SK18102000A3 - Zlúčeniny inhibujúce bunkovú adhéziu a farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje - Google Patents

Zlúčeniny inhibujúce bunkovú adhéziu a farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje Download PDF

Info

Publication number
SK18102000A3
SK18102000A3 SK1810-2000A SK18102000A SK18102000A3 SK 18102000 A3 SK18102000 A3 SK 18102000A3 SK 18102000 A SK18102000 A SK 18102000A SK 18102000 A3 SK18102000 A3 SK 18102000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
omepupa
vla
compound
mammal
cells
Prior art date
Application number
SK1810-2000A
Other languages
English (en)
Other versions
SK285280B6 (sk
Inventor
Wen-Cherng Lee
Alan Gill
Original Assignee
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen, Inc. filed Critical Biogen, Inc.
Publication of SK18102000A3 publication Critical patent/SK18102000A3/sk
Publication of SK285280B6 publication Critical patent/SK285280B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/16—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka nových zlúčenín, ktoré sú vhodné na inhibíciu, zmenu alebo prevenciu bunkovej adhézie a ochorení súvisiacich s bunkovou adhéziou. Vynález sa týka tiež farmaceutických kompozícií obsahujúcich tieto zlúčeniny a spôsobov ich použitia na inhibíciu a prevenciu bunkovej adhézie a ochorení súvisiacich s bunkovou adhéziou. Zlúčeniny a farmaceutické kompozície podlá vynálezu sa môžu použiť ako liečebné alebo preventívne činidlá. Vhodné sú zvlášť na liečenie mnohých zápalových a autoimunitných ochorení.
Doterajší stav techniky
Bunková adhézia je proces, pomocou ktorého sa bunky zhlukujú k sebe, migrujú smerom k špecifickému cieľu alebo sa lokalizujú v mimobunkovej matrici. Bunková adhézia samotná je jedným zo základných mechanizmov zúčastňujúcich sa na mnohých biologických javoch. Bunková adhézia je napríklad zodpovedná za adhéziu hematopoietických buniek k bunkám endotelu a za následnú migráciu týchto hematopoietických buniek z ciev a na miesto poškodenia. Bunková adhézia samotná hrá úlohu pri mnohých ochoreniach, ako sú napríklad zápalové a imunitné reakcie cicavcov.
Výskumy na molekulárnej úrovni bunkovej adhézie ukázali, že rôzne makromolekuly na povrchu buniek, spoločne známe ako molekuly alebo receptory bunkovej adhézie, sprostredkujú interakcie bunka-bunka a bunka-matrica. Napríklad proteíny spoločne nazývané integríny sú kľúčovým sprostredkovateľom adhéznych interakcii medzi hematopoietickými bunkami a ich mikroprostredím (Μ.Ξ. Hemler, VLA Proteins in the Integrin Family: Structures, Functions and Their Role on Leukocytes; Ann. Rev. Immunol. 8,
• • · • • · · · • • •e • · • • • • • · • · • • · • · • e • • · •
• • • • · • • ···· • · • · • • · ·
str. 365 (1990)). Integriny sú nekovalentnými heterodimérnymi komplexmi skladajúcimi sa z dvoch podjednotiek nazývaných a a β. Existuje 17 rôznych podjednotiek a (al-alO, a-L, a-M, a-D, a-X, a-IIB, a-V a a-E) a najmenej 9 rôznych podjednotiek β (β1-β9) , ktoré sa doteraz identifikovali. Na základe typu zložiek podjednotiek a a β je možné každú molekulu integrinu zaradiť do podskupiny.
Integrin α4-β1, známy tiež ako veľmi neskorý antigén-4 (VLA-4) alebo CD49d/CD29, je receptorom na povrchu bunky leukocytu, kcorý sa podieľa na mnohých rôznych matricových adhéznych interakciách, ako bunka-bunka, tak bunka-matrica (M.E. Hemler, Ann, Rev. Immunol., 8, str. 365 (1990)). Slúži ako receptor pre bunky endotelu povrchového proteínu, ktorý je možné vyvolať cytokinom, pre molekulu-1 cievnej bunkovej adhézie (VCAM-1), rovnako ako pre mimobunkovú matricu proteínu fibronektínu (FN) (Ruegg a kol., J. Celí. Biol. 177, str. 179 (1991); Wayner a kol., J. Celí. Biol., 105, str. 1873 (1987); Kramer a kol., J. Biol. Chem., 264, str. 4684 (1989); Gehlsen a kol., Science, 24, str. 1228 (1988)). Dokázalo sa, že anti-VLA-4 monoklonálne protilátky (mAb) inhibujú adhézne interakcie závislé od VLA-4 ako in vitro, tak in vivo (Ferguson a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, str. 8072 (1991); Ferguson a kol., J. Immunol., 150, str. 1172 (1993)). Výsledky in vivo experimentov naznačujú, že táto inhibícia VLA-4 závislej bunkovej adhézie môže predchádzať, inhibovať alebo zmeniť niektoré zápalové a autoimunitné ochorenia (R.L. Lobb a kol., The Pathophysiologic Role of a4 Integrins In Vivo, J. Clin, Invest., 94, str. 1722-28 (1994)) .
S cieľom identifikovať minimálne aktívne aminokyselinové sekvencie potrebné pre väzbu VLA-4 Komoriya a kol. (The Minimal Essential Sequence for a Major Celí Type-Specific Adhesion Site (CS1) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine, J.
• · ··
Biol., Chem., 266 (23), str. 15075-79 (1991)) syntetizovali sadu prekrývajúcich sa peptidov založených na aminokyselinovej sekvencii CS-1 úseku (VLA-4 väzbová doména) rôznych druhov fibronektinu. Identifikovali peptid obsahujúci osem aminokyselín, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, rovnako ako dva menšie prekrývajúce sa peptidy, Glu-Ile-Leu-Asp-Val a Leu-Asp-Val-Pro-Ser, ktoré majú inhibičnú aktivitu proti bunkovej adhézii závislej od FN. Tieto výsledky naznačujú, že tripeptid Leu-Asp-Val je minimálna sekvencia pre aktivitu k bunkovej adhézii. Neskôr sa preukázalo, že Leu-Asp-Val viaže len lymfocyty, ktoré vykazujú aktivovanú formu VLA-4, a tak sa objavila otázka využiteľnosti týchto peptidov in vivo (E.A. Wayner a kol., Activation-Dependent Recognition by Hematopoietic Cells of the LDV Sequence in the V Región of Fibronectin, J. Celí., Biol., 116(2), str. 489-497 (1992)). Určité väčšie peptidy obsahujúce LDV postupne preukázali aktivitu in vivo (T.A. Ferguson a kol., Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Responses In Vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, str. 8072-76 (1991); a S.M. Wahl a kol., Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment, J. Clin. Invest., 94, str. 655-62 (1994)). Opísaný bol cyklický pentapeptid, ktorý môže inhibovať adhéziu, ako VLA-4, tak VLA-5 k FN (D.M. Nowlin a kol., A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits α4β1 a α5β1 Integrin-mediated Celí Adhesion, J. Biol. Chem., 268 (27), str. 20352-59 (1993); a PCT prihláška PCT/US91/04862). Tento pentapeptid je založený na tripeptidovej sekvencii Arg-Gly-Asp z FN, ktorá je známa ako obvyklý motív v mieste rozpoznania pre niekoľko mimobunkových matricových proteínov.
Príklady iných VLA-4 inhibítorov sú uvedené napríklad v ďalšej US patentovej prihláške 08/376,372 a v medzinárodnej patentovej prihláške WO 98/04913, ktoré sú tu uvedené ako odkaz. USSN 376,372 opisuje lineárne peptidylové zlúčeniny obsahujúce β-aminokyseliny, ktoré majú inhibičnú aktivitu k bunkovej adhé4 ···· ·· ·· ·· • · · · · ··· ··· · · · · · • · · · · · ··· ·· ···· ·· · zii. Medzinárodné patentové prihlášky WO 94/15958 a WO 92/00995, ktoré sú tu uvedené ako odkazy, opisujú cyklický peptid a peptidomimetické zlúčeniny, ktoré majú modulačnú aktivitu proti bunkovej adhézii. Medzinárodné patentové prihlášky WO 93/08823 a WO 92/08464 (uvedené ako odkaz) opisujú zlúčeniny modulujúce bunkovú adhéziu obsahujúcu guanidylovú skupinu, močovinovú skupinu a tiomočovinovú skupinu. US patent č. 5 260 277 opisuje guanidinylové zlúčeniny modulujúce bunkovú adhéziu (patent uvedený ako odkaz).
Napriek tomuto pokroku sú potrebné špecifické inhibítory VLA-4 závislej bunkovej adhézie, ktoré majú lepšie farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti, ako je orálna biologická využiteľnosť a dlhé trvanie pôsobenia. Tieto zlúčeniny by mohli poskytnúť vhodné činidlá na liečenie, zmenu, prevenciu alebo potlačenie rôznych ochorení sprostredkovaných bunkovou adhéziou a väzbu VLA-4.
Podstata vynálezu
Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú inhibítormi integrínu VLA-4 a blokujú väzbu VLA-4 k jeho rôznym ligandom, ako je VCAM-1 a oblasti fibronektinu. Tieto zlúčeniny sú vhodné na inhibiciu procesu bunkovej adhézie, vrátane aktivácie, migrácie, proliferácie a diferenciácie buniek. Tieto zlúčeniny sú vhodné na inhibiciu, prevenciu a potlačenie bunkovej adhézie sprostredkovanej VLA-4 a ochorení súvisiacich s touto adhéziou, ako sú zápalové a imunitné reakcie, vrátane napríklad sklerózy multiplex, astmy, alergickej rhinitídy, alergickej konjunktivitídy, zápalového artritídy, autológnej infekcii, reumatoidnej artritídy, transplantácie orgánu, drene, zápalu po septickej restenózy, vírusovej črevného ochorenia, vrátane choroby, určitých typov ochorenia pľúc, diabetu typu 1, transplantácie kostnej myokarditídy, zápalového ulceratívnej kolitídy a Crohnovej toxickej a imunitnej nefritídy, kontaktnej dermálnej precitlivenosti, psoriázy, metastáz nádorov, mnohonásobného myelómu a ate5
Φ • · • ···· • ··· ·· • · • · • · • · • • · • • • · •
• • • · • · • ···· • ·· • •
rosklerózy. Zlúčeniny podlá predloženého vynálezu sa môžu použiť samotné alebo v kombinácii s ďalšími terapeutickými alebo profylaktickými činidlami na inhibíciu, zmenu, prevenciu alebo potlačenie bunkovej adhézie. Predložený vynález poskytuje tiež farmaceutické kompozície obsahujúce tieto inhibítory bunkovej adhézie sprostredkovanej VLA-4 a spôsoby použitia zlúčenín a kompozícií podľa vynálezu na inhibíciu bunkovej adhézie.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: uvádza odozvu dýchacích ciest ovce po liečení oMePUPA-V. Ovce, prirodzene citlivé na Ascaris suum, sa stimulujú aerosolom alergénu Ascaris suum, po dvoch hodinách sa podá oMePUPA-V v značených dávkach alebo zodpovedajúce množstvo vehíkula. V daných časoch sa meria činnosť pľúc a zaznamenáva sa ako zmena špecifickej rezistencie dýchacích ciest vzhľadom na hodnoty základnej línie pred štúdiou (ľavé panely). Rezistencia dýchacích ciest vzhľadom na inhalovaný karbachol sa určí pred začiatkom štúdie a 24 hodín po stimulácii alergénom (pravé panely) . Odozva dýchacích ciest sa zaznamená ako pomer PC4oo (množstvo karbacholu potrebného na zvýšenie rezistencie o 400%) hodnôt pred stimuláciou a po stimulácii.
Obr. 2: Ovce, prirodzene citlivé na Ascaris suum, sa stimulujú podávaním aerosólu oMePUPA-V pri daných dávkach alebo Ascaris suum. Zmeny rezistencie dýchacích ciest sa merajú po stimulácii aerosolom a maximálna rezistencia pľúc (cm H2/sek.) po stimulácii sa porovná s hodnotami základnej línie. *=p<0,05 porovnané s PBS kontrolou, jednofaktorová analýza rozptylu, po ktorej nasleduje Dunnettov test viacnásobného porovnania s kontrolnou skupinou. Označuje štatisticky významný vzrast maxima špecifickej rezistencie pľúc v porovnaní s PBS kontrolnou skupinou.
Obr. 3: Ovce, prirodzene citlivé na Ascaris suum, sa stimulujú podávaním aerosólu Ascaris suum 24 hodín po štvordennom podávaní aerosólu oMePUPA-V (0,03 mg) alebo zodpovedajúceho množstva vehikulá (etanol : normálny fyziologický roztok, 1:2, ···· ··· ·· ·· •· · · •· · • ·· · • ·· ·· ···· • · •· · •· •· •· ·· ·
1:499, dolný horný panel; Tris : normálny panel). Činnosť pľúc sa meria zmena špecifickej rezistencie línie pred štúdiou (ľavé panely). inhalovaný karbachol sa po stimulácii alergénom sa zaznamená ako pomer vzrast rezistencie o fyziologický roztok, v daných časoch a zaznamená sa ako pľúc vzhľadom na hodnotu základnej
Rezistencia dýchacích ciest na určí pred inhalačnou štúdiou a 24 hodín (pravé panely). Odozva dýchacích ciest PC4oo (množstvo karbacholu potrebné na 400%) porovnaním hodnôt pred a po stimulácii.
Obr. 4: Myšie Balb/c, vopred senzitizované na DNFB, sa stimulujú aplikáciou DNFB na chrbtovú stranu ľavého ucha a vehikulom na chrbtovú stranu pravého ucha. Po 24 hodinách sa odmeria hrúbka ucha mikrometrickým meradlom. oMePUPA-V sa podáva v uvedených dávkach 4 hodiny po stimulácii DNFB. Pozitívna kontrolná (+CTRL) zlúčenina sa podávala v maximálne účinnej enterálnej dávke. Hodnoty znamenajú priemer ± smerodajná odchýlka priemeru pre 8 zvierat. Horný panel ukazuje absolútny opuch ucha. Dolný panel ukazuje percentuálnu inhibíciu opuchu ucha v porovnaní s kontrolným uchom stimulovaným vehikulom (VEH).
Obr. 5: Analýza kompetície medzi oMePUPA-V a známym inhibítorom za rôznych podmienok aktivácie. Jurkatove bunky (l,5xl06/ml) v TBS plus 2 mM Mn2+, 1 mM Ca2+ plus 1 mM Mg2+, 1 mM Ca2+ plus 10 mM Mg2+, 10 mM Mg2+ alebo 10 mM Mg2+ plus 10 μς/πιΐ TS2/16 sa spracovávajú 5 nM 3H známym inhibítorom samotným alebo 5 nM 3H známym inhibítorom plus 10 nM BIO1519 30 minút pri teplote miestnosti. Bunky sa potom peletujú odstredením, resuspendujú sa v 100 μΐ TBS plus Mn2+ a analyzujú sa pomocou scintilačného počítania. Počty väzieb za týchto podmienok znamenajú integrín, ktorý nie je obsadený testovanou zlúčeninou, a je teda voľný na väzbu 3H známeho inhibítora.
Podrobný opis vynálezu
Predložený vynález poskytuje zlúčeniny, ktoré sú schopné • ···· ·· ·· ·· ··· · · · · · · · • ··· · · · · · • · · · · · · ·· ···· ·· ··· inhibovať bunkovú adhéziu sprostredkovanú VLA-4, pomocou inhibície väzby ligandov k tomuto receptoru. Výhodnou zlúčeninou je (P)-N- [[4-[[(2-metylfenylamino)karbonyl]amino]fenyl]acetyl]-Lktorý je tu označovaný ako oMePUPA-V
-prolyl-3-metyl-p-alanín,
oMePUPA-V
Predložený vynález sa týka tiež farmaceutický prijateľných derivátov, soli a esterov oMePUPA-V.
Zlúčeniny všeobecného vzorca I obsahujú jedno alebo viac asymetrických centier, a môžu sa teda vyskytovať vo forme racemických zmesí, jednotlivých enantiomérov, diastereomérnych zmesí a jednotlivých diastereomérov. Predložený vynález zahŕňa všetky také izomérne formy zlúčenín všeobecného vzorca I.
Predložený vynález tiež zahŕňa farmaceutický prijateľné soli zlúčenín všeobecného vzorca I. Termín farmaceutický prijateľné soli znamená soli pripravené z farmaceutický prijateľných netoxických zásad alebo kyselín vrátane anorganických alebo organických zásad a anorganických alebo organických kyselín. Soli odvodené od anorganických zásad zahŕňajú amóniové, amónne, vápenaté, meďné, železnaté, železité, Utne, horečnaté soli, manganité, manganaté, draselné, sodné, zinočnaté a podobné soli. Zvlášť výhodné sú amóniové, vápenaté, horečnaté, draselné a sodné soli.
Soli odvodené od farmaceutický prijateľných organických netoxických zásad zahŕňajú soli primárnych, sekundárnych a terciárnych amínov, substituovaných amínov vrátane prírodných substituovaných amínov, cyklických amínov a zásaditých iónomeničo8
• ···· • · ·· ·· ·
• · • • • • · • • • ·
• ··· • • • • • •
• • • • • • • •
• · ···· • · ···
vých kyselín, ako je arginin, betaín, kofeín, cholín, N, 2V-diben zyletyléndiamín, dietylamín, 2-dietylaminoetenol, 2-dimetylaminoetanol, etanolamín, etyléndiamín, N-etylmorfolín, N-etylpiperidín, glukamín, glukozamín, amín, lyzín, metylglukamín, polyamínové živice, prokaín, histidín, hydrabamín, izopropylmorfolín, piperazín, piperidín, puríny, teobromín, trietylamín, trimetylamín, tripropylamín, trometamín a podobne.
Ak je zlúčenina podľa predloženého vynálezu zásaditá, môžu sa soli pripraviť z farmaceutický prijateľných netoxických kyselín, vrátane anorganických a organických kyselín. Medzi také kyseliny patrí kyselina octová, kyselina benzénsulfónová, kyselina benzoová, kyselina gáforsulfónová, kyselina citrónová, kyselina etánsulfónová, kyselina fumarová, kyselina glukónová, kyselina glutámová, kyselina bromovodíková, kyselina chlorovodíková, kyselina izetionová, kyselina mliečna, kyselina maleínová, kyselina jablčná, kyselina mandľová, kyselina metánsulfónová, kyselina slizová, kyselina dusičná, kyselina pamoová, kyselina pantoténová, kyselina fosforečná, kyselina jantárová, kyselina sírová, kyselina vínna, kyselina p-toluénsulfónová a podobne. Zvlášť výhodné sú kyselina citrónová, kyselina bromovodíková, kyselina chlorovodíková, kyselina maleínová, kyselina fosforečná, kyselina sírová a kyselina vínna.
Ďalej predložený vynález zahŕňa preliečivá, najmä esterové preliečivá, kde karboxylová skupina (Ä)-N-[[4-[[(2-metylfenylamino)karbonyl]amino]fenyl]acetyl]-L-propyl-3-metyl-p-alanínu je esterifikovaná akýmkoľvek alkoholom. Medzi výhodné alkoholy patrí metanol, etanol, propanol, butanol alebo alkoholy obsahujúce 1 až 10 atómov uhlíka, ktoré majú priamy alebo rozvetvený reťazec.
Schopnosť zlúčenín všeobecného vzorca I antagonizovať pôsobenie VLA-4 ich robí vhodnými na prevenciu, liečenie alebo zvrátenie symptómov, porúch alebo ochorení vyvolaných väzbou VLA-4 k svojim ligandom. Títo antagonisti budú teda inhibovať procesy
···· ··· ·· ·· • · · · • e · bunkovej adhézie, vrátane aktivácie, migrácie, proliferácie a diferenciácie buniek. Ďalším predmetom podlá predloženého vy nálezu je spôsob liečenia, prevencie, zmiernenia alebo potlačenia ochorení alebo porúch sprostredkovaných cestou VLA-4. Medzi takéto ochorenia patrí napríklad astma, skleróza multiplex, alergická rinitída, alergická konjunktivitída, zápalové ochorenie plúc, reumatoidná artritída, mnohonásobný myelóm, septická artritída, diabetes typu I, odmietnutie transplantovaného orgá nu, zápalové črevné ochorenia a ďalšie.
Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu syntetizovať s použitím bežných postupov, pričom niektoré z nich sú tu uvedené formou príkladov. Tieto zlúčeniny sa výhodne chemicky syntetizujú z ľahko dostupných východiskových látok, ako sú a-aminokyseliny a ich funkčné ekvivalenty. Výhodné sú tiež modulárne a konvergentné spôsoby syntézy týchto zlúčenín. Pri konvergentnom prístupe sa napríklad veľké časti výsledného produktu v posledných krokoch syntézy spoja, skôr ako by sa postupne pridávali malé časti k rastúcemu reťazcu molekuly.
Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu tiež modifikovať pripojením vhodných funkčných skupín s cieľom zlepšiť ich selektívne biologické vlastnosti. Tieto modifikácie sú odborníkom pracujúcim v tejto oblasti známe a patria medzi ne modifikácie zvyšujúce biologickú penetráciu do daného biologického systému (napríklad krvi, lymfatického systému, centrálneho nervového systému), zvyšujúce orálnu biologickú využiteľnosť, zvyšujúce rozpustnosť, aby ich bolo možné podávať injekčné, meniace metabolizmus a meniace rýchlosť vylučovania. Medzi príklady takýchto modifikácií patrí esterifikácia polyetylénglykolmi, derivatizácia pivolátmi alebo mastnými kyselinami, konverzia na karbamáty, hydroxylácia aromatických kruhov a substitúcia heteroatómov aromatických kruhov, vynález sa však neobmedzuje len na tieto príklady.
Podľa predloženého vynálezu znamená termín pacient cicav10 ·· • ···· ·· ··· ···· ··· • ··· · e · · · • ···· ···· • · · · · · · ··· ··· ·· ·♦·· ·· · ca, vrátane človeka. Termín bunka znamená akúkoľvek bunku, výhodne bunku cicavca, vrátane buniek človeka.
Aktivita a špecifickosť pripravených zlúčenín podľa predloženého vynálezu vzhľadom na VLA-4 sa môže určiť pomocou in vivo a in vitro testov.
Napríklad inhibičná aktivita zlúčenín podľa predloženého vynálezu vzhľadom na bunkovú adhéziu sa môže merať pomocou určenia koncentrácie inhibítora potrebnej na blokovanie väzby buniek exprimujúcich VLA-4 k mikrotitračným doštičkám potiahnutým fibronektínom alebo CS1. Pri tomto type testu sa jamky mikrotitračnej doštičky potiahnu buď fibronektínom (obsahujúcim CS-1 sekvenciu) alebo CS-1. Ak sa použije CS-1, musí sa konjugovať k proteínovému nosičovi, ako teľací sérový albumín, aby sa mohol viazať na jamky. Keď sa jamky potiahnu, pridajú sa rôzne koncentrácie testovanej zlúčeniny spolu s vhodne označenými bunkami exprimujúcimi VLA-4. Alternatívne sa môže najskôr pridať testovaná zlúčenina a nechať sa inkubovať s potiahnutými jamkami pred pridaním buniek. Bunky sa nechajú inkubovať v jamkách najmenej 30 minút. Po inkubácii sa jamky vyprázdnia a premyjú. Inhibícia väzby sa meria určením hodnoty fluorescencie alebo rádioaktivity viazanej na doštičku na každú rôznu koncentráciu testovanej zlúčeniny a tiež na kontrolnú vzorku neobsahujúcu testované zlúčeniny.
Bunky exprimujúce VLA-4, ktoré sa môžu použiť pri tomto teste, zahŕňajú Ramosove bunky, Jurkatove bunky, bunky melanómu A375, a tiež bunky lymfocytov ľudskej periférnej krvi (PBL). Bunky použité pri tomto teste sa môžu značiť akýmkoľvek vhodným spôsobom, napríklad pomocou fluorescenčných alebo rádioaktívnych značiek.
Na kvantitatívne vyhodnotenie inhibičnej aktivity zlúčenín podľa vynálezu sa môže tiež použiť test priamej väzby. Pri tomto teste sa konjuguje VCAM-IgG fúzny protein obsahujúci prvé dve imunoglobulínové domény VCAM (D1D2) pripojené nad základnou oblasťou molekuly IgGl (VCAM 2D-IgG) k značkovaciemu enzýmu, ako je alkalická fosfatáza (AP). Syntéza tejto fúzie VCAM-IgG je opísaná v medzinárodnej patentovej prihláške WO 90/13300, ktorej obsah sa tu uvádza ako odkaz. Konjugácia tejto fúzie k značkovaciemu enzýmu sa dosiahne zosieťovacími postupmi, ktoré sú odborníkom pracujúcim v tejto oblasti známe.
Enzýmový konjugát VCAM-IgG sa potom umiestni do jamiek mnohojamkovej mikrotitračnej doštičky, ako je napríklad doštička, ktorá je súčasťou Millipore Multiscreen Assay Systém (Millipore Corp., Bedford, MA). Potom sa do každej jamky pridajú rôzne koncentrácie testovanej inhibičnej zlúčeniny a potom bunky exprimujúce VLA-4. Bunky, zlúčenina a enzýmový konjugát VCAM-IgG sa zmiešajú a nechajú sa inkubovať pri teplote miestnosti.
Po inkubácii sa jamky odvodnia za vákua a v jamkách zostanú bunky a všetok viazaný VCAM. Množstvo viazaného VCAM sa určí pridaním vhodného kolorimetrického substrátu pre enzýmový konjugát VCAM-IgG a určí sa množstvo reakčného produktu. Pokles množstva reakčného produktu znamená vzrast väzbovej inhibičnej aktivity. Postup niektorých testov je opísaný ďalej.
Na testovanie inhibičnej špecifickosti zlúčenín podlá predloženého vynálezu k VLA-4 sa uskutočnia testy na hlavné skupiny integrínov, to znamená β2 a β3, a tiež na ďalšie βΐ integríny, ako sú VLA-5, VLA-6 a α4β7. Tieto testy môžu byť podobné testom inhibície adhézie a priamej väzby, opísaným skôr, pričom sa nahradia príslušné bunky exprimujúce integrín a zodpovedajúci ligand. Napríklad sa použijú polymorfonukleárne bunky (PMN) exprimujúce na svojom povrchu integríny β2 a viažuce ICAM. Integríny β3 sú zahrnuté do zhlukovania krvných doštičiek a inhibícia sa môže merať pomocou štandardného testu zrážania krvných doštičiek. VLA-5 sa viaže špecificky k sekvencií Arg-Gly-Asp, zatiaľ čo VLA-5 sa viaže k laminínu. α4β7 je nedávno objavený homológ VLA-4, ktorý tiež viaže fibronektín • · ··· ···· · ···· ·· · ·· • · · · · ···· • · · · · · · ··· ··· ·· ···· ·· · a VCAM. Špecifickosť vzhľadom k α4β7 sa urči pri teste väzby, ktorý využíva skôr opísaný značkovací konjugát VCAM-IgG-enzým a bunkový kmeň, ktorý exprimuje α4β7, ale nie VLA-4, ako je RPMI-8866 alebo JY bunky.
Keď sa identifikujú VLA-4 špecifické inhibítory, môžu sa ďalej charakterizovať pomocou in vivo testov. Jeden taký test študuje inhibíciu kontaktnej hypersenzitivity u živočíchov a je opísaný napríklad v článkoch P.L. Chisholm a kol., Monoclonal Antibodies to the Integrin a-4 Subunit Inhibit the Murine Contact Hypersensitivity Response, Eur. J. Immunol., 23, strana 682-688 (1993) a v Current Protocols in Imunology, J.E. Coligan a kol., Eds., John Wiley and Sons, New York, 1, str. 4.2.1-4.2.5 (1991), ktorých obsah je tu uvedený ako odkaz. V tomto teste sa senzibilizuje pokožka živočícha vystavením dráždivej látke, ako je dinitrofluórbenzén, potom sa ľahko fyzicky podráždi napríklad ľahkým poškrabaním pokožky ostrou hranou. Po zotavení sa pomocou rovnakého postupu živočíchy znova senzibilizujú. Niekoľko dní po senzibilizácii sa jedno ucho živočícha vystaví chemickému draždidlu a druhé ucho sa ošetrí nedráždivým kontrolným roztokom. Krátko po podráždení uší sa zvieratám pomocou podkožnej injekcie podávajú rôzne dávky inhibítora VLA-4. In vivo inhibícia zápalu súvisiaceho s bunkovou adhéziou sa testuje meraním odozvy opuchu liečeného ucha proti opuchu neliečeného ucha živočícha. Opuch sa meria pomocou posuvného meradla alebo iného nástroja vhodného na meranie hrúbky ucha. Týmto spôsobom je možné zistiť, ktoré inhibítory podľa predloženého vynálezu sú najvhodnejšie na inhibíciu zápalu.
Ďalší in vivo test, ktorý sa môže použiť na testovanie inhibítorov podľa vynálezu, je test astmy oviec. Táto skúška sa uskutočňuje podľa postupu, ktorý je opísaný v W.M. Abraham a kol., α-Integrins Mediated Antigen-Induced Late Bronchial Responses and Prolongated Airway Hyperresponsiveness in Sheep, J. Clin. Invest., 93, str. 776-87 (1994), čo je tu uvedené ako • · • · · · · ··· ···· ··· • ··· · · · · · • ···· ···· • 9 9 9 9 9 9
999 999 99 9999 99 · odkaz. Pomocou tejto skúšky sa meria inhibicia neskorej fázy odozvy dýchacích ciest a precitlivenosť dýchacích ciest vyvolaná antigénom Ascaris u alergických oviec. Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť testované tiež pri teste zhlukovania krvných doštičiek.
Inhibítory VLA-4 podľa predloženého vynálezu sú prekvapujúco výhodne aktívne a selektívne. Všeobecne sú tieto zlúčeniny selektívne vzhľadom k VLA-4 (> lOOOkrát oproti α4β7 a α5β1), sú negatívne pri bežných testoch PanLabs a non-GLP Arnes, čisté pri štandardných farmakologických testoch vedľajších účinkov a sú účinné na ovčom modeli dávkovania predpokladaného množstva účinného pre človeka 1 mg/deň alebo menej, raz denne.
Zlúčeniny podľa vynálezu majú prekvapujúco dobrú účinnosť v porovnaní so štruktúrne podobnými inhibítormi VLA-4. Napríklad u oviec citlivých na Ascaris liečených raz denne štyri dni rozprašovaným liečivom pri dávke 0,1 mg/kg a potom stimulovaných antigénom 24 hodín po poslednej dávke, skôr testované zlúčeniny značne znížili skorú odozvu a blokovali neskoršiu fázu bronchokonštrikcie a vývoj nešpecifickej precitlivenosti. S predpokladom biologickej ekvivalencie u človeka by celková dávka pre človeka s hmotnosťou 70 kg mohla byť 7 mg. Ďalej liečivo podávané ovciam prostredníctvom endotracheálnej trubice v daných dávkach je podľa odhadu dvakrát vyššie, ako sa typicky dosiahne u človeka pomocou orálneho inhalačného zariadenia. Ďalej je pravdepodobné, že bude potrebné pridať k výslednej pevnej kompozícii prísady, aby sa optimalizovalo plnenie prístroja a dodanie liečiva. Podľa týchto faktorov je možné odhadnúť dávku u človeka 14 mg alebo viac, čo presahuje technický limit 1 až 5 mg, ktorý je možné dodať v jednej dávke pomocou inhalačného zariadenia na suchý prášok (DPI). Aj keď je možné potrebnú dávku dodať pomocou niekoľkých dávkovaní DPI, bude táto skutočnosť predstavovať nevýhodu na trhu s liekmi proti astme, kde je typická dávka inhalovaného steroidu 0,2 až 1,0 mg.
oMePUPA-V znížila skorú odozvu, blokovala neskorú fázu bron14 • ···· · · · · ·· ··· ···· ··· • ··· · · · · · • · · · · · · ·· ···· ·· ··· chokonštrikcie a normalizovala precitlivenosť pri minimálnej dávke 0,003 mg/kg pri podávaní vo forme rozprašovanej dávky 2 hodiny pred stimuláciou antigénom. Ďalej denná dávka 0,001 mg/kg 4 dni pri stimulácii antigénom 24 hodín po poslednej dávke poskytla maximálnu odozvu. oMePUPA-V je tridsaťkrát až stokrát účinnejšia, ako skôr používané zlúčeniny, pri hladinách dávkovania v rozsahu, ktoré je rovnaké ako u najlepších predávaných steroidov na inhalačné použitie. oMePUPA-V, rovnako ako predposledný syntetický medziprodukt, je vysoko kryštalický (pozri obr. 1, tabuľka 1).
Ďalej má oMePUPA-V zlepšený metabolický profil v porovnaní so známymi zlúčeninami inhibujúcimi VLA-4. Napríklad po podávaní aerosólu sa nárokované zlúčeniny rýchlo prevedú na menej aktívny metabolit, ktorý je prevládajúcim produktom získaným z bronchoalveolárneho výplachu (BALF) a je tiež prevládajúcim produktom pozorovaným pri systémovom obehu, pričom vykazoval dlhší polčas života v plazme, ako materská zlúčenina. Pretože je rýchla metabolická konverzia na menej aktívne zlúčeniny vhodnou stratégiou na dosiahnutie zníženia expozície systému, zlúčeniny, ktoré sa metabolizujú na vedľajšie produkty s malou alebo žiadnou vnútornou aktivitou, predstavujú menšie ťažkosti pri vyvíjaní a sú výhodné z hľadiska hromadenia.
Potenciálne proteolytické produkty oMePUPA-V sú neaktívne pri VLA-4 väzbovom teste a teda pomocou proteolýzy sa budú generovať neaktívne produkty. Aj tak in vitro metabolické štúdie a tiež in vivo PK štúdie u krýs, psov a oviec ukazujú, že oMePUPA-V je proteolyticky stabilný.
Tabuľka 1:
Vlastnosti oMePUPA-V v porovnaní so známymi inhibítormi
Vlastnosť Známa zlúčenina oMePUPA-V
IC50 proti väzbe VLA-4-VCAM-Ig 1,5 nM 2,7 nM
IC50 proti väzbe a4p7-VCAM-Ig 2,7 μΜ > 100 μΜ
IC50 proti adhézii a5Pl-FN > 100 μΜ > 100 μΜ
···♦ 99 99 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
999 99 9999 99 999
Minimálna účinná dávka na ovčom mo-
deli
- jednotlivá dávka 0,1 mg/kg 0,003 mg/kg
- opakovaná dávka 0,03-0,1 mg/kg 0,001 mg/kg
Kryštalinita nie áno
In vitro pharma screen 85 test 1 slabý zásah čistý
ACE aktivita ACE substrát čistý
Glukuronidácia nízke hladiny plánované
Test Ames (nutagenita) čistý čistý
Ancilárna farmakológia (vedľajšie účinky) čistý
Systémová expozícia, dávka 10 mg aerosólu (ovce) 40 ng/mlxhod. skončené
Metabolický profil aktívny metabolit
Orálna biol.využiteľnosť < 1% < 1%
Stabilita vo veľkom (40°C, 75% rel. vlhkosť) nestabilná stabilná > 4 týždne
Stabilita vo formulácii (40°C) 0,2% degradácia/deň stabilná > 4 týždne
Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu upraviť do farmaceutických
prostriedkov, ktoré sa môžu podávať orálne, parenterálne, pomocou inhalačného spreja, miestne, rektálne, nazálne, bukálne, vaginálne alebo pomocou implantovaného zásobníka. Termín paren terálne podávanie zahŕňa podkožné, vnútrožilové, medzisvalové, intraartikulárne, do kĺba, intrasternálne, intratekálne, intra hepatikálne, intralezionálne a intrakraniálne injekcie alebo infúznu techniku.
Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu obsahujú akúkoľvek zlúčeninu podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľný derivát, spolu s akýmkoľvek farmaceutický prijateľným nosičom. Termín nosič zahŕňa farmaceutický prijateľné adjuvans a vehikulá. Farmaceutický prijateľné nosiče, ktoré sa môžu použiť vo farmaceutických prostriedkoch podľa vynálezu, zahŕňajú ionomeniče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitín, sérové proteíny, ako je ľudský sérový albumín, pufrovacie látky ako sú fosfáty, glycín, kyselinu sorbovú, sorban draselný, čiastočne glyceridované zmesi nasýtených rastlinných mastných kyselín, vodu, soli alebo elektrolyty, ako je protamín sulfát, hydrogenfosforečnan ·· • ···· ·· ··· · · · · ··· • ··· · · · · · • ···· ···· • · · · · · · ··· ··· ·· ···· ·· · sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, soli zinku, koloidný oxid kremičitý, trikremičitan horečnatý, polyvinylpyrolidón, látky založené na celulóze, polyetylénglykol, sodnú sol karboxymetylcelulózy, polyakryláty, vosky, blokové polyméry polyetylénpolyoxypropylén, polyetylénglykol a lanolin.
Podľa vynálezu môžu byť farmaceutické prostriedky vo forme sterilného roztoku na injekčné podávanie, napríklad sterilného vodného roztoku na injekčné podávanie alebo olejovej suspenzie na injekčné podávanie. Takéto suspenzie sa môžu pripraviť podľa techník, ktoré sú v tejto oblasti známe, s použitím vhodných dispergujúcich alebo zvlhčujúcich činidiel a suspendujúcich činidiel. Sterilné prostriedky na injekčné podávanie môžu byť sterilné roztoky na injekčné podávanie alebo suspenzie v netoxických parenterálne prijateľných riedidlách alebo rozpúšťadlách, napríklad ako roztok v 1,3-butándiole. Medzi prijateľné vehikulá a rozpúšťadlá, ktoré sa môžu použiť, patrí voda, Ringerov roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Ďalej sa ako rozpúšťadlo alebo suspendujúce činidlo používajú sterilné, stabilizované oleje. Na tento cieľ je možné použiť akýkoľvek nedráždivý stabilizovaný olej, vrátane mono- a diglyceridov. Mastné kyseliny, ako je kyselina olejová a jej glyceridové deriváty sú vhodné pri príprave injikovateľných prostriedkov, rovnako ako farmaceutický prijateľné prírodné oleje, ako sú olivový olej alebo ricínový olej, najmä v ich polyoxyetylovaných formách. Tieto olejové roztoky alebo suspenzie môžu tiež obsahovať ako riedidlo alebo dispergujúcu látku alkoholy s dlhým reťazcom.
Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sa môžu podávať orálne v akejkoľvek orálne prijateľnej dávkovacej forme, vrátane toboliek, tabliet, vodných suspenzií alebo roztokov, vynález sa však neobmedzuje len na tieto príklady. V prípade tabliet na orálne podávanie sa ako nosiče bežne používajú laktóza a kukuričný škrob. Typicky sa tiež pridávajú mazadlá, ako je stearát horečnatý. Na orálne podávanie vo forme toboliek sú vhodnými riedidlami laktóza a sušený kukuričný škrob. Ak je na orálne
• ···· • · ·· ·· •
• · • • • • · • · • ·
• ··· • • • • • •
• • • • • • • •
·· ···· ·· ···
použitie potrebná vodná suspenzia, aktívna zložka sa zmieša s emulgátorom a suspendujúcim činidlom. Ak sa to vyžaduje, môže sa tiež pridať určité sladiace činidlo, príchuť alebo farbiace činidlo.
Alternatívne sa môžu farmaceutické prostriedky podľa vynálezu podávať vo forme čapíkov na rektálne podávanie. Čapíky sa môžu pripravovať zmiešaním činidla s vhodnou nedráždivou prísadou, ktorá je pevná pri teplote miestnosti, ale kvapalná pri rektálnej teplote, a roztápa sa v konečníku za uvoľnenia liečiva. Takýmito materiálmi sú kakaové maslo, včelí vosk a polyetylénglykoly.
Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu sa môžu podávať miestne, zvlášť ak sú miestom liečby miesta alebo orgány, ktoré sú dobre prístupné na miestnu aplikáciu. Patrí medzi ne očné ochorenie, kožné ochorenie alebo ochorenie konečníka. Pre každú z týchto oblastí alebo orgánov sa vhodné farmaceutické prostriedky ľahko pripravujú.
Miestna aplikácia do spodného intestinálneho traktu sa môže uskutočniť pomocou rektálnej čapikovej formy (pozri skôr uvedené) alebo pomocou vhodného klystírového prostriedku. Môžu sa tiež použiť miestne transdermálne náplasti.
Na miestnu aplikáciu sa môžu farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu upraviť do vhodných mastí obsahujúcich aktívnu zložku suspendovanú alebo rozpustenú v jednom alebo viacerých nosičoch. Nosiče na miestnu aplikáciu podávania zlúčenín podľa predloženého vynálezu zahŕňajú minerálne oleje, kvapalnú vazelínu z ropy, bielu vazelínu z ropy, propylénglykol, polyoxyetylénové zlúčeniny, emulgačné vosky a vodu, predložený vynález však nie je obmedzený len na tieto príklady. Alternatívne sa môžu farmaceutické prostriedky pripraviť vo vhodnom roztoku alebo kréme obsahujúcom aktívne zložky suspendované alebo rozpustené v jednom alebo viacerých farmaceutických nosičoch. Medzi vhodné nosiče patrí minerálny olej, sorbitan monostearát, poly18 • ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· • ··· · · · · · • · · · · · · ·· ···· ·· ··· sorbát 60, cetylesterový vosk, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol a voda, predložený vynález však nie je obmedzený len na tieto príklady.
Na očné použitie sa môžu farmaceutické prostriedky pripraviť ako mikronizované suspenzie v izotonickom sterilnom fyziologickom roztoku s upraveným pH, alebo výhodne ako roztoky v izotonickom sterilnom fyziologickom roztoku s upraveným pH, buď s alebo bez konzervačných látok ako je benzylalkóniumchlorid. Alternatívne sa môžu farmaceutické prostriedky na očné použitie pripraviť vo forme masti ako je vazelína.
Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu sa môžu tiež podávať pomocou nazálneho aerosólu alebo inhalačné pomocou nebulizátora, suchej práškovej formy na inhaláciu alebo odmeriavacieho dávkovacieho inhalátora. Takéto prostriedky sa pripravia v súlade s technikami, ktoré sú odborníkom v oblasti farmaceutických prostriedkov známe, a môžu sa pripraviť ako roztoky vo fyziologickom roztoku, s využitím benzylalkoholu alebo iných vhodných konzervačných látok, látok podporujúcich absorpciu na zvýšenie biologickej využiteľnosti, fluorovaných uhľovodíkov a/alebo iných bežných látok podporujúcich rozpustnosť alebo dispergujúcich činidiel. Ďalej môžu kompozície podľa vynálezu obsahovať akékoľvek farmaceutický prijateľné nosiče, ako sú napríklad laktóza pre suché práškové kompozície.
Množstvo aktívnej zložky, ktorá sa môže kombinovať s nosičom, pričom vzniká jedna dávková forma, sa bude meniť v závislosti od liečeného pacienta a konkrétneho spôsobu podávania. Je zrejmé, že špecifická dávka a liečebný režim pre konkrétneho pacienta bude závislý od rôznych faktorov zahŕňajúcich aktivitu využitej zlúčeniny, vek, telesnú hmotnosť, celkový zdravotný stav, pohlavie, stravu, čas podávania, rýchlosť vylučovania, kombináciu liečiva, a úsudok lekára a závažnosť ochorenia, ktoré sa lieči. Množstvo aktívnej zložky môže tiež závisieť od liečebného alebo profylaktického činidla, s ktorým sa zložka • ···· ·· ·· ·· ··· ···· ··· • ··· · · · · · • · · · · ··· ··· ··· ·· ···· ·· ··· podáva.
Dávkovanie a interval dávok zlúčenín podlá predloženého vynálezu účinné pri prevencii, potlačení alebo inhibícii bunkovej adhézie, bude závisieť od rôznych faktorov, ako je povaha inhibítora, veľkosť pacienta, cieľ liečby, povaha ochorenia, ktoré sa lieči, konkrétny použitý farmaceutický prostriedok, a úsudok lekára. Vhodné je dávkovanie množstva v rozsahu 0,001 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, výhodne v rozsahu 0,01 až 50 mg/kg telesnej hmotnosti za deň a výhodnejšie asi 10 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, aktívnej zložky zlúčeniny podľa predloženého vynálezu.
Na použitie ako prostriedku na vnútrožilové podávanie je vhodné dávkovanie 0,001 mg až 25 mg/kg, výhodnejšie asi 0,01 mg/kg až 1 mg/kg.
V súlade s iným uskutočnením, prostriedky, ktoré obsahujú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu, môžu tiež obsahovať ďalšie činidlá vybrané zo skupiny obsahujúcej kortikosteroidy, bronchodilatátory, antiastmatiká (bunkové stabilizátory), protizápalové látky, antireumatiká, imunosupresíva, antimetabolity, imunomodulátory, antipsoriatiká a anatidiabetiká. Špecifické zlúčeniny z týchto tried sa môžu vybrať zo zlúčenín, uvedených pod vhodným názvom v Comprehensive Medicinal Chemistry, Pergamon Press, Oxford, England, str. 970-986 (1991), čo je tu uvedené ako odkaz. Okrem tejto skupiny môžu prostriedky obsahovať zlúčeniny ako sú teofylín, sulfasalazín a aminosalicyláty (protizápalové látky); cyklosporín, FK-506, a rapamycin (imunosupresívum); cyklofosfamid a metotrexát (antimetaboliká); steroidy (inhalačné, orálne a miestne podávanie) a interferóny (imunomodulátory) . Ďalej sa zlúčeniny podľa predloženého vynálezu môžu podávať spolu s ďalšími inhibítormi bunkovej adhézie. Keď sa v kombinácii s nárokovanými inhibítormi VLA-4 podáva jedno alebo viac ďalších činidiel, aktívne zložky sa môžu formulovať spolu alebo alternatívne sa môžu podávať v kombinácii. Podávanie jed20 • ···· ·· ·· • · · · · · · • ··· · · · ·· • · · • · • · · · ·· ···· • · · ·· ··· ného alebo viacerých aktívnych činidiel v kombinácii s inhibítormi VLA-4 podľa vynálezu môže byť v podstate súčasné alebo poscupné. Odborník pracujúci v tejto oblasti môže ľahko určiť najvhodnejší spôsob aplikácie v závislosti od činidla, ktoré sa má podávať, požadovaného výsledku a pacienta a ochorenia, ktoré sa má liečiť.
V súlade s inými uskutočneniami, predložený vynález poskytuje spôsoby prevencie, inhibície alebo potlačenia zápalov spojených s bunkovou adhéziou a imunitnými alebo autoimunitnými reakciami spojenými s bunkovou adhéziou. Bunková adhézia spojená s VLA-4 hrá kľúčovú úlohu pri rôznych zápaloch, imunitných a autoimunitných ochoreniach. Inhibícia bunkovej adhézie pomocou zlúčenín podľa predloženého vynálezu sa môže využiť pri spôsoboch liečenia alebo prevencie zápalových, imunitných alebo autoimunitných ochorení. Výhodne sú ochorenia, ktoré sa majú liečiť pomocou spôsobov podľa predloženého vynálezu vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa astmu, artritídu, alergie, syndróm dýchacieho stresu u dospelých, kardiovaskulárne ochorenie, trombózu alebo škodlivú agregáciu krvných doštičiek, odmietnutie transplantátu, neoplastické ochorenia, psoriázu, sklerózu multiplex, diabetes a zápalové črevné ochorenie.
Tieto spôsoby môžu využiť zlúčeniny podľa predloženého vynálezu pri monoterapii alebo v spojení s protizápalovými alebo imunosupresívnymi činidlami. Takéto kombinované liečenie zahŕňa podávanie činidla v jednotlivej dávkovej forme alebo vo viacnásobných dávkových formách podávaných v rovnakom čase alebo v rôznych časoch.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava oMePUPA-V oMePUPA-V, čo je (R)-N- [[4-[[(2-metylfenylamino)karbonyl]···· ··
··· • e «· • · · • · · 4 · 4 • · · 9 · ·· • 4 ·9 9 9
9999 99999 amino]fenyl]acetyl]-L-prolyl-3-metyl-p-alanín, sa pripraví pomocou postupnej syntézy z komerčne vyrábaného Boe-(L)-prolínu (Boc-Pro-OSu; Bachem) a hemisulfátu (R)-benzyl-3-aminobutyrátu (Celgene Corp.). Východiskové látky sa kondenzujú v dichlórmetáne v prítomnosti trietylaminu, potom sa pomocou 4N roztoku kyseliny chlorovodíkovej v dioxáne hydrolyzuje skupina Boe a získa sa hydrochlorid, ktorý sa rekryštalizuje zo zmesi dichlórmetánu a dietyléteru. Pomocou kondenzácie hydrochloridu so sukcínimidyl-2-[4-[2-(metylfenylaminokarbonyl)]aminofenylacetátom (MPUPA-OSu), pripraveným zo zodpovedajúcej kyseliny, MPUPA-OH (Ricerca, Inc.), sa získa kryštalický oMePUPA-V-benzylester, ktorý sa katalytický hydrogenuje (10% paládium na uhlí) v zmesi tetrahydrofuránu a vody (9:1) a získa sa oMePUPA-V. Výsledný produkt sa po rekryštalizácii z 20% vodného acetónu získa vo forme bielej pevnej látky.
Súhrn fyzikálnych vlastností:
Chemický názov: (R)-N- [[4-[[(2-metylfenylamino)karbonyl]amino]fenyl]acetyl]-L-prolyl-3-metyl^-alanin,
Súhrnný vzorec: C25H30N4O5 Molárna hmotnosť: 466,53 Vzhľad: čisto biely prášok Teplota topenia: 153,6-154,4°C.
Schéma 1:
Príprava MPUPA-OSu (2) z MPUPA-OH (1)
--0C,*CH3CN·· QlnanCTt0SU ru O n 2. HOSu, TEA, -60°, 0.5 h I M H 3 1 potom t.t., 2 hod. CH3 2
Schéma 2:
Syntéza oMePUPA-V (8) z Boe-(L)-Pro-OSu (3) a hemisulfátu benzyl- (R) -3-aminobutyrátu (4)
• • · • ···· • ··· • • · • · • · • · · ·· • · • • • · • · • · • · · • • · • •
• ·· · • ··· • · ·· • ···· • · ·· ·· ·
N HCI/ dioxán
r.t.. 2 h
92% (2 kroky)
1. H2/10% Pd, 10% vod. THF
380 kPa, t.t., 25 h., 87 % 2· rekryštalizácxa z
20% vod. acetónu 84 *
Syntéza oMePUPA-V
Syntetický postup, ktorý sa použije na prípravu oMePUPA-V, je opísaný v schémach 1 a 2. Východiskové látky sa získajú z komerčne dostupných látok: zlúčenina (1) sa pripraví vo veľkom množstve spoločnosťou Ricerca, Inc., Painesville, OH; zlúčenina (3) sa získa od spoločnosti Bachem Bioscience, Inc., King of Prusia, PA a zlúčenina (4) od spoločnosti Celgene Corp., Warren, NJ.
Príprava oMePUPA-V:
Všeobecné analytické postupy (XH NMR, 13C NMR, HS, IČ a HPLC) XH NMR sa meria buď na prístroji Bruker AC 300 alebo Varian 500 alebo Varian 600 a vzorky sa analyzujú buď v perdeuterodime tylsulfoxide a vzťahujú sa na perdeuterodimetylsulfoxid (δ
2,49 ppm) alebo v deuterochloroforme a vzťahujú sa na zvyšný
• · • · ·
• · • · • ·
• • · •
• • ♦ · •
• • · •
···· ·· • · ·
• ···· ·· ·· · · · : ···..: :
• · · · ······ ·· chloroform (δ 7,24 ppm).
13C NMR sa meria buď na pristrojí Varian 500 alebo Varian 600 a vzorky sa merajú buď v perdeuterodimetylsulfoxide a vzťahujú sa na perdeuterodimetylsulfoxid (δ 40,5 ppm) alebo v deuterochloroforme a vzťahujú sa na deuterochloroform (δ 77,0 ppm).
Hmotr.ostné spektrá sa merajú na spektrometri VG Platform LC-MS-DS Mass Spectrometer Systém s automatickým samplerom Hewlett Packard Model 1500 AutoSampler a údaje sa spracujú pomocou Fisons VG MassLynx Mass Spectrometer Workstation. HRMS sa uskutočňuje na M-Scan (PA) s použitím ostreľovania rýchlymi atómami (FAB) na hmotnostnom spektrometri VG Analytical ZAB 2SE vzhľadom na SOP# MS-002, MS-006, MS-012 a MS-023. Na generovanie iónov na získanie hmotnostného spektra, ktoré sa zaznamená pomocou pristroja PDP-11-250J, sa použije ostreľovanie iónmi cézia.
IČ spektrá sa merajú na prístroji Perkin Elmer 1600 Šerieš FTIR.
Analytická vysokotlaková chromatografia (HPLC) sa uskutočňuje nasledujúcim spôsobom:
1. Chromatogramy s použitím programu 1 (Equilibrate @ 20% B, nástrek vzorky, 20% B (1 min.), 20% až 70% B (24 min.), 70%-100% B (70 min.) sa získajú pomocou autosamplera Perkin Elmer Šerieš 200 HPLC s detektorom Perkin Elmer 785A UV (nastavené na 214 nm) a detektorom Applied Biosystems 783A UV (nastavené na 254 nm) s PE Nelson 1020 integrátorom. Uvádzajú sa len údaje o percentách plochy.
2. Chromatogramy s použitím programu 8 (Equilibrate @ 15% B, nástrek vzorky, 15% B (1 min.), 15%-40% B (25 min.), 40% B (10 min.) sa získajú pomocou Applied Biosystems 400 Solvent Delivery Systém pri vlnovej dĺžke 783 A na UV detektori s použitím autosamplera Waters 717. Údaje sa spracujú pomocou integrátora Hew• · lett Packard 3396 Šerieš II. Integrátor sa nastaví na nasledujúce parametre: tlmenie = 8, základná línia = 5, odmietnutá plocha = 10000, šírka piku = 0,04, rýchlosť záznamu = 2.
Každá HPLC sa uskutočňuje s použitím kolóny Vydac C-18 (veľkosť pórov 5 μ, 4,5 mm x 25 cm, kat. #218TP54).
Rozpúšťadlo A (voda + 0,1% kyseliny trifluóroctovej)
Rozpúšťadlo B (acetonitril + 0,1% kyseliny trifluóroctovej)
Prietok = 1 ml/min..
Použijú sa nasledujúce gradienty:
Program 1: Equilibrate @ 20% B, nástrek vzorky, 20% B (2 min.), 20% až 70% B (25 min.), 100% B (5 min.).
Fyzikálne údaje pre [4-[[[(2-metylfenyl)amino]karbonyl]amino]fenyl] octovú kyselinu (1, MPUPA-OH: látka vyrobená spoločnosťou Ricerca Inc.):
teplota topenia 210-215°C (rozklad);
IČ (KBr) 3295 (široký pás), 3034 (široký pás), 1707, 1637, 1603, 1551, 1516, 1457, 1414, 1302, 1241, 1189, 1118 cm'1;
NMR (600 MHz, perdeuterodimetylsulfoxid) δ 12,28 (šs, 1H), 9,0 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,88 (d, J=7,8Hz, 1H) , 7,43 (d, J=8,4Hz,
2H), 7,19 (d, J=8,4Hz, 2H) , 7,16 (m, 2H), 6,94 (dd, J=7,8,
8,4Hz, 1H), 3,51 (s, 2H), 2,25 (s, 3H);
13C NMR (150 MHz, perdeuterodimetylsulfoxid) δ 173,0 (C), 152,7 (C), 138,5 (C), 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 128,3 (CH),
127,5 (CH), 126,2 (CH), 122,7 (CH), 121,0 (CH), 118,1 (CH), 40,1 (CH2), 17,9 (CH3) ;
HS (El) m/z 285 (M+l)+ 193, 152, 134, 132, 109, 108, 106, 93, 91, 57;
Elementárna analýza pre Ci6Hi6N2O3: vypočítané C 67,59; H 5,67; N 9,85; nájdené: C 67,60; H 5,70; N 10,01.
Príprava sukcínimidyl [4-[[[(2-metylfenyl)amino]karbonyl]amino]-
• · · · • · φφφ · φ φφφ φφφ φ φ φφ fenyl]acetátu (2, MPUPA-OSu)
K vriacej suspenzii 150 g o-metylfenylureafenyloctovej kyseliny (1, MPUPA-OH; 0,501 mol; od Ricerca, Inc.) v 600 ml acetonitrilu (600 ml) sa v priebehu 10 minút za energického miešania pridá 41 ml (0,558 mol) tionylchloridu. Uvoľní sa veľké množstvo chlorovodíka. Reakčná zmes sa za neustáleho miešania v priebehu
1,5 hodiny ochladí na teplotu miestnosti. Reakčná zmes prejde na ružovú suspenziu, ku ktorej sa naraz pridá 75,5 g (0,636 mol) N-hydroxysukcínimidu (HOSu). K tejto zmesi sa v priebehu 30 minút pri teplote, ktorá sa pomocou vodného kúpeľa udržiava pod 60°C, prikvapká 174 ml trietylamínu. Miešanie pokračuje 2 hodiny a potom sa k reakčnej zmesi pridá destilovaná voda. Pevná látka sa odfiltruje a premyje 2 litrami destilovanej vody a dvakrát 200 ml acetonitrilu, suší sa na vzduchu a potom sa suší nad P2O5 za vákua (asi 13,3 Pa) a získa sa 175 g (výťažok 97%) surového produktu vo forme béžového prášku. 174 g surového produktu sa rekryštalizuje z 3,5 litra acetonitrilu s 10 g aktívneho uhlia a získa sa 129 g MPUPA-OSu (2; výťažok 68%) vo forme bieleho prášku (čistota viac ako 99%).
Teplota topenia: 211,2-211,8°C;
IČ (KBr): 3905-3203 (široký pás), 1816, 1783, 1654, 1368, 1304, 1244, 1116, 1021 cm'1;
ΧΗ NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 9,04 (s, 1H) , 7,92 (s, 1H) , 7,82 (d, 1H), 7,44 (d, J=8,5Hz, 2H), 7,24 (d, j=8,5Hz, 2H), 7,15 (m, 2H), 6,93 (dd, J=7,4, 7,3Hz, 1H) , 4,02 (s, 2H) , 2,80 (s, 4H) , 2,23 (s, 3H);
HS (El, ES+) m/z 382 [(M+l)+], 239, 108, 106.
Fyzikálne údaje pre sukcínimidyl Boe(L)-prolín (Boc-Pro-OSu; 3; látka získaná od Bachem Bioscience):
Teplota topenia: 132 - 136°C;
IČ (KBr) 3456, 2940, 1731, 1619, 1561, 1541, 1497, 1454, 1395,
1337, 1259, 1202, 1118, 1060 cm1;
...... · • · · · ?
...... ;
• · · · · ·· ···· ·· ·
J=3,8, 8,7Hz,
2,32 (m, 1H), • ···· ·· · : ···;
······ XH NMR (300 MHz, deuterochloroform) δ 4,51 (dd, 1H), 3,56 (m, 1H) , 3,44 (m, 1H) , 2,80 (s, 4H) ,
2,27 (m, 1H), 1,94 (m, 2H), 1,43 (s, 9H) ;
HS (El) m/z 335 (M+N2)+ 279, 213, 138, 114, 86;
HPLC 97,1%,
Fyzikálne údaje pre hemisulfát benzyl-(R)-3-aminobutyrátu (4; látka získaná od Celgene Corp.):
teplota topenia 249,4 - 249,8°C;
IČ (KBr) 3515, 3383, 2989, 2945, 2880, 1821, 1788, 1744, 1701,
1476, 1454, 1421, 1394, 1368, 1260, 1241, 1202, 1159, 1077 cm'1;
NMR (300 MHz, deuterochloroform) δ 7,85 (šs, 2H) , 7,26 (s,
5H), 5,06 (ABkv, J=12,3Hz, 2H) , 4,35 (m, 2H), 3,73 (m, 1H), 2,92 (dd, J=6,4, 17,1Hz, 1H) , 2,66 (dd, J=6,4, 17,0Hz, 1H), 1,35 (d, J=6,5Hz, 3H);
HS (El) m/z 195 (M+3)+, 194 (M+2)+, 106, 92, 91;
HPLC 99,0%.
Príprava benzylesteru N-(terc-butoxykarbonyl)-L-prolyl-3-metyl-(R)-β-alaninu (5)
K dobre miešanej suspenzii 66,7 g hemisulfátu benzyl-R-3-aminobutyrátu (4; 213 mmol) v 200 ml dichlórmetánu sa pridá
53,9 g Boe-(L)-Pro-OSu (3; 222 mmol) a 95 ml (681 mol) trietylaminu. Reakčná zmes sa nechá miešať 2 hodiny pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa extrahuje medzi 1,5 litra etylacetátu a 250 ml vody a organická vrstva sa premyje trikrát 250 ml 10% kyseliny citrónovej, 250 ml vody, 250 ml nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 250 ml vody a trikrát 250 ml soľanky, suší sa nad síranom sodným a odparí sa najskôr na rotačnej vákuovej odparke (40°C, 10,7 kPa) a potom za vysokého vákua (teplota miestnosti, 16 hodín; 26,7 Pa) a získa sa 88,1 g medziproduktu 5 vo forme viskózneho oleja, ktorý obsahuje zvyšky etylacetátu a dichlórmetánu (podlá NMR) a má čistotu vyššiu ako ·· ··
98% (HPLC). Táto látka sa použije bez čistenia v ďalšej reakcii.
XH NMR (300 MHz, deuterochloroform) δ 7,30 (m, 5H) , 6,44 (šs,
IH) , 5,10 (dd, J=12,3, 14,1Hz, 2H) , 4,32 (m, IH) , 4,13 (m, IH) , 3,34 (šs, 2H), 2,48 (d, J=5,lHz, 2H) , 2,1 (m,2H), 1,75 (šs, 2H), 1,40 (s, 9H), 1,17 (d, J=6,0Hz, 3H);
HS (EI) : m/z [M+Na]+ 313, 291, 191, 194, 165, 91.
Príprava hydrochloridu benzylesteru L-prolyl-3-metyl-(R)-β-alaní nu (6)
K medziproduktu 5 z predchádzajúcej reakcie sa postupne pridá 240 ml roztoku 4N kyseliny chlorovodíkovej v dioxáne. Dochádza k silnému uvoľňovaniu plynu (pozor exotermický). Reakčná zmes sa nechá miešať 2 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa odparí najskôr na rotačnej odparke (45°C, 10,7 kPa) a potom cez noc za vysokého vákua (teplota miestnosti, 14 hodín, 26,7 Pa) a získa sa mimoriadne viskózna látka, ktorá sa kryštalizuje zo zmesi dichlormetánu a éteru (600 ml/700 ml) a získa sa 64,0 g (celkový výťažok po dvoch krokoch 92%) hydrochloridu 6 vo forme bielej pevnej látky (HPLC čistota 99,6%).
Teplota topenia: 119,8-120,5°C
IČ KBr): 3217, 3072, 2904, 2756, 1736, 1681, 1560, 1446, 1387, 1352, 1295, 1244, 1178, 1096 cm-1;
1H NMR (500 MHz, deuterochloroform) δ 10,21 (šs, IH), 8,71 (d,
J=8,0Hz, IH) , 7,77 (šs, IH) , 7,24 (m, 5H) , 5,00 (s, 2H) , 4,52 (šs, IH), 4,22 (t, J=6,5Hz, IH) , 3,33 (šs, 2H) , 2,67 (dd, J=5,5, 15,5Hz, IH), 2,44 (m, 2H), 1,89 (m, 3H), 1,15 (d, J=6,5Hz, 3H);
13C NMR (125 MHz, deuterochloroform) δ 171,03 (C=O), 167,67 (C=O), 135,58 (C), 128,43 (CH), 128,13 (CH), 128,06 (CH), 66,34 (CH2), 59,71 (CH), 46, 55 (CH2) , 43, 34 (CH), 40,42 (CH2) , 30,50 (CH2), 24,23 (CH2), 19,92 (CH3) ;
HS (EI) m/z 291 [M-C1]+ 199, 194, 160, 139, 92, 91;
Elementárna analýza pre CieHz3N2O3Cl: vypočítané C 58,80; H 7,094;
····
N 8,57; nájdené: C 58,95; H 6,99; N 8,46.
Príprava benzylesteru N- [[4-[[(2-metylfenylamino)karbonyl]amino]fenyl]acetyl]-L-prolyl-3-metyl-(R)-β-alaninu (7)
K roztoku 61,77 g hydrochloridu 6 (189 mmól) v 125 ml dimetylformamidu sa pridá 69,39 g MPUPA-OSu (2; 181,9 mmól) a potom 90 ml trietylamínu (pH 10). Reakčná zmes sa nechá miešať 3,5 hodiny a potom sa zriedi 1 litrom etylacetátu a trikrát sa extrahuje 250 ml vody. Teraz sa začne zrážať produkt. K organickej vrstve sa pridá 250 ml 10% roztoku kyseliny citrónovej (pozor exotermický) a po pretrepani vznikne veľké množstvo zrazeniny. Pevná látka sa odfiltruje na frite (2 L, M). Pevná látka sa premyje dvakrát 250 ml 10% kyseliny citrónovej, 250 ml vody, dvakrát 250 ml nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 250 ml vody a trikrát 250 ml solanky a potom sa za sania suší na lieviku (asi 10,7 kPa) cez noc (asi 14 hodín) a získa sa belavá pevná látka, ktorá sa rekryštalizuje zo zmesi tetrahydrofuránu a dietyléteru (1 liter/1,4 litra) a získa sa 83,3 g zlúčeniny 7 (HPLC čistota 99,6%) vo forme bielej pevnej látky.
Filtrát sa potom trikrát premyje 250 ml 10% kyseliny citrónovej, 250 ml vody, dvakrát 250 ml nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 250 ml vody a trikrát 250 ml solanky. Pri každom ďalšom premytí vodným roztokom sa zráža ďalšia zlúčenina; premývanie pokračovalo a dávalo sa pozor, aby sa nestrácala zrazenina. Po filtrácii sa získa 4,02 g produktu vo forme bielej pevnej látky. Filtrát sa nakoniec zriedi 1 1 éteru, filtruje sa a premyje sa trikrát 100 ml dietyléteru a získa sa ďalších 1,67 g bielej pevnej látky. Celkový výťažok tejto reakcie je 88%.
Teplota topenia: 153-153,5°C
IČ (KBr) 3342, 3307, 3119, 2966, 1737, 1702, 1643, 1590, 1543,
1514, 1455, 1414, 1308, 1238, 1179 cm-1;
1H NMR (500 MHz, DMSO-dg) : zmes rotamérov 3:2 (piky prevládajúcej konformácie): δ 9,00 (šs, 1H) , 7,91 (šs, 1H) , 7,84 (d, J=8,3Hz,
1H) , 7,68 (d, J=8,3Hz, 1H), 7,40-7,28 (m, 7H), 7,13 (3H), 7,06
(d, J=8,8Hz, 1H), 6,92 (t, J=7,3Hz, 1H), 5,06 (AB kv, J=12,2Hz,
Dn=8,9Hz, 2H), 4,18 (dd, J=3,4, 8,8Hz, 1H) , 4,10 (kvintet,
J=6,8Hz, 1H) , 3,57 (m, 2H) , 3,50-3,22 (m, 3H), 2,62-2,37 (m,
2H), 2,23 (s, 3H) , 2,18-1,68 (m, 3H) , 1,05 (d, J=6,8Hz, 3H) a
(piky minoritnej konformácie) : δ 9,00 ( šs, 1H), 7,91 (šs, 1H),
7,84 (d, J=8,3Hz, 1H), 8,15 (d, J=8,3Hz, 1H) , 7,40-7,28 (m, 7H) ,
7,13 (3H), 7,06 1 (d, J=8,8Hz, 1H) , 6,92 (t, J=7,3Hz, 1H), 5,01
(ABkv, J=12,2Hz, Dn=19,0Hz, 2H), 4,32 (dd, J=2,4, 8,8Hz, 1H) ,
4,22 (kvintet, J= ‘6,8Hz, 1H), 3,57 (m, 2H) , 3,50-3,22 (m, 3H) ,
2, 62-2,37 (m, 2H) , 2,23 (s, 3H) , 2,18- -1,68 (m, 3H) , 1,10 (d,
J=6,8Hz, 3H);
13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) : zmes rotamérov, (piky prevládajúcej
konformácie): δ 170,80 (0= Ό), 170,52 (0=0), 169,18 (C=O), 152,61
(0=0), 138,10 (C), 137,38 (C), 136,04 (C) , 130,05 (CH), 129,63
(CH), 129,47 (CH) , 128,58 (C), 128,28 (CH) , 127,89 (CH), 127,85
(C), 126,02 (CH) , 122,50 (CH), 117,90 (CH) , 117,81 (CH), 65,44
(CH2), 59,61 (CH) , 47,04 (CH2), 41,75 (CH) , 40,41 (CH2), 40,00
(CH2), 29,29 (CH2) , 24,13 (CH2) , 19,88 (CH3), 17,78 (CH3) a (piky
minoritnej konformácie): δ 170,94 (0=0), 170,52 (C=O), 169,31
(C=O), 152,61 (C=O), 138,10 (C), 137,38 (C), 136,04 (C), 130,05
(CH) , 129,63 (CH) , 129,47 (CH) , 128,65 (C), 128,28 (CH), 127,89
(CH), 127,85 (C), 126,02 (CH) , 120,940 (CH), 117,90 (CH), 117,81
(CH) , 65,44 (CH2) , 59, 91 (CH) , 46, 51 (CH2), 42,01 (CH) , 40,13
(CH2) , 39, 84 (CH2) , 31,75 (CH2) , . 22,11 (CH2), 20,05 (CH3), 17,78
(CH3) ;
HS (EI) m/z 579 [M+Na]+ 557, 454, 426, 357, 336, 293, 267, 201;
Elementárna analýza pre C32H36N4O5: vypočítané C 69, 05; H 6,52;
N 10,07; nájdené: C 68,87; H 6,52; N 9,93.
Príprava N-[[4-[[(2-metylfenylamino)karbonyl]amino]fenyl]acetyl]-L-prolyl-3-metyl-(R)-β-alanín (8; oMePUPA-V)
Roztok 80,18 g oMePUPA-V-OBn (7) v 800 ml zmesi tetrahydrofuránu a vody (9:1) sa hydrogenuje pri tlaku vodíka 0,38 MPa v prítomnosti 2,44 g 10% paládia na uhlí. Po 25 hodinách sa reakčná zmes filtruje cez Solka Floc® (144 g; Fiber Sales & Development Corp.) na lieviku s fritou. Filtrát sa potom znova filtruje cez ďalšie lôžko zo Solka Floc® (115 g), odparí sa asi na 250 ml a postupne sa naleje do 3 litrov dobre miešaného toluénu. Suspenzia sa nechá miešať 0,5 hodiny, filtruje sa cez 2 1 lievik s kremelinou a získaný biely prášok sa nechá sušiť najskôr na lieviku za sania (10,7 kPa; 0,5 hodiny) a potom vo vákuovej sušiarni (14 hodín; 45°C; tlak upravený na 3,33 kPa za prietoku dusíka). 3iele hrudky sa rozdrvia (trecia miska s tíčikom) na jemný prášok a získa sa 58,3 g (výťažok 87%) oMePUPA-V vo forme bielej pevnej látky. Produkt sa rekryštalizuje zo zmesi acetónu a vody (320 ml/75 ml) . Kryštály sa odfiltrujú a sušia sa najskôr na lieviku s fritou za sania (1 hodina, 107 kPa) a potom vo vákuovej sušiarni (25 hodín; 45°C, tlak upravený na 3,33 kPa pomocou prietoku dusíka) a získa sa 47,0 g (84% po kryštalizácii) oMePUPA-V vo forme bielej pevnej látky (HPLC čistota 99,1%), teplota topenia 153,6-154,4°C;
IČ (KBr) 3354, 3307, 1719, 1643, 1590, 1543, 1514, 1449, 1414,
1308, 1237 cm1;
:H NMR (600 MHz, DMSO-d6) : zmes rotamérov 3:2 (piky pre prevládajúcu konformáciu) : δ 12,21 (šs, 1H) , 8,99 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,87 (d, J=8,2Hz, 1H) , 7,68 (d, J=7,9Hz, 1H) , 7,40 (d, J=8,6Hz,
2H), 7,17 (d, J=5,9Hz, 2H) , 7,15 (d, J=7,6Hz, 1H) , 7,12 (dd,
J=7,9, 8,2Hz, 1H), 6,94 (dd, J=7,3, 7,3Hz, 1H), 4,22 (dd, J=3,3,
8,8Hz, 1H), 4,06 (m, J=6,6Hz, 1H) , 3,47 (dd, 1H) , 3,44 (d, J=15,0Hz, 1H), 3,37 (dd, 1H) , 3,29 (d, J=15,4Hz, 1H) , 2,46 (dd, 1H), 2,27 (m, 1H), 2,25 (s, 3H) , 1,99 (m, 1H) , 1,80 (m, 1H) ,
1,78 (m, 1H) , 1,76 (m, 1H) , 1,07 (d, J=6,6Hz, 3H) a (piky pre minoritnú konformáciu): Ô 12,21 (šs, 1H), 8,99 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,87 (d, J=8,2Hz, 1H) , 8,12 (d, J=8,2Hz, 1H) , 7,40 (d,
J=8,6Hz, 2H), 7,16 (d, J=5,9Hz, 2H), 7,15 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,12
(dd, J=7,9, 8,2Hz, 1H) , 6,94 (dd, J=7,3, 7,3Hz, 1H) , 4,34 (dd,
J=l,8, 8,4Hz, 1H), 4,18 (m, J=6,6Hz, 1H), 3,60 (m, 2H), 3,59 (m, 1H), 3,48 (m, 1H), 2,47 (dd, J=6, 6, 15,4Hz, 1H), 2,40 (dd, J=6,6, 15,4Hz, 1H), 2,25 (s, 3H) , 2,15 (m, 1H) , 1,83 (m, 1H) ,
1,91 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,12 (d, J=6,6Hz, 3H) ;
δ prevládajúcu konformáciu):
59,7
137,5 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) (piky pre
172,4
(C=O), 170,9 (C=O), 169,3 (C=O), 152,6 (C=O), 138,2 (C) ,
(C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 129 ,6 (CH), 128,7 (C) , 127,4
126,1 (CH), 122,6 (CH), 120,9 (CH) , 118,0 (CH) , 117,9 (CH),
(CH), 46,6 (CH2), 41,7 (CH2) , 40, 6 (CH2), 40,2 (CH2) , 29,4
piky pre minoritnú (CH2) konformáciu: δ 172,5 (C=O), 171,0 (C=O), 160,5 (C=O), 152,7 (C=O), 138,19 (C), 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 129,6 (CH), 128,8 (C), 127,4 (C), 126,1 (CH), 122,6 (CH), 120,9 (CH), 118,0 (CH), 117,9 (CH), 59,9 (CH), 47,1 (CH2) , 42,0 (CH2) , 39,8 (CH2), 40,3 (CH2), 31,8 (CH2) , 24,2 (CH2) , 20,2 (CH3) , 17,9 (CH3) ;
HS (El) m/z 468 [M+H]+, 336, 267, 137;
Elementárna analýza pre C25H3oN4Os: vypočítané: C 64,36; H 6,48; N 12,01; nájdené: C 64,07; H 6,40; N 11,85.
Príklad 2
Aktivita na ovčom modeli alergického zápalu plúc
Použijú sa alergické ovce s hmotnosťou 27 až 50 kg.
U všetkých oviec sa najskôr preukázal vývoj ako skorej, tak neskorej bronchiálnej odozvy na rozprašovaný alergén Ascaris suum. Ovce boli pri vedomí a držali sa v upravenom nákupnom vozíku v polohe ležmo s imobilizovanou hlavou. Po miestnej anestézii nosnej dutiny 2% lidokaínom sa cez nozdry zavedie balónový katéter do dolnej časti pažeráka. Zvieratá sa intubujú upevnenou endotracheálnou trubicou cez druhú nozdru s použitím flexibilného bronchoskopu z optických vlákien ako vodiča. Všetky postupy použité pri tejto štúdii sú odsúhlasené Mount Sinai Medical Center Animal Research Committee, ktorý je zodpovedný za zabezpečenie humánneho zaobchádzania a použitia pokusných zvierat.
···· ·· ·· ·· • ···· ··· ··· · · · · · • · · · · · ··· ·· ···· ·· ·
Pleurálny tlak sa upraví s použitím ezofagiálneho balónového katétra (naplneného 1 ml vzduchu) , ktorý sa umiestni 5 až 10 cm od gastroezofageálneho spojenia. V tejto polohe sa koncový expiračný pleurálny tlak pohybuje v rozsahu -2 až -5 cm H2O. Akonáhle sa balón umiestni, zabezpečí sa, aby zostal v rovnakej polohe v priebehu celého pokusu. Laterálny tlak v dýchacej trubici sa meria katétrom s postranným otvorom (vnútorný priemer 2,5 mm) zavedeným cez endotracheálnu trubicu a umiestneným distálne na koniec endotracheálnej trubice.
Tracheálne a pleurálne tlakové katétre sa pripoja k diferenciálnemu meniču tlaku (MP45, Validyne, Northridge, CA) na meranie transpulmonárneho tlaku, ktorý sa definuje ako rozdiel medzi tracheálnym a pleurálnym tlakom. Prietok vzduchu sa meria pripojením proximálneho konca endotracheálnej trubice k pneumotachografu (Fleisch, Dyňa Science, Inc., Blue Beli, PA). Signály transpulmonárneho tlaku a prietoku sa zaznamenávajú na multikanálovom fyziologickom záznamovom zariadení, ktoré je pripojené na osobný počítač 80-386 DOS pre on line výpočet strednej rezistencie prietoku pľúcami (RL) pomocou delenia zmeny transpulmonárneho tlaku zmenou toku stredného objemu nádychu (získanom digitálnou integráciou). Na získanie RL v cmH2O/l/sek. sa použije priemer najmenej 5 dychov, bez hltacieho artefaktu. Ihneď po meraní Rl sa meria hrudný objem plynu (Vtg) v telovom pletyzmografe s konštantným objemom a získa sa špecifická rezistencia pľúc (SRL = RL x Vtg) v L x cmH2O/l/sek. .
Všetky kvapalne dávkované aerosóly sa generujú s použitím lekárskeho vzduchového nebulizátora (Raindrop®, Puritán Bennett, Lenexa, KS) , ktorý poskytuje aerosol so stredným aerodynamickým priemerom 3,2 pm, čo sa určí pomocou Andersenovho kaskádového impaktora. Nebulizátor sa pripojí k dozimetrickému systému, skladajúcemu sa zo solenoidového ventilu a zdroja stlačeného vzduchu (137,9 kPa). Výstup z nebulizátora vedie do plastového kusa v tvare T, ktorého jeden koniec je pripojený k vdychovému • ···· ·· ·· ·· · ··· ···· ···· • ··· · · · · · · • ···· ···· · • ···· ··· ··· ··· ·· ···· ·· ··· portu piestového respirátora (Harvard Apparatus, S. Natic, MA) . Solenoidový ventil sa aktivuje na jednu sekundu na začiatku vdychovacieho cyklu respirátora. Aerosol sa doručuje v respiračnom objeme 500 ml a pri počte 20 vdychov za minútu. Na hodnotenie bronchiálnej citlivosti sa vytvoria kumulatívne krivky odozvy na koncentráciu karbacholu pomocou merania SRL ihneď po vdýchnutí pufra a po každom následnom podaní 10 vdychov zvyšujúcej sa koncentrácie karbacholu (0,25, 0,5, 1,0, 2,0 a
4,0 % hmotnosť/objem v pufrovanom fyziologickom roztoku). Test dráždivosti sa skončí, keď SRl vzrastie nad 400% vzhľadom na hodnotu po podaní fyziologického roztoku alebo po podaní najvyššej koncentrácie karbacholu. Bronchiálna citlivosť sa hodnotí určením kumulatívnej koncentrácie karbacholu (v dychovej jednotke), ktorá zvýši SRL o 400% vzhľadom na hodnotu po podaní fyziologického roztoku (PC4Oo) pomocou interpolácie krivky odozvy na dávku. Jedna dychová jednotka (BU) sa definuje ako jeden vdych 1% (hmotn./obj.) rozprašovaného roztoku karbacholu.
Dávky oMePUPA-V sa rozpustia buď v zmesi etanolu a normálneho fyziologického roztoku 1:2, v zmesi etanolu a 200 mM fosforečnanu sodného 1:5 alebo pufra Tris. Keď sa použije Tris, pripraví sa akékoľvek požadované zriedenie s použitím normálneho fyziologického roztoku. Dávky sa pripravia v celkovom objeme 3 až 5 ml.
Pri všetkých štúdiách sa základná línia citlivosti dýchacích ciest (to znamená PC4oo) určí tri až štyri dni pred začiatkom štúdie. Pri predbežnej štúdii s jednou dávkou sa odmeria SRL a zvieratá sa liečia zlúčeninou alebo vehikulom. SRL sa meria 2 hodiny po liečbe (tesne pred stimuláciou) a potom sa zvieratá stimulujú alergénom. Pri štúdii s viacerými dávkami, začínajúcej 4 dni pred stimuláciou alergénom, sa zvieratá liečia raz denne počas 4 dní a stimulujú sa alergénom 24 hodín po poslednej dávke. SRl sa meria pred a po poslednej dávke zlúčeniny alebo vehikula. Pri všetkých štúdiách sa SRĽ odmeria ihneď po stimulácii alergénom, po hodine 1 až 6 hodín po stimulácii a po pol hodine
• · ·· ···· • · ··
6,5 až 8 hodín po stimulácii alergénom. Určenie citlivosti dýchacích ciest (PC400) po stimulácii sa uskutoční 24 hodín po stimulácii alergénom.
Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± smerodajná odchýlka priemeru. Zmena SRl sa vypočíta na každú ovcu ako rozdiel vzhľadom na základnú líniu SRĽ pred testom. Zmeny SRL po stimulácii sa charakterizujú pomocou skorej odozvy dýchacích ciest (EAR), ktorá sa vyvinie v čase v rozsahu 0 až 4 hodín. Potom nasleduje neskorá odozva dýchacích ciest (LAR), ktorá sa vyvinie asi 4 až 8 hodín po stimulácii alergénom. Plochy pod EAR a LAR krivkami sa vypočítajú na každé zviera s použitím lichobežníkového pravidla. Významné zníženie plochy pod krivkami EAR a LAR vzhľadom na kontrolu placebom sa považuje za terapeutický účinok na zmenu SRl vyvolanú alergénom. Citlivosť dýchacích ciest na karbachol (PC400) testovaná pred a 24 hodín po stimulácii alergénom, sa vyjadrí ako pomer PC400 (hodnota PC400 po/pred stimuláciou) na každú ovcu. Významné zvýšenie pomeru PC400 vzhľadom na kontrolu placebom sa považuje za terapeutický účinok. Porovnanie s kontrolou placebom sa uskutočňovalo s použitím jednofaktovej analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval Dunnettov test (jednostranný) na viacnásobné porovnanie s kontrolou. Porovnania, ktoré vedú k p<0,05 sa považujú za štatisticky významné.
Obr. 1 ukazuje inhibičnú odozvu na dávku oMePUPA-V vo forme aerosólu u oviec senzibilizovaných Ascaris suum 2 hodiny po dávkovaní. Ľavý panel ukazuje zmenu špecifickej rezistencie pľúc SRl, cm HsO/sek.. Pravé panely ukazujú citlivosť dýchacích ciest na inhalovaný karbachol (pomer PC400, pred/po stimulácii) zistenú 24 hodín po stimulácii. oMePUPA-V pri dávkach 0,01 až 0,03 mg nevykazuje skorú alebo neskorú odozvu dýchacích ciest alebo nemení precitlivenosť na karbachol 24 hodín po stimulácii alergénom. Dávky 0,1, 1 a 3 mg inhibujú skorú odozvu dýchacích ciest a maximálne inhibujú neskorú odozvu dýchacích ciest. Tieto dávky tiež inhibujú precitlivenosť na karbachol 24 hodín po stimulácii • ···· ·· ·· ·· ··· · · · · · · · • ··· · · · · · • · · · · · · ·· ···· ·· ··· alergénom. Štatistická analýza týchto údajov je uvedená v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Liečba Dávka (mg) Vehikulum n EAR (ASRLxh) LAR (ASRLxh) PC400 (po/pred)
Dávka 2 hodiny pred stimuláciou alergénom
PBS 12 5,85+0,62 4,85±0,69 0,49±0,03
OMePUPA-V 0,01 EtOH:NS 2 6,87±0,05 5,11±1,46 0,44±0,04
0,03 EtOH:NS 2 10,62±3,91 3,98±0,23 0,43±0,00
0,10 EtOH:NS 4 2,54±0,74* 0,67±0,17* 0,18±0,11*
1,00 EtOH:PBS 2 2,14+0,70 0,27±0,34* 1,05±0,11*
3,00 EtOH:PBS 2 2,47+0,62 0,68±0,07* l,07±0,08*
= p<0,05 v porovnaní s PBS kontrolou, jednofaktorová analýza rozptylu, nasledovaná Dunnettovým testom na viacnásobné porovnanie s kontrolnou skupinou. Ukazuje štatisticky významný pokles EAR alebo LAR alebo významný vzrast pomeru PC400 vzhľadom na kontrolnú skupinu PBS.
Ovce prirodzene citlivé na Ascaris suum sa stimulujú aerosólom alergénu Ascaris suum 2 hodiny po podaní aerosólu oMePUPA-V v uvedených dávkach alebo 24 hodín po poslednej dávke oMePUPA-V opakovaného podávania dávky počas štyroch dní, ktorá bola nižšia, ako je základná línia alebo podávania ekvivalentného množstva PBS. Činnosť pľúc, označená ako zmena špecifickej rezistencie dýchacích ciest vzhľadom na hodnotu základnej línie pred štúdiou, sa meria 8 hodín po stimulácii alergénom. Skorá odozva dýchacích ciest (0-4 hodiny, EAR) a neskorá odozva dýchacích ciest (4-8 hodín, LAR) sa vyjadrí ako priemerná plocha pod Δ krivky špecifickej rezistencie pľúc vzhľadom na čas ± smerodajná odchýlka priemeru. Rezistencia dýchacích ciest na inhalovaný karbachol sa určí pred začiatkom štúdie a 24 hodín po stimulácii alergénom. Citlivosť dýchacích ciest sa uvádza ako pomer PC400 (množstvo karbacholu potrebného na zvýšenie rezistencie o 400%) porovnaním hodnôt pred a po stimulácii.
• ···· ·· ·· ·· ··· ···· · · · • ··· · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · ··· ··· ·· ···· ·· ·
Dráždivosť pri jednej dávke
Žiadna z dávok oMePUPA-V použitých v skôr uvedenej štúdii nemá dráždivý účinok, čo je zrejmé z toho, že nedochádza k zmene rezistencie dýchacích ciest vzhľadom na základnú líniu rezistencie po stimulácii alergénom Ascaris suum. Výsledky sú uvedené na obr. 2.
Štúdie pri opakovaných dávkach
Obr. 3 ilustruje, že 0,03 mg dávka oMePUPA-V, ktorá sa ukázala ako neúčinná, keď sa použije pri jednodávkovom predbežnom liečení, je však účinná, keď sa podáva raz denne počas 4 dní, keď sa stimulácia antigénom uskutoční 24 hodín po poslednej dávke. Horné a dolné ľavé panely ukazujú, že tento účinok bol zrejmý pri použití dvoch rôznych formulácií. Precitlivenosť na karbachol po ďalších 24 hodinách bola tiež maximálne inhibovaná, čo je zrejmé z horného a dolného pravého panela na obrázku 3. Ochranný účinok oMePUPA-V bol významný proti EAR a LAR a proti precitlivenosti na karbachol a kvantitatívna analýza je uvedená v tabuľke 3.
Výsledky tejto štúdie ukazujú, že jednotlivé predbežné liečenie malou molekulou inhibítora VLA, oMePUPA-V, vo forme aerosólu môže chrániť proti skorej a neskorej odozve dýchacích ciest vyvolanej alergénom a AHR po dráždení alergénom na modeli alergických oviec. Pri akýchkoľvek dávkach oMePUPA-V podávaných jednotlivo pri predbežnom liečení nedochádza k žiadnemu dráždivému účinku na dýchacie cesty. Výsledky tiež ukázali, že účinná dávka oMePUPA-V sa môže znížiť pri viacnásobnej liečbe. Spoločne tieto údaje poskytujú jasný dôkaz toho, že adhézna dráha VLA-4 hrá rozhodujúcu úlohu v patofyziologických indikátoroch (LAR a AHR) dlhších zápalových stavov, ktoré sú vyvolané v dýchacích cestách alergických oviec po podráždení alergénom.
• ···· ·· ·· ·· · ··· ···· · · ·· • ··· · · · · · · • ···· ···· · • ···· · · · ··· ··· ·· ···· ·· ···
Tabuľka 3
Liečba Dávka (mg) Vehikulum n EAR (ASRLxh) LAR (ASRLxh) PC4Q0 (po/pred)
Dávka raz denne počas 4 dní, stimulácia alergénom 24 hodín po poslednej dávke
PBS 8 4,33±0,81 4,96±0,40 0,38±0,03
oMePUPA-V 0,03 EtOH:NS 4 l,53±0,34* 0,59±0,16* l,06±0,04*
0,03 Tris:NS 4 1,40+0, 35* 0,02+0,06* 1, 04±0,04*
* = p<0,05 v porovnaní s PBS kontrolou, jednofaktorová analýza rozptylu, nasledovaná Dunnettovým testom na viacnásobné porovnanie s kontrolnou skupinou. Ukazuje štatisticky významný pokles EAR alebo LAR alebo významný vzrast pomeru PC400 vzhľadom na kontrolnú skupinu PBS.
Ovce, prirodzene citlivé na Ascaris suum, sa stimulujú aerosólom alergénu Ascaris suum 24 hodín po poslednej dávke pri opakovanom dennom podávaní nižšej dávky oMePUPA-V , ako je základná línia, alebo ekvivalentného množstva PBS počas 4 dní. Pľúcna mechanika, označená ako zmena špecifickej rezistencie dýchacích ciest vzhľadom na hodnotu základnej línie pred štúdiou, sa meria 8 hodín po stimulácii alergénom. Skorá odozva dýchacích ciest (0-4 hodiny, EAR) a neskorá odozva dýchacích ciest (4-8 hodín, LAR) sa vyjadrí ako priemerná plocha pod krivkou špecifickej rezistencie pľúc vzhľadom na čas ± smerodajná odchýlka priemeru. Rezistencia dýchacích ciest k inhalovanému karbacholu sa určí pred začiatkom štúdie a 24 hodín po stimulácii alergénom. Citlivosť dýchacích ciest sa uvádza ako pomer PC400 (množstvo karbacholu potrebného na zvýšenie rezistencie o 400%) porovnaním hodnôt pred a po stimulácii.
Príklad 3
Aktivita na modeli precitlivenosti oneskoreného typu
Štúdie na modeli červených krviniek oviec
Na všetky pokusy sa použijú samice špecifického druhu myší ···· ·· ·· ·· · • · · · · ···· ··· · · · · · · ···· ···· · • · · · · · · ··· ·· ···· ·· ···
Balb/c bez patogénu vo veku 8 až 10 týždňov od Jackson Labs. Zvieratá sa kŕmia a napájajú podľa chuti. Bunky červených krviniek oviec (sRBC) v roztoku Alsever z rovnakej ovce sa získavajú týždenne z Charles River Pharm. Services (Southbridge, MA). sRBC sa peletujú odstredením pri 1000 g počas 10 minút pri 4°C a akýkoľvek viditeľný povlak sa odstráni. Bunky sa potom premyjú fyziologickým roztokom. Bunková peleta sa suspenduje vo fyziologickom roztoku a odpočíta sa s použitím hemocytometra. Bunky sa zriedia vo fosfátovom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) na 2xl08 sRBC na ml. V dni 0 sa myši senzibilizujú pomocou
s.c. injekcie 2xl07 sRBC v 100 μΐ PBS. Na piaty deň sa sRBC pripraví rovnako, ako je uvedené skôr, ale zriedi sa v PBS na výslednú koncentráciu 4xl09 sRBC na ml. Z tohto preparátu sa 25 μΐ injektuje s.c. do chodidla pravej zadnej končatiny.
Na enterálne podávanie zlúčeniny sa oMePUPA-V (Lot# 2770-029) formuluje vo vehikule obsahujúcom 60% PEG 400 v 0,02M TRIS a získa sa zásobný roztok s koncentráciou 5 mg/ml. Vo vehikule obsahujúcom PEG/TRIS sa pripravia vhodné zriedenia a podávajú sa enterálne v objeme 100 μΐ. Anti-VLA-4 protilátka (PS/2) sa zriedi vo fyziologickom roztoku pri koncentrácii 4,3 mg/kg a podáva sa intraperitoneálne v objeme 100 μΐ. Všetky liečivá sa podávajú ihneď po stimulácii sRBC.
Opuch nestimulovanej (ľavej) kontrolnej končatiny a stimulovanej (pravej) zadnej končatiny sa meria s použitím posuvného meradla cd Mitutoyo (Model #304-196, Dyer, Lancaster, PA) 20 hodín po stimulácii končatiny. Údaje sú vyjadrené ako zmena hrúbky chodidla, ktorá sa určí odpočítaním hrúbky ľavej zadnej končatiny a pravej zadnej končatiny. Zmeny v hrúbke chodidla sa porovnajú s použitím obojstranného Študentovho t-testu.
Anti-VLA-4 protilátka PS/2 pri dávke 4,3 mg/kg intraperitoneálne inhibuje opuch asi na 30%, zatiaľ čo oMePUPA-V podávaná enterálne pri dávke 20 mg/kg je na tomto modeli bez účinku (úda• ···· ·· ·· ·· · ··· · · · · ···· • ··· · · · · · · : ·*···**··· ··· ··· ·· ···· ·· ··· je nie sú uvedené) . Študovala sa účinnosť oMePUPA-V podávanej pri dávke 20 mg/kg enterálnym spôsobom na DTH modeli indukovanom sRBC u myší a nezistil sa žiadny účinok.
Príklad 4
Aktivita na modeli precitlivenosti oneskoreného typu
Na všetky štúdie sa použijú dvadsaťgramové samice myší Balb/c bez vírusu (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) umiestnené po štyroch na jednu klietku v mikroizolovaných klietkach v zariadení bez vírusov Biogen a dostávajú podía chuti krmivo pre myši a majú k dispozícii kohútik s vodou. Myši sa anestetizujú zmesou ketamín:xylazín (90:10 mg/kg, i.p.). 3 cm2 kože na bruchu sa oholia a koža sa omyje 70% etanolom. Na holé miesto sa jednotne aplikuje 25 μΐ 0,5% DNFB v zmesi 4:1 objemovo, acetónu a olivového oleja ako vehikula. Koža sa ľahko poškrabe koncom pipety, čím sa vyvolá ľahký zápal. Myš sa položí naznak do svojej klietky a nechá sa zotaviť z anestézie. O 24 hodín neskôr po úvodnej senzibilizácii sa myši znova senzibilizujú 25 μΐ 0,5% DNFB vo vehikule na rovnakom mieste na koži na bruchu, znova nasleduje ľahké poškrabanie so špičkou pipety. Pri druhej senzibilizácii sa myši neanestetizujú. Na piaty deň (asi 120 hodín po prvej senzibilizácii) sa na stimuláciu imunitnej odozvy použije podiritujúca dávka senzibilizátora (0,2% DNFB v zmesi 4:1 (objemovo) acetónu a olivového oleja ako vehikula). Myši sa anestetizujú zmesou 90:10 mg/kg ketamínu : xylazínu i.p. a na chrbtovú stranu ľavého ucha sa aplikuje 10 μΐ 0,2% DNFB. Na pravé ucho sa rovnakým spôsobom aplikuje zmes 4:1 objemovo acetónu a olivového oleja ako vehikula. V priebehu nasledujúcich 24 hodín sa vyvinie dvojfázová odozva opuchu ucha, čo je uvedené na obrázku 4. 24 hodín po stimulácii sa myši znova anestetizujú zmesou ketamínu a xylazínu a odmeria sa im pomocou posuvného meradla hrúbka obidvoch uší s presnosťou na 10’4 palca (0,000254 cm).
Orálne sa pomocou sondy 4 hodiny po stimulácii imunitnej • ···· ·· ·· ·· ·· · · · · · ··· • ··· · · · · · • · · · · · · ·· ···· · · · · · odozvy na piaty deň podávajú zlúčeniny (100 μΐ) alebo vhodné vehikulum (dimetylsulfoxid [DMSO] v izotonickom fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku [PBS], 100 μΐ) . Na každý test sa použije skupina 8 myší. oMePUPA-V (číslo šarže 2044-076) sa rozpustí v destilovanej vode pridaním 0,5% fosforečnanu sodného ako pufra, pH 8,8 a 3% dimetylsulfoxidu. Opuch ucha na každú myš sa vypočíta ako rozdiel medzi hrúbkou ucha stimulovaného vehikulom a DNFB 24 hodín po stimulácii. Typický opuch ucha indukovaný DNFB je 65-75xl0-4 palca. Inhibícia opuchu ucha sa určí porovnaním liečenej skupiny so skupinou ošetrenou vehikulom. Štatistický význam rozdielu medzi liečenými skupinami sa hodnotí s použitím jednofaktorovej analýzy rozptylu, po ktorej nasleduje Dunnettov test na viacnásobné porovnanie s kontrolnou skupinou (Systat, SPSS Inc.) s použitím p<0,05. Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± smerodajná odchýlka priemeru (SEM).
Obr. 4 porovnáva opuch ucha meraný 24 hodín po stimulácii DNFB u myší, ktoré dostali vehikulum (DMSO, PBS), pozitívnu kontrolnú zlúčeninu (podávanú pri 0,03 μg/kg) alebo 0,03 alebo 0,3 mg/kg oMePUPA-V, podávanej enterálne 4 hodiny po DMFB stimulácii (horný panel). Percentuálna inhibícia spôsobená liečbou je uvedená na dolnom paneli. Obidve dávky oMePUPA-V významne inhibujú opuch ucha v podobnom rozsahu, ako je to pri pozitívnej kontrolnej zlúčenine.
Jedna enterálna dávka 0,03 alebo 0,3 mg/kg oMePUPA-V podaná 4 hodiny po stimulácii DNFB môže významne inhibovať opuch ucha na modeli kontaktnej precitlivenosti u myši.
Príklad 5
Biochémia
5.1. Afinita receptora oMePUPA-V meraná pomocou konjugátu VCAM-Ig alkalickej fosfatázy pri teste priamej väzby VCAM-Ig (DBA)
VCAM-Ig sa pripraví a čistí podlá postupu opísaného • ···· ·· ·· ·· · ··· ···· · · ·· Λ 1 · ··· , · · · · · , ··}······ • ···· · · · ······ ·· ···· ·· ··· v (Jakubowski, A., a kol. Celí Adhesion and Communication 3:131-142, 1995). Konjugácia na teľaciu intestinálnu fosfatázu (s cieľom štiepenia chromogénneho substrátu) sa uskutoční podľa postupu v Lobb R.R. a kol., Celí Adhesion and Communication 3:385-397, 1995). Väzba na VLA sa testuje na bunkovom kmeni ľudských buniek T, Jurkat (α4β1). VCAM-Ig-AP a oMePUPA-V súťažia o väzbu na α4β1 na povrchu týchto buniek v prítomnosti 1 mM Mn2+.
Pri teste priamej väzby VCAM-Ig oMePUPA-V súťaží s VCAM-Ig-AP o väzbu k Jurkatovým bunkám v prítomnosti 1 mM chloridu manganatého v závislosti od koncentrácie pri IC50 8 ± 1 nM (n=9) . Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.
5.2 Afinita receptora oMePUPA-V meraná pomocou konjugátu VCAM-Ig alkalickej fosfatázy pri purifikovanom VLA-4 proteín/proteínovom teste
VLA-4 sa purifikuje z detergenčného extraktu vysoko exprimujúceho subklonu buniek K562 transfekovaných oc4 pomocou protilátkovej afinitnej chromatografie a imobilizuje sa na mikrotitračné jamky, čím sa pripraví test kompetitívnej väzby proteín/proteín. VCAM-Ig-AP sa viaže na doštičku potiahnutú purifikovaným VLA-4 v neprítomnosti alebo prítomnosti oMePUPA-V (Lot #2) a 1 mM MnC12- Doštičky sa odpočítajú pri 405 nm a údaje sa analyzujú s použitím software SoftMax v. 2,32.
Väzba konjugátu VCAM-Ig na purifikovaný VLA-4 sa celkom blokuje špecifickou neutralizáciou anti-a4 monoklonálnej protilátky (HP1/2). Dve IC50 získané pre oMePUPA-V pri teste VLA-4 proteín/proteín sú uvedené v tabuľke 4 rovnako ako hodnoty IC50 získané na Jurkatových bunkách z testu kompetitívnej väzby VCAM-Ig- -AP a testu bunkovej adhézie CS1.
5.3. Afinita receptora oMePUPA-V testovaná pri teste adhézie buniek CS-1
a. Adhézia Jurkatových buniek na konjugát CS1/BSA ···· ·· ·· ·· • 9 · · · · · · ··· 9 · · · ·
Peptid NH2-cystein-tyrozín-CS-l sa syntetizuje a kondenzuje k BSA-SMCC (SMCC je heterobifunkčné zosieťovadlo, ktoré reaguje s voľnými aminoskupinami na BSA a samotnom cysteíne syntetického peptidu) na CS1/BSA v pomere 10:1. Jamky sa cez noc potiahnu 100 μΐ konjugátu zriedeného na výslednú koncentráciu 1 μg/ml. Ďalší deň sa jamky blokujú BSA v PBS jednu hodinu a potom sa trikrát premyjú.
Bunkový kmeň ľudských T buniek, Jurkatove bunky, sa označuje 2 μΜ BCECF-AM (fluorescenčné farbivo (2', 7'-bis (2-karboxyetyl)-5 a
6)karboxyfluoresceínacetoxymetylester (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon; katal. číslo #B-1150)), ktoré sa zabuduje a deesterifikuje tak miesta väzby farbiva živými bunkami. Jurkatove bunky (lxlO5 buniek/jamka) v pufri obsahujúcom 1 mM Mn2+ sa pridajú k potiahnutým doštičkám v prítomnosti trojnásobných sériových zriedení inhibítora. Každá koncentrácia sa testuje duplicitne. Po 30 minútach pri teplote miestnosti sa doštičky prevrátia a premyjú sa trikrát, alebo pokiaľ na kontrolných jamkách potiahnutých samotným BSA nie sú prilepené žiadne bunky. CSl-adherentné bunky sa kvantifikujú vo fluorescenčnom zariadení Cytofluór na odčítanie doštičiek s použitím excitačnej vlnovej dĺžky 485 nm a emisnej vlnovej dĺžky 530 nm.
Bunky priliehajúce na CS1/BSA v neprítomnosti zlúčeniny slúžia ako kontrola s inhibíciou 0%, zatiaľ čo bunky priliehajúce na samotný BSA slúžia ako kontrola so 100% inhibíciou. IC50 sa vypočítajú s použitím software Deltagraph, verzia 5.
Adhézia označených Jurkatových buniek v prítomnosti Mn2+ sa úplne blokuje EDTA a neutralizuje anti-a4pi mAb, HP1/2, čo potvrdzuje, že väzba je špecifická. Tabuľka 4 obsahuje aktivitu oMePUPA-V pri teste adhézie CS1/BSA a tiež výsledky testu väzby.
oMePUPA-V je účinným antagonistom VLA-4 v pufri obsahujúcom
Mn . Pri teste vážnosti je osemdesiatkrát účinnejší, keď sa testuje v prítomnosti Mn2+ na izolovaných VLA-4, ako na Jurkato• B
BB B B 8 B B B BB • ··· · · B BB
B B B · · BB
BBB BBB BB BBBB BB B vých bunkách. oMePUPA-V je funkčným antagonistom, čo je viditeľné z jeho schopnosti blokovať v závislosti od dávky a úplne adhéziu Jurkatových buniek na CS1. Absolútne hodnoty pri adhéznom teste sú vyššie, ako hodnoty pozorované pri teste vážnosti. Môže to byť spôsobené multivalentnou povahou adhézie. Pri akomkoľvek formáte testu inhibícia väzby s EDTA a HP1/2 demonštruje špecifickú väzbu na VLA-4.
Tabuľka 4
Afinita receptora oMePUPA-V v prítomnosti 1 mM MnCl2 podľa kompetitivneho väzbového testu VCAM-Ig, testu bunkovej adhézie CS1 a testu purifikovaného VLA-4 proteínu/proteínu
IC50 ± SD [nM]
Test oMePUPA-V
Väzba Jurkatovej bunky VCAM-IG 8 ± 1 (n=9)
Adhézia Jurkatovej bunky CS1 22 ± 2 (n=4)
Väzba purifikovaného VLA-4 VCAM-Ig 0,1 (n=l) (0,1, 0,1)
6.4. Špecifickosť inhibície oMePUPA-V
a. Špecifickosť oMePUPA-V sa testuje pomocou buniek JY pri teste priamej väzby VCAM-Ig a adhéznom teste CS1
Väzba α4β7 sa testuje na bunkách JY v prítomnosti Mn2+. Pri väzbovom teste VCAM-Ig a oMePUPA-V súťažia o väzbu k α4β7 na bunkách JY (postup testu pozri oddiel 4.1.1.). Pri teste adhézie bunrek sa testuje schopnosť oMePUPA-V blokovať JY (α4β7) väzbu buniek ku konjugátu CS1/BSA.
oMePĽPA-V neblokuje väzbu α4β7 k VCAM-Ig alebo CS1/BSA. Αηίί-β7 Mab, Fib27 (Pharmingen), inhibuje tieto interakcie úplne, čo naznačuje, že väzba bola α4β7 špecifická. Preto oMePUPA-V je špecifickým inhibítorom VLA-4. Výsledky sú uvedené v tabuľke 5.
b. Špecifickosť oMePUPA-V, ktorá sa testuje pomocou adhézie buniek K562 k jamkám potiahnutých Fn-120 ·· ·· ··
Neošetrené 96 jamkové polystyrénové doštičky s plochým dnom sa cez noc pri 4°C potiahnu 5 gg/ml Fn-120. Doštičky sa dvakrát premyjú fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS) a blokujú sa 1 hodinu pri teplote miestnosti 1% bovinným sérovým albumínom (BSA). Doštičky sa dvakrát premyjú pufrom TBS obsahujúcim 1 mM MnCl2+ (testový pufor). Bunky K562 sa označia 2 μΜ fluorescenčného farbiva, BCECF-AM (pozri oddiel 4.1.3.) a 30 minút sa pri teplote miestnosti viažu na doštičku. Doštičky sa prevrátia a trikrát sa premyjú a vo fluorescenčnom zariadení na odčítanie doštičiek Cytofluór sa kvantifikujú adherentné bunky s použitím excitačnej vlnovej dĺžky 485 nm a emisnej vlnovej dĺžky 530 nm.
Adhézia K562 k Fn-120 sa úplne blokuje neutralizáciou anti-a5 protilátky, IIA1 (Pharmingen), čo naznačuje špecifickú väzbu cez VLA-5. K inhibícii väzby buniek K562 k Fn 120K fragmentu oMePUPA-V nedochádza pri dávkach 100 μΜ. Pozri tabuľka 5 ďalej.
c. Test zhlukovania pomocou ktorého sa zisťuje špecifickosť oMePUPA-V
Spôsoby
Aktivita proti gpllbllla sa testuje pomocou štandardného zhlukovania krvných doštičiek s použitím plazmy bohatej na krvné doštičky. Na vyvolanie zhlukovania sa použije ADP v prítomnosti plazmy, kde sú Ca2+ a Mg2+ hlavnými dvoj väzbovými katiónmi. Ako pozitívna kontrola sa použije GRGDSP @ 100 μg/ml.
Výsledky oMePUPA-V sa testuje pri troch dávkach 1, 10 a 100 μΜ. Neinhibuje zhlukovanie krvných doštičiek vyvolané ADP v žiadnej dávke. Výsledky sú uvedené v tabuľke 5. oMePUPA-V je veľmi (>10000 krát) špecifický pre VLA-4. Nevyskytuje sa žiadna merateľná aktivita (>100 μΜ) proti príbuzným integrínom α4β7 a VLA-5 ···· ·· • ···· · · · · ·· · · · t · · ···· ···· · • · · · » · · ··· ·· ···· ·· ··· ·· alebo proti integrinu β3, gpllbllla.
Tabulka 5
Inhibičná aktivita oMePUPA-V podlá testu kompetitivnej väzby α4β7 VCAM-Ig, adhéznych testov α4β7 a VLA-5 a štúdie zhlukovania krvných doštičiek
Bunkový kmeň Ligand Dvojväzbový katión oMePUPA-V [nM] ic50±sd
JY α4β7 VCAM-Ig DBA Mn2+ 3% inhibícia @ 100 μΜ (n=3)
JY α4β7 CS1/BSA adhézia Mn2+ žiadna @ 100 μΜ (n=4) inhibícia
K562 (VLA-5) Fn-120 adhézia Mnz+ žiadna @ 100 μΜ (n=3) inhibícia
doštičky (IlblIIa) zhlukovanie fibrinogénu Ca2+/Mn2+ žiadna @ 100 μΜ (n=l) inhibícia
Príklad 6
Test oMePUPA-V pre LIBS indukciu
6.1. Meranie na Jurkatových bunkách s použitím LIBS protilátky 9EG7
a. Indukcia LIBS pomocou antagonistov α4β1 sa testuje in vitro pomocou analýzy FACS. Jurkatove bunky (2xl05/jamka) sa preinkubujú pri 37°C 20 minút s fyziologickým roztokom pufrovaným TRIS obsahujúcim 2 mM MgC12 (Mg2+-TBS) samotného alebo zo sérií zriedení testovanej zlúčeniny. Vzorky sa prevedú do ľadového kúpeľa a doplnia sa LIBS protilátkou, 9EG7, pri výslednej
O l koncentrácii 10 μg/ml. Bunky sa dvakrát premyjú Mg -TBS a suspendujú sa v zriedení 1:200 kozieho antipotkanového IgG konjugovaného s FITC v Mg2+-TBS a inkubujú sa 30 minút pri 4°C. Bunky sa dvakrát premyjú a resuspendujú sa v Mg2+-TBS. Pomocou FACS analýzy (Becton Dickinson FACScan) sa určí priemerná intenzita fluorescencie (MFI). Výsledky sú vyjadrené ako MFI. Údaje sa analyzujú pomocou software Microsoft Excel verzia 5.0
• · · ·· ···· ·· · a Deltagraph verzia 4.0.
Obr. 5 ukazuje, že oMePUPA-V indukoval expozíciu epitopu LIBS v porovnaní s pufrom 2 mM Mg2+ (panel B) . Indukcia bola závislá od koncentrácie a mala podobnú magnitúdu, ako indukcia pozorovaná s 1 mM Mn2+ (panel A) . Vynechanie LIBS protilátky a detekcia protilátky alebo vynechanie detekcie protilátky samotnej eliminuje značenie (panel B) . Hodnoty ED50 odozvy sú 20 nM.
Záver
Tieto údaje ukazujú, že oMePUPA-V indukuje rovnakú konformačnú zmenu u VLA-4, akú je možné pozorovať s natívnymi ligandami. Hodnoty LIBS všeobecne spadajú do rozsahu definovaného testu väzby a adhézie, ktoré sú 8 nM a 22 nM, v tomto poradí, pre oMePUPA-V.
6.2. Panel receptorov z rôznych druhov
a. Afinita receptora oMePUPA-V podľa testu priamej väzby VCAM-Ig s použitím konjugátu VCAM-Ig alkalickej fosfatázy a lymfocytov periférnej krvi alebo buniek sleziny od rôznych druhov
PBL sa izolujú z periférnej krvi človeka, oviec a psov pomocou spôsobov opísaných pre PBL oviec (Abraham W.M. a kol., J. Clin. Invest., 93: 776-787, 1991). Na porovnanie väzby oMePUPA-V k týmto rôznym typom buniek sa použije kompetitivny väzbový test VCAM-Ig-AP.
Hodnoty IC50 získané pre oMePUPA-V na lymfocytoch periférnej krvi alebo bunkách sleziny od rôznych druhov v prítomnosti Mn2+ sú uvedené v tabuľke 6. V prítomnosti Mn2+ inhibuje oMePUPA-V pri podobnom IC50 väzbu VCAM-Ig k lymfocytom získaným od človeka, krýs, psov, oviec a myší. Neexistuje teda žiadny dôkaz špecifickosti k druhom. Tento výsledok je v sújade s vysokým stupňom konzervácie sekvencie pozorovaným medzi druhmi pre VLA-4 a jeho prirodzené ligandy, CS-1 a VCAM.
···· ·· • ···· · · · ··· · · · · · • · · · · · ··· ·· ···· ·· ·
Tabuľka 6
Afinita receptora oMePUPA-V podľa kompetitivneho väzbového testu VCAM-Ig s použitím konjugátu VCAM-Ig alkalickej fosfatázy a lymfocytov periférnej krvi alebo buniek sleziny od rôznych druhov
Druhy Zdroj Dvojväzbový katión IC50 [nM]
Človek PBL Mn2+ 6 ± 1 (n=3)
Ovca PBL Mn2+ 3 ± 1 (n=3)
Ošípaná PBL Mn2+ 13 ± 2 (n=3)
Myš splenocyty Mn2+ 4 ± 2 (n=4)
Krysa splenocyty Mn2+ 5 ± 1 (n=3)
Príklad 7
Kinetika receptora oMePUPA-V
7.1. Kompetičný test pomocou 3H-známeho inhibitora ako sondy
Jurkatove bunky sa udržujú v médiu RPMI-1640 plus 10% fetálnom bovinnom sére pri 37°C v tkanivovom kultivačnom inkubátore. Na väzbové štúdie sa bunky peletujú odstredenim, dvakrát sa premyjú TBS (50 mM Tris HC1, 150 mM NaCl, 0,1% bovinný sérový albumín, 2 mM glukózy, 10 mM HEPES pH 7,4), suspendujú sa asi pri 2xl06 buniek/ml v TBS a spočítajú sa s použitím Neubauerovho hemocytometra. Bunky sa ďalej zriedia v označených pufroch na l,5xl06/ml a podrobia sa spracovaniu, ktoré je opísané pre každý pokus. Bunky sa potom peletujú odstredenim, resuspendujú sa v
100 μΐ testového pufra a prevedú obsahujúcej 2,9 ml
ScintiVerse II sa do scintilačnej (Fisher Scientific).
nádobky
Rádioaktivita súvisiaca s bunkami sa lačného počítadla.
Počet väzieb kvantifikuje za týchto scintiintegrín, pomocou podmienok meria zlúčeninou, a je ktorý nie je obsadený preto voľný, aby sa viazal na 3H známy inhibítor. Všetky štúdie testovanou sa uskutočňujú v silikonizovanej 1,5 ml eppendorfovej skúmavke pri štandardnom objeme vzorky 1 ml. Nešpecifická väzba 3H-známeho inhibitora k bunkám (pozadie) sa definuje meraním väzby inhibitora v neprítomnosti iónu kovu. Počet špecifických väzieb ·· • ··· ·· ·· ···· ···· • ·· · · · · · · : ·*··· ··· • •••a* aa aaaa aa aaa sa vypočíta odpočítaním nešpecifických väzieb od celkového počtu väzieb.
Séria kompetitívnych štúdií sa uskutočňuje na overenie toho, či oMePUPA-V a známy inhibítor súťažia o rovnaké miesto na VLA-4. Najskôr sa 3H-známy inhibítor zmieša s ekvimolárnym množstvom oMePUPA-V, desaťnásobným prebytkom a stonásobným prebytkom, inkubuje sa s Jurkatovými bunkami a určí sa schopnosť studeného (neznačeného) inhibitora súťažiť o väzbu známeho inhibitora. Ošetrenie oMePUPA-V poskytuje inhibíciu väzby 3H-známeho inhibitora závislú na dávke. Koncentrácia oMePUPA-V, ktorá je potrebná na kompetíciu väzby 3H-známeho inhibitora, je desaťkrát vyššia, ako tá, ktorá bola potrebná, keď sa použil studený inhibítor ako kompetítor, čo zodpovedá jeho nižšej afinite k VLA-4 aktivovanému Mn2+. Po druhé sa Jurkatove bunky aktivované Mn2+ spracujú s 3H-známym inhibitorom, aby sa prvý obsadil VLA-4 rádioaktívnou sondou, a potom sa pridá prebytok studeného oMePUPA-V. Pri následnom spracovaní prebytkom studeného oMePUPA-V alebo známeho inhibitora nebolo možné rozlíšiť schopnosť nahradiť rádioaktívnu sondu. Po tretie sa Jurkatove bunky aktivované Mn2+ spracujú saturačným množstvom oMePUPA-V a meria sa miera, pri ktorej disociuje oMePUPA-V. Na rozdiel od predĺženého polčasu života známeho inhibitora pre VLA-4 aktivovaného Mn2+, sa oMePUPA-V rýchlo uvoľní z oMePUPA-V-VLA-4 pri ti/2 kratšom ako 10 minút. Veľký rozdiel v ti/2 pre oMePUPA-V a známy inhibítor naznačuje, že nižšia afinita oMePUPA-V k VLA-4 je výsledkom jeho vyššej rýchlosti uvoľnenia.
Údaje o disociácii ukazujú, že väzba oMePUPA-V k VLA-4 je veľmi závislá od aktivačného stavu VLA-4 a že vykazuje rovnakú selektivitu pre aktiváciu, ako je tomu u známeho inhibitora. Ako u Mn2+-aktivovaného VLA-4, bol ti/2 disociácie oMePUPA-V z Mn2+-aktivovaného VLA-4 kratší ako 10 minút, čo je najkratší časový úsek, ktorý je možné vyhodnotiť pri kompetitívnom formáte. Na druhej strane v prítomnosti Mg2+ plus aktivačné protilátky, TS2/16, bol ti/2 dlhší (20 minút) . Všetky možné aktivačné stavy ·· • ···· ·· ·· · · · · ···· • ··· « · ·· · • · · · ·· · ··· ··· ·· ···· ·· · sa netestovali podrobne, uskutočnil sa však jednoduchý prehľadný test, ktorý môže rýchlo objasniť rozdiely. Pri tomto teste sa daná koncentrácia oMePUPA-V (10 nM) zmieša s 5 nM 3H-známeho inhibitora a uskutoční sa väzba za týchto podmienok pri rôznych stavoch aktivácie. Keď má oMePUPA-V mimoriadne vysokú alebo nízku afinitu pre VLA-4, je možné tento stav zistiť rozdielom v množstve 3H-známeho inhibitora. Percentuálne rozdiely vo väzbe 3H-známeho inhibitora za rôznych podmienok aktivácie napovedajú, čo je možné odhadnúť na základe známych vlastností inhibitora.
Väzbové štúdie potvrdzujú, že oMePUPA-V súťaží so známym inhrbítorom o väzbu k VLA-4 pri koncentráciách, ktoré zodpovedajú jeho afinite a demonštrujú, že dve zlúčeniny súťažia o rovnaké miesto na integríne. Podobnosť väzby oMePUPA-V a známeho inhibitora pri rôznych stavoch aktivácie VLA-4 napovedá, že mechanizmus väzby je podobný.
7.2. Test oMePUPA-V na paneloch Panlabs a Cerep oMePUPA-V sa testuje na paneloch rádioligandov, enzýmov a funkčných testoch pomocou testovacej súpravy Panlabs ProfilingScreen, DiscoveryScreen a Immunoscreen a pomocou testovacej súpravy na paneli membránového receptora Cerep. Pre oMePUPA-V sa pri 10 μΜ nepozorovala žiadna významná aktivita pri akomkoľvek teste zahŕňajúcom test receptora NK1, zatiaľ čo známe inhibítory vykazujú určitú aktivitu.
Cerep tiež ukazuje, že oMePUPA-V neinhibuje aktivitu ľudskej ACE proteázy. Zdrojom ACE proteáz boli bunky ľudského endotelu (HUVEC). 3H-HGG, pridaný k HUVEC, sa pomocou ACE prevedie na 3H-hipurovú kyselinu a glycylglycín. Captopril, čo je silný inhibítor ACE, blokuje konverziu pri IC50 990 pM, zatiaľ čo oMePUPA-V ju pri 10 μΜ neblokuje.
Farmaceutické vlastnosti:
oMePUPA-V je belavý kryštalický prášok. Je rozpustný v dimetylsulfoxide a má rozpustnosť vo vode 0,120 mg/ml. Správanie sa ···· ·· ·· ·· • ···· ··· ··· · · · · · • · · · · · ··· ·· ···· ·· · oMe?UPA-V za tepla sa študovalo pomocou DSC, TGA a mikroskopie v horúcom stave a zistilo sa, že látka sa topí asi pri 160°C. Podľa DSC a TGA analýzy sa zistilo, že asi pri 136°C oMePUPA-V stráca prchavé nečistoty a pravdepodobne dochádza k dehydratácii monohydrátu.
Formulácie
Nebulizačná formulácia
Ďalej sa opisuje výroba vedúca k 100 ml nebulizačnej formulácii obsahujúcej 5 mg/ml oMePUPA-V.
Pripraví sa 200 ml zásobného pufrovacieho roztoku:
1. Do vhodnej nádoby sa naváži 0,286 g Tromethaminu, USP.
2. Do vhodnej nádoby sa naváži 1,676 g chloridu sodného, USP.
3. Pridá sa 200 ml vody na injekcie, USP.
Zmes sa premieša tak, aby bola homogénna.
1. Do vhodnej nádoby sa naváži 0,500 g oMePUPA-V.
2. Pridá sa 100 ml pufrovacieho roztoku pripraveného v kroku 1.
3. Zmes sa premieša, pokiaľ nie je homogénna.
4. Uskutoční sa sterilná filtrácia do vhodnej nádoby.
5. Uzatvorí sa vhodným uzáverom.
Typické vlastnosti formulácie:
pH: 7,4, osmolalita: 290 mOsm
Príklad 9
Poscup testu stability pomocou HPLC
Kolóna: Zorbax® SB-C18, častica 3 |im, 4,6x150 mm
Ochranná kolóna: Zorbax® SB-C18, častica 5 μιη, 4,6x12,5 mm Prietok: 1 ml/min.
Teplota na kolóne: 40°C
Teplota autosamplera: 4°C
Mobilná fáza :
A: 0,1% (hmotn./objem) kyseliny trifluóroctovej (TFA) vo vode ···· ·· ·· ·· • ···· · · · ··( · · · · « · · · · · ·· ···· ·· ·
B: 0,1% (hmotn./objem) kyseliny trifluóroctovej (TFA) v 90% (objem/objem) acetonitrilu, 10% (objem/objem) vody
Gradient:
Čas (min.) % B
Ô-315
3-18 15 až 100
18-21100
21-2815
Nástrek: 10 μΐ 0,2 mg/ml roztoku v Tris/NaCl/voda (medziprodukt) alebo v 0,1 TFA/45% acetonitril (výsledný produkt)
Detekcia: UV 254 nm (primárna) a 215 nm
Kontrola: oMePUPA-V, zahrieva sa vo vriacej vode 20 minút.
Uskutočnila sa predbežná kvalifikácia.
Stabilita liečebnej látky:
Pri skladovaní medziproduktu vo veľkom objeme počas dvoch týždňov za nasledujúcich podmienok sa neprejavila žiadna degradácia: pri 40°C v uzatvorenej liekovke; pri 50°C v uzatvorenej liekovke; pri 25°C, relatívnej vlhkosti 60%; a pri 40°C, relatívnej vlhkosti 75%. Vo štvrtom týždni sa objavili jeden alebo dva detegovatelné degradačné piky pri 40°C a 50°C, ale hladina nečistôt bola stále nižšia, ako 0,02%.
Stabilita roztoku
a) Nebulizačná formulácia, 5 mg/ml v Tris/NaCl, skladovaná pri teplote miestnosti dva mesiace vykázala včasné eluované degradačné piky v celkovom množstve 1% (pri 254 nm) a 2-3% (pri 215 nm).
b) Zahrievanie nebulizačnej formy vo vriacej vode 20 minút znížilo čistotu z 99,9% na 98,7% pri 254 nm a zo 100% na 93,6% pri 215 nm.
c) Roztok s koncentráciou 0,2 mg/ml v Tris/NaCl/vode pri neutrálnom pH je stabilný pri 2-8°C najmenej jeden týždeň.
• ···· ·· ·· ·· ··· ···· · · · «·»······ ςο · ···· ···· · · · · · · · ··· ··· ·· ···· ·· ·
Odborníkom pracujúcim v tejto oblasti je zrejmé, že je možné vykonať rôzne modifikácie a zmeny v nárokovanom vynáleze, bez toho aby došlo k odchýleniu sa od obsahu vynálezu. Predpokladá sa, že vynález zahŕňa modifikácie a varianty podlá vynálezu s podmienkou, že spadajú do rozsahu pripojených patentových nárokov a ich ekvivalentov.

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Zlúčenina inhibujúca bunkovú adhéziu oMePUPA-V a jej farmaceutický prijateľné estery, soli alebo izoméry.
  2. 2. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 1 a farmaceutický prijateľný nosič.
  3. 3. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 2, vyznačujúca sa t ý m, že ďalej obsahuje druhé činidlo vybrané zo skupiny, ktorú tvoria kortikosteroidy, bronchodilátory, antiastmatiká, protizápalové činidlá, antireumatiká, imunosupresíva, antimetabolity, imunomodulátory, antipsoriatiká a antidiabetiká.
  4. 4. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje inhibičnú zlúčeninu podľa nároku 1 a jednu alebo viac zlúčenín inhibujúcich bunkovú adhéziu.
  5. 5. Kompozícia podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že jednou alebo viacerými zlúčeninami inhibujúcimi bunkovú adhéziu je inhibítor VLA-4.
  6. 6. Spôsob prevencie, inhibície alebo potlačenia bunkovej adhézie u cicavcov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok podávania účinného množstva farmaceutickej kompozície podľa ná54
    • ···· ·· ·· ·· • ·· · • · · · • · • · • ··· • · · • · • • · • · · · • · · • • · • · · • · • ······ ·· ···· ·· ···
    roku 2, tomuto cicavcovi.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa použije na prevenciu, inhibiciu alebo potlačenie zápalu.
  8. 8. Spôsob liečenia astmy, alergickej rhinitidy, sklerózy multiplex, aterosklerózy, zápalového črevného ochorenia alebo mnohonásobného myelómu u cicavca, vyznačuj ú c i sa tým, že sa tomuto cicavcovi podáva terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podľa nároku 1.
  9. 9. Spôsob liečenia sklerózy multiplex u cicavca, vyznačujúci sa tým, že sa tomuto cicavcovi podáva terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podľa nároku 1.
  10. 10. Spôsob liečenia zápalových črevných ochorení u cicavca, vyznačujúci sa tým, že sa tomuto cicavcovi podáva terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podľa nároku 1.
  11. 11. Farmaceutická kompozícia, v y z n a č u úca sa tým, že obsahuje ester zlúčeniny podľa nároku 1.
  12. 12. Kompozícia podľa nároku 11, vyznačujúca sa t ý m, že ester je vybraný z metanolu, etanolu, propanolu, butanolu a alkylalkoholov s priamym alebo rozvetveným reťazcom obsahujúcim 1 až 10 atómov uhlíka.
  13. 13. Spôsob liečenia, prevencie alebo zmiernenia symptómov astmy, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa nároku 1 pacientovi trpiacemu astmou.
SK1810-2000A 1998-05-28 1999-05-28 Inhibítor VLA-4, farmaceutická kompozícia a ich použitie na prípravu liečiva SK285280B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8706498P 1998-05-28 1998-05-28
PCT/US1999/011924 WO1999061421A1 (en) 1998-05-28 1999-05-28 A NOVEL VLA-4 INHIBITOR: oMePUPA-V

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK18102000A3 true SK18102000A3 (sk) 2001-07-10
SK285280B6 SK285280B6 (sk) 2006-10-05

Family

ID=22202907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1810-2000A SK285280B6 (sk) 1998-05-28 1999-05-28 Inhibítor VLA-4, farmaceutická kompozícia a ich použitie na prípravu liečiva

Country Status (31)

Country Link
US (1) US6495525B1 (sk)
EP (1) EP1082302B1 (sk)
JP (1) JP2002516309A (sk)
KR (1) KR100636713B1 (sk)
CN (1) CN1148350C (sk)
AT (1) ATE256659T1 (sk)
AU (1) AU764108B2 (sk)
BG (1) BG65021B1 (sk)
CA (1) CA2333656C (sk)
CZ (1) CZ298413B6 (sk)
DE (1) DE69913687T2 (sk)
DK (1) DK1082302T3 (sk)
EA (1) EA002988B1 (sk)
EE (1) EE04639B1 (sk)
ES (1) ES2211096T3 (sk)
HK (1) HK1035726A1 (sk)
HU (1) HUP0102255A3 (sk)
IL (1) IL139967A (sk)
IS (1) IS5737A (sk)
MX (1) MXPA00011774A (sk)
NO (1) NO317990B1 (sk)
NZ (1) NZ509199A (sk)
PL (1) PL198189B1 (sk)
PT (1) PT1082302E (sk)
SI (1) SI1082302T1 (sk)
SK (1) SK285280B6 (sk)
TR (1) TR200100190T2 (sk)
UA (1) UA65623C2 (sk)
WO (1) WO1999061421A1 (sk)
YU (1) YU75500A (sk)
ZA (1) ZA200007300B (sk)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6645939B1 (en) 1997-11-24 2003-11-11 Merck & Co., Inc. Substituted β-alanine derivatives as cell adhesion inhibitors
JP2001524465A (ja) * 1997-11-24 2001-12-04 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド 細胞接着阻害剤としての置換β−アラニン誘導体
AU757873B2 (en) * 1998-09-14 2003-03-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treating multiple myeloma and myeloma-induced bone resorption using integrin antagonists
US7618630B2 (en) 1998-09-14 2009-11-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treating multiple myeloma and myeloma-induced bone resorption using integrin antagonists
US6525069B1 (en) 1998-12-18 2003-02-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Co. N-ureidoalkyl-piperidines as modulators of chemokine receptor activity
CZ2002518A3 (cs) 1999-08-13 2002-05-15 Biogen, Inc. Inhibitory buněčné adheze a farmaceutické prostředky, které je obsahují
NZ518886A (en) 1999-12-28 2004-02-27 Pfizer Prod Inc Non-peptidyl inhibitors of VLA-4 dependent cell binding useful in treating inflammatory, autoimmune, and respiratory diseases
WO2002053534A1 (fr) 2000-12-28 2002-07-11 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Inhibiteurs de vla-4
ES2382806T3 (es) 2003-07-24 2012-06-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Compuesto ácido ciclohexanocarboxílico
US7419666B1 (en) 2004-02-23 2008-09-02 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Treatment of ocular disorders
US7196112B2 (en) 2004-07-16 2007-03-27 Biogen Idec Ma Inc. Cell adhesion inhibitors
GT200500321A (es) * 2004-11-09 2006-09-04 Compuestos y composiciones como inhibidores de proteina kinase.
US7685367B2 (en) * 2006-03-08 2010-03-23 Microsoft Corporation Multi-cache cooperation for response output caching
MX2009001272A (es) * 2006-08-02 2009-02-11 Genzyme Corp Terapia de combinacion.
CA2714335A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple sclerosis by administration of alpha-fetoprotein in combination with an integrin antagonist
CN102057054B (zh) 2008-04-11 2015-06-10 梅里麦克制药股份有限公司 人血清白蛋白接头以及其结合物
CN102282168A (zh) 2008-11-18 2011-12-14 梅里麦克制药股份有限公司 人血清白蛋白接头以及其结合物
EP3466977B1 (en) 2010-04-16 2022-01-05 Biogen MA Inc. Anti-vla-4 antibodies
US20150202287A1 (en) 2012-08-30 2015-07-23 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
US11174256B2 (en) 2018-10-30 2021-11-16 Gilead Sciences, Inc. Imidazopyridine derivatives
AU2019373242B2 (en) 2018-10-30 2023-07-13 Gilead Sciences, Inc. Compounds for inhibition of alpha 4 beta 7 integrin
WO2020092401A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Gilead Sciences, Inc. COMPOUNDS FOR INHIBITION OF ALPHA 4β7 INTEGRIN
CN112969687A (zh) 2018-10-30 2021-06-15 吉利德科学公司 作为α4β7整合素抑制剂的喹啉衍生物
CA3148613A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Gilead Sciences, Inc. Phenylalanine derived compounds and their use as inhinitors of alpha 4 beta 7 integrin

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1149971B (it) 1979-06-11 1986-12-10 Syntex Inc Derivati nonapeptide e decapeptide dell'ormone che rilascia l'ormone luteinizzante
US4725583A (en) 1985-01-23 1988-02-16 Abbott Laboratories Functionalized peptidylaminoalcohols
US4826815A (en) 1985-05-17 1989-05-02 Abbott Laboratories Renin inhibiting compounds
DK163689A (da) 1988-04-08 1989-10-30 Sandoz Ag Peptidderivater
DK0506748T3 (da) 1989-12-22 1996-01-22 Commw Scient Ind Res Org Aminosyrer, peptider eller derivater deraf bundet til fedtstoffer
CA2043741C (en) 1990-06-07 2003-04-01 Kiyofumi Ishikawa Endothelin antagonistic peptide derivatives
US5192746A (en) 1990-07-09 1993-03-09 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Cyclic cell adhesion modulation compounds
US5260277A (en) * 1990-09-10 1993-11-09 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Guanidinyl and related cell adhesion modulation compounds
WO1992008464A1 (en) 1990-11-15 1992-05-29 Tanabe Seiyaku Co. Ltd. Substituted urea and related cell adhesion modulation compounds
DE69226820T2 (de) 1991-06-21 1999-05-12 Merck & Co Inc Peptidylderivate als Inhibitoren von Interleukin-1B-konvertierenden Enzymen
WO1993008823A1 (en) 1991-11-06 1993-05-13 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Guanidinyl and related cell adhesion modulation compounds
US5352667A (en) 1991-11-22 1994-10-04 Ofer Lider Non-peptidic surrogates of the Arg-Gly-Asp sequence and pharmaceutical compositions comprising them
WO1993012809A1 (en) 1991-12-24 1993-07-08 Fred Hutchinson Cancer Research Center Competitive inhibition of high-avidity alpha4-beta1 receptor using tripeptide ldv
DE4212304A1 (de) 1992-04-13 1993-10-14 Cassella Ag Asparaginsäurederivate, ihre Herstellung und Verwendung
IL102646A (en) 1992-07-26 1996-05-14 Yeda Res & Dev Non-peptidic surrogates of the ldv sequence and pharmaceutical compositions comprising them
JPH08505628A (ja) 1993-01-08 1996-06-18 田辺製薬株式会社 ペプチド型細胞接着阻害薬
US5314902A (en) 1993-01-27 1994-05-24 Monsanto Company Urea derivatives useful as platelet aggregation inhibitors
DE4309867A1 (de) 1993-03-26 1994-09-29 Cassella Ag Neue Harnstoffderivate, ihre Herstellung und Verwendung
US5922755A (en) 1993-04-09 1999-07-13 Toyama Chemical Co., Ltd. Immunomodulator, cell adhesion inhibtor, and agent for treating, and preventing autoimmune diseases
AU693143B2 (en) 1993-12-06 1998-06-25 Cytel Corporation CS-1 peptidomimetics, compositions and methods of using the same
US5770573A (en) 1993-12-06 1998-06-23 Cytel Corporation CS-1 peptidomimetics, compositions and methods of using the same
US5434188A (en) 1994-03-07 1995-07-18 Warner-Lambert Company 1-ether and 1-thioether-naphthalene-2-carboxamides as inhibitors of cell adhesion and as inhibitors of the activation of HIV
US6306840B1 (en) * 1995-01-23 2001-10-23 Biogen, Inc. Cell adhesion inhibitors
US6248713B1 (en) 1995-07-11 2001-06-19 Biogen, Inc. Cell adhesion inhibitors
PL190866B1 (pl) * 1996-07-25 2006-02-28 Biogen Inhibitor adhezji komórek, sposób jego wytwarzania i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna i sposób jej wytwarzania

Also Published As

Publication number Publication date
BG105060A (en) 2001-08-31
PL198189B1 (pl) 2008-06-30
EA002988B1 (ru) 2002-12-26
UA65623C2 (en) 2004-04-15
SK285280B6 (sk) 2006-10-05
HK1035726A1 (en) 2001-12-07
EE04639B1 (et) 2006-06-15
EA200001236A1 (ru) 2001-06-25
CN1148350C (zh) 2004-05-05
ZA200007300B (en) 2002-02-27
CN1307561A (zh) 2001-08-08
CZ298413B6 (cs) 2007-09-26
HUP0102255A2 (hu) 2001-11-28
NO20006023L (no) 2001-01-17
IL139967A (en) 2005-11-20
ES2211096T3 (es) 2004-07-01
CA2333656C (en) 2008-07-29
ATE256659T1 (de) 2004-01-15
TR200100190T2 (tr) 2001-05-21
EP1082302B1 (en) 2003-12-17
WO1999061421A1 (en) 1999-12-02
IL139967A0 (en) 2002-02-10
DE69913687T2 (de) 2004-10-07
PL344440A1 (en) 2001-11-05
IS5737A (is) 2000-11-28
BG65021B1 (bg) 2006-12-29
US6495525B1 (en) 2002-12-17
NO317990B1 (no) 2005-01-17
AU764108B2 (en) 2003-08-07
DE69913687D1 (de) 2004-01-29
NO20006023D0 (no) 2000-11-28
PT1082302E (pt) 2004-04-30
KR100636713B1 (ko) 2006-10-20
HUP0102255A3 (en) 2001-12-28
MXPA00011774A (es) 2002-10-17
YU75500A (sh) 2002-12-10
EE200000698A (et) 2002-06-17
AU4219299A (en) 1999-12-13
NZ509199A (en) 2003-10-31
KR20010043906A (ko) 2001-05-25
CZ20004425A3 (en) 2001-05-16
DK1082302T3 (da) 2004-04-26
CA2333656A1 (en) 1999-12-02
SI1082302T1 (en) 2004-06-30
JP2002516309A (ja) 2002-06-04
EP1082302A1 (en) 2001-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK18102000A3 (sk) Zlúčeniny inhibujúce bunkovú adhéziu a farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje
EP1265606B9 (en) Cell adhesion inhibitors
DE69637328T2 (de) Zelladhäsionsinhibitoren
TW567184B (en) 2,5-Dioxoimidazolidines as inhibitors of leucocyte adhesion and as VLA-4 antagonists
PL191082B1 (pl) Inhibitor IIb/IIIa, sposób jego wytwarzania i jego zastosowanie
SK1192002A3 (en) Caspase inhibitors and uses thereof
US5212158A (en) Derivatives of l-proline, their preparation and their biological uses
DE69920518T2 (de) Vitronectin-rezeptor-antagonist
EP0136720B1 (en) Enkephalin analogs
US4495178A (en) Enkephalin analogs
JPS59205372A (ja) 縮合７員環化合物およびそれを含有してなる高血圧症予防・治療剤
JP2003516380A (ja) Ｖｌａ−４インテグリンアンタゴニスト

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20090528