MX2010011088A

MX2010011088A - Composiciones y metodos novedosos para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la inmunidad.

Info

Publication number: MX2010011088A
Application number: MX2010011088A
Authority: MX
Inventors: Hilary Clark; Dan Eaton; Lino Gonzalez Jr; Jane L Grogan; Jason Hackney; Kristin D Harden; Xin Yu
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-08
Publication date: 2010-11-05
Also published as: ES2640533T3; CA2719189C; IL246293B; AU2009233708A1; US20230098521A1; CN102057272A; PL3208612T3; CN110082533B; US20170145093A1; EP2279412B1; BRPI0906550B1; JP2020114211A; IL246293A0; EP3208612A1; IL272817A; PL2279412T3; IL228988A0; KR101692080B1; JP2011523034A; WO2009126688A2

Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para utilizar esas composiciones para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS NOVEDOSOS PARA EL TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA INMUNIDAD Campo de la Invención La presente invención se relaciona con composiciones y métodos útiles para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad.

Antecedentes de la Invención Las enfermedades relacionadas con la inmunidad e inflamatorias son la manifestación o consecuencia de una trayectoria biológica muy compleja, con frecuencia, con múltiples interconexiones, que en la fisiología normal, son críticas para responder a un insulto o lesión, iniciar la reparación del insulto o lesión, y montar la defensa innata y adquirida contra los organismos extraños. La enfermedad o patología ocurre cuando estas trayectorias fisiológicas normales causan un insulto o lesión adicional, ya sea relacionado directamente' con la intensidad de la respuesta, como una consecuencia.de la regulación anormal o estimulación excesiva, como una reacción autóloga o como una combinación de éstos.

Aunque la 'génesis de estas enfermedades con frecuencia involucra trayectorias con múltiples pasos y con frecuencia múltiples diferentes sistemas/trayectorias biológicas, la intervención en puntos críticos en una o más de estas trayectorias puede tener un efecto de mejora o terapéutico. La intervención terapéutica puede ocurrir mediante el antagonismo de un proceso/trayectoria perjudicial o la estimulación de un proceso/trayectoria benéfico.

Muchas enfermedades relacionadas con la inmunidad se conocen y se han estudiado de manera extensa. ¦ Tales enfermedades incluyen enfermedades inflamatorias mediadas por la inmunidad, enfermedades inflamatorias mediadas no por la inmunidad, enfermedades infecciosas, enfermedades de inmunodeficiencia, neoplasia, etc.

Los linfocitos T (células T) , son un componente importante de una respuesta inmune de un mamífero. Las células T reconocen los antígenos que están asociados con una molécula autóloga codificada por los genes dentro del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) . El antígeno puede manifestarse junto con moléculas del MHC en la superficie de las células que presentan el antígeno, células infectadas con virus, células cancerígenas, injertos, etc. El sistema de las células T elimina estas células alteradas que plantean una amenaza para la salud del mamífero hospedero. Las células T incluyen las células T auxiliares y las células T citotóxicas. Las células T auxiliares proliferan de manera extensa después del reconocimiento de un complejo antígeno- HC en una célula que presenta el antígeno. Las células T auxiliares también secretan una variedad de citocinas, es decir, linfocinas, que juegan un papel principal en la activación de las células B, células T citotóxicas y una variedad de otras células que participan en la respuesta inmune. Otra subcategoría de las células T auxiliares son las células T auxiliares foliculares (TFh) (para una revisión, véase Vineusa et al., Nat . Rev. Immunol . 5: 853-865 (2005)). Detectables por su expresión característica del receptor 5 de CXC-quimiocina (Schaerli et al., J. Exp. Med. 192: 1553-62 (2000)), se ha encontrado que estas células producen IL-10 y posiblemente IL-21. Las células TFh proporcionan ayuda a las células B del centro germinal, particularmente ayudando en la supervivencia y propagación de las células B e induciendo potencialmente la producción de anticuerpos durante el cocultivo con células B. También se han implicado en la tolerogénesis .

Las células T reguladoras (Treg) son un subconjunto de las células T auxiliares que juegan un papel crítico en la inhibición de las respuestas inmunes autorreactivas , y se encuentran con frecuencia en sitios de inflamación crónica, tal como en el tejido de un tumor (Wang, H^Y. & Wang, R.F., Curr Opin Immunol 19, 217-23 (2007)). Las células Treg se definen fenotípicamente por una alta expresión en la superficie celular de CD25, CLTA4 , GITR y neuropilina- 1 (Read, S., Malmstrom, V. & Powrie, F., J Exp Med 192, 295-302 (2000); Sakaguchi, S., et al., J Immunol 155, 1151-64 (1995); Takahashi, T. et al., J Exp Med 192, 303-10 (2000); McHugh, R.S. et al., Immunity 16, 311-23 (2002); Bruder, D. et al., Eur J Inmunol 34, 623-30 (2004)), y están bajo el control del factor de transcripción F0XP3 (Hori, S., Nomura, T. & Sakaguchi, S.( Science 299, 1057-61 (2003)). Las células Treg realizan su función supresora en las células T activadas a través de mecanismos dependientes del contacto y la producción de citocina (Fehervari, Z. & Sakaguchi, Curr Opin Immunol 16, 203-8 (2004)). Las células Treg también modulan las respuestas inmunes mediante la interacción directa con los ligandos en las células dendríticas (DC) , tales como la interacción con CTLA4 con las moléculas B7 en las DC que provoca la inducción de la indoleamina 2 , 3 -dioxigenasa (IDO) (Fallarino, F. et al., Nat Inmunol 4, 1206-12 (2003)), y la ligadura de CD40L (Serra, P. et al., Immunity 19, 877-89 (2003)). Las DC son células que presentan el antígeno, profesionales, capaces de inducir la inmunidad o tolerancia contra antígenos autólogos o no autólogos . Las células Treg expandidas por DC suprimen las respuestas de alorreactividad in vitro (Yamazaki, S. et al., Proc Nati Acad Sci USA 103, 2758-63 (2006); Ahn, J.S., Krishnadas, D.K. & Agrawal, Int Immunol 19, 227-37 (2007)), y cuando se transfirieron de manera adoptiva, las células Treg apropiadas inhibieron la diabetes en ratones NOD.scid (Tarbell, K.V. et al., J" Exp Med 199, 1467-77 (2004)), o indujeron el asma experimentalmente (Lewkowich, I.P. et al. J" Exp Med 202, 1549-61 (2005)). Las interacciones específicas de los ligandos en las DC con células Treg también pueden anular su función supresora, tal como el acoplamiento de GITR en ratones (Shimizu, J., et al . , Nat In iunol 3, 135-42 (2002)), sugiriendo que las DC pueden tener un papel plural en la modulación de la función de las células Treg.

Las moléculas de CTLA4 y GITR son representativas de los ligandos definidos dentro de las superfamilias de CD28-B7 y TNF de moléculas coestimuladoras/inhibidoras , respectivamente (Greenwald, R.J., et al., Arxnu Rev Immunol 23, 515-48 (2005)). Estas moléculas tienen un alto contenido de células Treg, pero también están sobrerreguladas típicamente en las células T activadas. Con el fin de buscar nuevas moléculas coestimuladoras expresadas en las células Treg, se realizaron investigaciones para identificar los genes expresados de manera específica en las células T (Abbas, A.R. et al., Genes Immun 6, 319-31 (2005)), que tenían ambos dominios de la Ig y motivos de activación o inhibición basados en tirosina del inmunorreceptor ( ITAM/ITI ) . A través de la intersección de estas dos estrategias de investigación bioinformática en todo el genoma, se identificó una proteína unida a la superficie celular novedosa con la proteína que codifica un dominio de IgV, un dominio transmembranal y dos motivos inhibidores de la tirosina del inmunorreceptor putativos (véase la publicación de la patente de los Estados Unidos no. US20040121370 , incorporada en la presente como referencia) . La proteína designada TIGIT (por la célula T-Ig y el dominio ITIM) , mostró expresarse en las células T, particularmente en los subconj untos de las células Treg y las células de memoria, así como en las células NK. Existe la necesidad de nuevos agentes terapéuticos y métodos de tratamiento para tratar los trastornos inmunes, particularmente los trastornos autoinmunes. En la presente, las Solicitantes identificaron los compañeros que se unen a TIGIT y proporcionan nuevas composiciones, métodos de detección y métodos para el tratamiento de trastornos inmunes modulados por la interacción de TIGIT con aquellos . compañeros de unión y los efectos de TIGIT dilucidados en la maduración y actividad de las células T.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y métodos útiles para el diagnóstico y tratamiento de una enfermedad relacionada con la inmunidad en mamíferos, incluyendo humanos. La presente invención se basa en la identificación de proteínas involucradas en la regulación negativa de la proliferación y función de ciertos tipos de células inmunes. Las enfermedades relacionadas con la inmunidad pueden tratarse suprimiendo o tratando la respuesta inmune. Las moléculas que mejoran la respuesta inmune estimulan o potencian la respuesta inmune a un antígeno. Las moléculas que estimulan la respuesta inmune pueden utilizarse de manera terapéutica, en donde la mejora de la respuesta inmune sería benéfica. De manera alterna, las moléculas que suprimen la respuesta inmune atenúan o reducen la respuesta inmune a un antígeno (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) , pueden utilizarse de manera terapéutica, en donde la atenuación de la respuesta inmune seria benéfica (por ejemplo, inflamación) . Aquí, las Solicitantes demostraron que la proteína TIGIT (por "célula T-Ig y dominio ITIM" ) , se unen de manera específica al receptor del poliovirus (PVR, también conocido como CD155) y a varios otros miembros de una familia de proteínas dilucidada recientemente, y que esta interacción de TIGIT-PVR regula de manera negativa la activación y proliferación de las células T. En consecuencia, los polipéptidos de TIGIT, los agonistas de los mismos y los antagonistas de los mismos, así como los polipéptidos de PVR, los agonistas de los mismos y los antagonistas de los mismos, son útiles para preparar ' medicinas y medicamentos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad e inflamatorias. La invención también proporciona métodos para tratar enfermedades relacionadas con la inmunidad e inflamatorias y métodos y composiciones para detectar y valorar el estado de las enfermedades relacionadas con la inmunidad e inflamatorias.

En una modalidad, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de los siguientes aminoácidos: una alanina en la posición del aminoácidos que corresponde a la posición del aminoácido 67 de la TIGIT humana, una glicina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 74 de la TIGIT humana, una prolina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 114 de la TIGIT humana, y una glicina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 116 de la TIGIT humana. En un aspecto, el polipéptido no es PVR, PVRL1, PVRL2 , PVRL3 , PVRL4 , TIGIT, CD96 o CD226. En otro aspecto, el polipéptido comprende además uno o más de: un aminoácido seleccionado de valina, isoleucina y leucina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 54 de la TIGIT humana, un aminoácido seleccionado de serina y treonina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición' del aminoácido 55 de la TIGIT humana, una glutamina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 56 de la TIGIT humana, una treonina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 112 de la TIGIT h mana, y un aminoácido seleccionado de fenilalanina y tirosina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 113 de la TIGIT humana. En otro aspecto, el polipéptido comprende además, uno o más submotivos estructurales seleccionados de lo siguiente: a. un aminoácido seleccionado de valina e isoleucina en la posición del aminoácido 54 - un aminoácido seleccionado de. serina y treonina en la posición del aminoácido 55 - una glutamina en la posición del aminoácido 56; b. una alanina en la posición 67 - cualquier aminoácido en cada posición del aminoácido 68-73 - una glicina en la posición del aminoácido 74; y c. una treonina en la posición del aminoácido 112 - un aminoácido seleccionado de fenilalanina y tirosina en la posición del aminoácido 113 - una prolina en la posición del aminoácido 114 - cualquier aminoácido en la posición del aminoácido 115 - una glicina en la posición del aminoácido 116, en donde la numeración de las posiciones de los aminoácidos corresponde a las posiciones de los aminoácidos de la TIGIT humana, aunque la numeración absoluta de los aminoácidos en el polipéptido puede diferir.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para determinar si un polipéptido de prueba es un miembro de la familia de polipéptidos TLP que comprende la alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de prueba con una secuencia de aminoácidos de uno o más miembros de la familia de polipéptidos TLP y valorar la presencia o ausencia en la secuencia de secuencia de aminoácidos del polipéptido de prueba de una o más de una alanina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 67 de la TIGIT humana, una glicina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 74 de la TIGIT humana, una prolina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 114 de la TIGIT humana, y un a glicina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 116 de la TIGIT humana. En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar uno o más miembros de la familia de la proteína TLP identificando las proteínas en una o más bases de datos de la secuencia, cuyas secuencias de aminoácidos comprenden al menos un aminoácido seleccionado de una alanina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 67 de la TIGIT humana, una glicina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 74 de la TIGIT humana, una prolina en la posición del aminoácido que corresponde a la. posición del aminoácido 114 de la TIGIT humana, y una glicina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 116 de la TIGIT humana.

En otra modalidad, la invención proporciona un agente aislado que interactúa de manera específica con una o más regiones conservadas o sustancialmente conservadas de los miembros de la familia TLP. En un aspecto, el agente es un antagonista de la expresión y/o actividad de un miembro de la familia TLP. En otro aspecto, el antagonista se selecciona de un inhibidor de molécula pequeña, un anticuerpo inhibidor o un fragmento que se une al antígeno del mismo, un aptámero, un ácido nucleico inhibidor y un polipéptido inhibidor. En otro aspecto, el agente es un agonista de la expresión y/o actividad de un miembro de la familia TLP. En otro aspecto, el agonista se selecciona de un anticuerpo agonizante o un fragmento que se une al antígeno del mismo, un péptido agonizante, y una molécula pequeña o proteína que activa la unión de TIGIT al PVR y/o la señalización intracelular de TIGIT mediada por el PVR. En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar o detectar un o más miembros de la familia TLP, poniendo en contacto un polipéptido miembro de la familia TLP putativo con al menos uno de los agentes anteriores, y determinando la unión de al menos un agente al miembro de la familia TLP putativo .

En otra modalidad, la invención proporciona un método para determinar si una célula inmune de prueba es una célula Treg activada o normal, una célula T de memoria, una célula NK, o una célula TFh, que comprende valorar el nivel de expresión de la TIGIT en la célula inmune de prueba y comparando con el nivel de expresión de la TIGIT en una célula Treg activada o normal, célula T de memoria, célula NK, o célula Tph conocida, o comparando en nivel de expresión de la TIGIT en la célula inmune de prueba con el valor de la expresión de TIGIT estándar conocido. En otra modalidad, la invención proporciona un método para modular la función y/o actividad del sistema inmune, que comprende modular la unión de TIGIT a una o más de PVR, PVRL3 y PVRL2.

En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, que comprende al menos una HVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs : 23-28. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, que comprende al menos una HVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 31-36. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21* En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 o una porción de la misma. en otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30 o una porción de la misma. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21 o una porción de la misma, y la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 o una porción de la misma. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 o una porción de la misma, y la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia, de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO : 30 o una porción de la misma. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, en donde la cadena ligera del anticuerpo se codifica por la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 50 o una porción de la misma. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, en donde la cadena pesada del anticuerpo se codifica por la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 51 o una porción de la misma. En un aspecto, un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno del mismo de la invención, se selecciona de un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo heteroconjugado y una inmunotoxina .

En otro aspecto, al menos una HVR de la invención es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una HVR expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs : 23-28. En otro aspecto, al menos una HVR de la invención es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una HVR expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 31-36. En otro aspecto, la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno de la invención comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21. En otro aspecto, la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno de la invención, comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29. En otro aspecto, la cadena pesada de un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno de la invención, comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22. En otro aspecto, la cadena pesada de un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno de la invención, comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO : 30. En otro aspecto, un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno de la invención, comprende una cadena ligera, que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21, y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22. En otro aspecto, un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno de la invención, comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29, y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO : 30.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para modular una interacción de CD226-PVR y/o una interacción de CD96-PVR, que comprende administrar al menos uno de TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, o un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT in vivo o in vitro. En un aspecto, la TIGIT o un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT se administra y la interacción de CD226-PVR y/o la interacción de CD96-PVR se inhibe o bloquea. En otro aspecto, se administra un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, y la interacción de CD226-PVR y/o la interacción de CD96-PVR se estimula.

En otra modalidad, la invención proporciona una método para modular la función y/o actividad de la célula inmune, modulando la expresión y/o actividad de la TIGIT y/o el PVR, o modulando la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR. En un aspecto, la modulación es disminuir o inhibir la proliferación de una o más células inmunes o la liberación de una citocina proinflamatoria por una o más de las células inmunes, tratando las células in vitro o in vivo con la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad del PVR, o estimulando la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR. En otro aspecto, la modulación es incrementar o estimular la proliferación de una o más células inmunes o la liberación de una citocina proinflamatoria por una o más células inmunes, tratando las células in vitro o in vivo con un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR, o inhibiendo la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir una respuesta inmune, administrando in vitro o in vivo la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad del PVR, o estimulando la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR. En otra modalidad, la invención proporciona un método para incrementar o estimular una respuesta inmune, administrando in vitro o in vivo un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR, o inhibiendo la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para modular el tipo y/o cantidad de la producción de citocina de una célula inmune, modulando la expresión y/o actividad de la TIGIT o el PVR in vitro o in vivo. En un aspecto, la producción de la citocina proinflamatoria se estimula y/o incrementa mediante la administración de un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR, o inhibiendo la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR. En otro aspecto, la producción de la citocina proinflamatoria se inhibe mediante la administración de un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad del PVR, o estimulando la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para estimular la fosforilación de ERK y/o la señalización intracelular a través de la trayectoria de ERK en una o más células inmunes, que comprende tratar una o más células inmunes con la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, o un agonista de la expresión y/o actividad del PVR.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para diagnosticar una enfermedad relacionada con la inmunidad, que se relaciona con una respuesta aberrante de las células inmunes en un sujeto, que comprende valorar la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra del sujeto, y comparar la expresión y/o actividad de la TIGIT con una cantidad de referencia de la expresión y/o actividad de la TIGIT o la cantidad de la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra de un sujeto normal. En un aspecto, la enfermedad relacionada con la inmunidad se selecciona de soriasis, artritis, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer. En otro aspecto, el cáncer es cáncer de mama. En otra modalidad, la invención proporciona un método para valorar la severidad de una enfermedad relacionada con la inmunidad que se relaciona con una respuesta aberrante de las células inmunes en un sujeto, que comprende valorar la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra del sujeto, y comparar la expresión y/o actividad de la TIGIT con una cantidad de referencia de la expresión y/o actividad de la TIGIT o la cantidad de la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra de un sujeto normal. En un aspecto, la enfermedad relacionada con la inmunidad se selecciona , de soriasis, artritis, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer. En otro aspecto, el cáncer es cáncer de mama. En otra modalidad, la invención proporciona un método para evitar una enfermedad relacionada con la inmunidad, que se relaciona con una respuesta aberrante de las células inmunes en un sujeto, que comprende modular la expresión y/o actividad de la TIGIT en el sujeto. En un aspecto, la enfermedad relacionada con la inmunidad se selecciona de soriasis, artritis, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer. En otro aspecto, el cáncer es cáncer de mama. En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar o disminuir la severidad de una enfermedad relacionada con la inmunidad que se relaciona con una respuesta aberrante de las células inmunes en un sujeto, que comprende modular la expresión y/o actividad de la TIGIT en el sujeto. En un aspecto, la enfermedad relacionada con la inmunidad se selecciona de soriasis, artritis, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer. En otro aspecto, el cáncer es cáncer de mama .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 describe una alineación ' de las secuencias de la proteína TIGIT de humano, ratón, macaco rhesus y perro. El sombreado indica las posiciones que contienen aminoácidos idénticos en tres o cuatro especies. La secuencia de la señal está indicada por una línea punteada, el dominio fijo V de inmunoglobulina se indica por una línea doble, los sitios de la N-glucosilación se indican por una línea delgada por encima de la posición requerida, el dominio transmembranal se indica por una línea gruesa, y el motivo ITIM extendido putativo se indica por una línea punteada doble. La TIGIT humana comparte 88%, 67% y 58% de identidad con las secuencias del macaco rhesus, perro y ratón, respectivamente.

Las Figuras 2A y 2B describen una alineación de las secuencias de la proteína de los dominios de IgV de las proteínas de la familia del PVR indicadas. Las cadenas laterales que comparten similitud a través de las secuencias se marcan de acuerdo con la propiedad. Se indican los residuos de la huella del marco V (círculo negro) y los residuos de la huella relacionados con el PVR (residuos en el recuadro de línea gruesa) . Para propósitos comparativos, seis secuencias del dominio de IgV (expuestas bajo la línea horizontal) de los miembros de la familia que no son del PVR, también se alinean.

La Figura 3 describe los resultados de los análisis del biosensor para valorar la capacidad de TIGIT-Fc (línea gris claro) o una proteína Fe de control (línea negra) para unirse a varias proteínas, como se describe en el Ejemplo 2. Los números 1-8 representan, respectivamente, ESAM, OTOR, TEK, TNFRSF10C, IGFBP4 , PVR, IL-19 y TEK.

La Figura 4A describe los resultados de los ensayos del biosensor para valorar la unión de varias proteínas de fusión Fe a TIGIT-Fc inmovilizado, como se describe en el Ejemplo 2. Las Figuras 4B-1 a 4B-6 describen los resultados de los análisis FACS para valorar la unión de las proteínas de fusión Fe biotiniladas a los transfectantes estables CHO que expresan el receptor, como se describe en el Ejemplo 2.

Las Figuras 5A y 5B describen los resultados de un ensayo de unión al radioligando representativo para determinar la Kd para la unión entre TIGIT-Fc y células CHO que expresan a PVR, como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 6 muestra gráficas que describen los resultados de los estudios de unión de competencia entre TIGIT, PVR, CD226 y CD96, como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 7 muestra los resultados de experimentos que valoran la capacidad de un anticuerpo anti-PVR para bloquear la unión del PVR a TIGIT o CD226, como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 7A describe la' unión de PVR-Fc biotinilado a transfectantes CHO que expresan a CD226 o TIGIT en la presencia (línea punteada) o ausencia (línea sólida) de un exceso molar de 10 veces del anticuerpo D171. Los resultados de un anticuerpo de control que coincide con el isotipo, se indican por el área sombreada. La Figura 7B describe la unión de PVR-Fc (línea superior) o el amortiguador (línea inferior) a los biosensores cargados con CD226-FC o TIGIT-Fc. La línea media indica la unión de PVR-Fc al biosensor precargado con CD226-Fc o TIGIT-Fc que se ha bloqueado con el anticuerpo D171 antes de la exposición a PVR-Fc .

La Figura 8A describe los datos de la expresión de TIGIT (panel izquierdo) o los datos de la expresión de CD226 (panel derecho) , en una variedad de tipos de células inmunes, como se describe en el Ejemplo 2(A). La Figura 8B describe los análisis de RT-PCR de TIGIT y la expresión del ARNm de ICOS en las células Tfh tonsilares, como se describe en el Ejemplo 2 (A) .

Las Figuras 9A-B describen los resultados de los experimentos que prueban la capacidad del anticuerpo anti-TIGIT 10A7 para unirse a TIGIT en la superficie de las células, como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 9A muestra la unión del anticuerpo anti-TIGIT 10A7 a líneas celulares 293 -TIGIT estables (línea sólida) y la anulación de la unión en la presencia de PVR-Fc (línea punteada) . La región gris representa la unión de un anticuerpo de control que coincide con el isotipo. La Figura 9B muestra los resultados de los análisis FACS que demuestran que la TIGIT se coexpresa con FoxP3 en las células T CD4 GITR+. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes.

Las Figuras 10A-F describen los resultados de experimentos que valoran la expresión de TIGIT ya sea mediante análisis del ARNm o mediante estudios de unión en la superficie celular, como se describe en el Ejemplo 3. Las Figuras 10A-1 a 10A-2 describen los resultados de los experimentos de citometría de flujo para determinar la expresión de TIGIT y CD226 en células T CD4+CD45RA+ en reposo o activadas (durante uno o dos días) (panel izquierdo) o CD4+CD45RO+ (panel derecho) , como se describe en el Ejemplo 2 (A) . La Figura 10B muestra una gráfica de barras que indica las veces de cambio en el ARNm de TIGIT en diferentes tipos de células inmunes clasificadas directamente ex vivo de las PB C, en comparación con los niveles de ARNm. de TIGIT en las células CD4+CD45RA+ no diferenciadas. La Figura 10C muestra gráficas de barras que indican las veces del incremento en los niveles de ARNm de TIGIT en células Treg CD4+CD45RO+, CD4+CD45RA+ y CD4+CD25hi clasificadas, activadas · con anti-CD3 y anti-CD28 durante 1 ó 2 días, o células NK CD56+ clasificadas activadas con IL-2 durante un día, en comparación con las células no estimuladas. Las gráficas de FACS mostradas son de un experimento representativo y los valores de la RT-PCR son un promedio de tres donadores. La Figura 10D muestra los resultados de los ensayos FACS que muestran que las células PBMC humanas CD25" carecen de la expresión de TIGIT. La Figura 10E describe los resultados de los experimentos FACS que valoran la expresión de la superficie celular de la TIGIT en las células PBMC humanas que expresan cantidades bajas o altas de CD25 y muestran que la expresión de TIGIT se correlaciona con la expresión de FOXP3. La Figura 10F describe los resultados de los experimentos FACS que valoran la expresión de TIGIT >en células T CD4+CD25hi clasificadas, activadas con anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 horas (panel izquierdo) y los análisis de RT-PCR complementarios de los niveles de ARNm de TIGIT en células CD25" o CD25hi CD4+ en descanso o activadas .

La Figura 11 proporciona gráficas que muestran las veces del cambio en la expresión de TIGIT o CD226 en células CD25, CD25+, CD45RA+, CD45RO+ en reposo o activadas (durante uno o dos días) , como se describe en el Ejemplo 2(A) .

La Figura 12A describe los resultados de los experimentos de citometría de flujo para valorar la estabilidad de la expresión de TIGIT en las células T, como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 12B describe los resultados de ensayos basados en placas para valorar la expresión de TIGIT en células TIGIT+ y TIGIT" clasificadas, expuestas a concentraciones variables de anti-CD3, como se describe en el Ejemplo 3.

Las Figuras 13A-C muestran gráficas que describen los resultados de experimentos que valoran la capacidad de TIGIT para modular la producción de IL-10, IL-12p40 e IL-12p70 en ratones scid que carecen de células B y T, como se describe en el Ejemplo 5.

La Figura 14 describe los resultados de los experimentos de la citometría de flujo para valorar la expresión de TIGIT en células T auxiliares que producen IL-17 versus que producen IL-2, como se describe en el Ejemplo 2 (A) . Los datos en cada panel son representativos de un experimento que utiliza PBMC de un donador diferente.

La Figura 15 describe los resultados de los análisis de ARNm que valoran los niveles de expresión de TIGIT en muestras de tejido enfermo, como se describe en el Ejemplo 3. El panel más a la derecha proporciona los datos de la expresión de las células clasificadas tomadas del tejido sinovial de la artritis reumatoide . La expresión de PVR y CD226 fue indetectable en estas muestras.

La Figura 16 describe los resultados de los experimentos de RT-PCR que valoran la expresión de TIGIT (panel superior) o CD226 (panel inferior) en los tejidos tomados en varios puntos de medición de modelos de ratón de la artritis inducida por el colágeno con relación a las muestras normales.

La Figura 17 describe los resultados de los análisis del ARNm que valoran los niveles de expresión de la TIGIT, PVR y CD226 en muestras de tejido de macacos rhesus asmáticos y de control, como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 18A describe los resultados de los análisis de ARNm que valoran los niveles de expresión de la TIGIT (panel superior) en células normales o cancerosas o la expresión de CD4 en varias muestras de tumor de mama (panel inferior) . Las Figuras 18B-18D describen los resultados de los análisis de ARNm que valoran los niveles de expresión de TIGIT' (Figura 18B) , PVR (Figura 18C) , y CD226 (Figura 18D) en varias muestras de cáncer, como se describe en el Ejemplo 3. Los paneles inferiores de cada una de las Figuras 18B, 18C y 18D, muestran niveles de expresión de TIGIT, PVR o CD226, respectivamente, en muestras de cáncer que contienen varios porcentajes de células de tumor. Los recuadros en todos los paneles representan los datos estadísticamente significativos .

Las Figuras 19A-D describen los resultados de los experimentos que valoran el efecto de TIGIT en la activación de las células T, como se describe en el Ejemplo 4. La Figura 19A describe los resultados de los ensayos FACS que valoran la expresión de PVR en monocitos CD14+, i DDC y MDDC . Los experimentos anti-PVR se muestran sin sombreado y los controles que coinciden con el isotipo se muestran en gris. La Figura 19B describe los resultados de los análisis MLR in vitro utilizando DC maduradas con TNFa y células T CD4+ aisladas, que valoran el efecto de TIGIT-Fc en la proliferación de las células T. Los datos indicados con el asterisco tienen una p<0.001. La Figura 19C describe los resultados de los experimentos que valoran la proliferación de las células T mediante la incorporación de [3H] -timidina (cpm) (panel izquierdo) y la producción de IFN-? mediante ELISA (panel derecho) en las células T CD4+ activadas con anti-CD3 soluble en la presencia de las DC CDllc+ autólogas y el anticuerpo anti-TIGIT 10A7 (barras negras) o el control del isotipo (barras blancas) . Un solo asterisco indica una p<0.01; un doble asterisco indica una p<0.001. La Figura 19D describe los resultados de los experimentos que valoran la proliferación y la producción de IFN-? en células T CD4+CD25" no diferenciadas activadas con las DC CDllc+ autólogas y anti-CD3 solubles en la presencia de 100 µg/mL de TIGIT-Fc (barras grises) o el control del isotipo (barras blancas) . Un solo asterisco indica una p<0.01; un doble asterisco indica una p<0.001.

Las Figuras 20A y 20B describen los resultados de los experimentos que valoran la capacidad de las células T de TIGIT+ clasificadas para inhibir la proliferación de las células T TIGIT" en un ensayo MLR, como se describe en el Ej emplo 4.

La Figura 21A describe los resultados de los ensayos de proliferación que valoran el efecto de las células Treg TIGIT+ en la proliferación de otras células T y APC en la presencia y ausencia del anticuerpo anti-TIGIT (10A7) , como se describe en el Ejemplo 4, así como la producción de IFN-? e IL-10 en esas poblaciones celulares. . La Figura 21B describe los resultados de los ensayos de proliferación que valoran los efectos de las células Treg TIGIT+ en la proliferación de las células T no diferenciadas en comparación con las Treg TIGIT", como se describe en el Ejemplo 4A.

Las Figuras 22A-D describen los resultados de los experimentos que valoran la capacidad de TIGIT para modular la producción de la citocina en iMDDC y DC maduras, como se describe en el Ejemplo 5. Las Figuras 22A-1 a 22A-3 muestran los resultados de los ensayos ELISA que miden la producción de IL-10 o IL-12p40 en iMDDC, iMDDC estimuladas con TNF-a, iMDDC estimuladas con CD40L, iMDDC estimuladas con LPS, o iMDDC estimuladas con Pam3CSK4. Los resultados mostrados son promedios de tres experimentos. Las líneas en cada panel representan los datos de cada uno de tres donadores diferentes. La Figura 22B muestra los resultados de los análisis FACS para medir la expresión de los marcadores de la maduración de la superficie celular HLA-DR, CD80, CD83 y CD86 en las células tratadas. Los valores se representan como la intensidad de la fluorescencia media (MFI) , y los datos mostrados son representativos de tres donadores. La Figura 22C muestra los datos de los experimentos que miden los efectos de la TIGIT en la producción de otras citocinas proinflamatorias de MDDC maduradas con TNFoc o maduradas con LPS. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos. Los niveles de IL-6, IL12p70 e IL-18 se determinaron mediante análisis LUMINEX, como se describe en el Ejemplo 5. La Figura 22D muestra una gráfica que representa las cantidades relativas de secreción de TGF en iMDDC, en respuesta a TIGIT. Fe o a un control que coincide con el isotipo, como se describe en el Ejemplo 5.

Las Figuras 23A-C describen los resultados de los experimentos que valoran el efecto del tratamiento con TIGIT en la activación de la señalización corriente abajo mediante PVR, como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 23A muestra los análisis de transferencia Western del estado de fosforilación de la tirosina del PVR tratado con TIGIT o un control. La Figura 23B muestra los análisis de transferencia Western del estado de dimerización de ERK tras el tratamiento de iMDDC con TIGIT-Fe, TIGIT-Fe-DANA, o el control. La Figura 23C muestra los análisis de transferencia Western de la ß-catenina activa versus la total en iMDDC tratadas con TIGIT versus tratadas con el control .

Las Figuras 24A-B describen los resultados de los experimentos que valoran el efecto del bloqueo de varias moléculas se señalización corriente abajo en las disminuciones indicadas por TIGIT en la producción de IL-12p40 en MDDC maduradas con TNFoc, como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 24A muestra gráficas de los resultados de los experimentos que prueban el impacto de un inhibidor de la cinasa MAPK en las disminuciones inducidas por TIGIT-Fc o TIGIT-Fe-DANA en la producción de IL-12p40. La Figura 24B muestra gráficas de los resultados de los experimentos que valoran el impacto de un anticuerpo anti-TIGIT (10A7) , un anticuerpo anti-IL-10, o un anticuerpo anti-CD32 en las disminuciones mediadas por TIGIT en la producción de IL-I2p40 de las DDC maduradas con TNFa.

Las Figuras 25A-B describen los resultados de los experimentos que valoran el impacto del tratamiento con TIGIT-Fc en la activación de las células T, como se describe en el Ejemplo 7. Las gráficas de los datos de los experimentos que valoran la cantidad de proliferación de las células T (Figura 25A) o la producción de IL-2 (Figura 25B) inducidas por/en iMDDC o cultivos de MDDC madurados con TNFa/CD40L tratados con TIGIT-Fc o el anticuerpo de control.

La Figura 26 describe los resultados de los experimentos que valoran el impacto del tratamiento con TIGIT-Fc en la expresión de ILT en las MDDC humanas activadas, como se describe en el Ejemplo 7.

Las Figuras 27A-H describen los resultados de los experimentos que valoran el efecto del tratamiento con TIGIT en las respuestas de hipersensibilidad del tipo retardado en ratones, como se describe en el Ejemplo 7. La Figura 27A muestra una gráfica que representa los datos de la hinchazón de la oreja de ratones del tipo silvestre o con IL-10 desactivada, tratados con el anticuerpo anti-ambrosía, TIGIT-Fc o CTLA4. La Figura 27B muestra los datos que representan la respuesta de la proliferación de las células del bazo de ratones tratados con TIGIT-Fc-, CTLA4-Fc- o con el control a la reestimulación con KLH. Los datos muestran una respuesta ± la desviación estándar (n = 3 por grupo; el ensayo de recuperación in vitro se realizó en pozos por triplicado) . La Figura 27C muestra una gráfica que representa los datos de la hinchazón de la oreja de ratones del tipo silvestre tratados con TIGIT-Fc, TIGIT-Fc-DANA o anticuerpo anti-TIGIT 10A7. Las Figuras 27D y 27E describen gráficas que indican la respuesta de la proliferación de las células del bazo de ratones del tipo silvestre (Figura 27D) o con IL-10 desactivado (Figura 27E) tratados con TIGIT-Fc a la reestimulación con KLH. Las Figuras 27F y 27G describen gráficas que indican los niveles de IL-2 o IFN-? en sobrenadantes del cultivo de esplenocitos aislados de ratones del tipo silvestre (Figura 27F) o con IL-10 desactivada (Figura 27G) tratados con TIGIT-Fc que se han reactivado con KLH durante dos días. Los datos se muestran como la media ± s.d. (n = 3 por grupo; la recuperación in vi tro se realizó en pozos por triplicado). Un asterisco indica p<0.001. La Figura 27H describe gráficas que muestran los niveles relativos de ARNm de IL-10 (panel izquierdo) , IL-12/23p40 (panel central) , e IL-12p35 (panel derecho) de esplenocitos CDllc* de ratones del tipo silvestre o deficientes de IL-10 tratados con TIGIT-Fc y el control del isotipo, determinados mediante qRT-PCR (n = 8) . Los niveles de ARNm de IL-10 de los esplenocitos con poca cantidad de WT CDllc" también se determinaron como un control . Los. datos representan los niveles de ARNm arbitrarios con relación a los niveles de AR m correspondientes de ratones no inmunizados. Un asterisco indica p<0.05.

Las Figuras 28A-28E describen los resultados de los experimentos que valoran los efectos de la desactivación de la expresión de TIGIT mediante el ARNsi específico de TIGIT, como se describe en el Ejemplo 4(B). La Figura 28A muestra los resultados de los análisis de qRT-PCR de la eficiencia de desactivación de TIGIT versus el ARNsi de control. Los niveles de ARNm de CTLA4 se determinaron como un control no objetivo. La Figura 28B muestra los análisis FACS de la expresión de TIGIT en la superficie en células tratadas con ARNsiconcrol y ARNsiTIGIT (resumidas en la Tabla 7) . Las Figuras 28C y 28D muestran los resultados de los análisis FACS de la proliferación celular de las células T humanas CD4+CD45R0+ activadas con anti-CD3 unido a la placa solo o en conjunto con anti-CD28 en la presencia del ARNsicontrol o ARNsiTIGIT (Figura 27C) o el anticuerpo anti-TIGIT 10A7 (Figura 27D) La Figura 28E describe los resultados de los análisis de la producción de citocina de las células utilizadas en los ensayos en la Figura 28C después de dos días de cultivo. Los datos mostrados son representativos de cuatro donadores y experimentos individuales .

Las Figuras 29A-29E describen los resultados de los experimentos que valoran la expresión de CD226 en varios tipos de células y tras varios tratamientos. La Figura 29A describe los resultados de los análisis FACS que muestran la expresión superficial de CD226 en células CD4+CD45RA+ no diferenciadas clasificadas en reposo y activadas con anti-CD3 y anti-CD28 (día 1 y 2) (paneles superiores) o las células CD4+CD45RO+ de memoria (paneles inferiores) utilizando anti-CD226. La Figura 29B proporciona gráficas que muestran las veces del incremento en los niveles de ARNm en células CD4+CD45RO+, CD4+CD45RA+ y CD8+ clasificadas, activadas con anti-CD3 más anti-CD28 durante 1 ó 2 días, y células NK CD56+ clasificadas activadas con IL-2 más IL-15 durante un día, en comparación con las células no estimuladas. La Figura 29C muestra los niveles de ARNm relativos de una variedad de marcadores celulares en las células clasificadas directamente ex vivo de las PBMC como se determina mediante qRT-PCR, como un indicador de las poblaciones de células CD4+, CD8+, CD4+CD45RO+, CD4+CD25hi Treg( NK y DC CDllc+ con relación a las CD4+CD45RA+ no diferenciadas. Los datos mostrados representan un promedio de los datos de tres donadores. La Figura 29D describe los resultados de los análisis FACS para determinar la coexpresión de CD226 y CD25 en las células CD4+ activadas, tomadas de una población de PBMC humanas totales teñidas con anti-CD4, anti-CD25 y anti-CD226. La gráfica mostrada es una . representativa de dos donadores. La Figura 29E muestra una gráfica que describe los niveles de ARNm de TIGIT y CD226 en células CD4+CD25" y CD4+CD25hl activadas y en reposo aisladas de las PBMC. Los niveles de ARNm se representan como las veces de cambio con respecto a las células CD4+CD25" en reposo y son un promedio de los datos de dos donadores .

Las Figuras 30A-C describen los resultados de los experimentos que valoran la funcionalidad de las células inmunes en ratones- deficientes de TIGIT, como se describe en el Ejemplo 8. La Figura 30A muestra gráficas que comparan la proliferación de células T deficientes de TIGIT (TIGIT.KO) versus células T del tipo silvestre en la ausencia (panel izquierdo) o presencia (panel medio) de células que presentan en antígeno del tipo silvestre. El panel derecho muestra gráficas que comparan la proliferación de las células T TIGIT.KO a las células T del tipo silvestre en la presencia de células que presentan el antígeno de TIGIT.KO. La Figura 30B muestra los resultados de los ensayos FACS que valoran los niveles de IFNy e IL-4 en células T TIGIT.KO versus del tipo silvestre. La Figura 30C son gráficas que muestran los niveles medidos de las citocinas indicadas en los sobrenadantes de células T TIGIT.KO o del tipo silvestre.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La TIGIT se ha identificado previamente como un modulador putativo de la función inmune (véase, por ejemplo, la publicación de la patente de los Estados Unidos no. US20040121370 , incorporada en la presente como referencia) . Aquí, las Solicitantes demostraron que la TIGIT es un miembro de una familia descrita recientemente de proteínas relacionadas con la inmunidad, que incluye el receptor del poliovirus (PVR, también conocido como NECL5 o CD155) , proteínas 1-4 similares al PVR (PVRL1-4) , CD96 y CD226. Las Solicitantes proporcionan los elementos estructurales conservados de esta nueva familia, cuyos miembros juegan papeles en la regulación y función inmune, y proporcionan métodos para identificar miembros adicionales de la familia.

Las Solicitantes muestran que la TIGIT se une estrechamente al PVR, y se une con una Kd menor a PVRL3 (también · conocido como nectina-3 o CD113) y PVRL2 (también conocido como nectina-2 o CD112) . El PVR es un receptor de la superficie celular altamente expresado en las células dendríticas (DC) , así como FDC, fibroblastos, células endoteliales y algunas células del tumor (Sakisaka, T. & Takai, Y., Curr Opin Cell Biol 16, 513-21 (2004); Fuchs , A. & Colonna, M . , Semin Cáncer Biol 16, 359-66 (2006)). Las Solicitantes muestran mediante análisis de ARNm y de FACS, qué la TIGIT se expresa de manera predominante en una variedad de células T activadas, particularmente las células T reguladoras (Treg) , células T de memoria, células NK y células T auxiliares foliculares (Tfh) . Los estudios descritos en la presente demuestran que la interacción de TIGIT con el PVR en las DC, y muestran que esta interacción de unión modula la función de las DC, particularmente la producción de la citocina. Las DC humanas unidas a TIGIT secretan altos niveles de IL-10 y menos citocinas proinflamatorias (tales como IL-12p40 e IL-12p70) . La unión-de TIGIT a las células T inmaduras (valorado utilizando constructos de fusión de TIGIT) , inhibió la activación y proliferación de las células T. Notablemente, esta inhibición se invirtió en la presencia de un inhibidor de ERK, indicando que la activación de ERK puede ser un paso importante en el funcionamiento de la TIGIT para modular la actividad de las DC. Las Solicitantes muestran en la presente que las células T TIGIT+ suprimen la proliferación de no sólo otras células T TIGIT", sino también las células que presentan el antígeno, cuando están presentes en una población mezclada de células inmunes, y que la TIGIT misma es responsable de este efecto supresor, puesto que la inclusión de un anticuerpo anti-TIGIT de bloque en la mezcla, reduce en gran medida la supresión observada.

La TIGIT está incrementada en la expresión en los tejidos de la artritis, soriasis, trastorno inflamatorio del intestino y de cáncer de mama con relación a los tejidos de control normales, como se muestra en la presente. Las Solicitantes también demostraron directamente la capacidad de la TIGIT para modular la respuesta inmune mostrando que una proteína de fusión de TIGIT inhibió las respuestas de las células T humanas in vitro y la activación de las células T murinas en un ensayo de hipersensibilidad del tipo retardado in vivo. La TIGIT modificó de manera significativa las DC maduras,, y a un menor grado, las DC inmaduras, sugiriendo que la interacción de TIGIT-PVR puede ser importante en la afinación de una respuesta inmune reguladora una vez que las DC se vuelven células que presentan el antígeno activadas completamente. Los experimentos presentados en la presente, sugieren un mecanismo mediante el cual la TIGIT inhibe la activación de los linfocitos T a través de un ciclo de retroalimentación inhibidor vía la inducción de IL-10 en las DC. En consecuencia, la invención proporciona además, métodos novedosos para modular la función inmune, modulando los subconjuntos particulares de citocinas o los subcon untos particulares de células inmunes . Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle aquí posteriormente.

I . Definiciones Los términos "polipéptido de TIGIT", "proteína TIGIT" y "TIGIT", se utilizan de manera indistinta en la presente y se refieren a secuencias polipeptídicas específicas como se describe en la presente. Los polipéptido de TIGIT descritos en la presente, pueden aislarse de una variedad de fuentes, tal como de tejido humano o de tejido de un organismo no humano, o prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos. En una modalidad, un polipéptido de TIGIT tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4. Todas las descripciones en esta especificación que se refieren al "polipéptido de TIGIT", se refieren a cada uno de los polipéptidos individuales, así como en conjunto. Por ejemplo, las descripciones de la preparación de, purificación de, derivación de, formación de anticuerpos para o contra, la administración de, composiciones que contienen, tratamiento de una enfermedad con, etc., pertenecen a cada polipéptido de la invención de manera individual. Los términos "polipéptido de TIGIT" , "proteína TIGIT" o "TIGIT" también incluyen variantes de los polipéptidos de TIGIT descritos en la presente o conocidos en la técnica.

Una "polipéptido de TIGIT de secuencia nativa", comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de TIGIT correspondiente derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos de TIGIT de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido de TIGIT de secuencia nativa" abarca de manera específica las formas truncadas o secretadas naturales del polipéptido de TIGIT específico (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular) , las formas variantes naturales (por ejemplo, formas empalmadas de manera alterna) y las variantes alélicas naturales del polipéptido. En varias modalidades de la invención, los polipéptidos de TIGIT de secuencia nativa descritos en la presente, son polipéptidos de la secuencia nativa madura o de longitud completa que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud completa. Sin embargo, aunque el polipéptido de TIGIT descrito en las figuras acompañantes se muestran como que empiezan con residuos de metionina designados en la presente como la posición 1 del aminoácido en las figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina localizados corriente arriba o corriente debajo de la posición 1 del aminoácido en las figuras, puedan emplearse como el residuo de aminoácido inicial para los polipéptidos de TIGIT.

El "dominio extracelular" del polipéptido de TIGIT o "ECD" , se refiere a la forma del polipéptido de TIGIT que está esencialmente libre de los dominios transmembranales y citoplasmáticos. De manera ordinaria, un ECD del polipéptido de TIGIT tendrá menos que 1% de tales dominios transmembranales y/o citoplasmáticos, y de manera preferida, tendrá menos que 0.5% de tales dominios. Se entenderá que cualquier dominio transmembranal identificado para los polipéptidos de TIGIT de la presente invención, se identifican de acuerdo con el criterio empleado de manera rutinaria en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembranal pueden variar, pero más probablemente, por no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio como se identifica en la presente. Opcionalmente , por lo tanto, un dominio extracelular de un polipéptido de TIGIT puede contener de aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquier lado del límite del dominio transmembranal/dominio extracelular, y tales polipéptidos, con o sin el péptido de señal asociado, y los ácidos nucleicos que los codifican, están contemplados por la presente invención. En una modalidad, el ECD de TIGIT abarca los aminoácidos 1-139 de la proteína TIGIT humana expuesta en la SEQ ID NO: 1.

Las ubicaciones aproximadas de los "péptidos de señal" de los varios polipéptidos de TIGIT descritos en la presente, pueden identificarse utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de la señal del polipéptido de TIGIT humano expuesto en la SEQ ID NO: 1 se predice que abarca los aminoácidos 1-15 (véase, por ejemplo, la publicación de la Patente de los Estados Unidos no. US20040121370) . Se nota, sin embargo, que el límite C terminal de un péptido de señal puede variar, pero más probablemente por no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier lado del límite C terminal del péptido de señal, como se identificó inicialmente en la presente, en donde el límite C terminal del péptido de señal puede identificarse de acuerdo con el criterio empleado de manera rutinaria en la técnica para identificar ese tipo de elemento de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucí . Acids . Res . 14:4683-4690 (1986)). Además, también se reconoce que en algunos casos, la escisión de una secuencia de señal de un polipéptido secretado no es enteramente uniforme, resultando en más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, en donde el péptido de señal se escinde dentro de no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier lado del límite C terminal del péptido de señal como se identifica en la presente, y los polinucleótidos que los codifican, están contemplados por la presente invención.

"Variante del polipéptido de TIGIT", significa un polipéptido de TIGIT activo como se definió anteriormente, o a continuación, que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos con una secuencia del polipéptido de TIGIT de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia del polipéptido de TIGIT que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido de TIGIT, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier fragmento de una secuencia del polipéptido de TIGIT de longitud completa. Tales variantes del polipéptido de TIGIT incluyen, por ejemplo, polipéptidos de TIGIT en donde uno o más residuos de ¦ aminoácidos se agregan, o suprimen en el término N o C de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. De manera ordinaria, una variante del polipéptido de TIGIT tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 81% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera ' alterna al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de aminoácidos, de manera alterna al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de aminoácidos y de manera alterna al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos con una secuencia del polipéptido de TIGIT de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia del polipéptido de TIGIT que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido de TIGIT,' con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento definido de manera específica de una secuencia del polipéptido de TIGIT de longitud completa. De manera ordinaria, los polipéptidos variantes de TIGIT son de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más.

"Por ciento (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del polipéptido de TIGIT identificadas en la presente, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata, que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia del polipéptido de TIGIT específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para alcanzar el máximo por ciento de identidad de la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. La alineación para propósitos de determinar el por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias formas, que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando un programa para computadora disponible al público tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o el programa egalign (DNASTAR) . Aquellos con experiencia en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualesquier algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para propósitos en la presente, sin embargo, los valores del % de identidad de la secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa para computadora de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código de la fuente completa para el programa ALIGN-2 esta disponible al público. El programa para computadora de comparación de las secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código de la fuente se ha presentado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Reproducción de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde se registró bajo el Registro de Derechos de Reproducción de los Estados Unidos No. TXU510087. El programa ALIGN-2 también está disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California.

El programa ALIGN-2 debe recopilarse para utilizarse en un sistema de operación UNIX, de manera preferida UNIX V4. OD digital. Todos los parámetros de comparación de la secuencia se corrigen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que puede, de manera alterna expresarse como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de la secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada), se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos calificados como correspondencias idénticas mediante el programa de alineación de la secuencia ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de la secuencia de aminoácidos de B a A. Como ejemplos de cálculos del % de identidad de la secuencia de aminoácidos utilizando este método, las Tablas 1 y 2 demuestran como calcular el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos designada "Proteína de Comparación" con la secuencia de aminoácidos designada "TIGIT" , en donde "TIGIT" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de TIGIT hipotético de interés, "Proteína de Comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el cual el polipéptido "TIGIT" de interés se compara, y "X, "Y" y "Z" representan cada uno diferentes residuos de aminoácidos hipotéticos .

Tabla 1 Proteína de interés XXXXXXXXXXXXXXX (Longitud = 15 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYY (Longitud = 12 aminoácidos) % de identidad de la secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácidos que corresponden de manera idéntica entre las dos secuencias de polipéptidos determinado mediante ALIGN-2), dividido entre (el número total de residuos de aminoácidos de la proteína de interés) = 5 dividido entre 15 = 33.3% Tabla 2 Proteína de interés XXXXXXXXXX (Longitud = 10 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 aminoácidos) % de identidad de la secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácidos que corresponden de manera idéntica entre las dos secuencias de polipéptidos determinado mediante ALIGN-2) , dividido entre (el número total de residuos de aminoácidos de la proteína de interés) = 5 dividido entre 10 = 50% A menos que se indique de manera específica de otra manera, todos los valores del % de identidad de la secuencia de aminoácidos utilizados en la presente, se obtienen como se describió en el párrafo anterior y las Tablas 1 y 2 utilizando el programa para computadora ALIGN-2. Sin embargo, los valores del % de identidad de la secuencia de aminoácidos también pueden obtenerse como se describe a continuación utilizando el programa para computadora WU-BLAST-2 (Altschul et al., ethods in Enzymology 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de" WU-BLAST-2 se fijan a los valores por defecto. Aquéllos que no se fijan a los valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se fijan con los siguientes valores: distancia de superposición = 1, fracción de superposición = 0.125, umbral de la palabra (T) = 11, y matriz de calificación = BLOSUM62. Cuando se emplea WU-BLAST-2, se determina un valor del % de identidad de la secuencia de aminoácidos dividiendo (a) el número de residuos de aminoácidos idénticos correspondientes entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido de TIGIT de interés que tiene una secuencia derivada del polipéptido de TIGIT nativo y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia contra la cual el polipéptido de TIGIT de interés se compara, que puede ser un polipéptido variante de TIGIT) determinado mediante WU-BLAST-2 entre (b) el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido de TIGIT de interés. Por ejemplo, en la afirmación "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos A que tiene o que tiene al menos 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos B" , la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido de TIGIT de interés.

El por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos también puede determinarse utilizando el programa de comparación de la secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)) . El programa de comparación de la secuencia NCBI-BLAST2 puede descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov u obtenerse de otra manera del Instituto Nacional de Salud, Bethesda, D. NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en donde todos de aquéllos parámetros de búsqueda se fijan a los valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, no enmascarado = si, hebra = todas, casos esperados = 10, longitud de la complejidad baja mínima = 15/5, valor e de múltiples pasos = 0.01, constante para los múltiples pasos = 25, disminución para la alineación con huecos final = 25 y matriz de calificación = BLOSUM62.

En situaciones en donde NCBI-BLAST2 se emplea para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que puede, de manera alterna expresarse como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de la secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada), se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos calificados como correspondencias idénticas mediante el programa de alineación de la secuencia NCBI-BLAST2 en esa alineación del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de la secuencia de aminoácidos de B a A.

Los términos "polinucleótido de TIGIT" y "secuencia nucléotídica de TIGIT" , se utilizan de manera indistinta en la presente, y se refieren a secuencias polinucleotídicas específicas que codifican un polipéptido de TIGIT. Estos polinucleótidos pueden comprender ADN o ARN o ambos de ADN y ARN. Los polinucleótidos de TIGIT descritos en la presente, pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como de tejido humano o tejido de un organismo no . humano, o prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos. Todas las descripciones en esta especificación que se refieren a un "polinucleótido de TIGIT", se refieren a cada uno de los polinucleótidos individuales, así como en conjunto. Por ejemplo, las descripciones de la preparación de, purificación de, derivación de, administración de, composiciones que contienen, tratamiento de una enfermedad con, etc., pertenecen a cada polinucleótido de la invención de manera individual así como colectivamente. Los términos "polinucleótido de TIGIT" y "secuencia nucléotídica de TIGIT" también incluyen variantes de los polinucleótidos de TIGIT descritos en la presente.

Un "polinucleótido de TIGIT de secuencia nativa", comprende un polinucleótido que tiene la misma secuencia de ácidos nucleicos que el polinucleótido de TIGIT correspondiente derivado de la naturaleza. Tales polinucleótidos de TIGIT de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "polinucleótido de TIGIT de secuencia nativa" abarca específicamente los polinucleótidos que codifican las formas truncas o secretadas naturales del polipéptido de TIGIT específico (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular) , las formas variantes naturales (por ejemplo, formas empalmadas de manera alterna) y variantes alélicas naturales del polipéptido. En varias modalidades de la invención, los polinucleótidos de TIGIT de secuencia nativa descritos en la presente, son polinucleótidos de la secuencia nativa madura o de longitud completa que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa.

Un "polinucleótido variante de TIGIT" o "secuencia de ácidos nucleicos variante de TIGIT", significa una molécula de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de TIGIT activo como se define a continuación, y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una secuencia del polipéptido de TIGIT de la secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia del polipéptido de TIGIT de secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido de TIGIT, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia del polipéptido de TIGIT de longitud completa. De manera ordinaria, un polinucleótido variante de TIGIT tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 81% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de.l ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia, del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia del ácido nucleico, de manera alterna al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos y de manera alterna al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una secuencia del polipéptido de TIGIT de secuencia nativa de longitud completa, una secuencia del polipéptido de TIGIT de secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido de señal, • un dominio extracelular de un polipéptido de TIGIT, con o sin el secuencia de la señal, o cualquier otro fragmento de una secuencia del polipéptido de TIGIT de longitud completa. Las variantes no abarcan la secuencia nucleotídica nativa.

De manera ordinaria, los polinucleó.tidos variantes de TIGIT son al menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, de manera alterna al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más.

"Por ciento (%) de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican a TIGIT identificadas en la presente, se define como el porcentaje de nucleótidos . en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en secuencia de ácidos nucleicos de TIGIT de interés, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el por ciento máximo de identidad de la secuencia. La alineación para propósitos de determinar el por ciento de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos puede lograrse de varias formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando un programa para computadora disponible al público tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR) . El programa para computadora de comparación de la secuencia ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código de la fuente se ha presentado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Reproducción de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde se registró bajo el Número de Registro de Derechos de Reproducción de los Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede recopilarse del código de la fuente disponible al público. El programa ALIGN-2 debe recopilarse para utilizarse en un sistema de operación UNIX, de manera preferida, UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de la comparación de la secuencia están fijos mediante el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencias de ácidos nucleicos, el % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos C dada para, con o contra una secuencia de ácidos nucleicos D dada (que puede expresarse de manera alterna como una secuencia de ácidos nucleicos C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos para, con o contra una secuencia de ácidos nucleicos D dada), se calcula como sigue: 100 veces la fracción /Z en donde W es el número de nucleótidos calificados como correspondencias idénticas mediante el programa de alineación de la secuencia ALIGN-2 en esa alineación del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D . Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos de D a C. Como ejemplos del cálculo del % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos, las Tablas 3 y 4 demuestran como calcular el % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos designada "ADN de Comparación" con la secuencia de ácidos nucleicos designada "ADN de TIGIT" , en donde "ADN de TIGIT" representa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica a TIGIT hipotética de interés, "ADN de Comparación" representa la secuencia nucleotídica de una molécula de ácido nucleico contra la cual se va a comparar la molécula de ácido nucleico "ADN de TIGIT" de interés, y "N" , "L" y "V" representan cada uno, diferentes nucleótidos hipotéticos.

Tabla 3 ADN de interés NNNNNNNNNNNNNN (Longitud = 14 nucleótidos) ADN de Comparación NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleótidos) % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos = (el número de nucleótidos que corresponden de manera idéntica entre las dos secuencias de ácidos nucleicos determinado mediante ALIGN-2) dividido entre (el número total de nucleótidos del ADN de interés) = 6 dividido entre 14 = 42.9% Tabla 4 ADN de interés NNNNNNNNNNNN (Longitud = 12 nucleótidos) ADN de Comparación NNNNLLLW (Longitud = 9 nucleótidos) %' de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos = (el número de nucleótidos que corresponden de manera idéntica entre las dos secuencias de ácidos nucleicos determinado mediante ALIGN-2) dividida entre (el número total de nucleótidos del ADN de interés) = 4 dividido entre 12 = A menos que se indique de manera específica de otra manera, todos los valores del % de identidad de la secuencia de ácido nucleicos utilizados en la presente, se obtienen como se describió en el párrafo anterior y las Tablas 3 y 4 utilizando el programa para computadora ALIGN-2. Sin embargo, los valores del % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos pueden obtenerse como se describe a continuación utilizando el programa para computadora WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymoloqy 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 se fijan a los valores por defecto. Aquellos que no se fijan a los valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se fijan con los siguientes valores: distancia de superposición = 1, fracción de superposición = 0.125, umbral de la palabra (T) = 11, y matriz de calificación = BLOSUM62. Cuando se emplea WU-BLAST-2, se determina un valor del % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos dividiendo (a) el número de nucleótidos idénticos correspondientes entre la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de TIGIT de interés que tiene una secuencia derivada del ácido nucleico que codifica el polipéptido de TIGIT de secuencia nativa y la molécula de ácido nucleico de comparación de interés (es decir, la secuencia contra la cual la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de TIGIT de interés se compara, que puede ser un polinucleótido de TIGIT variante) , determinado mediante WU-BLAST-2 entre (b) el número total de nucleótidos de la molécula de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de TIGIT de interés. Por ejemplo, en la afirmación "una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos A que tiene al menos 80% de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos B" , la secuencia de ácidos nucleicos A es la molécula de ácidos nucleicos de comparación de interés, y la secuencia de ácidos nucleicos B es la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de TIGIT de interés.

El por ciento de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos también puede determinarse utilizando el programa de comparación de la secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de la secuencia NCBI-BLAST2 puede descargarse' de http://www.ncbi.nlm.nih.gov u obtenerse de otra manera del Instituto Nacional del Salud, Bethesda, MD. El NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en donde todos de aquéllos parámetros de búsqueda se fijan a los valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, no enmascarado = si, hebra = todos, casos esperados = 10, longitud mínima de baja complejidad = 15/5, valor e de múltiples pasos = 0.01, constante para los múltiples pasos = 25, disminución para la alineación con huecos final = 25 y matriz de calificación = BLOSUM62.

En situaciones en donde NCBI-BLAST2 se emplea para comparaciones de la secuencia, el % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos C dada para, con o contra una secuencia de ácidos nucleicos D dada (que puede expresarse de manera alterna como una secuencia de ácidos nucleicos C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos para, con o contra una secuencia de ácidos nucleicos D dada), se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos calificados como correspondencias idénticas mediante el programa de alineación de la secuencia NCBI-BLAST2 en esa alineación del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos de D a C .

En otras modalidades, los polinucleótidos variantes de TIGIT son moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de TIGIT activo y que son capaces de hibridarse, de manera preferida bajo condiciones rigurosas de hibridación y lavado, a secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido de TIGIT de longitud completa, como se describe en la presente. Los polipéptidos variantes de TIGIT pueden se aquéllos que se codifican por un polinucleótido variante de TIGIT.

"Aislado" , cuando se utiliza para describir los varios polipéptidos descritos en la presente, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio natural . Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirán típicamente con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En las modalidades preferidas, el polipéptido se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna mediante el uso de . un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, de manera preferida, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye al polipéptido in situ dentro de las células recombinantes , puesto que al menos un componente del medio natural del polipéptido no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el polipéptido aislado se prepara mediante al menos un paso de purificación.

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de TIGIT "aislado" u otro ácido nucleico que codifica el polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está asociada de manera ordinaria en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado es diferente en la forma o entorno en la cual se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido aislado, por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido específico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado incluye moléculas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido contenidas en las células que expresan ordinariamente el polipéptido, en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de aquella de las células naturales .

El término "secuencias de control" se refieren a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante enlazada de manera operable en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariontes , por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Las células eucarióticas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y mej oradores.

El ácido nucleico está "enlazado de manera operable" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está enlazado de manera operable al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador está enlazado de manera operable a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unción al ribosoma está enlazado de manera operable a una secuencia codificante si se coloca para facilitar la traducción. Generalmente, "enlazado de manera operable" significa que las secuencias de ADN que enlazan están contiguas, y en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que estar contiguos. En enlace se logra mediante la ligadura en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se utilizan oligonucleótidos sintéticos adaptadores o enlazantes de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre de manera específica, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-TIGIT únicos o anticuerpos que se unen de manera específica a cualesquiera de los otros polipéptidos descritos en la presente (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) , composiciones de anti-TIGIT o de anticuerpo con especificidad poliepitópica , anti-TIGIT de una sola cadena u otros anticuerpos, y fragmentos de anti-TIGIT u otros anticuerpos (véase a continuación) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores.

El "rigor" de las reacciones de hibridación se determina fácilmente por alguien con experiencia ordinaria en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de la sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para el recocido apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas menores. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para recocerse cuando las hebras complementarias están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Entre mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, resulta que las temperaturas relativas más altas tenderían a ser las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que' las temperaturas más bajas menos rigurosas. Para los detalles adicionales y una explicación del rigor de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) .

"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alto rigor", como se define en la presente, pueden identificarse como aquellas que: (1) emplean una baja fuerza iónica y una alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/sulfato de dodecilo sódico al 0.1% a 50°C; (2) empleo durante la hibridación de un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (volumen/volumen) de formamida con seroalbúmina bovina al 0.1%/Ficoll al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) empleo de 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5 x de solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml) , SDS al 0.1% y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55 °C, seguido por un lavado de alto rigor que consiste de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C.

Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye el uso de soluciones de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que aquéllas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato disódico 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. La persona con experiencia reconocerá como ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., conforme sea necesario para acomodar los factores tales como la longitud de la sonda y lo similar.

El término "epitopo marcado" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido de interés (como un ejemplo no limitante, un polipéptido de TIGIT) fusionado a un "polipéptido de marca" . El polipéptido de marca tiene residuos suficientes para proporcionar un epitopo contra el cual puede hacerse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto, de manera que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido de marca de manera preferida también es bastante único, de manera que el anticuerpo no reacciona de manera sustancialmente cruzada con otros epitopos. Los polipéptido de marca adecuados generalmente tienen al menos seis residuos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (de manera preferida, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos) .

Como se utiliza en la presente, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heberóloga¦ (una "adhesina") con las. funciones efectoras de dominios contantes de la inmunoglobulina . Estructuralmente , las inmunoadhesinas comprenden una función de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente del reconocimiento del antígeno y el sitio de unión de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo" ) , y una secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina. La parte de la adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina 'puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos de IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

"Activo" o "actividad" para los propósitos de la presente, se refieren a las formas de un polipéptido (como un ejemplo no limitante, un polipéptido de TIGIT) , que retiene una actividad biológica y/o inmunológica de la forma nativa o natural de ese polipéptido (en el ejemplo previo, una actividad de TIGIT) , en donde la actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimuladora) , causada por el polipéptido nativo o natural diferente a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epitopo antigénico, poseída por un polipéptido nativo o natural y una actividad "inmunológica", se refiere a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epitopo antigénico, poseída por un polipéptido nativo o natural (en el ejemplo previo, un epitopo antigénico de TIGIT) .

El término "aptámero" , se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de unirse a una molécula objetivo, tal como un polipéptido. Por ejemplo, un aptámero de la invención puede unirse de manera específica a un polipéptido de TIGIT, o a una molécula en una trayectoria de señalización que modula la expresión de TIGIT. La generación y el uso terapéutico de aptámeros están bien establecidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,475,096, y la eficacia terapéutica de Macugen® (Eyetech, New York) , para tratar la degeneración macular relacionada con la edad.

El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o completamente una actividad biológica de un polipéptido nativo descrito en la presente. De una manera similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido nativo descrito en la presente. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen, de manera específica, anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anticuerpos, fragmentos de variantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para identificar los agonistas o antagonistas de un polipéptido, pueden comprender poner en contacto un polipéptido con un agonista candidato o una molécula antagonista y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas asociadas normalmente con¦ el polipéptido .

Los términos "antagonista de la TIGIT" y "antagonistas de la actividad de TIGIT o expresión de TIGIT", se utilizan de manera indistinta y se refieren a un compuesto que interfiere con el funcionamiento normal de la TIGIT, ya sea disminuyendo la transcripción o traducción del ácido nucleico que codifica la TIGIT, o inhibiendo o bloqueando la actividad de la polipéptido de TIGIT o ambos. Los ejemplos de antagonistas de TIGIT incluyen, de manera no exclusiva, polinucleótidos antisentido, ARN interfirientes , ARN catalíticos, quimeras de ARN-ADN, aptámeros específicos de TIGIT, anticuerpos anti-TIGIT, fragmentos que se unen a TIGIT de anticuerpos anti-TIGIT, moléculas pequeñas que se unen a TIGIT, péptidos que se unen a TIGIT, y otros polipéptidos que se unen de manera específica a TIGIT (incluyendo, de manera no exclusiva, fragmentos que se unen a TIGIT de uno o más ligandos de TIGIT, fusionados opcionalmente a uno o más dominios adicionales) , de manera que la interacción entre el antagonista de la TIGIT y la TIGIT resulta en una reducción o cese de la actividad o expresión de la TIGIT. Se entenderá por alguien con experiencia ordinaria en la técnica, que en algunos casos, un antagonista de la TIGIT puede antagonizar una actividad de TIGIT sin afectar otra actividad de la TIGIT. Por ejemplo, un antagonista de la TIGIT deseable para utilizarse en ciertos métodos de la presente, es un antagonista de la TIGIT que antagoniza la actividad de1 la TIGIT en respuesta a una de la interacción del PVR, interacción de PVRL3 , o interacción de PVRL2, por ejemplo, sin afectar o afectar de manera mínima cualesquier otras interacciones de la TIGIT.

Los términos "antagonista de PVR" y "antagonista de la actividad del PVR o expresión del PVR" se utilizan de manera indistinta y se refieren a un compuesto que interfiere con el funcionamiento normal del PVR, ya sea disminuyendo la transcripción o traducción del ácido nucleico que codifica el PVR, ó inhibiendo o bloqueando la actividad del polipéptido del PVR, o ambos. Los ejemplos de antagonistas del PVR incluyen,. de manera no exclusiva, polinucleótidos antisentido, ARN interfirientes , ARN catalíticos, quimeras de ARN-ADN, aptámeros específicos del PVR, anticuerpos anti-PVR, fragmentos que se unen al PVR de anticuerpos anti-PVR, moléculas pequeñas que se unen al PVR, péptidos que se unen al PVR, y otros polipéptidos que se unen de manera específica al PVR (incluyendo, de manera no exclusiva, fragmentos que se unen al PVR de uno o más ligandos del PVR, fusionados opcionalmente a uno o más dominios adicionales) , de manera que la interacción entre el antagonista del PVR y el PVR resulta en una reducción o cese de la actividad o expresión del PVR. Se entenderá por alguien con experiencia ordinaria en la técnica que, en algunos casos, un antagonista del PVR puede antagonizar una actividad del PVR son afectar otra actividad del PVR. Por ejemplo, un antagonista del PVR deseable para utilizarse en ciertos métodos de- la presente, es un antagonista del PVR que antagoniza la actividad del PVR en respuesta a una interacción de TIGIT sin tener un impacto en las interacciones PVR-CD96 y/o PVR-CD226.

Los términos "agonista de la TIGIT" y "agonista de la actividad de la TIGIT o expresión de la TIGIT", se utilizan de manera indistinta y se refieren a un compuesto que mejora o estimula el funcionamiento normal de la TIGIT, incrementando la transcripción o traducción del ácido nucleico que codifica la TIGIT, y/o inhibiendo o bloqueando la actividad de una molécula que inhibe la expresión de la TIGIT o actividad de la TIGIT, y/o mejorando la actividad de la TIGIT normal (incluyendo, de manera no exclusiva, mejorar la estabilidad de la TIGIT o mejorar la unión de la TIGIT a uno o más ligandos objetivo) . Por ejemplo, el agonista de la TIGIT pueden seleccionarse de un anticuerpo, un fragmento que se une al antígeno, un aptámero, un ARN interfiriente , una molécula pequeña, un péptido, una molécula antisentido, y otro polipéptido de unión. En otro ejemplo, el agonista de la TIGIT puede ser un polinucleótido seleccionado de un aptámerq, ARN interfiriente , o molécula antisentido que interfiere con la transcripción y/o traducción de una molécula inhibidora de TIGIT. Se entenderá por alguien con experiencia ordinaria en la técnica que en algunos casos, un agonista de la TIGIT puede agonizar una actividad de la TIGIT sin afectar otra actividad de la TIGIT. Por ejemplo, un agonista de la TIGIT deseable para utilizarse en ciertos métodos de la presente, es un agonista de la TIGIT que agoniza la actividad de la TIGIT en respuesta a una de la interacción de PVR, interacción de PVRL3 o interacción de PVRL2, por ejemplo, sin afectar o afectar al mínimo cualesquier otras interacciones de la TIGIT.

Los términos "agonista del PVR" y "agonista de la actividad del PVR o expresión del PVR", se 'utilizan de manera indistinta y se refieren a un compuesto que mejora o estimula el funcionamiento normal del PVR, incrementando lá transcripción o traducción del ácido nucleico que codifica el PVR, y/o inhibiendo o bloqueando la actividad de una molécula que inhibe la expresión del PVR o la actividad del PVR, y/o mejorando la actividad del PVR normal (incluyendo, de manera no exclusiva, mejorar la estabilidad del PVR o mejorar la unión del PVR a uno o más ligandos objetivo) . Por ejemplo, el agonista del PVR puede seleccionarse de un anticuerpo, un fragmento que se une al antígeno, un aptámero, un AR interfiriente , una molécula pequeña, un péptido, una molécula antisentido, y otro polipéptido de unión. En otro ejemplo, el agonista del PVR puede ser un polinucleótido seleccionado de un aptámero, un ARN interfiriente , o molécula antisentido que interfiere con la transcripción y/o traducción de una molécula inhibidora del PVR. Se entenderá por alguien con experiencia ordinaria en la técnica, que en algunos casos, un agonista del PVR puede agonizar una actividad del PVR sin afectar otra actividad del PVR. Por ejemplo, un agonista del PVR deseable para utilizarse en ciertos métodos de la presente, es un agonista del PVR que agoniza la actividad del PVR en respuesta a la interacción de la TIGIT, o que imita a la TIGIT para interactuar con el PVR, por ejemplo, sin afectar o afectar al mínimo las interacciones de unión de PVR-CD96 o PVR-CD226.

"Tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es evitar o hacer lenta (disminuir) la condición o trastorno patológico seleccionado. Aquéllos en necesidad de tratamiento incluyen aquéllos ya con el trastorno, así como aquéllos propensos a tener el trastorno o aquéllos en los cuales se va a evitar el trastorno.

La administración "crónica" se refiere a la administración de los agentes en un modo continuo, en oposición a un. modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un periodo de' tiempo extendido. La administración "intermitente" es el tratamiento que no se hace de manera consecutiva sin interrupción, sino más bien de naturaleza cíclica.

"Mamífero" para propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológicos, deportivos o mascotas, tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. De manera preferida, el mamífero es un humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluyen la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

"Portadores", como se utiliza en la presente, incluyen portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que son no tóxicos para la célula o mamífero que se expone a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el portador fisiológicamente aceptable está en una solución acuosa con el pH amortiguado. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona ; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, de manera preferida la región que se une al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2 Y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062

[1995] ) ; moléculas de anticuerpos de una sola cadena; y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos que se unen al antígeno idénticos, llamados f agmentos "Fab" , cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fe" residual, una designación que refleja la capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 <2ue tiene dos sitios que se combinan con el antígeno y todavía es capaz de reticular el antígeno.

"Fv" es el fragmento del anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión al antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha no covalente . Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión del antígeno en la superficie del dímero VH-VL. De manera colectiva, las seis CDR confieren la especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) , tienen la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad menor que todo el sitio de unión.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos cuantos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el residuo de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos del anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de ¦ los fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulación entre los mismos. Otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpo .también son conocidos .

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado, pueden asignarse a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de. la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, a las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4, IgA e IgA2.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "sFv" comprende los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica . De manera preferida, el polipéptido Fv comprende además un enlazante polipeptídico entre los dominios VH y VL que permiten que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de los sFv, véase Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg and Moore eds . , Springer-Verlag, New York, p . 269-315 (1994).

Los términos "diacuerpos" se refieren a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios dé unión al antígeno, fragmentos los cuales comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL) . al utilizar un enlazante que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En ciertas modalidades, el anticuerpo se purificará (1) a mayor que 95% en peso del anticuerpo, determinado mediante el método de Lowry, y de manera más preferida, más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna -mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras- o no reductoras, utilizando un tinte o tinción tal como, de manera no exclusiva, azul de Coomassie o tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes , puesto que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos un paso de purificación.

Un anticuerpo que "se une de manera específica a" o es "específico para" un polipéptido o un epitopo particular en un polipéptido particular, es uno que se une a ese polipéptido o epitopo particular en un polipéptido particular, sin unirse sustancialmente a otro polipéptido o epitopo del polipéptido.

El término "región hipervariable" , "HVR" o "HV" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a las regiones de un dominio variable del anticuerpo, que son hipervariables en la secuencia y/o forman espiras definidas estructuralmente . Generalmente, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en VH (Hl, H2 , H3 ) , y tres en VL (Ll, L2 , L3). En los anticuerpos nativos, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3 en particular, juega un papel único para conferir una especificidad fina a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al., I aunity 13:37-45 (2000); Johnson y u, in Methods ¦ in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). En realidad, los anticuerpos de camélido naturales que consisten de una cadena pesada, sólo son funcionales y estables en la ausencia de la cadena ligera. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Varias delineaciones de la HVR están en uso y se abarcan en la presente. Las Regiones que Determinan la Complementariedad (CDR) de Kabat, se basan en la variabilidad de la secuencia y son las más comúnmente utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Iromunological Interest, 5a Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en su lugar a la ubicación de las espiras estructurales (Chothia y Lesk J". Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de la AbM representan un compromiso entre las HVR de Kabat y las espiras estructurales de Chothia, y se utilizan por el programa de modelado del anticuerpo AbM de Oxford Molecular. Las HVR de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR se indican a continuación.

Espira Rabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-¦L34 L26-L32 L30 -L36 L2 L50-L56 L50-¦L56 L50-L52 L46 -L55 L3 L89-L97 L89-¦L97 L91-L96 L89 -L96 Hl H31-H35B H26-¦H35B H26-H32 H30 -H35B (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-•H35 H26-H32 H30 -H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50- H58 H53-H55 H47 -H58 H3 H95-H102 H95-¦H102 H96-H101 H93 -H101 Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como Sigue: 24-36 Ó 24-34 (Ll), 46-56 Ó 50-56 (L2) y 89-97 ó 89-96 (L3) en VL y 26-35 (Hl) , 50-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, ó 95-102 (H3) en VH. Los residuos del dominio variable están numerados de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

Los residuos del "marco" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes a los residuos de la HVR definidos en la presente.

El término "numeración del residuo de dominio variable como en Kabat" o "numeración de la posición del aminoácido como en Kabat", y las variaciones de lo mismo, se refiere al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de la cadena pesada o los dominios variables de la cadena ligera de la recopilación de los anticuerpos en Kabat et al., supra. Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento de, o inserción en, un FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir un inserto de un solo aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc., de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante la alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar" .

El sistema de numeración de Kabat se utiliza generalmente cuando se refiere a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences oí Immunological Interest . 5a Ed. Servicios de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991)). El "sistema de enumeración de EU" o "índice EU" se utiliza generalmente cuando se refiere a un residuo en una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU reportado en Kabat et al., supra) . El "índice EU como en Kabat", se refiere a la numeración del residuo del anticuerpo EU de IgGl humano. A menos que se indique de otra manera en la presente, las referencias a los números del residuo en el dominio variable de los anticuerpos, significa la numeración del residuo mediante el sistema de numeración de Kabat. A menos que se indique de otra manera en la presente, las referencias a los números de residuo en el dominio constante de los anticuerpos, significan la numeración del residuo mediante el sistema de numeración EU (por ejemplo, véase la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/640,323, Figuras para la numeración EU) .

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo, que resultan en una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee esas alteraciones. En una modalidad, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad pueden producirse utilizando ciertos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992), describen la maduración por afinidad por la mezcla · del dominio VH y VL . La mutagénesis aleatoria de HVR y/o los residuos del marco se describen, por ejemplo. Barbas et al. Proc Nat . Acad. Sci . USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Inmuno1. 154 (7) : 3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Ciertos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben de manera sustancial o completa la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo agonista", como se utiliza en la presente, es un anticuerpo que limita parcial o completamente al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

La palabra "marca" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga de manera directa o indirecta a un anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado" . La marca puede ser detectable por si misma (por ejemplo, marcas de radioisótopos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.

Mediante "fase sólida" se quiere decir una matriz no acuosa a la cual el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Los ejemplos de fases sólidas abarcadas en la presente incluyen, de manera no exclusiva, aquéllas formadas de manera parcial o completa de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa) , poliacrilamidas , poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 4,275,149.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos , que es útil para el suministro de un fármaco (tal como un polipéptido descrito en la presente o anticuerpos para el mismo) a un mamífero. Los componentes del liposoma se arregla comúnmente en una formación de bicapa, similar al arreglo de los lípidos de las membranas biológicas.

Una "molécula pequeña" se define en la presente por tener un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltons.

El término "enfermedad relacionada con la inmunidad" , significa una enfermedad en la cual un componente del sistema inmune de un mamífero causa, media o contribuye de otra manera a una morbilidad en el mamífero. También se incluyen enfermedades en las cuales la estimulación o intervención de la respuesta inmune tiene un efecto de mejora en la progresión de la enfermedad. Incluidas dentro de este término están las enfermedades inflamatorias mediadas por la inmunidad, las enfermedades inflamatorias mediadas no por la inmunidad, enfermedades infecciosas, enfermedades de inmunodeficiencia, neoplasia, etc.

El término "enfermedad mediada por las células T" , significa una enfermedad relacionada con la inmunidad en la cual las células T median de manera directa o indirecta o contribuye de otra manera a una morbilidad en un mamífero. La enfermedad mediada por las células T puede asociarse con los efectos mediados por las células, efectos mediados por la linfocina, etc., e incluso efectos asociados con las células B si las células B son estimuladas, por ejemplo, por las linfocinas secretadas por las células T.

Los ejemplos de enfermedades relacionadas con la inmunidad e inflamatorias, algunas de las cuales son mediadas por las células T, que pueden tratarse de acuerdo con la invención, incluyen el lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías , esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis , polimiositis) , síndrome de Sjógren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal) , trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada por la inmunidad) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) , diabetes mellitus, enfermedad renal mediada por la inmunidad (glomerulonefritis , nefritis túbulointersticial) , enfermedades desmielinizantes de los sistemas nervioso central y periférico tales como esclerosis · múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré , y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros viruses no hepatotrópicos) , hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, trastorno inflamatorio del intestino (IBD) (colitis ulcerativa: enfermedad de Crohn) , enteropatía sensible al gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel autoinmunes o mediadas con la inmunidad incluyendo enfermedades hullosas de la piel, eritema multiforme y dermatitis por contacto, soriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eosinofílicas , fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades asociadas con transplantes incluyendo rechazo del injerto y enfermedad de injerto versus hospedero. Las enfermedades infecciosas incluyendo enfermedades virales tales como SIDA (infección por VIH) , hepatitis A, B, C, D y E, herpes, etc., infecciones bacterianas, infecciones micóticas, infecciones por protozoarios e infecciones parasitarias también pueden tener componentes y/o etiología inmune y/o inflamatoria.

Varias enfermedades de la piel están correlacionadas con una respuesta inmune aberrante y con la autoinmunidad . Las enfermedades tales como la soriasis tienen como marca característica el ampollamiento de la piel, descamación de la piel, edema y la presencia de autoanticuerpos que se unen a las proteínas de la piel. En esta solicitud, los experimentos determinan que la expresión de TIGIT está sobrerregulada a la piel soriática vs . la piel normal. La modulación de -la expresión y/o actividad de la TIGIT puede ser útil en el tratamiento de los síntomas o las causas subyacentes de la soriasis.

El término trastorno inflamatorio del intestino ("IBD"), ' describe un grupo de trastornos inflamatorios crónicos de causas desconocidas, en las cuales el aparato digestivo (intestino) se inflama, causando con frecuencia calambres o diarrea frecuentes. Se estima que el predominio de la IBD en los Estados Unidos es de aproximadamente 200 por 100,000 personas de la población. Los pacientes con IBD pueden dividirse en dos grupos principales, aquéllos con colitis ulcerativa ( "UC" ) y aquéllos con la enfermedad de Crohn ("CD") .

En pacientes con UC, hay una reacción inflamatoria que involucra principalmente la mucosa colónica. La inflamación es típicamente uniforme y continua sin áreas intervinientes de la mucosa normal . Las' células de la mucosa superficial así como el epitelio y la submucosa de la cripta están involucradas en una reacción inflamatoria con infiltración de neutrófilos. Finalmente, esta situación progresa típicamente al daño epitelial con la pérdida de las células epiteliales que resultan en múltiples ulceraciones, fibrosis, displasia y retracción longitudinal del colon. La CD difiere de la UC en que la inflamación se extiende a través de todas las capas de la pared intestina e involucra el mesenterio así como los nodos linfáticos. La CD puede afectar cualquier parte del canal alimenticio de la boca al ano. La enfermedad es, con frecuencia discontinua, es decir, segmentos severamente enfermos del intestino se separan de áreas aparentemente libres de la enfermedad. En la CD, la pared intestinal también se engrosa, lo que puede conducir a obstrucciones. Además, las fístulas y fisuras no son poco comunes .

Clínicamente, la IBD está caracterizada por diversas manifestaciones que resultan con frecuencia en un curso crónico impredecible . La diarrea sanguinolenta y el dolor abdominal están acompañados frecuentemente por fiebre y pérdida de peso. La anemia no es poco común, así como la fatiga severa. Las manifestaciones de las articulaciones varían de artralgia a artritis aguda, así como las anormalidades en la función del hígado que están asociadas normalmente con la IBD. Los pacientes con IBD también tiene un riesgo incrementado de carcinomas del colon en comparación con la población general. Durante los "ataques" agudos de IBD, el trabajo y otra actividad son usualmente imposibles, y con frecuencia un paciente es hospitalizado.

Aunque la causa de la IBD permanece desconocida, varios factores, tales como los genéticos, infecciosos y susceptibilidad inmunológica se han implicado. La IBD es mucho más común en los caucásicos, especialmente aquéllos de ascendencia judía. La naturaleza inflamatoria crónica de la condición ha causado una búsqueda intensa de una posible causa infecciosa. Aunque se han encontrado agentes que estimulan la inflamación aguda, no se ha encontrado que ninguno cause la inflamación crónica asociada con la IBD. La hipótesis de que la IBD es una enfermedad autoinmune está apoyada por la manifestación extraintestinal mencionada previamente de la IBD como artritis de las articulaciones, y la respuesta conocida positiva de la IBD al tratamiento con agentes terapéuticos, tales como glucocorticoides adrenales, ciclosporina y azatioprina, que se conocen por suprimir la respuesta inmune. Además, el tracto GI , más que cualquier otro órgano del cualquier otro órgano del cuerpo, está expuesto de manera continua a sustancias antigénicas potenciales, tales como las proteínas de los alimentos, subproductos bacterianos (LPS) , etc.

Además, el riesgo de cáncer de colon está altamente elevado en pacientes con colitis ulcerativa severa, particularmente si la enfermedad ha existido durante varios años. Aproximadamente 20-25% de los pacientes con IBD eventualmente requieren cirugía para eliminar el colon, debido al sangrado masivo, enfermedad debilitante crónica, perforación del colon o riesgo de cáncer. La cirugía se realiza también algunas veces cuando otras formas de tratamiento médico fallan o cuando los efectos colaterales de los esteroides y otros medicamentos amenazan la salud del paciente. Puesto que la cirugía es invasiva y altera drásticamente la vida, no es un régimen de tratamiento altamente deseable, y es típicamente el tratamiento de último recurso. Con el fin de entender mejor esta enfermedad y posiblemente tratarla, los experimentos determinaron que la TIGIT estaba sobrerregulada tanto en la CD como en la UC cuando- se comparan con el tejido normal. La modulación de la expresión y/o actividad de la TIGIT puede probar ser útil en el tratamiento de una o más formas de IBD.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica que involucra principalmente la membrana sinovial de múltiples articulaciones, con la lesión resultante del cartílago articular. La patogénesis es dependiente de los linfocitos T y está asociada con la producción de factores reumatoides, autoanticuerpos dirigidos contra la IgG autóloga, con la formación resultante de complejos inmunes que alcanzan altos niveles en el fluido de la articulación y la sangre. Estos complejos en las articulaciones pueden inducir el infiltrado marcado de los linfocitos y monocitos hacia el sinovio y cambios marcados sinoviales posteriores; el espacio/fluido de la articulación es infiltrado por las células similares con la adición de numerosos neutrófilos. Los tejidos afectados son principalmente las articulaciones, con frecuencia en un patrón simétrico. Sin embargo, la enfermedad extraarticular también aparece en dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extraarticulares con la enfermedad de las articulaciones progresiva en curso y las lesiones típicas de la fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas. La segunda forma de la enfermedad extraarticular es el llamado síndrome de Felty, que aparece tardíamente en el curso de la enfermedad de RA, algunas veces después de que la enfermedad de las articulaciones se ha vuelto quiescente, e involucra la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia . Esta puede acompañarse por vasculitis en múltiples órganos con la formación de infartos, úlceras de la piel y gangrena. Los pacientes también desarrollan con frecuencia nodulos reumáticos en el tejido del subcutis superpuesto a las articulaciones afectadas; la etapa tardía de los nodulos tiene centros necróticos rodeados por un infiltrado celular inflamatorio mezclado. Otras manifestaciones que pueden ocurrir en la RA incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, queratoconjuntivitis seca y nodulos reumatoides.

La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que empieza con frecuencia a menos de 16 años de edad. Su fenotipo tiene algunas similitudes con la RA; algunos pacientes que* son positivos al factor reumatoide, son clasificados como artritis reumatoide juvenil. La enfermedad se subclasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser severa y es típicamente destructiva y conduce a la anquilosis de las articulaciones y a un crecimiento retardado. Otras manifestaciones pueden incluir uveítis anterior crónica y amiloidosis sistémica.

El término "cantidad efectiva" es una concentración o cantidad de un polipéptido y/o un agonista/antagonista, que resulta en alcanzar un propósito indicado particular. Una "cantidad efectiva" de un polipéptido o agonista o antagonista del mismo, puede determinarse de manera empírica. Además, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una concentración o una cantidad de un polipéptido y/o agonista/antagonista, que es efectiva para lograr un efecto terapéutico indicado. Esta cantidad también puede determinarse de manera empírica.

El término "agente citotóxico" , como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o causa la destrucción de las células. El término pretende incluir los isótopos radioactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186) , agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, micótico, de plantas o animales o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen adriamicina, doxorrubicina , epirrubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida , tiotepa, busulfano, citoxina, taxoides, por ejemplo, paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) , y doxetaxel (Taxotero, Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) , toxótero, metotrexato, cisplatino, melfalano, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina , mitomicinas, esperamicinas (véase la Patente de los Estados Unidos No. 4,675,187), melfalano y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se incluye en esta definición, los agentes hormonales que actúan para regular e inhibir la acción hormonal en los tumores, tales como el tamoxifeno y la onapristona.

Un "agente inhibidor del crecimiento" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerígena sobreexpresando cualquiera de los genes identificados en la presente, ya sea in vitro o in vivo. Así, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce de manera significativa el porcentaje de células que sobreexpresan tales genes en la fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar diferente a la fase S) , tales como agentes que inducen la detención de Gl y la detención de la fase M. Los bloqueadores de la fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxol , y los inhibidores topo II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen la Gl también entran en la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina , cisplatino, metotrexato, 5- fluorouracilo y ara-C. La información adicional puede encontrarse, por ejemplo, en The Molecular Basis of Cáncer, endelsohn e Israel, eds . , Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders : Filadelfia, 1995), especialmente la página 13.

El término "citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúa en otras células como mediadores intracelulares . Ciertos ejemplos de tales citocinas son las linfocinas, monocinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Incluidas entre las citocinas están, por ejemplo, la hormona del crecimiento tal como la hormona del crecimiento humana, la hormona del crecimiento humana N-metionilo y la hormona del crecimiento bovino; la hormona paratiroidea ; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glucoproteína tales como la hormona que estimula el folículo (FSH) , hormona que la estimula la tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento del fibroblasto; prolactina; lactógeno de placentario; factor a y ß de necrosis del tumor; sustancia que inhibe la muleriana; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor del crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores del crecimiento nervioso, tales como NGF-ß; factor de crecimiento de las plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-a y TGF-ß; factor de crecimiento I y II simular a la insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductores ; interferones tales como interferón a, ß y ?,- factores que estimulan la colonia (CSF) tales como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF) ; interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-?a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis del tumor tal como el TNF-cc o TNF-ß; y otros factores polipeptídicos , incluyendo LIF y el ligando kit (KL) . Como se utiliza en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de un cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

Como se utiliza en la presente, el término "inmunoadhesina" , designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de la inmunoglobulina . Estructuralmente , las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada, que es diferente al reconocimiento del antígeno y al sitio de unión de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo" ) , y una secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina, típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos- IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2) , IgE, IgD o IgM.

Como se utiliza en la presente, el término "células inflamatorias", designa células que mejoran la respuesta inflamatoria tales como células mononucleares , eosinófilos, macrófagos y neutrófilos polimorfonucleares (PMN) .

II. Composiciones y Métodos de la Invención La TIGIT se ha identificado previamente como un modulador putativo de la función inmune (véase, por ejemplo, la publicación de la patente de los Estados Unidos no. US20040121370, incorporada en la presente como referencia) . En la presente, las Solicitantes demuestran que la TIGIT es un miembro de una familia descrita recientemente de proteínas relacionadas con la inmunidad denominada la familia de "proteínas similares a TIGIT" (TLP) que incluye el receptor del poliovirus (PVR, también conocido como NECL5 o CD155) , proteínas 1-4 similares al PVR (PVRL1-4) , CD96 y CD226. Las Solicitantes proporcionan los elementos estructurales conservados de esta nueva familia TLP, cuyos miembros juegan papeles en la regulación y función inmune, y proporcionan métodos para identificar los miembros de la familia adicionales. PVRL1-4 y PVR comparten una arquitectura del dominio común (IgV- IgC- IgV) , mientras que CD226 y CD96 carecen del dominio IgV proximal de la membrana . Los segmentos intracelulares de estas ocho proteínas muestran únicamente una similitud limitada unas con otras fuera del motivo de unión de afadina compartido entre PVRL1-3; PVRL4 carece de esta secuencia, pero se sabe todavía que se une a la afadina. Basándose en la estructura cristalina del dominio IgV relacionado de NECL-1 (Dong et al., J. Biol . Chem. 281: 10610-17 (2006)), se predice que el primer y tercer motivos caen en las espiras de la horquilla entre las hebras beta B y C y F y G, respectivamente. Estas dos espiras son adyacentes una a la otra en un extremo del pliegue IgV. El segundo motivo comprende las hebras beta C y C" que están involucradas en formar parte de la interfase homodimérica para NECL-1. Así, estos motivos de la secuencia pueden jugar un papel en las interacciones homo y heterotípicas específicas observadas entre los miembros de la familia del PVR.

Los miembros de la familia TLP comprenden varios aminoácidos absolutamente conservados, incluyendo alanina67, glicina74, prolina114 y glicina116. Además, los miembros de la familia TLP comprenden varios aminoácidos que están sustancialmente conservados (por ejemplo, encontrados en la mayoría de los miembros de la familia, pero no en cada miembro de la familia) , incluyendo un aminoácido seleccionado de valina, isoleucina y leucina en la posición 54, un aminoácido seleccionado de serina y treonina en la posición 55, una glutamina en la posición 56, una treonina en la posición 112, y un aminoácido seleccionado de fenilalanina y tirosina en la posición 113. Los miembros de la familia TLP también comprenden tres submotivos estructurales: valina/isoleucina5-serina/treonina55-glutamina5S ; alanina67-X6e"73-glicina74 (en donde X es cualquier aminoácido) ; y treonina112-fenilalanina/tirosina113-prolina114-x115-glicina116 (en donde X es cualquier aminoácido) . Se entenderá por alguien con experiencia ordinaria en la técnica, que la numeración utilizada anteriormente es con respecto a la secuencia de la proteína TIGIT humana, y aunque la posición relativa de estos residuos y motivos conservados en diferentes miembros de la familia de la proteína TLP es idéntica a la posición de aquellos aminoácidos en la secuencia de la TIGIT humana, la numeración absoluta de esos residuos en otros miembros de la familia TLP puede diferir.

Dada la implicación de los miembros de la familia TLP identificada en la regulación y función inmune, también probablemente otros miembros de esta familia de proteínas están involucrados en la regulación y función inmune. En consecuencia, la invención proporciona métodos para determinar si una proteína dada es un miembro de la familia TLP alineando la secuencia de la proteína a las secuencias de uno o más de los miembros de la familia identificados anteriormente y valorando la presencia o ausencia en la secuencia de proteína dada de los residuos conservados de manera absoluta identificados anteriormente, los residuos conservados sustancialmente identificados anteriormente, y/o los submotivos estructurales identificados anteriormente. La invención también proporciona método para identificar otros miembros de la familia de la proteína TLP buscando una o más bases de datos de la secuencia para las proteínas cuyas secuencias de aminoácidos comprenden los residuos conservados de manera absoluta identificados anteriormente, los residuos conservados sustancialmente identificados anteriormente y/o los submotivos estructurales identificados anteriormente.

La identificación de la familia TLP por las Solicitantes de la presente, también presenta la posibilidad de que las características estructurales comunes de los miembros de la familia TLP puedan permitir que dos o más miembros de la familia TLP se modulen de manera similar. Por ejemplo, si los residuos de aminoácidos y submotivos conservados y sustancialmente conservados en cada miembro de la familia TLP, dan lugar a estructuras tridimensionales similares en aquellos miembros de la familia en uno o más dominios de cada proteína, entonces aquellas estructuras tridimensionales similares pueden seleccionarse con el fin de modular simultáneamente más de un miembro de la familia TLP, o incluso todos los miembros de la familia TLP al mismo tiempo. La invención también proporciona así, agentes ( "agentes que interactúan con TLP" ) , que interactúan de manera específica con las regiones conservadas o sustancialmente conservadas de los miembros de la familia TLP. Tales agentes pueden utilizarse para identificar uno o más miembros adicionales de la familia TLP, valorando si una proteína candidata interactúa con un agente que interactúa con TLP. La interacción de la proteína candidata con el agente que interactúa con TLP puede indicar que la proteína puede ' también ser un miembro de la familia TLP. Los agentes que interactúan con TLP pueden modular la actividad de TLP. Por ejemplo, un agente que interactúa con TLP puede ser un antagonista de la actividad de TLP, incluyendo, de manera no exclusiva, un inhibidor de molécula pequeña, un anticuerpo inhibidor o un fragmento que se une al antígeno del mismo, un aptámero, y un péptido inhibidor. En otro ejemplo, un agente que interactúa con TLP puede ser un agonista de la actividad de TLP, incluyendo, de manera no exclusiva, un anticuerpo agonizante o un fragmento que se une al antígeno del mismo, un péptido agonizante, y una molécula pequeña que estabiliza una estructura de la proteína TLP para facilitar la actividad de la proteína TLP. Los agentes que interactúan con TLP pueden identificarse en una variedad de formas conocidas, por ejemplo, utilizando los métodos de selección descritos en la presente.

Las Solicitantes muestran mediante análisis de ARNm y FACS que la TIGIT se expresa de manera predominante en una variedad de células T activadas, particularmente las células T reguladoras (Treg) , células T de memoria, células NK y células T auxiliares de las células B foliculares (Tfh) , aisladas del tejido tonsilar.. La invención proporciona así métodos para identificar si una célula seleccionada es o no una célula Treg, una célula T de memoria, una célula NK o una célula TFh basándose en si la célula expresa o no a TIGIT.

La invención también proporciona métodos para utilizar la TIGIT para purificar las células Treg, las células T de memoria, las células NK y las células Tph de otros tipos de células inmunes que no expresan a TIGIT, utilizando cualquiera de los métodos de purificación conocidos en la técnica y/o descritos en la presente (como un ejemplo no limitante, mediante citometría de flujo) . Las Solicitantes también demuestran que la expresión más alta de TIGIT en estas poblaciones celulares aparece en las células Treg activadas.- Así, la invención también proporciona métodos para identificar si una célula dada es una célula Treg activada basándose en su nivel de expresión de TIGIT con relación a los niveles de expresión de TIGIT en una o más muestras de control (en donde las muestras de control pueden ser valores predeterminados de las poblaciones de subconjuntos de células T ejemplares, o las muestras de control pueden ser otras muestras de las subpoblaciones de células T conocidas, tales como células Treg activadas, células Treg no activadas, células T no diferenciadas, células T de memoria, células NK, células TFh u otras poblaciones de células T) . También se proporcionan métodos para determinar si una célula Treg dada está activada, determinando su nivel de expresión de TIGIT con, relación a los niveles de expresión de TIGIT en una o más muestras de células Treg activadas o inactivadas de control, o con relación a los valores de expresión de TIGIT predeterminados en las poblaciones de células Treg activadas o inactivadas conocidas. Se proporcionan además métodos para aislar de manera separada las células Tr„a activadas de otras células T, utilizando cualquiera de los métodos de purificación conocidos en la técnica y/o descritos en la presente, en donde la cantidad de TIGIT expresada en la célula, puede utilizarse para separar la célula de otras células (como un ejemplo no limitante, mediante citometría de flujo) .

Las Solicitantes demostraron en la presente que la TIGIT se une estrechamente al PVR, y se une con una Kd menor al PVRL3 (también conocido como nectina-3 o CD113) y el PVRL2 (también conocido como nectina-2 o CD112) . Como se ejemplifica por las Solicitantes, la TIGIT que se une al PVR bloquea la interacción del PVR con otros dos ligandos, CD226 y CD96, y CD226 es un inhibidor menos efectivo de la interacción TIGIT-PVR que la TIGIT es de la interacción PVR-CD226. Las Solicitantes produjeron anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, el anticuerpo anti-TIGIT 10A7 descrito en la presente) , que inhibe la unión de TIGIT o una proteina de fusión de TIGIT al PVR expresado en la superficie celular. Las Solicitantes produjeron además otros anticuerpos, tales como el anticuerpo 1F4 descrito en la presente, con diferentes especificidades del epitopo en TIGIT que 10A7. De manera notable, CD226 no se expresa de manera significativa en las células Treg o TFh, dos tipos de células que expresan altamente a TIGIT.

Apoyada por estos hallazgos, la invención proporciona agonistas y antagonistas de la interacción TIGIT-PVR, la interacción TIGIT-PVRL2 , y la interacción TIGIT- PVRL3, y métodos para modular la unión de TIGIT-PVR, la unión de TIGIT- PVRL2 y la unión de TIGIT-PVRL3 in vi tro o in vivo, utilizando tales agonistas y antagonistas. También se proporcionan métodos para modular la interacción de CD226-PVR y/o la interacción de CD96-PVR, administrando TIGIT (un competidor para la unión del PVR) o un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento que se une al antígeno del mismo in vi tro o in vivo. La invención incluye además anticuerpos anti-TIGIT y fragmentos de los mismos, tanto agonizantes como antagonizantes , y en particular, los anticuerpos anti-TIGIT 10A7 y 1F4 y tipos alternos de anticuerpos que comprenden las CDR del anticuerpo anti-TIGIT 10A7 y/o 1F4.

Los estudios descritos en la presente demuestran la interacción de la TIGIT con el PVR en las DC, y muestra que esta interacción de unión modula la función de las DC, particularmente la producción de citocina. El PVR es un receptor de la superficie celular conocido por estar altamente expresado en las células dendríticas (DC) , así como FDC, fibroblastos, células endoteliales , y algunas células tumorales (Sakisaka, T. & Takai, Y., Curr Opin Cell Biol 16, 513-21 (2004); Fuchs, A. & Colonna, M . , Semin Cáncer Biol 16, 359-66 (2006)). Las DC humanas unidas a TIGIT secretan altos niveles de IL-10 y menos citocinas proinflamatorias y otras citocinas (tales como IL-12p40, IL-12p70, IL-6, IL-18 e IFNy) . La TIGIT no tiene un efecto en la producción de ciertas citocinas tales como IL-23. Esta citocina que se tuerce tras la unión a TIGIT se observó únicamente en las células que se han estimulado por TNFoc o CD40/LPS, y no en células estimuladas con TLR2- o Pam3CSK4, sugiriendo que la TIGIT es un medio mediante el cual el sistema inmune puede afinar la función de las DC. La unión de las TIGIT a las células T inmaduras (como se valoró utilizando los constructos de fusión de TIGIT) , inhibió la activación y proliferación de las células T. Sin embargo, el tratamiento de la TIGIT no afecta la capacidad de las DC derivadas de los monocitos inmaduros (iMDDC) para madurar, ni induce directamente la maduración de esas células. De manera notable, esta inhibición se invirtió en la presencia de un inhibidor de ERK, indicando que la activación de ERK puede ser un paso importante en el funcionamiento de la TIGIT para modular la actividad de las DC. De hecho, las Solicitantes demostraron que la unión de la TIGIT a PVR, resulta en la fosforilación de PVR y en la fosforilación incrementada del dimero pERK, pero no el monómero pERK. Este no fue un efecto generalizado, puesto que, por ejemplo, la trayectoria de señalización intracelular p38 no fue modulada por el tratamiento con TIGIT-Fc de las células. Las Solicitantes muestran en la presente que las células T TIGIT+ suprimen la proliferación de no sólo otras células T TIGIT", sino también las células que presentan el antígeno, cuando están presentes en una población mezclada de células inmunes. Las Solicitantes demostraron además que la interacción TIGIT-PVR modula los efectos observados anteriormente, puesto que la inclusión de un anticuerpo anti-TIGIT o un anticuerpo anti-PVR en los experimentos, redujo en gran medida la inhibición de la proliferación observada, la modulación de la producción de la citocina DC, y la supresión de la proliferación de otras células inmunes. En general, los datos proporcionados por las Solicitantes en la presente, sugieren que la TIGIT proporciona un mecanismo de retroalimentación del sistema inmune regulando de manera negativa la respuesta inmune.

En consecuencia, la invención proporciona métodos para modular la función de las células inmunes (por ejemplo, DC) , modulando la expresión y/o actividad de la TIGIT o el PVR. Por ejemplo, se proporcionan métodos para disminuir o inhibir la proliferación de las células inmunes (por ejemplo, DC o células que presentan el antígeno) , tratando las células inmunes in vitro o in vivo con. TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la' TIGIT, o un agonista de la expresión y/o actividad del PVR. También se proporcionan métodos para incrementar la proliferación de las células inmunes (por ejemplo, DC o las células que presentan el antígeno) , tratando las células inmunes in vi tro o in vivo con un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT o un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR. La invención también proporciona métodos para incrementar/estimular una respuesta inmune administrando un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT o un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR. De manera similar, se proporcionan métodos para disminuir/inhibir una respuesta inmune administrando la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT o un agonista de la expresión y/o actividad del PVR.

También se proporcionan por la invención métodos para modular el tipo y/o cantidad de producción de citocina de una célula inmune (por ejemplo, DC) , modulando la expresión y/o actividad de la TIGIT o el PVR. De manera específica, la invención proporciona métodos para incrementar la producción de IL-10 mediante células inmunes, por ejemplo, DC, tratando las células in vitro o in vivo con TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, o un agonista de la expresión y/o actividad del PVR. También se proporcionan métodos para disminuir la producción y/o liberación de la citocina proinflamatoria por las células inmunes, por ejemplo, las DC, tratando las células in vitro o in vivo con TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, o un agonista de la expresión y/o actividad del PVR. De manera similar, también se proporcionan métodos para disminuir la producción de IL-10 por las células inmunes, por ejemplo, las DC, tratando las células in vitro o in vivo con un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT o un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR. La invención proporciona además métodos para incrementar la producción y/o liberación de la citocina proinflamatoria por las células inmunes, por ejemplo, las DC, tratando las células in vitro o in vivo con un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT o un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR. También se proporcionan métodos para estimular la fosforilación y/o señalización intracelular de ERK a través de la trayectoria de ERK en una o más células, tratando las células con TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, o un agonista de la expresión y/o actividad del PVR. De manera similar, la invención proporciona métodos para inhibir o disminuir la fosforilación y/o la señalización intracelular de ERK a través de la trayectoria de ERK en una o más células, tratando las células con un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT o un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR.

La TIGIT está incrementada en la expresión en los tejidos de la artritis, soriasis, trastorno inflamatorio del intestino y cáncer de mama, con relación a los tejidos de control normales, como se muestra en la presente. Con respecto a los tejidos del cáncer de mama, las Solicitantes mostraron que la expresión de TIGIT no se correlaciona con las células del tumor per se, sino en su lugar con los infiltrados de las células inmunes CD4+ en los tumores. Las Solicitantes también demostraron directamente la capacidad de la TIGIT para modular la respuesta inmune, mostrando que una proteína de fusión de TIGIT inhibió las respuestas de las células T humanas in vitro y la activación de las células T murinas en un ensayo de hipersensibilidad del tipo retardado in vivo. En consecuencia, la invención proporciona métodos para diagnosticar enfermedades/trastornos que involucran la respuesta aberrante de las células inmunes en un sujeto, valorando la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra del sujeto y comparando la expresión y/o actividad con una cantidad de referencia de la expresión y/o actividad de la TIGIT o la cantidad de la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra de un sujeto normal. La invención también proporciona métodos para valorar la severidad de una enfermedad o trastorno que involucra una respuesta aberrante de las células inmunes (es decir, una enfermedad relacionada con la inmunidad) en un sujeto, valorando la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra del sujeto, y comparando la expresión y/o actividad con una cantidad de referencia de la expresión y/o actividad de la TIGIT o la cantidad de la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra de un sujeto normal. También se proporcionan métodos para prevenir una enfermedad o trastorno, que involucra la respuesta aberrante de las células inmunes (es decir, una enfermedad relacionada con la inmunidad) , modulando la expresión y/o actividad de la TIGIT. Además se proporcionan métodos para tratar o disminuir la severidad de una enfermedad o trastorno que involucra una respuesta aberrante de las células inmunes (es decir, una enfermedad relacionada con la inmunidad) , modulando la expresión y/o actividad de la TIGIT. La modulación de la expresión y/o actividad de la TIGIT puede tomar la forma de inhibir la actividad de la TIGIT y/o expresión (es decir, con un antagonista de la TIGIT o un antagonista del PVR) , cunado las actividades reguladoras negativas de la TIGIT están contribuyendo al estado de enfermedad. Por ejemplo, el antagonizar la expresión y/o actividad de la TIGIT puede ser deseable cuando un incremento en la proliferación de las DC y/o una producción incrementada de las citocinas proinflamatorias por las DC es deseable. La modulación de la expresión y/o actividad de la TIGIT puede tomar la forma de activar o incrementar la expresión y/o actividad de la TIGIT (es decir, administrando la TIGIT, un agonista de la TIGIT o un agonista del PVR) , cuando las actividades reguladoras negativas de la TIGIT son deseables para controlar un estado de enfermedad. · Por ejemplo, el agonizar la expresión y/o actividad de la TIGIT puede ser deseable cuando una disminución en la proliferación de las DC y/o una liberación disminuida de las citocinas proinflamatorias por las DC es deseable. Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle aquí posteriormente .

A. Polipeptidos de TIGIT de Longitud Completa La presente invención proporciona secuencias nucleotídicas aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente solicitud como polipéptidos de TIGIT. En particular, los ADNc que codifican varios polipéptidos de TIGIT se han identificado y aislado, como se describe con mayor detalle en la especificación y los Ejemplos siguientes. Se entenderá por alguien con experiencia ordinaria en la técnica, que la invención también proporciona otros polipéptidos útiles en los métodos de la invención (es decir, PVR) , y que cualquiera de la descripción de la presente, se dirige de manera específica al método de creación, producción, marcado, modificación postraduccional , uso u otros aspectos de los polipéptidos de TIGIT, también será aplicables para otros polipéptidos que no son de TIGIT.

B . Variantes del Polipéptido de TIGIT Además de los polipéptidos de TIGIT de la secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente, está contemplado que puedan prepararse las variantes de TIGIT : Las variantes de TIGIT pueden prepararse introduciendo cambios nucleotídicos apropiados en el polinucleótido . de TIGIT, y/o mediante la síntesis del polipéptido de TIGIT deseado. Aquellos con experiencia en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales de la TIGIT, tales como cambiar el número o posición de los sitios de glucosilación o alterar las características de anclado de la membrana del polipéptido.

Las variaciones en la TIGIT de la secuencia de longitud completa nativa o en varios dominios de la TIGIT descrita en la presente, pueden hacerse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y lineamientos para las mutaciones conservadoras y no conservadoras expuestas, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más codones que codifican la TIGIT, que resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos de la TIGIT, en comparación con la TIGIT de secuencia nativa. Opcionalmente , la variación es mediante la sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de la TIGIT. La guía para determinar cuales residuos de aminoácidos pueden insertarse, sustituirse o suprimirse sin afectar de manera adversa la actividad deseada, puede encontrarse comparando la secuencia de la TIGIT con aquélla de las moléculas de la proteína conocida homologa y reduciendo al mínimo el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechos en las regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos de aminoácidos conservadores. Las inserciones o supresiones pueden opcionalmente , estar en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. Las variaciones permitidas pueden determinarse haciendo de manera sistemática inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en la » secuencia, y probando las variantes resultantes para la actividad exhibida por la secuencia nativa de longitud completa o madura.

Los fragmentos del polipéptido de TIGIT también se proporcionan en la presente. Tales fragmentos pueden truncarse en el término N o el término C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido de TIGIT.

Los fragmentos de TIGIT pueden prepararse mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Los fragmentos peptídicos deseados pueden sintetizarse químicamente. Un procedimiento alterno involucra generar fragmentos de TIGIT mediante digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida por escindir las proteínas en los sitios definidos por los residuos de aminoácidos particulares, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislando el fragmento deseado. Aún otra técnica adecuada involucra aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento polipeptídico deseado, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los oligonucleótidos que definen el término deseado del fragmento de ADN, se emplean en los cebadores 5' y 3' en la PCR. De manera preferida, los fragmentos del polipéptido de TIGIT comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido de TIGIT nativo descrito en la presente.

En ciertas modalidades, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 5 bajo el encabezamiento de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces cambios más sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la Tabla 5, o como se describe además a continuación, con referencia a las clases de aminoácidos, se introducen, y los productos se seleccionan.

Tabla 5 Residuo Sustituciones Ejemplares Sustituciones Original Preferidas Ala (A) val; leu; ile val lys; gln; asn lys Arg R) gln; his; lys; arg gln Asn N) glu Asp D) glu ser Cys C) ser asn Gln Q) asn asp Glu E) asp ala Gly G) pro; ala arg His H) lie I) asn; gln; lys; arg leu leu; val; met; ala; phe; Leu L) norleucina ile norleucina; ile; val; arg Lys K) met ; ala; phe leu Met M) arg; gln; asn leu Phe F) leu; phe; ile ala Pro P) leu; val; ile; ala; tyr thr Ser S) ala ser Thr T) thr tyr Residuo Sustituciones Ejemplares Sustituciones Original Preferidas Trp (W) ser phe Tyr (Y) tyr; phe Val (V) leu trp; phe; thr; ser ile; leu; met ; phe; ala; norleucina Las modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunológica del polipéptido se logran seleccionando sustituciones que difieren de manera significativa en su efecto en mantener (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen grupos basándose en las propiedades de la cadena lateral comunes: (1) hidrofóbicos : norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr,- (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras abarcan intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.' Tales residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de la sustitución conservadora o, de manera más preferida, en los sitios restantes (no conservados) .

Las variaciones pueden hacerse utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis medida por el oligonucleótido (dirigida al sitio) , exploración de alanina y mutagénesis con PCR. La mutagénesis dirigida al sitio [Cárter et al., Nucí . Acids Res . , 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987)], la mutagénesis del cásete [Wells et al.. Gene , 34:315 (1985)], la mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans . R. Soc . London SerA, 317:415 (1986)], u otras técnicas conocidas, pueden realizarse en el ADN clonado para producir el ADN variante.

El análisis de los aminoácidos de exploración ' también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos relativamente pequeños, neutros. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo, debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbón beta y es menos probable de alterar la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)] . La alanina también se prefiere típicamente debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra con frecuencia en las posiciones enterradas y expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)] . Si la sustitución con alanina no proporciona cantidades adecuadas de la variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico .

C . Modificaciones de la TIGIT Las modificaciones covalentes de la TIGIT están incluidas dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos de aminoácidos seleccionados de un polipéptido con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N o C terminales del polipéptido de TIGIT. La derivación con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular el polipéptido de TIGIT en una matriz de superficie de soporte insoluble en agua para utilizarse en el método para purificar los anticuerpos anti-TIGIT y viceversa. Los agentes de reticulación utilizados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ásteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3' -ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1 , 8-octano y agentes tales como metil-3 - [ (p-azidofenil) ditio] propioimidato .

Otras modificaciones incluyen la desamidación de los residuos de glutaminilo y asparaginilo a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, la hidroxilación de la prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilación de la amina N terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C terminal.

Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos de TIGIT incluido dentro del alcance de esta invención, comprende alterar el patrón de glucosilación nativo del polipéptido. "Alterar el patrón de glucosilación nativo" pretende para propósitos de la presente, significar la supresión de una o más porciones de carbohidrato encontradas en una TIGIT de secuencia nativa (ya sea mediante la eliminación del sitio de glucosilación subyacente o suprimiendo la glucosilación mediante medios químicos y/o enzimáticos) ,' y/o agregando uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en la TIGIT de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, involucra un cambio en la naturaleza y proporciones de las varias porciones de carbohidrato presentes. La adición de los sitios de glucosilación a un polipéptido puede lograrse alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración puede hacerse, por ejemplo, mediante la adición de, o sustitución mediante uno o más residuos de serina o treonina al polipéptido de la secuencia nativa (para sitios de glucosilación enlazados a O) . La secuencia de aminoácidos del polipéptido puede opcionalmente , alterarse a través de cambios al nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas , de manera que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados .

Otros medios para incrementar el número de porciones de carbohidrato en el polipéptido es mediante el acoplamiento químico o enzimático de los glucósidos del polipéptido. Tales métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en la WO 87/05330, publicada el 11 de Septiembre de 1987, y en Aplin y riston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) .

La eliminación de las porciones de carbohidrato presentes en el polipéptido puede lograrse de manera química o enzimática, o mediante la sustitución mutacional de los codones que codifican los residuos de aminoácidos que sirven como objetivos para la glucosilación. Las técnicas de desglucosilación química se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch . Biochem . Biophys . , 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal . Biochem . , 118:131 (1981) . La escisión enzimática de las porciones de carbohidrato en los polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo y exoglucosidasas , como se describe por Thotakura et al . , Meth . Enzymol . , 138 :350 (1987) .

Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido descrito en la presente, comprende enlazar el polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteináceos , por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337.

Los polipéptidos de la presente invención también pueden modificarse de una manera para formar una molécula quimérica que comprende un polipéptido fusionado a otro polipéptido heterologo o secuencia de aminoácidos.

En una modalidad, tal molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido de interés con un polipéptido marcado que proporciona un epitopo al cual un anticuerpo antimarca puede unirse de manera selectiva. La marca del epitopo se coloca generalmente en el término amino o carboxilo del polipéptido de interés. La presencia de tales formas marcadas del epitopo del polipéptido de interés, pueden detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de marca. También, la provisión de la marca del epitopo permite que el polipéptido de interés se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo antimarca u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la marca del epitopo. Varios polipéptidos de marca y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen marcas de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly) ; el polipéptido de marca HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol . , 8:2159-2165 (1988)]; la marca c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4 , B7 y 9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la marca de la glucoproteína D (gD) del virus del Herpes Simple y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de marca incluyen, de manera no exclusiva, el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210. (1988)]; el péptido del epitopo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido del epitopo de alfa-tubulina [Skinner et al., J. Biol . Chem. , 266:15163-15166 (1991)]; y la marca del péptido de la proteína del gen 10 T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].

En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina . Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesina" ) , tal fusión podría ser a' la región Fe de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig de manera preferida incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana1 suprimido o inactivado) de un polipéptido, en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una modalidad, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de la articulación, CH2 y CH3 , o la articulación, CH1 , CH2 y CH3 de la molécula de IgGl . Para la producción de las fusiones de inmunoglobulina, véase también la Patente de los Estados Unidos No. 5,428,130, expedida en Junio 27, de 1995.

D . Preparación del Polipéptido La descripción siguiente se relaciona principalmente con la producción de polipéptidos cultivando las células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Esta contemplado, por supuesto, que los métodos alternos, que son bien conocidos en la técnica, puedan emplearse para preparar los polipéptidos. Por ejemplo, la secuencia polipeptídica, o porciones de la misma, pueden producirse mediante la síntesis directa del péptido utilizando técnicas en fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J . Am . Chem . Soc . , 85:2149-2154 (1963)] . La síntesis de la proteína in vitro pueden realizarse utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) , utilizando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del polipéptido pueden sintetizarse químicamente de manera separada y combinarse utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido de longitud completa. 1. Aislamiento del ADN que Codifica el Polipéptido El ADN que codifica un polipéptido de interés puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada de tejido que se cree que posee el ARNm del polipéptido y expresarlo a un nivel detectable. En consecuencia, el ADN humano que codifica el polipéptido puede obtenerse de manera conveniente de una biblioteca de ADNc preparada de tejido humano. El gen que codifica el polipéptido también puede obtenerse de iuna biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos automatizados) .

Las bibliotecas pueden seleccionarse con sondas (tales como anticuerpos para el polipéptido u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) , diseñadas para identificar el gene de interés o la proteína codificada por el mismo. La selección del ADNc o la biblioteca genómica con la sonda seleccionada, puede realizarse utilizando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manu l (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alterno para aislar el gen que codifica el polipéptido, es utilizar la metodología PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)] .

Los Ejemplos siguientes describen técnicas para seleccionar una biblioteca de ADNc. Las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas como sondas deberían ser de una longitud suficiente y suficientemente no ambiguas de manera que se reducen al mínimo los falsos positivos . El oligonucleótido es marcado de manera preferida, de modo que puede detectarse tras la hibridación al ADN en la biblioteca que está siendo seleccionada. Los métodos para marcar son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de radiomarcas como ATP marcado con 32P, biotinilación o marcado con enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo el rigor moderado y el rigor alto, se proporcionan en Sambrook et al . , supra .

Las secuencias identificadas en tales métodos de selección de la biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en las bases de datos públicas, tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias, privadas. La identidad de la secuencia (a nivel de aminoácido o nucleótido) dentro de las regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa, puede determinarse utilizando métodos conocidos en la técnica y como se describen en la presente.

El ácido nucleico que tiene una secuencia codificante de la proteína, puede obtenerse seleccionando bibliotecas de ADNc o genómicas selectas, utilizando la secuencia de aminoácidos deducida, descrita en la presente por primera vez, y. si es necesario, utilizando procedimientos de extensión del cebador convencionales, como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar los precursores y procesar los intermediarios · del ARNm que pueden no haber sido transcritos de manera inversa en el ADNc. 2. Selección y Transformación de las Células Hospederas Las células hospederas se transfectan o transforman con vectores de expresión o de clonación descritos en la presente para la producción del polipéptido y cultivadas en un medio nutriente convencional modificado conforme sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, temperatura, pH y los similar, pueden seleccionarse por la persona con experiencia sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares, pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology : a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y en Sambrook et al., supra .

Los métodos para la transfección de las células eucarióticas y la transformación de las células procarióticas son conocidos por la persona con experiencia ordinaria, por ejemplo, CaCl2, CaP04, mediados por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula hospedera utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células . El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación, se utilizan generalmente para procariontes . La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y la WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para las células de mamífero sin tales paredes celulares, puede emplearse el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virolog , 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transfecciones del sistema hospedero de las células de mamífero se ha descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,399,216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo típicamente de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc . Nati. Acad. Sci . (USA) , 76:3829 (1979). Sin embargo, otros métodos para introducir el ADN en las células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión del protoplasto bacteriano con las células intactas, o policationes , por ejemplo, polibreno, poliornitina, también pueden utilizarse. Para varias técnicas para transformar las células de mamífero, véase Keown et al., Methods in Enzymology, ' 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336 :348-352 (1988) .

Las células hospederas adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente, incluyen células procarioticas, levaduras o eucarióticas superiores. Los procariontes adecuados incluyen, de manera no exclusiva, eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacterias tales como E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles al público, tales como la cepa de E. coli 12 M 294 (ATCC. 31,446) ; E. coli X1776 (ATCC 31,537); la cepa de E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células hospederas procarioticas adecuadas incluyen Enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como 'Bacílli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989) , Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un hospedero u hospedero original particularmente preferido, debido a que es una cepa hospedera común para las fermentaciones del producto del ADN recombinante . De manera preferida, la célula hospedera secreta cantidades mínimas de las · enzimas proteolíticas . Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican las proteínas endógenas del hospedero, con los ejemplos de tales hospederos incluyendo a la cepa de E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo de tonA; la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo de tonA ptr3; la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55,244)., que tiene el genotipo completo de tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan1; la cepa de E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo de tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; la cepa de E. coli W3110 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación de supresión degP no resistente a la kanamicina y la cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 4,946,783, expedida el 7 de Agosto de 1990. De manera alterna, los métodos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de la polimerasa de los ácidos nucleicos son adecuados.

Además de los microbios procarióticos , los eucarióticos tales como hongos y levaduras filamentosos son hospederos para la clonación o expresión, adecuados, para los vectores que codifican el polipéptido. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedero eucariótico inferior utilizado comúnmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature , 290:140

[1981]; EP 139,383 publicada el 2 de Mayo de 1985); hospederos de Kluyveromyces (Patente de los Estados Unidos No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol . , 154 (2 ): 737-742

[1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. therwotolerans y K. arxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic icrobiol., 28:265-278

[1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 76:5259-5263

[1979] ) ; Schwannio yces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada el 31 de Octubre de 1990); y los hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de Enero de 1991) , y hospederos de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. , 112:284-289

[1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221

[1983]; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474

[1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J . , 4:475-479

[1985] ) . Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente, e incluyen, de manera no exclusiva, levaduras capaces de crecer en metanol, seleccionadas del género que consiste de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de las especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras, puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs , 269 (1982) .

Las células hospederas adecuadas para la expresión del polipéptido glucosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas. Los ejemplos de líneas de células hospederas de mamíferos útiles, incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Los ejemplos más específicos incluyen la línea CVl de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC C L 1651) ; la línea de riñon embriónico humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspensión, Graham et al., J\_ Gen Virol . , 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. , 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065) y tumor mamario de ratón (M T 060562, ATCC CCL51) . La selección de la célula hospedera apropiada se considera que está dentro de la experiencia en la técnica. 3. Selección y Uso de un Vector Replicable El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc" o ADN genómico) que codifica el polipéptido puede insertarse en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Varios vectores estás disponibles al público. El vector puede, por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio de la endonucleasa de restricción apropiado, utilizando las técnicas conocidas en el campo. Los componentes del vector incluyen generalmente, de manera no exclusiva, una o más de una secuencia de la señal, un origen de la replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mej orador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de los vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes, emplea técnicas de ligación estándar, que son conocidas para la persona con experiencia.

El polipéptido puede producirse de manera recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de la señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el término N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia de la señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia de la señal puede ser una secuencia de la señal procariótica, seleccionada, por ejemplo,- del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa , lpp, o los líderes de la enterotoxina II estable con el calor. Para la secreción de la levadura, la secuencia de la señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de la levadura, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces, el último descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,010,182), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 de Abril de 1990), o la señal descrita en la WO 90/13646 publicada el 15 de Noviembre de 1990. En la expresión de las células de mamífero, las secuencias de la señal de mamífero pueden utilizarse para dirigir la secreción de la proteína, tal como las secuencias de la señal de los polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, así como los líderes secretores virales.

Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células hospederas seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y viruses. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayorías de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido 2µ es adecuado para las levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en las células de mamífero.

Los vectores de expresión y de clonación contendrán típicamente un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas , o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio del complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli .

Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son aquéllos que permiten la identificación de las células competentes, para captar el ácido nucleico que codifica el polipéptido, tal como DHF o la timidina cinasa. Una célula hospedera apropiada cuando se emplea DHFR del tipo silvestre, es la línea celular CHO deficiente en la actividad de DHFR, preparada y propagada como se describió por Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para utilizarse en la levadura, es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977) ] .

Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor enlazado de manera operable a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido, para dirigir la síntesis del ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células hospederas potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para utilizarse con los hospederos procarióticos incluyen los sistemas promotores de la ß-lactamasa y la lactosa [Chang et al., ature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res.' , 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizarse en los sistemas bacterianos también contienen una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada de manera operable a los polipéptidos que codifican el ADN.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizarse con los hospederos de levadura incluyen los promotores para la 3 -fosfoglicerato cinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glucolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la enolasa, gliceraldehído-3 -fosfatasa deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6- fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores de la levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones del promotor para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína , gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables para la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizarse en la expresión de la levadura se describen además en EP 73,657.

La transcripción del polipéptido de los vectores en las células hospederas de mamíferos está controlada, por ejemplo, por los promotores obtenidos de los genomas de los viruses, tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (RU 2,211,504 publicada el 5 de Julio de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2) , virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y Virus 40 simiano (SV40) , de los promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de la inmunoglobulina, y los promotores del choque por calor, con la condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedera.

La transcripción de un ADN que codifica el polipéptido por los eucariontes superiores puede incrementarse insertando una secuencia mej oradora en el vector. Los mej oradores son elementos que actúan en cis del ADN, usualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias mejoradoras se conocen ahora de los genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a- fetoproteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, uno utilizará un mej orador de un virus de una célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el mej orador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270) , el mejorador del promotor inicial del citomegalovirus , el mejorador del polioma en el lado tardío del origen de replicación y adenovirus mej oradores. El mejorador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia codificante del polipéptido, pero se localiza, de manera preferida, en el sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en las células hospederas eucarióticas (células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) , contendrán también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de los ADN o ADNc eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el polipéptido.

Aún otros métodos, vectores y células hospederas adecuadas para la adaptación a la síntesis de un polipéptido de interés en el cultivo, de las células recombinantes de vertebrados, se describen en Gething et al., Nature , 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117, 060 y EP 117, 058. 4. Detección de la Amplificación/Expresión del Gen La amplificación y/o expresión del gen puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern, transferencia Northern convencionales, para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia por puntos (análisis de ADN) o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada de manera apropiada, basándose en las secuencias proporcionadas en la presente. De manera alterna, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína . Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo en donde el dúplex se une a la superficie, de manera que tras la formación del dúplex en la superficie, la presencia del anticuerpo unido al dúplex puede detectarse.

La expresión del gen, de manera alterna, puede medirse mediante métodos inmunológicos , tales como la tinción inmunohistoquímica de las células o secciones de tejido y el ensayo del cultivo celular o los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción y/o el ensayo inmunohistológico de los fluidos de muestra pueden ser ya sea monoclonales o policlonales , y pueden prepararse en cualquier mamífero. De manera conveniente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente o contra una secuencia exógena fusionada al ADN, que codifica el polipéptido y que codifica un epitopo del anticuerpo específico. 5. Purificación del Polipéptido Las formas de un polipéptido de interés pueden recuperarse de- un medio de cultivo de lisados de una célula hospedera. Si están unidos a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión énzimática. Las células empleadas en la expresión del polipéptido pueden romperse por varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o agentes que lisan las células.

Puede desearse purificar el polipéptido de las proteínas o polipéptidos de las células recombinantes . Los siguientes procedimientos son ejemplares de los procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio de iones; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía sobre sílice o en una resina de intercambio de cationes tal como DEAE; cromatoenfocamiento; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; utilizando filtración en gel, por ejemplo, Sephadéx G-75; columna de proteína A Sepharose para eliminar los contaminantes tales como la IgG; y columnas quelantes de los metales para unirse a las formas marcadas con epitopos del polipéptido. Varios métodos de purificación de la proteína pueden emplearse, y tales métodos son conocidos en la técnica, y se describen por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification : Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) . Los pasos de la purificación seleccionada dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y del polipéptido particular producido.

E . Distribución del Tejido La ubicación de los tejidos que expresan el polipéptido puede identificarse determinando la expresión del ARNm en varios tejidos humanos. La ubicación de tales genes proporciona la información sobre cuales tejidos son más probables de ser afectados por las actividades de estimulación e inhibición de los polipéptidos . La ubicación de un gen en un..tejido específico también proporciona un tejido de muestra para los ensayos de bloqueo/activación de la actividad discutidos a continuación.

Como se indicó anteriormente, la expresión del gen en varios tejidos puede medirse por medio de transferencia Southern, transferencia Northern convencionales, para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205

[1980]), transferencia con puntos (análisis de ADN) , o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada de manera apropiada, basada en las secuencias descritas en la presente. De manera alterna, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína .

La expresión del gen en varios tejidos, de manera alterna, puede medirse mediante métodos inmunológicos , tales como tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo del cultivo celular o los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico . Lós anticuerpos útiles para la tinción y/o el ensayo inmunohistoquímico de los fluidos de muestra pueden ser ya sea monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. De manera conveniente, los anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia nativa de un polipéptido o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN que codifican el polipéptido o contra una secuencia exógena fusionada al ADN que codifica un polipéptido y que codifica un epitopo del anticuerpo específico.' Las técnicas generales para generar anticuerpos, y los protocolos especiales para la transferencia Northern y la hibridación in situ se proporcionan a continuación.

F . Estudios de Unión al Anticuerpo La actividad de un polipéptido de la invención puede verificarse además, mediante estudios de unión al anticuerpo, en los cuales se prueba la capacidad de los anticuerpos anti-polipéptido para inhibir el efecto del polipéptido en las células de los tejidos. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales , monoclonales , humanizados, biespecificos y heteroconjugados, la preparación de los cuales se describe aquí a continuación.

Los estudios de unión al anticuerpo pueden llevarse a cabo en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitivos, ensayos alternados directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Véase, por ejemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Los ensayos de unión competitivos se basan en la capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la muestra de prueba para la unión con una cantidad limitada del anticuerpo. La cantidad de la proteína objetivo en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad del estándar que se une a los" anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad del estándar que se une, los anticuerpos, de manera preferida, se insolubilizan antes o después de la competición, de manera que el estándar y el analito que se unen a los anticuerpos pueden separarse de manera conveniente del estándar y el analito que permanecen no unidos .

Los ensayos intercalados involucran en uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epitopo, de la proteína a ser detectada. En un ensayo intercalado, el analito de la muestra de prueba se une mediante un primer anticuerpo que se inmoviliza en un soporte sólido, y posteriormente, un segundo anticuerpo se une al analito, formando así un complejo insoluble de tres partes. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,376,110. El segundo anticuerpo puede por sí mismo, estar marcado con una porción detectable (ensayos intercalados directos) o puede medirse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con una porción detectable (ensayo intercalado indirecto) . Por ejemplo, un tipo de ensayo intercalado en un ensayo ELISA, caso en el cual, la porción detectable es una enzima.

Para inmunohistoquímica, la muestra del tejido puede ser fresca o congelada o puede incluirse en parafina y finarse con un conservador tal como formalina, por ejemplo.

G. Ensayos Basados en Células Los ensayos basados en células y los modelos animales para las enfermedades •relacionadas con la inmunidad pueden utilizarse para entender además, la relación entre los genes y los polipéptidos identificados en la presente y el desarrollo y la patogénesis de la enfermedad relacionada con la inmunidad.

En un procedimiento diferente, las células de un tipo conocido por estar involucradas en una enfermedad relacionada con la inmunidad particular, se transfectan con los ADNc descritos en la presente, y la capacidad de estos ADNc para estimular o inhibir la función inmune se analiza. Las células adecuadas pueden transíectarse con el gen deseado, y verificarse para la actividad de la función inmune. Tales líneas celulares transfectadas pueden utilizarse entonces para probar la capacidad de los anticuerpos poli o monoclonales o las composiciones del anticuerpo, para inhibir o estimular la función inmune, por ejemplo, para modular la proliferación de las células T o la infiltración de las células inflamatorias. Las células transfectadas con las secuencias codificantes de los genes identificados en la presente, pueden utilizarse además, para identificar los candidatos de fármacos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad.

Además, los cultivos primarios derivados de animales transgénicos (como se describe a continuación) pueden utilizarse en los ensayos basados en células de la presente, aunque las líneas celulares estables son utilizadas más comúnmente en la técnica. Las técnicas para derivar líneas celulares continuas de animales transgénicos, son bien conocidas en el campo (véase, por ejemplo, Small et al., Mol. Cell. Biol. 5: 642-648

[1985]).

Un ensayo basado en células adecuado es la reacción de los linfocitos mezclados (MLR) . Current Protocols in Imunology, unidad 3.12; editado por J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, Institutos Nacionales de Salud, Publicado por John Wiley & Sons, Inc. En este ensayo, se analiza la capacidad de un compuesto de prueba para estimular o inhibir la proliferación de las células T activadas. Una suspensión de células T que responden se cultiva con células de un estimulador alogenéico y la proliferación de las células T se mide mediante la captación de timidina tritiada. Este ensayo es una medida general de la reactividad de las células T. Puesto que la mayoría de las células T responden a, y producen IL-2 tras la activación, las diferencias en la capacidad de respuesta en este ensayo reflejan en parte, las diferencias en la producción de IL-2 por las células que responden. Los resultados de la 'MLR pueden verificarse mediante un ensayo de detección de la linfocina estándar (IL-2). Current Protocols in Immunology, anterior, 3.15, 6.3.

Una respuesta proliferativa de las células T en el ensayo MLR puede deberse a las propiedades mitogénicas directas de la molécula probada o a una activación inducida por un antígeno externo. La verificación adicional de la actividad estimuladora de las células T del polipéptido, puede obtenerse mediante un ensayo de coestimulación. La activación de las células T requiere una señal específica del antígeno, mediada a través del receptor de las células T (TCR) y una señal coestimuladora mediada a través de una segunda interacción de unión al ligando, por ejemplo la interacción de unión de B7 (CD80, CD86)/CD28. La reticulación de CD28 incrementa la secreción de la linfocina por las células T activadas. La activación de las células T tiene controles negativo y positivo a través de la unión de los ligandos, que tienen un efecto negativo o positivo. CD28 y CTLA-4 son glucoproteínas relacionadas de la superfamilia de la Ig, que se unen a B7. CD28 que se une a B7' tiene un efecto de coestimulación positivo de la activación de las células T; de manera inversa, CTLA-4 que se une a B7 tiene un efecto de desactivar las células T. Chambers, C. A. y Allison, J. P., Curr. Opin. Immunol . (1997) 9:396. Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065; Linsey, P. S. y Ledbetter, J. A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:191; June, C. H. et al, Immunol. Today (1994) 15:321; Jenkins, . K. , I munity (1994) 1:405. En un ensayo de coestimulación, los polipéptidos se prueban para la actividad coestimuladora o inhibidora de las células T.

El uso directo de un compuesto estimulador como en la invención, se ha validado en experimentos con la glucoproteína 4-1BB, un miembro de la familia del receptor del factor de necrosis del tumor, que se une a un ligando (4-1BBL) expresado en las células T cebadas y señala la activación y el crecimiento de las células T. Alderson, M.

E. et al., J . Immunol . (1994) 24:2219.

El uso de un compuesto que estimula el agonista también se ha validado experimentalmente . Como un ejemplo, la activación de 4-1BB mediante el tratamiento con un anticuerpo anti-4-??? del agonista, mejora la erradicación de tumores. Hellstrom, I. y Hellstrom, K. E.( Crit. Rev. immunol . (1998) 18:1. La terapia con inmunoadyuvantes para el tratamiento de tumores, descrita con más detalle a continuación, es otro ejemplo del uso de los compuestos estimulantes de la invención.

De manera alterna, también puede lograrse un efecto estimulante o que mejora la inmunidad, mediante la administración de un polipéptido que tiene propiedades que mejoran la permeabilidad vascular. La permeabilidad vascular mejorada sería benéfica para los trastornos que pueden atenuarse por una infiltración local de células inmunes (por ejemplo, monocitos, eosinófilos, PMN) y la inflamación.

Por otra parte, los polipéptidos de TIGIT, así como otros compuestos de la invención, que son inhibidores directos de la proliferación/activación de las células T, secreción de la citocina proinflamatoria y/o la permeabilidad vascular, pueden utilizarse directamente para suprimir la respuesta inmune. Estos compuestos son útiles para reducir el grado de la respuesta inmune y para tratar enfermedades relacionadas con la inmunidad, caracterizadas por una respuesta hiperactiva, superóptima o autoinmune . Este uso de los compuestos de la invención se ha validado por los experimentos descritos anteriormente, en los cuales CTLA-4 que se une al receptor B7 desactiva las células T. Los compuestos inhibidores directos de la invención, funcionan de una manera análoga. Se esperaría que el uso de un compuesto que suprime la permeabilidad vascular, redujera la inflamación. Tales usos serían benéficos para tratar las condiciones asociadas con una inflamación excesiva.

De manera similar, los compuestos, por ejemplo, anticuerpos, que se unen a los polipéptidos inhibidores de la TIGIT y bloquean el efecto de estos polipéptidos inhibidores de la TIGIT, producen un efecto inhibidor neto y pueden utilizarse también para suprimir la respuesta inmune mediada por las células T, dejando a la TIGIT libre para inhibir la proliferación/activación de las células y/o la secreción de linfocina. El bloqueo del efecto inhibidor de los polipéptidos, suprime la respuesta inmune del mamífero.

De manera alterna, para las condiciones asociadas con una respuesta inmune y/o inflamación mediada por las células T insuficiente, la inhibición o disminución de 'la actividad y/o expresión de la TIGIT o la interferencia con la capacidad de la TIGIT para unirse a, y/o señalar a través del PVR, puede ser benéfico para el tratamiento. Tal inhibición o disminución puede proporcionarse mediante la administración de un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT y/o un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR.

H. Modelos Animales Los resultados de los ensayos basados en células in vitro puede verificarse además utilizando modelos animales in vivo y ensayos para la función de las células T. Puede utilizarse una variedad de modelos animales bien conocidos, para entender además, el papel de los genes identificados en la presente en el desarrollo y patogénesis de la enfermedad relacionada con la inmunidad, y para probar la eficacia de los agentes terapéuticos candidatos, incluyendo los anticuerpos, y otros antagonistas de los polipéptidos nativos, incluyendo antagonistas de molécula pequeña. La naturaleza in vivo de tales modelos, los hace predictivos de las respuestas en pacientes humanos. Los modelos animales de las enfermedades relacionadas con la inmunidad incluyen animales no recombinantes y recombinantes (transgénicos) . Los modelos con animales no recombinantes incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo, modelos murinos . Tales modelos pueden generarse introduciendo células en ratones singenéicos, utilizando técnicas estándar, por ejemplo, inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implante del bazo, implante intraperitoneal , implante bajo la cápsula renal, etc.

La enfermedad del injerto versus el hospedero aparece cuando las células inmunocompetentes se transplantan en pacientes inmonosuprimidos o tolerantes. Las células del donador reconocen y responden a los antígenos del hospedero. La respuesta puede variar de una inflamación severa que amenaza la vida, a casos leves de diarrea y pérdida de peso. Los modelos de la enfermedad del injerto versus el hospedero proporcionan un medio para valorar la reactividad de las células T contra los antigenos del MHC y los antígenos menores del transplante. Un procedimiento adecuado se describe con detalle en Current Protocols in Immunology, anterior, unidad 4.3.

Un modelo animal para el rechazo del aloinjerto de la piel es un medio para probar la capacidad de las células T para mediar la destrucción del tejido in vivo y una media de su papel en el rechazo del transplante. Los modelos más comunes y aceptados utilizan injertos murinos de la piel de la cola. Los experimentos repetidos han mostrado que el rechazo del aloinjerto de la piel está mediado por las células T, células T auxiliares y células T citotóxicas-efectoras y no' por los anticuerpos. Auchincloss, H. Jr. y Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2a ed., . E. Paul ed. , Raven Press, NY, 1989, 889-992. Un procedimiento adecuado se describe con detalle en Current Protocols in Immunology, anterior, unidad 4.4. Otros modelos de rechazo de transplante que pueden utilizarse para probar los compuestos de la invención, son los modelos de transplante cardiaco alogenéico, descritos por Tanabe, M. et al, Transplantation (1994) 58:23 y Tinubu, S. A. et al, J. Immunol . (1994) 4330-4338.

Los modelos animales para la hipersensibilidad del tipo retardado proporciona un ensayo de la función inmune mediada por las células también. Las reacciones de hipersensibilidad del tipo retardado son una respuesta inmune mediada por las células T in vivo, caracterizada por la inflamación, que no alcanza un pico hasta después de que ha transcurrido un periodo de tiempo después de la exposición al antígeno. Estas reacciones también ocurren en enfermedades autoinmunes específicas del tejido, tales como la esclerosis múltiple ( S) y la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, un modelo para MS) . Un procedimiento adecuado se describe con detalle en Current Protocole in Inwnunology, anterior, unidad 4.5.

La EAE es una enfermedad autoinmune mediada por las células T, caracterizada por la inflamación de las células T y las células mononucleares y la desmielinización posterior de los axones en el sistema nervioso central . La EAE es considerada generalmente como un modelo animal relevante para la MS en los humanos. Bolton, C, Múltiple Sclerosis (1995) 1:143. Se han desarrollado modelos agudos y de recaída- remisión. Los compuestos de la invención pueden probarse para la actividad estimuladora o inhibidora de las células T, contra la enfermedad desmielinizante mediada por la inmunidad, utilizando el protocolo descrito en Current Protocols in Im unology, anterior, unidades 15.1 y 15.2. Véase también los modelos para la enfermedad de la mielina, en los cuales los oligodendrocitos o células de Schwann se injertan en el sistema nervioso central, como se describió en Duncan, I. D. et al, Molec . Med. Today (1997) 554-561.

La hipersensibilidad por contacto es un ensayo de hipersensibilidad del tipo retardado simple in vivo de la función inmune mediada por las células. En este procedimiento, la exposición cutánea a los haptenos exógenos que dan lugar a una reacción de hipersensibilidad del tipo retardado se mide y cuantifica. La hipersensibilidad por contacto involucra una fase de sensibilización inicial, seguida por una fase de provocación. La fase de provocación ocurre cuando los linfocitos T encuentran un antígeno con el cual han tenido un contacto previo. Ocurre la hinchazón e inflamación, haciendo a éste un modelo excelente de la dermatitis por contacto alérgica humana. Un procedimiento adecuado se describe con detalle en Current Protocols in Immunology, Eds . J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach y W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unidad 4.2. Véase también Grabbe, S. y Schwarz, T, Iwmun. Today 19 (1) : 37-44 (1998) .

Un modelo animal para la artritis es la artritis inducida por el colágeno. Este modelo comparte las características clínicas, histológicas e inmunológicas de la artritis reumatoide autoinmune humana y es un modelo aceptable para la artritis autoinmune humana. Los modelos de ratón y rata están caracterizados por sinovitis, erosión del cartílago y el hueso subcondral . Los compuestos de la invención pueden probarse para la actividad contra la artritis autoinmune utilizando los protocolos descritos en Current Protocols in Im unology, anterior, unidades 15.5. Véase también el modelo que utiliza un anticuerpo monoclonal para las integrinas CD18 y VLA-4, descrito en Issekutz, A.C. et al., Immunology (1996) 88:569.

El modelo de la artritis inducida por el colágeno (CIA) se considera un modelo adecuado para estudiar los fármacos potenciales o compuestos biológicos activos en la artritis humana, debido a las muchas similitudes inmunológicas y patológicas con la artritis reumatoide (RA) humana, la implicación de la histocompatibilidad mayor localizada, activación completa de los linfocitos T auxiliares restringidos a la clase II y la similitud de las lesiones histológicas. Las características de este modelo de la CIA que son similares a aquéllas encontradas en los pacientes con RA incluyen: erosión del cartílago y el hueso en los márgenes de la articulación (como puede observarse en las radiografías) , sinovitis proliferativa, implicación asimétrica de articulaciones periféricas pequeñas y de tamaño mediano en el esqueleto apendicular, pero no en el axial. Jamieson et al., Invest . Radiol . 20: 324-9 (1985). Además, la IL-1 y el TN-a parecen estar implicados en la CIA, así como en la RA. Joosten et al., J . Immunol . 163: 5049-5055 (1999). Los anticuerpos que neutralizan al TNF y de manera separada, TNFR:Fc reducen los síntomas de la RA en este modelo (Williams et al., PNAS, 89:9784-9788 (1992); Wooley et al., J. Immunol .151: 6602-6607 (1993)).

En este modelo para la RA, el colágeno del tipo II se purifica del cartílago articular bovino (Miller, Biochemistry 11:4903 (1972)) y se utiliza para inmunizar ratones (Williams et al, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 91:2762 (1994) ) . Los síntomas de la artritis incluyen eritema y/o hinchazón de las extremidades, así como erosiones o defectos en el cartílago y el hueso, determinadas mediante histología. Este modelo ampliamente utilizado también se describe, por ejemplo, por Holmdahl et al., APMIS 97:575 (1989) y en Current Protocole in I munology, supra, unidades 15.5, y en Issekutz et al., Immunology, 88:569 (1996), así como en los Ejemplos aquí posteriormente.

Se ha descrito un modelo del asma, en el cual la hiperreactividad de las vías aéreas inducida por el antígeno, la eosinofilia pulmonar y la inflamación son inducidos sensibilizando un animal con ovoalbúmina y a continuación exponiendo al animal a la misma proteína suministrada mediante aerosol. Varios modelos animales (cobayo, rata, primate no humano) muestran síntomas similares al asma atópica con los antígenos en aerosol. Los modelos murinos tienen muchas de las características del asma humana. Los procedimientos adecuados para probar los compuestos de la invención para la actividad y efectividad en el tratamiento del asma se describen por Wolyniec, W. W. et al, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol . (1998) 18:777 y las referencias citadas en la misma.

Además, los compuestos de la invención pueden probarse en modelos animales para las enfermedades similares a la soriasis. La evidencia sugiere una patogénesis de las células T para la soriasis. Los compuestos de la invención pueden probarse en el modelo de ratones scid/scid descrito por Schon, . P. et al, Nat. Med. (1997) 3:183, en el cual los ratones demuestran lesiones histopatológicas de la piel que se parecen a la soriasis. Otro modelo adecuado es la quimera de piel humana/ratón scid preparada como se describió por Nickoloff, B. J. et al, Am. J. Path. (1995) 146:580.

Los modelos de animales recombinantes ( transgénicos) pueden diseñarse introduciendo la porción codificante de los genes identificados en la presente en el genoma de los animales de interés, utilizando técnicas estándar para producir animales transgénicos . Los animales que pueden servir como un objetivo para la manipulación transgénica incluyen, de manera no exclusiva, ratones, ratas, conejos, cobayos, ovejas, cabras, cerdos y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, chimpancés y. monos. Las técnicas conocidas en el campo para introducir un transgén en tales animales, incluyen la microinyección pronucleica (Hoppe y Wanger, Patente de los Estados Unidos No. 4,873,191); transferencia del gen mediada por el retrovirus en las líneas germinales (por ejemplo, Van der Putten et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 6148-615

[1985]); direccionamiento del gen en células germinales embriónicas (Thompson et al . , Cell 56, 313-321

[1989]); electroporación de embriones (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814

[1983]); transferencia del gen mediada por el esperma (Lavitrano et al., Cell 57, 717-73

[1989] ) . Para una revisión, véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,736,866.

Para el propósito de la presente invención, los animales transgénicos incluyen aquéllos que portan el transgén sólo en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgén puede integrarse ya sea como un solo transgén, o en concatámeros , por ejemplo, en cascadas cabeza a cabeza o cabeza a cola. La introducción selectiva de un transgén en un tipo de célula particular también es posible siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992) .

La expresión del transgén en los animales transgénicos puede verificarse, mediante técnicas estándar. Por ejemplo, los análisis de transferencia Southern o de amplificación con PCR pueden utilizarse para verificar la integración del transgén. El nivel de expresión del AR m puede analizarse entonces utilizando técnicas tales como la hibridación in situ, análisis de transferencia Northern, PCR, o inmunocitoquímica .

Los animales pueden examinarse además, para los signos de una patología de una enfermedad inmune, por ejemplo, mediante el examen histológico para determinar la infiltración de las células inmunes a los tejidos específicos. Los experimentos de bloqueo también pueden realizarse, en los cuales los animales transgénicos son tratados con los compuestos de la invención, para determinar el grado de la estimulación o inhibición de la proliferación de las células T de los compuestos. En estos experimentos, los anticuerpos bloqueantes, que se unen a un polipéptido de. la invención, preparados como se describió anteriormente, se administran al animal y el efecto de la función inmune se determina .

De manera alterna, pueden construirse animales "desactivados" que tienen un gen defectuoso o alterado que codifica un polipéptido identificado en la presente, como resultado de la recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica el polipéptido y el ADN genómico alterado que codifica el mismo polipéptido introducido en una célula embriónica del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica un polipéptido particular, puede utilizarse para clonar el ADN genómico que codifica a ese polipéptido, de acuerdo con las técnicas establecidas . Una porción del ADN genómico que codifica un polipéptido particular puede suprimirse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede utilizarse para verificar la integración. Típicamente, varias kilobases del ADN flanqueante no alterado (tanto en los extremos 5' como 3') se incluyen en el vector [véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homólogos] . El vector se introduce en una línea de células germinales embriónicas (por ejemplo, mediante electroporacion) y las células en las cuales el ADN introducido se han recombinado de manera homologa con el ADN endógeno, se seleccionan [véase, por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [véase, ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) , p. 113-152] . Un embrión quimérico puede implantarse entonces en un animal hembra sustituto seudopreñado adecuado, y el embrión se lleva a término para crear un animal "desactivado". La progenie que aloja al ADN recombinado de manera homologa en sus células germinales, puede identificarse mediante técnicas estándar y se utilizan para crear animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homologa. Los animales desactivados pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido.

I . Terapia con el Inmunoadyuvante En una modalidad, los compuestos inmunoestimuladores de la invención pueden utilizarse en la terapia con inmunoadyuvante para el tratamiento de tumores (cáncer) . Está ahora bien establecido que las células T reconocen los antígenos específicos del tumor humano. Un grupo de antígenos del tumor, codificados por las familias de genes MAGE, BAGE y GAGE, son silenciosos en todos los tejidos normales adultos, pero se expresan en cantidades significativas en los tumores, tales como melanomas, tumores del pulmón, tumores de cabeza y cuello y carcinomas de la vejiga. DeSmet, C. et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci.

USA, 93:7149. Se ha mostrado que la coestimulación de las células T induce la regresión del tumor y una respuesta antitumoral tanto in vitro como in vivo. Melero, I. et al., Nature Medicine (1997) 3:682; Kwon, E. D. et al., Proc. Nati. Acad.. Sci. USA (1997) 94: 8099; Lynch, D. H. et al, Nature Medicine (1997) 3:625; Finn, O. J. y Lotze, M. T., J. Immunol . (1998) 21:114. Los datos proporcionados en la presente demuestran que la expresión de la TIGIT se correlaciona con los infiltrados de las células inmunes en los tumores de cáncer de mama. También se demuestra en la presente, que la TIGIT inhibe la proliferación de las DC y otras células inmunes y que inhibe la producción de la citocina proinflamatoria de tales células. Así, la sobreexpresión de la TIGIT en las células inmunes del infiltrado del tumor puede ser aberrante, puesto que una actividad disminuida de las células T en los tumores sería indeseable. Los antagonistas de la TIGIT y/o los antagonistas de la interacción de señalización de TIGIT-PVR (es decir, antagonistas del PVR) , pueden administrarse como adyuvantes, solos o junto con un agente regulador del crecimiento, agente citotóxico o agente quimioterapéuticos , para estimular la proliferación/activación de las células T y una respuesta antitumoral a los antígenos del tumor. El agente regulador del crecimiento, citotóxico o agente quimioterapéuticos puede administrarse en cantidades convencionales utilizando regímenes de administración conocidos. La actividad inmunoestimuladora por el antagonista de la TIGIT y la actividad de los compuestos antagonistas de la TIGIT de la invención, permite cantidades reducidas de los agentes reguladores del crecimiento, citotóxico o quimioterapéuticos , disminuyendo potencialmente la toxicidad para el paciente.

J. Ensayos de Selección para los Candidatos del Fármaco Los ensayos de selección para los candidatos del fármaco se diseñan para identificar los compuestos que se unen o complejan con los polipéptidos codificados por los genes identificados en la presente o en un fragmento biológicamente activo del mismo, o interfiere de otra manera con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de selección incluyen ensayos susceptibles para la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos del fármaco de molécula pequeña. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos, incluyendo péptidos, de manera preferida, péptidos solubles, fusiones de (poli) éptido-inmunoglobulina, y, en particular, anticuerpos que incluyen, de manera no exclusiva, anticuerpo poli y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos antiidiotípicos y versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos. Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión de proteína-proteína, ensayos de selección bioquímicos, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica. Todos los ensayos son comunes en que provocan el contacto del candidato del fármaco con un polipéptido codificado por un ácido nucleico identificado en la presente, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen.

En los ensayos de unión, la interacción es' la unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido codificado por el gen identificado en la presente o el candidato del fármaco, se inmoviliza en una fase sólida, por ejemplo, en una placa de microtitulación, mediante uniones covalentes o no covalentes . La unión no covalente generalmente se logra recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido y secando. De manera alterna, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido a ser inmovilizado, puede utilizarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza agregando el componente no inmovilizado, que puede marcarse con una marca detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reacción es completa, los componentes que no reaccionan o se eliminan, por ejemplo, mediante lavado, y los complejos anclados en la superficie sólida se detectan. Cuando el componente no inmovilizado originalmente porta una marca detectable, la marca de detección inmovilizada en la superficie indica que ha ocurrido la complej ación . En donde el componente no inmovilizado originalmente no porta una marca, la complej ación puede detectarse, por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se une de manera específica al complejo inmovilizado.

Si él compuesto candidato interactúa con, pero no se une a una proteína particular codificada por un gen identificado en la presente, su interacción con esa proteína se analizará mediante métodos bien conocidos por detectar las interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen procedimientos tradicionales, tales como, reticulación, coinmunoprecipitación y copurificación a través de gradientes o columnas cromatográficas . Además, las interacciones proteína-proteína pueden verificarse utilizando un sistema genético basado en levadura descrito por Fields y colaboradores [Fields y Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 88, 9578-9582 (1991)] como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991). Muchos activadores transcripcionales, tales como la levadura GAL4 , consisten de dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de unión al ADN, mientras que el otro funciona como el dominio de la activación de la transcripción. El sistema de expresión de la levadura en las publicaciones anteriores (referidos generalmente como el "sistema de dos híbridos") toma ventaja de esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína objetivo se fusiona al dominio que se une al ADN de GAL4 , y otra, en la cual las proteínas activantes candidatas se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen reportero GALl-lacZ bajo el control del promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 vía la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen los polipéptidos interactuantes se detectan con un sustrato cromogénico para la .ß-galactosidasa . Un equipo completo (MATCHMAKER™) para identificar las interacciones proteína-proteína', entre dos proteínas específicas, utilizando la técnica de dos híbrido, está comercialmente disponible de Clontech. Este sistema también puede extenderse para formar un mapa de los dominios de la proteína involucrados en las interacciones específicas de la proteína, así como para señalar los residuos de aminoácidos que son cruciales para estas interacciones!.

Con el fin de encontrar compuestos que interfieran con la interacción, de un gen identificado en la presente y otros componentes intra o extracelulares puedan ser probados, se prepara usualmente una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra o extracelular, bajo condiciones y durante un tiempo que permita la interacción y unión de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la unión, la reacción se corre en la ausencia y en la presencia del compuesto de prueba. Además, un placebo puede agregarse a una tercera mezcla de reacción, para servir como un control positivo. La unión (formación de un complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra o extracelular presente en la mezcla se verifica como se describió anteriormente. La formación de un complejo en las reacciones de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su compañero de reacción.

K. Composiciones y Métodos para el Tratamiento de Enfermedades Relacionadas con la Inmunidad Las · composiciones útiles en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad incluyen, de manera no exclusiva, proteínas, anticuerpos, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido y de ribozima, moléculas de triple hélice, etc.', que inhiben o estimulan la función inmune, por ejemplo, proliferación/activación de las células T, liberación de la linfocina o infiltración de las células inmunes.

Por ejemplo, las moléculas de ARN y ADN antisentido actúan para bloquear directamente la traducción del ARNm al hibridarse a un ARNm objetivo y evitando la traducción de la proteína. Cuando se utiliza ADN antisentido, los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de inicio de la traducción, por ejemplo, se prefieren entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia nucleotídica del gen objetivo.

Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica del ARN. Las riboximas actúan mediante la hibridación específica de la secuencia para el ARN objetivo complementario, seguido por la escisión endonucleolítica . Los sitios de escisión de la ribozima específicos, dentro de un objetivo de ARN potencial pueden identificarse mediante técnicas conocidas. Para los detalles adicionales véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology 4, 469-471 (1994), y la publicación del PCT No. WO 97/33551 (publicada en Septiembre 18 de 1997) .

Las moléculas de ácido nucleico en la formación de la triple hélice, utilizadas para inhibir la transcripción, deben ser de una sola hebra y compuestas de desoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera que promueve la formación de la triple hélice vía las reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requieren tramos considerables de purinas o pirimidinas en una hebra de un dúplex. Para los detalles adicionales, véase, por ejemplo, la publicación del PCT No. O 97/33551, supra.

Estas moléculas pueden identificarse mediante cualquiera o cualquier combinación de los ensayos de selección discutidos anteriormente y/o mediante otras técnicas de selección bien conocidas por aquéllos con experiencia en la técnica.

L . Anticuerpos Anti-TIGIT La presente invención proporciona además, anticuerpos anti-TIGIT. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales , monoclonales , humanizados, biespecífieos y heteroconjugados . Se entenderá por alguien con experiencia ordinaria en la técnica que la invención también proporciona anticuerpos contra otros polipéptidos (es decir, anticuerpos anti-PVR) y que cualquiera de la descripción presente que esté dirigido de manera específica al método de creación, producción, variedades, uso u otros aspectos de los anticuerpos anti-TIGIT, también será aplicable a los anticuerpos específico para otros polipéptidos que no son de TIGIT. 1. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos anti-TIGIT pueden comprender anticuerpos policlonales. Los métodos para preparar los anticuerpos policlonales son conocidos por la persona con experiencia. Los anticuerpos policlonales pueden crearse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante, y si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o adyuvante será inyectado en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales . El agente inmunizante puede incluir el polipéptido de TIGIT o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil para conjugar el agente inmunizante a la proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen de manera no exclusiva, hemocianina de lapa ranurada, seroalbúmina, tiroglogulina bovina e inhibidor de la tripsina de soya. Los ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorimonicolato de trehalosa sintético) . El protocolo de inmunización puede seleccionarse por alguien con experiencia en la técnica sin experimentación indebida. 2. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos anti-TIGIT pueden, de manera ' alterna, ser anticuerpo monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando métodos de hibridoma, tales como aquéllos descritos por Kohler y Milstein, Nature , 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un. ratón, hámster u otro animal hospedero apropiado, se inmuniza típicamente con un agente inmunizante, para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán de manera específica al agente inmunizante. De manera alterna, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante incluirá típicamente, el polipéptido de TIGIT o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, los linfocitos de la sangre periférica ("PBL") se utilizan si se desean células de origen humano, o se utilizan células del bazo o del nodo linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos se fusionan a continuación con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103] . Las líneas celulares inmortalizadas son usualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de miéloma de origen de roedor, bovino y humano. Usualmente, se emplean las líneas celulares de mieloma de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que de manera preferida, contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosrorribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias las cuales previenen el crecimiento de las células deficientes de HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son , aquéllas que se fusionan de manera eficiente, soportan un alto nivel de expresión estable del anticuerpo por las células que producen el anticuerpo seleccionadas, y son sensibles al medio, tal como el medio HAT. Además, las líneas celulares inmortalizadas preferidas son líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Centro de Distribución de Células del Instituto Salk, San Diego, California y de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma se cultivan, puede probarse entonces para la presencia de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido. De manera preferida, la especificidad de la unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por la inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoanálisis (RIA) o un inmunoanálisis enlazado a enzimas (ELISA) . Tales técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal . Biochem. , 107:220 (1980) .

Después de que las células de hibridoma deseadas se identifican, la clonas pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y cultivando mediante métodos estándar [Goding, supra] . El medio de cultivo adecuado para este proposito incluye, por ejemplo, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. De manera alterna, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitos en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por las subclonas pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o del fluido de ascitos, mediante procedimientos de purificación de la inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis sobre gel, diálisis o cromatografía por afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden hacerse mediante métodos de ADN recombinante , tales como aquéllos descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse de manera específica a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aisladas, el ADN puede colocarse en los vectores de expresión, que son transíectados entonces en las células hospederas, tales como células COS simianas, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera la proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes . El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanos, en lugar de las secuencias murinas homologas [Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Morrison et al., supra] o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina, de toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Tal polipéptido que no es de inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio que se combina al antígeno de un anticuerpo de la invención, para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes . Los métodos para preparar los anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada está truncada generalmente en cualquier punto en la región Fe, para evitar que la cadena pesada se reticule. De manera alterna, los residuos de cisteína relevantes son sustituidos con otro residuo de aminoácido o son suprimidos para evitar .la reticulación.

Los métodos in vitro también son adecuados para preparar los anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, puede lograrse utilizando técnicas rutinarias conocidas en el campo. 3. Anticuerpos Humanos y Humanizados Los anticuerpos anti-TIGIT de la invención pueden comprender además, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por . ejemplo, murinos) , son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab' , F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las cuales los residuos de una región que determina la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por los residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo del donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del marco Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes . Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo del receptor ni en la CDR o las secuencias del marco importadas . En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos dominios variables; en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de la inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las regiones FR son aquéllas de una secuencia de consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de manera óptima, también comprenderá al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fe) , típicamente aquélla de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature , 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr . Op . Struct . Biol . , 2:593-596 (1992)].

Los métodos para humanizar los anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son referidos con frecuencia como residuos "importados", que se toman típicamente de un dominio variable "importado" .· La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de inter y colaboradores [Jones et al., Nature , 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature , 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], sustituyendo las DCR de roedor o las secuencias de la CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la CDR y posiblemente algunos residuos de la FR son sustituidos por residuos de los sitios análogos en los anticuerpos de roedor.

Los anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando varias técnicas conocidas en el campo, incluyendo bibliotecas de representación del fago [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581 (1991)]. Las técnicas de Colé et al. y Boerner et al., están también disponibles para la. preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol . , 147(1): 86-95 (1991)]. De manera similar, los anticuerpos humanos pueden hacerse introduciendo un locus de la inmunoglobulina humana en animales transgénicos , por ejemplo, ratones, en los cuales los genes de la inmunoglobulina endógena se han inactivado de manera parcial o completa. Tras la exposición, se observa la producción del anticuerpo humano, que se parece estrechamente a aquélla observada en los humanos en todos los aspectos, incluyendo el rearreglo del gen, montaje y repertorio del anticuerpo. Este procedimiento se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotec nology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13 65-93 (1995) .

Los anticuerpos también pueden ser madurados por afinidad, utilizando métodos de selección y/o mutagénesis conocidos, como se describió anteriormente. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos, tienen una afinidad que es cinco veces, de manera más preferida 10 veces, aún de manera más preferida 20 ó 30 veces mayor que la del anticuerpo inicial (generalmente murino, humanizado o humano) del cual se prepara el anticuerpo madurado. 4. Anticuerpos Biespecífieos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales , de manera preferida, humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para la TIGIT, la otra es para cualquier otro antígeno, y de manera preferida, por una proteína o receptor o subunidad de receptor de la superficie celular.

Los métodos para hacer los anticuerpos biespecífieos se conocen en la técnica. Tradicionalmente , la producción recombinantes de los anticuerpos biespecífico se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de la inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) , producen · una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se logra usualmente mediante los pasos de la cromatografía por afinidad. Los procedimientos similares se describen en la WO 93/08829, publicada el 13 de Mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J . , 10:3655-3659 (1991).

Los dominios variables del anticuerpo, con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan el anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a la secuencia del dominio constante de la inmunoglobulinas . La fusión, de manera preferida, es con el dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de la articulación, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en los vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedero adecuado. Para los detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecífieos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otro procedimiento descrito en la WO 96/27011, la interfase entre un par de moléculas del anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante . La interfase preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más de las cadenas de aminoácidos de la interfase de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula del anticuerpo, reemplazando cadenas laterales grandes de aminoácidos con otras pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales indeseados, tales como homodímeros .

Los anticuerpos biespecífieos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab')2). Las técnicas para generar anticuerpos biespecificos de los fragmentos de anticuerpo, se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos pueden prepararse utilizando un enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente complejante del ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación del disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados son convertidos entonces a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB se reconvierte entonces al Fab'-tiol mediante . la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos pueden utilizarse como agentes para · la inmovilización selectiva de enzimas.

Los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar los anticuerpos biespecificos . Shalaby et al., J . Ex . Med . 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula de un anticuerpo biespecífico F(ab')2 completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó de manera separada de E. coli y se sometió al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico . El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a las células que sobreexpresan al receptor ErbB2 y a las células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos del tumor de mama humano .

Varias técnicas para hacer y aislar los fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo de las células recombinantes también se han descrito. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J . Immunol . 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región de la articulación para formar monómeros y a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros del anticuerpo. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alterno para hacer fragmentos del anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) mediante un enlazante, que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En- consecuencia, los dominios VH- y VL de un fragmento son obligados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando por lo tanto, dos sitios de unión al antígeno. Otra estrategia para hacer fragmentos del anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros de Fv de una sola cadena (sFv) , también se ha reportado. Véase, Gruber et al., J . Immunol . 152:5368 (1994) .

Los anticuerpos con más de dos valencias están contemplados. Como un ejemplo no limitante, pueden prepararse anticuerpos triespecífieos . Véase, por ejemplo, Tutt et al., J . Immunol . 147:60 (1991).

Los anticuerpos biespecífieos ejemplares pueden unirse a dos epitopos diferente en un polipéptido de TIGIT dado en la presente. De manera alterna, un brazo del polipéptido anti-TIGIT puede combinarse con un brazo que se une a una molécula activadora en un leucocito, tal como una molécula del receptor de las células T (por ejemplo CD2 , CD3 , CD28 o B7) , o receptores Fe para la IgG (FcyR) , tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16), para enfocar los mecanismos de defensa, celular a la células que expresa el polipéptido de TIGIT particular. Los anticuerpos biespecífieos también pueden utilizarse para localizar los agentes citotóxicos en la células que expresan un polipéptido de TIGIT particular. Estos anticuerpos poseen un brazo que se une a TIGIT y un brazo que se une a un agente citotóxico o a un quelante de radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido de TIGIT y se' une además al factor del tejido (TF) . 5. Anticuerpos Heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos de manera covalente. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir las células del sistema inmune a las células indeseadas [Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980] , y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Esta contemplado que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en la química de las proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que involucran agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace de tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquéllos descritos, por ejemplo, en la Patente de- los Estados Unidos No. 4,676,980. 6. Diseño de la Función Efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo para tratar el cáncer. Por ejemplo, los residuos de cisteína pueden introducirse en la región Fe, permitiendo por lo tanto la formación del enlace de disulfuro en la cadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado, puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una destrucción de las células mediada por el complemento incrementada y una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Véase, Carón et al., J. Exp Med. , 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol . , 148 : 2918-2922 (1992) . Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral mejorada también pueden prepararse utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolf'f et al. Cáncer Research, 53: 2560-2565 (1993) . De manera alterna, un anticuerpo puede diseñarse para que tenga regiones Fe dobles y pueda, por lo tanto, tener capacidades de lisis del complemento y de ADCC mejoradas. Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989). 7. Inmunoconjugados La invención también pertenece . a los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, micótico, de planta o animal, o fragmentos de la misma) , o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) .

La invención también proporciona inmunoconjugados (referidos de manera indistinta como "conjugados del anticuerpo- fármaco" , o "ADC"), que comprenden un anticuerpo conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina de proteína, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, micótico, de planta o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) .

Los inmunoconjugados se ha utilizado para el suministro local de agentes citotóxicos, es decir, fármacos que destruyen o inhiben el crecimiento o proliferación de las células, en el tratamiento del cáncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinión in Pharmacology 5:543-549; u et al (2005) JVature Biotechnology 23 (9) : 1137-1146 ; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; Patente de los Estados Unidos No. 4,975,278). Los inmunoconjugados permiten el suministro dirigido de una porción del fármaco a un tumor, y la acumulación intracelular en el mismo, en donde la administración sistémica de los fármacos no conjugados puede resultar en niveles inaceptables de toxicidad para las células normales, así como para las células del tumor que buscan ser eliminadas (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , in Monoclonal Antibodies 484 : Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) p . 475-506. Ambos anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales se han reportado como útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol . Immunother. 21:183-87). Los fármacos utilizados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorrubicina , metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . Las toxinas utilizadas en los conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina diftérica, toxinas de plantas tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) J. Nat . Cáncer Inst . 92 (19) :1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), máitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y caliqueamicina (Lode et al (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos mediante mecanismos que incluyen la unión a la tubulina, unión al ADN o inhibición de la topoisomerasa . Tales fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan a anticuerpos grandes o a ligandos del receptor de la proteína.

ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) , es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa de Igl murino dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de los linfocitos B normales y malignos y el radioisótopo lllln o 90Y unido mediante un enlazante-quelante de tiourea (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucí. Med. 27 (7) : 766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99 (12) : 4336-42 ; Witzig et al (2002) J. Clin.

Oncol. 20 (10) :2453-63 ; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol . 20 (15) :3262-69) . Aunque el ZEVALIN tiene actividad contra el Linfoma de Hodgkin que no es de las células B (NHL) , la administración resulta en citopenias severas y prolongadas en la mayoría de los pacientes. El MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals) , un conjugado anticuerpo- fármaco compuesto de un anticuerpo huCD33 anticuerpo enlazado a caliqueamicina, se aprobó en el 2000 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda mediante inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7) :686; Patentes de los Estados Unidos Nos. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). El cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto del anticuerpo huC242 enlazado vía el enlazante de disulfuro SPP a la porción del fármaco maitansinoide, DM1, está avanzando hacia los ensayos de Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan a CanAg, tal como cánceres de colon, pancreáticos, gástricos y otros cánceres. MLN-2704 (Millennium Pharm. , BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo- fármaco compuesto del anticuerpo monoclonal del antígeno de la membrana específica anti-prostática (PSMA) enlazada a la porción del fármaco maitansinoide, DM1, está bajo desarrollo para el tratamiento potencial de los tumores de próstata. Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de la dolastatina, se conjugaron a anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos para CD30 en malignidades hematológicas ) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnol . 21 (7) : 778-784) , y están bajo desarrollo terapéutico.

En ciertas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo y un agente quimioterapéutico u otra toxina. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados se describen en la presente (por ejemplo, anteriormente) . Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden utilizarse, incluyen la cadena de la difteria A, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleuri es fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia , curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Véase, por ejemplo, la WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre de 1993. Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de los anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131l, 131In, 90Y y 186Re . Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes de acoplamiento a la proteína bifuncionales , tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol ) (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl) , ásteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil ) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6 -diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triamin-pentaacético marcado con carbono, 14 (MX-DTPA) , es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase la WO94/11026.

Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina , maitansinoides , dolastatinas, aurostatinas , un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también están contemplados en la presente. a. Maitansina y maitansinoides En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (de longitud completa o fragmentos) , conjugados a una o más moléculas maitansinoides. Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló primero del arbusto de África Oriental Maytenus serrata (Patente de los Estados Unidos No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y esteres de maitansinol C-3 (Patente de los Estados Unidos No. 4,151,042). Los maitansinoles sintéticos y los derivados y análogos de los mismos se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533.

Las porciones del fármaco maitansinoide son porciones de fármaco atractivas en los conjugados de anticuerpo-fármacos, debido a que son: (i) relativamente accesibles para prepararse mediante la fermentación o modificación química, derivación de productos de la fermentación, (ii) susceptibles para la derivación con grupos funcionales adecuados para la conjugación a través de enlazantes que no son de disulfuro a los anticuerpos, (iii) estables en plasma, y (iv) efectivos contra una variedad de líneas celulares de tumores.

Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides , los métodos para hacer los mismos, y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,208,020, 5,416,064 y en la Patente Europea EP 0 425 235 Bl, las descripciones de las cuales se incorporan de manera expresa en la presente como referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996), describen inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado como DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado es altamente citotóxico hacia las células del cáncer de colon cultivadas, y mostró actividad antitumoral en un ensayo de cultivo del tumor in vivo. Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992), describen inmunoconjugados en los cuales un maitansinoide se conjugó vía un enlazante de disulfuro al anticuerpo murino A7 uniéndose a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que se unen al encogen HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado de TA.1-maitansinoide se probó in vitro en la línea celular del cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos superficiales HER-2 por célula. El conjugado del fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría incrementarse, incrementando el número de moléculas maitansinoides por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una baja citotoxicidad sistémica en los ratones.

Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan mediante el enlace químico de un anticuerpo a una molécula maitansinoide sin disminuir de manera significativa la actividad biológica del anticuerpo de la molécula maitansinoide. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,208,020 (la descripción de la cual se incorpora de manera expresa en la presente como referencia) . Un promedio de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por molécula de anticuerpo, ha mostrado eficacia en mejorar la citotóxicidad de las células objetivo, sin afectar de manera negativa la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría que mejorara la citotóxicidad con respecto al uso del anticuerpo descubierto. Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica, y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Los maitansinoides adecuados se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,208,020, y en otras patentes y publicaciones que no son de patente referidas aquí anteriormente . los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula maitansinol, tal como varios ésteres de maitansinol.

Existen muchos grupos enlazantes conocidos en la técnica, para ser conjugados de anticuerpo-maitansinoide , incluyendo, por ejemplo, aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 5,208,020 o la Patente EP 0 425 235 Bl, Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992), y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/960,602, presentada el 8 de Octubre del 2004, las descripciones de las cuales se incorporan de manera expresa en la presente como referencia. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden los componentes enlazantes de SMCC pueden prepararse como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/960,602, presentada el 8 de Octubre del 2004. Los grupos enlazantes incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles de peptidasa o grupos lábiles de esterasa, como se describe en las patentes identificadas anteriormente, los grupos disulfuro y tioéter son preferidos. Los grupos enlazantes adicionales se describen y ejemplifican en la presente.

Los conjugados del anticuerpo y maitansinoide pueden hacerse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento a la proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3 - (2-piridilditio) propionato (SPDP) , ciclohexan-1-carboxilato de succinimidil-4 - (N-maleimidometilo) (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HC1) , ásteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil ) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenceno) .

Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen el N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y N-succinimidil-4- (2-piridiltio) entanoato (SPP) , para proporcionar un enlace disulfuro.

El enlazante puede unirse a la molécula maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo del enlace. Por ejemplo, un enlace éster puede formarse mediante la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con un hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 del maitansinol o un análogo de maitansinol. b. Auristatinas y dolastatinas En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a dolastatinas o análogos y derivados peptídicos de dolostatina, las auristatinas (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5635483; 5780588). Las dolastatinas y auristatinas han mostrado interferir con la dinámica del microtúbulo, hidrólisis GTP, y la división nuclear y celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 ( 12 ): 3580-3584 ) , y tienen actividad anticancerígena (US 5663149) y antimicótico (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). La porción del fármaco de la dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del término N (amino) o el término C (carboxilo) de la porción del fármaco peptídico (WO 02/088172) .

Las modalidades ejemplares de la auristatina incluyen porciones del fármaco de monometilaurista.tina enlazadas al término N DE y DF, descritos en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" , US No. de Serie 10/983,340, presentada el 5 de Noviembre del 2004, la descripción de las cuales se incorpora de manera expresa como referencia en su totalidad.

Típicamente, las porciones de fármaco basadas en péptidos pueden prepararse formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Tales enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (véase, E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) , que es bien conocido en el campo de la química peptídica. Las porciones de fármaco de auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos de: la US 5635483; US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc . 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R. , et al. Synthesis, 1996, 719-725; y Pettit et al (1996) J. Chem. Soc . Perkin Trans . 1 5:859-863. Véase también Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7) : 778-784 ; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" , US No. de Serie 10/983,340, presentada el 5 de Noviembre del 2004, incorporadas en la presente como referencia en su totalidad (que describen, por ejemplo, enlazantes y métodos para preparar los compuestos de monometilvalina tales como M AE y AF conjugados a los enlazantes) . c. Caliqueamicina En otras modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina son capaces de producir rupturas del ADN de doble hebra a concentraciones subpicomolares . Para la preparación de los conjugados de la familia de la caliqueamicina, véanse las Patentes de los Estados Unidos 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas de American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, de manera no exclusiva, ???, a2?, a3?, N-acetil-???, PSAG y II (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes de los Estados Unidos mencionadas anteriormente de American Cyanamid) . Otro fármaco antitumoral al que el anticuerpo puede conjugarse es QFA que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA, tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana del plasma. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo mejora en gran medida sus efectos citotóxicos. d. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse a los anticuerpos incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como el complejo LL-E33288 descrito en las Patentes de los Estados Unidos 5,053,394, 5,770,710, así como a las esperamicinas (Patente de los Estados Unidos 5, 877, 296) .

Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden utilizarse, incluyen la cadena de la difteria A, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aer ginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Véase, por ejemplo, WO 93/21232, publicada el 28 de Octubre de 1993.

La presente invención contempla además, un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con una actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN, tal como una desoxirribonucleasa; DNasa) .

Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de los anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios centigráficos , por ejemplo, tc99m o 1123, o una marca de espín para la formación con resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como formación de imágenes por resonancia magnética, mri) , tales como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Las radiomarcas u otras marcas pueden incorporarse en el conjugado de varias maneras. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos utilizando los precursores de aminoácidos adecuados que involucran, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las marcas tales como tc"m o I123, Re186, Re188 e In111, pueden unirse vía un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 puede unirse vía un residuo de lisina. El método de YODOGENO (Fraker et al (1978) Biochem.

Biophys. Res. Commun. 80: 49-57), puede utilizarse para incorporar el yodo- 123. " onoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) , describe otros métodos con detalle.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden hacerse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento a la proteína bifuncionales , tales como N-succinimidil-3 - (2-piridilditio) propionato (SPDP) , ciclohexan-1-carboxilato de succinimidil-4- (N-maleimidometilo) (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HC1) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilentriamin-pentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) , es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Véase la WO 94/11026. El enlazante puede ser un "enlazante escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante lábil ácido, un enlazante sensible a la peptidasa, un enlazante fotolábil, un enlazante de dimetilo o un enlazante que ¦ contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de los Estados Unidos, No. 5,208, 020) .

Los compuestos contemplan de manera expresa, pero de manera no exclusiva, ADC preparado con reactivos reticulantes : BMPS, E CS, G BS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC , SMPB, SMPH, sulfo-EMCS , sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (benzoato de succinimidil- (4-vinilsulfona) ) , que están cómercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., E.U.A). Véanse las páginas 467-498, del Manual y Catálogo de Aplicaciones del 2003-2004. e. Preparación de .los conjugados de anticuerpo-fármaco En los conjugados de anticuerpo- fármaco (ADC) , un anticuerpo (Ab) se conjuga a una o más porciones de fármaco (D) , por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 porciones de fármaco por anticuerpo, a través de un enlazante (L) . El ADC de Fórmula I puede prepararse mediante varias rutas, empleando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo enlazante bivalente para formar Ab-L, vía un enlace covalente, seguido por la reacción con una porción del fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de una porción de fármaco con un reactivo enlazante bivalente, para formar D-L, vía un enlace covalente, seguida por la reacción con un grupo nucleofílico de un anticuerpo. Los métodos adicionales para preparar el ADC se describen en la presente.

Ab-(L-D) p I El enlazante puede estar compuesto de uno o más componentes enlazantes . Los componentes enlazantes ejemplares incluyen 6-maleimidocaproilo ( "MC" ) , maleimidopropanoilo ( "MP" ) , valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), 4- (2-piridiltio) pentanoato de N-Succinimidilo ("SPP"), 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1 carboxilato de N-Succinimidilo ("SMCC), y (4-yodo-acetil) aminobenzóato de N-Succinimidilo ("SIAB"). Los componentes enlazantes adicionales son conocidos en la técnica y algunos se describen en la presente. Véase también "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" , US. No. de Serie 10/983,340, presentada el 5 de Noviembre del 2004, el contenido de la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En algunas modalidades, el enlazante puede comprender residuos de aminoácidos. Los componentes enlazantes de aminoácidos ejemplares incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un' pentapéptido . Los dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) . Los tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente enlazante de aminoácidos, incluyen aquellos naturales, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos no naturales, tales como citrulina. Los componentes del enlazante de aminoácido pueden diseñarse y optimizarse en su selectividad para la escisión enzimática mediante enzimas particulares, por ejemplo, una proteasa asociada con el tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.

Los grupos nucleofílieos en los anticuerpos incluyen, de manera no exclusiva: (i) grupos amina N terminales, (ii) grupos de amina de cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos hidroxilo de azúcar o amino, en donde el anticuerpo está glucosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílieos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con los grupos electrofílieos en las porciones enlazantes y los reactivos enlazantes, incluyendo: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS , ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas ; (iii) grupos aldehido, cetona, carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos parra la conjugación con reactivos enlazantes mediante el tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol ) . Cada puente de cisteína formará así, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Los grupos nucleofílicos adicionales pueden introducirse en los anticuerpos a través de la reacción de las lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) , resultando en la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo (o fragmento del mismo), introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos de cisteína no nativos) .

Los conjugados del anticuerpo-fármaco también pueden producirse mediante la modificación del anticuerpo para introducir porciones electrofílicas , que pueden reaccionar con los sustituyentes nucleofílieos en el reactivo enlazante o el fármaco. Los azúcares de los anticuerpos glucosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos enlazantes o las porciones del fármaco. Los grupos de la base de Schiff de imina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, mediante reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glucosilado con galactosa oxidasa o. meta-peryodato de sodio puede proporcionar grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína, que pueden reaccionar con los grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra modalidad, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N terminales, pueden reaccionar con el meta-peryodato de sodio, resultando en la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Tal aldehido puede hacerse reaccionar con una porción de fármaco o nucleófilo enlazante.

De igual manera, los grupos nucleofílieos en la porción del fármaco incluyen, de manera no exclusiva: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con los gripos electrofílieos en las porciones enlazantes y los reactivos enlazantes, incluyendo: (i) ásteres activos tales como esteres de NHS , ésteres de HOBt , haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas ; (iii) grupos aldehido, cetona, carboxilo y maleimida.

De manera alterna, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y el agente citotóxico puede hacerse, por ejemplo, mediante técnicas recomb'inantes o síntesis peptídica. La longitud del ADN puede comprender las regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado, ya sea adyacentes una a la otra o separadas por una región que codifica un péptido enlazante, que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En aún otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en la preselección del tumor, en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la eliminación del conjugado no unido de la circulación, utilizando un agente de eliminación y a continuación la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) , que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) . 8. Inmunoliposomas Los anticuerpos descritos en la presente también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante los métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,013,556.

Los liposomas particularmente útiles pueden generarse mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de un tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con un diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol . Chem. , 257 : 286-288 (1982) vía una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como Doxorrubicina) , está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Véase, Gabizon et al., J . National Cáncer Inst . , 81(19) : 1484 (1989) .

M. Composiciones Farmacéuticas Las moléculas activas de la invención (por ejemplo, polipéptidos de TIGIT, anticuerpos anti-TIGIT, variantes de cada uno, agonistas de la TIGIT, antagonistas de la TIGIT, agonistas del PVR y antagonistas del PVR) , así como otras moléculas identificadas mediante los ensayos de selección descritos anteriormente, pueden administrarse para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad, en la forma de composiciones farmacéuticas.

Las formulaciones terapéuticas para una molécula activa, por ejemplo, un polipéptido o anticuerpo de la invención, se preparan para el almacenamiento mezclando la molécula activa que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables {Re ington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed.

[1980]), en la 'forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables, son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos, antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales · como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos , tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLU ONICS™ o polietilenglicol (PEG) .

Los compuestos identificados mediante los ensayos de selección descritos en la presente pueden formularse de una manera análoga, utilizando técnicas estándar bien conocidas en el campo.

Las lipofecciones o liposomas también pueden utilizarse para suministrar la molécula activa en las células. En donde se utilizan fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibidor más pequeño que se une de manera específica al dominio de unión de la proteína objetivo se prefiere. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, las moléculas peptídicas pueden diseñarse para mantener la capacidad para unirse a la secuencia de la proteína objetivo. Tales péptidos pueden sintetizarse de manera química y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, arasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90, 7889-7893

[1993]).

La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo conforme sea necesario para la indicación particular siendo tratada, de manera preferida, aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa unas con otras. De manera alterna o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, una citocina o un agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Las moléculas activas también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y poli- (metilmetacilato) , respectivamente', en sistemas de suministro del fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol , A. Ed. (1980).

Las formulaciones a ser utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

Puede prepararse preparaciones de liberación sostenida de las moléculas activas. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenidá incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices las . cuales están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) , o poli (alcohol vinílico) ) , polilactidas (Patente de los Estados Unidos No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, polímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) , y ácido poli-D- (-) -3 -hidroxibutírico . Aunque los polímeros tales como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico, permiten la liberación de las moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, resultando en una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden considerarse para la estabilización, dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se ' descubre que el mecanismo de agregación es la formación de un enlaces S-S intermolecular a través del intercambio de tiodisulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

N. Métodos de Tratamiento Esta contemplado que los polipéptidos , anticuerpos y otros compuestos activos de la presente invención, pueden utilizarse para tratar varias enfermedades y condiciones relacionadas con la inmunidad, tales como las enfermedades mediadas por las células T, incluyendo aquéllas caracterizadas por la infiltración de las células inflamatorias en un tejido, estimulación de la proliferación de las células T, inhibición de la proliferación de las células T, producción de citocinas incrementada o disminuida, y/o permeabilidad vascular incrementada o disminuida o la inhibición de la misma. Dadas las descripciones en la presente del papel de la TIGIT en modular la proliferación de las células T y la producción de la citocina, la modulación de la expresión y/o actividad de la TIGIT puede ser eficaz para prevenir y/o tratar estas enfermedades.

Las condiciones o trastornos ejemplares a ser tratados con los polipéptidos , anticuerpos y otros compuestos de la invención, incluyen, de manera no exclusiva, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, osteoartritis , espondiloartropatías , esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis , polimiositis) , síndrome de Sjógren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal) , trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada por la inmunidad) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) , diabetes mellitus, enfermedad renal mediada por la inmunidad (glomerulonefritis , nefritis túbulointersticial ) , enfermedades desmielinizantes de los sistemas nervioso central y periférico, tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros viruses no hepatotrópicos) , hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y colangitis esclerosante, enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerativa: enfermedad de Crohn) , enteropatía sensible al gluten, y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel autoinmunes o mediadas con la inmunidad incluyendo enfermedades bullosas de la piel, eritema multiforme y dermatitis por contacto, soriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eosinofílicas , fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades asociadas con transplantes 'incluyendo rechazo del injerto y enfermedad de injerto versus hospedero.

El lupus sistémico eritematoso, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos autorreactivos a las proteínas/tejidos antólogos y a la generación posterior de la inflamación mediada por la inmunidad. Los anticuerpos median de manera directa o indirecta la lesión del tejido. Aunque no se ha mostrado que los linfocitos T están involucrados directamente en el daño del tejido, los linfocitos T se requieren para el desarrollo de los anticuerpos autorreactivos . La génesis de la enfermedad es, por lo tanto, dependiente de los linfocitos T. Múltiples órganos y sistemas son afectados clínicamente, incluyendo el riñon, pulmón, sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula ósea y sangre .

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica que involucra principalmente la membrana sinovial de múltiples articulaciones, · con la lesión resultante al cartílago articular. La patogénesis es dependiente de los linfocitos T y está asociada con la producción de factores reumatoides, autoanticuerpos dirigidos contra la IgG autóloga, con la formación resultante de complejos inmunes que logran altos niveles en el fluido de las articulaciones y la sangre. Estos complejos en la articulación pueden inducir a un infiltrado marcado de los linfocitos y los monocitos en el sinovio y cambios sinoviales marcados posteriores; el espacio/fluido de la articulación si se infiltra por células similares con la adición de numerosos neutrófilos. Los tejidos afectados son principalmente las articulaciones, con frecuencia en un patrón simétrico. Sin embargo, la enfermedad extraarticular también aparece eri dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extraarticulares con la enfermedad de la articulación progresiva en curso y lesiones típicas de fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas. La segunda forma de enfermedad extraarticular es el llamado síndrome de Felty, que ocurre de manera tardía en el curso de la enfermedad de RA, algunas veces después de que la enfermedad de las articulaciones se ha vuelto guiescente, e involucra la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia . Esta puede acompañarse por vasculitis en múltiples órganos con la formación de infartos, úlceras de la piel y gangrena. Los pacientes con frecuencia también desarrollan nodulos reumáticos en el tejido del subcutis superpuesto a las articulaciones afectadas; la etapa tardía de los nodulos tiene centros necróticos rodeados por un infiltrado de células inflamatorias mezcladas. Otras manifestaciones que pueden ocurrir en la RA incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, queratoconjuntivitis seca y nodulos reumáticos.

La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que empieza con frecuencia a menos de 16 años de edad. Su fenotipo tiene algunas similitudes con la RA; algunos pacientes que son positivos al factor reumatoide se clasifican como artritis reumatoide juvenil. La enfermedad se subclasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser severa y es típicamente destructiva y conduce a la anquilosis de las articulaciones y a un crecimiento retardado. Otras manifestaciones pueden incluir uveítis anterior crónica y amiloidosis sistémica.

Las espondiloartropatías son un grupo de trastornos con algunas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto génico HLA-B27. Los trastornos incluyen: espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter (artritis reactiva) , artritis asociada con la enfermedad inflamatoria del intestino, espondilitis asociada con soriasis, espondiloartropatía de inicio juvenil y espondiloartropatía no diferenciada.. Las características distintivas incluyen sacroileítis con o sin espondilitis; artritis asimétrica inflamatoria; asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del locus HLA-B del MHC clase I) ; inflamación ocular y ausencia de autoanticuerpos asociado con otra enfermedad reumatoide. Las células más implicadas como una clave para la inducción de la enfermedad son los linfocitos T CD8+, una célula que selecciona el antígeno presentado por las moléculas del MHC clase I. Las células T CD8+ pueden reaccionar contra el alelo del MHC clase I HLA-B27 como si fuera un péptido extraño expresado por las moléculas de MHC clase I. Se tiene la hipótesis de que un epitopo de HLA-B27 puede . imitar un epitopo antigénico bacteriano u otro epitopo antigénico microbiano, e inducir, por lo tanto, una respuesta de las células T CD8+. Como se muestra en la presente, la TIGIT se expresa en las células T CD8+, y la modulación de la expresión y/o actividad de la TIGIT en esas células, puede modular los síntomas de y/o prevenir esta enfermedad.

La esclerosis sistémica (escleroderma) , tiene una etiología, desconocida. Una marca característica de la enfermedad es la induración de la piel; probablemente esto se induce por un proceso inflamatorio activo. La escleroderma puede ser localizada o sistémica; las lesiones vasculares son comunes y la lesión de. las células endoteliales en la microvasculatura es un evento inicial importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica; la lesión vascular puede ser mediada por la inmunidad. Una base inmunológica está implicada por la presencia de infiltrados de células mononucleares en las lesiones cutáneas y la presencia de anticuerpos antinucleares en muchos pacientes. ICAM-1 con frecuencia está sobrerregulado en la superficie celular de los fibroblastos en las lesiones de la piel, sugiriendo que la interacción de las células T con estas células puede tener un papel en la patogénesis de la enfermedad. Otros órganos involucrados incluyen: el tracto gastrointestinal: atrofia del músculo liso y fibrosis que resulta en peristalsis/motilidad anormal; riñon: proliferación de la íntima subendotelial concéntrica que afectan las arterias arqueadas e interlobulares pequeñas con un flujo de la sangre cortical renal reducido resultante, que resulta en proteinuria, azotemia e hipertensión; músculo esquelético: atrofia, fibrosis intersticial; inflamación; pulmón: neumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y corazón: necrosis de la banda de contracción, cicatrización/fibrosis .

Las miopatías inflamatorias idiomáticas, incluyendo la dermatomiositis , polimiositis y otros, son trastornos de la inflamación crónica del músculo de etiología desconocida, que resulta en debilidad del músculo. La lesión/inflamación muscular es con frecuencia simétrica y progresiva. Los autoanticuerpos están asociados con la mayoría de las formas. Estos autoanticuerpos específicos de la miositis están dirigidos contra, e inhiben la función de los componentes, proteínas y AR , involucrados en la síntesis de la proteína.

El síndrome de Sjógren se debe a la inflamación mediada por la inmunidad y a la destrucción funcional posterior de las glándulas lagrimales y las glándulas salivales. La enfermedad puede asociarse con, o estar acompañada por enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad está asociada con la producción de autoanticuerpos contra los antígenos Ro y La, ambos de los cuales son complejos pequeños de ARN-proteína . Las lesiones resultan en queratoconjuntivitis seca, xerostomía, con otras manifestaciones o asociaciones incluyendo cirrosis biliar, neuropatía periférica o sensorial y púrpura palpable.

La vasculitis sistémica- son enfermedades en las cuales la lesión primaria es la inflamación y el daño posterior a los vasos sanguíneos, que resulta en isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos abastecidos por los vasos afectados y la disfunción del órgano final eventual en algunos casos. Las vasculitis también pueden aparecer como una lesión secundaria o secuencia de otras enfermedades inflamatorias mediadas por la inmunidad, tales como artritis reumatoide, esclerosis sistémica, etc., particularmente, en enfermedades también asociadas con la formación de complejos inmunes. Las enfermedades en el grupo de la vasculitis sistémica primaria incluyen: vasculitis necrotizante sistémica: poliarteritis nodosa, angiítis alérgica y granulomatosis , poliangiítis ; granulomatosis de Wegener,-granulomatosis linfomatoide ; y arteritis de las células gigantes. Las vasculitis misceláneas incluyen: síndrome del nodo linfático mucocutáneo (MLNS o enfermedad de Kawasaki), vasculitis del CNS aislada, enfermedad de Behet, tromboanginitis obliterante (enfermedad de Buerger) y venulitis necrotizante cutánea. El mecanismo patogénico de la mayoría de los tipos de vasculitis listados, se cree que es principalmente debido a la deposición de complejos de inmunogl'obulina en la pared del vaso y la inducción posterior de una respuesta inflamatoria, ya sea vía ADCC, la activación del complemento o ambas .

La sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que está caracterizada por la presencia de granulomas epitelioides en casi cualquier tejido en el cuerpo; la implicación del pulmón es muy común. La patogénesis involucra la persistencia de macrofagos activados y células linfoides en sitios de la enfermedad con las secuencias crónicas posteriores que resultan de la liberación de los productos activos liberados local y sistémicamente por estos tipos de células.

La anemia hemolítica autoinmune, incluyendo la anemia hemolítica autoinmune, pancitopenia' inmune y la hemoglobinuria nocturna paroxismal, es un resultado de la producción de anticuerpos que reaccionan con los antígenos expresados en la superficie de las células sanguíneas rojas (y en algunos casos, otras células sanguíneas, incluyendo también las plaquetas) , y es un reflejo de la eliminación de esas células recubiertas por anticuerpos vía la lisis mediada por el complemento y/o mecanismos mediados por el receptor ADCC/Fc.

En la trombocitopenia autoinmune, incluyendo la púrpura trombocitopénica y la trombocitopenia mediada por la inmunidad en otro entorno clínico, la destrucción/eliminación de las plaquetas .ocurre como resultado de un anticuerpo, o complemento que se une a las plaquetas, y la eliminación posterior mediante la lisis del complemento, mecanismos mediados por ADCC o del receptor FC.

La tiroiditis, incluyendo la enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil y tiroiditis atrófica, son el resultado de una respuesta autoinmune contra los antígenos de la tiroides, con la producción de anticuerpos que reacciona con las proteínas presentes en, y con frecuencia específicas para la glándula tiroides. Existen modelos experimentales que incluyen los modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos); modelos inducibles: inmunización de animales con tiroglobulina, antígeno microsomal tiroideo (peroxidasa tiroidea) .

La diabetes mellitus del tipo I o la diabetes dependiente de la insulina es la destrucción autoinmune de las células ß de las isletas pancreáticas; está destrucción es mediada por los auto-anticuerpos y las células T autorreactivas . Los anticuerpos para la insulina o el receptor de la insulina también pueden producir el fenotipo sin capacidad de respuesta a la insulina.

Las enfermedades renales mediadas por la inmunidad, incluyendo la glomerulonefritis y la nefritis túbulointersticial , son el resultado de una lesión mediada por los anticuerpos o los linfocitos T al tejido renal, ya sea directamente como el resultado de la producción de anticuerpos autorreactivos o de células T contra los antígenos renales, o indirectamente como resultado de la deposición de los anticuerpos y/o complejos inmunes en el riñon, que son reactivos contra oros antígenos no renales. Así, otras enfermedades mediadas por la inmunidad que resultan en la formación de complejos inmunes, también pueden inducir la enfermedad renal mediada por la inmunidad como una secuencia indirecta. Ambos mecanismos inmunes directo e indirecto, resultan en una respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de lesiones en los tejidos renales con daño de la función del órgano resultante y en algunos casos, progresión a falla renal. Ambos mecanismos inmunes humorales y celulares pueden estar implicados en la patogénesis de las lesiones.

Las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nervioso central y periférico, incluyendo Esclerosis Múltiple; polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré ; y la Polineuropatía Desmielinizante Inflamatoria Crónica, se cree que tienen una base autoinmune y resultan en la desmielinización de los nervios como resultado del daño causado a los oligodendrocitos o a la mielina directamente. En la MS, hay evidencia que sugiere que la inducción y progresión de la enfermedad es dependiente de los linfocitos T. La Esclerosis Múltiple es una enfermedad desmielinizante que es dependiente de los linfocitos T y que tiene un curso de recaída-remisión o un curso progresivo crónico. La etiología es desconocida; sin embargo, las infecciones virales, la predisposición genética, el medio ambiente y la autoinmunidad contribuyen todos. Las lesiones contienen infiltrados de células microgliales mediadas por predominantemente por los linfocitos T, y macrófagos infiltrantes; los linfocitos T CD4+ son el tipo celular predominante en las lesiones. El mecanismo de muerte celular de los oligodendrocitos y la desmielinización posterior no es conocido, pero probablemente es accionado por los linfocitos T.

La Enfermedad Inflamatoria y Fibrótica del Pulmón, incluyendo las Neumonías Eosinofílicas ; la Fibrosis Pulmonar Idiopática y la Neumonitis por Hipersensibilidad pueden involucrar una respuesta inflamatoria inmune desregulada. La inhibición de esa respuesta sería de un beneficio terapéutico.

La Enfermedad de la Piel Autoinmune o Mediada por la Inmunidad, incluyendo las Enfermedades Büllosas de la Piel, Eritema Multiforme y Dermatitis por Contacto, están mediadas por autoanticuerpos , la génesis de las cuales es dependiente de los linfocitos T.

La Soriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por los linfocitos T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrofagos y células que procesan el antígeno y algunos neutrófilos.

Las enfermedades alérgicas, incluyendo el asma, rinitis alérgica; dermatitis atópica; hipersensibilidad a los alimentos y urticaria son dependientes de los linfocitos T. Estas enfermedades están mediadas de manera predominante por la inflamación inducida por los linfocitos T, inflamación mediada por la IgE o una combinación de ambas .

Las enfermedades mediadas con el transplante, incluyendo el rechazo del Injerto y la enfermedad del Injerto Versus el Hospedero (GVHD) , son dependientes de los linfocitos T; la inhibición de la función de los linfocitos T es aliviante.

Otras enfermedades en las cuales la intervención de la respuesta inmune y/o inflamatoria tienen un beneficio, son las enfermedades infecciosas incluyendo, de manera no exclusiva, la infección viral (incluyendo de manera no exclusiva, SIDA, hepatitis A, B, C, D, E y el herpes) , infección bacteriana, infecciones micóticas e infecciones por protozoarios y parasitarias (moléculas (o derivados/agonistas) que estimulan a MLR, pueden utilizarse de manera terapéutica para mejorar la respuesta inmune a los agentes infecciosos) , enfermedades de inmunodeficiencia (moléculas/derivados/agonistas) , que estimulan el MLR pueden utilizarse de manera terapéutica para mejorar la respuesta inmune para condiciones de inmunodeficiencia heredada, adquirida, infecciosa inducida (como en la infección con VIH), o iatrogénica (es decir, de la quimioterapia) y neoplasia .

Se ha demostrado que algunos pacientes humanos con cáncer desarrollan una respuesta a los anticuerpos y/o linfocitos T a los antígenos en las células neoplásicas. Se ha mostrado ahora en los modelos animales de la neoplasia, que la mejora de la respuesta inmune puede resultar en el rechazo o regresión de ese neoplasma particular. Las moléculas que mejoran la respuesta de los linfocitos T en MLR tienen utilidad in vivo para mejorar la respuesta inmune contra la neoplasia. Las moléculas que mejoran la respuesta proliferativa de los linfocitos T en el MLR (o agonistas o anticuerpos de molécula pequeña que afectan el mismo receptor de una manera agonística) , pueden utilizarse de manera terapéutica para tratar el cáncer. Las moléculas que inhiben la respuesta de los linfocitos en el MLR (es decir, TIGIT) , también funcionan in vivo durante la neoplasia para suprimir la respuesta inmune a un neoplasma; tales moléculas pueden expresarse por las células neoplásicas mismas o su expresión puede inducirse por el neoplasma en otras células. El antagonismo de tales moléculas inhibidoras (ya sea con un anticuerpo, agonistas de molécula pequeña u otros medios) , mejora el rechazo del tumor mediado por la inmunidad.

Además, la inhibición de las moléculas con propiedades proinflamatorias puede tener un beneficio terapéutico en la lesión por reperfusión; apoplejía; infarto al miocardio; aterosclerosis ; lesión aguda del pulmón; choque hemorrágico; quemadura; sepsis/choque séptico; necrosis tubular aguda; endometriosis ; enfermedad degenerativa de las articulaciones y pancreatis.

Los compuestos de la presente invención, por ejemplo, polipéptidos , moléculas pequeñas o anticuerpos, se administran a un mamífero, de manera preferida un humano, de acuerdo con los métodos conocidos, tales como la administración intravenosa como un bolo o mediante la infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal , intracerobroespinal , subcutánea, intraarticular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica o inhalación (intranasal, intrapulmonar) . La administración intravenosa, subcutánea o inhalada de los polipéptidos y anticuerpos se utilizan más comúnmente.

En la terapia con un inmunoadyuvante , otros regímenes terapéuticos, tales como la administración de un agente anticancerígeno, pueden combinarse con la administración de las proteínas, anticuerpos o compuestos de la presente invención. Por ejemplo, el paciente a ser tratado con, por ejemplo, un inmunoadyuvante de la invención, también puede recibir un agente anticancerígeno (agente quimioterapéutico) o terapia con radiación. La preparación y programas de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos , pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el prácticamente con experiencia. La preparación y programas de dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, D (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder, o seguir la administración del inmunoadyuvante o puede proporcionarse de manera simultánea con el mismo. Además, un compuesto, antiestrógeno, tal como tamoxifeno o un agente antiprogesterona tal como onapristona (véase, EP 616812), puede proporcionarse en dosificaciones conocidas para tales moléculas.

Puede ser deseable administrar también anticuerpos contra otra enfermedad inmune asociada o antígenos asociados con el tumor, incluyendo, de manera no exclusiva, anticuerpos que se unen a CD20, CDlla, CD18, ErbB2 , EGFR, ErbB3 , ErbB4 , o al factor endotelial vascular (VEGF) . De manera alterna o adicional, dos o más anticuerpos que se unen a los mismos o dos o más antígenos diferentes descritos en la presente, pueden coadministrarse al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico administrar un o más citocinas al paciente. Por ejemplo, en una modalidad, los polipéptidos de TIGIT se coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse primero, seguido por un polipéptido de TIGIT. Sin embargo, la administración simultánea o administración primera también está contemplada. Las dosificaciones adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquéllas utilizadas actualmente y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y, por ejemplo, el polipéptido de TIGIT.

Para el tratamiento o reducción en la severidad de la enfermedad relacionada con la inmunidad, la dosificación apropiada de un compuesto de la invención dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se definió anteriormente, la severidad y el curso de la enfermedad, si el agente se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al .compuesto, y la discreción del médico que atiende. El compuesto puede administrarse de manera adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.

Por ejemplo, dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) de un polipéptido o anticuerpo es una dosificación candidata inicial par ala administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas,' o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurre la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se verifica fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales .

O . Artículos de Fabricación En otra modalidad de la invención, un artículo de fabricación que contiene los materiales (por ejemplo, que comprende una molécula de la TIGIT, un agonista de la TIGIT, un antagonista de la TIGIT, un agonista del PVR, o un antagonista del PVR) , útiles para el diagnóstico o tratamiento de los trastornos descritos anteriormente, se proporciona. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una instrucción. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de prueba. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente mantiene una composición que es efectiva para diagnosticar o tratar la condición y puede tener una abertura de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica) . El agente activo en la composición es usualmente un polipéptido o un anticuerpo de la invención. Una instrucción o etiqueta en, o asociada con el recipiente, indica que la composición se utiliza para diagnosticar o tratar la condición de elección. El artículo de fabricación puede comprender además, un segundo recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de d xtrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos del paquete con instrucciones para el uso.

P . Diagnóstico y Pronóstico de la Enfermedad Relacionada con la Inmunidad Las proteínas de la superficie celular, tales como las proteínas que se sobreexpresan en ciertas enfermedades relacionadas con la inmunidad (es decir, TIGIT) , son excelentes agentes moduladores para los candidatos de los fármacos o el tratamiento de la enfermedad. Las mismas proteínas junto con las proteínas secretadas codificadas por los genes amplificados en los estados de la enfermedad relacionada con la inmunidad, encuentran un uso adicional en el diagnóstico y pronóstico de estas enfermedades. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra los productos de la proteína de los genes amplificados en la artritis reumatoide y otras enfermedades relacionadas con la inmunidad, pueden utilizarse como diagnósticos o pronósticos.

Por ejemplo, los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de anticuerpo, pueden utilizarse para detectar de manera cualitativa o cuantitativa la expresión de las proteínas codificadas por los genes amplificados o sobreexpresados ("productos génicos marcadores"). El anticuerpo está equipado de manera preferida con una marca detectable, por ejemplo, fluorescente, y la unión puede verificarse mediante microscopía con luz, citometría de flujo, fluorimetría u otras técnicas conocidas en el campo. Estas técnicas son particularmente adecuadas, si el gen sobreexpresado codifica una proteína de la superficie celular. Tales ensayos de unión se realizan esencialmente como se describió anteriormente.

La detección in situ de la unión del anticuerpo a los productos génicos del marcador puede realizarse, por ejemplo, mediante inmunofluorescencia o microscopía con inmunoelectrones . Para este propósito, un espécimen histológico se retira del paciente, y un anticuerpo marcado se aplica al mismo, de manera preferida, superponiendo el anticuerpo en una muestra biológica. Este procedimiento también permite determinar la distribución del producto génico marcador en el tejido examinado. Será evidente para aquellos con experiencia en la técnica, que una amplia variedad de métodos histológicos están fácilmente disponibles para la detección in situ. Otras técnicas son también bien conocidas en el campo, por ejemplo, la clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS) .

Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos únicamente, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Todas las referencias de patentes, publicaciones de patentes y de la literatura citadas en la presente especificación, se incorporan por lo tanto como referencia en su totalidad.

EJEMPLOS EJEMPLO 1; CARACTERIZACIÓN ADICIONAL DE LA TIGIT La TIGIT se ha identificado previamente (véase, por ejemplo, la publicación de la patente de los Estados Unidos no. US20040121370 , incorporada en la presente como referencia en su totalidad) , en estrategias de búsqueda en todo el genoma dirigidas a los genes expresados de manera específica por las células inmunes que tienen una estructura del dominio que consiste de dominios de Ig extracelulares , una región transmembranal del tipo uno y un motivo de activación o 'inhibición de la tirosina del inmunorreceptor intracelular (ITAM/ITIM) (Abbas, A.R. et al. Genes I mun 6, 319-31 (2005); Burshtyn, D.N. et al., J Biol Chem 272, 13066-72 (1997); Kashiwada, M. et al., J Immunol 167, 6382-7 (2001)). La secuencia de la TIGIT humana y los homólogos de ratón (presentados a Genbank) , de macacos rhesus (no. de acceso de Genbank XP_001107698 ) y perro (no. de acceso de Genbank XP_545108), se muestran en la Figura 1. Para dilucidar adicionalmente el papel de' la TIGIT en la función inmune, se realizó una búsqueda de la homología que identificó el dominio de Ig de la TIGIT como similar a los dominios de IgV N terminales de la proteína del receptor del poliovirus (PVR)( y las proteínas 1-4 similares al PVR (PVRL1-4) , así como los dominios de IgV N terminales dé CD96 y CD226 (véanse las Figuras 2A-2B) . La alineación de estas proteínas mostró que los residuos altamente conservados que definen el dominio de IgV canónico se conservaron en la TIGIT, y sugieren además que esas ocho proteínas pueden comprender un subconjunto relacionado de la familia de la Ig. Los residuos del marco V conservados han mostrado ser importantes para establecer el pliegue del marco V (Wiesmann, C. & de Vos, A.M. Cell Mol Life Sci 58, 748-59 (2001)). Varios residuos se identificaron cerca del pliegue del marco V que estaban conservados entre las ocho proteínas, incluyendo cuatro residuos conservados de manera absoluta (A67, G74, P114 y G116) , y cinco residuos conservados (V/l/L54, S/T55, Q56, T112 y F/Y113) , que comprenden tres submotivos (V/I5-S/T5S-Q56) , (A67-X (6) -G74) y (T112-F/Y113-P11 -X-G116) . En el caso de la TIGIT, estos submotivos parecen estar conservados a través de las especies (véase la Figura 1) , y no están presentes en otras proteínas que contienen el dominio de IgV descrito actualmente. Estos residuos conservados pueden definir una clase de proteínas similares a PVR, incluyendo PVR, proteínas 1-4 similares a PVR, CD96, CD226 y TIGIT.

PVRL1-4 y PVR comparten una arquitectura del dominio común (IgV-IgC-IgV) , mientras que CD226 y CD96 carecen del dominio de IgV proximal a la membrana. TIGIT es el miembro más económico de la familia, que consiste de un solo dominio de IgV. Los segmentos intracelulares de estas ocho proteínas muestran solo una similitud limitada unos con otros, fuera del motivo que se une a la afadina compartido entre PVRL1-3. Basándose en la estructura del dominio de IgV relacionado de NECL-1 (Dong, X. et al., J Biol Chem 281, 10610-7 (2006)), se predice que el primer y tercer motivos caen en las espiras de la horquilla entre las hebras beta B y C y F y G, respectivamente. Estas dos espiras están adyacentes una a la otra en un extremo del pliegue de IgV. El segundo motivo comprende las hebras beta C y C" que están involucradas en formar parte de la interfase homodimérica para NECL-1. Así, los motivos de la secuencia observada en la familia TIGIT/PVR, puede jugar un papel en las interacciones homo y heterotípicas específicas observadas entre los miembros de la familia del PVR. El PVR se ha caracterizado previamente como una proteína similar a la nectina, pero los análisis de la secuencia anteriores sugieren que, en su lugar, se considera un miembro de la familia del PVR, con ciertas nectinas (es decir, PVRL1-4), estando clasificadas como una rama de la familia del PVR.

EJEMPLO 2: IDENTIFICACIÓN DEL LIGANDO DEL PVR Los compañeros de unión potenciales para la TIGIT se identificaron seleccionando una biblioteca grande de proteínas secretadas para buscar proteínas que se unen a la TIGIT inmovilizada. Brevemente, se construyó una fusión Fe de TIGIT (TIGIT-Fc) clonando los aminoácidos 1-138 de la TIGIT humana en un vector que precede inmediatamente a la región Fe de la IgGl humana (TIGIT-Fc) . Una versión alterna de TIGIT-Fc en la cual la unión de FcyR se anuló, también se construyó introduciendo dos mutaciones en la cual la Fe de TIGIT-Fc a D256A y N297A, utilizando las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio estándar (TIGIT-Fc-DANA) . La proteína de fusión resultante se expresó de manera transiente en, y se purificó de células CHO, utilizando técnicas de cromatografía por afinidad estándar. Una biblioteca de proteínas secretadas individuales fusionadas a marcas de hexahistidina o Fe, se seleccionó para la unión a TIGIT-Fc utilizando el sistema del Octeto (ForteBio) . Las proteínas se probaron para unirse en HBS-P (Hepes 10 m , pH 7.4; NaCl 0.15 M; Tensoactivo P20 al 0.005%). La TIGIT-Fc o una proteína de fusión de Fe de control se cargó en biosensores de Fe antihumano para la saturación. Los biosensores se lavaron en amortiguador (30 segundos) , se colocaron en pozos que contienen 5 µg/mL de proteína durante tres minutos, y se lavaron nuevamente durante 30 segundos. Los sensores se recargaron y lavaron después de cada dos ciclos de unión. La unión se indicó como un incremento en el nivel de respuesta mayor que 0.2 nm, y la especificidad se determinó mediante la comparación a una proteína de fusión Fe de control. Una sola proteína que se une a TIGIT se identificó en más de 1000 proteínas analizadas. Como se múestra en la Figura 3, una proteína de fusión de TIGIT-Fc inmovilizada en un biosensor de Fe antihumano, interactúo de manera específica con una proteína de fusión de PVR-Fc. La especificidad de esta interacción se apoyó por la falta de interacción específica de la TIGIT con cualquier otra proteína en la biblioteca, y además por el hecho de que los biosensores cargados con otras proteínas que contienen el dominio de la Ig, no provocaron una respuesta del PVR.

Debido a que se ha conocido previamente que PVR, PVRL1-4, CD96 y CD226 interactúan unos con otros (He, Y. et al., J Virol 77, 4827-35 (2003); Satoh-Horikawa , K. et al . , J Biol Chem 275, 10291-9 (2000); Bottino, C. et al. J Exp Med 198, 557-67 (2003); Fuchs, A. et al., J" Im unol 172, 3994-8 (2004); Reymond, N. et al., J" Exp Med 199, 1331-41 (2004)), la interacción de la TIGIT con cada una de estas proteínas se valoró utilizando el sistema de biosensores descrito anteriormente. Las proteínas de fusión de Fe se construyeron y purificaron para cada una de las proteínas a ser probadas, como se describió anteriormente para la TIGIT-Fc. De manera específica, los aminoácidos 1-343 de la proteína 1 similar al PVR (PVRL1) , los aminoácidos 1-360 de la proteína 2 similar al PVR (PVRL2) , los aminoácidos 1-411 de la proteína 3 similar al PVR (PVRL3), los aminoácidos 1-349 de la proteína 4 similar al PVR (PVRL4) , los aminoácidos 1-259 de CD226, o los aminoácidos 1-500 de CD96, se fusionaron inmediatamente antes de la región Fe de la IgGl humana. Las proteínas de fusión de Fe resultantes se probaron para la unión a TIGIT-Fc. PVR-Fc, PVRL3 - Fe y PVRL2-FC se unieron a la TIGIT-Fc, mientras que CD226-FC, CD96 -Fe , PVRLl-Fc y PVRL4 -Fe no se unieron a la TIGIT-Fc (Figura 4A) . De las tres uniones observadas, PVR-Fc mostró la mayor unión a TIGIT-Fc, seguido por PVRL3-FC, y la menor cantidad de unión de los tres a TIGIT-Fc se observó con PVRL2-Fc.

Los análisis de FACS también se realizaron para valorar la unión de las fusiones de Fe al miembro de la familia del PVR construidas anteriormente para células CHO que expresan la TIGI . Las proteínas de fusión de Fe se biotinilaron vía el acoplamiento de amina utilizando NHS-PE04-Biotina (Pierce) en PBS . La unión de biotina- ligandos se detectó utilizando estreptavidina conjugada con ficoeritina (Caltag) . El anticuerpo monoclonal de ratón a una marca gD (Genentech) , se conjugó a AlexaFluor 647 (Invitrogen) . Los anticuerpos se conjugaron a marcas de flúor apropiadas utilizando las técnicas estándar. Las células se tiñeron según las instrucciones del fabricante. Antes de la tinción, las células se bloquearon con un suero apropiado o con igG purificada. La adquisición se realizó en un FACSCalibur (BD Biosciences) , y se analizó con el programa JoFlo (Tree Star, Inc.). La dispersión hacia adelante y lateral activó las células viables. Los resultados se exponen en las Figuras 4B-1 a 4B-6, y muestran que el patrón de unión observado en el ensayo del biosensor artificial fue el mismo que el observado en un entorno más fisiológico en la superficie celular.

Para determinar la fuerza de las interacciones de unión de PVR-TIGIT, PVRL2 -TIGIT y PVRL3 -TIGIT, se realizaron ensayos de unión directa al radioligando utilizando células CHO transfectadas de manera estable con esas proteínas. Para la expresión en la superficie de las células CHO, los ADN de longitud completa de TIGIT, PVR, PVRL2 , PVRL3 , CD226 y CD96, se clonaron en un vector inmediatamente después de- una secuencia de la señal de gD (MGGTAARLGAVILFWIVGLHGVRG (SEQ ID NO: 19)) y la marca de gD ( KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVL (SEQ ID NO: 20)) . Los plásmidos se transfectaron en células CHO utilizando Lipofectamina LTX ( Invitrogen) . La expresión de las proteínas marcadas con gD se verificó mediante citometría de flujo utilizando el conjugado anti-gD Alexa-647. Las líneas celulares transfectadas de manera estable se clasificaron dos veces mediante FACS para la pureza antes del uso. Las proteínas de fusión de Fe construidas como se describió anteriormente se yodaron (125I) utilizando el método del Yodógeno. Se llevaron a cabo estudios de unión en transfectantes estables por triplicado con el ligando yodado 0.1-3 nM. Las proteínas yodadas se incubaron con 1 x 105-2 x 105 células en la presencia de una serie de diluciones de la proteína competidora no marcada (25 pM-5 µ?) durante cuatro horas a 4°C. Las suspensiones celulares se recolectaron en membranas de nitrocelulosa (Millipore) y se lavaron de manera extensa. Los filtros secos se contaron y se realizaron análisis Scatchard utilizando el programa NewLigand 1.05 (Genentech) para determinar la afinidad de unión (Kd) .

Las Figuras 5A y 5B muestran la unión de la proteína TIGIT-Fc radiomarcada a las células CHO que expresan al PVR. La Kd promedio para la interacción de TIGIT-Fc-PVR en cuatro experimentos fue de 3.15 nM. La Tabla 6 muestra los resultados de todos los análisis en forma tabular.

Tabla 6. Unión celular de las proteínas de la familia del PVR. Los receptores se expresaron en células CHO, y todos los ligandos fueron constructos de Fe. La MFI se determinó mediante citometría de flujo con ligandos de Fe biotinilados , después de activar las células positivas al receptor. La afinidad de unión (Kd) se determinó mediante un ensayo de unión del radioligando por competencia. La Kd se indica (nM) y es el valor promedio de al menos 3 ensayos independientes, excepto en donde se indica (*) .

Recepto Ligando r PVR TIGIT PVRL2 PVRL3 CD226 CD96 MFI Kd MFI Kd MF Kd MFI Kd MFI Kd MFI I PVR - - +++ 1.02 - • - +++ 70.8 +++ 114* +++ TIGIT ++++ 3.15 - - ++ & +++ 38.9 - - PVRL2 - - - ++ 14-30 - - PVRL3 ++ - ++ - ++ 3-13 - - - - ++++ MFI>5000 +++ FI=1000-4999 ++ MFI=100-999 + FI<100 Sin unión & Unión específica, pero Kd no dilucidada promedio de dos ensayos La interacción de TIGIT con el PVR exhibió la afinidad más alta (Kd = 1-3 n ) , mientras que la afinidad de la TIGIT que se une a PVRL3 fue aproximadamente 10-30 veces menor (Kd = 38.9 nM) (véase la Tabla 6) . Debido al pobre ajuste de la curva en el ensayo del radioligando, la constante de unión para la interacción de PVRL2 -TIGIT no pudo determinarse, pero la unión específica se observó, sin embargo, y fue consistente con los datos de FACS descritos anteriormente, que muestran una unión modesta de PVRL2-FC a CHO-TIGIT, y refuerzan además el hallazgo de que la unión entre PVRL2 y TIGIT es una interacción de baja afinidad. La proteína de fusión de Fe yodada (ligando) se unió a las células CHO que expresan el receptor a la concentración indicada, y compitieron con diluciones en serie de 10 veces de CD226-FC (8 µ? en CHO-TIGIT; 5 µ? en CHO-PVR) , TIGIT-Fc (2 µ? en CHO-PVR; 6 µ? en CHO-CD226 y CHO-CD96) . La unión no específica se determinó utilizando un exceso de 2000 veces del ligando, frío y se sustrajo de la unión total. Los estudios de competencia mostraron que la TIGIT bloqueó de manera efectiva la interacción del PVR a sus otros correceptores CD226 y CD96, mientras que CD226 fue un inhibidor menos efectivo de la interacción de TIGIT-PVR (Figura 6) . Estos datos están de acuerdo con la afinidad más alta observada de la interacción de PVR-TIGIT (1-3 n ) en comparación con la interacción de PVR-CD226 (aproximadamente 115 nM, de acuerdo con Tañara-Hanaoka, S. et al. Int Immunol 16, 533-8 (2004)). Los estudios de la competencia directa con CD96 no fueron posibles debido a la baja expresión de esa proteína, aunque la TIGIT inhibió completamente la unión del PVR a las células CHO que expresan a CD96. Los estudios de competencia anteriores demuestran que TIGIT, CD226 y CD96 comparten un sitio de unión común o sitios de unión que se superponen en el PVR. Este hallazgo se apoyó además mediante la observación de que el anticuerpo anti-PVR D171, que se une al dominio de IgV N terminal del PVR, bloquea la unión de TIGIT y de CD226 al PVR (Figura 7) .

EJEMPLO 3; EXPRESIÓN DE LA TIGIT Y EL PVR (A) Expresión de la TIGIT y del PVR en Células Inmunes en Reposo y Activadas La distribución y expresión relativa de TIGIT y PVR en las células inmunes se valoró como un indicador del papel de estas dos moléculas en la función inmune normal, y se comparó con la expresión de CD226, una molécula conocida previamente y mostrada en el Ejemplo 2 por interactuar con el PVR in vivo. Un estudio inicial ha mostrado que la expresión de TIGIT fue específica para las células T y NK, a través de múltiples tipos de células inmunes, así como un arreglo de tejidos (Abbas, A.R. et al., Genes Imun 6, 319-31 (2005)). Se realizó un análisis adicional de la expresión de TIGIT en una variedad de células inmunes y tejidos ex vivo y después de la activación. Como se muestra en las Figuras 8A y 8B, la TIGIT se expresa más fuertemente en las células T reguladoras (Treg) , y también se expresa altamente en las células NK y las células Tfh del tejido tonsilar humano. La TIGIT se expresó a un grado menor en células NK no estimuladas, en células T de memoria activadas y en reposo, en células T CD8+ y en células Th2 y Thl . Estos datos se correlacionan con los datos mostrados en la publicación de la patente de los Estados Unidos no. US20040121370 , en donde se mostró que la TIGIT se sobreexpresaba de manera significativa en las células T CD4+ aisladas activadas por an i-CD3/lCAM-l y anti-CD3/anti-CD28 , en comparación con las células T CD4+ en reposo aisladas. En contraste, se ha reportado que el PVR se expresa en las células endoteliales , fibroblastos, osteoclastos , células dendríticas foliculares, células dendríticas y células tumorales (Sakisaka, T. & Takai, Y., Curr Opin Ce12 Biol 16, 513-21 (2004); Fuchs, A. & Colonna, M . , Semin Cáncer Biol 16, 359-66 (2006)). Estos datos resultan en que la TIGIT está asociada con las células T que producen las citocinas reguladoras que pueden suprimir la respuesta inmune.

También se realizaron análisis de citometría de flujo complementarios, utilizando los mismos métodos descritos en el Ejemplo 2. Las células T ex vivo humanas se examinaron después de la activación para la expresión de TIGIT superficial utilizando un anticuerpo de TIGIT antimurino de hámster (10A7) que reacciona de manera cruzada con la TIGIT humana y bloquea la interacción de TIGIT con el PVR (véase la Figura 9) . Los anticuerpos anti -TIGIT se generaron mediante inmunización de hámster con la proteína de fusión TIGIT- Fe murina y obteniendo anticuerpos anti ratón de hámster de las mismas, utilizando técnicas estándar. Dos anticuerpos, 10A7 y 1F4 , también se unieron de manera específica a la TIGIT humana (datos no mostrados) , y se utilizaron para experimentos adicionales. De manera notable, 10A7 y 1F4 se unen a diferentes epitopos en la TIGIT humana, como se evidencia por el hecho de que la unión de 1F4 a TIGIT no bloquea la unión de 10A7 a TIGIT en la superficie de la TIGIT que expresa las células 293 (datos no mostrados) . Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 10A7 se determinaron utilizando técnicas estándar. La secuencia de la cadena ligera de este anticuerpo es: DIV TQSPSSLAVSPGEKVT TCKSSQSLYYSGVKENLLAWYQQKPGQS PKLLIYYASIRFTGVPDRFTGSGSGTDYTLTITSVQAEDMGQYFCQQGIN PLTFGDGTKL EIKR (SEQ ID NO: 21) y la secuencia de la cadena pesada de este anticuerpo es: EVQLVESGGGLTQPGKSLKLSCEASGFTFSSFTMHWVRQSPGKGLEWVAFIRSGSGIVFYA DAVRGRFTISRDNAKNLLFLQMNDLKSEDTAMYYCARRPLGH TFDS GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 22), en donde las regiones que determinan la complementariedad (CDR) de cada cadena se representan en texto en negrillas. Así, la CDR1 de la cadena ligera de 10A7 tiene la secuencia SSQSLYYSGVKENLLA (SEQ ID NO : 23) , la CDR2 de la cadena ligera de 10A7 tiene la secuencia ASIRFT (SEQ ID NO: 24), y la CDR3 de la cadena ligera de 10A7 tiene la secuencia QQGINNPLT (SEQ ID NO: 25) . La CDR1 de la cadena pesada de 10A7 tiene la secuencia GFTFSSFTMH (SEQ ID NO: 26) , la CDR2 de la cadena pesada de 10A7 tiene la secuencia FIRSGSGIVFYADAVRG (SEQ ID NO: 27), y la CDR3 de la cadena pesada de 10A7 tiene la secuencia RPLGHNTFDS (SEQ ID NO: 28) .

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 1F4 se determinaron utilizando RACE 5' (véase, por ejemplo, Ozawa et al., BioTechniques 40(4): 469-478 (2006) ) . La secuencia de la cadena ligera de este anticuerpo es: DWLTQTPLSLSVSFGDQVSISCRSSQSLVNSYGNTFLSWYLHKPGQSPQLLIFGISNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPPTFGPGTKLEVK (SEQ ID NO: 29) y la secuencia de la cadena pesada de este anticuerpo es : EVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKASGYSFTGHILM VKQSHGK LEWIGLIIPY GGTSYN QKFKGKATLTVDKSSSTAY ELLSLTSDDSAVYFCSRGLRGFYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 30), en donde las regiones que determinan la complementariedad (CDR) de cada cadena se representan por el texto en negrillas. Así, la CDR1 de la cadena ligera de 1F4 tiene la secuencia RSSQSLVNSYGNTFLS (SEQ ID NO: 31), la CDR2 de la cadena ligera de 1F4 tiene la secuencia GISNRFS (SEQ ID NO: 32), y la CDR3 de la cadena ligera de 1F4 tiene la secuencia LQGTHQPPT (SEQ ID NO : 33) . La CDR1 de la cadena pesada de 1F4 tiene la secuencia GYSFTGHLMN (SEQ ID NO: 34), la CDR2 de la cadena pesada de 1F4 tiene la secuencia LIIPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 35), y la CDR3 de la cadena pesada de 1F4 tiene la secuencia GLRGFYAMDY (SEQ ID NO: 36) . Los cebadores utilizados para la metodología de secuenciamiento RACE fueron como sigue: cebadores específicos del gen de la RT-PCR : (i) cadena pesada : IgGRace4 TTTYTTGTCCACCKTGGTGCTGC (SEQ ID NO: 37) ; IgGRace2 CTGGACAGGGATCCAGAGTTCC (SEQ ID NO: 38) ; IgGRace7 CARGTCAMDGTCACTGRCTCAG (SEQ ID NO: 39) ; IgGRacel GAARTARCCCTTGACCAGGC (SEQ ID NO:64) ; (ii) cadena ligera KapRace3 : GTAGAAGTTGTTCAAGAAG (SEQ ID NO: 40); KapRace2 GAGGCACCTCCAGATGTTAAC (SEQ ID NO: 41); KapRace7 CTGCTCACTGGATGGTGGGAAG (SEQ ID NO: 42); KapRacel : GAAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO: 43); y cebadores de la PCR de la cola de RACE 5 ' : ODC2 : GATTCAAATCTCAATTATATAATCCGAATATGTTTACCGGCTCGCTCATGGACCCCCCCCC CCCDN (SEQ ID NO: 44); ODC3 : GAATTCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 45); ODC4: CTCATGGACCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 46); ODC5 : AAATATAATACCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 47); ADC5 : AAATATAATACCCCCCC (SEQ ID NO: 48), y ADC5X: CTCATGGACCCCCCC (SEQ ID NO: 49) .

La secuencia nucleotídica que codifica la cadena ligera de 1F4 se determinó como GATGTTGTGTTGACTCAAACTCCACTCTCCCTGTCTGTCAGCTTTGGAGATCAAGTTTCTA TCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTTGTAAACAGTTATGGGAACACCTTTTTGTCTTGGTA CCTGCACAAGCCTGGCCAGTCTCCACAGCTCCTCATCTTTGGGATTTCCAACAGATTTTCT GGGGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCA CAATAAAGCCTGAGGACTTGGGAATGTATTACTGCTTACAAGGTACGCATCAGCCTCCCAC GTTCGGTCCTGGGACCAAGCTGGAGGTGAAA (SEQ ID NO: 50), y la secuencia nucleotídica que codifica la cadena pesada de 1F4 se determinó como GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAACTTCAATGAAGATAT CCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCCATCTTATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCA TGGAAAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTATTCCTTACAATGGTGGTACAAGCTATAAC CAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGG AGCTCCTCAGTCTGACTTCTGATGACTCTGCAGTCTATTTCTGTTCAAGAGGCCTTAGGGG CTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 51) .

Las células mononucleares de la sangre periférica humana (PB C) se aislaron de las cubiertas amarillas mediante centrifugación sobre Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences) . Los subconjuntos de células indicados se purificaron con equipos de MACS correspondientes (Miltenyi) . La pureza de las células clasificadas se verificó mediante citometría de flujo y varió de más de 93% para las células purificadas mediante clasificación celular magnética a más de 98% para las células purificadas mediante citometría de flujo. Todas las células se bloquearon con 10-20% del suero apropiado o la IgG purificada antes de la tinción. Los análisis de PC cuantitativa se realizaron para valorar los niveles de ARNm de las proteínas de interés en las poblaciones de las células clasificadas. El ARN total de las células clasificadas se aisló con el equipo RNeasy (Qiagen) y se digirieron con ADNsa I (Qiagen) . El ARN celular total se transcribió de manera inversa y se analizó mediante PCR con TaqMan™ en tiempo real por triplicado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un Sistema de Detección de la Secuencia 7500 (Applied Biosystems) . Las unidades de expresión arbitrarias se proporcionan como las veces de la expresión con respecto a las células no estimuladas. Los cebadores hacia delante e inversos utilizados para detectar la TIGIT fueron: TGCCAGGTTCCAGATTCCA (SEQ ID NO: 52) y ACGATGACTGCTGTGCAGATG (SEQ ID NO: 53), respectivamente, y la secuencia de la sonda de la TIGIT utilizada fue AGCCATGGCCGCGACGCT (SEQ ID NO: 54) .

Las células T de CD4+ se aislaron de las PBMC y se activaron con anti-CD3 y anti-CD8. La TIGIT expresada en al superficie celular fue indetectable en las células CD4+CD45RA+ no diferenciadas no estimuladas, mientras que las células CD4+CD45RO+ no estimuladas tuvieron una expresión baja pero indetectable (Figuras 10A-1 a 10A-2) . Como se muestra en las Figuras 10A-1 a 10A-2, la expresión de TIGIT difirió de manera significativa de la expresión de CD226 en los subconjuntos de RA+ vs . RO+ de las células T CD4. Los análisis del ARNm en las poblaciones de células inmunes clasificadas directamente ex vivo de las PBMC, mostraron una expresión mayor de la TIGIT en las células Treg, RO y NK que en otros tipos celulares estudiados con relación a la expresión de TIGIT en las células CD4+CD45RA+ no diferenciadas (Figura 10B) . Después de la activación con anti-CD3 y CD28, la TIGIT expresada en la superficie de la célula se sobrerreguló en las poblaciones de células T sin diferenciar y de memoria, como se muestra en las Figuras 10A-1 a 10A-2. Las células de memoria CD4+CD45R0+ tuvieron niveles significativamente más altos de expresión a las 24 y 48 horas postactivación en comparación con las células CD4+CD45RA+ no diferenciadas (Figuras 10A-1 a 10A-2) . Las células de memoria CD4+CD45R0+ expresaron 5.3 veces más ARNm de TIGIT en el día 1 que en el día 0, mientras que las células no diferenciadas solo incrementaron la expresión de TIGIT por 1.4 veces con relación al día 0 (Figura 10C) . La expresión de TIGIT no fue detectable en el día 6.

La estabilidad de la expresión de TIGIT en las células T también se valoró. Brevemente, las células CD4+CD45RO+ se aislaron y activaron con anti-CD3/anti-CD28 durante un día. Las células se clasificaron con flujo mediante FACS para las poblaciones de CD4+ y CD4+TIGIT+. Después de reposar durante cinco días posteriores a la clasificación, las células se reestimularon con anti-CD3/anti-CD28 durante .tres días y la expresión de TIGIT en la superficie celular se determinó mediante FACS. En un experimento separado, las células TIGIT+ y las células CD4+ se emplacaron a una densidad de 2 x 105 células/pozo en placas de 96 pozos recubiertos con varias concentraciones de anti-CD3 (0-0.8 µg/mL) , un volumen de 100 /¿L y se cultivaron durante 4 días bajo condiciones estándar. La 3H-timidina se agregó para las 18 horas finales de la incubación, seguido por lavado. Al final de los cuatro días, las células se solubilizaron y la radiactividad asociada con cada muestra se midió mediante conteo del centelleo. Como se muestra en las Figuras 12A y 12B, la expresión de TIGIT se indujo por las células TIGIT+ y las células TIGIT", indicando que las células TIGIT" pueden expresar a TIGIT bajo ciertas circunstancias y que las células TIGIT+ no son una población-celular fija.

Dado el nivel de expresión más alto de TIGIT en las células de memoria efectoras, la expresión en los subconjuntos de las células T fue analizada adicionalmente . Dado que las moléculas coestimuladores o coinhibidoras expresada en las células T efectoras/de memoria activadas se expresan con frecuencia en las células Treg inducidas, se valoró la expresión de TIGIT en las células Treg. Las células Treg están definidas fenotípicamente como células CD25hl, y se conocen por expresar el factor de transcripción FoxP3 (Fontenot, J.D. et al., Iw unity 22, 329-41 (2005)). En los ratones, el factor de transcripción FoxP3 se utiliza para codefinir las poblaciones de células Treg (Linsley, P.S. et al., Science 257, 792-5 (1992)). Sin embargo, esta asociación no se mantiene en las células T humanas, puesto que todas las células T humanas activadas expresan a FoxP3 (Ziegler SF., Eur J Immunol . 37(l):21-3 (2007))). Las células CD4+CD25hl aisladas recientemente ex vivo, expresan la TIGIT, mientras que las células CD25" fueron negativas para la expresión en la superficie celular de la TIGIT (Figura R(D)). Las células T TIGIT+ también coexpresaron a FoxP3 y GITR (Figuras 9 y 10E) . La activación de las células CD25+ clasificadas resultó en una sobrerregulación de la expresión de la proteína TIGIT (Figura 10F) y un incremento de 6.5 veces en los niveles del ARNm (Figuras 10C y 10F) . Las veces del incremento en el ARNm de TIGIT fueron equivalentes en las células Treg y T de memori .

La comparación de los niveles del ARNm de las células inmunes clasificadas directamente ex vivo de las PBMC del donador, mostró que las células Treg CD4+CD25hi, CD4+CD45RO+ y las células NK, tuvieron cada una, una expresión significativa de TIGIT, con las células Treg que exhiben la expresión más alta (Figura 10C) . La expresión de TIGIT no se observó en las células B o los monocitos en reposo o activados (Figura 10C y datos no mostrados) . De manera notable, CD226, otro correceptor para PVR, no se sobrerreguló en las células Treg CD4+CD25hi, sugiriendo papeles reguladores divergentes de la TIGIT versus CD226 (Figura 11) .

En otros experimentos, la expresión de TIGIT en las células T (TFH) tonsilares humanas, se examinó utilizando citometría de flujo, siguiendo los protocolos estándar descritos anteriormente, con la excepción de que para los ensayos que involucran a FoxP3 , las células se tiñeron con anticuerpos siguiendo el protocolo anterior, seguido por fijación y permeabilización de las células y la tinción con anti-FoxP3 o la IgG de control. La expresión de TIGIT se correlaciona con los altos niveles de coexpresión de CXCR5 e ICOS en las células T, marcadores que se observan típicamente en las células TFH (Figura 8A) . En contraste, la expresión de CD226 (DNAM) en esas células fue de baja a inexistente (Figura 8A) . También se observaron altos niveles de expresión de TIGIT en las células Th que producen IL-17 CD4+CCR4+CCR6+ (Figura 14) . En general, se mostró que la TIGIT se expresa por células T reguladores en reposo y activadas, células Tfh tonsilares humanas, células T auxiliares que producen IL-17, células T auxiliares efectoras/ de memoria en reposo y activadas (células CD4+CD45RO+) y células NK, y pueden sobrerregularse además, tras la activación de estas células. Las células CD8+ también expresan la TIGIT y esta expresión sólo es sobrerregulada ligeramente tras la activación celular. En la presente se muestra a CD226 y se conoce en la técnica que se expresa por las células T CD8+, en las células T CD45RA+, los mastocitos, plaquetas, células citotóxicas naturales (NK) , células T CD4+CD45RA* activadas y células T CD4+CD45RO+ . La TIGIT se expresa de manera específica en las células Treg y Tph y CD4+CD45RO+ efectoras/de memoria en reposo; mientras que CD226 no se expresa en estas células.

(B) Expresión de TIGIT y PVR en la Enfermedad Humana Habiendo determinado que la TIGIT se expresa altamente en las poblaciones seleccionadas de células inmunes, los niveles de expresión de la TIGIT, PVR y CD226 se valoraron a continuación en los tejidos de diferentes estados de enfermedad relacionada con la inmunidad, " incluyendo soriasis, trastorno inflamatorio del intestino, artritis, asma y cáncer. Se utilizó un sistema basado en un microarreglo para . los estudios, y la descripción del protocolo del microarreglo apropiado puede encontrarse en la literatura, por ejemplo, en la publicación de la patente de los Estados Unidos no. US20080038264 , incorporada en la presente como referencia. Como se muestra en la Figura 15, se observó una expresión significativa de la TIGIT en el tejido sinovial humano inflamado, con relación al tejido no inflamado, particularmente notable en el caso del tejido de la artritis reumatoide . Dentro de las muestras del tejido de la artritis inflamado, la expresión de la TIGIT se correlacionó principalmente con las células T, en oposición a los macrófagos o fibroblastos (véase la Figura 15, panel derecho) . Estos datos se confirmaron además en los modelos de la artritis murina inducida por el colágeno (CIA) mediante análisis con RT-PCR del AR m de los niveles de la TIGIT (véase la Figura 16) . En el modelo de la CIA utilizado en la presente, los ratones DBA-1J se inmunizaron con 100 g de colágeno bovino del tipo II en 100 L de Adyuvante Completo de Freund (CFA) en el Día 0 y el Día 21 intradérmicamente . El ARN extraído de las articulaciones de las patas posteriores en los días 28, 30 y 40 se valoró para la expresión de TIGIT y CD226, como se describió anteriormente. Como se observa en la Figura 16, se observó una expresión incrementada de TIGIT en el día 40, mientras que la expresión de CD226 estuvo desregulada de manera significativa para el día 40.

Se observaron incrementos menores en la expresión de TIGIT con relación a los tejidos normales en las muestras de tejido con soriasis y las muestras de tejido con la enfermedad inflamatoria del intestino. Los análisis similares en las muestras de tejido con asma de macacos rhesus mostraron que la expresión de TIGIT está significativamente elevada en el tejido con la enfermedad, en comparación con el tejido de control normal (Figura 17) . Las muestras de cáncer de mama también exhibieron una expresión de TIGIT incrementada en gran medida, con relación al tejido de mama normal, con cantidades variables en diferentes tipos de tejido de cáncer de mama. Como se muestra en el panel superior de la Figura 18B, la expresión más grande de TIGIT se observó en las muestras de tumor con el porcentaje más bajo de células tumorales, sugiriendo que la expresión de TIGIT está correlacionada con otras células que infiltran el tumor, más que con las células tumorales mismas. El panel inferior de la Figura 18A indica que las células CD4* están incrementadas en las muestras del tumor que tienen bajos porcentajes de células del tumor. Dado que los datos presentados aquí con respecto a la expresión de TIGIT en las células Treg y otros subconj untos de células T, los altos niveles de expresión de TIGIT observados en las muestras de tumor de mama con los porcentajes más bajos de células tumorales, sugieren que la TIGIT se expresa por los infiltrados del tumor de las células inmunes, más probablemente, infiltrados de células Treg. La correlación de la expresión de TIGIT con las células T en las muestras de cáncer de mama sugieren que la TIGIT puede jugar un papel en la regulación del tumor. Por ejemplo, un tumor puede evadir la respuesta inmune del hospedero reclutando/activando las células Treg TIGIT*.

EJEMPLO 4: PAPEL DE LA TIGIT EN LA ACTIVACIÓN DE LAS CÉLULAS T Dados los altos niveles de expresión de TIGIT por las células Treg y las células T. de memoria mostrados anteriormente, y la expresión conocida de PVR en las células dendríticas (Pende, D. et al., Blood 107, 2030-6 (2006)), se investigó la posibilidad de que la TIGIT pueda modificar la función de las DC y efectuar la activación de las células T.

(A) Función de la TIGIT en la Modulación de la Proliferación de las Células T El efecto de TIGIT-Fc en un ensayo de proliferación de la reacción de linfocitos mezclados (MLR) se valoró utilizando DC humanas derivadas de monocitos maduradas con TNFa. Brevemente, los monocitos se aislaron mediante la selección negativa de las PBMC totales humanas (Miltenyi Biotec) . Las DC derivadas de monocitos inmaduras (iMDDC) se generaron incubando los monocitos (3 x 105 células/ml) en medio RPMI 1560 completo que contiene FBS al 10%, penicilina y estreptomicina, suplementado con IL-4 humana recombinante (125 ng/mL, R&D Biosystems) y GM-CSF humana recombinante (50 ng/mL, R&D Biosystems) en una atmósfera humidificada a 37 °C, C02 al 5% durante 5 días. Se agregaron nuevamente GM-CSF e IL-4 en el día 2 y el día 4 con medio RPMI 1640 completo fresco. Después de cinco días de cultivo, más de 90% de las células exhibieron un fenotipo DC inmaduro (CD14", MHC clase II+, CD80+, CD86+ y CD83low) , verificado mediante análisis FACS . Estas DC inmaduras se utilizaron en la presente para el tratamiento con LPS, CD40L, TNFa, Pam3CSK4 y TSLP, y las proteínas de fusión indicadas para inducir su maduración. Los análisis fenotípicos de las MDDC y las líneas celulares se llevaron a cabo mediante inmunofluorescencia . Los anticuerpos monoclonales utilizados para la tinción de la superficie celular incluyeron anti-CD83, FITC-HLA-DR, PE-anti-CD86 y FITC-anti-CD80 marcados con PE. Todas las incubaciones se realizaron en la presencia de suero AB humano al 10%, para evitar la unión a través de la porción Fe de las fusiones/anticuerpos. Los estudios del inhibidor se realizaron mediante la preincubación de las moléculas indicadas con 10 µ? del inhibidor MEK1 (PD98059) , 1 ^g/mL del anticuerpo anti-IL-10, 10 /¿g/ml del anticuerpo anti-CD32 o 10 µg/ml del anticuerpo anti-TIGIT, antes de la estimulación con TNFa (0.1 ^g/mL) . El solvente DMSO o la IgG humana se utilizaron como un control. Los sobrenadantes del cultivo celular se recolectaron después de 16 horas y se probaron para la producción de IL-12 p40 mediante ELISA.

El efecto del anticuerpo de bloqueo anti-TIGIT 10A7 en la proliferación y activación de las células T se valoró. No se observó un efecto tras la incubación de células T CD4+ CD45R0+ activadas con anti-CD3 con 10A7. Cuando las células T se cultivaron con anti-CD3, junto con las DC CDllc+ autólogas, la proliferación de las células T se incrementó dos veces (p< 0.01) y la producción de IFNy se incrementó cuatro veces (p< 0.001) (Figura 19C) . Esta exacerbación de la actividad de las células T se observó a un grado menor en las PBMC totales. En contraste, TIGIT-Fc inhibió de manera significativa la activación de las células T (p<0.01) y la producción de IFNy (p<0.001) en la presencia de las DC CDllc+ (Figura 19D) . Cuando las PBMC totales se activaron con anti-CD3 , TIGIT-Fc tuvo un efecto más suave que se observó en los experimentos previos, sugiriendo que la cantidad de PVR presente en las células puede ser importante para la actividad. No se observó un efecto en las células T solas, como se esperaba, dado que la TIGIT no se une a tales células. Se encontró también que el tratamiento con el anticuerpo anti-TIGIT bloquea la supresión de las células Treg de la proliferación de las células T, sólo en la presencia de APC . Se encontró además que TIGIT. Fe regula la función -de las células CDllc+ e inhibe la proliferación de las células T no diferenciadas en ensayos de traspozos, indicando que las modificaciones observadas en el comportamiento y la proliferación celular se deben específicamente a la unión a TIGIT. Tomados juntos, estos datos sugieren que la TIGIT regula la activación de las células T vía la interacción con un ligando en las APC, más probablemente, el PVR.

Tanto las iMDDC como las MDDC maduradas por el TNFa expresan el PVR superficial, con las MDDC que expresan niveles más altos de PVR que las iMDDC (Figura 19A) . Las MDDC maduradas con TNFa también incrementaron la proliferación de las células T con respecto a las iMDDC no estimuladas (Figura 19B) . En los ensayos con MLR, la adición de TIGIT-Fc resultó en una disminución modesta pero significativa en la proliferación, mientras que TIGIT-Fc agregado a las MDDC maduradas por el TNFa redujeron la proliferación a niveles de la línea basas. La inhibición de proliferación inducida por la TIGIT se evitó tras la inclusión adicional del anticuerpo anti-TIGIT 10A7 o el anticuerpo anti-PVR TX21. Los niveles de IL-10 secretada en el día 3 fueron significativamente más altos en los cultivos que contienen TIGIT-Fc que aquéllos que contienen el control del isotipo (45 ± 5 pg/mL , versus 29 ± 8 pg/mL, respectivamente, con una p=0.04). La inclusión del anticuerpo anti-TIGIT o el anticuerpo anti-PVR también bloqueó el incremento inducido por TIGIT-Fc en la IL-10 secretada (datos no mostrados) . Los niveles de IFNy se redujeron mediante el tratamiento con TIGIT-Fc (datos no mostrados) . Tomados juntos, estos datos sugieren que la TIGIT modula la activación de las células T.

Para examinar el efecto de las células T TIGIT+ en las proliferación de las células T ' TIGIT". en cocultivo, se realizaron ensayos con MLR adicionales. Brevemente, las células T CD4+CD45RO+ se aislaron de las PBMC humanas y se activaron durante cinco días. En el día seis, las células se rees'timularon con anti-CD3/anti-CD28 durante la noche y las células TIGIT+ se clasificaron de manera separada de las células TIGIT" mediante FACS . Las células TIGIT" se marcaron con CFSE y se mezclaron a una relación de 10:1 con las células CDllc+ aisladas de un segundo donador, con o sin el mismo número de células TIGIT+ en el cultivo. Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron en el día siete para el análisis luminex de la producción de la citocina (IFNy o IL-17) . La proliferación celular se analizó mediante FACS, activando las células CFSE+ vivientes, en el día ocho. Los resultados se muestran en las Figuras 20A y 20B. Como se observa en la Figura 20A, las células T TIGIT+ expresaron niveles menores de IFNy e IL-17 que las células T TIGIT" . Cuando las células T TIGIT+ se mezclaron con las células T TIGIT", el cultivo resultante fue significativamente menor en la producción de estas dos citocinas, indicando que las células T TIGIT+ inhiben la producción de las células T TIGIT" de estas dos citocinas. Las células TIGIT+ también inhibieron la proliferación de las células T TIGIT" (Figura 20B) . Esto apoya además la idea de que las células TIGIT+ son en realidad, células reguladoras y que pueden actuar en las células CD4+ para inhibir su respuesta, ya sea directamente a través de la secreción de las citocinas inhibidoras o indirectamente vía el acoplamiento del PVR en las células que presentan el antígeno.

Basándose en la observación en el Ejemplo 3(A) de que las. células Treg CD4+CD25hl en particular, expresan altamente a la TIGIT, se realizaron ensayos para examinar¦ la capacidad del subconjunto de las células T Treg para inhibir la proliferación de otras células inmunes. Brevemente, las células Treg CD4+CD25hl se aislaron de la cubierta amarilla con el equipo MACS kit (Miltenyi) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células CD4+CD25" también se prepararon como las células T efectoras, para ser utilizadas en el ensayo. Las poblaciones de células que presentan el antígeno (APC) se aislaron mediante métodos estándar, irradiando las PBMC que se habían gastado previamente de células T, utilizando microperlas de CD3 MACS (Miltenyi) . Las células T Treg, las células T efectoras y las APC aisladas se mezclaron a una relación de 1:4:4 y se incubaron con 0.5 µg/ml de anti-CD3 soluble. Las células mezcladas se emplacaron en pozos recubiertos con 10 g/mL del anticuerpo anti-TIGIT 10A7 o una IgG de control y se cultivaron durante cuatro días con [3H] -timidina agregada a las 18 horas finales de la incubación. Las células de cada pozo se solubilizaron y la cantidad de radiactividad en cada muestra se cuantificó. Los valores indicados del por ciento de proliferación se calcularon con relación a la cantidad de radiactividad observada en las células efectoras en la ausencia de células Trpo. Los resultados se muestran en la Figura 21A. En los pozos recubiertos con la IgG de control, se observó aproximadamente 55% de proliferación celular, manteniéndose con el hallazgo experimental de que las células T TIGIT+ inhibieron la proliferación de las células T TIGIT" . La inclusión de un anticuerpo anti-TIGIT en los pozos, incrementó de manera significativa la proliferación observada, confirmando que la TIGIT media el efecto supresor. Esta evidencia sugiere además que las células Treg TIGIT+ pueden actuar como reguladores negativos de la proliferación y función de las células inmunes. De hecho, cuando las células Treg CD4+CD25hiTIGIT+ y las células Treg CD4+CD25hiTIGIT" se aislaron y examinaron de manera separada para su capacidad para suprimir la proliferación de las células T no diferenciadas, se encontró que las células Treg TIGIT+ eran más potentes para suprimir la proliferación de las células T no diferenciadas que las células Treg TIGIT". Brevemente, las células Treg TIGIT* y TIGIT" se aislaron mediante FACS . Las células CDllc+ se seleccionaron de manera positiva utilizando CDllc-PE (BD Biosciences) y microperlas anti-PE (MACS) . Las células T no diferenciadas se emplacaron en una placa de 96 pozos con fondo de U a una . densidad de 4 x 105, junto con 2 x 105 células Treg y 0.8 x 105 células CDllc* que presentan el antígeno. Como se muestra en la Figura 21B, las células Treg TIGIT* fueron casi el doble de potentes para suprimir la proliferación de las células T no diferenciadas que las células Treg TIGIT", apoyando además el hallazgo de que las células Treg TIGIT+ pueden actuar como reguladores negativos de la proliferación y función de las células inmunes.

(B) Desactivación de la TIGIT Utilizando la línea celular que expresa a la TIGIT marcada con gD (células 293 -TIGIT) construida anteriormente, se encontró que estas células no exhiben fosforilación de la TIGIT tras la interacción con el PVR exógeno, el anticuerpo monoclonal anti-TIGIT 10A7 reticulado o con el tratamiento con pervanadato. . Además, el tratamiento con 10A7 de estas células resultó en ningún efecto significativo en la señalización de TCR. Estos datos sugieren que cualquiera de los motivos ITIM en la TIGIT expresada en las células construidas, no fueron funcionales o que la línea celular estable carecía de uno o más componentes necesarios para la activación de la TIGIT.

Para dilucidar además las funciones intrínsecas de la células para la TIGIT, se realizaron estudios del ARN inhibidor (ARNi) . Los AR i en el objetivo más los específicos del gen y los ARNi de control negativos se obtuvieron de la Tecnología del ARNi de Dharmacon. Las células T CD45RO+ humanas se purificaron de la cubierta amarilla con el equipo MACS™ (Miltenyi Biotec) y se marcaron con CFSE. Los ARNsi (ARNsicontrol o ARNsiTIGIT) se transíectaron en estas células con la tecnología Nucleofector™ (Amaxxa) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células transíectadas se activaron con anti-CD3 unido a la placa (5 µg/mL) , solo o más 2 µg/mL de anti-CD28 soluble. Algunas células se recolectaron en el día 2 o el día 5 postactivación, para los análisis de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) o FACS . La proliferación de las células T se determinó mediante FACS en el día 5, como se describió anteriormente. La qRT-PCR se realizó como se describió anteriormente en el Ejemplo 3(A), y los niveles de AR m de RPL-19 en cada muestra se utilizaron como los controles internos . Los cebadores de la TIGIT se proporcionaron anteriormente; los cebadores CTLA4 y CD226 humanos y los problemas se obtuvieron .de Applied Biosystems . Las secuencias del cebador y de la sonsa utilizadas para detectar diferentes especies de IL-12 e IL-10 murinas, fueron como sigue: mIL-12p40: cebador hacia adelante: 5'-ACATCTACCGAAGTCCAATGCA-3 ' (SEQ ID NO: 55); cebador inverso: 5 ' -GGAATTGTAATAGCGATCCTGAGC- 3 ' ( SEQ ID NO : 56 ) ; sonda : 5 ' -TGCACGCAGACATTCCCGCCT- 3 ' (SEQ ID NO: 57); mIL-12p35: cebador hacia adelante: 5 ' -TCTGAATCATAATGGCGAGACT-3 ' (SEQ ID NO: 58); cebador inverso: 5 ' -TCACTCTGTAAGGGTCTGCTTCT-3 ' (SEQ ID NO: 59); sonda: 5 ' -TGCGCCAGAAACCTCCTGTGG-3 ' (SEQ ID NO: 60); mlL-10: cebador hacia adelante: 5 ' -TGAGTTCAGAGCTCCTAAGAGAGT- 3 ' (SEQ ID NO: 61); cebador inverso: 5 ' -AAAGGATCTCCCTGGTTTCTC-3 ' (SEQ ID NO: 62); sonda: 5 ' -TCCCAAGACCCATGAGTTTCTTCACA- 3 ' (SEQ ID NO: 63) .

El ARNi específico para la TIGIT se empleó para desactivar de manera específica la expresión de TIGIT en las células T CD45RO+ humanas primarias, que expresan normalmente altos niveles de TIGIT (Figuras 10A-1 a 10A-2) . La eficacia de la desactivación de TIGIT utilizando este método se valoró mediante análisis de qRT-PCR y FACS (Figuras 28A, 28B y Tabla 7) . Para el segundo día del tratamiento, la transcripción de la TIGIT se redujo por >90% mediante el tratamiento con ARNsiTIGIT tratamiento en comparación con un A Nsicontrol mezclado, mientras que el ARNm de CTLA4 (una proteína de control) no cambió por el tratamiento. La reducción en el ARNm de TIGIT resultó en una disminución de la TIGIT en la superficie celular de un promedio de 25% a <2% de las células T (Figura 28B) . Para el día 5, la expresión de TIGIT en esas mismas células fue reducida un 70%, en comparación con la expresión en las células de control (Figuras 28A y 28B, y Tabla 7) . La desactivación de TIGIT no tuvo un efecto significativo en la proliferación de las células T, en respuesta a anti-CD3 (ya . sea a concentraciones subóptimas u óptimas) o a anti-CD3 más anti-CD28 (Figura 28C) . De manera similar, la desactivación de TIGIT tampoco tuvo un efecto observado en la producción de las citocinas IL-2, IL-4, IL-10 o el IFN-? (Figura 28E) . Además, el tratamiento de las células con el anticuerpo anti-TIGIT 10A7 tampoco tuvo un efecto observado en la activación de las células T que expresan a TIGIT bajo las mismas condiciones que las descritas anteriormente (Figura 28D) .

Tabla 7. Eficiencia de la Desactivación del ARNi de la TIGIT *Los valores de CT se proporcionan como el valor de CT ± la desviación estándar para la TIGIT o CTLA4 EJEMPLO 5 : EFECTO DE LA TIGIT EN LA PRODUCCIÓN DE LA CITOCINA Para determinar si la TIGIT tuvo un efecto directo en las DC diferente al efecto general descrito anteriormente en la maduración de las células T, se valoró la maduración y la función de las DC en la ausencia y presencia de TIGIT-Fc. El resultado en el Ejemplo 4 con respecto a la capacidad de la TIGIT para modular la . producción de IFNy e IL-17 en las poblaciones mezcladas de células T, sugiere que deben realizarse estudios adicionales de la. producción de la citocina por las DC tratadas con TIGIT- Fe. Las células T no tratadas se purificaron mediante selección negativa (equipo de aislamiento de las células T CD4 , Miltenyi Biotech) a una pureza del >95%. Las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 completo con suplementos nutricionales estándar. Las células T alogenéicas (2 x 10s) se cultivaron en la ausencia (medio solo) o presencia de las iMDDC e DDC a la relación indicada en las placas µ de 96 pozos con fondo de U (Nunc) en 200 µL de medio por pozo. Las células se cultivaron durante 72 horas, seguido por un impulso de 18 horas con 1 µ(? (0.037 MBq) de [3H] timidina (Amersham) . Las células se transfirieron a una placa Unifilter-96 GF/C utilizando un recolector de células y la incorporación de la [3H] timidina se midió en el fluido de centelleo utilizando un contador de centelleo (Canberra Packard Ltd.) . Todas las determinaciones de llevaron a cabo por triplicado. La producción de citocina por las iMDDC se analizó en los sobrenadantes recolectados en el día 5 del cultivo y almacenados a -80 °C. Las mismas MDDC se maduraron en la presencia o ausencia de los estímulos indicados durante 24 horas, en la presencia o ausencia de TIGIT-Fc o TIGIT-Fc-DANA. Después de 48 horas de estimulación, los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -80 °C. Las concentraciones de citocina se midieron mediante ELISA (R&D Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, o utilizando las perlas inmovilizadas con el anticuerpo LINCOplex (LINCO Research) con detección por un instrumento Luminex 100 (Luminex) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Cuando se agregó TIGIT-Fc, TIGIT-Fc-DANA o CD226-Fc a las iMDDC durante la maduración con TNFa o CD40L soluble, la producción de IL-12/23p40 y la producción de IL-12p70 se redujeron de manera significativa en comparación con el tratamiento con el control que coincide con el isotipo (p=0.007 y p=0.03, respectivamente), a niveles comparables para la iMDDC (Figuras 22A-1 a 22A-3) . De manera inversa, la IL-10 secretada se incrementó mediante el tratamiento con TIGIT-Fc, TIGIT-Fc-DANA o CD226-Fc, con relación al tratamiento con el control que coincide con el isotipo (p=0.027 y p=0.18, respectivamente) (Figuras 22A-1 a 22A-3). La secreción de TGFP también se incrementó en las iMDDC en respuesta al tratamiento con TIGIT-Fc (véase la Figura 22D) . Sin embargo, la TIGIT-Fc no afecta la capacidad de las iMDDC de madurar a MDDC, puesto que CD80, CD86, CD83 y HLA-DR estuvieron sobrerregulados de manera equivalente en los cultivo del control del isotipo (Figura 22B) . Notablemente, la interacción de TIGIT-PVR no induce directamente la maduración de las DC.

El efecto de TIGIT-Fc, TIGIT-Fc-DANA y CD226-FC en las trayectorias de maduración de las DC mediadas por TLR también se examinó. El tratamiento con cada una de las tres proteínas de Fe exhibió un incremento similar, aunque menos robusto de la producción de IL-10 de LPS (MDDC maduradas con TLR4 (p<0.01), una disminución en IL-12/23p40 (p=0.07 a 0.18) y una disminución significativa en la producción de IL-12p70 (p<0.05 para todas las proteínas de fusión) (véase las Figuras 22A-1 a 22A-3), y no tuvo un efecto en la trayectoria de maduración con TLR2. Esta modulación de la producción de IL-10 e IL-12p40 mediante el tratamiento con TIGIT de las DC, fue similar a si se agregaba TIGIT-Fc a los monocitos durante la diferenciación con G -CSF e IL-4, o cuando sólo se agregaba durante la fase de maduración (datos no mostrados) . Los efectos de la TIGIT-Fc en la producción de IL-10 e IL-12p40 en las i DDC no sometidas a maduración, fueron modestos, pero puesto que los niveles observados de estas citocinas en las iMDDC fueron bajos, los efectos estadísticamente significativos pueden ser difíciles de detectar (Figura 22B) . Notablemente, CD226 funcionó de manera similar a la TIGIT en estos ensayos, apoyando un papel para el PVR en las MDDC. Dado que la CD226 tiene un motivo ITAM y puede actuar para mejorar las señales TCR (Dalhardon et al. J. Immunol. 175: 1558-1565 (2005)), el grado de expresión de la TIGIT y/o CD226 en diferentes subconj untos de las células T puede contribuir a la regulación diferencial de las respuestas inflamatorias locales in vivo (Figura 10, Figura 29) .

Los niveles de producción de otras citocinas proinflamatorias mediante las DC tratadas con TIGIT-Fc también se determinaron. La producción de IL-6 e IL-18 se redujo de manera significativa mediante el tratamiento con TIGIT-Fc en> todas las poblaciones de MDDC maduradas. La IL- 12p40 es una subunidad conocida de la IL-12p70 y la IL-23, de manera que los niveles de producción de ambas de estas citocinas se midieron en los cultivos de DDC tratados con TIGIT-Fc. En comparación con los cultivos de control, el tratamiento con TIGIT-Fc resultó en una producción disminuida de manera significativa de IL-12p70 por las MDDC maduradas con TNFa o CD40L (Figura 22C) . Los niveles de IL-23 fueron relativamente bajos y apenas detectables bajo las condiciones del ensayo. TIGIT-Fc redujo a IL-6 e IL-18 bajo todas las condiciones de las MDDC maduradas, pero debido a la variabilidad del donador, la reducción observada no fue estadísticamente significativa.

Para valora si el efecto observado de la TIGIT-Fc requiere la reticulación del PVR, se utilizó una versión mutada con Fe de la TIGIT-Fc, en la cual la unión de FcyR de anuló completamente (TIGIT-Fc-DANA, descrita en el Ejemplo 1) . Como se muestra en las Figuras 22A-1 a 22A-3, ambas de TIGIT-Fc y TIGIT-Fc-DANA inhibieron igualmente y de manera significativa la IL-12p40 y mejoraron la producción de IL-10 de las DC maduradas con TNFa. Este resultado indicó que el sesgo de la citocina por la proteína de fusión de TIGIT no era dependiente de la reticulación mediada por Fe.

La capacidad de la TIGIT para modificar el patrón de producción de la citocina de las DC no se observó bajo todas las condiciones de maduración in vitro. El efecto fue más pronunciado en las trayectorias de maduración inducidas por el TNFa, CD40L soluble y LPS (TLR4) , en donde la maduración mediada por TLR2 permaneció no afectada. Se ha mostrado que LPS y Pam3CSK4 activan a ERK y p38 a varios grados : LPS activa principalmente los resultados del tratamiento con p38 y Pam3CSK4 en la actividad de la cinasa ERK alta. Así, no es sorprendente que el tratamiento con TIGIT-Fc de las DC maduradas con Pam3CSK4 muestre poco efecto (véase las Figuras 22A-1 a 22A-3) . La capacidad diferencial de éstos y otros estímulos, tales como TNFa y CD40L para controlar las trayectorias de ERK/p38 es significativa para determinar el resultado de la función de las MDDC . No sólo las DC han demostrado expandir las células Treg, sino que las DC también pueden romper la tolerancia de las células Treg e inducir la activación y producción de IL-2 (Féhervari, Z. & Sakaguchi, S., Curr Opin Immunol 16, 203-8 (2004)). La capacidad de la TIGIT para modificar las DC bajo algunas condiciones de maduración, pero no otras, sugiere que la modulación de la TIGIT es un método mediante el cual las células Treg y las células T activadas pueden afinar la función de las DC .

También se realizaron estudios de la función de la TIGIT en un modelo de ratón que carece de células B y T, pero que tiene macrófagos y células dendríticas (ratones scid) . Brevemente, los ratones CB17/SCID (6-8 semanas de edad) se trataron una vez intravenosamente con 200 µg de TIGIT.Fc, TIGIT. DANA, o un anticuerpo anti-ambrosía de control. El anticuerpo monoclonal anti-CD40 o el control del isotipo (200 ^g/ratón) se administró seis horas después. El suero se recolectó 16 horas más tarde para analizar los niveles de IL-10, MCP-1, IL-12p40 e IL-12p70 mediante un ensayo ELISA. La administración de TIGIT-Fc o TIGIT-Fc-DA A en los ratones scid estimuló la producción de IL-10 e IL-12p40 y disminuyó la producción de IL-12p70 (Figuras 13A-C) . Este hallazgo fue consistente con los datos in vi tro anteriores, y sugieren que la TIGIT no requiere de células B o T para ejercer sus efectos moduladores de la citocina.

De los ejemplos anteriores, la expresión de TIGIT se restringió a las células T y a las células NK, con la expresión más alta encontrada en las células Treg. CD226, el ligando de baja afinidad para el PV , no se expresa en las células Treg a pesar de la expresión en las células T activadas (Abbas, A.R. et al., Genes Immun 6, 319-31 (2005); Dardalhon, V. et al., J" Immunol 175, 1558-65 (2005)). Aunque el equilibrio de TIGIT y CD226 in vivo permanece sin determinarse, la afinidad más alta de TIGIT por el PVR sugiere que juega un papel dominante cuando ambos se coexpresan. Tomados juntos, la alta expresión de TIGIT en las células T y las células Treg activadas, y la interacción de TIGIT con el PVR para inducir la IL-10 y para inhibir la liberación de la citocina proinflamatoria de las DC maduras, sugiere que la TIGIT proporciona un mecanismo de retroalimentación para desregular la respuesta inmune.

EJEMPLO- 6: EFECTO DE LA TIGIT EN LA SEÑALIZACIÓN DEL PVR Puesto que la trayectoria de señalización de MAPK es importante para regular la trayectoria de la IL-10 (Xia, C.Q. & Kao, K.J., Scand J Iw unol 58, 23-32 (2003)), la actividad de varios miembros de la trayectoria MAPK se valoró en las MDDC tratadas con TIGIT. CHO-PVR se privaron de suero durante tres horas, a continuación se trataron con 50 g/mL de TIGIT-Fc o no se trataron durante 15 minutos a 37 °C. Las células se homogeneizaron y las proteínas de la membrana se extrajeron utilizando un Equipo de Extracción de la Membrana del Plasma (BioVision) se sometieron a electroforesis sobre sulfato de dodecilo sódico-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) bajo condiciones no reductoras, seguido por la transferencia a membranas de nitrocelulosa (BioRad) . Las membranas se bloquearon con BSA al 5% en Tris-HCl 50 mM (pH 7.6), NaCl 150 mM, Tween-20 al 0.1% y a continuación se sondearon con anti-fosfotirosina-HRP (BD Bioscience) , se depuraron con Amortiguador de Restablecimiento (Pierce) , y se resondearon con anticuerpo policlonal de cabra anti-PVR (R&D Systems) . En el Día 5 las iMDDC se trataron con 10 g/mL de TIGIT-Fc o con la IgG humana de control durante el periodo de tiempo indicado a 37°C. Los lisados celulares totales se prepararon en amortiguador RIPA y se sometieron a SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno Immobilon (PVDF, Millipore) . Después del bloqueo con BSA al 1% en Tris-HCl 50 mM pH 7.6, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0.1%, seguido por detección mediante proteína quimioluminiscente . Para el resondeo, las membranas se incubaron en amortiguador de depuración (Tris-HCl 62.5 mM pH 6.7, ß-mercaptoetanol 100 mM, SDS al 2%) durante 30 minutos a 50 °C con agitación ocasional. La detección de la fosfotirosina, fosfo-p38MAPK y fosfo-ERK se llevó a cabo utilizando los anticuerpos policlonales específicos para la anti-fosfotirosina (Upstate) , anti-fosfo-p38MAPK (Cell Signaling Technology) , y una MAPK anti-fosfo-p44/42 monoclonal (Cell Signaling Technology) . Como un control para la carga de las proteínas, las transferencias se resondearon con el antisuero policlonal contra ERK (Cell Signaling Technology) , p38MAPK (Cell Signaling Technology) o ß-actina (NeoMarkers) , ß-catenina (BD Pharmingen) o ß-catenina activa (Upstate) .

Los datos mostrados en la Figura 23A demuestran que el PVR es fosforilado tras la unión a TIGIT (comparar la banda de tirosina fosforilada tenue observada en las células del control que coincide con el isotipo versus las tratadas con TIGIT, mientras que las cantidades totales de PVR permanecen constantes, como se indica por las bandas oscuras de manera equivalente en la porción inferior de la Figura) . Esto sugiere que la unión de TIGIT inicia una función de señalización mediada por el PVR. La fosforilación incrementada del dímero de pERK (91 KD) pero no del monómero (42KD) se observó en las iMDDC tratadas con TIGIT-Fc y TIGIT-Fc-DANA (Figura 23B) . En contraste, la actividad de la p38 no se afectó (Figura 23B) . Un reporte reciente sugiere que la estimulación de E-cadherina y la inducción de la ß-catenina activa, causaba que las DC derivadas de la médula ósea murina maduraran a DC tolerogénicas , capaces de inhibir las respuestas inmunes in vivo (Jiang, A. et al., Immunity 27, 610-24 (2007)). Aquí, cuando las MDDC humanas se trataron con TIGIT-Fc, se indujo la forma activa de la trayectoria de la ß-catenina, un efecto no observado con el control que coincide con el isotipo (Figura 23C) .

Estos resultados sugieren que la TIGIT, a través de su interacción con PVR, modula la actividad de ERK y por lo tanto, la producción de citocina mediante las MDDC. Para confirmar esta observación, se agregó un inhibidor específico de la cinasa ERK junto con TIGIT-Fc a los cultivos de MDDC, y se determinaron los niveles de la IL-12 secretada de esos cultivos. La desregulación mediada por TIGIT-Fc de la producción de IL-12p40 se invirtió en la presencia del inhibidor de ERK (Figura 24A) . Un efecto similar se observó cuando el anticuerpo anti-IL-10 neutralizante se incluyó en el cultivo (véase la Figura 24B) . La producción de la citocina modulada por la TIGIT de las MDDC también se bloqueo por el anticuerpo anti-TlGlT 10A7 o un anticuerpo bloqueante anti-PVR (Figura 24B) . Juntos, estos resultados indicaron que la ligadura de TIGIT- PVR afecta la actividad de ERK e incrementa la relación de producción de la citosina IL-10/IL-12 en las DC con relación a otras citocinas producidas.

EJEMPLO 7: IMPACTO DE LAS MDDC MODULADAS POR LA TIGIT EN LA ACTIVACIÓN DE LAS CÉLULAS T Para determinar si el efecto de la TIGIT en la producción de la citocina de las DC tuvo consecuencias funcionales, se realizaron experimentos para valorar el efecto de la modulación de la TIGIT de las MDDC en la proliferación de las células T y la producción de la citocina. Las MDDC tratadas con TIGIT- Fe (maduradas con TNFoc o sCD40L) se cultivaron con las células T en una respuesta MLR como se describió anteriormente, y se verificó el efecto sobre las células T. La proliferación de las células T se inhibió por un promedio de 50% (p < 0.05) cuando los cultivos que contienen las DC modificadas con TIGIT se compararon con las DC de control (Figura 25A) . Además, los niveles de IL-2 en los cultivos se redujeron dos veces (p<0.01) (Figura 25B) ) . Estos datos se correlacionan con la disminución de la IL-12 y un incremento en la producción de IL-10 en las DC tratadas con TIGIT, como se describió en los ejemplos anteriores. En general, las DDC modificadas con TIGIT inhibieron las células T, lo que sugiere que la TIGIT puede regular las capacidades funcionales de las DC, una vez que las DC están completamente maduras. Notablemente, la adición de TIGIT-Fc a los cultivos de células MDDC-T inhibió la proliferación de las células T, lo que indica que TIGIT-Fc no necesita estar presente al inicio de la maduración de las DC para modificar las DC .

El impacto del tratamiento con TIGIT en la expresión de las otras moléculas de la superficie celular en las MDDC humanas activadas también se investigó. Se ha sabido que la expresión de ciertos receptores de trascriptos similares a la inmunoglobulina (ILT) en las DC, está modulada en respuesta a la activación de esas células (Velten et al., Eur. J. Immunol . 34: 2800-2811 (2004); Ju et al., Gene 331: 159-164 (2004)). Por ejemplo, la expresión de los receptores ILT2 e ILT3 está desregulada en las DC activadas por CpG-ADN, y la expresión de ILT2 , ILT3 , ILT4 y ILT5 está sobrerregulada en las DC inducidas por IL-10. Dado que la TIGIT estimula la producción de IL-10 en las DC, se examinó el impacto de la TIGIT en la expresión de los ILT en las DC activadas. Las iMDDC se aislaron como se describió anteriormente. Ciertas poblaciones de iMDDC se activaron con TNF o CD40L, y también se trataron con TIGIT-Fc o un control que coincide con el isotipo. Las células tratadas se clasificaron mediante FACS, basándose en su expresión del transcripto 2, 3 ó 5 similar a la inmunoglobulina (ILT2, ILT3 o ILT5) . Como se muestra en la Figura 26, la activación de las iMDDC desregula la expresión de ILT2, ILT3 e ILT5. En contraste, la activación y el tratamiento simultáneo con la TIGIT-Fc resulta en una desregulación disminuida de la expresión de los ILT2 , ILT3 e ILT5, con relación a la desregulación observada en las iMDDC activadas, pero no tratadas con TIGIT-Fc. Este efecto observado puede deberse a la capacidad de la TIGIT de estimular la producción de IL-10 en las DC; las DC que expresan la IL-10 son conocidas por ser tolerogénicas y expresar niveles más altos de ILT. Sin embargo, la desregulación de los ILT, tales como ILT2 , 3 y 5, puede ser también un efecto directo en la TIGIT, y proporcionar otro método mediante el cual la TIGIT induce la tolerancia.

Para determinar si los efectos in vitro observados del tratamiento con TIGIT en la activación de las células T puede trasladarse a una situación ÍJI vivo, los efectos del tratamiento con TIGIT-Fc se compararon con aquéllos de CTLA4-Fc, un inhibidor bien documentado de la respuesta de las células T (Linsley, P.S. et al., Science 257, 792-5 (1992)) en una respuesta de hipersensibilidad del tipo retardado (DTH) . Brevemente, ratones C57BL/6 de 8-10 semanas de edad se inmunizaron subcutáneamente en la base de la cola con 100 µg de hemocianina de lapa ranurada (KLH) (Sigma) en 100 µL de CFA (Difco Laboratories) . Una cohorte de animales (n=10) se trató en los días 1, 4 y 6 con 100 µg de TIGIT-Fc, TIGIT-Fc-DANA, CTLA-4-Fc murinos o IgG2a anti-ambrosía del control del isotipo negativo mediante inyección intraperitoneal . En el día 6, se midió el espesor de la oreja derecha e izquierda. La oreja derecha se inyectó entonces con 25 µL de solución salina y la oreja izquierda se expuso a 30 µg de KLH en 25 µL de solución salina. En el día 7, se midieron nuevamente los espesores de la oreja derecha e izquierda, y la diferencia entre los espesores del día 7 y el día 6 se definió como la hinchazón de la oreja. La hinchazón de la oreja en las orejas inyectadas con solución salina sola fue menor que 0.02 mm para cada grupo de tratamiento. Después de la medición de la hinchazón de la oreja, los ' ratones se sometieron a eutanasia y . se recolectaron los bazos . Se prepararon suspensiones de una sola célula y se cultivaron en placas de 96 pozos con fondo plano a una densidad de 1 x 106 células/ml (200 L/ ozo) en DMEM que contiene FBS al 10%, glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 ^g/mL) . Las células se cultivaron en medio solo o en la presencia de varias concentraciones de KLH. Como un control positivo para la activación de las células T, las células se cultivaron en pozos prerrecubiertos con 5 µg/mL de anti-CD3 (BD Biosciences) con ·2 ^g/mL de anti-CD28 soluble (BD Biosciences) . Para el análisis de la proliferación, 1 ?? de [3H] timidina (Perkin Elmer) se agregó a cada pozo en un volumen de 50 µ?_ durante las últimas 18 horas de un cultivo de cuatro días, las células se recolectaron y se midió la incorporación de [3H] timidina mediante conteo del centelleo del líquido.

Se midió una hinchazón de la oreja significativamente menor en los ratones tratados con TIGIT-Fc y CTLA4-Fc, en comparación con el tratamiento de control, y la potencia fue similar para ambos grupos de tratamiento (p<0.0001 para ambos grupos) (Figura 27A) . No hubo diferencia estadística entre TIGIT-Fc y CTLA4-Fc (p = 0.07). De manera significativa, en los ratones deficientes de IL-10, la TIGIT-Fc no tuvo un efecto en las respuestas DTH, a pesar de la inhibición . de DTH con CTLA4-Fc (p=0.004), apoyando el papel de la IL-10 en la función de TIGIT-PVR. TIGIT-Fc-DANA fue similar en sus efectos á la inhibición de DTH que TIGIT-Fc, demostrando que TIGIT-Fc no requiere la reticulación mediada por Fe del PVR. Anti-TIGIT no tuvo efecto en DTH (Figura 27C) . Se realizaron ensayos para determinar las respuestas de recuperación in vitro para KLH en ratones tratados y se demostró que la proliferación, la producción de la citocina IL-2 e IFNy disminuyó de manera significativa en los ratones del tipo silvestre tratados con TIGIT-Fc, pero no en los ratones deficientes de IL-10 (Figuras 27D-G) .

Las DC CDllc+ se aislaron de los bazos en los ratones de DTH a la terminación del estudio (día 7) y el efecto de TIGIT-Fc en la proliferación de las DC y los perfiles de la citocina se valoraron mediante qRT-PCR, como se describió anteriormente. Las células T esplénicas aisladas de TIGIT-Fc y los animales tratados con CTLA4-Fc no proliferaron en respuesta a KLH en .los ensayos de recuperación en comparación con los animales del control tratados con el isotipo (p<0.001 para ambos grupos de tratamiento) (Figura 27B) . Este resultado indica que la TIGIT pueden ser importante durante el cebado de las células T y la fase efectora de las respuestas inmunes* dirigidas por las células T. De manera similar a los datos in vitro obtenidos anteriormente de los estudios con MDDC, las células CDllc+ aisladas de los ratones tratados con TIGIT-Fc, tuvieron el ARNm de IL-10 incrementado (p < 0.05) y el ARNm de IL-12/23p40 e IL-12p35 disminuido, aunque éstas últimas mediciones no alcanzan significancia estadística (p = 0.07 y 0.08, respectivamente) (Figura 27H) . Sin embargo, el tratamiento con TIGIT-Fc sólo tuvo un efecto menor en la transcripción de IL-12p40/p35 en las células CDllc* derivadas de ratones KO IL-10, indicando que la desregulación mediada por TIGIT de los niveles de ARNm de IL-12p40/p35 es específica y la sobrerregulacion mediada por TIGIT de la IL- 10 se requiere para la desregulación de la citocina proinflamatoria IL-12 en este modelo.

EJEMPLO 8: RATONES DEFICIENTES DE TIGIT Se generaron ratones con TIGIT desactivada utilizando técnicas estándar. Para confirmar la ausencia de un gen de TIGIT funcional en estos ratones, las células T totales se aislaron de los bazos de ratones desactivados o del tipo silvestre, y se incubaron posteriormente con anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 durante tres días. EL ARN total se aisló de las células utilizando un equipo RNeasy (Qiagen) y se sometieron a RT-PC en tiempo real para medir el ARm de TIGIT. Los niveles del ARNm de CD96 también se valoraron como un control. Los resultados del estudio demostraron que los ratones desactivados eran deficientes en la expresión de TIGIT.

Las poblaciones de células inmunes de los nodos linfáticos mesentéricos se examinaron en ratones con TIGIT desactivada de 9 meses de edad en comparación con los ratones del tipo silvestre, utilizando análisis FACS como se describió en el Ejemplo 3A. Los ratones con TIGIT desactivada mostraron números incrementados de células T CD4+ de memoria, mDC, pDC, monocitos, células T CDllc+ PVRhl, y células B totales en comparación con ratones del tipo silvestre. Las poblaciones de células CD4+ no diferenciadas y maduras fueron similares entre los ratones desactivados y del tipo silvestre. También se encontró que los ratones desactivados tienen números incrementados de ZB (B220+CD21hi) , NKT (DX5+CD4+ o DX5+CD8+) , y células T CD8+ de memoria en el bazo, con relación a los ratones silvestres. Este nivel incrementado de células T CD8+ de memoria también se observó en los nodos linfáticos mesentéricos en las células de parche de Peyer en los ratones desactivados. El incremento en los números de pDC y células de monocito observados en un nodo linfático mesentérico de los ratones desactivados, también se observó en el bazo y los parches de Peyer de estos ratones, aunque la diferencia en los niveles con relación a aquéllos en los ratones silvestres fue menos pronunciada que en el nodo linfático mesentérico.

La actividad de las células T aisladas de los ratones deficientes de TIGIT también se investigó. Brevemente, los. esplenocitos totales también se aislaron de ratones deficientes de TIGIT de 9 meses de edad y de compañeros de carnada del tipo silvestre. 106 células de cada tipo de ratones se sembraron en placas de 96 pozos de fondo plano y se estimularon con anti-CD3 unido a la placa (10 µg/mL) más anti-CD28 (2 . En el segundo día, los sobrenadantes se recolectaron y la producción de citocina se analizó mediante Luminex. Las células se recolectaron y sometieron a FACS, clasificándolas mediante la presencia de IFNy e IL-4 intracelulares . La proliferación celular se midió mediante la incorporación de 3H-timidina, como se describió en el Ejemplo 3A. los ensayos, con MLR se realizaron generalmente de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 4A. De manera específica, las células T CD4+ se aislaron de los bazos de ratones deficientes de TIGIT o de compañeros de carnada del tipo silvestre mediante aislamiento negativo (MACS) . Los esplenocitos Balb/C con poca cantidad de células T se irradiaron a 3000 rad y se utilizaron como células que presentan el antígeno. 2 x 105 células T CD4+ se estimularon con 1 ^g/mL de anti-CD3 soluble (células T únicamente) , o mezcladas con las células que presentan el antígeno alogenéicas a una relación de 1:2. La proliferación se midió en el tercer día mediante la incorporación de 3H-timidina, como se describió en el Ejemplo 3A. En un segundo experimento, el ensayo con MLR se realizó de manera idéntica, pero las células T CD4+ se aislaron de ratones Balb/c y las células que presentan el antígeno se prepararon de ratones deficientes de TIGIT o de ratones del tipo silvestre .

Las células T de ratón deficientes de TIGIT proliferaron de manera similar a las células T de los ratones del tipo silvestre en un ensayo de proliferación estándar (Figura 30A, panel izquierdo) . Sin embargo, en la presencia de las células que presentan el antígeno, las células T deficientes de TIGIT tuvieron una proliferación incrementada con relación a las células T del tipo silvestre (Figura 30A, panel medio) . Notablemente, las células que presentan el antígeno del bazo de los ratones deficientes de TIGIT, estimularon la proliferación de las células T del tipo silvestre al mismo grado que las células que presentan el antígeno tomadas de ratones del tipo silvestre (Figura 30A, panel derecho) . Combinados, estos datos sugieren que las células T están desreguladas en la proliferación mediante un mecanismo que involucra la TIGIT expresada en esas células T, más que en las células que presentan el antígeno, y confirma además que la actividad de la TIGIT en la desregulación de la respuesta de las células T. Una proporción mayor de las células T de los ratones deficientes de TIGIT tuvo niveles de IFNy intracelulares altos que las células T de ratón del tipo silvestre (Figura 30B) . Los análisis de producción de la citocina de los sobrenadantes de las células T deficientes de TIGIT y del tipo silvestre mostraron que la producción/secreción de IFNy y TNFa se incrementó en las células T deficientes de TIGIT con relación a las células T del tipo silvestre, mientras que los niveles de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-12p70 permanecieron consistentes entre las dos poblaciones de células.

Claims

REIVINDICACIONES :

1. Un método para determinar si una célula inmune de prueba ese una célula Treg, célula T de memoria, célula NK, o célula TFh activada o normal, que comprende valorar el nivel de expresión de la TIGIT en la célula inmune de prueba, y compararlo con el nivel de expresión de la TIGIT en una célula Treg, célula T de memoria, célula NK o célula TFh conocida activada o normal, o comparando el nivel de expresión de la TIGIT en la célula inmune de prueba para conocer el valor de la expresión de la TIGIT estándar.

2. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de los siguientes aminoácidos: una alanina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 67 de la TIGIT humana, una glicina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 74 de la TIGIT humana, una prolina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 114 de la TIGI humana, y una glicina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 116 de la TIGIT humana .

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido no es PVR, PVRL1, PVRL2 , PVRL3 , PVRL4 , TIGIT, CD96 o CD226.

4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque el polipéptido comprende además, uno o más de: un aminoácido seleccionado de valina, isoleucina y leucina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 54 de la TIGIT humana, un aminoácido seleccionado de serina y treonina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 55 de la TIGIT humana, una glutamina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido .56 de la TIGIT humana, una treonina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 112 de la TIGIT humana, y un aminoácido seleccionado de fenilalanina y tirosina en la posición del aminoácido que corresponde a la posición del aminoácido 113 de la TIGIT humana .

5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque el polipéptido comprende además uno o más submotivos estructurales seleccionados de lo siguiente: a. un aminoácido seleccionado de valina e isoleucina en la posición del aminoácido 54 - un aminoácido seleccionado de serina y treonina en la posición del aminoácido 55 - una glutamina en la posición del aminoácido 56; b. una alanina en la posición 67 - cualquier aminoácido en .cada posición del aminoácido 68-73 - una glicina en la posición del aminoácido 74; y c. una treonina en la posición del aminoácido 112 - un aminoácido seleccionado de fenilalanina y tirosina en la posición del aminoácido 113 - una prolina en la posición del aminoácido 114 - cualquier aminoácido en la posición del aminoácido 115 - una glicina en la posición del aminoácido 116, y en donde la numeración de las posiciones del aminoácido corresponde a las posiciones del aminoácido de la TIGIT humana.

6. Un método para determinar si un polipéptido de prueba es un miembro de la familia de polipéptidos TLP, que comprende alinear la secuencia de aminoácidos del polipéptido de prueba con una secuencia de aminoácidos de uno o más miembros de la familia de polipéptidos TLP y valorar la presencia o ausencia en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de prueba de cualquiera de los aminoácidos ¦ expuestos en la reivindicación 2.

7. Un método para identificar uno o más miembros de la familia de la proteína TLP, identificando las proteínas en una o más base de datos de la secuencia, cuyas secuencias de aminoácidos comprenden al menos uno de los aminoácidos expuestos en la reivindicación 2.

8. Un agente aislado que interactúa de manera específica con una o más regiones conservadas o sustancialmente conservadas de los miembros de la familia TLP.

9. El agente de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente es un antagonista de la expresión y/o actividad de un miembro de la familia TLP.

10. El agente de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el antagonista se selecciona de un inhibidor de molécula pequeña, un anticuerpo inhibidor o un fragmento que se une al antígeno del mismo, un aptámero, un ácido nucleico inhibidor y un polipéptido inhibidor.

11. El agente de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente es un agonista de la expresión y/o actividad de un miembro de la familia TLP.

12. El agente de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el agente se selecciona de un anticuerpo agonizante o un fragmento que se une al antígeno del mismo, un péptido agonizante y una molécula pequeña o proteína que activa la unión de la TIGIT al PVR y/o la señalización intracelular de la TIGIT mediada por el PVR.

13. Un método para identificar o detectar uno o más miembros de la familia TLP, poniendo en contacto un polipéptido miembro de la familia TLP putativo con el agente de la reivindicación 8 y determinar la unión del agente al miembro de la familia TLP putativo.

14. Un método para modular la función y/o actividad del sistema inmune, que comprende modular la unión de la TIGIT a uno o más de PVR, PVRL3 y PVRL2.

15. Un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento del mismo, que comprende al menos una HVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs : 23-28 o las SEQ ID NOs: 31-36.

16. El anticuerpo anti-TIGIT o fragmento que se une al antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NOS : 21 Ó 29.

17. El anticuerpo anti-TIGIT o fragmento que se une al antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NOS: 22 ó 30.

18. El anticuerpo anti-TIGIT o fragmento que se une al antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NOs: 21 ó 29 y la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NOs: 22 ó 30.

19. El anticuerpo anti-TIGIT o fragmento que se une al antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo heteroconjugado y una inmunotoxina .

20. El anticuerpo anti-TIGIT o fragmento que se une al antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque al menos una HVR es al menos 90% idéntica a una HVR expuesta en cualquiera de · las SEQ ID NOs : 23-28 ó 31-36.

21. El anticuerpo anti-TIGIT o fragmento del mismo, de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque la cadena ligera y/o cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos al menos 90% idénticas a las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 21 ó 29, o 22 ó 30, respectivamente.

22. Un método para modular una interacción de CD226-PVR y/o una interacción de CD96-PVR, que comprende administrar al menos uno de TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, o un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT in vivo o in vi tro.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque se administra la TIGIT o un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT y la interacción de CD226-PVR y/o la interacción de CD96-PVR- se inhibe.

24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque se administra un antagonista de . la expresión y/o actividad de la TIGIT y la interacción de CD226-PVR y/o la interacción de CD96-PVR se estimula.

25. Un método para modular la función y/o actividad de la célula inmune, modulando la expresión y/o actividad de la TIGIT y/o el PVR, o modulando la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la modulación es disminuir o inhibir la proliferación de una o más células inmunes o la liberación de la citocina proinflamatoria por una o más células inmunes, tratando las células in vitro o in vivo con TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad del PVR, o estimulando, la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la modulación es incrementar o estimular la proliferación de una o más células inmunes o la liberación de la citocina proinflamatoria por una o más células inmunes, tratando las células in vitro o in vivo con un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un antagonista de la expresión y/o actividad del ' PVR, o inhibiendo la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

28. Un método para inhibir una respuesta inmune, administrando in vitro o in vivo la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un agonista de la expresión ¦ y/o actividad del PVR, o estimulando la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

29. Un método para incrementar o estimular una respuesta inmune, administrando in vitro o in vivo un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR, o inhibiendo la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

30. Un método para modular el tipo y/o cantidad de producción de citocina de una célula inmune, modulando la, expresión y/o actividad de la TIGIT o el PVR in vitro o in vivo.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la producción de la citocina proinflamatoria se estimula y/o incrementa mediante la administración de un antagonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un antagonista de la expresión y/o actividad del PVR, o inhibiendo la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la producción de la citocina proinflamatoria se inhibe por la administración de un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad del PVR, o estimulando la señalización intracelular mediada por la TIGIT que se une al PVR.

33. Un método para estimular la fosforilación y/o señalización intracelular de ERK a través de la trayectoria de ERK en una o más células inmunes, que comprende tratar una o más células inmunes con TIGIT, un agonista de la expresión y/o actividad de la TIGIT, o un agonista de la expresión y/o actividad del PVR.

34. Un método para diagnosticar una enfermedad relacionada con la inmunidad, que se relaciona con una respuesta aberrante de las células inmunes en un sujeto, que comprende valorar la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra del sujeto, y comparar la expresión y/o actividad de la TIGIT con una cantidad de referencia de la expresión y/o actividad de la TIGIT, o la cantidad de la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra de un sujeto normal.

35. Un método para valorar la severidad de una enfermedad relacionada con la inmunidad, que se relaciona con una respuesta aberrante de las células inmunes en un sujeto, que comprende valorar la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra del sujeto y comparar la expresión y/o actividad de la TIGIT con una cantidad de referencia de la expresión y/o actividad de la TIGIT, o la cantidad de la expresión y/o actividad de la TIGIT en una muestra de un sujeto normal.

36. Un método para prevenir una enfermedad relacionada con la inmunidad, que se relaciona con una respuesta aberrante de las células inmunes en un sujeto, que comprende mo.dular la expresión y/o actividad de la TIGIT en el sujeto.

37. Un método para tratar o disminuir la severidad de una enfermedad relacionada con la inmunidad, que se relaciona con una respuesta aberrante de las células inmunes en un sujeto, que comprende modular la expresión y/o actividad de la TIGIT en el sujeto.

38. Los métodos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-37, caracterizados porque la enfermedad relacionada con la inmunidad se selecciona de soriasis, artritis, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer .