CS271477B2

CS271477B2 - Method of antibiotic production

Info

Publication number: CS271477B2
Application number: CS875724A
Authority: CS
Inventors: Alexander C Goudie; Nigel D A Walshe
Original assignee: Pfizer Ltd
Priority date: 1986-08-01
Filing date: 1987-07-31
Publication date: 1990-10-12
Also published as: PL150863B1; PT85463B; US4912130A; YU144387A; FI873326A; EP0255335A2; YU45093B; NO165678C; US4992466A; CS572487A2; SK278214B6; DK171134B1; IN168460B; JPH0576959B2; NO873034L; MX7556A; IE60669B1; DD280105A5; GR3001582T3; ATE60784T1

Description

Řešení spočívá ve způsobu výroby antibiotika na basi póly cyklického éteru vzorce I nebo jeho kationtové soli_t přijatelné z farmaceutického hlediska tak, že se podrobí řícené hydrolýse sloučenina vzorce II nebo její kationtová sůl ve směsi rozpouštědel e obsahem acetonitrilu a _vody za přítomnosti kyseliny a popřípadě se volná kyselina převede na kationtovou sůl, přijatelnou z farmaceutického hlediska.

CS 271 477 B2

(11)
(13)	B2
(51)	Int.	Cl.⁵
	A 61	к 31/335
	C 07	D 407/14

i

CS 271 477 B2

Vynález ee týká způsobu výroby antibiotika na basi póly cyklického etheru· Jde o skupinu sloučenin» která je biologicky charakter!sována svým účinkem na transport kati ontů buněčnými membránami· Tato skupina antibiotik zahrnuje známé sloučeniny jako monensin» nigericin, grisorixin, dianeaycin, meduranyein, narasin, salinomycin, lasalocid, mutalomycin, ionomycin a leuseramycin· Souhrnná správa o těchto sloučeninách je uvedena v publikaci Vestley, Polyether Antibiotics, Adv· Appl· Microbiol·, 22_t 177, 1977·

Svrchu uvedená antibiotika typu póly cyklického etheru jsou účinná proti grampositivním bakteriím, houbám a prvokům· tato antibiotika mají také vyjádřenou antikokcidiální účinnost· Z tohoto důvodu byla tato antibiotika užívána s různým stupněm úspěchu při léčbě různých infekcí u zvířat·

Kokcidiosa, která je známým onemocněním, způsobeným prvoky je stále vážným problémem a její potlačování má velký hospodářský význam zejména v drůbežářství· Kokcidiosa je výsledkem infekce jednou nebo větším počtem čeledí BLmeria nebo Isospora, souhrnný článek, týkající se tohoto problému je publikace Lund a Parr, Diseases of Poultry, 5· vydání, Biester a Schwarte, Iova Statě University Prese, Ames, Towa, 1965, str· Ю56 - 1096· Existuje šest čeledí kokcidií, které způsobují onemocnění u vnímavých kuřat· Jde o čeledi Eiaeria tenella, 2· ne c a tri x, S· brunet ti, E· acervulina, E· maxima a E. mi váti, tyto organismy způsobují poškození bui přímo zničením výstelkových buněk zažívací soustavy nebo nepřímo svými toxiny· Tři další čeledi prvoků téhož roku jsou poměrně neškodné· Avšak E· mitie, E· hagani a S· praecox mohou snížit hmotnostní přírůstky, zhoršit využití krmivá a nepříznivě ovlivnit produkci vajec·

Vzhledem к velkým hospodářským ztrátám, které jsou tímto způsobem způsobovány, je zapotřebí nacházet nová antibiotika, účinná proti kokcidiose·

Enteritis je dalším onemocněním, které může způsobit těžké hospodářské ztráty u pěstitelů hospodářských zvířat· К výskytu tohoto onemocnění dochází u kuřat, vepřů, skotu a ovcí, onemocnění je převážně působeno anaerobními bakteriemi, se jména Clostridium perfringens a působením virů· ftiterotoxemie u přežvýkavců, jejímž příkladem může být přejedení u ovcí je způsobována infekcí C· perfringens·

Dysenterie vepřů je dalším velmi běžným onemocněním vepřů, které je diagnostikováno ve Spojených Státech· Mimoto převažuje toto onemocnění v řadě dalších zení a každý rok způsobuje velké ztráty pěstitelům vepřů na celém světě· V poslední době bylo zjištěno, že příčinou tohoto onemocnění je velká apirocheta· Tento organismus, Třeponemá hyodysenteriae byl nyní isolován a jeho schopnost, způsobovat uvedené onemocnění, byla prokázána, jak bylo popsáno v publikaci Harris D. L· a další, Svine Dysentery-1, Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease, Vet· Med/SAC, 67· 61 - 64, 1972· Uvedené údaje ee týkají pokusů, které byly s organismem prováděny· Je nutno uvést, že není známo, zda je T· hyodysenteriae jediným organismem, který způsobuje dysenterii u vepřů· Z uvedených údajů je však možno uzavřít, že běží o primární zdroj infekce·

Dalším ekonomicky sledovaným ukazatelem ve veterinárním lékařství je sledování přírůstků a/nebo zvýšené využití krmivá u skotu nebo u živočichů s jediným žaludkem, například vepřů· Mechanismus využití hlavních živin u skotu je dobře znám· Mikroorganismy v bachoru zvířat rozkládají uhloiydráty za vzniku monosacharidů a pak převádějí

СБ 271 477 В2 vzniklé monosacharidy na pyrohroznánové deriváty· Tyto deriváty jsou pak mikrobiologicky metabolisovány na acetáty, butyráty nebo propionáty, které jsou společně uváděny jako deriváty těkavých alifatických kyselin· Souhrnně jsou tyto poměry uvedeny v publikaci Leng, Physiology of Bigestion and Metabolism in the Ruminant, Phillipson a další, Ede· Oriel Prese, Newcastle-upon-Tyne, Velká Británie, 1970, str. 408 - 410.

Relativní využití těkavých kyselin je podrobně vysvětleno v publikaci McCullough, Feedstuffs, 19· června 1971, str· 19, a Eskeland a další, J· An· Sci·, 33· 282, 1971, a Church a další, Bigestive Physiology and Nutrition of Ruminants, sv· 2, 1971, str· 622 a 625· Přesto že acetáty a butyráty jsou využívány, к využití propionátú dochází efektivněji· Mimoto v případě, že je přítomno příliš malé množství propionátú, může se u zvířat vyvinout ketosa· Je tedy zřejmé, že výhodné prostředky podporují u zvířat větší produkci propionátú z uhlohydrátú a tím zvyšují i využití uhlohydrátú a snižují výskyt ketosy.

Vynález se týká způsobu výroby nového antibiotika na bázi polycyklického etheru· Toto antibiotikum je označováno UK-58,852 a je možno je vyjádřit vzorcem·

V evropském patentovém spisu č· 169011 se popisuje nové antibiotikum kyselé povahy na bázi polycyklického éteru, označované jako UK-58,852·

Toto antibiotikum je možno získat tak, že se pěstuje v submersní kultuře za aerobních podmínek ve vodném Živném prostředí mikroorganismus Actinomadura roseorufa Huang ep· nov·, ATCC 39697, který byl izolován ze vzorku půdy v Japonsku· Nyní bylo prokázáno, že při hydrolýze antibiotika UK-58,852 za pečlivě řízených podmínek je možno získat odštěpením jednoho z připojených glykonových kruhů novou sloučeninu, která je plně účinná jako antikokcidiální látka se širokým spektrem a která je daleko výhodnější než původní sloučenina, protože má daleko nižší toxicitu·

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby antibiotika na bázi polycyklického éteru vzorce I

jakož i kationtových solí, přijatelných z farmaceutického hlediska tak, že se podrobí řízené hydrolýze sloučenina vzorce IX

CS 271 477 B2 nebo její kationtová sůl ve směsi rozpouštědel в obsahem acetonitrilu a vody za přítomnosti kyseliny a popřípadě se volná kyselina převede na kationtovou sůl, přijatelnou s farmaceutického hlediska·

Hydrolýza se e výhodou provádí při použití kyseliny tolueneulfonové ve eměsi acetonitrilu a vody» která obsahuje 0»5 až 5 % hmot* vody·

S výhodou se užije 1»1 molámího ekvivalentu kyseliny p-tolueneulfonové na 1 ekvivalent sodné soli sloučeniny vzorce II ·

Rozpouštědlo» v němž se reakce provádí» může obsahovat ještě další složky» například terč· butanol· Při provádění reakce je možno užít také jinou kyselinu» například kyselinu chlorovodíkovou» kyselinu octovou nebo silně kyselou pryskyřici· Reakci je možno provádět při teplotě místnosti a její průběh je možno sledovat chromatografií na tenké vrstvě tak» aby bylo možno dosáhnout optimálního výtěžku výsledného produktu· Reakce je obvykle ukončena za 1 až 3 hodiny při použití kyseliny p-toluensulfonové ve směsi acetonitrilu a vody» jinak se reakční doba může měnit v závislosti na použité kyselině a na použitém rozpouštědle· Po dovršení reakce se reakční směs neutralizuje přebytkem hydrogenuhličitanu sodného» zahustí a extrahuje di ethyletherem nebo dichlormethanem» načež se čistí při použití standardní chromátografie na silikagelu· Výsledný produkt je pak možno překrystalovat jako volnou kyselinu nebo příslušnou kationtovou sůl·

Antibiotikum UK-61 689 je taká možno získat se surových extraktů fermentačního prostředí s obsahem UK-58 892· Je například možno zahustit methylisobutylketonový extrakt a pak jej rozpustit s výhodou ve směsi acetonitrilu a vody a pak se působí kyselinou p-toluensulionovou· Výhodná směs acetonitrilu a vody obsahuje 5 % hmot, vody» poměr surového fermentačního prostředí ke kyselině p-tolueneulfonové je přibližně 9:1· Poměry jsou přibližné a mohou se měnit podle složení extraktu fermentačního prostředí· Je možno užít jako rozpouštědlo také směsi methanolu a vody» hydrolýzu je však také možno provádět tak» že se na surový methy li sobu ty lketonový extrakt působí kyselinou p-toluensulfonovou bez přidání rozpouštědla· Je možno užít také anorganických kyselin» například kyseliny chlorovodíkové·

Antibiotikum UK-61 689 má inhibiční účinek na řadu grampositivních mikroorganismů· V následující tabulce I jsou uvedeny výsledky testů in vitro· Při těchto pokusech byl každý organismus naočkován do řady zkumavek s obsahem živného prostředí a různých koncentrací antibiotika UK-61 689 ke stanovení minimální inhibiční koncentrace v mikrogramech/mililitr» která inhibuje růst organismu na dobu 24 hodin (MIC)·

Tabulka I

Antibakteriální účinnost

Organismus kmen číslo

Clostridium perfringens

10A006

10A009

3»12

CS 271 477 B2

Organismus	kmen číslo	MIC /Ug/ml
Actinomycee pyogenes	14D002	0,39
	14D008	0,39
	14D011	0,39
Treponema hyodysenteriae	94AOO1	6,25
	94A002	6,25
	94AOO7	3,12
	94ΑΟΟΘ	3,12

Údaje o účinnosti antibiotika UK-61 689 a jeho solí proti kokcidiálním infekcí» u kuřat byly sískány následující» způsobem: skupině 3 až 5 10 dnů starých bezpathogenních bílých leghornských kohoutků bylo podáváno smíšené krmivo β obsahem antibiotika UK-61 689 nebo jeho sodné a/nebo draselné soli, která byl v krmivu rozptýlena. Po 24 hodinách byla kuřata perorálně naočkována oocystami příslušné čeledi Mmeria· Další skupin/ kuřat stejného stáří byly krmeny stejným krmivém bez antibiotika· Tyto skupiny byly rovněž infikovány po 24 hodinách· Další skupiny kuřat byly krmeny stejným krmivém bes antibiotika, avšak nebyly infikovány a sloužily jako normální kontrolní skupiny· Výsledky byly vyhodnoceny po pěti dnech v případě E. acervulina a po šesti dnech u ostatních organismů.

Při vyhodnocení bylo použito stupnice 0 až 4, tak, jak je pro E. tenella uvedeno v publikaci J· S· Iynch, Λ Mew Method for the primary Evaluation of Anticoccidial Ac ti vity, Am· J· Vet· Ees·, 22· 324 až 326, 1961· Pro ostatní organismy bylo užito stupnice 0 až 3 podlé publikací J· Johnson а V. H· Reid, Anticoccidial Drugs· Lesion Scoring Technique in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks, Exp. Parasit·, 28, 30 - 36, 1970· К vyhodnocení bylo užito vždy zlomku, v jehož činiteli bylo uvedeno vyhodnocení pro ošetřenou skupinu a ve jmenovateli vyhodnocení pro infikovanou kontrolní skupinu·

Bylo zjištěno, že antibiotikum UK-61 689 a jeho kationtové soli mají velmi dobrý účinek proti kokcidiálnín infekcím u drůbeže· V případě, že tyto látky byly přidány do krmivá pro kuřata v koncentraci 19 až 120 ppm, byly tyto látky účinné při potlačování infekcí Eineria tenolla, S· acervulina, B· maxima, S· brunotti a E. necatrix.

Účinnost antibiotika UK-61 689 je stejná jako účinnost antibiotika UK-93 892, jehož vzorec je uveden na str· 7 popisné části přihlášky, jeho toxicita je však nižší. Z tohoto důvodu je toto antibiotikum výhodnější pro použití u hospodářských zvířat.

Hodnoty bDg₀ v mg/kg pro myši a krysy ve srovnání s antibiotikem 98 892 jsou následující :

	UK-5 8 892	UK-61 698
myší samci (perorálně)	2-9	25-50
myší samci (intraperitoneálně)	2-9	15-30
krysí samci (perorálně)	1-2	50-100
krysí samci (intraperitoneálně)	0,2-1	vySSÍ než 10

CS 271 477 B2

Je zřejmé, že hodnoty 1Д>₅₀ jeou přibližně lOx vyšší a že tato látka je tedy 10x méně toxická než sloučenina 58 852·

Hodnota krmivá ae obvykle stanoví přímo zkrmováním zvířatům. V britském patentovém spisu č. 1 197 826 je podrobně uvedena technika in vitro, která simuluje poměry v bachoru a při níž se krmivo uvádí do styku s mikroorganismy. Tímto způsobem je možno daleko přesněji krmivo vyhodnotit. Při provádění těchto pokusů se užívá zařízení, v němž probíhají trávicí pochody in vitro a je tedy možno je sledovat. Do zařízení se vloží krmivo, očkovací materiál z bachoru a různé látky, podporující růst za přesně stanovených podmínek a změny se pak hodnotí v průběhu spotřebovávání krmivá použitým mikroorganismem. Stoupnutí obsahu kyseliny propionové v kapalině ukazuje, že došlo к žádoucí směně ve spotřebovávání krmivá. Změny obsahu kyseliny propionové se vyjadřují v procentech obsahu této kyseliny v kontrolní bachorové kapalině. Dlouhodobé pokusy in vitro ukazují, že existuje vzájemný vztah mezi zvýšením obsahu kyseliny propionové v bachoru a zlepšením celkového stavu zvířete.

Bachorová kapalina se odebírá od krav в pištěli, kterým se podává běžné krmivo a seno· Tato kapalina se okamžitě zfiltruje přes mul a 10 ml této kapaliny ee vloží do konické banky o obsahu 50 ml s obsahem 400 mg standardního substrátu (68 % hmot· kukuřičného škrobu, 17 % hmot, celulosy a 15 % hmot· sojového extraktu), 10 ml pufru o pH 6,8 a zkoumaná látka. Baňky se pak promyjí dusíkem, prostým kyslíku na 2 minuty a pak se inkubují 16 hodin na třepaěce na vodní lázni při teplotě 39 °C. Všechny pokusy se provádějí třikrát.

Po skončené inkubaci se 5 ml vzorku smísí β 1 ml 25 % hmot, kyseliny methafosforečné. Po 10 minutách se přidá 0,25 ml kyseliny mravenčí a směs se odstřeluje 10 minut při 1 500 otáěkách/minutu· Vzorky se analyzují plynověkapalinovou chromatografií způsobem podle publikace D. W. Kellog, J. Dairy Science, 52. 1690, 1969. NejvýšSítu množstvím kyseliny octové, propionové a máselné se stanoví pro vzorky z baněk bez přidané pokusné látky nebo s pokusnou látkou.

Při pokusech in vitro způsobilo antibiotikum UK-61 689 v množství 20 yUg/ml vzestup produkce kyseliny propionové o 80 % ve srovnání s kontrolním roztokem bez tohoto antibiotika. Je známo, že sloučeniny, které podporují produkci propionové kyseliny v bachoru také zlepšují využití krmivá u přežvýkavců, například skotu a ovcí a obdobný účinek mají i u zvířat s jedním žaludkem, například u vepřů. Antibiotikum UK-61 689 je možno podávat smísením s krmivém ve formě volné kyseliny nebo soli, například sodné nebo draselné nebo jako směs těchto látek· Do krmivá je tcké možno včlenit surové fermentační prostředí s obsahem tohoto antibiotika v požaaované koncentraci. Antibiotikum UK-61 689 je možno podávat v požadovaných dávkách také v retardované formě, z níž se pomalu uvolňují požadovaná množství antibiotika·

Při léčbě kokcidiosy u drůbeže se antibiotikum podává perorálně s vhodným nosičem. Obvykle je tímto nosičem pitná voda nebo krmivo, takže dostatečná dávka je přijímána в potravou. Antibiotikum je možno přímo mísit s pitnou vodou, 8 výhodou ve formě ve vodě rozpustného kapalného koncentrátu, například vodného roztoku ve vodě rozpustné soli nebo je možno je přímo mísit β krmivém ve formě přídavného krmivá nebo koncentrátu. Obvykle se užívá přídavné krmivo nebo koncentrát s obsahem kapalného nebo pevného nosiče, jako je voda, sojová mouka, mouka ze lněných semen, mouka z kukuřičných palic a běžné minerální přídavky, obvykle užívané v krmivu pro drůbež· Zvláště vhodným faktorem je krmivo pro drůbež jako takové. Nosič napomáhá stejnoměrnému roz

CS 271 477 B2 ptýlení účinné látky· To je velni důležité^ protože je zapotřebí použít jen malého množství účinného antibiotika· Je důležité, aby účinná lítka byla důkladně promísena в přídavným krmivém i s výsledným krmivém· Z tohoto důvodu je výhodné antibiotikum dispergovat nebo rozpustit ve vhodném oleji, například sojovém oleji, kukuřičném oleji, oleji z bavlníkových semen a podobně, nebo s těkavým organickým rozpouštědlem, které se pak smísí a nosičem· Obsah účinné látky v koncentrátu se může měnit v Širokém rozmezí, protože je snadné upravit konečnou koncentraci v krmivu přidáním příslušného množství přídavného krmivá·

Koncentráty je možno mísit i a bílkovinným nosičem, jako je sojová mouka a jiné druhy koncentrátů sa vzniku přídavného krmivá, které je možno přímo zkrmovat drůbeži. V tomto případě se drůbeži podává běžné krmivo· V jiném případě přímým přidáním do krmivá vzniká vyvážené hotové krmivo в obsahem účinné hladiny antibiotik· VSechny uvedené směsi se připravují standardními postupy v mísících zařízeních к zajištění homogenity·

Je zřejmé, že obsah antibiotika se může sa různých okolností měnit· Kontinuální preventivní podávání v období růstu, tj· v prvních 6 až 12 týdnech u kuřat je při nižších dávkách velmi účinným postupem· Při léčbě infekcí, které již vznikly, je zapotřebí užít vyšších dávek· Obsah antibiotika v krmivu se obvykle pohybuje v rozmezí 15 až 120 ppm· Při podání v pitné vodě je množství, které zajistí tutéž souhrnnou dávku denně, tj· 15 až 120 ppm ovlivněno denní spotřebou krmivá a poměrem této dávky ke spotřebě vody·

Vynález bude osvětlen následujícími příklady·

Příklad 1

К roztoku 15,0 g, 0,147 molu čistého antibiotika UK-58 852, připraveného podle evropského patentového spisu č· 0169 011 ve 400 ml směsi acetonitrilu a vody v poměru 90 : 5 se přidá 3,07 g, 0,071 molu kyseliny P-toluensulfonové· Reakce se sleduje chromatografií na tenké vrstvě až do požadovaného výtěžku výsledného produktu, tj· přibližně 3 hodiny. Pak se reakční směs smísí s přebytkem hydrogenuhličitanu sodného v pevném stavu nebo ve vodném roztoku, načež se odpaří za sucha ve vakuu· Výsledná pevná látka se rozpustí v diethyletheru a promyje se nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, hydrogenuhličitanový roztok se promyje diethyletherem a etherové vrstvy se slijí a postupně promyjí vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného· Etherový roztok se vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří do sucha ve vakuu· Výsledný surový reakční produkt obsahoval převážně UK-61 689, avšak byl znečištěn různým množstvím výchozího antibiotika UK-58 852 a dalšími vedlejšími produkty· Po chromatografii na silikagelu a překrystalováním z isopropyletheru bylo tímto způsobem ve výtěžku 32 % získáno 4,2 g UK-61 689 ve formě sodné soli s teplotou tání 175 až 176 °C.

Optická otáčivost Wp⁵ « +19,3° (c « 0,5» MeOH), C-13 NMR (CDClj): 179,15 ppm, 107,45, 103,18, 97,74, 96,96, 86,92, 84,60, 84,20, 82,27, 82,01, 80,88, 80,20, 79,86, 74,80, 74,55, 73,07, 70,06, 67,71, 66,89, 59,11, 56,81, 45,40, 39,82, 38,93, 36,46, 33,81,

33,71, 33,54, 33,42, 33,13, 32,44, 32,26, 30,56, 27,58, 26,90, 26,84, 26,11, 23,23, 18,40, 17,53, 16,99, 12,13, 11,04, 10,42.

CS 271 477 B2

Příklad 2

Surový methylisobutylketonový extrakt fermentačního prostředí v množství jeden litr, obsahující přibližně 25 g antibiotika UK-58 852 se zahustí ve vakuu na 680 g hustého tmavého oleje, který se přidá к 5,6 litrů· směsi acetonitrilu a vody v poměru 95 : 5 · výsledné mléčná emulze se najednou smísí se 78,2 g kyseliny p-toluensulfonové. Při postupu reakce se emulse postupně dělí na dvě zřetelně oddělené vrstvy, směs se současně míchá celkem 1,25 hodin· Pak se reakční směs vlije do dělicí nálevky, olejovitá horní vrstva se oddělí a znovu smísí se směsí acetonitrilu a vody v poměru 95 *· 5. Obě vrstvy směsi acetonitrilu a vody se slijí a přidá se к nim nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (400 ml)· Směs se zahustí ve vakuu na hustý sirup, který se rozpustí ve 2 litrech směsi diethyletheru a ethylacetátu v poměru 3:1a pak se promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného· Organická vrstva se vysuší síranem sodným a odpaří na 432 g hustého hnědého oleje· Čištění se s výhodou provádí protiproudovou extrakcí, při níž se užívá směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 1 : 1 jako nepolární fáze a směsi methanolu a vody v poměru 3 : 2 jako polární vodná fáze· Odpařením organických extraktů se získá polotuhá pevná látka, která se rozetře в isopropyletherem, čímž se získá 10 g sodné soli UK-61 689 в teplotou tání 169 - 170 °C« Tento materiál byl při chromátografii na tenká vrstvě a NMR-spektru totožný se sloučeninou, získanou způsobem podle příkladu 1·

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims

1· Způsob výroby antibiotika na bázi póly cyklického eteru vzorce I jakož i kationtových solí, přijatelných z farmaceutického hlediska, vyznačující se tím, že se podrobí řízené hydrolýze sloučenina vzorce II

CS 271 477 B2 (II) nebo Její kationtová sůl ve směsi rozpouštědel s obsahem acetonitrilu a vody za přítomnosti kyseliny a popřípadě se volná kyselina převede na kationtovou sůl, přijatelnou z farmaceutického hlediska·

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se hydrolýza provádí při použití kyseliny p-toluensulf onové ve směsi acetonitrilu a vody.

3· Způsob podle kteréhokoliv z bodů 1 a ?, vyznačující se tím, že směs acetonitrilu a vody obsahuje 5 až 0,5 ÍK hmot. vody.

4. Způsob podle kteréhokoliv z bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se užije 1,1 solárního ekvivalentu kyseliny p-toluensulfonové na 1 ekvivalent sodné soli sloučeniny vzorce II.