NO159537B - Fremgangsmaate for fremstilling av antibiotikum sb 22484 ved fermentering av streptomyces sp nrrl 15496. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt antibiotisk stoff, SB 22484, ved fermentering av Streptomyces sp. NRRL 15496. Dette nye antibiotiske stoffet anvendes ved behandling av infeksjonssykdommer som skyldes mikroorganismer som lar seg behandle med dette antibiotiske stoff.

Antibiotikum SB 22484 har en syrefunksjon som er i stand til å danne salter. De farmasøytiske akseptable salter av antibiotikum SB 22484 som innbefatter alkalimetall-, jordalkali-metall-, ammonium- og substituerte ammoniumsalter inngår som en del av oppfinnelsen.

Av hensiktsmessighetsgrunner så vil betegnelsen "antibiotikum SB 22484" når man omtaler de biologiske aktiviteter for de fremstilte forbindelser, referere seg til et antibiotisk stoff valgt fra antibiotikum SB 22484 og dets farmasøytisk akseptable salter.

Angivelser i det nedenstående skal forklares som følger: Uttrykket "lavere alkylalkanoylestere" betegner C2-C6 alkyl ( C2~ C()) alkanoylestere såsom etylacetat, propylacetat, butylacetat, etylpropionat, butylpropionat, butylamylat og lignende. Uttrykket "vannublandbare lavere alkylketoner" betegner ( Cq- C^ q) ketoner som er meget lite blandbare med vann, f.eks. 2-pentanon, 2-heksanon, 3-heksanon, 2-heptanon, 3-metyl-2-butanon og 3-butyl-2-pentanon.

Uttrykket "halogenerte lavere hydrokarboner" betegner polyhalogenerte (C1-C4) hydrokarboner såsom metylenklorid, kloroform, dikloretan, o.l.

Uttrykket "høyere alkanoler" betegner rette eller forgrenede lineære eller cykliske (C4-C7) alkanoler som er meget dårlig blandbare med vann, f.eks. butanol, 2-metylpropanol, 2-metyl-2-propanol, pentanol-2-metylbutanol, 2-metyl-2-butanol, cykloheksanol, o.l.

Det antibiotiske stoff som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse er karakterisert ved et relativt spesifikt antimikrobielt spektrum, og er f.eks. aktive overfor Neisseriae-raser, relativt aktive overfor streptokokker, Ureaplasma, Mycoplasma og Hepophilus, men som er nesten inaktive overfor Staphylococci og vanlige gram-negative bakterier såsom Proteus, Escherichia og Pseudomonas.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt antibiotisk stoff, SB 22484, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som i form av den frie syren har de i det nedenstående angitte egenskaper, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man ved en temperatur i området 20-40°C dyrker Streptomyces sp. NRRL 15496 under submerse, aerobe betingelser i nærvær av assimilerbare kilder m.h.t. karbon, hydrogen og uorganiske salter, utvinner og isolerer nevnte antibiotikum fra fermenteringsmediet og, om nødvendig, omdanner nevnte antibiotikum til det ønskede salt.

Det er ifølge oppfinnelsen foretrukket at man fremstiller antibiotikum SB 22484 som en blanding inneholdende minst en av dets fire hovedkomponenter SB 22484 faktorer 1, 2, 3 og 4.

Stammen NRRL 15496 ble isolert fra en jordprøve samlet i Italia, og som den 6. juli 1983 ble deponert hos den inter-nasjonalt anerkjente kultursamling Agicultural Research Collection (NRRL) i Peoria, Illinois, USA, i henhold til Budapest-avtalen.

Egenskapene for Streptomyces sp. NRRL 15496 er gitt i de følgende avsnitt.

Makroskopisk og mikroskopisk undersøkelse

Koloniene er karakterisert ved et gult til dypt kromgult vegetativt mycelium som utvikler seg på de fleste undersøkte media og et turkisgrønt luftmycelium. Sporoforene er arran-gert i spiraler, som små spoler og kroker. Sporene er sylindriske med avrundede ender og har en diameter på 1,2 x 2-3 >jm.

Basert på formen av sporoforene og på fargen av luftmycelium, så er Streptomyces sp. NRRL 15496 blitt klassifisert til "Group Spirea-Green Section" ifølge den klassifikasjon som er angitt av Pridham, Hesseltine og Benedict (T. G. Pridham, C. W. Hesseltine og R. G. Benedict, A Guide for the Classifica-tion of Streptomycetes according to selected group, Appl. Microb. Vol. 6 (1958)).

Kulturegenskapene

For undersøkelse av kulturegenskaper ble Streptomyces sp. NRRL 15496 dyrket på forskjellige standarder slik det er beskrevet av Shirling og Gottlieb (1) med et tillegg av flere media som er anbefalt Wacksman (2).

Fargebestemmelser ble utført når dette er nødvendig, ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet av Maerz og Paul (3).

Alle de data som er angitt i tabell 1 i det etterfølgende, ble notert etter 2 ukers inkubering ved 28°C.

pH på de media som ble brukt for klassifikasjonen, var om-trentlig nøytral.

Anvendelse av karbonkilder

Evnen for Streptomyces sp. NRRL 15496 til å anvende forskjellige karbonråstoffer, ble undersøkt ved "hjelp av den fremgangsmåte for er beskrevet av Shirling og Gottlieb. Resultatene er angitt i tabell II nedenfor.

Fysiologiske egenskaper

Tabell III angir fysiologiske egenskaper for Streptomyces sp. NRRL 15496.

For fremstilling av antibiotikum SB 22484 dyrkes en Streptomyces sp. som er i stand til å fremstille nevnte antibiotikum, nemlig Streptomyces sp. NRRL 15496 under aerobe betingelser i et vandig næringsmedium som inneholder en assimilerbar karbonkilde, en assimilerbar nitrogenkilde og uorganiske salter. Nevnte dyrkningsmedium kan være ethvert av en rekke næringsmedia som vanligvis brukes ved fermentering, men visse media er imidlertid foretrukket. De foretrukne karbonkilder er således glukose og mannose, galaktose, stivelse, maismel o.l. Foretrukne nitrogenkilder er ammoni-akk, nitrater, soyabønnemel, pepton, kjøttekstrakt, gjær-ekstrakt, trypton, aminosyrer, o.l. Blant de uorganiske salter som kan tilsettes fermenteringsmediet, er de vanlige salter som er i stand til å gi natrium-, kalium-, Jern-, sink-, kobolt-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, klorid-, karbonat-, sulfat-, fosfat- og nitrationer, o.l. ioner.

Vanligvis vil den antibiotikumproduserende stamme på forhånd være dyrket i en rystekolbe, hvoretter denne kulturen blir brukt for å inokulere store fermenteringskar for fremstilling av vesentlige mengder av det antibiotiske stoff. Det medium som brukes for forkulturen, kan være det samme som brukes for senere større fermenteringer, men man kan også bruke andre media. Nevnte SB 22484 produserende stammer kan dyrkes ved temperaturer mellom 20 og 40°, fortrinnsvis mellom 24 og 30°C.

Under fermenteringen kan produksjonen av antibiotikum undersøkes ved hjelp av prøver som tas ut av mediet, eller ved ekstrakter av mycelkaken som undersøkes for antibiotisk aktivitet, f.eks. ved hjelp av bioprøver eller tynnsjikts-kromatografi- eller høytrykkskromatografimetoder.

Organismer som er følsomme overfor antibiotikum SB 22484, kan også brukes for dette formål. Spesielt fordelaktige prøve-organlsmer er Neisseria caviae ATCC 14659 og Streptococcus dysgalactiae ATCC 9926. Bioprøven kan hensiktsmessig utføres ved en agardiffusjonsmetode på agarplater. Maksimal produksjon av antibiotisk aktivitet skjer vanligvis mellom andre og femte døgn av fermenteringen.

Antibiotikum SB 22484 fremstilt under fermenteringen av stammen Streptomyces sp. NRRL 15496 finnes i alt vesentlig I mediet. Utvinningen av nevnte antibiotikum kan derfor fortrinnsvis utføres ved at man ekstraherer det filtrerte fermenteringsmediet. Ekstraheringen kan best utføres ved hjelp av etylacetat, men kan også bruke andre lavere alkylalkanoylestere som er ublandbare med vann, såsom metylacetat, etylpropionat og butylpropionat, lavere hydrokarboner såsom polyhalogenerte hydrokarboner, f.eks. metylenklorid, dikloretan og kloroform, lavere alkylketoner såsom metylisopropyl-keton, metylisobutylketon, høyere alkanoler såsom butanol,

pentanol og cykloheksanol, o.l.

Det urene antibiotikum SB 22484 kan så utvinnes fra opp-løsningsmiddelet på følgende måte, ved at man konsentrerer det ekstraherende oppløsningsmiddel til et lite volum og deretter utfeller det urene antibiotikumet fra oppløsningen ved å tilsette et ikke-oppløsningsmiddel.

Rensing av det urene antibiotiske stoffet kan så utføres ved hjelp av forskjellige metoder, f.eks. kolonnekromatografi, saltdannelse eller ekstraksjon med egnet oppløsningsmiddel. Når man bruker kolonnekromatografi for rensingen, kan man fortrinnsvis bruke den såkalte steriske utelukkelseskromato-grafiske teknikk som anvendes for å få optimale, separerende resultater. Spesielt for Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Ab) en kontrollert poretverrbundet dekstran hvor mesteparten av hydroksylgruppene er blitt alkylert, vist seg å være en ekstremt fordelaktig stasjonær fase for utmerket rensing. Alternativt kan det filtrerte mediet justeres til pH mellom 5 og 9, og så føres gjennom en ikke-funksjonalisert polystyrenharpiks, såsom Amberlite X-AD-2 (XAD-4, XAD-7, XAD-8) eller Diaion HP 20 kromatografisk kolonne fremstilt i deionisert vann, idet man som elueringsmiddel bruker en binær blanding av fra 10 til 90% aceton, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol eller tetrahydrofuran i vann. Fraksjonene slås sammen etter sitt antibiotiske innhold, konsentreres tiltørret, justeres til pH mellom 4 og 8 og så ekstraheres som beskrevet ovenfor for det filtrerte medium.

Det er foretrukket at det filtrerte mediet justeres til ca. pH 7,5 og ekstraheres med en vannublandbar lavere alkyl-alkanoylester, fortrinnsvis butylacetat. Det organiske lag blir så konsentrert og justert til pH ca. 9,0. Denne justeringen av pH kan utføres fortrinnsvis ved at man til-setter natriumdietylmalonat. Bunnfallet oppløses i vann, Justeres til ca. pH 4 og ekstraheres så med den vannublandbare lavere alkylalkanoylesteren. Utfelling med en base, fortrinnsvis natriummalonat, ved å justere pH til ca. 9, gjentas, for derved å få et renset preparat av det antibiotiske stoffet. Man kan foruten ovennevnte teknikk også bruke andre kolonnekromatografIske teknikker, så absorpsjonskromatografi eller delingskromatografi.

Rensing av saltdannelse utføres ved å oppløse det antibiotiske stoffet i et egnet oppløsningsmiddel og tilsette en ekvimolar mengde av en base. Det salt som dannes, utfelles ved å tilsette et ikke-oppløsningsmiddel og så frafiltrere det fremstilte produkt. Det antibiotiske stoffet i form av den frie syren kan fremstilles ved å oppløse det urene antibiotikumet i etylacetat og så ekstrahere den organiske opp-løsningen med sure buffere, fortrinnsvis en fosfatbuffer ved pH ca. 4,0.

Utvinning av produktet kan så utføres på vanlig kjent måte, f.eks. ved en utfelling fra det organiske laget eller ved en konsentrering av blandingen til et lite volum. Evis produk-tets titreringsverdi Ikke er tilstrekkelig høy, så kan den ytterligere renses ved kolonnekromatografi idet man anvender i alt vesentlig samme fremgangsmåte som ovenfor.

Når man bruker kolonnekromatografi for rensingen, så kan hele rensingsmetoden også kontrolleres ved hjelp av høytrykks væskekromatografi.

Fraksjoner med lik HPCL profil kombineres og konsentreres ttll tørrhet, hvorved man i alt vesentlig får et rent antibiotikum SB 22484.

Det således fremstilte antibiotikum SB 22484 kan deretter om-dannes til et tilsvarende ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabelt salt. Egnede salter innbefatter alkali og jordalkalimetallsaltene, typisk vil dette være natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumsalter, samt ammonium- og substituerte ammoniumsalter. Representative ssubstituerte ammoniumsalter innbefatter primære, sekundære eller tertiære (C1-C4) alkylammonium og hydroksy ( C^ C^) alkylammonium-salter, og det kan også anvendes benzatin, prokain, hydro-bramin og tilsvarende vannuoppløselige, ikke-tpksiske farma-søytisk akseptable salter.

En annen foretrukken gruppe av salter av forbindelser er representert ved basiske addisjonssalter med basiske aminosyrer, såsom arginin eller lysin, eller aminosukkere såsom glukosamin, o.l.

Alkali- og jordalkalimetallsaltene fremstilles slik man vanligvis fremstiller metallsalter. F.eks. kan antibiotikum SB 22484 oppløses i en minimal mengde av et egnet opp-løsningsmiddel, typisk en lavere alkanol, hvoretter den støkiometriske mengden av mengden av en egnet base gradvis tilsettes den fremstilte oppløsningen, hvorved det fremstilte saltet utfelles ved tilsetning av et ikke-oppløsnings-middel. Alkali- og jordalkalimetallsaltene som fremstilles, kan så utvinnes ved filtrering eller ved en fordampning av oppløsningsmiddelet.

Alternativt kan disse saltene fremstilles i en i alt vesentlig vannfri form ved hjelp av en lyofilisering. I slike tilfeller lyofiliserer man de vandige oppløsninger som inneholder de ønskede salter, vanligvis fremstilt ved en saltdannelse av antibiotikum SB 22484 med egnede alkali- og jordalkalimetallsalter, f.eks. karbonat eller hydroksyd i slike mengder at man oppnår en pH på 7,0 og 8,5.

Organiske ammoniumsalter kan fremstilles I alt vesentlig ved hjelp av den ovennevnte fremgangsmåte ved at et passende valgt amin tilsettes til oppløsning av antibiotikum SB 22484 i et egnet oppløsningsmiddel, hvoretter man fordamper opp-løsningsmiddelet og overskuddet av aminreagensen, hvoretter man lyofiliserer den konsentrerte oppløsningen.

Fysikalske- kjemiske egenskaper for antibiotikum SB 22484

Antibiotikum SB 22484 har følgende egenskaper:

A) et ultrafiolett absorpsjonsspektrum slik det er vist på fig. 1 på de vedlagte tegninger, som viser følgende absorpsjonsmaksima: B) et infrarødt absorpsjonsspektrum som er vist på fig. 2 på de vedlagte tegninger, og som viser følgende absorpsjonsmaksima (cm~^): 3700-3080, 2980-2840 (nujol); 1645; 1560; 1455 (nujol); 1375 (nujol); 1305; 1240; 1215; 1145; 1090; 1060; 1035; 990; 945; 910; 890; 850; 810; 720 (nujol); C) et NMR spektrum som er vist på fig. 3, og som viser følgende grupper av signaler (i ppm) i en 270 MHz ^"H-NMR avlest i heksadeuteroaceton idet man brukte TMS som en indre referanse (0,00 ppm) (liten delta = ppm):

0,77 liten delta(3H); 0,83 liten delta (3H),

1,21-1,24 liten delta (3H); 1,2-2,7 liten delta (5H),

1.67 liten delta (s, 3H); 1,73 liten delta (3H)

2,01 liten delta (s, 3H); 3,20 liten delta (s, 3H); 3,3-5,6 liten delta (11H); 5,4-6,7 liten delta (13H); 6,04 liten delta (1H); 7,40 liten delta (1H);

7.68 liten delta (1H); 10,53 liten delta (1H)

(s = singlet)

D) et massespektrum oppnådd ved en direkte væske-tilløpsvæskekromatografi-massespektroskopi (LC-MC) idet man brukte et HP 5985 B apparat som arbeidet på den negative ionemåten, og hvor analysen ble utført under de følgende betingelser: som viser fire hovedtopper med tilbakeholdelsestider på 4,48, 5,03, 5,65 og 7,25 min, henholdsvis, og som vil-kårlig ble betegnet som antibiotikum SB 22484 faktorene 1, 2, 3 og 4, henholdsvis; E) Følgende hovedfragmenteringstopper for de ovennevnte antibiotiske faktorer, dvs. antibiotoikum SB 22484 faktorene 1, 2, 3 og 4: F) Følgende Rf verdiene i forskjellige kromatografiske systemer idet man brukte silanisert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater:

Antibiotikum SB 22484 er et antibakterielt middel som spesielt er aktivt mot bakteriestammer som forårsaker infeksjonssykdommer som vanligvis er vanskelige å helbrede, f.eks. gonore og meningitis. Som nevnt tidligere er antibiotiske stoff fremstilt ifølge oppfinnelsen aktivt mot Neisseriae-stammer, relativt aktive overfor Streptococci, Ureaplasma, Mycoplasma og Hemophylus, mens det er nesten inaktivt overfor Staphylococci og vanlige gram-negative bakterier som Proteus, Escherichia and Pseudomonas.

Den antibakterielle virkningen av forbindelsen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan vises in vitro ved hjelp av standard fortynningsprøver.

Iso-sensitestmedium (Oxoid) og Todd-Hewitt medium (Difco) ble brukt for Staphylococci og Streptococci henholdsvis, Neisseriae-stamme ble dyrket på GC-agarbare (Difco) + lsé Iso-Vitalex (BBL) og Hemophylus ble dyrket på GC-agarbase (Difco) + 1# Iso-vitalex (BBL) + 1<K> hemoglobin (Difco). Næringsmediet ble fortynnet slik at det endelig inokulum var ca. IO<4> til IO<5> kolonidannende enheter pr. ml (CFU/ml). Som minimalt hemmende konsentrasjon (MIC) satte man den laveste konsentrasjonen av antibiotikumet som ikke ga noen synlig vekst etter 18 til 24 timers inkubering ved 37°C. Neisseriae-stammene ble Inkubert i en CC^-anrlket atmosfære.

In vitro-aktivitetsspektraene for antibiotikum SB 22484 er angitt i tabell IV.

L-tallene identifiserer interne samlingstall.

(x)

(<x>) Klinisk isolerte stammer ble identifisert ved hjelp

av interne samlingstall.

(xx)

Klinisk isolerte stammer resistente overfor spektinomycin (MIC > 128 under disse betingelser).

( XXX )

Klinisk isolert beta-penicillin-fremstillende stamme resistent overfor penicillin med en MIC /► 50 under disse betingelser.

Aktiviteten overfor Ureaplasma urealyticum ble bedømt etter vekst av mikroorganismen på et medium med følgende sammensetning:

Den minimalt hemmende konsentrasjonen (MIC) ble bestemt i rør ved hjelp av en to gangers serumfortynningsmetode (konsentrasjonsområde fra 0,008 til 128 my g pr. ml).

Volumet på 1 ml pr. tube ble inokulert med fra 10 -10 farveforandrende enheter (ecu) fra 20 til 24 timers dyr-kede kulturer. Rørene ble inkubert ved 37°C.

MIC-sluttpunktet ble tatt som den laveste konsentrasjonen av antibiotikumet som hindret en farveforandring bedømt på et tidspunkt da kontrollkulturen viste en farveforandring som tilsvarer pH 7,8 (bestemt ved en sammenligning av farven på mediet med farven på det samme medium justert til forskjellige pH-verdier). Denne forandring opptrådte ca. 24 timer etter inkuberingen når man brukte en inokulum

O O O

på ca. 10-10 cm pr. ml. Inokulumets størrelse ble bedømt på følgende måte: Serie 10 gangers fortynninger av næringsmediet ble brukt som inokulum og tilsatt mediet, og ccu/ml ble beregnet på basis av den laveste fortynning som viste en farveforandring.

Resultatene av denne prøven på en klinisk isolert stamme er angitt nedenfor:

"In vitro"-baktericide eksperimenter viser at antibiotikum SB 22484 dreper 99, 9% av cellene av N. gonorrhea L 997 i en logaritmisk vekstfase på CG agarbase (Difco) + 1% Iso-Vitalex (BBL), etter Inkubering i 24 timer ved 37°C med en konsentrasjon som tilsvarer 5 ganger den angitte MIC-verdi 10 - g pr. ml.

Primære resultater av in vitro-prøver viser at antibiotikum SB 22484 når det blir gitt s.c. 200 mg pr. kg til mus som var eksperimentelt infisert med S. pyrogenes ifølge den fremgangsmåten som er beskrevet av V. Arioli et al., J. Anti-biotics 29, 511 (1976), beskytter tre ut av fem dyr. Videre viser forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen en meget lav toksisitet, ettersom deres LD50 i intraperitonealt til-førte mus er høyere enn 1000 mg. pr. kg kroppsvekt (høyeste undersøkte dose).

P.g.a. sin antimikrobielle virkning kan forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen effektivt brukes som de aktive ingredienser i antimikrobielle preparater enten for mennesker eller dyr, enten det gjelder profylakse eller terapi som innbefatter infeksjonssykdommer som forårsakes av visse typer patogene bakterier.

På bakgrunn av de antimikrobielle aktiviteter for antibiotikumet SB 22484 så vel som for de tilsvarende salter, så kan de brukes i farmasøytiske preparater. Mer spesielt kan antibiotikum SB 22484 og de tilsvarende ikke-toksiske farma-søytisk akseptable salter brukes i blandinger i ethvert ønskelig mengdeforhold.

Som vist ovenfor er antibiotikum SB et kompleks av minst fire hovedkomponenter (SB 22484-faktor 1, 2, 3 og 4). Det tør være innlysende at den prosentvise mengden av disse faktorene i komplekset kan variere fra en kultur til en annen kultur avhengig av forskjellige parametre såsom kulturmediets sammensetning og fermenteringsbetingelser foruten forskjellige variasjoner med hensyn til isolering og rensing. Foreliggende oppfinnelse innbefatter således alle blandinger av antibiotikum SB 22484, faktorene 1, 2, 3 og 4 i ethvert mengdeforhold. Disse blandinger inngår generelt i uttrykket antibiotikum SB 22484.

På bakgrunn av den antimikrobielle virkningen vil antibiotikum SB 22484 kunne anvendes som et antimikrobielt middel av stor viktighet ved behandlingen av gonore. Denne sykdommen behandles for tiden med en rekke forskjellige antibiotika, hovedsakelig med penicillin og spektinomycin, alternativt med tetracyklin og ampicillin. Etter hvert som antallet av gonore har steget jevnt og sikkert de siste 15 til 20 år, så har imidlertid bruken av disse antibiotika for behandling av sykdommen resultert i en økende frekvens av resistens hos de sykdomsfremkallende bakterier. P.g.a. dette vil det følgelig være meget ønskelig og viktig å kunne utvikle nye antibakterielle forbindelser som har høy virksomhet på den mikroorganisme som er årsak til gonore,

og heri inngår også enkelte stammersom er resistente overfor de typer antibiotika som brukes i dagens terapi.

Vanligvis så vil antibiotikum SB 22484 så vel som dens ikke-toksiske farmasøytisk akseptable salter ved en anti-bakteriell behandling kunne tilføres på forskjellige måter, f.eks. topisk eller parenteralt. Det er imidlertid foretrukket å tilføre de aktive ingredienser parenteralt.

Preparater for Injeksjon kan være 1 form av suspensjoner, oppløsninger eller emulsjoner 1 oljeaktige eller vandige væsker, og kan inneholde andre tilsetningsstoffer såsom suspenderende midler, stabilisatorer eller dispergerings-midler.

Alternativt kan den aktive ingrediens være i pulverform for rekonstituering når den skal leveres, f.eks. i sterilt vann for injeksjon.

Avhengig av den tilførselsvei man velger, kan forbindel-sene opparbeides i forskjellige doseringsformer.

I visse tilfeller kan det f.eks. være mulig og ønskelig å opparbeide forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen ii belagte doseringsformer for oral tilførsel, og disse kan fremstilles på vanlig kjent måte (se f.eks. "Remington's Pharmaceuical Sciences" 15. utgave, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania), USA, side 1614).

Dette vil spesielt være tilfelle når det er ønskelig at antibiotikumet skal være spesielt virksomt eller skal absorberes i tynntarmen, mens det skal gå uforandret gjennom mavesekken.

Den mengde av den aktive ingrediens som skal tilføres, vil være avhenig av forskjellige faktorer såsom størrelse og kondisjon på den pasient som skal behandles, tilførselsvei og frekvens av tilførsel, samt den eller de bakterier som har frembragt sykdommen eller lidelsen.

Det antibiotiske stoff fremstilt ifølge oppfinnelsen, dvs. antibiotikum SB 22484 og dets fysiologisk akseptable salter, vil generelt være effektivt i daglige doser mellom 5 og 100 mg aktiv ingrediens pr. kg kroppsvekt, eventuelt oppdelt i to til fire doser pr. døgn.

Spesielt fordelaktige preparater kan fremstilles i doseringsenheter som inneholder fra 100 til 5.000 mg. pr. enhet.

Når man imidlertid behandler gonore, så vil det ofte av praktiske årsaker være ønskelig med en enkeltdoseterapi, og man vil da bruke høyere minimumsdoser av antibiotikum SB 22484, vanligvis mellom 10 og 100 mg pr. kg kroppsvekt, for derved å kunne holde et effektivt blodnivå av den aktive ingrediens over et lengre tidsrom.

Ved behandling av gonore vil det videre være ønskelig å ha en parenteral doseringsform som gir langvarig virkning. Preparater med slik langvarig virkning kan fremstilles på forskjellige måter, noe som er velkjent i den farmasøy-tiske industri. En foretrukken fremgangsmåte for fremstilling av et slikt preparat inneholdende antibiotikum SB 22484 innbefatter bruken av et vannuoppløselig salt av dette antibiotiske stoff, f.eks. benzatinet, prokainet, hydrabaminet o.l. salter suspendert i et vandig eller oljeaktig medium.

Ved intramuskulær injeksjon vil disse salter bli frigjort meget langsomt p.g.a. den lave vannoppløseligheten, hvorved man opprettholder et høyt blodniuå av det antibiotiske stoff over et lengre tidsrom.

Fremstilling av farmasøytiske preparater

En enhetsdoseringsform for intramuskulær injeksjon fremstilles med 2000 mg av prokainsaltet av antibiotikum SB 22484 suspendert i 3 ml raffinert jordnøttolje, gjort geleaktig med 2% aluminiumstearat.

En enhetsdoseringsform for intramuskulær injeksjon fremstilles med 250 mg av antibiot.i\um SB 22484 oppløst i 5 ml av et oppløsningsmiddel med følgende sammensetning: Propylenglykol 40%, etanol 10%, o,5% trihydroksymetylamin (vekt/volum), 50%.

En enhetdoseringsform for intramuskulær injeksjon fremstilles med 5 ml av en steril suspensjon USP inneholdende 8% propylenglykol og 3.500 mg av antibiotikum SB 22484.

En enhetsdoseringsform for intramuskulær injeksjon fremstilles med 2000 mg av antibiotikum SB 22484 natriumsalt suspendert i 5 ml sterilt vann for injeksjon.

De følgende eksempler illustrerer også oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstilling av det antibiotiske stoff

Et lyofilisert rør inneholdende en kultur av Streptomyces Sp. NRRL 15496 ble åpnet og aseptisk overført til en skråagar av havremel. Etter 10 døgns inkubering ved ca. 28°C ble skråagarkulturen suspendert i destillert vann og inokulert i en 500 ml Erlenmeyerkolbe inneholdende 100 ml av et medium inneholdende følgende sammensetning:

Denne kolben ble inkubert ved 228°C, 220 omdreininger pr. minutt i ca. 48 timer.

Hele kulturen ble brukt for å inokulere et 10 liters fermenteringskar inneholdende 6 liter fermenteringsmedium med følgende sammensetning:

Fermenteringskaret ble holdt på 28°C og rørt med 900 omdr. pr. minutt og en gjennomstrømning på et volum/volum/min.

Man fikk maksimal antibiotisk aktivitet etter ca.

40 timers fermentering.

Innholdet av antibiotikum ble bestemt med en papirskive-agarprøvemetode idet man brukte Neisseria caviae ATCC 14659 og Streptococcus dysgalaktia ATCC 9926 som prøve-organisme.

Eksempel 2

Massiv produksjon av antibiotisk stoff

Et lyofilisert rør inneholdende en kultur av Streptomyces Sp. NRRL 15496 ble åpnet og aseptisk overført til en skråagar av havremel. Etter 10 døgns inkubering ved 28°C ble denne skråagarkulturen suspendert i destillert vann og inokulert i to 2000 ml Erlenmeyerkolber inneholdende 500 ml medium med følgende sammensetning:

Disse to kolbene ble inkubert ved 28°C, rørt med 220 omdreininger pr. min. i ca. 40 timer.

Kulturene i de to kolbene ble brukt til å inokulere et 50 liters fermenteringskar inneholdende 30 ml av et medium med følgende sammensening:

og ble fermentert ved 28°C, rørt med 500 omdreninger pr. minutt og en gjennomluftning på 1 volum/volum/minutt.

Etter 24 timers fermentering ble ovennevnte 30 liters kultur inokulert i et 300 liters fermenteringskar inneholdende 200 liter medium med samme prosentvise sammensetning som det foregående. Dette fermenteringskaret ble holdt på 28°C, rørt med 240 omdreininger pr. minutt og en gjennomstrømning på 1 volum/volum/minutt.

Man fikk maksimal antibiotisk aktivitet etter ca.

40 timers fermentering.

Innholdet av antibiotikum ble bestemt ved hjelp av en "papirskiveagarprøvemetode", idet man brukte Neisseria caviae ATCC 14659 som var dyrket over natten på et hjerne-hjerteagarmedium ved 37°C, som en prøveorganisme. Mediet gir en inhiberingssone med diameter på 23 mm på en 10 cm papirskive.

Eksempel 3

Isolering og rensing av antibiotikum SB 22484

60 liters fermenteringsmedium ble filtrert i nærvær av filtreringshjelpemiddelet Clarcel R, hvoretter filtratet ble justert til pH ca. 7,0 og ekstrahert med ca. 60 ml etylacetat. Den organiske fasen ble utskilt ved sentrifu-gering og konsentrert til et lite volum. Petroleter ble så tilsatt den oljeakige resten, og det urene antibiotiske bunnfallet ble frafiltrert. 4,5 g av dette ble så oppløst i 50 ml metanol, påsatt en kromatografisk kolonne på lm inneholdende 1,5 ml Sephadex L 20 i metanol, hvoretter systemet ble eluert med det samme oppløsningsmiddelet.

Det ble oppsamlet fraksjoner på ca. 20 ml, og disse ble undersøkt ved hjelp av ovennevnte papirskivediffusjons-prøve mot N. caviae ATCC 14659 og ved hjelp av tynnsjikt-kromatografi og høytrykks væskekromatografianalyse.

De fraksjoner som inneholdt antibiotikumet, ble slått sammen og konsentrert til tørrhet. Den oljeaktige resten ble oppløst i en minimal mengde tetrahydrofuran, hvoretter etyleter ble tilsatt, og blandingen rystet i et egnet tidsrom inntil man fikk et bunnfall. Dette ble frafiltrert og tørket til ca. 960 mg av et rent preparat av antibiotikum SB 22484 med de fysikalske-kjemiske egenskaper som er beskrevet ovenfor.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikum SB 22484 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som i form av den frie syren har følgende egenskaper: A) et ultrafiolett absorpsjonsspektrum som har føl-gende absorpsjonsmaksima: B) et infrarødt absorpsjonsspektrum som har følgende absorps jonsmaksima (m "*") :

3700-3080, 2980-2840 (nujol); 1645; 1560; 1455 (nujol); 1375 (nujol); 1305; 1240; 1215; 1145; 1090;

1060; 1035; 990; 945; 910; 890: 850; 810; 720 (nujol); C) et NMR-spektrum som har følgende grupper av signaler (i ppm) i et 270 MHz H-NMR analyseappårat registrert i heksadeuteroaceton under anvendelse av TMS som en indre referanse (0,00 ppm) (6 = ppm).: 0. 776 (3H); 0,836; 1,21-1,246 (3H); 1,2-2,76 (5H) ; 1, 676 (s, 3H) ; 1,736 (3H) ; 2,016 (s, 3H) ; 3,206 (s, 3H) ; 3,3-5,66 (11H) ; 5,4-6,76 (13H) ; 6 , 046 (1H) ; 7, 406 (1H) ; 7,686 (1H); 10,636 (lH) (s = singlet); D) et massespektrum oppnådd ved hjelp av direkte væskeinnløpsvæskekromatografi i LC-MF ved bruk av et HP 5985 B apparat, som arbeider ifølge negativ-ion metode, og som utfører væskekromatografien under de følgende betingelser: kolonne: Brownley Lab. RP 8 10 my m, 25 cm (en oktylsilanfunksjonalisert silisiumdioksydgel) Strømnings- 1 ml pr. minutt forhold: elueringsmiddel:acetonitril:0,IM ammoniumformat = 60:40 som viser fire hovedtopper med tilbakeholdelsestider på 4,48, 5,03, 5,65 og 7,25 minutter, respektivt; de er vilkår-lig betegnet antibiotikum SB 22484, faktorer 1, 2, 3 og 4, respektivt; E) følgende hovedfragmenteringstopper for de ovennevnte identifiserte antibiotiske faktorer, dvs. antibiotikum SB 22484, faktorer 1, 2, 3 og 4: faktor 1: 752, 734, 716, 684, 538, 598, 566, 500 faktor 2: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580 faktor 3: 752, 734, 716, 684, 638, 598, 566, 500 faktor 4: 766, 748, 730, 698, 652. 612, 580, 500; F) følgende RF-verdier i forskjellige kromatografiske systemer under anvendelse av plater av silanisert silisium- dioksydgel 60 F254 Merck: visualisering: UV-lys ved 254 nm, karakterisert ved at man ved en temperatur i området 20-40°C dyrker Streptomyces sp. NRRL 15496 under submerse, aerobe betingelser i nærvær av assimilerbare kilder med hensyn til karbon, hydrogen og uorganiske salter, utvinner og isolerer nevnte antibiotikum fra fermenteringsmediet, og, om nødvendig, omdanner nevnte antibiotikum til det ønskede salt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man fremstiller antibiotikum SB 22484 som en blanding inneholdende minst en av dets fire hovedkomponenter SB 22484 faktorer 1, 2, 3 og .4.