DK161150B - Antibiotikum sb 22484, fremgangsmaade til fremstilling deraf og mikroorganisme til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 161150 B

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antibiotikum der arbitrært har fået betegnelsen antibiotikum SB 22484, eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

2 Antibiotiket ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del angivne.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af dette antibiotikum ved dyrkning af Strep-tomyces sp. NRRL 15496. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen IQ er ejendommelig ved det i krav 2 angivne.

Endelig angår opfindelsen den nævnte hidtil ukendte mikroorganisme til udøvelse af fremgangsmåden.

Antibiotikum SB 22484 har en syrefunktion med evne til at danne salte. Farmaceutisk acceptable salte af antibio-12 tikum SB 22484 indbefatter alkalimetalsalte, jordalkalimetal-salte, ammoniumsalte og substituerede ammoniumsalte, og de udgør som nævnt en del af den foreliggende opfindelse.

For at lette redegørelsen vil betegnelsen "antibiotikum SB 22484", i sammenhænge hvor der er tale om den biologi-2ø ske aktivitet af forbindelsen ifølge opfindelsen, blive brugt om både antibiotikum 22484 og de farmaceutisk acceptable salte deraf.

Med betegnelsen "lavere alkylalkanoylestere" sigtes til C2_galkyl-C2_6alkanoylestere som fx ætylacetat, propylace-2^ tat, butylacetat, ætylpropionat, butylpropionat og butylamylat. Med betegnelsen "vandublandbare lavere alkylketoner" sigtes til C^_^øketoner som kun i svag grad er blandbare med vand såsom 2-pentanon, 2-hexanon, 3-hexanon, 2-heptanon, 3-metyl-2-butanon og 3-metyl-2-pentanon.

2Q Med betegnelsen "halogenerede lavere kulbrinter" sigtes til polyhalogenerede C^_^kulbrinter som fx metylenklorid, kloroform og diklorætan.

Med betegnelsen "højere alkanoler" sigtes til ligekæde-de eller forgrenede, lineære eller cykliske C^_^alkanoler 22 som kun i ringe grad er blandbare med vand som fx butanol, 2-metylpropanol, 2-metyl-2-propanol, pentanol-2-metylbutanol, 2-metyl-2-butanol og cyklohexanol.

DK 161150 B

2

Antibiotiket ifølge opfindelsen udmærker sig ved et temmelig specifikt antimikrobielt spektrum eftersom det er virksomt mod stammer af Neisseria, temmelig aktivt mod streptokokker, Ureaplasma, Mycoplasma og Hemophilus, mens 5 det er næsten inaktivt mod stafylokokker og de almindelige gramnegative bakterier såsom Proteus, Escherichia og Pseudomonas .

Mikroorganismen ifølge opfindelsen, Streptomyces sp. NRRL 15496 blev isoleret fra en jordprøve opsamlet i

Italien og deponeret den 6. juli 1983 hos den internationalt anerkendte kultursamling Agricultural Research Collection (NRRL) i Peoria, Illinois, USA, under Budapest-traktatens

forskrifter. Stammen har fået tildelt accessionsnummeret NRRL

15496.

15

De karakteristiske egenskaber af Streptomyces sp. NRRL 15496 fremgår af det følgende.

Makroskopisk og mikroskopisk undersøgelse

Kolonierne er karakteriseret ved et gult til et dybt 20 o kromgult vegetativt mycelium der dannes pa de fleste af de undersøgte medier, og et turkisgrønt luftmycelium. Sporoforerne befinder sig i spiraler, skruer og hager. Sporerne er cylindriske med afrundede ender og har en diameter på 1,2 x 2-3 μια.

25

Pa basis af sporoforernes form og luftmyceliets farve har man henført Streptomyces sp. NRRL 15496 til gruppen "Spira-Green Section" i den klassifikation der er foreslået af Pridham, Hesseltine og Benedict (T.G. Pridham, C.W. Hessel- tine og R.G. Benedict "A guide for the classification of 30

Streptomycetes according to selected groups", Appl. Microb.

Vol. 6, 1958).

Kulturkarakterer

Til undersøgelse af kulturkaraktererne blev Strepto-35 myces sp. NRRL 15496 dyrket pa forskellige standardmedier foreslået af Shirling og Gottlieb (1) og med tilføjelse af flere medier anbefalet af Waksman (2).

DK 161150 B

3

Farvebestemmelser blev overalt hvor nødvendigt foretaget ved den af Maerz og Paul (3) angivne metode.

Alle de i nedenstående tabel I anførte resultater er opnået efter to ugers inkubering ved 28°C.

5 pH-Værdien af de medier der brugtes til klassifikation var tilnærmelsesvis neutral (pH 6,6-7).

4

DKTfl150B

pa ^ b <-i. hj p o ^ cn a s a a a IQ H· '-K CD iD iQ Μ H (+ 3 fl> 0 p K d

P Ω Η Η *0 p ·< 01 H- CD <1 CL < t-j H

H O 3 ft Η Ω 43 < pi H H- l-i ^ rt

It »mo P Ο Η- O d Odd *< h- ifl 3 ^ H d m d 3 3 3 η- h dPIHOH0l3O O d *“ O P H i£3 CO I—1 · CD Μ H M iQ p iQ iQ ffi 43 ι οι h oi cn οι οι h pj -— (-4 pi ^ p) οι p a pj g pj h3 Η Η O d 01 ^iQ tjip iQ a> ** H 01 JV H 43 pi pi d P) Pi rt 0 a οι · p h d h η η η- ro 01 H ft hi H · d h(

d 01 d H on P · 3(D

0 43 HP '-'iQ to hj H · X H- U> 01 p rt p — p" Η σ> | 0 • ^ 01 oi rh T3 O f-ΐ Ml hi Hi 3 (Old H hhM Hi H ¢0 4 iQ 4 t| < p Μ < Μ M M (->0 \MH- Η Η· Η M \ < H- d >C Η- O 3 ppiQ p tQ p £, Cj p iQ p iQ pip F O iQ h-tPiP iP 3 r+ Η O PiP PjP \rtP piP PjP \ H 0 fVP p p

(+ Hi I—1 PM phi to M PM PM Ό Hi M ΙΟ Ο M rt P

P Μ H- ' H- *» p OH- * H- ' Η- Μ Η- \ T+ H- p

HpiP lP (+ <iP (P iP piQlPiQ r+ 01

Pi M Hi POhh Pi \ O H- (+

iDP<t<< p < H <J H < 0< P <5 Oi<< < M

ffl 01 ffi H ft MifBPftHffi '85 O 85 (+ P

MX X < X M ** 3 * 01 * ** Η X 43 \(Q 01 P01 P01 poi P 01 ^01 PiP Hi 01 3 (+

ω d (+ O (+ M (+ pi(+ htirt r+rt *<(+ m (+ K O

m Pi s ppp* tr p 03 3Pi3oi3 '3 H 3 h* 3 r+3 ' p. 3 P +< PPP P P <! P p P P PP Μ Ω 3 Pi O' pi pi OPiPPiiOPi ?f P 'Pi H- p 1-3 P +5 H-r+d+s dmp

Ρ,Η dip ip (+(+ ip MiP 0 +i ip (+ 3 CT

C d M M 4¾ Μ M 3*< *<*< 01 O

iPd p p OX prop iQ d Μ X 43 M

Η r+ r+ d rt \r+ d pi

SO iPO W MPPO H

d <+ O O £iiP O -^0 (+ dip 25 d < < Μ < σ> < I a ppp p p a

+5 +5 +5+5 F

II 11

M

Ui

1*3 Hi Hi Hi x 3 Hi 01 piip rtip F

H-0 +5 +5 +SH-0 H 43 P d dd d id

Oipi P p POlPi POdM +i M Hi σι «PP < < <(PP < H d r+ X & r+ +5 +5 85 85 85 +5+5 85 0 0 H- 3 OP +5 +5 +5 OP +5+5ΜΜ01Μ+<

d(+ P P P d (+ P Old iPd O

d dd dd dPHi+5+tiP

PPi Pi p. ppp P rt O (+ M

ppp pppp3d3n- 01 d 01 d Ηι+<! d ^ d 43 d 43 d 0003

OP OP (+ P P

+5 Μ +5M dMOlM

O 01 p 01 +5 Η- 43 H- HP HP itfdOd H-3 H 3 P p 01 ·· p

Hi Hi iQ 01 H 3

H 43 P

(+ rt Ο P p

d d d H

Η H d 01

I IPO

3

Hi Hi Hi Hi Hi Hi +h Hl430 HHH HHH Η Η H-43

PPP ppp p p id M

<<< <<< < <30 ffiffifB fBffiffi ffi ffiPOl

HHH HHH H HdP

PPP PPP P P (+ M

ddd ddd d d H-

Qj Pj Pj Pj Qj tQ

PPP PPP P P (+

DK 161150B

5 OJtOHiQ ?? 0) N N fD PJ g ® *< w<— wfu £ i ro ro ό 5. ^ 2-2·

MSgOOc+c+H· g J

z>whm σ 3 ro ro ro o o 3 % B.

(D · 3 * c ro H1 X 3 hhiQ JT „ g > rta g rtro tn tn i i-htn rt 3

* 3 . Γ. h· 3 rt (Q ro ro mvS

Kro ρίΒΡίΟΐιΟΜΗ^ n,a o η s C| to hvq ro h ro ro ro ro 3 η h ro · 3" sr ro χ q h ^ ® XN Jf (IIP· ^ίΓη£κ S 8l . cη K H ro O ro η η h

o 3 ro h h in ro S

iq in rtn· o ro ro ^ 3.3 tn ro >0 3; <£i ro <0 ro . h co ro ro i vo ro o 0 h so «τι o iq ro ro h c+ 3 ro - ro d •xj t-3 μ- cn oii Hi 3 Hitn cn Η μη OH hi 3 «>0 3 < roro'oo x) <h- μ o ηό λ* η· !< h· < h- h o o ro c ro ho ro ro 0 rooi roro hø mø ro 0 ro ø ^SS1 m h rt η h ro Di ro & h 3 ro n-ro nro øro \ 5 £ ro >|Mrt tn hih ron rotn σ η η η h ron ^ Hi H rr HOldH o HH· 'D) O D1 Η· Hl H HH· ' p) tT'S. 9.

o rt - η· 3 ro ø rt 3 ro ø hø ro 0 rt rort <t uiH-ro α s? rt o 0 _ η 0 . ^ 03 co cr < ro < ro < < < 0 < ® ™ ^ ro < <3 - O H- flj - ft 3 ft! S.9S.2.S*,,S‘rt·** " § & g u> ^ s^rox ί^<^Ηιίν x rt ^

> K 1 h cnHtnHtn 01 roro rom P* ω ω J

owvo rt ro rt h- r+ rt H rt Hirt ^ ^ ^ o ro σι - < ro hi < - o* h 2 _ 2 μ. rt o σι hi 3 iQ 3 3H3(t) 3 ® 3 3 3 ® *3 oro·- tn ro ro 3 ro ro rorort m * ro 0 ro iro nro 3 ro " Sft H& 000 < * 0 B0, % a uj. ^ η (D 0)Ο*“Π r1· m »w o ro ro° ro η m rt rt - η ιβ 3 1 ro iQ rtH 3h 3 σ ri· Hl rt K ok: k; rt tQK HH ^

Ql H· JT* QJ M V. 3 3 iQ 3 C 3 ^ P 03 ·* H3 O Η Λ* H 0 ø 3 W H{ 1—1 5" iH- ^ 5 m *< Dj ø < ro \ nro < ro rt <0 ro c; ro rt ho o rt 3 -if ^ 9 o O |NJ Hi rt < < o \ < M 2

Hl- o ro ro \o ro σι ro n H HH H (Q (+ N H {t O Ui I I - -J I ro o to n tn ro o T ro Hi Hi hi HiOtn li ϋ ί1 w HU) Η Η Η Η H (DO Η Η·*0 H „,2, - u>ro ro ro ro ro ho rotnro ro 95 >t»0 < <J <ί <JH-H <J(QH ·- ?J5 M - r+ « fli ft SSn H Hl|

• ro H H H H 3 ro H®0 H

i3h ro ro ro ro hi033 ro 22 η£ΤΗ·3333 33 3 52.

n, (p N Qi Qi Qi ø i3* 0 ro Dl Qj ø ϋ o roro ro ro ro <ro ro ro ron-

ro 5 rt η· ro 3 S

^ Lj. LJ. Qj *T3 3 3 ro η o m o ro

- H 3 η· Η H

|_l. (I) W

g ro o rt h ro O 3 Hl m 0 tn H- ro H CO i Hi ro ro rt 5 rt- 1 3 H (+ 5 i α « % 1

H- s; (+ I I

HH· o HH 3 X ·<

03(5 HiHlHiHiHlHlHlHl 'O O

Otntn Η Η Η Η Η Η Η H H'O

n s « g § s » s i s § 11 0·(ΰ Η Η Η Η Η Η Η H 3 1) 3-ororororororororo rtn V η· 33333333 H· roturo aoiøøøøøø *9.

ssrotnrorororororororo r+

HJ H

Γ+ η μ· 3 3 O 0

• H

ro

DK 161150B

6

Udnyttelse af kulstofkilder

Streptomyces sp. NRRL 15496's evne til at udnytte forskellige kulstofkilder undersøgtes ved den af Shirling og Gottlieb beskrevne metode og fremgår af nedenstående ta- .

5 bel II.

Tabel II

Udnyttelse af kulstofkilder.

Kulstofkilde Vækst 10 ---—--

Inositol

Fruktose +++

Rhamnose +++

Mannitol +++ 15 Xylose +++

Raffinose

Arabinose ++

Cellulose

Sakkarose - 20 Mannose +++

Laktose +++ '

Galaktose +++

Salicin +

Glukose ++ 25 +++ = kraftig udnyttelse ++ = moderat udnyttelse + = svag udnyttelse = ingen udnyttelse 30

Fysiologiske karakterer I tabel III er anført fysiologiske karakterer af Streptomyces sp. NRRL 15496.

35

DK 161150 B

7

Tabel III

Fysiologiske karakterer.

Test Resultat --——

Stivelseshydrolyse +++ I^S-dannelse +

Melanindannelse

Tyrosinhydrolyse +

Caseinhydrolyse +

Calciummalathydrolyse

Nitratreduktion +

Lakmusmælk ingen koagulering ingen peptonisering

Gelatinesmeltning +++ 15 negativ reaktion + svag positiv reaktion ++ positiv reaktion +++ stærk positiv reaktion 20

Til fremstilling af antibiotikum SB 22484 kan dyrkningsmediet være et hvilket som helst blandt et antal næringsmedier der sædvanligvis bruges i gæringsteknikken, men visse medier foretrækkes dog. Foretrukne kulstofkilder er således glukose, mannose, galaktose, sti-25 velse, majsmel og lignende. Foretrukne nitrogenkilder er ammoniak, nitrater, sojabønnemel, pepton, kødekstrakt, gærekstrakt, trypton, aminosyrer og lignende. Blandt de uorganiske salte der kan inkorporeres i dyrkningsmediet er de sædvanlige opløselige salte med evne til at levere natrium, kalium, jern, 30 zink, kobolt, magnium, kalcium, ammonium, klorid, karbonat, sulfat, fosfat, nitrat og lignende ioner.

35

DK 161150 B

8 Sædvanligvis for-dyrkes den antibiotikumproducerende •l stamme i en rystekolbe hvorpå den dannede kultur bruges til podning af krukkefermentorer til produktion af væsentlige mængder af det antibiotiske stof. Det medium der bruges til 5 forkulturen kan være det samme som det der bruges ved gæringer i større målestok, men der kan også bruges andre medier.

De SB 22484-producerende stammer kan dyrkes ved temperaturer mellem ca. 20°C og ca. 40°C og fortrinsvis ved temperaturer omkring 24-30°C.

10

Under gæringen kan antibiotikumproduktionen overvåges ved afprøvning af prøver af næringssuppen eller af ekstrakter af myceliekagen for antibiotisk aktivitet, fx ved hjælp af biobestemmelse eller ved TLC- eller HPLC-processer. Organismer der vides at være følsomme over for antibiotikum SB 22484 er nyttige til dette formål. Særlig nyttige prøveorganismer til formålet er Neisseria caviae ATCC 14659 og Streptococcus dysgalactiae ATCC 9926. Biobestemmelsen udføres hensigtsmæssigt ved agar-diffusionsmetoden på agarplader. Maximal produktion af antibiotisk aktivitet indtræder i almindelighed mel- 20 lem gæringens anden og femte dag.

Antibiotikum SB 22484 dannet under gæring af stammen Streptomyces sp. NRRL 15496 findes hovedsagelig i mediet.

Udvinding af antibiotiket udføres derfor fortrinsvis ved ekstraktion af det filtrerede medium. Ekstraktion 25 af det filtrerede medium udføres bedst med ætylacetat, men der kan også med fordel bruges andre lavere alkylalkanoyl-estere som er ublandbare med vand, fx metylacetat, ætylpropio-nat og butyIpropionat, samt lavere kulbrinter såsom polyhalo-generede kulbrinter såsom metylenklorid, diklorætan og kloro- o n form eller lavere alkylketoner såsom metylisopropylketon, metylisobutylketon, højere alkanoler såsom butanol, pentanol og cyklohexanol og lignende stoffer.

Råt antibiotikum SB 22484 udvindes derefter fra ekstraktionsopløsningsmidlet ved rutinemetoder som hensigtsmæs-sigt indebærer koncentrering af ekstraktionsopløsningsmidlet til et ringe rumfang og udfældning af det rå antibiotikum fra denne opløsning ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel.

DK161150B

9

Rensning af det rå antibiotikum kan derefter foretages ved hjælp af forskellige teknikker som fx søjlekro- matografering, saltdannelse eller ekstraktion med passende opløsningsmidler. Når der bruges søjlekromatografering til 5 rensningen udnyttes fortrinsvis den såkaldte steriske eksklusions-kromatografiske teknik til opnåelse af de optimale adskillelsesresultater. Navnlig har "Sephadex" ® LH-20 (fra Pharmacia Fine Chemicals, AB), et tværbundet dextran med kontrolleret porestørrelse, hvor de fleste hydroxylgrupper er 10 blevet alkyleret, vist sig at være en yderst nyttig stationær fase til opnåelse af ypperlig rensning. Det filtrerede medium kan dog også reguleres til pH 5-9 og føres gennem en ikke- funktionaliseret polystyrenharpiks såsom "Amberlite" ® XAD-2 (XAD-4, XAD-7, XAD-8) eller en "Diaion" HP 20 kromatografisk 15 kolonne fremstillet i deioniseret vand under anvendelse af en binær blanding af 10-90% acetone, metanol, ætanol, n-propa-nol, isopropanol eller tetrahydrofuran i vand som eluerings-middel. Fraktionerne forenes i henhold til indholdet af antibiotikum deri, koncentreres til tørhed, bringes til pH 4-8 20 og ekstraheres som beskrevet ovenfor for filtreringssuppens vedkommende.

Ved en anden foretrukken fremgangsmåde reguleres det filtrerede medium til pH ca. 7,5 og ekstraheres med en vand- ublandbar lavere alkylalkanoylester, fortrinsvis butylacetat.

25

Det organiske lag koncentreres og bringes til pH ca. 9,0.

Denne pH-regulering opnås fortrinsvis ved tilsætning af na-triumdiætylmalonat. Bundfaldet optages i vand, reguleres til pH ca. 4 og ekstraheres på ny med den valgte vandublandbare lavere alkylalkanoylester. Udfældning med en base, fortrins-vis natriumdiætylmalonat, ved regulering af pH til ca. 9 gentages til opnåelse af et renset præparat af anti-biotiket ifølge opfindelsen. Der kan også anvendes andre søjlekromatografiske teknikker såsom adsorptionskromatografi eller fordelingskromatografi til denne rensning.

Rensning ved saltdannelse udføres simpelthen ved at man opløser antibiotiket i et passende opløsningsmiddel og tilsætter en ækvimolær mængde af basen. Det salt 35

DK 161150 B

10 der dannes udfældes ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel og udvindes derefter ved filtrering. Antibio-tiket i form af fri syre kan fremstilles ved at man opløser det rå antibiotikum i ætylacetat og derefter ekstraherer den ^ organiske opløsning med sure puffere, fortrinsvis fosfatpuffer ved ca. pH 4,0.

Udvinding af produktet udføres derefter i det væsentlige under anvendelse af de sædvanlige fremgangsmåder som fx ved udfældning af produktet fra det organiske lag eller 10 ved koncentrering af blandingen til et ringe rumfang. Hvis titeren af produktet ikke er tilstrækkelig høj kan der ske yderligere rensning ved søjlekromatografering under udnyttelse af i det væsentlige samme procedure som beskrevet ovenfor for den første rensnings vedkommende.

15 Når der bruges søjlekromatografering til rensningen kan hele rensningsprocessen overvåges ved HPLC.

Fraktioner med nogenlunde ensartet HPLC-profil forenes og koncentreres til tørhed til frembringelse af i det væsentlige rent antibiotikum SB 22484.

20

Det på denne måde vundne antibiotikum SB 22484 kan omdannes til et tilsvarende ugiftigt farmaceutisk acceptabelt salt. Eksempler på egnede salte er bl.a. alkali- og jordalka-limetalsalte, typisk natrium-, kalium-, kalcium- og magniumsalte, samt ammoniumsalte og substituerede ammoniumsalte.

25

Repræsentative substituerede ammoniumsalte er bl.a. primære, sekundære og tertiære C^_^alkylammoniumsa-lte og hydroxy-C^_^ alkylammoniumsalte, og i henhold til en særlig udførelsesform for opfindelsen tillige benzathin-, prokain-, hydraba-min- og tilsvarende vanduopløselige, ugiftige, farmaceutisk acceptable salte.

En yderligere foretrukken klasse salte af forbindelserne ifølge opfindelsen repræsenteres af basiske additionssalte med basiske aminosyrer såsom arginin og lysin, eller aminosuk- kere som fx glukosamin.

Alkalimetal- og jordalkalimetalsaltene fremstilles ved de sædvanlige processer som man almindeligt bruger til fremstilling af metalsalte. Som eksempel kan antibiotikum 35

DK 161150 B

11 SB 22484 opløses i den mindst mulige mængde af et passende opløsningsmiddel, typisk en lavtkogende alkanol, hvorefter den støkiometriske mængde af en passende udvalgt base gradvis sættes til den dannede opløsning hvorpå det dannede salt ud-5 fældes ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel. Det herved dannede alkalimetal- eller jordalkalimetalsalt udvindes derefter ved filtrering eller afdampning af opløsningsmidlerne.

Man kan også fremstille sådanne salte i i det væsentlige vandfri form ved frysetørring; i dette tilfælde filtreres vandige opløsninger indeholdende det ønskede salt, opnået ved udsaltning af antibiotikum SB 22484 med et passende valgt alkalimetal- eller jordalkalimetalkarbonat eller -hydroxyd i en sådan mængde at der opnås en pH-værdi mellem 7,0 og 8,5, fra uopløselige stoffer og frysetørres.

15

De organiske ammoniumsalte kan fremstilles i det væsentlige på samme måde ved tilsætning af en passende valgt amin til en opløsning af antibiotikum SB 22484 i et passende opløsningsmiddel og påfølgende afdampning af opløsningsmidlet og overskud af amin-reagens eller ved frysetørring af den 20 koncentrerede opløsning.

Fysisk-kemiske egenskaber af antibiotikum SB 22484

Antibiotikum SB 22484 har følgende karakteristiske egenskaber; 25 A) Et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i tegnin gens figur 1, og som udviser følgende absorptionsmaxima: X (nm) 30 max lem a) i 0,1 N HC1 230 663 283 192 332 343 25 b) i fosfatpuffer pH 7,38 230 719 323 391 c) i 0,1 N natriumhydroxyd 323 387

DK 161150 B

12 (nm) E^% max lem d) i metanol 229 715 5 320 365 B) et infrarødt absorptionsspektrum som er vist i tegningens figur 2 og som udviser følgende absorptionsmaxima, udtrykt i cm”1: 3700-3080, 2980-2840 (nujol); 1645; 1560; 1455 10 (nujol); 1375 (nujol); 1305; 1240; 1215; 1145; 1090; 1060; 1035; 990; 945;- 910; 890; 850; 810; 720 (nujol), C) et NMR-spektrum som er vist i tegningens figur 3 og som udviser følgende grupper signaler (i ppm) i 270 MHz ^H-

^ NMR opnoteret i hexadeuteroacetone under anvendelse af TMS

som intern reference (0,00 ppm) (δ = ppm) (idet s betegner singlet): 0,77δ(3Η); 0,83δ(3Η); 1,21-1,24δ(3H); 1,2-2,7δ(5H); 1,67δ(s, 3H); 1,73δ(3Η); 2,016(s, 3H); 3,20S(s, 3Η); 3,3-5,66 (11Η); 5,4-6,7δ(13Η); 6,04δ(ΐΗ); 7,40δ(ΐΗ); 7,68δ(ΐΗ); 10,53δ 20 (1Η)' D) et massespektrum opnået ved direkte væskeindgangsvæske-kromatografi-massespektroskopi (LC-MS) under anvendelse af et PH 5985 B apparat, arbejdende på negativ ion-måde, idet LC gennemføres under følgende betingelser:

Kolonne; "Brownlee Lab" RP 8 10 pm, 25 cm

Strømningshastighed: 1 ml/min

Elueringsmiddel: acetonitril/0,1M ammoniumformiat 60:40, hvilket massespektrum udviser fire hovedtoppe med retentions-2q tider henholdsvis 4,48, 5,03, 5,65 og 7,25 minutter, svarende til fire stoffer arbitrært benævnt antibiotikum SB 22484 faktorer henholdsvis 1, 2, 3 og 4, E) følgende hoved-fragmenteringstoppe for de ovennævnte ^ antibiotiske faktorer, altså antibiotikum SB 22484 faktor 1, faktor 2, faktor 3 og faktor 4: faktor 1: 752, 734, 716, 684, 638, 598, 566, 500 faktor 2: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580

DK 161150 B

13 faktor 3: 752, 734, 716, 684, 638, 598, 566, 500 faktor 4: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580, 500, F) følgende Rf-værdier i forskellige kromatografiske sy- 5 1 stemer under anvendelse af silaniserede silikagel-plader (60 F254 fra "Merck"® ):

Elueringssystem, rumfangsdele Rf-værdi _ 1) NaH9P0./metanol 4:6 0,44 10 4 0,50 0,55 2) NaH9P0./metanol/acetonitril 4:5:1 0,52 0,57 0,63 3) 0,05M tetrabutylammoniumfosfat 0,46 15 (pH 7,0):metanol 4:6 0,50 _____ 0,55

Synliggørelse: ultraviolet lys ved 254 nm

Antibiotikum SB 22484 er et antibakterielt middel som 20 er specifikt virksomt mod bakteriestammer som er ansvarlige for infektionssygdomme der generelt er vanskelige at helbrede såsom gonorré og meningitis. Som allerede nævnt er antibiotiket ifølge opfindelsen faktisk virksomt mod stammer af Neisseria, ret aktivt mod streptokokker, Ureaplasma, 25 Mysoplasma og Hemophilus og er næsten inaktivt mod stafylokokker og de almindelige gramnegative bakterier såsom Proteus, Escherichia og Pseudomonas.

Den antibakterielle aktivitet af forbindelserne ifølge opfindelsen kan demonstreres in vitro ved hjælp af standard-30 fortyndingsprøver. Iso-Sensitest suppe ("Oxoid"® ) og Todd-

Hewitt suppe ("Difco" ® ) bruges til henholdsvis stafylokokker og streptokokker; stammer af Neisseria dyrkes på GC agar-grundlag ("Difco" ) + 1% "Iso-Vitalex" (BBL) og Hemophilus dyrkes på GC agar-grundlag ("Difco") + 1% "Iso-Vitalex" (BBL) + 1% 35 hæmoglobin ("Difco"). Suppekulturerne fortyndes således at 4 5 det sluttelige inoculum indeholder omkring 10 -10 kolonidannende enheder/ml (CFU/ml). Den mindste inhiberende koncentration (MIC) anses som den laveste koncentration af antibiotiket

DK 161150 B

14 som ikke -.giver nogen synlig vækst efter 18-24 timers inkuber ing ved 37°C. Stammer af Neisseria inkuberes i en CC^-beriget atmosfære.

Aktivitetsspektrene in vitro af antibiotikum SB 22484 er anført summarisk i nedenstående tabel IV:

Tabel IV

Antibakteriel aktivitet in vitro af antibiotikum SB 22484.

10

Stamme MIC, μg/ml S. pyogenes C 203 SKF 13400 8 S. dysgalactiae ATCC 9926 8 S. pneumoniae UC 41 L 44 4 15 H. influenzae type b aTCC 9795 32 H. influenzae type d ATCC 9332 32 H. influenzae L 990 ^ 32 M. gallisepticum 9/6 Weybridge L 431 4 N. caviae ATCC 14659 0,5 20 N. gonorrhoeae NCTC 8254 0,5 N. gonorrhoeae L 997^X^ 2 N. gonorrhoeae ^ L 1596 ^XX^ 2 N. gonorrhoeae ^ L 1599 ^xxx^ 1 N. meningitis A ATCC 13077 4 25 N. meningitis B ATCC 13090 1 N. meningitis C ATCC 13102 2 N. meningitis D ATCC 13113 1 N. meningitis ATCC 13804 1 2q L-tallene identificerer ansøgernes interne kollektionsnumre.

(x) Klinisk isolerede stammer som identificeres ved ansøgernes interne kollektionsnummer.

(xx) Klinisk isoleret stamme som er resistent mod spectino-mycin (MIC > 128 under disse betingelser) 2^ (xxx) Klinisk isoleret P-penicillinase-producerende stamme (resistent mod penicillin med en MIC > 50 under disse betingelser).

DK 161150 B

15

Aktiviteten mod Ureaplasma urealyticum bestemtes efter dyrkning af mikroorganismen på et medium med følgende sammensætning: 5 PPLO-suppe uden krystalviolet ("Difco") 80 ml 1 N HCl 0,9 ml

Hesteserum ("Sclavo" ®) 10 ml 5% urinstof (fra C. Erba RP) 1 ml 0,2% fenolrødt 1 ml 10 reguleret til pH ca. 6

Den mindste inhiberende koncentration (MIC) bestemtes i rør ved den dobbelte seriefortyndingsmetode (koncentrationsområde fra 0,008 til 128 μg/ml).

15 „ 2 3

Der brugtes rumfang pa 1 ml pr. rør, podet med 10 -10 farveændrende enheder (ccu) fra 20-24 timer gamle suppekulturer. Rørene inkuberedes ved 37°C.

MIC-slutpunkt blev taget som den laveste koncentration af antibiotiket som forhindrede en farveændring, bedømt på et tidspunkt da kontrolkulturen udviste en farveændring svarende til pH 7,8 (bestemt ved sammenligning af mediets farve med farven af samme medium reguleret til forskellige pH-vær-dier). Denne ændring indtrådte efter ca. 24 timers inkube-^ ring når der brugtes inocula på tilnærmelsesvis 10-10 ccu/ml.

Inoculets størrelse bedømtes på følgende måde: serielle tidobbelte fortyndinger af suppekulturerne anvendt som inoculum sattes til suppen; ccu/ml beregnedes på basis af den laveste fortynding som udviste farveændring.

Resultaterne af dette forsøg med en klinisk isoleret 30 stamme var: MIC, μg/ml

Ureaplasma urealyticum L 1479 8 I baktencide forsøg in vitro dræber antibiotikum SB 22484 99,9% af cellerne af Neisseria gonorrhoeae L 997, i den logaritmiske vækstfase på GC agargrundlag ("Difco") + 1% 35

DK 161150 B

16 "Iso-Vitalex" (BBL) efter inkubering i 24 timer ved 37°C med en koncentration svarende til fem gange MIC-værdien (10 μg/ml).

Foreløbige resultater af forsøg in vivo viser at antibiotikum SB 22484 når det indgives subkutant i en mængde på 5 200 mg/kg til mus der eksperimentelt er inficeret med Streptococcus pyogenes i henhold til V. Arioli et al., J. Antibiotics 29, 511, 1976, beskytter 3 ud af 5 dyr. Desuden udviser forbindelserne ifølge opfindelsen en meget lav toxicitet eftersom deres LDc« ved intraperitoneal indgift i mus er over 10 1000 mg/kg (den højeste afprøvede dosis).

I betragtning af deres antimikrobielle aktivitet kan forbindelserne ifølge opfindelsen effektivt anvendes som virksom bestanddel i antimikrobielle præparater som anvendes i human- og veterinærmedicinen enten til forebyggelse eller 1 5 terapeutisk behandling af infektionssygdomme fremkaldt af følsomme patogene bakterier.

I betragtning af den antimikrobielle aktivitet af antibiotikum SB 22484 såvel som af de tilsvarende salte kan de bruges i farmaceutiske eller veterinære medicinske præpara- 20 ter. Nærmere betegnet kan antibiotikum SB 22484 og de tilsvarende ugiftige farmaceutisk acceptable salte bruges i blandinger i et hvilket som helst mængdeforhold.

Som påvist foran er antibiotikum SB et kompleks af mindst fire hovedkomponenter (SB 22484 faktor 1, 2, 3 og 4).

25

Som det er åbenbart for de sagkyndige kan de indbyrdes mængdeforhold mellem disse faktorer variere endog fra portion til portion i afhængighed af forskellige parametere såsom dyrkningsmedier og gæringsbetingelser samt rutinevariationer i isolerings- og rensningsprocessen. Opfindelsen omfatter derfor 30 alle mulige blandinger af antibiotikum SB 22484 faktor 1, 2, 3 og 4 i hvilke som helst indbyrdes mængdeforhold. Disse blandinger omfattes generelt af betegnelsen "antibiotikum SB 22484".

I betragtning af dets antimikrobielle aktivitet kan 35 antibiotikum SB 22484 finde anvendelse som det antimikrobielle middel man vælger først til behandling af gonorré. Gonorré behandles for tiden med et antal forskellige antibiotika,

DK 161150 B

17 primært med penicillin og spectinomycin og alternativt med tetracyklin eller ampicillin. Forekomsten af gonorré er imidlertid steget konstant igennem de sidste 15-20 år og den vidt udbredte anvendelse af disse antibiotika til behandling af gonorré har resulteret i en stigende hyppighed af resistens mod lægemidlerne. Af denne grund betegner udviklingen af nye antibakterielle forbindelser som er bemærkelsesværdigt virksomme mod den mikroorganisme som er ansvarlig for gonorré, herunder også nogle stammer som er resistente mod de lægemidler der bruges i gængs terapi, et fremskridt for behandlingen af denne sygdom.

I almindelighed kan til antibiotikumbehandling antibiotikum SB 22484 såvel som de ugiftige farmaceutisk acceptable salte deraf indgives ad forskellige veje såsom topisk eller 15 parenteralt.Den parenterale indgift er imidlertid den foretrukne administrationsmåde.

Præparater til injektion kan have sådanne former som suspensioner, opløsninger eller emulsioner i olieagtige eller vandige bærevæsker, og de kan indeholde adjuvanser såsom sus- 20 penderingsmidler, stabiliseringsmidler og/eller dispergerings-midler.

Det virksomme stof kan også være i pulverform til re-konstitution på anvendelsestidspunktet når en passende bærevæske såsom sterilt vand til injektion sættes dertil.

25 I afhængighed af indgiftvejen kan disse forbindelser oparbejdes i forskellige dosisformer.

I nogle tilfælde er det muligt at oparbejde forbindelserne ifølge opfindelsen i den såkaldte enterisk overtrukne dosisform til oral indgift, og sådanne kan fremstilles på kendt 30 made (se fx Remington's Pharmaceutical Sciences, femtende udgave, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvahie, USA, side 1614).

Dette kan særlig være tilfældet når det ønskes at an-tibiotiket skal være særlig virksomt eller adsorberes i tarmkanalen og passerer uændret gennem maven.

Den mængde aktivt stof der skal indgives afhænger af forskellige faktorer såsom størrelsen og tilstanden af den

DK 161150 B

18 til behandling værende patient, indgiftvejen og indgifthyppigheden samt tilstandens årsag.

Det antibiotiske stof ifølge opfindelsen, altså antibiotikum 22484 og de fysiologisk acceptable salte deraf, er generelt effektive ved dagsdoser fra ca. 5 til ca. 100 mg virksom bestanddel pr. kg af patientens legemsvægt, eventuelt opdelt i 2-4 portioner om dagen.

Særlig hensigtsmæssige præparater er sådanne der fremstilles i dosisenheder indeholdende fra ca. 100 til ca. 5000 10 mg pr. enhed.

Når antibiotikum SB 22484 bruges til behandling af gonorré, hvor man på grund af praktiske problemer i høj grad foretrækker enkeltdosisterapi, bør der bruges højere minimumsdoser deraf, i almindelighed mellem 10 og 100 mg/kg, for at 15 opretholde en effektiv blodkoncentration af lægemiddel over et forlænget tidsrum.

Til behandling af gonorré anvendes der desuden fortrinsvis en parenteral dosisform med forlænget virkning. Præparater med forlænget virkning kan fremstilles i henhold til for- 20 skellige mekanismer og metoder som velkendt i farmacien. En foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af et præparat med forlænget virkning og indeholdende antibiotikum SB 22484 indebærer anvendelse af et vanduopløseligt salt af denne antibiotiske substans såsom et benzatinsalt, procainsalt, hydra-25 bammsalt eller lignende salt, suspenderet i et vandigt eller olieagtigt medium.

Disse salte afgives efter intramuskulær injektion faktisk meget langsomt på grund af den lave vandopløselighed og giver således forlænget varighed af blodkoncentrationer 30 af den antibiotiske substans.

Fremstilling af farmaceutiske præparater

En dosisenhedsform til intramuskulær injektion fremstilles med 2000 mg af procainsaltet af antibiotikum SB 22484 35 suspenderet i 3 ml raffineret jordnøddeolie geleret med 2% aluminiumstearat.

En enhedsdosisform til intramuskulær injektion kan fremstilles med 250 mg antibiotikum SB 22484 opløst i 5 ml

DK 161150 B

19 af et opløsningsmiddel med følgende sammensætning: propylen- glykol 40%, ætanol 10%, 0,5%strihydroxymetylamin (v/r), 50%.

En enhedsdosisform til intramuskulær injektion kan også fremstilles med 5 ml steril suspension USP indeholdende 5 8% propylenglykol og 3500 mg antibiotikum SB 22484.

Endvidere kan en dosisenhedsform til intramuskulær injektion fremstilles med 2000 mg antibiotikum SB 22484-natri-umsalt suspenderet i 5 ml sterilt vand til injektion.

Nogle eksempler tjener til nærmere belysning af anti- 10 biotikum SB 22484 og dets fremstilling.

Eksempel 1

Fremstilling af det antibiotiske stof 15 Et lyofiliseret rør indeholdende en kultur af Strepto- myces sp. NRRL 15496 åbnes og overføres aseptisk til en skråflade af havremelsagar. Efter 10 dages inkubering ved ca.

28°C suspenderes skråkulturen i destilleret vand og podes i en med afbøjningsorganer forsynet, 500 ml stor Erlenmeyer-20 kolbe indeholdende 100 ml af et medium med følgende sammensætning:

Oksekødekstrakt 5 g

Pepton 5 g 25 Enzymatisk caseinhydrolysat 3 g Gærekstrakt 5 g

NaCl 1,5 g

Glukose 20 g

Destilleret vand 1000 ml 30

Denne kolbe inkuberes ved 28°C med 220 opm i ca. 48 timer.

Hele kulturen bruges til podning af en 10 liter stor fermentor indeholdende 6 liter gæringsmedium med følgende sammensætning: 35

DK 161150B

i

20 I

i

Oksekødekstrakt 4 g i

Pepton 4 g \

NaCl 2,5 g Gærekstrakt 1 g 5

Sojabønnemel 10 g !

Glukose 25 g j

CaCO^ 5 g

Ledningsvand 1000 ml

Denne fermentor inkuberes ved 28°C med 900 opm og en luftning på 1 rumfang pr. rumfang medium pr. minut.

Maximal antibiotisk aktivitet opnås efter ca. 40 timers gæring.

Antibiotikumkoncentrationen bestemmes ved papirskive-15 agar-prøvemetoden under anvendelse af Neisseria caviae ATCC 14659 og Streptococcus dysgalactiae ATCC 9926 som testorganismer .

Eksempel 2 20 ----------

Massiv produktion af den antibiotiske substans

Et frysetørret rør indeholdende en kultur af Streptomy-ces Sp. NRRL 15496 åbnes og overføres aseptisk til en skråflade af havremelsagar. Efter 10 dages inkubering ved 28°C suspende-25 res skråkulturen i destilleret vand og podes i to med afbøjningsorganer forsynede, 2000 ml store Erlenmeyer-kolber indeholdende 500 ml medium med følgende sammensætning:

Oksekødekstrakt 5 g 30 Pepton 5 g

Enzymatisk caseinhydrolysat 3 g Gærekstrakt 5 g

NaCl 1,5 g

Glukose 20 g 35 Destilleret vand 1000 ml

Disse to kolber inkuberes ved 28°C og med 220 opm i ca. 40 timer.

DK 161150 B

21

Kulturen fra de to kolber bruges til podning af en 50 liter stor fermentor indeholdende 30 liter udsædsmedium med følgende sammensætning: 5 Oksekødekstrakt 4 g

Pepton 4 g

NaCl 2,5 g Gærekstrakt 1 g

Sojabønnemel 10 g

Glukose 25 g

CaCO^ 5 g

Postevand 1000 ml og der gæres ved 28°C og med 500 opm under en luftning på 15 i rumfang pr. rumfang medium pr. minut.

Efter 24 timers gæring podes de 30 liter udsædskultur i en 300 liter stor gæringsbeholder indeholdende 200 liter medium med samme procentuelle sammensætning som det foregående. I denne gæringsbeholder inkuberes der ved en tempera-20 tur på 28°C og med en omrøring på 240 opm og en luftning på 1 rumfang pr. rumfang medium pr. minut.

Maximal antibiotisk aktivitet opnås efter ca. 40 timers gæring.

Antibiotikumkoncentrationen bestemmes ved papirskive-25 agar-bestemmelsesmetoden under anvendelse af Neisseria caviae ATCC 14659, dyrket natten over i hjerne-hjerte-agarmedium ved 37°C, som testorganisme. Suppen giver en inhiberingszone med en diameter på 23 mm på en 10 cm papirskive.

30 Eksempel 3

Isolering og rensning af antibiotikum SB 22484 Gæringssuppen, 60 liter, filtreres i nærværelse af filterhjælpen "Clarcel“flow-ma" og filtratet reguleres til 35 pH ca. 7,0 og ekstraheres med ca. 60 ml ætylacetat. Den organiske fase fraskilles ved centrifugering og koncentreres til et lille rumfang. Derefter sættes der petroleumsæter til den olieagtige remanens og det rå antibiotiske bundfald opsamles

DK 161150 B

22 ved filtrering. En fraktion af dette materiale, 4,5 g, opløses i 50 ml metanol, overføres til en kromatografikolonne på 1 m og indeholdende 1,5 ml "Sephadex" ® L 20 i metanol hvorpå systemet elueres med samme opløsningsmiddel.

Der opsamles fraktioner på ca. 20 ml og de bestemmes ved papirskive-diffusionsbestemmelse mod Neisseria caviae ATCC 14659 og ved TLC- og HPLC-analyse.

De antibiotikumindeholdende fraktioner forenes og koncentreres til tørhed. Den olieagtige remanens opløses i den 10 mindst mulige mængde tetrahydrofuran, der tilsættes ætylæter og blandingen rystes i passende tid indtil der danner sig et bundfald som opsamles og tørres; der vindes herved ca.

960 mg rent præparat af antibiotikum SB 22484 med de foran beskrevne fysisk-kemiske egenskaber.

15 20 25 30 35

Claims (8)

1. NaH-PO./metanol 4:6 0,44 0,50 30 0,55

1. Antibiotikum SB 22484 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, kendetegnet ved at det i form af den 5 fri syre har følgende karakteristika: A) Et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima: λ (nm) E“ Ί Q iticisc xcm a) i 0,1 N HC1 230 663 283 192 332 343 15 b) i fosfatpuffer pH 7,38 230 719 323 391 c) i 0,1 N natriumhydroxyd 323 387 20 d) i metanol 229 715 320 365 B) et infrarødt absorptionsspektrum som udviser følgende 25 -1 absorptionsmaxima, udtrykt i cm : 3700-3080, 2980-2840 (nujol); 1645; 1560; 1455 (nujol); 1375 (nujol); 1305; 1240; 1215; 1145; 1090; 1060; 1035; 990; 945; 910; 890; 850; 810; 720 (nujol), ^ C) et NMR-spektrum som udviser følgende grupper signaler (i ppm) i 270 MHz ^H-NMR opnoteret i hexadeuteroacetone under anvendelse af TMS som intern reference (0,00 ppm) (6 = ppm) (idet s betegner singlet): 0,776(3H); 0,836(3H); 1,21-1,246(3H); 1,2-2,76(5H); 35 1,676(s, 3H); 1,736(3H); 2,016(s, 3H); 3,206(s, 3H); 3,3-5,66 (11H); 5,4-6,76(13H); 6,046(1H); 7,406(1h); 7,686(1h); 10,536 (IH), DK 161150 B D) et massespektrum opnået ved direkte væskeindgangsvæske-kromatografi-massespektroskopi (LC-MS) under anvendelse af et PH 5985 B apparat, arbejdende på negativ ion-måde, idet LC gennemføres under følgende betingelser: 5 Kolonne: "Brownlee Lab" RP 8 ΙΟμπι, 25 cm (en oktylsilan-funktionaliseret silikagel) Strømningshastighed: 1 ml/min Elueringsmiddel: acetonitril/O,1M ammoniumformiat 60:40, ^ hvilket massespektrum udviser fire hovedtoppe med retentionstider henholdsvis 4,48, 5,03, 5,65 og 7,25 minutter, svarende til fire stoffer arbitrært benævnt antibiotikum SB 22484 faktorer henholdsvis 1, 2, 3 og 4, Ib E) · følgende hoved-fragmenterxngstoppe for de ovennævnte antibiotiske faktorer, altså antibiotikum SB 22484 faktor 1, faktor 2, faktor 3 og faktor 4: faktor 1: 752, 734, 716, 684, 638, 598, 566, 500 faktor 2: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580 20 faktor 3: 752, 734, 716, 684, 638, 598, 566, 500 faktor 4: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580, 500, F) følgende R^-værdier i forskellige kromatografiske sy-stemer under anvendelse af silaniseréde silikagel-plader (60 ^ra "Merck"®): Elueringssystem, rumfangsdele Rf-værdi

2. Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum SB 22484 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved at man dyrker Strep-5 tomyces sp. NRRL 15496 eller en antibiotikum SB 22484-produ-cerende varietet eller mutant deraf med i det væsentlige samme egenskaber under submerse aerobe betingelser i nærværelse af assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganiske salte, udvinder og isolerer antibiotiket fra gæringssuppen 1Q og om ønsket omdanner det til et salt deraf.

2. NaH-PO./metanol/acetonitril 4:5:1 0,52 0,57 0,63 3) 0,05M tetrabutylammoniumfosfat 0,46 (pH 7,0):metanol 4:6 0,50 35 __ °'55_____ Synliggørelse: ultraviolet lys ved 254 nm DK 161150 B

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at dyrkningen af den producerende stamme udføres ved en temperatur mellem 20 og 40°C.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet .j ^ ved at udvindingen af antibiotiket udføres ved ekstraktion af den filtrerede gæringssuppe med et opløsnins-middel udvalgt blandt vandublandbare lavere alkylalkam> ylestere, lavere polyhalogenerede kulbrinter og højere alka-noler. 2Q

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2r, kendetegnet ved at isoleringen af antibiotiket opnås ved sterisk eksklusions-søjlekromatografering på derivatiseret tværbundet dextran med kontrolleret porestørrelse eller ikke-funktionaliseret polystyren.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved at kromatografikolonnen elueres med en binær blanding af 10-90% acetone, metanol, ætanol, n-propanol, isopropanol eller tetrahydrofuran i vand.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet 2Q ved at udvindingen af antibiotiket sker ved regulering af gæringssuppens pH-værdi til ca. 7,5, ekstraktion deraf med en vandublandbar lavere alkyl-alkanoylester, regulering af pH til ca. 9,0, udvinding ved filtrering og optagning af det dannede bundfald i vand, regulering af denne sus-2^ pension til pH ca. 4, ekstraktion deraf med en vandublandbar DK 161150 B lavere alkanoylester og på ny udfældning og regulering af pH til ca. 9.

8. Mikroorganisme til udøvelse af den i et hvilket som helst af kravene 2-7 angivne fremgangsmåde, kendete g-5 net ved at den udgøres af Streptomyces sp. NRRL 15496.