FI89368C - Polycyklisk eter och anvaendning av den som tillvaext befraemjande aemne i foderkompositioner foer noetboskap och svin - Google Patents

Description

1 89368

Polysyklinen eetteri ja sen käyttö nautakarjan ja sikojen rehukoostumuksessa kasvua edistävänä aineena

Jakamalla erotettu hakemuksesta 873326 5

Esillä oleva keksintö koskee uutta polysyklistä eetteriä, jolla on kaava OCH^ 10 e0H OH yV'0'xl>^CH3 CH3 i_CH Cn3

f / V—/ \—L .Joint CH

^ ^ OH H * H ^ £ 0 A » A

C00H CH3 ch3 h ch3 H H H oh ja sen fysiologisesti hyväksyttäviä kationisuoloja sekä näiden yhdisteiden käyttöä nautakarjan tai sikojen rehu-20 koostumuksessa kasvua edistävänä ja/tai ravinnon hyväksikäyttöä parantavana aineena.

Yllä mainittu keksinnön mukainen polysyklinen eetteri kuuluu happamien polysyklisten eetterien ryhmään, jonka yhdisteille on biologisesti luonteenomaista, että ne 25 vaikuttavat kationinsiirtoon solumembraanien välillä. Tähän antibioottien ryhmään kuuluu hyvin tunnettuja antibiootteja, kuten monensiini, nigerisiini, grisoriksiini, dianemysiini, meduramysiini, narasiini, salinomysiini, la-salosiidi, mutalomysiini, ionomysiini ja leuseramysiini. 30 Aihetta on käsitelty julkaisussa Westley, "Polyether Antibiotics", Adv. Appi. Microbiol., 22, 177, 1977.

Edellä luetellut eetteriantibiootit vaikuttavat gram-positiivisiin bakteereihin, sieniin ja alkueläimiin. Erityisesti näissä antibiooteissa esiintyy tehokasta kok-35 kidiaalista vaikutusta. Siitä syystä niitä on käytetty 2 39368 vaihtelevalla menestyksellä hoidettaessa erilaisia eläin-infektioita .

Tuotantokyvyn lisäys (lisääntynyt kasvunopeus ja/tai kohonnut ravinnon hyväksikäytön tehokkuus) märehti-5 jöillä, kuten nautakarjassa, ja yksivatsaisilla eläimillä, kuten sioilla, on tavoiteltu päämäärä eläinlääketieteessä. Erityisen mielenkiinnon kohteena on parantunut tuotantokyky, joka saavutetaan parantamalla ravinnon hyväksikäytön tehokkuutta. Märehtijöiden rehun suurimman ravitsevan osan 10 hyväksikäytön mekanismi on hyvin tunnettu. Mikroeliöt eläimen pötsissä hajottavat hiilihydraatteja monosakkari-dien valmistamiseksi, ja sitten ne muuttavat nämä monosak-karidit pyruvaattiyhdisteiksi. Mikrobiologisissa prosesseissa pyruvaatit muutetaan aineenvaihdunnan kautta ase-15 taateiksi, butyraateiksi tai propionaateiksi, jotka tunnetaan haihtuvina rasvahappoina. Yksityiskohtaisempaa tarkastelua varten, ks. julkaisut: Leng, "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et ai., toim., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, Englanti, 20 1970, S. 408 -410.

Vastaavaa haihtuvien rasvahappojen hyväksikäytön tehokkuutta käsitellään julkaisuissa McCullough, "Feed-stuffs", 19. kesäkuuta 1971, s. 19; Eskeland et ai., J. An. Sei., 33. (1971) s. 282; ja Church et ai., "Digestive 25 Physiology and Nutrition of Ruminants", Voi. 2, 1971, s. 622 ja 625. Vaikka asetaatteja ja butyraatteja käytetäänkin hyväksi, propionaattien hyväksikäytön tehokkuus on suurempi. Siten suotuisa yhdiste saa eläimet tuottamaan hiilihydraateista suuremman osuuden propionaatteja, jol-30 loin hiilihydraattien hyväksikäytön tehokkus kasvaa.

EP-hakemusjulkaisussa 0169011 on kuvattu hapan polysyklinen eetteriantibiootti, joka on nimetty UK-58852:-ksi ja jolla on kaava li 3 09368

αΛ* OCH

Y^ywm OCH

C»3 k Λ 5 O or 3 yXO^^CH3

CH„ ^ 2 .OCH. 1 O CH

__. V^3yY

\~L· Λί'-Ο^'.....CH3 I OH H A H 0 | fNo^I ΙΟ* 4^1

10 cooh ch3 ch3 h ch3 H H H OR

jossa sekä R että R1 on vety. Sitä valmistetaan aerobisen upotuslisääntymisen avulla, joka tapahtuu vesipitoisessa 15 ravintoliuoksessa, jossa on mikro-organismia Actinomadura roseorufa Huang sp. nov., ATCC 39697, joka on eristetty Japanin maaperästä otetusta näytteestä. Nyt on todettu, että UK-58852:n hydrolysoiminen tarkoin valvotuissa olosuhteissa johtaa yhden molekyylissä olevan glykoni-renkaan 20 lohkeamiseen, jolloin syntyy edellä mainittu kaavan I mukainen uusi yhdiste, joka on parempi kuin UK-58852 -yhdiste vähäisemmän myrkyllisyytensä vuoksi. Tämä keksinnön mukainen uusi kaavan I mukainen yhdiste on nimetty yhdisteeksi UK-61689.

25 Yhdistettä UK-61689 ja sen kationisuoloja voidaan valmistaa menetelmällä, joka käsittää yhdisteen UK-58852 tai sen kationisuolan valvotun hydrolyysin.

Yhdisteen UK-58852 hydrolyysi kaavan I mukaisen yhdisteen (UK-61689) valmistamiseksi suoritetaan edulli-30 sesti käyttäen para-tolueenisulfonihappoa, joka on aseto-nitriili/vesiliuottimessa. Edullisessa asetonitriili/ve-sikoostumuksessa on 5 - 0,5 % vettä. Para-tolueenisulfoni-happoa käytetään edullisesti 1,1 mooliekvivalenttia UK-58852: n natriumsuolan yhtä mooliekvivalenttia kohden.

4 89368

Muita käyttökelpoisia liuotinsysteemejä ovat pelkkä asetonitriili tai t-butanoli/vesi tai asetoni/vesi. Vaihtoehtoisiin happoihin kuuluvat mineraalihapot, kuten kloo-rivetyhappo, etikkahappo tai vahvasti hapan hartsi. Yleen-5 sä reaktio suoritetaan huoneen lämpötilassa, ja sitä seurataan ohutkerroskromatografiällä, kunnes halutun tuotteen saanto on optimaalinen. Reaktioaika on yleensä noin tunnista kolmeen tuntiin asetonitriilissä/vedessä olevalle para-tolueenisulfonihappo-hydrolyysisysteemille, mutta se 10 voi vaihdella käytettävän hapon ja liuotinsysteemin mukaan. Kun reaktio on kulkenut suurin piirtein loppuun, reaktioseos tehdään neutraaliksi ylimäärällä natriumbikarbonaattia, väkevöidään ja uutetaan dietyylieetterillä tai dikloorimetaanilla ja sitten puhdistetaan käyttäen silika-15 geelikromatografiän standardimenetelmiä. Lopullinen tuote voidaan sitten uudelleen kiteyttää vapaana happona tai sopivana kationisuolana.

Vaihtoehtoisesti yhdiste UK-61689 voidaan valmistaa käsittelemättömistä fermentaatiouutteista, jotka sisältä-20 vät UK-58852:ta. Tällöin metyyli-isobutyyliketoni (MIBK) -fermentaatiouute väkevöidään ja liuotetaan edullisesti asetonitriiliin/veteen ja käsitellään para-tolueenisulfo-nihapolla. Edullinen asetonitriilivesikoostumus sisältää 5 % vettä, ja käsittelemättömän fermentointiöljyn suhde 25 para-tolueenisulfonihappoon on noin 9:1; nämä suhteet ovat keskiarvoja ja ne voivat vaihdella fermentointiuutteen mukaan. Toinen liuotinsysteemi, jota voidaan käyttää, on metanoli/vesi, mutta hydrolyysi voidaan suorittaa myös käsittelemällä puhdistamatonta MIBK -uutetta para-toluee-30 nisulfonihapolla siten, ettei lisättyä liuotinta ole mukana. Vaihtoehtoisiin happoihin kuuluvat mineraalihapot, kuten kloorivetyhappo.

Eläinrehujen arvo on määritetty yleensä suoraan ruokkimalla eläintä. GB-patenttijulkaisussa 1 197 826 esi-35 tetään yksityiskohtaisesti in vitro -pötsimenetelmä, jonka

II

5 y 9 368 avulla mikro-organismien aiheuttamat rehussa ilmenevät muutokset mitataan vaivattomimmin ja erittäin tarkasti arvosteltaessa eläinten rehuja. Tässä menetelmässä käytetään laitetta, jossa eläinten ruoansulatusprosesseja suo-5 ritetaan ja tutkitaan in vitro. Eläinten rehut, pötsisiir- roste ja erilaiset kasvua edistävät aineet syötetään laboratorioyksikköön ja otetaan siitä pois tarkoin valvotuissa olosuhteissa, ja tapahtuvia muutoksia tutkitaan tarkasti ja jatkuvasti sinä aikana, kun mikro-organismit käyttävät 10 rehua.

Pötsinesteen propionihappopitoisuuden kasvu osoittaa, että kasvua edistävät aineet rehukoostumuksessa ovat aiheuttaneet halutun vasteen märehtijän kokonaissuorituksessa. Propionihappopitoisuuden muutos ilmoitetaan pro-15 sentteinä todetusta vertailupötsinesteen propionihappopi- toisuudesta. Pitkäaikaisia in vivo -ruokintatutkimuksia käytetään osoittamaan luotettava korrelaatio pötsinesteen propionihappopitoisuuden kasvun ja rehun parantuneen tehokkuuden välillä.

20 Pötsinestettä kerätään lehmästä, jolle on tehty avanne ja jota on ruokittu kaupallisella lihotusrehulla sekä heinällä. Pötsineste suodatetaan välittömästi juusto-kankaan läpi, ja 10 ml nestettä lisätään kartionmuotoiseen 50 ml:n pulloon, jossa on 400 mg standardisubstraattia 25 (68 % maissitärkkelystä + 17 % selluloosaa + 15 % uutettua soijajauhoa), 10 ml puskuriliuosta, jonka pH on 6,8, sekä koeyhdistettä. Pulloihin johdetaan hapetonta typpikaasua noin kahden minuutin ajan, ja niitä inkuboidaan ravistus-vesihauteessa 39 °C:ssa noin 16 tunnin ajan. Kaikki kokeet 30 suoritetaan kolmena rinnakkaiskokeena.

Inkuboinnin jälkeen 5 ml näytettä sekoitetaan 1 ml:aan 25-prosenttista metafosforihappoa. 10 minuutin kuluttua lisätään 0,25 ml muurahaishappoa ja seosta sent-rifugoidaan nopeudella 1500 kierrosta/min. 10 minuutin 35 ajan. Sitten näytteet analysoidaan kaasu-nestekromatogra- 6 1)9368 fialla menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa D. H. Kellog, J. Dairy Science, 52 (1969) s. 1690. Etikka-, pro-pioni- ja butyyrihapon huippupitoisuudet määritetään käsittelemättömistä ja käsitellyistä inkubaatiopulloista 5 saaduista näytteistä.

Tällä in vitro -menetelmällä tutkittuna yhdiste UK-61689, jota oli suhteessa 20 mikrogrammaa millilitraa kohden, nosti propionihappotuotantoa noin 80 % verrattuna propionihappotuotantoon vertailuliuoksessa, johon ei ollut 10 lisätty yhdistettä UK-61689. Yhdisteet, jotka kiihottavat PPH:n (pötsin propionihapon) tuotantoa, tiedetään parantavan märehtijöiden, kuten nautakarjan ja lampaiden, ravinnon hyväksikäyttöä ja niillä voi lisäksi olla samanlainen vaikutus yksivatsaisiin eläimiin, kuten sikoihin. Yh-15 diste UK-61689 voidaan antaa eläimelle sekoittamalla se rehukoostumukseen joko vapaana happona tai suolana, esim. natrium- tai kaliumsuolana tai niiden seoksena. Vaihtoehtoisesti voidaan sekoittaa yhdistettä UK-61689 sisältävää raakatuotetta tai kuivattua fermentointilientä rehukoostu-20 mukseen haluttuina väkevyyksinä. Yhdiste UK-61689 voidaan antaa haluttuina annostuksina myös käyttäen sopivaa pitki-tetysti vapauttavaa laitetta, joka on suunniteltu vapauttamaan tehoainetta vakiomäärinä.

Esillä olevaa keksintöä valaistaan seuraavilla esi-25 merkeillä.

Esimerkki 1

Liuokseen, jossa oli 15,0 g (0,0147 mol) puhdasta UK—58 852 -antibioottia (valmistettu EP-hakemusjulkaisussa 169011 kuvatulla tavalla) asetonitriili/vesiseoksessa 30 (95:5), lisättiin 3,07 g (0,0161 mol) p-tolueenisulfoni- happoa. Reaktiota seurattiin ohutkerroskromatografiällä, kunnes halutun tuotteen saanto oli optimaalinen (noin kolmen tunnin ajan). Reaktioseosta käsiteltiin kiinteällä bikarbonaatilla tai sen vesiliuoksella, joita oli ylimää-35 rin, ja väkevöitiin kuiviin tyhjössä. Syntynyt kiinteä I:: 7 U 9 3 6 8 aine liuotettiin dietyylieetteriin ja pestiin kyllästetyllä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella, bikarbonaattipesu-vedet uutettiin dietyylieetterillä ja kaikki eetteriker-rokset yhdistettiin ja pestiin peräkkäin vedellä ja kyl-5 lästetyllä natriumkloridilla. Eetteriliuos kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Syntynyt käsittelemätön reaktiotuote sisälsi yhdistettä UK-61689, joka oli vallitsevana tuotteena, mutta jossa oli mukana vaihtelevia määriä lähtöainetta, 10 UK-58852, ja muita sivutuotteita. Käsittelemätön tuote puhdistettiin silikageelipylväskromatografiällä, minkä jälkeen se uudelleenkiteytettiin isopropyylieetteristä, ja näin saatiin 4,2 g (32 %) yhdistettä UK-61689 natriumsuo-lana, sp. 175 - 176 °C; [a]£5 = +19,3 (c=0:5, MeOH); 15 C-13 NMR (CDClj) : 179,15 ppm, 107,45, 103,18, 97,74, 96,96, 86,92, 84,60, 84,20, 82,27, 82,01, 80,88, 80,20, 79,86, 74,80, 74,55, 73,07, 70,06, 67,71, 66,89, 59,11, 56,81, 45,40, 39,82, 38,93, 36,46, 33,81, 33,71, 33,54, 33,42, 33,13, 32,44, 20 32,26, 30,56, 27,58, 26,90, 26,84, 26,11, 23,23, 18,40, 17,53, 16,9 9, 12,13, 11,04, 10,42.

Esimerkki 2 Käsittelemätön fermentointiuute (MIBK) (1 1) , joka sisälsi UK-58852 -antibioottia (arviolta 25 g) , väkevöi-25 tiin tyhjössä 680 g:ksi. Paksu, tumma öljy lisättiin ase-tonitriili/vesiseokseen (95:5) (5,6 1), ja syntynyttä maitomaista emulsiota käsiteltiin p-tolueenisulfonihapolla (78,2 g) yhtenä annoksena. Reaktion edetessä emulsio erottui vähitellen kahdeksi eri kerrokseksi, joita sekoitet-30 tiin voimakkaasti kaikkiaan 1,25 tunnin ajan. Reaktioseos kaadettiin erotussuppiloon, ja öljyinen pohjakerros poistettiin ja suspendoitiin lisäämällä asetonitriili/vesi-seosta (95:5). Asetonitriili- ja vesikerrokset yhdistettiin ja niitä käsiteltiin kyllästetyllä natriumbikarbonaa-35 tin vesiliuoksella (400 ml). Sitten seos väkevöitiin tyh- 8 b 9 3 6 8 jossa paksuksi siirapiksi, liuotettiin dietyylieetteri/-etyyliasetaattiseokseen (3:1) (2 1) ja pestiin kylläste tyllä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella. Orgaaninen kerros kuivattiin natriumsulfaatilla ja väkevöitiin paksuksi 5 ruskeaksi öljyksi (432 g) . Puhdistaminen suoritettiin vai-vattomimmin käyttäen vastavirtauuttomenetelmiä. Uutossa käytettiin heksaani/etyyliasetaattiseosta (1:1) polaarit-tomana faasina ja metanoli/vesiseosta (3:2) polaarisena vesifaasina. Haihduttamalla orgaaniset uutteet saatiin 10 puolikiinteää ainetta, joka jauhettiin kuivaksi isopropyy-lieetterissä, ja näin saatiin UK-61689 natriumsuolana, 10 g, sp. 169 - 170 °C. Tämä aine vastasi esimerkin 1 menetelmällä valmistettua UK-61689 -yhdistettä TLC- ja NMR-tuloksia verrattaessa.

l!

Claims (2)

9 b 9360

1. Polysyklinen eetteri, jolla on kaava: 5 och3 pH OH Z'0 ^3 “3 ^ A A \ CH, ,“3 COOH CH3 CH3 H CH3 h h h oh (I) 15 tai sen fysiologisesti hyväksyttävä kationisuola.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen polysyklisen eetterin tai sen fysiologisesti hyväksyttävän kationisuolan käyttö nautakarjan tai sikojen rehukoostumuksessa kasvua 20 edistävänä ja/tai ravinnon hyväksikäyttöä parantavana aineena . 10 89 368