NO165678B - Fremgangsmaate ved fremstilling av et polysyklisk eterantibiotikum. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte ved fremstilling av et nytt medlem av sure polysykliske eterantibiotika, en klasse forbindelser som biologisk karakteriseres ved sin effekt på kationtransporten over cellemembraner. Denne familie av antibiotika omfatter slike velkjente midler som monensin, nigericin, grisorixin, dianemycin, meduramycin, narasin, salinomycin, lasalocid, mutalomycin, ionomycin og leuseramycin. Det har vært gitt en oversikt over emnet av Westly i "Polyeter Antibiotics", Adv. A<p>pl. Microbiol., 22, 177, 1977.

De polysykliske eterantibiotika som er nevnt ovenfor, er aktive mot gram-positive bakterier, sopp og protozoa. Særlig utviser disse antibiotika sterk coccidiostatisk aktivitet. De har derfor vært anvendt med varierende hell for behandlingen av en rekke dyreinfeksjoner.

Den velkjente protozoa-sykdommen, coccidiose, er fremdeles et alvorlig problem, og kontroll derav er økonomisk viktig for veterinærvitenskapen, særlig for fjærfeindustrien. Coccidiose kommer av infeksjoner med en eller flere av artene Eimerie eller Isopora (for et overblikk, se Lund og Farr i "Diseases of Poultry," 5th ed., Biester and Schwarte, Eds., Iowa State University Press, Ames, Ia., 1965, pp. 1056-1996). Det finnes seks arter av coccidia som frembringer lett merkbar sykelighet i mottagelige kyllinger. Eimeria tenella, E. necatrix. E. brunetti. E acervulina, E. maxima og E. mivati frembringer skader enten direkte gjennom destruksjon av epitelceller i fordøyelseskanalen eller indirekte ved produksjon av toksiner. Tre andre arter av protozoa som hører til samme genus, betraktes som forholdvis uskadelige; dog kan E. mitits. E. ha<q>ani og E. praecox redusere vektøkning, senke foreffektiviteten og påvirke eggproduksjonen negativt.

Med henblikk på de store økonomiske tap grunnet coccidiose fortsetter jakten på et nytt coccidiostatisk middel.

Enteritt er en annen sykdom som kan forårsake alvorlige økonomiske tap for husdyroppdrettere. Enteritt oppstår i kyllinger, griser, fe og sauer og tilskrives hovedsakelig anaerobe bakterier, særlig Clostridium perfringens, og virus. Enterotoksemi i drøvtyggere som "forspisningssykdom" hos sauer er et eksempel på, er en tilstand som forårsakes av C. perfringens-infeksjon.

Svinedysenteri er en av de vanligste svinesykdommer som diagnostiseres i USA. I tillegg er sykdommen også utbredt i mange andre land og forårsaker hvert år betraktelige tap i bestanden for svineoppdrettere i hele verden. Det har nylig vært oppdaget at en spirochæt er den forårsakende organisme for sykdommen. Denne organisme, Tre<p>onema hvodvsenteriae. er nå blitt isolert, og det er vist at den kan frembringe sykdommen [Harris, D. L. et aJL. "Swine Dysentery-1, Inoculation of Pigs with Treponema hvodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease," Vet. Med/ SAC. 61-64, 1972]. Forsøksdata som er oppført i det følgende, vedrører forsøk utført med denne organisme. Det bør bemerkes at det ikke er kjent om T. hvodysenteriae er den eneste organisme som forårsaker svinedysenteri. Fra de tilgjengelige data kan det dog konkluderes med at den er hovedkilden for infeksjonen.

Prestasjonsøkning (øket grad av vekst og/eller øket effektivitet ved forutnyttelse) i drøvtyggere såsom fe, og i monogastriske dyr såsom svin, er et annet økonomisk ønskelig mål for veterinærvitenskapen. Av særlig interesse er forbedret prestasjon som oppnås ved øket effektivitet av forutnyttelsen. Mekanismen for utnyttelse av hovednærings-delene i drøvtyggerfor er velkjent. Mikroorganismer i dyrets vom nedbryter karbohydrater for å frembringe monosakkarider og omdanner deretter disse monosakkarider til pyruvatfor-bindelser. Pyruvatene metaboliseres ved hjelp av mikro-biologiske prosesser for å danne acetater, butyrater eller propionater, som samlet er kjent som flyktige fettsyrer. For en mer detaljert diskusjon, se Leng i "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant," Phillipson et al., Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 197 0, pp.. 408-410.

Den relative effektivitet for flyktig fettsyreutnyttelse diskuteres i McCullogh, i "Feedstuffs", June 19, 1971,

s. 19]; [Eskeland et al. i J. An. Sei., 33., 282, 1971]; og Church et al. i "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Vol. 2, 1971, pp. 622 og 62 5. Selvom acetater og butyrater utnyttes, blir propionatene utnyttet med større effektivitet. Videre kan dyrene utvikle ketosis når for lite propionater er tilgjengelig. En substans med god virkning stimulerer derfor dyrene til å frembringe en høyere andel av propionater fra karbohydrater, for slik å øke karbohydrat-utnyttelsesgraden og også å reduseres forekomsten av ketosis.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte ved fremstilling av et nytt surt polysyklisk eterantibiotikum. EPA-0169011 beskriver et surt polysyklisk eterantibiotikum betegnet UK-58,852 som har formel:

hvori R og R<1> begge er H, hvilket antibiotikum fremstilles ved aerob propagering under overflaten i et vandig næringsmedium av mikroorganismen Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697 som ble isolert i en jordprøve fra Japan. Det er nå funnet at hydrolyse av UK-58,852 under nøyaktig kontrollerte betingelser fører til spaltning av en av de

festede glykonringer, og det frembringes en ny forbindelse som er fullt effektiv som et bredspektret coccidiostatisk middel, og som har fordeler over UK-58,852-forbindelsen på grunn av sin forbedrede toksisitetsprofil.

I henhold til foreliggende oppfinnelse frembringes derfor en forbindelse som betegnes antibiotikum UK-61,689 med formel:

og dens farmasøytisk akseptable kationiske salter. Eksempler på slike salter er natrium- og kaliumsaltene. Fremgangsmåtene omfatter kontrollert hydrolyse av forbindelsen UK-58,852 eller et kationisk salt derav.

Hydrolysen av UK-58,852 utføres fortrinnsvis under anvendelse av para-toluen-sulfonsyre i et løsningsmiddel av acetonitril/vann. Den foretrukne acetonitril/vann-blanding inneholder mellom 5 og 0,5% vann. Fortrinnsvis anvendes et forhold på 1,1 molare ekvivalenter av para-toluensulfonsyre til 1 ekvivalent av natriumsaltet av UK-58,852.

Andre løsningsmiddelsystemer som kan anvendes, omfatter ren acetonitril eller t-butanol/vann eller aceton/vann. Alternative syrer omfatter mineralsyrer, såsom saltsyre, eddiksyre, eller en sterk syreharpiks. Generelt utføres reaksjonen ved romtemperatur og overvåkes ved tynnsjiktkromatografi inntil utbyttet av det ønskede produkt synes å være optimalt. Omsetningstiden er generelt ca. en til tre timer for para-toluensulf onsyre i hydrolysesystemet av acetonitril/vann, men vil variere avhengig av syren og løsningsmiddelsystemet som anvendes. Etter at omsetningen i det vesentlige er fullsten-: dig, nøytraliseres reaksjonsblandingen med overskudd av natriumbikarbonat, konsentreres og ekstraheres med dietyleter eller diklormetan og renses deretter under anvendelse av standardisert silikagel-kromatografiteknikk. Sluttproduktet kan deretter omkrystalliseres som den frie syre eller et hensiktsmessig kationisk salt.

Alternativt kan antibiotikum UK-61,689 fremstilles fra råfermenteringsekstrakter som inneholder UK-58,852. Slik konsentreres et fermenteringsekstrakt av metylisobutylketon (MIBK) og oppløses fortrinnsvis i acetonitril/vann og behandles med para-toluensulfonsyre. Den foretrukne acetonitril/vann-blanding inneholder 5% vann, og forholdet av rå fermenteringsolje til para-toluensulfonsyre er ca. 9:1; disse forhold er omtrentlige og kan varieres i henhold til sammen-setningen av fermenteringsekstraktet. Andre løsningsmiddel-systemer som kan anvendes omfatter metanol/vann, men hydrolysen kan også utføres ved behandling av det rå MIBK-ekstrakt med para-toluensulfonsyre i fravær av løsningsmiddel. Alternative syrer omfatter mineralsyrer, såsom saltsyre.

Antibiotikum UK-61,689 utviser hemmende virkning mot vekst av en rekke gram-positive mikroorganismer. I tabell I nedenfor er resultatene av in vitro-forsøk oppført. For dette forsøk inokuleres hver organisme i en rekke forsøksrør som inneholder næringsmedium og varierende konsentrasjoner av antibiotikum UK-61,689, for å bestemme den minimale konsentrasjon av forbindelsen i jjg/ml som hemmer veksten av organismen i et tidsrom på 24 timer (MIC).

Effektivitetsdata for Antibiotikum UK-61,689 og dets salter mot coccidiostatiske infeksjoner i kyllinger ble erholdt på følgende måte. Grupper på 3-5 ti dager gamle patogenfrie hvite italienerhanekyllinger ble matet med et blandingsfor som inneholdt antibiotikum UK-61,689 eller dets natrium-og/eller kaliumsalt enhetlig dispergert deri. Etter å ha fått denne rasjon i 24 timer ble hver kylling inokulert per os med oocyter av den spesielle art av Eimeria som ble undersøkt. Andre grupper av 3-5 ti dager gamle kyllinger ble matet med lignende blandingsfor uten antibiotikum UK-61,689 eller dets salter. De ble også infisert etter 24 timer og tjente som infiserte kontroller. Ytterligere en annen gruppe av 3-5 ti dager gamle kyllinger ble matet med samme blandingsfor uten antibiotikum UK61,689 og ble ikke infisert med coccidia. Disse tjente som normale kontroller. Resultatene av behandlingen ble evaluert etter fem dager i tilfelle E. acervulina, og seks dager for alle andre organismer. Kriteriet som ble brukt for å måle den coccidiostatiske aktivitet besto av lesjons-scoringer på 0 til 4 for E. tenella etter J. E. Lynch, "A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am. J- Vet. Res., 22, 324-326, 1961; og 0 til 3 for andre arter basert på modifika-sjonen av scoringssystemet foreslått av J. Johnson og W. H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit., 28, 30-36, 1970. Et konstant forhold ble bestemt ved å dele lesjonsscoringen for hver behandlet gruppe med lesjonsscoringen hos de infiserte kontroller.

Det ble funnet at antibiotikum UK-61,689 og dets kationiske salter utviser utmerket aktivitet mot coccidiostatiske infeksjoner i fjærfe. Når innlemmet i dietten for kyllinger på nivåer fra 15 til 120 ppm, er disse forbindelser effektive for å kontrollere infeksjoner som stammer fra Eimeria tenella. E. acervulina, E. maksima, E. brunetti og E. necatrix.

Verdien av dyrefor har vanligvis vært bestemt direkte ved mating av dyret. Britisk patentbeskrivelse 1,197,826 beskriver detaljert en vom-teknikk in vitro hvorved forandringer som oppstår i foret, og som frembringes av mikroorganismer, måles på enkel måte og med stor nøyaktighet ved evalueringen av dyrefor. Denne teknikk omfatter anvendelsen av en anord-ning i hvilken de fordøyende prosesser i dyrene ledes og studeres in vitro. Dyrefor, vom-inokulum og forskjellige vekstfrembringende midler innføres og trekkes fra en labora-torieenhet under nøyaktig kontrollerte betingelser, og de forandringer som finner sted, studeres kritisk og fremskri-dende i løpet av mikroorganismenes forbruk av foret. En økning i propionsyreinnholdet i vomvæsken indikerer at det er oppnådd en ønskelig respons i total vomprestasjon ved hjelp av de vekstfremmende midler i forblandingen. Forandrin-gen i propionsyreinnhold uttrykkes som prosent av propionsyreinnholdet som finnes i vomvæsken hos kontrollene. Lang tids foringsstudier in vivo anvendes for å vise en pålitelig korrelasjon mellom propionsyreøkningen i vomvæsken og en

forbedret prestasjon i dyrene.

Vomvæsken samles fra en fistulert ku som mates med en kommersiell fetende rasjon og høy. Vomvæsken filtreres straks over osteduk, og 10 ml tilsettes til en 50 ml konisk kolbe som inneholder 400 mg standardsubstrat (68% kornsti-velse + 17% cellulose + 15% ekstrahert soyabønnemel), 10 ml av en pH 6.8 puffer og forsøksforbindelsen. Kolbene tilføres oksygenfri nitrogengass i ca. 2 minutter og inkuberes i et rystevannbad ved 3 0°C i ca. 16 timer. Alle forsøk utføres i trippel.

Etter inkuberingen blandes 5 ml av prøven med 1 ml 25% metafosforsyre. Etter 10 minutter tilsettes 0,25 ml maursyre, og blandingen sentrifugeres ved 1500 rpm i 10 minutter. Prøvene analyseres deretter ved gass-væske-kromatografi ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet av D. W. Kellog, J. Dairy Science, 52., 1690, 1969. Peak-høyder for eddik-, propion- og butylsyre bestemmes for prøver fra ubehandlede inkuba-sjonsflasker.

Når testet ved hjelp av denne in vitro fremgangsmåte, forårsaket antibiotikum UK-61,689 i en mengde av 20 jig pr. ml en økning på ca. 80% i produksjonen av propionsyre i forhold til det som produseres i kontrolloppløsningen uten tilsatt antibiotikum UK-61,689. Forbindelser som stimulerer produksjonen av RPA (Rumen propionic acid), er kjent for å forbedre forutnyttelsen hos drøvtyggere såsom fe og sauer, og kan også ha en lignende effekt på monogastriske dyr, såsom griser. Antibiotikum UK-61,68 9 kan administreres til dyret ved innlemmelse i forblandinger, enten som den frie syre eller som et salt, f.eks. natrium- eller kaliumsaltet eller en blanding derav. Alternativt kan en råproduktform eller tørket fermenteringsbuljong som inneholder antibiotikum UK-61,689, innlemmes i forblandinger i de ønskede konsentrasjoner. Antibiotikum UK-61,689 kan også administreres i ønsket dose under anvendelse av en hensiktsmessig vedvarende frisettelsesanordning som er utformet for å måle ut konstante nivåer av medikamentet.

For anvendelse i behandlingen av coccidiosis i fjærfe administreres forbindelsen fremstilt i henhold til denne oppfinnelse oralt i en egnet bærer. Hensiktsmessig utføres medisineringen i drikkevannet eller i fjærfeforet, slik at en terapeutisk dose av middelet tas inn med det daglige vann og med matrasjonen. Middelet kan enten måles direkte i drikkevannet, fortrinnsvis i form av en væske, vannoppløselig konsentrat (såsom vandig oppløsning av et vannoppløselig salt) eller tilsettes direkte til foret som sådant eller i form av en forblanding eller et konsentrat. En forblanding eller et konsentrat av det terapeutiske middel i en bærer anvendes vanligvis for innlemmelse av middelet i foret. Egnede bærere er væsker eller faststoffer etter ønske, såsom vann, forskjellige mel, f.eks. soyabønnemel, linfrømel, maiskolbemel og mineralblandinger som vanligvis anvendes i fjærfefor. En særlig effektiv bærer er fjærfeforet selv, dvs. en liten del av fjærfeforet. Bæreren underletter en enhetlig fordeling av de aktive materialer i det ferdige for som forblandingen er iblandet i. Dette er viktig da kun små porsjoner av foreliggende sterkt virksomme midler er nødvendig. Det er viktig at forbindelsen blandes godt inn i forblandingen og deretter i foret. For dette formål, kan middelet dispergeres eller oppløses i en egnet oljebærer, såsom soyaolje, maisolje, bomulsfrøolje og lignende, eller i et flyktig organisk løsningsmiddel og deretter blandet med bæreren. Det vil være klart at andelene av det aktive materiale i konsentratet kan varieres innen vide grenser da mengden av middelet i det endelige for kan tilpasses ved å blande tilsvarende deler av forblandingen med foret for å oppnå et ønsket nivå av det terapeutiske middel.

Høypotens-konsentrater kan blandes av forfremstillere med proteinholdige bærere såsom soyabønnemel og andre mel som beskrevet ovenfor, for å frembringe konsentrerte tilsetningsstoffer som er egnet for direkte mating til fjærfe.

I slike tilfeller kan fjærfeet konsumere den vanlige dietten. Alternativt kan slike konsentrerte tilsetningsstoffer tilsettes direkte til fjærfeforet for å frembringe et næringsmessig balansert, endelig for som inneholder et terapeutisk effektivt nivå av forbindelsen fremstilt i henhold til oppfinnelsen. Blandingene blandes grundig ved hjelp av standardprosedyrer, såsom i en to-bladsblander, for å sikre homogenitet. Det vil naturligvis være klart for fagmannen at anvendelsesnivået av forbindelsen beskrevet heri vil variere under forskjellige forhold. Kontinuerlig medisinering på lavt nivå i løpet av vekstperioden, dvs. i løpet av de første 6 til 12 ukene for kyllinger, er et effektivt forebyggende tiltak. Ved behandling av etablerte infeksjoner kan høyere nivåer være nødvendige for å overkomme infeksjonen. Bruksnivået i foret vil generelt ligge i området fra 15 til 120 ppm. Administrert i drikkevann, vil nivået være det som frembringer den samlede daglige dose av medikamenteringen, dvs. 15 til 120 ppm, og være faktorisert ved vektforholdet av gjennomsnittlig daglig inntak av for til gjennomsnittlig daglig inntak av vann.

Foreliggende oppfinnelse illustreres ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

En oppløsning av 15,0 g (0,0147 mol) rent antibiotikum UK-58,852 (fremstilt som beskrevet i EPA 0169011) i acetonitril/vann (95:5) (400 ml) ble tilsatt 3,07 g (0,0161 mol) av p-toluensulfonsyre. Omsetningen ble fulgt ved hjelp av tynnsjiktkromatografi inntil utbyttet av det ønskede produkt synes å være optimalt (ca. 3 timer). Reaksjonsblandingen ble behandlet med et overskudd av fast eller vandig bikarbonat, og konsentrert til tørrhet under vakuum. Det resulterende faststoff ble oppløst i dietyleter og vasket med en mettet vandig oppløsning av natriumbikarbonat, bikarbonat-vaske-vannet ble ekstrahert med dietyleter, og alle eterlag ble samlet og vasket flere ganger med vann og mettet natriumklorid. Eteroppløsningen ble tørket over vannfri natriumsulfat og fordampet til tørrhet i vakuum. Det resulterende reaksjons-råprodukt inneholdt UK-61,689 som det overveien-ende produkt, men var forurenset med forskjellige mengder av utgangsproduktet UK-58,852 og andre biprodukter. Råproduktet ble renset ved silikagelkromatografi etterfulgt av omkrystallisering fra isopropyleter og gav 8,4 g (32%) UK-61,689 som natriumsalt, s.m.p. 175-176°C; [a]D<25> = +19,3°

(c=0,5, MeOH); C-13 NMR (CDC13): 179,15 ppm, 107,45, 103,18, 97,74, 96,96, 86,92, 84,60, 84,20, 72,27, 82,01, 80,88, 80,20, 79,86, 74,80, 74,55, 73,07, 70,06, 67,71, 66,89, 59,11, 56,81, 45,40, 39,82, 38,93, 36,46, 33,81, 33,71, 33,54, 33,42, 33,13, 32,44, 32,36, 30,56, 27,58, 26,90, 26,84, 26,11, 23,23, 18,40, 17,53, 16,9, 12,13, 11,04, 10,42.

EKSEMPEL 2

Et rå-fermenteringsekstrakt (MIBK) (1 1.) som inneholdt antibiotikum UK-58,852 (anslått til 25 g) ble konsentrert

under vakuum til 680 g. Den tykke, mørke olje ble tilsatt til acetonitril/vann (05:5) (5,6 1), og den resulterende melkeak-tige emulsjon ble behandlet med p-toluensulfonsyre (78,2 g) i en porsjon. Ettersom reaksjonen skred frem, ble emulsjonen

gradvis adskilt i to klare lag, som ble rørt kraftig i sammenlagt 1,25 timer. Reaksjonsblandingen ble helt i en skilletrakt, det oljeaktige bunnlag ble fjernet og oppslemmet med ytterligere acetonitril/vann (95:5). Aceto-

nitril/vann lagene ble samlet og behandlet med mettet vandig bikarbonat (400 ml). Blandingen ble deretter konsentrert til en tykk sirup i vakuum, oppløst i dietyleter/etylacetat (3:1)

(2 1) og vasket med mettet vandig natriumbikarbonat. Det organiske lag ble tørket over natriumsulfat og konsentrert i en tykk brun olje (432 g). Rensing ble mest hensiktsmessig utført under anvendelse av motstrøms-ekstraksjonsteknikker. Ekstraksjonen anvendte en heksan:etylacetat (1:1) som den ikke-polare fase og metanol:vann (3:2) som den polare vandige fase. Fordamping av de organiske ekstrakter ga et semi-faststoff som ble malt med isopropyleter for å gi "UK-61,689" som natriumsalt, 10 g, s.m.p. 169-170°C. Dette materialet viste seg å være identisk med forbindelse "UK-61,689" som ble fremstilt ved fremgangsmåten i Eksempel 1, da de ble sammenlignet ved hjelp av TLC og NMR.

EKSEMPEL 3

5,11 g antibiotikum UK 58,852 ble oppløst i acetonitril/vann (99:1) (127,7 ml), og 5,50 ml 1,00 N HC1 ble tilsatt opp-løsningen. Hydrolysen ble fulgt ved hjelp av tynnsjiktskroma-tografi inntil utbyttet av det ønskete produkt synes å være optimal (2 timer 45 min). Reaksjonsblandingen ble deretter behandlet med et overskudd av en mettet vandig natriumkar-bonatoppløsning og inndampet til tørrhet under vakuum. Det resulterende faststoff ble ekstrahert 2 ganger med dietyleter, og de kombinerte eterekstrakter ble vasket 2 ganger med en mettet vandig natriumbikarbonatoppløsning, 2 ganger med vann og 1 gang med mettet vandig natriumklorid. Eteropp-løsningen ble tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet under vakuum. Det erholdte råprodukt ble renset ved kromatografi på silikagel, etterfulgt av omkrystallisering fra isopropyleter og gav 856 mg av forbindelsen UK-61,689.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et antibiotikum med formel eller et farmasøytisk aksepabelt kationisk salt derav, karakterisert ved kontrollert sur hydrolyse av en forbindelse med formel og hvis nødvendig å omdanne den frie syreform til et farmasøytisk akseptabelt kationisk salt derav.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at hydrolysen utføres under anvendelse av para-toluensulfonsyre i et løsningsmiddel av

3. Fremgangsmåte i henhold til ett av de foregående krav karakterisert ved at acetonitril/ vann-blandingen inneholder mellom 5 og 0,5% vann.

4. Fremgangsmåte i henhold til et av de foregående krav karakterisert ved at det anvendes 1,1 molekvivalenter para-toluensulfonsyre til 1 molekvivalent av natriumsaltet av forbindelsen med formel II.

5. Anvendelse av forbindelsen med formel (I) som fortilset-ning for å fremme vekst og/eller forbedre utnyttelsen av foret.