KR920001373B1

KR920001373B1 - 항생 물질 sb 22484의 제조 방법

Info

Publication number: KR920001373B1
Application number: KR1019840005335A
Authority: KR
Inventors: 셀바 엔리코; 타모니 기오르기오; 베레타 그라씨아; 아리오리 비토리오; 카사니 기오바니; 파렌티 프란세스코
Original assignee: 그루포 레페티트 에스.피.에이; 레나토 스가르비
Priority date: 1983-08-31
Filing date: 1984-08-30
Publication date: 1992-02-11
Also published as: EP0139158B1; ZA846451B; EP0139158A3; DE3476396D1; NO843446L; ES8602126A1; GB8323382D0; CA1228313A; HU193696B; DK411584A; JPH067797B2; GR80076B; NO159537C; PT79161B; IE842219L; NO159537B; FI843418A; FI843418A0; IL72688A; DK411584D0

Abstract

내용 없음.

Description

항생 물질 SB 22484의 제조 방법

제1도는 본 발명의 항생 물질의 자외선 흡수 스펙트럼임.

제2도는 본 발명의 항생 물질의 적외선 흡수 스펙트럼임.

제3도는 본 발명의 항생 물질의 NMR 스펙트럼임.

본 발명은 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496 또는 이것의 변이체 또는 돌연 변이체를 이용하여 항생 물질 SB 22484를 제조하는 방법에 관한 것이다.

항생 물질 SB 22484는 염을 형성할 수 있는 산기능을 갖고 있다. 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염, 암모늄염 및 치환 암모늄염을 비롯한 항생 물질 SB 22484의 약리학적으로 허용되는 염도 본 발명에 속한다. 본 발명의 생물학적 활성을 취급할 때, “항생 물질 SB 22484”란 항생 물질 SB 22484 및 약리학적으로 허용되는 그의 염에서 선택되는 항생 물질을 가르키는 것이다. “저급 알킬 알카노일 에스테르”란 말은 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트, 에틸 프로피오네이트, 부틸 프로피오네이트, 부틸 아밀레이트 등과 같은 (C₂-C₆)알킬 (C₂-C₆)알카노일 에스테르를 가르키는 것이다. “불용성 저급 알킬 케톤”이란 말은 2-펜타논, 2-헥사논, 3-헥사논, 2-헵타논, 3-메틸-2-부타논 및 3-메틸-2-펜타논과 같은 물에 거의 녹지 않는 (C₅-C₁₀)케톤을 뜻한다. “할로겐화된 저급 탄화수소”란 말은 염화메틸렌, 클로로포름, 디클로로에탄 등과 같은 폴리할로겐화된 (C₁-C₄)탄화수소류를 뜻한다. “고급 알칸올”이란 말은 부탄올, 2-메틸 프로판올, 2-메틸-2-프로판올, 펜탄올 2-메틸 부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 시클로헥산올 등과 같은 물에 거의 용해되지 않는 직쇄 또는 분지쇄의 선상 또는 환상의 (C₄-C₇)알칸올을 지칭하는 것이다. 본 발명의 항생 물질은 사실상 네이세리아에(Neisseriae)균주에 활성이 있고, 스트렙토코치(Streptococci), 우레아플라스마(Ureaplasma), 마이코플라스마(Mycoplasma) 및 헤모필루스(Hemophilus)에는 제법 활성이 있으나, 스타필로코치(Staphylococci) 및 프로테우스(Proteus), 에스케리키아(Escherichia) 및 슈도모나스(Pseudomonas)와 같은 통상의 그람 음성균에 대해서는 거의 불활성이므로, 오히려 특이적인 항균 범위가 있다는데 그 특징이 있다.

항생 물질 SB 22484는 이탈리아에서 수집된 토양 시료에서 분리된 균주를 발효시켜 얻는데, 이 균주는 부다페스트 조약의 규정에 의하여 국제적으로 인정되는 미합중국 일리노이스, 페오리아에 소재하는 기탁 기관인 NRRL(Agricultural Research Collection)에 1983년 7월 6일에 기탁되어 기탁 번호 NRRL 15496을 부여받았다. 대한민국에서는 1984년 8월 3일에 기탁 번호 KAIST 840803-12714호로 한국과학기술원에 기탁되어 있다(별첨 미생물 수탁 번호 통지서 참조).

스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496의 특성은 다음과 같다.

[육안 및 현미경 관찰]

집락의 특징은 대부분의 시험 배지상에서 생성된 황색 내지 진한 크롬 황색 영양 균사체 및 청록색의 호기성 균사라는 점이다. 포자체는 나선, 코일 및 고리 모양으로 정열되어 있다. 포자는 둥근 단부가 있는 원통형으로서 직경은 1.2×2-3nm이다.

포자체의 형태와 호기성 균사의 색상에 준하여, 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496은 프리드함(Pridham), 핫셀타인(Hesseltine) 및 베네딕트(Benedict)의 분류법에 따라서 “Group Spira-Green Section”에 속하게 되었다[T.G.Pridam, C.W.Hesseltine, 및 R.G.Benedict, “A guide to the classification of Streptomyces according to selected groups”, Appl.Microb.Vol.6, (1958)].

[배양 특성]

배양 특성을 시험하기 위해서, 셜링(Shirling)과 고틀리브(Gottlieb)에 의하여 제안된 여러 가지 표준 배지¹⁾내에서 왁크만(Wacksman)에 의하여 추천된 몇가지 배지²⁾첨가와 함께, 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496을 배양하였다. 색상 판단은 매르쯔(Maerz)와 폴(Paul)방법³⁾으로 필요할 때마다 행하였다. 다음 표 I에 나타낸 것은 모두 28℃에서 2주일간 배양한 후에 기록된 것이다. 분류용으로 사용된 배지의 pH는 거의 중성이었다(pH 6.6-7).

[표 I]

[탄소원의 이용능]

셜링(Shirling)과 고틀리브(Gottlieb)의 방법으로 검토된 서로 다른 탄소원을 이용하는 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496의 능력은 다음 표 Ⅱ에 보고되어 있다.

[표 Ⅱ]

[생리학정 특성]

다음 표 Ⅲ에는 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496의 생리학적 특성이 보고되어 있다.

[표 Ⅲ]

항생 물질 SB 22484를 생산하려면, 동화 가능한 탄소원, 동화 가능한 질소원 및 무기염이 함유된 수용성 영양 배지 내에서 호기성 조건하에 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496과 같이 상기 항생 물질을 생성할 수 있는 균쥬 또는 SB 22484를 생성하는 변이주나 돌연변이주를 배양한다. 상기 배지는 몇 가지 배지가 우선하지만, 발효 기술에서 통상 사용되는 어떠한 배지든지 사용할 수 있다. 따라서, 예컨대 탄소원으로서는 글루코스, 만노스, 갈락토스, 전분, 옥수수밀 및 동종의 것들이 좋다. 질소원으로서는 암모니아, 질산염, 대두분, 펩톤, 육즙, 효모 엑기스, 트립톤, 아미노산 및 동종의 것들이 좋다. 배지에 혼합시킬 수 있는 무기 염류로서는 나트륨, 칼륨, 철, 아연, 코발트, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 염화물, 탄산염, 황산염, 인산염, 질산염 및 동종의 이온종을 생성시킬 수 있는 통상의 용해성 염류가 있다.

통상, 항생 물질 생성주는 진탕 플라스크에서 예비 배양되고, 이어서 다량의 항생 물질 생산용 발효조를 접종시키는데 사용된다. 예비 배양에 사용된 배지는 대량 발효용과 동일하지만, 다른 배지도 사용될 수 있다. SB 22484생성주는 약 20℃와 40℃사이의 온도, 특히 약 24-30℃의 온도에서 증식될 수 있다. 발효 도중에, 항생 물질 생성량은 예컨대 생물학적 측정법(bioassays) 또는 TLC법이나 HPLC법 등으로 항생 물질 활성체에 대한 균사 케이크의 발효액 또는 추출액의 시료를 시험함으로써 검사될 수 있다. 항생 물질 SB 22484에 민감한 것으로 알려진 미생물이 이러한 목적에 유용하다. 특히, 네이쎄리아 카비아에(Neisseria caviae) ATCC 14659 및 스트렙토코쿠스 다이스갈랍티아에(Streptococcus dysgalactiae) ATCC 9926이 유용한 균주이다. 생물학적 측정법은 한천판상에서의 한천 희석법에 의하여 간편하게 수행된````다. 항생 물질 활성의 최대 생성은 일반적으로 발효 2일째 및 5일째 사이에서 일어난다. 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496균주의 발효 도중에 생산된 항생 물질 SB 22484는 주로 발효액에서 발견된다. 따라서, 이 항생 물질의 회수는 여과 처리된 발효액을 추출시킴으로써 바람직하게 수행된다. 여과 처리된 발효액의 추출 조작은 에틸 아세테이트를 사용할 때 가장 잘 수행되지만, 메칠 아세테이트, 에틸 프로피오네이트, 부틸 프로피오네이트와 같이 물과의 혼화성이 없는 저급 알킬 알카노일 에스테르 및 염화메틸렌, 디클로로에탄 및 클로로포름 등의 폴리할로겐화 탄화수소류, 메틸이소프로필케톤, 메틸 이소부틸케톤과 같은 저급 알킬 케톤류, 부탄올, 펜탄올 및 시클로헥산올과 같은 고급 알칸올, 및 동종의 것들이 적절히 사용될 수 있다. 항생 물질 SB 22484조(祖) 생성물은 추출 용매를 적은 부피로 농축시켜서 비용매의 첨가에 의하여 이 용액으로부터 그 항생 물질을 침전시키는 과정이 포함되는 통상의 절차에 따라 추출 용매로부터 회수된다. 항생 물질 조생성물의 정제는 칼럼 크로마토그래피법, 염형성법 또는 적당한 용매에 의한 추출법과 같은 기법으로 이루어질 수 있다.

정제에 칼럼 프로마토그래피가 사용될 때, 최적의 분리 결과를 얻으려면 이른바 입체 축출 크로마토그래피법(stericexclusion chromatopraphy)을 응용하는 것이 좋다. 특히, 대부분의 히드록실기가 알킬화되고 조절된 기공을 가진 가교 결합 데스트란인 Sephadex

LH-20, (Pharmacia Fine Chemicals, Ab)이 우수한 정제에 쓰일 극히 유용한 정지상인 것이 입증되었다. 별법에 의하면, 여과 처리된 발효액은 pH 5-9로 조정된 다음, 물 중에 아세톤, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 또는 테트라히드로푸란이 10-90% 녹아 있는 2성분 혼합물을 전개제로 사용하여 Amberlite X-AD-2(XAD-4,XAD-7,XAD-8) 또는 탈이온수중에서 제조된 Diaion HP20 크로마토그래피 칼럼과 같은 기능기가 없는 폴리스티렌 수지에 통과된다. 분획들은 항생 물질 함량에 따라 한데 모으고, 농축 건고하여 pH 4-8로 조정하고, 상술한 대로 여과 발효액용으로 추출된다.

다른 바람직한 방법에 의하면, 여과 처리된 발효액은 약 pH 7.5로 조정한 다음, 저급 알킬 알카노일 에스테르, 특히 부틸 아세테이트로 추출한다. 유기층은 농축하여, pH 9.0으로 조정된다. 이 pH 조정은 나트륨 디에틸말로네이트를 첨가하여 얻는 것이 좋다. 침전은 물에 취하여, pH 4로 조정하고 다시 수불용성 저급 알킬 알카노일 에스테르로 추출한다. pH 약 9로 조정함으로써 염기, 바람직하게는 나트륨 디에틸말로네이트를 사용하는 침전을 반복하여 본 발명 항생 물질의 정제된 제형을 얻는다. 흡착 크로마토그래피 또는 분배 크로마토그래피와 같은 다른 칼럼 크로마토그래피 기법 역시 이러한 정제에 양호하게 이용된다. 염형성법에 의한 정제는 적당한 용매에 항생 물질을 용해하고, 등몰량의 염기를 첨가함으로써 간단하게 수행된다. 형성되는 염은 비용매의 첨가로 침전시키고, 이어허 여과하여 회수한다. 유리산 형태의 항생 물질은 에틸 아세테이트에 항생 물질 조 생성물을 용해하고, 이어서 유기 용액을 산성 완충액, 바람직하게는 pH 4.0의 인산염 완충액으로 추출함으로써 제조될 수 있다. 이어서, 통상의 방법, 예컨대 그 혼합물을 유기층으로부터 침전시키거나 적은 부피로 될 때까지 농축시킴으로써 생성물이 회수된다. 생성물의 품위가 충분히 높지 않다면, 전술한 최초의 정제법과 사실상 동일한 방법을 적용하는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 더 정제할 수 있다.

칼럼 크로마토그리피를 정제용 목적으로 사용할 경우, 그 전체 정제 공정 역시 HPLC로 검사될 수 있다. 유사한 HPLC 모습을 가진 분획들을 혼합하고, 농축 건조하여 매우 순수한 항생 물질 SB 22484를 얻었다. 이와같이 하여 얻은 항생 물질 SB 22484는 대응하는 무독성의 약리학적으로 허용되는 염으로 전환시킬 수 있다. 적당한 염으로서는 알칼리 금속염과 알칼리 토금속염, 통상 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 및 마그네슘염, 그리고 암모늄염 및 치환 암모늄염 등이 있다. 대표적인 치환 암모늄염으로서는 일차, 이차 또는 삼차 (C₁-C₄) 알킬암모늄염 및 히드록시(C₁-C₄) 알킬 암모늄염이 있고, 본 발명은 실시태양에 의하면, 벤자틴, 프로카인, 히드라바민 및 유사한 수불용성의 무독성의 약리학상 허용되는 염이 있다. 본 발명 화합물의 다른 바람직한 염은 아르기닌 또는 리신과 같은 염기 아미노산과의 염기성 부가염 또는 글루코사민 등의 아미노당 등이다.

알칼리 금속염 및 알칼리 토금속염은 금속염 제조에 통상 사용되는 일반적인 방법으로 제조된다. 예를들면, 항생 물질 SB 22484는 최소량의 적당한 용매, 통상 저급 알칸올에 용해하여 얻은 용액에 화학양론적인 양의 적절히 선택된 염기를 서서히 첨가하고, 그 결과로 생긴 염은 비용매의 첨가에 의하여 침전으로 석출시킨다. 형성되는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속은 이어서 여과 또는 용매의 증발 제거에 의하여 회수된다.

별법으로서는, 이들 염은 동결 건조를 통하여 완전 무수형으로 제조될 수 있는데, 이때 pH 7.0과 8.5사이의 pH를 얻는데 필요한 양의 적절히 선택된 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 탄산염 또는 수산화물을 사용하여 항생 물질 SB 22484를 염석( 析)시켜 얻은 소정의 염이 함유된 수용액을 여과하여 불용물을 제거하고 동결 건조한다. 유기 암모늄염은 적당한 용매에 용해된 항생 물질 SB 22484의 용액에 적당하게 선택한 아민을 첨가하고, 이어서 용매와 과량의 아민 시약을 증발 제거하거나 농축 용액을 동결 건조함으로써 실질적으로 전술한 방법에 따라 생성될 수 있다.

[항생 물질 SB 22484의 이화학적 특성]

항생 물질 SB 22484의 특성은 다음과 같다.

A) 첨부된 제1도에 나타낸 바와 같이 다음의 흡수 최대치를 나타내는 자외선 흡수 스펙트럼 :

λmax(nm)

a) 0.1N HCl 중에서

230 663

283 192

332 343

b) pH 7.38 인산염 완충액 중에서

230 719

323 391

c) 0.1N 수산화나트륨에서

323 387

d) 메탄올 중에서

229 715

320 365

B) 제2도에 나타난 바와 같이 다음의 최대 흡수치를 나타내는 적외선 흡수 스펙트럼 : (cm^-1) : 3700-3080, 2980-2840(nujol) ; 1645 ; 1560 ; 1455(nujol) ; 1375(nujol) ; 1305 ; 1240 ; 1215 ; 1145 ; 1090 ; 1060 ; 1035 ; 990 ; 945 ; 910 ; 890 ; 850 ; 810 ; 720(nujol).

C) 제3도에 나타난 바와 같이 TMS를 내부 표준 물질(0.00ppm)로 사용하여 헥사듀테로 아세톤 중에서 기록된 270MHz¹H-NMR에서 다음과 같은 일군의 시그날(ppm단위)을 나타내는 NMR스펙트럼(δ=ppm) : 0.77δ(3H) ; 0.83δ(3H) ; 1.21-1.24δ(3H) ; 1.2-2.7δ(5H) ; 1.67δ(s,3H) ; 1.73δ(3H) ; 2.01δ(s,3H) ; 3.20δ(s,3H) ; 3.3-5.6δ(11H) ; 5.4-6.7δ(13H) ; 6.04δ(1H) ; 7.40δ(1H) ; 7.68δ(1H) ; 10.53δ(1H)(s=단일선).

D) 네가티브 이온 모드(negative ion mode)로 작동하고 다음 조건에서 LC를 행하는 HP 5985 B장치를 사용하여 직접 액체 주입식 액체 크로마토그래피-매스 스펙트로 스코피(LC-MS)에 의하여 얻은 매스(mass) 스펙트럼 :

칼럼 : Brownlee Lab. RP 8 10μm, 25cm

유속 : 1ml/분

전개액 : 아세토니트릴 : 0.1M 포름산 암모늄 60:40.

이 스펙트럼은 체류 시간이 각각 4.48, 5.03, 5.65 및 7.25분이고, 항생 물질 SB 22484 인자 1,2,3 및 4로 각각 임의 명명된 4개의 주(主) 피크를 나타낸다.

E) 상기 항생 물질 인자, 즉 항생 물질 SB 22484 인자 1,2,3 및 4에 대한 다음의 메인 프레그멘테이션(main fragmentation) :

인자 1 : 752,734,716,684,538,598,566,500

인자 2 : 766,748,730,698,652,612,580

인자 3 : 752,734,716,684,638,598,566,500

인자 4 : 766,748,730,698,652,612,580,500

F) 실란화실리카 겔 60 F₂₅₄메르크판(Merck plate)을 사용한 여러 가지 크로마토그래피계에서의 Rf값 :

가시화 : 254nm의 자외선

항생 물질 SB 22484는 임질 및 뇌막염과 같이 일반적으로 치료하기가 까다로운 전염병의 원인이 되는 균주에 특히 활성이 있는 항균제이다. 이미 언급한 바와같이, 본 발명의 항생 물질은 네이세리아에 균주에 대하여 활성이 있으며 스트렙토코치, 우레아플라스마, 마이코플라스마 및 헤모필루스에도 상당한 활성이 있으나, 프로테우스, 에스케리키아 및 슈도모나스와 같은 일반적인 그람 음성균과 스타필로코치에는 기의 불활성이다.

본 발명의 항생 물질의 항균 활성은 표준 희석 시험법에 의하여 시험관내에서 증명될 수 있다. 스타필로코치와 스트렙토코치에 대해서는 각각 이소-센시테스트액(Iso-Sensi test broth)(Oxoid)과 토드-헤위트액(Todd-Hewitt broth)(Difco)을 사용하고, 네이쎄리아에 균주는 GC 한천 염기(Difco)＋1% 이소-비탈렉스(Iso-Vitalex)(BBL)에서 배양하며, 헤모필루스는 GC 한천 염기(Difco)+1% Iso-Vitalex(BBL)＋1% 헤모글로빈(Difco)에서 배양한다. 액체 배지(broth culture)는 최종 접종체가 약 10⁴-10⁵군체 형성 단위/ml(CFU/ml)가 되도록 한다. 최소 억제 농도(MIC)는 37℃에서 18-24시간 배양후 증식이 목측(目測)되지 않는 가장 낮은 항생 물질 농도로 간주한다. 네이세리아에는 CO₂가 풍부한 분위기 중에서 배양한다.

항생 물질 SB 22484의 시험관내 활성 범위는 다음 표에 요약되어 있다.

[표 Ⅳ]

L숫자는 출원인의 회사내의 고유 보관 번호를 나타내는 것임.

(*) 출원인 회사내의 고유 보관 번호로 확인되는, 임상학적으로 단리시킨 균주.

(**) 스펙티노마이신(spectinomycin)에 내성이 있는 임상학적으로 단리시킨 균주(이 조건하에서의 MIC〉128)

(***) 임상학적으로 달라진 β-페니실리나제 생산 균주(이 조건하에서의 MIC〉50, 페니실린에 내성 있음).

우레아플라스마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 대한 활성은 다음의 조성으로 된 배지에서 그 미생물을 증식시킨 후 분석하였다.

크리스탈 바이올렛트(crystal violet)가 없는 PPLO액(Difco) 80ml

1N 염산 0.9ml

말의 혈청(Sclavo) 10ml

5% 뇨(c Erba RP) 1ml

0.2% 페놀 레드 1ml

약 pH 6으로 조정됨

최소 억제 농도(MIC)는 시험관에서 2배 연속 희석법에 따라 측정하였다(농도 범위, 0.008 내지 128μg.ml). 20-24시간의 액제 배지로부터 10²-10³변색 단위(ccu)로 접종시킨 1ml/시험관의 부피가 사용되었다. 이들 시험관은 37℃에서 접종시켰다. MIC 종말점은 대조 배지가 pH 7.8에 대응하는 변색을 나타낼 때에 평가된 변색을 억제한 항생 물질의 최소 농도로 취하였다(여러가지 pH값으로 조정된 동일 배지의 색과 배지의 색을 비교하여 측정하였다). 이 변색은 약 10²-10³ccu/ml 접종물을 사용하였을 때 배양 약 24시간 후에 발생하였다. 접종 크기는 다음과 같이 평가하였다. 접종물로 사용된 액체 배지의 10배 연속 희석액을 액체 배지에 첨가하였다. ccu/ml는 변색을 보여 준 가장 낮은 희석액에 준하여 계산하였다.

임상학적으로 단리시킨 균주에 대한 이 실험의 결과는 다음과 같다.

MIC(μg/ml)

우레아플라스마 우레알리티쿰(U. urealyticum) L 1479 8

멸균 시험관내 시험에서, 항생 물질 SB 22484는 MIC(10μg/ml)에 5배에 대응하는 농도로 37℃에서 24시간 배양후 GC 한천 염기(Difco)＋1% Iso-Vitalex(BBL)상에서 대수 증식기(增殖期)에 엔. 고노르헤아(N. Gonorrhea) L 997의 99.9%를 사멸시켰다. 생체 시험의 예비 결과는 에스. 파이오제네스(S. pyogenes)로 감염된 마우스에, 아리올리(V. Arioli) 등의 방법[J. Antibiotics 29, 511(1976)]에 따라, 피하에 200mg/kg을 투여할 때 5마리 중 3마리가 에방된 것을 나타낸다. 더구나, 본 발명의 화합물은 마우스에 복강내 투여시의 LD₅₀이 1000mg/kg(시험된 것 중 가장 높은 투여량)이상이기 때문에, 매우 낮은 독성을 나타낸다. 항균 활성 측면에서 볼 때, 본 발명의 화합물은 사람에 사용되는 항균제의 활성 성분 및 감작성의 병원성균에 의한 전염병의 예방용 또는 치료용 수의약으로도 효과적으로 사용될 수 있다.

항생 물질 SB 22484뿐만 아니라 이것의 염의 항균 활성면에서 볼 때, 이들은 약리학적 또는 수의학적 조성물로 사용될 수 있다. 특히, 항생 물질 SB 22484와 대응하는 무독성의 약리학적으로 허용되는 염은 어느 비율의 혼합물에도 사용될 수 있다. 전술한 바와같이 항생 물질 SB는 최소한 4가지 주성분(SB 22484 1,2,3 및 4)의 복합체이다. 이 분야에서 숙련된 자에게 자명한 바와같이, 이 복합체 중에서의 이들 성분의 비율은 배지와 발효조건 및 분리·정제 공정상의 변수와 같은 여러 가지 매개 변수에 따라서 각 뱃취별로도 달라질 수 있다. 본 발명은 이러한 다양한 비율의 항생 물질 SB 22484인자 1,2,3 및 4의 혼합물을 모두 포함한다. 이들 혼합물은 일반적으로 “항생 물질 SB 22484”로 표현함으로써 모두 포함시키고자 한다.

항균 활성의 측면에서 볼때, 항생 물질 SB 22484는 임질 치료시 첫째로 꼽히는 항균제로서의 용도가 있을 수 있다. 임질은 페니실린과 스펙티노마이신 그리고 이와 달리 테트라사이클린 또는 암피실린으로 현재 처리되고 있다. 그러나, 임질은 지난 15-20년간 꾸준히 그 발생이 증가되었기 때문에, 임질 치료에 이들 물질들을 광범위하게 사용하게 됨으로써 내성이 증가하게 되었다. 그러한 까닭에, 현재의 치료시에 내약성이 있는 몇가지 미생물을 비롯하여 임질의 병인이 되는 미생물에 현저한 활성이 있는 새로운 항균성 화합물의 개발이 이 질병 치료에 있어서의 진보·발전을 나타내는 것이다.

일반적으로, 항균 치료를 위해서는 항생 물질 SB 22484 뿐만 아니라 이것의 약리학상 허용되는 무독성 염을 국소 또는 비경구와 같은 경로로 투여할 수 있다. 그러나, 비경구 투여가 바람직한 투여 경로이다. 주 사용 조성물을 현탁액제, 용액제 또는 유성(油性) 또는 수성 비히클 중의 에멀젼제과 같은 제형으로 될 수 있고, 또 현탁제, 안정제 및/또는 분산제 등의 보조제를 함유할 수도 있다.

별법으로서는 활성 성분은 주사용 멸균수와 같은 적절한 비히클이 첨가될때 운송시에 재구성용 분말형으로 할 수 있다. 투여 경로에 따라서, 이것은 여러 가지 투여형으로 조성될 수 있다. 예를들면, 본 발명의 화합물은 공지의 기술로 장용피형으로 되어 경구 투여용으로 조성될 수 있다(“Remington′s Pharmaceutical Science” 제15판, Mack Publishing Company, 이스톤, 펜실베니아, 미합중국, 제614면). 이것은 장에서 흡수될 필요가 있을 때 위장을 그대로 통과하도록 하는 것이다.

투여할 활성 성분의 양은 피처리 객체의 크기와 상태, 투여 경로와 횟수 및 관련된 원인제와 같은 여러 조건에 따른다. 본 발명의 항생 물질, 즉 SB 22484 및 생리학적으로 허용되는 그의 염은 환자 체중당 1일에 약 5 내지 약 100mg의 투여량을 1일 2 내지 4회로 분할 투여하는 것이 일반적으로 효과가 있다. 특히, 투여 단위당 약 100 내지 약 5,000mg을 함유하는 투여 단위로 제조된 조성물이 좋다. 그러나, 임질 치료에 사용될 때, 장시간 그 약의 효율적인 혈 농도를 유지하려면, 실용성 때문에 단일 투여량 치료가 크게 바람직한 경우에는, 항생 물질 SB 22484를 통상 10 내지 100mg/kg 범위의 비교적 높은 최소 투여 단위를 사용하여야 한다.

더 나아가, 임질 치료시에는 작용 지연형 비경구 투여제형을 사용하는 것이 좋다. 작용 지연형 제형은 당 업계에서 공지된 상이한 메카니즘과 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 항생 물질 SB 22484를 함유하는 작용 지연형 제형의 제조에 좋은 방법은 수성 또는 유성 매질내에 현탁된 벤자민, 프로카인, 히드라바민 및 동종의 염과 같은 본 발명 항생 물질의 수불용성 염류의 사용을 포함한다. 이들 염은 실제로 근육내 투여시 낮은 용해성 때문에 매우 서서히 방출되어서 항생 물질의 혈중 농도를 지속적으로 유지시켜 준다.

[약학적 제형의 제조]

근육내 주사용 단위 투여형은 항생 물질 SB 22484의 프로카인염 2000mg을, 2% 스테아르산 알루미늄으로 겔화시킨 정제된 땅콩유 3ml에 현탁시켜 제조한다.

근육내 주사용 단위 투여형은 항생 물질 SB 22484 250mg을 0.5% 트리히드록시메틸아민(w/v) 50%로 조성된 용매 5ml에 용해시켜 제조한다.

근육내 주사용 단위 투여형은 8% 프로필렌 글리콜을 함유하는 멸균 현탁액(미국 약전) 항생 물질 SB 22484 3500mg으로 제조된다.

근육내 주사용 단위 투여량은 항생 물질 SB 22484 나트륨염을 주사용 멸균수 5ml에 현탁시켜 제조한다.

이하, 본 발명 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

[실시예 1]

[항생 물질의 제조]

스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496의 배지를 함유하는 동결 건조된 시험관을 개방하고, 오트 밀 한천 경사 배지에 무균적으로 옮겼다. 28℃에서 10일간 배양한 다음, 경사 배지를 증류수에 현탁시키고, 다음 조성으로 된 배지 100ml가 들어 있고 보호 장치가 되어 있는 500ml 삼각 플라스크에 접종시켰다.

비프 엑기스 5g

펩톤 5g

효소 카제인 가수 분해물 3g

효모 엑기스 5g

NaCl 1.5g

덱스트로스 20g

증류수 1000ml

플라스크를 28℃, 220rpm의 조건하에 약 48시간 배양시켰다. 전체 배지를 사용하여 다음 조성의 발효 배지 6ℓ가 함유된 10ℓ 발효조를 접종시켰다.

비프 엑기스 4g

펩톤 4g

NaCl 2.5g

효모 엑기스 1g

대두분 10g

덱스트로스 25g

CaCO₃5g

수도물 1000ml

이 발효조는 28℃, 900rpm의 조건하에 1 v/v/m의 비율로 환기시키며 배양시켰다. 항생 물질 최대 활성은 발효 약 40시간만에 얻어진다. 항생 물질의 양은 시험균으로 네이세리아 카비아에(Neisseria caviae) ATCC 1465와 스트렙토코쿠스 다이스갈락티아에(Streptococcus dysgalactiae) ATCC 9926을 사용한 페이퍼-디스크 한천 분석법에 의하여 측정한다.

[실시예 2]

[항생 물질의 대량 생산]

스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496의 배지를 함유하는 동결 건조된 시험관을 개방하여, 오트 밀 한천 경사 배지에 무균적으로 접종시켰다. 28℃에서 10일간 배양 후, 경사 배지를 증류수에 현탁하여, 다음의 조성으로 된 배지 500ml가 함유된 보호 장치가 되어 있는 2개의 2000ml 삼각 플라스크에 접종시킨다.

비프 엑기스 5g

펩톤 5g

효소 카제인 가수 분해물 3g

효모 엑기스 5g

NaCl 1.5g

덱스트로스 20g

증류수 1000ml

상기 2개의 플라스크를 28℃, 220rpm의 조건하에 약 40시간 배양시킨다.

상기 2개의 플라스크의 배지를 사용하여 다음 조성의 종균 배지 30ℓ가 들어 있는 50ℓ 발효조를 접종시켰다.

비프 엑기스 4g

펩톤 4g

NaCl 2.5g

효모 엑기스 1g

대두분 10g

덱스트로스 25g

CaCO₃5g

수도물 1000ml

28℃, 500rpm의 조건하에 1 v/v/m의 통기 속도로 발효시킨다.

발효 24시간 후, 종균 배지 30ℓ를 전술한 것과 동일한 조성비를 배지 200ml를 함유한 300ℓ 발효조에 접종시킨다. 이 발효조는 28℃, 240rpm의 조건하에 1 v/v/m의 통기 속도로 배양한다. 항생 물질의 최대 활성은 발효 40시간만에 얻어진다. 항생 물질의 양은 시험 미생물로 BH(brain heart) 한천 배지에서 37℃로 하룻밤 증식시킨 네이세리아 카비아에(Neisseria caviae) ATCC 14659를 사용한 “페이퍼-디스크 한천 분석법”으로 측정한다. 이 배지액은 10mm 페이퍼 디스크상에서 직경 23mm의 억제 대역을 나타낸다.

[실시예 3]

[항생 물질 SB 22484의 단리 및 정체]

발효액(60ℓ)을 여과기 보조 Clarcel

-flow-ma의 존재하에 여과하고, 여액은 pH 약 7.0으로 조정후 에틸아세테이트(약 60ml)로 추출한다. 유기층은 원심 분리로 분리하고, 작은 부피로 될 때까지 농축한다. 석유 에테르를 오일 모양의 잔사에 첨가하고, 여과기로 항생 물질 침전을 수집한다. 이 물 질의 분획(4.5g)은 메탄올(50ml)에 용해하면, 메탄올 중에 크로마토그래피 칼럼(1m)에 도포하고, 그 계를 Sephadex L 20이 1.5ml 들어 있는 동일한 용매로 용출한다. 분획물 약 20ml를 수집하여, 엔. 카비아에(N. caviae) ATCC 14659에 대하여 페이퍼-디스크 확산 분석과 TLC 및 HPLC분석법으로 분석한다. 분획이 들어 있는 항생 물질을 한데 모아 농축건고시킨다. 오일 모양의 잔사는 최소량의 테트라히드로푸란에 용해하고, 여기에 에틸 에테르를 가하여 생긴 혼합물을 적당한 시간 동안 진탕시켜, 형성된 침전을 수집 및 건조하여 전술한 이화학적 특성을 갖는 순수한 항생 물질 SB 22484 약 960mg을 얻는다.

Claims

항생 물질 SB 22484를 생성하는 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) NRRL 15496을 동화 가능한 탄소원, 질소원 및 무기염원의 조재하에 액중(液中) 호기성 조건으로 배양시키고, 그 발효액으로부터 항생 물질 SB 22484를 회수 및 분리시키고, 필요에 따라 소망하는 염으로 변환시키는 것을 특징으로 하는 아래 A)-F)의 특성이 있는 유리산 형태의 항생 물질 SB 22484 또는 약리적으로 허용되는 그의 염의 제조 방법.

A) 흡수 최대치가 아래와 같은 자외선 흡수 스펙트럼 :

λmax(nm)

a) 0.1N HCl 중에서

230 663

283 192

332 343

b) 인산염 완충액(pH 7.38) 중에서

230 719

323 391

c) 0.1N 수산화나트륨 중에서

323 387

d) 메탄올 중에서

229 715

320 365

B) 흡수 최대치가 아래와 같은 적외선 흡수 스펙트럼(cm^-1) : 3700-3080, 2980-2840(뉴졸) ; 1645 ; 1560 ; 1455(뉴졸) ; 1375(뉴졸) ; 1305 ; 1240 ; 1215 ; 1145 ; 1090 ; 1060 ; 1035 ; 990 ; 945 ; 910 ; 890 ; 850 ; 810 ; 720(뉴졸).

C) 내부 표준(0.00ppm)으로서 TMS를 사용하여 헥사듀테로아세톤 중에서 기록된 270MHz¹H-NMR에서의 신호군(ppm)이 아래와 같은 NMR스펙트럼(δ=ppm) : 0.77δ(3H) ; 0.83δ(3H) ; 1.21-1.24δ(3H) ; 1.2-2.7δ(5H) ; 1.67δ(s,3H) ; 1.73δ(3H) ; 2.01δ(s,3H) ; 3.20δ(s,3H) ; 3.3-5.6δ(11H) ; 5.4-6.7δ(13H) ; 6.04δ(1H) ; 7.40δ(1H) ; 7.68δ(1H) ; 10.53δ(1H)(s=단일선).

D) 네가티브 이온 모드로 작동하고, 다음 조건하에서 LC를 행하는 HP 5985 B 장치를 사용하여, 직접 액체 주입식 LC-MS로 얻은 매스(mass) 스펙트럼.

칼럼 : Brownlee Lab. RP 8 10μm, 25cm(옥틸실란 기능 처리된 실리카 겔)

유속 : 1ml/분

전개액 : 아세토니트릴 : 0.1M 포름산 암모늄, 60:40.

이 스펙트럼은 체류 시간이 각각 4.48, 5.03, 5.65 및 7.25분이고, 항생 물질 SB 22484 인자 1,2,3 및 4로 각각 임의 명명된 4개의 주(主) 피크를 나타냄.

E) 상기 항생 물질 인자, 즉 항생 물질 SB 22484 인자 1,2,3 및 4에 대한 다음과 같은 메인 프레그멘테이션(main fragmentation) 피크 :

인자 1 : 752,734,716,684,538,598,566,500

인자 2 : 766,748,730,698,652,612,580

인자 3 : 752,734,716,684,638,598,566,500

인자 4 : 766,748,730,698,652,612,580,500

F) 실란화실리카 겔 60 F₂₅₄메르크판(Merck plate)를 사용한 여러 가지 크로마토그래피계에서의 Rf값 :

가시화 : 254nm의 자외선
제1항에 있어서, 생성 균주의 배양이 20°-40℃에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항생 물질의 회수가 물과 혼화되지 않는 저급 알킬 알카노일산 에스테르, 저급 폴리할로겐화 탄화수소 및 고급 알칸올에서 선택되는 용매를 사용하여 여과시킨 발효액을 추출시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항생 물질 SB인자 1,2,3 및 4의 4종의 주성분을 일정 비율로 함유하는 혼합물인 항생 물질 SB 22484의 분리가 유도 조절된 기공 가교 결합 덱스트란 또는 비기능성 폴리스티렌을 사용하여 입체 축출 칼럼 크로마토그래피에 의하여 수행되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 크로마토그래피 칼럼이 물중의 아세톤, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 또는 테트라히드로푸란의 이성분(二成分) 혼합물 10 내지 90%로 전개되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항생 물질의 회수가 발효액의 pH를 약 7.5로 조정하고, 이것을 물과 혼화되지 않는 저급 알킬 알카노일 에스테르로 추출하여 pH를 약 9.0으로 되게 하고, 형성되는 침전은 여과 회수하여 물에 용해하고, 이때 생긴 현탁액의 pH를 약 4로 조정하여 물과 혼화되지 않는 저급 알카노일 에스테르로 추출시킨 다음, 이 추출액의 pH를 약 9로 조절시켜서 다시 침전시킴으로써 수행되는 것인 방법.