NO157314B - Fremgangsmaate og apparat for identifisering og opptelling av spesifiserte blodcelle-undergrupper. . - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å identifisere og telle celler i en bestemt undergruppe med lymfocytter eller andre celletyper i blodet av den art som angitt i innledningen til krav 1, og videre angår oppfinnelsen et appparat for identifisering og opptelling av spesifiserte T-lymfocytter eller andre blodcelletyper av den art som angitt i innledningen til krav 9.

Lymfocyttbestanden i blod er definert av et antall underklasser som spiller en avgjørende rolle ved immunreaksjon. For eksempel vil det relative antallet med lymfocytter i forskjellige undergrupper sannsynligvis forandre seg ved sykdom. Opptellingen og identifikasjonen av celler i de forskjellige underklassene gir da en indikasjon ikke bare på blodets konsistens, men i alminnelighet også1 den relative tilstanden til organismen.

Det er kjent at i det minste flere undergrupper med funksjonsmessig klare lymfocytter kan bli identifisert på basis av antigeniske bestemmelser på celleoverflaten. Især har det forekommet en betraktelig akademisk og klinisk interesse for T-lymfocytter. T-lymfocyttene er karakterisert ved spesielt, identifiserbare antigeniske bestemmelser på deres overflate, som adskiller cellene til den undergruppen fra andre blodceller og fra cellene til andre lymfocyttundergrupper. Da interessen er stor for identifisering og produsering av reagenter som innbefatter antilegemer, som er selektivt reaktive med de lymfocyttunderklassene som er av interesse.

Det skal bemerkes at det er to prinsipielle grupper med lymfocytter involvert i immunsystemet til mennesker og dyr. Det første av disse (thymus-avdelt celle eller T-celle) differensieres i thymus fra hæmooooooopoitiske stammeceller, mens innenfor thymusen er differensieringscellene kalt "thymocytter". De utviklede T-cellene unnslipper fra thymusen og sirkulerer mellom vevet, lymfekarene og blodstrømmen. Disse T-cellene utgjør en stor andel av mengden med resirku-lasjonen av små lymfocytter. De har Immunologisk særegenhet og er direkte involvert i celleformidlende immunreaksjoner (slik som podningsavvisning) som effektorceller. På tross av at T-cellene Ikke utskiller humoralantlstoffer er de noen ganger nødvendige for utskillelsen av disse antistoffene fra den andre gruppen med lymfocytter beskrevet nedenfor.Noen av T-cellene utgjør en reguleringsfunksjon i annet henseende ved immunsystemet. Mekanismen til denne prosessen med cellesam-virkning er til nå ikke fullstendig forstått.

Den andre gruppen med lymfocytter (benmargavledende celler eller B-celler) er de som utskiller antistoff. De er ogoså utviklet av hemopoitiske stammeceller, men deres differensi-ering er ikke bestemt av thymus. Hos fugler blir de differen-siert i et organ analogt til thymusen, kalt Bursa fabricii. Hos pattedyr er det Imidlertid ikke blitt oppdaget noe ekvivalent organ og man antar at disse T-cellene differensieres inne i benmargen.

Man har nå oppdaget at T-cellene blir delt i det minste i flere undertyper, såkalt "hjelpe", "supressor", og "dreper"-T-celler, som har funksjonen med henholdsvis å fremme reaksjon,* undertrykke en reaksjon, eller drepe (lyse) fremmede celler. Disse underklassene er vel forståtte for musefamiliesystemer, men de har kun nylig blitt beskrevet for menneskelige systemer. Se for eksempel, R.L. Evans, et al., Journal of Experimental Medicine, Volum 145, 221-232, 1977; og L. Chess og S.F. Schlossman "Functional Analysis of Distinct Human T Cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", i "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, Editor, Plenum Press, 1977, Volume 7, 363-379.

Muligheten for å identifisere eller undertrykke grupper eller undergrupper med T-celler er viktig for diagnoser eller behandling av forskjellige immunregulerende sykdommer eller tilstander.

F.eks. har visse leukemier og lymfomer differerende prognoser avhengig av om deres opprinnelse er B-celler eller T-celler. Vurderingen av sykdomsprognosen avhenger således av et skille mellom disse to lymfocyttgruppene. Se, f.eks. A.C. Aisenberg og J.C. Long, "The American Journal of Medicine", 58:300 (Mars, 1975); D. Belpomme, et al., "immunologlcal Diagnosis of Leukemias and Lymphomas, S. Thierf leider, et al., eds. Springer, Heidelberg, 1977, 33-45; and D. Belpomme, et el., British Journal of Haematology, 1978, 38, 85. Visse sykdoms-stadier (f.eks. juvenile rheumatoid arthritis og visse leukemier) er forbundet med ubalanse i T-celle-undergruppene. Det er blitt antydet at autoimmune sykdommer i alminnelighet er forbundet med et overskudd av "hjelpe"-T-celler eller et underskudd på visse "suppressor"-T-celler, mens ondartetheter i alminnelighet er forbundet med et overskudd med "suppres-sor"-T-celler. Ved visse leukemier blir det produsert for mye T-celler i et bremsestadium av utviklingen. Diagnoser kan således avhenge av muligheten av å detektere denne ubalansen eller overskuddet, Jfr. f.eks. J. Kersey, et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" i Haematology and Blood Transfusion, Volum 20, Springerforlag, 1977, 17-24, og referanser deri.

I det siste har monoklonal antistoffteknikk blitt benyttet for å frembringe store mengder med antistoff av høy renhet til de forskjellige lymfocyttunderklassene. Ved benyttelsen av slike antistoffer har det vist seg mulig å undersøke et individs lymfocytter for å bestemme det relative antallet med celler i forskjellige underklasser. Ved benyttelse av direkte eller indirekte teknikk kan antistoffene bli fluorescerende merket, og dermed analysere prøvene ved hjelp av en strøm-ningscytometrisk analyse.

Vanlig immunfluorercerings-teknikk innbefatter nå fysikalsk isolasjon av lymfocytter fra andre elukocytter som et Innledende trinn. Dette trinnet eliminerer muligheten for at ikke-spesifikt fargede monocytter eller granulocytter kan bli telt som spesifikt fargede lymfocytter. Dette første lymfocytt-isolasjonstrinnet er langt og vanskelig, i virkeligheten er det mye lengre enn de relativt enkle trinnene med farging eller analysering av lymfocyttene. På kliniske områder hvor det er ønskelig med hurtige, gjeentagende analyser, er nødvendigheten av å isolere lymfocytter fra andre leukocytter en uoversiktelig hindring. Også for de undersøkelsesanvendel-ser hvor tid er av en mindre betydning, utgjør første lymfocytt-Isolasjonstrinnet risikoen for tap av noen lymfocytter i løpet av fjerningen av monocytter og granulocytter, noe som gir usikkerhet og unøyaktighet ved den påfølgende analysen. Følgelig vil feil ved den fullstendige elimi-neringen av andre blodceller fra lymfocyttene som skal bli isolert, gi betydelig risiko for feil, og tilstedeværelsen av slike andre celler kan forårsake feil i påfølgende analyser .

En hensikt med foreliggende oppfinnelse er å frembringe en fremgangsmåte og apparat for identifisering og opptelling av spesifikke underklasser av lymfocytter, mens man unngår nødvendigheten av tidligere adskillelse av lymfocyttene fra andre blodceller. Det er videre et trekk ved foreliggende oppfinnelse å frembringe en slik fremgangsmåte og apparat for andre t^per blodceller med lignende antigenetiske karakteris-tika.

Det er videre en annen hensikt med foreliggende oppfinnelse å frembringe en fremgangsmåte og apparat som er betraktelig hurtigere enn tidligere kjente teknikker, og som i det vesentlige hindrer feilanalyser i forbindelse med uønskede, overflødige data fra andre celler eller tap av data ved tap av lymfocytter fra prøven. Dessuten er det videre en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe slike fremgangsmåter og apparater hvor hastigheten og den relative enkel-heten gir lymfocyttunderklasse-identifiseringen og opptellingen et levedyktig klinisk instrument.

Ovenfornevnte tilveiebringes ved hjelp av en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art hvis karakteristiske trekk fremgår av krav 1, samt ved hjelp av et apparat av den innledningsvis nevnte art hvis karakteristiske trekk fremgår av krav 9.

Ytterligere trekk ved oppfinnelsen fremgår av de øvrige kravene.

Foreliggende oppfinnelse utgjør utvelgelsesmodifIkasjoner ved vanlige strømningscyto-fluorometriske apparater med hensyn til optikk og signalbehandlingen, hvor selektivt immun-fluorescerende flekker (direkte eller indirekte) til underklassen som er av interesse kan bli benyttet, og hele blodprøven (enten den brungule delen eller det antikoagulerte fullblodet) blir analysert med en celle om gangen.

En av de rettvinkelfluooorescerings-kanalene til et strøm-ningscyto-f luormeterapparat kan være tilpasset til å virke som en spesifisert bølgelengdeføler for rettvinkelspredning. En fullblodprøve eller brungul del blir inkubert for å tillate spesifikke antigener på overflaten til lymfocyttene til den underklassen som er av interesse må bli kombinert med et antistoff som har en forutbestemt fluorescerende reaksjon på gitt belysning (dvs. fokusert koherent lys fra en argonlaser), idet undergruppeceller som er av interesse blir fluorescerende som følge av et sådant innfallende lys. Cellene til prøven blir så ført gjennom en strømningskanal til et strømningscytometer som har kapasitet til å overvåke fremoverspredt lys såvel som til rettvinklet-spredt lys og fluorescererlng. Visse fremoverspredningstilstander, når tilstede, blir benyttet i sammenheng med rettvinkellys spredningstilstander for å innføre detektert fluorescering. Ved detektering av spesiell fluorescering til en gitt farge (f.eks. grønt) vil et utgangssignal bli frembragt for å indikere forekomsten av en lymfocytt til en gitt underklasse. Disse data kan bli passende lagret og/eller fremvist (f.eks. i en eller annen form for histogram). Videre kan i og for seg kjent cellesorteringsteknikk bli benyttet for fysikalsk å isolere lymfocyttcellene i den gitte underklassen.

Oppfinnelsen skal nå beskrives nærmere med henvisning til tegningene, hvor: Fig. 1 viser en stilisert utførelse av et kommersielt

tilgjengelig cytofluorrrometerapparat,

fig. 2 viser et skjematisk diagram av et signalbehand-1 ingsapparat, idet apparatene av den type vist

på fig. 1 kan bli benyttet i forbindelse med prinsippene ved foreliggende oppfinnelse, for å identifisere og opptelle spesifiserte lymfocyttundergrupper, og

fig. 3A

til 3F viser histogrammer som viser anvendelsen av

prinsippene ved foreliggende oppfinnelse.

Fig. 1 viser skjematisk funksjonen og konstruksjonen av apparatet som kan bli benyttet sammen med prinsippene ved foreliggende oppfinnelse. Apparatet vist på fig. 1 er i virkeligheten en spesiell enhet tilgjengelig kommersielt under handelsbetegnnelsen "Cytofluorograph", som blir solgt av "Ortho Instruments, 410 University Avenue, Westwood, Massachusetts 02090". Apparatet på fig. 1 inneholder innretninger for strømningscytometri for celleanalyser og innbefatter innretninger for å avføle cellefluoresceringsreaksjonen for spesielle typer belysning.

Brennpunktet til apparatet på fig. 1 er en strømningskanal 106, hvor celler i væskesuspensjonen blir ført i en rekke og med en hurtig hastighet (2500 celler pr. sek.) gjennom en avfølingssone. Avfølingssonen blir definert av den innbyrdes skjæringen av cellestrømmen og en innfallende lysstråle, som er fokusert koherent lys fra en gasslaser. Når cellene føres gjennom avfølingssonen samvirker den med innfallende lys på forskjellige måter. Noe lys blir naturligvis absorbert av cellen, annet lys blir spredt med en relativt liten vinkel i forhold til aksen til det innfallende lyset, og enda et annet lys blir spredt med en vinkel totalt avvikende fra aksen til det innfallende lyset f.eks. med en rett vinkel på det innfallende lyset. Dessuten, avhengig av selve cellen og enhver farging eller flekking som cellen tidligere har blitt utsatt for kan fluorescerende emisjon forekomme.

Fotofølere plassert med forskjellige orienteringer med hensyn til cellestrømmen og innfallende laserlys, tillater detektering av et uvanlig sett memd reaksjoner for hver gitt celletype. Fig. 1 innbefatter således en argonionlaser 101 og en helium neonlaser 102 med utsendt koherent 4 lys, som blir forskjellig avbøyd via speiler 103 og 104 og en linse 105 til avfølingssonen til strømningskanalen 106. Som i og for seg kjent blir celleprøvestrømmen ført laminært i strømmende vøskeomhylling for å sikre at kun en enkel celle ville bli belyst i avfølingssonen til et gitt tidspunkt. Da hver celle blir belyst av lys fra linsen, kan reaksjon mellom cellen og lyset bli avfølt.

Som vist på fig. 1 detekterer en slukkefølger 108 mengden av lys blokkert av cellen, og lys med spredning fremover blir detektert av fotoføleren 109 og 110 i en tilnærmet kjegleformet vinkel med halvvinkel 20°. Elektriske signaler frembragt av føleren 108, 109 og 110 blir koblet med forsterkeren 120 og 121, som frembringer elektriske signaler med egnet amplitude og lignende for påfølgende analyse og/eller fremvisning.

Ved apparatet på fig. 1 blir lys utsendt fra cellen på grunn av en fluorescerende reaksjon avfølt ved rette vinkler både i cellestrømningsretningen og i forhold til aksen til innfallende lys. Et kurveformet speil 125 og en kondensatorlinse 107 samler dette lyset tilnærmet i en kjegleformet halvvinkel på 20° og fører dette lyset gjennom åpning 111 og derpå til et dikroisk speil 112 og til et andre speil 113. Et første fargefilter 114 (dvs. for gjennorns11pping av lys med relativt lang bølgelengde), fører valgt lys fra den dikroiske speilen 112 til fotoføleren 117 (dvs. et fotomultiplikatorrør). Et andre filter 115 slipper gjennom selektivt lys av en forskjellig farge (dvs. lys med relativt kort bølgelengde) fra den andre speilen 113 til den andre fotoføleren 116. Elektriske signaler fra føleren 116 og 117, i form av pulser korresponderende med lys fra respektive celler, blir tilført forsterkeren 118 og 119 som derved frembringer signaler som er tilpasset for passende behandling.

Som vist ved utførelsesformen på<*> fig. 1 frembringer en følervelger 122 utgangshistogrammer som benytter signaler fra forsterkerene 118 til 121. En brukbar form for utgangssig-naler f.eks. et amplitudepunkt med rød fluorescens fra føleren 117 opp mot amplituden til grønn fluorescens av føleren 116. Et slikt histogram er vist ved fremvisningsinn-retningen 123 hvor hvert punkt på histogrammet representerer en individuell celle. Grupper eller samlinger av indikatorer på histogrammet representerer gruppen celler av lignende type. Det er innlysende at fagmannen på området av og til finner det nyttig å frembringe histogrammer med liten fremoverrettet vinkelspredning i forhold til intensiteten til aksial lysslukning, og så bortetter.

I forbindelse med kjent anvendelse av apparatet på fig. 1 er den såkalte første fluorescerende kanalen 119 fra føleren 117 under visse omstendigheter nyttig for å detektere bredvinkel-spredning, mens den prinsipielt blir benyttet for å måle fluorescer ingens lange bølgelengder. Slik som tilfellet er ved foreliggende oppfinnelse overfor å fremheve denne faktoren er det foretrukket at den vanlige rødfilterblokken 114 skal bli erstattet av filter bestemt for dirigering av blått laserlys til føleren 117 fra laseren 101, hvis lys blir spredt med rette vinkler i forhold til det innfallende lys i aksen fra linsen 105. Tilpasningen til konstruksjonspara-meterne til fotomultiplikatoren 117 og forsterkeren 119 kan være tilsvarende nødvendig for å frembringe signaler med egnede karakteristikker for påfølgende behandlinger.

Fig. 2 viser et blokkdiagram av foretrukket signalbehand-lingslnnretning ifølge prinsippene ved foreliggende oppfinnelse. Apparatet skal nå bil beskrevet nærmere ved hjelp av den følgende teoretiske og fremgangsmåtetrekkene ved foreliggende oppfinnelse.

Viktig preparering av blodprøvene ifølge foreliggende oppfinnelse utgjør i det vesentlige inkubasjon av prøven med et antistoff til undergruppen som er av interesse, som har den nødvendige karakteristikken med utsendt* fluorescerende lys ved belysning av innfallende laserlys. Ved en metode blir fullblod fra vanlige menneskelige givere antikoagulert (f.eks. med EDTA) , sentrifugert og den brungule delen (belegget) blir isolert. Alternativt blir antikoagulerte fuullblod benyttet. Inkubasjonen med egnet antistoff blir fullført hvoretter røde celler blir lyserte fra prøven på vanlig måte. Under antagelse at begynnelsesantistoffet var riktig fluorescerende aktiv er prøven deretter klar for fortynning og strømningscytofluorometrisk analyse. I tilfelle at en indirekte immunofluorescensflekking er involvert, blir en andre inkubasjon utført med et andre antistoff, til det første antistoffet, som på sin side har de nødvendige fluorescerings-karakteristikkene.

Når prøven er ført gjennom strømningskanalen og belyst, blir de optiske p&rametrene til slukking, fremoverlysspredningen, rettvinkelspreednlngen og fluorescerlngen samtidig detektert, men fra signalbehandlingsstandpunktet blir betydningen av de forskjellige parametrene tatt hensyn til med en relativ prioritet. Det vil si, både den fremovergående smale vinkel-pulsen (valgfritt, men ikke nødvendigvis også innbefattende slukkesignalet), og den rette vinkelspredningspulsen må være innenfor respektive område for at bruken av grønn fluorescerende signal skal bil utløst. Deretter, etter korrigering for uekte fluorescerende emansjon fra ukombinerte antistoffer e.l., indikerer tilstedeværelsen av en grønn fluorescerende puls tilstedeværelsen av en lymfocyttcelle 1 den spesifiserte undergruppen. Denne metoden virker på grunn av at "vinduet" for fremover spredning virker som utskilling av leukocytter fra blodplater, især lyserte røde celler og uekte rester i oppløsningen og "vinduet" med hensyn til rettvinkelspred-ningen adskiller lymfocytter fra monocytter og granulocytter. Detekteringen av en celle som har liten vinkelspredning og rett vinkel spredningspulser innenfor de respektive vinduene korresponderer derved effektivt med detekteringen av tilstedeværelsen til en lymfocytt.

Den primære indikasjonen på ønsket undergruppe med lymfocytt er fluorescensen til en spesiell farge. Dersom prøven innbefatter uekte indikatorer vil det naturligvis være nødvendig å ta hensyn til virkningen av slike indikatorer. En slik indikator Innbefatter fluorescerende molekyler i oppløsningen, som kan bli eliminert ved å vaske prøven før strømningscytometrianalysen. En annen gruppe med uekte indikatorer blir frembragt av ikke-spesifisert binding av fluorescerende antistoffer med celler. En mulighet for hver av indikatortypene (eller begge) er å ha for hånden et kontrollmateriale, som utgjør virkningen av uekte eller kunstige fluorescerende data. En annen mulighet er å ha for hånden i instrumentet data som korresponderer med reaksjonen på slik kontroll. En virkelig avlesning kan bil oppnådd ved kompensering av de aktuelle detekterte prøvesignalene ved innføring av kontrollfaktor, eksempelvis ved å kombinere (dvs. subtraksjon eller avhylling) reaksjonen til styringen med det faktiske portførte fluorescerende signal. På lignende måte kan kontrollprøver eller kontrolldata bli benyttet for å korrigere et utall tilstander som kan bli detektert.

Fig. 2 viser et funksjonsblokkdiagram som viser prosedyren ved foreliggende oppfinnelse. På fig. 2 er et foroverspredt referanse-"vindu" betegnet med 201 og et rett vinkel referanse "vindu" med 204. Disse referanseverdiene kan bli opprettholdt så enkelt som ved et fast eller justerbart potensiometer, eller ved hjelp av en omhyggelig utarbeidet og esoterlsk måte som lagret programkontroll som tar hensyn til de forskjellige omgivelsesfaktorene, variabler tilknyttet med prosesstypen eller prosessmengden involvert i blodet som er blitt prøvet eller lignende. I et hvert tilfelle definerer "vinduene" henholdsvis 201 og 204 ampiitudeområdene hvor korresponderende fremoverspredt eller rettvinklede spred-ningspulsene definerer mulige leukocytter. Fremoverspredt pulssignal 202 slik som kan bil frembragt av forsterkeren 120 på fig. 1 fra smalvinkelfotoføleren 109 og 110 er forbundet med en komparator 203 som frembringer et åprjingssignal til OG-porten 207 når den tilknyttede pulsen ved 202 faller innenfor vinduet definert ved 201. Det rettvinklede spred-ningspulssignalet ved 205 er på lignende måte koblet til ennå en annen komparator 206, idet dens andre inngang er utført med referanse "vindu" for rettvinklet spredning fra 204. Når den rettvinklede sprednlngspulsen ved 205 faller Innenfor rettcinklingsspredningsvinduet blir et åpningssignal ført fra komparatoren 206 til OG-porten 207. Ved koinsidens for forekomsten av en fremoverspredt puls innenfor det fremover-spredte referansevinduet og e'n rettvinklet puls innenfor det rettvinklede spredningsvinduet da muliggjør OG-porten 207 en bestemmelse ved 208 som hjelper til med identifiseringen av forekomsten av en grønn fluorescerende puls fra grønnfluores-ceringskanalen 209 (dvs. for forsterkeren 118 til apparatet på fig. 1).

En pulsanalysator 211 kompenserer av og til data fra grønn-fluoresceringskanalen og frembringer egnet fremvisning og utgangsdatasignal. Som tidligere nevnt kan kompensasjonen være så enkel som subtraksjon av en viss intensitetsmengde på grunn av uekte men forutsatte fluorescerende signaler, eller kan være så omhyggelig utarbeidet som frembringelsen av data ved tidligere eller påfølgende analyse av en kontrollprøve. Pulshøydeanalysen ved 211 innbefatter egnet forsterkning, filtrering og signalbehandling i samsvar med vanlig utførel-se, slik som er velkjent for fagmannen på området. Fremvis-ningen eller frembringelsen av utgangsdata ved 212 Innbefatter frembringelse av egnede histogrammer e.l. som også innenfor det som er vanlig kjent for fagmannen på området.

Uttrykket "fluorescerende reaksjonsantistoff" er her benyttet for antistoffer som selv fluorescerer eller antistoff som er merkede til å fluorescere ved spesiell påvirkning.

Den viste skjematiske anordningen på fig. 2 er kun ment som en funksjonsmessig visning av prinsippene ved foreeliggende oppfinnelse, og det er klart at et utall alternative måter er mulig innenfor oppfinnelsens ramme for fagmannen på området. Det er også kun utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse som er beskrevet i sammenheng med fremgangsmåten av apparatet, og det er således klart at et utall alternativer er mulig for fagmannen på området uten at disse vil avvike fra hva som er hensikten og tanken med foreliggende oppfinnelse.

Eksempel

Materialer og fremgangsmåter:

A. Cellebehandling.

Fullblod fra vanlige menneskelige givere ble antikoagulert med EDTA. Den brungule delen ble fjernet og konsentrasjonen med leukocytter i den brungule delen ble bestemt. Prosentdelen med lymfocytter ble vurdert ved hjelp av e4n modifisert Cytofluorograph (Ortho Instruments, Westwood, MA) som beskrevet under. Dersom lymfocyttkonsentrasjonen var større enn 10 000/mm<5> ble den brungule delen fortynnet med fosfat-buffert saltoppløsning, (dvs. "PBS") (Dulbeco) til en konsentrasjon på 10 000 lymfocytter/mm5 .

B. Indirekte Immunofluorescerende flekking.

100 pl med brungul del ble inkubert med 100 pl med egnet fortynnet monoklonalt antistoff (muse-antilymfocyttunder-gruppe) ved 4'C for 30 min. Ved slutten av denne inkubasjonen

ble cellene behandlet med 2-4 ml med bufferert, isotonisk ammoniumklorid (NH4CI 16,58 g/l, dinatrium EDTA, 0,074 g/l, kalium bikarbonat 2,00 g/l, pH=7,3). Etter fem minutter hadde de røde cellene blitt lysert, og suspensjonen ble sentrifugert ved 200 x G i fem minutter. Overstående væske ble fjernet og pellet inneholdende leukocytter og blodplaterester og røde cellerester ble vasket med en gang 1 PBS. Pelleten ble lett dispergert og inkubert ved 4°C i 30 minutter med 100 pl av en 40:1 fortynning med fluorescert geit-anti-mus 7S (Meloy Laboratories, Springfield, VA), F/p = 2,5. Etter denne inkubasjonen og en valgfri ytterligere vasking med PBS ble cellene oppløst til et endelig volum avn 1 ml. og er klart for analyse i strømningscytometeret.

C. Strømningscytometrisk analyse.

En Cytofluorograph FC200/4800A (Ortho Instrumenter, Westwood, MA) blir benyttet samtidig for å måle fremover og rettvinklede lysspredning og den grønnfluorescerende fluoresceringen til hver celle i prøven. Instrumentene ble modifisert ved å erstatte "rødt" filteret blokkert med filtre egnet for dirigering av blått laserlys spredt med rette vinkler i forhold til den innfallende strålen i fotomultiplikatoren i alminnelighet nyttet til å detektere rød fluorescering. Grønnfilterblokken inneholdt et FITC-filter. Rettvinklet spredt signal sammen med vanlig tilgjengelig fremoverspredt signal ble fremvist som et cytogram på 4800A analysator. Ved bruk av kontrollen på instrumentet ble en bortført puls frembragt for cellene som har spesielle kombinasjoner av fremover og rettvinklet og spredt lys. De grønnfluorescerende pulsene ble elektrisk integrert av en separat modul i tillegg til 4800A og integrerte fluorescerende pulser ble opptegnet på en pulshøydeanalysator (Modell 2102, Ortho Instruments, Westwood, MA). Ved bruk av den bortførte pulsen fra 4800A var det mulig å opptegne fluorescerende pulser fra kun de celler med spesielle lysspredningsegenskaper.

D. Resultater.

Frémgangsmåten for leukocyttidentifikasjon er vist på cytogrammene på fig. 3A og 3B. Uttrykket "cytogram" som benyttes her, er en fremvisning av data hvor hvert punkt representerer en enkel celle, og plasseringen av punktet er gitt av koordinater som er proporsjonale med valgte para-metre, f.eks. rettvinklet og fremoverspredt lys-intensiteter frembragt av cellen i Cytofluorographen. Prøven på flg. 3A var fullblod oppløst med ammoniumklorid-lysert reagens. Fire grupper eller punkter eller celler kan bli adskilt. Gruppen 1 er på grunn av samlinger eller flere blodplater og røde cellerester. Gruppene 2-4 er fremkommet på grunn av henholdsvis lymfocytter, monocytter og granulocytter. Identifiseringen av leukocyttgruppene er basert på sammenligningen av det relative antallet I hver gruppe med manuell differensiell leukocytt-telling. Lignende grupper ble observert med en rød (HeNe) laser på en prototypcelle-sorterer. Sortering av celler i korresponderende grupper, flekking av cellene med acridin orange og observering av cellene under et fluorescerende mikroskop, ga ytterligere klarhet over at gruppene var korrekt identifisert. Fig. 3B viser et cytogram av en prøve med "mononukleære celler" preparert med tetthets-gradient separasjon av helt blod. Blodplatesamlinger, lymfocytt- og monocytt-grupper er lignende de på fig. 3A, mens granulocyttgruppene er fraværende, som ventet. Det fremgår av fig. 3A og 3B at lymfocyttene er lett adskilte fra granulocytter. Der kan være en liten mengde med overlapping av lymfocytter og monocytter i gruppene 2 og 3, men for foreliggende formål har det blitt ansett for tilstrekkelig å betrakte gruppen 2 som inneholdende kun lymfocytter og gruppen 3 som inneholdende monocytter.

Fremoverspredt lys er som det fremgår av fig. 3A, 3B primært nyttig i adskiHelse av leukocytter fra blodplater og røde cellerester. Den instrumentmessige terskelen ble innstilt til å omfatte disse mindre cellene slik at kun leukocytter ble talt. Når dette er gjort frembringer den rettvinklede lysspredningsparameteren alene utmerket adskillelse av 1 eukocytt-typene. Hisitogrammene "A" og "B" på fig. 3C korresponderer med cytogrammene vist på fig. 3A og 3B. Toppene i til 3 korresponderer med lymfocytter, monocytter og granulocytter, henholdsvis.

Når prosedyren med flekking av immunfluorescent er påført den brungule delen frembringer den tilslutt preparerte cellen lysspredningsgrupper vesentlig lik de vist på fig. 3A. Siden lymfocytter, monocytter og granulocytter kan bli adskilt på basis av rettvinklet lysspredning, vil et cytogram med grønn fluorescerende, henholdsvis rettvinklet spredt lys vise hvilke av disse leukocytt-typene som er flekket. Figurene 3D og 3E viser slike cytogrammer for blodprøver inkubert med en kontroll, fig. 3D, eller anti-T-celler, fig. 3E, antistoff. Kontrollen var en overstående væske fra en ikke-antistoff-produserende klone, mens anti-T-celle-antistoffet var et monoklonisk antistoff. I tilfelle med kontroll, viste kun granulocytter tilstrekkelig fluorescering.

Blodet flekket med anti-T-antistoff viste imidlertid en klar5 lymfocyttgruppe som hadde relativ fluorescens-intensitet. Denne "T"-gruppen inneholdt 77$ av lymfocyttene (som definert av lysspredning) og inneholdt således kun T-lymfocytter.

Fig. 3F viser histogrammer med grønn fluorescens fra lymfocyttgruppen (gruppen 2 på fig. 3A). Histogrammet A på flg. 3F er for prøven med kontroll antistoff, mens histogrammet B på fig. 3F er for prøven med anti-T-antistoffet. T-cellene frembringer en klar topp i histogrammet B på fig. 3F. T-cellene former en svært klar topp. Et histogram med grønn f luorescering fra alle leukocyttene har en topp på grunn av granulocyttene som delvis overlapper T-lymfocytt-toppen.

Eksperimenter med flere forskjellige lymfocyttgrupper med spesifikke antistoffer som benytter blod fra flere menneskelige givere som har gitt resultater med en kvalitet lignende den nevnt ovenfor. Blod prøvet med antistoffer karakterisert som anti-T-celle hadde i alminnelighet 7056-803É celler som frembragte signifikant fluorescens i lymfocyttgruppen. Blod prøvet med antistoffer karakterisert som anti-B-celle hadde i alminnelighet 20% celler i lymfocyttgruppen som produserte signifikant fluorescens. Disse resultatene er i det normale området av T-celle og B-celle prosentdelen.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte for å identifisere og telle celler i en bestemt undergruppe med lymfocytter eller andre celletyper i blodet, som viser like antigenegenskaper, innbefattende frembringelse av et aliquot fra blodet som skal bli undersøkt, og føring av aliquotet, hovedsakelig en celle av gangen, gjennom et område ved hvilket er fokusert lys med forutbestemt spektralkarakteristikk, karakterisert veda) selektiv merking av cellene til undergruppen ved inkubering av aliquotet med et antistoff som er reaktivt med cellene i undergruppen, idet antistoffet har forutbestemt fluorescerende reaksjon i forhold til lys med den forutbestemte spektralkarakteristikken, b) lysering av røde celler fra aliquotet, c) detektering av lys spredt av og utsendt av fluorescensen fra hver celle til aliquotet, d) anvendelse av det spredte lyset for å detektere om en celle er en lymfocytt eller annen celletype, og e) identifisering av en celle som er av undergruppen ved å detektere forekomsten av den forutbestemte fluorescerende reaksjonen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det tilføres antikoagulert, men ellers i det vesentlige ubehandlet fullblod.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det tilføres en fullblodprøve, at prøven sen-trifugeres for en forutbestemt tidsperiode, at prøvens brungule dellag isoleres, og at aliquotet tilveiebringes av det isolerte brungule dellaget.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, tilpasset for identifisering og opptelling av spesifiserte underklasser med T-lymfocyttyper, karakterisert ved at cellene merkes ved inkubering av aliquotet med anti-under-gruppeantistoff som fluorescerer ved kjent intensitet og frekvens når det blir bestrålt av en optisk stimulerings-anordning med gitt bølgelengde.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det nevnte området fokuseres av en argonlaser.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det spredte lyset anvendes for å detektere om cellen er en lymfocytt ved at det tilveiebringes respektive sammenligningsområder for fremoverspredt lys og rettvinklet spredt lys, at det detekteres fremover- og rettvinklet spredte pulser for en gitt celle, at det sammenlignes respektive detekterte pulser med korresponderende sammenligningsomrnder,og at det muliggjøres, når begge detekterte pulser er innenfor de.es korresponderende områder, detektering av rettvinkel-fluorescens med den forutbestemte reaksjonen.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 4, karakterisert ved at merkingen skjer ved inkubering av aliquotet med en mengde antistoff som på forhånd er forbundet med et fluorescerende fargemiddel.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 4, karakterisert ved at merketrinnet utføres ved en første inkubering med et ikke-fluorescerende reaksjonsantistoff, og at aliquotet ytterligere inkuberes med et antistoff-reagent som har forutbestemt fluorescerende reaksjon og som er reaktiv med ikke-fluorescerende reaksjonsantistoff.

9. Apparat for identifisering og opptelling av spesifiserte T-lymfocytter eller andre blodcelletyper som fremviser lik antigenisk karakteristikk i en prøve som har blitt inkubert med fluorescerende reagerende antistoff som reagerer med en antigengruppe på overflaten til den spesifiserte T-lymfocytten eller blodcelletypen, innbefattende en strømningscelle (106) for gjennomslipping av cellene til prøvenhurtig og hovedsakelig en av gangen gjennom et gitt område, en kilde med lys (101, 102) som stimulerer fluoresceringen i antistoffet, innretninger (103, 104,

105) for retting og fokusering av lyset fra kilden mot cellene som strømmer gjennom det gitte området, første fotof ølende innretninger (109, 110) anordnet for å detektere lys spredt i en fremoverrettet retning fra området av en celle som passerer derigjennom,og tredje fotofølende innretninger (115, 116) anordnet for føle fluorescerende lyspulser fra cellene, karakterisert veda) andre fotofølende innretninger (114, 117) anordnet ph en akse hovedsakelig ved rette vinkler i forhold til cellestrømmens akse for å detektere lys spredt hovedsakelig ved rette vinkler i forhold til innfallende stråle fra området av en celle som passerer derigjennom, b) innretninger (201, 204) for å tilveiebringesammenlig-ningsområder for henholdsvis fremoverspredt lys og rettvinklet spredt lys, c) innretninger (203, 206) for å sammenligne lyspulser detektert av første og andre fotofølende innretning med respektive sammenligningsområder fra nevnte innretninger (201, 204) for tilveiebringelsen av sarrmenligningsormråder. d) innretninger (207, 208) som reagerer på signaler fra innretninger for tilveiebringelse av sammenligningsområder for å frigjøre detektering av en forutbestemt reaksjon fra de tredje fotofølende innretningene når detekterte lyspulser forekommer innenfor respektive sammenligningsområder, og e) innretninger (212) for fremvisning av en represen-tasjon av fluorescerende lyspulser fra cellene som en indikasjon på forekomsten av spesifiserte T-lymfocytter eller blodcelletyper i nevnte område.

10. Apparat ifølge krav 9, karakterisert ved at det innbefatter en innretning (210, 211) for kompensering av signalene detektert av de tredje fotofølende innretninger for å ta hensyn til en forvalgt uekte fluorescenseffekt, idet innretningene (212) for frem-visningen reagerer på sin side på innretningen (210, 211) for kompensering.

11. Apparat ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at innretningene (103, 104, 105) for retting og fokusering er anordnet for å levere lys fra kilden (101, 102) i det vesentlige ortogonalt i forhold til cellestrøm-men i nevnte gitte område.

12. Apparat ifølge krav 9, karakterisert ved at kilden ned lys innbefatter en argonione-laser (101) og at de tredje fotofølende innretningene (115, 116) innbefatter innretninger for å avføle grønne fluorescerende lys-pulser.

13. Apparat ifølge krav 12,karakterisert ved at de tredje fotofølsomme innretningene (115, 116) er tilpasset til å avføle grønne lyspulser langs nevnte akse hovedsakelig ved rette vinkler i forhold til selve strøm-mens akse.