NO853567L

NO853567L - Nye antibiotika, fremgangsm¨te for fremstilling av disse o g farmas¯ytiske preparater inneholdende disse.

Info

Publication number: NO853567L
Application number: NO853567A
Authority: NO
Inventors: Anne Camille Horan; Jerzy Golik; James Andrew Matson; Mahesh Gordhandas Patel
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1984-09-17
Filing date: 1985-09-12
Publication date: 1986-03-18
Also published as: DE3569538D1; ES546915A0; EP0175284A3; EP0175284A2; EP0175284B1; DK415185A; JPH0558440B2; HU194315B; ES8703931A1; JPS61106592A; ATE42305T1; CA1315230C; US4743594A; ZA857003B; PT81118B; HUT42527A; KR860002574A; GR852224B; FI853506A0; FI853506L

Description

Foreliggende oppfinnelse angår farmasøytisk aktive forbindelser av generell formel I

hvori X er H eller Cl og R er H eller CH3, i racemisk eller optisk aktiv form, og farmasøytisk akseptable salter derav.

De bølgede linjer betegner bindinger til de to 6-

leddede sukkerringer og angir at substituentene bundet til hver sukkerring, kan være i hvilke som helst av de mulige stereokjemiske konfigurasjoner. Strukturen av hver sukkerring kan være stol-og/eller båtform.

De nye forbindelser er anvendbare som antibakterielle

og antitumormidler. På grunn av deres antibakterielle aktivitet vil de nye forbindelser bli betegnet som anti-biotika i det etterfølgende selv om de utviser andre ikke-antibiotisk beslektede aktiviteter.

Oppfinnelsen angår enn videre en fremgangsmåte for fremstilling av de nye forbindelser. Mikroorganismen anvendt ved fremgangsmåten, er en ny actinomycet av slekten Actinomadura betegnet som Actinomadura melliaura sp. nov.

SCC1655, tidligere betegnet som Actinomadura fulva sp. nov.

Antibiotikum AT 2433 kompleks produseres ved fermentering under anvendelse av en biologisk ren kultur av den nye mikroorganisme Actinomadura melliaura. Antibiotikum AT 24 3 3 er et kompleks av 4 komponenter hvor hver av disse er representert ved formel I. Komplekset av de 4 komponenter er her angitt som "antibiotikum AT 2433 kompleks". Indi-viduelt er de fire AT 2433 komponenter betegnet som AT 2433 A^, A2, og B2 og er spesifisert under henvisning til formel I og den etterfølgende tabell I.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikum AT 2433 kompleks som omfatter dyrkning av en stamme av Actinomadura melliaura sp. nov. som er i stand til å produsere antibiotikum AT 24 33 kompleks i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder av carbon og nitrogen under submerse aerobe betingelser inntil en mengde av antibiotikum AT 24 3 3 kompleks er produsert av angitte stamme i angitte næringsmedium. Antibiotikum AT 24 33 kompleks gjenvinnes og separeres i sine fire komponenter betegnet som antibiotikum AT 24 3 3 A^, A0, og B2.

Den foretrukne kultur for fremstilling av en forbindelse av formel I og antibiotikum AT 2433-komplekset er en biologisk ren kultur av mikroorganismen Actinomadura melliaura som har identifiseringskarakteristikaene ATCC 39691.

Antibiotikum AT 24 33 kompleks og de fire komponenter isolert derfra, er effektive mot forskjellige grampositive og gramnegative bakterier og utviser aktivitet mot eksperimen- telle dyretumorsystemer, f.eks. P-388 leukemi i mus.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse representert ved formel I hvori X er H eller Cl og hvori er H eller CH3, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, i racemisk eller optisk aktiv form, og en inert farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

Ifølge et annet trekk ved oppfinnelsen er det tilveiebragt en metode for behandling av en pattedyrvert som er angrepet av en ondartet tumor, hvilken omfatter administrering til angitte vert med en ondartet tumor av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse representert ved formel I eller et farmasøytisk preparat derav.

Ifølge et annet trekk ved oppfinnelsen er det tilveiebragt en metode for behandling av ømfintlige bakterieinfeksjoner som omfatter administrering til en vert med behov for slik behandling, av en forbindelse av formel I eller et farmasøytisk preparat derav i en mengde tilstrekkelig til å behandle en slik infeksjon.

Mikroorganismen

Antibiotikum AT 2433-komplekset representert ved formel I, fremstilles ved fermentering av en biologisk ren kultur av Actinomadura melliaura sp. nov., betegnet som stamme SCC 1655. Actinomadura melliaura SC 1655. Actinomadura melliaura SC 1655 ble erholdt fra en jordprøve oppsamlet i Bristol Cove, California.

En subkultur av denne mikroorganisme er deponert ved den permanente samling i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og er blitt gitt aksesjonsnummeret

ATCC 39691 i deponeringsinstitusjonen.

Beskrivelse av den produserende stamme Actinomadura melliaura sp. nov. ATCC 39691

De taksonomiske metoder anvendt her, er de som er beskrevet av Gordon [Gordon, R. E., "Some criteria for the recognition of Norcardia madurae (Vincent) Blanchard J. Gen. Microbiol., £5:355-364, 1966], og av Leudemann og Brodsky [Leudemann, G. M., og Brodsky, B., "Micromonospora carbonacea sp. nov., and Everninomicin-producing organism", Antimicrob. Agents Chemother., s. 47-52, 1964], og av Horan og Brodsky [Horan, A. C., og B. C. Brodsky, "A novel antibiotic-producing Actinomadura, Actinomadura kijaniata sp. nov.",

Int. J. Syst. Bacteriol., 32 *• 195-200, 1982], og av Becker et al. [Becker, B., Lechevalier, M. P., og Lechevalier, H. A., "Chemical composition of cell wall preparations from strains of various genera or aerobic actinomycetes", Appl. Microbiol., _13: 236-243, 1966], og av Lechevalier og Lechevalier, [Lechevalier, M. P. og Lechevalier,. H. A., "Chemical composition as a criteria in the classification of aerobic actinomycetes", Int. J. Syst. Bacteriol,, 20:487-493, 1970], og av Shirling og Gottlieb [Shirling, E. B., og D. Gottlieb, "Methods for characterization of Streptomyces species",

Int. J, Syst. Bacteriol., 16:313-340, 1966], og av Waksman [Waksman, S. A., "The Actinomycetales", bind 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore Md.].

Makroskopiske karakteristika for Actinomadura melliaure

ATCC 39691

Etter 14 til 21 dager ved 30°C ble god vekst at Actinomadura melliaura ATCC 39691 observert på Emersons NZA-glucose, gjærekstrakt-glucose, ISP 2, 6 og 7 agar. I de fleste andre media er veksten middels, Diffuserbare pigmenter ble ikke dannet på de testede media» Luftmycelium, hvit i masse, ble dannet på Czapek-sucrose, gjærekstrakt-glucose, ISP-3 og 4 agar. Vegetative mycelpigmenter varierte fra gyllenbrun til gyllen til brun. Farver anvendt i beskrivelsen av pigmentene, følger farve-navnkartene i Color Harmony Manual, 4. utg., Container Corp. of America, Chicago, 1958; og i Descriptive Color Names Dictionary, Container Corp. of America, Chicago, 1950., Taylor H. D. , Knoche, L., og Granville, W. C. Dyrkningskarakteristika er angitt i

tabell II.

Mikroskopiske karakteristika for Actinomadura melliaura

ATCC 3961

På vannagar ble det etter 10 til 14 dager ved 30°C dannet rikelig, fint (0,5 til 0,8yum i diameter) luftmycelium. Lange sporoforer med rettet eller svakt krokede kjeder med 10-20 sporer oppsto langs lengden av luftmyceliet. Ved de terminale ender av luftmyceliet kan karakteristisk to sporoforer som bærer sporer, observeres. Sporene er sylindriske, ikke-bevegelige, 1,0 til 2,0^um i diameter og synes glatt-veggede.

Fysiologiske karakteristika for Actinomadura melliaura

ATCC 39691

Vekst av Actinomadura melliaura ATCC 39691 fant sted ved temperaturer i området på 27°C til 40°C på gjærekstrakt-glucoseagar. Det optimale veksttemperaturområde er 30 til 35°C. Dårlig vekst ble observert ved 10°C og 45°C. Andre fysiologiske egenskaper for stammen er vist i tabell III. Actinomadura melliaura ATCC 39691 utnytter de fleste sukkere og et område av organiske syrer for veksten. Carbonutnytt-elsesresultatene er oppført i tabell IV.

1. Medium of Leudemann&Brodsky (Antimicrob. Agents Chemother., s. 47-52, 1964). 2. Medium of Gordon (J, Gen.Microbiol. 45:355-364, 1966).

Aminosyrekomponenter i cellevegg og sukkerkomponenter i helcellen

Celleveggen av Actinomadura melliaura ATCC 39691 ble undersøkt i henhold til de metoder som er beskrevet av Becker et al. (Appl. Microbiol. 13; 236-243, 1965) og Yamaguchi (J. Bacteriol. 8J9: 441-453, 1965) og ble funnet å inneholde aminosyren meso-diaminopimelihsyre. Den karakteristiske sukkerkomponent i helcellehydrolysatet ble identifisert som Madurose (3-0-methyl-D galactose) i henhold til de prosedyrer som er beskrevet av Lechevalier og Lechevalier i Biology of the Actinomycetes and Related Organisms 11: 78-92, 1976.

Basert på cellevegganalyse og morfologiske karakteristika kan kulturen kategoriseres som en art av slekten Actinomadura, betegnet som Actinomadura melliaura ATCC 39691. Den nye Actinomadura melliaura ATCC 39691 ble sammenlignet med 13 deponerte arter av Actinomadura-slekten. Av de

13 deponerte stammer deler Actinomadura melliaura ATCC 39691 vegetativt myceliumpigmentering med A. helvata, A. flava, og A, brunneaj Actinomadura melliaura ATCC 39691 avviker fra

A. helvata i morfologi av sporekjeden, farve på luftmyceliet, utnyttelse av methyl-3-D-glucosid og i antibiotikaproduksjon. Actinomadura melliaura ATCC 39691 avviker fra A. flava i luftmyceliumdannelse, morfologi av den sporebærende hyfe hvori hele luftmyceliet fragmenteres til kjeder av sporer, ved utnyttelse av methyl—3~D-glucosid, og ved antibiotika-produks jon; og fra A. brunnea i morfologi, farve på luftmyceliet, utnyttelse av methyl-|3—D-glucosid og av mannitol, og i antibiotisk aktivitet. Tabell V sammenlignet Actinomadura melliaura ATCC 39691 med de angitte stammer av Actinomadura.

Basert på den særpregede morfologi av Actinomadura melliaura ATCC 39691 og dets karakteristiske fysiologiske og dyrkningsmessige karakteristika, såvel som produksjonen av det nye antibiotikum AT 24 3 3 kompleks, betraktes kulturen å representere en distinkt, ny art av slekten Actinomadura.

Det skal forstås at hvis en annen stamme av denne nye art av slekten Actinomadura vil bli funnet, vil typestammen også være typeunderarten»

Det skal forstås at foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til anvendelse av den særlig foretrukne stamme Actinomadura melliauraATCC 39691 som ovenfor beskrevet, eller til organismer som fullt ut svarer til de ovenfor angitte beskrivelser. Det er spesielt tatt i betraktning å innbefatte andre antibiotikum AT 24 33 kompleks-produserende stammer eller mutanter av den nye art, f.eks. de som kan dannes på konvensjonelle måter slik som røntgenbestråling, ultrafiolett bestråling, behandling med nitrogensenneper, fageksponering og lignende.

Fermentering

Actinomadura melliaura (f.eks. stammen deponert under nr. ATCC 39691) vil når den fermenteres under regulerte betingelser i et egnet mediuitv produsere antibiotikum AT 24 33-komplekset fra hvilket 4 forbindelser representert ved formel I og angitt som AT 2433A_, AT 2433 A2, AT 2433 B1

og AT 2433 B2, isoleres.

Fermenteringen som gir antibiotikaene, startes med Produksjon av et kraftig vegetativt inokulum som vanligvis produseres i to eller tre trinn. Et egnet medium for fremstilling av slikt inokulum er angitt i det etterfølgende som medium A og medium B. Inokulumet og fermenteringen utføres i et medium hvori pH opprettholdes på fra 6,5 til 8,5, fortrinnsvis 7,5 for inokulumet og 7,0 for fermenteringen.

De riktige pH-områder opprettholdes vanligvis ved innarbeid-else av egnede buffere, slik som calciumcarbonat i mediet.

Det vegetative inokulum og fermenteringen utføres ved en temperatur på fra 27°C til 40°C. Det foretrukne tempera-turområde for å fremstille det vegetative inokulum og for å utføre fermenteringen er 30 til 35°C.

Generelt fremstilles næringsmediene i et egnet fermen-teringskar eller kolbe som steriliseres og avkjøles før inokuleringen. Mediene kan imidlertid lagres under aseptiske betingelser ved temperatur under 0°C før bruk.

Lagerkulturer av Actinomadura melliaura opprettholdes som fryst helkraft.

Inokulumfremstilling

For å fremstille antibiotikum AT 24 33 kompleks foretrekkes et kraftig voksende vegetativt inokulum.

Generelt utføres inokulumfremstillingen i to eller flere trinn. For fermenteringer i stor målestokk (f.eks. rundt 50 liter) foretrekkes det at inokulumet fremstilles i tre trinn.

Et egnet medium for fremstilling av vegetative inokula er som følger: 2 ml friskt tinet helkraft av en 5 volum% suspensjon av Actinomadura melliaura anvendes for å inokulere 50 ml av sterilt medium A.

Kolben inkuberes ved ca. 30°C i fra 48 til 9 6 timer, fortrinnsvis rundt 72 timer, på en rister ved 300 omdr. pr. minutt og med en slaglengde på 5,08 cm.

Andre inokulumtrinn -

En serie på 2-liters Erlenmeyerkolber inneholdende 500 ml sterilt medium A inokuleres med 2 5 ml av en 5 volum% løsning av første inokulum. Inkuberingsprosedyren beskrevet for første inokulumtrinn følges.

Tredje inokulumtrinn ( valgfritt)

25 ml av andre inokulum anvendes for å inokulere hver av en serie på 500 ml porsjoner av sterilt medium B i 2-liters Erlenmeyerkolber. Kolbene inkuberes med en omrøring på 350 opm ved ca. 30°C i fra 24 til 72 timer, fortrinnsvis rundt 48 timer. Gjennomluftning med ca. 0,35 volum luft/volum fermentering/minutt (WM) anvendes.

Ifølge et trekk ved oppfinnelsen utføres ikke dette tredje inokulumtrinn. Antibiotikaproduksjon startes under anvendelse av det andre inokulumtrinn.

Antibiotikaproduksjon (fermentering)

Følgende medium betegnet medium B er blitt funnet å gi både tilfredsstillende og reproduserbare utbytter av antibiotisk produksjon:

10 liter sterilt medium B inokuleres med 500 ml av produktet fra andre inokulumtrinn som ovenfor beskrevet. Fermenteringsblandingen inkuberes ved fra 27 til 40°C, fortrinnsvis fra 30 til 35°C, med omrøring og gjennomluftning på 350 opm og 0,35 WM. pH ved fermenteringen opprettholdes på fra 6,8 til 7,5 ved tilsetning av fortynnet syre eller alkali om nødvendig. Tilsetningen av fortynnet syre eller fortynnet alkali er vanligvis unødvendig. Ved en normal fermentering vil imidlertid pH stige til ca. 7,5 og vil falle tilbake til nøytral verdi ved slutten av fermenteringen.

Produksjon av antibiotikum AT 24 33 overvåkes ved bestemmelser på helkraftbrønn mot Micrococcus luteus ATCC 9341 eller Staphylococcus aureus 209 P neomycin-bestemmelsesagar (BBL).

Isolering av antibiotikum AT 24 33 kompleks og separering av antibiotikum AT 2433 A.^, A,,, B.^ og B2

Antibiotikum AT 2433 kompleks isoleres fra kraften ved ekstraksjon under anvendelse av ca. 2 volumer av et ubland-bart, organisk løsningsmiddel, f.eks. ethylacetat pr. eks-trakt, og ved ekstrahering av kraften to ganger. Ekstraktene kombineres, fordampes til et residuum og oppløses i et hydro-carbonløsningsmiddel, f.eks. "Skellysolve" B og methanol.

En del vann pr. 10 volumer methanol tilsettes, og væske-væskefordeling av antibiotikum AT 2433-komplekset anvendes. Det vandige methanollag separeres og ekstraheres med to porsjoner av f.eks. "Skellysolve" B. Ytterligere vann tilsettes"nder dannelse av 1:3 (v/v) vann:methanol som ekstraheres med 3 like volumer av f.eks. carbontetraklorid. Ytterligere vann tilsettes under dannelse av 1:2 (v/v) vann:methanol som ekstraheres med 6 like volumer av kloroform (eller methylen-klorid). Kloroformekstraktene kombineres og fordampes under dannelse av et residuum. Residuet underkastes væskekromatografi ved middels trykk på en silicagelkolonne under anvendelse av den nedre fase av 4:4:3, (v/v/v) løsning av kloro-formtmethanol:vann som elueringsmiddel. Elueringen startes, og fraksjonene inneholdende AT 2433 A^og A2(som bestemt ved lignende R_-verdier på silicagel tlc-plater) fordampes under dannelse av en blanding av AT 2433 A^og A2. På lignende måte oppsamles fraksjonen inneholdende AT 2433 B^og B2og fordampes under dannelse av en blanding av AT 24 33 B^ og B2<AT 24 33 A^og A2underkastes væskekromatografi ved middels trykk på silicagel under anvendelse av en lineær gradient av kloroform (1% NH^OH) til 1:10 (v/v) methanol: kloroform (1% NH^OH). Fraksjonene inneholdende en blanding av AT 2433 A1og A2(som bestemt ved tic), oppsamles og fordampes til tørrhet under dannelse av et fast materiale.

På lignende måte renses AT 2433 B, og B^. Separasjon av

AT 24 33 A^ fra AT 24 3 3 A2utføres under anvendelse av væskekromatografi ved middels trykk på en octadecylsilan-behandlet silicagelkolohne (C-18 silicagel) under anvendelse av 4:3:3 (v/v/v) acetonitril:methanol:0,1 M ammoniumacetat som elueringsmiddel. Eluatet overvåkes ved tic, og fraksjoner inneholdende urent AT 24 33 A2 og AT 24 33 A^oppsamles og fordampes til tørrhet. Det urene AT 2433 A2renses ved å gjenta væskekromatografien ved middels trykk på C-18 silicagel.

AT 2433 B1separeres fra AT 2433 B2ved væskekromatografi ved middels trykk på C-18 silicagel under anvendelse av 4:3:3 (v/v/v) acetonitril:methanol'.ammoniumacetat som elueringsmiddel.

Strukturene av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, dvs. AT 2433 A,, AT 2433 A^, AT 2433 B, og AT 2433 B„, bestemmes

^ I 13

ved analyse av deres infrarøde, ultrafiolette, H og C kjernemagnetisk resonnans- og massespektra.

Biologisk aktivitet av AT 2433 A_, AT 2433 K2>AT 2433 B1og AT 2433 B2

Antibiotikum AT 2433 A_, AT 2433 A^og AT 2433 B1 og AT 24 33 B2 ble testet in vitro for å bestemme antibakteriell aktivitet mot et utall av grampositive og gramnegative organismer.

De in vitro antibakterielle aktivitetstester ble utført via konvensjonelle agar-fortynningsmetoder i Muell-Hinton agar (MHA) ved pH 7,4.

Antibiotikum AT 2433 A1, A2, B-j^og B2ble fastslått å være aktive overfor grampositive bakterier. Alle de fire antibiotiske forbindelser utviste den største antibakterielle in vitro-aktivitet overfor Sarcina lutea (ATCC 9341) hvori AT 2433 A^ og B^hadde en minimal inhiberende konsentrasjon (MIC) på 0,25 (^ug/ml, MHA, 48 timer), og AT 2433 A2og B2hadde MIC-verdier på 1,0 og 4,0. De fire forbindelser ble også funnet å ha in vitro antibakteriell aktivitet overfor Bacillus subtilis (ATCC 6633) , Staphylococci stamme falcium (ATCC 09790) og faecalis (ATCC 29212).

Antibiotikum AT 24 3 3 ble også funnet å ha in vitro aktivitet overfor den gramnegative bakterie E. coli SS 1431 med en MIC på 16,0 (^ug/ml, MHA, 48 timer).

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen angitt som AT 2433 A-^ og AT 2433 B^, utviste in vivo antitumoraktivitet overfor transplantert muse P-388 leukemi.

Antitumoraktivitet ble bestemt ved National Cancer Institute standardtest som er publisert i Cancer Chemother. Rep. 3:1-103,1972.

I testen ble IO<6>celler (en letal dose) av P-388 leukemi administrert intraperitonealt pr. mus på dag 0. Testforbindelsene ble seriefortynnet (1:2, 1:4, 1:8, etc), og hver fortynning ble administrert intraperitonealt til musene på dag 1, 4 og 7.

Resultatene er oppført i tabell VI.

Ved den maksimale tolererte dose (ingen dødsfall på

dag 5 eller tidligere på grunn av toksisitet) på 2 mg/kg gitt hver 3. dag med 3 injeksjoner ga AT 2433 A^en økning i levetid i forhold til kontrollene på 72% (%T/C =172).

For AT 24 33 B1var den høyeste testede dose på 16 mg/kg inhiberende for tumorvekst, men mindre effektiv enn AT 2433 A^.

Lignende aktivitet forventes for antibiotikum AT 24 33 A2og AT 2433 B2-

Terapeutisk bruk

Som tidligere angitt, utviser forbindelsene av formel I antibakteriell aktivitet overfor et utall grampositive, og i ett tilfelle (AT 2433 B^), gramnegative bakterier.

Ifølge oppfinnelsen er det således tilveiebragt en metode for behandling av ømfintlige bakterieinfeksjoner som omfatter administrering til en vert, dvs. et varmblodig pattedyr med behov for slik behandling, en forbindelse av formel I eller et farmasøytisk preparat derav, i en tilstrekkelig mengde til å behandle slike infeksjoner.

Forbindelsene utviser også antitumoraktivitet overfor ondartede tumorer i pattedyr, f.eks. P-388 leukemi i mus.

Ifølge et annet trekk ved oppfinnelsen er det således også tilveiebragt en metode for behandling av en pattedyrvert angrepet av en ondartet tumor som omfatter administrering til angitte vert med en ondartet tumor, av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse av formel I eller et farma-søytisk preparat derav.

En ytterligere side ved oppfinnelsen angår et farma-søytisk preparat omfattende en forbindelse av formel I eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, i racemisk eller i optisk aktiv form, og en inert farmasøytisk akseptabel bærer eller et fortynningsmiddel.

Typisk egnede farmasøytisk akseptable salter er syre-addisjonssalter dannet ved tilsetning til forbindelsene ifølge oppfinnelsen av en ekvivalent av en uorganisk syre slik som HC1, HF, HNC>3, H2SC>4 eller H3P04eller en organisk syre slik som eddiksyre, propionsyre, oxalsyre, valerinsyre, oljesyre, palmitinsyre, stearinsyre, laurinsyre, benzosyre, melkesyre, paratoluensulfonsyre, methansulfonsyre, sitron-syre, maleinsyre, fumarsyre, ravsyre og lignende.

De farmasøytiske preparater kan fremstilles ved å kombinere forbindelsene ifølge oppfinnelsen eller et farma-søytisk akseptabelt salt derav med et hvilket som helst egnet, dvs. inert farmasøytisk fortynningsmiddel eller bærer, og disse kan administreres oralt, parenteralt eller topisk i et utall av formuleringer.

Eksempler på egnede preparater innbefatter faste preparater for oral administrering slik som tabletter, kapsler, piller, pulvere og granuler, væskeformige preparater for oral administrering slik som løsninger, suspensjoner eller emulsjoner. De kan også fremstilles i form av sterile, faste preparater som kan oppløses i sterilt vann, fysiologisk salt-vann eller annet sterilt injiserbart medium umiddelbart før bruk.

Det skal forstås at de aktuelle foretrukne doser av forbindelsene eller farmasøytisk akseptable salter derav vil variere alt etter den bestemte forbindelse som anvendes, det bestemte preparat som formuleres, administreringsmåte og den bestemte situasjon, vert og sykdom som skal behandles. Mange faktorer som modifiserer virkningen av legemidlet, må tas i betraktning av den behandlende lege, f.eks. alder, kroppsvekt, kjønn, diett, administreringstid, utskillelsestid, vertens tilstand, legemiddelkombinasjoner, reaksjons-sensibiliteter og strengheten av sykdommen. Administreringen kan utføres kontinuerlig eller periodevis innen den maksi-malt tolererte dose. Optimale administreringsgrader for et gitt sett av betingelser kan lett bestemmes av legen under anvendelse av konvensjonelle doseringsbestemmelsestester.

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Generelle metoder

Løsningsmidler og reagenser

Løsningsmidler anvendt for kolonnekromatografi, LC ved middels trykk og utfellinger, var ikke redestillert. Kloroform, carbontetraklorid og methanol var vannfri ACS kvalitet.

Vannkvaliteten var avionisert vann ført gjennom et

Cr)

Millipore^4 vannsystem av reagenskvalitet (18 megohm Milli-Q-vann). Acetonitril og dimethylsulfoxyd var løsnings-midler av hplc kvalitet. Tetrahydrofuran var konserverings-middelfritt "Omnisolve" av hplc kvalitet. "Skellysolve" B var levert fra Getty Oil og var ikke renset på nytt. Ammoniumacetat var av Fisher Certified ACS kvalitet. Elueringsmidlet (normalt oppsamlet i 50 ml fraksjoner) fra kolonne-kromatografien ble overvåket ved 405 nm og 4 35 nm med en ISCO ultrafiolett (UV) detektor. Angivelsene er på volumbasis.

Tynnskiktskromatografi (tic) ble utført på Whatman LK5DF eller LK6DF silicagelplater (20 cm x 20 cm, tykkelse 0,25 mm). Platene ble fremkalt i Dasaga tic tanker. Tankene ble fylt med 200 ml elueringsmiddel og fikk ekvilibreres før innføring av platene. Fremkalte, lufttørkede plater ble visualisert med 366 nm ultrafiolett lys.

De infrarøde spektre ble målt på et Beckman IR instrument modell 4 230. Ultrafiolette spektre ble målt på et Beckman Acta III UV instrument. 1 H og<13>C NMR spektre ble målt på et Bruker WM 360 instrument ved 360 og 90 MHz. Kjemiske ioniser-ingsmassespektra under anvendelse av CH^som en reaktantgass ble målt på et Hewlett-Packard HP 5985B instrument. Felt-desorpsjonsmassespetra ved lav og høy oppløsning ble målt på et Varian MAT-731 instrument.

Eksempel 1

Fermenteringsbetingelser for produksjon av antibiotikum

AT 24 33 kompleks

Lagerkultur:

Lagerkulturer av Actinomadura melliaura ATCC 39691 ble opprettholdt som fryst helkraft.

Inokulum:

A. Første trinn: Et 5 volum? inokulum fra den tinede lagersuspensjon av Actinomadura melliaura (ATCC 39691) ble anvendt for å inokulere 70 ml såmedium A (kjøttekstrakt,

3,0 g; trypton, 5,0 g; gjærekstrakt, 5,0 g; cerelose, 1,0 g>

potetstivelse, 24,0 g;CaC03, 2,0 g; kranvann, 1000 ml;

pH 7,5 med NaOH) i en 300 ml Erlenmeyerkolbe. Kolben ble inkubert ved 30°C i 48 timer på en gyratorisk rister med en slaglengde på 5,08 cm og en hastighet på 300 opm.

B. Andre trinn: 500 ml av såmedium A ble inokulert med

25 ml (5 volum%) av inokulum fra første trinn i 2-liters Erlenmeyerkolber og ble inkubert som beskrevet i eksempel IA. C. Fermentering: 10 1 fermenteringsmedium A (gjærekstrakt, 5,0 g; NZ-amin, 5,0 g; cerelose, 10,0 g; oppløselig stivelse,

_ 3

20,0 g; CaC03, 4,0 g; kranvann, 1000 ml; CoCl2(c, 10 M, 1,0 ml) i en 14 liters fermentor ble inokulert med 70 ml 5 volum% inokulum fra det andre trinn. Fermenteringene ble utført i 9 6 timer ved 30°C og med 3 50 opm og en luftstrømning på 0,35 WM.

Produksjon av antibiotikum AT 2433 kompleks ble overvåket ved analyser av helkraft mot Micrococcus luteus ATCC 9341 eller Staphylococcus aureus 209P i neomycin-bestemmelsesagar (BBL).

D. Isolering: 110 1 fermenteringskraft ble ekstrahert med

2 x 110 1 ethylacetat. Ethylacetatekstraktene ble kombinert, og løsningsmidler ble fordampet i vakuum under dannelse av 32,6 g av et fast, urent antibiotisk kompleks AT 24 33.

Eksempel 2

Separering av antibiotikum AT 24 33 kompleks i AT 24 33 A(A^ogA2) og AT 2433 B ( B1 ogB.J

A. Væske- væskefordeling av fast, urent antibiotikum AT 2433

kompleks:

32,6 g fast, urent antibiotikumkompleks AT 2433 fra eksempel 1 ble oppløst i 200 ml "Skellysolve" B og 200- ml methanol under anvendelse av en Cole-Palmer Model 8845-60 Ultrasonic Cleaner. Løsningen ble overført til en 1-liters skylletrakt og fortynnet med 22,2 ml vann. Blandingen ble ristet, og de resulterende faser fikk separere. Den vandige methanol (nedre fase) ble overført til en andre skilletrakt. Den vandige methanolfase ble ekstrahert ytterligere to ganger med 200 ml aliquoter av "Skellysolve" B som på forhånd var blitt mettet med et likt volum på 10% (v/v) vann i methanol. Den vandige methanolfase ble fortynnet med 44,4 ml vann og ekstrahert 3 ganger med 200 ml aliquoter av carbontetraklorid som på forhånd var blitt mettet med et likt volum av 25% (v/v) vann i methanol. Den vandige methanolfase ble fortynnet med 41 ml vann og ekstrahert 6 ganger med 200 ml aliquoter av kloroform. Kloroformen var på forhånd blitt mettet med et likt volum av 35% (v/v) vann i methanol. Kloroformekstraktene ble oppsamlet og fordampet i vakuum til tørrhet på et rotasjonsfordamper under dannelse av 5,4-5 g av residuum A, en blanding inneholdende de fire forbindelser AT 2433 A^, A2, B1og B2-

B. Kolonnekromatografi av residuum A:

Følgende løsningsmidler ble ekvilibrert i en 6 liters skilletrakt; 2160 ml kloroform; 2160 ml methanol og 1620 ml vann. De resulterende faser ble separert. Den nedre fase ble anvendt som elueringsmiddel for kolonnekromatografi og tlc-kromatografi.

En 2,0 cm (indre diameter) x 100 cm Glenco Universal LC kolonne, serie 3500, ble oppslemningspakket med 140 g Woelm silicagel (0,032 - 0,063 mm) i det ovenfor angitte elueringsmiddel. En prøve på 5,45 g av residuum A i 10 ml elueringsmiddel ble trukket inn i den 15 mi store prøveslynge. Prøveslyngen ble koblet til LC-systemet ved middels trykk. Elueringen ble startet med en strømningshastighet på ca.

21 ml/min, og følgende fraksjoner ble oppsamlet: Fraksjon 1 - 180 ml, fraksjon 2 - 100 ml, fraksjon 3 - 50 ml, fraksjon 4 til 33 - 75 ml hver. 25^ul aliquoter av hver fraksjon ble anbragt på Whatman LK6DF silicagel tlc-plater. Platene ble fremkalt med elueringsmidlet og belyst med 36.6 nm ultrafiolett lys. Fraksjon 7-14 ble oppsamlet og fordampet i vakuum på en rotasjonsfordamper under dannelse av urent AT 2433 A, en blanding av AT 2433 A1og A2(1,2 g). Fraksjon 14-21 ble oppsamlet og fordampet i vakuum på en rotasjonsfordamper under dannelse av urent AT 24 33 B, en blanding av AT 2433 B1 og B2(1,4 g). C. Kolonnekromatografi av urent AT 243 3 A;

En Glenco kolonne med 2,0 cm indre diameter x 30 cm ble oppslemningspakket med 37 g Woelm silicagel (0,060 - 0,200 mm, 70-230 mesh) i kloroform. De øverste 4 cm av silicagelen ble fjernet og tilsatt til en oppløsning av 1,7 g urent AT 24 33 A i 200 ml av en blanding av 2 deler kloroform - 1 del methanol. Løsningsmidlet ble fordampet i vakuum på en rotasjonsfordamper. Det resulterende lysegule pulver ble oppslemmet i kloroform og pakket på nytt i kolonnen. Kolonnen ble ekvilibrert ved pumping av 300 ml kloroform mettet med ammoniumhydroxyd (1 volum% konsentrert ammoniumhydroxyd - 99% kloroform, nedre fase). Elueringen ble startet med en 2 liters lineær gradient av kloroform mettet med ammoniumhydroxyd (1 volum% konsentrert ammoniumhydroxyd tilsatt), og 40 fraksjoner ble oppsamlet ved en strømningshastighet på 21 ml/min. Elueringsmidlet ble overvåket ved 405 nm. Fraksjon 31-34 ble oppsamlet og fordampet til tørrhet i vakuum på en rotasjonsfordamper. Residuet ble oppløst i 50 ml av en blanding av 2 deler kloroform og 1 del methanol. Løsningen ble tilsatt meget langsomt til en hurtig omrørt "Skellysolve" B løsning (1700 ml). Det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering under dannelse av 697,5 mg homogent AT 24 33 A, en blanding av AT 24 33 A±og A2, fri for AT 2433 B±og B2-

D. Kolonnekromatografi av urent AT 24 33 B:

En Glenco kolonne med en indre diameter på 2,0 cm x

30 cm ble oppslemningspakket med 37 g Woelm silicagel (0,032-0,063 mm) i kloroform. De øverste 2 cm av silicagel ble fjernet og tilsatt til en løsning (50 ml) av 500 mg urent AT 2433 B, en blanding av AT 2433 B1og B2i en blanding av 2 deler kloroform og 1 del methanol. Løsningsmidlet ble fordampet i vakuum i en rotasjonsfordamper. Den lysegule impregnerte silicagel ble repakket i kolonnen under anvendelse av en kloroformoppslemning. Kolonnen ble ekvilibrert med kloroform mettet med konsentrert ammoniumhydroxyd (1 volum%). Elueringen startet med en 2 liters lineær gradient av kloroform mettet med ammoniumhydroxyd (1 volum% konsentrert ammoniumhydroxyd tilsatt), og 16 fraksjoner (ca. 100 ml hver) ble oppsamlet. Elueringsmidlet ble overvåket ved 405 nm. Følgende fraksjoner ble erholdt etter inspeksjon av kromatogrammet: fraksjon 1, 0 til 1218 ml; fraksjon 2, 1219 ml til 1746 ml; og fraksjon 3, 1765 ml til 2000 ml. Fraksjon 2 ble fordampet til tørrhet i vakuum i en rotasjonsfordamper. Residuet ble oppløst i 5 ml av en blanding av 2 deler kloroform og 1 del methanol. Løsningen ble tilsatt til 1 liter raskt omrørt "Skellysolve" B. Det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering under dannelse av 4 54 mg homogent AT 24 33 B, en blanding av AT 24 3 3 B^ og B2, fri for AT 2433 A^^ og A2.

Eksempel 3

O ppløsning av AT 2433 A-^ og A2:

A. En Glenco kolonne med en indre diameter på 2,65 cm og en høyde på 60 cm ble oppslemningspakket med Baker C-18 silicagel (octadecylsilan bundet til silicagel) (0,040 mm midlere partikkelstørrelse) i methanol. Kolonnen ble koblet til et LC-system av middels trykk og ble ekvilibrert med 600 ml av følgende elueringsmiddel: 4 deler acetonitril, 3 deler methanol og 3 deler 0,1 M ammoniumacetat. En prøve på 360 mg AT 2433 A erholdt fra eksempel 2C i 1 ml dimethylsulfoxyd ble trukket inn i prøveslyngen og pumpet på kolonnen med elueringsmiddel. Elueringen ble startet, og elueringsmidlet ble overvåket ved 405 nm og 4 35 nm. Ca. 50 ml<1>s fraksjoner ble oppsamlet ved en strømningshastighet på ca.

19 ml/min. Basert på elueringskromatogrammet ble frak-

sjon 12 - 16 oppsamlet under dannelse av fraksjon r, og fraksjon 17 - 24 ble oppsamlet under dannelse av fraksjon 2. Kromatografien ble gjentatt 4 ganger under anvendelse av friskt AT 2433 A (erholdt fra eksempel 2C) hver gang (for-

søk 2, 100 mg; forsøk 3, 167 mg; forsøk 4, 160 mg; og

forsøk 5, 188 mg). Fraksjon 1 fra hvert av de 5 forsøk ble oppsamlet og ekstrahert med 1000 ml kloroform. Ekstraktet (nedre fase) ble konsentrert til tørrhet under dannelse av urent AT 24 33 A,,. Fraksjon 2 fra hvert forsøk ble opp-arbeidet separat. De oppsamlede fraksjoner ble ekstrahert med 500 ml kloroform. Ekstraktet (nedre fase) ble konsentrert til tørrhet. Residuet ble oppløst i 2 ml av en blanding av 2 deler kloroform og 1 del methanol. Denne løsning ble tilsatt til 500 ml "Skellysolve" B under hurtig omrøring. Det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering under dannelse av AT 24 3 3 A^

B. Et Glenco rør med en indre diameter på 1,65 cm og en høyde på 60 cm ble oppslemningspakket med Baker C-18 silicagel i methanol. Kolonnen ble innført i LC-systemet ved middels trykk og ekvilibrert med elueringsmidlet (se ovenfor). Urent AT 2433 A-, fra eksempel 3A ble oppløst i 1 ml dimethylsulfoxyd. Løsningen ble trukket inn i en 15 cm prøveslynge og pumpet inn i kolonnen. Elueringen ble startet, og 50 ml<1>s fraksjoner ble oppsamlet. Elueringsmidlet ble overvåket ved 405 nm og 4 35 nm med ISCO UV-detektor. Basert på det resulterende kromatogram ble fraksjon 16-28 oppsamlet. De oppsamlede fraksjoner ble ekstrahert med 1000 ml kloroform. Den nedre fase (kloroform) ble separert og fordampet til tørrhet i vakuum på en rotasjonsfordamper. Residuet ble oppløst i 5 ml av en blanding av 2 deler kloroform og 1 del methanol. Denne løsning ble tilsatt til 500 ml "Skellysolve" B under hurtig omrøring. Det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering under dannelse av AT 2433 A,,.

Følgende fysikalske og kjemiske egenskaper for AT 24 33 A1og AT 2433 A2er oppført i tabell VII og VIII.

"*" H NMR 3 60 MHz kjernemagnetisk resonansspekter: observerte kjemiske skiftninger og mønsterbeskrivelse £„ ( dimethyl— sulfoxyd- d^): 10.64 (s, 1H, N5'-H), 9.27 (d, 1H, Cl-Hel. Cl'.-H), 9.18 (d, 1H, Cl'-Hel.Cl-H), 7.88 (d, 1H, C4'-H),

7.73 (m, 2H, C3-H og C3'-H), 7.49 (m, 2H, C2-H og

C2'H), 6.91, (d, 1H, Cl"-H), 5.48 (brs, 1H, C3"-0H_), 5.13 (m, 1H, Cl"'-H), 5.06 (brs, 1H, C2"-0H_) , 4.81 (brs, 1H, C3" '-0H_), 4.21 (brd, 1H, C6a"-H), 4.08 (brd, 1H, C5"-H), 3.99 (dd, 1H, C6b"-H), 3.77 (dd, 1H, C3"'- H), 3.60-3.70

(m, 6H, C2"-H, C3"-H, C4"-H, C5a"•-H,C5b"'-H), 3.68 . (s, 3H,C4-H"-0C<H>3), 3.40 (m, 1H, C4"'-H overlapper med H^O) , 3.25 (s, 3H, N8-CH3), 2.30 (m, 2H, C4"'-NH_, C2"'-H), 2.22 (s, 3H, C4",-NCH3), 1.78 (m, 1H, C2b"'-H).

13

C NMR 90 MHz kjernemagnetisk resonansspekter; observerte kjemiske skiftninger og tilskrivelser 8 ^ ( dimethyl-s ulfoxyd- d^):

Massespekter (CI-MS-CH4) :M/Z = 679 [M+l ] +

~*" H NMR 360 MHz kjernemagnetisk resonansspekter: observerte kjemiske skiftninger og mønsterbeskrivelse &„ n ( dimethyl-sulfoxvd- d^-) : 10.64 (s, 1H, N5'-H), 9.27 (d, 1H, Cl-Hel. Cl<1->H), 9.18 (d, 1H, Cl'-H el. Cl-H), 7.88 (d, 1H, C4'-H),

7.33 (m, 2H, C3-H og C3'-H), 7.49 (m, 2H, C2-H og C2'-H) , 6.91, (d, 1H, Cl<n->H), 5.48 (brs, 1H,

C3"-0H_), 5.14 (m, 1H, Cl"'-H), 5.06 (brs, 1H, C2"-0_>, 4.81 (brs, 1H, C3"'-0j_) 4.21 (brd, 1H, C6a"-H), 4.08

(brd, 1H, C5"-H), 3.99 (dd, 1H, C6b"-H), 3.68 (s, 3H,C4"-OCH3), 3.72-3.30 (m, 7H, C2"-H, C3"-H, C4"-H, C3'<*>'-H, C4"'-H, C5a" ' -H,C5b" '-H overlap<p>er med j^O) , 3.25 (s, 3H, N8-CJ13), 2.55 (m, 2H, C4"'-N<H>2)»2.32 (m, 1H, C2a"'-H), 1.73 (m, 1H, C2b"'-H).

Massespekter: Felt-desorpsjonsmålinger ved høy og lav opp-løsning :

FD-LR-MS: m/z 664 [M]<+>

m/z 687 [M+Na]<+>

FD-HR-MS: m/z 664,1795 observert,

664,1936 forventet for C33H33<C>lN4Og

Eksempel 4

Oppløsning av AT 2433 og :

En Glenco-kolonne med indre diameter på 2,65 cm og en høyde på 60 cm ble oppslemningspakket med Baker C-18 silicagel (0,040 mm midlere partikkelstørrelse) i methanol. Kolonnen ble innført i LC system ved middels trykk og ble ekvilibrert med 600 ml av følgende elueringsmiddel: 3 deler acetonitril, 3 deler methanol og 4 deler 0,1 M ammoniumacetat. En prøve på 360 mg AT 24 3 3 B erholdt fra eksempel 2D i 2 ml dimethylsulfoxyd ble trukket inn i prøveslyngen og pumpet på kolonnen med elueringsmidlet. Elueringen ble startet, og elueringsmidlet ble overvåket ved 405 nm og 4 35 nm med ISCO UV detektor, og 50 ml1 s fraksjoner ble oppsamlet. 5yUl's aliquoter av fraksjonene 14 - 19 ble undersøkt ved hplc under anvendelse av en^u-"Bondapak" C-18 kolonne og et elueringsmiddel av 4 deler acetonitril, 3 deler methanol og 3 deler 0,1 M ammoniumacetat. Fraksjonene 14 - 16 ble oppsamlet og ekstrahert med 500 ml kloroform. Den nedre fase (kloroform) ble separert og konsentrert til tørrhet under dannelse av AT 2433 B2- Fraksjon 17 - 24 ble oppsamlet og ekstrahert med 500 ml kloroform. Den nedre fase (kloroform) ble fraskilt og konsentrert til tørrhet under dannelse av urent AT 2433 B^. Det urene AT 2433 B.^ble rekromatograf ert og isolert som ovenfor beskrevet under dannelse av ca. 180 mg rent AT 2433 B1.

De fysikalske og kjemiske egenskaper for AT 2433 B^og B2er oppført i tabell IX og X.

H NMR 360 MHz kjernemagnetisk resonansspekter: observerte kjemiske skiftninger og mønsterbeskrivelse&( dimethyl-sulf oxyd- d^) : 10.50 (brs, 1H, N5'-H), 9.32 (d, 1H, Cl-H el. Cl'-H), 9.21 (d, 1H, Cl'-H el. Cl-H), 8.14 (d, 1H, C4-H), 7.86 (d, 1H, C4'-H), 7.68 (m, 2H, C3-H og C3'-H), 7.48

(m, 2H, C2-H og C2'-H), 6.44, (d, 1H, Cl'-H), 5.6-4.6

(br. m, 4H, C3"-0H_, Cl"'-H, C2"-0H_, C3"-0H_), 4.3-3.2 (m, 10H, C2"-H, C3"-H, C4"-H, C5"-H, C6a"-H, C6b"-H, C3'"-H, C4"'-H, C5a"'-H, C5b" *-H), 3.68 (s, 3H, C4"-0CH3), 3.25

(s, 3H, N8-CH3), 2.35 (m, 1H, C4,,t-t_), 2.30 (s,3H,C4'1'-NCH^), 2.03 (m, 1H, C2a"'-H), 1.60 (m, 1H, C2b"'-H).

13

C NMR 90 MHz kTermemagnetisk resonansspekter: $ c( dimethylsulfoxyd- d^)

observerte kjemiske skiftninger ( PPM):

169.6, 169.5, 140.5, 139.5, 127.4, 127.2, 127.0, 126.7, 124.5, 124.3, 124.2, 120.9, 120.3, 114.7, 111.7, 97.8, 86.5, 79.1, 76.2, 76.0, 71.1, 66.3, 65.7, 61.9, 60.3, 60.0, 38.0, 23.6.

Massespekter: Kjemisk ionisering-CH4 : m/z = 64 5, [M+l] +

Felt-desporpsjonsmålinger ved høy og lav

oppløsning

LR-MS: m/z =644, [M]<+>

m/z = 667, [M+Na]<+>

HR-MS: m/z = 6 44,2401 observert,

644 , 2476 forventet for C,.H<.rN.>0o34 36 4 9

"*" H NMR 360 MHz kjernemagnetisk resonansspekter:

observerte kjemiske skiftninger ( PPM) og mønsterbeskrivelse SIt ( dimethylsulfoxyd- d^: 10.50 (brs, 1H,N5'-H), 9.32 (d, 1H, Cl-H el. Cl'-H), 9.21 (d, 1H, Cl'-H el Cl-H), 8.14 (d, 1H, C4-H),

7.86 (d, 1H, C4'-H), 7.68 (m, 2H, C3-H og C3'-H), 7.48

(m, 2H, C2-H og C2'-H), 6.44 (d, 1H, Cl'-H), 5.6-4.6

(br. m, C3"-0H_, Cl'"-H, C2"-0H_, C3"-0J_), 4.3-3.2 (m, 10H, C2"-H, C3"-H, C4"-H, C5"-H, C6a"-H, C6b"-H, C3"'-H, C4"'-

H, C5a",-H,/C5b"'-H), 3.68 (s, 3H,C4"-OCH3), 3.25 (s,

3H, N8-CH3), 2.55 (m,2H,C4'<1>'-NH_), 2.03 (m, 1H, C2a"'-

H), 1.60 (m, 1H, C2b"'-H).

Massespekter: Felt-desorpsjonsmålinger med lav og høy oppløs-ning:

LR-MS: m/z =6 30 [M]<+>

m/z = 653 [M+Na]+

HR-MS: m/z = 630,2224 observert,

630,2316 forventet for C33H34<N>4°9

Claims

1. Forbindelse av formel I

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at (a) X er Cl og R er CH^, betegnet som AT 2433 A.^, hvilken forbindelse i sin amorfe, faste form har hovedsakelig de fysikalske karakteristika som er angitt i tabell VII, eller (b) X er Cl og R er H, betegnet som AT 24 33 A2 , hvilken forbindelse i sin amorfe, faste form har hovedsakelig de fysikalske karakteristika som er angitt i tabell VIII, eller (c) X er H og R er CH^ , betegnet som AT 2433 B1 , hvilken forbindelse i sin amorfe, faste form har hovedsakelig de fysikalske karakteristika som er angitt i tabell IX, eller (d) X er H og R er H, betegnet som AT 2433 B2 , hvilken forbindelse i sin amorfe, faste form hovedsakelig har de fysikalske karakter istika som er angitt i tabell X, eller (e) AT 2433 kompleks omfattende de fire forbindelser (a) til (d) eller (f) en blanding omfattende AT 2433 A1 og AT 2433 A2 eller (g) en blanding omfattende AT 2433 B1 og AT 2433 B2 , og farma-søytisk akseptable salter derav.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, som kan erholdes fra fermentering av Actinomadura melliaura ATCC 39691, og farmasøytisk akseptable salter derav.

4. Forbindelse og farmasøytisk akseptable salter derav ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 3, for anvendelse ved behandling av en ondartet tumor i et pattedyr.

5. Forbindelse og farmasøytisk akseptable salter derav ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 3, for anvendelse ved behandling av bakterielle infeksjoner.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 3 og farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at en stamme av Actinomadura melliaura som er i stand til å produsere slike forbindelser, dyrkes i et vandig næringsmedium inntil hovedsakelig antibakteriell aktivitet er overført dertil, og at minst én av forbindelsene definert ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 3, isoleres som sådan eller i form av et farmasøytisk akseptabelt salt.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at Actinomadura melliaura ATCC 39691 eller en mutant derav, dyrkes.

8. Forbindelse erholdt ved fremgangsmåten ifølge krav 6 eller 7.

9. Farmasøytiske preparater inneholdende som aktiv bestanddel minst én forbindelse ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 3 og 8, sammen med en farmasøytisk bærer eller eksipient.

10. Biologisk ren kultur av mikroorganismen Actinomadura melliaura med identifiseringskarakteristikaene ATCC 39691, hvilken kultur er i stand til å produsere en forbindelse definert ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 3 i gjen-vinnbar mengde ved fermentering under aerobe betingelser i et vandig næringsmedium.