MX2008013393A - Formulaciones liofilizadas de pepticuerpos terapeuticos. - Google Patents

Formulaciones liofilizadas de pepticuerpos terapeuticos.

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MX2008013393A
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William J Callahan
Gayathri Ratnaswamy
Ramil F Latypov
Dingjiang Liu
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Abstract

La presente invención proporciona formulaciones estables de larga duración de un pepticuerpo terapéutico liofilizado y métodos para elaborar una composición liofilizada que comprende un pepticuerpo terapéutico.

Description

FORMULACIONES LIOFILIZADAS DE PEPTICUERPOS TERAPEUTICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN En general, la invención se refiere a formulaciones liofilizadas de pepticuerpos terapéuticos y métodos para elaborar una composición liofilizada que comprende pepticuerpos terapéuticos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas recombinantes son una clase emergente de agentes terapéuticos. Estos agentes terapéuticos recombinantes han concebido avances en la formulación de proteínas y en la modificación química. Se han identificado modificaciones que pueden proteger a , las proteínas terapéuticas, principalmente al bloquear su exposición a enzimas proteolíticas . Las modificaciones de las proteínas también pueden incrementar la estabilidad, tiempo de circulación y actividad biológica de las proteínas terapéuticas. Un artículo de revisión que describe la modificación de proteínas y las proteínas de fusión es Francis (1992), Focus on Growth Factors 3:4-10 (Mediscript, Londres), que se incorpora de este modo como referencia. Una modificación útil es la combinación de un polipéptido con un dominio "Fe" de un anticuerpo. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente REF. : 197189 independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que se une al antígeno, y un dominio constante conocido como "Fe", que se enlaza a estas funciones efectoras como activación de complemento y ataque por células fagocíticas. Un Fe tiene una vida media prolongada en suero, en tanto que un Fab es de vida corta. Capón et al. (1989), Nature 337: 525-31. Ver también por ejemplo la patente de los Estados Unidos número 5,428,130. Cuando se construyen con untamente con un pepticuerpo terapéutico o proteína terapéutica, un dominio Fe puede proporcionar vida media más prolongada o incorporar funciones tal como unión al receptor de Fe, unión a proteína A, fijación de complemento y quizá aún transferencia placentaria. Id. La Tabla 1 resume el uso de fusiones de Fe con proteínas terapéuticas conocidas en la técnica.
Tabla 1.- Fusión de Fe con proteínas terapéuticas Forma de Fe Compañero de Implicaciones Referencia fusión terapéuticas IgGl N-término de Enfermedad de Hodgkin; Pat. de EUA CD30-L linfoma anaplástico; 5,480,981 leucemia de células T Fcy2a murino IL-10 Anti-inflamatorio; Zeng et al. Rechazo de trasplante (1995) , Immunol . 154:5590-600 Forma de Fe Compañero de Implicaciones Referencia fusión terapéuticas IgGl Receptor TNF Choque séptico Fisher et al. (1996), tL Engl. J. Med. 334:1697- 1702; Van Zee, K. et al. (1996) Immunol. 156: 2221-30 IgG, IgA, Receptor TNF Inflamación, trastornos Pat. EUA IgM, o IgE autoinmunitarios 5,808,029, (excluyendo emitida 15-el primer Septiembre-dominio) 1998 IgGl Receptor CD4 SIDA Capón et al. (1989) , Nature 337: 525-31 IgGl, IgG3 N-témino de Anticancerígeno, Harvi11 et IL-2 antiviral al. (1995), Immunotech. 1: 95-105 Forma de Fe Compañero de Implicaciones Referencia fusión terapéuticas IgGl C-término de Osteoartritis; Densidad WO 97/23614, OPG ósea publicado 3- Julio-1997 IgGl N-término de Antiobesidad PCT/US leptina 97/23183, presentada 11-Diciembre- 1997 Ig Cyl CTLA-4 Trastornos Linsley humana autoinmunitarios (1991), Exp. Med. 174:561-9 Las proteínas y péptidos de fusión o conjugados a polietilenglicol ("PEG") también se han estudiado para el uso en productos farmacéuticos, en implantes artificiales, y en otras aplicaciones donde es de importancia la biocompatibilidad . Se han propuesto varios derivados de PEG, los cuales tienen una porción activa que permite que el PEG se una al producto farmacéutico e implantes y a moléculas y en general a superficies. Por ejemplo, se han propuesto derivados de PEG' para acoplar PEG a superficies para controlar la humectación, acumulación estática, y unión de otros tipos de moléculas a la superficie, incluyen proteínas o residuos de proteína . En otros estudios, se ha mostrado que el acoplamiento de PEG ( "PEGilación" ) es deseable para superar obstáculos encontrados en el uso clínico de moléculas biológicamente activas. La publicación PCT publicada número WO 92/16221 señala, por ejemplo, que se ha encontrado que muchas proteínas potencialmente terapéuticas tienen una vida media corta en suero sanguíneo. La PEGilación disminuye la velocidad de depuración desde la corriente sanguínea al incrementar el peso molecular aparente de la molécula. Hasta cierto tamaño, es inversamente proporcional la velocidad de filtración glomerular de las proteínas al tamaño de la proteína. En general, la capacidad de la PEGilación para disminuir la depuración, por lo tanto, no es una función de cuántos grupos de PEG se unan a la proteína, sino del peso molecular total de la proteína conjugada. La depuración disminuida puede conducir a eficiencia incrementada con respecto al material no PEGilado. Ver, por ejemplo, Conforti et al., Pharm. Research Commun. vol. 19, pág. 287 (1987) y Katre et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. vol. 84, pág. 1487 (1987). Además, la PEGilación puede incrementar la agregación de las proteínas (Suzuki et al., Biochem. Biophys. Acta vol. 788, pág. 248 (1984)), alterar (es decir), la inmunogenicidad de las proteínas (Abuchowski et al., J. Biol . Chem. Vol. 252 pág. 3582 (1977)), e incrementar la solubilidad de las proteínas como se describe, por ejemplo, en la publicación PCT número WO 92/16221. En general, la interacción de un ligando de proteína con su receptor frecuentemente toma lugar en una entrecara relativamente grande. Sin embargo, como se demuestra en el caso de hormona de crecimiento humana unida a su receptor, sólo unos pocos residuos clave en la entrecara contribuyen realmente a la mayoría de la energía de unión. Clackson, T. et al., Science 267:383-386 (1995). Esta observación y el hecho que el volumen del ligando de proteína restante sirven sólo para presentar los epítopos de unión en la topología correcta hace posible encontrar ligandos activos de tamaño mucho más pequeño. De esta manera, las moléculas con una longitud de sólo "péptido" como se define en la presente pueden unirse a la proteína de receptor de un ligando dado de proteína grande. Estos péptidos pueden imitar la bioactividad del ligando de proteína grande ("agonistas peptídicos") o, a través de la unión competitiva, inhibir la bioactividad del ligando de proteína grande (antagonistas peptídicos"). Han emergido bibliotecas de péptidos de visualización en fagos como un método poderoso para identificar estos antagonistas y agonistas peptídicos. Ver, por ejemplo, Scott et al. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990), Science 249: 404; patente de los Estados Unidos número 5,223,409, emitida el 29 de Junio de 1993; patente de los Estados Unidos número 5,733,731, emitida el 31 de Marzo de 1998; patente de los Estados Unidos número 5,498,530, emitida el 12 de Marzo de 1996; patente de los Estados Unidos número 5, 432, 018, emitida el 11 de Julio de 1995; patente de los Estados Unidos número 5,338,665, emitida el 16 de Agosto de 1994; patente de los Estados Unidos número 5,922,545, emitida el 13 de Julio de 1999; O 96/40987, publicada el 19 de Diciembre de 1996; y WO 98/15833, publicada el 16 de Abril de 1998, cada una de las cuales se incorpora como referencia. En estas bibliotecas, se presentan secuencias peptidicas aleatorias por fusión con proteínas de revestimiento de fagos filamentosos. Típicamente, los péptidos presentados se eluyen por afinidad contra un dominio extracelular inmovilizado de anticuerpo de un receptor. Los fagos retenidos se pueden enriquecer por rondas sucesivas de purificación y repropagación por afinidad, y los mejores péptidos de unión se secuencian para identificar los residuos clave dentro de una o más familias estructuralmente relacionadas de péptidos. Ver, por ejemplo, Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, en la cual se identificaron dos familias distintas. Las secuencias peptidicas también pueden sugerir qué residuos se pueden reemplazar de manera segura por exploración con alanina o por mutagénesis al nivel de ADN . Se pueden crear y seleccionar bibliotecas de mutagénesis para optimizar adicionalmente la secuencia de los mejores aglutinantes. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24. Otros métodos compiten con la visualización en fago en la investigación de péptidos. Se puede fusionar una biblioteca de péptidos en el término carboxilo del represor lac y expresar en E. coli. Otro método basado en E. coli permite la visualización de la membrana exterior de la célula por fusión con una lipoproteina asociada a peptidoglicano (PAL) . Estos métodos y métodos relacionados se refieren colectivamente como "visualización E. coli". Otro planteamiento biológico para seleccionar mezclas de péptidos solubles usa levadura para expresión y secreción. Ver Smith et al. (1993), Mol. Pharmacol. 43: 741-8. El método de Smith et al., y métodos relacionados se refieren como "selección basada en levadura". En otro método, la traducción de ARN aleatorio se detiene antes de la liberación de ribosoma, dando por resultado una biblioteca de polipéptidos con su ARN asociado, aún unido. Este método y métodos relacionados se refieren colectivamente como "visualización en ribosoma". Otros métodos emplean enlace químico de péptidos hacia ARN; ver, por ejemplo, Robert & Szostak (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 94: 12297-303. Este método y métodos relacionados se refieren colectivamente como "selección por ARN-péptido" . Se han desarrollado bibliotecas peptídicas químicamente derivadas, en las cuales los péptidos se inmovilizan en materiales no biológicos estables, tal como varillas de polietileno o resinas permeables a solvente. Otra biblioteca peptidica químicamente derivada usa fotolitografía para explorar péptidos inmovilizados en portaobjetos de vidrio. Estos métodos y métodos relacionados se refieren colectivamente como "selección peptidica química". La selección peptidica química puede ser ventajosa ya que permite el uso de D-aminoácidos y otros análogos no naturales, así como elementos no peptídicos. Tanto los métodos biológicos como químicos se revisan en Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62. En el caso de péptidos bioactivos conocidos, se puede llevar a cabo el diseño racional de ligandos peptídicos con propiedades terapéuticas favorables. En este planteamiento, se hacen cambios graduales a una secuencia peptidica y se determina el efecto de la sustitución en la bioactividad o en una propiedad biofísica predictible del péptido (por ejemplo, estructura de solución) . Estas técnicas se refieren colectivamente como "diseño racional". En esta técnica, se hace una serie de péptidos en los cuales se reemplaza con alanina un residuo único a la vez. Esta técnica se refiere comúnmente como un "desplazamiento de alanina" o una "exploración de alanina". Cuando se reemplazan dos residuos (contiguos o separados), se refiere como un "desplazamiento doble de alanina". Las sustituciones resultantes de aminoácidos se pueden usar solas o en combinación para dar por resultado una nueva entidad peptidica con propiedades terapéuticas favorables. También se puede usar el análisis estructural de la interacción p r ot e i na -pr o t e i na para sugerir péptidos que emiten la actividad de unión de ligandos de proteina grande. En este análisis, la estructura cristalina puede sugerir la identidad y orientación relativa de residuos críticos del ligando de proteína grande, del cual se puede diseñar un péptido. Ver, por ejemplo, Takasaki et al. (1997) , Nature Biotech. 15: 1266-70. Estos métodos y métodos relacionados se refieren como "análisis estructural de proteína". Estos métodos analíticos también se pueden usar para investigar la interacción entre una proteína de receptor y péptidos seleccionados por vi s u a 1 i z a c i ón en fago, que pueden sugerir modificación adicional de los péptidos para incrementar la afinidad de unión. Conceptualmente, los miméticos peptídicos de cualquier proteína se pueden identificar usando visualización en fago y los otros métodos mencionados anteriormente. Estos métodos también se han usado para correlación de epítopos, para identificación de aminoácidos críticos en interacciones proteína-proteína, y como guías para el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos. Por ejemplo, Córtese et al. (1996) , Curr. Opin. Biotech. 7: 616-21. Ahora se están usando bibliotecas peptidicas más frecuentemente en estudios inmunológicos , tal como correlación de epitopos. Kreeger (1996) , The Scientist 10(13) : 19-20. De interés particular es el uso de bibliotecas peptidicas y otras técnicas en el descubrimiento de péptidos farmacológicamente activos. En la Tabla 2 se resumen varios de estos péptidos identificados en la técnica. Los péptidos se describen en las publicaciones listadas, cada una de las cuales se incorpora de este modo como referencia. La actividad farmacológica de los péptidos se describe, y en muchos casos se sigue por un término taquigráfico para el mismo en paréntesis. Se han modificado algunos de estos péptidos (por ejemplo, para formar dimeros C-t erminalmente reticulados) . Típicamente, se seleccionaron bibliotecas peptidicas para la unión a un receptor para una proteína farmacológicamente activa (por ejemplo, receptor de EPO) . En al menos un caso (CTLA4) , la biblioteca peptídica se examina para la unión a un anticuerpo monoclonal .
Tabla 2.- Péptidos farmacológicamente activos Forma de péptído Compañero de Actividad fermacdcc^ Referencia ijTiórVprota'na de nterés1 Urúctopcrdaifuro MAbdeCTLM MrnéfodeCTL Fukunxtoetd.(1998). Ntetie ritra-péptido 267-70 Exxxka Receptor de TNF-a Antagonista de TNF-a Takasaki etá. (19971 Nature Qctech. 15:1266-70;WO9953842, pLbicada 3- ?dembre-1933 Lneal Receptorde TNF-a Antagonista de TNF-a Cr*ros4¾¾as(1998),J. Irrm., 5621-5626 Unido por dsJLfD C3b Irti ión de activación de Sahu etal. (1996 ImmunoL 157: 884-rírapéptido comptemento; 91: Morkiset al. (1938). Prcteh Sd.7: 619- enfermedades 27 autonruT-aias CantagcrisladeC3b'') Lineal Vrcdha Proceso de adhesión cekJar, Adevetá. (1937\ Biochem. J.324: 5236 aedrriento celular, ofeeraacon, curación de heridas, metástESSlirraal fVriína rculna'') Lneal Proteína de irión a C4 AriWrOTtófoo Lhseetá.(193n J. Bid Chem.272 (C4BP) 1465&65 Lheal Receptor de uodnasa Procesos asociados oon Goodson et al (1994), Proc Nati. Acad. rieracrión de urochasa oon Sd.91 : 712933; sofaLd rteracional WO su receptor (por ej., 9705969, pubícacia2-OdLfcre-1997 angogénesB, vascn de cáUasturrcratesy metástesis); (" antagonista de UKR) Lineal Mdm2, Hom2 Inh con de radivadón de P¡Gks^et£i(1994 Oncccene9:2523¾ p53 medada por Mdm2 o Bottieretal. (1997) J. Md. Bol.269: 744- hdr2;arrtrnor 56; BotaeretaL (1996). Onccqene 13: Cartagorista de rr^crn'') 2141-7 Lineal p21wiH AnWuTxrdmferla Bal etal. (19971 Curr. Bd.7: 71-80 acSvidaddep21ww Lneal FarnesMransferasa Anficancerigero al preverir Gfc s et al (1994), QJ 77:175-178 ta activación del encogen ras Lineal Dom o a efector de Ras Antcanoengeno al nhbr la MocdeetaL(1934lTreridsGenetia44- fijxonbiolcgcadel 48 RcdiguezetaL (19T4), Nature oncegénras 370527-632 Forma de pépüdo Compañero de Adividadferrnacdógica Referencia irervprota'na de hteiés1 Lineal Domh deSH2/SH3 Anlicarcertgeno á hhbrel Pawson etd. (1933), Cur. Bü.3:434432 orechientotumoral con Yu et aL (1994), CeJ 76933945; Rckteset 1ragna inasas activadas; aL(1994) EN/BOJ.13:559S5604; trafemerto de estados de Soateetá. (1994) J.l¾i(_hern.269 erfermedad medados por 238536: Soarkset at (19961 Proc NatL SH3C'apt-gof?sladeSH3,) AcadScL 93: 15404; Pat EEUA 5386,160, emitida 23^v1arzD-1999, Pat EEUA 5(888,763, err da30-Mara 1939 Lheai p16 Ant ancengeno á iritar FáhraeusetaL (1996), Oír. ESoL 6:8491 actividad de p16; porej., que ¡n be cornptejo cidna D- Q*C *TTélioodep16") Lineal SrcLyn Irtixión de advacon de Staufferetal (1997) Bcchem.36: 9388- céüas cebadas, 94 oondccnes relacionadasa lc hpersens«dadtpo1 artagonstadeoéüas cebadas1) Lheal Proteasa de células Tratarréento de trastornos SdotLid htEmadonal W093Q3812, cebadas ritamabnos medados por Dubicado6Agosti>1998 beraaondetrpbsa€ Clnhfcidores de proteasa de celias cebadas") Lineal Antígeno núcleo de H3V TrataniertocterfeccbTes LXscn & Murav(1996) Prcc NatL Aead. (HEScAg) virales* HBVfartMHBV") S .9221948 Lheal Setedhas Acnescn de neutróflos; Martensetal. (19951 J. Bb. Chem 270: erferrTieclades ftarnatofias 2112936; sokáud de Pat europea EP ("antagonisb de 9e dha") 0,714312, pubfcada 5JLITÍO-1996 Lineal, atizado CatriodJna ArtegorisfadecaÉriodLÍTa Perceetá. (1995) Moteo Diversflv 1: 259- 65: Deomanetain993\J.E Chem. 268: 2302530; Adey&Kay(19G6),Gene 169: 1334 Forma de pépfcto Compañero de AdvidadfenTacdógica Referencia unaVprcteína de hterés1 Lineá,ácfzado Integras Ekscadcr de tumor, SdbtudesnlenTac^ tratanisrtoparacor iiones pubfcada 1 unk>1995; WO97/O8203, relacionadas a eventos pLtícac¾&Mar2r>1997;WO9£ 10795, ceUares medados por pubfcada el 19deMazode 1998; WO nte ha, hduyendo 9924462, rxtícada el 20 de Mayo de ac^gacen de tequetas, 1999; Kraft etaL (1999), J. Bol Chem.274: Irombosis, aiación de 1979-1985 heridas, osteoporosB, reparación de tejdo, artgcgéness (perej.. para tratamiento de cáncer), e rrvasión tmoral (" de Lrión a irtegrina'') Cídco, inea¡ F¾fOTedra y empórrente TratartiÉrtoidecoricidones WO9309985, pubhada 12-Marzr>1998 de matriz exbacelularde ritematoresy céUas T y macrótagos autonruilarias Lineal Scrnatosta&rByoorfelaina Tratarrierto o prevencen de SoicituddePateuopea0311393, turoes productores de rxi±ada2&Abíi-1999 hormonas, acromegaJa, ggantismo, demencia, útaera gástrica, creemenfo tuToaL iTrtjiciónde secreción hamonal, nrediaben de sueñoo ad dadneural Lineal LbopoSsacárido bacteriano Anfl foo; cheque 9éptjco; Fa EEUA5 77,151,erriida2-Jvferao- trastornos moddabtes por 1999 CAP37 LhealocícIcD, Panja<ha,rrelria Antpatógeno WO97/31019, puMcada2810gostr>1997 rdu sndoD-amixócidos Lheal,cicíco IP Impotencia, trastornos WO 97/40070, pubfcada 30Odubre- neLiOctegeneralMas 1997 Lheal CTL Cáncer EP 0,770,624, pubfcada 2-Mayo-1997 L eal T]-IF-gamma2 Burnste (1988), E5ccherri27:4066-71 Lineal Amina Ccccer(198A Prcc Nall.Acad.Sci. 84S62&32 Lineal ActerorediiTa Ktemura (1993), BBRC, 19255360 La proteina listada en esta columna se puede unir por el péptido asociado (por ejemplo, receptor de EPO, receptor de IL-1) o imitar por el péptido asociado. Las referencias listadas para cada uno ponen en claro si la molécula está unida por o se imita por, los péptidos. Los péptidos identificados por selección de bibliotecas peptidicas se han considerado como "guias" en el desarrollo de agentes terapéuticos en lugar de que se usen como agentes terapéuticos mismos. Al igual que otras proteínas y péptidos, se removerían rápidamente in vivo ya sea por filtración renal, mecanismos de depuración celular en el sistema reticuloendotelial , o degradación proteolítica . (Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-11). Como resultado, la técnica usa actualmente los péptidos identificados para validar objetivos de fármaco o como núcleos moleculares para diseño de compuestos orgánicos que pueden no haber sido tan fácilmente o tan rápidamente identificados a través de selección de bibliotecas químicas. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. Típicamente, los péptidos purificados sólo son marginalmente estables en un estado acuoso y se someten a degradación química y física que da por resultado una pérdida de actividad biológica durante el procesamiento y almacenamiento. Adicionalmente , las composiciones peptidicas en solución acuosa se someten a hidrólisis, tal como desamidación y escisión de enlaces peptídicos. Estos efectos representan un problema serio para péptidos terapéuticamente activos que se propone que se administren a humanos dentro de un intervalo definido de dosis en base a la actividad biológica . La administración de péptidos purificados permanece como una estrategia promisoria de tratamiento para muchas enfermedades que afectan a la población humana. Sin embargo, no se ha afrontado la capacidad del pepticuerpo terapéutico para permanecer en una composición farmacéutica estable durante el tiempo en una variedad de condiciones de almacenamiento y luego ser efectivo para pacientes in vivo. De esta manera, permanece la necesidad en la técnica de proporcionar pepticuerpos terapéuticos en formulaciones estables que son útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades y trastornos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona formulaciones útiles para liofilización de pepticuerpos terapéuticos, que dan por resultado un producto de pepticuerpo terapéutico altamente estable. El producto de pepticuerpo terapéutico estable es útil como un agente terapéutico del tratamiento de individuos que padecen de trastornos o condiciones que pueden beneficiarse de la administración del pepticuerpo terapéutico. En un aspecto, la invención proporciona una composición liofilizada de pepticuerpo terapéutico que comprende un amortiguador, un agente de volumen, un agente estabilizador, y opcionalmente un agente tensioactivo; en donde el amortiguador está comprendido de un agente amortiguador de pH en un intervalo de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM y en donde el pH está en un intervalo de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 8.0; en donde el agente de volumen está a una concentración de aproximadamente 0 % a aproximadamente 4.5 % p/v; en donde el agente estabilizador está a una concentración de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 20 % p/v; en donde el agente tensioactivo está a una concentración de aproximadamente 0.004 % o aproximadamente 0.4 % p/v; y en donde el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula I, Fórmula I: [ (X1) a-F1- (X2) b] - (L1) c- SPd en donde: F es un dominio Fe; X1 se selecciona de P'-ÍL^e- F2-{L3)I-P1- (L2)e- P3- (L4) g-P2- (L3) f-P1- (L2) e- y P4- (L5) h-P3- (L4) g-P2- (L3) f-P1- (L2) e- X2 se selecciona de: - (L2)e-PX- (L3) f-P2, -(L2)e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3/ y - (L2) e-P1- (L3) f-P2- (L4 ) g-P3- (L5) h-P4 en donde P1, P2, P3 y P4 son cada uno independientemente secuencias de péptidos farmacológicamente activos ; L1, L2, L3, L4, y L5 son cada uno independientemente ligadores ; a, b, c, e, f, g y h son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición que al menos uno de a y b sea 1; d es 0, 1, o mayor que 1; y WSP es un polímero soluble en agua, la unión del cual se efectúa en cualquier porción reactiva en F1. En otra modalidad, el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula II Fórmula II: [X1-F1] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el C-término de X1, y cero, uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. En aún otra modalidad, el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula III Fórmula III: [ Fx-X2] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de X2, y cero, uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1.
En aún otra modalidad, el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula IV Fórmula IV: [ F1- (L1) e-P1] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de -(L1)C_P1, y cero, uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. En otra modalidad, el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula V Fórmula V: [F1- (L1)e-P1- (L2) f-P2] - (L1) c-WSP<j en donde el dominio Fe se une en el N-término de -L1- ?1-!,2 - ?2 , y cero, uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. En otra modalidad, el pepticuerpo terapéutico es un multimero o dimero. En otra modalidad, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde P1, P2, P3 y/o P4 se selecciona independientemente de un péptido expuesto en cualquiera de las Tablas 4 hasta 38. En una modalidad relacionada, P1, P2, P3 y/o P4 tiene la misma secuencia de aminoácidos. En otra modalidad, el dominio Fe se expone en SEQ ID NO:l, en otra modalidad, WSP es PEG. En aún otra modalidad, el dominio Fe se expone en SEQ ID NO:l y WSP es PEG. En otra modalidad, el PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 kDa y 100 kDa, o entre 6 kDa y 25 kDa . En otra modalidad, la composición comprende al menos 50 %, 75 %, 85 %, 90 % o 95 % de pepticuerpo terapéutico PEGilado.
En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde el agente amortiguador de pH se selecciona del grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato y aspartato. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde el agente de volumen se selecciona del grupo que consiste de manitol, glicina, sacarosa, dextrano, polivinilpirrolidona , carboximetilcelulosa, lactosa, sorbitol, trehalosa, o xilitol. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde el agente estabilizador seleccionado del grupo que consiste de sacarosa, trehalosa, mañosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glicosamina, fructosa, manitol, sorbitol, glicina, arginina-HC1, compuestos de poli-hidroxi , incluyendo polisacáridos tal como dextrano, almidón, hidroxietil-almidón, ciclodextrinas , N-metil-pirrolideno, celulosa y ácido hialurónico, cloruro de sodio . En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde el agente tensioactivo se selecciona del grupo que consiste de laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctil-sodio, dioctilsulfonato de sodio, ácido quenodesoxicólico, sal sódica de N-lauroilsarcosina , dodecilsulfato de litio, sal sódica de ácido 1-octanosulfónico, hidrato de colato de sodio, desoxicolato de sodio, sal sódica de ácido glicodesoxicólico, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, raonohidrato de cloruro de cetilpiridinio, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonina, Tritón X-100, Tritón X-114, lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, polioietileno, aceite de ricino hidrogenado 10, 40, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 20, 40, 60, 65 y 80 lecitina de soya, DOPC, DMPG, DMPC y DOPG; éster de ácido graso de sacarosa, metil-celulosa y carboximetil-celulosa . En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico está entre aproximadamente 0.25 mg/mL y 250 mg/mL. En otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 4 % p/v, en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.004 % p/v. En otra modalidad, se proporciona la composición mencionada anteriormente en donde P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 6. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico es 0.5 mg/mL. En otra modalidad, el pepticuerpo terapéutico es cualquiera de SEQ ID NO:993, SEQ ID NO:994, SEQ ID NO:995, SEQ ID NO:996, SEQ ID NO:997, SEQ ID NO:998, SEQ ID NO:999, SEQ ID NO:1000, SEQ ID NO:1001, SEQ ID NO:1002, SEQ ID NO:1003, SEQ ID NO:1004, SEQ ID NO:1005, SEQ ID NO:1006, SEQ ID NO:1007, SEQ ID NO:1008, SEQ ID NO:1009, SEQ ID NO:1010, SEQ ID NO.1011, SEQ ID NO:1012, SEQ ID NO:1013, SEQ ID NO:1014, SEQ ID NO:1015, SEQ ID NO:1016, SEQ ID NO:1017. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 7.0; en donde el agente de volumen es manitol al 4 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.01 % p/w. En otra modalidad, se proporciona la composición mencionada anteriormente en donde P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 32. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico es 30 mg/mL. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde el agente amortiguador de pH es histidina 20 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 3.3 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.01 % p/v. En otra modalidad, la composición mencionada anteriormente se proporciona en donde P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 4. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico es 100 mg/mL. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 2.5 % p/v; y en donde el agente estabilizador es sacarosa al 3.5 % p/v. En aún otra modalidad, la composición mencionada anteriormente se proporciona en donde P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 31. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico es 30 mg/mL. En otra modalidad de la invención, se proporciona una composición mencionada anteriormente en donde la composición se selecciona del grupo que consiste de: a) histidina 10 mM, pH 4.7 , 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; b) histidina 10 mM, pH 5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; c) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; d) succinato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; e) glutamato 10 mM, pH 4.5, 9 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; f) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de sacarosa, 1 % de hidroxietil-almidón , 0.004 % de polisorbato 20; g) glutamato 5 mM, pH 4.5, 2 % de manitol, 1 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; y h) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de trehalosa, 0.004 % de polisorbato 20. En otra modalidad, se proporciona la composición mencionada anteriormente en donde P1 comprende una secuencia expuesta en las Tablas 21-24. En aún otra modalidad, la composición mencionada anteriormente se proporciona en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico se selecciona del grupo que consiste de 1, 30, 85 y 100 mg/mL. La presente invención también contempla métodos para elaborar pepticuerpo terapéuticos liofilizados de la presente invención. En una modalidad, la invención proporciona un método para elaborar un pepticuerpo terapéutico liofilizado que comprende los pasos de: a) preparar una solución de un amortiguador, un agente de volumen, un agente estabilizador, y opcionalmente un agente tensioactivo ; en donde el amortiguador está comprendido de un agente amortiguador de pH en un intervalo de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM y en donde el pH está en un intervalo de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 8.0; en donde el agente de volumen está en una concentración de aproximadamente 2.5 % a aproximadamente 4 % p/v; en donde el agente estabilizador está a una concentración de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 5 % p/v; en donde el agente tensioactivo está a una concentración de aproximadamente 0.004 % o aproximadamente 0.04 % p/v; y b) liofilizar el pepticuerpo terapéutico; en donde el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula I, Fórmula I: [ (X1) a-F1- (X2) b] - (L1) c~ SPD en donde F1 es un dominio Fe; X1 se selecciona de P3-(Li)g-P2-(L3)f-P1-(Lz)e- y P4- (L5)H-P3- (L4)G-P2- (L3) f-P1- (L2) E- X2 se selecciona de: -(I^e-P'-d^f-P2, -(L2)E-P1-(L3)F-P2-(L4)g-P3, y - (L2)e-P1- (L3) F-P2- (L4) G-P3- (L5)H-P4 en donde P1, P2, P3 y P4 son cada uno independientemente secuencias de péptidos farmacológicamente activos ; L1, L2, L3, L4, y L5 son cada uno independientemente ligadores ; a, b, c, e, f, g y h son cada uno ' independientemente 0 ó 1, con la condición que al menos uno de a y b sea 1 ; d es 0, 1, o mayor que 1; y SP es un polímero soluble en agua, la unión del cual se efectúa en cualquier porción reactiva en F1. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula II Fórmula II: [X1-F1] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el C-término de X1, y cero, uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente se proporciona en donde el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula III Fórmula III: [ F1-X2 ] - ( L1 ) c-WSPd en donde el dominio Fe se une al N-término de X2, y cero, uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula IV Fórmula IV: [ F1- (L1) c-P1] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de -(L1)c-P1, y se une en cero, uno o más SP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula V Fórmula V: [F1- (L1) e_P1_ (L2) f-P2] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de -L1-?1-!,2-?2 , y se une en cero, uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el pepticuerpo terapéutico es un multimero o dimero. En otra modalidad, el P1, P2, P3 y/o P4 se seleccionan independientemente de un péptido expuesto en cualquiera de las Tablas 4 hasta 38. En otra modalidad relacionada, P1, P2, P3 y/o P4 tienen la misma secuencia de aminoácidos. En otra modalidad, el dominio Fe se expone en SEQ ID NO:l, en otra modalidad, WSP es PEG. En otra modalidad, el dominio Fe se expone en SEQ ID NO:l y WSP es PEG. En otra modalidad, PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 kDa y 100 kDa o entre 6 kDa y 25 kDa . En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde la composición comprende al menos 50 %, 75 %, 85 %, 90 % o 95 % de pepticuerpo terapéutico PEGilado. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el agente amortiguador de pH se selecciona del grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato y aspartato. En esta modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el agente de volumen se selecciona del grupo que consiste de manitol, glicina, sacarosa, dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa , lactosa, sorbitol, trehalosa, o xilitol. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el agente estabilizador seleccionado del grupo que consiste de sacarosa, trehalosa, mañosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa, manitol, sorbitol, glicina, arginina-HCl , compuestos de poli-hidroxi , incluyendo polisacáridos tal como dextrano, almidón, hidroxietil-almidón, ciclodextrinas , N-metil-pirrolideno, celulosa y ácido hialurónico, cloruro de sodio. En otra modalidad, se proporciona un método mencionado anteriormente en donde el agente tensioactivo se selecciona del grupo que consiste de laurilsulfato de sodio, dioctil-sulfosuccinato de sodio, dioctilsulfonato de sodio, ácido quenodesoxicólico, sal sódica de N-lauroilsarcosina , dodecilsulfato de litio, sal sódica de ácido 1-octanosulfónico, hidrato de colato de sodio, desoxicolato de sodio, sal sódica de ácido glicodesoxicólico, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, monohidrato de cloruro de cetilpiridinio , bromuro de hexadeciltrimetilamonio, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonina, Tritón X-100, Tritón X-114, lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, polioietileno, aceite de ricino hidrogenado 10, 40, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 20, 40, 60, 65 y 80 lecitina de soya, DOPC, DMPG, DMPC y DOPG; éster de ácido graso de sacarosa, metil-celulosa y carboximetil-celulosa . En aún otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico está entre aproximadamente 0.25 mg/mL y 250 mg/mL. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 4 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.004 % p/v. En otra modalidad, el método mencionado anteriormente se proporciona en donde P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 6. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico es 0.5 mg/mL. En otra modalidad, se proporciona un método mencionado anteriormente en donde el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 7.0; en donde el agente de volumen es manitol al 4 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.01 % p/v. En otra modalidad, el método mencionado anteriormente se proporciona en donde P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 32. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico es 30 mg/mL. En otra modalidad, se proporciona un método mencionado anteriormente en donde el agente amortiguador de pH es histidina 20 mM, y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 3.3 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.01 % p/v. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 4. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico es 100 mg/mL. En otra modalidad, se proporciona un método mencionado anteriormente en donde el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 2.5 % p/v; y en donde el agente estabilizador es sacarosa al 3.5 % p/v. En aún otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 31. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico es 30 mg/mL . En otra modalidad de la invención, se proporciona un método mencionado anteriormente en donde la composición se selecciona del grupo que consiste de: a) histidina 10 mM, pH 4.7, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; b) histidina 10 mM, pH 5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; c) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; e) succinato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; e) glutamato 10 mM, pH 4.5, 9 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; f) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de sacarosa, 1 % de hidroxietil-almidón, 0.004 % de polisorbato 20; g) glutamato 5 mM, pH 4.5, 2 % de manitol, 1 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; y h) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de trehalosa, 0.004 % de polisorbato 20. En otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde P1 comprende una secuencia expuesta en las Tablas 21-24. En aún otra modalidad, se proporciona el método mencionado anteriormente en donde la concentración del pepticuerpo terapéutico se selecciona del grupo que consiste de 1, 30, 85 y 100 mg/mL. En otra modalidad, se proporciona un método mencionado anteriormente que comprende además, antes de la liofilización, los pasos de: b) ajustar el pH de la solución a un pH entre aproximadamente 4.0 y aproximadamente 8.0; c) preparar una solución que contiene el pepticuerpo terapéutico; d) intercambiar con amortiguador la solución del paso (c) en la solución del paso (b) ; e) adicionar una cantidad apropiada de un agente tensioactivo; f) liofilizar la mezcla del paso (e) . En otra modalidad, se proporciona el método mencionado, anteriormente en donde se proporciona un método para preparar una composición reconstituida de pepticuerpop terapéutico que comprende los pasos de: a) liofilizar una composición de pepticuerpo terapéutico mencionado anteriormente; y b) reconstituir la composición liofilizada de pepticuerpo terapéutico. En otra modalidad, se proporciona un kit para preparar una composición farmacéutica acuosa, que comprende un primer recipiente que tiene una composición liofilizada de pepticuerpo terapéutico, mencionado anteriormente, y un segundo recipiente que tiene un solvente fisiológicamente aceptable para la composición liofilizada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definición de Términos El término "que comprende", con respecto a un compuesto peptidico, significa que un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales en cualquiera o ambos de los términos amino o carboxi de la secuencia determinada. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deben interferir de manera significativa con la actividad del compuesto. Con respecto a la composición de la presente invención, el término "que comprende" significa que una composición puede incluir componentes adicionales. Estos componentes adicionales pueden interferir de manera significativa con la actividad de la composición. El término "pepticuerpo" se refiere a una molécula que comprende péptidos fusionados ya sea directa o indirectamente a otra moléculas tal como un dominio Fe de un anticuerpo, donde la porción peptidica se une de manera especifica a un objetivo deseado. Los péptidos se pueden fusionar ya sea a una región Fe o insertar en una Asa de Fe, una molécula modificada de Fe. Las Asas de Fe se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US2006/0140934 incorporada en la presente como referencia en su totalidad. La invención incluye estas moléculas que comprenden un dominio Fe modificado para comprender un péptido como una secuencia interna (preferentemente en una región de asa) del dominio Fe. Las moléculas péptidicas internas de Fe pueden incluir más de una secuencia peptidica en tándem en una región interna particular y pueden incluir péptidos adicionales en otras regiones internas. En tanto que se ejemplifican las regiones de asa putativas, las inserciones en cualquier otro dominio no terminal del Fe también se consideran partes de esta invención. El término "pepticuerpo" no incluye proteínas de fusión de Fe (por ejemplo, proteínas de longitud completa fusionadas al dominio Fe) . El término "vehículo" se refiere a una molécula que impide la degradación y/o incrementa la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o incrementa la actividad biológica de una proteína terapéutica. Los vehículos de ejemplo incluyen un dominio Fe como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,428,130 de Capón et al., emitida el 27 de Junio de 1995. El término "Fe nativo" se refiere a una molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento no de unión a antígeno que resulta de la digestión del anticuerpo entero, ya sea en la forma monomérica o multimérica. Típicamente, un Fe nativo comprende un dominio CH2 y CH3. La fuente original de inmunoglobulina del Fe nativo es un aspecto de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas . Un Fe nativo es un polipéptido monomérico que se puede enlazar en formas diméricas o multiméricas por la asociación covalente (es decir, enlaces de disulfuro) , asociación no covalente o una combinación de ambas. El número de enlaces intermoleculares de disulfuro entre sub-unidades monoméricas de moléculas de Fe nativas varían desde uno a cuatro dependiendo de la clase (por ejemplo IgG, IgA, IgE) o sub-clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgA2). Un ejemplo de un Fe nativo es un dímero unido a disulfuro que resulta de digestión con papaína de una IgG. Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9. El término "Fe nativo" como se una en la presente es genérico a las formas monomérica, dimérica y multimérica. El término "variante de Fe" se refiere a una molécula o secuencia que se modifica de un Fe nativo, pero aún comprende un sitio de unión para el receptor de salvamento, FcRn. Las solicitudes internacionales W097/34631 (publicada el 25 de Septiembre de 1997) y W096/32478 describen variantes de Fe de ejemplo, así como interacción con el receptor de salvamento, y de este modo se incorporan como referencia. En un aspecto, el término "variante de Fe" comprende una molécula o secuencia que se humaniza de un Fe nativo no humano. En otro aspecto, un Fe nativo comprende sitios que se pueden remover debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica como se requiere por las moléculas de fusión de la presente invención. De esta manera, el término "variante de Fe" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos de Fe nativo que afectan o están comprendidos en (1) formación de enlaces de disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula hospedadora seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal en la expresión en una célula hospedadora seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con complemento, (6) unión a un receptor de Fe diferente de un receptor de salvamento, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Las variantes de Fe se describen en detalle adicional más adelante en la presente. El término "dominio de Fe" abarca moléculas de variante de Fe y Fe nativo y secuencias como se define anteriormente. Como con las variantes de Fe y Fe nativos, el término "dominio Fe" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas del anticuerpo entero o producidas por otros medios. En una modalidad, por ejemplo, la región de Fe puede ser: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:l). Se conocen secuencias adicionales de Fe, en la técnica, y se contempla para el uso en la invención. Por ejemplo, Fe IgG 1 (Acceso GenBank No. P01857), Fe IgG2 (Acceso GenBank No. P01859), Fe IgG3 (Acceso GenBank No. P01860), Fe IgG4 (Acceso GenBank No. P01861), Fe IgAl (Acceso GenBank No. P01876), Fe IgA2 (Acceso GenBank No. P01877), Fe IgD (Acceso GenBank No. P01880), Fe IgM (Acceso GenBank No. P01871), y Fe IgE (Acceso GenBank No. P01854) son algunas secuencias de Fe adicionales contempladas para el uso en la presente. Opcionalmente, se puede adicionar una secuencia de aminoácidos N-terminal a las secuencias anteriores (por ejemplo, donde se exprese en bacterias). El término "multímero" como se aplica a dominios Fe o moléculas que comprenden dominios Fe se refiere a moléculas que tiene dos o más cadenas de polipéptido asociadas de manera covalente, de forma no covalente, o tanto por interacciones covalentes como no covalentes. Típicamente, las moléculas de IgG forman dímeros; IgM pentámeros; IgD, dímeros; e IgA, momómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Se pueden formar multímeros al aprovechar la secuencia y la actividad resultante de la fuente nativa de Ig del Fe o al derivatizar (como se define más adelante) este Fe nativo. Los términos "derivatización" , "derivatizar" o "derivatizado" significan procesos y compuestos resultantes en los cuales, por ejemplo y sin limitación, (1) el compuesto tiene una porción cíclica; por ejemplo, reticulación entre residuos de cisteinilo dentro del compuesto; (2) el compuesto se retícula o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el compuesto tiene un residuo de cisteinilo y de esta manera forma dímeros reticulados en cultivo o in vivo; (3) se reemplazan uno o más enlaces de peptidilo por un enlace no de peptidilo; (4) el N-término se reemplaza por -NRRi, NRC(0)Ri, -NRC(0)ORi, -NRS(0)2Ri -NHC (O) NHR, un grupo succinimida, un benciloxicarbonil-NH- sustituido e insustituido, en donde R y Ri y los sustituyentes de anillo son como se definen más adelante en la presente; (5) el C-término se reemplaza por -C(0)R2 o -NR3R4 en donde R2, R3 y R4 son como se definen más adelante en la presente; y (6) compuestos en los cuales se modifican las porciones de aminoácidos individuales a través del tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales. Los productos derivatizados se describen adicionalmente más adelante en la presente. Como se usa en la presente el término "péptido refiere a moléculas de 2, 3, 4, 5, 6, 7, í 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 0 más aminoácidos enlazados por enlaces peptidicos. Típicamente, los péptidos contienen conformaciones aleatorias y/o flexibles, tal como espirales aleatorias; y carecen típicamente de conformaciones estables, tal como aquellas observadas en proteinas/polipéptidos más grandes, típicamente mediante estructuras secundarias y terciarias. En modalidades particulares, se contemplan en la presente numerosos intervalos de tamaño de los péptidos, tal como de aproximadamente: 3-90, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50; 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30; 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30; 10-20 aminoácidos de longitud, y similares. En modalidades adicionales, los péptidos usados en la presente no son más de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 ó 20 aminoácidos de longitud. Los péptidos de ejemplo se pueden generar por cualquiera de los métodos expuestos en la presente, tal como portados en una biblioteca peptidica (por ejemplo, una biblioteca de visualización en fago) , generados por síntesis química, derivados por digestión de proteínas, o generados usando técnicas de ADN recombinante . Los péptidos incluyen la forma D y L, ya sea purificados o en una mezcla de las dos formas . Adicionalmente, las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de esta invención también se contemplan. Por "sales fisiológicamente aceptables" se quiere decir cualquiera de las sales que se conocen o se descubran más adelante como que son farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos específicos son: acetato; trifluroacetato; hidrohaluros , tal como cloruro y bromuro; sulfato; citrato; tartrato; glicolato; y oxalato. El término "aleatorizado" como se usa en la presente se refiere a secuencias peptídicas referidas a secuencias completamente aleatorias (por ejemplo, seleccionadas por métodos de visualización en fago) y secuencias en las cuales se reemplazan uno o más residuos de una molécula que se presenta de manera natural por un residuo de aminoácido que no aparece en esta posición en la molécula que se presenta de manera natural. Los métodos de ejemplo para identificar secuencias peptidicas incluyen visualización en fago, visualización en E. Coli, visualización en ribosaoma, selección basada en levadura, selección de ARN-péptido, selección química, diseño racional, análisis estructural de proteína, u similares. El término "farmacológicamente activo" significa que una sustancia descrita de este modo se determina que tiene actividad que afecta un parámetro médico (por ejemplo, pero no limitado a presión sanguínea, cuenta de células sanguíneas, nivel de colesterol) , o estado de enfermedad (por ejemplo, pero no limitado a cáncer, trastornos autoinmunitarios ) . De esta manera, los péptidos farmacológicamente activos comprenden péptidos agonísticos o miméticos y antagónicos como se define más adelante. Los términos "péptido mimético" y "péptido agonista" se refieren a un péptido que tiene actividad biológica comparable a una proteína (por ejemplo, pero no limitado a EPO, TPO, G-CSF y otras proteínas descritas en la presente) que interactúa con una proteína de interés. Estos términos incluyen además péptidos que limitan indirectamente la actividad de una proteina de interés, tal como al potenciar los efectos de ligando natural de la proteina de interés; ver, por ejemplo, los péptidos miméticos de G-CSF listados en las Tablas 2 y 7. Como un ejemplo, el término "mimético de EPO" comprende cualquiera de los péptidos que se puedan identificar o derivar como se describe en Wrighton et al. (1996), Science 273: 458-63, Naranda et al. (1999), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 7569-74, o cualquier otra referencia en la Tabla 2 identificada como que tiene materia mimética de EPO. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos de los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas peptidicas . Como otro ejemplo, el término "péptido mimético de EPO" o "TMP" se refiere a péptidos que se pueden identificar o derivar como se describe en Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,869,451 y 5,932,946 y cualquier otra referencia en la Tabla 2 identificada como que tiene materia mimética de TPO, asi como solicitud internacional WO 00/24770 publicada el 04 de Mayo de 2000, incorporada de este modo como referencia. Aquellos expertos en la técnica aprecian que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos que realmente de describen en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas peptidicas . Como otro ejemplo, el término "péptido mimético de G-CSF" se refiere a cualquier péptido que se pueda identificar o describir en Paukovits et al. (1984), Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 365: 303-11 o cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificada como que tiene materia mimética de G-CSF. Aquellos expertos en la técnica aprecian que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos de los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas peptidicas . El término "péptido mimético de CTLA4". se refiere a cualesquiera de los péptidos que se puedan identificar o derivar como se describe en Fukumoto et al. (1998), Nature Biotech. 16:267-70. aquellos expertos en la técnica aprecian que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos de los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas peptidicas. El término "péptido antagonista" o "péptido inhibidor" se refiere a un péptido que bloquea o interfiere de alguna manera con la actividad biológica de la proteina asociada de interés, o tiene actividad biológica comparable a un antagonista o inhibidor conocido de la proteina asociada de interés. De esta manera, el término "péptido antagonista de TNF" comprende péptidos que se pueden identificar o derivar como se describe en Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70 o cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificadas como que tienen materia antagonista de TNF. Aquellos expertos en la técnica aprecian que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos de los realmente ' descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas peptidicas. Los términos "antagonista de IL-1" y "péptido mimético de IL-lra" se refieren a péptidos que inhiben o reducen la expresión de la activación del receptor de IL-1 por IL-1. La activación del receptor de IL-1 resulta de la formación de un complejo entre IL-1, receptor de IL-1 y una proteina auxiliar de receptor de IL-1. El antagonista de IL-1 o péptidos miméticos de IL-lra se une a IL-1, receptor de IL-1, o proteina auxiliar de receptor de IL-1 y obstruye la formación de del complejo entre cualquiera de estos dos o tres componentes del complejo. Los antagonistas de IL-1 o péptidos miméticos de IL-lra de ejemplo se pueden identificar o derivar como se describe en las patente de los Estados Unidos números 5,608,035; 5,786,331, 5,880,096; o cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificadas como que tienen materia antagonista de IL-1 o mimética de IL-lra. Aquellos expertos en la técnica aprecian que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos de los que realmente se describen en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas peptidicas. El término "péptido antagonista de VEGF" se refiere a péptidos que se pueden identificar o derivar como se describe en Fairbrother (1998), Biochem. 37: 17754-64, y en cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificados como que tienen materia antagonista de VEGF. Aquellos expertos en la técnica aprecian que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos de los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas peptidicas. El término "péptido inhibidor de MMP" se refiere a péptidos que se pueden identificar o derivar como se describe en Koivunen (1999), Nature Biotech. 17: 768-74 y en cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificados como que tienen materia inhibidora de MMP. Aquellos expertos en la técnica aprecian que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos de los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas peptidicas. El término "péptido inhibidor de miostatina" se refiere a péptidos que se pueden identificar por su capacidad para reducir o bloquear la actividad de miostatina o señalización, como se demuestra en ensayos in vitro tal como por ejemplo, el ensayo de actividad de miostatina basado en células pMARE C2C12 o por prueba en animal in vivo como se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos número US20040181033A1 y publicación de solicitud PCT número WO 2004/058988. En las Tablas 21-24 se exponen péptidos inhibidores de miostatina de ejemplo. El término "antagonista de integrina/adhesión" se refiere a péptidos que inhiben o reducen la expresión de la actividad de integrinas, selectinas, moléculas de adhesión celular, receptores de integrina, receptores de selectina, o receptores de moléculas de adhesión celular. Los antagonistas de integrina/adhesión de ejemplo comprenden laminina, equistatina, los péptidos descritos en las tablas 25-28. El término "inhibidor de resorción ósea" se refiere a moléculas como se determina por los ensayos de los Ejemplos 4 y 11 de la WO 97/23614, que se incorpora de este modo como referencia en su totalidad. Los inhibidores de resorción ósea de ejemplo incluyen el anticuerpo de OPG y de OPG-L, que se describen respectivamente en la WO 97/23614 y WO 98/46751, respectivamente, que se incorporan de este modo como referencia en su totalidad. El término "inhibidor de factor de crecimiento de nervios" o "agonista de factor de crecimiento de nervios" se refiere a un péptido que se une a, e inhibe la, actividad o señalización del factor de crecimiento de nervios (NGF) . Los péptidos de ejemplo de este tipo se exponen en la Tabla 29. El término "dominio de modulación de TALL-1" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que se une al TALL-1 y comprende secuencias que se presentan de forma natural o secuencias aleatorizadas . Los dominios de modulación de TALL-1 de ejemplo se pueden identificar o derivar por visualización en fagos u otros métodos mencionados en la presente. Los péptidos de ejemplo de este tipo se exponen en las Tablas 20 y 31. El término "antagonista de TALL-1" se refiere a una molécula que se une al TALL-1 e incrementa o disminuye uno o más parámetros de ensayo opuestos del efecto en aquellos parámetros por TALL-1 nativo de longitud completa. Esta actividad se puede determinar, por ejemplo, por ensayos tal como se describe en la subsección titulada "Actividad biológica de AGP-3" en la sección de Materiales y Métodos de la solicitud de patente, titulada "PROTEÍNAS RELACIONADAS A TNF" , WO 00/47740, publicada el 17 de Agosto de 2000. El término "Péptido antagonista de Ang 2" se refiere a péptidos que se pueden identificar o derivar como que tienen características antagónicas de Ang-2. Los péptidos de ejemplo de este tipo se exponen en las Tablas 32-38. El término " SP" se refiere a un polímero soluble en agua que impide que un péptido, proteina u otro compuesto al cual se une se precipite en un ambiente acuoso, tal como, a manera de ejemplo, un ambiente fisiológico. Sigue a continuación una descripción más detallada de varias modalidades de SP, contempladas por la invención.
Liofilización y Administración Los pepticuerpos terapéuticos son útiles en formulaciones farmacéuticas a fin de tratar enfermedades humanas como se describe en la presente. En una modalidad, las composiciones de pepticuerpo terapéutico, se liofilizan. Se lleva a cabo la liofilización usando técnicas comunes y se deben optimizar para la composición que se desarrolla [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) y Chang et al., Pharm Res. 13: 243-9 (1996) ] . Un ciclo de liofilización, en un aspecto, está compuesto de tres pasos: congelación, secado primario y secado secundario [A.P. ackenzie, Phil Trans R Soc Londres, Ser B, Biol 278:167 (1977)]. En el paso de congelación, la solución se enfria para iniciar la formación de hielo. Adicionalmente , este paso incluye la cristalización del agente de volumen. El hielo se sublima en la etapa de secado primario, y se conduce al reducir la presión de cámara por debajo de la presión de vapor del hielo, usando un vacio y al introducir calor para promover la sublimación. Finalmente, se remueve el agua adsorbida o unida en la etapa de secado secundario bajo presión reducida de cámara y a una temperatura elevada de anaquel. El proceso produce un material conocido como una torta liofilizada. Posteriormente, la torta se puede reconstituir con ya sea agua estéril o diluyente adecuado para inyección . El ciclo de liofilización no sólo determina el estado físico final de los excipientes, sino también afecta otros parámetros tal como tiempo de reconstitución, apariencia, estabilidad y contenido final de humedad. La estructura de la composición en el estado congelado prosigue a través de varias transiciones (por ejemplo, transiciones vitreas, humectaciones, y cristalizaciones) que se presentan a temperaturas específicas y se pueden usar para entender y optimizar el proceso de liofili zación . La temperatura de transición vitrea (Tg y/o Tg') puede proporcionar información acerca del estado físico de un soluto y se puede determinar por calorimetría de exploración diferencial (DSC). La Tg y Tg' son un parámetro importante que se debe tomar en cuenta cuando se diseña el ciclo de liofilización . Por ejemplo, Tg' es importante para secado primario. Adicionalmente , en el estado seco, la temperatura de transición vitrea proporciona información en la temperatura de almacenamiento del producto final .
Excipientes en General Los excipientes son aditivos que se incluyen en una formulación debido a que ya sea imparten o mejoran la estabilidad, distribución y capacidad de manufactura de un producto de fármaco. A pesar de la razón para su inclusión, los excipientes son un componente integral de un producto de fármaco y por lo tanto necesitan, ser seguros y bien tolerados por los pacientes. Para fármacos proteicos, la elección de los excipientes es particularmente importante debido a que pueden afectar tanto la eficiencia como la inmunogenicidad del fármaco. Por lo tanto, se necesitan desarrollar formulaciones de proteina con selección apropiada de excipientes que den estabilidad, seguridad y comerciabilidad adecuadas. Usualmente, una formulación liofilizada está comprendida de un amortiguador, un agente de volumen y un estabilizador. La utilidad de un agente tensioactivo se puede evaluar y seleccionar en casos donde llega a ser una cuestión la agregación durante el paso de liofilización durante la reconstitución. Se incluye un agente amortiguador apropiado para mantener la formulación dentro de zonas estables de pH durante la liofilización . En la Tabla A se proporciona una comparación de los componentes excipientes en formulaciones de proteina liofilizada y liquida.
Tabla A.- Componentes excipientes de formulaciones de proteina liofilizada Componente excipiente Función en formulación liofilizada Amortiguador Mantiene pH de formulación durante la liofilización y en la reconstitución Agente de - Estabilizadores incluyen crio- tonicidad/estabilizador y lio-protectores Ejemplos incluyen polioles, azúcares y polímeros Crioprotectores protegen proteínas de estrés de congelación Lioprotectores estabilizan proteínas en el estado secado por congelación Agente de volumen Usado para mejorar elegancia del producto y para impedir explosión Proporciona resistencia estructural a la lio-torta Ejemplos incluyen manitol y glicina Componente excipiente Función en formulación liofilizada Agente tensioactivo - Empleado si es una cuestión de agregación durante el proceso de liofilización - Puede servir para reducir los tiempos de reconstitución Ejemplos incluyen polisorbato 20 y 80 Antioxidante Usualmente no empleado, las reacciones moleculares en las lio-tortas se recargan en su mayor parte Iones metálicos/agente - Se puede incluir si se excluye quelador un ión metálico especifico sólo como un co-factor o donde se requiera el método para actividad de proteasa - Agentes quelantes en general no se necesitan en lio-formulaciones Componente excipiente Función en formulación liofilizada Conservador Sólo para formulaciones de múltiples dosis Proporciona protección contra crecimiento microbiano en formulación Usualmente se incluye en el diluyente de reconstitución (por ejemplo, b FI) El resto principal en el desarrollo de formulaciones para proteínas terapéuticas es estabilizar el producto contra los esfuerzos de la fabricación, envío y almacenamiento. El papel de los excipientes de la formulación es proporcionar estabilización contra estos esfuerzos o estrés. También se pueden emplear los excipientes para reducir la viscosidad de formulaciones de proteína de alta concentración a fin de permitir su distribución y mejorar la conveniencia del paciente. En general, los excipientes se pueden clasificar en base a los mecanismos por los cuales se estabilizan las proteínas contra varios estreses químicos y físicos. Algunos excipientes se usan para aliviar los efectos de un estrés específico o para regular una susceptibilidad particular de una proteína específica. Otros excipientes tienen efectos más generales en las estabilidades físicas y covalentes de las proteínas. Los excipientes descritos en la presente se organizan ya sea por su tipo químico o su papel funcional en las formulaciones. Se proporcionan breves descripciones de los modos de estabilización cuando se analiza cada tipo de excipiente . Dadas las enseñanzas y guía proporciona en la presente, aquellos expertos en la técnica conocerán qué cantidad o intervalo de excipiente se puede incluir en cualquier formulación particular para lograr una formulación biofarmacéutica de la invención que promueva la retención en la estabilidad del producto biofarmacéutico . Por ejemplo, la cantidad y tipo de una sal que se incluye en una formulación biofarmacéutica de la invención se puede seleccionar en base a la osmolaridad deseada (es decir, isotónica, hipotónica o hipertónica) de la solución final así como las cantidades y osmolaridad de otros componentes que se incluyen en la formulación. De manera similar, por ej emplificación con referencia al tipo de poliol o azúcar incluido en una formulación, la cantidad de este excipiente dependerá de su osmolaridad . A manera de ejemplo, la inclusión de aproximadamente 5 % de sorbitol puede lograr isotonicidad en tanto que se necesitan aproximadamente 9 % de un excipiente de sacarosa para lograr isotonicidad. La selección de la cantidad o intervalo de concentraciones de uno o más excipientes que se pueden incluir dentro de una formulación farmacéutica de la invención se han ejemplificado anteriormente por referencia a sales, polioles y azúcares. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica entenderán que las consideraciones descritas en la presente y ejemplificadas adicionalmente por referencia a excipientes específicos son igualmente aplicables a todos los tipos y combinaciones de excipientes que incluyen, por ejemplo, sales, aminoácidos, otros agentes de tonicidad, agentes tensioactivos, estabilizadores, agentes de volumen, crioprotectores , lioprotectores , antioxidantes, iones metálicos, agentes quelantes y/o conservadores. Además, donde se reporta un excipiente particular en una formulación por ejemplo mediante por ciento (%) p/v, aquellos expertos en la técnica reconocerán que también se contempla la concentración molar equivalente de ese excipiente . Por supuesto, una persona que tenga habilidad en la técnica reconocerá que las concentraciones de los excipientes mencionados anteriormente comparten una interdependencia dentro de una formulación particular. A manera de ejemplo, la concentración de un agente de volumen se puede disminuir donde, por ejemplo, hay una alta concentración de proteína/péptido o donde, por ejemplo, hay una alta concentración de agente estabilizador. Además, una persona que tiene habilidad en la técnica reconocerá que, a fin de mantener la isotonicidad de una formulación particular en la cual no hay agente de volumen, se ajustaría por consiguiente la concentración de un agente estabilizador (es decir, una cantidad "tonificante" del estabilizador se usaría) . Se conocen otros excipientes en la técnica y se pueden encontrar en Powell et al., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci . Technology, 52:238-311.
Amortiguadores La estabilidad de un fármaco de proteína usualmente se observa que es máxima en un intervalo estrecho de pH . Este intervalo de pH de estabilidad óptima necesita ser identificado tempranamente durante los estudios de pre-formulación. Se ha mostrado que varios planteamientos tal como estudios de estabilidad acelerada y estudios de selección calorimétrica son útiles en esta empresa (Remmele R.L., Jr . , et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Una vez que se finaliza una formulación, el producto de fármaco se debe elaborar y mantener dentro de una especificación predefinida a todo lo largo de su vida en anaquel. Por lo tanto, casi siempre se emplean agentes amortiguadores para controlar el pH en la formulación. Se han empleado, rutinariamente, ácidos orgánicos, fosfatos y Tris como amortiguadores en formulaciones de proteínas (Tabla B) . La capacidad de amortiguador de las especies amortiguadoras es máxima a un pH igual a la pKa y disminuye conforme se incrementa el pH o disminuye lejos de este valor. Existe noventa por ciento de capacidad amortiguadora dentro de una unidad de pH de su pKa . La capacidad de amortiguador también se incrementa de manera proporcional con el incremento de la concentración del amortiguador . Se necesitan considerar varios factores cuando se elige un amortiguador. Primero y ante todo, la especie de amortiguadores y su concentración necesitan ser definidos en base a su pKa y el pH deseado de la formulación. Igualmente importante es asegurar que el amortiguador sea compatible con el fármaco proteico, con los otros excipientes de la formulación, y no catalice ninguna reacción de degradación. Recientemente, se ha mostrado que los ¦amortiguadores de carboxilato polianiónico tal como citrato y succinato forman aductos covalentes con residuos de cadena lateral de proteínas. Un tercer aspecto importante se considera que es la sensación de picazón e irritación que puede inducir el amortiguador. Por ejemplo, se conoce que el citrato provoca picazón en la inyección (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2) : 218-21 (2006) ) . El potencial para picazón e irritación es mayor para fármacos que se administran mediante la ruta SC o IM, donde la solución de fármaco permanece en el sitio durante un periodo de tiempo relativamente más prolongado que cuando se administra por la ruta IV donde la formulación se diluye rápidamente en la sangre en la administración. Para formulaciones que se administran por infusión IV directa, se necesita monitorizar la cantidad total de amortiguador (y cualquier otro componente de la formulación) . Se tiene que tener particularmente cuidado acerca de los iones potasio administrados en la forma del amortiguador de fosfato de potasio, lo que puede inducir efectos cardiovasculares en un paciente ( Hol lander-Rodrigue z JC , et al., Am . Fam . Physician., 73(2) : 283-90 (2006) ) . Los amortiguadores para formulaciones liofilizadas necesitan consideración especial. Algunos amortiguado es tal como fosfato de sodio pueden cristalizarse de la fase amorfa de la proteina durante el congelamiento dando por resultado cambios más bien grandes en el pH. Se deben evitar otros amortiguadores comunes tal como acetato e imidazol puesto que pueden sublimarse o evaporarse durante el proceso de 1 io f i 1 i zación , cambiando de este modo el pH de la formulación durante la liofili zación o después de la reconstitución.
Tabla B.- Agentes amortiguadores comúnmente usados valores de pKa El sistema amortiguador presente en las composiciones se selecciona que sea fisiológicamente compatible y mantenga un pH deseado en la solución reconstituida asi como en la solución antes de la liofilización . En una modalidad, el pH de la solución antes de la liofilización está entre pH 2.0 y pH 12.0. Por ejemplo, en una modalidad, el pH de la solución antes de la liofilización es 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7, ó 12.0. En otra modalidad, el pH de la solución reconstituida está entre 4.5 y 9.0. En una modalidad, el pH en la solución reconstituida es 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, ó 9.0. En una modalidad, el agente amortiguador de pH usando en la formulación es un aminoácido o mezcla de aminoácidos. En un aspecto, el agente amortiguador de pH es histidina o una mezcla de aminoácidos, uno de los cuales es histidina. El compuesto amortiguador de pH puede estar presente en cualquier cantidad adecuada para mantener el pH de la formulación a un nivel predeterminado. En una modalidad, cuando el agente amortiguador de pH es un aminoácido, la concentración del aminoácido está entre 0.1 mM y 1000 mM (1 ) . En una modalidad, el agente amortiguador de pH es al menos 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, ó 900 mM. En otra modalidad, la concentración del agente amortiguador de pH está entre 1, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ó 90 mM y 100 mM. En aún otra modalidad, la concentración del agente amortiguador de pH está entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, ó 40 mM y 50 mM. En aún otra modalidad, la concentración del agente amortiguador de pH es 10 mM. Otros agentes amortiguadores de pH de ejemplo usados para amortiguar la formulación como se expone en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato, y aspartato.
Estabilizadores y Agentes de Volumen Típicamente, se usan agentes de volumen en formulaciones liofilizadas para mejorar la elegancia del producto y para impedir la explosión. En general, las condiciones en la formulación se diseñan de modo que el agente de volumen cristalice de la fase amorfa congelada (ya sea durante la congelación o fijación por arriba de la Tg ' ) dando la estructura y volumen de la torta. El manitol y la glicina son ejemplos de agentes de volumen comúnmente usados. Los estabilizadores incluyen una clase de compuestos que pueden servir como crioprotectores , lioprotectores , y agentes formadores de vidrio. Los crioprotectores actúan para estabilizar las proteínas durante la congelación o en el estado congelado a bajas temperaturas (P. Cameron, ed . , Good Pharmaceutical Freeze-Drying Practice, Interpharm Prerss, Inc., Buffalo Grove, IL, 1997)). Los lioprotectores estabilizan las proteínas en la forma de dosis sólida liofilizada al conservar las propiedades conformacionales tipo nativas de la proteína durante las etapas de deshidratación de la liofilización . Las propiedades de estado vidrioso se han clasificado como "fuertes" o "frágiles" dependiendo de sus propiedades de relajación como una función de la temperatura. Es importante que los crioprotectores , lioprotectores, y agentes formadores de vidrio permanezcan en la misma fase con la proteína a fin de impartir estabilidad. Los azúcares, polímeros y polioles caen en esta categoría y algunas veces pueden servir para los tres papeles. Los polioles abarcan una clase de excipientes que incluyen azúcares (por ejemplo, manitol, sacarosa, sorbitol), y otros alcoholes polhídricos (por ejemplo, glicerol y propilenglicol ) . El polímero, polietilenglicol (PEG) se incluye en esta categoría. Comúnmente se usan polioles como excipientes estabilizadores y/o agentes de isotonicidad tanto en formulaciones de proteína parenterales líquidas y liofilizadas . Con respecto a la serie de Hofmeister, los polioles son cosmotrópicos y preferencialmente se excluyen de la superficie de la proteína. Los polioles pueden proteger las proteínas tanto de las rutas de degradación físicas como químicas. Los co-solventes preferencialmente excluidos incluyen la tensión superficial efectiva de solvente en la entrecara de la proteína por lo que las conformaciones de proteína más energéticamente favorables son aquéllas con las áreas superficiales más pequeñas. El manitol es un agente de volumen popular en las formulaciones liofilizadas debido a que se cristaliza de la fase de proteína amorfa durante la liofili zación conduciendo estabilidad estructural a la torta (por ejemplo, LeukineMR, EnbrelMR - Lyo, BetaseronMR) . En general, se usa en combinación con un crio- y/o lio-protector tal como sacarosa. Debido a la propensión del manitol para cristalizarse bajo condiciones congeladas, el sorbitol y la sacarosa son los agentes de tonicidad/estabilizadores preferidos en las formulaciones líquidas para proteger el producto contra los esfuerzos de congelación-descongelación encontrados durante el transporte o cuando se congela antes de la fabricación. El sorbitol y la sacarosa son bastante más resistentes a la cristalización y por lo tanto menos probables que se separen de fase de la proteína. Es interesante señalar que en tanto que se ha usado manitol en cantidades de tonificación en varias formulaciones líquidas comercializadas tal como ActimmuneMR, ForteoMR, y RebifMR, las etiquetas del producto de estos fármacos llevan una advertencia "no Congelar". El uso de agentes reductores (que contienen grupos aldehido o cetona libres) tal como glucosa y lactosa se deben evitar debido a que pueden reaccionar y glicar los residuos superficiales de resina y arginina de las proteínas mediante la reacción de Maillard de aldehidos y aminas primarias (Chevalier F, et al., Nahrung, 46(2): 58-63 (2002); Humeny A, et al., J Agrie Food Chem. 50(7): 2153-60 (2002)). La sacarosa puede hidrolizarse a fructosa y glucosa bajo condiciones ácidas (Kautz C. F. y Robinson A. L . , JACS, 50(4) 1022-30 (1928)), y en consecuencia puede provocar glicación. El polímero, poliet ilenglicol (PEG) puede estabilizar las proteínas por dos diferentes mecanismos dependientes de la temperatura. A menores temperaturas, se excluye preferencialmente de la superficie de las proteínas, pero se ha mostrado que interactúa con la forma no plegada de la proteína a mayor temperatura dada su naturaleza anfipática (Lee L.L., y Lee J.C., Biochemistry, 26(24): 7813-9 (1987)) . De esta manera, a bajas temperaturas puede proteger las proteínas mediante el mecanismo de exclusión preferencial , pero a mayores temperaturas, posiblemente al reducir el número de colisiones productivas entre las moléculas no plegadas. También, el PEG es un crioprotector y se ha empleado en RecombinateMR, una formulación liofilizada del factor antihemofílico recombinante, que utiliza PEG 3350 a una concentración de 1.5 mg/mL. Los PEG líquidos de bajo peso molecular (PEG 300-600) se pueden contaminar con peróxidos y provocan la oxidación de la proteina. Si se usan, el contenido de peróxido en la materia prima se debe reducir al mínimo y controlar a todo lo largo de su vida en anaquel. Lo mismo se mantiene válido para polisorbatos. En una modalidad particular de las presentes composiciones, se adiciona un estabilizador (o una combinación de estabilizadores) a la formulación de liofilización para impedir o reducir la agregación y degradación química inducida por almacenamiento o inducida por liofilización . Una solución nebulosa o turbia en la reconstitución indica que ha precipitado la proteína. El término "estabilizador" significa un excipiente capaz de impedir la agregación u otra degradación física, así como la degradación química (por ejemplo, autolisis, desamidación, oxidación, etc.) en un estado acuoso y sólido. Los estabilizadores que se emplean convencionalmente en composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, mañosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa, manitol, sorbitol, glicina, arginina-HCl , compuestos de poli-hidroxi , incluyendo polisacáridos tal como dextrano, almidón, hidroxietil-almidón, ciclodextrinas , N-metil-pirolideno, celulosa y ácido hialurónico, cloruro de sodio [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]. En una modalidad, el estabilizador se incorpora en una concentración de aproximadamente 0 % a aproximadamente 40 % p/v. En otra modalidad, el estabilizador se incorpora en una concentración de al menos 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, ó 40 % p/v. En otra modalidad, el estabilizador se incorpora en una concentración de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 % a aproximadamente 10 % p/v. En aún otra modalidad, el estabilizador se incorpora en una concentración de aproximadamente 2 % a aproximadamente 4 % p/v. En aún otra modalidad, el estabilizador se incorpora en una concentración de aproximadamente 2 % p/v. Si se desea, las composiciones liofilizadas también incluyen cantidades apropiadas de agentes de regulación de osmolaridad y volumen, adecuados para formar una "torta" liofilizada. Los agentes de volumen pueden ser ya sea cristalinos (por ejemplo, manitol, glicina) o amorfos (por ejemplo, sacarosa, polímeros tal como dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa) . Otros agentes de volumen de ejemplo incluyen lactosa, sorbitol, trehalosa, o xilitol. En una modalidad, el agente de volumen es manitol. En una modalidad adicional, el agente de volumen se incorpora en una concentración de aproximadamente 0 % a aproximadamente 10 % p/v. En otra modalidad, el agente de volumen se incorpora en una concentración de al menos 0.2, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, ó 9.5 % p/v. En aún una modalidad adicional, en una concentración de aproximadamente 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 % hasta 5.0 % p/v, para producir una torta elegante y mecánica y farmacéuticamente estable. En otra modalidad, la concentración de manitol es 4 % p/v.
Agentes Tensioactivos Las moléculas de proteina tienen una alta propensión a interactuar con superficies, lo que las hace susceptibles a adsorción y desnaturalización en entrecaras aire-liquido, frasco-liquido, y líquido-liquido (aceite de silicón) . Esta ruta de degradación se ha observado que es inversamente dependiente de la concentración de la proteína y da por resultado ya sea la formación de agregados de proteína solubles insolubles o la pérdida de proteína de la solución mediante adsorción a superficies. Además de la adsorción de la superficie del recipiente, se exacerba la degradación inducida a la superficie con agitación física, como se experimentará durante el envío y manejo del producto. Comúnmente se usan agentes tensioactivos en formulaciones de proteína para impedir la degradación inducida por la superficie. Los agentes tensioactivos son moléculas antipáticas con la capacidad de competir con las proteínas por las posiciones interfaciales. Las porciones hidrófobas de las moléculas de agente tensioactivo ocupan posiciones interfaciales (por ejemplo, aire/liquido) , en tanto que las porciones hidrófilas de las moléculas permanecen orientadas hacia el solvente en masa. A concentraciones suficientes (típicamente alrededor de la concentración micelar crítica del detergente) , una capa superficial de moléculas de agente tensioactivo sirve para impedir que las moléculas de proteína se adsorban en la entrecara. De este modo, se reduce al mínimo la degradación inducida en la superficie. La mayoría de los agentes tensioactivos comúnmente usados son ésteres de ácidos grasos de sorbitan-polietoxilatos , es decir, polisorbato 20 y polisorbato 80 (por ejemplo, AvonexMR, NeupogenMR, NeulastaMR) . Los dos difieren sólo en la longitud de la cadena alifática que imparte carácter hidrófobo a las moléculas, C-12 y C-18, respectivamente. Por consiguiente, el polisorbato 80 es más activo en la superficie y tiene una menor concentración micelar crítica que el polisorbato 20. El agente tensioactivo, poloxámero 188, también se ha usado en varios productos líquidos comercializados tal como Gonal-FMR, NorditropinMR, y OvidrelMR. Los detergentes también pueden afectar la estabilidad conformacional termodinámica de las proteínas. Aquí nuevamente, serán específicos de la proteína los efectos de un excipiente determinado. Por ejemplo, se ha mostrado que los polisorbatos reducen la estabilidad de algunas proteínas e incrementa la estabilidad de otras. La desestabilización con detergente de las proteínas se puede racionalizar en términos de las extremidades hidrófobas de las moléculas de detergente que pueden acoplarse en unión específica con estados de proteínas parcial o completamente desplegados. Estos tipos de interacciones pueden provocar .un cambio en el equilibrio conformacional hacia los estados de proteína más expandidos (es decir, incrementando la exposición de las porciones hidrófobas de la molécula de proteína en el complemento a la unión a polisorbato) . De manera alternativa, si el estado nativo de la proteína exhibe algunas superficies hidrófobas, la unión por detergente al estado nativo puede estabilizar esa conformación . Otro aspecto de los polisorbatos es que son inherentemente susceptibles a degradación oxidativa. Frecuentemente, como materias primas, contienen cantidades suficientes de peróxidos para provocar oxidación de cadenas laterales de residuos de proteína, especialmente metionina. El potencial para daño oxidativo que surge de la adición del estabilizador enfatiza el punto que se deben usar en las formulaciones las concentraciones efectivas más bajas de los excipientes. Para agentes tensioactivos , la concentración efectiva para una proteína dada dependerá del mecanismo de estabilización. Se ha postulado que si el mecanismo de estabilización del agente tensioactivo se relaciona a la prevención de la desnaturalización superficial, la concentración efectiva será alrededor de la concentración micelar critica del detergente. Por el contrario, si el mecanismo de estabilización se asocia con interacciones especificas de proteína-detergente, la concentración efectiva de agente tensioactivo se relacionará a la concentración de proteína y a la estequiometría de la interacción (Randolph T.W., et al., Pharm Biotechnol . , 13:159-75 (2002)). También se pueden adicionar agentes tensioactivos en cantidades apropiadas para impedir el fenómeno de agregación relacionado a la superficie, durante la congelación y el secado [Chang, B, J. Pharm. Sci . 85:1325, (1996)]. Los agentes tensioactivos de ejemplo incluyen agentes tensioactivos aniónicos, catiónicos, no iónicos, zwiteriónicos y anfotéricos, que incluyen agentes tensioactivos derivados de aminoácidos que se presentan de forma natural. Los agentes tensioactivos aniónicos incluyen, pero no se limitan a, laurilsulfato de sodio, dioctil-sulfosuccinato de sodio y dioctil-sulfonato de sodio, ácido quenodesoxicólico, sal sódica de N-lauroilsarcosina, dodecilsulfato de litio, sal sódica de ácido 1-octanosulfónico, hidrato de colato de sodio, desoxicolato de sodio, y sal sódica de ácido glicodesoxicólico . Los agentes tensioactivos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, monohidrato de cloruro de cetilpiridinio, y bromuro de hexadeciltrimetilamonio . Los agentes tensioactivos zwiteriónicos incluyen, pero no se limitan a CHAPS, CHAPSO, SB3-10 y SB3-12. Los agentes tensioactivos no iónicos incluyen, pero no se limitan a, digitonina, Tritón X-100, Tritón X-114, TWEEN-20 y TWEEN-80. En otra modalidad, los agentes tensioactivos vincluyen lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, polioxietileno, aceite de ricino hidrogenado 10, 40, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, lecitina de soya y otros fosfolipidos tal como DOPC, DMPG, DMPC y DOPG; éster de ácido graso de sacarosa, metil-celulosa y carboximetil-celulosa. Las composiciones que comprenden estos agentes tensioactivos, ya sea de manera individual o como una mezcla en diferentes relaciones, por lo tanto se proporcionan de manera adicional. En una modalidad, el agente tensioactivo se incorpora en una concentración de aproximadamente 0 % a aproximadamente 5 % p/v. En otra modalidad, el agente tensioactivo se incorpora en una concentración de al menos 0.001, 0.002, 0.005, 0.007, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 ó 4.5 % p/v. En otra modalidad, el agente tensioactivo se incorpora en una concentración de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % p/v. En aun otra modalidad, el agente tensioactivo se incorpora en una concentración de aproximadamente 0.004, 0.005, 0.007, 0.01, 0.05 ó 0.1 % p/v hasta aproximadamente 0.2 % p/v. En aun otra modalidad, el agente tensioactivo se incorpora en una concentración aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 0.1 % p/v.
Sales Frecuentemente se adicionan sales para incrementar la concentración iónica de la formulación, que puede ser importante para la solubilidad, estabilidad física e isotonicidad de la proteína. Las sales pueden afectar la estabilidad física de las proteínas en una variedad de maneras. Los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas por la unión a residuos cargados en la superficie de la proteína. De manera alternativa, pueden estabilizar el estado desnaturalizado por la unión a grupos peptídicos a lo largo de la estructura de la proteína (-CONH-) . También, las sales pueden estabilizar la conformación nativa de la proteína al proteger de las interacciones electrostáticas repulsivas entre los residuos dentro de una molécula de proteína. Los electrolitos en las formulaciones de proteína también pueden proteger las interacciones electrostáticas atractivas entre las moléculas de proteína que conducen a agregación e insolubilidad de la proteína. El efecto de la sal en la estabilidad y solubilidad de proteínas varía de manera significativa con las características de las especies iónicas. La serie de Hofmeister se originó al rededor de 1880 como una manera para clasificar otros electrolitos en base a su capacidad para precipitar proteínas (Cacace .G., et al., Quarierly Reviews of Biophysics., 30(3): 241-277 (1997)). En este reporte, la serie Hofmeister se usa para ilustrar una escala de efectos de estabilización de proteína por co-solutos iónicos y no iónicos. En la Tabla C, se ordenan los co-solutos con respecto a sus efectos generales en proteínas de estado en solución, desde estabilizadores ( cosmotrópicos ) a desestabilizadores ( cautrópicos ) . En general, las diferencias en los efectos a través de los aniones son bastante mayores que las observadas para los cationes, y para ambos tipos, los efectos son más aparentes a mayores concentraciones de lo que son aceptables en las formulaciones parenterales . Comúnmente se usan altas concentraciones de cosmotropos (por ejemplo, >1 molar sulfato de amonio) para precipitar proteínas de la solución por un proceso llamado "de salado" donde se excluye preferencialmente el cosmotropo de la proteína de la superficie, reduciendo la solubilidad de la proteína en su conformación nativa (plegada) . La remoción o dilución de la sal regresará la proteína a la solución. El término "salado" se refiere al uso de iones desestabilizantes (por ejemplo, tal como guanidina y cloruro) que incrementan la solubilidad de las proteínas al solvatar los enlaces peptídicos de la estructura de la proteína. Concentraciones crecientes del cautropo favorecerán la conformación de estado desnaturalizado (no plegado) de la proteina conforme se incrementa la solubilidad de la cadena peptidica. La efectividad relativa de los iones para "salar", "desalar" define suposición en la serie de Hofmeister. A fin de mantener la isotonicidad en una formulación parenteral, en general, se limitan las concentraciones de sal a menos de 150 mM para combinaciones de iones monovalentes. En este intervalo de concentraciones, el mecanismo de estabilización de sal probablemente es debido a la selección de fuerzas intramoleculares repulsivas electrostáticas o fuerzas intramoleculares atrayentes (selección de Debye-Huckel) . De manera interesante, se ha mostrado que las sales cautrópicas son más efectivas en la estabilización de la estructura de la proteina que concentraciones similares de cosmotropos por este mecanismo. Los aniones cautrópicos se cree que se unen más fuertemente con los iones cosmotrópicos . Con respecto a la degradación de proteínas covalentes, los efectos diferenciales de la concentración iónica de este mecanismo se esperan a través de la teoría de Debye-Huckel . Por consiguiente, los reportes publicados de estabilización de proteínas por cloruro de sodio se acompañan por aquellos donde el cloruro de sodio aceleró la degradación covalente. Los mecanismos por los cuales las sales afectan la estabilidad de la proteína son específicos de la proteína y pueden variar de manera significativa como una función del pH de la solución. Un ejemplo donde puede ser útil un excipiente al permitir la distribución de un fármaco de proteina es aquel de algunas formulaciones de anticuerpo de alta concentración. Recientemente, se ha mostrado que las sales son efectivas en la reducción de la viscosidad de estas formulaciones (Liu J., et al., J. Pharm Sci . , 94(9): 1928-40 (2005). Erratum in: J. Pharm Sci., 95(1): 234-5. (2006)).
Tabla C Serie de Hofmeister de sales Co-soluto Escalas de estabilización Anión Catión Otro (CH3)4N1 Glicerol/S Estabilización Kosmotrópico orbitol (desalado) P04 (CH3) 2NH Sacarosa/T rehalosa SO, NH< TMAO CHCOO K Cl' Na Br~ Cs1 Li1 Desestabilizaci Caotrópico Mg Guanidina ón (salado) Ca Arginina Ba Urea Aminoácidos Los aminoácidos han encontrado uso versátil en formulaciones de proteina como amortiguadores, agentes de volumen, estabilizadores y antioxidantes. Se emplean histidina y ácido glutámico para amortiguar formulaciones de proteina en el intervalo de pH de 5.5 - 6.5 y 4.0 - 5.5 respectivamente. El grupo imidazol de la histidina tiene una pKa = 6.0 y el grupo carboxilo de la cadena lateral de ácido glutámico tiene una pKa de 4.3 que lo hace adecuado para amortiguar en sus respectivos intervalos de pH . El acetato, el amortiguador más comúnmente usado en el intervalo de pH ácido de 4.0 - 5.5, se sublima durante la liofilización y por lo tanto no se debe de usar en formulaciones liofilizadas . Particularmente el ácido glutámico es útil en estos casos (por ejemplo, StemgenMR) . Comúnmente se encuentra histidina en formulaciones de proteina, comercializadas (por ejemplo XolairMR, HerceptinMR, RecombinateMR) . Proporciona una buena alternativa a citrato, un amortiguador conocido que pica en la inyección. De manera interesante, también se ha reportado que histidina tiene un efecto estabilizador en ABX-IL8 (un anticuerpo de IgG2) con respecto a la agregación cuando se usa a altas concentraciones en presentaciones tanto liquidas como liofilizadas (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). También se observó que la histidina (hasta 60 mM) reduce la viscosidad de una formulación de alta concentración de este anticuerpo. Sin embargo, en el mismo estudio, los autores observaron agregación y descoloramiento incrementados en formulaciones que contienen histidina durante estudios de congelación-descongelación del anticuerpo en recipientes de acero inoxidable. Los autores atribuyeron esto a un efecto de los iones de hierro lixiviados de la corrosión de los recipientes de acero. Otro nota de precaución con histidina es que sufre foto-oxidación en la presencia de iones metálicos (Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). El uso de metionina como un antioxidante en formulaciones parece ser promisorio; se ha observado que es efectivo contra varios esfuerzos oxidativos (Lam XM, et al., J Pharm Sci., 86(11) :1250.5 (1997) ) . Los aminoácidos glicina, prolina, serina y alanina se han mostrado que estabilizan proteínas por el mecanismo de exclusión preferencial . También la glicina es un agente de volumen comúnmente usado en formulaciones liofilizadas (por ¦ i MR ¦ MR MR ejemplo Neumega , Genotropin , Humatrope ) . Cristaliza de la fase amorfa congelada dando la estructura y volumen de la torta. Se ha mostrado que la arginina es un agente efectivo en la inhibición de la agregación y se ha usado en formulaciones tanto líquidas o liofilizadas (por ejemplo, ActivaseMR, AvonexMR, líquido EnbrelMR) . Adicionalmente , la eficiencia mejorada del repliegue de ciertas proteínas en la presencia de arginina se ha atribuido a su supresión de la reacción de agregación competente durante el replegamiento .
Antioxidantes La oxidación de residuos de proteínas surge de varias fuentes diferentes. Más allá de la adición de antioxidantes específicos, la prevención de daño oxidativo de proteína comprende el control cuidadoso de varios factores a todo lo largo del proceso de fabricación y almacenamiento del producto tal como oxígeno atmosférico, temperatura, exposición a la luz y contaminación química. Los antioxidantes farmacéuticos más comúnmente usados son agente reductores, eliminadores de oxígeno/radicales libres, o agentes queladores. Los antioxidantes en formulaciones de proteínas terapéuticas deben ser solubles en agua y permanecer activos a todo lo largo de la vida en anaquel del producto. Los agente reductores y eliminadores de oxígeno/radicales libres trabajan al remover especies activas de oxígeno en solución. Los agentes quelantes tal como EDTA pueden ser efectivos en la unión de contaminantes de metales traza que promueve la formación de radicales libres. Por ejemplo, se utilizó EDTA en la formulación líquida de factor ácido de crecimiento de fibroblastos para inhibir la oxidación catalizada por iones metálicos de residuos de cisteína. Se ha usado EDTA en productos comercializados tal como KineretMR y OntakMR. Además de evaluar la efectividad de varios excipientes al impedir la oxidación de proteínas, los científicos de formulación deben estar consientes del potencial de los antioxidantes mismos para inducir otros cambios covalentes o físicos a la proteína. Se han reportado en la literatura varios de estos casos. Los agentes reductores (tal como glutationas) pueden provocar interrupción de los enlaces intramoleculares de disulfuro, lo que puede conducir a transposición de disulfuro. En la presencia de iones de metales de transición, se ha mostrado que el ácido ascórbico y EDTA promueven la oxidación de metionina en varias proteínas y péptidos (Akers MJ, y Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parental Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science Taylor and Francis, UK (1999)); Fransson J.R., J. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). Se ha reportado que el tiosulfato de sodio reduce los niveles de oxidación de metionina inducida por temperatura y luz en rhuMab HER2; sin embargo, también se reporta en este estudio la formación de un aducto de tiosulfato-proteína (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci 86(11): 1250-5 (1997)) . La selección de un antioxidante apropiado se hace de acuerdo a los esfuerzos y sensibilidades específicas de la proteína.
Iones Metálicos En general, los iones de metales de transición son indeseados en las formulaciones de proteína debido a que catalizan reacciones de degradación química y física en las proteínas. Sin embargo, se incluyen iones metálicos específicos en las formulaciones donde son co-factores a las proteínas y en formulaciones de suspensión de proteínas donde forman complejos de coordinación (por ejemplo, suspensión en zinc de insulina) . Recientemente, se ha propuesto el uso de iones de magnesio (10 - 120 mM) para inhibir la isomeri zación de ácido aspártico hacia ácido isoaspártico (WO 2004039337). Dos ejemplos donde los iones metálicos confieren estabilidad o actividad incrementada en las proteínas son desoxirribonucleosa humana (rhDNasa, PulmozymeMR) , y Factor VIII. En el caso de rhDNasa, los iones de Ca+2 (hasta 100 mM) incrementaron la estabilidad de la enzima a través de un sitio específico de unión (Chen B, et al., J. Pharm Sci., 88(4); 477-82 (1999)). En realidad, la remoción de iones de calcio de la solución con EGTA provocó un incremento en la desamidación y en la agregación. Sin embargo, este efecto se observó sólo con iones de Ca+2; se observó que otros cationes divalentes Mg+2, Mn+2 y Zn+2 desestabilizan rhDNasa. Se observaron efectos similares en el Factor VIII. Los iones de Ca+2 y Sr+2 estabilizaron una proteína en tanto que otros tal como Mg+2, Mn+2 y Zn+2, Cu+2 y Fe+2 desestabilizaron la enzima (Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). En un estudio separado con el Factor VIII, se observó un incremento significativo en la proporción de agregación en la presencia de iones de Al+3 (Derrick TS, et al., J. Pharm. Sci., 93(10); 2549-57 (2004)). Los autores señalan que frecuentemente se contaminan los otros excipientes tal como sales amortiguadoras con iones de Al+3 e ilustran la necesidad de usar excipientes de calidad apropiada en productos formulados.
Conservadores Los conservadores son necesarios cuando se desarrollan formulaciones parenterales de múltiples usos que comprenden más que una extracción del mismo recipiente. Su función primaria es inhibir el crecimiento microbiano y asegurar la esterilidad del producto a todo lo largo de la vida en anaquel o el término de uso del producto de fármaco. Los conservadores comúnmente usados incluyen alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Aunque los conservadores tienen una historia prolongada de uso, puede ser desafiante el desarrollo de formulaciones de proteína que incluyan conservadores. Los conservadores casi siempre tienen un efecto desestabilizador (agregación) en las proteínas, y esto ha llegado ser un factor principal en la limitación de su uso en las formulaciones de proteína de múltiples dosis (Roy S, et al., J Pharm Sci., 94(2); 382-96 (2005)). A la fecha, se han formulado muchos fármacos de proteína para únicamente uso único. Sin embargo, cuando son posibles formulaciones de múltiples dosis, tiene la ventaja adicional de permitir conveniencia del paciente, y comerciabilidad incrementada. Un buen ejemplo es aquel de la hormona de crecimiento humana (hGH) donde el desarrollo de formulas conservadas ha conducido a comercialización de presentaciones de inyección de múltiples usos, convenientes. Al menos cuatro de estos dispositivos que contienen formulaciones conservadas de hGH actualmente están disponibles en el mercado. NorditropinMR (liquido, Novo Nordisk) , Nutropin AQMR (liquido, Genentech) y Genotropin (liofilizado - cartucho de cámara dual, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol en tanto que SomatropeMR (Eli Lilly) se formula con m-cfresol. Se deben considerar varios aspectos durante el desarrollo de formulación de formas de dosis conservadas. La concentración efectiva de conservador en el producto de fármaco se debe optimizar. Esto requiere probar un conservador determinado en la forma de dosis con intervalos de concentración que confieren efectividad anti-microbiana sin comprometer la estabilidad de la proteina. Por ejemplo, se seleccionaron exitosamente tres conservadores en el desarrollo de una formulación liquida para receptor de interleucina-1 (Tipo I), usando calorimetría de exploración diferencial (DSC). Los conservadores se ordenaron por clasificación en base a su impacto en la estabilidad en concentraciones comúnmente usadas en productos comercializados (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).
Como se debe esperar, el desarrollo de formulaciones líquidas que contienen conservadores es más desafiante que las formulaciones liofilizadas . Se pueden liofilizar los productos secados por congelación sin el conservador y reconstituir con un diluyente que contiene el conservador en el momento del uso. Esto acorta el tiempo para el cual un conservador está en contacto con la proteína, reduciendo de esta manea significativamente al mínimo los riesgos asociados de estabilidad. Con formulaciones líquidas. La efectividad y estabilidad del conservador tiene que ser mantenida durante la vida completa en anaquel (~18 - 24 meses del producto) . Un punto importante para señalar es que la efectividad del conservador tiene que ser demostrada en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes y excipientes . Algunos conservadores pueden provocar reacciones en el sitio de inyección, que es otro factor que necesita consideración cuando se elige un conservador. En ensayos clínicos que se enfocaron en la evaluación de conservadores y amortiguadores en Norditropin, se observó que la percepción de dolor es menor de formulaciones que contienen fenol y alcohol bencílico en comparación a formulaciones que contienen m-cresol (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-104 (2004)). De manera interesante, entre el conservador más comúnmente usado, el alcohol bencílico posee propiedades anestésicas (Minogue SC. y Sun DA., Anesth Analog., 100(3): 683-6 (2005)). Dadas las enseñanzas y guias proporcionadas en la presente, los expertos en la técnica conocerán qué cantidad o intervalo de excipiente se puede incluir en cualquier formulación particular para lograr una formulación biofarmacéutica de la invención que promueva la retención en la estabilidad del producto biofarmacéutico . Por ejemplo, la cantidad y kit de una sal que se va a incluir en una formulación biofarmacéutica del a invención se puede seleccionar en base a la osmoralidad deseada (es decir, isotónico, hipotónico o hipertónico) de la solución final asi como las cantidades y osmoralidad de otros componentes que se van a incluir en la formulación. De manera similar, por ej emplificación con referencia al tipo de poliol o azúcar incluido en una formulación, la cantidad de este excipiente dependerá de su osmoralidad. A manera de ejemplo, la inclusión de aproximadamente 5 % del sorbitol puede lograr isotonicidad en tanto que se necesitan aproximadamente 9 % de un excipiente de sacarosa para lograr isotonicidad. La selección de la cantidad o intervalo de concentraciones de uno o más excipientes que se pueden incluir dentro de una formulación biofarmacéutica de la invención se ha ejemplificado anteriormente con referencia a sales, polioles y azúcares. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica entenderán que las consideraciones descritas en la presente y ejemplificadas adicionalmente por referencia a excipientes específicos son igualmente aplicables a todos los tipos y combinaciones de excipientes que incluyen, por ejemplo, sales, aminoácidos, otros agentes de tonicidad, agentes tensioactivos , estabilizadores, agentes de volumen, crioprotectores , lioprotectores , anti-oxidantes , iones metálicos, agentes quelantes y/o conservadores. Adicionalmente, donde se reporte un excipiente particular en una formulación por ejemplo por porciento (%) p/v, aquellos expertos en la técnica reconocerán que también se contempla la concentración molar equivalente de ese excipiente . Por supuesto, una persona con habilidad ordinaria en la técnica reconocerá que la concentración de los excipientes mencionados anteriormente comparte una interdependencia dentro de una formulación particular. A manear de ejemplo, la concentración de un agente de volumen se puede disminuir donde, por ejemplo, hay una alta concentración de proteína/péptido o donde, por ejemplo, hay una alta concentración de agente estabilizador. Además, una persona experta en la técnica reconocerá que, a fin de mantener la isotonicidad de una formulación particular en la cual no hay agente de volumen, la concentración de un agente estabilizador se ajustará por consiguiente (es decir, una cantidad "tonificante" del estabilizador se usará) .
Las composiciones son estables durante al menos dos años de 2o a 8°C en el estado liofilizado. Esta estabilidad a largo plazo es benéfica para prolongar la vida en anaquel del producto farmacéutico.
Métodos de Preparación La presente invención contempla además métodos para la preparación de formulación de proteínas terapéuticas. En un aspecto, los métodos para preparar una formulación de pepticuerpo terapéutico liofilizado que comprende el paso de liofilizar una composición de pepticuerpo terapéutico en un amortiguador que comprende un agente amortiguador, un agente de volumen, un agente estabilizador y un agente tensioact ivo . Los presentes métodos comprenden además uno o más de los siguientes pasos: adicionar un agente estabilizador a la mezcla antes de la liofilización, adicionar al menos un agente seleccionado de un agente de volumen, un agente regulador de osmoralidad, y un agente tensioactivo a la mezcla antes de la liofili zación . El agente de volumen puede ser cualquier agente de volumen descrito en la presente. En un aspecto, el agente de volumen es manitol. En otra modalidad, el agente estabilizador es sacarosa. El agente tensioactivo puede ser cualquier agente tensioactivo descrito en la presente. En una modalidad, el agente tensioactivo es polisorbato 20. La práctica de reconstitución normal para material liofilizado es adicionar un volumen de agua pura o agua estéril para inyección (WFI) (típicamente equivalente al volumen removido durante la liofilización) , aunque algunas veces se usan soluciones diluidas de agentes antibacterianos en la producción de productos farmacéuticos para administración parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Por consiguiente, se proporcionan métodos para la preparación de pepticuerpos terapéuticos reconstituidos que comprende el paso de adicionar un diluyente a una composición liofilizada de pepticuerpo terapéutico de la invención. La composición liofilizada de pepticuerpo terapéutico se puede reconstituir como una solución acuosa. Una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua estéril para inyección, agua con conservadores para uso de múltiples dosis, o agua con las cantidades apropiadas de agentes tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 20), solución salina al 0.4 %, glicina al 0.3 %, o suspensiones acuosas pueden contener el compuesto activo en mezcla con excipientes adecuados para la elaboración de suspensiones acuosas. En varios aspectos, estos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa , alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; agentes dispersantes o humectantes pueden ser una fosfatida que se presenta de manera natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilonooxicetanol , o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxitel-sorbitol , o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol. Por ejemplo, monooleato de polioxietilen-sorbitan . Las suspensiones acuosas pueden contener también uno o más conservadores, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo. Para administrar las composiciones a humanos o animales de prueba, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Las frases "farmacéuticamente" o "farmacológicamente aceptables" se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhibe la degradación de proteínas tal como agregación y productos de escisión, y además no producen reacciones alérgicas, u otras reacciones alérgicas cuando se administran usando rutas bien conocidas en la técnica, como se describen más adelante. Los "portadores farmacéuticamente aceptables" incluyen cualquiera y todos ' los solventes clínicamente útiles, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales , agentes de retraso de absorción e isotónicos y similares, incluyendo aquellos agentes descritos anteriormente. Las composiciones de pepticuerpo terapéutico se pueden administrar de manera oral, de forma tópica, de manera transdérmica , parenteralmente , por aspersión de inhalación, de forma vaginal, de manera rectal o por inyección intracraneal. El término parenteral como se usa en la presente incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal , o técnicas de infusión. Se contempla también la administración por inyección intravenosa, intradérmica , intramuscular, intramamaria , intraperitoneal , intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implante quirúrgico en un sitio particular. En general, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, asi como otras impurezas que pueden ser perjudiciales al receptor. Se pueden llevar a cabo administraciones individuales o múltiples de las composiciones con los niveles de dosis y el patrón, que se seleccionan por el médico que trata. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, como se define anteriormente, de la severidad y del curso de la enfermedad, si el fármaco se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia anterior, historia clínica del paciente y respuesta al fármaco, y la discreción del médico que atiende.
Kits Como un aspecto adicional, la invención incluye kits que comprenden uno o más compuestos o composiciones liofilizadas envasadas de una manera que facilita su uso para administración a sujetos. En una modalidad, este kit incluye un compuesto o composición descrita en la presente (por ejemplo, una composición que comprende una proteina o péptido terapéutico) , envasado en un recipiente tal como una botella o recipiente sellado, con una marca fijada al recipiente o incluida en el envase que describe el uso del compuesto o composición en la práctica del método. En una modalidad, el kit contiene un primer recipiente que tiene una composición liofilizada de proteina o péptido terapéutico y un segundo recipiente que tiene una solución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición liofilizada. En un aspecto, el compuesto o composición se envasa en una forma de dosis unitaria. El kit puede incluir además un dispositivo adecuado para administrar la composición de acuerdo a una ruta especifica de administración. De manera preferente, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de la composición de proteina o péptido terapéutico.
Dosis El régimen de dosis comprendido en un método para tratar una condición descrita en la presente se determinará por el médico que atiende, considerando varios factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la edad, condición, peso corporal, género y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. En varios aspectos, el régimen diario está en el intervalo de 0.1 - 1000 µg de una preparación por kilogramo de peso corporal (calculando la masa de la proteína sola, sin modificación química) o de 0.1-150 µg/kg. En algunas modalidades de la invención, la dosis puede exceder 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg. Las preparaciones de la invención se pueden administrar por un bolo inicial seguido por una infusión continua para mantener niveles terapéuticos en circulación del producto de fármaco. Como otro ejemplo, el compuesto inventivo se puede administrar como una dosis de una sola vez. Aquellos expertos en la técnica optimizarán fácilmente las dosis efectivas y los regímenes de administración como se determina por la buena práctica médica y la condición clínica del paciente individual. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y de la ruta de administración. La formulación farmacéutica óptima se determinará por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y de la ruta deseada. Ver, por ejemplo Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, la descripción de la cual se incorpora de este modo como referencia. Estas formulaciones pueden incluir el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de depuración in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la ruta de administración, se puede calcular una dosis adecuada de acuerdo al peso corporal, área superficial de cuerpo o tamaño de órgano. La refinación adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosis apropiada para el tratamiento que comprende cada una de las formulaciones mencionadas anteriormente, se hace por rutina por aquellos expertos en la técnica, sin experimentación indebida, especialmente en vista de la información de dosis y de los ensayos descritos en la presente, así como de los datos farmacocinéticos observados en los ensayos clínicos humanos analizados anteriormente. Se pueden determinar las dosis apropiadas a través del uso de ensayos establecidos para determinar las dosis del nivel sanguíneo en unión con datos apropiados de dosis-respuesta. El régimen final de dosis se determinará por el médico que atiende, considerando varios factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, la severidad del daño y la sensibilidad del paciente, la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. Conforme se lleven a cabo estudios, emergerá información adicional con respecto a los niveles apropiados de dosis y con respecto a la duración del tratamiento para las varias enfermedades y condiciones.
Estructura de los compuestos En General. En las preparaciones de acuerdo con la invención, se une un péptido a un vehículo a través del N-término del péptido, el C-término del péptido o ambos, y la estructura resultante se puede modificar adicionalmente con un W'SP covalentemente unido que se une a la porción de vehículo en el producto de vehículo-péptido . De esta manera, las moléculas de pepticuerpo terapéutico de esta invención se pueden describir con la siguiente fórmula I: en donde: F1 es un vehículo; X1 se selecciona de ?2-{L3)f-P1-{L2)e- P3- (L )g-P2- (L3) f-P1- (L2)e- y P4- (L5) h-P3- (L4) g-P2- (L3) f-P1- (L2) e- X2 se selecciona de: - (L2),,-?1, - (L2) e-P1- (L3) f-P2- (L4) g-P3- (L5) h-P4 en donde P1, P2, P3 y P4 son cada uno secuencias independientes de péptidos farmacológicamente activos; L1, L2, L3, L4 y L5 son cada uno independientemente fij adores ; a, b, c, e, f, g y h son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición que al menos uno de a y b es 1; d es 0, l o mayor que 1; y SP es un polímero soluble en agua, la unión del cual se efectúa en cualquier porción reactiva en F1. El compuesto 1 comprende compuestos de las fórmulas II [X1-F1] - (L1) c-WSPd incluyendo multímeros de los mismos, en donde F1 es un dominio Fe y se une en ¦ el C-término de X1, y se unen uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1; III [ F1-X2] - (L1) c-WSPd incluyendo multímeros del mismo, en donde F1 es un dominio Fe y se une en el N-término de X2, y se unen uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1; IV [F1- (L1) c-P1] - (L1) c-WSPd incluyendo multimeros del mismo, en donde F1 es un dominio Fe y se une en el N-término de -(L1)c-P1/ y se unen uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1; V [F1- (L1) c-P1- (L2) f-P2] - (L1) c-WSPd incluyendo multimeros del mismo, en donde F1 es un dominio Fe y se une en el N-término de -L1-P1-L2-P2 y se unen uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. En una modalidad, F1 es una modalidad Fe y se une ya sea al N-término o C-término de un péptido. En una modalidad relacionada, el Fe se enlaza en una forma dimérica como se describe en la presente a la cual se unen dos (o más) péptidos. Los péptidos pueden ser homodiméricos (es decir, la misma secuencia de aminoácidos), o heterodinámicos (es decir, diferentes secuencias de aminoácidos que se unen al mismo objetivo o que se unen a diferentes objetivos). En otra modalidad, se proporcionan asas de Fe que comprenden un péptido (s) . Las asas de Fe que comprenden un péptido (s) se preparan en un proceso en el cual se incorpora al menos un péptido biológicamente activo como una secuencia interna en un dominio Fe. Esta secuencia interna se puede adicionar por inserción (es decir, entre aminoácidos en el dominio Fe anteriormente existente) o por reemplazo de aminoácidos en el dominio Fe anteriormente existente (es decir, removiendo aminoácidos en el dominio Fe anteriormente existente y adicionando aminoácidos peptidicos). En este último caso, el número de aminoácidos peptidicos adicionados no necesita corresponder al número de aminoácidos removidos del dominio Fe anteriormente existente. Por ejemplo, en un aspecto, se proporciona una molécula en la cual se remueven 10 aminoácidos y se adicionan 15 aminoácidos. Los compuestos farmacológicamente activos, proporcionados, se preparan por un proceso que comprende: a) seleccionar al menos un péptido que modula la actividad de una proteina de interés; b) preparar un agente farmacológico que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido seleccionado como una secuencia interna de un dominio Fe. Este proceso se puede emplear para modificar un dominio Fe que está ya enlazado a través de un N- o C-término o cadena lateral a un péptido, por ejemplo, como se describe en las solicitudes de Patentes de los Estados Unidos Nos. 2003/0195156, 2003/0176352, 2003/0229023 y 2003/0236193, y las publicaciones internacionales Nos. WO 00/24770 y WO 04/026329. El proceso descrito en la publicación de solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US2006/0140934 también se puede emplear para modificar un dominio FC que es parte de un anticuerpo. De esta manera, se pueden producir diferentes moléculas que tienen funcionalidades adicionales, tal como un dominio de unión a un diferente epitopo o un dominio de unión adicional al epitopo existente de la molécula precursora. Las moléculas que comprenden una secuencia peptidica interna también ser refieren como "pepticuerpos internos de Fe" ó "moléculas peptidicas internas de Fe". Las moléculas peptidicas internas de Fe pueden incluir más de una secuencia peptidica en tándem en una región interna particular, y pueden incluir péptidos adicionales en otras regiones internas. En tanto que se prefieren las regiones asa putativas, también se consideran como parte de la invención las inserciones en cualesquiera de los otros dominios no terminales del Fe. También se abarcan por esta invención las variantes y derivados de los compuestos anteriores (descritos más adelante) . Los compuestos de esta invención se pueden preparar por métodos normales de síntesis, técnicas de ADN recombinante , o cualquier otro método para preparar péptidos y proteínas de fusión. Un uso contemplado para las moléculas peptidicas internas de Fe es como un producto terapéutico o un agente profiláctico. Un péptido seleccionado puede tener actividad comparable a o aún mayor que el ligando natural imitado por el péptido. Además, ciertos agentes terapéuticos basados en ligandos naturales pueden inducir anticuerpos contra el ligando endógeno propio del paciente. En contraste, la secuencia única del péptido enlazado a vehículo evita esta trampa al tener poca o típicamente ninguna identidad de secuencia con el ligando natural. Adicionalmente , los pepticuerpos internos de Fe pueden tener ventajas en el replegamiento y purificación con respecto a moléculas de Fe de N- o C-terminalmente enlazadas. Aun además, los pepticuerpos internos de Fe pueden ser más estables tanto de manera termodinámica, debido a la estabilización de los dominios quiméricos, como de manera química, debido a resistencia incrementada a la degradación proteolítica de las amino- y carboxi-peptidasas . Los pepticuerpos internos de Fe también pueden exhibir propiedades farmacocinéticas mejoradas. Péptidos . Se pueden usar varios péptidos en unión con la presente invención. De interés particular son los péptidos que imitan la actividad de EPO, TPO, hormona de crecimiento. G-CSF, GM-CSF, IL-lra, CTLA4 , TRAIL, TNF, VEGF, MMP, miostatina, integrina, OPG, OPG-1, NGF, TALL-1, compañeros de unión de Ang-2, TGF-a, y TGF-ß. También son de interés antagonistas peptídicos, particularmente aquellos antagonistas a la actividad de TNF, cualquiera de las interleucinas (IL-1, 2, 3, ...), y proteínas comprendidas en la activación del complemento (por ejemplo, C3b) . Los péptidos de selección de objetivo también son de interés, incluyendo péptidos buscadores de tumores, péptidos en transporte y membrana, y similares. Todas estas clases de péptidos se pueden excluir por los métodos descritos en las referencias citadas en esta especificación y en otras referencias. La visualización en fagos, en particular, es útil para generar péptidos para el uso en la presente invención. Se ha señalado que la selección por afinidad de bibliotecas de péptidos aleatorios se puede usar para identificar ligandos peptidicos para cualquier sitio de cualquier producto génico. Dedman et al. (1993) , J. Biol. Chem. 268: 23025-30. La vi s ua 1 i z a c i ón en fago es particularmente bien adecuada para identificar péptidos que se unen a estas proteínas de interés como receptores de superficie celular o cualquiera de las proteínas que tengan epitopos lineales. Wilson et al. (1998), Can. J. Microbiol. 44:313-29; Kay et al. (1997), Drug Disc. Today 3: 370-8. Estas proteínas se revisan de forma extensiva en Herz et al (1997), J. Receptor & Signal Transduction Res. 17(5): 671-776, que se incorpora de este modo como referencia. Estas proteínas de interés se prefieren para el uso en esta invención. A manera de ejemplo y no de limitación, se proporciona un grupo de péptidos que se unen a receptores de citocinas. Recientemente las citocinas se han clasificado de acuerdo a su código de receptor. Ver Inglot (1997) , Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 45: 353-7, que se incorpora de este modo como referencia. Entre estos receptores están los CKR (familia I en Tabla 3) . En la Tabla 3 aparece la clasificación de los receptores.
Tabla 3 - Receptores de Citocina Clasificados por Código de Receptor Citocinas (Ligandos ) Tipo de Receptor Familia Subfamilia Familia Subfamilia 1. Citocinas 1. IL-2, IL-4, 1. Citocina 1. yCr comheraatopoyéticas IL-7, IL-9, IL- R (CKR) partido, IL- 13, IL-15 9R, IL-4R 2. IL-3, IL-5, 2. GP 140 PR GM-CSF compartido 3. IL-6, IL-11, 3. RP 130 IL-12, LIF, compartido, OSM, CNTF, IL-6 R, Leptina (OB) Leptina R 4. G-CSF, EPO, 4. R "de TPO, PRL, GH cadena 5. IL-17, HVS- individual" , IL-17 GCSF-R, TPO- R, GH-R 5. Otro R2 II. Ligandos de IL-10, BCRF-1. II . IL-10 -R IL-10 HSV-IL-10 Citocinas (Ligandos ) Tipo de Receptor Familia Subfamilia Familia Subfamilia III . 1. IFN- l, a2, III . 1. IFNAR Interferones a4, m, t, IFN- Interferón- 2. IFNGR R ß3 2. IFN-? IV. IL-1 y 1. IL-la, IL- IV. 1L-IR 1. IL-1R, IL-ligandos tipo 1ß, IL-IRa lRAcP IL-1 2. IL-18R, 2. IL-18, IL- IL-18RAcP 18BP · V. Familia de 1. TNF- , TNF-ß 3. NGF/TNF TNF-RI, AGP- TNF (LT), FASL, R4 3R, DR4 , DR5 , CD40L, CD30L, OX40, OPG, CD27L, OX40L, TAC1, CD40, OPGL, TRAIL, FAS, ODR APRIL, AGP-3, BLys, TL5 , Ntn- 2 , KAY , Neutrocina-1 VI . Quimiocinas 1. a- 4. 1. CXCR quimiocinas : Quimiocina- R Citocinas (Ligandos ) Tipo de Receptor Familia Subfamilia Familia Subfamilia IL-8, GRO , ß, 2. CCR ?, IF-10, PF-4, 3. CR SDF-1 4. DARC5 2. ß quemocinas : ????a, ???ß, MCP- 1,2, 3,4, RANTES , eotaxina 3. ? quemocinas : linfotactina Citocinas (Ligandos ) Tipo de Receptor Familia Subfamilia Familia Subfamilia VII. Factores 1.1 SCF, M-CSF, VII. RKF 1. subfamilia de crecimiento PDGF-AA, AB, T BB, KDR, FLT-1 , 1.1 IgTK III FLT -3L, VEGF, R, VEGF-R1. SSV -PDGF, HGF, VEGF-RII SF 1.2 FGFa, FGFp 1.2 IgTK IV R 1.3 EGF, TGF- 1.3 TK-1 Rica a, VV-F19 en cisteina (tipo EGF) 1.4 TK-II 1.4 IGF-1 , IGF- Rica en 11, Insul ina cisteina , 1.5 NGF, BDNF, NT-3, NT- 46 IGF-R1 b 1.5 TK-V de 2. TGF-ß? ,ß2,ß3 punto de cisteina 2. Subfamilia de serina- treonina- cinasa (STKS) 7 1 IL-17R corresponde a familia de CKR pero está sin asignar a 4 sub-familias indicadas. 2 Otros subtipos de IFN tipo I permanecen no asignados. Citocinas hematopoyéticas , ligandos de IL-10 e interferones no poseen proteina-cinasas intrínsecas funcionales. Las moléculas de señalización para las citocinas son JAK, STAT y moléculas no receptores relacionadas. IL-14, IL-16 e IL-18 se han clonado de acuerdo al código de receptor y permanecen no asignadas . 3 Receptores de TNF usan múltiples moléculas intracelulares distintas para transducción de señales incluyendo "dominio muerte" de FAS-R y TNF-DR de 55kDa que participa en sus efectos citotóxicos. NGF/TNF-R puede unirse a NGF y factores relacionados así como a ligandos de TNF. Los receptores de quimiocina son siete receptores de dominio transmembrana (7T , serpentina) . Están acoplados a proteína G. 4 El antígeno de grupo sanguíneo Duffy (DARC) es un receptor de eritrocito que puede unirse a varias quimiocinas diferentes. IL-1R corresponde a la superfamilia de inmunoglobulinas pero sus características de eventos de transducción de señales permanecen no claras. 5 Las citocinas neurotróficas pueden asociarse también con receptores de NGF/TNF. 6 STKS puede abarcar muchos otros factores relacionados a TGF- ß que permanecen no asignados. Las proteinas-cinasas son parte intrínseca del dominio intracelular de la familia de cinasas de receptor (RKF) . Las enzimas participan en la transmisión de señales mediante los receptores. Otras proteínas de interés como objetivos para generación de péptidos en la presente invención incluyen lo siguiente : a?ß3 ?ß? Ang-2 B7 B7RP1 CRP1 Calcitonina CD28 CETP cMet Factor de complemento B C4b CTLA4 Glucagon Receptor de Glucagon LIPG MPL variantes de empalme de moléculas preferencialmente expresadas en células tumorales; por ejemplo, CD44, variantes no glicosiladas de CD30 de glicoproteinas de superficie de Lewis Y y mucina CD19, CD20, CD33, CD45. antigeno de membrana especifico de próstata y antigeno de células especificas de próstata. metaloproteinasas de matriz (MMP) , ambas segregadas y unidas a membranas (por ejemplo, M P-9) Catepsinas Receptor de TIE-2 heparanasa activador de plasminógeno de eurocinasa (UPA) , receptor de UPA hormona paratiroide (PTH), proteina relacionada a hormona paratiroide (PTHrP), PTH-RI, PTH-RII Her2 Her3 Insulina Miostatina TALL-1 Factor de crecimiento de nervio Integrinas y receptores Selectinas y receptores de los mismos Moléculas de Adhesión celular y receptores de las mismas .
Los péptidos de ejemplo aparecen en las Tablas 4 hasta 38 posteriores. Estos péptidos se pueden preparar por cualquiera de los métodos descritos en la técnica anterior, muchos de los cuales se analizan en la presente. El la mayoría de las tablas que siguen, se usan abreviaciones de aminoácidos de letra única. La "X" en estas secuencias (y a todo lo largo de esta especificación, a menos que se especifique de otro modo en una caso particular) significa que pueden estar presentes cualquiera de los 20 residuos de aminoácido que se presentan de manera natural. Cualquiera de estos péptidos se pueden enlazar en tándem (es decir, de manera secuencial) con o sin ligadores, y se proporcionan unos pocos ejemplos enlazados en tándem, en la tabla. Los ligadores se listan como "?" y pueden ser cualquiera de los ligadores descritos en la presente. Las repeticiones en tándem y los ligadores se muestran separados por iones por claridad. Cualquier péptido que contenga un residuo de cisteinilo se puede reticular con otro péptido que contiene Cys, cualquiera o ambos de los cuales se pueden enlazar a un vehículo. En la tabla se proporcionan unos pocos ejemplos reticulados. Cualquier péptido que tenga más de un residuo de Cys puede formar un enlace de disulfuro intra-peptídico, también; ver, por ejemplo, péptidos miméticos de EPO en la Tabla 5. En las tablas se especifican unos pocos ejemplos de péptidos unidos a disulfuro intrapeptídico . Cualquiera de estos pépitidos se puede derivatizar como se describe en la presente, y en la tabla se proporcionan unos pocos ejemplos derivatizados. Los péptidos derivatizados en las tablas son de ejemplo en lugar de ser limitantes, puesto que los péptidos no derivatizados asociados se pueden emplear en esta invención, también. Para derivados en los cuales el término carboxilo se pueda rematar con un grupo amino, el grupo amino de remate se muestra como -NH2. Para derivados en los cuales los residuos de aminoácido se sustituyen por porciones diferentes de residuos de aminoácido, las sustituciones "se denotan por el s, que significa cualquiera de las porciones descritas en Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9 y Cuthbertson et al. (1997), J. Med. Chem. 40: 2876-82, que se incorporan como referencia. El sustituyente J y los sustituyentes (Z5, ?6, ...Z4o) son como se definen en las Patentes de los Estados Unidos Números. 5,608,035; 5,786,331; y 5,880,096, que se incorporan como referencia. Para las secuencias EPO-miméticas (Tabla 5), los sustituyentes X2 hasta Xn y el número entero "n" son como se definen en la O 96/40772, que se incorporan como referencia. También para las secuencias EPO-miméticas , los sustituyentes Xna, Xia, *2a, *3a, X4a, Xsa y Xca siguen las definiciones Xn, Xi, X2, X3, X , X5, y C/ respectivamente, de WO 99/47151, que también se incorpora como referencia. Los sustituyentes "?", "T", y "+" son como se definen en Sparks et al. (1996), Proc. Nati. Acad. Sci . 93: 1540-4, que se incorpora de este modo como referencia. X 4 , X 5 , X6, y X7 se definen en la Patente de los Estados Unidos Número. 5,773,569, que se incorpora de este modo como referencia, excepto que: los péptidos de unión a integrina, Xi, X2, X3, X4, X 5 , ? ? , X7, y Xg son como se definen en las solicitudes Internacional O 95/14714, publicada el 01 de Junio de 1995 y WO 97/08203, publicada el 06 de Marzo de 1997, que también se incorporan como referencia; y para péptidos VI P-mimét icos , Xi, ??' , ? ? ' ' , X2, X3, X4, X5, ?d y Z y los números enteros m y n son como se definen en la WO 97/40070, publicada el 30 de Octubre de 1997, que también se incorpora como referencia. Xaa e Yaa más adelante son como se definen en la WO 98/09985, publicada el 12 de Marzo de 1998 , que se incorpora como referencia. ???, AA2 , ???, AB2, y AC son como se definen en la solicitud Internacional WO 98/53842, publicada el 03 de Diciembre de 1998, que se incorpora como referencia. X1, X2, X3 y X4 en la Tabla 17 sólo don como se definen en la solicitud Europea EP 0, 911,393, publicada el 28 de Abril de 1999. Los residuos que aparecen en negritas son D- ami noá c i do s . Todos los péptidos se enlazan a través de enlaces peptidicos a menos que se señale de otro modo. Las abreviaciones se listan al final de esta especificación. En la columna "SEQ ID NO", "NR" significa que no se requiere listado de secuencias para la secuencia dada.
Tabla 4.- Secuencias peptídicas de antagonista de IL-1 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: FEWTPGYWQJY 24 AcFEWTPGYWQJY 25 FEWTPaWYQJY 26 FEWTPSarWYQJY 27 FEWTPGYYQPY 28 FEWTPGWWQPY 29 FEWTPNYWQPY 30 FEWTPvYWQJY 31 FEWTPecGYWQJY 32 FEWTPAibYWQJY 33 FEWTSarGYWQJY 34 FEWTPGYWQPY 35 FEWTPGYWQHY 36 FEWTPGWYQJY 37 AcFEWTPGWYQJY 38 FEWTPGW-pY-QJY 39 FAWTPGYWQJY 40 FEWAPGYWQJY 41 FEWVPGYWQJY 42 FEWTPGYWQJY 43 AcFEWTPGYWQJY 44 FEWTPAWYQJY 45 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: FEWTPSarWYQJY 46 FEWTPGYYQPY 47 FEWTPGWWQPY 48 FEWTPNYWQPY 49 FEWTPVYWQJY 50 FE TPecGYWQJY 51 FEWTPAibYWQJY 52 FE TSarGYWQJY 53 FEWTPGYWQPYALPL 54 INapEWTPGYYQJY 55 YEWTPGYYQJY 56 FEWVPGYYQJY 57 FEWTPSYYQJY 58 FEWTPNYYQJY 59 TKPR 60 RKSSK 61 RKQDK 62 NRKQDK 63 RKQDKR 64 ENRKQDKRF 65 VTKFYF 66 VTKFY 67 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: VTDFY 68 SHLYWQPYSVQ 69 TLVYWQPYSLQT 70 RGDYWQPYSVQS 71 VHVYWQPYSVQT 72 RLVYWQPYSVQT 73 SRVWFQPYSLQS 74 NMVYWQPYSIQT 75 SVVFWQPYSVQT 76 TFVY QPYALPL 77 TLVY QPYSIQR 78 RLVYWQPYSVQR 79 SPVFWQPYSIQI 80 WIEWWQPYSVQS 81 SLIYWQPYSLQM 82 TRLYWQPYSVQR 83 RCDYWQPYSVQT 84 MRVFWQPYSVQN 85 KIVYWQPYSVQT 86 RHLYWQPYSVQR 87 ALVWWQPYSEQI 88 SRVWFQPYSLQS 89 SEQ ID . Secuencia/Estructura NO: EQPYALPLE 90 QLVWWQPYSVQR 91 DLRYWQPYSVQV 92 ELVWWQPYSLQL 93 DLVWWQPYSVQW 94 NGNYWQPYSFQV 95 ELVYWQPYSIQR 96 ELMYWQPYSVQE 97 NLLY QPYSMQD 98 GYEWYQPYSVQR 99 SRV YQPYSVQR 100 LSEQYQPYSVQR 101 GGGWWQPYSVQR 102 VGRWYQPYSVQR 103 VHVYWQPYSVQR 104 QARWYQPYSVQR 105 VHVYWQPYSVQT 106 RSVYWQPYSVQR 107 TRVWFQPYSVQR 108 GRIWFQPYSVQR 109 GRVWFQPYSVQR 110 ARTWYQPYSVQR 111 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: ARVWWQPYSVQM 112 RLMFYQPYSVQR 113 ESMWYQPYSVQR 114 HFGWWQPYSVHM 115 ARFWWQPYSVQR 116 RLVY Q PYAPIY 117 RLVYWQ PYSYQT 118 RLVYWQ PYSLPI 119 RLVYWQ PYSVQA 120 SRVWYQ PYAKGL 121 SRVWYQ PYAQGL 122 SRVWYQ PYAMPL 123 SRVWYQ PYSVQA 124 SRVWYQ PYSLGL 125 SRVWYQ PYAREL 126 SRVWYQ PYSRQP 127 SRVWYQ' PYFVQP 128 EYEWYQ PYALPL 129 IPEYWQ PYALPL 130 SRIWWQ PYALPL 131 DPLFWQ PYALPL 132 SRQWVQ PYALPL 133 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: IRSWWQ PYALPL 134 RGYWQ PYALPL 135 RLLWVQ PYALPL 136 EYRWFQ PYALPL 137 DAY VQ PYALPL 138 SGYFQ PYALPL 139 NIEFWQ PYALPL 140 TRD VQ PYALPL 141 DSS YQ PYALPL 142 IGNWYQ PYALPL 143 NLRWDQ PYALPL 144 LPEFWQ PYALPL 145 DSY Q PYALPL 146 RSQYYQ PYALPL 147 ARFWLQ PYALPL 148 NSYFWQ PYALPL 149 RFMYWQPYSVQR 150 AHLFWQPYSVQR 151 WWQPYALPL 152 YYQPYALPL 153 YFQPYALGL 154 YWYQPYALPL 155 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: RWWQPYATPL 156 GWYQPYALGF 157 YWYQPYALGL 158 IWYQPYAMPL 159 SNMQPYQRLS 160 TFVYWQPY AVGLPAAETACN 161 TFVYWQPY SVQMTITGKVTM 162 TFVYWQPY SSHXXVPXGFPL 163 TFVYWQPY YGNPQWAIHVRH 164 TFVYWQPY VLLELPEGAVRA 165 TFVYWQPY VDYVWPIPIAQV 166 GWYQPYVDGWR 167 RWEQPYVKDGWS 168 EWYQPYALGWAR 169 GWWQPYARGL 170 LFEQPYAKALGL 171 GWEQPYARGLAG 172 AWVQPYATPLDE 173 MWYQPYSSQPAE 174 GWTQPYSQQGEV 175 DWFQPYSIQSDE 176 PWIQPYARGFG 177 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: RPLYWQPYSVQV 178 TLIYWQPYSVQI 179 RFDYWQPYSDQT 180 WHQFVQPYALPL 181 EWDS VYWQPYSVQ TLLR 182 WEQN VYWQPYSVQ SFAD 183 SDV VYWQPYSVQ SLEM 184 YYDG VYWQPYSVQ VMP A 185 SDIWYQ PYALPL 186 QRIWWQ PYALPL 187 SRIWWQ PYALPL 188 RSLYWQ PYALPL 189 TIIWEQ PYALPL 190 WETWYQ PYALPL 191 SYDWEQ PYALPL 192 SRIWCQ PYALPL 193 EIMFWQ PYALPL 194 DYVWQQ PYALPL 195 MDLLVQ WYQPYALPL 196 GSKVIL WYQPYALPL 197 RQGANI WYQPYALPL 198 GGGDEP WYQPYALPL 199 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: SQLERT WYQPYALPL 200 ETWVRE WYQPYALPL 201 KKGSTQ WYQPYALPL 202 LQARMN WYQPYALPL 203 EPRSQK WYQPYALPL 204 VKQKWR WYQPYALPL 205 LRRHDV WYQPYALPL 206 RSTASI WYQPYALPL 207 ESKEDQ WYQPYALPL 208 EGLTMK WYQPYALPL 209 EGSREG WYQPYALPL 210 VIEWWQ PYALPL 211 VWYWEQ PYALPL 212 ASEWWQ PYALPL 213 FYEWWQ PYALPL 214 EGWWVQ PYALPL 215 WGEWLQ PYALPL 216 DYVWEQ PYALPL 217 AHTWWQ PYALPL 218 FIEWFQ PYALPL 219 WLAWEQ PYALPL 220 VMEWWQ PYALPL 221 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: ERMWQ PYALPL 222 NXXWXX PYALPL 223 WGNWYQ PYALPL 224 TLYWEQ PYALPL 225 VWRWEQ PYALPL 226 LLWTQ PYALPL 227 SRIWXX PYALPL 228 SDIWYQ PYALPL 229 WGYYXX PYALPL 230 TSGWYQ PYALPL 231 VHPYXX PYALPL 232 EHSYFQ PYALPL 233 XXIWYQ PYALPL 234 AQLHSQ PYALPL 235 WANWFQ PYALPL 236 SRLYSQ PYALPL 237 GVTFSQ PYALPL 238 SIVWSQ PYALPL 239 SRDLVQ PYALPL 240 HWGH VYWQPYSVQ DDLG 241 SWHS VYWQPYSVQ SVPE 242 WRDS VYWQPYSVQ PESA 243 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: TWDA VYWQPYSVQ KWLD 244 TPPW VYWQPYSVQ SLDP 245 YWSS VYWQPYSVQ SVHS 246 YWY QPY ALGL 247 YWY QPY ALPL 248 EWI QPY ATGL 249 NWE QPY AKPL 250 AFY QPY ALPL 251 FLY QPY ALPL 252 VCK QPY LEWC 253 ETPFTWEESNAYYWQPYALPL 254 QGWLTWQDSVDMYWQPYALPL 255 FSEAGYTWPENTYWQPYALPL 256 TESPGGLDWAKIYWQPYALPL 257 DGYDRWRQSGERYWQPYALPL 258 TANVSSFEWTPGYWQPYAL L 259 SVGEDHNFWTSE YWQPYALPL 260 MNDQTSEVSTFP YWQPYALPL 261 SWSEAFEQPRNL YWQPYALPL 262 QYAEPSALNDWG YWQPYALPL 263 NGDWATADWSNY YWQPYALPL 264 THDEHI YWQPYALPL 265 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: MLEKTYTTWTPG YWQPYALPL 266 WSDPLTRDADL YWQPYALPL 267 SDAFTTQDSQAM YWQPYALPL 268 GDDAAWRTDSLT YWQPYALPL 269 AI IRQLYRWSEM YWQPYALPL 270 ENTYSPNWADSM YWQPYALPL 271 MNDQTSEVSTFP YWQPYALPL 272 SVGEDHNFWTSE YWQPYALPL 273 QTPFTWEESNAY YWQPYALPL 274 ENPFTWQESNAY YWQPYALPL 275 VTPFTWEDSNVF YWQPYALPL 276 QIPFTWEQSNAY YWQPYALPL 277 QAPLTWQESAAY YWQPYALPL 278 EPTFTWEESKAT YWQPYALPL 279 TTTLTWEESNAY YWQPYALPL 280 ESPLTWEESSAL YWQPYALPL 281 ETPLTWEESNAY YWQPYALPL 282 EATFTWAESNAY YWQPYALPL 283 EALFTWKESTAY YWQPYALPL 284 STP-TWEESNAY YWQPYALPL 285 ETPFTWEESNAY YWQPYALPL 286 KAPFTWEESQAY YWQPYALPL 287 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: STSFTWEESNAY YWQPYALPL 288 DSTFTWEESNAY YWQPYALPL 289 YIPFTWEESNAY YWQPYALPL 290 QTAFTWEESNAY YWQPYALPL 291 ETLFTWEESNAT YWQPYALPL 292 VSSFTWEESNAY YWQPYALPL 293 QPYALPL 294 Py-l-NapPYQJYALPL 295 TANVSSFEWTPG YWQPYALPL 296 FEWTPGYWQPYALPL 297 FEWTPGYWQJYALPL 298 FEWTPGYYQJYALPL 299 ETPFTWEESNAYYWQPYALPL 300 FTWEESNAYYWQJYALPL 301 ADVL YWQPYA PVTLWV 302 GDVAE YWQPYA LPLTSL 303 SWTDYG YWQPYA LPISGL 304 FEWTPGYWQPYALPL 305 FEWTPGYWQJYALPL 306 FEWTPGWYQPYALPL 307 FEWTPGWYQJYALPL 308 FEWTPGYYQPYALPL 309 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: FEWTPGYYQJYALPL 310 TANVSSFEWTPGYWQPYALPL 311 SWTDYGYWQPYALPISGL 312 ETPFTWEESNAYYWQPYALPL 313 ENTYSPNWADSMYWQPYALPL 314 SVGEDHNFWTSEYWQPYALPL 315 DGYDRWRQSGERYWQPYALPL 316 FEWTPGYWQPYALPL 317 FEWTPGYWQPY 318 FEWTPGYWQJY 319 EWTPGYWQPY 320 FEWTPGWYQJY 321 AEWTPGYWQJY 322 FAWTPGYWQJY 323 FEATPGYWQJY 324 FEWAPGYWQJY 325 FEWTAGYWQJY 326 FEWTPAYWQJY 327 FEWTPGAWQJY 328 FEWTPGYAQJY 329 FEWTPGYWQJA 330 FEWTGGYWQJY 331 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: FEWTPGYWQJY 332 FEWTJGYWQJY 333 FEWTPecGY QJY 334 FEWTPAibYWQJY 335 FEWTPSarWYQJY 336 FEWTSarGYWQJY • 337 FEWTPNYWQJY 338 FEWTPVYWQJY 339 FEWTVPYWQJY 340 AcFE TPGWYQJY 341 AcFEWTPGYWQJY 342 INap-EWTPGYYQJY 343 YEWTPGYYQJY 344 FEWVPGYYQJY 345 FEWTPGYYQJY 346 FEWTPsYYQJY 347 FEWTPnYYQJY 348 SHLY-Nap-QPYSVQM 349 TLVY-Nap-QPYSLQT 350 RGDY-Nap-QPYSVQS 351 NMVY-Nap-QPYSIQT 352 VYWQPYSVQ 353 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: VY-Nap-QPYSVQ 354 TFVYWQJYALPL 355 FEWTPGYYQJ-Bpa 356 XaaFEWTPGYYQJ-Bpa 357 FEWTPGY-Bpa-QJY 358 AcFE TPGY-Bpa-QJY 359 FEWTPG-Bpa-YQJY 360 AcFEWTPG-Bpa-YQJY 361 AcFE-Bpa-TPGYYQJY 362 AcFE-Bpa-TPGYYQJY 363 Bpa-EWTPGYYQJY 364 AcBpa-EWTPGYYQJY 365 VYWQPYSVQ 366 RLVYWQPYSVQR 367 RLVY-Nap-QPYSVQR 368 RLDY QPYSVQR 369 RLVWFQPYSVQR 370 RLVYWQPYSIQR 371 DNSSWYDSFLL 372 DNTAWYESFLA 373 DNTA YENFLL 374 PARE DNTA YDSFLI C 375 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: TSEY DNTTWYEKFLA SQ 376 SQIP DNTA YQSFLL HG 377 SPFI DNTAWYENFLL TY 378 EQIY DNTAWYDHFLL SY 379 TPFI DNTAWYENFLL TY 380 TYTY DNTAWYERFLM SY 381 TMTQ DNTAWYENFLL SY 382 TI DNTAWYANLVQ TYPQ 383 TI DNTAWYERFLA QVPD 384 HI DNTAWYENFLL TYTP 385 SQ DNTAWYENFLL SYKA 386 QI DNTAWYERFLL QYNA 387 NQ DNTAWYESFLL QYNT 388 TI DNTAWYENFLL NHNL 389 HY DNTAWYERFLQ QGWH 390 ETPFTWEESNAYYWQPYALPL 391 YIPFTWEESNAYYWQPYALPL 392 DGYDRWRQSGERYWQPYALPL 393 pY-INap-pY-QJYALPL 394 TANVSSFEWTPGYWQPYALPL 395 FEWTPGYWQJYALPL 396 FEWTPGYWQPYALPLSD 397 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: FEWTPGYYQJYALPL 398 FE TPGYWQJY 399 AcFEWTPGY QJY 400 AcFEWTPGWYQJY 401 AcFEWTPGYYQJY 402 AcFEWTPaY QJY 403 AcFEWTPaWYQJY 404 AcFEWTPaYYQJY 405 FEWTPGYYQJYALPL 406 FEWTPGYWQJYALPL 407 FEWTPGWYQJYALPL 408 TANVSSFEWTPGYWQPYALPL 409 AcFEWTPGYWQJY 410 AcFEWTPGWYQJY 411 AcFEWTPGYYQJY 412 ACFEWTPAYWQJY 413 AcFEWTPAWYQJY 414 ACFEWTPAYYQJY 415 Secuencias peptidicas EPO-miméticas SEQ ID Secuencia/Estructura NO: GGVYACRMGPITWVCSPLGG 449 VGNYMAHMGPITWVCRPGG 450 GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 451 GGLYACHMGPMT VCQPLRG 452 TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 453 YSCHFGPLTWVCK 454 YCHFGPLTWVC 455 SCHFGPLTWVCK 456 (AX2) n 3 4 5GPX6TWX7X8 457 XnCXiX2GWVGX3CX4X5 Xc 458 Tabla 6.- Secuencias peptldicas TPO-miméticas SEQ ID Secuencia/Estructura NO: IEGPTLRQ LAARA 459 IEGPTLRQWLAAKA 460 IEGPTLREWLAARA 461 IEGPTLRQWLAARA-A-IEGPTLRQWLAARA 462 IEGPTLRQWLAAKA-?-IEGPTLRQWLAAKA 463 IEGPTLRQCLAARA-A-IEGPTLRQCLAARA 464 i l IEGPTLRQWLAARA-?-? (BrAc) -?-IEGPTLRQWLAARA 465 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: IEGPTLRQWLAARA-?-? (PEG) -A- IEGPTLRQWLAARA 466 IEGPTLRQCLAARA-A-IEGPTLRQWLAARA 467 1 IEGPTLRQCLAARA-?-IEGPTLRQWLAARA IEGPTLRQWLAARA-A-IEGPTLRQCLAARA 468 1 IEGPTLRQWLAARA-A-IEGPTLRQCLAARA VRDQIXXXL 469 TLREWL 470 GRVRDQVAGW 471 GRVKDQIAQL 472 GVRDQVSWAL 473 ESVREQVMKY 474 SVRSQISASL 475 GVRETVYRHM 476 GVREVIVMHML 477 GRVRDQIWAAL 478 AGYRDQILIWL 479 GRVRDQIMLSL 480 GRVRDQI (X) 3L 481 CTLRQWLQGC 482 CTLQEFLEGC 483 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: CTRTEWLHGC 484 CTLRE LHGGFC 485 CTLREWVFAGLC 486 CTLRQWLILLGMC 487 CTLAEFLASGVEQC 488 CSLQEFLSHGGYVC 489 CTLREFLDPTTAVC 490 CTLKEWLVSHEVWC 491 CTLREWL (X) 2-6C 492 REGPTLRQWM 493 EGPTLRQWLA 494 ERGPFWAKAC 495 REGPRCV WM 496 CGTEGPTLST LDC 497 CEQDGPTLLEWLKC 498 CELVGPSLMSWLTC 499 CLTGPFVTQWLYEC 500 CRAGPTLLEWLTLC 501 CADGPTLREWISFC 502 C (X) i-2EGPTLRE L (X) i_2C 503 GGCTLREWLHGGFCGG 504 GGCADGPTLREWISFCGG 505 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: GNADGPTLRQWLEGRRPKN 506 LAIEGPTLRQWLHGNGRDT 507 HGRVGPTLREWKTQVATKK 508 TIKGPTLRQ LKSREHTS 509 ISDGPTLKE LSVTRGAS 510 SIEGPTLRE LTSRTPHS 511 Tabla 7.- Secuencias peptídicas G-CSF-miméticas SEQ ID Secuencia/Estructura NO: EEDCK 512 EEDCK 513 EEDCK EEDaK 514 EEDaK 515 EEDaK pGluEDaK 516 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: pGluEDoK 517 pGluEDaK PicSDaK 518 PicSDaK 519 I 1 PicSDaK EEDCK-A-EEDCK 520 EEDXK-A-EEDXK 521 Tabla 8.- Secuencias peptidicas de antagonista de TNF SEQ ID Secuencia/Estructura NO: YCFTASENHCY 522 YCFTNSENHCY 523 YCFTRSENHCY 524 FCASENHCY 525 YCASENHCY 526 FCNSENHCY 527 FCNSENRCY 528 FCNSVENRCY 529 Tabla 9.- Secuencias peptídicas de unión a integrina SEQ ID Secuencia/Estructura NO: RXiETX2WX3 541 RX1ETX2WX3 542 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: RGDGX 543 CRGDGXC 544 CXiX2RLDX3X4C 545 CARRLDAPC 546 CPSRLDSPC 547 X1X2X3RGDX4X5X6 548 CX2CRGDCX5C 549 CDCRGDCFC 550 CDCRGDCLC 551 CLCRGDCIC 552 X1X2 DDX4X5X7X8 553 X 1X2X3 DDX4X5X 6X7X8 554 CWDDG LC 555 C DDLWWLC 556 CWDDGLMC 557 CWDDGWMC 558 CS DDGWLC 559 CPDDLWWLC 560 NGR NR GSL NR RGD NR CGRECPRLCQSSC 561 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: CNGRCVSGCAGRC 562 CLSGSLSC 563 RGD NR NGR NR GSL NR NGRAHA 564 CNGRC 565 CDCRGDCFC 566 CGSLVRC 567 DLXXL 568 RTDLDSLRTYTL 569 RTDLDSLRTY 570 RTDLDSLRT 571 RTDLDSLR 572 GDLDLLKLRLTL 573 GDLHSLRQLLSR 574 RDDLHMLRLQLW 575 SSDLHALKKRYG 576 RGDLKQLSELTW 577 RGDLAALSAPPV 578 Tabla 10.- Secuencias peptídicas de antagonista de selectina SEQ ID Secuencia/Estructura NO: DITWDQLWDLMK 579 DITWDELWKIMN 580 DYT FEL DMMQ 581 QIT AQLWNMMK 582 DMTWHDLWTLMS 583 DYSWHDLWEMMS 584 EITWDQLWEVMN 585 HVSWEQL DIMN 586 HITWDQLWRIMT 587 RNMS LELWEHMK 588 AEWTWDQLWHVMNPAESQ 589 HRAEWLALWEQMSP 590 KKEDWLAL RIMSV 591 IT DQL DLMK 592 DITWDQLWDLMK 593 DITWDQLWDLMK 594 ¦ DITWDQLWDLMK 595 CQNRYTDLVAIQNKNE 596 AENWADNEPNNKRNNED 597 RKNNKTWTWVGTKKALTNE 598 KKALTNEAENWAD 599 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: CQXRYTDLVAIQNKXE 600 RKXNXXWTWVGTXKXLTEE 601 AENWADGEPNNKXNXED 602 CXXXYTXLVAIQNKXE 603 RKXXXXWX VGTXKXLTXE 604 AXNWXXXEPNNXXXED 605 XKXKTXEAXN XX 606 a 11.- Secuencias peptídicas antipatógenas SEQ ID Secuencia/Estructura NO: GFFALIPKI ISSPLFKTLLSAVGSALSSSGGQQ 607 GFFALI PKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGGQE 608 GFFALIPKI I SSPLFKTLLSAV 609 GFFALI PKIISSPLFKTLLSAV 610 KGFFALIPKII SSPLFKTLLSAV 611 KKGFFALI PKIISSPLFKTLLSAV 612 KKGFFALI PKIISSPLFKTLLSAV 613 GFFALIPKIIS 614 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 615 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 616 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 617 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKR 618 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: AVLKVLTTGLPALISWIKR 619 KLLLLLKLLLLK 620 KLLLKLLLKLLK 621 KLLLKLKLKLLK 622 KKLLKLKLKLKK 623 KLLLKLLLKLLK 624 KLLLKLKLKLLK 625 KLLLLK 626 KLLLKLLK 627 KLLLKLKLKLLK 628 KLLLKLKLKLLK 629 KLLLKLKLKLLK 630 KAAAKAAAKAAK 631 KVVVKVVVKVVK 632 KVVVKVKVKVVK 633 KVVVKVKVKVK 634 KVVVKVKVKVVK 635 KLILKL 636 KVLHLL 637 LKLRLL 638 KPLHLL 639 KLILKLVR 640 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: KVFHLLHL 641 HKFRILKL 642 KPFHILHL 643 KIIIKIKIKIIK 644 KIIIKIKIKIIK 645 KIIIKIKIKIIK 646 KIPIKIKIKIPK 647 KIPIKIKIKIVK 648 RIIIRIRIRIIR 649 RIIIRIRIRIIR 650 RIIIRIRIRIIR 651 RIVIRIRIRLIR 652 RIIVRIRLRIIR 653 RIGIRLRVRI IR 654 KIVIRIRIRLIR 655 RIAVKWRLRFIK 656 KIGWKLRVRI IR 657 KKIGWLI IRVRR 658 RIVIRIRIRLIRIR 659 RIIVRIRLRIIRVR 660 RIGIRLRVRI IRRV 661 KIVIRIRARLIRIRIR 662 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: RI IVKIRLRI IKKIRL 663 KIGIKARVRIIRVKII 664 RI IVHIRLRI IHHIRL 665 HIGIKAHVRIIRVHII 666 RIYVKIHLRYIKKIRL 667 KIGHKARVHI IRYKI I 668 RIYVKPHPRYIKKIRL 669 KPGHKARPHI IRYKI I 670 KIVIRIRIRLIRIRIRKIV 671 RI IVKIRLRI IKKIRLIKK 672 KIG KLRVRI IRVKIGRLR 673 KIVIRIRIRLIRIRIRKIVKVKRIR 674 RFAVKIRLRIIKKIRLIKKIRKRVIK 675 KAGWKLRVRIIRVKIGRLRKIGWKKRVRIK 676 RIYVKPHPRYIKKIRL 677 KPGHKARPHI IRYKI I 678 KIVIRIRIRLIRIRIRKIV 679 RI IVKIRLRI IKKIRLIKK 680 RIYVSKISIYIKKIRL 681 KIVI TRIRLTSIRIRSIV 682 KPIHKARPTI IRYKMI 683 cíclicoCKGFFALIPKIISSPLFKTLLSAVC 684 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: CKKGFFALIPKI ISSPLFKTLLSAVC 685 CKKKGFFALIPKI ISSPLFKTLLSAVC 686 CíclicoCRIVIRIRIRLIRIRC 687 CiclicoCKPGHKARPHIIRYKIIC 688 CiclicoCRFAVKIRLRI IKKIRLIKKIRKRVIKC 689 KLLLKLLL KLLKC 690 KLLLKLLLKLLK 691 KLLLKLKLKLLKC 692 KLLLKLLLKLLK 693 a 12.- Secuencias peptidicas VIP-miméticas SEQ ID Secuencia/Estructura NO: HSDAVFYDNYTR LRKQMAVKKYLN SILN 694 Nle HSDAVFYDNYTR LRKQMAVKKYLN SILN 695 ???? ' Xi ' ' X2 696 X3 S X4 LN 697 H CH CO XYX5 NH CH CO X6 698 1 i I 1 (CH2)m Z (CH2)n KKYL 699 NSILN 700 KKYL 701 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: KKYA 702 AVKKYL 703 NSILN 704 KKYV 705 SILauN 706 KKYLNle 707 NSYLN 708 NSIYN 709 KKYLPPNSILN 710 LauKKYL 711 CapKKYL 712 KYL 713 KKYNle 714 VKKYL 715 LNSILN 716 YLNSILN 717 KKYLN 718 KKYLNS 719 KKYLNSI 720 KKYLNSIL 721 KKYL 722 KKYDA 723 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: AVKKYL 724 NSILN 725 KKYV 726 SILauN 727 NSYLN 728 NSIYN 729 KKYLNle 730 KKYLPPNSILN 731 KKYL 732 KKYDA 733 AVKKYL 734 NSILN 735 KKYV 736 SILauN 737 LauKKYL 738 CapKKYL 739 KYL 740 KYL 741 KKYNle 742 VKKYL 743 LNSILN 744 YLNSILN 745 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: KKYLNle 746 KKYLN 747 KKYLNS 748 KKYLNSI 749 KKYLNS IL 750 KKKYLD 751 ciclicCKKYLC 752 C KYLK 753 1i 11 S-CH2-CO KKYA 754 WWTDTGLW 755 WWTDDGL 756 WWDTRGL VWTI 757 FWGNDGIWLESG 758 DWDQFGL RGAA 759 R DDNGL VVVL 760 SGMWSHYGIWMG 761 GGRWDQAGLWVA 762 KLWSEQGIWMGE 763 CWSMHGLWLC 764 GCWDNTGIWVPC 765 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: DWDTRGL VY 766 SLWDENGAWI 767 KWDDRGLWMH 768 QAWNERGLWT 769 Q DTRGLWVA 770 NVHGIWQE 771 SWDTRGLWVE 772 DWDTRGLWVA 773 S GRDGLWIE 774 E TDNGLWAL 775 SWDEKGLWSA 776 SWDSSGLWMD 777 Tabla 13.- Secuencias peptidicas de antagonista de mdm/hdm SEQ ID Secuencia/Estructura NO: TFSDLW 778 QETFSDL KLLP 779 QPTFSDL KLLP 780 QETFSDYWKLLP 781 QPTFSDYWKLLP 782 MPRFMDY EGLN 783 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: VQNFIDYWTQQF 784 TGPAFTHYWATF 785 IDRAPTFRDHWFALV 786 PRPALVFADYWETLY 787 PAFSRFWSDLSAGAH 788 PAFSRFWSKLSAGAH 789 PXFXDYWXXL 790 QETFSDLWKLLP 791 QPTFSDLWKLLP 792 QETFSDYWKLLP 793 QPTFSDYWKLLP 794 Tabla 14.- Secuencias peptídicas de antagonista de calmodulina SEQ ID Secuencia/Estructura NO: SCVKWGKKEFCGS 795 SCWKYWGKECGS 796 SCYE GKLRWCGS 797 SCLRWGKWSNCGS 798 SCWRWGKYQICGS 799 SCVSWGALKLCGS 800 SCIR GQNTFCGS 801 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: SCWQ GNLKICGS 802 SCVRWGQLSICGS 803 LKKFNARRKLKGAILTTMLAK 804 RRWKKNFIAVSAANRFKK 805 RKWQKTGHAVRAIGRLSS 806 INLKALAALAKKIL 807 KI SILAPLGTTLVKLVA 808 LKKLLKLLKKLLKL 809 L WKKLLKLLKKLLKKLL 810 AEWPSLTEIKTLSHFSV 811 AEWPSPTRVI STTYFGS 812 AELAHWPPVKTVLRSFT 813 AEGSWLQLLNLMKQMNN 814 AE PSLTEIK 815 Tabla 15.- Secuencias peptldicas de inhibidor de proteasa de célula cebada/antagonistas de células cebada SEQ ID Secuencia/Estructura NO: SGSGVLKRPLPILPVTR 816 RWLSSRPLPPLPLPPRT 817 GSGSYDTLALPSLPLHPMSS 818 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: GSGSYDTRALPSLPLHPMSS 819 GSGSSGVTMYPKLPPHWSMA 820 GSGSSGVRMYPKLPPHWSMA 821 GSGSSSMRMVPTIPGSAKHG 822 RNR NR QT NR RQK NR NRQ NR RQR NR RNRQKT 823 RNRQ 824 RNRQK 825 NRQKT 826 RQKT 827 Tabla 16.- Secuencias peptldicas de antagonista de SH3 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: RPLPPLP 828 RELPPLP 829 SPLPPLP 830 GPLPPLP 831 SEQ ID Secuencia /Estructura NO: RPLPIPP 832 RPLPIPP 833 RRLPPTP 834 RQLPPTP 835 RPLPSRP 836 RPLPTRP 837 SRLPPLP 838 RALPSPP 839 RRLPRTP 840 RPVPPIT 841 ILAPPVP 842 RPLPMLP 843 RPLPILP 844 RPLPSLP 845 RPLPSLP 846 RPLPMIP 847 RPLPLIP 848 RPLPPTP 849 RSLPPLP 850 RPQPPPP 851 RQLPIPP 852 XXXRPLPPLPXP 853 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: XXXRPLPPIPXX 854 XXXRPLPPLPXX 855 RXXRPLPPLPXP 856 RXXRPLPPLPPP 857 PPPYPPPPIPXX 858 PPPYPPPPVPXX 859 LXXRPLPX P 860 ¾>XXRPLPXLP 861 ???T?????? 862 +PP PXKPXWL 863 ???????+3?? 864 PPVPPRPXXTL 865 ????,??? 866 +0DXPLPXLP 867 Tabla 17.- Secuencias peptídicas somatostatina o cortistatina-miméticas SEQ ID Secuencia/Estructura NO: Met Pro Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 870 Ser Ser Cys Lys Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ser Ser 871 Cys Lys Asp Arg Met Pro Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys 872 Thr Phe Ser Ser Cys Mel Pro Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 873 Ser Ser Cys Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ser Ser 874 Cys Asp Arg Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys 875 Thr Phe Ser Ser Cys Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 876 Ser Ser Cys Lys Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ser Ser 877 Cys Lys Asp Arg Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys 878 Thr Phe Ser Ser Cys Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 879 Ser Ser Cys Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ser Ser 880 Cys SEQ ID Secuencia/Estructura NO: Asp Arg Met Pro Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys 881 Thr Phe Thr Ser Cys Lys Met Pro Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 882 Thr Ser Cys Lys Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser 883 Cys Lys Asp Arg Met Pro Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys 884 Thr Phe Thr Ser Cys Met Pro Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 885 Thr Ser Cys Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser 886 Cys Asp Arg Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys 887 Thr Phe Thr Ser Cys Lys Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 888 Thr Ser Cys Lys Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser 889 Cys Lys Asp Arg Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys 890 Thr Phe Thr Ser Cys Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 891 Thr Ser Cys SEQ ID Secuencia/Estructura NO: Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser 892 Cys Tabla 18.- Secuencias peptídicas de antagonista de UKR SEQ ID Secuencia/Estructura NO: AEPMPHSLNFSQYLWYT 893 AEHTYSSLWDTYSPLAF 894 AELDLWMRHYPLSFSNR 894 AESSLWTRYAWPSMPSY 896 AEWHPGLSFGSYLWSKT 897 AEPALLNWSFFFNPGLH 898 AEWSFYNLHLPEPQTIF 899 AEPLDLWSLYSLPPLAM 900 AEPTLWQLYQFPLRLSG 901 AEISFSELMWLRSTPAF 902 AELSEADLWTTWFGMGS 903 AESSLWRIFSPSALMMS 904 AESLPTLTSILWGKESV 905 AETLFMDLWHDKHILLT 906 AEILNFPLWHEPL STE 907 AESQTGTLNTLFWNTLR 908 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: AEPVYQYELDSYLRSYY 909 AELDLSTFYDIQYLLRT 910 AEFFKLGPNGYVYLHSA 911 FKLXXXGYVYL 912 AESTYHHLSLGYMYTLN 913 YHXLXXGYMYT 914 Tabla 19.- Secuencias peptidicas de inhibición de macróf y/o células T SEQ ID Secuencia/Estructura NO: Xaa-Yaa-Arg NR Arg-Yaa-Xaa NR Xaa-Arg-Yaa NR Yaa-Arg-Xaa NR Ala-Arg NR Arg-Arg NR Asn-Arg NR Asp-Arg NR Cys-Arg NR Gln-Arg NR Glu-Arg NR SEQ ID Secuencia/Estructura NO: Gly-Arg NR His-arg NR Ile-Arg NR Leu-Arg NR Lys-Arg NR Met-Arg NR Phe-Arg NR Ser-Arg NR Thr-Arg NR Trp-Arg NR Tyr-Arg NR Val-Arg NR Ala-Glu-Arg NR Arg-Glu-Arg NR Asn-Glu-Arg NR Asp-Glu-Arg NR Cys-Glu-Arg NR Gln-Glu-Arg NR Glu-Glu-Arg NR Gly-Glu-Arg NR His-Glu-Arg NR Ile-Glu-Arg NR SEQ ID Secuencia/Estructura NO: Leu-Glu-Arg NR Lys-Glu-Arg NR Met-Glu-Arg NR Phe-Glu-Arg NR Pro-Glu-Arg NR Ser-Glu-Arg NR Thr-Glu-Arg NR Trp-Glu-Arg NR Tyr-Glu-Arg NR Val-Glu-Arg NR Arg-Ala NR Arg-Asp NR Arg-Cys NR Arg-Gln NR Arg-Glu NR Arg-Gly NR Arg-His NR Arg-Ile NR Arg-Leu NR Arg-Lys NR Arg-Met NR Arg-Phe NR SEQ ID Secuencia/Estructura NO: Arg-Pro NR Arg-Ser NR Arg-Thr NR Arg-Trp NR Arg-Tyr NR Arg-Val NR Arg-Glu-Ala NR Arg-Glu-Asn NR Arg-Glu-Asp NR Arg-Glu-Cys NR Arg-Glu-Gln NR Arg-Glu-Glu NR Arg-Glu-Gly NR Arg-Glu-His NR Arg-Glu-Ile NR Arg-Glu-Leu NR Arg-Glu-Lys NR Arg-Glu-Met NR Arg-Glu-Phe NR Arg-Glu-Pro NR Arg-Glu-Ser NR Arg-Glu-Thr NR SEQ ID Secuencia/Estructura NO: Arg-Glu-Trp NR Arg-Glu-Tyr NR Arg-Glu-Val NR Ala-Arg-Glu NR Arg-Arg-Glu NR Asn-Arg-Glu NR Asp-Arg-Glu NR Cys-Arg-Glu NR Gln-Arg-Glu NR Glu-Arg-Glu NR Gly-Arg-Glu NR His-Arg-Glu NR Ile-Arg-Glu NR Leu-Arg-Glu NR Lys-Arg-Glu NR Met-Arg-Glu NR Phe-Arg-Glu NR Pro-Arg-Glu NR Ser-Arg-Glu NR Thr-Arg-Glu NR Trp-Arg-Glu NR Tyr-Arg-Glu NR SEQ ID Secuencia/Estructura NO: Val-Arg-Glu NR Glu-Arg-Ala, NR Glu-Arg-Arg NR Glu-Arg-Asn NR Glu-Arg-Asp NR Glu-Arg-Cys NR Glu-Arg-Gln NR Glu-Arg-Gly NR Glu-Arg-His NR Glu-Arg-lle NR Glu-Arg-Leu NR Glu-Arg-Lys NR Glu-Arg-Met NR Glu-Arg-Phe NR Glu-Arg-Pro NR Glu-Arg-Ser NR Glu-Arg-Thr NR Glu-Arg-Trp NR Glu-Arg-Tyr NR Glu-Arg-Val NR Tabla 20.- Péptidos Farmacológicamente Activos Adicionales de emplo SEQ ID Secuencia/Estructura Actividad NO: VEPNCDIHVMWE ECFERL 915 Antagonista de VEGF GERWCFDGPLT VCGEES 916 Antagonista de VEGF RGWVEICVADDNGMCVTEAQ 917 Antagonista de VEGF GWDECDVARMWEWECFAGV 918 Antagonista de VEGF GERWCFDGPRAWVCGWEI 919 Antagonista de VEGF EELWCFDGPRAWVCGYVK 920 Antagonista de VEGF RGWVEICAADDYGRCLTEAQ 921 Antagonista de VEGF RGWVEICESDVWGRCL 922 Antagonista de VEGF RGWVEICESDVWGRCL 923 Antagonista de VEGF GGNECDIARMWEWECFERL 924 Antagonista de VEGF RGWVEICAADDYGRCL 925 Antagonista de VEGF CTTHWGFTLC 926 Inhibidor de MMP CLRSGXGC 927 Inhibidor de MMP CXXHWGFXXC 928 Inhibidor de MMP CXPXC 929 Inhibidor de MMP CRRHWGFEFC 930 Inhibidor de MMP STTHWGFTLS 931 Inhibidor de MMP CSLHWGFWWC '932 CTLA -mimético GFVCSGI FAVGVGRC 933 CTLA4-mimético APGVRLGCAVLGRYC 934 CTLA4-mimético SEQ ID Secuencia /Estructura Actividad NO: LLGRMK 935 Antiviral (HBV) ICVVQDWGHHRCTAGHMANLTSHASAI 936 Antagonista de C3b ICVVQDWGHHRCT 937 Antagonista de C3b CVVQD GHHAC 938 Antagonista de C3b STGGFDDVYDWARGVSSALTITLVATR 939 De unión a vinculina STGGFDDVYDWARRVSSALTTTLVATR 940 De unión a vinculina SRGVNFSEWLYDMSAAMKEASNVFPSRRSR 941 De unión a vinculina SSQNWDMEAGVEDLTAAMLGLLSTIHSSSR 942 De unión a vinculina SSPSLYTQFLVNYESAATRIQDLLIASRPSR 943 De unión a vinculina SSTGWVDLLGALQRAADATRTSIPPSLQNSR 944 De unión a vinculina DVYTKKELIECARRVSEK 945 De unión a vinculina EKGSYYPGSGIAQFHIDYNNVS 946 De unión a C4BP SGIAQFHI DYNNVSSAEGWHVN 947 De unión a C4BP LVTVEKGSYYPGSGIAQFHIDYNNVSSAEG 948 De unión a C4BP WHVN SGIAQFHIDYNNVS 949 De unión a C4BP LLGRMK 950 Anti-HBV ALLGRMKG 951 Anti-HBV LDPAFR 952 Anti-HBV CXXRGDC 953 Inhibición de agregación de plaquetas SEQ ID Secuencia/Estructura Actividad NO: RPLPPLP 954 Antagonista de Src PPVPPR 955 Antagonista de Src XFXDXWXXLXX 956 Anticancerígeno (particularmente para sarcomas KACRRLFGPVDSEQLSRDCD 957 P16-mimético RERWNFDFVTETPLEGDFAW 958 P16-mimético KRRQTSMTDFYHSKRRLIFS 959 P16-mimético TSMTDFYHSKRRLI FSKRKP 960 P16-mimético RRLIF 961 P16-mimético KRRQTSATDFYHSKRRLI FSRQIKIWFQNR 962 P16-mimético RMKWKK KRRLI FSKRQIKIWFQNRR KWKK 963 P16-mimético Asn Gln Gly Arg His Phe Cys 964 CAP37 rriimético/de Gly Gly Ala Leu lie His Ala unión a LPS Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gin Arg His Phe Cys Gly Gly Ala 965 CAP37 mimético/de Leu lie His Ala Arg Phe Val unión a LPS Met Thr Ala Ala Ser Cys SEQ ID Secuencia/Estructura Actividad NO: Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala 966 CAP37 mimético/de Gly Trp Gly Ser Gln Arg Ser unión a LPS Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val WHWRHRI PLQLAAGR 967 Carbohidrato (GDI alfa)mimético LKTPRV 968 De unión a 2GP1 Ab NTLKTPRV 969 De unión a ß2??1 Ab NTLKTPRVGGC 970 De unión a ß2??1 Ab KDKATF 971 De unión a ß2??1 Ab KDKATFGCHD 972 De unión a ß2s?1 Ab KDKATFGCHDGC 973 De unión a ß2??1 Ab TLRVYK 974 De unión a 2GP1 Ab ATLRVYKGG 975 De unión a ß26?1 Ab CATLRVYKGG 976 De unión a ß20?1 Ab INLKALAALAKKIL 977 De transporte en membrana GWT NR De transporte en membrana GWTLNSAGYLLG 978 De transporte en membrana SEQ ID Secuencia/Estructura Actividad NO: G TLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL 979 De transporte en membrana CVHAYRS 980 Antiproliferativo, antiviral CVHAYRA 981 Antiproliferativo, antiviral CVHAPRS 982 Antiproliferativo, antiviral CVHAPRA 983 Antiproliferativo, antiviral CVHSYRS 984 Antiproliferativo, antiviral CVHSYRA 985 Antiproliferativo, antiviral CVHSPRS 986 Antiproliferativo, antiviral CVHSPRA 987 Antiproliferativo, antiviral CVHTYRS 988 Antiproliferativo, antiviral CVHTYRA 989 Antiproliferativo, antiviral SEQ ID Secuencia/Estructura Actividad NO: CVHTPRS 990 Antiproliferativo, antiviral CVHTPRA 991 Antiproliferativo, antiviral HWAWFK 992 De liberación de hormona de crecimiento, antiisquémico Tabla 21.- Péptidos Inhibidores de Miostatina Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptídica Miostatina-TN8 -Conl 1036 KDKCKMWHWMCKPP Miostatina-TN8 -Con2 1037 KDLCAMWH MCKPP Miostatina-TN8 -Con3 1038 KDLCKMWKWMCKPP Miostatina-TN8 -Con4 1039 KDLCKM H MCKPK Miostatina-TN8 -Con5 1040 WYPCYEFHFWCYDL Miostatina-TN8 -Con6 1041 YPCYEGHFWCYDL Miostatina-TN8 -Con7 1042 I FGCKWWDVQCYQF Miostatina-TN8 -Con8 1043 IFGCKWWDVDCYQF Miostatina-TN8 -Con9 1044 ADWCVSPNWFCMVM Miostatina-TN8 -ConlO 1045 HKFCPWWALFCWDF Miostatina-TN8 -1 1046 KDLCKM HWMCKPP Miostatina-TN8 -2 1047 IDKCAIWGWMCPPL Miostatina-TN8 -3 1048 YPCGEFGMWCLNV Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptidica Miostatina-TN8 -4 1049 WFTCLWNCDNE Miostatina-TN8 -5 1050 HTPCPWFAPLCVEW Miostatina-TN8 -6 1051 KEWCWRWKWMCKPE Miostatina-TN8 -7 1052 FETCPSWAYFCLDI Miostatina-TN8 -8 1053 AYKCEANDWGCWWL Miostatina-TN8 -9 1054 NSWCEDQWHRCWWL Miostatina-TN8 -10 1055 WSACYAGHFWCYDL Miostatina-TN8 -11 1056 ANWCVSPNWFCMVM Miostatina-TN8 -12 1057 WTECYQQEFWCWNL Miostatina-TN8 -13 1058 ENTCERWKWMCPPK Miostatina-TN8 -14 1059 WLPCHQEGFWCMNF Miostatina-TN8 -15 1060 STMCSQWHWMCNPF Miostatina-TN8 -16 1061 I FGCHWWDVDCYQF Miostatina-TN8 -17 1062 IYGCKWWDIQCYDI Miostatina-TN8 -18 1063 PDWCIDPDWWCKFW Miostatina-TN8 -19 1064 QGHCTRWPWMCPPY Miostatina-TN8 -20 1065 WQECYREGFWCLQT Miostatina-TN8 -21 1066 WFDCYGPGFKCWSP Miostatina-TN8 -22 1067 GVRCPKGHLWCLYP Miostatina-TN8 -23 1068 HWACGYWPWSCKWV Miostatina-TN8 -24 1069 GPACHSPWWWCVFG Miostatina-TN8 -25 1070 TTWCISPMWFCSQQ Miostatina-TN8 -26 1071 HKFCPPWAIFCWDF Miostatina-TN8 -27 1072 PDWCVSPRWYCNMW Miostatina-TN8 -28 1073 VWKCHWFGMDCEPT Miostatina-TN8 -29 1074 KKHCQIWTWMCAPK Miostatina-TN8 -30 1075 WFQCGSTLFWCYNL Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptídica Miostatina-TN8-31 1076 WSPCYDHYFYCYTI Miostatina-TN8-32 1077 S MCGFFKEVCM V Miostatina-TN8-33 1078 EMLCMIHPVFCNPH Miostatina-TN8-34 1079 LKTCNLWPWMCPPL Miostatina-TN8-35 1080 VVGCK YEAWCYNK Miostatina-TN8-36 1081 PIHCTQ AWMCPPT Miostatina-TN8-37 1082 DSNCPWYFLSCVIF Miostatina-TN8-38 1083 HIWCNL^MKCVEM Miostatina-TN8-39 1084 NLQCIYFLGKCIYF Miostatina-TN8-40 1085 A RCMWFSDVCTPG Miostatina-TN8-41 1086 WFRCFLDADWCTSV Miostatina-TN8-42 1087 EKICQM S MCAPP Miostatina- TN8-43 1088 WFYCHLNKSECTEP Miostatina- TN8-44 1089 FWRCAIGIDKCKRV Miostatina- TN8-45 1090 NLGCKWYEVWCFTY Miostatina- TN8-46 1091 IDLCNMWDGMCYPP Miostatina- TN8-47 1092 EMPCNIWGWMCPPV Miostatina- TN12-1 1093 WFRCVLTGIVDWSECFGL Miostatina- TN12-2 1094 GFSCTFGLDEFYVDCSPF Miostatina- TN12-3 1095 LPWCHDQVNADWGFCMLW Miostatina- TN12-4 1096 YPTCSEKF I YGQTCVLW Miostatina- TN12-5 1097 LGPCPIHHGPWPQYCVYW Miostatina- TN12-6 1098 PFPCETHQISWLGHCLSF Miostatina- TN12-7 1099 HWGCEDLMWSWHPLCRRP Miostatina- TN12-8 1100 LPLCDADMMPTIGFCVAY Miostatina- TN12-9 1101 SHWCETI FWMNYAKCVHA Miostatina- TN12-10 1102 LPKCTHVPFDQGGFCLWY Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptidica Miostatina-TN12- 11 1103 FSSC SPVSRQDMFCVFY Miostatina-TN12- 13 1104 SHKCEYSG LQPLCYRP Miostatina-TN12- 14 1105 PWWCQDNYVQHMLHCDSP Miostatina-TN12-15 1106 WFRCMLMNSFDAFQCVSY Miostatina-TN12- 16 1107 PDACRDQPWYMFMGCMLG Miostatina-TN12-17 1108 FLACFVEFELCFDS Miostatina-TN12- 18 1109 SAYCIITESDPYVLCVPL Miostatina-TN12- 19 1110 PSICESYSTMWLPMCQHN Miostatina- TN12-20 1111 WLDCHDDSWAWTKMCRSH Miostatina- TN12-21 1112 YLNCVMMNTSPFVECVFN Miostatina- TN12- 22 1113 YPWCDGFMIQQGITCMFY Miostatina- TN12- 23 1114 FDYCTWLNGFKDWKCWSR Miostatina- TN12- 24 1115 LPLCNLKEISHVQACVLF Miostatina- TN12- 25 1116 SPECAFARWLGIEQCQRD Miostatina- TN12- 26 1117 YPQCFNLHLLEWTECDWF Miostatina- TN12- 27 1118 RWRCEIYDSEFLPKCWFF Miostatina- TN12- 28 1119 LVGCDNVWHRCKLF Miostatina- TN12- 29 1120 AGWCHVWGEMFGMGCSAL Miostatina-•TN12- 30 1121 HHECEWMARWMSLDCVGL Miostatina--TN12- 31 1122 FPMCGIAGM DFDFCVWY Miostatina--TN12- 32 1123 RDDCTFWPEWLWKLCERP Miostatina--TN12- 33 1124 YNFCSYLFGVSKEACQLP Miostatina--TN12- 34 1125 AHWCEQGPWRYGNICMAY Miostatina--TN12- 35 1126 NLVCGKI SAWGDEACARA Miostatina--TN12-¦36 1127 HNVCTIMGPSMKWFCWND Miostatina--TN12--37 1128 NDLCAMWGWRNTIWCQNS Miostatina--TN12-•38 1129 PPFCQNDNDMLQSLCKLL Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptídica Miostatina-TN12-39 1130 WYDCNVPNELLSGLCRLF Miostatina-TN12-40 1131 YGDCDQNHWMWPFTCLSL Miostatina-TN12-41 1132 GWMCHFDLHDWGATCQPD Miostatina-TN12-42 1133 YFHCMFGGHEFEVHCESF Miostatina- TN12-43 1134 AYWCWHGQCVRF Miostatina-Lineal- 1 1135 SEHWTFTD DGNEWWVRPF Miostatina-Lineal-2 1136 MEMLDSLFELLKDMVPISKA Miostatina- Lineal-3 1137 SPPEEALME LG QYGKFT Miostatina- Lineal- 4 1138 SPENLLNDLYILMTKQE YG Miostatina- Lineal-5 1139 FHWEEGI PFHVVTPYSYDRM Miostatina- Lineal- 6 1140 KRLLEQFMNDLAELVSGHS Miostatina- Lineal-7 1141 DTRDALFQEFYEFVRSRLVI Miostatina- Lineal-8 1142 RMSAAPRPLTYRDIMDQY H Miostatina- Lineal- 9 1143 NDKAHFFEMFMFDVHNFVES Miostatina- Lineal- 10 1144 QTQAQKI DGLWELLQS IRNQ Miostatina- Lineal- 11 1145 MLSEFEEFLGNLVHRQEA Miostatina- Lineal- 12 1146 YTPKMGSEWTSFWHNRIHYL Miostatina- Lineal- 13 1147 LNDTLLRELKMVLNSLSDMK Miostatina- Lineal- 14 1148 FDVERDLMRWLEGFMQSAAT Miostatina- Lineal- 15 1149 HHGWNYLRKGSAPQ FEAWV Miostatina- Lineal- 16 1150 VESLHQLQM LDQKLASGPH Miostatina- Lineal- 17 1151 RATLLKDFWQLVEGYGDN Miostatina- Lineal- 18 1152 EELLREFYRFVSAFDY Miostatina-¦Lineal- 19 1153 GLLDEFSHFIAEQFYQMPGG Miostatina--Lineal-20 1154 YREMSMLEGLLDVLERLQHY Miostatina--Lineal-21 1155 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ Miostatina-¦Lineal-22 1156 WREHFLNSDYIRDKLIAIDG Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptidica Miostatina-Lineal -23 1157 QFPFYVFDDLPAQLEYWIA Miostatina-Lineal -24 1158 EFFH LHNHRSEVNH LDMN Miostatina-Lineal -25 1159 EALFQNFFRDVLTLSEREY Miostatina-Lineal -26 1160 QY EQQ MTYFRENGLHVQY Miostatina-Lineal -27 1161 NQRMMLEDLWRIMTPMFGRS Miostatina-Lineal -29 1162 FLDELKAELSRHYALDDLDE Miostatina-Lineal -30 1163 GKLIEGLLNELMQLETFMPD Miostatina-Lineal -31 1164 ILLLDEYKKD KSWF Miostatina- 2xTN8- 19 kc 1165 QGHCTR P MCPPYGSGSATGGSGST ASSGSGSATGQGHCTR P MCPPY Miostatina- 2xTN8-con6 1166 WYPCYEGHFWCYDLGSGSTASSGSGSATGW YPCYEGHFWCYDL Miostatina- 2xTN8-5 kc 1167 HTPCPWFAPLCVEWGSGSATGGSGSTASSG SGSATGHTPCPWFAPLCVEW Miostatina- 2xTN8- 18 kc 1168 PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGSGSTASSG SGSATGPDWCIDPDWWCKFW Miostatina- 2xTN8- 11 kc 1169 ANWCVSPNWFCMVMGSGSATGGSGSTASSG SGSATGANWCVSPNWFCMVM Miostatina- 2xTN8-25 kc 1170 PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGSGSTASSG SGSATGPDWCIDPDWWCKFW Miostatina- 2xTN8-23 kc 1171 HWACGYWPWSCKWVGSGSATGGSGSTASSG SGSATGHWACGYWPWSCKWV Miostatina- TN8-29 -19 kc 1172 KKHCQIWTWMCAPKGSGSATGGSGSTASSG SGSATGQGHCTRWPWMCPPY Miostatina- TN8-19 -29 kc 1173 QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGSGSTASSG SGSATGKKHCQIWTWMCAPK Miostatina- TN8-29 -19 kn 1174 KKHCQIWTWMCAPKGSGSATGGSGSTASSG SGSATGQGHCTRWPWMCPPY Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptidica Miostatina-TN8-29-19-8g 1175 KKHCQI T MCAPKGGGGGGGGQGHCTR P WMCPPY Miostatina-TN8-19-29-6gc 1176 QGHCTR PWMCPPYGGGGGGKKHCQIWTWM CAPK Tabla 22.- Péptidos Inhibidores de Miostatina Pepticuerpo Madurado SEQ ID Secuencia Peptidica por Afinidad NO: mTN8-19-l 1177 VALHGQCTRWPWMCPPQREG mTN8-19-2 1178 YPEQGLCTRWPWMCPPQTLA mTN8-19-3 1179 GLNQGHCTRWPWMCPPQDSN mTN8-19-4 1180 MITQGQCTRWPWMCPPQPSG mTN8-19-5 1181 AGAQEHCTRWPWMCAPNDWI mTN8-19-6 1182 GVNQGQCTRWRWMCPPNGWE mTN8-19-7 1183 LADHGQCIRWPWMCPPEGWE mTN8-19-8 1184 ILEQAQCTRWPWMCPPQRGG mTN8-19-9 1185 TQTHAQCTRWPWMCPPQWEG mTN8-19-10 1186 VVTQGHCTLWPWMCPPQRWR mTN8-19-ll 1187 IYPHDQCTRWPWMCPPQPYP mTN8-19-12 1188 SYWQGQCTRWPWMCPPQWRG mTN8-19-13 1189 MWQQGHCTRWPWMCPPQGWG mTN8-19-14 1190 EFTQWHCTRWPWMCPPQRSQ mTN8-19-15 1191 LDDQWQCTRWPWMCPPQGFS mTN8-19-16 1192 YQTQGLCTRWPWMCPPQSQR Pepticuerpo Madurado SEQ ID Secuencia Peptidica por Afinidad NO: mTN8-19-17 1193 ESNQGQCTRWPWMCPPQGGW mTN8-19-18 1194 WTDRGPCTRWPWMCPPQANG mTN8-19-19 1195 VGTQGQCTRWPWMCPPYETG mTN8-19-20 1196 PYEQGKCTRWPWMCPPYEVE mTN8-19-21 1197 SEYQGLCTR P MCPPQGWK mTN8-19-22 1198 TFSQGHCTRWPWMCPPQGWG mTN8-19-23 1199 PGAHDHCTRWPWMCPPQSRY mTN8-19-24 1200 VAEEWHCRRWPWMCPPQDWR ????8-19-25 1201 VGTQGHCTRWPWMCPPQPAG mTN8-19-26 1202 EEDQAHCRSWPWMCPPQGWV mTN8-19-27 1203 ADTQGHCTRWPWMCPPQHWF mTN8-19-28 1204 SGPQGHCTRWPWMCAPQGWF mTN8-19-29 1205 TLVQGHCTRWPWMCPPQRWV mTN8-19-30 1206 GMAHGKCTRWAWMCPPQSWK mTN8-19-31 1207 ELYHGQCTRWPWMCPPQSWA mTN8-19-32 1208 VADHGHCTRWPWMCPPQGWG mTN8-19-33 1209 PESQGHCTRWPWMCPPQGWG mTN8-19-34 1210 IPAHGHCTRWPWMCPPQRWR mTN8-19-35 1211 FTVHGHCTRWPWMCPPYGWV mTN8-19-36 1212 PDFPGHCTRWRWMCPPQGWE mTN8-19-37 1213 QLWQGPCTQWPWMCPPKGRY mTN8-19-38 1214 HANDGHCTRWQWMCPPQWGG Pepticuerpo Madurado SEQ ID Secuencia Peptidica por Afinidad NO: mTN8-19-39 1215 ETDHGLCTRWP MCPPYGAR mTN8-19-40 1216 GTWQGLCTRWPWMCPPQGWQ mTN8-19 conl 1217 VATQGQCTR PWMCPPQGWG mTN8-19 con2 1218 VATQGQCTRWP MCPPQRWG mTN8 con6-l 1219 QREWYPCYGGHLWCYDLHKA mTN8 con6-2 1220 ISAWYSCYAGHF CWDLKQK mTN8 con6-3 1221 WTGWYQCYGGHLWCYDLRRK mTN8 con6-4 1222 KTF YPCYDGHFWCYNLKSS mTN8 con6-5 1223 ESRWYPCYEGHLWCFDLTET Tabla 23.- Péptidos Inhibidores de Miostatina Pepticuerpo Madurado SEQ ID Secuencia Peptidica por Afinidad NO: L2 1224 MEMLDSLFELLKDMVPI SKA mL2-Conl 1225 RMEMLESLLELLKEIVPMSKAG mL2-Con2 1226 RMEMLESLLELLKEIVPMSKAR mL2-l 1227 RMEMLESLLELLKDIVPMSKPS mL2-2 1228 GMEMLESLFELLQEIVPMSKAP mL2-3 1229 RMEMLESLLELLKDIVPI SNPP mL2-4 1230 RIEMLESLLELLQEIVPI SKAE mL2-5 1231 RMEMLQSLLELLKDIVPMSNAR mL2-6 1232 RMEMLESLLELLKEIVPTSNGT Pepticuerpo Madurado SEQ ID Secuencia Peptidica por Afinidad NO: mL2-7 1233 RMEMLESLFELLKEIVPMSKAG mL2-8 1234 RMEMLGSLLELLKEIVPMSKAR mL2-9 1235 QMELLDSLFELLKEIVPKSQPA mL2-10 1236 RMEMLDSLLELLKEIVPMSNAR mL2-ll 1237 RMEMLESLLELLHEIVPMSQAG mL2-12 1238 QMEMLESLLQLLKEIVPMSKAS mL2-13 1239 RMEMLDSLLELLKDMVPMTTGA mL2-14 1240 RIEMLESLLELLKDMVPMANAS mL2-15 1241 RMEMLESLLQLLNEIVPMSRAR mL2-16 1242 RMEMLESLFDLLKELVPMSKGV mL2-17 1243 RIEMLESLLELLKDIVPIQKAR mL2-18 1244 RMELLESLFELLKDMVPMSDSS mL2-19 1245 RMEMLESLLEVLQEIVPRAKGA mL2-20 1246 RMEMLDSLLQLLNEIVPMSHAR mL2-21 1247 RMEMLESLLELLKDIVPMSNAG mL2-22 1248 RMEMLQSLFELLKGMVPISKAG mL2-23 1249 RMEMLESLLELLKEIVPNSTAA mL2-24 1250. RMEMLQSLLELLKEIVPISKAG mL2-25 1251 RIEMLDSLLELLNELVPMSKAR L-15 1252 IHHGWNYLRKGSAPQ FEA V mL15-conl 1253 QVESLQQLLMWLDQKLASGPQG mL15-l 1254 RMELLESLFELLKEMVPRSKAV Pepticuerpo Madurado SEQ ID Secuencia Peptidica por Afinidad NO: mL15-2 1255 QAVSLQHLLMWLDQKLASGPQH mL15-3 1256 DEDSLQQLLMWLDQKLASGPQL mL15-4 1257 PVASLQQLLIWLDQKLAQGPHA mL15-5 1258 EVDELQQLLNWLDHKLASGPLQ mL15-6 1259 DVESLEQLLMWLDHQLASGPHG mL15-7 1260 QVDSLQQVLLWLEHKLALGPQV mL15-8 1261 GDESLQHLLMWLEQKLALGPHG mL15-9 1262 QIEMLESLLDLLRDMVPMSNAF mL15-10 1263 EVDSLQQLLMWLDQKLASGPQA mL15-ll 1264 EDESLQQLLIYLDKMLSSGPQV mL15-12 1265 AMDQLHQLLIWLDHKLASGPQA m'L15-13 1266 RIEMLESLLELLDEIALI PKAW mL15-14 1267 EVVSLQHLLMWLEHKLASGPDG mL15-15 1268 GGESLQQLLMWLDQQLASGPQR mL15-16 1269 GVESLQQLLI FLDHMLVSGPHD mL15-17 1270 NVESLEHLMMWLERLLASGPYA mL15-18 1271 QVDSLQQLLIWLDHQLASGPKR mL15-19 1272 EVESLQQLLMWLEHKLAQGPQG mL15-20 1273 EVDSLQQLLMWLDQKLASGPHA mL15-21 1274 EVDSLQQLLMWLDQQLASGPQK mL15-22 1275 GVEQLPQLLMWLEQKLASGPQR mL15-23 1276 GEDSLQQLLMWLDQQLAAGPQV Pepticuerpo Madurado SEQ ID Secuencia Peptidica por Afinidad NO: mL15-24 1277 ADDSLQQLLMWLDRKLASGPHV mL15-25 1278 PVDSLQQLLIWLDQKLASGPQG L-17 1279 RATLLKDFWQLVEGYGDN mL17-conl 1280 DWRATLLKEFWQLVEGLGDNLV mL17-con2 1281 QSRATLLKEFWQLVEGLGDKQA mL17-l 1282 DGRATLLTEFWQLVQGLGQKEA mLl7-2 1283 LARATLLKEFWQLVEGLGEKVV mL17-3 1284 GSRDTLLKEFWQLVVGLGDMQT mL17-4 1285 DARATLLKEFWQLVDAYGDRMV mL17-5 1286 NDRAQLLRDFWQLVDGLGVKSW mL17-6 1287 GVRETLLYELWYLLKGLGANQG mL17-7 1288 QARATLLKEFCQLVGCQGDKLS mL17-8 1289 QERATLLKEFWQLVAGLGQNMR mL17-9 1290 SGRATLLKEFWQLVQGLGEYRW mL17-10 1291 TMRATLLKEFWLFVDGQREMQW mL17-ll 1292 GERATLLNDFWQLVDGQGDNTG mL17-12 1293 DERETLLKEFWQLVHGWGDNVA mL17-13 1294 GGRATLLKELWQLLEGQGANLV mL17-14 1295 TARATLLNELVQLVKGYGDKLV mL17-15 1296 GMRATLLQEFWQLVGGQGDNWM mL17-16 1297 STRATLLNDLWQLMKGWAEDRG mL17-17 1298 SERATLLKELWQLVGGWGDNFG Pepticuerpo Madurado SEQ ID Secuencia Peptidica por Afinidad NO: mL17-18 1299 VGRATLLKEFWQLVEGLVGQSR mL17-19 1300 EIRATLLKEFWQLVDE REQPN mLl7-20 1301 QLRATLLKEFLQLVHGLGETDS mL17-21 1302 TQRATLLKEFWQLIEGLGGKHV mL17-22 1303 HYRATLLKEFWQLVDGLREQGV mL17-23 1304 QSRVTLLREFWQLVESYRPIVN mL17-24 1305 LSRATLLNEFWQFVDGQRDKRM mL17-25 1306 WDRATLLNDFWHLMEELSQKPG mL17-26 1307 QERATLLKEFWRMVEGLGKNRG mLl7-27 1308 NERATLLREFWQLVGGYGVNQR L-20 1309 YREMSMLEGLLDVLERLQHY mL20-l 1310 HQRDMSMLWELLDVLDGLRQYS mL20-2 1311 TQRDMSMLDGLLEVLDQLRQQR mL20-3 1312 TSRDMSLLWELLEELDRLGHQR mL20-4 1313 MQHDMSMLYGLVELLESLGHQI mL20-5 1314 WNRDMRMLESLFEVLDGLRQQV mL20-6 1315 GYRDMSMLEGLLAVLDRLGPQL mL20 conl 1316 TQRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR mL20 con2 1317 WYRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR L21 1318 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ mL-21-1 1319 TQNSRQMLLSDFMMLVGSMIQG mL-21-2 1320 MQTSRHILLSEFMMLVGSIMHG Pepticuerpo Madurado SEQ ID Secuencia Peptidica por Afinidad NO: mL-21-3 1321 HDNSRQMLLSDLLHLVGTMIQG mL-21-4 1322 MENSRQNLLRELIMLVGNMSHQ mL-21-5 1323 QDTSRHMLLREFMMLVGEMIQG mL-21 conl 1324 DQNSRQMLLSDLMILVGSMIQG L-24 1325 EFFH LHNHRSEVNH LDMN mL24-l 1326 NVFFQWVQKHGRVVYQWLDINV mL24-2 1327 FDFLQWLQNHRSEVEHWLVMDV Tabla 24.- Péptidos Inhibidores de Miostatina Nombre de Péptido Pepticuerpo 2x mTN8- M-GAQ-WYPCYEGHFWCYDL- Con6- (N) -1K GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-WYPCYEGHFWCYDL- LE-5G-FC (SEQ ID NO: 1328) 2x mTN8- FC-5G-AQ-WYPCYEGHFWCYDL- Con6- (C) -1K GSGSATGGSGSTASSGSGSATG- WYPCYEGHFWCYDL- LE (SEQ ID NO: 1329) 2x mTN8- M-GAQ-IFGCKWWDVQCYQF- Con7- (N) -1K GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-IFGCKWWDVQCYQF- LE-5G-FC (SEQ ID NO: 1330) Nombre de Péptido Pepticuerpo 2x mTN8- FC-5G-AQ-I FGCKWWDVQCYQF- Con7- (C) -1K GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-IFGCKWWDVQCYQF- LE (SEQ ID NO: 1331) 2x mTN8- M-GAQ-I FGCKWWDVDCYQF- Con8- (N) -1K GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-IFGCKWWDVDCYQF- LE-5G-FC (SEQ ID NO: 1332) 2x mTN8- FC-5G-AQ-I FGCKWWDVDCYQF- Con8- (C) -1K GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-I FGCKWWDVDCYQF- LE (SEQ ID NO: 1333) 2x mTN8-19-7 FC-5G-AQ- LADHGQCIRWPWMCPPEG ELEGSGSATGGSGSTASSG SGSATGLADHGQCIR PWMCPPEGWE-LE (SEQ ID NO: 1334) 2x mTN8-19-7 FC-5G-AQ- ST-GG del2x LADHGQCIRWPWMCPPEGWEGSGSATGGSGGGASSGSG LE SATGLADHGQCIRWPW CPPEGWE (SEQ ID NO: 1335) 2x mTN8-19- FC-5G-AQ- 21 SEYQGLCTRWPW CPPQG KLEGSGSATGGSGSTASSG SGSATGSEYQGLCTRWPWMCPPQGWK-LE (SEQ 10 NO: 1336) Nombre de Péptido Pepticuerpo 2x mTN8-19- FC-5G-AQ- 21 ST-GG SEYQGLCTRWPWMCPPQGWKGSGSATGGSGGGASSGS del2x LE GSATGSEYQGLCTRWPWMCPPQGWK (SEQ ID NO: 1337) 2x mTN8-19- FC-5G-AQ- 22 TFSQGHCTRWPWMCPPQGWGLEGSGSATGGSGSTASSG SGSATGTFSQGHCTRWPWMCPPQG G -L E (SEQ ID NO: 1338) 2x mTN8-19- FC-5G-AQ- 32 VADHGHCTRWPWMCPPQGWGLEGSGSATGGSGSTASS GSGSATGVADHGHCTRWPWMCPPQGWG-LE (SEQ ID NO: 1339) 2x mTN8-19- FC-5G-AQ- 32 ST-GG VADHGHCTRWP MCPPQGWGGSGSATGGSGGGASSGS del2x LE GSATGVADHGHCTRWP VCPPQGWG (SEQ ID NO: 1340) 2x mTN8-19- FC-5G-AQ- 33 PESQGHCTRWP MCPPQGWGLEGSGSATGGSGSTASSG SGSATGPESQGHCTRWPWMCPPQGWGLE (SEQ ID NO: 1341) Nombre de Péptido Pepticuerpo 2x mTN8-19- FC-5G-AQ- 33 ST-GG PESQGHCTRWPWMCPPQGWGGSGSATGGSGGGASSGS de!2x LE GSATGPESQGHCTRWPWMCP PQGWG (SEQ ID NO: 1342) Tabla 25.- Secuencias peptídicas de antagonista de integrina SEQ ID Secuencia/Estructura NO: CLCRGDCIC 1344 CWDDGWLC 1345 CWDDLWWLC 1346 CWDDGLMC 1347 CWDDGWMC 1348 CSWDDGWLC 1349 CPDDLWWLC 1350 NGR 1351 GSL 1352 RGD 1353 CGRECPRLCQSSC 1354 CNGRCVSGCAGRC 1355 CLSGSLSC 1356 GSL 1357 SEQ ID Secuencia /Estructura NO: NGRAHA 1358 CNGRC 1359 CDCRGDCFC 1360 CGSLVRC 1361 DLXXL 1362 RTDLDSLRTYTL 1363 RTDLDSLRTY 1364 RTDLDSLRT 1365 RTDLDSLR 1366 GDLDLLKLRLTL 1367 GDLHSLRQLLSR 1368 RDDLHMLRLQLW 1369 SSDLHALKKRYG 1370 RGDLKQLSELTW 1371 CXXRGDC 1372 STGGFDDVYD ARGVSSALTTTLVATR 1373 STGGFDDVYDWARRVSSALTTTLVATR 1374 SRGVNFSEWLYDMSAAMKEASNVFPSRRSR 1375 SSQNWDMEAGVEDLTAAMLGLLSTIHSSSR 1376 SSPSLYTQFLVNYESAATRIQDLLIASRPSR 1377 SSTGWVDLLGALQRAADATRTSIPPSLQNSR 1378 DVYTKKELIECARRVSEK 1379 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: RGDGX 1380 CRGDGXC 1381 CARRLDAPC 1382 CPSRLDSPC 1383 CDCRGDCFC 1384 CDCRGDCLC 1385 RGDLAALSAPPV 1386 Tabla 26.- Secuencias peptldicas de antagonista de selectina SEQ ID Secuencia/Estructura NO: DIT DQLWDLMK 1387 DITWDELWKIMN 1388 DYTWFELWDMMQ 1389 QITWAQLWNMMK 1390 DMTWHDLWTLMS 1391 DYSWHDLWEMMS - 1392 EITWDQLWEVMN 1393 HVSWEQLWDIMN 1394 HITWDQLWRIMT 1395 RNMSWLELWEHMK 1396 AEWTWDQLWHVMNPAESQ 1397 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: HRAEWLALWEQMSP 1398 KKEDWLALWRIMSV 1399 ITWDQLWDLMK 1400 DITWDQLWDLMK 1401 DITWDQL DLMK 1402 DITWDQLWDLMK 1403 CQNRYTDLVAIQNKNE 1404 AENWADNEPNNKRNNED 1405 RKNNKTWTWVGTKKALTNE 1406 KKALTNEAENWAD 1407 CQXRYTDLVAIQNKXE 1408 AENWADGEPNNKXNXED 1409 Tabla 27.- Péptidos de unión a vinculina SEQ ID Secuencia/Estructura NO: SSQNWDMEAGVEDLTAAMLGLLSTIHSSSR 1410 SSPSLYTQFLVNYESAATRIQDLLIASRPSR 1411 SSTGWVDLLGALQRAADATRTSIPPSLQNSR 1412 DVYTKKELIECARRVSEK 1413 STGGFDDVYDWARGVSSALTTTLVATR 1414 STGGFDDVYDWARRVSSALTTTLVATR 1415 SEQ ID Secuencia/Estructura NO: SRGVNFSEWLYDMSAAMKEASNVFPSRRSR 1416 Tabla 28.- Secuencias peptldicas relacionadas a laminina Tabla 29.- Péptidos de modulación de NGF SEQ ID NO: Secuencia de Porción Peptidica de Producto de Fusión de Fc-Péptido 1427 TGYTEYTEEWPMGFGYQWSF 1428 TDWLSDFPFYEQYFGLMPPG SEQ ID NO: Secuencia de Porción Peptidica de Producto de Fusión de Fc-Péptido 1429 FMRFPNPWKLVEPPQG YYG 1430 VVKAPHFEFLAPPHFHEFPF 1431 FSYIWIDETPSNIDRYMLWL 1432 VNFPKVPEDVEPWP SLKLY 1433 T HPKTYEEFALPFFVPEAP 1434 WHFGTPYIQQQPGVYWLQAP 1435 V NYGPFFMNFPDSTYFLHE 1436 WRIHSKPLDYSHVWFFPADF 1437 FWDGNQPPDILVDWPWNPPV 1438 ' FYSLEWLKDHSEFFQTVTEW 1439 QFMELLKFFNSPGDSSHHFL 1440 TNVDWISNNWEHMKSFFTED 1441 PNEKPYQMQSWFPPDWPVPY 1442 WSHTEWVPQVWWKPPNHFYV 1443 WGEWINDAQVHMHEGFISES 1444 VPWEHDHDLWEIISQDWHIA 1445 VLHLQDPRGWSNFPPGVLEL 1446 IHGCWFTEEGCVWQ 1447 YMQCQFARDGCPQW 1448 KLQCQYSESGCPTI 1449 FLQCEISGGACPAP 1450 KLQCEFSTSGCPDL SEQ ID NO: Secuencia de Porción Peptidica de Producto de Fusión de Fc-Péptido 1451 KLQCEFSTQGCPDL 1452 KLQCEFSTSGCPWL 1453 IQGCWFTEEGCPWQ 1454 SFDCDNP GHVLQSCFGF 1455 SFDCDNPWGHKLQSCFGF Tabla 30.- Péptidos de Modulación de TALL Secuencia/estructura SEQ ID NO: LPGCKWDLLI QWVCDPL-A-V1 1456 V1-A-LPGCKWDLLIKQWVCDPL 1457 LPGCKWDLLIKQWVCDPL-?- 1458 LPGCKWDLLIKQWVCDPL- ?-V1 V1-A-LPGC WDLLIKQWVCDPL- ? - 1459 LPGCK DLLIKQWVCDPL SADCYFDILTKSDVCTSS-A-V1 1460 V1-A-SADCYFDILTKSDVCTSS 1461 SADCYFDILTKSDVTSS-?- 1462 SADCYFDILTKSDVTSS-A-V1 V1-A-SADCYFDILTKSDVTSS-A- 1463 SADCYFDILTKSDVTSS FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A-V1 1464 Secuencia/estructura SEQ ID NO: V1-A-FHDCKWDLLTKQWVCHGL 1465 FHDCKWDLLTKQWVCHGL-?- 1466 FHDCKWDLLTKQ VCHGL-A-V1 Vi-A-FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A- 1467 FHDCKWDLLTKQWVCHGL .- Pepticuerpos inhibidores de TALL- 1 Pepticuerpo Pepti- Secuencia Peptidica cuerpo, SEQ ID NO TALL-l-8-l-a 1468 MPGTCFPFPWECTHAGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG EY CKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK TALL-l-8-2-a 1469 MWGACWPFPWECFKEGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV E ESNGQPENNYKTI PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Pepticuerpo PeptiSecuencia Peptidica cuerpo, SEQ ID O TALL- 1-8-4-a 1470 MVPFCDLLTKHCFEAGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTI PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG TALL- 1- 12-4-a 1471 MGSRCKYK DVLTKQCFHHGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV FNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVE ESNG QPENNY TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK TALL- 1- 12-3-a 1472 MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPA PIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK Pepticuerpo PeptiSecuencia Peptidica cuerpo, SEQ ID NO TALL-l-12-5-a 1473 MSADCYFDILTKSDVCTSSGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVE ESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK TALL-l-12-8-a 1474 MSDDCMYDQLTRMFICSNLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVDVSHEDPEVKFN YVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK TALL-l-12-9-a 1475 MDLNCKYDELTYKEWCQFNGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK TALL-1-12-10- 1476 MFHDCKYDLLTRQMVCHGLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSV a FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTIPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Pepticuerpo Pepti- Secuencia Peptídica cuerpo, SEQ ID NO TALL-1-12-11- 1477 MRNHCFWDHLLKQDICPSPGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN YVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTIS AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQG NVFSCSVMHEALHNHYTQ SLSLSPGK TALL-1-12-14- 1478 MANQCW DSLTKKNVCEFFGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK TALL-1- 1479 MFHDCKWDLLTKQWVCHGLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSV consenso FLFPPKP DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV GFYPS OIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK Pepticuerpo PeptiSecuencia Peptídica cuerpo, SEQ ID NO TALL-1 dímero 1480 MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPG en tándem CKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYR VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSOIAVEWESNGQPEN NYKTIPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK TALL-1 1481 MFHDCKWDLLTKQWVCHGLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMFHD consenso de CKWDLLTKQWVCHGLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP dímero en PKPKDTLMISRTPEVTCV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT tándem KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSOIAVEWESNGQPEN NYKTI PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK Tabla 32.- Péptidos Inhibidores de ANG-2 Péptido SEQ ID NO. Secuencia Péptidica Con4-44 1482 PIRQEECD DPWTCEHM EV Con4-40 1483 TNIQEECEWDPWTCDHMPGK Con4-4 1484 YEQDACEWDPWTCEHMAEV Con4-31 1485 NRLQEVCE DPWTCEHMENV Con4-C5 1486 AATQEECEWDPWTCEH PRS Péptido SEQ ID NO. Secuencia Péptidica Con4-42 1487 LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW Con4-35 1488 VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG Con4-43 1489 SISHEECEWDPWTCEHMQVG Con4-49 1490 WAAQEECEWDPWTCEHMGRM Con4-27 1491 TWPQDKCEWDPWTCEHMGST Con4-48 1492 GHSQEECGWDPWTCEHMGTS Con4-46 1493 QHWQEECEWDPWTCDHMPSK Con4-41 1494 NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR Con4-36 1495 KSGQVECNWDPWTCEHMPRN Con4-34 1496 VKTQEHCDWDPWTCEHMREW Con4-28 1497 AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM Con4-39 1498 PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM Con4-25 1499 RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK Con4-50 1500 HGQNMECEWDPWTCEHMFRY Con4-38 1501 PRLQEECVWDPWTCEHMPLR Con4-29 1502 RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ Con4-47 1503 QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS Con4-20 1504 QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL Con4-45 1505 WAQQEECAWDPWTCDHMVGL Con4-37 1506 LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS Con4-33 1507 PMNQVECDWDPWTCEHMPRS AC2-Con4 1508 FGWSHGCEWDPWTCEHMGST Con4-32 1509 KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP Péptido SEQ ID NO. Secuencia Péptidica Con4-17 1510 GPRISTCQWDPWTCEHMDQL Con4-8 1511 STIGDMCEWDPWTCAHMQVD AC4-Con4 1512 VLGGQGCEWDPWTCRLLQG Con4-l 1513 VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG Con4-Cl 1514 TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG Con4-21 1515 TKGKSVCQWDP TCSHMQSG Con4-C2 1516 TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG Con4-18 1517 WVNEVVCEWDPWTCNH DTP Con4-19 1518 VVQVGMCQ DP TCKHMRLQ Con4-16 1519 AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV Con4-ll 1520 QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR Con4-C4 1521 TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG Con4-23 1522 TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT Con4-15 1523 QWS PPCEWDP TCQTVWPS Con4-9 1524 GTSPSFCQWDP TCSHMVQG TN8-Con4* 1525 QEECEWDP TCEHM Tabla 33.- Péptidos Inhibidores de ANG-2 Péptido SEQ ID NO. Secuencia Péptidica Ll-1 1526 QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT Ll-2 1527 LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS Ll-3 1528 TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ Ll-4 1529 VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA Péptido SEQ ID NO. Secuencia Peptidica Ll-5 1530 VKYKPLDELDEILYEQQTFQER Ll-7 1531 TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG Ll-9 1532 SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA Ll-10 1533 QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA Ll-11 1534 QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS Ll-12 1535 YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV Ll-13 1536 QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR Ll-14 1537 SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ Ll-15 1538 QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG Ll-16 1539 QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR Ll-17 1540 VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ Ll-18 1541 QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS Ll-19 1542 PTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH Ll-20 1543 EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG Ll-21 1544 HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL Ll-22 1545 YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA AC6-L1 1546 TNYKPLDELDATLYEHWILQHS Ll-Cl 1547 PKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR L1-C2 1548 TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR L1-C3 1549 TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR Ll 1550 KFNPLDELEETLYEQFTFQQ Tabla 34.- Péptidos Inhibidores de ANG-2 Tabla 35.- Péptidos Inhibidores de ANG-2 Péptido SEQ ID NO. Secuencia Peptidica 12-9-1 1558 GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT 12-9-2 1559 KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS 12-9-3 1560 LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR 12-9-4 1561 AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK 12-9-5 1562 LLDYCEGVQDPFTFGCENLD 12-9-6 1563 HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG 12-9-7 1564 MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM 12-9-C2 1565 LQDYCEGVEDPFTFGCENQR 12-9-Cl 1566 LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR 12-9 1567 FDYCEGVEDPFTFGCDNH Tabla 36.- Péptidos de Unión a ANG-2 Tabla 37.- Péptidos de Unión a ANG-2 Pepticuerpo Secuencia de Pepticuerpo Ll (N) MGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID INO: 1575) Ll (N) WT MKFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID INO: 1576) Ll (N) 1K WT MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1577) 2xLl (N) MGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGG FNPLDELE ETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1578) 2xLl (N) WT MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGKFNPLDELEETLYE QFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ 10 NO: 1579) Con4 (N) MGAQQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1580) Con4 (N) 1K-WT MQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHLEGG GGG-Fc (SEQ ID NO: 1581) Pepticuerpo Secuencia de Pepticuerpo 2xCon4 (N) 1K MGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH QEECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO : 1582) Ll (C) M-Fc-GGGGGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQLE (SEQ ID NO: 1583) Ll (C) 1K M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELEETLY EQFTFQQLE (SEQ ID NO : 1584) 2xLl (C) M-Fc- GGGGGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGGKFNPLD ELEETLYEQFTFQQLE (SEQ ID NO:1585) Con4 (C) M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO : 1586) Con4 (C) lk M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCE HMLE (SEQ ID NO : 1587) 2xCon4 (C) 1K M-Fc- GGGGGAQQEECE DPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGS ATHQEECE DPWTCEHMLE (SEQ ID NO : 1588) Con4-Ll (N) MGAQEECEWDP TCEHMGGGGGGGG FNPLDELEETLYEQ FTFQQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHLEGGGGG-Fc (SEQ IDNO: 1589) Con4-Ll (C) IM-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELEETLY EQFTFQQGGGGGQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO : 1590) TN-12-9 (N) MGAQ-FDYCEGYEDPFTFGCDNHLE-GGGGG-Fc (SEQ ID No : 1591) C17 (N) MGAQ-QYGCDGFLYGCMINLE-GGGGG-Fc (SEQ ID NO:1592) Pepticuerpo Secuencia de Pepticuerpo TN8-8 (N) MGAQ-KRPCEEMWGGCNYDLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1593) TN8-14 (N) MGAQ-HQICKWDPWTCKH LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1594) Conl (N) MGAQ-KRPCEEIFGGCTYQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1595) Tabla 38.- Péptidos de Unión a ANG-2 Pepticuerpos Madurados Secuencia de Pepticuerpo (Seq Id No:) por Afinidad Derivados de Con4 Con4-44 (C) M-Fc-GGGGGAQ-PIRQEECDWDPWTCEHMWEV-LE (SEQ ID NO: 1596) Con4-40 (C) M-Fc-GGGGGAQ-T IQEECEWDPWTCDHMPGK-LE (SEQ ID NO: 1597) Con4-4 (C) M-Fc-GGGGGAQ-WYEQDACEWDP TCEHMAEV-LE (SEQ ID NO: 1598) Con4-31 (C) M-Fc-GGGGGAQ-NRLQEVCEWDPWTCEHMENV-LE (SEQ ID NO: 1599) Con4-C5 (C) M-Fc-GGGGGAQ-AATQEECEWDPWTCEHMPRS-LE (SEQ ID NO: 1600) Con4-42 (C) M-Fc-GGGGGAQ-LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW-LE (SEQ ID NO: 1601) Con4-35 (C) M-Fc-GGGGGAQ-VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG-LE (SEQ ID NO: 1602) Con4-43 (C) M-Fc-GGGGGAQ-SISHEECEWDPWTCEHMQVG-LE (SEQ ID NO: 1603) Con4-49 (C) M-Fc-GGGGGAQ-WAAQEECEWDPWTCEHMGRM-LE (SEQ ID NO: 1604) Con4-27 (C) M-Fc-GGGGGAQ-TWPQDKCEWDPWTCEHMGST-LE (SEQ ID NO: 1605) Pepticuerpos Madurados Secuencia de Pepticuerpo (Seq Id No:) por Afinidad Derivados de Con4 Con4-48 (C) M-Fc-GGGGGAQ-GHSQEECGWDPWTCEHMGTS-LE (SEQ ID NO: 1606) Con4-46 (C) M-Fc-GGGGGAQ-QHWQEECE DPWTCDHMPSK-LE (SEQ ID NO: 1607) Con4-41 (C) M-Fc-GGGGGAQ-NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR-LE (SEQ ID NO: 1608) Con4-36 (C) M-Fc-GGGGGAQ-KSGQVECNWDPWTCEHMPRN-LE (SEQ ID NO: 1609) Con4-34 (C) M-Fc-GGGGGAQ-VKTQEHCDWDPWTCEHMREW-LE (SEQ ID NO: 1610) Con4-28 (C) M-Fc-GGGGGAQ-AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM-LE (SEQ ID NO: 1611) Con4-39 (C) M-Fc-GGGGGAQ-PVNQEDCEWDP TCEH PPM-LE (SEQ ID NO: 1612) Con4-25 (C) M-Fc-GGGGGAQ-RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK-LE (SEQ ID NO: 1613) Con4-50 (C) M-Fc-GGGGGAQ-HGQNMECE DPWTCEHMFRY-LE (SEQ ID NO: 1614) Con4-38 (C) M-Fc-GGGGGAQ-PRLQEECV DPWTCEHMPLR-LE (SEQ ID NO: 1615) Con4-29 (C) M-Fc-GGGGGAQ-RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ-LE (SEQ ID NO: 1616) Con4-47 (C) M-Fc-GGGGGAQ-QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS-LE (SEQ ID NO: 1617) Con4-20 (C) M-Fc-GGGGGAQ-QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL-LE (SEQ ID NO: 1618) Con4-45 (C) M-Fc-GGGGGAQ-WAQQEECAWDP TCDHMVGL-LE (SEQ ID NO: 1619) Con4-37 (C) M-Fc-GGGGGAQ-LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS-LE (SEQ ID NO: 1620) Pepticuerpos Madurados Secuencia de Pepticuerpo (Seq Id No:) por Afinidad Derivados de Con4 Con4-33 (C) M-Fc-GGGGGAQ-PMNQVECDWDPWTCEHMPRS-LE (SEQ ID NO: 1621) AC2-Con4 (C) M-Fc-GGGGGAQ-FGWSHGCEWDPWTCEHMGST-LE (SEQ ID NO: 1622) Con4-32 (C) M-Fc-GGGGGAQ-KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP-LE (SEQ ID NO: 1623) Con4-17 (C) M-Fc-GGGGGAQ-GPRISTCQWDPWTCEHMDQL-LE (SEQ ID NO: 1624) Con4-8 (C) M-Fc-GGGGGAQ-STIGDMCEWDPWTCAHMQVD-LE (SEQ ID NO: 1625) AC4-Con4 (C) M-Fc-GGGGGAQ-VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 1626) Con4-l (C) M-Fc-GGGGGAQ-VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG-LE (SEQ ID NO: 1627) Con4-Cl (C) M-Fc-GGGGGAQ-TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG-LE (SEQ ID NO: 1628) Con4-21 (C) M-Fc-GGGGGAQ-TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG-LE (SEQ ID NO: 1629) Con4-C2 (C) M-Fc-GGGGGAQ-TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG-LE (SEQ ID NO: 1630) Con4-18 (C) M-Fc-GGGGGAQ-WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP-LE (SEQ ID NO: 1631) Con4-19 (C) M-Fc-GGGGGAQ-VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ-LE (SEQ ID NO: 1632) Con4-16 (C) M-Fc-GGGGGAQ-AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV-LE (SEQ ID NO: 1633) Con4-ll (C) M-Fc-GGGGGAQ-QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR-LE (SEQ ID NO: 1634) Con4-C4 (C) M-Fc-GGGGGAQ-TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG-LE (SEQ ID NO: 1635) Pepticuerpos Madurados Secuencia de Pepticuerpo (Seq Id No:) por Afinidad Derivados de Con4 Con4-23 (C) M-Fc-GGGGGAQ-TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT-LE (SEQ ID NO: 1636) Con4-15 (C) M-Fc-GGGGGAQ-QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS-LE (SEQ ID NO: 1637) Con4-9 (C) M-Fc-GGGGGAQ-GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG-LE ' (SEQ ID NO: 1638) Con4-10 (C) M-Fc-GGGGGAQ-TQGLHQCEWDPWTCKVLWPS-LE (SEQ ID NO: 1639) Con4-22 (C) M-Fc-GGGGGAQ-VWRSQVCQWDPWTCNLGGDW-LE (SEQ ID NO: 1640) Con4-3 (C) M-Fc-GGGGGAQ-DKILEECQWDPWTCQFFYGA-LE (SEQ ID NO: 1641) Con4-5 (C) M-Fc-GGGGGAQ-ATFARQCQWDPWTCALGGNW-LE (SEQ ID NO: 1642) Con4-30 (C) M-Fc-GGGGGAQ-GPAQEECEWDPWTCEPLPLM-LE (SEQ ID NO: 1643) Con4-26 (C) M-Fc-GGGGGAQ-RPEDMCSQWDPWTWHLQGYC-LE (SEQ ID NO: 1644) Con4-7 (C) M-Fc-GGGGGAQ-LWQLAVCQWDPQTCDHMGAL-LE (SEQ ID NO: 1645) Con4-12 (C) M-Fc-GGGGGAQ-TQLVSLCEWDPWTCRLLDGW-LE (SEQ ID NO: 1646) Con4-13 (C) M-Fc-GGGGGAQ-MGGAGRCEWDPWTCQLLQGW-LE (SEQ ID NO: 1647) Con4-14 (C) M-Fc-GGGGGAQ-MFLPNECQWDPWTCSNLPEA-LE (SEQ ID NO: 1648) Con4-2 (C) M-Fc-GGGGGAQ-FGWSHGCEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 1649) Con4-6 (C) M-Fc-GGGGGAQ-WPQTEGCQWDPWTCRLLHG -LE (SEQ ID NO: 1650) Pepticuerpos Madurados Secuencia de Pepticuerpo (Seq Id No:) por Afinidad Derivados de Con4 Con4-24 (C) M-Fc-GGGGGAQ-PDTRQGCQWDPWTCRLYGM -LE (SEQ ID NO: 1651) ACl-Con4 (C) M-Fc-GGGGGAQ-TWPQDKCE DPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 1652) AC3-Con4 (C) M-Fc-GGGGGAQ-DKILEECE DPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 1653) AC5-Con4 (C) M-Fc-GGGGGAQ-AATQEECEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 1654) Ll Madurados por Pepticuerpo (Seq Id No:) Afinidad Derivados de Pbs Ll-7 (N) MGAQ-TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG-LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1655) AC6-L1 (N) MGAQ-TNYKPLDELDATLYEHWILQHS LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1656) Ll-15 (N) MGAQ-QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1657) Ll-2 (N) MGAQ-LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1658) Ll-10 (N) MGAQ-QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1659) Ll-13 (N) MGAQ-QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1660) Ll-5 (N) MGAQ-VKYKPLDELDEILYEQQTFQER LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1661) L1-C2 (N) MGAQ-TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1662) L1-C3 (N) MGAQ-TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1663) Pepticuerpos Madurados Secuencia de Pepticuerpo (Seq Id No:) por Afinidad Derivados de Con4 Ll-11 (N) MGAQ-QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1664) Ll-17 (N) MGAQ-VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1665) Ll-12 (N) MGAQ-YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1666) Ll-1 (N) MGAQ-QNYKPLDELDATLYEHFI FHYT LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1667) Ll-4 (N) MGAQ-VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1668) Ll-20 (N) MGAQ-EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1669) Ll-22 (N) MGAQ-YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1670) Ll-14 (N) MGAQ-SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1671) Ll-16 (N) MGAQ-QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1672) Ll-18 (N) MGAQ-QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1673) Ll-3 (N) MGAQ-TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1674) Ll-21 (N) MGAQ-HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1675) Ll-Cl (N) MGAQ-QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1676) Ll-19 (N) MGAQ-QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1677) Ll-9 (N) MGAQ-SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA LEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 1678) Pepticuerpos Madurados Secuencia de Pepticuerpo (Seq Id No:) por Afinidad Derivados de Con4 Conl Madurados por Pepticuerpo (Seq Id No:) Afinidad Derivados de Pbs Conl-4 (C) M-Fc-GGGGGAQ-SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL-LE (SEQ ID NO: 1679) Conl-1 (C) M-Fc-GGGGGAQ-AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA-LE (SEQ ID NO: 1680) Conl-6 (C) M-Fc-GGGGGAQ-GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG-LE (SEQ ID NO: 1681) Conl-3 (C) M-Fc-GGGGGAQ-APGQRPYDGMLGWPTYQRIV-LE (SEQ ID NO: 1682) Conl-2 (C) M-Fc-GGGGGAQ-QTWDDPCMHILGPVTWRRCI-LE (SEQ ID NO: 1683) Conl-5 (C) M-Fc-GGGGGAQ-FGDKRPLECMFGGPIQLCPR-LE (SEQ ID NO: 1684) Parent: Conl (c) M-Fc-GGGGGAQ-KRPCEEI FGGCTYQ-LE (SEQ ID NO: 1685) 12-9 Derivado Pepticuerpo (Seq Id No:) 12-9-3 (C) M-Fc-GGGGGAQ-LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR-LE (SEQ ID NO: 1686) 12-9-7 (C) M-Fc-GGGGGAQ-MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM-LE (SEQ ID NO: 1687) 12-9-6 (C) M-Fc-GGGGGAQ-HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG-LE (SEQ ID NO: 1688) 12-9-C2 (C) M-Fc-GGGGGAQ-LQDYCEGVEDPFTFGCENQR-LE (SEQ ID NO: 1689) 12-9-5 (C) M-Fc-GGGGGAQ-LLDYCEGVQDPFTFGCENLD-LE (SEQ ID NO: 1690) 12-9-1 (C) M-Fc-GGGGGAQ-GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT-LE (SEQ ID NO: 1691) Pepticuerpos Madurados Secuencia de Pepticuerpo (Seq Id No:) por Afinidad Derivados de Con4 12-9-4 (C) M-Fc-GGGGGAQ-AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK-LE (SEQ ID NO: 1692) 12-9-Cl (C) M-Fc-GGGGGAQ-LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR-LE (SEQ ID NO: 1693) 12-9-2 (C) M-Fc-GGGGGAQ-KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS-LE (SEQ ID NO: 1694) Parent: 12-9 (C) M-Fc-GGGGGAQ-FDYCEGVEDPFTFGCDNH-LE (SEQ ID NO: 1695) Además de los compuestos de TMP expuestos en la Tabla 6, la invención proporciona numerosos compuestos de TMP diferentes. En un aspecto, los compuestos de TMP comprende la siguiente estructura general: TMPX- (Li) n-TMP2 en donde TMPi y TMP2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo de compuestos que comprenden la estructura núcleo: X2-X3-X4-X5- 6-^7-^8-X9-X10 en donde, X2 se selecciona del grupo que consiste de Glu, Asp, Lys, y Val; X3 se selecciona del grupo que consiste de Gly y Ala; X4 es Pro; X5 se selecciona del grupo que consiste de Thr y Ser; ?d se selecciona del grupo que consiste de Leu, lie, Val, Ala, y Phe; X7 se selecciona del grupo que consiste de Arg y Lys; X8 se selecciona del grupo que consiste de Gln, Asn, y Glu; X9 se selecciona del grupo que consiste de Trp, Tyr, y Phe; Xio se selecciona del grupo que consiste de Leu, lie, Val, Ala, Phe, Met, y Lys; Li es un ligador como se describe en la presente; y n es 0 ó 1 ; y sales fisiológicamente aceptables de los mismos. En una modalidad, Li comprende (Gly)n, en donde n es de 1 hasta 20, y cuando n es mayor que 1, hasta la mitad de los residuos Gly se pueden sustituir por otro aminoácido seleccionado de los restantes 19 aminoácidos naturales o un estereoisómero de los mismos. Además de la estructura núcleo X2-Xio expuesta anteriormente para TMPi y TMP2, también son posibles otras estructuras relacionadas en donde se adiciona uno o más de lo siguiente a la estructura núcleo de TMPi y/o TMP2: Xi se une al N-término y/o Xn, Xi2, Xi3, y/o Xi4 se unen al C-término, en donde Xi, Xi2, X13, y X14 son como sigue: Xi se selecciona del grupo que consiste de lie, Ala, Val, Leu, Ser, y Arg; X11 se selecciona del grupo que consiste de Ala, He, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His, y Glu; X12 se selecciona del grupo que consiste de Ala, lie, Val, Leu, Phe, Gly, Ser, y Gln; X13 se selecciona del grupo que consiste de Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln, y Gly; y X14 se selecciona del grupo que consiste de Ala, lie, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu, y Gly. Los compuestos de TMP de la invención están constituidos de, es decir, que comprenden, al menos 9 subunidades (X2-Xio) , en donde X2-X10 comprenden la estructura núcleo. Las subunidades X2-Xi4 son aminoácidos independientemente seleccionados de entre los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural, sin embargo, la invención abarca compuestos donde X2-Xi4 se seleccionan independientemente del grupo de aminoácidos atipicos que no se presentan de manera natural, bien conocidos en la técnica. Los aminoácidos específicos se identifican para cada posición. Por ejemplo, X2 puede ser Glu, Asp, Lys, o Val. Se usan en la presente abreviaciones tanto de tres letras como de una letra para los aminoácidos; en cada caso, las abreviaciones son las normales usadas para los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural o variaciones bien conocidas de los mismos. Estos aminoácidos pueden tener ya sea la estereoquímica L o D (excepto por Gly, que no es L ni D) , y los TMP (así como todos los otros compuestos de la invención) pueden comprender una combinación de estereoquímicas. La invención también proporciona moléculas de TMP inversas (así como para todos los otros péptidos descritos en la presente) en donde se invierte la secuencia amino-terminal a carboxi-terminal de los aminoácidos. Por ejemplo, lo inverso de una molécula que tiene la secuencia normal Xi-X2-X3 sería X3-X2-Xi. La invención también proporciona moléculas de TMP retro-inversas (así como todas las otras moléculas de la invención descritas en la presente) , en donde, al igual que un TMP inverso, la secuencia amino-terminal a carboxi-terminal de aminoácidos se invierte y los residuos que normalmente son enantiómeros "L" en TMP se alteran a la forma "D" del estereoisómero . Los compuestos de TMP de ejemplo de la invención por lo tanto incluyen sin limitación los siguientes compuestos: IEGPTLRQWLAARA-GPNG- IEGPTLRQWLAARA ' (SEQ ID NO: 993) IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cíclico) I I (SEQ ID NO: 994) IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineal) (SEQ ID NO: 995) IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID NO: 996) IEGPTLRQ LAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 997) IEGPTLRQWLAARA-GGGK (BrAc) GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 998) IEGPTLRQ LAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 999) IEGPTLRQWLAARA-GGGK (PEG) GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1000) IEGPTLRQWLAARA-GGGC (PEG) GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1001) IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1002) IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1003) IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1004) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1005) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID NO: 1006) IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID NO: 1007) Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1008; Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 100f Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cíclico) (SEQ ID NO: 1010 Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineal) (SEQ ID NO: 1011) Fc- IEGPTLRQALAARA-¦GGGGGGGG- IEGPTLRQALAARA (SEQ ID NO: 1012) Fc- IEGPTLRQWLAARA-¦GGGKGGGG- IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1013) Fc-¦IEGPTLRQWLAARA-¦GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1014) Fc- IEGPTLRQWLAARA-•GGGNGSGG- IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1015) Fc- IEGPTLRQWLAARA-¦GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA Fc-•IEGPTLRQWLAARA-•GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1016) Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1017) Compuestos Derivatizados La invención también contempla la derivatización del péptido y/o porción de vehículo (como se analiza más adelante) de los compuestos. Estos compuestos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica, y similares de los compuestos. Las porciones pueden eliminar o atenuar de manera alternativa cualquier efecto secundario indeseado de los compuestos y similares. Los compuestos derivatizados de ejemplo incluyen compuestos en los cuales: 1. El compuesto o alguna porción del mismo es cíclica. Por ejemplo, la porción de péptido se puede modificar para contener dos o más residuos de Cys (por ejemplo, en el ligador) , que pueden ciclizarse por formación de enlace de disulfuro. Para citas a referencias en la preparación de productos derivatizados ciclizados, ver Tabla 2. 2. El compuesto se retícula o se vuelve capaz de reticulación entre moléculas. Por ejemplo, la porción de péptido se puede modificar para contener un residuo de Cys y de este modo ser capaz de formar un enlace de disulfuro intermolecular con una molécula similar. El compuesto también se puede reticular a través de su C-término, como en la molécula mostrada a continuación. 3. Uno o más enlaces de peptidilo [-C(0)NR-] (enlaces) se reemplaza por un enlace no de peptidilo. Los enlaces no de peptidilo de ejemplo son -CH2-carbamato [-CH2-OC(0)NR-], fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S (O) 2NR-] , urea [-NHC (O) H-] , -CH2-amina secundaria, y péptido alquilado [-C(0)NR6- en donde R6 es un alquilo inferior]. 4. El N-término se derivatiza. Típicamente, el N-término se puede acilar o modificar a una amina sustituida. Los grupos derivatizados N-terminales de ejemplo incluyen -NRR1 (diferente de -NH2 ) , -NRC(0)R1, -NRC(0)0R1, -NRS(0)2R1, -NHC(0)NHR1, succinimida, o benciloxicarbonil-NH- (CBZ-NH- ) , en donde R y Rl son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo ¦ inferior y en donde el anillo de fenilo puede estar sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de Cl-C4alquilo, Cl-C4alcoxi, cloro, y bromo. 5. El C-término libre se derivatiza. Típicamente, el C-término se esterifica o amida. Por ejemplo, se pueden usar métodos descritos en la técnica para adicionar (NH-CH2-CH2-NH2)2 a los compuestos de esta invención. Igualmente, se pueden usar métodos descritos en la técnica para adicionar -NH2 a los compuestos de esta invención. Los grupos derivatizados C-terminales de ejemplo incluyen, por ejemplo, -C(0)R2, en donde R2 es alquilo inferior o -NR3R4, en donde R3 y R4 son independientemente hidrógeno o Cl-C8alquilo (de manera preferente Cl-C4alquilo) . 6. Se reemplaza un enlace de disulfuro con otra porción de reticulación, preferentemente más estable (por ejemplo, un alquileno) . Ver, por ejemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9. 7. Se modifican uno o más residuos individuales de aminoácido. Se conocen varios agentes de derivatización para reaccionar específicamente con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales seleccionados, como se describe en detalle más adelante. 8. Típicamente, se usan polímeros heterobifuncionales para enlazar proteínas. Un ejemplo es S CC, o Succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-l- carboxilato. El extremo de NHS (N-Hidroxilsuccinimida) reacciona con aminas primarias, que la conjugación a pH ~7 es óptima. Una vez que se forma el complejo, la reacción de la porción de maleimida de SMCC puede proseguir con otra proteína/péptido que contiene un grupo sulfhidrilo libre, que ' se presenta a una velocidad mucho más rápida que la formación de la amida en la reacción inicial. El resultado es un enlace entre dos proteínas, por ejemplo, conjugados de anticuerpo- enzima. Se ilustra una aplicación por la preparación de fragmentos Fab ' reticulados a peroxidasa de rábano (Ishikwa, et al., 1983a, b; Yoshitake et al., 1982a, b; Imagawa et al., 1982; Uto et al., 1991). El uso de sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidil-4- (N-maleimidometil) -ciclohexano-1- carboxilato) permite solubilidad en agua de modo que no se necesita un paso de solubilización orgánica, que permite mayor flexibilidad y menos interrupción de la actividad en la reacción con proteínas. Se pueden hacer reaccionar residuos de lisinilo y residuos amino-terminales con .anhídridos de ácido succínico u otro carboxílico, que invierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tal como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; 0-metilisourea; 2 , 4 -pentanodiona ; y reacción catalizada con transaminasa con glioxilato. Se pueden modificar residuos de arginilo por reacción con cualquiera o una combinación de varios reactivos convencionales, incluyendo fenilglioxal , 2 , 3-butanodiona , 1,2-ciclohexanodiona , y ninhidrina. La derivati zación de residuos de arginilo requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido a la pKa alta del grupo funcional de guanidina. Adicionalmente, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina asi como los grupos de epsilon-amino de arginina. Se han estudiado extensivamente las modificaciones especificas de residuos de tirosilo, con interés particular en introducir marcas espectrales en residuos de tirosilo por reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano . Más comúnmente, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil-tirosilo y compuestos derivatizados de 3-nitro, respectivamente. Los grupos de cadena lateral de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se pueden modificar selectivamente por reacción con carbodiimidas (R 1 -N=C=N-R ' ) tal como l-ciclohexil-3- ( 2-morfolinil- ( 4-etil ) carbodiimida o l-etil-3- ( 4 -azonia- , 4 -dimetilpentil ) carbodiimida . Adicionalmente, los residuos de aspartilo y glutamilo se pueden convertir a residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones de amonio. Se pueden desamidar residuos de glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo. De manera alternativa, estos residuos se desamidan bajo condiciones moderadamente ácidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención. Los residuos de cisteinilo se pueden reemplazar por residuos de aminoácido u otras porciones ya sea para eliminar el enlace de disulfuro, o por el contrario, para estabilizar la reticulación. Ver, por ejemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9. La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los péptidos o sus derivados funcionales a una matriz de soporte insoluble en agua o a otros vehículos macromoleculares . Los agentes reticuladores comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1 , 1-bis (diazoacetil ) -2-feniletano, glutaraldehído , ásteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicí lico, imidoésteres homobifuncionales , incluyendo ésteres de disuccinimidilo tal como 3, 3 ' -ditiobis (succinimidilpropionato) , y maleimidas bifuncionales tal como bis-N-maleimido-1 , 8-octano . Los agentes de derivatización tal como metil-3-[(p-azidofenil ) ditio] propioimidato producen compuestos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en la presencia de luz. De manera alternativa, se emplean para la inmovilización de proteínas, matrices reactivas insolubles en agua tal como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de los Estados Unidos números 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440. Los grupos de carbohidrato ( oligosacárido ) se pueden unir convenientemente a sitios que se conoce que son sitios de glicosilación en proteínas. En general, los oligosacáridos 0-enlazados se unen a residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) en tanto que los oligosacáridos N-enlazados se unen a residuos de asparagina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferentemente uno de los 19 aminoácidos que se presentan de manera natural diferente de prolina. Las estructuras de los oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo, son diferentes. Un tipo de azúcar que comúnmente se encuentra en ambos es ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico) . Usualmente, el ácido siálico es el residuo terminal de oligosacáridos tanto N-enlazados como O-enlazados, y en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Estos sitios se pueden incorporar en el ligador de los compuestos de esta invención y de manera preferente se glicosilan por una célula durante la producción recombinante de los compuestos de polipéptido (por ejemplo, en células mamíferas tal como CHO, BHK, COS) . Sin embargo, estos sitios se pueden glicosilar adicionalmente por procedimientos sintéticos o sertiisintéticos conocidos en la técnica. Otras modificaciones posibles incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en Cys, metilación de grupos alfa-amino de lisina, arginina, y cadenas laterales de histidina. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), ¦pp. 79-86 (1983) . Los compuestos de la presente invención se pueden cambiar al nivel de ADN, también. La secuencia de ADN de cualquier porción del compuesto se puede cambiar a codones más compatibles con la célula hospedadora elegida. Para E. coli, que es la célula hospedadora preferida, se conocen en la técnica los codones optimizados. Los codones se pueden sustituir para eliminar sitios de restricción o para incluir sitios de restricción imperceptibles, que pueden ayudar en el procesamiento del ADN en la célula hospedadora elegida. El vehículo, ligador y las secuencias de ADN peptídicas se pueden modificar para incluir cualquiera de los cambios de secuencia anteriores . Compuestos derivatizados conjugados a isotipo y toxina. Otro conjunto de compuestos derivatizados útiles son las moléculas descritas anteriormente, conjugádas a toxinas, trazadores, o radioisótopos. Esta conjugación es especialmente útil para moléculas que comprenden secuencias peptidicas que se unen a células tumorales o patógenas. Estas moléculas se pueden usar como agentes terapéuticos o como una ayuda para cirugía (por ejemplo, cirugía radioinmunoguiada o RIGS) o como agentes de diagnóstico (por ejemplo, radioinmunodiagnósticos 0 RID) . Como agentes terapéuticos, estos compuestos derivatizados conjugados poseen varias ventajas. Facilitan el uso de toxinas y radioisótopos que serían tóxicos si se administraran sin la unión específica proporcionada por la secuencia peptídica. También pueden reducir los efectos secundarios que acompañan el uso de radiación y quimioterapia al facilitar menores dosis efectivas del compañero de conjugación. Los compañeros de conjugación útiles incluyen: - radioisótopos, tal como 90 Itrio, 131 Yodo, 225 Actinio, y 213 Bismuto; toxina de ricino A, toxinas microbianamente derivadas tal como endotoxina de Pseudomonas (por ejemplo, PE38, PE40), y similares; - moléculas compañeras en sistemas de captura (ver más adelante) ; biotina, estreptavidina (útil como ya sea moléculas compañeras en sistemas de captura o como trazadores, especialmente para usos de diagnóstico) ; y - agentes citotóxicos (por ejemplo, doxorrubicina ) . Una adaptación útil de estos derivados conjugados es el uso en un sistema de captura. En este sistema, la molécula de la presente invención comprenderá una molécula benigna de captura. Esta molécula de captura será capaz de unirse específicamente a una molécula efectora separada que comprende, por ejemplo, una toxina o radioisótopo. Tanto la molécula conjugada a vehículo como la molécula efectora se administrarán al paciente. En este sistema, la molécula efectora tendrá una vida media corta excepto cuando se una a la molécula de captura, conjugada a vehículo, reduciendo al mínimo de este modo cualquier efecto secundario tóxico. La molécula conjugada a vehículo tendrá una vida media relativamente prolongada, pero será benigna y no tóxica. Las porciones de unión específica de ambas moléculas pueden ser parte de un par conocido de unión específica (por ejemplo, biotina, estreptavidina ) o pueden resultar de métodos de generación de péptidos como aquellos descritos en la presente. Estos compuestos derivatizados conjugados se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica. En el caso de moléculas efectoras proteicas (por ejemplo, endotoxina de Pseudomonas ) , estas moléculas se pueden expresar como proteínas de fusión de construcciones de ADN correlativas. Se pueden preparar compuestos derivatizados, conjugados a radioisótopo, por ejemplo, como se describe para el anticuerpo BEXA (Coulter) . Se pueden preparar compuestos derivati zados que comprenden agentes citotóxicos o toxinas microbianas, por ejemplo, como se describe para el anticuerpo BR96 (Bristol-Myers Squibb) . Se pueden preparar moléculas empleadas en sistemas de captura, por ejemplo, como se describe por las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones de NeoRx. Se pueden preparar moléculas empleadas para RIGS y RID, por ejemplo, por las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones de NeoProbe.
Vehículos La invención requiere la presencia de al menos un vehículo unido a un péptido a través del N-término, C-término o una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácido. También se pueden usar múltiples vehículos. En un aspecto, un dominio Fe es el vehículo. El dominio Fe se puede fusionar al término N o C de los péptidos o a tanto el término N como el término C. En varias modalidades de la invención, el componente Fe es ya sea un Fe nativo o una variante de Fe. La fuente de inmunoglobulina del Fe nativo es, en un aspecto, de origen humano y puede ser, en modalidades alternativas, de cualquier clase de inmunoglobulina. Los dominios Fe nativos están constituidos de polipéptidos monoméricos que se pueden enlazar en formas diméricas o multiméricas por asociación covalente (es decir, enlaces de disulfuro) y/o no covalente. El número de enlaces intermoleculares de disulfuro entre subunidades monoméricas de moléculas Fe nativas varia desde uno a cuatro dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclases (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Un ejemplo de un Fe nativo es un dimero unido a disulfuro que resulta de la digestión con papaina de una IgG (ver Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Se debe señalar que los monómeros de Fe se dimerizarán espontáneamente cuando estén presentes los residuos apropiados de cisteina, a menos que estén presentes condiciones particulares que impidan la dimerización a través de la formación de enlaces de disulfuro. Aún si se remueven o reemplazan por otros residuos, los residuos de cisteina que normalmente forman enlaces de disulfuro en el dimero de Fe, las cadenas monoméricas formarán en general un dimero a través de interacciones no covalentes. El término "Fe" se usa en la presente para querer decir cualquiera de estas formas: el monómero nativo, el dimero nativo (enlazado por unión a disulfuro), dimeros modificados (enlazado por disulfuro y/o de forma no covalente) , y monómeros modificados (es decir, compuestos derivatizados ) . Como se señala, las variantes de Fe son vehículos adecuados dentro del alcance de. esta invención. Un Fe nativo se puede modificar extensivamente para formar una variante de Fe, con la condición que se mantenga la unión al receptor de salvamento; ver, por ejemplo, WO 97/34631 y WO 96/32478. En estas variantes de Fe, se pueden remover uno o más sitios de un Fe nativo que proporcionan características estructurales o actividad funcional no requerida por las moléculas de fusión de esta invención. Se pueden remover estos sitios por ejemplo al sustituir o suprimir residuos, al insertar residuos en el sitio, o al truncar porciones que contienen el sitio. Los residuos insertados o sustituidos también pueden ser aminoácidos alterados, tal como peptidomiméticos o D-aminoácidos. Las variantes de Fe pueden ser deseables por varias razones, varias de las cuales se describen en la presente. Las variantes de Fe de ejemplo incluyen moléculas y secuencias en las cuales: 1. Se remueven sitios comprendidos en la formación de enlaces de disulfuro. Esta remoción puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína, presentes en la célula hospedadora usada para producir las moléculas de la invención. Para este propósito, el segmento que contiene cisteína en el N-término se puede truncar o se pueden suprimir o sustituir los residuos de cisteína con otros aminoácidos (por ejemplo, alanilo, serilo) . Aún cuando se remuevan los residuos de cisteína, los dominios Fe de cadena individual pueden aún formar un dominio Fe dimérico que se mantiene conjuntamente de forma no covalente. 2. Un Fe nativo se modifica para hacerlo más compatible con una célula hospedadora seleccionada. Por ejemplo, se puede remover la secuencia de PA cerca del N-término de un Fe nativo típico, que se puede reconocer por una enzima digestiva en E. coli tal como prolina-iminopeptidasa . También se puede adicionar un residuo de metionina N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa de forma recombinante en una célula bacteriana tal como E. coli. 3. Una porción del N-término de un Fe nativo se remueve para impedir la heterogeneidad N-terminal cuando se expresa en una célula hospedadora seleccionada. Para este propósito, se puede suprimir cualquiera de los primeros 20 residuos de aminoácido en el N-término, particularmente aquéllos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5. 4. Se remueven uno o más sitios de glicosilación . Los residuos que típicamente están glicosilados (por ejemplo, asparagina) pueden conferir respuesta citolítica. Estos residuos se pueden suprimir o sustituir con residuos no glicosilados (por ejemplo, alanina). 5. Se remueven sitios comprendidos en la interacción con el complemento, tal como el sitio de unión Clq. Por ejemplo, se pueden suprimir o sustituir la secuencia EKK de IgGl humana. El reclutamiento de complemento no puede ser ventajoso para las moléculas de esta invención y de este modo se puede evitar con esta variante de Fe. 6. Se remueven sitios que afectan la unión a receptores de Fe diferentes de un receptor de salvamento. Un Fe nativo puede tener sitios para interacción con ciertas células sanguíneas blancas que no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y de este modo se pueden remover. 7. Se remueve el sitio de ADCC. Los sitios de ADCC se conocen en la técnica; ver, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) con respecto a los sitios de ADCC en IgGl. Estos sitios, tampoco, no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y de este modo se pueden remover . 8. Cuando el Fe nativo se deriva de un anticuerpo no humano, el Fe nativo se puede humanizar. Típicamente, para humanizar un Fe nativo, se sustituirán residuos seleccionados en el Fe nativo no humano con residuos que normalmente se encuentran en el Fe nativo humano. Son bien conocidas las técnicas para humanización de anticuerpos. Un vehículo alternativo será una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto peptidomimético) capaz de la unión a un receptor de salvamento. Por ejemplo, se puede usar como un vehículo un polipéptido como se describe en la patente de los Estados Unidos número 5,739,277, emitida el 14 de abril de 1998 a Presta et al. Los péptidos también se pueden seleccionar por visualización en fago para la unión al receptor de salvamento de RcRn. Estos compuestos de unión al receptor de salvamento también se incluyen dentro del significado de "vehículo" y están dentro del alcance de esta invención. Estos vehículos se deben seleccionar para vida media incrementada (por ejemplo, al evitar secuencias reconocidas por proteasa) e inmunogenicidad disminuida (por ejemplo, al favorecer secuencias no inmunogénicas , como se descubrió en la humanización de anticuerpo) . Se pueden construir variantes, análogos o derivados de la porción Fe por ejemplo al hacer varias sustituciones de residuos o secuencias. Los polipéptidos variantes (o análogos) incluyen variantes de inserción, en donde uno o más residuos de aminoácido complementan una secuencia de aminoácidos de Fe. Las inserciones se pueden localizar en cualquiera o ambos términos de la proteína, o se pueden colocar dentro de regiones internas de la secuencia de aminoácidos de Fe. Las variantes de inserción, con residuos adicionales en cualquiera o ambos términos, pueden incluir, por ejemplo, proteínas de fusión y proteínas que incluyen marcas o marbetes de aminoácidos. Por ejemplo, la molécula de Fe puede contener opcionalmente un Met N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa de manera recombinante en una célula bacteriana tal como E. coli. En variantes de supresión de Fe, se remueven uno o más residuos de aminoácido en un polipéptido de Fe. Las supresiones se pueden efectuar en uno o ambos términos del polipéptido de Fe, o con remoción de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de Fe. Por lo tanto, las variantes de supresión incluyen todos los fragmentos de una secuencia de polipéptido de Fe. En las variantes de sustitución de Fe, se remueven uno o más residuos de aminoácido de un polipéptido de Fe y se reemplazan con residuos alternativos. En un aspecto, las sustituciones son de naturaleza conservadora y son bien conocidas en la técnica las sustituciones conservadoras de este tipo. De manera alternativa, la invención abarca sustituciones que también son no conservadoras. Las sustituciones conservadoras de ejemplo se describen en Lehninger, [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc. New York (1975), pp. 71-77] y se exponen inmediatamente a continuación . Sustituciones Conservadoras I Característica de la Cadena lateral /Aminoácido No polar (hidrófoba) : A. Alifática A L I V P B. Aromática F W Característica de la Cadena lateral Aminoácido C. Que contiene azufre M D. Línea límite G No cargada, polar: A. Hidroxilo S T Y B. Amidas N Q C. Sulfhidrilo C D. Línea límite G Positivamente cargada (básica) K R H Negativamente cargada (ácida) D E Las sustituciones conservadoras alternativas de ejemplo se exponen inmediatamente a continuación.
Sustituciones Conservadoras II Residuo original Sustitución de ejemplo Ala (A) Val, Leu, lie Arg (R) Lys, Gln, Asn Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (E) Asp His (H) Asn, Gln, Lys, Arg lie (I) Leu, Val, Met, Ala, Residuo original Sustitución de ejemplo Leu (L) lie, Val, Met, Ala, Phe Lys (K) Arg, Gln, Asn Met (M) Leu, Phe, lie Phe (F) Leu, Val, lie, Ala Pro (P) Gly Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Val (V) lie, Leu, Met, Phe, Ala Por ejemplo, se pueden suprimir o reemplazar residuos de cisteina con otros aminoácidos para impedir la formación de algunas o todas las reticulaciones de disulfuro de las secuencias de Fe. Cada residuo de cisteina se puede remover y/o sustituir con otros aminoácidos, tal como Ala o Ser. Como otro ejemplo, las modificaciones también se pueden hacer para introducir sustituciones de aminoácido para (1) remover el sitio de unión de receptor de Fe; (2) remover el sitio de unión a complemento (Clq) ; y/o para (3) remover el sitio de citotoxicidad mediado por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) . Estos sitios se conocen en la técnica, y cualesquiera de las sustituciones conocidas están dentro del alcance del Fe como se usa en la presente. Por ejemplo, ver Molecular Immunology, Vol . 29, No. 5, 633-639 (1992) con respecto a los sitios de ADCC en IgGl. Igualmente, se pueden reemplazar uno o más residuos de tirosina por residuos de fenilalanina . Además, también se contemplan otras inserciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos variantes, y están dentro del alcance de la presente invención. En general, se preferirán sustituciones conservadoras de aminoácidos. Adicionalmente , las alteraciones pueden estar en la forma de aminoácidos alterados, tal como peptidomiméticos o D-aminoácidos . También se pueden derivatizar secuencias de Fe del compuesto, como se describe en la presente para péptidos, es decir, que tienen modificaciones diferentes de la inserción, supresión o sustitución de residuos de aminoácido. De manera preferente, las modificaciones son de naturaleza covalente, e incluyen por ejemplo, unión química con polímeros, lípidos, otras porciones orgánicas e inorgánicas. Los compuestos derivati zados de la invención se pueden preparar para incrementar la vida media en circulación, o se pueden diseñar para mejorar la capacidad de selección de objetivo para el polipéptido a células, tejidos u órganos deseados. También es posible usar el dominio de unión a receptor de salvamento de la molécula intacta de Fe como la parte de Fe de un compuesto de la invención tal como se describe en la WO 96/32478, titulada " Polipéptidos Alterados con Vida Media Incrementada". Los miembros adicionales de la clase de moléculas designadas como Fe en la presente son aquéllos que se describen en la WO 97/34631, titulada "Dominios Tipo Inmunoglobulina con Vidas Media Incrementada". Ambas de las solicitudes PCT publicadas citadas en este párrafo se incorporan de este modo como referencia.
Componentes de WSP Los compuestos de la invención pueden incluir adicionalmente al menos un WSP. La porción de WSP de la molécula puede estar ramificada o no ramificada. Para uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero es farmacéuticamente aceptable. En general, se selecciona un polímero deseado en base a consideraciones tal como si el conjugado de polímero se usará de manera terapéutica, y si es así, la dosis deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis, y otras consideraciones. En varios aspectos, el peso molecular promedio de cada polímero soluble en agua está entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 40 kDa y entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 35 kDa. En aún otro aspecto, el peso molecular de cada polímero está entre aproximadamente 6 kDa y aproximadamente 25 kDa. El término "aproximadamente" como se usa en la presente y a todo lo largo, indica que en preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular señalado. En general, entre mayor sea el peso molecular o haya más ramificaciones, mayor será la proporción de polímero/proteína. Se pueden usar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado que incluye por ejemplo, la duración de la liberación sostenida; los efectos, si los hay, en la actividad biológica; la facilidad en el manejo; el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polímero soluble en agua en una proteína terapéutica. El WSP se debe unir a un polipéptido o péptido con consideración dada a los efectos de los dominios funcionales o antigénicos del polipéptido o péptido. En general, se puede realizar la derivatización química bajo cualquier condición adecuada usada para hacer reaccionar una proteína con una molécula de polímero activado. Los grupos activadores que se pueden usar para enlazar el polímero soluble en agua a una o más proteínas incluyen sin limitación sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano y 5-piridilo. Si se une al péptido por alquilación reductiva, el polímero seleccionado debe tener un aldehido reactivo individual de modo que se controle el grado de polimerización. Los polímeros solubles en agua adecuados, clínicamente aceptables, incluyen sin limitación, PEG, propionaldehído de polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , monometoxi-polietilenglicol , carboximetilcelulosa , poliacetales , alcohol polivinilico (PVA), polivinil-pirrolidona, poli-1 , 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolimero de etileno/anhidrido maleico, poli (beta-aminoácidos) (ya sea homopolimeros o copolimeros aleatorios), poli (n-vinil-pirrolidona ) polietilenglicol, homopolimeros de propilenglicol (PPG) y otros óxidos de polialquileno, copolimeros de óxido de propileno/óxido de etileno, polioles polioxietilado (POG) (por ejemplo, glicerol) y otros polioxoles polioxietilados , sorbitol polioxietilado, o glucosa polioxietilada, ácidos colónicos u otros polímeros de carbohidrato, Ficoll o dextrano y mezcla de los mismos. Los Polímeros Solubles en Agua también se pueden hacer que sean térmicamente sensibles, como en la formación de geles térmicos reversibles. Los ejemplos incluyen Tetronics, con estructuras de cuatro brazos y copolímeros de PEG-PLGA. La hidrofilicidad de los polímeros se puede variar al sustituir las porciones hidrófobas en la cadena de polímero. Un ejemplo de esto está en la manufactura de PLGA, en la cual se puede incrementar la relación de ácido láctico a ácido glicólico para permitir menor solubilidad en agua. Se pueden desear polímeros interiores solubles en agua, en ciertas aplicaciones, por ejemplo en el incremento del potencial para interactuar con las membranas celulares. En la reconstitución, se puede usar una relación apropiada de fosfolipidos para inducir la formación de micelas o liposomas en solución. La ventaja de este sistema puede estar en la capacidad para incorporar algo de la proteina dentro de la micela, con el beneficio potencial de distribución prolongada. Los fosfolipidos capaces de formar liposomas o micelas incluyen DMPG, DMPC, DOPC, DOPG y componentes de fortalecimiento, apropiados de liposomas secundarios, tal como colesterol. Ciertos excipientes, tal como fosfato de oleth-10 de DEA y fosfato de oleth-10, son capaces de formar micelas en solución. Los polímeros de polisacáridos son otro tipo de polímero soluble en agua que se pueden usar para modificación de proteínas o péptidos. Las proteínas o péptidos modificadores por la adición de polisacáridos, por ejemplo, por glicosilación, pueden incrementar la vida media, disminuir la antigenicidad, incrementar la estabilidad y disminuir la proteólisis. Los dextranos son polímeros de polisacáridos comprendidos de subunidades individuales de glucosa predominantemente enlazadas por enlaces al-6. El dextrano mismo está disponible en muchos intervalos de peso molecular, y está fácilmente disponible en pesos moleculares desde aproximadamente 1 kD a aproximadamente 70 kD. El dextrano es un polímero adecuado soluble en agua para el uso en la presente invención como un vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fe) . Ver, por ejemplo, WO 96/11953 y WO 96/05309. El uso de dextrano conjugado a inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico se ha reportado; ver por ejemplo, publicación de patente Europea número 0, 315, 456, que se incorpora de este modo como referencia. Se prefiere el dextrano de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD cuando se usa dextrano como un vehículo de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, el WSP es PEG y la invención contempla preparaciones en donde se modifica un compuesto para incluir cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tal como y sin limitación mono-(C1-C10) -alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol . El propionaldehído de poletilenglicol puede tener ventajas en la elaboración debido a su estabilidad en agua. El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio de PEG contemplado para el uso en la invención varía de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa. En otro aspecto, la porción de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 6 kDa a aproximadamente 25 kDa. En general, los grupos de PEG se unen a péptidos o proteínas mediante acilación o alquilación reductiva a través de un grupo reactivo en la porción de PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo en el péptido o proteina objetivo (por ejemplo, un grupo aldehido, amino o éster) . Usando los métodos descritos en la presente, se puede preparar una mezcla de moléculas conjugadas de polímero/péptido, y la ventaja proporcionada en las mismas en la capacidad para seleccionar la proporción de conjugado de polimero/péptido que se incluye en la mezcla. De esta manera, si se desea, se puede preparar una mezcla de péptidos con varios números de porciones de polímero unidas (es decir cero, uno o dos) con una proporción predeterminada de conjugado de polímero/proteína . Una estrategia útil para la PEGilación (se analizan otros métodos en más detalle en la presente) de péptidos sintéticos consiste de combinar, a través de la formación de un enlace conjugado en solución, un péptido y una porción de PEG, que tiene cada uno una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva una a la otra. Los péptidos se pueden preparar fácilmente con síntesis convencional en fase sólida. Los péptidos se "pre-activan" con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores purifican y caracterizan completamente antes de reaccionar con la porción de PEG. Usualmente, la ligación del péptido con PEG toma lugar en fase acuosa y se puede monitorizar fácilmente por HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados se pueden purificar fácilmente por HPLC preparativa y caracterizar por HPLC analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría básica de desorpción con láser.
Ligadores Un grupo "ligador" es opcional, ya sea colocado entre péptidos, péptido y vehículo, o vehículo y WSP. Cuando está presente, no es crítica su estructura química, puesto que sirve principalmente como un separador. El ligador está constituido preferentemente de aminoácidos enlazados conjuntamente por enlaces peptídicos. De esta manera, en modalidades preferidas, el ligador está constituido de 1 a 20 aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos, en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural. Algunos de estos aminoácidos pueden estar glicosilados , como es bien entendido por aquéllos expertos en la técnica. En una modalidad más preferida, el 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de glicina, alanita, prolina, asparagina, glutamina y glicina. De manera aún más preferente, un ligador está constituido de una mayoría de aminoácidos que están esféricamente no impedidos, tal como glicina y alanina. De esta manera, los ligadores preferidos son poliglicinas (particularmente (Gly)4, (Gly)5, (Gly)8, poli (Gly) Ala) , y polialaninas . Otros ejemplos específicos son: (Gly) 3Lys (Gly) 4 (SEQ ID No.: 1018); (Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID No.: 1019); (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID No.: 1020); y GlyProAsnGlyGly (SEQ ID No.: 1021). Para explicar la nomenclatura, por ejemplo, (Gly) 3Lys (Gly) 4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly . También se prefieren combinaciones de Gly y Ala. Los ligadores mostrados aquí son de ejemplo; los ligadores dentro del alcance de esta invención pueden ser mucho más prolongados y pueden incluir otros residuos. También son posibles ligadores no peptidicos. Por ejemplo, se pueden usar ligadores tal como -NH- (CH2) s-C (O) -, en donde s=2-20. Estos ligadores de alquilo se pueden sustituir adicionalmente por cualquier grupo no esféricamente impedido tal como alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6) acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2, fenilo, etcétera. Un ligador no peptidico de ejemplo es un ligador de PEG. en donde n es tal que el ligador tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD, de manera preferente 100 a 500 kD. Los ligadores peptidicos se pueden alterar para formar derivados de la misma manera como se describe anteriormente.
Producción de polipéptidos y Péptidos Un péptido que se ha identificado se puede elaborar de células hospedadoras transformadas usando técnicas de ADN recombinante . Si el componente de vehículo es un polipéptido, se puede expresar como uno de producto de fusión de polipéptido- o péptido-vehículo . Para hacerlo así, primero se prepara, usando métodos conocidos en la técnica, una molécula de ADN recombinante que codifique para el péptido. Por ejemplo, se pueden escindir secuencias que codifiquen para los péptidos a partir del ADN usando enzimas de recepción, adecuadas. De manera alternativa, la molécula de ADN se puede sintetizar usando técnicas de síntesis química, tal como el método de fosforamidato . También, se puede usar una combinación de estas técnicas. La invención proporciona por lo tanto nucleótidos que codifican para un compuesto de la invención . La invención también proporciona vectores que codifican para compuestos de la invención en un hospedador apropiado. El vector comprende el polinucleótido que codifica para el compuesto operativamente enlazado a secuencias apropiadas de control de expresión. Son bien conocidos los métodos para efectuar este enlace operativo, ya sea antes o después de que el polinucléotido se inserte en el vector. Las secuencias de control de expresión incluyen promotores, activadores, intensificadores , operadores, sitios de unión ribozómica , señales de inicio, señales de paro, señales de remate, señales de poliadenilación, y otras señales comprendidas con el control de la transcripción o traducción. El vector resultante que tiene el polinucleótido en el mismo se usa para transformar un hospedador apropiado. Esta transformación se puede realizar usando métodos bien conocidos en la técnica. Se puede usar, en la práctica de esta invención, cualquiera de un gran número de células hospedadoras disponibles y bien conocidas. La selección de un hospedador particular es dependiente de varios factores reconocidos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, compatibilidad con el vector de expresión elegido, toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, velocidad de transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bio-seguridad y costos. Se debe determinar un equilibrio de estos factores con el entendimiento que no todos los hospedadores pueden ser igualmente efectivos para la expresión de una secuencia particular de ADN. Dentro de estas guías generales, los hospedadores microbianos útiles incluyen bacterias (tal como E. coli) , levadura (tal como Saccharomyces ) y otros hongos, insectos, plantas, células mamíferas (incluyendo humano) en cultivo, u otros hospedadores conocidos en la técnica. Luego, el hospedador transformado se cultiva y purifica. Las células hospedadoras se pueden cultivar bajo condiciones convencionales de fermentación de modo que se expresen los compuestos deseados. Estas condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, los péptidos se purifican del cultivo por métodos bien conocidos en la técnica. Dependiendo de la célula hospedadora utilizada para expresar un compuesto de la invención, se pueden unir convenientemente grupos de carbohidratos ( oligosacáridos ) a sitios que son conocidos como sitios de glicosilación en proteínas. En general, se unen oligosacáridos O-enlazados a los residuos de serina (SER) o treonina (Thr) en tanto que se unen oligosacáridos N-enlazados a los residuos de asparagina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr , donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. De manera preferente, X es uno de los 19 aminoácidos que se presentan de forma natural no contando prolina. Las estructuras de los oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico) . Usualmente, el ácido siálico es el residuo terminal de oligosacáridos tanto N-enlazados como O-enlazados, y en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Estos sitios se pueden incorporar en el ligador de los compuestos de esta invención y de manera preferente se glicosilan por una célula durante la producción recombinante de los compuestos de polipéptido (por ejemplo, en células mamiferas tal como CHO, BHK, COS) .Sin embargo, estos sitios se pueden glisilar adicionalmente por procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en la técnica. De manera alternativa, los compuestos se pueden elaborar por métodos sintéticos. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de síntesis en fase sólida. Son bien conocidas las técnicas adecuadas, incluyen aquéllas descritas en Merrifield (1973) , Che. Po 1 ypep t i de s , pp . 335-61 (Katsoyannis y Panayotis eds) ; Merrifield (1963) , J. Am . Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985) , Biochem. Intl. 10:394-414; Stewart y Young (1969) , Solid Phase Peptide Synthesis; patente de los Estados Unidos número 3,941,763; Finn et al. (1976) , The Proteins (3rd ed.) 2:105-253 ; y Ericsson et al. (1976) , The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527. La síntesis en fase sólida es la técnica preferida para elaborar péptidos individuales puesto que es el método más efectivo en el costo para elaborar péptidos pequeños. Los compuestos que contiene péptidos derivati zados o que contienen grupos no peptídicos son particularmente tratables con la síntesis por técnicas químicas orgánicas bien conocidas.
Modificación de WSP Para obtener un compuesto covalentemente unido a un WSP, se emplea cualquier método descrito en la presente o de otro modo conocido en la técnica. Los métodos para preparar compuestos derivatizados químicos de polipéptido o péptidos comprenderán en general los pasos de a) hacer reaccionar el péptido con la molécula polimérica activada (tal como un compuesto derivativos de éster o aldehido reactivo de la molécula de polímero) bajo condiciones por las cuales el polipéptido se llega a unir a una o más moléculas de polímero, y (b) obtener los productos de reacción. Las condiciones de reacción óptimas se determinarán en base a parámetros conocidos y al resultado deseado. Por ejemplo, entre mayor sea la relación de moléculas de proteína: proteína, mayor será el porcentaje de la molécula de polímero unida. Se puede enlazar una molécula biológicamente activa a un polímero a través de cualquier grupo funcional disponible usando métodos normales bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de grupos funcionales que usan métodos normales son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de grupos funcionales en ya sea el polímero o molécula biológicamente activa que se pueden usar para formar estos enlaces incluyen grupos amina y carboxi, grupos tiol tal como residuos de cisteína, aldehidos y cetonas, y grupos hidroxi como se pueden encontrar en residuos de serina, treonina, tirosina, hidroxiprolina e hidroxilisina . El polímero se puede activar al acoplar un grupo reactivo tal como tricloro-s-triazina [Abuchowski , et al., (1977), J. Biol. Chem. 252:3582-3586, incorporado en la presente como referencia en su totalidad}, carbonilimidazol [Beauchamp, et al., (1983), Anal. Biochem. 131:25-33, incorporada en la presente como referencia en su totalidad] , o succinato de succinimidilo [Abuchowski, et al., (1984), Cáncer Biochem. Biophys. 7:175-186, incorporado en la presente como referencia en su totalidad] a fin de reaccionar con una funcionalidad de amina en la molécula biológicamente activa. Otro método de acoplamiento comprende la formación de un grupo glioxililo en una molécula y un grupo aminooxi, hidrazida o semicarbazida en la otra molécula que se va a conjugar [Fields y dixon, (1968), Biochem. J. 108:883-887; Gaertner, et al., (1992), Bioconjugate Chem. 3:262-268; Geoghegan y Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3:138-146; Gaertner, et al., (1994), J. Biol. Chem. 269:7224-7230, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad] . Otros métodos comprenden la formación de un éster activo en un grupo de alcohol libre de la primera molécula que se va a conjugar usando cloroformiato o disuccinimidilcarbonato, que entonces se puede conjugar a un grupo amina en la otra molécula que se va a acoplar [Veronese, et al., (1985), Biochem. y Biotech. 11:141-152; Nitecki, et al., patente de los Estados Unidos número 5,089,261; Nitecki, patente de los Estados Unidos número 5,281,698, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad] . Otros grupos reactivos que se pueden unir mediante grupos alcohol libres se exponen en Wright, EP 0539167A2 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) , que también describe el uso de imidatos para acoplamiento mediante grupos amina libres. Otra química comprende la acilación de aminas primarias de un objetivo usando el NHS-éster de metoxi-PEG (0-[ (N-succinimidiloxicarbonil ) -metil ] -O ' -metilpolietilenglicol ) . La acilación con metoxi-PEG-NHS da por resultado un enlace de amida que eliminará la carga de la amina primaria original. Otros métodos utilizan oxidación moderada de un objetivo bajo condiciones seleccionadas para seleccionar como objetivo el diol colgante del ácido siálico de la penúltima unidad de glicosilo para oxidación a un aldehido. El glicoaldehído resultante entonces se hizo reaccionar con una metoxi-PEG-hidrazida (O-Hidrazinocarbonilmetil ) -0 ' -metilpolietilenglicol ) para formar una hidrazona semi estable entre PEG y el objetivo. La hidrazona se reduce de manera subsiguiente por cianoborohidruro de sodio para producir un conjugado estable de PEG. Ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 6,586,398 (Kinstler, et al., 01 de julio de 2003), incorporada en la presente como referencia en su totalidad.
En aplicaciones especificas de técnicas para modificación química, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 4,002,531 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) señala que se usó alquilación reductiva para unión de moléculas de polietilenglicol a una enzima. La patente de los Estados Unidos número 4,179,337 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) describe conjugados de PEG: proteína que comprende, por ejemplo, enzimas e insulina. La patente de los Estados Unidos número 4,904,584 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) describe la modificación del número de residuos de lisina en proteínas para la unión de moléculas de polietilenglicol mediante grupos amina reactivos. La patente de los Estados Unidos número 5,834,594 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) describe conjugados de PEG: proteína, solubles en agua sustancialmente no inmunogénicos , que comprenden por ejemplo, las proteínas IL-2, interferón alfa, e IL-lra. Los métodos de Hakimi et al., comprenden la utilización de ligadores únicos para conectar los varios grupos amino libres en la proteína al PEG. Las patentes de los Estados Unidos números 5,824,784 y 5,985,265 (cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) enseñan métodos que permiten proteínas químicamente modificadas de manera N-terminal, selectivamente, y análogos de las mismas, incluyendo G-CSF e interferón de consenso. De manera importante, estas proteínas modificadas tienen ventajas como se relaciona a estabilidad de proteína, así como proporcionan ventajas de procesamiento. También, se ha descrito la modificación SP en Francis et al., In: Stability of protein pharmaceuticals : in vivo pathways of degradation and strategies for portein stabilization (Eds. Ahern., T. y Manning, M.C.) Plenum, N.Y., 1991 (incorporado en la presente como referencia en su totalidad) . En aún otro aspecto, se usa el método descrito en Delgado et al., "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Cloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation" , En: Fisher et al., eds., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnologu, Plenum Press, N.Y., N.Y., 1989 pp . 211-213 (incorporado en la presente como referencia en su totalidad) que comprende el uso de cloruro de tresilo, que no da por resultado grupo de enlace entre la porción de WSP y la porción de polipéptido. En otros aspectos, se efectúa la unión de un WSP a través del uso de esteres de N-hidroxi-succinimidilo de carboximetil-metoxi-polietilenglicol , como es bien conocido en la técnica. Para otras descripciones de la modificación de un objetivo con un WSP, ver, por ejemplo, solicitud de patente de los Estados Unidos número 20030096400; EP 0 442724A2; EP 0154316; EP 0401384; WO 94/13322; patentes de los Estados Unidos números. 5,362,852; 5,089,261; 5,281,698; 6,423,685; 6,635,645; ,6,433,135; solicitud internacional WO 90/07938; Gaertner y Oxford, (1996), Bioconjugate Chem. 7:38-44; Greenwald et al., Crit Rev Therap Drug Carrier Syst. 2000; 17:101-161; Kopecek et al., J Controlled Reléase, 74:147-158, 2001; Harris et al., Clin Pharmacokinet 2001; 40 ( 7 ) : 539-51 ; Zalipsky et al., Bioconjug Chem. 1997; 8:111-118; Nathan et al., Macromolecules, 1992; 25:4476-4484; Nathan et al., Bioconj Chem. 1993; 4:54-62; y Francis et al., Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992), las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.
Alquilación reductiva En un aspecto, se lleva a cabo la unión covalente de un WSP por procedimientos de modificación química por alquilación reductiva como se proporciona en la presente para modificar selectivamente el grupo a-amino N-terminal y probar el producto resultante para la característica biológica deseada, tal como los ensayos de actividad biológica proporcionados en la presente. La alquilación reductiva para la unión de un WSP a una proteína o péptido aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (por ejemplo, lisina versus N-terminal) disponibles para derivatización en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, se logra derivatización sustancialmente selectiva de la proteína en el N-térraino con un grupo carbonilo que contiene el polímero. Para alquilación reductiva, los polímeros seleccionados pueden tener un grupo aldehido reactivo individual. Un aldehido reactivo es, por ejemplo, propionaldehído de polietilenglicol , que es estable en agua, o derivados de mono-Ci-Ci0 alcoxi o ariloxi de los mismos (ver, patente de los Estados Unidos número 5,252,714, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . En un planteamiento, se emplea alquilación reductiva para conjugar un PEG-aldehído (O- ( 3-oxopropil ) -O ' -metilpolietilenglicol ) a una amina primaria. Bajo condiciones apropiadas, se ha demostrado que este planteamiento produce conjugados de PEG predominantemente modificados a través de la a-amina en el N-término de la proteína. Una funcionalidad de aldehido útil para conjugar la molécula biológicamente activa se puede generar a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino y alcohólicos adyacentes. En un polipéptido, por ejemplo, se puede usar una serina, treonina o hidroxilisina N-terminal para generar una funcionalidad de aldehido mediante esición oxidativa bajo condiciones moderadas usando periodato. Estos residuos, o sus equivalentes, pueden estar normalmente presentes, por ejemplo en el N-término de un polipéptido, se pueden exponer mediante digestión química o enzimática, o se pueden introducir mediante métodos recombinantes o químicos. Las condiciones de reacción para generar el aldehido comprenden típicamente adición de un exceso molar de meta-periodato de sodio y bajo condiciones moderadas para evitar oxidación a otras posiciones en la proteína. El pH es preferentemente cerca de 7.0. Una reacción típica comprende la adición de un exceso molar de 1.5 veces de meta-periodato de sodio, seguido por incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. El grupo funcional de aldehidos se puede acoplar a un polímero activado que contiene una funcionalidad de hidrazida o semicarbazida para formar un enlace de hidrazona o semicarbazona . Están comercialmente disponibles polímeros que contienen hidrazida, y se pueden sintetizar, si es necesario, usando técnicas normales. Las hidrazidas de PEG para el uso en la invención se pueden obtener de Shearwater Polymers, Inc, 2307 Spring Branch Road, Hunstville, Ala. 35801 (ahora parte de Nektar Therapeutics , 150 Industrial Road, San Carlos, CA 94070-6256) . El aldehido se acopla al polímero al mezclar la solución de los dos componentes con untamente y calentando a aproximadamente a 37°C hasta que esté sustancialmente completa la reacción. Un exceso de la hidrazida polimérica se usa típicamente para incrementar la cantidad de conjugado obtenido. Un tiempo típico de reacción es de 26 horas. Dependiendo de la estabilidad térmica de los reactivos, se puede alterar la temperatura y tiempo de reacción para proporcionar resultados adecuados. La determinación detallada de las condiciones de reacción tanto de la oxidación como del acoplamiento se exponen en Geoghegan y Stroh, (1992), Bioconjugate Chem 3:138-146 y en Geoghegan, patente de los Estados Unidos número 5,362,852, cada una de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Usando alquilación reductiva, el agente reductor debe ser estable en solución acuosa y de manera preferente es capaz de reducir sólo la base de Schiff formada en el proceso inicial de alquilación reductiva. Los agentes reductores se seleccionan de, y sin limitación borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, borato de dimetilamina , borato de trimetilamina y borato de piridina. El pH de la reacción afecta la relación de polímero a proteína que se va a usar. En general, si el pH de la reacción es menor que la pKa de un grupo reactivo objetivo, se deseará un exceso mayor de polímero a proteína. Si el pH es mayor que la pKa objetivo, no necesita ser tan grande la relación polímero : proteína (es decir, están disponibles más grupos reactivos, de modo que se necesitan menos moléculas de polímero) . Por consiguiente, la reacción se realiza en un aspecto a un pH que permite que se aproveche que las diferencia de pKa entre los grupos e-amina de los residuos de lisina y aquél del grupo -amino del residuo N-terminal de la proteina. Por esta derivatización selectiva, se controla la unión de un polímero soluble en agua a una proteína; la conjugación con el polímero toma a lugar predominante en el N-término de la proteína y no se presenta modificación significativa de estos grupos reactivos, tal como los grupos amino de cadena lateral de lisina. Por lo tanto, en un aspecto, se proporcionan métodos para la unión covalente de un WSP a un compuesto objetivo y que proporcionan una preparación sustancialmente homogénea de moléculas conjugadas de WSP/proteína , en la ausencia de purificación extensiva adicional como se requiere usando otras químicas de modificación química. De manera más específica, si se usa polietilenglicol , los métodos descritos permiten la producción de una proteína N-terminalmente PEGilada que carece posiblemente de grupos de enlace, antigénicos, es decir, la porción de polietilenglicol que acopla directamente a la porción de proteína sin sub-productos potencialmente tóxicos. Dependiendo del método de unión a WSP, elegido, la proporción de moléculas de WSP unidas al péptido o moléculas peptídicas objetivo variará, como serán sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, se determina la relación óptima (es términos de eficiencia de reacción ya que no hay proteína o polímero sin reaccionar en exceso) por el peso molecular del WSP seleccionado. Además, cuando se usan métodos que comprenden unión no especifica y purificación posterior de una especie deseada, la relación puede depender del número de grupos reactivos (típicamente grupos amino) disponibles.
Purificación El método para obtener una preparación modificada con WSP sustancialmente homogénea es, en un aspecto, por purificación de una especie predominantemente individual del compuesto modificado a partir de una mezcla de especies. A manera de ejemplo, primero se separa una especie sustancialmente homogénea por cromatografía de intercambio iónico para obtener material que tiene una característica de carga de una especie individual (aunque pueden estar presentes otras especies que tienen la misma carga aparente) , y entonces se separa la especie deseada usando cromatografía de exclusión de tamaño. Se reportan y contemplan por la invención, otros métodos, e incluyen, por ejemplo, PCT WO 90/04606 publicada el 03 de Mayo de 1990, se describe un proceso para fraccionar una mezcla de aductos de PEG-proteína que comprende dividir los aductos de PEG/proteína en un sistema bifásico acuoso que contiene PEG. De esta manera, un aspecto de la presente invención es un método para preparar un conjugado de compuesto modificado con WSP comprendido de (a) hacer reaccionar un compuesto que tiene más de un grupo amino con una porción de polímero soluble en agua bajo condiciones de alquilación reductiva, a un pH adecuado para activar selectivamente el grupo a-amino en el término amino de la porción de proteína de modo que el polímero soluble en agua se una selectivamente al grupo a-amino; y (b) obtener el producto de reacción. Opcionalmente , y particularmente para un producto terapéutico, los productos de reacción se separan de porciones sin reaccionar . Como se determina por correlación peptídica y secuenciación N-terminal, se proporciona una preparación que comprende al menos 50 % de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar. En otras modalidades, se proporcionan preparaciones que comprenden al menos 75 % de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar; al menos 85 % de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar; al menos 90 % de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar; al menos 95 % de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar; y al menos 99 % de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar. Los siguientes ejemplos no se propone que sean limitantes sino sólo de ejemplo de modalidades específicas de la invención.
Ejemplo 1 Montaje de Construcción de Expresión de mFc-TMP Se construyó un polipéptido que codifica para una proteina de fusión de TMP que comprende una región Fe murina (mFc-TMP) al combinar secuencias de nucleótidos que codifican individualmente para Fe murino y un TMP (descrito en EP01124961A2 ) . En la primera ronda de PCR, el componente que codifica para Fe murino se amplificó con los cebadores de PCR 3155-58 (SEQ ID NO: 1022) y 1388-00 (SEQ ID NO: 1023). 3155-58: CCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGA (SEQ ID NO: 1024) 3155-59: CCACCTCCACCTTTACCCGGAGAGTGGGAG (SEQ ID NO: 1025) En aún reacción separada, se amplificó un polipéptido que codifica para TMP con los cebadores 1209-85 (SEQ ID NO: 1026) y 3155-59 (SEQ ID NO: 1027) . 1209-85: CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (SEQ ID NO: 1028) 1388-00: CTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID NO: 1029) Los fragmentos de PCR resultantes se purificaron en gel y se combinaron en un tubo individual durante una segunda ronda de PCR con los cebadores 1209-85 (SEQ ID NO: 1030) y 1388-00 (SEQ ID NO: 1031) . El producto de PCR de esta segunda ronda de amplificación se purificó en gel y se digirió con enzimas de restricción Ndel y Xhol. El fragmento de digestión se purificó y ligó en el vector pAMG21, digerido anteriormente con las mismas enzimas. Esta mezcla de ligación se transformó mediante electroporación en E. coli y se colocó en placas sobre medio de LB + Kanamicina. Se seleccionaron colonias mediante PCR y secuenciación de ADN . Se identificó un clon positivo con una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1032) que codifica para la proteina de fusión mFc-TMP (SEQ ID NO: 1033) y se designó 6397. Polinucleótido se codifica para proteina de fusión Fe murino-TMP (SEQ ID NO: 1034) 1 GATTTGATTC TAGATTTGTT TTAACTAATT AAAGGAGGAA TAACAT RF abierto: ATGGTCGACGGTTG TAAGCCATGC ATTTGTACAG TCCCAGAAGT ATCATCTGTC 101 TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG CTCACCATTA CTCTGACTCC 151 TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG CAAGGATGAT CCCGAGGTCC 201 AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG TGCACACAGC TCAGACGCAA 251 CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC CGCTCAGTCA GTGAACTTCC 301 CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ) 351 ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAACCAAA 401 GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC ATTCCACCTC CCAAGGAGCA 451 GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG CATGATAACA GACTTCTTCC 501 CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC 551 TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA GATGGCTCTT ACTTCGTCTA 601 CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG GGAGGCAGGA AATACTTTCA 651 CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA ACCACCATAC TGAGAAGAGC 701 CTCTCCCACT CTCCGGGTAA AGGTGGAGGT GGTGGTATCG AAGGTCCGAC 751 TCTGCGTCAG TGGCTGGCTG CTCGTGCTGG TGGTGGAGGT GGCGGCGGAG 801 GTATTGAGGG CCCAACCCTT CGCCAATGGC TTGCAGCACG CGCATAA Secuencia 3' : TCTCGAGGATCCG CGGAAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAAGCCCG AAAGG Secuencia de proteina de Fe murino-TMP (SEQ ID NO: 1035) 1 MVDGCKPCIC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT ITLTPKVTCV WDISKDDPE 51 VQFSWFVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS VSELPIMHQD WLNGKEFKCR 101 VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP PPKEQMAKDK VSLTCMITDF 151 FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG SYFVYSKLNV QKSNWEAGNT 201 FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGKGGGGG lEGPTLRQWL AARAGGGGGG 251 GGIEGPTLRQ WLAARA* Ejemplo 2 Fermentación de Cepa 6397 Se inició la fermentación de las cepas 6397 por inoculación de 500 mL de caldo Luria esterilizado con un cultivo de siembra de la cepa en un matraz agitado. Cuando la densidad celular alcanzó 0.9 a 600 nm, los contenidos se usaron para inocular un termentador de 15 litros que contiene 10 litros del medio de crecimiento basado en complejo (800 g de glicerol, 500 g de tripticasa, 3 g de citrato de sodio, 40 g de KH2P04, 20 g (NH )2S04, 5 mi de antiespuma Fluka P-2000, 10 mi de metales traza (cloruro férrico 27.0 g/L, cloruro de zinc 2.00 g/L, cloruro de cobalto 2.00 g/L, molibdato de sodio 2.00 g/L, cloruro de calcio 1.00 g/L, sulfato cúprico 1.90 g/L, ácido bórico 0.50 g/L, cloruro de manganeso 1.60 g/L, dihidrato de citrato de sodio 73.5 g/L), 10 mi de vitaminas (biotina 0.060 g/L, ácido fólico 0.040 g/L, riboflavina 0.42 g/L, piridoxina-HCl 1.40 h/L, niacina 6.10 g/L, ácido pantoténico 5.40 g/L, hidróxido de sodio 5.30 ml/L) , se adicionó agua para llevar a 10 L) . El termentador se mantuvo a 37°C y pH 7 con niveles de oxigeno disuelto mantenidos a un mínimo de 30 % de saturación. Cuando la densidad celular alcanzó 13.1 unidades OD a 600 nm, el cultivo se indujo por la adición de 10 mi de 0.5 mg/ml de N- ( 3-oxo-hexanoil ) homoserina-lactona. A 6 horas después de la incubación, el caldo se enfrió a 10°C, y las células se recolectaron por centrifugación a 4550 g durante 60 minutos a 5°C. La pasta celular entonces se almacenó a -80°C.
Ejemplo 3 Replegamiento de Proteina Se disolvió pasta de E. Coli (300 g) de la cepa 6397 que expresa mFc-TMP en 2250 mi de amortiguador de lisis (Tris-HC1 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0) y se hizo pasar a través de un microfluidizador enfriado, dos veces a 913.99 kg/cm2 13,000 lb/pulg2) . El homogenado entonces se centrifugó a 11, 300 g durante 60 minutos a 4°C. El sobrenadante se descartó, y el sedimento se volvió a suspender en volúmenes de 200 mi de agua usando una trituradora de tejido. El homogenado se centrifugó a 27,200 g durante 30 minutos a 4°C, y el sobrenadante se descartó. Aproximadamente 12.5 % del sedimento se volvió a suspender en 28 mi de Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, con 35 mg de lisozima (Sigma, St Louis, MO) de clara de huevo de gallina) usando un triturador de tejido y se incubó a 37 °C durante 20 minutos. Después de la incubación, la suspensión se centrifugó a 27,200 g durante 30 minutos a 22°C, y se descartó el sobrenadante. El sedimento se volvió a suspender en 35 mi de gaunidina-HCl 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, después de lo cual se adicionaron 350 µ? de DTT 1 M (Sigma St Louis, MO) y el material se incubó a 37°C durante 30 minutos. La solución entonces se centrifugó a 27,200 g durante 30 minutos a 22°C. El sobrenadante entonces se transfirió a 3.5 L de amortiguador de replegamiento (base Tris 50 mM, arginina-HCl 160 mM, urea 3 M, glicerol al 20 %, pH 9.5, cisteina 1 mM, cistamina-HCL 1 mM) a 1 ml/min con agitación suave a 4°C.
Ejemplo 4 Purificación de Construcción Después de aproximadamente 40 horas de incubación a 4°C con agitación moderada, la solución de replegamiento descrita en el ejemplo 3 se concentró a 500 µ? usando un aparato de ultrafiltración de flujo potencial con un cartucho de 30 kDa (Satorius, Goettingen, Alemania) seguido por diafiltración contra 3 litros de Q-Amortiguador A (Tris-HCl 20 mM; pH 8.0). El material concentrado se filtró a través de papel Whatman GF/A y se cargó en una columna de flujo rápido de Q-Sefarosa de 86 mi (ID de 2.6 cm) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a 15 ml/min. Después del lavado de la resina con varios volúmenes de columna de Q-Amortiguador A, la proteina se eluyó usando un gradiente lineal de volumen de 20 columnas a Q-Amortiguador B al 60 % (Tris-HCl 20 mM, NaCl 1 M, pH 8.0) a 10 ml/min. Las fracciones pico se mezclaron, y la mezcla se hizo pasar a través de un filtro jeringa Mustang E (Pall Corporation, East Hills, NY) a 1 ml/min. El material filtrado se filtró una segunda vez a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.22 µp? y se almacenó a -80°C.
Ejemplo 5 PEGilación de Proteina A una solución agitada, enfriada (4°C) de mFc-TMP (3.5 mi, 0.8 mg/ml) en amortiguador de acetato de sodio 100 mM, pH 5, que contiene NaCNBH3 20 mM, se adicionó un exceso molar de 3.8 veces de metoxipolietilenglicol-aldehido (MPEG) (peso ¦ molecular promedio, 20 kDa) (Nektar) . La agitación de la mezcla de reacción se continúa a la misma temperatura. El grado de la modificación de la proteina durante el transcurso de la reacción se monitorizó por SEC HPLC usando una columna Superóse 6 HR 10/30 (Amersham Bioscience) eluida con un amortiguador de fosfato 0.05 M con NaCl 0.15 M, pH 7.5 a 0.4 ml/min. Después de 16 horas, el análisis por SEC HPLC indicó que la mayoría de las proteínas se han conjugado a MPEG. En este momento, la mezcla de reacción se intercambio de amortiguador en un amortiguador de Tris-HCl 20 mM, pH 8.12. Los conjugados de MPEG-mFc-AMP2 se aislaron por cromatografía de intercambio iónico usando una columna Hi Trap HP Q de 1 mi (Amersham Bioscience) equilibrada con una amortiguador de Tris/HCl 20 mM, pH 8.12. La mezcla de reacción se cargó en la columna a una velocidad de flujo de 0.5 mL/min y el aldehido MPEG sin reaccionar se eluyó con tres volúmenes de columna del amortiguador de inicio. Se usó un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna desde 0 % a 100 % de amortiguador de Tris/HCl 20 mM, pH 8.2, que contiene NaCl 0.5 M para eluir los conjugados de proteina-polimero. Las fracciones (2 mi) recolectadas durante la separación por cromatografía de intercambio iónico se analizaron por HPLC SEC como se describe anteriormente. Una fracción que contiene los conjugados de mono- y di-MPEG-mFc-TMP en una relación aproximada de 2.3 a 1 (como se describe por SEC HPLC) se concentró, y se filtró estéril.
Ejemplo 6 Prueba in vivo Ratones BDF1 (Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts ) se dividieron en grupos de 10 y se inyectaron en los días 0, 21 y 42 de forma subcutánea con ya sea agente diluyente (PBS de Dulbecco con 0.1 % de alúmina de suero bovino) o agente diluyente con 50 µg de la proteína de conjugado de mono- y di-MPEG-mFc-TMP de prueba (como se describe anteriormente) por kg de animal. Cada grupo se dividió en la mitad y se sangró (140 µ?) del seno retro- orbital en puntos de tiempo alternos (días 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 19, 24, 26, 28, 31, 33, 40, 45, 47, 49, 52 y 59) . En el día 59, los ratones se anestesiaron con isoflurano antes del sangrado. La sangre recolectada se analizó para un conteo completo y diferencial usando un analizador sanguíneo automatizado ADVIA 120 con software murino (Bayer Diagnostics, New York, NY) .
Ejemplo 7 Fe Humano-TMP Liofilizado Estudios Iniciales de Selección de Formulación Liofilizada El pepticuerpo Fe humano-TMP descrito en la presente en el Ejemplo 7 corresponde a una forma dimérica de SEQ ID NO: 1017, en donde el Fe humano es SEQ ID NO:l, que tiene una metionina iniciadora en el N-término. Se valoró la capacidad de Fc-TMP por varias técnicas cromatográficas : HPLC de fase inversa, HPLC de Intercambio Catiónico, HPLC de Exclusión de Tamaño y SDS-PAGE, todas las cuales son indicativas de estabilidad a temperatura elevada. Las formulaciones que variaron en concentración desde 0.1 hasta 40 mg/ml se examinaron de la degradación tanto química como física a temperatura acelerada, refrigerada y congelada. Se evaluó la estabilidad de Fc-TMP con respecto a pH variable y la inclusión de manitol o glicina como agentes formadores de torta y glucosa como lioprotector . Eventualmente se eligieron manitol y sacarosa para optimización adicional después de que el otro candidato (glicina) no mostró mejora en la estabilidad de la proteina. También se mostró que Tween-20 (polisorbato 20) inhibe la agregación en la liofilización sobre un intervalo de concentraciones de 0.002 a 0.1 % . Los siguientes amortiguadores se examinaron en estudios de selección sobre un intervalo de pH de 4-8: glicina, succitato, histidina, fosfato y Tris. De estos estudios de selección, Fc-TMP formulada en amortiguador de histidina a pH 5 con una pequeña cantidad de Tween 20 (0.004 %) adicionada, se mostró que es más óptimo para la estabilidad.
Validación de Sacarosa y Tween 20 en la Formulación de Fc-TMP Los esfuerzos subsiguientes de desarrollo se enfocaron en la validación del nivel de sacarosa, manitol y Tween 20 en la formulación a una concentración de proteina de aproximadamente 0.5 mg/ml (para ajustar los requerimientos anticipados de dosificación en la clínica). Se demostró en estos estudios el efecto de sacarosa, manitol y Tween 20 en la optimización de la estabilidad. También se iniciaron estudios de seguimiento para el propósito de anticipar cuestiones e intereses de fabricación.
La Sacarosa es Benéfica al Reducir al Mínimo la Degradación Química a Temperatura Elevada Se probó el efecto de concentraciones variables de sacarosa y manitol en la estabilidad de Fc-TMP. La proteína se formuló a 0.3 y 2 mg/ml a fin de asociar el intervalo anticipado de concentración en la clinina. Además, se prepararon muestras con y sin Tween 20 al 0.004 %. La relación de sacarosa : manitol se cambió al variar la cantidad de sacarosa y al ajusfar el nivel de manitol a cada concentración de sacarosa para mantener la isotonicidad . Se examinaron las siguientes relaciones de sacarosa : manitol (expresadas como % en peso por volumen): 0.2:5.1; 0.5:4.8; 1:4.5; 1.5:4.3 y 2:4. Se mostró que las mayores relaciones de sacarosa : manitol reducen al mínimo la degradación química como se monitorea por HPLC de Intercambio Catiónico y de Fase Inversa. Como se muestra en la Tabla 39, el por ciento de pico principal se compara inicialmente después de almacenamiento a temperatura elevada de Fc-TMP durante 18 semanas a 37°C. La pérdida más grande del pico principal de intercambio catiónico se presenta en la formulación líquida (Fc-TMP formulado en acetato 10 mM, sorbitol al 5 % a pH 5) , seguido por las formulaciones liofilizadas con 0.2, 0.5 y 1.0 % de sacarosa, respectivamente. El efecto protector de la sacarosa al reducir al mínimo la degradación química también se observó por análisis de HPLC de Fase Inversa de muestras después de almacenamiento a temperatura elevada (Tabla 39). El por ciento de pico principal (determinado del análisis de HPLC de fase inversa de Fc-TMP) cae significativamente en los bajos niveles de sacarosa, pero no parece cambiar significativamente formulaciones con concentraciones de sacarosa de más de 1 % . Interpretados conjuntamente, estos resultados indican que el mantener niveles de sacarosa a 1.5 % o mayores es critico para la estabilidad de Fc-TMP en la liofilización .
Tabla 39 Fc-TMP en Histidina 10 mM, amortiguada a pH 5 con Tween 20 Pérdida de Pico Principal de CEX-HPLC y RP Después de 18 Semanas a 37°C Formulación RP-HPLC CEX-HPLC Tiempo 18 Tiempo 18 Cero Semanas Cero Semanas 0.2 % de sacarosa, 5.1 78.6 72.2 79.8 62.6 de Manitol 0.5 % de sacarosa, 4.8 77.3 73.1 78.9 71.6 de Manitol 1 % de sacarosa, 4.5 de 78.4 78.0 80.5 73.9 Manitol 1.5 % de sacarosa, 4.3 73.2 79.8 80.5 78.7 de Manitol 2 % de sacarosa, 4 de 79.2 81.3 76.8 78.9 Manitol Formulación RP-HPLC CEX-HPLC Tiempo 18 Tiempo 18 Cero Semanas Cero Semanas Acetato 10 mM, 5 % de 74.7 42.8 75.5 34.1 Sorbitol, pH 5 (control líquido) En tanto que Fc-TMP en el control líquido (la formulación de acetato 10 MM, sorbitol al 5 %, pH 5) tiene crecimiento significativo en el área pico pre- y postprincipal, la proteína muestra más degradación en la región pico post-principal en el análisis de las muestras liofilizadas con menores cantidades de sacarosa. El trabajo anterior con muestras de estabilidad líquida (después de almacenamiento a temperatura elevada) ha mostrado que surge la desamidación de glutamina y arginina en la proteína, lo que contribuye al crecimiento en la región pre-pico en las muestras líquidas. A temperatura refrigerada, no se observa degradación química por HPLC de intercambio catiónico y de fase inversa en la formulación liofilizada después de almacenamiento a largo plazo. Por ejemplo, los cromatogramas de intercambio catiónico no muestran cambios evidentes bajo temperaturas variadas (-80°C, 4°C y temperatura ambiente controlada durante seis meses) . Debido a la carencia de degradación química en la formulación liofilizada durante el tiempo a temperatura ambiente controlada y menor, mucho del trabajo de desarrollo de formulación se centró en reducir al mínimo la agregación física asociada con el secado por congelamiento.
Tween 20 Reduce al Mínimo la Agregación Inducida por Liofilización La inclusión de Tween 20 a una baja concentración (0.004 %) se necesita para reducir al mínimo una pequeña cantidad de agregación que es evidente después de la 1 i o f i 1 i z a c i ón . Esto se puede demostrar al examinar los resultados pertinentes de varios estudios de estabilidad en los cuales se evaluaron las muestras para estabilidad con y sin la adición de Tween 20. Primero se usó una mayor concentración de proteína de Fc-TMP para explorar un amplio intervalo de Tween 20 a fin de investigar la cantidad necesaria para reducir al mínimo la agregación. La concentración de Fc-TMP en este estudio fue 20 mg/ml, con los niveles de Tween 20 ajustados a 0.002, 0.004, 0.006 y 0.01 %. Después del almacenamiento durante un año a 4°C, la agregación se limita a <0.1 % en todas las formulaciones con Tween 20. Los resultados de seis meses tampoco mostraron agregación significativa.
Tween 20 al 0.004 % se eligió para consideración adicional en los estudios de formulación, como se analiza en la presente designado para Fc-TMP a 0.5 mg /mi . La Tabla 40 muestra la cantidad de agregación en Fc-TMP monitorizado en tiempo cero, 3 y '11 meses después de almacenamiento a 4°C. En este estudio, se liofilizó Fc-TMP a 0.5 mg/ml en la formulación mencionada anteriormente y en formulaciones con relaciones variadas de sacarosa: manitol sin Tween 20 adicionado. Además, se siguió la estabilidad en la formulación actual sin Tween 20 y se amortiguó a pH 4.5, 5 y 5.5. Los resultados muestran que sólo la formulación mencionada anteriormente tiene agregación mínima a PH 5. En formulaciones si Tween 20, la agregación varía desde 0.5 % a alrededor de 5 %. También es mayor la agregación a pH 4.5 y 5.5 en comparación a aquella detectada a pH 5. Menores relaciones de s a ca r o s a : ma n i t o 1 (formulaciones de sacarosa al 0.2, 0.5 y 1 %) tienen mayor agregación, puesto que los niveles son típicamente cerca de 5 %. Durante el tiempo, el nivel de agregación permanece consistente en la formulación mencionada anteriormente y en la formulación sin Tween 20 a través del punto de tiempo de un año.
Tabla 40 Fc-TMP en histidina 10 mM, formulaciones variadas, 0.5 mg/ml Por ciento de Agregación Medido por SEC-HPLC Las muestras de formulación optimizadas se seleccionaron para evaluación en el punto de tiempo de 11 meses.
Se diseñaron estudios adicionales de formulación para confirmar el efecto benéfico de Tween en la reducción al mínimo de la agregación. Todas las muestras en estos estudios se formularon a pH 5 con y sin Tween 20 al 0.004 %. La Tabla 41 lista el por ciento de agregación después del almacenamiento a 4°C para intervalos de tiempo de 0, 18 semanas y 1 año en la estabilidad. En el tiempo cero, inmediatamente después de la liofilización, se reduce al mínimo la agregación en todas las muestras con Tween 20 al 0.004 %. Se observan pequeñas cantidades de agregación en muestras sin Tween 20, con la cantidad más alta encontrada en la formulación con sacarosa al 0.2 %. La efectividad de Tween 20 al reducir al mínimo la agregación también se extiende al punto de tiempo de' 18 semanas, con el mayor por ciento de agregación encontrado en las muestras que carecen de Tween 20 y a bajas relaciones de sacarosa : manitol . Después del almacenamiento durante un año a 4°C, la agregación también es consistentemente baja en las muestras que contienen Tween 20.
Tabla 41 Fc-TMP en histidina 10 mM, formulaciones variadas, 0.3 mg/ml, pH5 Por ciento de Agregación Medido por SEC-HPLC Después del Almacenamiento a 4°C Formulación Tiempo Cero 4 Meses 1 Año1 2 % de Sacarosa, 4 % de <0.1 0.2 . <0.1 Manitol (con Tween 20 al 0.004 %) 2 % de Sacarosa, 4 % de 0.2 0.2 Manitol 0.2 % de Sacarosa, 5.1 % <0.1 <0.1 <0.1 de Manitol (con Tween 20 al 0.004 %) Formulación Tiempo Cero 4 Meses 1 Año1 0.2 % de Sacarosa, 5.1 % 1.1 1.3 de anitol 0.5 % de Sacarosa, 4.8 % <0.1 0.2 <0.1 de Manitol (con Tween 20 al 0.004 %) 0.5 % de Sacarosa, 4.8 % 0.2 0.8 de Manitol 1 % de Sacarosa, 4.5 % de <0.1 <0.1 <0.1 Manitol (con Tween 20 al 0.004 %) 1 % de Sacarosa, 4.5 % de 0.1 0.3 Manitol 1.5 % de Sacarosa, 4.8 % <0.1 <0.1 <0.1 de Manitol (con Tween 20 al 0.004 %) 1.5 % de Sacarosa, 4.8 % 0.1 0.3 de Manitol Muestras con Tween 20 se seleccionaron para evaluación en el punto de tiempo de 1 año Otro estudio de estabilidad, diseñado para probar la efectividad de antioxidantes en la reducción al mínimo de la degradación química, reforzó el efecto protector de Tween 20. Los antioxidantes no tienen un impacto en la reducción al mínimo de la degradación química en almacenamiento a temperatura elevada. Sin embargo, la formulación mencionada anteriormente, con 0.004 % de Tween 20 y a una concentración de Fc-TMP de 0.2 mg/ml, tiene <0.1 % de agregación en el tiempo cero y 0.1 % después de 5 meses de almacenamiento a 4°C. La misma formulación sin Tween 20 tiene 0.4 % de agregación en tiempo cero y 1 % de agregación después de almacenamiento durante 5 meses. Los resultados del estudio de estabilidad presentados en las Tablas II, III y los estudios mencionados anteriormente ilustran el efecto protector de Tween 20 en la reducción al mínimo de la agregación en la liofili zación . Es mínimo el crecimiento de la agregación durante el tiempo, puesto que los puntos de tiempo que se extienden desde 1 año a 4°C no muestran incrementos significativos en la agregación en muestras formuladas con 0.004 % de Tween 20. En base a estos resultados de estudio de estabilidad que muestran que la adición de Tween 20 reduce al mínimo la agregación en la liofilización, se inició trabajo a mayor escala con la formulación recomendada.
Estudios a Mayor Escala La Agregación es Dependiente de la Concentración Se diseño un estudio inicial a mayor escala para simular las condiciones de fabricación y para examinar la fortaleza de la formulación con respecto al estrés de envió y con respecto a la estabilidad en la reconstitución. Se intercambio con amortiguador el Fc-TMP, en el amortiguador de formulación, usando un dispositivo de filtración de flujo tangencial, similar a los procesos de escala mayor. La proteína se diluyó subsiguientemente a concentraciones de 0.5 y 0.1 mg/ml con Tween 20 también adicionado antes del paso final de filtración. Después de que se rellenaron todas las muestras, se realizó la liofilización . Se expone a continuación un proceso de liofilización de ejemplo: Pasos de Tratamiento Térmico Temperatura de Congelación -50°C Congelamiento Adicional 0 minutos Punto de Ajuste de Condensador -60°C Punto de Ajuste de Vacío 100 m Torr Pasos de Secado Primario Temperatiempo Vac Rampa/ tura Mantenimiento Paso No. 1 -50 15 100 H Paso No. 2 -25 120 100 R Paso No. 3 -25 600 100 H Paso No. 4 -25 600 100 H Paso No. 5 0 800 100 R Paso No. 6 25 800 100 R Paso No. 7 25 800 100 H Paso No. 8 25 800 100 H Paso No. 9 25 0 100 H Paso No. 10 25 0 100 H Paso No. 11 25 0 100 H Paso No. 12 25 0 100 H Paso No. 13 25 0 100 H Paso No. 14 25 0 100 H Paso No. 15 25 0 100 H Paso No. 16 25 0 100 H Post--Calor 25 100 100 H Temperatura Secundaria a 28 °C El almacenamiento pasivo a 4°C dio por resultado más agregación a la concentración baja de Fc-TMP (0.1 mg/ml). En el tiempo cero, se determinó por SEC-HPLC la agregación como que es de 0.4 % en la formulación de 0.1 mg/ml, en tanto que se detectó 0.1 % de agregación en la proteina formulada a 0.5 mg/ml. Después de seis meses de almacenamiento a temperatura refrigerada, la agregación permaneció a los mismos niveles como la observada para las muestras de tiempo cero para ambas concentraciones de Fc-TMP, de acuerdo con los resultados de los estudios anteriores de estabilidad. Debido a la mayor cantidad de agregación observada a la menor concentración (0.1 mg/ml) se decidió que 0.5 mg/ml se estudiaría mejor como la concentración de lección para trabajo adicional a mayor escala .
Agregación no Incrementa en Estrés Simulado de corte También se sometieron muestras liofilizadas (no reconstituidas) del estudio inicial de aumento de escala a molienda simulada y transporte con aire con la ayuda de kit de simulación de estrés. De forma breve, se siguió el protocolo como se resume en el ASTM (American Society Testing Methods), Método #D-4728. Se logró la molienda simulada y el transporte en aire usando una Mesa de Vibración Electrodinámica Modelo S202, y un Amplificador de Potencia, Modelo #TA240 (Unholtz-Dickie Corporation, Wallingford, CT) . Después del estrés de transportación, se comparó la apariencia física de las tortas liofilizadas a los controles pasivos, con el resultado que no fueron obvios cambios morfológicos de la torta. Fue aceptable tanto la estabilidad química como física, con agregación consistente en las muestras sometidas a estrés y controles pasivos (<0.1 % en las muestras de 0.5 mg/ml en comparación a 0.4 % en las muestras de 0.1 mg/ml). Se examinó la estabilidad en la reconstitución, en este estudio, al preparar muestras recién reconstituidas y al incubar durante 3, 7 y 14 días ya sea de forma pasiva, con agitación lenta o agitación vigorosa. La Tabla 42 muestra los resultados para las formulaciones de 0.1 y 0.5 mg/ml. Como se espera, la cantidad de agregación se reduce al mínimo las formulaciones a 0.5 mg/ml. En comparación a la agitación lenta durante el tiempo versus las muestras no agitadas, ningún incremento significativo en la agregación es evidente durante el periodo de 14 días. También es consistente la cantidad de dimerización en estas formulaciones (Sin agitación y Con agitación) . De manera interesante, los resultados de la agitación parecen presentar una tendencia; es decir, la agregación cae a menos que niveles detectables después del tiempo cero tanto las muestras de 0.1 como de 0.5 mg/ml. Entre tanto, hay un incremento correspondiente en la cantidad de dimerización observada en la mayoría de las muestras agitadas en cada punto de tiempo, sugiriendo que hay alguna reversibilidad al ir desde el estado agregado al dimero en Fc-TMP sometida a estrés de corte.
Tabla 42 Fc-TMP en Histidina lOmM, con 2 % de Sacarosa, 4 % de Manitol y 0.004 % de Tween 20, pH 5 Por ciento de Agregación y Diraerización Medido por SEGHPLC Después del Almacenamiento a 0.1 mg/ml Secado Secundario Durante 12 Horas en el Ciclo de Liofilización es Suficiente para Reducir al Mínimo la Humedad Residual Se realizó un segundo estudio de escala aumentada en el cual se intercambió con amortiguador Fc-TMP y se diluyó a 0.5 mg/ml en la formulación recomendada. Se logró la liofilización con un ciclo que consiste de un paso inicial de congelación a -50°C, seguido por fijación a -13°C. La temperatura se disminuyó a -50°C, se mantuvo durante 1 hora, y el secado primario se inició a -50°C con un punto de ajuste de vacio de lOOmTorr. Después de un breve periodo de mantenimiento a -50°C, la temperatura se bajó a -25°C durante un periodo de dos horas, se mantuvo a -25°C durante 20 horas, y luego aumentó gradualmente a 25 °C después de aproximadamente 27 horas para el comienzo del secado secundario. Se continuó el secado secundario durante un mínimo de 12 horas a 25°C. Durante el ciclo de liofilización, las muestras se jalaron después de 12, 18 y 24 horas de secado secundario a fin de verificar la estabilidad y comparar el nivel de humedad residual. Los resultados muestran que la humedad residual, como se mide por Titulación con Karl Fisher, es de aproximadamente 0.6 % o menos (Tabla 43) en todas las muestras examinadas. La humedad es similarmente baja en tortas de placebo con amortiguador. En base a este trabajo, el tiempo de secado secundario del ciclo de liofilización se puede acortar en un intervalo entre 12-18 horas.
Tabla 43 Humedad Residual en Fc-TMP Tiempo de Secado Secundario Mantenidos a 12, 18 y 24 Horas Tiempo de Secado Secundario Por ciento de Humedad por Karl Fisher 12 horas 0.23 12 horas 0.38 Tiempo de Secado Secundario Por ciento de Humedad por Karl Fisher Placebo de Amortiguador 0.43 18 horas 0.63 18 horas 0.28 Placebo de Amortiguador 0.3 24 horas 0.46 24 horas 0.37 Placebo de Amortiguador 0.31 Los resultados de estabilidad también son comparables con respecto a este intervalo de tiempo de secado secundario, puesto que las muestras no tienen diferencias con respecto a la estabilidad química o física. Por ejemplo, la cantidad de agregación es <0.1 % para todas las muestras examinadas, en tanto que el por ciento de dímero es consistente a 0.1 %. Estos resultados confirman que el tiempo de secado secundario se puede acortar a menos de 24 horas sin afectar la estabilidad inicial de la proteína. Se realizó trabajo adicional para evaluar la fortaleza de la formulación con respecto a concentraciones variadas de excipiente. Puesto que el trabajo anterior de estabilidad ha mostrado que la sacarosa, por ejemplo, puede tener un impacto en la estabilidad, fue necesario examinar la fortaleza de Fc-TMP en cambios menores en los niveles de excipiente .
Estudio Estadístico de Fc-TMP Fortaleza de la Formulación Se ha diseñado un estudio estadístico inicial para examinar cambios menores en las variables de la formulación tal como el pH de la formulación, concentración de amortiguador de histidina y relación sacarosa : manitol , usando un paquete de software E-chip. Estas muestras se liofilizaron pero se usó un ciclo de secado por congelación no óptimo que dio por resultado mayor agregación que la observada de forma típica. El estudio fue un estudio de selección, asumiendo una superficie de respuesta lineal. Los resultados de la valoración de la estabilidad mostraron que el pH (4.7 a 5.3) y la concentración fe amortiguador de histidina (variada de 5 a 15 mm) , tienen poco impacto en la estabilidad de Fc-TMP. A fin de verificar la contribución de Tween 20 y la relación de sacarosa : manitol en la estabilidad total de Fc-TMP, se inició un estudio de diseño estadístico de seguimiento usando el ciclo más óptimo de liofilización .
Estudio de Estabilidad Estadístico Cuadrático El segundo estudio de diseño estadístico examinó variaciones en Tween 20 (0.001 %, 0.0045 % y 0.008 %), la relación de sacarosa : manitol (0.7:4.2, 2:4 y 2.3:3.8), y las variaciones en la concentración de proteina (0.3, 0.65 y 1 mg/ml) . El pH de las formulaciones también se ajustó a 4.7, 5 y 5.3, y la concentración del amortiguador de histidina varió de 7, 10 y 13 mM. Se prepararon muestras y se liofilizaron usando un liofilizador Virtis (SP Industries, Inc., Gardiner, NY) , con un ciclo conservador optimizado, usado para los estudios anteriores de estabilidad. Los resultados de estabilidad se interpretaron usando E-chip (paquete de software de diseño estadístico, Hockessin, DE) de dos maneras: una valoración del impacto de las variables de la formulación en la cantidad de agregación y en la dimerización observada en el tiempo cero, y el efecto de las variables de la formulación al afectar la estabilidad en almacenamiento a temperatura elevada (37 °C) como se mide por velocidades de cambio desde el tiempo cero.
Resultados de Formulación de Tiempo Cero de Estudio Estadístico Cuadrático Los resultados desde la valoración de tiempo cero mostraron que, como se espera, Tween 20 reduce al mínimo la • agregación, sin embargo, la concentración de proteína también fue significativa en la reducción de la tendencia para agregarse en el secado por congelación. El programa de software E-chip valora los efectos que tienen diferentes variables de entrada (las condiciones de la formulación) en la agregación y dimerización de Fc-TMP durante el secado por congelación. Con respecto a la dimerización de Fc-TMP en el tiempo cero, no se consideró un excipiente de la formulación (en base a los resultados de E-chip) que tenga un efecto significativo. Varias variables de la formulación impactaron la cantidad de agregación observada en Fc-TMP secada por congelación. En base a los resultados de resumen proporcionados por E-chip, la concentración de Fc-TMP tiene el más grande efecto en el grado de agregación observada en tiempo cero, seguido por el nivel de Tween 20. Se observa agregación que es la mayor, en el tiempo cero, en las muestras de baja concentración. Igualmente, cantidades mayores de Tween 20 tienen más efecto protector en la reducción al mínimo de la agregación en el tiempo cero, aunque esta tendencia fue significativamente como el efecto de concentración de proteína. Se observaron mayores cantidades de agregación en este estudio en comparación a los resultados del estudio anterior, y se observó aproximadamente 0.5 % de agregación en algunas muestras a las concentraciones más bajas de proteína con Tween 20. Se observó que la variabilidad en la agregación caía conforme se incrementa la concentración de la proteína. A 0.5 mg/ml y mayores concentraciones, Fc-TMP tiene la agregación más baja promedio que en las muestras formuladas en o por abajo de 0.3 mg/ml.
Tween 20 a 0.004 % es Efectivo al Reducir al Mínimo la Agregación en Almacenamiento a Temperatura Elevada El Estudio de diseño estadístico también se usó para valorar los cambios en almacenamiento a temperatura elevada. Se compararon las velocidades de agregación en las condiciones variadas en formulación después de 16 días a 37°C al sustraer los resultados de temperatura elevada de los resultados iniciales (del tiempo cero) y normalizando al tiempo de 1 mes. Las velocidades que son negativas de esta manera se refieren como una pérdida evidente de la propiedad medida durante el tiempo. Se determinaron variables de respuesta (que corresponden a los resultados de los ensayo) a través de RP-HPLC (por ciento de pureza de pico principal y por ciento de pre-pico) , HPLC de intercambio catiónico (por ciento de pureza de pico principal) HPLC de exclusión de tamaño (agregación y formación de dímero) y NIR-agua (humedad residual por espectroscopia infrarroja, que se correlacionó con los resultados de Titulación de Karl Fisher en algunas muestras para verificar la exactitud) . Los resultados de una comparación de las velocidades de cambio obtenidas de cada técnica de ensayo muestran que los cambios en la agregación y en la oxidación por RP-HPLC fueron estadísticamente significativos con respecto a la concentración de Fc-TMP y concentración de Tween-20 al cuadrado, dentro de dos desviaciones estándar. El término Tween 20 al cuadrado surge igualmente de la naturaleza cuadrática del estudio que asume una superficie de respuesta en curva. En este caso, el término Tween 20 al cuadrado se ajusta mejor modelo, además de sugerir posiblemente que hay un efecto interactivo por si mismo que afecta la estabilidad. Las otras respuestas medidas, tal como la pureza de pico principal por HPLC de intercambio catiónico, o las condiciones de pH variado, por ejemplo, no exhiben ninguna respuesta significativa al afectar la estabilidad de la proteina. Como es el caso con el estudio inicial de aumento de escala analizado anteriormente (muestras agitadas en tambor, no agitadas en tambor y agitadas), la cantidad de agregación es menor después de almacenamiento a alta temperatura. La velocidad de cambio en estas muestras se usó para hacer predicciones en base al modelo estadístico (estudio cuadrático) para anticipar el efecto protector de Tween 20. La Tabla 44 muestra predicciones de la cantidad de agregación esperada, en base al modelo de diseño estadístico, conforme la concentración de Tween 20 se aumenta desde 0 a 0.008 %. Como se muestra, la velocidad de agregación, normalizada un mes a 37°C, es negativa (indicando la pérdida de agregado en estas condiciones) con la excepción de Tween 20 al 0 %, caso en el cual se predice que crezca la agregación. La velocidad de pérdida de agregado aparece en meseta a concentraciones de Tween 20 de 0.002 % mayores. Sugiriendo que Tween 20 a bajos niveles (0.002-0.006 %) es suficiente para reducir al mínimo la degradación física. La velocidad de crecimiento del dímero es correspondientemente similar bajo estas condiciones y no se correlacionó estadísticamente con ninguno de los excipientes de la formulación, como se menciona anteriormente.
Tabla 44 Predicciones de Modelo Cuadrático Estadístico Concentraciones Variadas de Tween 20 y Fc-TMP En base a Incubación de 16 Días a 37°C (normalizados a un mes! % de Fc-TMP % de Límite de % de Límite de Tween (mg/ml) agregación predicción oxidación predicción 20 de SEC por RP- HPLC 0.5 -0.09 -0.32, 0.47 2.59, 0.50) 1.65) 0.002 0.5 -0.35 ¦0.69, -0.68 2.44, 0.0) 1.08) 0.004 0.5 -0.53 •0.87, •0.58 -2.32, 0.19) 1.17) 0.006 0.5 -0.45 ¦0.78, -0.17 (-1.86, 0.12) 1.52) % de Fc-TMP % de Limite de % de Limite de Tween (mg/ml) agregación predicción oxidación predicción 20 de SEC por RP- HPLC 0.008 0.5 -0.12 (-0.46, 0.54 (-1.18, 0.21) 2.26) 0.004 0.3 -0.59 (-0.94, - 0.58 (-1.18, 0.25) 2.34) 0.004 0.1 -0.63 (-1-10, - 2.69 (-0.28, 0.16) 5.09) La velocidad de cambio en la oxidación medida por RP-HPLC a 0.5 mg/ml, asumiendo que esto corresponde a cambios en la región de pre-pico de cada cromatograma , no es estadísticamente significativa con respecto al término Tween 20 al cuadrado. En este caso, el modelo (como se muestra en la Tabla 44) predice que conforme la concentración de Tween 20 se varía, la velocidad de oxidación es consistente con los límites de los intervalos de predicción. La concentración de proteína afecta la oxidación, puesto que la velocidad de crecimiento se incrementa desde 0.58 a 2.69 conforme cae la concentración de proteína desde 0.3 a 0.1 mg/ml (en tanto que se mantiene constante Tween 20 al 0.004 %). Estos resultados sugieren que mantener la concentración de Tween 20 entre 0.002 a 0.006 % deseable desde un punto de vista de estabilidad. La cantidad de proteina también es importante, puesto que la estabilidad se empeora a concentraciones por abajo de 0.5 mg/ml.
Estabilidad a Temperatura Refrigerada Considerando lo anterior, la siguiente formulación se usó para valorar la estabilidad a temperatura refrigerada de Fc-TMP liofilizado: 0.5 mg/ml de Fc-TMP en Histidina 10 mM amortiguada a pH 5, 2 % de Sacarosa, 4 % de Manitol, y 0.004 % de Tween 20. La formulación se monitorizó para estabilidad a temperatura refrigerada durante un periodo de un año. La Tabla 45 muestra los resultados de estabilidad de este estudio, con resultados desde tiempo cero, 3 meses y un año, listados. Como se muestra, el por ciento de pureza de pico principal, como se mide por HPLC de Fase Inversa y de Intercambio Catiónico, no parece disminuir con el tiempo. Las diferencias menores en la pureza de pico principal durante el tiempo son típicas de la variación normal en la resolución de las columnas cromatográf icas y también se observan en la norma congelada. El por ciento de agregación es consistente y no parece crecer después de un año.
Tabla 45 Por Ciento de Pico Máximo de PHCL de Fase Invertida Punto de Tiempo Concentración 0 3 meses 1 año 0.3 81.0 82.5 82.4 0.5 69.0 82.7 83.4 1.0 80.6 82.4 83.2 Material de inicio 82.4 84.0 84.5 congelado Por ciento de Pico Máximo de HPL de Intercambio Catiónico Punto de Tiempo Concentración 0 3 meses 1 año 0.3 67.0 71.8 81.8 0.5 73.5 83.1 80.0 1.0 74.2 79.7 80.5 Material de inicio 75.3 77.0 83.6 congelado Por Ciento de Agregación de HPLC de Exclusión de Tamaño Punto de Tiempo Concentración 0 3 meses 1 año 0.3 <0.1 0.1 0.1 0.5 <0.1 <0.1 0.1 1.0 <0.1 <0.1 <0.1 Material de inicio 0.1 0.1 <0.1 congelado Se formula Fc-TMP en histidina 10 M, amortiguada a pH 5.0 con 2 % de sacarosa, 4 % de manitol y 0.004 % de Tween-20. Se ha mostrado que pH 5 es más óptima para estabilidad, y que la relación sacarosa:manitol es critica al reducir al mínimo la degradación química en el almacenamiento a temperatura elevada para este sistema de proteína. Se necesita Tween-20 a una baja concentración a fin de reducir al mínimo la cantidad de agregación que se presenta como resultado del proceso de liofilización. Los estudios de estabilidad para aplicaciones a escala mayor soportan estas conclusiones. También se han investigado estudios estadísticos que validan el nivel de cada excipiente en la formulación, incluyendo la necesidad de que la concentración de proteína esté a 0.5 mg/ml. La estabilidad a temperatura refrigerada de la formulación recomendada no muestra degradación significativa después del almacenamiento durante un año a 4°C.
Ejemplo 8 Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Ang-2 A fin de determinar la formulación óptima para péptido liofilizado de unión a Fc-Ang-2, se llevaron a cabo análisis que valoraron la agregación del péptido de unión a Fc-Ang-2 y la estabilidad a varios valores de pH, varias concentraciones de excipiente, y varias concentraciones de proteina. El péptido de unión a Fc-Ang-2 consiste de dos moléculas de polipéptido farmacéuticamente activas enlazadas al C-término de la porción Fe de una molécula de anticuerpo de IgGl. La molécula está comprendida de 574 residuos de aminoácido con un pesos molecular total de 63,511 Daltones. El pl de la molécula es 5.45. Hay dos enlaces de disulfuro en cada uno de los polipéptidos activos. Hay un total de 20 residuos de cisteina a todo lo largo de la molécula, la mayoría de los cuales están oxidados en puentes de disulfuro. La secuencia del péptido de unión de Fc-Ang-2 es como sigue: MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF FPPKPKDTMSRT^ REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN^ SLTCLWGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSL^ YTQKSLSLSPGKGGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID No. 2) La porción Fe de la IgGl termina en K228. El G229-G233 compone una secuencia ligadora. El polipéptido activo se une en A234 y se extiende al resto de la secuencia.
Selección de pH de Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Ang-2 La selección de pH probó la estabilidad de un péptido de unión a Fc-Ang-2 a pH 4.0, 7.0 y 8.0. A pH 4.0, los amortiguadores seleccionados incluyeron ácido glutámico, citrato de sodio y succinato de sodio, cada uno a una concentración de 10 mM. A pH 7.0, los amortiguadores seleccionados fueron histidina y tris, ambos a concentración de 10 mM. También se seleccionaron histidina y tris a pH 8.0, cada uno a 10 mM. Cada uno de los amortiguadores contuvo 4 % de manitol como un agente de torta de liofilización y 2 % de sacarosa como un excipiente. Además, el amortiguador de histidina a pH 7.0 se examinó con y sin la presencia de un agente tensioactivo, Tween-20 al 0.01 % (v/v). La proteina se diluyó a 5 mg/ml con cada uno de los amortiguadores de formulación. Esta solución se dializó en cada uno de los amortiguadores de formulación usando tubería de diálisis con un límite de exclusión de peso molecular de 10,000 Da, donde se realizaron un total de 6 intercambios con un mínimo de 4 horas de equilibrio entre intercambios. Después de la diálisis, la proteína se puso en alícuotas en frascos de vidrio de 3 cm3 con un volumen de relleno de 1 mi. Estos frascos entonces se liofilizaron usando un instrumento de secado por congelación a escala de laboratorio. Después de la liofilización, los frascos se sellaron y almacenaron para incubación a 4°C, 29°C, y 37°C, donde los frascos individuales se retiraron y analizaron en varios puntos durante tiempo, empezando inmediatamente después de la liofilización y extendiéndose a un periodo de 24 meses. Las muestras se reconstituyeron con el volumen apropiado de agua y se analizaron para estabilidad de proteína usando cromatografía líquida de exclusión de tamaño y electroforesis en gel (que detecta la agregación, dimerización y escisión proteolítica ) , cromatografía líquida de intercambio aniónico (que detecta la oxidación) . Además, las propiedades de la torta tal como los tiempos de reconstitución y humedad y las propiedades de la solución líquida reconstituida se analizaron (tal como pH) .
Estudio de Excipiente de Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Ang-2 Se realizó la selección de excipientes en un amortiguador individual, histidina 10 mM a pH 7.0. Los dos excipientes comparados en este estudio fueron arginina al 0.85 % y sacarosa al 1 %. El agente de torta usado con arginina fue manitol al 4 %, y el agente de torta usado con sacarosa fue glicina al 2 %. Cada una de las formulaciones se probó a concentraciones de proteína de 1 mg/ml, 30 mg/ml y 60 mg/ml. Además, se probó a 30 mg/ml una formulación que contiene una combinación de manitol y sacarosa. Cada una de las formulaciones contuvo Tween-20 al 0.001 %. La proteína se concentró primero a 70 mg/ml se dializó en la formulación apropiada usando un dispositivo de ultrafiltración/diafiltración a escala del laboratorio. La proteína entonces se diluyó a cada una de las tres concentraciones con amortiguador apropiado de formulación. La proteína entonces se puso en alícuotas en frascos de vidrio de 3 ce con un volumen de relleno de 1 mi. Los frascos entonces se liofilizaron usando un instrumento de secado por congelación a escala de laboratorio. Después de la liofilización, los frascos se sellaron y almacenaron para incubación a 4°C, 29°C, 37°C y 52°C, donde los frascos individuales se retiraron y analizaron en varios puntos durante el tiempo, empezando inmediatamente después de la liofilización y extendiéndose a un periodo de 24 meses. Las muestras se analizaron para estabilidad de proteina usando cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio aniónico y SDS-PAGE. También se examinaron las propiedades de la torta liofilizada y las soluciones líquidas reconstituidas.
Selección de Concentración de Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Ang-2 La selección de concentraciones se realizó en histidina 10 m a pH 7.2, con 4 % de manitol como el agente de torta y 2 % de sacarosa como un excipiente. La proteína se concentró a aproximadamente 140 mg/ml y se dializó en la formulación usando un dispositivo de ultrafiltración/diafiltración a escala del laboratorio. La proteína dializada entonces se diluyó a 30 mg/ml, 60 mg/ml y 120 mg/ml en el amortiguador de formulación. Las soluciones entonces se pusieron en alícuotas en 3 frascos de vidrio de 3 cm3 a un volumen de relleno de 1 mi. Los frascos se liofilizaron usando un instrumento de secado por congelación a escala del laboratorio. Después de la liofilización, los frascos se sellaron y almacenaron para incubación a 4°C, 29°C, 37°C y 52°C, donde los frascos individuales se retiraron y analizaron en varios puntos durante el tiempo, empezando inmediatamente después de la liofilización y extendiéndose a un periodo de 24 meses. Las muestras se analizaron para estabilidad de proteina usando cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio aniónico y SDS-PAGE. También se analizaron las propiedades de la torta liofilizada y las soluciones líquidas reconstituidas.
Conclusión . Considerando lo anterior, las formulaciones óptimas comprenden histidina 10 mM, 4 % de manitol, 2 % de sacarosa, Tween-20 al 0.01 %, pH 7.0.
Ejemplo 9 Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Agp-3 A fin de determinar la formulación óptima para péptido liofilizado de unión a Fc-Agp-3, se llevaron a cabo análisis que valoraron la agregación del péptido de unión a Fc-Agp-3 y la estabilidad a varios valores de pH, varias concentraciones de excipiente, y varias concentraciones de proteina . El péptido de unión a Fc-Agp-3 es un pepticuerpo N-enlazado contra el factor de activación de células B (BAFF) dirigido contra enfermedades relacionadas a células B. El pepticuerpo se construye de dos polipéptidos enlazados a disulfuro no glicosilados con una masa total de -63.6 kD. El punto isoeléctrico para este pepticuerpo se ha estimado que es pH 7.36.
Secuencia de Fe (SEQ ID No. 1696) : V D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F P S D I A V E E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K Secuencia de Péptido de Unión a Agp-3 (SEQ ID No.: 1697): G C K W D L L I K Q W V C D P L G S G S A T G G S G S T A S S G S G S A T H M L P G C K W D L L I K Q W V C D P L G G G G G De esta manera, la secuencia del péptido de unión a Fc-Agp-3 es como sigue: G C K W D L L I K Q W V C D P L G S G S A T G G S G S T A S S G S G s A T H M L P G C K D L L I K Q w V C D P L G G G G G V D K T H T C P P c P A P E L L G G P s V F L F P P K P K D T L M I s R T P E V T c V V V D V S H E D P E V K F N Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D L N G K E Y K c K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T c L V K G F Y P S D I A V E w E s N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y s K L T V D K s R W Q Q G N V F s c s V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K (SEQ ID NO 1698 ) Selección Amplia de pH de Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Agp-3 a 10 mg/ml La estabilidad se valoró principalmente por HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC) , que fue indicadora de estabilidad a temperaturas elevadas. Para valorar las propiedades de estabilidad y reconstitución del péptido liofilizado de unión a Fc-Agp-3 sobre el intervalo de pH de 3.85-7.6, se formuló péptido de unión a Fc-Agp-3 a 10 mg/ml en varios amortiguadores de 10 mM en la presencia de 2.5 % de manitol y 2.0 % de sacarosa. Se probaron los siguientes amortiguadores a incrementos de unidad de pH de aproximadamente 0.5: acetato, succinato, histidina, pirofosfato, fosfato y tris. Para el trabajo de desarrollo de la formulación, se obtuvo material purificado de volumen en la formulación líquida congelada de 30 mg/ml. El material se dializó en los amortiguadores apropiados de formulaciones y liofilizó en un liofilizador Virtis un ciclo conservador. El paso de fijación se realizó a -20°c y duró durante 4 horas para permitir la cristalización de manitol. El secado primario se realizó a la temperatura distante de -25°C durante 20 horas. El secado primario alcanzó la terminación a -25°C puesto que no se observó pico en el vacío conforme la temperatura de arranque se incrementó hasta 0°C. No se observó colapso mayor y las muestras prosiguieron exitosamente a través del secado secundario primero a 0°C, y luego a 25°C. En la reconstitución las formulaciones con pH en o por arriba de 7 estuvieron ligeramente turbias, en tanto que todas las otras formulaciones fueron claras. Esto se explicó por la proximidad de las formulaciones de pH alto al punto isoeléctrico del péptido de unión a Fc-Agp-3 (pl = 7.36). El análisis por SE-HLPC reveló un número como la especie principal de alto peso molecular. Se observó que el por ciento relativo de dímero fue fuertemente dependiente de pH con la acumulación más baja a pH 5 y por abajo. La cantidad de agregados solubles también mostró alguna dependencia del pH . No se observaron agregados solubles en las muestras antes de la liofili zación . En contraste, estuvo presente una pequeña cantidad de dímero en todas las formulaciones antes de la liofilización, y se incrementó adicionalmente en las muestras reconstituidas, después de la liofilización . No se observó recorte significativo en todas las formulaciones. La cantidad más alta del monómero intacto fue en el caso de formulaciones de acetato, succinato e histidina a pH 5 y por abajo.
Selección Amplia de pH de Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Agp-3 a 30 mg/ml: Efecto Estabilizador de Sacarosa y Manitol Se valoró la estabilidad principalmente por HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC) , que fue indicadora de la estabilidad. Para evaluar el efecto de la presencia de 2.5 % de manitol y 3.5 % de sacarosa en la estabilidad en las propiedades de estabilidad de constitución del péptido liofilizado de unión a Fc-Agp-3 sobre el intervalo de ph de 4.5-7.5, se formuló el péptido de unión a Fc-Agp-3 a 30 mg/ml en amortiguadores de succinato, histidina y fosfato de 10 mM. Los amortiguadores de pirofosfato y Tris se excluyeron de este estudio debido a pobre desempeño en la selección amplia anterior de pH. Se excluyó el amortiguador de acetato debido a la posibilidad de cambios en el pH en las muestras reconstituidas como resultado de la sublimación de acetato durante el secado por congelación. Para el trabajo de desarrollo de la formulación, se obtuvo un material purificado de volumen en la formulación liquida congelada de 30 mg/ml. El material se dializó en los amortiguadores apropiados de formulación y se liofilizó en un liofilizador Virtis usando un ciclo conservador. El paso de fijación se realizó a -20°C y duró durante 5 horas para permitir la cristalización más completa de manitol. El secado primario se realizó a la temperatura de anaquel de -25°C durante 20 horas. El secado primario no alcanzó completamente la terminación a -25°C, y se observó algún pico en el vacio conforme se incrementó la temperatura de anaquel hasta 0°C. No se observó colapso mayor y las muestras prosiguieron exitosamente a través del secado secundario primero a 0°C, y luego a 25°C. En la reconstitución, las formulaciones con pH de aproximadamente 7 fueron ligeramente turbias, en tanto que todas las otras formulaciones fueron claras. Como se mencionó anteriormente, esto se puede explicar por la proximidad de las formulaciones de alto pH al punto isoeléctrico del péptido de unión a Fc-Agp-3. El análisis por SE-HPLC reveló dimero como la especie principal de alto peso molecular. Nuevamente, se observó que el por ciento relativo de dimero fue fuertemente dependiente del pH con la acumulación más baja a pH 5 y por abajo. La cantidad de agregados solubles no mostró clara dependencia con el pH. No se observaron agregados solubles en las muestras antes de la liofilización . Se observó -0.6 % de dimero en el volumen no de GMP antes de la formulación y se incrementó hasta 3.0 % para formulaciones de alto pH antes de la liofilización como resultado del intercambio/concentración de amortiguador.
La dependencia del pH de la acumulación de dimero también se confirmó por correspondencia cercana de la cantidad relativa de dimero a un pH dado a pesar del tipo de amortiguador. El por ciento de dimero no se incrementó significativamente después de la 1 i o f i 1 i z a c i ón como se evidencia por muestra de T = 0. La única excepción fueron las muestras que no contienen ni sacarosa ni manitol, que mostraron incrementos notable de -0.25-0.5 % en el por ciento de dimero. En la presencia de sacarosa, la pérdida del pico principal fue mínima aún después del intercambio de amo r t i guado r / 1 i o f i 1 i z a c i ón para formulaciones de succinato e histidina con pH 4.1 y 4.7, respectivamente. Comparándolas todas las formulaciones de fosfato mostraron pérdida de ~3 % del pico principal antes de la 1 i o f i 1 i z a c i ón . Aunque, la torta se formó aún en la presencia tanto de sacarosa como de manitol, el pico principal correspondiente cayó por 0.5-0.7 % en comparación a las formulaciones que contiene azúcar. Además, la reconstitución de las formulaciones sin azúcar fue mucho más prolongada (>2 min) y requirió alguna agitación. A fin de asegurar la fortaleza de la torta, se incluyeron manitol o glicina como agentes de volumen en todas las formulaciones subsiguientes aunque la sacarosa sola se mostró que confiere suficiente estabilidad de proteína.
Selección Estrecha de pH de Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Agp-3 a 30 mg/ml Se valoró la estabilidad principalmente por HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC) y HPLC de fase invertida (RP-HPLC) , que fue indicadora de la estabilidad a temperaturas elevadas. Puesto que el por ciento de recuperación del pico principal fue mayor a pH 5 o por abajo, el amortiguador de fosfato se omitió de la selección estrecha de pH . Además de los amortiguadores de succinato e histidina que se desempeñaron bien en las selecciones amplias de pH, la selección estrecha de pH incluyó glutamato 10 mM, pH 4-6. Las formulaciones se probaron a incrementos unitarios de pH de 0.2. El contenido de sacarosa manitol se mantuvo constante a 3.5 % y 2.5 %, respectivamente, excepto para las dos formulaciones de succinato a pH 4.5 con 2.0 % y 50 % de sacarosa. También, se probaron seis formulaciones lio genéricas potenciales a cada uno de los incrementos unitarios de pH, tal como: 1) Histidina a 20 mM, 2.0 % de glicina, 1.0 % de sacarosa a pH 5.0 2) Histidina a 20 mM, 2.0 % de glicina, 1.0 % de sacarosa a pH 6.0 3) Histidina a 20 mM, 2.0 % de glicina, 1.0 % de sacarosa a pH 7.0 4) Histidina a 20 mM, 4.0 % de manitol, 2.0 % de sacarosa a pH 5.0 5) histidina a 20 mM, 4.0 % de manitol, 2.0 % de sacarosa a pH 6.0 6) Histidina a 20 mM, 4.0 % de manitol, 2.0 % de sacarosa a pH 7.0 Para el trabajo de desarrollo de formulaciones, se asoció material purificado de volumen en la formulación liquida congelada de 30 mg/ml. El material se dializó en los amortiguadores apropiados de formulación y se liofilizó en un liofilizador Virtis usando un sitio conservador. El ciclo de liofilización se modificó adicionalmente . El paso de fijación se realizó a -15°C para permitir la cristalización de glicina y duró 5 horas. El secado primario se realizó inicialmente a -30°C durante un periodo corto de tiempo (4 h) . Entonces, la temperatura de anaquel se elevó a -25°C, y se mantuvo constante durante 24 horas. Sin embargo, el secado primario no alcanzó completamente el término a -25°C como se evidencia por un pequeño pico en el vacio conforme se incrementó adicionalmente la temperatura de anaquel hasta 0°C. Sin embargo, no se observó colapso mayor y las muestras prosiguieron exitosamente a través del secado secundario primero a 0°C, y luego a 25°C. Hasta los 6 meses, se generaron datos de estabilidad en estado liofilizado a 37°C para valorar la estabilidad a largo plazo para el péptido de unión a Fc-Agp-3. El incremento en el pH da por resultado la pérdida del pico principal para todas las formulaciones de histidina. Sólo se monitorizaron formulaciones genéricas hasta 6 meses, pero la ventaja del pH cercano a 5.0 fue casi obvio para los puntos de tiempo de 1 y 3 meses. Además, los datos de seis meses para las formulaciones genéricas sugieren que las formulaciones de manitol más sacarosa son más estables que glicina más sacarosa, especialmente a pH 6 y superior. En el caso de formulaciones de glutamato y succinato también hubo un incremento claro dependiente de pH en la cantidad de dimero, el producto principal de degradación, conforme el pH llega a ser menos ácido. Se dio, para los agregados, dependencia similar al pH. La más alta recuperación del pico principal se observó para pH 5 y por abajo. La pérdida inicial del pico principal para T=0 se puede explicar por degradación de proteina durante el intercambio de amortiguador y concentración como se evidencia por una pérdida similar para las formulaciones antes de la liofilización . Sin embargo, los datos de estabilidad de 3 meses sugieren que las formulaciones de glutamato tienen mayor estabilidad física que sus contrapartes de succinato (con el mismo pH) . También se señala que en este estudio también se probó el efecto de concentraciones incrementadas de sacarosa en la estabilidad de las formulaciones de succinato. Además de 3.5 % de sacarosa, se compararon formulaciones con 2.0 % y 5.0 % de sacarosa en succinato, pH 4.5. El incremento en la sacarosa disminuyó la especie de alto peso molecular en algún grado, pero no afectó de forma significativa la cantidad del pico principal. Por lo tanto, se consideró óptima sacarosa a 3.5 % puesto que las formulaciones correspondieron más cercanamente con la tonicidad fisiológica. Se observó una especie de corte que crece a pH bajo por RP-HPLC. Una porción significativa del corte dependiente de pH en las formulaciones liofilizadas se presentó antes de la liofilización como resultado del intercambio de amortiguador, consumidor de tiempo, y los pasos de concentración de proteina. Después de la liofilización, no se observó incremento significativo en la cantidad de recortes aún después de almacenamiento de 3 a 6 meses a 37°C. En general, los datos sugieren usar formulaciones de pH mayor para mitigar el recorte puesto que no es observable a pH 6 y por arriba. Sin embargo, la cantidad del dimero es significante a pH mayor y puede ser tan alta como 2.5-4.5 % a pH 6 y mayor. Por lo tanto, se puede encontrar un arreglo en la formulación del péptido de unión a Fc-Agp-3 a pH5, donde el recorte es moderado, especialmente en los amortiguadores de glutamato e histidina, y cuando aún se suprime de forma suficiente la formación de dimero.
Conclusión manitol y 3.5 % de sacarosa han proporcionado estabilidad de proteina y torta suficiente como se confirma por estudio en anaquel de 6 meses a 37°C. Por lo tanto, se puede usar histidina 10 mM, manitol al 2.5 %, sacarosa al 3.5 % a pH 5.0 y glutamato 10 mM, manitol al 2.5 %, sacarosa al 3.5 % a pH 5.0 para formular el péptido de unión a Fc-Agp-3 de 30 mg/ml. Además, este estudio muestra que histidina a 20 mM, 4.0 % de manitol, 2.0 % de sacarosa a pH 5.0 también se desempeñan bien y se pueden considerar como una posible formulación lio genérica para pepticuerpos .
Ejemplo 10 Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Myo A fin de determinar la formulación óptima para el péptido liofilizado de unión a Fc-Myo, se llevaron a cabo análisis que valoraron la agregación y estabilidad del péptido de unión a Fc-Myo a varios valores de pH, varias concentraciones de excipiente y varias concentraciones de proteina . El péptido de unión a Fc-Myo es un pepticuerpo C-enlazado contra la proteina principal dirigida contra enfermedades relacionadas al desaprovechamiento muscular. El pepticuerpo se construyó de dos polipéptidos enlazados a disulfuro no glicosilados con una masa total de -59.1 kD. El punto isoeléctrico para este pepticuerpo se ha estimado que es pH 6.88.
Secuencia de Fe ( SEQ ID No.: 1699): M D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K Secuencia de Péptido de Unión a Miostatina (SEQ ID No. : 1700) : G G G G G A Q L A D H G Q C I R W P W M C P P E G W E De esta manera, la secuencia del péptido de unión a ¦ Fc-Myo: M D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K G G G G G A Q L A D H G Q C I R W P W M C P P E G W E (SEQ ID No.: 1701) Determinación de Condición de pH para Péptido Liofilizado de unión a Fc-Myo Se valoró la estabilidad principalmente por HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC), que fue indicadora de la estabilidad a temperaturas elevadas. Se diseñó un estudio de selección de pH y se realizó para determinar el pH óptimo de formulación en el estado liquido antes de la liofilización . La proteina se formuló a pH 4.5, 4.75, 5.0, 5.5 y 6.0 con agentes amortiguadores de acetato de histidina y sacarosa como el estabilizador (el lio-protector) . Los frascos formulados se almacenaron a 29°C durante hasta 1 año. Se monitorizó la estabilidad usando SE-HPLC. Se calcularon las constantes de velocidad de agregación para cada una de las condiciones de la formulación. La velocidad de agregación a pH 4.5 se encontró que es la mínima, por lo tanto se seleccionó pH 4.5 como la condición preferida de pH de formulación.
Estudio de agente amortiguador de péptido liofilizado de unión a Fc-Myo a 30 mg/ml Se valoró la estabilidad principalmente por HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC) , que fue indicadora de la estabilidad. Una forma de dosis de 30 mg/ml como se investigó usando tres agentes amortiguadores diferentes: glutamato 10 mM, histidina 10 mM y succinato 10 mM a pH 4.5. Todas las formulaciones contienen 0.004 % de polisorbato 20.
Para el trabajo de desarrollo de la formulación, se obtuvo material purificado de volumen en la formulación liquida congelada de 30 mg/ml. El material se dializó en los amortiguadores apropiados de formulación y se liofilizó en un liofilizador Virtis usando un " ciclo conservador. La formulación de proteina liofilizada presentó elegancia aceptable de torta. En la reconstitución, las formulaciones fueron claras. Se almacenó el péptido liofilizado de unión a Fc-Myo a 4, 29, 37 y 52 °C. Se llevaron a cabo los estudios de estabilidad en tiempo real 4°C y se encontró que son comparables para estas formulaciones durante hasta 3 meses. Sin embargo a 52°C almacenamiento de 3 meses, la formulación que contiene histidina fue ligeramente mejor que la formulación que contiene glutamato. La formulación succinato fue significativamente menos estable que las otras formulaciones. En base a estos resultados, se consideraron histidina y glutamato como los agentes amortiguadores preferidos para la formulación final de péptido de unión a Fc-Myo .
Estudio de Excipientes de Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Myo a 30 mg/ml: Efecto Estabilizador de Sacarosa, Trehalosa e Hidroxietil-Almidón El estudio se valoró principalmente por HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC), que fue indicadora de la estabilidad. Para evaluar el efecto de la presencia de trehalosa, hidroxietil-almidón sacarosa en la estabilidad del péptido liofilizado de unión a Fc-Myo, se formuló el péptido de unión a Fc-Myo a 30 mg/ml en amortiguador de glutamato 10 mM con 4 % de manitol. La concentración de trehalosa y sacarosa usada fue 2.0 %, se adicionó 1 % de hidroxietil-almidón a la formulación de sacarosa para hacer una formulación final de glutamato 10 mM, 4 % de manitol, 2 % de sacarosa, y 1 % de hidroxietil-almidón. Todas las formulaciones contuvieron 0.004 % de polisorbato 20. Para el 'trabajo de desarrollo de la formulación, se obtuvo material purificado de volumen en la formulación liquida congelada de 30 mg/ml. El material se dializó en los amortiguadores apropiados de formulación y se liofilizó en un liofilizador Virtis usando un ciclo conservador. La formulación de proteina liofilizada presentó elegancia aceptable de torta. En la reconstitución las formulaciones fueron claras. La estabilidad de las formulaciones se monitorizó usando SE-HPLC. El péptido liofilizado de unión a Fc-Myo se almacenó a 4, 29, 37 y 52°C. La estabilidad (4°C) en condición de tiempo en anaquel de tiempo real se encontró comparable entre estas formulaciones durante hasta 3 meses. Sin embargo, bajo condición de almacenamiento a 52°C durante 3 meses, la formulación que contiene sacarosa fue ligeramente mejor que la formulación que contiene trehalosa. La adición de hidroxietil-almidón no presenta ningún impacto negativo en la estabilidad. En base a estos resultados, se consideró sacarosa como el estabilizador preferido para la formulación final de péptido de unión a Fc-Myo.
Estudio de Excipientes de Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Myo a 30 mg/ml; Efecto Estabilizador de Sacarosa en Manitol Se valoró la estabilidad principalmente por HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC) que fue indicadora de la estabilidad. Para evaluar el efecto de la presencia de la cantidad variable de manitol y sacarosa en las propiedades de estabilidad y reconstitución del péptido liofilizado de unión a Fc-Myo sobre el intervalo de manitol de 4.0 a 8 % y el intervalo de sacarosa de 1.0 % a 4.0 %, se formuló el péptido de unión a Fc-Myo a 30 mg/ml en amortiguador de glutamato 10 mM. Todas las formulaciones contienen 0.004 % de polisorbato. Para el trabajo de desarrollo de la formulación, se obtuvo un material purificado de volumen en la formulación liquida congelada de 30 mg/ml. El material se dializó en los amortiguadores apropiados de formulación y se liofilizó en un liofilizador Virtis usando un ciclo conservador. La formulación de proteina liofilizada presentó elegancia aceptable de torta. En la reconstitución, las formulaciones fueron claras. La estabilidad de estas formulaciones se monitorizó usando método de SE-HPLC. El péptido liofilizado de unión a Fc-Myo se almacenó a 4, 29, 37 y 52°C. La estabilidad (4°C) en condición de tiempo en anaquel y tiempo real se encontró comparable entre estas formulaciones durante hasta 3 meses. Sin embargo cuando se almacenó a 52°C durante 3 meses, se encontró una cantidad creciente de sacarosa que contribuye al incremento en la estabilidad contra la degradación. Debido a una cuestión para mantener la condición isotónica para la formulación final que limita la cantidad total de disacáridos y para mantener una relación apropiada en manitol y sacarosa para conservar la propiedad de torta liofilizada, 4.0 % de manitol y 2.0 % de sacarosa fueron los excipientes preferidos para la formulación final.
Estudio de Excipientes de Péptido Liofilizado de Unión a Fc-Myo a 1, 30, 85 mg/ml La estabilidad se valoró principalmente por HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC) , que fue indicadora de la estabilidad. Para evaluar el efecto de la concentración de proteina en las propiedades de estabilidad de constitución del péptido liofilizado de unión a Fc-Myo, el péptido de unión a Fc-Myo se formuló a 1, 30, 85 mg/ml en un amortiguador de glutamato 10 mM con 4 % de manitol y 2 % de sacarosa. Todas las formulaciones contienen 0.004 % de polisorbato 20. Para el trabajo de desarrollo de la formulación, el material purificado de volumen se obtuvo en la formulación liquida congelada de 30 mg/ml. El material se intercambio de amortiguador en los amortiguadores apropiados de formulación usando UF/DF y se liofilizó en un liofilizador Virtis usando ciclo conservador. La formulación liofilizado de proteina presentó elegancia aceptable de torta. En la reconstitución, las formulaciones fueron claras. La estabilidad de estas formulaciones se monitorizó usando el método de SE-HPLC. El péptido liofilizado de unión a Fc-Myo se almacenó a 4, 29, 37°C. La estabilidad (4°C) en condición de tiempo de anaquel y tiempo real se encontró comparable entre estas formulaciones durante hasta 6 meses. La estabilidad es igualmente aceptable para todas las concentraciones estudiadas como la formulación de producto comercial .
Conclusión 4.0 % de manitol y 2.0 % de sacarosa han proporcionado estabilidad suficiente de torta y proteina como se confirma por estudio de anaquel de 12 meses a 4°C. Por lo tanto, histidina 10 mM, manitol a 4.0 %, sacarosa al 2.0 % a pH 4.5 y glutamato 10 mM, manitol al 4.0 , sacarosa al 2.0 % a pH 4.5 se pueden usar para formular de 1 a 100 mg/ml de péptido de unión a Fc-Myo. La presente invención se ha descrito en términos de modalidades particular encontradas a propuestas para comprender modos preferidos para la práctica de la invención. Se apreciará por aquéllos expertos en la técnica que, en vista de la presente descripción, se pueden hacer numerosas modificaciones y cambios en las modalidades particulares e emplificadas sin apartarse del alcance propuesto de la invención . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Composición liofilizada de pepticuerpo terapéutico que comprende un amortiguador, un agente de volumen, un agente estabilizador, y opcionalmente un agente tensioactivo; caracterizado porque el amortiguador está comprendido de un agente amortiguador de pH en un intervalo de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM y en donde el pH esta en el intervalo de aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 8.0, en donde el agente de volumen está a una concentración de aproximadamente 0 % a aproximadamente 4.5 % p/v; en donde el agente estabilizador está a una concentración de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 20 % p/v; en donde el agente tensioactivo está a una concentración de aproximadamente 0.004 % a aproximadamente 0.4 % p/v; y en donde el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula I; Fórmula I: [ (X1) a-F1- (X2) b] - (L1) c-WSPd en donde : F1 es un dominio Fe; X1 se selecciona de P'-ÍL^ f-P^ÍL^ e- P3- (L4) g-P2- (L3) f-P1- (L2) e- y P4- (L5)h-P -L4)g-P2- (L3) 2 , f-P1- ( L X2 se selecciona de: - (L^ e- 1, -(L2)e-P1-(L3)f-P2, -(L2) e-P1-(L3)f-P2-(L4)g-P3, y - (L2) e-P1- (L3) f-P2- (L4) g-P3- (L5) h-P4 en donde P1, P2, P3 y P4 son cada uno independientemente secuencias de péptidos farmacológicamente activos ; L1, L2, L3, L4 y L5 son cada uno independientemente ligadores ; a, b, c, e, f, g y h son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición que al menos uno de a y b sea 1/ d es 0, 1 o mayor que 1; y WSP es un polímero soluble en agua, la unión del cual se efectúa en cualquier porción reactiva en F1. 2. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula II Fórmula II [X1-F1] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el C-término de X1, y se unen cero, uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. 3. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula III Fórmula III [F1-X2] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de X2, y se unen uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. . Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula IV Fórmula IV [F1- (L1) c-P1] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de -(L1)c-P1, y se unen cero, uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. 5. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula V Fórmula V [ F1- (L1) e-P1- (L2) f-P2] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de -L1-P1-L -P2 y se unen cero, uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. 6. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizada porque el pepticuerpo terapéutico es un multimero. 7. Composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el pepticuerpo terapéutico es un dimero. 8. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizada porque P1, P2, P3 y/o P4 se selecciona independientemente de un péptido expuesto en cualquiera de las Tablas 4 hasta 38. 9. Composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque P1, P2, P3 y/o P4 tienen la misma secuencia de aminoácidos. 10. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizada porque el dominio Fe se expone en SEQ ID NO: 1. 11. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizada porque SP es PEG. 12. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizada porque el dominio Fe se expone en SEQ ID NO: 1 y WSP es PEG. 13. Composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 kDa y 100 kDa. 14. Composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 6 kDa y 25 kDa. 15. Composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 50 % PEGilado. 16. Composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 75 % PEGilado. 17. Composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 85 % PEGilado. 18. Composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 90 % PEGilado. 19. Composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 95 % PEGilado. 20. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el agente amortiguador de pH se selecciona del grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato y aspartato . 21. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el agente de volumen se selecciona del grupo que consiste de manitol, glicina, sacarosa, dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, lactosa, sorbitol, trehalosa y xilitol. 22. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el agente estabilizador se selecciona del grupo que consiste de sacarosa, trehalosa, mañosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentibiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructuosa, manitol, sorbitol, glicina, arginina, HC1, compuestos de poli-hidroxi , incluyendo polisacáridos tal como dextrano almidón, hidroxietil-almidón, dextrina, N-metil-pirrolideno, celulosa y ácido hialurónico, cloruro de sodio. 23. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el agente tensioactivo se selecciona del grupo que consiste de laurilsulfato de sodio, dioctil-sulfosuccinato de sodio, dioctil-sulfonato de sodio, ácido quenodesoxicólico, sal sódica de N-lauroilsarcosina, dodecilsulfato de litio, sal sódica de ácido 1-octanosulfónico, hidrato de colato de sodio, desoxicolato de sodio, sal sódica de ácido glicodesoxicólico, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, monohidrato de cloruro de cetilpiridinio, bromoro de hexadeciltrimetilamonio, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonina, Tritón X-100, Tritón X-114, lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, 40, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 20, 40, 60, 65 y 80, lecitina de soya, DOPC, DMPG, DMPC y DOPG; éster de ácido graso de sacarosa, metil-celulosa y carboximetil-celulosa . 24. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque la concentración del pepticuerpo terapéutico esta entre aproximadamente 0.25 mg/mL y 250 mg/mL. 25. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 4 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.004 % p/v. 26. Composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 6. 27. Composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la concentración del pepticuerpo terapéutico es 0.5 mg/mL. 28. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 7.0; en donde el agente de volumen es manitol al 4 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.01 % p/v. 29. Composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 32. 30. Composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la concentración del pepticuerpo terapéutico es 30 mg/mL. 31. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el agente amortiguador de pH es histidina 20 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 3.3 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.01 % p/v. 32. Composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 4. 33. Composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la concentración del pepticuerpo terapéutico es 100 mg/mL. 34. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 2.5 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 3.5 % p/v. 35. Composición de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 31. 36. Composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la concentración del pepticuerpo terapéutico es 30 mg/mL. 37. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque la composición selecciona del grupo que consiste de: a) histidina 10 mM, pH 4.7, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; b) histidina 10 mM, pH 5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; c) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; d) succinato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; e) glutamato 10 mM, pH 4.5, 9 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; f) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de sacarosa, 1 % de hidroxietil-almidón, 0.004 % de polisorbato 20; g) glutamato 5 mM, pH 4.5, 2 % de manitol, 1 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; y h) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de trehalosa, 0.004 % de polisorbato 20. 38. Composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque P1 comprende una secuencia expuesta en las Tablas 21-24. 39. Composición de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la concentración del pepticuerpo terapéutico se selecciona del, grupo que consiste de 1, 30, 85, y 100 mg/mL. 40. Método para elaborar un pepticuerpo terapéutico liofilizado, caracterizado porque comprende los pasos de: a) preparar una solución de un amortiguador, un agente de volumen, un agente estabilizador, y opcionalmente un agente tensioactivo ; donde el amortiguador está comprendido de un agente amortiguador de pH en un intervalo de aproximadamente 5 mm hasta aproximadamente 20 mM y en donde el pH esta en el intervalo de aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 8.0; en donde el agente de volumen esta una concentración de aproximadamente 2.5 % a aproximadamente 4 % p/v; en donde el agente estabilizador está a una concentración de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 5 % p/v; en donde el agente tensioactivo está a una concentración de aproximadamente 0.004 % a aproximadamente 0.04 % p/v; y b) liofilizar el pepticuerpo terapéutico; en donde el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula I·, Fórmula I: [ (X1) a-F1- (X2) b] - (L1) c-WSPd en donde: F1 es un dominio Fe; X1 se selecciona de P2- (L3) f-P1- (L2)e- ?3- ( ') g-P2- ( 3) f-P1- (L2) e- y P4- (L5) h-P3-L4) g-P2- (L3) f-P1- (L2) e- X2 se selecciona de: - (L^e-P1, -(L2)e-P1-(L3)f-P2- (L4)g-P3, y - (L2) e-P1- (L3) f-P2- (L4) a-P3- (L5) h-P4 en donde P1, P2, P3 y P4 son cada uno independiente secuencias de péptidos farmacológicamente activos; L1, L2, L3, L4 y L5 son cada uno independientemente ligadores ; a, b, c, e, f, g y h son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición que al menos uno de a y b es 1; d es 0, l o mayor que 1 ; y SP es un polímero soluble en agua, la unión del cual se efectúa en cualquier porción reactiva en F1. 41. Método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el pépticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula II Fórmula II [X1-F1] - (L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el C-término de X1, y se unen cero, uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. 42. Método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el pépticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula III Fórmula III [ Fx-X2 ] - ( L1 ) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de X2, y se unen cero, uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. 43. Método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el pépticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula IV Fórmula IV [F1-(L1)e-P1]-(L1) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de -(L c-?1/- y se unen cero, uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. 44. Método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el pepticuerpo terapéutico comprende una estructura expuesta en la Fórmula V Fórmula V [ F1- (L1 ) e-P1- (L2 ) f-P2 ] - (L1 ) c-WSPd en donde el dominio Fe se une en el N-término de -L1-P1-L2-P2 y se unen cero, uno o más WSP al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. 45. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 hasta 44, caracterizado porque el pepticuerpo terapéutico es un multimero. 46. Método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el pepticuerpo terapéutico es un dimero. 47. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 hasta 46, caracterizado porque P1, P2, P3 y/o P4 se selecciona independientemente de un péptido expuesto en cualquiera de las Tablas 4 hasta 38. 48. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque P1, P2, P3 y/o P4 tienen la misma secuencia de aminoácidos. 49. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 hasta 46, caracterizado porque el dominio Fe se expone en SEQ ID NO: 1. 50. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 hasta 46, caracterizado porque SP es PEG. 51. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 hasta 46, caracterizado porque el dominio Fe se expone en SEQ ID NO: 1 y WSP es PEG. 52. Método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 kDa y 100 kDa. 53. Método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 6 kDa y 25 kDa. 54. Método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la composición comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 50 % PEGilado. 55. Método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 75 % PEGilado. 56. Método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 85 % PEGilado. 57. Método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 90 % PEGilado. 58. Método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque comprende al menos un pepticuerpo terapéutico 95 % PEGilado. 59. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque el agente amortiguador de pH se selecciona del grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato y aspartato . 60. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque el agente de volumen se selecciona del grupo que consiste de manitol, glicina, sacarosa, dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, lactosa, sorbitol, trehalosa o xilitol. 61. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque el agente estabilizador se selecciona del grupo que consiste de sacarosa, trehalosa, mañosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentibiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructuosa, manitol, sorbitol, glicina, arginina-HC1, compuestos de poli-hidroxi , incluyendo polisacáridos tal como dextrano almidón, hidroxietil-almidón, ciclodextrinas , N-metil-pirrolideno, celulosa y ácido hialurónico, cloruro de sodio . 62. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque el agente tensioactivo se selecciona del grupo que consiste de laurilsulfato de sodio, dioctil-sulfosuccinato de sodio, dioctil-sulfonato de sodio, ácido quenodesoxicólico, sal sódica de N-lauroilsarcosina , dodecilsul fato de litio, sal sódica de ácido 1-octanosulfónico, hidrato de colato de sodio, desoxicolato de sodio, sal sódica de ácido glicodesoxicólico, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, monohidrato de cloruro de cetilpiridinio, bromoro de hexadeciltrimetilamonio, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonina, Tritón X-100, Tritón X-114, lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, 40, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 20, 40, 60, 65 y 80, lecitina de soya, DOPC, DMPG, D PC y DOPG; éster de ácido graso de sacarosa, metil-celulosa y carboximetil-celulosa . 63. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque la concentración del pepticuerpo terapéutico esta entre aproximadamente 0.25 mg/mL y 250 mg/mL. 64. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 4 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.004 % p/v. 65. Método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 6. 66. Método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la concentración del pepticuerpo terapéutico es 0.5 mg/mL. 67. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 7.0; en donde el agente de volumen es manitol al 4 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.01 % p/v. 68. Método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 32. 69. Método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la concentración del pepticuerpo terapéutico es 30 mg/mL. 70. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque el agente amortiguador de pH es histidina 20 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 3.3 % p/v; en donde el agente estabilizador es sacarosa al 2 % p/v; y en donde el agente tensioactivo es polisorbato 20 al 0.01 % p/v. 71. Composición de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 4. 72. Método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la concentración del pepticuerpo terapéutico es 100 mg/mL. 73. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque el agente amortiguador de pH es histidina 10 mM y en donde el pH es 5.0; en donde el agente de volumen es manitol al 2.5 % p/v; y en donde el agente estabilizador es sacarosa al 3.5 % p/v. 74. Método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque P1 comprende una secuencia expuesta en la Tabla 31. 75. Método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque la concentración del pepticuerpo terapéutico es 30 mg/mL. 76. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-58, caracterizado porque la composición se selecciona del grupo que consiste de: a) histidina 10 mM, pH 4.7, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; b) histidina 10 mM, pH 5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; c) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol y 2 % de sacarosa, con y sin 0.004 % de polisorbato 20; d) succinato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; e) glutamato 10 mM, pH 4.5, 9 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; f) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de sacarosa, 1 % de hidroxietil-almidón, 0.004 % de polisorbato 20; g) glutamato 5 mM, pH 4.5, 2 % de manitol, 1 % de sacarosa, 0.004 % de polisorbato 20; y h) glutamato 10 mM, pH 4.5, 4 % de manitol, 2 % de trehalosa, 0.004 % de polisorbato 20. 77. Método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque P1 comprende una secuencia expuesta en las Tablas 21-24. 78. Composición de conformidad con la reivindicación 77, caracterizada porque la concentración del pepticuerpo terapéutico se selecciona del grupo que consiste de 1, 30, 85, y 100 mg/mL. 79. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-75, caracterizado porque además comprende, antes de la liofilización, los pasos de: b) ajustar el pH de la solución a un pH entre aproximadamente 4.0 y aproximadamente 8.0; c) preparar una solución que contiene el pepticuerpo terapéutico; d) intercambiar con amortiguador la solución del paso (c) en la solución del paso (b) ; e) adicionar una cantidad apropiada de un agente tensioactivo; y f ) liofilizar la mezcla del paso (e) . 80. Método para preparar una composición reconstituida de pepticuerpo terapéutico, caracterizado porque comprende los pasos de; a) liofilizar una composición de pepticuerpo terapéutico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 40-78; y b) reconstituir la composición del pepticuerpo terapéutico liofilizado. 81. Kit para preparar una composición farmacéutica acuosa, caracterizado porque comprende un primer recipiente que tiene una composición de pepticuerpo terapéutico liofilizado de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 36, y un segundo recipiente que tiene un solvente fisiológicamente aceptable para la composición liofilizada.
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