NL7907402A

NL7907402A - Werkwijze voor het bereiden van gist-autolysaat.

Info

Publication number: NL7907402A
Application number: NL7907402A
Authority: NL
Original assignee: Standard Oil Co
Priority date: 1978-10-06
Filing date: 1979-10-05
Publication date: 1980-04-09
Also published as: FR2438088B1; JPS5554891A; US4218481A; FR2438088A1

Description

* * * %

J

STANDARD OIL COMPANY, te Chicago, Illinois, Verenigde Staten van Amerika

Werkwijze voor het bereiden van gist-autolysaat.

Deze uitvinding betreft de autolyse van gist, en meer in het bijzonder een manier waarop de autolyse van gist versterkt wordt door de toevoeging van bepaalde exogene enzymen. Het aldus verkregen autolysaat is bijzonder geschikt als groeibevorderen-5 de nutriënt bijhet aanmaken van zuivel-startcultures in de kaas-fabrikage en andere melk-verwerkingen.

Geautolyseerd gist en gist-autolysaat (ookwel "geautolyseerd gistextract" genoemd), twee verschillende produkten van de autolyse van gist, zijn In de voedselindustrie reeds lang 10 toegepast om ergens smaak aan te geven. Ook zijn het belangrijke bronnen van nutriënten voor diverse fermentaties. Autolyse treedt op wanneer endogene enzymen, voornamelijk proteases en ribonucleases, de intracellulaire, hoogmoleculaire bestanddelen van de gistcellen aantasten. Dit proces kan aangezet worden door de gist te verhitten 15 tot een temperatuur (ongeveer 50°C) waarop de cel gedood wordt maar de enzymen nog intact blijven. Ook kan het gestimuleerd worden door stoffen die plasmolyse of vervloeiing in de hand werken, zoals zouten en organische oplosmiddelen. Bij autolyse worden macromoleculen gehydrolyseerd en de lagere moleculaire, oplosbare afbraakprodukten, 20 zoals peptiden, aminozuren, nucleotiden, enz. diffunderen uit de cellen. Het schijnt dat het in oplossing brengen van organisch stikstofhoudend materiaal het voornaamste aspect van de autolyse is.

De autolyse van gist kan gebeuren bij temperaturen tussen 30° en 60°C. In het algemeen gaat dit proces uiterst 25 langzaam en bij lage temperaturen duurt het wel 3 tot 7 dagen voordat het afgelopen is. Bij 50-55°C kan een volledige vertering in 3 dagen voltooid zijn, maar in de praktijk worden kortere tijden toegepast ten koste van de opbrengst aan autolysaat. Bij de lagere temperaturen van 30-40°C is de toevoeging van antiseptica om bederf 7907402 i --¾ 2 te voorkomen nodig» hoewel antiseptica om veilig te zijn bij 'alle temperaturen toegepast mogen worden. Algemeen gebruikte antiseptica zijn ethylacetaat, amylacetaat, tolueen, formaldehyd, enz.

Bij een typische autolyse wordt een zachte pap 5 van levende gistcellen (15-18 gew.% droge stof) geplasmolyseerd met 2-5 gew.% zout (betrokken op gewicht aan cellen). Dan wordt 1 % ethylacetaat als antisepticum toegevoegd om bacteriegroei tegen te gaan. De suspensie wordt nu op 50-55°C verhit en daar 12-24 uur op gehouden of totdat de gewenste mate van in oplossing gaan bereikt is. 10 Het aldus verkregen geautolyseerde materiaal wordt dan bij 80-100°C gepasteuriseerd, afgekoeld, en gecentrifugeerd of gefiltreerd. Het filtraat kan geconcentreerd worden tot een pasta met ongeveer 70-80 gew.% droge stof, of gesproeidroogd tot een poeder. Ook kan het geautolyseerde. mengsel direct gesproeidroogd worden, zonder verwijde-15 ring van het celpuin. Beide produkten verschillen aanzienlijk in samenstelling, smaak en toepasbaarheid.

Het gebruik van exogene enzymen om de autolyse van gisten te versterken is een nieuwe benadering, hoewel diverse enzymen bij diverse andere werkwijzen toegepast zijn. Bijvoorbeeld 20 is in het Amerikaanse octrooischrift 3.088.879 het gebruik van papa'ine voor het vrijmaken van de celinhoud uit bepaalde soorten mycelium beschreven; in het bijzonder gaat het hier om de behandeling van Penicillium chrysogenum (gewone blauwe schimmel) en Agaricus campestris (gewone champignon). De. aanbevolen omstandig-25 heden zijn 50 tot 85°G en een pH van 4,3 tot 6,3. Dit octrooischrift suggereert niet de toepasbaarheid van papaïne op andere microörga-nismen zoals gisten, en er wordt niets over autolyse in gezegd.

Het Amerikaanse octrooischrift 3.523.801 leert ons een niet-autolytische werkwijze voor het bereiden van 30 smaakstoffen uit microbencellen, waarbij die microbencellen eerst 1 tot 3 uur bij 50-80°C aan een alkalische oplossing blootgesteld worden om de celwanden te vernietigen, waarna geneutraliseerd en kennelijk gepasteuriseerd wordt (10-15 minuten verhitten tot boven 100°C). Op de aldus behandelde cellen laat men dan 6 tot 48 uur 35 bij 50-60°C een geschikt protease in werken om de eiwitten af te breken. Deze werkwijze omvat dus een combinatie van een chemische 79074 02 A * 3 en een enzymatische behandeling, en niet een autolyse.

Het Amerikaanse octrooischrift 3.778.513 leert ons ook een werkwijze voor het bereiden van een smaakstof-extract door eerst de celwanden in 1 tot 5 uur bij 100-130°C met zoutzuur 5 te vernietigen en op het ontlede materiaal na neutralisatie een protease te laten inwerken dat de rest van het eiwit tot een mengsel van peptiden afbreekt. Aanvullende bestanddelen worden aan het pep-tiden-mengsel toegevoegd, en dit wordt dan een £ tot 5 uur op 50-80°C verhit, en dan is het een smaakstofprodukt. Doordat men hier 10 begint met zoutzuur is er van autolyse geen sprake, want door een dergelijke behandeling worden de hiervoor aansprakelijke enzymen geïnactiveerd.

Het Amerikaanse octrooischrift 3.809.780 leert ons ook een werkwijze voor het bereiden van een smaakstof 15 waarbij gisten blootgesteld worden aan bepaalde lytische enzymen van de geslachten Coprinus, Daedaleopsis en Irpex. De gistcellen kunnen nog levend zijn, maar de voorkeur gaat uit naar door verhitting afgedode cellen. Men laat het enzym 5 tot 48 uur bij 45 tot 55°G inwerken bij een pH die afhankelijk is van het gekozen enzym.

20 Hoewel de omstandigheden bij deze werkwijze de autolyse in de hand zouden werken als levende cellen gebruikt waren leert dit Amerikaanse octrooischrift ons duidelijk dat men bij voorkeur met door verhitting afgedode cellen moet beginnen, en inderdaad werden de cellen in alle voorbeelden eerst ongeveer 10 minuten verhit tot on-25 geveer 100°C of hoger. Na zo'n verhitting kan autolyse niet meer optreden, want de enzymen zijn alle kapot. Bovendien leert dit octrooischrift ons de toepassing van bepaalde enzymen en suggereert het niet dat andere enzymen bij zo'n werkwijze het ook heel goed doen. In het bijzonder wijst dit octrooischrift niet in de 30 richting van een combinatie van enzymen met autolyse.

Zoals reeds gezegd kost autolyse in het algemeen veel tijd, is de efficiëntie daarvan laag en leidt het niet met zekerheid tot goede produkten. Bovendien was gevonden dat typische autolysaten, zoals die die men door plasmolyse met bijvoorbeeld 35 NaCl verkrijgt, maar slechte groeibevorderaars voor melkzuurbacteriën (voor de startcultures in de kaasfabrikage) zijn. Maar deze 790 7402 'i 4 uitvinding verschaft een betere autolyse-werkwijze, waarbij vooral de opbrengst aan gistautolysaat verhoogd en de tijd voor een volledige vertering bekort wordt. Verder verschaft deze uitvinding een doeltreffende groeibevorderaar voor melkzuurbacteriën die men als 5 startcultures bij de kaasfabrikage kan gebruiken.

Deze verbeteringen worden bereikt door continu of in porties bepaalde exogene enzymen aan het autolyse-systeem toe te voegen. De efficiëntie van de autolyse van gist blijkt aanzienlijk verbeterdyfce worden door tenminste ëén protease toe te voegen 10 en/of een mengsel van protease, nuclease, lipase en/of amylase.

In het bijzonder zijn de sulfhydryl-proteases (waaronder papaïne, ficine en bromelaxne) en de gemengde enzymen (waaronder pancreatine en aspergillus-protease) naar verhouding erg goed werkzaam in hun synergisme met. de autolyse. Papaïne, dat door FDA vrijgegeven is 15 voor toepassing in voedsel, is voor dit doel nog het allerbest.

Een volledige autolytische vertering van de cellen van Candida utilis kan in 24 uur bereikt worden, waarbij 80-90 % in oplossing gaat. Van andere soorten gist mag men verwachten dat hiervoor nog minder tijd nodig is, daar Candida utilis naar verhouding moeilijker 20 te autolyseren is dan vele andere gisten. De werkwijze volgens de uitvinding is dan ook goed toepasbaar op onder meer Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis en Kluyveromyces fragilis, maar de toepassing op alle mogelijke gisten valt binnen het kader van deze uitvinding.

25 Het geautolyseerde materiaal kan verwerkt wor den tot geautolyseerde gist door het hele reactiemengsel te drogen, of tot een volledig in water oplosbaar produkt oftewel gist-autoly-saat, door het celpuin te verwijderen en het filtraat te concentreren of te sproeidrogen. Beide produkten zijn bijzonder nuttig 30 voor het stimuleren van de melkzuurfermentatie bij de kaasfabrikage.

Het/de toegevoegde exogene enzym(en) werkt/ werken bij de autolyse van het celmateriaal in synergisme met de endogene enzymen van de gist. Hoe dat precies gaat is niet bekend, maar men denkt aan twee mogelijke mechanismen. Het ene mechanisme 35 houdt een directe aantasting van de gistcelwand en/of -membraan door de toegevoegde enzymen in waarbij de structuur van de celbe- 790 74 02 5 grenzing verbroken wordt. De inhoud van de cel, waaronder ook de endogene enzymen, kunnen dan naar buiten lekken en dit laat een betere inwerking van de enzymen op de substraten toe. Waargenomen is dat bij autolyse van gist in aanwezigheid van papalne de structuur 5 van de gistcelwand geleidelijk aan verdween naarmate de vertering voortschreed. Dit gebeurde niet in afwezigheid van papaïne. Een tweede mogelijke mechanisme is dat de autolyse begint met de inwerking van het/de exogene enzym(en). Van enzymen met betrekkelijk kleine afmetingen (molecuulgewichten van ongeveer 13.000 voor 10 ribonuclease en 23.900 voor papalne) weet men dat ze door de gistcelwand en het membraan kunnen binnendringen en dus intracellulaire bestanddelen kunnen hydrolyseren. Daarbij raakt dan de hele organisatie van het cytoplasma in de war, waardoor de endogene enzymen nu op hun substraten kunnen gaan inwerken, wat op zijn beurt de 15 autolyse verder versnelt.

Hoewel diverse enzymen in voedsel toelaatbaar zijn zijn papaïne en pancreatine, zowel afzonderlijk als tezamen, het sterkst werkzaam. Papaïne, een heel gewoon protease, is naar verhouding effectiever in het ondersteunen van de gistautolyse dan 20 pancreatine. Pancreatine is een mengsel van enzymen en bevat protease, amylase, lipase en nuclease. Waargenomen is dat bij de autolyse van gist de combinatie van pancreatine en papaïne de smaak van het eindprodukt tot op zekere hoogte verbetert.

Meer in het bijzonder omvat de werkwijze vol-25 gens de uitvinding de volgende stappen: a) Aan een waterige suspensie van levende gistcellen wordt zoveel papaïne, ficine, bromelaïne, pancreatine en/of aspergillus-protease toegevoegd dat de concentratie aan exogeen enzym in de suspensie tussen 0,01 en 1,0 gew.% ligt, en 30 (b) de enzym bevattende suspensie wordt onder voortdurend roeren 2 tot 24 uur op een temperatuur tussen 40° en 60°C en een pH tussen 5,0 en 7,5 gehouden.

De beginsuspensie van levende gistcellen bevat bij voorkeur 10 tot 20 gew.% droge stof, maar erg belangrijk is 35 de concentratie niet. Na de inwerking kan de suspensie tot geauto-lyseerd gist gepasteuriseerd of gesproeidroogd worden, maar ook kan 790 74 02 \ Λ **· 6 het eerst opgehelderd en verder geconcentreerd worden (eventueel in meerdere stappen) en daarna tot gistautolysaat gesproeidroogd worden. In het eerste geval kan het pasteuriseren gebeuren door de geautolyseerde suspensie 1 tot 30 minuten te verhitten tot tempera-5 turen tussen 80° en 105°C. Bij het sproeidrogen liggen de inlaat- en uitlaat-temperaturen bij voorkeur tussen 140° en 250°C respectievelijk 75° en 100°C. Als een gistautolysaat gewenst is verdient het aanbeveling de geautolyseerde suspensie eerst te centrifugeren om het celpuin te verwijderen, zodat men een bovenstaande vloeistof ......

10 met alleen maar oplosbare materialen verkrijgt; dit wordt dan onder vacuum bij 50°-65°C geconcentreerd tot ongeveer 30 gew.% droge stof.

Dit concentraat wordt dan weer gecentrifugeerd om eventueel neergeslagen stof te verwijderen, en dan onder vacuum bij 50° tot 65°C geconcentreerd tot een pasta met 70 tot 80 gew.% droge stof. Als 15 alternatief op het tweede concentreren kan het gecentrifugeerde concentraat direct tot een poeder gesproeidroogd worden.

De werkwijze volgens de uitvinding is vooral interessant en nuttig bij het bereiden van een produkt dat men wil gebruiken als nutriënt bij het aanmaken van startcultures in de 20 kaasfabrikage of andere melkfermentaties. De toevoeging van peptiden, peptonen en aminozuren is gunstig voor de groei van melkzuurbacteriën op media op basis van melk en/of wei. Voor dat doel wordt soms met protease (pepsine, trypsine of papaïne) aangetaste melk gebruikt. Gistextract wordt hiervoor ook wel eens gebruikt, maar 25 het is naar verhouding duurder en men is minder zeker van de kwaliteit. Maar het geautolyseerde produkt van de werkwijze volgens de uitvinding lijkt grote kansen te hebben om althans voor deze toepassing de bestaande gistextracten te verdringen.

De uitvinding wordt nu nader toegelicht door de 30 volgende, niet beperkende voorbeelden.

Voorbeeld I

In een continue fermentatieketel werd Candida utilis (ATCC 9256) op ethanol met zuurstof als beperkende factor gekweekt. De gistcellen werden gecentrifugeerd tot een pasta met 35 ongeveer 15 % droge stof. In een aantal 70 ml buizen werden 25 ml porties van deze suspensie gebracht, en aan elk monster werden diver- 790 7 4 02 7 i se enzymen toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5 gew.% aan enzym. Ook kreeg elke buis als antisepticum 0,25 ml ethylacetaat.

De irihoud werd goed omgeschud en elke buis werd afgesloten. De buizen met het autolyserende materiaal werden nu 24 uur op 55°C ge-5 houden; de pH was ca 6,0. Het percentage dat in oplossing ging werd bepaald door de droge gewichten van bovenstaande vloeistof en van celpuin te bepalen. De werking van diverse enzymen bij het ondersteunen van de autolyse blijkt uit de volgende tabel.

Tabel A

10 Toegevoegd enzym % van de celmassa in oplossing _ gegaan_

Blanco (niets toegevoegd) 37,8

Papaine 78,4

Ficine 68,7 15 Bromelaïne 75,8

Renninen 39,5

Pepsine 41,8

Trypsine 37,6

Pancreatine 57,7 20 Aspergillus-Protease 59,6

De bij het ondersteunen van de gistautolyse sterkst werkzame enzymen behoren tot de sulfhydryl-proteases, waartoe papaïne, ficine en bromelaïne gerekend worden. Papaïne is van deze drie de beste. Pancreatine en aspergillus-protease, die geacht 25 worden mengsels van enzymen te zijn, versterken de autolyse ook significant. Rennine, pepsine en trypsine zijn onwerkzaam, maar dat is niet verrassend want de optimale pH's voor hun werking zijn respectievelijk 2,0, 3,5 en 8,0. De optimale pH voor de autolytische enzymen van de gist is 5,0 tot 6,5. Deze proef werd uitgevoerd met 30 een pH van 6,0.

Voorbeeld II

Een gistcel-pasta met ongeveer 15 % droge stof werd voorbehandeld door hem 15 minuten op 80°C te pasteuriseren. Zowel levende cellen als gepasteuriseerde cellen werden gebruikt 35 als uitgangsstof van een verteringsproef, beide met of zonder 0,5 % papaïne (betrokken op droog gewicht aan cellen). Verder gebeurde 790 7402 8 deze proef onder dezelfde omstandigheden als voorbeeld I. De uitkomsten hiervan staan in tabel B.

Tabel B

Cellen Papaine, % % van de celmassa in oplossing 5 Levend 0,0 36,7

Levend 0,5 70,9

Gepasteuriseerd 0,0 17,7

Gepasteuriseerd 0,5 41,9

Men ziet de versterkende werking van het pa-10 païne op de autolyse, en dat men van levende cellen uit moet gaan. Voorbeeld III

De proef van voorbeeld I werd herhaald, behalve dat de papaïne-dosis gevarieerd werd van 0,01 tot 0,3 % (betrokken op droog gewicht aan cellen) en dat de duur van de autolyse 10 uur 15 of 23 uur was. De verkregen geautolyseerde suspensies werden gepasteuriseerd door 15 minuten verhitten op 95°C en daarna gevriesdroogd. Van alle monsters werd bepaald hoeveel % er in oplossing gegaan was, en ook werd hun geschiktheid voor het stremmen van melk nagegaan.

De mate van in oplossing brengen staat in tabel C.

20 Tabel C

Papaïne-dosering % van de celmassa in oplossing gegaan (gram per 100 gram cellen) 10 uur 23 uur 0 39,8 40,7 0,01 51,6 66,8 25 0,03 57,7 73,6 0,10 65,6 79,8 0,30 72,3 84,2

De mèlkstremproef werd als volgt uitgevoerd: uit poeder aangemaakte vetvrije melk (10 % droge stof) met daarin 30 0,1 tot 0,3 gew.% te beproeven monster werd 5 minuten op 80-85°C

gepasteuriseerd. Na afkoelen tot 37°C werd elke buis geënt met 1 ml verse gemengde culture van Streptococcus thermophilus en Lactobacillus bulgaricus (stam R-1 uit het laboratorium van Chr. Hansen) in 10 % gepasteuriseerde vetvrije melk. De beënte buizen werden op 35 37°C geïncubeerd en na verschillende tijden werd gekeken of er stremming opgetreden was. Onder gewone omstandigheden is daar 4 tot 790 7402 9 tot 5 uur voor nodig. De uitkomsten staan in tabel D.

Tabel D

Melkstremproef

Monster _gram per 100 ml melk_Resultaat_ 5 Blanco (geen gist- geen stremsel materiaal)

Gistextract 0,1 zachte wrongel uit de handel 0,2 stevige wrongel 0,01 % papaïne 0,1 geen stremsel 10 0,2 zachte wrongel 0,3 zachte wrongel 0,03 % Papaïne 0,1 zachte wrongel <u 0,2 stevige wrongel

i-H

2 0,3 stevige wrongel § - 15 u 0,1 % papaïne 0,1 zachte wrongel a ö 0,2 stevige wrongel o ~ 0,3 stevige wrongel «e_____________ ö u 0,3 % papaïne 0,1 zachte wrongel

CQ

$ 0,2 stevige wrongel 20 0,01 % papaïne 0,1 zachte wrongel 0,2 stevige wrongel 0,3 stevige wrongel « " ' —— 0,03 % papaïne 0,1 zachte wrongel t—t 2 0,2 stevige wrongel 3 25 9 0,3 stevige wrongel u _ 3 -- 3 0,1% papaïne 0,1 zachte wrongel co ^ 0,2 stevige wrongel CÖ _;_ (3 -" +j 0,3 % papaïne 0,1 zachte wrongel co o 0,2 stevige wrongel 30 Uit de resultaten blijkt het effect van de papaïne-toevoeging op de tijd nodig om de irihoud der gistcellen tot oplossing te brengen. Na 10 uur inwerking is het gistautolysaat even geschikt voor de kaasbereiding als na 23 uur.

790 7402 "* 10

Voorbeeld TV

In een ketel van 190 liter mét warm^watermantel werden 165 kg cellen van Candida utilis (15,3 % droge stof.) en 25,3 g ruw papaïne gebracht. Het mengsel werd 12 uur onder roeren 5 en onder 0,35 atmosfeer stikstof op 55°C verhit. Na deze 12 uur werd de inhoud van de ketel tot 98°C verhit door direct inblazen van 2 atmosfeer stoom. Na 30 minuten op 98°C werd de inhoud tot 40°C afgekoeld. Dit materiaal werd gesproeidroogd met een inlaattempera-tuur van 160°C en een uitlaattemperatuur van 85°C. Het produkt was 10 een fijn, lichtbruin poeder met 5,8 % vocht. Van de uitgangsgist was slechts 1,1 % in water oplosbaar materiaal, en van het gesproei-droogde produkt wel 66,2 %.

Dit produkt werd op de eerder beschreven wijze in de melkstremproef beoordeeld. Zonder enige toeslag was de melk 15 na 4uur nog niet gestremd. Mét 0,2 % handelsprodukt hadcle melk na 4 uur een zachte wrongel. Met 0,2 % gesproeidroogd gistautolysaat van dit voorbeeld was er na 4 uur een stevige wrongel. Hieruit ziet men dat het op de gespecificeerde wijze geautolyseerde gist een effectieve groeifactor bij de kaasbereiding is, beter dan een zelfde 20 hoeveelheid gewoon gistextract.

790 7402

Claims

1. Werkwijze voor het autolyseren van gist, met het kenmerk, dat (β.) aan een waterige suspensie van levende gistcellen zoveel papaïne, 5 ficine, bromelaïne, pancreatine en/of aspergillus-protease toegevoegd wordt dat de concentratie aan exogeen enzym in de suspensie tussen 0,01 en 1,0 gew.% ligt, en (b) de enzym bevattende suspensie onder voortdurend roeren 2 tot 24 uur op een temperatuur tussen 40° en 60°C en een pH tussen 5,0 10 en 7,5 gehouden wordt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het toegevoegde enzym papaïne is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het toegevoegde enzym pancreatine is.

4. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat het enzym toegevoegd wordt aan cellen van Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis en/of Kluyveromyces fragilis.

5. Werkwijze volgens een der voorafgaande 20 conclusies, met het kenmerk, dat de temperatuur tijdens de tweede stap 50° tot 55°C is.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 5, met het kenmerk, dat de suspensie van geautolyseerde gist gepasteuriseerd en daarna gesproeidroogd wordt.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 5, met het kenmerk, dat de suspensie van geautolyseerde gist gecentrifugeerd wordt, dat de bovenstaande vloeistof geconcentreerd wordt tot een vloeistof met 30 % droge stof, dat uit dit concentraat eventueel neergeslagen stof door centrifugeren verwijderd wordt, en dat 30 het aldus geklaarde concentraat gesproeidroogd wordt.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men uitgaat van een suspensie van Candida utilis met 15-20 % droge stof, en dat men hieraan 0,01 tot 1,0 gew.% papaïne toevoegt. 790 7402