ES2211096T3

ES2211096T3 - Un inhibidor de vla-4: omepupa-v.

Info

Publication number: ES2211096T3
Application number: ES99926019T
Authority: ES
Inventors: Wen-Cherng Lee; Alan Gill
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2019-05-28
Also published as: TR200100190T2; DK1082302T3; EE04639B1; BG105060A; HUP0102255A3; CZ298413B6; US6495525B1; DE69913687D1; EE200000698A; EA200001236A1; EP1082302B1; NO317990B1; UA65623C2; CA2333656A1; PL198189B1; KR20010043906A; CA2333656C; AU764108B2; MXPA00011774A; YU75500A

Abstract

Un compuesto de fórmula (I): **FORMULA** o un profármaco farmacéuticamente aceptable, una sal o un isómero del mismo, en donde dicho profármaco es un profármaco de éster.

Description

Un inhibidor de VLA-4: oMePUPA-V.

La presente invención se refiere a compuestos que son útiles para inhibir, alterar o evitar la adhesión celular y las patologías mediadas por la adhesión celular. Esta invención también se refiere a formulaciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, y al uso de estos compuestos para la preparación de un medicamento para inhibir y evitar la adhesión celular y las patologías mediadas por la adhesión celular. Los compuestos y las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser utilizados como agentes terapéuticos o profilácticos. Son especialmente muy adecuados para el tratamiento de muchas enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

Antecedentes de la invención

La adhesión celular es un proceso por el que las células se asocian entre sí, migran hacia una diana específica o se sitúan dentro de la matriz extracelular. La adhesión celular como tal, constituye uno de los mecanismos fundamentales que sostienen numerosos fenómenos biológicos. Por ejemplo, la adhesión celular es responsable de la adhesión de las células hematopoyéticas a las células endoteliales y la subsiguiente migración de estas células hematopoyéticas fuera de los vasos sanguíneos hacia el sitio de la lesión. La adhesión celular como tal tiene una función en numerosas patologías tales como, por ejemplo, la inflamación y las reacciones inmunes en los mamíferos.

Investigaciones en la base molecular de la adhesión celular han revelado que diversas macromoléculas de la superficie celular -conocidas colectivamente como moléculas de la adhesión celular o receptores- median en las interacciones célula-célula y célula-matriz. Por ejemplo, las proteínas de la superfamilia denominada "integrinas" son mediadores clave en las interacciones adhesivas entre las células hematopoyéticas y su entorno (M.E. Hemler, "VLA Proteins in the Integrin Family: Structures, Functions, and Their Role on Leukocytes". Ann. Rev. Immunol., 8, pág. 365 (1990)). Las integrinas son complejos heterodímeros no covalentes que constan de dos subunidades denominadas \alpha y \beta. Existen al menos 17 subunidades \alpha diferentes (\alpha1-\alpha10, \alpha-L, \alpha-M, \alpha-D, \alpha-X, \alpha-IIB, \alpha-V y \alpha-E) y al menos 9 subunidades \beta distintas (\beta1-\beta9) que han sido identificadas hasta la fecha. Basándose en el tipo de los componentes de sus subunidades \alpha y \beta, cada molécula de integrina se puede clasificar en una subfamilia.

La integrina \alpha4\beta1, también conocida como el antígeno-4 muy tardío ("very late antigen-4, VLA-4") o CD49d/
CD29, es un receptor de la superficie celular de leucocitos que participa en una amplia variedad de interacciones en la adhesión célula-célula y célula-matriz (M.E. Hemler, Ann. Rev. Immunol., 8, pág. 365 (1990)). Sirve como un receptor para la proteína de la superficie de células endoteliales, inducible con citoquinas, la molécula-1 de adhesión a células vasculares ("VCAM-1"), así como para la proteína de la matriz extracelular, fibronectina ("FN") (Ruegg y col., J. Cell Biol., 177, pág. 179 (1991); Wayner y col., J. Cell Biol., 105, pág. 1873 (1987); Kramer y col., J. Biol. Chem., 264, pág. 4684 (1989); Gehlsen y col., Science, 24, pág. 1228 (1988)). Los anticuerpos monoclonales anti-VLA-4 ("mAbs") han mostrado que inhiben las interacciones adhesivas dependientes de VLA-4 in vitro e in vivo (Ferguson y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, pág. 8072 (1991); Ferguson y col., J. Immunol., 150, pág. 1172 (1993)). Resultados de experimentos in vivo sugieren que la inhibición de la adhesión celular dependiente de VLA-4 puede evitar, inhibir o alterar diversas patologías inflamatorias y autoinmunes (R.L. Lobb y col., "The Pathophysiologic Role of \alpha4 Integrins In vivo", J. Clin. Invest., 94, págs. 1722-28 (1994)).

Para identificar la secuencia mínima de aminoácidos activos, necesaria para unirse a VLA-4, Komoriya y col. sintetizaron una variedad de péptidos solapantes basándose en la secuencia de aminoácidos de la región CS-1 (el dominio de unión a VLA-4) de una especie particular de fibronectina. ("The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CS1) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), págs. 15075-79 (1991)). Identificaron un péptido de 8 aminoácidos, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, así como dos pentapéptidos solapantes menores, Glu-Ile-Leu-Asp-Val y Leu-Asp-Val-Pro-Ser, que poseían actividad inhibidora frente a la adhesión celular dependiente de FN. Estos resultados sugieren que el tripéptido Leu-Asp-Val era la secuencia mínima para la actividad de adhesión celular. Posteriormente se mostró que Leu-Asp-Val se une sólo a linfocitos que expresan una forma activa de VLA-4, arrojando dudas de este modo sobre la utilidad de dicho péptido in vivo (E.A. Wayner y col., "Activation-Dependent Recognition by Hematopoietic Cells of the LDV Sequence in the V Region of Fibronectin", J. Cell. Biol., 116(2), págs. 489-497 (1992)). Sin embargo, en ciertos péptidos mayores que contienen la secuencia LDV se observó posteriormente que eran activos in vivo (T.A. Ferguson y col., "Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Responses In vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, págs. 8072-76 (1991); y S.M. Wahl y col., "Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, págs. 655-62 (1994)). También se ha descrito un pentapéptido cíclico que puede inhibir la adhesión de VLA-4 y de VLA-5 a FN. (Véase, p. ej., D.M. Nowlin y col., "A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits \alpha4\beta1 y \alpha5\beta1 Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem., 268(27), págs. 20352-59 (1993); y el documento de publicación PCT PCT/US91/04862). Este pentapéptido estaba basado en la secuencia tripeptídica Arg-Gly-Asp de FN que se conoce como un motivo común en el sitio de reconocimiento de diversas proteínas en la matriz extracelular.

Se han descrito ejemplos de otros inhibidores de VLA-4, por ejemplo, en el documento de solicitud de patente de EE.UU. en tramitación, 08/376.372, y en el documento WO98/04913, incorporados específicamente como referencia en esta memoria. El documento USSN 376.372 describe compuestos peptídicos lineales que contienen aminoácidos \beta que tienen actividad inhibidora de la adhesión celular. Los documentos de solicitudes de patente internacionales WO 94/15958 y WO 92/00995, incorporados a esta memoria específicamente como referencias, describen compuestos cíclicos peptídicos y peptidomiméticos con actividad moduladora de la adhesión celular. Los documentos de solicitudes de patente internacionales WO 93/08823 y WO 92/08464 (incorporados a esta memoria específicamente como referencias) describen compuestos que modulan la adhesión celular que contienen guanidinilo, urea y tiourea. El documento de patente de EE.UU. nº 5.260.277 describe compuestos de guanidinilo para la modulación de la adhesión celular y también se incorpora a esta memoria específicamente como referencia.

A pesar de estos avances, sigue existiendo una necesidad de inhibidores específicos, de bajo peso molecular de la adhesión celular dependiente de VLA-4, que tengan propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas mejoradas, tales como biodisponibilidad y duración significativa de la acción. Tales compuestos proporcionarían agentes útiles para el tratamiento, alteración, prevención o supresión de distintas patologías mediadas por la adhesión celular y la unión a VLA-4.

Sumario de la invención

Los compuestos de la presente invención son inhibidores de la integrina VLA-4 que bloquean, por tanto, la unión de VLA-4 a sus distintos ligandos, tales como VCAM-1 y regiones de fibronectina. Por tanto, estos compuestos son útiles para inhibir procesos de adhesión celular que incluyen la activación celular, la migración, la proliferación y la diferenciación. Estos compuestos son útiles para inhibir, evitar y suprimir la adhesión celular mediada por VLA-4 y las patologías asociadas a esta adhesión, tales como la inflamación y las reacciones inmunes, que incluyen, por ejemplo, esclerosis múltiple, asma, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, enfermedades inflamatorias pulmonares, artritis reumatoide, artritis séptica, diabetes de tipo 1, trasplante de órganos, restenosis, trasplante autólogo de médula ósea, secuelas inflamatorias de infecciones víricas, miocarditis, enfermedad inflamatoria intestinal que incluye colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, ciertos tipos de nefritis tóxica e inmunológica, hipersensibilidad dérmica por contacto, soriasis, metástasis tumoral, mieloma múltiple y ateroesclerosis. Los compuestos de esta invención se pueden emplear de forma aislada o en combinación con otros agentes terapéuticos o profilácticos para inhibir, alterar, evitar o suprimir la adhesión celular. Esta invención también proporciona formulaciones farmacéuticas que contienen estos inhibidores de la adhesión celular mediada por VLA-4 y el uso de los compuestos y de composiciones de la invención para la preparación de un medicamento para inhibir la adhesión celular.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 describe la sensibilidad de las vías aéreas de carneros después del tratamiento con oMePUPA-V. Los carneros, sensibles naturalmente a Ascaris suum, fueron estimulados con un aerosol de alérgeno Ascaris suum, dos horas después de la administración con aerosol de oMePUPA-V, en las dosis indicadas o una cantidad equivalente de vehículo. La mecánica pulmonar se midió en los intervalos de tiempo indicados y se describe como el cambio de la resistencia específica de las vías aéreas desde el valor base del estudio preliminar (paneles a la izquierda). La resistencia de las vías aéreas al carbacol inhalado se determinó antes de iniciar el estudio y a las 24 h de la estimulación con el alérgeno (paneles a la derecha). La sensibilidad de las vías aéreas se describe como la proporción de PC_{400} (cantidad de carbacol requerido para incrementar la resistencia en un 400%) en comparación con los valores anteriores y posteriores a la estimulación.

Figura 2: Carneros, sensibles naturalmente a Ascaris suum, se estimularon con una administración con aerosol de oMePUPA-V, en las dosis indicadas o un aerosol de Ascaris suum. Los cambios en la resistencia de las vías aéreas se midieron después de la estimulación con el aerosol y la resistencia pulmonar máxima específica (cm H_{2}O/s) después de la estimulación, se comparó con los valores base.

*=p<0,05 comparado con el testigo de PBS, análisis de un factor de la varianza, seguido de la prueba de Dunnett para la comparación múltiple con un grupo testigo. Indica un incremento estadísticamente significativo de la resistencia pulmonar máxima específica, comparado con el grupo testigo de PBS.

Figura 3. Carneros, naturalmente sensibles a Ascaris suum, se expusieron a un aerosol con alérgeno de Ascaris suum, 24 h después de la cuarta administración diaria con aerosol de oMePUPA-V (0,03 mg) o una cantidad equivalente del vehículo (etanol:solución salina normal, 1:2, panel superior; Tris:solución salina normal, 1:499, panel inferior). La mecánica pulmonar se midió en los tiempos indicados y se describe como el cambio en la resistencia específica de las vías aéreas desde el valor base del estudio preliminar (paneles a la izquierda). La resistencia de las vías aéreas al carbacol inhalado se determinó antes de la iniciación del estudio y 24 h después de la estimulación con el alérgeno (paneles a la derecha). La sensibilidad de las vías aéreas se describe como la proporción de PC_{400} (cantidad de carbacol necesaria para incrementar la resistencia en un 400%) en comparación con los valores anteriores y posteriores a la estimulación.

Figura 4. Ratones Balb/c sensibilizados previamente a DNFB, fueron estimulados mediante la aplicación de DNFB a la superficie dorsal de la oreja izquierda y de vehículo a la superficie dorsal de la oreja derecha. Veinticuatro horas después, se midió el espesor de las orejas con un micrómetro. El oMePUPA-V se administró en las dosis indicadas, 4 horas después de la estimulación con DNFB. El compuesto testigo positivo (+CTRL) fue suministrado con una dosis entérica de eficacia máxima. Los valores son medias \pm error estándar de la media de 8 animales. El panel superior muestra la inflamación absoluta de la oreja. El panel inferior muestra el porcentaje de inhibición de la inflamación de la oreja comparado con el testigo vehículo (VEH).

Figura 5. La inducción de LIBS mediante antagonistas de \alpha4\beta1 se sometió a ensayo in vitro mediante análisis con FACS. Las células Jurkat (2 x 10^{5}/pocillo) se preincubaron a 37ºC durante 20 minutos en solución salina tamponada con TRIS que contenía MgCl_{2} 2 mM (Mg^{+2}-TBS) aislado o en diluciones en serie de compuestos del ensayo. Las muestras se transfirieron a un baño de hielo y se suplementaron con anticuerpo de LIBS, 9EG7, hasta una concentración final de 10 \mug/ml. Las células se lavaron dos veces con Mg^{+2}-TBS y se resuspendieron en una dilución 1:200 de un conjugado de FITC-IgG de cabra anti-ratón en Mg^{+2}-TBS. La intensidad media de la fluorescencia (MFI) se determinó mediante análisis con FACS (Becton Dickinson FACScan). El panel superior muestra la inducción de LIBS con oMePUPA-V con tampón Mn^{+2} 1 mM. El panel inferior muestra la inducción de LIBS con oMePUPA-V comparada con el tampón Mg^{+2} 2 mM.

Descripción detallada

La presente invención proporciona compuestos que son capaces de inhibir la adhesión celular mediada por VLA-4, inhibiendo la unión de ligandos a ese receptor. El compuesto preferido es (R)-N-[[4-[[(2-metilfenilamino)carbonil]amino]fenil]acetil]-L-prolil-3-metil)-\beta-Alanina, denominado en esta memoria "oMePUPA-V", representado por la siguiente fórmula I:

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La invención también engloba derivados farmacéuticamente aceptables, sales y ésteres de oMePUPA-V.

Los compuestos de Fórmula I contienen uno o varios centros asimétricos y, por tanto, pueden presentarse como mezclas racémicas, enantiómeros simples, mezclas diasteroméricas e diasterómeros individuales. La presente invención propone abarcar todas las mencionadas formas isómeras del compuesto de Fórmula I.

La invención reivindicada también engloba sales farmacéuticamente aceptables de la Fórmula I. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales preparadas a partir de bases o ácidos no tóxicos, farmacéuticamente aceptables que incluyen bases inorgánicas u orgánicas y ácidos inorgánicos u orgánicos. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen sales de aluminio, de amonio, de calcio, de cobre, férricas, ferrosas, de litio, de magnesio, mangánicas, de manganeso, potásicas, de sodio, de zinc y similares. Son particularmente preferidas las sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio.

Las sales derivadas de bases no tóxicas, orgánicas y farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias que incluyen aminas sustituidas presentes en la naturaleza, aminas cíclicas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como resinas de arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etil-morfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares.

Cuando el compuesto de la presente invención es básico, se pueden preparar sales a partir de ácidos no tóxicos, farmacéuticamente aceptables que incluyen ácidos inorgánicos y orgánicos. Tales ácidos incluyen ácido acético, benzosulfónico, benzoico, canforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluensulfónico y similares. Son particularmente preferidos los ácidos cítrico, bromhídrico, clorhídrico, maleico, fosfórico, sulfúrico y tartárico.

Adicionalmente, la invención reivindicada engloba profármacos de éster en donde el grupo carboxilo de:

(R)-N-[[4-[[(2-metilfenilamino)carbonil]amino]fenil]acetil]-L-prolil-3-metil)-\beta-Alanina se esterifica con cualquiera de los alcoholes. Los alcoholes preferidos son metanol, etanol, propanol, butanol o alcoholes alquílicos C_{1-10} de cadena lineal o ramificada.

La capacidad de los compuestos de Fórmula I para antagonizar las acciones de VLA-4, los vuelve útiles para evitar, tratar o aliviar los síntomas, los trastornos o las enfermedades inducidas por la unión de VLA-4 a sus ligandos. Por tanto, estos antagonistas inhibirán los procesos de adhesión celular que incluyen la activación celular, la migración, la proliferación y la diferenciación. Por ello, otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de estos compuestos para la preparación de un medicamento para tratar, evitar, aliviar o suprimir enfermedades o trastornos mediados por la ruta de VLA-4. Tales enfermedades y trastornos incluyen, por ejemplo, el asma, la esclerosis múltiple, la rinitis alérgica, la conjuntivitis alérgica, enfermedades pulmonares inflamatorias, la artritis reumatoide, el mieloma múltiple, la artritis séptica, la diabetes de tipo I, el rechazo de trasplante de órganos, la enfermedad inflamatoria intestinal y otras.

Los compuestos de esta invención se pueden sintetizar empleando cualquier técnica convencional, algunas de las cuales se ejemplifica en esta memoria. Preferentemente, estos compuestos se sintetizan químicamente a partir de materiales de partida fácilmente adquiribles, tales como \alpha-aminoácidos y sus equivalentes funcionales. Los métodos de modulación y convergentes para la síntesis de estos compuestos también son preferidos. En una aproximación convergente, por ejemplo, grandes secciones del producto final se juntan en las últimas etapas de la síntesis, más que la adición incrementada de pequeñas piezas a una cadena molecular en crecimiento.

Tal y como se emplea en toda esta solicitud, el término "paciente" se refiere a mamíferos, que incluyen los seres humanos. Y el término "célula" se refiere a cualquier célula, preferentemente células de mamíferos que incluyen los seres humanos.

Una vez sintetizados, se pueden determinar las actividades y las especificidades frente a VLA-4 de los compuestos de acuerdo con esta invención, empleando ensayos in vitro e in vivo.

Por ejemplo, la actividad inhibidora de la adhesión celular de estos compuestos se puede medir determinando la concentración de inhibidor requerida para bloquear la unión de las células que expresan VLA-4 a las placas revestidas con fibronectina o con CS1. En este tipo de ensayo, los pocillos de microtitulación se revisten con fibronectina (que contiene la secuencia de CS-1) o con CS-1. Si se emplea CS-1, se tiene que conjugar con una proteína vehículo, tal como seroalbúmina de ternera, para unirse a los pocillos. Una vez que se han revestido los pocillos, se añade a continuación concentraciones variadas del compuesto del ensayo junto con las células que expresan VLA-4, marcadas adecuadamente. Alternativamente, el compuesto del ensayo se puede añadir primero y dejarlo incubar en los pocillos revestidos antes de la adición de las células. Las células se dejan incubar en los pocillos durante al menos 30 minutos. Después de la incubación, los pocillos se vacían y se lavan. La inhibición de la unión se mide por cuantificación de la fluorescencia o la radiactividad unida a la placa para cada una de las distintas concentraciones del compuesto del ensayo, así como para los testigos que no contienen el compuesto del ensayo.

Las células que expresan VLA-4 que se pueden utilizar en este ensayo, incluyen las células Ramos, las células Jurkat, las células de melanoma A375, así como linfocitos de sangre periférica humana (PBLs). Las células empleadas en este ensayo pueden estar marcadas de cualquier forma adecuada, por ejemplo marcadas con fluorescencia o con radiactividad.

También se puede emplear un ensayo directo de la unión para cuantificar la actividad inhibidora de los compuestos de esta invención. En este ensayo, una proteína de fusión VCAM-IgG que contiene los dos primeros dominios de la inmunoglobulina de VCAM (DID2) unidos por encima de la región bisagra de la molécula IgG1 ("VCAM 2D-IgG"), se conjuga con una enzima marcadora, tal como fosfatasa alcalina ("AP"). La síntesis de esta fusión VCAM-IgG se describe en el documento de publicación PCT WO 90/13300, cuya descripción se incorpora en esta memoria como referencia. La conjugación de esta fusión con una enzima marcadora se consigue mediante métodos de reticulación bien conocidos en la técnica.

El conjugado de VCAM-IgG y enzima se coloca a continuación en los pocillos de una placa de filtración de multipocillos, tal como la contenida en el Sistema de Ensayo de Millipore Multiscreen (Millipore Corp., Bedford, MA). A continuación, se añaden a los pocillos distintas concentraciones del compuesto inhibidor del ensayo, seguido de la adición de células que expresan VLA-4. Las células, el compuesto y el conjugado de VCAM-IgG y enzima se mezclan entre sí y se dejan incubar a temperatura ambiente.

Después de la incubación, los pocillos se drenan a vacío dejando atrás las células y cualquier VCAM unida. La cuantificación de VCAM unida se determina añadiendo un sustrato colorímetro adecuado para la enzima conjugada con VCAM-IgG y determinando la cantidad de producto de reacción. Un producto de reacción disminuido indica una actividad inhibidora de la unión incrementada. El protocolo para ciertos ensayos se describe a continuación:

Para determinar la especificidad inhibidora de VLA-4 de los compuestos de esta invención, se realizaron ensayos para otros grupos principales de integrinas, es decir, \beta2 y \beta3, así como otras integrinas \beta1, tales como VLA-5, VLA-6 y \alpha4\beta7. Estos ensayos pueden ser similares a la inhibición de la adhesión y a los ensayos de unión directa descritos anteriormente, sustituyendo la célula adecuada que expresa integrina y el ligando correspondiente. Por ejemplo, células polimorfonucleares (PMNs) expresan integrinas \beta2 en su superficie y se unen a ICAM. Las integrinas \beta3 están implicadas en la agregación plaquetaria y la inhibición se puede medir en un ensayo convencional de agregación plaquetaria. La VLA-5 se une específicamente a las secuencias Arg-Gly-Asp, mientras que VLA-6 se une a laminina. La \alpha4\beta7 es un homólogo descubierto recientemente de VLA-4 que también se une a fibronectina y a VCAM. La especificidad en relación con \alpha4\beta7 se determina en un ensayo de ligación que emplea el conjugado de VCAM-IgG y marcador enzimático descrito anteriormente y una línea celular que expresa \alpha4\beta7, pero no VLA-4, tal como las células RPMI-8866 o JY.

Una vez que se han identificado los inhibidores específicos de VLA-4, se pueden caracterizar adicionalmente en ensayos in vivo. Uno de esos ensayos estudia la inhibición de la hipersensibilidad por contacto en un animal, tal como describen P.L. Chisholm y col., "Monoclonal Antibodies to the Integrin \alpha-4 Subunit Inhibit the Murine Contact Hypersensitivity Response", Eur. J. Immunol., 23, págs. 682-688 (1993) y en "Current Protocols in Immunology", J.E. Coligan y col., compiladores John Wiley & Sons, Nueva York, 1, págs. 4.2. 1-4.2.5 (1991), cuyas descripciones se incorporan en esta memoria como referencia. En este ensayo, la piel del animal se sensibiliza por estimulación con un agente irritante, tal como dinitrofluorobenceno, seguido de una ligera irritación física, tal como arañar ligeramente la piel con una punta afilada. Después de un periodo de recuperación, los animales se sensibilizan de nuevo, siguiendo el mismo proceder. Varios días después de la sensibilización, se expone una oreja del animal al agente químico irritante, mientras que la otra oreja se trata con una solución testigo no irritante. Poco después de tratar las orejas, se administra a los animales varias dosis del inhibidor de VLA-4 mediante inyección subcutánea. La inhibición in vivo de la inflamación asociada a la adhesión celular se determina midiendo la respuesta de inflamación de la oreja del animal en la oreja tratada frente a la oreja no tratada. La inflamación se mide empleando un compás de espesores u otro instrumento adecuado para medir el espesor de la oreja. De este modo, se pueden identificar los inhibidores de esta invención que son más adecuados para inhibir la inflamación.

Otro ensayo in vivo que se puede emplear para someter a ensayo los inhibidores de esta invención es el ensayo del asma en carneros. Este ensayo se realiza esencialmente tal y como describen W.M. Abraham y col., "\alpha4-Integrins Mediate Antigen-induced Late Bronchial Responses and Prolonged Airway Hyperresponsiveness in Sheep", J. Clin. Invest. 93, págs. 776-87 (1994), cuya descripción se incorpora en esta memoria como referencia. Este ensayo mide la inhibición de las respuestas de las vías aéreas en la fase tardía, inducidas por el antígeno de Ascaris y la hipersensibilidad de las vías aéreas en carneros alérgicos. Los compuestos de esta invención también se pueden someter a ensayo en un ensayo de agregación plaquetaria.

Los inhibidores de VLA-4 de la invención han mostrado una actividad y una selectividad sorprendentemente favorables. Generalmente, estos compuestos son selectivos para VLA-4 (>1000 veces frente a \alpha4\beta7 y \alpha5\beta1), negativos en ensayos de rutina PanLabs y non-GLP Ames, limpios en ensayos farmacológicos auxiliares convencionales y eficaces en el modelo de carneros después de una dosificación diaria con el nivel de uso pronosticado en humanos de 1 mg/día o menor.

Los compuestos reivindicados tienen una potencia sorprendentemente superior comparada con los inhibidores de VLA-4 estructuralmente relacionados. Por ejemplo, en carneros sensibles a Ascaris tratados una vez al día durante cuatro días con el fármaco nebulizado, con 0,1 mg/kg y a continuación estimulados con antígeno 24 horas después de la última dosis, los compuestos sometidos a ensayo previamente atenuaban sustancialmente la respuesta temprana y bloqueaban la broncoconstricción de la fase tardía y el desarrollo de hipersensibilidad no específica. Asumiendo una bioequivalencia en los seres humanos, una dosis total de 7 mg sería necesaria en una persona de 70 kg. Además, el fármaco se administró al carnero a través de un tubo endotraqueal con tasas de deposición que se estimaban que eran 2 veces superiores a las que se consiguen típicamente en los seres humanos con dispositivos de inhalación oral. Adicionalmente, es probable que sea necesario añadir excipientes a la formulación sólida final para optimizar el llenado del dispositivo y el suministro del fármaco. Estos factores sugieren un posible requerimiento de dosis en seres humanos de 14 mg o más, lo que excede el límite técnico de 1-5 mg, que se puede suministrar en una actuación a través de un dispositivo de inhalación con polvo seco (DPI). Aunque la dosis necesaria se podría suministrar mediante actuaciones múltiples del DPI, esto representaría una desventaja competitiva en el mercado del asma en donde las dosis típicas de esteroides inhalados son de 0,2-1,0 mg.

El oMePUPA-V atenuaba la respuesta temprana, bloqueaba la broncoconstricción de la fase tardía y normalizaba la hipersensibilidad con una dosis mínima de 0,003 mg/kg, cuando se administraba como una única dosis nebulizada 2 horas antes de la estimulación con el antígeno. Además, una dosis diaria de 0,001 mg/kg durante 4 días con una estimulación con el antígeno 24 horas después de la última dosis, proporcionaba una respuesta máxima. Por tanto, el oMePUPA-V es 30 a 100 veces más potente que los compuestos previos con niveles de dosis en el intervalo de los esteroides inhalados mejores del mercado. El oMePUPA-V, así como el penúltimo intermedio sintético, es altamente cristalino. (Véase Figura 1, Tabla 1).

Adicionalmente, el oMePUPA-V tiene un perfil metabólico mejorado cuando se compara con compuestos conocidos inhibidores de VLA-4. Por ejemplo, después de la administración del aerosol, los compuestos reivindicados se convirtieron rápidamente en un metabolito menos activo que era el producto predominante recuperado del fluido del lavado broncoalveolar (BALF) y también era el producto predominante observado en la circulación sistémica en donde inhibía una semivida plasmática más larga que el compuesto precursor. Aunque la rápida conversión metabólica a compuestos menos activos es una estrategia útil para conseguir una exposición sistémica reducida, los compuestos que se metabolizan en subproductos con poca actividad o sin actividad intrínseca, presentan menos complejidad en el desarrollo y se prefieren desde una perspectiva de reserva.

Los productos potencialmente proteolíticos de oMePUPA-V son inactivos en ensayos de ligación de VLA-4, por lo que la proteolisis generaría independientemente productos inactivos. Sin embargo, estudios metabólicos in vitro así como estudios de PK in vivo en ratas, perros y carneros, han mostrado que el oMePUPA-V es proteolíticamente estable.

TABLA 1 Propiedades de oMePUPA-V comparado con inhibidores previamente conocidos

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Los compuestos de la presente invención se pueden formular como composiciones farmacéuticas que se pueden administrar oralmente, parenteralmente, mediante pulverización para inhalación, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente o mediante un depósito implantado. El término "parenteral", tal y como se emplea en esta memoria, incluye la inyección o las técnicas de infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intraesternal, intrahepática, intralesional e intracraneal.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden cualquiera de los compuestos de la presente invención, o derivados de los mismos farmacéuticamente aceptables, junto con cualquier posible vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo" tal y como se emplea en esta memoria, incluye aditivos y vehículos aceptables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, pero no están limitados a, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno fosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilen glicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilen glicol y lanolina.

De acuerdo con esta invención, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de preparación estéril inyectable, por ejemplo, una suspensión acuosa u oleaginosa estéril inyectable. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con métodos conocidos en la técnica que emplean agentes adecuados de dispersión o humectantes y agentes de suspensión. La preparación estéril inyectable también puede ser una solución o una suspensión estéril inyectable en un diluyente o disolvente no tóxico, parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y los disolventes aceptables que se pueden emplear, está el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, aceites fijados estériles se emplean convencionalmente como un disolvente o un medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijado blando que incluya mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados glicéridos son útiles en la preparación de agentes inyectables, tales como son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones de aceite pueden contener también un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar oralmente bajo cualquier forma de dosificación oralmente aceptable, pero no están limitadas a cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos que se emplean generalmente incluyen lactosa y almidón de maíz. Los agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, se añaden típicamente. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando son necesarias suspensiones acuosas para el uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, se pueden añadir también ciertos agentes endulzantes, saboreantes o colorantes.

Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar en forma de supositorios para la administración rectal. Estos se pueden preparar mezclando el agente con un excipiente adecuado no irritante que es sólido a temperatura ambiente pero que se vuelve líquido a la temperatura rectal y, por tanto, se funde en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen manteca de coco, cera de abeja y polietilen glicoles.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar también tópicamente, especialmente cuando la diana del tratamiento incluye áreas u órganos de fácil acceso mediante aplicación tópica, incluyendo, por ejemplo, enfermedades oculares, de la piel o del tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos.

La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior se puede efectuar con una formulación de supositorio rectal (véase arriba) o con una formulación de enema adecuada. También se pueden emplear tópicamente parches transdérmicos.

Para las aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas se pueden formular en forma de ungüento adecuado que contiene el componente activo suspendido o disuelto en uno o varios vehículos. Los vehículos para la administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen, pero no están limitados a aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilen glicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas se pueden formular como una loción adecuada o una crema que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o varios vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos adecuados incluyen, pero no están limitados a aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.

Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticas se pueden formular como suspensiones micronizadas en solución salina isotónica e estéril con pH ajustado o, preferentemente, como soluciones en solución salina isotónica, estéril, con pH ajustado, con o sin agente conservante, tal como cloruro de bencilalconio. Alternativamente, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticas se pueden formular en forma de ungüento tal como vaselina.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención también se pueden administrar con un aerosol nasal o por inhalación mediante el uso de un nebulizador, un inhalador de polvo seco o un inhalador dosificado. Tales composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y se pueden preparar como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otro conservante adecuado, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/o otros agentes convencionales solubilizantes o dispersantes. Adicionalmente, las composiciones de la invención pueden incluir cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, lactosa para formulaciones en forma de polvo seco.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales del vehículo para producir una única dosificación, variará dependiendo del hospedador tratado, y del modo particular de administración. Se debe entender que, sin embargo, una dosificación específica tal y un régimen de tratamiento para cualquier paciente particular, dependerá de una variedad de factores, que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, tasa de excreción, combinación de fármacos y la opinión del médico del tratamiento y la gravedad de la enfermedad particular que está siendo tratada. La cantidad de ingrediente activo también dependerá del agente terapéutico o profiláctico, si hay alguno, junto con el que se administra el ingrediente.

La dosificación y la tasa de las dosis de los compuestos de esta invención, eficaces para evitar, suprimir o inhibir la adhesión celular, dependerá de una variedad de factores, tales como la naturaleza del inhibidor, el tamaño del paciente, el fin del tratamiento, la naturaleza de la patología a tratar, la composición farmacéutica específica utilizada y la opinión del médico del tratamiento. Son útiles niveles de dosificación de entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al día, preferentemente aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg y más preferentemente aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal al día de compuesto del ingrediente activo.

Para uso en donde se emplea una composición para administración intravenosa, un intervalo adecuado de dosificación es desde aproximadamente 0,001 mg hasta aproximadamente 25 mg/kg, más preferentemente, aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 1 mg/kg.

De acuerdo con otra realización, las composiciones que contienen un compuesto de esta invención también pueden comprender un agente adicional seleccionado entre el grupo consistente en corticoesteroides, broncodilatadores, antiasmáticos (estabilizadores de mastocitos), antiinflamatorios, antirreumáticos, inmunosupresores, antimetabolitos, inmunomoduladores, antisoriáticos y antidiabéticos. Los compuestos específicos dentro de cada una de estas clases se pueden seleccionar a partir de cualquiera de los listados con los títulos de grupo adecuados, en "Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, England, págs. 970-986 (1990), cuya descripción se incorpora a esta memoria como referencia. También están incluidos en este grupo compuestos tales como teofilina, sulfasalazina y aminosalicilatos (antiinflamatorios); ciclosporina, FK-506 y rapamicina (inmunosupresores); ciclofosfamida y metotrexato (antimetabolitos); esteroides (inhalados, orales o tópicos) e interferones (inmunomoduladores). Además, los compuestos de la invención se pueden administrar junto con inhibidores adicionales de la adhesión celular. Cuando se administran uno o varios agentes adicionales junto con el inhibidor reivindicado de VLA-4, los ingredientes activos se pueden formular juntos o, alternativamente, se pueden administrar en combinación. La administración de uno o varios agentes activos en combinación con los inhibidores de VLA-4 de la invención reivindicada, puede ser sustancialmente simultánea o secuencial. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la aplicación más adecuada, dependiendo de los agentes que se van a suministrar, los resultados deseados y el paciente y el trastorno a tratar.

De acuerdo con otras realizaciones, la invención proporciona el uso de estos compuestos para la preparación de un medicamento para evitar, inhibir o suprimir la inflamación asociada a la adhesión celular y la respuesta inmune o autoinmune asociada a la adhesión celular en un paciente. La adhesión celular asociada a VLA-4 tiene un papel central en una variedad de enfermedades inflamatorias, inmunes y autoinmunes. Por tanto, la inhibición de la adhesión celular por los compuestos de esta invención se puede utilizar en métodos para tratar o evitar las enfermedades inflamatorias, inmunes y autoinmunes. Preferentemente, los compuestos de la presente invención son útiles para el tratamiento de enfermedades seleccionadas entre asma, artritis, soriasis, rechazo de trasplantes, esclerosis múltiple, diabetes y enfermedad inflamatoria intestinal.

Los compuestos de esta invención son útiles en una monoterapia o en combinación con un agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Dichas terapias de combinación incluyen la administración de los agentes en forma de dosificación única o en forma de dosificación múltiple, al mismo tiempo o en momentos distintos.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de oMePUPA-V

El oMePUPA-V, (R)-N-[[4-[[(2-metilfenilamino)carbonil]amino]fenil]acetil]-L-prolil-3-metil)-\beta-Alanina, se preparó en una síntesis convergente de succinimidil Boc-(L)-prolina (Boc-Pro-OSu; Bachem) y hemisulfato de (R)-bencil-3-aminobutirato (Celgene Corp.), fabricados comercialmente. El acoplamiento de los materiales de partida en CH_{2}Cl_{2} en presencia de Et_{3}N, seguido de hidrólisis del grupo Boc con HCl 4 N en dioxano, proporcionó la sal de HCl que se recristalizó en CH_{2}Cl_{2}/Et_{2}O. El acoplamiento de la sal de HCl con fenil-acetato de succinimidil-2-[4-[2-(metilfenilaminocarbonil)]amino (MPUPA-OSu), preparado a partir del correspondiente ácido, MPUPA-OH (Ricerca, Inc.), proporcionaba éster oMePUPA-V-bencílico cristalino que se hidrógeno catalíticamente (10% de Pd/C) en THF/H_{2}O (9:1) para proporcionar oMePUPA-V. El producto final se obtuvo como un sólido blanco después de recristalizar en acetona acuosa al 20%.

Sumario de las características físicas

Nombre químico: (R)-N-[[4-[[(2-metilfenilamino)carbonil]amino]fenil]acetil]-L-prolil-3-metil)-\beta-Alanina

Fórmula empírica: C_{25}H_{30}N_{4}O_{5}

Peso molecular: 466,53

Apariencia: polvo blanco limpio

Punto de fusión: 153,6-154,4ºC

Esquema 1

Preparación de MPUPA-OSu (2) a partir de MPUPA-OH (1)

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Esquema 2

Síntesis de oMePUPA-V (8) a partir de Boc-(L)-Pro-OSu (3) y hemisulfato de bencil-(R)-3-aminobutirato (4)

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Síntesis de oMePUPA-V

La química sintética que se empleó para preparar oMePUPA-V se describe en los Esquemas 1 y 2. Los materiales de partida se obtuvieron a partir de fuentes comerciales y fabricantes contratados: (1) fue preparado en grandes cantidades por Ricerca, Inc., Painesville, OH; (3) se obtuvo de Bachem Bioscience, Inc., King of Prusia, PA y (4) de Celgene Corp., Warren, NJ.

Preparación de oMePUPA-V Métodos analíticos generales (^{1}H RMN, ^{13}C RMN, MS, IR & HPLC)

^{1}H RMN se realizaron en un instrumento Bruker AC 300 o Varian 500 o Varian 600 y las muestras se sometieron a DMSO-d_{6} y se hizo referencia a DMSO-d_{6} (d 2,49 ppm) o en CDCl_{3} y se hizo referencia a CHCl_{3} residual (d 7,24 ppm).

^{13}C RMN se realizó en un instrumento Varian 500 o Varian 600 y las muestras se sometieron a DMSO-d_{6} y se hizo referencia a dMSO-d_{6} (d 40,5 ppm) o en CDCl_{3} y se hizo referencia a CDCl_{3} (d 77,0 ppm).

Los espectros de masas se realizaron en un sistema de espectrómetro de masas de Fisons Platform LC-MS-DS con un Autosampler de Hewlett Packard, modelo 1500 y los datos se procesaron empleando un "Mass Spectrometer Workstation MassLynx" de Fisons VG. El trabajo de HRMS se realizó con M-Scan(PA) empleando bombardeo rápido de átomos en un espectrómetro de masas de campo grande de VG Analytical ZAB 2SE, con referencia a SOP#MS-002, MS-006, MS-012 y MS-023. Se empleó una pistola iónica de cesio para generar iones para los espectros de masas adquiridos, que se registraron empleando un sistema de datos de PDP-11-250J.

El espectro IR se realizó en una FTIR 1600 Series de Perkin Elmer.

La cromatografía analítica con HPLC se realizó del modo siguiente:

1. Los cromatogramas que emplean el Programa 1 (Equilibrate @ 20% de B, muestra inyectada, 20% de B (1 min), 20%-70% de B (24 min), 70%-100% de B (17 min) se obtuvieron empleando un "Series 200 HPLC autosampler system" de Perkin Elmer con detector de UV 785A de Perkin Elmer (equipo a 214 nm) y un detector de UV 783A de Applied Biosystems (equipo a 254 nm) con un integrador 1020 de PE Nelson. Sólo se describen los valores porcentuales de la región.

2. Los cromatogramas que emplean el Programa 8 (Equilibrate @ 15% de B, muestra inyectada, 15% de B (1 min), 15%-40% de B (25 min), 40% de B (10 min) se obtuvieron empleando un "400 Solvent Delivery System" de Applied Biosystems con un detector de UV de longitud de onda 783 A que emplea un "autosampler 717" de Waters. Los datos se procesaron empleando un integrador de 3396 series II de Hewlett Packard. El integrador estaba ajustado a los siguientes parámetros: atenuación = 8, umbral = 5, área de rechazo = 10000, anchura máxima = 0,04, velocidad de la gráfica = 0,2.

Todo el trabajo de HPLC se realizó utilizando una columna Vydac C-18 (5 m de tamaño de poro, 4,5 mm x 25 cm, nº de cat. 218TP54).

Disolvente A (agua + TFA al 0,1%)

Disolvente B (acetonitrilo + TFA al 0,1%)

Caudal = 1 ml/min

Los programas del gradiente son los siguientes:

Programa 1:

Equilibrate @ 20% de B, muestra inyectada, 20% de B (2 min), 20%-70% de B (25 min), 100% de B (5 min).

Datos físicos para el ácido [4-[[[(2-metilfenil)amino]carbonil]amino]fenil]acético (1, MPUPA-OH; material fabricado por Ricerca Inc.)

P.f. 210-215ºC (dec.);

IR (KBr) 3295 (banda br), 3034 (banda br), 1707, 1637, 1603, 1551, 1516, 1457, 1414, 1302, 1241, 1189, 1118 cm^{-1};

^{1}H RMN (600 MHz, DMSO-d_{6})d 12,28 (bs, 1H), 9,0 (s, 1 H), 7,91 (s, 1 H), 7,88 (d,J = 7,8 Hz, 1 H), 7,43 (d,J = 8,4 Hz, 2 H), 7,19 (d,J=8,4 Hz, 2 H), 7,16 (m, 2 H), 6,94 (dd,J = 7,8, 8,4 Hz, 1 H), 3,51 (s, 2 H), 2,25 (s, 3 H);

^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6}) d 173,0 (C), 152,7 (C), 138,5 (C), 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 128,3 (CH), 127,5 (CH), 126,2 (CH), 122,7 (CH), 121,0 (CH), 118,1 (CH), 40,1 (CH_{2}), 17,9 (CH_{3});

MS (EI) m/z 285 (M+1)^{+}, 193, 152, 134, 132, 109, 108, 106, 93, 91, 57;

Anal. Calc. para C_{16}H_{16}N_{2}O_{3}: C, 67,59; H, 5,67; N, 9,85; Encontrado: C, 67,60; H, 5,70; N, 10,01.

Preparación de [4-[[[(2-metilfenil)amino]carbonil]amino]fenil]acetato de succinimidilo (2, MPUPA-OSu)

A una suspensión a reflujo de ácido o-metilfenilurea fenilacético (1, MPUPA-OH; 150 g, 0,501 mol; de Ricerca Inc.) en acetonitrilo (600 ml) se añadió cloruro de tionilo (41 ml, 0,558 mol) durante 10 min con agitación fuerte. Se produjeron grandes cantidades de HCl. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente con agitación continua durante 1,5 h. La mezcla de reacción se volvió una suspensión rosa a la que se añadió N-hidroxisuccinimida sólida (HOSu; 75,5 g, 0,636 mol) en una porción. A esta mezcla se añadió gota a gota trietilamina (174 ml) durante 30 min, a la vez que se mantenía la temperatura de la mezcla de reacción por debajo de 60ºC con un baño de agua. Se continuó agitando durante 2 h y a continuación se añadió agua destilada (500 ml) a la mezcla de reacción. El material sólido se filtró y se lavó con 2 l de agua destilada y acetonitrilo (2 x 200 ml), se secó al aire y se secó adicionalmente sobre P_{2}O_{5} a vacío (\sim0,1 mmHg) para dar un producto en bruto (175 g, rendimiento del 97%) en forma de polvo beige. El producto en bruto (174 g) se recristalizó en acetonitrilo (3,5 l) con decoloración con carbón vegetal (10 g) para dar 129 g de MPUPA-OSu (2; rendimiento del 68%) en forma de polvo blanco (pureza > 99%).

P.f. 211,2-211,8ºC;

IR (KBr) 3905-3203 (banda br), 1816, 1783, 1654, 1368, 1304, 1244, 1116, 1201 cm^{-1};

^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}): d 9,04 (s, 1H), 7,92 (s, 1 H), 7,82 (d, 1 H), 7,44 (d,J = 8,5 Hz, 2 H), 7,24 (d,J = 8,5 Hz, 2 H), 7,15 (m, 2 H), 6,93, (dd,J = 7,4, 7,3 Hz, 1 H), 4,02 (s, 2 H), 2,80 (s, 4 H), 2,23 (s, 3 H);

MS (EI, ES^{+}) m/z 382 [(M+1)^{+}], 239, 108, 106.

Datos físicos para succinimidil Boc-(L)-prolina (Boc-Pro-OSu, 3; material obtenido de Bachem Bioscience)

P.f. 132-136ºC;

IR (KBr) 3456, 2940, 1731, 1619, 1561, 1541, 1497, 1454, 1395, 1337, 1259, 1202, 1118, 1060 cm^{-1};

\newpage

^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}): d 4,51 (dd,J = 3,8, 8,7 Hz, 1 H), 3,56 (m, 1 H), 3,44 (m, 1 H), 2,80 (s, 4 H), 2,32 (m, 1 H), 2,27 (m, 1 H), 1,94 (m, 2 H), 1,43 (s, 9 H);

MS (EI) m/z 335 (M+N_{2})^{+}, 279, 213, 138, 114, 86;

HPLC 97,1%.

Datos físicos para hemisulfato de bencil-(R)-3-aminobutirato (4; material obtenido de Celgene Corp.)

P.f. 249,4-249,8ºC;

R (KBr) 3515, 3383, 2989, 2945, 2880, 1821, 1788, 1744, 1701, 1476, 1454, 1421, 1394, 1368, 1260, 1241, 1202, 1159, 1077 cm^{-1};

^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7,85 (bs, 2 H), 7,26 (s, 5 H), 5,06 (ABq,J = 12,3 Hz, 2 H), 4,35 (m, 2 H), 3,73 (m, 1 H), 2,92 (dd,J = 6,4, 17,1 Hz, 1 H), 2,66 (dd,J = 6,4, 17,0 Hz, 1 H), 1,35 (d,J = 6,5 Hz, 3 H);

MS (EI) m/z 195 (M+3)^{+}, 194 (M+2)^{+}, 106, 92, 91;

HPLC 99,0%.

Preparación de éster bencílico de N-(terc-butoxicarbonil)-L-prolil-3-metil-(R)-\beta-alanina (5)

A una suspensión bien agitada de hemisulfato de bencil-R-3-aminobutirato (4; 66,7 g, 213 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (200 ml) se añadió Boc-(L)-Pro-OSu (3; 53,9 g, 222 mmol) y Et_{3}N (95 ml, 681 mmol). La mezcla de reacción se dejó agitando a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla de reacción se repartió entre EtOAc (1,5 l) y H_{2}O (250 ml) y la capa orgánica se lavó con ácido cítrico al 10% (3 x 250 ml), H_{2}O (250 ml), bicarbonato sódico saturado (250 ml), H_{2}O (250 ml) y salmuera (3 x 250 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró primero en un rotavapor (40ºC; \sim80 mmHg) y a continuación a alto vacío (temperatura ambiente, 16 h, 0,2 mmHg) para proporcionar un material intermedio 5 en forma de aceite viscoso (88,1 g) que contenía EtOAc residual y CH_{2}Cl_{2} (mediante RMN) y mostraba una pureza > 98% (HPLC). Este material se utilizó sin una purificación posterior en la reacción a continuación.

^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7,30 (m, 5 H), 6,44 (bs, 1 H), 5,10 (dd,J = 12,3, 14,1 Hz, 2 H), 4,32 (m, 1 H), 4,13 (m, 1 H), 3,34 (bs, 2 H), 2,48 (d,J = 5,1 Hz, 2 H), 2,1 (m, 2 H), 1,75 (bs, 2 H), 1,40 (s, 9 H), 1,17 (d,J = 6,0 Hz, 3 H);

MS (EI): m/z 413 [M+Na]^{+}, 313, 291, 191, 194, 165, 91.

Preparación de hidrocloruro de éster bencílico de L-prolil-3-metil-(R)-\beta-alanina (6)

Al material intermedio 5 procedente de la reacción anterior, se añadió gradualmente una solución de HCl 4 N en dioxano (240 ml). A esto sucedió una evolución vigorosa de gases (cuidado: exotérmica). La mezcla de la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente (2 h) y a continuación se concentró primero en un rotavapor (45ºC, \sim80 mmHg) y luego bajo alto vacío, durante una noche (temperatura ambiente, 14 h, \sim0,2 mmHg) para proporcionar un material extremadamente viscoso que se cristalizó en CH_{2}Cl_{2}/Et_{2}O (600 ml/700 ml) para proporcionar 64,0 g (92% de rendimiento total para dos etapas) de la sal de HCl 6 en forma de sólido blanco (pureza de HPLC 99,6%).

P.f. 119,8-120,5ºC;

IR (KBr) 3217, 3072, 2904, 2756, 1736, 1681, 1560, 1446, 1387, 1352, 1295, 1244, 1178, 1096 cm^{-1};

^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) d 10,21 (bs, 1 H), 8,71 (d,J = 8,0 Hz, 1 H), 7,77 (bs, 1 H), 7,24 (m, 5 H), 5,00 (s, 2 H), 4,52 (bs, 1 H), 4,22 (t aparente, J = 6,5 Hz, 1 H), 3,33 (bs, 2 H), 2,67 (dd, J = 5,5, 15,5 Hz, 1 H), 2,44 (m, 2 H), 1,89 (m, 3 H), 1,15 (d,J = 6,5 Hz, 3 H);

^{13}C RMN (125 MHz, CDCl_{3}) d 171,03 (C=O), 167,67 (C=O), 135,58 (C), 128,43 (CH), 128,13 (CH), 128,06 (CH), 66,34 (CH_{2}), 59,71 (CH), 46,55 (CH_{2}), 43,34 (CH), 40,42 (CH_{2}), 30,50 (CH_{2}), 24,23 (CH_{2}), 19,92 (CH_{3});

MS (EI) m/z 291 [M-Cl]^{+}, 199, 194, 160, 139, 92, 91;

Anal. Calc. para C_{16}H_{23}N_{2}O_{3}Cl: C, 58,80; H, 7,094; N, 8,57; encontrado: C, 58,95; H, 6,99; N, 8,46.

Preparación del éster bencílico de N-[[4-[[(2-metilfenilamino)carbonil]amino]fenil]acetil]-L-prolil-3-metil)-(R)-\beta-Alanina (7)

A una solución de la sal de HCl (61,77 g, 189 mmol) en DMF (125 ml) se añadió MPUPA-OSu (2; 69,39 g, 181,9 mmol) seguido de Et_{3}N (90 ml; pH \sim10). La mezcla de reacción se dejó agitar 3,5 h y a continuación se diluyó con EtOAc (1 l) y se extrajo con H_{2}O (3 x 250 ml). En este momento el producto empezó a precipitar. Se añadió una solución al 10% de ácido cítrico (250 ml) a la capa orgánica (precaución: exotérmica!) y después de agitar, se formó un copioso precipitado. El material sólido se filtró en un embudo de vidrio sinterizado (2 L,M). El material sólido se lavó con ácido cítrico (10%, 2 x 250 ml), H_{2}O (250 ml), bicarbonato sódico saturado (2 x 250 ml) y salmuera (3 x 250 ml) y se dejó secar en el embudo con succión (\sim80 mmHg) durante una noche (\sim14 h) para proporcionar un sólido color crema que se recristalizó en THF/Et_{2}O (1 l/1,4 l) para proporcionar 83,3 g de compuesto 7 (pureza HPLC 99,6%) en forma de sólido blanco.

El material filtrado se lavó adicionalmente con ácido cítrico (10%, 3 x 250 ml), H_{2}O (250 ml), bicarbonato saturado (2 x 250 ml), H_{2}O (250 ml) y salmuera (3 x 250 ml). Con cada lavado acuoso posterior, precipitaba adicionalmente compuesto; sin embargo, el lavado continuó, teniendo cuidado de no perder el material precipitado. La filtración proporcionó 4,02 g del producto en forma de sólido blanco. El material filtrado se diluyó finalmente con Et_{2}O (1 l), se filtró y el material sólido se lavó con Et_{2}O (3 x 100 ml) para proporcionar una tanda adicional de 1,67 g del material sólido. El rendimiento total para esta reacción era 88%.

P.f. 153-153,5ºC;

IR (KBr) 3342, 3307, 3119, 2966, 1737, 1702, 1643, 1590, 1543, 1514, 1455, 1414, 1308, 1238, 1179 cm^{-1};

^{1}H RMN (500 MHz, DMSO-d_{3}): una mezcla 3:2 de rotámeros, (picos para la conformación principal): d 9,00 (bs, 1 H), 7,91 (bs, 1H), 7,84 (d,J = 8,3 Hz, 1 H), 7,68 (d,J = 8,3 Hz, 1 H), 7,40-7,28 (m, 7 H), 7,13 (3 H), 7,06 (d,J = 8,8 Hz, 1 H), 6,92 (t,J = 7,3 Hz, 1 H), 5,06 (ABq, J = 12,2 Hz, Dn = 8,9 Hz, 2 H), 4,18 (dd,J = 3,4, 8,8 Hz, 1 H), 4,10 (quinteto,J = 6,8 Hz, 1 H), 3,57 (m, 2 H), 3,50-3,22 (m, 3 H), 2,62-2,37 (m, 2 H), 2,23 (s, 3 H), 2,18-1,68 (m, 3 H), 1,05 (d,J = 6,8 Hz, 3 H) y (picos para la conformación menor): d 9,00 (bs, 1 H), 7,91 (bs, 1 H), 7,84 (d,J = 8,3 Hz, 1 H), 8,15 (d,J = 8,3 Hz, 1 H), 7,40-7,28 (m, 7 H), 7,13 (3 H), 7,06 (d,J = 8,8 Hz, 1 H), 6,92 (t,J = 7,3 Hz, 1 H), 5,01 (ABq,J = 12,2 Hz, Dn = 19,0 Hz, 2 H), 4,32 (dd,J = 2,4, 8,8 Hz, 1 H), 4,22 (quinteto,J = 6,8 Hz, 1 H), 3,57 (m, 2 H), 3,50-3,22 (m, 3 H), 2,62-2,37 (m, 2 H), 2,23 (s, 3 H), 2,18-1,68 (m, 3 H), 1,10 (d,J = 6,8 Hz, 3 H);

^{13}C RMN (125 MHz, DMSO-d_{6}): una mezcla de rotámeros, (picos para la conformación principal): d 170,80 (C=O), 170,52 (C=O), 169,18 (C=O), 152,61 (C=O), 138,10 (C), 137,38 (C), 136,04 (C), 130,05 (CH), 129,63 (CH), 129,47 (CH), 128,58 (C), 128,28 (CH), 127,89 (CH), 127,85 (C), 126,02 (CH), 122,50 (CH), 117,90 (CH), 117,81 (CH), 65,44 (CH_{2}), 59,61 (CH), 47,04 (CH_{2}), 41,75 (CH), 40,41 (CH_{2}), 40,00 (CH_{2}), 29,29 (CH_{2}), 24,13 (CH_{2}), 19,88 (CH_{3}), 17,88 (CH_{3}) y (picos para la conformación menor): d 170,94 (C=O), 170,52 (C=O), 169,31 (C=O), 152,61 (C=O), 138,10 (C), 137,38 (C), 136,04 (C), 130,05 (CH), 129,63 (CH), 129,47 (CH), 128,65 (C), 128,28 (CH), 127,89 (CH), 127,85 (C), 126,02 (CH), 120,94 (CH), 117,90 (CH), 117,81 (CH), 65,44 (CH_{2}), 59,91 (CH), 46,51 (CH_{2}), 42,01 (CH), 40,13 (CH_{2}), 39,84 (CH_{2}), 31,75 (CH_{2}), 22,11 (CH_{2}), 20,05 (CH_{3}), 17,78 (CH_{3});

MS (EI) m/z 579 [M+Na]^{+}, 557, 454, 426, 357, 336, 293, 267, 201;

Anal. Calc. para C_{32}H_{36}N_{4}O_{5}: C, 69,05; H, 6,52; N, 10,07; encontrado: C, 68,87; H, 6,52; N, 9,93.

Preparación de N-[[4-[[(2-metilfenilamino)carbonil]amino]fenil]acetil]-L-prolil-3-metil)-\beta-Alanina (8; oMePUPA-V)

Una solución de oMePUPA-V-OBn (7; 80,18 g) en THF/H_{2}O (9:1; 800 ml) se hidrógeno a \sim3,85 kg/cm^{2} en presencia de Pd/C (10%; 2,44 g). Después de 25 h, se filtró la mezcla de reacción a través de Solka Floc® (144 g; Fiber Sales & Development Corp.) en un embudo de vidrio sinterizado. El material filtrado se filtró de nuevo a través de otra almohadilla de Solka Floc® (115 g), se concentró hasta \sim250 ml y se vertió gradualmente en tolueno bajo agitación fuerte (3 l). La suspensión se dejó agitando durante 0,5 h, se filtró (2 l, embudo de vidrio sinterizado) y el polvo blanco resultante se dejó secar, primero en el embudo con succión (\sim80 mmHg; 0,5 h) y después en un horno a vacío (14 h; 45ºC; presión ajustada a 63,5 cmHg a vacío con flujo de N_{2}). Los pedazos blancos se machacaron (mortero y almirez) para dar 58,3 g de un fino polvo (rendimiento del 87%) de oMePUPA-V como un sólido blanco. El producto se recristalizó en acetona/H_{2}O (320 ml/75 ml). Los cristales se recogieron y se secaron primero en el embudo de vidrio sinterizado con succión (1 h, 80 mmHg) y a continuación en el horno a vacío (25 h; 45ºC; presión ajustada a 63,5 cmHg a vacío mediante flujo de N_{2}) para proporcionar 47,0 g (84% de recuperación desde la recristalización) de oMePUPA-V como un sólido blanco (pureza HPLC 99,1%).

P.f. 153,6-154,4ºC;

IR (KBr) 3354, 3307, 1719, 1643, 1590, 1543, 1514, 1449, 1414, 1308, 1237 cm^{-1};

^{1}H RMN (600 MHz, DMSO-d_{6}): una mezcla 3:2 de rotámeros, (picos para la conformación principal): \delta 12,21 (bs, 1 H), 8,99 (s, 1 H), 7,91 (s, 1 H), 7,87 (d,J = 8,2 Hz, 1 H), 7,68 (d,J = 7,9 Hz, 1 H), 7,40 (d,J = 8,6 Hz, 2 H), 7,17 (d,J = 5,9 Hz, 2 H), 7,15 (d,J = 7,6 Hz, 1 H), 7,12 (dd,J = 7,9, 8,2 Hz, 1 H), 6,94 (dd,J = 7,3, 7,3 Hz, 1 H), 4,22 (dd,J = 3,3, 8,8 Hz, 1 H), 4,06 (m,J = 6,6 Hz, 1 H), 3,47 (dd, 1 H), 3,44 (d,J = 15,0 Hz, 1 H), 3,37 (dd, 1 H), 3,29 (d,J = 15,4 Hz, 1 H), 2,46 (dd, 1 H), 2,27 (m, 1 H), 2,25 (s, 3 H), 1,99 (m, 1 H), 1,80m (m, 1 H), 1,78 (m, 1 H), 1,76 (m, 1 H), 1,07 (d,J = 6,6 Hz, 3 H) y (picos para la conformación menor): \delta 12,21 (bs, 1 H), 8,99 (s, 1H), 7,90 (s, 1 H), 7,87 (d,J = 8,2 Hz, 1 H), 8,12 (d,J = 8,2 Hz, 1 H), 7,40 (d,J = 8,6 Hz, 2 H), 7,16 (d,J = 5,9 Hz, 2 H), 7,15 (d,J = 7,6 Hz, 1 H), 7,12 (dd,J = 7,9, 8,2 Hz, 1 H), 6,94 (dd,J = 7,3, 7,3 Hz, 1 H), 4,34 (dd,J = 1,8, 8,4 Hz, 1 H), 4,18 (m,J = 6,6 Hz, 1 H), 3,60 (m, 2 H), 3,59 (m, 1 H), 3,48 (m, 1 H), 2,47 (dd,J = 6,6, 15,4 Hz, 1 H), 2,40 (dd,J = 6,6, 15,4 Hz, 1 H), 2,25 (s, 3 H), 2,15 (m, 1 H), 1,83 (m, 1 H), 1,91 (m, 1 H), 1,77 (m, 1 H), 1,12 (d,J = 6,6 Hz, 3 H);

^{13}C RMN (150 MHz, DMSO-d_{6}): (picos para la conformación principal): \delta 172,4 (C=O), 170,9 (C=O), 169,3 (C=O), 152,6 (C=O), 138,2 (C), 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 129,6 (CH), 128,7 (C), 127,4 (C), 126,1 (CH), 122,6 (CH), 120,9 (CH), 118,0 (CH), 117,9 (CH), 59,7 (CH), 46,6 (CH_{2}), 41,71 (CH_{2}), 40,6 (CH_{2}), 40,2 (CH_{2}), 29,4 (CH_{2}), 22,2 (CH_{2}), 19,9 (CH_{3}), 17,9 (CH_{3}) y (picos para la conformación menor): \delta 172,5 (C=O), 171,0 (C=O), 160,5 (C=O), 152,7 (C=O), 138,19 (C), 137,5 (C), 130,2 (CH), 129,8 (CH), 129,6 (CH), 128,8 (C), 127,4 (C), 126,1 (CH), 122,6 (CH), 120,9 (CH), 118,0 (CH), 117,9 (CH), 59,9 (CH), 47,1 (CH_{2}), 42,0 (CH_{2}), 39,8 (CH_{2}), 40,3 (CH_{2}), 31,8 (CH_{2}), 24,2 (CH_{2}), 20,2 (CH_{3}), 17,9 (CH_{3});

MS (EI) m/z 468 [M+H]^{+}, 336, 267, 137;

Anal. Calc. para C_{25}H_{30}N_{4}O_{5}: C, 64,36; H, 6,48; N, 12,01; encontrado: C, 64,07; H, 6,40; N, 11,85.

Ejemplo 2 Actividad en un modelo ovino de inflamación pulmonar alérgica

Se emplearon carneros alérgicos que pesaban entre 27-50 kg. Todos los carneros habían mostrado previamente que desarrollaban respuestas bronquiales tempranas y tardías frente al alérgeno Ascaris suum inhalado por nebulización. Los carneros estaban conscientes y se sujetaron en posición prona con sus cabezas inmovilizadas en un carro de venta. Después de la anestesia tópica de las vías nasales con lidocaína al 2%, se avanzó un catéter de baloncillo a través de una narina hacia el esófago inferior. Los animales fueron entubados con un tubo endotraqueal con manguito a través de la otra narina, empleando como guía un broncoscopio de fibra óptica flexible. Todos los protocolos utilizados en este estudio estaban aprobados por el Comité de Investigación Animal del Centro Médico Mount Sinai, que es responsable de asegurar el cuidado humano y el uso de animales experimentales. La presión pleural se estimó empleando un catéter de baloncillo esofágico (relleno con 1 ml de aire), situado a 5 a 10 cm de la unión gastroesofágica. En esta posición, la presión pleural expiratoria final oscilaba entre -2 y -5 cm de H_{2}O. Una vez colocado el baloncillo, se aseguró para que permaneciera en posición durante la duración del experimento. La presión lateral de la tráquea se midió con un catéter de orificio lateral (diámetro interior, 2,5 mm) introducido a través del tubo endotraqueal y colocado distal al extremo del mismo.

Los catéteres de presión traqueal y pleural se conectaron a un transductor de presión diferencial (MP45, Validyne, Northridge, CA) para medir la presión transpulmonar que se había definido como la diferencia entre la presión traqueal y la pleural. La corriente de aire se midió conectando el extremo proximal del tubo endotraqueal a un neumatacógrafo (Fleisch, Dyna Sciences, Inc., Blue Bell, PA). Las señales de presión y flujo transpulmonar se registraron en un registrador fisiológico de canales múltiples que estaba unido a un ordenador personal 80-386 DOS para el cálculo en línea de la resistencia media del flujo pulmonar (R_{L}), dividiendo el cambio en la presión transpulmonar entre el cambio en el volumen de ventilación pulmonar medio (obtenido por integración digital). La media de al menos cinco respiraciones, exentas de artefactos tragados, se empleó para obtener R_{L} en cm de H_{2}O/l/s. Inmediatamente después de la determinación de R_{L}, se midió el volumen gaseoso torácico (V_{tg}) en un pletismógrafo corporal de volumen constante, para obtener la resistencia pulmonar específica (SR_{L} = R_{L} x V_{tg}) en l x cm de H_{2}O/l/s.

Todos los aerosoles de dosis líquidas se generaron empleando un nebulizador médico desechable de chorro de aire (Raindrop®, Puritan Bennett, Lenexa, KS) que proporcionaba un aerosol con un diámetro aerodinámico de masa media de 3, 2 \mum, según se determinó por un impactador en cascada de Andersen. El nebulizador se conectó a un sistema de dosímetro que constaba de una válvula solenoide y una fuente de aire comprimido (1,4 kg/cm^{2}). La salida del nebulizador estaba dirigida hacia una pieza de plástico en T cuyo extremo estaba conectado con el puerto inspiratorio de un respirador de pistón (Harvard Apparatus, S. Natick, MA). La válvula solenoide se activó durante un segundo al comienzo del ciclo inspiratorio del respirador. Los aerosoles fueron suministrados con un volumen corriente respiratorio de 500 ml y una tasa de 20 respiraciones por minuto. Para determinar la sensibilidad bronquial se realizaron curvas de respuesta de concentración acumulativa frente a carbacol, midiendo la SR_{L} inmediatamente después de la inhalación de tampón y después de cada administración consecutiva de 10 aspiraciones de concentraciones crecientes de carbacol (0,25, 0,5, 1,0, 2,0 y 4,0% peso/volumen en solución salina tamponada). El ensayo de provocación se interrumpió cuando la SR_{L} aumentaba por encima del 400% del valor post-solución salina o después de que se hubiera administrado la mayor concentración de carbacol. La sensibilidad bronquial se determinó calculando la concentración acumulativa de carbacol (en unidades de respiración) que incrementaba la resistencia pulmonar específica un 400% sobre el valor de la post-solución salina (PC_{400}) mediante interpolación a partir de la curva de respuesta a la dosis. Cada unidad de respiración (UR) se definió como una respiración de 1% p/v de solución nebulizada de carbacol.

Las dosis de oMePUPA-V se disolvieron en etanol:solución salina normal 1:2, etanol:fosfato sódico 200 mM 1:5 o en tampón Tris. Cuando se empleó Tris, cualquier dilución requerida se realizó empleando la solución salina normal. Las dosis se prepararon en un volumen total de 3-5 ml.

En todos los estudios, la sensibilidad base de las vías aéreas (es decir, PC_{400}) se determinó tres o cuatro días antes de iniciar el estudio. En estudios de pre-tratamiento con una sola dosis, se midió la SR_{L} y los animales se trataron con el compuesto o con vehículo. La SR_{L} se midió de nuevo 2 horas después del tratamiento (justo antes de la estimulación) y a continuación los animales fueron estimulados con el alérgeno. En los estudios con dosis múltiples, empezando 4 días antes de la estimulación con el alérgeno, los animales fueron tratados una vez al día durante 4 días y se estimularon con el alérgeno 24 h después de la última dosis. La SR_{L} se midió antes y después de la última dosis del tratamiento con el compuesto o con el vehículo. En todos los estudios, la SR_{L}se midió de nuevo inmediatamente después de la estimulación con el alérgeno, cada hora desde 1-6 horas después de la estimulación, y cada media hora desde 6,5-8 horas después de la estimulación con el alérgeno. Las determinaciones posteriores al alérgeno de la sensibilidad de las vías aéreas (PC_{400}) se realizaron 24 horas después de la estimulación con el alérgeno.

Los valores se expresan como medias \pm error estándar de la media. El cambio en la SR_{L} se calculó para cada carnero como la diferencia desde la SR_{L} base previa a la estimulación. Los cambios posteriores de la SR_{L} a la estimulación en estaban caracterizados por una respuesta temprana de las vías aéreas (EAR) que se producía durante el periodo de aproximadamente 0-4 horas. Esto fue seguido de una respuesta tardía de las vías aéreas (LAR) que se producía durante aproximadamente el periodo de 4-8 horas después de la estimulación con el alérgeno. Las áreas por debajo de las curvas EAR y LAR se computerizaron para cada animal, empleando la norma trapezoidal. Reducciones significativas en el área por debajo de las curvas EAR o LAR, comparadas con el testigo de placebo, se tomaron como efectos terapéuticos sobre los cambios inducidos por el alérgeno en SR_{L}. La sensibilidad de las vías aéreas frente a carbacol (PC_{400}), determinada antes y a las 24 h de la estimulación con el alérgeno, se expresó como una proporción de PC_{400} (valores de PC_{400} posteriores/anteriores a la estimulación) para cada carnero. Un incremento significativo en la proporción de PC_{400} comparado con el testigo de placebo, se tomó como un efecto terapéutico. Las comparaciones con el testigo de placebo se realizaron empleando el análisis de un factor de la varianza seguido de la prueba de Dunnett (prueba a un extremo) para la comparación múltiple con un testigo. Las comparaciones que dieron como resultado p<0,05 se tomaron como estadísticamente significativas.

La Figura 1 muestra la respuesta a la dosis inhibidora de oMePUPA-V aerosolizada en carneros sensibles a Ascaris suum, estimulados 2 horas después de la dosificación. Los paneles de la izquierda muestran el cambio en la resistencia pulmonar específica SR_{L}, cm de H_{2}O/s. Los paneles de la derecha muestran la sensibilidad de las vías aéreas al carbacol inhalado (proporción de PC_{400}, anterior/posterior a la estimulación) determinada 24 h después de la estimulación. oMePUPA-V en dosis de 0,01 y 0,03 mg no inhibía la respuesta temprana o tardía de las vías aéreas o no alteraba la hipersensibilidad frente al carbacol, 24 h después de la estimulación con el alérgeno. Las dosis de 0,1, 1 y 3 mg inhibían la respuesta temprana de las vías aéreas e inhibían de forma máxima la respuesta tardía de las vías aéreas. Estas dosis también inhibían la hipersensibilidad al carbacol, 24 h después de la estimulación con el alérgeno. El análisis estadístico de estos datos se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2

5

Los carneros que eran naturalmente sensibles a Ascaris suum, se estimularon con un aerosol de alérgeno de Ascaris suum 2 h después de la administración con aerosol de oMePUPA-V en las dosis indicadas o 24 h después de la última dosis de la administración diaria repetida durante 4 días de una dosis sub-umbral de oMePUPA-V o la cantidad equivalente de PBS. La mecánica pulmonar, definida como el cambio en la resistencia específica de las vías aéreas, desde el valor base del estudio previo, se midió 8 h después de la estimulación conel alérgeno. La respuesta temprana de las vías aéreas (0-4 h, EAR) y la respuesta tardía de las vías aéreas (4-8 h, LAR) se expresaron como el área media bajo la curva de Resistencia específica pulmonar \Delta, frente al tiempo \pm s.e.m. La resistencia de las vías aéreas frente al carbacol inhalado se determinó antes de iniciar el estudio y a las 24 h de la estimulación con el alérgeno. La sensibilidad de las vías aéreas se determina como la proporción de PC_{400} (cantidad de carbacol necesaria para incrementar la resistencia en un 400%) en comparación con los valores previos y posteriores a la estimulación.

Irritación con dosis simple

Ninguna de las dosis de oMePUPA-V empleadas en el estudio anterior tiene un efecto irritante, tal y como se refleja por la falta de cambio en la resistencia de las vías aéreas comparada con la resistencia base, después de la estimulación con el alérgeno Ascaris suum. Esto se muestra en la Figura 2.

Estudios con dosis repetidas

La Figura 3 ilustra que una dosis de 0,03 mg de oMePUPA-V que había mostrado ser ineficaz cuando se empleaba como un pretratamiento agudo con dosis simple, muestra, sin embargo, que era protectora si se daba una vez al día durante 4 días cuando la estimulación con el antígeno se había hecho 24 h después de la última dosis. Los paneles a mano derecha superior e inferior muestran que este efecto se observaba empleando dos formulaciones diferentes. La hipersensibilidad hacia el carbacol después de 24 h adicionales se inhibía de forma máxima, tal y como se muestra en los paneles a mano derecha superior e inferior, de la Figura 3. El efecto protector de oMePUPA-V era significativo contra EAR y LAR y contra la hipersensibilidad hacia el carbacol y el análisis cuantitativo se muestra en la Tabla 3.

Los resultados de este estudio muestran que un único pretratamiento con un inhibidor de molécula pequeña de VLA-4, oMePUPA-V, mediante aerosol, puede proteger contra las respuestas tempranas y tardías de las vías aéreas, inducidas con el alérgeno y la AHR inducida después del alérgeno en el modelo de carnero alérgico. No se observó un efecto irritante en las vías aéreas con ninguna de las dosis de oMePUPA-V dadas como pretratamiento único. Los resultados mostraban también que la dosis eficaz de oMePUPA-V se podía reducir con tratamientos múltiples. Colectivamente, estos datos proporcionan una fuerte evidencia de que la ruta de adhesión de VLA-4 tiene un papel crítico en los indicadores patofisiológicos (LAR y AHR) de los efectos inflamatorios prolongados que se inician en las vías aéreas de carneros alérgicos, después de la provocación con el alérgeno.

TABLA 3

6

Los carneros, naturalmente sensibles a Ascaris suum, se estimularon con un aerosol de alérgeno de Ascaris suum, 24 h después de la última dosis de la administración diaria repetida durante 4 días, de una dosis sub-umbral de oMePUPA-V o la cantidad equivalente de PBS. La mecánica pulmonar, descrita como el cambio en la resistencia específica de las vías aéreas desde el valor base del estudio previo, se midió durante las 8 horas posteriores a la estimulación con el alérgeno. La respuesta temprana de las vías aéreas ((0-4 h, EAR), y la respuesta tardía de las vías aéreas (4-8 h, LAR) se expresan como el área media bajo la curva de resistencia pulmonar específica, frente al tiempo \pm s.e.m. La resistencia de las vías aéreas frente al carbacol inhalado se determinó antes de iniciar el estudio y 24 h después de la estimulación con el alérgeno. La sensibilidad de las vías aéreas se describe como la proporción de PC_{400} (cantidad de carbacol necesario para incrementar la resistencia en 400%) en comparación con los valores previos y posteriores a la estimulación.

Ejemplo 3 Actividad en modelos de hipersensibilidad de tipo retardado Estudios con eritrocitos de carnero

Se emplearon ratones Balb/c hembras, específicos, exentos de patógeno, de 8-10 semanas de edad procedentes de Jackson Labs, para todos los experimentos. Los animales tenían agua y alimento a voluntad. Los eritrocitos de carnero (sRBC) en solución de Alsever del mismo carnero, se obtuvieron semanalmente de Charles River Pharm. Services (Southbridge, MA). Los sRBC se sedimentaron por centrifugación a 1000 g durante 10 minutos a 4ºC y se retiraron todos los coágulos blancos visibles. Las células se lavaron a continuación en solución salina. El sedimento celular se resuspendió en solución salina y se hizo un recuento con un hemocitómetro. Las células se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta tener 2 x 10^{8} sRBC por ml. El Día 0, se sensibilizaron ratones mediante inyección por vía a.s.c. de 2 x 10^{7} sRBC en 100 \mul de PBS. El Día 5, se prepararon sRBC como arriba, pero se diluyeron en PBS hasta tener una concentración final de 4 x 10^{9} sRBC por ml. De esta preparación, se inyectaron 25 \mul por vía s.c. en la almohadilla de la pata trasera.

oMePUPA-V (lote nº 2770-029) se formuló para la administración entérica del compuesto, en un vehículo de PEG 400 al 60% en TRIS 0,02 M hasta una concentración de almacenamiento de 5 mg/ml. Se prepararon diluciones adecuadas en el vehículo PEG/TRIS y se administraron entéricamente en un volumen de 100 \mul. El anticuerpo anti-VLA-4 (PS/2) se diluyó en solución salina con una concentración de 4,3 mg/kg y se administró intraperitonealmente en 100 \mul. Todos los tratamientos se administraron inmediatamente después de la estimulación con sRBC.

La inflamación del testigo no estimulado (izquierda) y de las almohadillas de las patas traseras estimuladas (derecha) se midió empleando un compás de calibres de tensión de Mitutoyo (Modelo nº 304-196, Dyer, Lancaster, PA), 20 horas después de la estimulación de la almohadilla de la pata. Los datos se presentan como el cambio en el espesor de la almohadilla de la pata, determinado por substracción del espesor de la garra trasera izquierda del espesor de la garra trasera derecha. Los cambios en el espesor de la almohadilla de la pata se compararon empleando una prueba T de Student a dos extremos.

El anticuerpo PS/2 anti-VLA-4 con una dosis de 4,3 mg/kg, inhibía intraperitonealmente la inflamación en aproximadamente el 30%, mientras que oMePUPA-V administrado entéricamente con una dosis de 20 mg/kg no tenía efecto en este modelo (datos no mostrados). Se estudió la eficacia de oMePUPA-V administrado con una dosis de 20 mg/kg por vía entérica en el modelo DTH inducido con sRBC en ratones, y no se observó eficacia.

Ejemplo 4 Actividad en modelos de hipersensibilidad de tipo retardado Modelo de hipersensibilidad por contacto

Ratones Balb/c hembras de 20 g de peso, exentos de virus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) en agrupaciones de cuatro en una jaula en jaulas microaisladas en animalarios exentos de virus de Biogen y que recibían alimento de ratones y agua corriente a voluntad, se emplearon para todos los estudios. Los ratones fueron anestesiados con cetamina:xilazina (90:10 mg/kg, i.p.). Un parche de 3 cm^{2} de piel abdominal, xifoideo al pubis quedó expuesto afeitando a fondo el pelo y la piel se frotó con etanol al 70%. Un volumen de 25 \mul de DNFB al 0,5% en un vehículo de acetona:aceite de oliva 4:1, se aplicó uniformemente sobre la piel abdominal descubierta. La piel se raspó ligeramente aplicando la punta de una pipeta para facilitar una ligera inflamación. El ratón quedó tumbado en posición supina en su jaula y se le dejó recuperar de la anestesia. Veinticuatro horas después de la sensibilización inicial, se sensibilizaron de nuevo los ratones con 25 \mul de DNFB al 0,5% en vehículo en el mismo lugar de la piel abdominal, seguido de nuevo por un ligero raspado con la punta de la pipeta. La segunda sensibilización se realizó mientras que se tenía encerrado al ratón sin anestesiar. El día 5 (aproximadamente 120 horas después de la sensibilización inicial), se empleó una dosis subirritante del sensibilizador (DNFB al 0,2% en vehículo de acetona:aceite de oliva 4:1 v/v) para estimular la respuesta inmune. Los ratones se anestesiaron con 90:10 mg/kg de cetamina:xilazina, por vía i.p., y se aplicaron 10 \mul de DNFB al 0,2% en la superficie dorsal de la oreja izquierda. La oreja derecha recibió una aplicación similar del vehículo de acetona:aceite de oliva 4:1 v/v. Después del periodo posterior de 24 horas, se produjo una respuesta inflamatoria bifásica de la oreja, tal y como se muestra en la Figura 4. Veinticuatro horas después de la estimulación, se anestesiaron de nuevo los ratones con cetamina:xilazina y se midió el espesor de ambas orejas con un micrómetro de ingeniería hasta una exactitud de 0,10 mm.

Los compuestos (100 \mul) o el vehículo adecuado (dimetilsulfóxido [DMSO] en solución salina tamponada con fosfato isotónica [PBS], 100 \mul) se administraron oralmente mediante sonda nasogástrica, 4 horas después de estimular la respuesta inmune el día 5. Se emplearon grupos de 8 ratones para cada tratamiento sometido a ensayo. oMePUPA-V (carga número 2044-076) se disolvió en agua destilada mediante adición de tampón de fosfato sódico al 0,5%, pH 8,8 y DMSO al 3%. La respuesta inflamatoria de la oreja de cada ratón se calculó como la diferencia entre el espesor de la oreja estimulada con vehículo y la estimulada con DNFB, 24 horas después de la estimulación. La inflamación típica de la oreja inducida con DNFB era de 65-75 x 10,16 x 10^{-6} cm. La inhibición de la respuesta inflamatoria de las orejas se determinó comparando los grupos tratados con su grupo testigo de vehículo. El significado estadístico de las diferencias entre los diferentes grupos de tratamiento se evaluó empleando el análisis de un factor de la varianza, seguido de la prueba de Dunnett para comparaciones múltiples con un grupo testigo (Systat, SPSS Inc.) empleando p<0,05. Los valores se expresan como medias \pm error estándar de la media (SEM).

La Figura 4 compara las respuestas inflamatorias de las orejas, medidas 24 horas después de la estimulación con DNFB en ratones que habían recibido vehículo (DMSO, PBS), compuesto testigo positivo (suministrado a 0,03 \mug/kg) o 0,03 ó 0,3 mg/kg de oMePUPA-V, dosificado entéricamente 4 horas después de la estimulación con DNFB (panel superior). Los porcentajes de inhibición inducidos con el tratamiento se muestran en el panel inferior. Ambas dosis de oMePUPA-V inhibían significativamente la respuesta inflamatoria de las orejas hasta un grado similar al mostrado por el compuesto testigo positivo.

Dosis únicas entéricas de 0,03 ó 0,3 mg/kg de oMePUPA-V proporcionadas 4 horas después de la estimulación con DNFB, podían inhibir significativamente la respuesta inflamatoria de las orejas en un modelo de hipersensibilidad por contacto en ratones.

Ejemplo 5 Bioquímica 5.1 Afinidad hacia el receptor de oMePUPA-V tal y como se midió empleando un conjugado de fosfatasa alcalina y VCAM-Ig en un ensayo de ligación directa de VCAM-Ig (DBA)

VCAM-Ig se construyó y se purificó tal y como se ha publicado (Jakubowski, A. y col. Cell Adhesion and Communication 3:131-142, 1995). La conjugación con fosfatasa alcalina intestinal de ternera, con el fin de escindir un sustrato cromógeno, se realizó tal y como se ha publicado (Lobb, R.R. y col. Cell Adhesion and Communication 3:385-397, 1995). La unión a VLA-4 se determinó en la línea de células T humanas, Jurkat (\alpha4\beta1). VCAM-Ig-AP y oMePUPA-V competían por la unión a \alpha4\beta1 en la superficie de estas células en presencia de Mn^{+2} 1 mM.

En el ensayo de unión directa de VCAM-Ig, oMePUPA-V compite con VCAM-Ig-AP para unirse a las células Jurkat en presencia de MnCl_{2} 1 mM, dependiente de la concentración, con un IC50 de 8 \pm 1 nM (n = 9). Los resultados se muestran en la Tabla 4.

5.2 Afinidad por el receptor de oMePUPA-V tal y como se midió empleando el conjugado de VCAM-Ig y fosfatasa alcalina en el ensayo de proteína/proteína de VLA-4

VLA-4 se purificó a partir de un extracto detergente de un subclon con alta expresión de células K562 transfectadas con \alpha4, mediante cromatografía de afinidad con anticuerpo y se inmovilizó sobre pocillos de microtitulación para establecer un ensayo de ligación competitiva proteína/proteína. VCAM-Ig-AP se unió a la placa revestida con VLA-4 purificado, en ausencia o en presencia de oMePUPA-V (lote nº 2) y MnCl_{2} 1 mM. Las placas se leyeron a 405 nm y los datos se analizaron empleando el programa SoftMax v. 2.32.

La unión del conjugado VCAM-Ig a VLA-4 purificado se bloqueó completamente mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-\alpha4 específico (HP1/2). Dos IC50 obtenidas para oMePUPA-V en el ensayo de proteína/proteína de VLA-4 están tabuladas en la Tabla 4 tal y como se obtuvieron los IC50 en células Jurkat a partir del ensayo de ligación competitiva de VCAM-Ig-AP y del ensayo de adhesión celular a CS1.

5.3 Afinidad del receptor de oMePUPA-V tal y como se determinó en el ensayo de adhesión celular a CS1

a. Adhesión de células Jurkat al conjugado CS1/BSA.

El péptido NH_{2}-cisteína-tirosina-CS-1 se sintetizó y se acopló a BSA-SMCC (SMCC es un reticulador heterobifuncional que reacciona con grupos amino libres en BSA y la única cisteína del péptido sintético) con una proporción de CS1/BSA de 10:1. Los pocillos se revistieron durante una noche con 100 \mul de conjugado diluido para dar una concentración final de 1 \mug/ml. Al día siguiente, los pocillos se bloquearon con BSA en PBS durante una hora y a continuación se lavaron tres veces.

La línea humana de células T, Jurkat, se marcó con BCECF-AM 2 \muM, un colorante fluorescente de éster acetoximetílico de (2',7',bis-(2-carboxietil)-5 y -6)carboxi fluoresceína (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon; nº de catálogo B-1150) que se internalizaba y se desesterificaba quedando atrapado de este modo el colorante en las células vivas. Las células Jurkat (1 x 10^{5} células/pocillo) en tampón que contenía Mn^{+2} 1 mM se añadieron a las placas revestidas en presencia de diluciones en serie de tres veces el inhibidor. Cada concentración se sometió a ensayo por duplicado. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, las placas se invirtieron y se lavaron tres veces o hasta que ninguna célula se adhería a los pocillos testigos revestidos sólo con BSA. Las células que se adherían a CS1 fueron cuantificadas en un lector de placas fluorescente de Cytofluor, empleando una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.

Las células adheridas a CS1/BSA en ausencia de compuesto, servían como el testigo de 0% de inhibición, mientras que las células que se adherían sólo a BSA servían como el testigo de 100% de inhibición. Las IC50 se calcularon empleando el programa Deltagraph, versión 5.

La adhesión de las células Jurkat marcadas en presencia de Mn^{+2} fue bloqueada completamente por EDTA y el mAb anti-\alpha4\beta1 neutralizante, HP1/2, indicando que la unión era específica. La Tabla 4 muestra la actividad de oMePUPA-V en el ensayo de adhesión a CS1/BSA, así como los resultados del ensayo de ligación.

oMePUPA-V es un potente antagonista de VLA-4 en tampones que contienen Mn^{+2}. Es 80 veces más potente cuando se somete a ensayo en presencia de Mn^{+2} sobre VLA-4 aislado que sobre células Jurkat en el ensayo de ligación. oMePUPA-V es un antagonista funcional, tal y como se muestra por su capacidad de bloquear totalmente la adhesión de Jurkat a CS1 dependiendo de la dosis. Los valores absolutos en el ensayo de adhesión son mayores que los observados en los ensayos de ligación. Esto puede ser debido a la naturaleza multivalente de la adhesión. En todos los formatos del ensayo, la inhibición de la unión mediante EDTA y HP1/2 demuestra la unión específica a VLA-4.

TABLA 4 Afinidad por el receptor de oMePUPA-V en presencia de MnCl_{2} 1 mM, tal y como se mide en el ensayo de ligación competitiva de VCAM-Ig, el ensayo de adhesión celular a CS1 y el ensayo de proteína/proteína de VLA-4 purificado

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6.4 Especificidad de la inhibición de oMePUPA-V

a. La especificidad de oMePUPA-V se determinó empleando células JY en los ensayos de unión directa de VCAM-Ig y de adhesión a CS1.

La unión a \alpha4\beta7 se determinó en células JY en presencia de Mn^{+2}. En el ensayo de unión, VCAM-Ig y oMePUPA-V compiten por la unión a \alpha4\beta7 en células JY (véase la sección 4.1.1 para el protocolo del ensayo). En el ensayo de adhesión celular, se sometió a ensayo la capacidad de oMePUPA-V para bloquear la unión de células JY (\alpha4\beta7) al conjugado CS1/BSA.

oMePUPA-V no bloquea la unión de \alpha4\beta7 a VCAM-Ig o CS1/BSA. El Mab anti-\beta7, Fib27 (Pharmingen), inhibía estas interacciones completamente indicando que la unión era específica de \alpha4\beta7. Por tanto, oMePUPA-V es un inhibidor específico de VLA-4. Los resultados están tabulados en la Tabla 5.

b. Especificidad de oMePUPA-V tal y como se determinó empleando la adhesión de células K562 a pocillos revestidos con Fn-120.

Placas sin tratar de fondo plano de poliestireno con 96 pocillos se revistieron con 5 \mug/ml de Fn-120, durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se bloquearon con seroalbúmina de ternera al 1% (BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces con tampón TBS que contenía MnCl_{2} 1 mM (tampón del ensayo). Las células K562 se marcaron con 2 \muM del colorante fluorescente, BCECF-AM (véase sección 4.1.3) y se unieron a la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se invirtieron y se lavaron tres veces y las células adherentes se cuantificaron en un lector de placas fluorescente de Cytofluor, empleando una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.

La adhesión de K562 a Fn-120 se bloqueó completamente con el anticuerpo anti-\alpha5 neutralizante, IIA1 (Pharmingen), indicando una unión específica a través de VLA-5. No existía inhibición de la unión de las células K562 al fragmento Fn120K mediante oMePUPA-V en dosis tan altas como 100 \muM. Véase Tabla 5 a continuación.

c. Ensayos de agregación realizados para determinar la especificidad de oMePUPA-V.

Métodos

La actividad contra gpIIbIIIa se determinó mediante agregometría convencional de plaquetas empleando un plasma rico en plaquetas. El ADP se utilizó para iniciar la agregación en presencia de plasma, en donde Ca^{+2} y Mg^{+2} eran los cationes divalentes principales. GRGDSP @ 100 \mu/ml se empleó como testigo positivo.

Resultados

oMePUPA-V se sometió a ensayo con tres dosis de 1, 10 y 100 \muM. No inhibía la agregación plaquetaria cuando se inducía con ADP, con ninguna de las dosis. Los resultados se muestran en la Tabla 5. oMePUPA-V es altamente específico (>10.000 veces) para VLA-4. No tiene una actividad medible (>100 \muM) contra las integrinas relacionadas, \alpha4\beta7 y VLA-5 o contra la integrina \beta3, gpIIbIIIa.

TABLA 5 Actividad inhibidora de oMePUPA-V tal y como se mide en el ensayo de ligación competitiva de \alpha4\beta7 VCAM-Ig, los ensayos de adhesión de \alpha4\beta7 y VLA-5 y en los estudios de agregación plaquetaria

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Ejemplo 6 Ensayo de oMePUPA-V para la inducción de LIBS 6.1 Medición en Jurkat empleando el anticuerpo 9EG7 de LIBS

a. La inducción de LIBS mediante antagonistas de \alpha4\beta1 se sometió a ensayo in vitro mediante análisis con FACS.

Las células Jurkat (2 x 10^{5}/pocillo) se preincubaron a 37ºC durante 20 minutos con solución salina tamponada con TRIS que contenía MgCl_{2} 2 mM (Mg^{+2}-TBS) solo o con diluciones en serie de los compuestos del ensayo. Las muestras se transfirieron a un baño de hielo y se suplementaron con anticuerpo de LIBS, 9EG7, hasta una concentración final de 10 \mug/ml. Las células se lavaron dos veces con Mg^{+2}-TBS y se resuspendieron en una dilución de 1:200 de un conjugado de FITC-IgG de cabra anti-ratón en Mg^{+2}-TBS y se incubaron durante 30 min a 4ºC. Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en Mg^{+2}-TBS. La intensidad media de la fluorescencia (MFI) se determinó por análisis con FACS (Becton Dickinson FACScan). Los resultados se expresan como MFI. Los datos fueron analizados con el programa Excel v5.0 y Deltagraph v4.0 de Microsoft.

La Fig. 5 muestra que oMePUPA-V induce la exposición del epítopo de LIBS cuando se compara con el tampón Mg^{+2} 2 mM (Panel B). La inducción era dependiente de la concentración y similar en magnitud a la inducción observada con Mn^{+2} 1 mM (Panel A). La omisión del anticuerpo de LIBS y el anticuerpo de detección o sólo la omisión del anticuerpo de detección, eliminaba la marcación (Panel B). La ED50 de la respuesta era \sim 20 nM.

Conclusión

Estos datos indican que oMePUPA-V induce el mismo cambio conformacional en VLA-4 que el observado con ligandos naturales. Los valores de LIBS caen generalmente en el intervalo definido por los ensayos de ligación y de adhesión que son 8 nM y 22 nM, respectivamente, para oMePUPA-V.

6.2 El escrutinio del receptor de especies múltiples

a. Afinidad del receptor de oMePUPA-V tal y como se mide en el ensayo de ligación directa de VCAM-Ig empleando un conjugado de VCAM-Ig y fosfatasa alcalina y linfocitos de sangre periférica o células del bazo de varias especies.

Los PBLs se aislaron a partir de sangre periférica humana, de carnero y de perro empleando métodos descritos para los PBLs de carnero (Abraham, W.M. y col., J. Clin. Invest. 93:776-787, 1984). El ensayo de unión competitiva de VCAM-Ig-AP se empleó para comparar la unión de oMePUPA-V a estos distintos tipos celulares.

Las IC50 obtenidas para oMePUPA-V en linfocitos de sangre periférica o en células del bazo de distintas especies en presencia de Mn^{+2}, se muestran en la Tabla 6. En presencia de Mn^{+2}, oMePUPA-V inhibe con una IC_{50} similar la unión de VCAM-Ig a linfocitos obtenidos a partir de seres humanos, ratas, perros, carneros y ratones. No hay evidencia de una especificidad de especie. Esto es compatible con el alto grado de conservación de secuencias observado entre especies para VLA-4 y sus ligandos naturales, CS-1 y VCAM.

TABLA 6 Afinidad del receptor de oMePUPA-V tal y como se mide en el ensayo de unión competitiva de VCAM-Ig, empleando conjugado de fosfatasa alcalina y VCAM-Ig y linfocitos de sangre periférica o células del bazo procedentes de distintas especies

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Ejemplo 7 Cinéticas del receptor de oMePUPA-V 7.1 Ensayo de competición empleando un inhibidor ^{3}H como sonda

Las células Jurkat se mantuvieron en medio RPMI-1640 más suero bovino fetal al 10% a 37ºC en un incubador de cultivos tisulares. Para los estudios de ligación, las células se sedimentaron por centrifugación, se lavaron dos veces con TBS (Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, seroalbúmina bovina al 0,1%, glucosa 2 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4), se suspendieron hasta tener aproximadamente 2 x 10^{6} células/ml en TBS y se contaron empleando un hemocitómetro de Neubauer. Las células se diluyeron adicionalmente hasta 1,5 x 10^{6}/ml en los tampones indicados y se sometieron a los tratamientos específicos definidos para cada experimento. Las células se sedimentaron a continuación por centrifugación, se resuspendieron en 100 \mul de tampón del ensayo y se transfirieron a un frasco de centelleo que contenía 2,9 ml de ScintiVerse II (Fisher Scientific). La radiactividad asociada a las células se cuantificó por recuento del centelleo. Las cuentas unidas bajo estas condiciones miden la integrina que no está ocupada por el compuesto del ensayo y que, por tanto, está libre para unirse al inhibidor ^{3}H-conocido. Todos los estudios se realizaron en tubos eppendorf de 1,5 ml siliconizados con un volumen de muestra convencional de 1 ml. La unión no específica del inhibidor ^{3}H-conocido a las células (ruido de fondo) se definió midiendo el inhibidor unido en ausencia de ion metálico. Las cuentas específicas unidas se calcularon sustrayendo las cuentas no específicas del total de cuentas unidas.

Se realizaron una serie de estudios de competición para verificar que oMePUPA-V y el inhibidor conocido compiten por el mismo sitio en VLA-4. Primero, el inhibidor ^{3}H-conocido se mezcló con una cantidad equimolar de oMePUPA-V, un exceso de 10 veces y un exceso de 100 veces, y se incubó con células Jurkat y se determinó la capacidad del inhibidor frío para competir en la unión con el inhibidor conocido. El tratamiento con oMePUPA-V producía una inhibición dependiente de la dosis de la unión del inhibidor ^{3}H-conocido. La concentración de oMePUPA-V que era necesaria para competir con la unión del inhibidor ^{3}H-conocido era 10 veces mayor que la necesaria cuando se utilizaba el frío como competidor, lo que es compatible con la menor afinidad hacia VLA-4 activado con Mn^{+2}. Segundo, las células Jurkat activadas con Mn^{+2} se trataron con inhibidor ^{3}H-conocido para ocupar en primer lugar VLA-4 con la sonda radiactiva y añadir a continuación oMePUPA-V frío. Los tratamientos posteriores con un exceso de oMePUPA-V frío o con inhibidor conocido no se distinguían por su capacidad para desplazar la sonda radiactiva. Tercero, las células Jurkat activadas con Mn^{+2} se trataron con cantidades saturantes de oMePUPA-V y se midió la tasa con la que oMePUPA-V se disociaba. A pesar de la semivida prolongada del inhibidor conocido de VLA-4 activado con Mn^{+2}, oMePUPA-V se libera rápidamente de oMePUPA-V-VLA-4 con un t_{^{1}/_{2}} de menos de 10 min. La gran diferencia en t_{^{1}/_{2}} para oMePUPA-V y el inhibidor conocido sugiere que la menor afinidad de oMePUPA-V hacia VLA-4 es el resultado de su tasa de disociación más rápida.

Los datos de la disociación revelan que la unión de oMePUPA-V a VLA-4 es altamente dependiente del estado de activación de VLA-4 y que muestra la misma selectividad por la activación que la observada con el inhibidor conocido. Igual que con VLA-4 activado con Mn^{+2}, el t_{^{1}/_{2}} de la disociación de oMePUPA-V de VLA-4 activado con Mg^{+2}, era menor de 10 min, el menor tiempo que se puede determinar en el formato de competición. Por otro lado, en presencia de Mg^{+2} más el anticuerpo activante, TS2/16, el t_{^{1}/_{2}} era prolongado (20 min). Todos los posibles estados de activación no se han determinado con detalle, sin embargo, se ha observado un simple escrutinio que puede destacar las diferencias. En este ensayo, una concentración fija de oMePUPA-V (10 nM) se mezcló con inhibidor ^{3}H-conocido 5 nM y se realizó la ligación bajos estas condiciones con distintos estados de activación. Si oMePUPA-V tenía una afinidad anormalmente alta o baja hacia VLA-4, ésta se podía detectar por la diferencia en la cantidad de inhibidor ^{3}H-conocido. Las diferencias en el porcentaje de inhibidor ^{3}H-conocido unido bajo distintos estados de activación se aproximan a lo que se pronosticaría basándose en las propiedades conocidas del inhibidor.

Los estudios de la unión verifican que oMePUPA-V compite con el inhibidor conocido en la unión a VLA-4, a concentraciones compatibles con su afinidad y demuestran que los dos compuestos compiten por el mismo sitio en la integrina. La similitud en la unión de oMePUPA-V y el inhibidor conocido, bajo diversos estados de activación de VLA-4, sugiere que el mecanismo de unión es similar.

7.2 Ensayo de oMePUPA-V en escrutinios con Panlabs y Cerep

oMePUPA-V se sometió a ensayo en el panel de escrutinio de Panlabs ProfilingScreen, de Discovery Screen y de Immunoscreen de radioligando, enzima y ensayos funcionales y en el panel de receptor de membrana de Cerep. No se observó una actividad significativa para oMePUPA-V con 10 \muM en ningún ensayo, incluyendo el ensayo del receptor NK1, contra el cual inhibidores conocidos mostraban alguna actividad.

Cerep también mostraba que oMePUPA-V no mostraba inhibición contra la actividad de la proteasa humana ACE. La fuente de las proteasas ACE eran células endoteliales humanas (HUVEC). ^{3}H-HGG, añadido a HUVEC, se convertía en ácido ^{3}H-hipúrico y glicilglicina mediante ACE. Captopril, un potente inhibidor de ACE, bloqueaba la conversión con un IC_{50} de 990 pM, mientras que oMePUPA-V no bloqueaba con 10 \muM.

Propiedades farmacéuticas

oMePUPA-V es un polvo cristalino de color blanco a crema. Es soluble en DMSO y tiene una solubilidad acuosa de 0,120 mg/ml. El comportamiento térmico de oMePUPA-V estudiado con DSC, TGA y microscopio calefactor, indica que el material se funde a aproximadamente 160ºC. A aproximadamente 136ºC, los análisis con DSC y TGA sugieren que oMePUPA-V libera una impureza volátil que puede ser compatible con la deshidratación de un monohidrato.

Formulación Formulación para nebulización

Las instrucciones para la fabricación de 100 ml de una formulación para nebulización de 5 mg/ml de oMePUPA-V se enumeran a continuación.

Preparar 200 ml de solución tampón de reserva del modo siguiente:

1.: Pesar 0,286 g de Trometamina, USP en un recipiente adecuado.

2.: Pesar 1,676 g de cloruro sódico, USP en el mismo recipiente.

3.: Añadir 200 ml de agua para inyección, USP.

Mezclar hasta homogeneidad

1.: Pesar 0,500 g de oMePUPA-V en un recipiente adecuado.

2.: Añadir 100 ml del tampón preparado en la etapa 1.

3.: Mezclar hasta homogeneidad.

4.: Filtrar estérilmente en un recipiente adecuado.

5.: Sellar con un cierre adecuado.

Propiedades típicas de la formulación:

pH: 7,4; Osmolalidad: 290 mOsm

Ejemplo 9 Indicación de la estabilidad del procedimiento HPLC

Columna: Zorbax® SB-C18,3 \mum de partícula, 4,6 x 150 mm

Precolumna: Zorbax® SB-C18,5 \mum de partícula, 4,6 x 12,5 mm

Caudal: 1 ml/min

Temperatura de la columna: 40ºC

Temperatura de la toma automática de muestras: 4ºC

Fase móvil A: 0,1% (p/v) de ácido trifluoroacético (TFA) en agua

B: 0,1% (p/v) de TFA en 90% (v/v) de acetonitrilo, 10% (v/v) de agua

Gradiente:

10

Inyección: 10 \mul de 0,2 mg/ml de soluciones en Tris/NaCl/agua (intermedio a granel) o en 0,1% de TFA/45% de acetonitrilo (producto final).

Detección: UV 254 nm (primario) y 215 nm

Testigo: oMePUPA-V, calentado en agua hirviendo durante 20 min.

El requisito preliminar del método fue completado.

Estabilidad de la sustancia del fármaco

No se observó degradación en el intermedio a granel almacenado durante dos semanas bajo las siguientes condiciones de almacenamiento: a 40ºC en un recipiente cerrado; a 50ºC en un recipiente cerrado, a 25ºC, RH 60%; y a 40ºC, RH 75%. A las cuatro semanas, uno o dos picos de degradación se volvieron detectables a 40ºC y 50ºC, pero el nivel de cada pico de impureza era todavía menor de 0,02%.

Estabilidad de la solución

a): Formulación para nebulización, 5 mg/ml en Tris/NaCl, almacenada a temperatura ambiente durante dos meses, mostraba picos de degradación de elución temprana con un nivel total de 1% (a 254 nm) y 2-3% (a 215 nm).

b): El calentamiento de la formulación para nebulización en agua hirviendo durante 20 min disminuye la pureza desde 99,9% hasta 98,7% a 254 nm y desde 100% hasta 93,6% a 215 nm.

c): La solución de 0,2 mg/ml en Tris/NaCl agua con un pH neutro es estable a 2-8ºC al menos durante una semana.

Claims

1. Un compuesto de fórmula (I):

11

o un profármaco farmacéuticamente aceptable, una sal o un isómero del mismo, en donde dicho profármaco es un profármaco de éster.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto es un profármaco.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el profármaco de éster se prepara haciendo reaccionar el compuesto de fórmula (I) con un alcohol C_{1-10} lineal o ramificado.

4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende adicionalmente un agente seleccionado entre el grupo consistente en corticoesteroides, broncodilatadores, antiasmáticos, antiinflamatorios, antirreumáticos, inmunosupresores, antimetabolitos, inmunomoduladores, antisoriáticos y antidiabéticos.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende adicionalmente un compuesto inhibidor de la adhesión celular.

7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el compuesto inhibidor es un inhibidor de VLA-4.

8. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, para la preparación de una composición farmacéutica para evitar, inhibir o suprimir la adhesión celular.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, para evitar, inhibir o suprimir la inflamación.

10. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar el asma, la rinitis alérgica, la esclerosis múltiple, la ateroesclerosis, la enfermedad inflamatoria intestinal o el mieloma múltiple.

11. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la esclerosis múltiple.

12. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar trastornos inflamatorios intestinales.

13. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar, evitar o mejorar los síntomas del asma.

14. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar, evitar, aliviar o suprimir enfermedades o trastornos mediados por la ruta de VLA-4.