать реакцию распухания уха на модели контактной аллергической реакции на мышах.

Пример 5. Биохимия.

5.1. Рецепторное сродство оМеРИРА-У, измеренное с использованием конъюгата УСАМ-1д со щелочной фосфатазой при проведении оценки прямого связывания (ОБА) с УСАМ-1д.

УСАМ-1д получали и очищали в соответствии с опубликованными данными (1акиЬо\\ък| А. е! а1. Се11 Абйекюп апб Соштишсабоп 3, 131142, 1995). Конъюгацию с кишечной щелочной фосфатазой (АР) плода крупного рогатого скота с целью расщепления хромогенного субстрата проводили в соответствии с публикацией ЬоЬЬ К. К е! а1. Се11 Абйекюп апб Соттшисабоп 3, 385-397, 1995. Связывание с УЪА-4 оценивали на линии Т-клеток человека, 1игка1 (α4β1). На поверхности этих клеток в присутствии 1 мМ Мп⁺² УСАМ-1д-АР и оМеРИРА-У конкурировали за связывание с α4β 1.

При оценке реакции прямого связывания с УСАМ-1д оМеРИРА-У конкурирует с УСАМ1д-АР за связывание с клетками 1игка1 в присутствии 1 мМ МпС12 в зависимости от концентрации с 1С₅₀ 8±1 нМ (п=9). Полученные результаты представлены в табл. 4.

5.2. Рецепторное сродство оМеРИРА-У, измеренное с использованием конъюгата УСАМ-1д со щелочной фосфатазой методом анализа очищенный УИА-4 белок/белок.

УИА-4 очищался от экстракта детергента высокоэкспрессирующего подклона а4трансфекцированных К562 клеток с помощью аффинной хроматографии с антителами и иммобилизовался в лунках микротитровального планшета для проведения анализа конкурентного связывания белок/белок. УСАМ-1д-АР связывали с планшетом, покрытым очищенными УИА-4, в отсутствие или в присутствии оМеРИРА-У (партия #2) и 1 мМ МпС1₂. Планшеты считывались при длине волны 405 нм, и данные анализировались с использованием программы 8ойМах ν. 2.32.

Связывание конъюгата УСАМ-1д с очищенным УИА-4 блокировалось полностью специфическим нейтрализующим моноклональным антителом анти-а4 (НР1/2). Два значения 1С₅₀, полученные для оМеРИРА-У при приведении анализа УИА-4 белок/белок, представлены в табл. 4, как и значения 1С₅₀, полученные на клетках 1игка1 при оценке конкурентного связывания с УСАМ-1д-АР и при оценке адгезии С81 клеток.

5.3. Рецепторное сродство оМеРИРА-У, оцененное в анализе адгезии клеток С81.

в. Адгезия клеток 1игка1 к конъюгату С81Ж8А.

Пептид МТ₂-цистеин-тирозин-С8-1 синтезируют и конденсируют с Β8А-8МСС (8МСС представляет собой гетеробифункциональный кросс-линкер, который реагирует со свободными аминогруппами на бычьем сывороточном альбумине (Р8А) и одним цистеином синтетического пептида) при соотношении С81Ж8А 10:1. Лунки планшета покрывают на протяжении ночи 100 мкл конъюгата, разбавленного до конечной концентрации 1 мкг/мл. На следующий день лунки блокируют Β8А в ΡΒ8 в течение 1 ч и затем промывают три раза.

Линию Т-клеток человека, 1игка1, метят с помощью 2 мкМ флуоресцентного красителя ΒСΕСΡ-АМ (2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5- и -6)карбоксифлуоресцеинацетоксиметиловый эфир) (Мо1еси1аг РгоЬек 1пс., Еидепе, Огедоп; каталог #В-1150), который интернализуется и деэтерифицируется, улавливая, таким образом, краситель внутрь живых клеток. Клетки 1игка1 (1х10⁵ клеток/лунка) в буфере, содержащем 1 мМ Мп²⁺, добавляют к покрытым планшетам в присутствии последовательных трехкратных разбавлений ингибитора. Каждую концентрацию оценивают дважды. После 30 мин нахождения при комнатной температуре планшеты переворачивают и промывают три раза или до тех пор, пока не будет клеток, прикрепленных к контрольным лункам, покрытым только Β8А. С81прикрепленные клетки определяют количественно в флуоресцентном планшет-ридере Су!оДиог с использованием длины волны возбуждения 485 нм и эмиссионной длины волны 530 нм.

Клетки, прикрепившиеся к С81Ж8А в отсутствие соединения, служат в качестве контроля с ингибированием 0%, тогда как клетки, прикрепившиеся к одному Β8А, служат в качестве контроля со 100%-м ингибированием. Значения 1С₅₀ вычисляют с использованием программы ИеНадгарй, версия 5.

Адгезия меченых клеток 1игка1 в присутствии Мп⁺² полностью блокируется ЕИТА и нейтрализующим анти-а.4|И. тАв (моноклональное антитело) НР1/2, указывая на то, что связывание является специфическим. В табл. 4 пред ставлена активность оМеРИРА-У в анализе адгезии к С81/ВСА, а также результаты оценки реакции связывания.

оМеРИРА-У является сильным антагонистом УЪА-4 в буферах, содержащих Мп²⁺. Он в 80 раз более активен при оценке в присутствии Мп²⁺ на изолированном УЪА-4, чем на клетках 1игка! при оценке реакции связывания. оМеРИРА-У является функциональным антагонистом, что обнаруживается по его способности в зависимости от дозы и полностью блокировать адгезию клеток 1игка! к С81. Абсолютные значения при оценке адгезии являются большими, чем значения, которые наблюдаются при оценке реакции связывания. Это может быть следствием многовалентной природы адгезии. Во всех форматах исследований ингибирование связывания с помощью ЕЭТЛ и НР1/2 иллюстрирует специфическое связывание с УЪА-4.

Таблица 4 Рецепторное сродство оМеРИРА-У в присутствии 1 мМ МпС12, измеренное в анализе реакции конкурентного связывания с УСАМ-1д, адгезии клеток С81 и в анализе очищенный УЪА-4 белок/белок

	1С50 ± ср.квад.ошибка, нМ
Анализ	оМсРИРА-У
Клетки 1игка! Связывание с УСАМ-Ед	8±1 (п=9)
Клетки 1игка! Адгезия к С81	22±2 (п=4)
Очищенный УЪА-Д	0,1 (п=2)
Связывание с УСАМ-!	(0,1, 0,1)

5.4. Специфичность ингибирующего действия оМеРИРА-У.

а). Специфичность оМеРИРА-У, оцениваемая с использованием 1У-клеток в анализе реакции прямого связывания с УСАМ-1д и адгезии к С81.

Связывание с α4β7 оценивают на ΊΥклетках в присутствии Мп²⁺. В анализе связывания УСАМ-1д и оМеРИРА-У конкурируют за связывание с α4β7 на ΡΥ-клетках (см. раздел

4.1.1. для протокола анализа). При исследовании клеточной адгезии оМеРИРА-У испытывают на его способность блокировать связывание ΡΥ-клеток (α4β7) с конъюгатом С81/В8А.

оМеРИРА-У не блокирует а4в7-связывание с УСАМ-1д или С81/В8А. Май анти-в7, Р1Й27 (Рйаттюдеп), ингибирует эти взаимодействия, однозначно показывая, что связывание является а4в7-специфичным. Следовательно, оМеРИРА-У является специфичным ингибитором для УЪА-4. Полученные результаты представлены в табл. 5.

б) . Специфичность оМеРИРА-У, изученная с использованием адгезии клеток К562 к лункам, покрытым Рп-120.

Необработанные 96-луночные полистирольные планшеты с плоским дном покрывают 5 мкг/мл Рп-120 в течение ночи при 4°С. Планшеты промывают дважды фосфатно-солевым буферным раствором (РВ8) и блокируют 1% бычьим сывороточным альбумином (В 8А) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают дважды ТВ8-буфером, содержащим 1 мМ МпС1₂ (буфер для исследования). Клетки К562 метят с помощью 2 мкМ флуоресцентного красителя, ВСЕСР-АМ, (см. раздел 4.1.3) и связывают с планшетом в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты переворачивают и промывают три раза и прикрепленные клетки количественно определяют в флуоресцентном планшет-ридере СуЮПног с использованием возбуждающей длины волны 485 нм и эмиссионной длины волны 530 нм.

Адгезия клеток К562 к Рп-120 полностью блокируется нейтрализующим антителом антиа5, 11А1 (Рйатттдеп), указывая на специфическое связывание через УЪА-5. Ингибирование связывания клеток К562 с фрагментами Рп120К с помощью оМеРИРА-У в дозах 100 мкМ отсутствовало. См. ниже табл. 5.

в) . Оценка реакции агрегации, проведенная с целью определения специфичности оМеРИРАУ.

Методы

Активность против дрПЫПа оценивают с помощью стандартной агрегометрии тромбоцитов с использованием обогащенной тромбоцитами плазмы. АИР используют для инициирования агрегации в присутствии плазмы, где Са⁺² и Мд⁺² являются основными двухвалентными катионами. В качестве положительного контроля используют ОКОИ8Р при 100 мкг/мл.

Результаты оМеРИРА-У испытывают в трех дозах 1, 10 и 100 мкМ. Он не ингибирует агрегацию тромбоцитов, индуцированную АИР, ни в одной из доз. Полученные результаты приведены в табл. 5. оМеРИРА-У является высоко (>10000 раз) специфичным для УЪА-4. Он не имеет заметной активности (>100 мкМ) в отношении родственных интегринов, α4β7 и УЪА-5 или в отношении в3-интегрина, дрИЬШа.

Таблица 5

Ингибирующая активность оМеРИРА-У, измеренная в анализе конкурентного связывания с α4β7 и УСАМ-1д, в анализе адгезии α4β7 и УИА-5 и при изучении агрегации тромбоцитов

Линия клеток	Лиганд	Двухвалентный катион	оМеРИРА-У 1С50±8И, нМ
ΊΥ (α4β7)	УСАМ-1д анализ прямого связывания	Ми+2	Ингибирование 3% при 100 мкМ (и = 3)
ΊΥ (α4β7)	С81/В8А Адгезия	Ми+2	Нет ингибирования при 100 мкМ (и = 4)
К562 (УИА-5)	Еи-120 Адгезия	Ми+2	Нет ингибирования при 100 мкМ (и = 3)
Тромбоциты (11Ь111а)	Фибриноген Агрегация	Са/Мд	Нет ингибирования при 100 мкМ (и = 1)

Пример 6. Оценка оМеРИРА-У для индукции И1В8 6.1. Измерения на клетках Лика! с использованием антитела И1В8 9Е67.

а). Индукцию И1В8 антагонистами α4β1 оценивают ίη уйго с использованием анализа ЕАС8. Клетки Лика! (2 х 10⁵/лунка) предварительно инкубируют при 37°С в течение 20 мин с физиологическим раствором с буфером ТК18, содержащим 2 мМ МдС1₂ (Мд⁺²-ТВ8), отдельно или с последовательными разбавлениями испытуемых соединений. Образцы переносят на ледяную баню и дополняют антителом И1В8, 9ЕС7, с конечной концентрацией 10 мкг/мл. Клетки промывают дважды с помощью Мд⁺²ТВ8 и снова суспендируют при разбавлении 1:200 1д6 козла против крыс, конъюгированного с Е1ТС (изотиоцианат флуоресцеина) в Мд⁺²-ТВ8, и выдерживают в течение 30 мин при 4°С. Клетки промывают дважды и снова суспендируют в Мд⁺²-ТВ8. Среднюю интенсивность флуоресценции (МЕ1) определяют с помощью анализа ЕАС8 (Вес!ои Июкшкои ЕАС8саи). Результаты выражены в виде МЕ1. Данные анализируют с использованием программ Мкгокой Ехе1 ν5.0 и ИеИадгарй ν4.0.

На фиг. 5 показано, что оМеРИРА-У индуцирует открытие ЫВ8 эпитопа в сравнении с 2 мМ Мд⁺²-буфера (График В). Индукция является концентрационно-зависимой и аналогична по величине индукции, наблюдаемой в случае 1 мМ Ми⁺² (График А). Пропуск ЫВ8 антитела и детекции антитела, или пропуск только детекции антитела устраняет лечение (График В). ЕИ₅₀ реакции составляет -20 нМ.

Заключение

Представленные данные показывают, что оМеРИРА-У индуцирует то же самое конформационное изменение в УИА-4, которое наблюдается в случае природных лигандов. Величины для И1В8 обычно попадают в интервал, определенный методами анализа связывания и адгезии, которые для оМеРИРА-У равны соответственно 8 и 22 нМ.

6.2. Многовидовой рецепторный скрининг.

а). Рецепторное сродство оМеРИРА-У, измеренное при оценке прямого связывания УСАМ-1д с использованием конъюгата УСАМ12 со щелочной фосфатазой и лимфоцитов периферической крови или клеток селезенки, полученных от различных видов.

Лимфоциты периферической крови (РВИ) выделяют из периферической крови человека, овец и собак, используя методы, описанные для РВИ овец (АЬгайат XV.М. е! а1. Л Сйи. Мей. 93:776-787, 1994). Анализ конкурентного связывания УСАМ-1д-АР используют для сравнения связывания оМеРИРА-У с этими различными типами клеток.

Значения 1С₅₀, измеренные для оМеРИРАУ на лимфоцитах периферической крови или на клетках селезенки, полученных от различных видов, в присутствии Ми⁺², представлены в табл. 6. В присутствии Ми⁺² оМеРИРА-У ингибирует с аналогичными значениями 1С₅₀ связывание УСАМ-1д с лимфоцитами человека, крыс, собак, овец и мышей. Отсутствуют свидетельства видовой специфичности. Это согласуется с высокой степенью сохранения последовательности, наблюдаемой среди видов для УИА-4 и его природных лигандов, С81 и УСАМ.

Таблица 6

Рецепторное сродство оМеРИРА-У, измеренное в анализе конкурентного связывания УСАМ-1д с использованием конъюгата УСАМ-1д со щелочной фосфатазой и лимфоцитов периферической крови или клеток селезенки, от различных видов

Вид	Источник	Двухвалентный катион	1С50 (нМ)
Человек	РВИ	Ми+2	6±1(и=3)
Овца	РВИ	Ми+2	3±1(и=3)
Собака	РВИ	Ми+2	13+2(и=3)
Мышь	Спленоциты	Ми+2	4±2(и=4)
Крыса	Спленоциты	Ми+2	5±1(и=3)

Пример 7. Рецепторная кинетика оМеРиРА-У.

7.1. Конкурентный анализ с использованием в качестве зонда ³Н-известного ингибитора.

Клетки 1итка! выдерживают в среде РРМ11640 плюс 10% сыворотки плода крупного рогатого скота при 37°С в термостате для тканевых культур. Для изучения реакции связывания клетки пеллетизируют центрифугированием, промывают два раза ТВ 8 (50 мМ Тпк-НС1, 150 мМ №С1, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 2 мМ глюкозы, 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4), суспендируют при концентрации приблизительно 2 х 10⁶ клеток/мл в ТВ 8 и подсчитывают с использованием гемоцитометра №иЬаиет. Клетки дополнительно разбавляют до концентрации 1,5 х 10⁶/мл в указанных буферах и подвергают специфичной обработке, определенной для каждого опыта. Клетки затем пеллетизируют центрифугированием, снова суспендируют в 100 мкл буфера для анализа и переносят в сцинтилляционный сосуд, содержащий 2,9 мл 8стйУегке II (Икйет 8с1епИйс). Радиоактивность, связанную с клетками, количественно определяют с помощью сцинтилляционного подсчета. Импульсы, связанные в этих условиях, определяют интегрин, который не занят испытуемым соединением и, следовательно, свободен для соединения с ³Н-известным ингибитором. Все исследования проведены в покрытых кремнием пробирках (еррепбогГ 1иЬе) емкостью 1,5 мл со стандартным объемом образца 1 мл. Неспецифическое связывание ³Н-известного ингибитора с клеткам (фон) измеряют путем определения ингибитора, связанного в отсутствии иона металла. Связанные специфические импульсы вычисляют путем вычитания неспецифических импульсов из общего количества связанных импульсов.

Проведен ряд конкурентных исследований для подтверждения того, что оМеРиРА-У и известный ингибитор конкурируют за один и тот же сайт на УЪА-4. Во-первых, ³Н-известный ингибитор смешивают с эквимолярным количеством оМеРиРА-У, 10-кратным избытком и со 100-кратным избытком, инкубируют с клетками 1итка! и оценивают способность не содержащего радиоактивности ингибитора (холодного ингибитора) конкурировать за связывание с известным ингибитором. Обработка с помощью оМеРиРА-У дает зависимое от дозы ингибирование связывания ³Н-известного ингибитора. Концентрация оМеРиРА-У, которая необходима для конкурирования со связыванием ³Низвестного ингибитора, в 10 раз больше, чем необходимо, когда не содержащий радиоактивности ингибитор используется в качестве конкурента, что согласуется с его более низким сродством к Мп⁺²-активируемому УЪА-4. Вовторых, Мп⁺²-активируемые клетки 1итка! обрабатывают ³Н-известным ингибитором для того, чтобы сначала занять УЪА-4 радиоактивным зондом и затем добавляют избыток холодного (т.е. не содержащего радиоактивности) оМеРиРА-У. Последующие обработки избытком не содержащего радиоактивности оМеРиРА-У или известным ингибитором не различаются по их способности вытеснять радиоактивный зонд. В-третьих, Мп⁺²-активируемые клетки 1итка! обрабатывают насыщающими количествами оМеРиРА-У и измеряют скорость, при которой оМеРиРА-У диссоциирует. В отличие от длительного периода полураспада известного ингибитора для Мп⁺²-активируемого УЪА-4, оМеРиРА-У легко высвобождается из оМеРиРА-У-УЪА-4 с периодом полураспада (1_1/2) менее чем 10 мин. Большое различие в 1_1/2 для оМеРиРА-У и известного ингибитора означает, что более низкое сродство оМеРиРА-У к УЪА-4 является результатом его более высокой скорости выведения.

Данные по диссоциации показывают, что связывание оМеРиРА-У с УЪА-4 зависит в высокой степени от состояния активации УЪА-4, и что он проявляет ту же самую селективность для активации, наблюдаемую в случае известного ингибитора. Как и в случае Мп⁺²активированных УЪА-4, время 11/2 диссоциации оМеРиРА-У из Мд⁺²-активированных УЪА-4 составляет менее 10 мин, наименьшую временную точку, которая может быть определена при конкурентном формате. С другой стороны, в присутствии Мд⁺² плюс активирующее антитело, Т82/16, 11/2 продлевается (до 20 мин). Все возможные состояния активации не оценивались подробно, однако, разработан простой скриниг, который может легко прояснять различия. В этом исследовании фиксированные концентрации оМеРиРА-У (10 нМ) смешивают с 5 нМ ³Н-известного ингибитора и проводят связывание в этих условиях при разных состояниях активации. Если оМеРиРА-У имеет аномально высокое или низкое сродство с УЪА-4, это можно определить по разнице в количестве ³Н-известного ингибитора. Различия в процентной величине связанного при различных условиях активации ³Н-известного ингибитора приближаются к тому, что можно было бы предсказать на основании известных свойств ингибитора.

Исследования реакции связывания подтверждают, что оМеРиРА-У конкурирует с известным ингибитором за связывание с УЪА-4 в концентрациях, согласующихся с его сродством, и показывают, что два соединения конкурируют за один и тот же сайт на интегрине. Сходство оМеРиРА-У и известного ингибитора при связывании при различных состояниях активации УЪА-4, означает, что механизм связывания является аналогичным.

7.2. Изучение оМеРиРА-У в Рап1аЬк и в скринингах Сегер.

Проведены испытания оМеРИРА-У в Рап1аЬ§ РгоШтдЗсгееп, П1§соуегу8сгееп и по иммунноскрининговому графику радиолиганд ных, ферментных и функциональных анализов, а также по графику мембранных рецепторов Сегер. Не наблюдается никакой значительной активности оМеРИРЛ-У при 10 мкМ в любом анализе, включая анализ ΝΚ1 рецептора, в отношении которого известные ингибиторы проявляют некоторую активность.

По данным Серег сообщается также, что оМеРИРЛ-У не оказывает никакого ингибирующего действия на АСЕ-протеазу человека. Источником АСЕ-протеаз являются эндотелиальные клетки человека (НИУЕС). ³Н-НОО, добавленный к НИУЕС, превращается в ³Нгиппуровую кислоту и глицилглицин с помощью АСЕ. Каптоприл, сильный АСЕ-ингибитор, блокирует это превращение с 1С₅₀ 990 пМ, тогда как оМеРИРА-У в концентрации 10 мкМ не блокирует.

Физические свойства.

оМеРИРА-У представляет собой от белого до не совсем белого цвета кристаллический порошок. Он растворим в ДМСО, и имеет растворимость в воде 0,120 мг/мл. Поведение оМеРИРА-У при нагревании, изученное с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (И8С), термогравиметрического анализа (ТОА) и микроскопии в горячем состоянии, показывает, что материал плавится приблизительно при 160°С. Данные анализа И8С и ТОА приблизительно при 136°С означают, что оМеРИРА-У теряет летучие примеси, что, вероятно, согласуется с дегидратацией моногидрата.

Готовая форма препарата.

Препарат для распыления

Указания по производству 100 мл препарата для распыления, содержащего 5 мг/мл оМеРИРА-У, представлены ниже.

Приготовить 200 мл исходного буферного раствора следующим образом.

1. Взвесить 0,286 г Трометамина (фармакопея США) в подходящем контейнере.

2. Взвесить 1,676 г хлористого натрия (фармакопея США) в том же контейнере.

3. Добавить 200 мл воды для инъекций (фармакопея США).

Смешать до получения гомогенной смеси.

1. Взвесить 0,500 г оМеРИРА-У в подходящем контейнере.

2. Добавить 100 мл буфера, приготовленного на стадии 1.

3. Смешать до получения гомогенной смеси.

4. Профильтровать стерильно в подходящий контейнер.

5. Герметично закрыть подходящей крышкой.

Типичные свойства препарата:

рН: 7.4,

Осмотическое давление: 290 мОсм.

Пример 9. Определение стабильности, методика ВЭЖХ.

Колонка: 2огЬах® 8В-С18, частицы 3 мкм, 4,6 х 150 мм

Предохранительная колонка: 2огЬах® 8ВС18, частицы 5 мкм, 4,6 х 12,5 мм

Скорость потока: 1 мл/мин

Температура колонки: 40°С

Температура автоматического пробоотборника: 4°С

Подвижная фаза

А: 0,1% (вес./об.) трифторуксусной кислоты (ТЕА) в воде

В: 0,1% (вес./об.) ТЕА в 90% (об./об.) аце-

тонитрила, 10% (об./об.) воды.
Градиент:	Время, мин	% В
	0-3	15
3-18	15-100
18-21	100
21-28	15

Впрыск: 10 мкл 0,2 мг/мл растворов в Тп5/№1С.'1/вода (объемный промежуточный продукт) или в 0,1% ТЕА/45% ацетонитрила (конечный продукт).

Определение: УФ 254 нм (основное) и 215 нм

Контроль: оМеРИРА-У, нагретый в кипящей воде в течение 20 мин.

Предварительные методы качественного определения закончены.

Стабильность лекарственного соединения.

Не наблюдается никакого разложения в объемном промежуточном продукте при хранении в течение двух недель при следующих условиях хранения: при 40°С в закрытом сосуде; при 50°С в закрытом сосуде; при 25°С и относительной влажности (ОВ) 60%; и при 40% и ОВ 75%. Спустя четыре недели, один или два пика разложения становятся заметными при хранении при 40 и 50°С, но уровень пика каждой примеси еще составляет менее 0,02%.

Стабильность раствора.

a) . Препарат для распыления, 5 мг/мл в Тп5/№1С1. хранившийся при комнатной температуре в течение двух месяцев, имеет пики разложения с ранним временем элюирования при общем уровне 1% (при 254 нм) и 2-3% (при 215 нМ).

b) . Нагревание препарата для распыления в кипящей воде в течение 20 мин снижает чистоту от 99,9% до 98,7% при 254 нМ и от 100% до 93,6% при 215 нм.

c) . Раствор с концентрацией 0,2 мг/мл в Тп5/№1С.’1/вода при нейтральном значении рН стабилен при 2-8°С, по меньшей мере, в течение недели.

Для квалифицированного в данной области специалиста очевидно, что различные модификации и изменения могут быть проведены в заявленном изобретении без отступления от сути и объема изобретения. Таким образом, подразу мевается, что настоящее изобретение охватывает модификации и варианты настоящего изобретения, при условии, что они находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов.

Claims (23)

1. (К)^-[[4-[[(2-метилфениламино)карбонил] амино] фенил] ацетил]-Е-пролил-3-метил-βаланин, ингибирующий клеточную адгезию сн» ^{н н} или его фармацевтически приемлемое производное, пролекарство или соль.

2. Соединение по п.1, в котором пролекарство представляет собой сложный эфир соединения.

3. Соединение по п.2, представляющее собой сложный эфир, полученный путем взаимодействия (К)-№[[4-[[(2-метилфениламино)карбонил] амино] фенил] ацетил]-Е-пролил-3-метилβ-аланина с С_1-10 спиртом с линейной или разветвленной цепью.

4. Соединение по п.2, представляющее собой сложный эфир, полученный путем взаимодействия (К)-^[[4-[[(2-метилфениламино)карбонил] амино] фенил] ацетил]-Е-пролил-3-метилβ-аланина с С_1-4 спиртом с линейной или разветвленной цепью.

5. Соединение по п.2, представляющее собой сложный эфир формулы

ΡΑ/Οαξτ:

СНз ^{Н Н} где В представляет собой С1-10алкил с линейной или разветвленной цепью.

6. Соединение по п.5, в котором В представляет собой С1_-4алкил с линейной или разветвленной цепью.

7. Соединение по п.1, имеющее формулу

СНз

8. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой соединение, ингибирующее клеточную адгезию, представлено в виде его соли.

10. Фармацевтическая композиция по п.8, дополнительно включающая еще один агент, выбираемый из группы, включающей кортикостериоды, бронхолитические агенты, антиастматические агенты, противовоспалительные агенты, противоревматические агенты, иммунодепрессанты, антиметаболиты, иммуномодуляторы, средства против псориаза и антидиабетические агенты.

11. Фармацевтическая композиция по п.8, дополнительно включающая одно или более соединений ингибиторов клеточной адгезии.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, в которой указанное одно или более соединений ингибиторов клеточной адгезии представляют собой ингибиторы интегрина α4β1.

13. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой соединение представляет собой пролекарство - сложный эфир.

14. Способ предотвращения, ингибирования или подавления клеточной адгезии у млекопитающих, включающий стадию введения указанному млекопитающему эффективного количества фармацевтической композиции по п.8 или 9.

15. Способ по п.14, в котором указанный способ используется для предотвращения, ингибирования или подавления воспаления.

16. Способ лечения астмы, аллергического ринита, рассеянного склероза, атеросклероза, воспалительного заболевания кишечника или множественной миеломы у млекопитающих, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения по п.1 или фармацевтической композиции по п.8 или 9.

17. Способ лечения рассеянного склероза у млекопитающих, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения по п.1 или фармацевтической композиции по п.8 или 9.

18. Способ лечения воспалительных заболеваний кишечника у млекопитающих, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения по п.1 или фармацевтической композиции по п.8 или 9.

19. Способ лечения, предотвращения или смягчения симптомов астмы, включающий введение пациенту, страдающему астмой, терапевтически эффективного количества соединения по п.1.

20. Применение соединения по любому из пп.2-7 для изготовления лекарства для лечения расстройства, опосредуемого клеточной адгезией.

21. Применение по п.19, в котором расстройство (заболевание) выбрано из группы, включающей астму, рассеянный склероз, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, воспаление легких, множественные миеломы, септический артрит, диабет типа 1, отторжение трансплантируемого органа и воспалительные заболевания кишечника.

22. Применение по п.21, в котором расстройством является рассеянный склероз.

23. Применение по п.21, в котором расстройством являются воспалительные заболевания кишечника.