FI77691B - Foerfarande foer framstaellning av ett antibiotikum sb 22484. - Google Patents

Description

77691

Menetelmä antibiootin SB 22484 valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uuden antibiootin, jota merkitään antibiootti SB 22484, valmistamiseksi viljelemällä kantaa Streptomyces sp. NRRL 15496.

5 Antibiootti SB 22484 omaa happofunktion kyeten muodostamaan suoloja. Antibiootin SB 22484 farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat, mukaanlukien aikai imetalli-, maa-alkaiimetal1i-, ammonium- ja substituoidut ammoniumsuo-lat, ovat osa tätä keksintöä.

10 Esityksen yksinkertaisuuden vuoksi, käsiteltäessä keksinnön mukaisten yhdisteiden biologista aktiivisuutta, termi "antibiootti SB 22484" tarkoittaa antibioottia, joka on antibiootti SB 22484 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

15 Termi "ai empi a 1 kyyl i a 1 kanoyyl i esterit" tarkoittaa (t^-Cg)- alkyyli(C2-Cg)alkanoyyliestereitä, kuten esimerkiksi etyyliasetaattia, propyyliasetaattia, butyyliasetaattia, etyylipropionaattia, butyylipropionaattia, butyyliamylaattia ja vastaavia.

Termi "veden kanssa sekoittumattomat ai empi a 1kyyliketonit" 20 tarkoittaa (Cg-C^lketoneja, jotka sekoittuvat niukasti veden kanssa, kuten esimerkiksi 2-pentanoni, 2-heksanoni, 3-heksanoni, 2-heptanoni, 3-metyyli-2-butanoni ja 3-metyy-1i-2-pentanoni.

Termi "haiogenoidut alemmat hiilivedyt" tarkoitta polyha-25 logenoituja (C^-C^)hiilivetyjä, kuten esimerkiksi mety-leenikloridia, kloroformia, dikkloorietaania ja vastaavia.

2 77691

Terni "korkeammat alkanolit" tarkoittaa suoria tai haarautuneita, lineaarisia tai syklisiä (C^-C^alkanoleja, jotka sekoittuvat niukasti veden kanssa, kuten esimerkiksi butanoli, 2-metyylipropanoli, 2-metyyli-2-propanoli, 5 pentanoli, 2-metyylibutanoli, 2-metyyli-2-butanoli, syk-loheksanoli ja vastaavat.

Tämän keksinnön mukaiselle antibiootille on tunnusomaista melko spesifinen antimikrobinen kirjo, itse asiassa se on aktiivinen Neisseriae-kantoja vastaan, melko aktii-10 vinen Streptococci'a, Ureaplasma' a, Mycoplasma'a ja He- mophilus'ta vastaan, kun taas se on melkein inaktiivinen Staphylococci'a ja yleisiä gram-negatiivisia bakteereita, kuten esimerkiksi Proteus’ta, Escherichia’a ja Pseudomonas ’ta vastaan.

15 Antibioottia SB 22484 tuotetaan viljelemällä kantaa, joka eristettiin Italiasta kerätystä maanäytteestä ja joka on tallennettu heinäkuun 6. päivänä 1983 kansainvälisesti tunnettuun kokoelmaan Agricultural Research Collection (NRRL), joka sijaitsee Peoriassa, Illinoisissa (USA), 20 Budapestin kokouksen edellyttämällä tavalla. Kannalle on annettu liittymisnumero NRRL 15496.

Kannan Streptomyces sp. NRRL 15496 tunnusmerkit on annettu seuraavissa kappaleissa.

25 MAKROSKOOPPINEN JA MIKROSKOOPPINEN TARKASTELU

Bakteeripesäkkei11 e on tunnusomaista väriltään keltaisesta aina syvän kromin keltaiseen oleva kasvumyseeli, jota muo-. . dostuu useimmilla tutkituilla väliaineilla ja turkoosin- -vihreä ilmamyseeli. Itiöalustat järjestäytyvät spiraaleik-30 si, kierukoiksi ja koukuiksi. Itiöt ovat lieriömäisiä, pyöreitä päästään ja niiden läpimitta on 1,2 x 2-3 Jim.

Itiöalustojen muodon ja ilmamyseelin perusteella Streptomyces sp. NRRL on määritelty Pridham'in, Hesseltine’n ja Benedict'in esittämän luokituksen mukaan kuuluvaksi ryh-

II

3 77691 mään "Group Spira-Green Section" (T.G. Pridham, C.W. Hesseltine ja R.G. Benedict, "A guide for the classification of Streptomycetes according to selected groups,

Appi. Microb. Voi. 6, (1958)).

5 VILJELYTUNNUSMERKIT

Viljelytunnusmerkkien tarkastelemiseksi, kantaa Strepto- myces sp. NRRL 15496 viljeltiin erilaisilla standardivä-liaineilla Shirling'in ja Gottlieb*in (1) mukaan, sekä lisäksi useilla Wacksman’in (2) esittämillä väliaineilla.

10 Värimääritys suoritettiin, sen ollessa tarpeen, Maerz'in ja Paul’in (3) menetelmällä.

Kaikki tulokset, jotka on esitetty seuraavassa taulukossa I, on saatu kahden viikon inkuboinnin jälkeen 28° C:ssa.

Luokitukseen käytetyn väliaineen pH oli suunnilleen neut-15 raali (pH 6,6-7).

„ 77691

•H I

+J I

•μ I

G I

0) I

e I

bO I

•H I

CX I

TJ I 0) d) <D (DO) (I)

3* I Ή M M r—( M M

<u ι o o o o o o

G I

<D I Μ Μ Μ ·Η Μ ·Η χ ι Φ <ν ο) α) α> ο) 3 ι

M I

M I I I

I mj :π3 Ε-· ι +J -μ

Ml M Μ ·Η X I ·> 4-* « :0 :θ +-*

Pi I ·Η 9fl MM Ή to Η ι <η α> η -μ +j α>

£ ι β) G <u M MW

co ι <υ jc <υ ·η m 33 I w M W »0 μ* :tJ (0

2 I >ϊ > >, -G W 4-> M

§1 E G e Μ Tj ·Η (0

I 2 ·Η ffl 0) X. <U +J

H I E W E G 3 G Ä

>l IMO M Ä M ÄO

J M I Μ Ο ·Η ·Η C ·Η X

W M I X > > *3 « I C G G G 3 G 3 J <D I 0) 3 (UM 3 m3

Mtoic-μ cw-μ w -μ > >, I M M Owe) OW(U 0)

EiTJTJ-GTJOOM OOM m «cTJi-Gtnso-GyOO y ·ο o o

en £ l M w M M G O GO

3· M | (U o -μ Q) 3 3 M 33 M M

m m ι y ·γ-> m y -μ ε α; -μ ε <u <u M M |

O J I

y oi ι tj ι y oi i-r-)i j~ G> 2 I G II »0 r stj I 0) ►f I 3 TJ W O <UG <U 3 m ex iO · ι w m m G E n) £ w 6 <ex ι y m ex y ä-m ä g y o ·«

H W I TJ 3 >, (U M o) <D TJ G tJ

i ex y g c f' ex m ex c ex y 3 c CO I ·> :TJ H M > :0 W I ** TJ «*>i-3*‘W · G « · w X1 O | TJ -μ to fd >> —iti M to tJ :nj Tj TJ cm tJ m

>* I 3 G 3 W <D 3 «J s 3 > 3+->^ y G

£ I > M ä > >My > G > G *"d :tJ

O Ml W ex W ·> G W W ^ W TJ WM'V. TJ> E-· M ι n3 en TJ TJ 0) TJ :τ) en tJ £ m α οι -μ ex, o> » y -μ y -μ e y :tj y g y w« uoi e cm exc <u :rd e m «o oi w ι TJ e <u TJ m TJ TJso) TJ X tJ <u qj Μ-μ h >, ι +-* >> g -μεχ-μ μ e μ μ ε e mc

CO E I W -μ M W M W ** M WÄ WÄM 3 M

3it)wtj m x ii tjtjtj tjtj ts <u tj 3ex 2 >iwm+j w >, y w-μ-μ w μ w ex μ -μ

< wiceXM G G G G G M CC G M Ä:tJ

2 TJ I 3 >> 0) 3 >i M 3 M 1) 3 M 3<tJ<U 0<U

2 yiGGy G μ £ Gcxy g ex G -ny y £ y ι I /-« I ro I io I CN 10) aii O tj -μ o

Cl O 2 G 3 2 M I G 2 G TJ 3 (tfiTJ tj cu g ex tj ex, M i bO Cu bO co tJ w >co Μ|(β co tJh bO tJ .hm :t)IO m O tj ι λ m g > » Ä ÄO) tO-S-MGmÄTJO)

>> I 3 0) 3 G >, M Tj IbOG

M | TJ G TJ M MO O b0 O M TJ M

0)Ι·μ M -n ttJ 0) 2 G TJ 2 G I Π3

•n I TJ TJ TJ M y 0) M O TJ M

m ι g m gm ycuwccu-μ-μΜ

M 13 M 3 rrJ G co >, m co CX 3 :tJ

>ITJ at) TJ> tTj M MMM 0)T)> iy > y ^ bObflw ft g ^ 5 77691 I oj o> ο) ο) a)

I M M rH i—( i—I

10 0 O O 0 I ·Η ·Η ·Η ·Η ·Η I <u a) maja) I Hfl :3 I μ +-> I ·Η ·Η ·Η I :0 -H :0 I Μ (0 ·Η I μ 0) μ I ·Η (0 ·Η I ·Η ·Η I :ro fO :3 μ I +j rH -P (/) I ·Η fl ·Η 3

I 0) +-> 0) .Y

I ft Λ ft 3

Ml Ä O ,C -H

I -H X -H G

O I > > X I C 3 C 3 X I -rl 3 ·Η 3 di ro -p en +-1

Dia) Ora a) a) Ocn o)

DIM OO M M OO M

<lO y T) O O X Ό O

HI ft O ft O

I ·Η 3 3 ·Η ·Η 3 3 ·Η • ια) -με ο ο +->ε ο>

• I

• I

• I I I

• I I CO I I C I

• I I >, O M I Μ Λ 3 >,1 I

• I s<Tl G 0) ε μ G eft

I 0) #tj CO M ft .¾ (¾¾ CO -rl Id HI

• ι ε c ·η * 'n. .h o) -h ε mm X \ A -r\ ft C σι * ε ~ X 0.0 3 μ ι o> Λ* >. οι mo 3 >, ft mg 3 1 O. ,G ft C :3 3 ft 3 C U X ,G 3 •Ml :3 ·Η ·Η > Λί >3 0) I *0. »· 3 M co coo) * G »m I aJ 3 μ o. 3 ·« 3 m 3 :3 fl u

I 3 C 3 M Si) x: H) ,¾ 3 3> 3 H

I >3 > a> μ -μ 3 >>,r->> I coa) tn X 3 c ^ 3 > io m s to I id h (0 3 to 3 *>

I Λ* 3 ^'•‘HtOO.Jcn»· X » s X +J C

I 3 <0 ·ιΗ ·Η ^ «rl 3 id Oi >.0)

I 3 > 3 μ 0) Μ+-*σ> Η-Ρ 3 μ 3 G C

• I -μ μ G ft Μ >, MCC^CGV>>M

I CO *3 CD ·Η G 3CG 3 MO) CO*H0) CO μ ft I 1030) d) ft ·Η 3 p>s 0) 3 O, C O ft C 3 CO :3 i en μ ,y co > μ -m g μ ·η en <h com>

I G G CO G μ X CO -H ,C :3 ft G μ ft e O. G

I 3.rl 3 3 >» aJ O -H 3 O 0) :3 3 >, :3 3 >, 3 I ft O. ft ft G CO ,νο.μ X ε > ft e > ft ft ε

I I I

i c^

I I

I O *rl I 'z. ft ft en I 3 3 o

I ft ft. OO 00 O

i dj en 3 nj x I 00 M 3 ft ft 3

I 3 ·Μ G e 3 3 M

I ·Η 0) ·Η ·Η 00 00 bO

I G G G - 3 3 I

i ·η ·η - ft μ o I ·μ I ·η ιβ >, ο) μ μ 3 e

- ICO·H 0)C a) G G O

I O M ftdCO G -rl 3 μ ft ift:fl oo) e > ft a, 3 I >1 > »rl ft 0) 3 0) 0)00 ι μ ~ x h cq ft ex a, id 6 77691 I I “ I ·Η

I O

I I 0) ! I cx I 10 I a) ai a) a) <u I cn

I ·—ί H rH r-l r-H I (U

to O O O O I O

1 I >1 t ·Η ·Η ·γΗ Ή Ή I c tat at a) <d Dio » I +-> • I cx

> I QJ

I I u • I +-> • I cn

I I

I I cm • I o

I I

» c 1C

t ·|Η 10

If-1 I ·Η to I -μ to I ffl

I to IN

I ^ I v+ · I e I u j- I Ό I (D oo I 6 I -μ co

I rH I O I

I ·Η I Id CD

HI I C csi I C <o I (0 oo ·> ο i id +-* <d a) at tu I jc c .

iS I 0) *H H rH rH Η IO “ Ο ,Y

* I .V 0) O O O Ol cn| rH ^

►O t H D I U O O

H I Ο ιΗ ·Η ·Η ·Η -rl ΙΟ · CJ ><

O I > <d 0) <D 0) 0) I «Η rH

<1 I O H 3 HI I Ό > O 0) ΙΌ 10 2 • Il V 4-* Il I I £ I >>

• I >1 J* C 3 G >,:Ό nd I +-> U

• I +-* *0 ·Η ,C Ο) 4-*> > 10) to · Ό · • i to +-> cx oc w I έ · a> a) c o

• I ·Η C Ή -rl c C I o +-> U O C

• I CX Ή +-* “Ό CX Ό 0) I I zf 0) Ο ·Η M

I >> CX 3 (0+-> >, ,Υ ·η I oo o g +j

• Ifc rC 3 H U £ rH I to I >, ·Η O

•I C O >0) ·Η O I to oo g +-> ·Η C

1*0) (0 X *CX ICTJrHOrHQid

• I id G ό ·> OC Ό·Η *> I H oo c <d CX

.yiO-H-s. id γ id 3 c+ <d i -h ca < e +-1 I > Ό H 3 *H >0) 3 | “ « +-> o <d I 05+-1 > Ok to 6 > I · ιοί u · · o

•Π I Id to CD to +-1¾ Id to | Q rH| < . O

I Y Ό toe Y * (ΰ I O u-> γ I Ό c γ ·ηό <d γ I λ * i) u m o I O λ; a) rH γ id +-* latr+r η o 14-1 c<d rH +-> c Ό ι·ηοΗιο m

Itonj-rl Id 3 * H t0 *rl Id IH.rl C*

I <d ·η Id Y 3 t) S idfXC Λί C I +-> I ·Η H rH

ItO -P Y +-»+-> H 10 0) Y <D I +-» 0) Y 3 -H

I C H rH 3 O) C ^ C+JC CClO+JHHid-H

I 3 >. 0) ·Η O -H O 3 >ι ·Η ·Η ·Η I CD O CO ·Η CX X

I k C Y C X CX H C G C. C^l Id ai 3 I

I I Id CQ rH Id 3 I Ci I ·η Ό Q) id

I id I I . « c os P

I bO ·Η I « 4J . id · u I id to I · to < s o I -H O I CQ >, · to £ tto o k c i · en cn g id

IO k Id O Q)IM Id*r->C

IO Id bO +-> G I · * ·Η O

I Y X Ό ·Η ·Η I bO >3 C Η · ·Η I 3 X ·Η Id Id I G Id rH < +-1 I H Id +-* 6 3 I ·Η · e ·Η ·Η IPO to +j γ I rH +-> to 3: N x)

»I I Ό 3 rHifcC-iSfcU

ι γ x <d +-» id I ·η m o o) o» 10 o h +-> > I λ »ΰ ä »e ·

ίο) o) id ·η G icni^HSTtN

I A CX C Ei f-ι id I

iid id <d I O Gi''N'->/_'>

IN NbOld 3 3 I rH CNI OO

10 o id ο X gl'—w^

II

7 77691 HIILILÄHTEIDEN HYVÄKSIKÄYTTÖ

Kannan Streptomyces sp. NRRL 15496 kyky käyttää erilaisia hiililähteitä, jotka tutkittiin Shirling'in ja Gottlieb'in kuvaamalla menetelmällä, on esitetty seuraavassa taulu-5 kossa: TAULUKKO II Hiilen hyväksikäyttö hiili lähde kasvu

Inositoli 10 Fruktoosi ++ +

Ramnoosi +++

Mannitoli +++

Ksyloosi +++

Raffinoosi 15 Arabinoosi ++

Selluloosa

Sakkaroosi

Mannoosi +++

Laktoosi +++ 20 Galaktoosi +++

Salisiini +

Dekstroosi ++ +++ = voimakas hyväksikäyttö ++ = kohtuullinen hyväksikäyttö 25 + = heikko hyväksikäyttö - = ei hyväksikäyttöä 8 77691

FYSIOLOGISET TUNNUSMERKIT

Taulukossa III esitetään kannan Streptomyces sp. NRRL 15496 fysiologiset tunnusmerkit.

TAULUKKO III

5 Fysiologiset tunnusmerkit

Koe Tulos Tärkkelyshydrolyysi +++ I^S-muodos tus +

Melaniinin muodostus 10 Tyrosiinihydrolyysi +

Kaseiinihydrolyysi +_

Kalsium-maleaattihydrolyysi

Nitraatti-pelkistys +_

Lakmusmaito ei koaguloitumista 15 ei peptonisoitumista

Gelatiinin nesteytys +++ - negatiivinen tulos + heikko positiivinen tulos ++ positiivinen tulos 20 +++ voimakas positiivinen tulos

Antibiootin SB 22484 tuottamiseksi viljellään sitä tuottavaa Streptomyces sp. NRRL 15496:ta aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa ravintoväliaineessa, joka sisältää assimiloituvan hiililähteen, assimiloituvan typpilähteen ja epäor-25 gaanisia suoloja. Mainittu viljelyväliaine voi olla mikä tahansa lukuisista ravintoväliaineista, joita tavallisesti käytetään käymisessä, kuitenkin tietyt väliaineet ovat edullisempia. Täten esimerkiksi edullisia hiililähteitä ovat glukoosi, mannoosi, galaktoosi, tärkkelys, maissi-

II

9 77691 jauho ja vastaavat. Edullisia typpilähteitä ovat ammoniakki, nitraatit, soijapapujauho, peptoni, lihauute, hiivauute, tryptoni, aminohapot ja vastaavat. Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan lisätä viljelyväliaineisiin, 5 ovat tavalliset liukenevat suolat, jotka pystyvät tuottamaan natrium-, kalium-, rauta-, sinkki-, koboltti-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti-, fosfaatti-, nitraatti-ioneja ja muita vastaavia.

Tavallisesti antibioottia tuottavaa kantaa esiviljellään 10 ravistelupullossa, sen jälkeen viljelmää käytetään ymp- pättäessä käymisastiat antibioottien huomattavien määrien tuottamiseksi. Esiviljelmässä käytetty väliaine voi olla sama, jota käytetään suuremmissa käymisastioissa, mutta muitakin väliaineita voidaan käyttää.

15 Antibioottia SB 22484 tuottavia kantoja voidaan viljellä lämpötiloissa, jotka ovat noin 20° C - noin 40° C, ja mieluimmin lämpötiloissa, jotka ovat noin 24° C - 30° C.

Käymisen kuluessa antibioottituotantoa voidaan seurata testaamalla antibioottinen aktiviteetti näytteistä, jotka on 20 otettu käymisliemestä tai myseelimassan uutteista, käyttäen bakteerikokeita tai TLC- tai HPLC-menetelmiä.

Tähän testiin sopivia ovat organismit, joiden tiedetään olevan herkkiä antibiooteille SB 22484, Erityisen edullisia koe-organismeja ovat Neisseria caviae ATCC 14659 ja 25 Streptococcus dysgalactiae ATCC 9926. Määritys suoritetaan edullisesti käyttäen agar-diffuusio-menetelmää agar-levyillä. Maksimaalinen antibioottinen aktiviteetti esiintyy yleensä käymisen toisen ja viidennen päivän välillä.

Antibiootti SB 22484, joka muodostuu kannan Streptomyces 30 sp. NRRL 15496 käymisen kuluessa, on pääasiallisesti käymis liemessä. Sen tähden mainittujen antibioottien talteen-ottaminen suoritetaan mieluimmin uuttamalla suodatettu käymis liemi. Suodatetun käymisliemen uuttaminen tapahtuu par- 10 77691 haiten etyyliasetaatilla, mutta sopivasti voidaan käyttää muita alempialkyylialkanoyyliestereitä, jotka ovat veden kanssa sekoittumattomia, kuten esimerkiksi metyyli-ase taattia, etyylipropionaattia ja butyylipropionaattia, 5 alempia hiilivetyjä, kuten esimerkiksi polyhalogenoituja hiilivetyjä, kuten esimerkiksi metyleenikloridia, dikloo-rietaania ja kloroformia, alempialkyyliketoneja, kuten esimerkiksi metyyli-isopropyyliketonia, metyyli-isobutyy-liketonia, korkeampia alkanoleja, kuten esimerkiksi bu-10 tanolia, pentanolia ja sykloheksanolia ja vastaavia.

Raaka antibiootti SB 22484 otetaan sen jälkeen talteen uuttoliuottimesta tavanomaisilla menetelmillä, jotka tavallisesti käsittävät uuttoliuottimen konsentroimisen pieneen tilavuuteen ja raa'an antibiootin saostamisen tästä 15 liuoksesta lisäämällä ei-liuottavaa ainetta.

Raa’an antibiootin puhdistaminen voidaan sen jälkeen tehdä käyttäen erilaisia menetelmiä, kuten esimerkiksi pylväs-kromatografiaa, suolan muodostamista tai uuttamista sopivilla liuottimilla. Puhdistettaessa pylväskromatografises-20 ti, käytetään mieluimmin niin sanottua s teeristä ekskluu-siokromatografiatekniikkaa optimaalisten erotustulosten saavuttamiseksi. Erityisesti Sephadex® LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Ab), kontrolloitu, huokoinen, ristiinkytketty dekstraani, jossa useimmat hydroksyyliryhmistä ovat 25 alkyloituja, on osoittautunut olevan erityisen edullinen stationäärifaasi puhdistuksessa. Vaihtoehtoisesti suodatetun käymisliemen pH säädetään arvoon 5-9 ja valutetaan läpi ei-funktionalisoidusta polystyreenihartsipylväästä, kuten esimerkiksi Amberlite X-AD-2 (XAD-4, XAD-7, XAD-8) tai 30 Diaion HP-20 kromatografiapylväästä, joka on valmistettu de-ionisoituun veteen, käyttäen eluointiliuoksena asetonin, metanolin, etanolin, n-propanolin, isopropanolin tai tetrahydrofuraanin binääristä 10-90-prosenttista seosta vedessä. Fraktiot yhdistetään antibioottisen sisällön mu-35 kaan, konsentroidaan kuiviin, pH säädetään arvoon 4-8 ja 11 77691 uutetaan kuten edellä on esitetty suodatetun käymisliemen yhteydessä.

Erään toisen edullisen menetelmän mukaan suodatetun käy-misliemen pH säädetään arvoon noin 7,5 ja uutetaan veden 5 kanssa sekoittumattomalla alempialkyylialkanoyylies teril lä ja mieluimmin butyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros konsentroidaan ja pH säädetään arvoon noin 9,0. Tämä pH:n säätäminen tapahtuu mieluimmin lisäämällä natriumdietyy-limalonaattia. Sakka liuotetaan veteen, pH säädetään ar-10 voon noin 4 ja uutetaan taas valitulla, veden kanssa se koittumattomalla alempialkyylialkanoyylies terillä. Saos-taminen emäksellä, mieluimmin natriumdietyylimalonaati11a, pH:n säätäminen arvoon noin 9, toistetaan keksinnön mukaisen antibiootin puhdistetun valmisteen saamiseksi.

15 Muita pylväskromatografia-menetelmiä, kuten esimerkiksi adsorptiokromatografiaa tai jakaantumiskromatografiaa voidaan yhtä hyvin käyttää tähän puhdistamiseen.

Puhdistaminen suolanmuodostuksella suoritetaan yksinkertaisesti liuottamalla antibiootti sopivaan liuottimeen, 20 ja lisäämällä ekvimolaarinen määrä emästä. Muodostuva suola saostetaan lisäämällä ei-liuottavia ainetta ja otetaan sen jälkeen talteen suodattamalla. Antibiootti vapaan hapon muodossa voidaan valmistaa liuottamalla raaka antibiootti etyyliasetaattiin, jonka jälkeen orgaaninen 25 liuos uutetaan happamilla puskureilla, mieluimmin fosfaat tipuskurilla pH-arvon ollessa noin 4.

Tuotteen talteenottaminen tapahtuu sen jälkeen pääasiallisesti käyttäen yleisiä menetelmiä, esim. saostamalla se orgaanisesta kerroksesta tai konsentroimalla seos pieneen 30 tilavuuteen. Jos tuotteen tiitteri ei ole riittävän korkea, se voidaan puhdistaa edelleen pylväskromatografisesti käyttäen olennaisesti samaa menetelmää kuin edellä esitettiin ensimmäisen puhdistuksen yhteydessä.

12 7 76 91 Käytettäessä pylväskromatografiaa puhdistukseen, koko puhdistusmenetelmää voidaan seurata myös HPLC-tekniikalla.

Fraktiot, joilla on samanlaiset HPLC-profiilit, yhdistetään ja konsentroidaan kuiviin, jolloin saadaan olennai-5 sesti puhdas antibiootti SB 22484.

Näin saatu antibiootti SB 22484 voidaan muuttaa vastaavaksi, myrkyttömäksi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi. Sopivia suoloja ovat alkalimetalli- ja maa-alkalimetal-lisuolat, tavallisesti natrium-, kalium-, kalsium- ja mag-10 nesiumsuolat ja ammonium- ja substituoidut ammoniumsuolat.

Edullisia substituoituja ammoniumsuoloja ovat primääriset, sekundääriset tai tertiääriset (C^-C^Jalkyyliammonium- ja hydroksi(C1-Cl+)alkyyliammoniumsuolat ja tämän keksinnön mukaisen erään suoritusmuodon mukaisesti bentsatsetiini-, 15 prokaiini-, oksiamiinisuolat ja samanlaiset veteen liukenemattomat, myrkyttömät, farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden suolojen erään toisen edullisen ryhmän muodostavat emäslisäyksellä muodostu-20 vat suolat, käytettäessä emäksisiä aminohappoja, kuten esimerkiksi arginiinia tai lysiiniä, tai aminosokereitä, kuten esimerkiksi glukoosiamiinia ja vastaavia.

Alkalimetalli- ja maa-alkalimetallisuolat valmistetaan metallisuoloille tavallisesti käytettyjen, tavanomaisten 25 menetelmien mukaan. Esimerkiksi antibiootti SB 22484 liuotetaan minimimäärään sopivaa liuotinta, tavallisesti alem-pialkanoliin, saatuun liuokseen lisätään vähitellen stö-kiömetrinen määrä sopivaa, valittua emästä ja saatu suola saostetaan lisäämällä ei-liuottavaa ainetta. Muodostuva 30 alkalimetalli- tai maa-alkalimetallisuola otetaan sen jäl keen talteen suodattamalla tai haihduttamalla liuottimet.

Vaihtoehtoisesti nämä suolat voidaan.valmistaa pääosin vedettömässä muodossa lyofilisoimalla; tässä tapauksessa 11 13 77691 vesipitoiset liuokset, jotka sisältävät toivotut suolat, jotka saadaan muodostamalla antibiootin SB 22484 suola sopivasti valitulla alkalimetalli- tai maa-alkalimetalli-karbonaatilla tai -hydroksidilla sellaisessa määrässä, jos-5 sa pH on välillä 7,0 - 8,5, suodatetaan liukenemattomien aineiden poistamiseksi ja lyofilisoidaan.

Orgaaniset ammoniumsuolat voidaan valmistaa pääosin edellä esitetyn menetelmän mukaisesti lisäämällä sopivasti valittua amiinia antibiootin S3 22484 liuokseen sopivas-10 sa liuottimessa, jonka jälkeen liuotin ja ylimääräinen amiinireagenssi haihdutetaan pois tai konsentroitu liuos lyofilisoidaan.

ANTIBIOOTIN SB 22484 FYSIKO-KEMIALLISET TUNNUSMERKIT

Antibiootilla SB 22484 on seuraavat tunnusmerkit: 15 A) Ultraviolettiabsorptiospektri, esitetty liitteenä ole vassa kuviossa 1, jossa esiintyy seuraavat absorptiomak-simit: ^maks (nm) ^lcm a) 0,1 N kloorivetyhapossa 20 230 663 283 192 332 343 b) fosfaattipuskurissa pH 7 ,38 230 719 25 323 391 c) 0,1 N natriumhydroksidissa 323 387 d) metanolissa 229 715 30 320 365 B) Infrapuna-absorptiospektri on esitetty liitteenä olevassa kuviossa 2 ja siinä esiintyy seuraavat absorptio- 14 77691 maks imi t (cm”^): 3700-3080, 2980-2840 (nujoli); 1645; 1560; 1455 (nujoli); 1375 (nujoli); 1305; 1240; 1215; 1145; 1090; 1060; 1035; 990; 945; 910; 890; 850; 810; 720 (nujoli) 5 C) NMR-spektri on esitetty kuviossa 3 ja siinä esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) 270 MHz ^H-NMR:ssä, joka on rekisteröity heksadeuteroasetonissa, käyttäen sisäisenä standardina TMSrää (0,00 ppm) (& = ppm): 0,77 & (3H) ; 0,83S(3H); 1,21-1,24 5(3H); 1,2-2,7 δ (5H); 10 1,67 & (s, 3H); 1,73δ(3Η); 2,01<$(s, 3!!); 3,20&(s, 3H); 3,3-5,6 δ (UH); 5,4-6,7 <5 ( 13H) ; 6,04<$(1H); 7,40<$(1H); 7,68 δ (1H) ; 10,53 δ (1H) (s = singletti) D) Massaspektrissä, joka saatiin suoraan nesteen sisäan- 15 ottavalla nestekromatografia-massaspektrometrilla (LC-MS), käyttäen HP 5985 B-laitetta, työskennellen negatiivisessa ionimuodossa ja käyttäen nestekromatografiaa (LC) seuraa-vissa olosuhteissa: kolonni: Brownlee Lab. RP 8 10 Jim, 2 5 cm 20 virtausnopeus: 1 ml/min eluentti: asetonitriili:0,1 M ammoniumformaatti, 60:40 esiintyy neljä pääpiikkiä, joilla on vastaavasti reten-tioajat 4,48, 5,03, 5,65 ja 7,25 min ja jotka on mieli-25 valtaisesti vastaavasti nimetty antibiootti SB 22484 te kijät 1, 2, 3 ja 4; E) Seuraavat pääpilkkoutumispiikit saadaan edellä esitetyille antibioottisille tekijöille, toisin sanoen antibiootti SB 22484 tekijöille 1, 2, 3 ja 4: 30 TEKIJÄ 1: 752, 734, 716, 684, 538, 598, 566, 500 TEKIJÄ 2: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580 TEKIJÄ 3: 752, 734, 716, 684, 638, 598, 566, 500 TEKIJÄ 4: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580, 500 15 77691 F) Seuraavat R^-arvot erilaisissa kromatografiasystee-meissä, käytettäessä silanoituja piihappogeeli 60 ^54 Merck-levyjä:

Eluointisysteemi (til./til./til.) R^-arvo 5 1) NaHjPO /metanoli 4/6 0,44 0,50 0,55 2) NaH^O^/metanoli/asetonitriili 4/5/1 0,52 10 0,57 0,63 3) 0,05M tetrabutyyliammoniumfosfaatti (pH 7,0):metanoli 4/6 0,46 0,50 15 0,55 Näkyväksi tekeminen: UV-valo aallonpituudella 254 nm

Antibiootti SB 22484 on antibakteerinen aine, joka on erityisen aktiivinen sellaisia bakteerikantoja vastaan, jotka aiheuttavat yleensä vaikeasti parannettavissa olevia 20 infektiosairauksia, kuten esimerkiksi tippuria (gonorrhea) ja aivo-selkäydinkalvon tulehdusta (meningitis). Kuten edellä jo esitettiin keksinnön mukainen antibiootti on aktiivinen Neisseriae-kantoja vastaan, melko aktiivinen Streptococci’a, Ureaplasma'a, Mycoplasma'a ja Hemophy-25 lus'ta vastaan, kun taas se on melkein inaktiivinen Sta- phylococci'a ja yleisiä, gram-negatiivisia bakteereita, kuten esimerkiksi Proteus'ta, Escherichia'a ja Pseudomonas 'ta vastaan.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden antibakteerinen aktivi-30 teetti voidaan todeta in vitro standardilaimennustes- 16 77691 teillä.

Iso-Sensitest käymislientä (Oxoid) ja Todd-Hewitt käymis- lientä (Difco) käytetään vastaavasti stafylokokeille ja streptokokeille, Neisseriae-kannat viljellään GC-agar- 5 alustalla (Difco) + 1 % Iso-Vitalex (BBL) ja Hemophylus viljellään GC-agaralustalla (Difco) + 1 % Iso-Vitalex (BBL) + 1 % hemoglobiini (Difco). Käymisliemet laimenne- 14 5 taan siten, että lopullinen ymppi on noin 10 - 10 pe säkettä muodostavaa yksikköä / ml (CFU/ml). Pienin es-10 tävä konsentraatio (MIC = minimal inhibitory concentra tion) on alhaisin antibioottikonsentraatio, jossa ei havaita näkyvää kasvua 18-24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa. Neisseriae-kantoja inkuboidaan hiilidioksidilla rikastetussa ilmakehässä.

15 Antibiootin SB 22484 in vitro aktiivisuuskirjo on esitetty seuraavassa taulukossa: I? 776 91

TAULUKKO XV

ANTIBIOOTIN SB 22484 ANTI3AKTEERINEN AKTIIVISUUS IN VITRO

Kanta MIC (jig/ml) 5 S, pyogenes C 203 SKF 13400 8 S, dysgalactiae ATCC 9926 8 S. pneumoniae UC 41 L 44 4 H. influenzae type b ATCC 9795 32 H, influenzae type d ATCC 9332 32 10 H« Influenzae L 990 32 M, gallisepticum 9/6 Weybridge L 431 4 N. caviae ATCC 14659 0,5 N. gonorrhoeae NCTC 8254 0,5 N, gonorrhoeae L 997^ 2 15 N. gonorrhoeae L 1596v 2 N, gonorrhoeae * L 15991 N. meningitis A ATCC 13077 4 N, meningitis B ATCC 13090 1 N. meningitis C ATCC 13102 2 20 N. meningitis D ATCC 13113 1 N. meningitis ATCC 13804 1 L-numerot viittaavat hakijan sisäisiin kokoelmanumeroihin.

(*) Kliinisesti eristettyjä kantoja, jotka on identifioitu sisäisillä kokoelmanumeroilla.

25 (**) Kliinisesti eristetty kanta, joka on resistentti spektinomysiinille (MIC >128 näissä olosuhteissa).

(**#) Kliinisesti eristetty /3-penisillinaasia tuottava kanta (resistentti penisilliinille, MIC>50 näissä olosuhteissa).

ie 77691

Aktiivisuus Ureaplasma urealyticum'illa testattiin sen jälkeen, kun mikro-organismia oli kasvatettu seuraavan koostumuksen omaavalla väliaineella: PPLO-käymislientä ilman kristalliviolettia 5 (Difco) 80 ml 1 N kloorivetyhappoa (HC1) 0,9 ml

Hevosen seerumia (Sclavo) 10 ml 5 % ureaa (C. Erba RP) 1 ml 0,2 % fenolipunaa 1 ml 10 pH säädetään arvoon noin 6.

Pienin estävä konsentraatio (MIC) määritettiin putkissa kaksinkertaisella sarjalaimennusmenetelmällä (konsentraa-tioiden rajat 0,008 - 128 ^lg/ml).

1 ml:n tilavuudet per putki ympättiin käyttäen 20-24 tun- 2 3 15 nm liemiviljelmästä 10 - 10 väriä vaihtavaa yksikköä (colour changing units, ecu). Putkia inkuboitiin 37°C:ssa. MIC-arvoksi otettiin antibiootin alhaisin konsentraatio, joka esti värin muuttumisen, arviointi suoritettiin silloin, kun kontrolliviljelmä muutti väriä, vastaten pH-20 arvoa 7,8 (määritetty vertaamalla väliaineen väriä saman väliaineen, eri pH-arvoihin säädettyinä oleviin väreihin).

Tämä muutos tapahtui noin 24 tunnin inkuboinnin jälkeen - 2 3 käytettäessä ymppiä, joka oli noin 10 - 10 ccu/ml.

Ymppikoko arvioitiin seuraavalla tavalla: sarja ymppinä 25 käytetyn käymisliemen 10-kertaisia laimennoksia lisättiin käymisliemeen; ccu/ml laskettiin alhaisimman, väriä muuttavan laimennoksen perusteella.

Tämän testin tulokset kliinisesti eristetyllä kannalla on esitetty seuraavassa: MIC (^ig/ml) 30 U. urealyticum L 1479 8

Bakterisidisissä "in vitro" kokeissa antibiootti SB 22484 tappaa 99,9 % N.gonorrhea L 997 soluista, kasvun logaritmisessa vaiheessa GC-agaralustalla (Difco) + 1 % Iso- B.

19 77691 -Vitalex (BBL), 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa konsentraatiossa, joka vastaa 5 kertaa MIC-arvoa (Ιο ^ig/ml). In vivo testien alustavat tulokset osoittavat, että antibiootti SB 22484, annettaessa s.c. 200 mg/kg S hiirille, jotka on kokeellisesti infektoitu S.pyogenes* ilia menetelmän mukaan, jonka ovat esittäneet V. Arioli et ai., julkaisussa J. Antibiotics 2J3, 511 (1976), suojaa 3 eläintä viidestä. Lisäksi tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä on erittäin alhainen myrkyllisyys, 10 koska niiden LD^g-arvo intraperitoneaalisesti annostet tuna hiirille, on korkeampi kuin 1000 mg/kg (korkein testattu annos).

Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden antimikrobisen aktiivisuuden perusteella niitä voidaan käyttää tehokkaasti 15 ihmisille ja eläimille tarkoitettujen antimikrobisten val misteiden aktiivisina aineosina, joko estettäessä tai hoidettaessa infektiosairauksia, jotka ovat näille yhdisteille herkkien patogeenisten bakteereiden aikaansaamia.

Antibiootin SB 22484 sekä vastaavien suolojen antimikro-20 bisten aktiivisuuksien perusteella niitä voidaan käyttää farmaseuttisissa tai eläinlääketieteellisissä valmisteissa. Erityisesti antibioottia SB 22484 ja vastaavia, myrkyttömiä, farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan käyttää seoksissa missä tahansa suhteessa.

25 Kuten edellä on esitetty antibiootti SB on ainakin neljän pääkomponentin kompleksi (SB 22484, tekijät 1, 2, 3 ja 4). Alan ammattimiehelle on selvää, että näiden tekijöiden prosenttiosuudet kompleksissa voivat vaihdella jopa seoksesta seokseen riippuen eri tekijöistä, kuten esimerkik-30 si viljelyväliaineesta ja käymisolosuhteista ja työjärjestys vaihteluista eristys- ja puhdistusmenetelmässä.

Tämä keksintö käsittää sen tähden kaikki antibiootin SB 22484 tekijöiden 1, 2, 3 ja 4 seokset kaikissa suhteissa. Näitä seoksia yleensä tarkoitetaan käytettäessä mainintaa 35 ’’antibiootti SB 22484”.

20 77691

Antimikrobisen aktiivisuutensa perusteella antibiootille SB 22*+ 84 voi löytyä käyttöä antimikrobisena aineena, joka primäärisesti valitaan hoidettaessa tippuria. Tippuria hoidetaan nykyään useilla erilaisilla antibiooteilla, etu-5 päässä penisilliinillä ja spektinomysiinillä ja vaihtoeh toisesti tetrasykliinillä tai ampisilliinilla. Kuitenkin tippuritapausten lukumäärä on kohonnut tasaisesti viimeisten 15-20 vuoden kuluessa, näiden antibioottien laaja käyttö hoidettaessa tippuria on johtanut lääkeresistenssin li-10 sääntyvään frekvenssiin. Tämän vuoksi uusien antibaktee- risten yhdisteiden, jotka ovat huomattavan aktiivisia tippuria aiheuttavaa mikro-organismia vastaan, mukaan lukien myös eräät nykyisessä hoidossa lääkeille resistentit kannat, kehittäminen merkitsee edistystä tämän sairauden hoi-15 dossa.

Yleensä antibakteerisessa hoidossa antibioottia SB 22484 sekä sen myrkyttömiä farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan annostaa eri tavoin, kuten esimerkiksi topi-kaalisesti tai parenteraalisesti. Kuitenkin parenteraali-20 nen annostaminen on edullisin annostustapa.

Injektoitavat koostumukset voivat olla sellaisissa muodoissa, kuten suspensiot, liuokset tai emulsiot, öljymäi-sessä tai vesipitoisessa kantaja-aineessa ja voivat sisältää apuaineita, kuten esimerkiksi suspendoivia, stabiloi-25 via ja/tai hajoittavia aineita. Vaihtoehtoisesti aktiivi nen aineosa voi olla jauhemaisessa muodossa jolloin lääkettä annostettaessa siitä valmistetaan injektoitava liuos, lisäämällä sopiva kantaja-aine, kuten esimerkiksi steriili vesi.

30 Riippuen annostamistavasta, nämä yhdisteet voidaan valmis taa erilaisiin annosmuotoihin.

Eräissä tapauksissa voisi olla mahdollista valmistaa oraalista annostamista varten keksinnön mukaiset yhdisteet mahanestettä kestävillä päällysteillä oleviin annosmuotoihin,

II

“ 77691 joka voidaan tehdä tunnetulla tavalla (kts. esimerkiksi "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. painos, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, sivu 1614). Tämä voisi tulla kysymykseen erityisesti silloin, kun toi-5 votaan antimikrobisen aineen olevan erityisen aktiivinen tai sen toivotaan adsorboituvan suolistossa, ja ohittavan muuttumattomana maha-alueen.

Aktiiviaineen määrän annostaminen riippuu useista tekijöistä, kuten esimerkiksi hoidettavan koosta ja tilasta, 10 annostamistavasta ja -tiheydestä ja aiheuttaneesta mikro-organismista.

Tämän keksinnön mukainen antibiootti, toisin sanoen antibiootti SB 22484 ja sen fysiologisesti hyväksyttävät suolat, ovat yleensä tehokkaita päivittäisen annoksen olles-15 sa noin 5 - noin 100 mg aktiiviainetta potilaan kehon painokiloa kohti, mahdollisesti jaettuna 2-4 annokseen päivässä. Erityisen edullisia koostumuksia ovat sellaiset, jotka valmistetaan annosyksikköihin, jotka sisältävät noin 100 - noin 5 000 mg yksikköä kohti.

20 Kuitenkin käytettäessä antibioottia tippurin hoitoon, jossa käytännön ongelmien takia yksi (single) annoshoito on erityisen edullinen, tulisi käyttää antibiootin SB 22484 korkeampia minimiannoksia, tavallisesti 10 - 100 mg/kg, jotta lääkeaineen tehokas pitoisuus pystytään säilyttämään 25 veressä pidennetyn ajan. Lisäksi hoidettaessa tippuria on edullista käyttää jatkuvavaikutteista parenteraalista an-nosmuotoa. Jatkuvavaikutteiset valmisteet voidaan valmistaa erilaisten mekanismien ja menetelmien mukaan, tunnetulla tavalla. Edullinen menetelmä jatkuvavaikutteisen, 30 antibioottia SB 22484 sisältävän valmisteen valmistamiseksi, käsittää tämän antibiootin veteen liukenemattoman suo-lan, kuten esimerkiksi bentsatsetiinin, prokaiinin, oksi-amiinin ja vastaavien suolojen käytön, suspendoimalla ne vesipitoiseen tai öljymäiseen väliaineeseen. Nämä suolat, 35 lihaksensisäisellä injektiolla, vapautuvat hyvin hitaasti 22 77691 niiden alhaisen vesiliukoisuuden takia, täten aikaansaaden antibiootin jatkuvan pitoisuuden veressä.

FARMASEUTTISTEN KOOSTUMUSTEN VALMISTUS:

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmiste-5 taan suspendoimalla 2000 mg antibiootin SB 22484 prokaii-nisuolaa 3 ml:aan puhdistettua maapähkinäöljyä, joka on geelitetty 2-prosenttisella aluminiumstearaati11a.

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmistetaan liuottamalla 250 mg antibioottia SB 22484 5 ml:aan 10 liuotinta, jonka koostumus on seuraava: propyleeniglyko- lia 40 %, etanolia 10 %, 0,05 % trihydroksimetyyliamii-nia (paino/til.) 50 %.

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmistetaan siten, että 5 ml steriiliä suspensiota USP sisältää 15 8 % propyleeniglykolia ja 3500 mg antibioottia SB 22484.

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmistetaan suspendoimalla 2000 mg antibiootin SB 22484 natrium-suolaa 5 ml:aan steriiliä vettä ennen injektiota.

*

II

23 7 7 6 91

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä edelleen, ne eivät kuitenkaan rajoita keksinnön piiriä.

ESIMERKKI 1 - ANTIBIOOTIN VALMISTUS

Lyofilisoitu putki, joka sisältää Streptomyces sp. NRRL 5 15496 viljelmän avataan ja siirretään aseptisesti kaura- jauhoagar-vinopinnalle. Inkuboidaan 10 päivää noin 28°C: ssa, jonka jälkeen vinopintaviljelmä suspendoidaan tislattuun veteen ja ympätään kapeakaulaiseen 500 ml:n Er-lenmeyer-pulloon, joka sisältää 100 ml väliainetta, jon-10 ka koostumus on seuraava:

Lihauutetta 5 g

Peptonia 5 g

Entsymaattista kaseiini-hydrolysaattia 3 g 15 Hiivauutetta 5 g

Natriumkloridia (NaCl) 1,5 g

Dekstroosia 20 g

Tislattua vettä 1000 ml Tätä pulloa inkuboidaan 28°C:ssa, 220 kierr./min. noin 20 48 tuntia.

Muodostunutta viljelmää käytetään ympättäessä 10 litran käymisastia, joka sisältää 6 litraa käymisväliainetta, jonka koostumus on seuraava:

Lihauutetta 4 g 25 Peptonia 4 g

Natriumkloridia (NaCl) 2,5 g

Hiivauutetta 1 g

Soijapapujauhoa 10 g

Dekstroosia 25 g 30 Kalsiumkarbonaattia (CaCO^) 5 g

Vesijohtovettä 1000 ml „„ 77691 24 Tätä käymisastiaa inkuboidaan 28°C:ssa, 900 kierr./min., ilmastuksen ollessa 1 til./til./min.

Maksimiantibioottiaktiivisuus saavutetaan noin 40 tunnin käymisen jälkeen.

5 Antibioottipitoisuus määritetään "paperikiekko-agarkoe- menetelmällä", käyttäen testiorganismina Neisseria caviae ATCC 14659 ja Streptococcus dysgalactiae ATCC 9926.

ESIMERKKI 2 - ANTIBIOOTIN MASSATUOTANTO

Lyofilisoitu putki, joka sisältää Streptomyces sp. NRRL 10 15496 viljelmän avataan ja siirretään aseptisesti kaura- jauhoagar-vinopinnalle. Inkuboidaan 10 päivää 28°C:ssa, jonka jälkeen vinopintaviljelmä suspendoidaan tislattuun veteen ja ympätään kahteen 2000 miina kapeakaulaiseen Er-lenmeyer-pulloon, jotka sisältävät 500 ml väliainetta, 15 jonka koostumus on seuraava:

Lihauutetta 5 g

Peptonia 5 g

Entsymaattista kaseiinihydro-lysaattia 3 g 20 Hiivauutetta 5 g

Natriumkloridia (NaCl) 1,5 g

Dekstroosia 20 g

Tislattua vettä 1000 ml Näitä kahta pulloa inkuboidaan 28°C:ssa, 220 kierr./min., 25 noin 40 tuntia.

Näiden kahden pullon viljelmää käytetään ympättäessä 50 litran käymisastia, joka sisältää 30 litraa ymppäysväli-ainetta, jonka koostumus on seuraava:

Lihauutetta 4 g 30 Peptonia 4 g

Natriumkloridia (NaCl) 2,5 g

Hiivauutetta 1 g

II

25 77691

Soijapapujauhoa 10 g

Dekstroosia 25 g

Kalsiumkarbonaattia (CaCO^) 5 g

Vesijohtovettä 1000 ml 5 ja annetaan käydä 28°C:ssa, 500 kierr./min. ilmastusnopeu- den ollessa 1 til./til./min.

24 tunnin käymisen jälkeen 30 litralla ymppiviljelmää ympätään 300 litran käymisastia, joka sisältää 200 litraa väliainetta, jonka prosenttinen koostumus on sama kuin 10 ymppiviljelmän. Tätä käymisastiaa inkuboidaan 28°C:n lämpötilassa, 240 kierr./min. ilmastusnopeuden ollessa 1 til./til./min. Maksimiantibioottiaktiivisuus saavutetaan noin 40 tunnin käymisen jälkeen

Antibioottipitoisuus määritetään "paperikiekko-agarkoe-15 menetelmällä", käyttäen testiorganismina Neisseria caviae ATCC 14559, jota on kasvatettu yön yli aivo-sydän-agar-väliaineella 37°C:ssa. Käymisliemi antaa inhibiitiovyöhyk-keen, jonka läpimitta on 23 mm 10 cm:n paperikiekolla.

ESIMERKKI 3 - ANTIBIOOTIN 3B 22484 ERISTÄMINEN JA PUH-20 DISTAMINEN

Käymisliemi (60 litraa) suodatetaan käyttäen suodatusapu-ainetta Clarcel ® flow-ma ja suodoksen pH säädetään arvoon noin 7,0 ja uutetaan etyyliasetaatilla (noin 60 ml). Orgaaninen faasi erotetaan sentrifugoimalla ja konsentroi-25 daan pieneen tilavuuteen. Sen jälkeen öljymäiseen jäännökseen lisätään petrolieetteriä ja raaka antibioottisakka kerätään suodattamalla. Tämän aineen fraktio (4,5 g) liuotetaan metanoliin (50 ml), valutetaan kromatografiapylvääs-tä (1 m), joka sisältää 1,5 ml Sephadex L 20:tä metano-30 lissa, ja systeemi eluoidaan samalla liuottimena. Kerä tään noin 20 ml:n. fraktiot ja testaan paperikiekko-diffuu-siotestillä N.caviae ATCC 14659 vastaan ja TLC- ja HPLC-analyysillä. Antibioottia sisältävät fraktiot yhdistetään 26 77691 ja konsentroidaan kuiviin, öljymäinen jäännös liuotetaan minimimäärään tetrahydrofuraania, lisätään etyylieetteriä ja seosta ravistellaan sopivan ajan, kunnes muodostuu sakka, joka otetaan talteen ja kuivataan, saadaan noin 960 5 mg antibiootin SB 2248U puhdasta valmistetta, jolla on edellä kuvatut fysiko-kemialliset tunnusmerkit.

I)

Claims (6)

27 77691

1. NaH2P04/metanoli 4/6 0,44 0,50 0,55 5 2) NaH2P04/metanoli/asetonitriili 4/5/1 0,52 0,57 0,63 3) 0,05M tetrabutyyliammoniumfosfaatti 10 (pH 7,0)rmetanoli 4/6 0,46 0,50 0,55 näkyväksitekeminen: UV-valo aallonpituudella 254 nm, tunnettu siitä, että viljellään kantaa Strepto-15 myces sp. NRRL 15496 submerssisissa, aerobisissa olo- suhteissa assimiloituvien hiili-, typpi 1 ähteiden ja epä-;:· orgaanisten suolojen läsnäollessa, mainittu antibiootti otetaan talteen ja eristetään käymisl iemestä ja, tarvit-taessa, muutetaan toivotuksi suolaksi.

1. Menetelmä tuottaa antibioottia SB 22484 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa, jolla vapaan hapon muodossa on seuraavat tunnusmerkit:

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa tuottavan kannan viljeleminen suoritetaan lämpötilassa, joka on välillä 20°C ja 40°C.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa - antibiootin taiteenottaminen tapahtuu uuttamalla suodatet- 25 tu käymisliemi liuottimena, joka on veden kanssa sekoittu-maton alempia!kyy!ialkanoyyliesteri, alempi polyhalogenoi-tu hiilivety tai korkeampi alkanoli.

4. Patenttivaatimuksen t mukainen menetelmä, jossa antibiootin eristäminen tapahtuu steerisellä ekskluusio- pyiväskromatograflal 1 a , johdetulla, kontrolloidulla, huo koisella ristiinkytketyl1ä dekstraani11 a tai ei-funktiona- lisoidulla polystyreenillä. 30 7 7 6 91

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, jossa 5 kromatografiapylväs eluoidaan asetonin, metanolin, etanolin, n-propanolin, isopropanolin tai tetrahydrofuraani n binäärisellä 10% - 90%-seoksel1 a vedessä.

5 A) uitraviolettiabsorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: ^ maks (ηη,) Elcr» a) 0,1 N kloorivetyhapossa 230 663 10 283 192 332 343 b) fosfaattipuskurissa pH 7,38 230 719 323 391 15 c) 0,1 N natriumhydroksidissa 323 387 d) metanolissa 229 715 320 365

20 B) infrapuna-absorptiospektri, jossa esiintyy seuraavat absorptiomaksimit (cm-1): 3700-3080, 2980-2840 (nujoli); 1645; 1560; 1455 (nujoli); 1375 (nujoli); 1305; 1240; 1215; 1145; 1090; 1060; 1035; 990; 945; 910; 890; 850; 810; 720 (nujoli)

25 C) NMR-spektri, jossa seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) 270 MHz 1H-NMR:ssä, joka on rekisteröity heksadeuteroase-tonissa, käyttäen sisäisenä standardina TMS:ää (0,00 ppm) ( 8 = ppm): 0,77 &(3H); 0,83 &(3H); 1,21-1 ,24 &(3H); 1 ,2-2,7 8(5H) ; 30 1 ,67 & (s , 3H); 1,73$(3H); 2,01 8(s, 3H); 3,20 &(s, 3H); 3,3-5,6 8 (11H); 5 ,4-6,7 S (13H); 6,04 M 1H); 7,40&(1H); 28 „ _ 77691 7,68 S (1H)J 10,53 & OH) (s = singletti) D) massaspektrissä, joka saatiin suoraan nesteen sisään-ottavalla nestekromatografia-massaspektrometrilla (LC-MS), 5 käyttäen HP 5985 B-laitetta, työskennellen negatiivisessa ionimuodossa ja käyttäen nestekromatografiaa seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Brownlee Lab. RP 8 10 pm, 25 cm (oktyylisilaani-funktionalisoitu piilo happogeeli) virtausnopeus: 1 ml/min eluentti: ase töni triili: 0 ,1M ammoniumformiaatti (60:40) esiintyy neljä pääpiikkiä, joiden retentioajat ovat vas-15 taavasti 4,48, 5,03, 5 ,65 ja 7,25 minuuttia; niitä nimi tetään mielivaltaisesti antibiootti SB 22484 tekijät 1, 2, 3 ja 4; E) edellä identifioiduilla antibioottitekijöillä, nimittäin antibiootti SB 22484 tekijöillä 1, 2, 3 ja 4, on seu- 20 raavat pääpilkkoutumispiikit: tekijä 1: 752, 734, 716, 684, 538, 598, 566, 500 tekijä 2: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580 tekijä 3: 752, 734, 716, 684, 638, 598, 566, 500 tekijä 4: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580, 500

25 F) seuraavat R^-arvot erilaisissa kromatografiasysteemeis- sä, käytettäessä silanoituja piihappogeeli-60 F25u Merck-levyjä: II 77691 el uoi nti systeemi (ti 1./ti 1./ti 1.) R^.-arvo

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa antibiootin taiteenottaminen tapahtuu säätämällä käymis- 10 liemen pH arvoon noin 7,5* uuttamalla se veden kanssa se-koittumattomal1 a aiempialkyyliesteri 11ä , säätämällä pH arvoon noin 9,0, ottamalla muodostunut sakka talteen suodattamalla ja liuottamalla se veteen, säätämällä tämän suspension pH arvoon noin 4, uuttamalla veden kanssa se-15 koittumattomal1 a alempia!kyyliesterillä ja taas seostamalla, säätämällä pH arvoon noin 9. Il 31 77691