RS55428B1

RS55428B1 - Liofilizovane formulacije terapeutskih peptitela

Info

Publication number: RS55428B1
Application number: RS20161076A
Authority: RS
Inventors: William J Callahan; Richard L Remmele Jr; Gayathri Ratnaswamy; Ramil F Latypov; Dingjiang Liu
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2006-04-21
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2017-04-28
Also published as: US20090258017A1; JP2021006525A; IL194653A0; KR101227278B1; PH12014502880A1; TWI352598B; AU2007240656A1; JP2009534392A; JP6356106B2; EP2594287A1; KR20120114384A; WO2007124090A3; UA99815C2; EA201270625A1; IL224966A; CA2649292A1; CR10442A; EP2018183B1; CR20140274A; JP2014040441A

Description

OBLASTPRONALASKA

[0001]Uopšteno, pronalazak se odnosi na formulacije liofilizovanih terapeutskih peptitela i postupke dobijanja liofilizovanih kompozicija koje sadrže terapeutska peptitela.

OSNOVA PRONALASKA

[0002]Rekombinantni proteini čine novu klasu terapeutskih agenasa. Ovi rekombinantni terapeutici obezbeđuju brojne prednosti u pripremi i u hemijskim modifikacijama. Osmišljene su modifikacije koje štite terapeutske proteine, pre svega tako što smanjuju njihovu izloženost delovanju proteolitičkih enzima. Modifikacije proteina takođe mogu da povećaju stabilnost terapeutskih proteina, vreme cirkulacije, kao i biološku aktivnost. Pregledni članak koji opisuje modifikacije proteina i fuzije proteina je Francis (1992), Focus on Grovvth Factors 3:4-10 (Mediscript, London).

[0003]Korisna modifikacija proteina je kombinovanje polipeptida sa "Fc" domenom antitela. Antitela obuhvataju dva funkcionalno nezavisna dela, varijabilni domen, poznat kao "Fab," koji vezuje antigen, i konstantni domen, poznat kao "Fc," koji je odgovoran za aktiviranje efektorskih funkcija, kao što je aktivacija komplementa i napad fagocitnim ćelijama. Domen Fc ispoljava dug polu-život u serumu, dok je Fab kratko-živeći. Capon i sar., (1989), Nature 337: 525-31. Videti takođe, U.S. Patent No. 5,428,130. Kada se ugradi u sastav terapeutskih peptitela ili proteina, Fc domen može da mu obezbedi duži polu-život i ispoljavanje funkcija kao što je vezivanje Fc receptora, vezivanje proteina A, fiksiranje komplementa, pa čak i prenos kroz posteljicu. Id. Tabela 1 sumarno prikazuje fuzije Fc domena sa terapeutskim proteinima poznate u stanju tehnike.

[0004]Fuzioni proteini ili polipeptidi konjugovani sa polietilen-glikolom ("PEG) izučavaju se radi primene u dobijanju farmaceutika, artificijelnih implanta i drugih primena u kojima je važna biokompatibilnost. Predloženi su različiti derivati PEG sa aktivnim mestom koje omogućava da se PEG veže za farmaceutike i implante, odnosno, uopšteno za molekule i površine. Na primer, predloženi su derivati PEG za sprezanje PEG za površine, kako bi on kontrolisao vlažnost, povećanje statičkog naelektrisanja, vezivanje drugih molekula za površinu, uključujući proteine i amino kiseline.

[0005]U nekim studijama pokazano je da sprezanj sa PEG ("PEGilacija") pokazuje poželjne efekte u prevazilaženju problema na koje se nailazi u kliničkoj primeni biološki aktivnih molekula. Objavljena PCT publikacija Br. WO 92/16221 tvrdi, na primer, da mnogi potencijalno terapeutski korisni proteini imaju nizak polu-život u serumu.

[0006]PEGilacija smanjuje brzinu eliminacije iz krvotoka, povećavajući molekulsku težinu molekula. Do izvesne veličine, brzina glomerularne filtracije proteina je obrnuto proporcionalna veličini proteina. Sposobnost PEGilacije da smanji izlučivanje nije generalan način na na koji funkcionišu PEG grupe zakačene za proteine, već je to povećanje ukupne molekulske mase konjugovanog proteina. Smanjenje klirensa može dovesti do povećanja efikasnosti u odnosu na na-PEGilovane materijale. Videti, na primer, Conforti i sar., Pharm. Research Commun. vol. 19, pg. 287 (1987) i Katre i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol. 84, str. 1487 (1987).

[00071Uz to, PEGilovanje može da smanji agregaciju proteina (Suzuki i sar., Biochem. Biophvs. Acta vol. 788, pg. 248 (1984)), da promeni (na primer), imunogenost proteina

(Abuchowski i sar., J. Biol. Chem. vol. 252 str. 3582 (1977) i, kada je potrebno, da poveća rastvorljivost proteina, na primer, u PCT Publikaciji Broj. WO 92/16221.

[0008JNačelno govoreći, interakcija proteinskog liganda sa njegovim receptorom najčešće se odvija preko relativno velike površine. Međutim, kao što je pokazano u slučaju vezivanja čovečjeg hormona rasta sa njegov receptor, samo nekoliko ključnih amino-kiselinskih ostataka suštinski doprinosi energiji vezivanja. Clackson, T. i sar., Science 267:383-386

(1995). Ova činjenica, kao i činjenica da glavnina preostalog dela proteinskog liganda ima svrhu samo da ispolji vezujuće epitope u pravilnoj topologiji, čini mogućim da se pronađu aktivni Ugandi znatno manjih dimenzija. Stoga, i molekuli dužine "peptida" kao što je ovde definisano, mogu da se vežu za receptorski protein tako velikog proteinskog liganda. Ovi peptidi mogu da imitiraju biološku aktivnost velikog proteinskog liganda ("peptidni agonisti") ili, putem kompetitivnog vezivanja, da inhibiraju bioaktivnost velikog proteinskog liganda ("peptidni antagonisti").

[0009]Pokazalo se da je izlaganje peptidne biblioteke u bakteriofagu moćan postupak identifikacije peptidnih agonista i antagonista. Na primer, videti, Scott i sar., (1990), Science 249: 386; Devlin i sar., (1990), Science 249: 404; U.S. Pat. No. 5,223,409, izdat, 29. juna. 1993; U.S. Pat. No. 5,733,731, izdat 31. marta, 1998; U.S. Pat. No. 5,498,530, izdat 12. marta, 1996; U.S. Pat. No. 5,432,018, izdat 11 jula, 1995; U.S. Pat. No. 5,338,665, izdat 16. avgusta, 1994; U.S. Pat. No. 5,922,545, izdat 13. jula, 1999; WO 96/40987, objavljen 19. decembra; i WO 98/15833, objavljen 16. aprila, 1998. U takvim bibliotekama, zahvaljujući fuziji sa ovojnim proteinima filamentoznog faga, izložene su nasumične peptidne sekvence. Izloženi peptidi se eluiraju imunoafinitetnim vezivanjem za vanćelijski domen receptora.Vezan peptidi se prečišćavanju sukcesivnim koracima afinitetnog prečišćavanja i repropagacije, a najbolji peptidi se sekvenciraju kako bi se identifikovali ključni amino-kiselinski ostaci unutar jedne ili više strukturno srodnih porodica peptida. Videti, na primer, rad Cwirla i sar. (1997), Science 276: 1696-9, u kojem su identifikovane dve različite porodice proteina. Peptidne sekvence mogu da ukažu na to koji se amino-kiselinski ostaci mogu bezbedno ukloniti alaninskim skeniranjem ili mutagenenzom na DNK nivou. Moguće je kreirati i pretražiti mutageno-formirane biblioteke, kako bi se dalje optimizovale sekvence najbolji vezivnih peptida. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophvs. Biomol. Struct. 26: 401-24.

[0010]Osim fagnih biblioteka, u oblasti istraživanja peptidi postoje u drugi jednako efikasni postupci. Peptidne biblioteke se mogu spojiti sa karboksilnim krajemlacrepresora i eksprimirati se uE. coli.Još jedan postupak koji se odvija u E. coli omogućava eksprimiranje biblioteke na spoljašnjoj strani ćelijske membrane, fuzijom sa peptidoglikan-asociranim lipoproteinom (PAL). Ovi i drugi srodni postupci zajedno se nazivaju "izlaganje na E. coli" Naredni postupak pretraživanja solubilnih peptidnih smeša zasniva se na korišćenju kvasca za ekspresiju i sekreciju. Videti, Smith i sar. (1993), Mol. Pharmacol. 43: 741-8. Postupak Smith i sar., kao i drugi srodni postupci nazivaju se "pretraživanje u kvascima". Naredni postupak zasniva se na prekidu translacije nasumičnih RNK pre oslobađanja sa ribozoma, usled čega se dobijaju biblioteke polipeptida povezane sa svojim odgovarajućim informacionim RNK. Ovi i slični postupci se kolektivno nazivaju "izlaganje na ribozomu." Ostali postupci baziraju se na hemijskom povezivanju peptida za odgovarajuće informacione RNK; videti, na primer„Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-303. Ovaj i ostali srodni pristupi kolektivno se nazivaju "pretraživanje RNK-peptida." Mogu se proizvesti hemijske peptidne biblioteke, u kojima su peptidi imobilisani na stabilnim, ne-biološkim materijalima, kao što su poletilenski štapići ili permeabilne smole. Druge hemijski dobijene peptidne biblioteke baziraju se na fotolitografiji u pretraživanju peptida imobilisanih na staklenim pločicama. Ovi i srodni postupci nazivaju se "hemijsko pretraživanje". Hemijsko pretraživanje je korisno, jer dozvoljava upotebu D-amino kiselina i drugih ne-prirodnih analoga, kao i nepeptidnih elemenata. Pregled bioloških i hemijskih postupaka dat je u Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62.

[0011]U slučaju poznatih bioaktivnih peptida, moguće je racionalno dizajnirati peptidne ligande sa željenim terapeutskim svojstvima. Kada se koristi ovaj pristup, uvode se postepene izmene peptidne sekvence, a zatim se ispituje efekat ovih supstitucija na bioaktivnost ili na moguća biofizička svojstva peptida (na primer, strukturna analiza). Ovi postupci se kolektivno nazivaju "racionalni dizajn". U jednom takvom postupku, pravi se serija peptida u kojima se jedna po jedna amino-kiselina zamenjuje alaninom. Ovaj postupak se obično naziva "alaninska šetnja" ili "alaninsko pretraživanje". Kada se zamene dva ostatka (susedna ili razdvojena), postupak se naziva "dvostruka alaninska šetnja". Uvedene amino-kiselinske supstitucije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim supstitucijama, daju nove peptide sa poželjnim terapeutskim svojstvima.

[0012]Za dizajniranje peptida koji su mimetici velikih proteinskih liganda moguće je primeniti strukturnu analizu protein-protein interakcija. Kkristalna struktura molekula može da ukaže na identitet i relativne orijentacije važnih amino-kiselinskih ostataka velikih proteinskih liganada, na osnovu kojih se može dizajnirati peptid. Videti, na primer, Takasaki i sar. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70. Ovi i drugi srodni postupci nazivaju se "strukturna analiza proteina". Ovakvi analitički postupci mogu se primeniti u istraživanju interakcija između receptorskog proteina i peptida izabranog na osnovu pretraživanja faga, što može da ukaže na dalje modifikacije sa ciljem da se poveća afinitet vezivanja.

[0013]Peptidni mimetici proteina, načelno se mogu idetifikovati pretraživanjem faga i drugim pomenutim postupcima. Iste postupke je moguće primeniti i za mapiranje epitopa, za identifikaciju amino-kiselina koje su ključne za protein-protein interakcijama, i kao vodilje u otkriću novih terapeutskih agenasa. Na primer, Cortese i sar. (1996), Curr. Opin. Biotech. 7: 616-21. Peptidne biblioteke sada se najviše koriste u imunološkim istraživanjima, kao što je mapiranje epitopa. Kreeger (1996), The Scientist 10(13): 19-20.

[0014]Od posebnog interesa je primena peptidnih biblioteka i drugih postupaka u otkriću farmakološki aktivnih peptida. U stanju tehnike poznat je veći broj ovakvih peptida i oni su sumarno prikazani u Tabeli 2. Peptidi su opisani u priloženim publikacijama. Opisana je i farmakološka aktivnost ovih peptida, a izvor u kojem je publikovan opis naveden je u uglastim zagradama. Neki od ovih polipeptida su modifikovani (na primer, tako da se dobiju dimeri povezani svojim C-terminusima). Uobičajeno je da se u peptidnim bibliotekama pretražujuje vezivanje farmakološki aktivnih proteina za receptor (na primer, EPO receptor). U najmanje jednom slučaju (CTLA4), peptidna biblioteka je pretražena u vezi sa vezivanjem za monoklonsko antitelo.

[0015]Peptidi identifikovani pretraživanjem peptidnih biblioteka obično su "predvodnici" u razvoju terapeutskih agenasa, a rede se koriste kao agensi. Kao i drugi proteini i peptidi, oni se lako uklonjajuin vivofiltracijom preko bubrega, degradacijom u ćelijama, razgradnjom u retikuloendotelnom sistemu ili proteolitičkom degradacijom (Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-11.) Zbog toga se trenutno poznati peptidi u stanju tehnike koriste kako bi se procenile mete lekova ili kao osnova za dizajniranje organskih jedinjenja koja ne bi mogla tako brzo i lako da budu identifikovana pretraživanjem hemijskih biblioteka (Lowman

(1997), Ann. Rev. Biophvs. Biomol. Struct. 26: 401-24; Kay i sar., (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8.)

[0016]Prečišćeni proteini obično su nestabilni u vodenom stanju, jer podležu hemijskoj i fizičkoj degradaciji usled koje gube i biološku aktivnosti tokom procesa prerade i skladištenja. Uz to, vodene peptidne kompoziciji lako se hidrolizuju, deamidacijom i razgradnjom peptidnih veza. Pitanje stabilnosti predstavlja ozbiljan problem u razmatranu terapeutski aktivnih peptida koji treba da budu primenjeni kod ljudi, unutar dobro deifinisanih doznih opsega. WO 2004/092215 opisuje postupke tretmana primenom specifinih peptitela sposobnih da vežu humani angiopoetin-2 (Ang-2). Patentna dokumetacija sa oznakom WO 01/83525 odnosi se na fuziju Fc domena sa biološki aktivnim peptidima i opisuje da vezivanje za nosač povećava polu-život peptida, koji bi inače bili veoma brzo degradiraniin vivo.Pronalazak WO 97/04801 odnosi se na izotonične liofilizovane formulacije proteina. Pronalazak WO 98/14476 odnosi se na farmaceutske kompozicije koje sadrže neki mpl ligand. Pronalazak WO 96/24369 odnosi se na kompozicije i postupke dobijanja koncentrovanih preparata IL-12 i formulacija IL-12 pogodnih za deponovanje i administraciju. Liao Xiangmin i sar., (2005), Pharmaceutical Research, Vol. 22, No. 11. pp. 1978-1985, opisuje uticaj koncentracije aktivnog farmaceutskog sastojka na fizičko stanje manitola u zamrznutim i vodenim sistemima.

[0017]Primena prečišćenih peptida predstavlja potencijalno efikasnu strategiju tretmana mnogih bolesti koje pogađaju ljude. Međutim, još uvek nije rešen problem stabilnosti terapeutskih peptitela, odnosno, sposobnosti da ostanu u formi stabilnih kompozicija tokom vremena u različitim uslovima skladištenja, a da zatim budu efikasne kod pacijenata in vivo. Stoga u stanju tehnike i dalje postoji potreba da se obezbede terapeutska peptitela u stabilnoj formulaciji koja se može primeniti kao terapeutski agensi u terapiji bolesti i poremećaja.

SAŽETAK PRONALASKA

[0018]Predmetni pronalazak obezbeđuje formulacije koje se mogu primeniti u liofilizaciji terapeutskih peptitela, sa ciljem da se dobiju stabilni terapeutski proizvodi peptitela. Stabilna terapeutska peptitela koriste se kao terapeutski agensi u tretmanu pacijenata koji boluju od poremećaja ili stanja koja se mogu poboljšati administracijom terapeutskih peptitela. Predmetni pronalazak je definisan zahtevima.

[0019]Konkretno, ponalazak obezbeđuje liofilizovanu kompoziciju terapeutskog peptitela, koja uključuje pufer, inertnu materiju, stabilizator, i površinski aktivnu materiju; naznačeno time da pufer obuhvata agens sa održavanje pH, naznačeno time da je a) navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i da je pH 5.0;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol;

Navedeni stabilizator je is 2% w/v saharoza; i

navedena površinski aktivna materija je 0.004 % w/v polisorbat-20; ili

b) Navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i pH je 7.0;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 4 % w/v manitol;

navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i

Navedena površinski aktivna materija je 0.01 % w/v polosorbat-20; ili

c) Navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i pH je 5.0;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 2.5 % w/v manitol; i

navedeni stabilizator je 3.5 % w/v saharoza; ili

d) navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i pH je 4.5;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 4 % w/v manitol;

navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i

navedena ovršinski aktivna materija je 0.004 % w/v polisorbat-20; ili

e) navedeni pH puferski agens je 20 mM histidin i pH je 5.0;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 4.0% w/v manitol; i

navedeni stabilizator je 2.0% w/v saharoza;

I naznačeno time da terapeutsko peptitelo uključuje strutkturu koja je predstavljena Formulom I,

Naznačeno time daje: F<1>neki Fc domen;

X<1>je izabran između

Naznačeno time da su P<1>, P^,<p3>, i<p4>nezavisno jedan od drugog, sekvence farmakološki aktivnih peptida;

U, L<2>, L3, L<4>, iL<5>su nezavisno jedan od drugog, veznici; a, b, c, e, f, g, i h su nezavisno jedan od drugog, 0 ili 1, pod uslovom daje najmanje a ili b jednako 1;

dje 0, 1, ili veće od 1; i

WSP je polimer rastvoran u vodi, na čije vezivanje utiče svaka reaktivna grupa na F<1>.

[0020] U narednom obliku izvođenja, terapeutsko peptitelo uključuje strukturu prikazanu formulom II

Naznačeno time daje Fc domen prikačen za C-terminus X<1>, i daje nula, jedan ili više WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika L<1>.

[0021] U narednom obliku izvođenja, terapeutsko peptitelo uključuje strukturu opisanu Formulom III

Naznačeno time da je Fc domen vezan za N-terminus X<2>, i da je nula, jedan ili više WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika L<1>.

[0022] U još jednom obliku izvođenja, terapeutsko peptitelo obuhvata strukturu prikazanu Formulom IV Naznačena time daje Fc domen vezan za N-terminus -(L<l>)c-P<l>i daje nula, jedan ili više WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika L<1>.

[0023] U narednom obliku izvođenja, terapeutsko peptitelo uključuje strukturu opisanu Formulom V

Naznačena time da je Fc domen vezan za N-terminus -L<l->P<l->L^-P^ i da je nula, jedan ili više WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika L<1>.

[0024]U narednom obliku izvođenja, terapeutsko peptitelo je multimer ili dimer. Narednim oblikom izvođenja obezbeđena je prethodno pomenuta kompozicija, naznačen time da su P<1>, P<2>,<p3>i/ih<p4>nezavisno izabrani među peptidima prikazanim u Tabelama 4 do 8. U sličnom obliku izvođenja,<pl>, P^,3 i/ili<p4>poseduju istu amino-kiselinsku sekvencu. U narednom obliku izvođenja, sekvenca Fc domena je prikazana u SEQ ID NO: 1. U narednom obliku izvođenja, WSP je PEG. U narednom obliku izvođenja, Fc domen je sekvenca predstavljena u SEQ ID NO: 1, dok WSP predstavlja PEG. U narednom obliku izvođenja, PEG ima molekulsku težinu između oko 2 kDa i 100 kDa, ili između 6 kDa i 25 kDa. U narednom obliku izvođenja, kompozicija uključuje najmanje 50 %, 75 %, 85 %, 90 %, ili 95 % PEGilovanog terapeutskog peptitela.

[0025]Ukoliko nije precizirano zahtevima, u prethodno pomenutim kompozicijama pH puferski agens može se izabrati iz grupe koju čine glicin, histidin, glutamat, sukcinat, fosfat, acetat i aspartat. U narednom obliku izvođenja pronalaska, obezbeđena je prethodno pomenuta kompozicija u kojoj je sredstvo za dopunjavanje izabrana iz grupe koju čine manitol, glicin, saharoza, dekstran, polivinil-pirolidon, karboksimetil-celuloza, laktoza, sorbitol, trehaloza ili ksilitol.

[0026]Ukoliko nije precizirano zahtevima, u prethodno pomenutoj kompoziciji stabilizator je izabran iz grupe koju čine saharoza, trehaloza, manoza, maltoza, laktoza, glukoza, rafinoza, celobioza, gentiobioza, izomaltoza, arabinoza, glukozamin, fruktoza, manitol, sorbitol, glicin, arginin HCL, poli-hidroksi jedinjenja, uključujući polisaharide, kao što su dekstran, škrob, hidroksietil škrob, ciklodekstrini, N-metil piroliden, celuloza i hijaluronska kiselina, natrij um hlorid.

[0027]Ukoliko nije precizirano zahtevima, u prethodno pomenutoj kompoziciji površinski aktivna materija se može izabrati iz grupe koju čine natrijum lauril-sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat, dioktilnatrijum-sulfonat, henodeoksiholna kiselina, N-lauroil-sarkozin natrijumova so, litijum dodecil sulfat, natrijumova so 1-oktan-sumporaste kiseline, natrijum-holat hiđrat, natrijum deoksiholat, natrijumova so glikodeoksiholne kiseline, benzalkonium hlorid ili benzetonium hlorid, cetil-piridinium hloridmonohidrat, heksadecil-trimetilamonijum bromid, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonin, Triton KS-100, Triton KS-114, lauromakrogol 400, polioksil-40 stearat, polioksietilen hidrogenisano ricinusovo ulje 10, 40, 50 i 60, glicerol monostearat, polisorbat-20, 40, 60, 65 i 80, sojin lecitin, DOPC, DMPG, DMPC, i DOPG; saharoza, estri masnih kiselina, metil-celuloza i karboksimetil-celuloza. U još jednom obliku izvođenja pronalaska, obezbeđena je prethodno pomenuta kompozicija, naznačena time daje koncentracija terapeutskog peptitela između 0.25 mg/mL i 250 mg/mL.

[0028]U narednom obliku izvođenja, obezbeđena je prethodno pomenuta kompozicija, naznačena time daje puferski agens za održavanje pH, 10 mM histidin i naznačena time daje pH 5.0; naznačena time daje sredstvo za dopunjavanje 4 % w/v manitol; naznačena time da je stabilizator 2 % w/v saharoza; i naznačena time daje površinski aktivna materija 0.004 % w/v polisorbat-20. U narednom obliku izvođenja, obezbeđena je prethodno pomenuta kompozicija, naznačena time da P^ obuhvata sekvencu predstavljenu u Tabeli 6. U još jednom obliku izvođenja, obezbeđena je prethodno navedena kompozicija, naznačena time da je koncentracija terapeutskog peptitela 0.5 mg/mL. U narednom obliku izvođenja, terapeutsko peptitelo je jedna od narednih sekvenci: SEQ ID NO:993, SEQ ID NO:994, SEQ ID NO:995, SEQ ID NO:996, SEQ ID NO:997, SEQ ID NO:998, SEQ ID NO:999, SEQ ID NO:1000, SEQ ID NO:1001, SEQ ID NO:1002, SEQ ID NO:1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO:1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO:1012, SEQ ID NO:1013, SEQ ID NO:1014, SEQIDNO:1015, SEQ ID NO: 1016, ili SEQ ID NO:1017.

[0029]U još jednom obliku izvođenja pronalaska obezbeđena je prethodno navedena kompozicija, naznačena time da je pH puferski agens 10 mM histidin i naznačena time daje pH 7.0; naznačena time daje sredstvo za dopunjavanje 4 % w/v mannitol; naznačena time da je stabilizator 2 % w/v saharoza; i naznačena time daje površinski aktivna materija 0.01% w/v polisorbat-20. U narednom obliku izvođenja, obezbeđena je prethodno pomenuta kompozicija naznačena time da<pl>obuhvata sekvencu predstavljenu u Tabeli 32. U još jednom narednom obliku izvođenja, obezbeđena je prethodno pomenuta kompozicija, naznačena time daje koncentracija terapeutskog peptitela 30 mg/mL.

[0030]Pronalaskom je dalje obezbeđena prethodno navedena kompozicija, naznačena time da je pH puferski agens 20 mM histidin i da je pH 5.0; naznačena time da je sredstvo za dopunjavanje 3.3 % w/v manitol; naznačena time da je stabilizator 2 % w/v saharoza; i naznačeno time da je površinski aktivna materija 0.01 % w/v polisorbat-20. U narednom obliku izvođenja kompozicije pronalaska,<pl>obuhvata sekvencu predstavljenu u Tabeli 4. U još jednom narednom obliku izvođenja pronalaska, koncentracija terapeutskog peptitela je 100 mg/mL.

[0031] U još jednom narednom obliku izvođenja pronalaska, obezbeđena je prethodno navedena kompozicija, naznačena time daje pH puferski agens 10 mM histidin i naznačena time da je pH 5.0; naznačena time da je sredstvo za dopunjavanje 2.5% w/v manitol; i naznačena time da je stabilizator 3.5 % w/v saharoza. U narednom obliku izvođenja obezbeđena je prethodno navedena formulacija naznačena time da<pl>obuhvata sekvencu predstavljenu u Tabeli 31. U još jednom obliku izvođenja, obezbeđena je prethodno navedena kompozicija, naznačena time da je koncentracija terapeutskog peptitela 30 mg/mL.

[0032] U narednom obliku izvođenja pronalaska, obezbeđena je prethodno pomenuta kompozicija, naznačena time da je kompozicija izabrana iz grupe koju čine: a) 10 mM histidin, pH 4.7, 4 % manitol i 2 % saharoza, sa ili bez 0.004 % polisorbata-20; i b) 10 mM histidin, pH 5, 4 % manitol i 2 % saharoza, sa ili bez 0.004 % polisorbata-20. U narednom obliku izvođenja obezbeđena je prethodno navedena kompozicija, naznačena time da<pl>uključuje sekvencu predstavljenu u Tabelama 21-24. U narednom obliku izvođenja, obezbeđena je prethodno navedena kompozicija, naznačena time da je koncentracija terapeutskog peptitela izabrana između 1, 30, 85, i 100 mg/mL.

[0033] Predmetni pronalazak predviđa postupke pripreme liofilizovanih terapeutskih peptitela saglasno predmetnom pronalasku. Konkretno, pronalazak obezbeđuje postupak pripreme liofilizovanog terapeutskog peptitela koji obuhvata sledeće korake: a) pripremu rastvora pufera, inertne materija, stabilizatora, i opciono, površinski aktivne materije; naznačeno time da pufer obuhvata pH puferski agens, naznačeno time daje a) navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i daje pH 5.0;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 4 % w/v manitol;

navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i

navedena površinski aktivna materija je 0.004% w/v polisorbat-20; ili

b) navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i pH je7.0;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol;

navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i

navedena površinski aktivna materija je 0.01 % w/v polisorbat-20; ili

c) navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i pH je 5.0;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 2.5 % w/v manitol; i

navedeni stabilizator je 3.5 % w/v saharoza; ili

d) navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i pH je 4.5;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 4 % w/v manitol;

navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i

navedena površinski aktivna materija je 0.004% w/v polisorbat-20; ili

e) navedeni pH puferski agens je 20 mM histidin i pH je 5.0;

navedena sredstvo za dopunjavanje je 4.0 % w/v manitol; i

navedeni stabilizator je 2.0 % w/v saharoza; i

b) liofilizacijom terapeutskog peptitela;

naznačeno time da terapeutsko peptitelo obuhvata strukturu predstavljenu Formulom

I,

Naznačena time daje:

F<l>neki Fc domen; X<1>je izabran između

X2 je izabran između:

Naznačeno time da su P<1>,<p2>,<p3>?i<p4,>svj nezavisno, sekvence farmakološki aktivnih peptida; L, L<2>, L3, L4 i l<5>su nezavisni veznici;

a, b, c, e, f, g, i h, svaki nezavisno ima vrednosti 0 ili l, uz uslov da najmanje jedan od njih, a ili b, ima vrednost 1;

d je 0, 1, ili više od 1; i

WSP je polimer rastvoran u vodi, na čije vezivanje utiče svaka reaktivna grupa u F<1>.

[0034] Naredni oblik izvođenja obezbeđuje prethodno pomenuti postupak, naznačen time da terapeutsko peptitelo obuhvata strukturu opisanu Formulom II

naznačenu time da je Fc domen vezan za C-terminus X<1>, i da je nula, jedna ili više WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika iJ. [0035] U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je prethodno pomenuti postupak, naznačen time da terapeutsko peptitelo obuhvata strukturu predstavljenu Formulom III naznačenu time da je Fc domen vezan za N-terminus X<2>, i da je nula, jedna ili više WSP vezano za Fc domen, opciono, preko veznika L<1>. [0036] Narednim oblikom izvođenja obezbeđen je prethodno navedeni postupak, naznačen time da terapeutsko peptitelo uključuje strukturu predstavljenu Formulom IV naznačenu time da je Fc domen vezan za N-terminus -(L<l>)c-P<l>i da je nula, jedna ili više WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika L<1>. [0037] Narednim oblikom izvođenja obezbeđen je prethodno navedeni postupak, naznačen time da terapeutsko peptitelo uključuje strukturu predstavljenu Formulom V

naznačenu time daje Fc domen vezan za N-terminus -L<1->P<1->L<2->P<2>i daje nula, jedna ili više WSP prikačeno za Fc domen, opciono preko veznika L<1>.

[0038] Narednim oblikom izvođenja obezbeđen je prethodno navedeni postupak naznačen time daje terapeutsko peptitelo multimer ili dimer. U narednom obliku izvođenja P<1>,<p2>,<p3>i/ili<p4>nezavisno su izabrani između peptida predstavljenih u nekoj od Tabela 4 do 38. U narednom obliku izvođenja, sekvenca P<1>,<p2>,<p3>i/ili p4 je ista. U narednom obliku izvođenja, Fc domen je predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 1. U narednom obliku izvođenja, WSP je PEG. U narednom obliku izvođenja, Fc domen je predstavljen u SEQ ID NO: 1, a WSP je PEG. U narednom obliku izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 2 kDa do oko 100 kDa ili od oko 6 kDa do 25 kDa. U narednom obliku izvođenja obezbeđen je prethodno navedeni pronalazak, naznačen time da kompozicija uključuje najmanje 50 %, 75 %, 85 %, 90 % ili 95 % PEGilovanog terapeutskog peptitela.

[0039]Ukoliko nije drugačije naglašeno zahtevima, u prethodno navedenom postupku puferski agens je izabran iz grupe koju čine glicin, histidin, glutamat, sukcinat fosfat, acetat i aspartat. Narednim oblikom izvođenja obezbeđen je navedeni postupak, naznačen time daje sredstvo za dopunjavanje izabrano iz grupe koju čine manitol, glicin, saharoza, dekstran, polivinil-pirolidon, karboksimetil-celuloza, laktoza, sorbitol, trehaloza ili ksilitol. U narednom obliku izvođenja obezbeđen je postupak naznačen time daje stabilizator izabran iz grupe koju čine saharoza, trehaloza, manoza, maltoza, laktoza, glukoza, rafinoza, celobioza, gentiobioza, izomaltoza, arabinoza, glukozamin, fruktoza, manitol, sorbitol, glicin, arginin HC1, polihidroksi jedinjenja, uključujući polisaharide, kao što su dekstran, škrob, hidroksietil škrob, ciklodekstrini, N-metil-piroliden, celuloza i hijaluronska kiselina, natrijum hlorid.

[0040]Ukoliko nije drugačije precizirano zahtevima, u prethodno navedenom postupku površinski aktivna materijal može biti izabrana iz grupe koju čine natrijum lauril-sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat, dioktil-natrijum sulfonat, henodeoksiholna kiselina, N-lauroil-sarkozin natrujumova so, litijum dodecil sulfat, natrijumova so 1-oktan-sulfonske kiseline, natrijum holat hidrat, natrijum deoksiholat, natrijumova so glikodeoksiholne kiseline, benzalkonium hlorid ili benzentonijum hlorid, cetil-piridinium hlorid monohidrat, heksadecil-trimetilamonium bromid, HAPS, HAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonin, Triton X-100, Triton X-114, lauro-makrogol 400, polioksil-40 stearat, polioksietilen hidrogenisano ricinusovo ulje 10, 40, 50 i 60, glicerol-monostearat, polisorbat 20, 40, 60, 65 i 80, sojin lecitin, DOPC, DMPG, DMPC, i DOPG; saharoza estri masnih kiselina, metil-celuloza i karboksimetil celuloza. U narednom obliku izvođenja postupka pronalaska, koncentracija terapeutskih peptitela je u opsegu od 0.25 mg/mL do 250 mg/mL.

[0041]U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak, naznačen time da je puferski agens 10 mM histidin i naznačen time da je pH 5.0; naznačen time da je sredstvo za dopunjavanje 4% w/v manitol; naznačen time daje stabilizator 2% w/v saharoza; i naznačen time da je površinski aktivna materija 0.004% w/v polisorbat-20. U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak naznačen time da<pl>obuhvata sekvence prikazane u Tabeli 6. U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak naznačen time da je koncentracija terapeutskih antitela 0.5 mg/mL.

[0042]U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak naznačen time da je puferski agens 10 mM histidin i naznačen time da je pH 7.0; naznačen time da je sredstvo za dopunjavanje 4 % w/v manitol; naznačen time da je stabilizator 2 % w/v saharoza; i naznačen time da je površinski aktivna materija 0.01 % w/v polisorbat-20. U narednom obliku izvođenja obezbeđen je postupak naznačen time da P<1>uključuje sekvencu koja se prikazana u Tabeli 32. U narednom obliku izvođenja obezbeđen je postupak naznačen time daje koncentracija peptitela 30 mg/mL.

[0043]Pronalaskom je dalje obelodanjen postupak, naznačen time da je puferski agens 20 mM histidin i naznačen time daje pH 5.0; naznačen time daje sredstvo za dopunjavanje 3.3 % w/v manitol; naznačen time da je stabilizator 2 % w/v saharoza; i naznačen time da je površinski aktivna materija 0.01 % w/v polisorbat-20. U narednom obliku izvođenja postupka saglasno pronalasku, P<1>uključuje sekvencu predstavljenu u Tabeli 4. U narednom obliku izvođenja postupka saglasno pronalasku, koncentracija terapeutskog peptitela je 100 mg/mL.

[0044]U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak naznačen time da je puferski agens 10 mM histidin i daje pH 5.0; naznačen time daje sredstvo za dopunjavanje 2.5% w/v manitol; i da je stabilizator 3.5 % w/v saharoza. U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak naznačen time da<pl>uključuje sekvencu predstavljenu u Tabeli 31. U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak naznačen time da je koncentracija terapeutskog peptitela 30 mg/mL.

[0045]U narednom obliku izvođenja obezbeđen je postupak naznačen time da je kompozicija izabrana iz grupe koji čine: a) 10 mM histidin, pH 4.7, 4 % manitol i 2% saharoza, sa ili bez 0.004 % polisorbata-20; i b) 10 mM histidin, pH 5, 4% manitol i 2% saharoza, sa ili bez 0.004 % polisorbata-20. U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak naznačen time da<pl>uključuje sekvencu predstavljenu u Tabelama 21-24. U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak naznačen time da je koncentracija terapeutskog peptitela izabrana iz grupe koji čine 1, 30, 85 i 100 mg/mL.

[0046]U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je postupak koji dodatno uključuje, pre liofilizacije, korake b) podešavanja pH rastvora na pH vrednost u opsegu od 4.0 do 8.0; c) pripreme rastvora koji sadrži terapeutsko peptitelo; d) izmena pufera rastvora iz koraka (c) u rastvor iz koraka (b); e) dodavanja adekvatne količine površinski aktivne materije; i f) liofilizovanja smeše iz koraka (e).

[0047]U narednom obliku izvođenja obezbeđen je postupak naznačen time daje postupak za pripremu rekonstutisane kompozicije terapeutskog peptitela, koji obuhvata korake a) liofilizovanja navedene kompozicije terapeutskog peptitela; i b) rekonstituisanja liofilizovane kompozicije peptitela.

[0048]U narednom obliku izvođenja, obezbeđen je komplet za pripremu vodene farmaceutske kompozicije, koji obuhvata kontejner sa navedenom liofilizovanom kompozicijom terapeutskog peptitela i drugi kontejner koji sadrži fiziološki prihvatljiv rastvarač za liofilizovanu kompoziciju.

DETALJAN OPIS PRONALSKA

Objašnjenje termina

[0049]Termin "uključivati," u vezi sa peptidnim jedinjenjem, znači da jedinjenje može da obuhvati dodatne amino kiseline na jednom ili na oba kraja, amino- ili karboksi-terminusu date sekvence. Naravno, ove dodatne amino kiseline ne bi trebalo značajano da utiču na aktivnost jedinjenja. U odnosu na kompoziciju predmetnog pronalaska, termin "uključivati" označava da kompozicija može da sadrži dodatne komponente. Te dodatne komponente ne bi trebalo značajno da utiču na aktivnost kompozicije.

[0050]Termin "peptitelo" odnosi se na molekul koji uključuje peptid(e) fuzionisane ili direkto ili indirektno sa drugim molekulima, kao što je Fc domen nekog antitela, u kojima je peptidni deo specifično vezan za željeni ciljni molekul. Peptid(i) se može fuzionisati sa Fc regionom ili se može ugraditi u Fc-petlju, neki modifikovani Fc molekul. Fc-petlje opisane su u patentnoj publikaciji U.S. Patent Application Publication No. US2006/0140934. Predmetni pronalazak obuhvata ovakve molekule koji poseduju Fc domen modifikovan tako da u sebi sadrži peptid kao internu sekvencu (poželjno u regionu petlje) Fc domena. Interni peptid Fc molekula može da uključi više od jedne peptidne sekvence u tandemu u konkretnom internom regionu, i oni mogu da obuhvate dodatne peptide u drugim internim regionima. Iako su dati primeri sa insercijama u regionima petlje, moguće su insercije u drugim ne-terminalnim domenima i one se takođe smatraju domenom pronalaska. Termin "peptitelo" ne obuhvata Fc-fuzione proteine (na primer, proteine pune dužine sekvence, fuzionisane za Fc domen).

[0051]Termin "nosač" odnosi se na molekul koji sprečava degradaciju i/ili povećava polu-život, smanjuje toksičnost, smanjuje imunogenost ili povećava biološku aktivnost terapeutskog proteina. Reprezentativni primeri nosača obuhvataju Fc domen, kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,428,130 za Capon i sar., koji je objavljen 27. juna 1995.

[0052]Termin "nativni Fc" označava molekul ili sekvencu koja sadrži fragment koji ne vezuje antigen, a koji je nastao digestijom celog antitela, kako u monomernoj, tako i u multimemoj formi. Tipično, nativni Fc uključuje CH2 i CH3 domen. U jednom aspektu pronalaska, nativni Fc originalno potiče od imunoglobulina humanog porekla, i to može biti bilo koja klasa imunoglobulina. Nativni Fc je neki monomerni polipeptid koji može biti povezan u dimer ili multimer, kovalentnom vezom (na primer, disulfidnim vezama), nekovalentnom vezom ili na oba načina. Broj intermolekularnih disulfidnih veza između monomernih sudjedinica nativnih Fc molekula kreće se od jedan do četiri, zavisno od klase (na primer, IgG, IgA, IgE) ili podklase (na primer, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Jedan primer nativnog Fc je dimer povezan disulfidnom vezom koji nastaje digestijom IgG molekula posredstvom enzima papaina. Ellison i sar. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9. Termin "nativni Fc", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na monomerne, dimerne i multimerne forme.

[0053]Termin "Fc varijanta" odnosi se na molekul ili sekvencu koja je modifikovana u odnosu na nativni Fc, ali i dalje uključuje vezujuće mesto za spasonosni receptor, FcRn. Međunarodna aplikacija WO 97/34631 (objavljena 25. septembra 1997) i WO 96/32478 opisuju primere Fc varijanti, kao i interakcije sa spasonosnim receptorom. U jednom aspektu termin "Fc varijanta" uključuje molekul ili sekvencu koja je humanizovana od Fc koji nije humanog porekla. U narednom aspektu, nativni Fc može sadržati mesta koja se mogu ukloniti, jer su odgovorna za strukturne odlike ili biološku aktivnost koje nisu poželjne u fuzionim molekulima, saglasno predmetnom pronalasku. Stoga, termin "Fc varijanta" uključuje molekul ili sekvencu kojoj nedostaje jedan ili više ostataka nativnih Fc mesta ili ostataka koji utiču ili su uključeni u (1) formiranje disulfidne veze, (2) nekompatibilnost sa izabranom ćelijom domaćina (3) heterogenost N-terminalnog regiona nakon ekspresije u izabranoj ćeliji domaćinu (4) glikozilaciju (5) interakciju sa komplementom (6) vezivanje za Fc receptor i druge spasonosne receptore ili (7) ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Fc varijante biće detaljno opisane u tekstu koji sledi.

[0054]Termin "Fc domen" obuhvata nativni Fc i varijantne Fc molekule i sekvence, kao što je ranije opisano. Kao što je slučaj sa Fc varijantama i nativnim Fc, termin "Fc domen" uključuje molekule u monomernoj i multimemoj formi, bilo da su nastali digestijom celog antitela ili na neki drugi način. U jednom obliku izvođenja, na primer, Fc region može biti:

[0055]U stanju tehnike poznate su i druge Fc sekvence predviđene za primenu u okviru ovog pronalaska. Na primer, Fc IgGl (GenBank Accession No. PO 1857), Fc IgG2 (GenBank Accession No. PO 1859), Fc IgG3 (GenBank Accession No. P01860), Fc IgG4 (GenBank Accession No. P01861), Fc IgAl (GenBank Accession No. P01876), Fc IgA2 (GenBank Accession No. PO 1877), Fc IgD (GenBank Accession No. PO 1880), Fc IgM (GenBank Accession No. PO 1871), i Fc IgE (GenBank Accession No. PO 1854) su dodatne Fc sekvence predviđene za primenu u ovom pronalasku.

[0056]Opciono, prethodnim sekvencama je moguće dodati neku N-terminalnu amino-kiselinsku sekvencu (na primer, kada se eksprimira u bakteriji).

[0057]Termin "multimer", kada se odnosi na Fc domene ili molekule koji obuhvataju Fc domene, označava molekule koji sadrže dva ili više polipeptidnih lanaca, povezanih kovalentno, nekovalentno ili i kovalentnim i nekovalentnim interakcijama. Uobičajeno je da IgG molekuli formiraju dimere; IgM, pentamere; IgD, dimere; i IgA, monomere, dimere, trimere ili tetramere. Mutlimeri se mogu formirati na osnovu sekvence i rezultujuće aktivnosti nativnog Ig izvora Fc domena ili izmena (derivacijama, kao što će biti opisano), kao što je nativni Fc.

[0058]Termini "derivirati" "derivativ" ili "deriviran" označava proces i rezultujuće jedinjenje, u kojem, bez ograničenja, (1) jedinjenje ima svoj ciklični deo; na primer, unakrsno povezivanje između cisteinil ostataka unutar jedinjena; (2) jedinjenje je unakrsno povezano ili sadrži mesto za unakrsno povezivanje; na primer, jedinjenje ima cisteinil ostatak i time formira unakrsne dimere u kulturi ili in vivo; (3) jedna ili više peptidnih veza je zamenjena nepeptidnim vezama; (4) N-terminus je zamenjen sa - NRRi, NRC(0)Ri, -NRC(O)ORi), -NRS(0)2Rl, -NHC(0)NHR, nekom sukcinimid grupom, ili supstituisanim ili nesupstituisanim benziloksikarbonil-NH-, naznačeno time da R i Ri i supstituenti u prstenu imaju značenje kao što je prethodno opisano; (5) C-terminus je zamenje sa -C(0)R2ili - NR3R4naznačeno time da R2, R3i R4imaju značnjenje, kao što je opisano; i (6) jedinjenja u kojima su pojedinačne amino kiseline modifikovane tretmanom agensima sposobnim da reaguju sa izabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima. Derivati su dodatno opisani tekstom koji sledi.

[0059]U značenju koje je ovde primenjeno, "peptid" se odnosi na molekule od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14 ,15, 16 ,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ,39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili više amino kiselina povezanih peptidnom vezom. Peptidi najčešće poseduju nasumičnu i/ili fleksibilnu konformaciju, kao što je nasumična zavojnica; i tipično im nedostaje stabilna konformacija, kao što je ona uočena kod većih proteina/polipeptida, tipično zahvaljujući sekundarnoj ili tercijarnoj strukturi. U konkretnim oblicima izvođenja, brojni opsezi veličine peptida predviđeni su ovim pronalaskom, kao što je od oko: 3-90, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50; 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30; 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30; 10-20 amino kiselina dužine, i slično. U narednim oblicima izvođenja, peptidi koji su ovde korišćeni, nisu duži od 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ili 20 amino kiselina u nizu. Reprezentativni peptidi mogu se generisati bilo kojim ovde opisanim postupkom, kao što su peptidne biblioteke (na primer, fagnom peptidnom blibliotekom), hemijska sinteza, mogu nastati razlaganjem proteina ili primenom rekombinantih DNK tehnologija. Peptidi obuhvataju D i L forme, prečišćene ili u smeši dve forme.

[0060]Dodatno su predviđene fiziološki prihvatljive soli jedinjenja saglasno pronalasku. Pod terminom "fiziolopki prihvatljive soli" podrazumeva se svaka so koja je ili je kasnije otkriveno da je farmaceutski prihvatljiva. Neki specifični primeri su: acetat; trifluoroacetat; hidrohalidi, kao što su hidrohlorid i hidrobromid; sulfat; citrat; tartrat; glikolat; i oksalat.

[0061]Termin "nasumičan", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na potpuno nasumične peptidne sekvence (na primer, selektovane postupkom fagnog izlaganja) i sekvence u kojima je jedan ili više ostataka u prirodno postojećim molekulima zamenjeno amino-kiselinskim ostacima koji se ne nalaze na tom mestu u prirodno postojećim molekulima. Reprezentativni postupci za identifikovanje peptidnih sekvenci obuhvataju ekspresiju u fagu, ekspresiju u E. coli, ribozomsku ekspresiju, pretraživanje u kvascu, RNK-peptidno pretraživanje, hemijsko pretraživanje, racionalni dizajn, analizu proteinske strukture i slično.

[0062]Termin "farmakološki aktivan" označava supstancu za koju je utvrđeno da poseduje aktivnost koja utiče na neki medicinski parametar (na primer, bez ograničenja, na krvni pritisak, broj ćelija, nivo holesterola) ili stanje bolesti (na primer, bez ograničenja, na kancer, autoimunske bolesti). Dakle, farmakološki aktivni peptidi uključuju agonističke ili mimetičke i antagonističke peptide, kao što je opisano u tekstu koji sledi.

[0063]Termini "-mimetički peptid" i "-agonistički peptid" odnose se na peptide koji ispoljavaju biološku aktivnost sličnu aktivnosti nekog drugog proteina (na primer, bez ograničenja, slični EPO, TPO, G-CSF i drugim kasnije opisanim proteinima), koji stupaju u interakciju sa proteinom od interesa. Ovi termini dalje uključuju peptide koji indirektno imitiraju aktivnost proteina od interesa, kao što je potenciranje efekata prirodnog liganda proteina od interesa; videti na primer, G-CSF-mimetičke peptide predstavljene u Tabelama 2 i 7. Kao primer, termin "EPO-mimetički peptid" uključuje svaki peptid, koji se može identifikovati ili derivirati, kao što je opisano u Wrighton i sar. (1996), Science 273: 458-63, Naranda i sar. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:7569-74, i ostale reference iz Tabele 2, koje ispoljava aktivnost sličnu EPO, EPO-mimetičku aktivnost. Svaka od ovih referenci omogućava prosečno stručnoj osobi da izaberu peptide različite od onih koji su obelodanjeni pronalaskom, praćenjem postupaka primenim različitih peptidnih bilbioteka.

[0064]U smislu narednog primera, termin "TPO-mimetički peptid" ili "TMP" odnosi se na peptide koji se mogu identifikovati ili derivirati, kao što je opisano kod Cwirla i sar. (1997), Science 276: 1696-9 , U.S. Pat. Nos. 5,869,451 i 5,932,946 i u ostalim referencama u Tabeli 2, a koji se odnose na TPO-mimetičke peptide, kao i u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 00/24770, objavljenoj 4. maja, 2000. Osoba prosečne stručnosti na osnovu referenci može da izabere druge peptide od onih koji su ovde navedeni, praćenjem postupaka u različitim peptidnim bibliotekama.

[0065]U smislu narednog primera, termin "G-CSF-mimetiki peptid" odnosi se na svaki peptid koji se može označiti ili je opisan kod Paukovits i sar. (1984), Hoppe-Seylers Z. Phvsiol. Chem. 365: 303-11 ili u nekoj od referenci u Tabeli 2, koja se bavi G-CSF-mimetičkom aktivnošću. Osoba prosečne stručnosti na osnovu ovih referenci može da izabere druge peptide od onih koji su ovde obelodanjeni, praćenjem postupaka sa različitim peptidnim bibliotekema.

[0066]Termin "CTLA4-mimetički peptid" odnosi se na svaki peptid koji je identifikovan ili deriviran i opisan u Fukumoto i sar., (1998), Nature Biotech. 16: 267-70. Osoba prosečne stručnosti na osnovu ovih referenci može da izabere druge peptide od onih koji su ovde obelodanjeni, praćenjem postupaka sa različitim peptidnim bibliotekema.

[0067]Termin "-antagonistički peptid" ili "inhibitorni peptid" odnosi se na peptid koji blokira ili na neki način interfererira sa biološkom aktivnošću proteina od interesa ili ima biološku aktivnost koja je uporediva sa poznatim antagonistom ili inhibitorom proteina od interesa. Stoga termin "TNF-antagonistički peptid" obuhvata peptide koju su identifikani ili derivirani, kao što je opisano u Takasaki i sar. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70 ili u nekoj od referenci u Tabeli 2, koja se bavi pitanjem TNF-antagonističke aktivnosti. Osoba prosečne stručnosti na osnovu ovih referenci može da izabere druge peptide od onih koji su ovde obelodanjeni, praćenjem postupaka sa različitim peptidnim bibliotekema.

[0068]Termini "IL-1 antagonista" i "IL-lra-mimetički peptid" odnose se na peptide koji inhibiraju ili smanjuju aktivaciju IL-1 receptora izazvanu delovanjem IL-1. Do aktivacije IL-1 receptora dolazi usled formiranja kompleksa između IL-1, IL-l-recepetora i pomoćnog proteina IL-1-receptora. Antagonosti IL-1 receptora ili IL-lra-mimetički peptidi vezuju se za IL-1, IL-1 receptor ili za pomoćni protein IL-1 receptora i tako ometaju formiranje kompleksa između ove dve ili sve tri komponente. Reprezentativni IL-1 antagonistički ili IL-lra-mimetički peptidi mogu se identifikovati ili derivirati od onih opisanih u U.S. Pat. Nos. 5,608,035; 5,786,331, 5,880,096; ili u referencama u Tabeli 2, koje se bave pitanjima IL-lra-mimetičke ili IL-1 antagonističke aktivnosti. Osoba prosečne stručnosti na osnovu ovih referenci može da izabere druge peptide od onih koji su ovde obelodanjeni, praćenjem postupaka sa različitim peptidnim bibliotekema.

[0069]Termin "VEGF-antagonistički peptid" odnosi se na peptide koji se mogu identifikovati ili derivirati od onih koji su opisani u Fairbrother (1998), Biochem. 37: 17754-64, i navedeni u referencama u Tabeli 2, a koje se odnose na VEGF-antagonističku aktivnost. Osoba prosečne stručnosti na osnovu ovih referenci može da izabere druge peptide od onih koji su ovde obelodanjeni, praćenjem postupaka sa različitim peptidnim bibliotekema.

[0070]Termin "MMP inhibitorni peptid" odnosi se na peptide koji se mogu identifikovati ili derivirati od onih opisanih u Koivunen (1999), Nature Biotech. 17: 768-74 i u referencama u Tabeli 2 koje se bave MMP inhibitornom aktivnošću. Prosečno stručnoj osobi ove reference omogućavaju da izaberu različite peptide od onih koji su ovde obelodanjeni, praćenjem postupaka sa različitim peptidnim bibliotekema.

[0071]Termin " inhibitorni peptid miostatina" odnosi se na peptide koji se mogu identifikovati na osnovu svoje sposobnosti da redukuju ili blokioraju aktivnost miostatina ili njegovu signalizaciju, kao što je pokazano uin vitrotestovima, kao što su na primer, test miostatinske aktivnosti na pMARE C2C12 ćelijama ili uin vivoživotinjskim testovima, koji su opisani u U.S. patentnoj prijavi broj US20040181033A1 i u PCT publikaciji No. WO2004/058988. Reprezentativni primeri inhibitornih peptida miostatina predstavljeni su u Tabelama 21-24.

[0072]Termin "antagonisti integrina/adhezije" odnosi se na petide koji inhibiraju ili smanjuju aktivnost integrina, selektina, ćelijskih adhezionih molekula, integrinskih receptora, selektinskih receptora ili receptora ćelijskih adhezionih molekula. Reprezentativni primeri antagonista integrina/adhezije uključuju laminin, ehistatin, peptide opisane u Tabelama 25-28.

[0073]Termin "inhibitor resorpcije kostiju" odnosi se na molekule koji su identifikovani primenom testova u Primerima 4 i 11 u WO 97/23614. Reprezentativni inhibitori resorpcije kostiju uključuju OPG i OPG-L antitelo, koji su opisano u WO 97/23614, odnosno, W098/46751.

[0074]Termini "inhibitor nervnog faktora rasta" ili "antagonist nervnog faktora rasta" odnose se na peptide koji se vezuju za i inhibiraju aktivnost nervnog faktora rasta (NGF) ili njegovu signalizaciju. Reprezentativni primeri ovakvih peptida dati su u Tabeli 29.

[0075]Termin "TALL-1 modulišući domen" odnosi se na na neku amino-kiselinsku sekvencu koja se vezuje za TALL-1 i uključuje prirodno postojeće sekvence ili nasumične sekvence. reprezentativni primeri TALL-1 modulišućih domena mogu se identifikovati ili derivirati izlaganjem u fagu ili drugim sličnim pristupima. Reprezentativni peptidi ovog tipa dati su u Tabelama 30 i 31.

[0076]Termin "antagonista TALL-1" označava molekul koji se vezuje za TALL-1 i povećava ili smanjuje jedan ili više testiranih parametara, suprotno efektima koje izaziva TALL-1 pune dužine lanca. Ovakva aktivnost se može odrediti, na primer, testovima kao što su testovi opisani u odeljku pod naslovom "Biološka aktivnost AGP-3" ("Biological activitv of AGP-3") u publikaciji Materials & Methods section of the patent application entitled, "TNF-RELATED PROTEINS", WO 00/47740, objavljenoj 17. avgusta, 2000.

[0077]Termin "Antagonistički peptid Ang 2" označava peptide koji se mogu identifikjovati ili derivirati kao peptidi koji ispoljavaju svojstva suprotna Ang-2 proteinu, reprezentativni peptidi ovog tipa predstavljeni su u Tabelama 32-38.

[0078]Termin "WSP" označava polimer rastvorljiv u vodi, koji onemogućava peptid, protein ili drugo jedinjenje koje je za njega vezano da se staloži u vodenom okruženju, kao što je na primer, fiziološki rastvor. Detaljniji opis različitih oblika izvođenja WSP predviđenih ovom prijavom biće dati u tekstu koji sledi.

Liofilizacija i priručna

[0079]Terapeutska peptitela mogu se primeniti za pravljenje farmaceutskih formulacija za tretiranje bolesti ljudi, kao što je ranije opisano. U jednom obliku izvođenja, kompozicije terapeutskog peptitela su liofilizovane. Liofilizacija se sprovodi primenom postupaka poznatih u stanju tehnike, uz optimizaciju shodno potrebama kompozicije koja se razvija [Tang i sar., Pharm Res. 21:191-200, (2004) i Chang i sar., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].

[0080]Ciklus liofilizacije je, u jednom aspektu, sastavljen iz tri koraka: smrzavanje, primarno sušenje i sekundarno sušenje [A.P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167

(1977)]. U koraku smrzavanja, rastvor se hladi kako bi se iniciralo formiranje leda. Dalje, ovaj korak indukuje kristalizaciju inertne materije. Led se sublimira u primarnoj fazi sušenja, koja se sprovodi smanjenjem pritiska u komori ispod vrednosti pritiska isparavanja leda, pomoću vakuuma i uvođenjem toplote koja podstiče sublimaciju. Na kraju, adsorbovana ili vezana voda uklanja se tokom sekundarne faze sušenja, pod sniženim pritiskom u komori i pri povećanoj radnoj temperaturi. Ovim postupkom nastaje materijal poznat pod imenom liofilizovani "kolač". Takav kolač se rekonstituiše sa sterilnom vodom ili pogodnim rastvaračem za injekcije.

[0081]Ciklus liofilizacije određuje, ne samo konačno fizičko stanje pomoćnih materija već utiče i na ostale parametre, kao što su vreme rekonstitucije, izgled, stabilnost i stepen vlažnosti sadržaja. Struktura kompozicije u smrznutom stanju prolazi kroz nekoliko prelaznih stanja (na primer, staklena tranzicija, vlaženje i kristalizacije), koja se odvijaju na specifičnim temperaturama, koje se mogu prilagođavati postupku liofilizacije. Temperatura staklene tranzicije (Tg i/ili Tg') daje informacije o fizičkom stanju rastvorka i može se odrediti diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC). Tg i Tg' predstavljaju važne parametre koji se uzimaju u obzir tokom osmišljavanja ciklusa liofilizacije. Na primer, Tg' je važan za primarno sušenje. Takođe u osušenom stanju, temperatura staklene tranzicije daje informaciju o temperaturi skladištenja finalnog proizvoda.

Uopšteno o pomoćnim materijama

[0082]Pomoćne materije (ekscipijensi) su aditivi koji se dodaju formulacijama sa ciljem da im obezbede ili pojačaju stabilnost, isporučljivost i proizvodnju leka. Bez obzira na razloge zbog kojeg su uključeni u kompozicije, pomoćne materije su integralni sastojci leka i stoga moraju biti bezbedni za upotrebu i lako se podnositi od strane pacijenata. Za lekove u formi proteina, izbor pomoćnih materija je naročito važan, jer on mogu da utiči i na efikasnost leka i na njegovu imunogenost. Stoga se proteinske formulacije obavezno razvijaju uz prateću selekciju pomoćnih materija, koje će im pružiti željenu stabilnost, bezbednost i prodaju.

[0083J Liofilizovane formulacije obično se sastoje od pufera, sredstva za dopunjavanje i stabilizatora. Korisnost površinski aktivne materije može se proceniti i ona se može izabrati u slučajevima u kojima tokom liofilizacije ili rekonstitucije dolazi do agregacije. Odgovarajući puferski agensi uključuju se da bi se održao pogodan opseg pH vrednosti formulacije tokom liofilizacije. Upoređivanje komponenti pomoćnih materija u tečnim i liofilizovanim formulacijama proteina dati su u Tabeli A.

[0084]Najveći izazov u razvoju formulacija terapeutskih proteina jeste stabilizacija proizvoda u odnosu na moguće poremećaje tokom proizvodnje, isporuke i skladištenja. Uloga pomoćnih materija u formulacijama jeste da umanje ove poremećaje. Uloga pomoćnih materija je da smanji viskoznost formulacija visokih koncentracija proteina, sa ciljem da se omogući njihova isporuka i povećao komfor tokom primene. Pomoćne materije se mogu klasifikovati na osnovu mehanizama pomoću kojih stabilizuju proteine u odnosu na različite fizičke i hemijske stresove. Neke pomoćne materije se primenjuju sa ciljem da ublaže efekte ovih poremećaja ili da regulišu neku specifičnu podloženost proteina. Druge pomoćne materije imaju uopštenije efekte na fizičku i kovalentnu stabilnost proteina. Pomoćne materije su u ovom tekstu organizovane na osnovu svog hemijskog sastava ili na osnovu svoje funkcionalne uloge u formulacijama. Za svaki tip pomoćne materije dat je kratak opis načina delovanja i smislu stabilizacije proteina.

[0085] Imajući u vidu instrukcije i smernice predstavljene ovim pronalaskom, stručnjaku će biti poznato koja količina ili opseg količina pomoćnih materija treba uključiti u neku konkretnu formulaciju da bi se dobila biofarmaceutska formulacija saglasno pronalasku koja uslovljava povećanje stabilnosti biofarmaceutika. Na primer, količina i tip soli koju treba uključiti i biofarmaceutsku formulaciju saglasno pronalasku može se odrediti na osnovu željene osmolarnosti (na primer, izotonične, hipotonične ili hipertonične) finalnog rastvora, kao i na osnovu količine i osmolarnosti ostalih sastojaka koji će biti uključeni u sastav formulacije. Slično primerima vezanim za tip poliola ili šećera uključenih u formulaciju, količina svake pomoćne materije zavisi od njene osmolarnosti.

[0086] Na primer, izotoničnost se postiže uključivanjem 5 % sorbitola, dok je za postizanje izotoničnosti saharozom potreban 9% rastvor. Izbor količine i opsega koncentracija jedne ili više pomoćnih materija koje se uključuju u biofarmaceutske formulacije saglasno pronalasku, dati su u prethodnim primerima za soli, poliole i šećere. Stručnjaku će biti poznato da su ovde opisana razmatranja i dati primeri koji se odnose na specifične pomoćne materije, jednako primenljivi na sve tipove i kombinacije pomoćnih materija, uključujući na primer, soli, amino kiseline, druge tonične agense, površinski aktivne materije, stabilizatore, sredstva za dopunjavanje, krioprotekore, lioprotektore, anti-oksidante, metalne jone, helirajuće agense i/ili konzervanse.

[0087] U slučajevima kada je u sastavu formulacije prijavljen konkretna pomoćna materija, u određenom procentnom sastavu (%) w/v, stručnjaku će biti poznato da se sadržaj te pomoćne materije može izraziti i u ekvivalentnoj molarnoj koncentraciji.

[0088]Prosečno stručnoj osobi je poznato da koncentracija svake od navedenih pomoćnih materija unutar određene formulacije zavise od koncentracije drugih pomoćnih materija. Na primer, koncentracija sredstva za dopunjavanje može se smanjiti onda kada je visoka koncentracija proteina/peptida ili stabilizatora. Ukoliko je cilj da se održi izotoničnost određene formulacije u kojoj nema sredstva za dopunjavanje, prosečno stručnoj osobi je poznato da je potrebno podesiti koncentraciju stabilizujućeg agensa (na primer, primenom "tonifikujuće" količine stabilizatora). Ostale pomoćne materije poznate u stanju tehnike mogu se naći kod Powell i sar., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technologv, 52:238-311.

Puferi

[0089]Stabilnosti proteinskog leka najčešće je najveća u vrlo uskom opsegu pH vrednosti. Optimalni opseg pH vrednosti pri kome se postiže stabilnost potrebno je utvrditi tokom najranije faze preformulacijskih istraživanja. U tom cilju je moguće uspešno primeniti nekoliko pristupa, kao što su kalorimetrijske studije (Remmele R.L. Jr., i sar., Biochemistrv, 38(16):5241 -7 (1999)). Kada se formulacija dovrši, lek se proizvodi skladišti u uslovima prethodno definisim specifikacijom. Stoga se, za kontrolu pH formulacije gotovo uvek koriste puferi.

[0090]Kao puferi u proteinskim formulacijama najčešće se koriste organske kiseline, fosfati i Tris (Tabela B). Sposobnost pufera da održava stabilan pH najveća je na onoj vrednosti pH koja je jednaka pKa, a smanjuje se sa udaljenjem od ove vrednosti. Devedeset procenata puferskog kapaciteta nalazi se unutar jedne pH jedinice veće ili manje od pKa. Puferski kapacitet takođe se proporcionalno povećava sa povećanjem koncentracije pufera.

[0091]U kontekstu biranja pufera potrebno je razmotriti nekoliko faktora. Pre svega, puferske i njihove koncentracije potrebno je izabrati na osnovu pKa i željene pH formulacije. Potrebno je takođe da se osigura kompatibilnost pufera s proteinskim lekom, sa drugim pomoćnim materijama i da pufer ne katalizuje neku drugu reakciju degradacije. Nedavno je pokazano da karboksilatni puferi, kao što su citratni i sukcinatni, formiraju kovalentne adukte, sa bočnim lancima proteina. Treći važan aspekt izbora jeste osećaj, na primer, žarenje i iritacija, koju pufer može da indukuje prilikom aplikacije leka. Na primer, poznato je da citratni pufer izaziva osećaj žarenja nakon injeciranja leka (Laursen T, i sar., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). Potencijal za iritaciju veći je kod lekova koji se primenjuju putem SC ili IM ruta, kada rastvor leka ostaje na mestu primene relativno dugo, u poređenju sa IV rprimenom, pri kojoj formulacija veoma brzo pristiže u krv nakon primene. Za formulacije koje se primenjuju direktno IV infuzijom, potrebno je proveriti ukupnu količinu pufera (i svih ostalih komponenti u formulaciji). Posebna pažnja je potrebna kada se primenjuju kalijumovi joni u formi kalijum-fosfatnog pufera, jer kaliju izaziva kardiovaskularne efekte kod pacijenata (Hollander-Rodriguez JC, i sar., Am. Fam. Phvsician., 73(2): 283-90 (2006)).

[0092]Kada je reč o puferima za liofilizovane formulacije potrebna su i dodatna razmatranja. Neki puferi, kao što je natrijum-fosfat, kristalizuju iz amorfne proteinske faze tokom faze smrzavanja, što uslovljava prilično veliku promenu pH. Treba izbegavati i ostale uobičajene pufere, kao što su acetatni i imidazol, jer oni sublimiraju ili isparavaju tokom procesa liofilizacije, menjajući pH fonmilacije tokom liofilizacije i nakon rekonstitucije.

[0093]Puferski sistem prisutan u kompozicijama bira se tako da bude fiziološki kompatibilan i da održi željenu pH vrednost u rekonstituisanom rastvoru, kao i u rastvoru pre liofilizacije. Kao što je ovde opisano, pH vrednost rastvora pre liofilizacije može biti između pH 2.0 i pH 12.0. Na primer, pH rastvora pre liofilizacije može biti 2.0, 2.3., 2.5.,2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7 ili 12.0. Kao što će biti opisano, pH rekonstituisanog rastvora može biti između 4.5 i 9.0. Na primer, pH u rekonstituisanom rastvoru može biti 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7 ili 9.0.

[0094]Kao što je već opisano, pH puferski agens primenjen u formulaciji može biti neka amino kiselina ili smeša amino kiselina od kojih je jedna histidin.

[0095]Pufersko jedinjenje može biti prisutno u svakoj količini koja je pogodna da održi pH formulacije na željenom nivou. Kao što je navedeno, kada je puferski agens neka amino ldselina, koncentracija te amino kiseline može biti između 0.1 mM i 1000 mM (1 M). Na primer, koncentracija pH puferskog agensa može biti najmanje 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, I. 5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700 ili 900 mM, ili može biti između 1, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90 mM i 100 mM. Kao što je prethodno navedeno, koncentracija pH puferskog agensa može biti između 5, 6, 7, 8, 9, 10, II, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 ili 40 mM i 50 mM. Kao što je ovde navedeno, koncentracija pH puferskog agensa može biti 10 mM.

[0096] Ostali puferi za održavanje pH koji se mogu primeniti u formulacijama saglasno pronalasku, obuhvataju bez ograničenja, glicin, histidin, glutamat, sukcinat, fosfat, acetat i aspartat.

Stabilizatori i sredstva za dopunjavanje

[0097] Sredstva za dopunjavanje se u liofilizovanim formulacijama najčešće koriste da bi se pospešio izgled i stabilnost formulacije. Us lovi u formulaciji načelno su takvi da sredstvo za dopunjavanje kristalizuje iz zamrznute amorfne faze (bilo tokom smrzavanja ili povratka na temperaturu iznad Tg'), što liofilizovanom kolaču daje strukturu i obim. Primeri najčešće korišćenih sredstava za dopunjavanje su manitol i glicin.

[0098] Stabilizatori su klasa jedinjenja koja može imati ulogu krioprotektora, lioprotektora i agensa za formiranje stakla. Kriprotektori deluju u smislu stabilizovanja proteina tokom smrzavanja ili ih štite u smrznutom stanju na niskim temperaturama (P. Cameron, ur., Good Pharmaceutical Freeze-Drving Practice, Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, (1997)). Lioprotektori stabilizuju proteine u suvo-smrznutim čvrstim doznim formama, štiteći nativna svojstva konformacije proteina tokom dehidratacione faze suvog smrzavanja. Svojstva staklastog stanja klasifikuju se kao "čvrsta" ili "fragilna", zavisno od njihovih relaksacionih svojstava u funkciji temperature. Važno je da kriprotektori, lioprotektori i agensi za formiranje stakla ostanu u istoj fazi sa proteinima kako bi se održala stabilnost. U ovu kategoriju spadaju šećeri, polimeri i polioli i u nekim slučajevima oni imaju sve tri uloge.

[0099] Polioli obuhvataju klasu pomoćnih materija u koju spadaju šećeri (na primer, manitol, saharoza, sorbitol), kao i polihiidroksidni alkoholi (na primer, glicerol i propilen glikol). Polimer polietilen-glikol (PEG) pripada ovoj kategoriji. Polioli se najčešće koriste kao stabilizatori i/ili izotonični agensi u tečnim i u liofilizovanim parenteralnim formulacijama proteina. U kontektsu Hofmeisterovih serija, polioli su kozmotropni i obično se sklanjanju sa površine proteina. Polioli štite proteine od fizičke i hemijske degradacije. Preferencijalno isključujući ko-rastvarači povećavaju efektivnu površinsku tenziju rastvarača na dodirnoj površini sa proteinima, gde su energetski najpovoljnije proteinske konformacije one koje uspostavljaju najmanju površinu.

[0100]Manitol je često korišćena sredstvo za dopunjavanje u liofilizovanim formulacija, jer on kristalizuje iz amorfne proteinske faze tokom suvog smrzavanja, ostavljajući za sobom strukturno stabilan "kolač" (na primer, Leukine ®, Enbrel ® - Lyo, Betaseron®). Manitol se načelno koristi u kombinaciji sa krio- i/ili lioprotektorima, kao što je saharoza. Zbog sklonosti manotola da kristalizuje u uslovima smrzavanja, sorbitol i saharoza su poželjni agensi za održavanje toničnosti i kao stabilizatori u tečnim formulacijama koji štite proizvod od stresa smrzavanja i topljenja, do kojeg dolazi tokom transporta ili prilikom zamrzavanja mase pre proizvodnje. Sorbitol i saharaoza su daleko najrezistentni]i na kristalizaciju i stoga manje skloni da se razdvoje od proteina. Zanimljivo je napomenuti da, iako je manitol korišćen u količini potrebnoj da se održi toničnost u nekoliko licenciranih tečnih formulacija na tržištu, kao što su Actimmune®, Forteo®, i Rebif®, proizvodne markice na ovim lekovima nose upozorenje 'Ne smrzavati'. Treba izbegavati primenu redukujućih šećera (koji sadrže slobodne aldehidne ili keto grupe), kao što su glukoza i laktoza, jer ove grupe mogu da reaguju i glikolizuju lizinske i argininske ostatke na proteinima, putem Maj arove (Maillard) reakcije aldehida sa primarnim aminima (Chevalier F, i sar.,, Nahrung, 46(2): 58-63 (2002); Humeny A, i sar. J Agric Food Chem. 50(7): 2153-60 (2002)). Saharoza se pod kiselim uslovima hidrolizuje na fruktozu i glukozu (Kautz C. F. and Robinson A. L., JACS, 50(4) 1022-30 (1928)) i posledično može izazvati glikozilaciju.

[0101]Polimer polietilen-glikol (PEG) može da stabilizuje proteine na dva temperaturno-zavisna načina. Pri nižim temperaturama, on se preferencijalno uklanja sa površine proteina, ali zbog svoje amfipatične prirode, stupa u interakciju sa neupakovanim formama istog proteina na višoj temperaturi (Lee L.L., i Lee J.C., Biochemistry, 26(24): 7813-9 (1987)). Stoga na niskim temperaturama on štiti proteine posredtsvom mehanizma preferencijalog uklanjanja, a na višim temperaturama verovatno smanjivanjem broja efikasnih sudara između nespakovanih molekula. PEG takođe deluje kao krioprotektor i u tom svojstvu se koristi u proizvodu Recombinate®, što je liofilizovana formulacija rekombinantnog Antihemofilijskog faktora, koja koristi PEG 3350 u koncentraciji od 1.5 mg/mL. Tečni PEG molekuli male molekulske težine (PEG 300 - 600) mogu biti kontaminirani peroksidima i mogu da izazovu oksidaciju proteina. Kada se koriste, sadržaj peroksida u sirovini treba da se umanji na najmanju meru i da se kontroliše tokom perioda trajanja. Isto važi za polisorbate.

[0102]U liofilizovane formulacije dodaje se stabilizator (ili kombinacija stabilizatora), kako bi se sprečile ili smanjile agregacija i hemijska degradacija izazvane liofilizacijom i skladištenjem. Prisustvo zamućenog rastvora nakon rekonstitucije ukazuje da je protein precipitirao. Termin "stabilizator" označava ekscipijens sposoban da spreči agregaciju ili drugi oblik fizičke degradacije (na primer, autolizu, deamidaciju, oksidaciju i drugo) u vodenom ili čvrstom stanju. Stabilizatori koji se rutinski primenjuju u farmaceutskim kompozicijama obuhvataju, bez ograničenja, saharozu, trehalozu, manozu, maltozu, laktozu, glukozu, rafinozu, celobiozu, gentiobiozu, izomaltozu, arabinozu, glukozamin, fruktozu, manitol, sorbitol, glicin, arginin HCL, polihidroksilna jedinjenja, uključujući polisaharide, kao što je dekstran, škrob, hidroksietil škrob, ciklodekstrine, N-metilpiroliden, celulozu i hijaluronsku kiselinu, natrijum hlorid [Carpenter i sar. Develop. Biol. Standard 74:225,

(1991)]. Kao što je ovde opisano, stabilizator se može uključiti u formulaciju u koncentraciji od oko 0 % do oko 40 % w/v. Kao što je dodatno opisano, stabilizator se može uključiti u koncentraciji od najmanje 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, ili 40 % w/v ili može biti prisutan u koncentraciji od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9% do oko 10% w/v. Kao stoje takođe opisano, stabilizator se može uključiti u koncentraciji od oko 2 % do oko 4% w/v. Kao što je takođe opisano, stabilizator se može uključiti u koncentraciji od oko 2 % w/v.

[0103]Ukoliko je potrebno, liofilizovane kompozicije mogu da obuhvate i odgovarajuće količine sredstva za dopunjavanje i agenasa koji kontrolišu osmolarnost kako bi se stvorio liofilizovani "kolač". Sredstva za dopunjavanje mogu biti u formi kristala (na primer, manitol, glicin) ili u amorfnoj formi (na primer, saharoza, polimeri, kao što je dekstran, polivinil-pirolidon, karboksimetil-celuloza). Drugi primeri sredstava za dopunjavanje obuhvataju laktozu, sorbitol, trehalozu ili ksilitol. U sadašnjem pronalasku, kao sredstvo za dopunjavanje primenjen je manitol. Kao što će biti dalje opisano, u sastavu formulacije sredstvo za dopunjavanje može biti prisutna u koncentraciji od oko 0 % do oko 10 % w/v2ili može biti prisutan u koncentraciji od najmanje 0.2, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0,5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 ili 9.5 % w/v. Kao što je opisano, sredstvo za dopunjavanje može biti uključeno u sastav formulacije u koncentraciji od oko 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 % do 5.0 % w/v, kako bi se proizveo mehanički i farmaceutski stabilan i izgledan kolač. Kao što je opisano, koncentracija manitola može biti 4% w/v.

Površinski aktivne materije

[0104]Proteinski molekuli imaju snažnu tendenciju da stupe u interakcije sa površinama, što ih čini podložnim adsorbovanju i denaturaciji na međufazama vazduh-tečnost, vajla-tečnost i tečnost-tečnost (silikonsko ulje). Utvrđeno je da ovakva degradacija obrnuto proporcionalno zavisi od koncentracije proteina i da dovodi do formiranja solubilnih i nesolubilnih proteinskih agregata ili do gubitka proteina iz rastvora zbog adsorpcije na površine. Osim adsorpcije na površinu kontejnera, degradacija uslovljena adsorbcijom za podlogu pojačana je fizičkom agitacijom, kao što je to slučaj tokom transporta i rukovanja proizvodom.

[0105]Površinski aktivne materije uobičajeno se koriste u proteinskim formulacijama kako bi se sprečila degradacija usled adsorpcije na površinu. Površinski aktivne materije su amfipatični molekuli koji imaju sposobnost da zamene proteine na dodirnim površinama. Hidrofobni delovi površinski aktivnih molekula okupiraju dodirne površine (na primer, između vazduha i tečnosti), dok hidrofilni delovi molekula ostaju orijentisani prema masi rastvarača. Pri dovoljnim koncentracijama (najčešće oko kritične micelarne koncentracije deterdženta), površinski sloj površinski aktivnih molekula služi da spreči molekule proteina da adsorbuju za površinu međusloja. Na ovaj način se značajno smanjuje degradacija uslovijena adsorpcijom za površine. Najčešće korišćene površinski aktivne materije su masno-kiselinski estri sorbitan polietoksilata, na primer polisorbat-20 i polisorbat-80 (na primer, Avonex®, Neupogen®, Neulasta®). Ove dve površinski aktivne materije razlikuju se međusobno samo u dužini alifatičnog lanca koji daje hidrofobni karakter ovim molekulima, C-12, odnosno, C-18. U skladu sa tim, polisorbat-80 ima snažniju površinsku aktivnost i nižu kritičnu micelarnu koncentraciju od polisorbata-20. Površinski aktivan poloksamer 188 takođe je koristi u nekoliko licenciranih tečnih proizvoda, kao što su Gonal-F ®, Norditropin ® i Ovidrel ®.

[0106]I deterdženti utiču na termodinamičku stabilnost konformacije proteina. I u ovom slučaju, efekat određene pomoćne materije zavisi od konkretnog proteina. Na primer, polisorbati redukuju stabilnost nekih proteina i povećavaju stabilnost drugih. Destabilizacija proteina usled delovanja deterdženta može se racionalizovati u smislu da se hidrofobni repovi molekula deterdženta mogu iskoristiti za specifično vezivanje sa delimično ili potpuno odvijenim proteinima. Ovakve interakcije mogu da dovedu do promene konformacione ravnoteže ka otvorenijim konformacijama proteina (usled povećanja izloženosti hidrofobnih delova proteinskog molekula uz vezivanje polisorbata). Alternativno, ukoliko protein u nativnom obliku ima ispoljene neke hidrofobne površine, vezivanje deterdženta za nativnu formu može da stabilizuje konformaciju proteina.

[0107]Naredni aspekt polisorbata je da su oni inherentno podložni oksidativnoj degradaciji. Cesto, kao sirovi materijali, oni sadrže dovoljne količine peroksida da se izazove oksidacija bočnih lanaca proteina, naročito metionina. Potencijal za oksidativno oštećenje nastao usled dodavanja stabilizatora naglašava činjenicu daje u sastav formulacije potrebno uključiti što je moguće nižu efektivnu koncentraciju ekscipijensa. Kada je reč o površinski aktivnim materijama, efektivna koncentracija za dati protein zavisi od mehanizma stabilizacije. Pretpostavlja se da ukoliko je mehanizam delovanja površinski aktivne materije povezan sa sprečavanjem površinske denaturacije, da će efektivna koncentracija biti blizu kritične micelarne koncentracije. Suprotno, ukoliko je mehanizam stabilizacije povezan sa interakcijama proteina i deterdženta, efektivna koncentracija površinski aktivne materije zavisi će od koncentracije proteina i stohiometrije ovih interakcija (Randolph T.W., i sar., Pharm Biotechnol., 13:159-75 (2002)).

[0108]Površinski aktivne materije mogu se dodati u odgovorajućim količinama, kako bi se sprečila agregacija usled adsorpcije za površine, tokom smrzavanja i sušenja [Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)]. Primeri površinski aktivnih materija obuhvataju anjonske, katjonske, nejonske, cviterojonske i amfoterne površinski aktivne materije, koje vode poreklo od prirodnih amino kiselina. Anjonske površinski aktivne materije obuhvataju, bez ograničenja, natrijum lauril-sulfat, dioktil-natrijum sulfosukcinat i dioktil-natrijum sulfonat, henodeoksiholna kiselina, N-lauroilsarkozin natrijumova so, litijum dodecil sulfat, natrijumova so 1-oktansulfonske kiseline, natrijum-holat hidrat, natrijum-deoksiholat i natrijumova so glikodeoksiholne kiseline. Katjonske površinski aktivne materije obuhvataju, bez ograničenja, benzalkonium -hlorid ili benzetonijum-hlorid, cetil-piridinium hlorid monohidrat i heksadecil-trimetilamonijum bromid. Cviterojonske površinski aktivne materije, obuhvataju bez ograničenja, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 i SB3-12. Ne-jonske površinski aktivne materije obuhvataju, bez ograničenja, digitonin, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, i TWEEN-80. Površinski aktivne materije takođe obuhvataju lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, polioksietilen hidrogenisano ricinusovo ulje 10, 40, 50 i 60, glicerol monostearat, polisorbat 40, 60, 65 i 80, sojin lecitin i fosfolipidi, kao što su DOPC, DMPG, DMPC i DOPG; saharoza estri masnih kiselina, metil-celuloza i karboksimetil-celuloza. Kompozicije mogu da uključe ove površinski aktivne materije, bilo pojedinačno ili u smeši u različitim proporcijama sa drugim površinski aktivnim materijama. Površinski aktivna materija može biti prisutna u koncentraciji od oko 0 % do oko 5 % w/v2, ili može biti u koncentraciji od najmanje 0.001, 0.002, 0.005, 0.007, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 ili 4.5 % w/v. Konkretno, površinski aktivna materija može se uključiti u sastav formulacije u koncentraciji od oko 0.001 % do oko 0.5 % w/v ili može biti prisutna u koncentraciji od oko 0.004, 0.005, 0.007, 0.01, 0.05 ili 0.1 % w/v do oko 0.2 % w/v. Konkretnije, površinski aktivna materija može biti uključena u sastav formulacije u koncentraciji od oko 0.01 % do oko 0.1% w/v.

Soli

[0109]Soli se često dodaju formulacijama da bi se povećala jonska jačina, što je važan faktor solubilnosti proteina, fizičke stabilnosti i izotoničnosti. Soli utiču na fizičku stabilnost proteina na različite načine. Joni stabilizuju nativno stanje proteina, vezivanjem za naelektrisane amino-kiselinske ostatke izložene na površini proteina. S druge strane, soli mogu da stabilizuju denaturisano stanje, vezivanjem za peptidne grupe duž osovine proteina (-CONH-). Soli takođe stabilizuju nativnu konformaciju proteina, praveći odbojne elektrostatičke interakcije između ostataka unutar proteinskog molekula. Elektroliti u sadržaju proteinskih formulacija mogu takođe da izazovu privlačne elektrostatičke interakcije između proteinskih molekula, što je uzrok agregacija i nerastvorljivosti.

[0110]Uticaj soli na stabilnost i solubilnost proteina značajno varira zavisno od karakteristik jonskih vrsta. Hofmeisterove serije iz 1880-tih godina omogućavaju rangiranje elektrolita na osnovu njihove sposobnosti da precipitiraju proteine (Cacace M.G. i sar., Quarterly Revievvs of Biophvsics., 30(3): 241-277 (1997)). U ovoj aplikaciji, Hofmeisterove serije su primenjene da ilustruju raspon mogućih uticaja jonskih i nejonski ko-rastvarača na stabilizaciju proteina. U Tabeli C, ko-rastvarači su poredani shodno svom efektu na rastvorljivost proteina, od stabilizujućih (kosmotropnih) ka destabilizujućim (haotropnim). Uopšteno govoreći, razlike efekata koje izazivaju anjoni mnogo su veće od onih koje izazivaju katjoni, a efekti su, i kod jednih i kod drugih, najuočljiviji pri višim koncentracijama od onih koje su prihvatljive u parenteralnim formulacijama. Visoke koncentracije kosmotropa (na primer, > 1 M amonijum sulfat) uobičajeno se koriste za precipitaciju proteina iz rastvora, primenom postupka 'isoljavanja', u kojem se kosmotrop preferencijalno uklanja sa površine proteina smanjujući solubilnost proteina u njegovoj nativnoj (upakovanoj) konformaciji. Uklanjanje ili razblaživanje soli vraća proteine u rastvor. Termin 'usoljavanje' odnosi se na destabilišuće jone (na primer, kao što je guanidin i hlorid) koji povećavaju solubilnost proteina, razlaganjem peptidnih veza osovine proteinskog molekula. Povećavanje koncentracije haotropa pogoduje održavanju denaturisane (zapakovane) konformacije proteina, kako se povećava solubilnost peptidnog lanca. Relativna efikasnost jona da 'usole' i 'isole' proteine određuje njihovu poziciju na Hofmeisterovoj seriji.

[0111] Da bi se održala izotoničnost parenteralnih formulacija, koncentracije soli ograničene su na manje od 150 mM za kombinacije monovalentnih jona. U ovom opsegu koncentracija, soli stabilizuju proteine, projekcijom elektrostatičkih odbojnih intramolekulskih sila ili privlačnih intermolekulskih sila (Debye-Huckel screen- ing). Pokazano je da u ovom mehanizmu delovanja, haotropne soli efikasnije stabilizuju strukturu proteina od istih koncentracija kosmotropa. Haotropni anjoni se jače vezuju od kosmotropnih jona. U vezi sa kovalentnom degradacijom proteina, prema Debye-Huckel-ovoj teoriji očekuju se različiti efekti jonskih jačina u ovom mehanizmu delovanja. Literaturni podaci koji se odnose na stabilizaciju proteina natrijum hloridom, praćeni su podacima prema kojima natrijum hlorid ubrzava kovalentnu degradaciju. Mehanizam kojim soli utiču na stabilnost proteina zavisi od samog proteina i značajno varira zavisno of pH rastvora. Primer u kojem pomoćna materija može korisno da omogući primenuu proteinskog leka jeste formulacija sa visokom koncentracijom antitela. Nedavno je pokazano da su soli efikasne u smanjivanju viskoznosti ovih formulacija (Liu J., i sar., J. Pharm Sci., 94(9): 1928-40 (2005); Erratum in: J Pharm Sci., 95(1): 234-5. (2006)).

Amino kiseline

[0112]Amino kiseline imaju raznovrsne primene u proteinskim formulacijama, kao puferi, sredstva za dopunjavanje, stabilizatori i anti-oksidanti. Histidin i glutaminska kiselina koriste se za održavanje pH vrednosti formulacija u opsegu od 5.5 - 6.5, odnosno, 4.0 - 5.5. Imidazolska grupa histidina ima pKa = 6.0, a karboksilna grupa bočnog lanca glutaminske kiseline ima pKa od 4.3, što ih čini pogodnim za održavanje odgovorajućih opsega pH vrednosti. Acetat, koji je istovremeno i najčešće korišćeni pufer za održavanje kiselog opsega pH vrednosti od 4.0 - 5.5, sublimira tokom liofilizacije, pa ga zato ne treba koristiti u suvo smrznutim formulacijama. U takvim slučajevima je naročito korisna glutaminska kiselina (na primer, Stemgen®). Histidin se nalazi u nekim licenciranim formulacijama na tržištu (na primer, Xolair®, Herceptin®, Recombinate®). On je dobra zamena za citrat, koji izaziva iritaciju nakon injektovanja. Zanimljivo je da histidin stabilizuje ABX- IL8 (IgG2 antitelo) od agregacije, kada je to antitelo prisutno u visokoj koncentraciji u tečnim i liofilizovanim formulacijama (Chen B, i sar., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). Histidin (sve do 60 mM) takođe smanjuje viskoznost u rastvorima visokih koncentracija ovog antitela. Međutim, u istoj studiji autori su uočili povećanu agregaciju i dekoloraciju formulacija sa histidinom, tokom suvog smrzavanja antitela u posudama od nerđajućeg čelika. Ove efekte autori su pripisali jonima gvožđa usled korozije čeličnih kontejnera. Drugo upozorenje vezano za upotrebu histidina odnosi se na činjenicu da on podleže foto-oksidaciji u prisustvu jona metala (Tomita M, i sar., Biochemistrv, 8(12): 5149-60 (1969)). Jedna od mogućih primena amino kiselina je primena metionina kao antioksidanta u formulacijama; uočeno je da je ova amino kiselina efikasna u slučaju različitih oksidativnih stresora (Lam XM, i sar., J Pharm Sci., 86(11): 1250-5(1997)).

[0113]Amino kiseline glicin, prolin, serin i alanin mogu da stabilizuju protein, mehanizmom preferencijalnog uklanjanja. Glicin se često koristi kao sredstvo za dopunjavanje u liofilizovanim formulacijama (na primer, Neumega ®, Genotropin®, Humatrope®). On se kristalizuje iz zamrznutih amorfnih faza dajući strukturu kolača i masu. Arginin je takođe efikasan agens u inhibiciji agregacije, a koristi se i u tečnim i u liofilizovanim formulacijama (na primer, Activase®, Avonex®, Enbrel® liquid). Velika efikasnost sticanja konačne konformacije proteina u prisustvu arginina pripisuje se njegovim delovanjem u smislu sprečavanja agregacije tokom pakovanja proteina.

Antioksidanti

[0114]Do oksidacije proteina dolazi iz različitih izvora. Osim dodavanja specifičnih antioksidanata, sprečavanje oksidativnog oštećenja proteina obuhvata pažljivu kontrolu brojnih faktora tokom celokupnog procesa proizvodnje i skladištenja proizvoda, kao što su atmosferski kiseonik, temperatura, izloženost svetlu i hemijska kontaminacija. Najčešće korišćeni farmaceutski antioksidanti su redukujući agensi, skupljači slobodnih kiseoničnih radikala i helirajući agensi. Antioksidanti u formulacijama terapeutskih proteina moraju biti hidrosolubilni i ostati aktivni tokom celog roka trajanja. Redukujući agensi i skupljači slobodnih kiseoničnih radikala funkcionišu tako što uklanjanju aktivne kiseonične vrste iz rastvora. Helirajući agensi, kao što je EDTA, mogu biti efikasni u vezivanju kontaminacija jonima metala koji podstiču formiranje slobodnih radikala. Na primer, EDTA se koristi u tečnim formulacijama kiselog faktora rasta fibroblasta kako bi inhibirao oksidaciju cisteinskih ostataka koja je katalizovana jonima metala. EDTA se koristi u licenciranim proizvodima na trežištu, kao što su Kineret® i Ontak®.

[0115]Osim procene efikasnosti različitih pomoćnih materija u sprečavanju oksidacije proteina, naučnici koji se bave pravljenjem formulacija moraju biti svesni i potencijala samih antioksidanata da indukuju druge kovalentne i fizičke promene na proteinima. Brojni slučajevi su prijavljeni u literaturi. Redukujući agensi (kao što je glutation) mogu izazvati raskidanje unutarmolekulskih disulfidnih veza, što može dovesti do disulfudnog mešanja. U prisustvu jona prelaznih metala, askorbinska kiselina i EDTA podstiču oksidaciju metionina u mnogim proteinima i peptidima (Akers MJ, i Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. U: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, urednici. Pharmaceutical Science. Tavlor and Francis, UK

(1999)); Fransson J.R., J. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, i sar., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). Natrijum-tiosulfat redukuje nivo svetlom i temperaturom izazvane oksidacije metionina u rhuMab HER2; međutim, u istoj studiji je prijavljeno i formiranje tiosulfat-proteinskog adukta (Lam XM, Yang JY, i sar., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)). Odgovarajući antioksidant bira se na osnovu specifičnih strestora i senzitivnosti specifičnog proteina.

Joni metala

[0116]Uopšteno govoreći, joni prelaznih metala najmanje su poželjni joni u sastavu proteinskih formulacija, jer oni podstiču fizičku i hemijsku degradaciju proteina. Neki joni metala, međutim, modu se uključiti u sastav formulacija, onda kada imaju ulogu kofaktora proteina, kao i u suspenzionim formulacijama proteina u kojima formiraju koordinacione komplekse (na primer, cinkove suspenzije insulina). Nedavno je predložena primena magnezijumovih jona (10-120 mM), kao inhibitora izomerizacije aspartatne kiseline u izoaspartatnu kiselinu (WO 2004039337).

[0117]Dva slučaja u kojima joni metala uvećavaju stabilnost ili povećavaju aktivnost proteina jesu humana dezoksiribonukleaza (rhDNase, Pulmozvme®) i Faktor VIII. U slučaju rhDNase, Ca 2+ joni (sve do koncentracije od 100 mM) povećavaju stabilnost enzima preko specifičnog vezujućeg mesta (Chen B, i sar., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). U stvari, uklanjanje kalcijumovih jona iz rastvora pomoću EGTA dovodi do deamidacije i agregacije.

2+ 2+ 2+ Ovaj efekat je, međutim, uočen samo sa jonima Ca ; ostali dvovalentni katjoni - Mg , Mn i Zn destabilizuju rhDNase. Slični efekti su uočeni kod Faktora VIII. Joni Ca i Sr stabilizuju ovaj protein, dok drugi joni, kao što su Mg , Mn i Zn , Cu i Fe destabilizuju ovaj enzim (Fatouros, A., i sar., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). U nezavisnoj studiji na Faktoru VIII, uočeno je značajno povećanje brzine agregacije u prisustvu Al3 jona (Derrick TS, i sar., J. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). Autori napominju da su druge pomoćne materije, kao što su puferske soli, često kontaminirane jonima Al 3+, što ukazuje na potrebu za primenom pomoćnih materija odgovarajućeg kvaliteta u formulisanim proizvodima.

Konzervansi

[0118]U razvoju multifunkcionalnih parenteralnih formulacija neophodna je primena konzervanasa koji sadrže jedan ili više ekstrakata u istom kontejneru. Osnovna uloga konzervanasa je da inhibiraju rast mikroorganizama i da obezbede sterilnost proizvoda tokom celog perioda trajanja ili tokom primene leka. Uobičajeni konzervansi u upotrebi su benzil-alkohol, fenol i m-krezol. Iako su konzervansi već dugo u primeni, razvoj konzervanasa za primenu u proteinskim formulacijama nije bez problema. Konzervansi gotovo uvek imaju destabilišući uticaj (agregacija) na proteine i to je osnovni faktor u ograničenju njihove primene u multi-doznim formulacijama proteina (Roy S, i sar.,, J Pharm Sci., 94(2): 382-96(2005)).

[0119]Do sada je većina proteinskih lekova formulisana je za pojedinačnu upotrebu. Međutim, kada su moguće multi-dozne formulacije, one imaju dodatnu pozitivnu odliku, jer povećaju komfor prilikom upotrebe, pa tako imaju u bolji položaj na tržištu. Dobar primer je humani hormon rasta (hGH) kod kojeg je razvoj konzerviranih formulacija omogućio komercijalizaciju znatno praktičnije injekcione olovke za veći broj primena. Na tržištu trenutno postoji najmanje četiri slične sprave sa konzerviranim formulacijama hGH. Norditropin® (tečni, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (tečni, Genentech) & Genotropin (liofilizovan - umetak sa dve komore, Pharmacia & Upjohn) sadrže fenol, dok je Somatrope® (Eli Lilly) formulisan sa m-krezolom.

[0120]Potrebno je razmotriti nekoliko aspekata vezanih za razvoj doznih formi za konzervirane formulacije proteina. Potrebno je optimizovati efektivnu koncentraciju konzervansa u sastavu leka. To se postiže testiranjem doznih formi koje sadrže konzervans u opsegu različitih koncentracija koje su efikasne protiv mikroorganizama, a da pri tome ne utiču na stabilnost proteina. Na primer, pretraživanjem konzervanasa prilikom razvoja tečne formulacije interleukin-1 receptora (Tip I), primenom diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) izabrano je tri uspešna konzervansa. Konzervansi su rangirani na osnovu svog uticaja na stabilnost proteina, pri koncentracijama koje se uobičajeno koriste u proizvodima na tržištu (Remmele RL Jr., i sar., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).

[0121]Kao što se može očekivati, razvoj tečnih formulacija sa konzervansom teži je od razvoja liofilizovanih formulacija. Suvo-smrznuti proizvodi mogu se liofilizovati bez konzervansa, a u trenutku primene mogu se rekonstituisati u rastvaraču koji sadrži konzervans. Ovo značajno skraćuje vreme tokom kojeg je konzervans u kontaktu sa proteinom, čime se na najmanju meru svodi rizik od remećenja stabilnosti. U tečnim formulacijama, efikasnost konzervansa i stabilnost moraju se održavati tokom celog roka trajanja (~18-24 meseci). Važno je naglasiti da je neophodno demonstrirati efikasnost konzervansa u finalnim formulacijama koje sadrže aktivan lek i u svim komponentama pomoćnih materija.

[0122]Neki konzervansi mogu uzrokovati rekaciju na mesti injketovanja, što je dodatni faktor koji treba razmotriti prilikom izbora konzervansa. U kliničkim studijama koje su se bavile procenom konzervanasa i pufera u Norditropinu, uočeno je da je bolni osećaj bio niži u formulacijama koje su sadržale fenol i benzil alkohol, u poređenju sa formulacijama koje su sadržale m-krezol (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)). Zanimljivo je da među uobičajenim konzervansima, benzil alkohol poseduje i anestetička svojstva (Minogue SC, i Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)).

[0123]Imajući u vidu činjenice i smernice, stručnjak u stanju tehnike znaće koju količinu ili opseg količina ovog ekspcipijensa treba dodati u neku konkretnu formulaciju kako bi se postigla biofarmaceutska formulacija saglasno pronalasku, koja pomaže održavanje stabilnosti ovog leka. Primera radi, količina i tip soli koja se uključuje u sastav biofarmaceutske formulacije saglasno pronalasku može se izabrati na osnovu željene osmolarnosti (to jeste, izotonična, hipotonična ili hipertonična) finalnog rastvora, kao i količine i osmolarnosti drugih komponenti u sastavu formulacije. Slično tome, ako se kao primer uzme tip poliola ili šećera uključenih u formulaciju, količina ovih pomoćnih materija zavisi od njihove osmolarnosti.

[0124] Na primer, uključivanje 5 % sorbitola može da omogući postizanje izotoničnosti, dok je sa 9 % saharoza potrebno uvođenje ekspcijensa kako bi se postigla izotoničnost. Izbor količine i opsega koncentracija jednog ili više ekscipijenasa koji se uključuju u sadržaj biofarmaceutskih formulacija saglasno pronalasku dat je prethodnim konkretnim primerima korišćenja soli, poliola i šećera. Stučnjaku u ovoj oblasti je poznato da razmatranja koja su ovde pomenuta u vezi sa konkretnim primerima, jednako se mogu primeniti na sve tipove i kombinacije ekscipijenasa, uključujući, na primer, soli, amino kiseline, druge agense za postizanje toničnosti, površinski aktivne materije, stabilizatore, inertne materije, krioprotektore, lioprotektore, antioksidante, jone metala, helirajuće agense i/ili konzervanse.

[0125] Osim toga, kada je u formulaciji prijavljena jedna konkretna pomoćna materija u količini izraženoj, na primer, u (%) w/v, stručnjak u oblasti će prepoznati da se podrazumeva i ekvivalentna molarna koncentracija istog ekscipijensa.

[0126] Naravno, osoba prosečne stručnosti prepoznaće da koncentracije prethodno pomenutih pomoćnim materija unutar jedne konkretne formulacije zavise od koncentracija drugih komponenti. Na primer, koncentracija sredstva za dopunjavanje može se smanjiti kada je, na primer, potrebna visoka koncentracija proteina/peptida ili kada je potrebna, na primer, visoka koncentracija stabilizatora. Osim toga, osoba prosečne stručnosti prepoznaje da će u cilju podešavanja toničnosti formulacije u kojoj nema sredstva za dopunjavanje, toničnost biti podešena pramenom koncentracije stabilizatora (odnosno, biće primenjena "tonifikujuća" količina stabilizatora).

[0127] Ove kompozicije su stabilne najmanje dve godine na 2°C do 8°C u liofilizovanom obliku. Dugoročna stabilnost je poželjna za produženje roka trajanja farmaceutskog proizvoda.

Postupci pripreme

[0128] Predmetni pronalazak dalje predviđa postupke pripreme formulacija teraputskih proteina, konkretno, postupke pripreme liofilizovanih formulacija terapeutskih peptitela, koji uključuju korak liofilizacije kompozicije terapeutskog peptitela u puferu koji se sastoji od puferskog agensa, sredstva za dopunjavanje, stabilizatora i površinski aktivne materije;

[0129]Predmetni postupci obuhvataju jedan ili više narednih koraka: dodavanja stabilizatora navedenoj smeši pre liofilizacije, dodavanja najmanje jednog agensa izabranog između sredstva za dopunjavanje, agensa za regulaciju osmolarnosti i površinski aktivne materije pre liofilizacije. Osim ukoliko nije drugačije precizirano zahtevima, sredstvo za dopunjavanje može biti bilo koja sredstvo za dopunjavanje koje je pomenuo ovim opisom. U jednom aspektu, sredstvo za dopunjavanje je manitol. U predmetnom pronalasku, stabilizator je saharoza. Ukoliko nije drugačije precizirano zahtevima, površinski aktivna materija može biti bilo koja površinski aktivna materija pomenuta u ovom opisu. U jednom obliku izvođenja, površinski aktivna materija je polisorbat-20.

[0130]Standardna praksa rekonstitucije liofilizovanih materijala sastoji se u oporavku zapremine dodavanjem čiste vode ili sterilne vode za injekcije (WFI) (najčešće ekvivalent zapremine uklonjene liofilizacijom), iako se u proizvodnji farmaceutika za parenteralnu primenu ponekad koriste i razblaženi rastvori antibakterijskih agenasa [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacv, 18:1311-1354 (1992)]. Saglasno tome, obezbeđeni su postupci pripreme rekonstituisanih terapeutskih peptitela, koji uključuju korak dodavanja rastvarača u liofilizovanu kompoziciju terapeutskog peptitela, saglasno pronalasku.

[0131]Liofilizovana kompozicija terapeutskog peptitela može se rekonstituisati u vodenom rastvoru. Brojni vodeni nosači, na primer, sterilna voda za injekcije, voda sa dodatim konzervansima za multi-doznu primenu ili voda sa odgovarajućom količinom površinski aktivnih materija (na primer, polosorbat-20), 0.4 % fiziološki rastvor, 0.3% glicin ili vodene suspenzije mogu sadržati aktivno jedinjenje u smeši sa pomoćnim materijama pogodnim za proizvodnju vodenih suspenzija. U različitim aspektima, ove pomoćne materije su suspendujući agensi, na primer, natrijum-karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidroksi-propilmetilceluloza, natrijumalginat, polivinil-pirolidon, gumeni tragakant, guma akacije; dispergujući agensi ili ovlaživači mogu biti prirodni fosfatidi, na primer, lecitin ili kondenzacioni proizvodi alkilen oksida i masnih kiselina, na primer, polioksietilen-stearat ili kondenzacioni proizvodi etilen oksida i dugolančanih alifatičnih alkohola, na primer, heptadeka-etilenoksicetanol ili kondenzacioni proizvodi etilenoksida i parcijalnih estara nastalih od masnih kiselina i heksitola, kao što je, na primer, polioksietilen-sorbitol monooleat ili kondenzacioni proizvodi etilenoksida i parcijalnih estara dobijenih od masnih kiselina i heksitol anhidrida, na primer, polietilen sorbitan monooleat. Vodene suspenzije mogu takođe sadržati jedan ili više konzervanasa, na primer, etil-, ili n-propil, p- hidroksibenzoat.

[0132]Za potrebe primene kompozicija kod ljudi ili životinja, u jednom aspektu, kompozicije obuhvataju jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Fraze "farmaceutski" ili "farmakološki prihvatljiv" odnose se na molekulske entitete i na kompozicije koje su stabilne, inhibiraju degradaciju proteina, kao što je agregacija ili isecanje proteina i uz to ne izazivaju alergijske reakcije ili druge neželjene reakcije kada se primene na način poznat u stanju tehnike, kao što je ovde opisano. "Farmaceutski prihvatljivi nosači" obuhvataju svaki i sve klinički prihvatljive rastvarače, medijume, obloge, antibakterijske i antifugalne agense, izotonične agense i agense za usporavanje adsorpcije i slično, uključujući i agense koji su prethodno opisani.

[0133]Kompozicije terapeutskih peptitela mogu se primeniti oralno, površinski, transdermalno, perenteralno, putem sprejeva za inhalaciju, vaginalno, rektalno ili putem intrakranijalne injekcije. Termin parenteralno ovde se koristi u značenju koje obuhvata subkutane injekcije, intravenske, intramuskularne, intracisternalne injekcije ili infuzione tehnike. Takođe je predviđena primena putem intravenske, intradermalne, intramuskularne injekcije, preko tkiva dojke, intraperitonealne, intratekalne, retrobulbarne, intrapulmonarne injekcije ili hirurškom implantacijom na specifično mesto. Načelno, kompozicije suštinski ne sadrže pirogene, kao i nečistoće koje mogu biti štetne za primaoca.

[0134]Pojedinačna ili višestruka administracija kompozicije može se sprovesti sa doznim nivoom i režimom koji propisuje nadležni lekar. Za prevenciju ili tretman bolesti, odgovarajuća doza zavisi od tipa bolesti koja se tretira, kao što je ranije opisano, težine simptoma i toka bolesti, od toga da li se lek primenjuje preventivno ili terapeutski, od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i reakcije na lek, kao i izbora samog nadležnog lekara.

Kompleti

[0135]Još jedan dodatni aspekt, pronalaska predviđa komplet koji uključuje jedno ili više liofilizovanih jedinjenja ili kompozicija spakovanih na način koji olakšava njihovu primenu kod pacijenata. U jednom aspektu, ovakav komplet obuhvata jedinjenje ili kompoziciju kao što je opisano (na primer, kompozicija koja obuhvata terapeutski protein ili peptid), upakovane u posudu, kao što je zaptivena boca ili sud, sa etiketom nalepljenom na posudu ili obezbeđenom u paketu, a koja precizno definiše postupak praktične primene jedinjenja ili kompozicije. U jednom aspektu, komplet sadrži jedan kontejner sa liofilizovanom kompozicijom terapeutskog proteina ili peptida i drugi kontejner sa fiziološki prihvatljivim rastvorom za rekonstituciju liofilizovane kompozicije. U jednom aspektu, jedinjenje ili kompozicija je upakovano u doznoj formi. Komplet može da sadrži i uređaj za primenu kompozicije saglasno specifičnom putu primene. Poželjno je da komplet sadrži etiketu koja opisuje primenu kompozicije terapeutskog proteina ili peptida.

Doze

[0136]Dozni režim koji se primenjuje u terapiji stanja opisanih ovim pronalaskom biće određen od strane nadležnog lekara, koji će razmotriti različite faktore koji mogu modifikovati delovanje lekova, na primer, uzrast, opšte stanje, telesnu masu, pol i ishranu pacijenta, ozbiljnost infekcije, vreme primene i druge kliničke faktore. U različitim aspektima, dnevni režim je u opsegu od 0.1-1000 |ug preparata po kilogramu telesne mase pacijenta (računajući samo masu proteina, bez hemijskih modifikacija) ili 0.1-150 ug/kg. U nekim aspektima, doza može premašiti 1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg.

[0137]Preparati saglasno pronalasku mogu se primeniti u vidu inicijalnog bolusa, nakon čega sledi kontinulna infuzija sa ciljem da se održi terapeutski nivo leka u cirkulaciji postignut bolusom. Na primer, novo jedinjenje se može primeniti u vidu jednokratne doze. Prosečno stručne osobe u stanju tehnike lako će optimizovati efektivne doze i režime primene na osnovu dobre medicinske prakse i kliničkog stanja konkretnog pacijenta. Dozni raspored i učestalost davanja lek zavise od farmakokinetičkih parametara agenasa i rute primene. Stručnjak će odrediti optimalnu farmaceutsku formulaciju, na osnovu rute administracije i željene doze. Videti na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), strane 1435-1712. Ove formulacije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost i brzinu oslobađanjain vivo,odnosno, brzinu izbacivanja primenjenog agensain vivo.Zavisno od rute primene, moguće je izračunati pogodnu dozu, na osnovu telesne, telesne površine ili veličine organa. Dalje neophodna podešavanja za izračunavanje odgovarajuće terapijske doze koja obuhvataju prethodno pomenute formulacije rutinski se obavijaju od strane prosečno stručne osobe, bez dodatnih proba, naročito u svetlu doznih informacija i testova koji su ovde opisani, kao i na osnovu farmakokinetikih podataka iz kliničkih istraživanja na ljudima, koja se ovde opisana. Adekvatno doziranje može se postići i na osnovu odgovarajućih dozno-zavisnih podataka. Konačan režim doze biće određen od strane nadležnog lekara, koji će uzeti u razmatranje različite faktore koji modifikuju delovanje lekova, na primer, specifičnu aktivnost leka, ozbiljnost stanja ili reakciju pacijenta, uzrast, opšte stanje, telesnu masu, pol, ishranu pacijenta, ozbiljnost infekcije, vreme administracije, kao i druge kliničke faktore. Sa daljim izvođenjem studija biće dostupni novi podaci u vezi sa odgovarajućim dozama i trajanjem tretmana različitih bolesti i stanja.

Struktura jedinjenja

[0138]Uopšteno. U preparatima saglasno pronalasku, peptid je vezan za nosač preko svog N-terminusa, C-terminusa peptida ili preko oba svoja terminusa, a tako nastala struktura može se dodatno modifikovati kovalentnim vezivanjem WSP, koji se vezuje za nosački deo molekula sastavljenog od nosača-peptida. Dakle molekuli terapeutskih peptitela saglasno pronalasku mogu se opisati narednom formulom I:

Naznačenom time daje: Fl nosač; X<1>je izabran između x<2>je izabran između:

naznačeno time da su P<1>,<p2>,<p3>i<p4>nezavisno jedna od druge, sekvence farmakološki aktivnih peptida, L<1>, L<2>, l<3>, l<4>i L<5>su nezavisno jedan od drugog, veznici;

a, b, c, e, f, g i h svaki nezavisno imaju vrednost 0 ili 1, uz uslov da ili a i/ili b ima vrednost i;

d je 0, 1 ili više od 1; i

WSP hidrosolubilni polimer, na čije vezivanje utiče svaka reaktivna grupa u F<1>.

[0139]Stoga, jedinjenja I uključuju jedinjenja formule

uključujući i njihove multimere, naznačeno time daje F<1>neki Fc domen i daje vezan za C-terminus X<1>, i da je jedan ili više WSP vezano za Fc domain, opciono preko veznika L<1>; uključujući i njihove multimere, naznačeno time daje F<l>neki Fc domen i daje vezan za N-terminus X^, i da je jedan ili više WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika L<1>; uključujući i njihove multimere, naznačeno time da je Fl neki Fc domen i da je vezan za N-terminus -(L<l>)c-P<l>i da je jedan ili više WSP vezano za taj Fc domen, opciono preko veznika U; i

uključujući i njihove multimere, naznačeno time da je Fl neki Fc domen i da je vezan za N-terminus -L<1->P<1->L<2->P<2>i da je jedan ili više WSP vezano za taj Fc domen, opciono preko veznika L1.

[0140] U jednom obliku izvođenja, F<1>je neki Fc domen i vezanje N-terminus ili C-terminus peptida. U sličnom obliku izvođenja, Fc je vezan u dimernu formu kao što je ovde opisano i za njega su vezana 2 (ili više) peptida. Peptidi mogu biti homodimeri (na primer, iste amino-kiselinske sekvence) ili heterodinamičmi (različite amino-kiselinske sekvence su vezane za istu metu ili su vezane za različite mete).

[0141] Narednim oblikom izvođenja obezbeđene su Fc-petlje koje obuhvataju peptid(e). Fc-petlje koje sadrže peptid(e) su dobijene u postupku u kojem je najmanje jedan biološki aktivan peptid, kao interna sekvenca, ugrađen u Fc domain. Ovakve interne sekvence mogu se dodati insercijom (odnosno, između amino kiselina u prethodno postojećem Fc domenu) ili zamenom amino kiselina u prethodno postojećem Fc domenu (odnosno, uklanjanjem amino kiselinske sekvence u prethodno postojećem Fc domenu i dodavanjem amino kiselina peptida). U slučaju ovog poslednjeg, broj dodatih amino kiselina u peptidu ne mora da odgovara broju uklonjenih amino kiselina iz prethodno postojećeg Fc domena. Na primer, u jednom aspektu obezbeđen je molekul iz kojeg je uklonjeno 10 amino kiselina i dodato 15 amino kiselina. Obezbeđena farmakološki aktivna jedinjenja se dobijaju postupkom koji obuhvata: a) izbor najmanje jednog peptida koji moduliše aktivnost proteina od interesa; i b) priprema farmakološkog agensa koji obuhvata amino-kiselinsku sekvencu izabranog peptida kao internu sekvencu unutar Fc domena. Ovaj postupak može se primeniti da se modifikuje Fc domen koji je već povezan preko N- ili C-terminusa ili bočnog lanca peptida, na primer, kao što je opisano u U.S. patentnim prijavama pod brojevim 2003/0195156, 2003/0176352, 2003/0229023, i 2003/0236193, i u međunarodnim publikacijama broj WO 00/24770 i WO 04/026329. Ovaj postupak opisan u U.S. Patent Application Publication broj US2006/0140934 može se takođe primeniti za modifikaciju nekog Fc domena koji je deo antitela. Na ovaj način je moguće dobiti različite molekule koji imaju dodatne funkcionalnosti, kao što je vezujući domen za različit epitop ili dodatni vezujući domen za postojeći epitop prekursorskog molekula. Moleculi koji sadrže neku internu peptinu sekvencu takođe nose oznaku "Fc interna peptitela" ili "Fc interni peptidni molekuli."

[0142]Interni peptidi Fc molekula mogu da uključe više od jedne peptidne sekvence u tandemu u određenom regionu i mogu da uključe dodatne peptide u drugim internim regionima. Iako su poželjne insercije u regionima petlje, i insercije u drugim, ne-terminalnim delovima unutar Fc takođe se smatraju delom ovog pronalaska. Varijante i derivati navednih jedinjenja (koje će biti opisane u tekstu koji sledi) takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom.

[0143]Jedinjenja saglasno predmetnom pronalasku mogu se dobiti standardnim postupcima, tehnikama rekombinantne DNK ili drugim postupcima za dobij anje peptida i fuzionih proteina.

[0144]Predviđeno je da se interne peptidi Fc molekula koriste kao terapeutici ili kao profilaktički agensi. Izabrani peptid može imati aktivnost sličnu - ili čak veću od prirodnog liganda na kojeg taj peptid liči. Osim toga, neki terapeutski agensi bazirani na prirodnim ligandima mogu da indukuju antitela protiv endogenih liganada pacijenta. To nije moguće kada je reč o ovim peptidima, zbog njihove jedinstvene sekvence povezand za nosač, kao i zbog toga što one ispoljavaju malo ili ni malo sličnosti sekvence sa prirodnim ligandom. Uz to, Fc interna peptitela mogu biti korisnija prilikom sklapanja i prečišćavanja u poređenju sa Fc molekulima povezanim preko N- ili C-terminusa. Uza sve, Fc interna peptitela su stabilnija, kako termodinamički, zbog stabilizacije himernih domena, tako i hemijski, zbog povećane rezistencije na proteolitičku degradaciju katalizovanu amino- i karboksi-peptidazama. Fc interna peptitela mogu takođe da ispolje poboljšana farmakokinetička svojstva.

[0145]Peptidi. Veliki broj peptida se može primeniti u kontekstu predmetnog pronalaska. Od naročitog su interesa peptidi koji imitiraju aktivnost EPO, TPO, hormona rasta, G-CSF, GM-CSF, IL-lra, CTLA4, TRAIL, TNF, VEGF, MMP, miostatin, integrin, OPG, OPG-L, NGF, TALL-1, Ang-2 vezujućeg(ih) partnera, TGF-a i TGF-p. Antagonisti peptida takođe su od interesa, konkretno oni koji antagonizuju aktivnost TNF, svih interleukina (IL-1, 2, 3, ...), i proteina uključenih u aktivaciju komplementa (na primer, C3b). Ciljani peptidi su takođe od interesa, uključujući tumor-vezujuće peptide, peptode membranskog transporta, i slično. Sve ove klase peptida mogu se otkriti postupcima opisanim u literaturi koja je navedena u ovoj specifikaciji i u drugim referencama.

[0146]Postupak izlaganja u fagu može se veoma korisno primeniti za generisanje peptida za primenu saglasno predmetnom pronalasku. Konstatovano je da za identifikaciju peptidnih liganada za bilo koje mesto svakog genskog proizvoda moguće primeniti afinitetnu selekciju iz biblioteke nasumičnih peptida. Dedman i sar., (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025-30. Izlaganje u fagu je naročito pogodno za identifikovanje peptida koji vezuju proteine od interesa, u vidu ćelijskih površinskih receptora ili drugih proteina koji imaju linearne epitope. Wilson i sar., (1998), Can. J. Microbiol. 44: 313-29; Kay i sar., (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. Detaljan pregled ovih proteina dat je u preglednom članku Herz i sar., (1997), J. Receptor & Signal Transduction Res. 17(5): 671-776. Ovakvi proteini od interesa su poželjni za primenu saglasno predmetnom pronalasku.

[0147]U smislu neograničavajućeg primera, obezbeđena je grupa peptida koja se vezuje za receptore citokina. Citokini su nedavno klasifikovani na osnovu svog receptorskog koda. Videti Inglot (1997), Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 45: 353-7. Među ovim receptorima su CKR (porodica I u Tabeli 3). Klasifikacija receptora data je u Tabeli 3.

[0148]Ostali proteini od interesa kao mete za generisanje peptida saglasno predmetnom pronalasku, obuhvataju sledeće:

av|33

aVpl

Ang-2

B7

B7RP1

CRPI

Kalcitonin

CD28

CETP

cMet

Faktor komplementa B C4b

CTLA4

Glukagon

Receptor glukagona

LIPG MPL

Varijante molekula nastale alterantivnom obradom iRNK, molekula koji se preferencijalno eksprimiraju na tumorskim ćelijama; na primer, CD44, CD30 neglikozilovane varijante mucina i Lewis Y površinski glikoproteini CD19, CD20, CD33, CD45

Specifični membranski antigen prostate i matriksna metaloproteinaza ćelijski specifičnog antigena prostate prostate (MMP), slobodni i membranski (na primer, MMP-9), Katepsini

TIE-2 receptor

heparanaza

urokinazni aktivator plazminogena (UPA), UPA receptor

paratiroidni hormon (PTH), hormon srodan paratiroidnom hormonu (PTHrP), PTH-RI, PTH- RII

Her2

Her3

Insulin

Miostatin

TALL-1

Nervni faktor rasta

Integrini i receptori

Selektini i njihovi receptori

Ćelijski adhezioni molekuli i njihovi receptori.

[149]Reprezentativni peptidi pojavljuju se u Tabelama 4 do 38. Oni se mogu dobiti primenom postupaka opisanih u stanju tehnike, od kojih su mnogi ovde pomenuti. U većini narednih tabela, za amino kiseline su korišćene jednoslovne skraćenice. Oznaka "X" u ovim sekvencama (i na drugim mestima u specifikaciji, ukoliko nije u konkretnim slučajevima drugačije precizirano) označava da na tom mestu može biti bilo koja od 20 prirodnih amino kiselina. Svaki od ovih peptida može biti povezan u tandem (odnosno, redom), sa ili bez veznika, a u tabeli je dato nekoliko tandemskih primera. Veznici nose oznaku "A" i to može biti bilo koji pomenuti veznikr. Tandemski ponovci i veznici prikazani su odvojeni povlakama, zbog preglednosti. Svaki peptid koji sadrži cisteinski ostatak može se unakrsno povezati sa drugim peptidom koji sadrži cisteinski ostatak, pri čemu jedan ili oba mogu biti povezani za nosač. Nekoliko unakrsno povezanih primera je dato u tabeli. Svi peptidi koji sadrže više od jednog cisteinskog ostatka mogu takođe da formiraju unutarpeptidnu disulfidnu vezu; videti, na primer, EPO-mimetičke peptide u Tabeli 5. Nekoliko primera intrapeptidnih disulfidno-povezanih peptida je specifikovano u tabeli. Svaki od ovih peptida može se derivirati kao što je opisano, a nekoliko deriviranih primera je dato u tabeli. Izvedeni peptidi u tabelama su dati kao primeri koji ne ograničavaju pronalazak, kao što se i asocirani neizvedeni peptidi mogu primeniti saglasno predmetnom pronalasku. Za derivate u kojima karboksilni terminusi mogu biti prekriveni amino grupom, pokrovna amino group je prikazana kao -NH2. Za derivate u kojima su amino-kiselinski ostaci supstituisani grupama koje nisu amino kiseline, supstitucije su označene oznakom a, koja označava da je ta grupa opisana u Bhatnagar i sar., (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9 i Cuthbertson i sar., (1997), J. Med. Chem. 40: 2876-82. Supstituenti J i supstituenti Z (Z5, Zg, ...Z40) imaju značenje kao što je definisano u U.S. Pat. Nos. 5,608,035, 5,786,331 i 5,880,096. Za EPO-mimetičke sekvence (Tabela 5), supstituenti X2doX\ \i celi brojevi "n" su kao što je definisano u WO 96/40772. Takođe za EPO-mimetičke sekvence, supstituenti Xna, Xi a, X2a, X3a, X4a, X5ai Xcaodgovaraju definicijama Xn, Xi, X2, X3, X4, X5i Xc, iz WO 99/47151. Supstituenti "T," "0," i "+" kao što je definisano kod Sparks i sar., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1540-4. X4, X5, X6, iX~ qimaju značenje kao što je definisano u U.S. Pat. No. 5,773,569, osim sledećeg: za integrin-vezujuće peptide, Xi, X2, X3, X4, X5, Xg,XjiXgimaju značenje kao što je definisano u međunarodnoj aplikaciji WO 95/14714, objavljenoj 1. juna 1995. i WO 97/08203, objavljenoj 6. marta, 1997; i za VlP-mimetičke peptide, Xi, Xi', Xi", X2, X3, X4, X5, X(5 i Z i celi brojevi m i n imaju značenje kao što je definisano u WO 97/40070, objavljenoj 30. oktobra, 1997. Xaa i Yaa su definisani u WO 98/09985, objavljenoj 12. marta, 1998. AAi, AA2, AB\, AB2, i AC su kao što je definisano u međunarodnoj prijavi WO 98/53842, objavljenoj 3. decembra, 1998. X<l>, X<2>, x<3>, i x4 samo u Tabeli 17, definisani su u evrospkoj aplikaciji EP 0 911 393, objavljenoj 28. aprila, 1999. Ostaci koji su označeni masnim slovima predstavljaju D-amino kiseline. Svi peptidi su povezani peptidnim vezama ukoliko nije drugačije specifikovano. Lista skraćenica data je na kraju ove specifikacije. U koloni "SEQ ID NO.", "NR" označava da za daru sekvencu nije potrebna lista sekvenci.

[0150]Osim TMP jedinjenja predstavljenih u Tabeli 6, u okviru ovog pronalaska je moguće primeniti brojna druga TMP jedinjenja. U jednom aspektu, TMP jedinjenja obuhvataju sledeću opštu strukturu: naznačeno time da su TMPii TMP2nezavisno izabrani iz grupe jedinjenja zajedničke strukture:

naznačeno time daje,

X2izabran iz grupe koju čine Glu, Asp, Lys, i Val;

X3je izabran iz grupe koju čine Gly i Ala;

X4 je Pro;

X5izabran iz grupe koju čine Thr i Ser;

X6je izabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala i Phe;

X7je izabran iz grupe koju čine Arg i Lys;

Xg je izabran iz grupe koju čine Gln, Asn, i Glu;

X<g>je izabran iz grupe koju čine Trp, Tyr, i Phe;

Xio je izabran iz grupe koju čine Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met i Lys;

LI je linker, kao stoje prethodno opisano; i

nje 0 ili 1;

i njihove fiziološki prihvatljive soli.

[0151]U jednom obliku izvođenja, Li uključuje (Gly)n, naznačeno time da n ima vrednosti 1 do 20, i da u slučajevima kada je n veće od 1, do polovine ukupnog broja Gly ostataka može biti supstituisano nekom drugom amino kiselinom, izabranom između preostalih 19 prirodnih amino kiselina ili njihovih stereoizomera.

[0152]Osim središnje dela X2-Xiq, čija je struktura prethodno navedena za TMPi i TMP2, moguće su i druge slične strukture, naznačene time daje na središnju strukturu dodato jedan ili više elemenata TMPi i/m TMP2: Xj je vezan za N-terminus i/ili Xi 1, Xi 2, Xi 3, i/iliX\4su vezani za C-terminus, naznačeno time da X\, X\ 2, Xi 3, iX\ 4imaju naredna značenja: X\je izabran iz grupe koju čine Ile, Ala, Val, Leu, Ser i Arg;

Xi 1 je izabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His i Glu;

X\ 2 je izabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser i Gln;

X\3je izabran iz grupe koju čine Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln i Gly; i

Xi4 je izabran iz grupe koju čine Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu i Gly.

[0153J TMP jedinjenja koje se mogu koristiti u okviru predmetnog pronalaska, sačinjena su od, odnosno, sadrže, najmanje 9 podjedinica (X2-Xi o), naznačeno time da X2-Xi o uključuje centralni deo strukture. Podjedinice X2-Xi4su amino kiseline nezavisno izabrane između 20 prirodnih amino kiselina, međutim pronalazak obuhvata jedinjenja u kojima su X2-Xj4nezavisno izabrane iz grupe atipičnih, ne-prirodnih amino kiselina, poznatih u stanju tehnike. Za svaku poziciju identifikovane su specifične amino kiseline. Na primer, X2može biti Glu, Asp, Lys ili Val. Ovde se koriste i trošiovne i jednoslovne skraćenice za označavanje amino kiselina; u oba slučaja, koriste se standardne skraćenice za 20 prirodnih amino kiselina ili za njihove dobro poznate varijante. Te amino kiseline mogu biti u L ili D stereohemiji (sa izuzetkom Gly, koja nije ni L ni D) i TMP (kao i ostala jedinjenja saglasno pronalasku) mogu sadržati kombinaciju stereoizomera. Pronalazak takođe obezbeđuje obrnute TMP molekule (kao i sve ostale peptide obelodanjene ovim pronalaskom), naznačene obrnutim redosledom sekvence od amino-terminalnog do karboksi-terminalnog kraja. Na primer, obrnuti molekul čija je normalna sekvenca Xj-X2-X3imaće sekvencu X3-X2-Xi. Pronalazak takođe obezbeđuje retro-obrnute TMP molekule (sve druge molekule obelodanje pronalaskom), naznačene time da kao i obrnuti TMP, redosled amino kiselina od amino-terminalnog do karboksi-terminalnog kraja je obrnut, a ostaci koji su inače kod normalnog peptida "L" enatiomeri u retro-obrnuom TMP peptidu su "D" stereoizomerne forme.

[0154] Primeri TMP jedinjenja koji se mogu primeniti saglasno pronalasku stoga uključuju, bez ograničenja, naredna jedinjenja:

Derivati

[0155]Pronalazak takođe predviđa deriviranje peptida i/ili nosačkog dela molekula (kao što će biti opisano). Ovakvi derivati mogu poboljšati rastvorljivost, apsorpciju, biološki poluživot i slična svojstva jedinjenja. Ovi delovi mogu takođe ukloniti ili ublažiti neželjene i druge slične efekte jedinjenja. Reprezentativni primeri derivata obuhvataju jedinjenja u kojima:

1. Jedinjenje ili neki njegov deo je cikličan. Na primer, peptidni deo molekula može biti modifikovan tako da sadrži dva ili cisteinska ostatka (na primer, u vezniku), koja mogu da se cikliziraju formiranjem disulfidne veze. Za detalje pripreme cikličnih derivata, videti Tabelu 2. Jedinjenje je unakrsno povezano ili osposobljeno da se unakrsno veže sa molekulima. Na primer, peptidni deo može biti modifikovan tako da sadrži jedan Cys ostatak i time da bude sposoban da formira međumolekulsku disulfidnu vezu sa nekim sličnim molekulom. Jedinjenje se takođe može unakrsno vezati preko svog C-terminusa, kao što je prikazano u narednom molekulu.

3. Jedan ili više peptidnih [-C(0)NR-] spojeva (veza) zamenjeno je ne-peptidnim

vezama. Reprezentativne ne-peptidne veze su -CH2-karbamat [-CH2-OC(0)NR-], fosfonat, -CH2-sulfonamid [-CH2-S(0)2NR-], urea [-NHC(0)NH-], -CH2-sekundarni amin i alkilovani peptid [-C(0)NR6-, naznačeno time da je R6 niži alkil].

4. N-terminus je izmenjen. N-terminus se najčešće aciluje ili modifikuje u supstituisani

amin. Reprezentativni primeri derivirajućih grupa na N-terminusu obuhvataju -NRR1 (sa izuzetkom -NH2), -NRC(0)R1, -NRC(0)ORl, -NRS(0)2R1, -NHC(0)NHR1, sukcinimid, ili benziloksikarbonil-NH-(CBZ-NH-), naznačeno time da su R i Rl nezavisno jedan od drugog vodonik ili niži alkil i naznačeno time da fenilni prsten može biti supstituisan jednim do tri supstituenta, izabranim iz grupe koju čine C1-C4 alkil, Cl-C4 alkoksi, hloro; i bromo.

5. Slobodni C-terminus je izmenjen. C-terminus se može esterifikovati ili amidovati. Na primer, moguće je primeniti postupke opisane u stanju tehnike kojim se supstituent (NH-

CH2-CH2-NH2)2dodaje jedinjenjima saglasno ovom pronalasku. Slično tome, moguće je primeniti postupke opisane u stanju tehnike kako bi se dodala -NH2 grupa jedinjenjima saglasno pronalasku. Reprezentativni primeri C-terminalnih derivacionih grupa obuhvataju, na primer, -C(0)R2 naznačeno time da je R2 niži alkoksi ili -NR3R4, naznačeno time da su R3 i R4 nezavisno jedan od drugog, vodonik ili C1-C8 alkil (poželjno C1-C4 alkil).

6. Disulfidna veza se zamenjuje drugom, poželjno stabilnijim unakrsno vezujućim delom

(na primer, neki alkilen). Videti, na primer, Bhatnagar i sar., (1996), J. Med. Chem. 39:

3814-9; Alberts i sar., (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9.

7. Modifikuje se jedna ili više pojedinačnih amino kiselina. U stanju tehnike poznati su

brojni derivirajući agensi koji specifično reaguju sa izabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima, kao što je detaljno opisano kasnije.

8. Za vezivanje proteina tipično se primenjuju heterobifunkcionalni polimeri. Primer je

SMCC ili sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-l-karboksilat. NHS deo (N-hiroksil-sukcinimid) reaguje sa primarnim aminima, čija se konjugacija optimalno odvija na pH~7. Kada se formira kompleks, reakcija maleimidskog dela SMCC može da se nastavi sa drugim proteinom/peptidom koji sadrži slobodnu sulfhidrilnu grupu, što se odvija mnogo većom brzinom od formiranja amida u inicijalnoj reakciji. Rezultat je veza između dva proteina, na primer, konjugat antitelo-enzim. Primena je ilustrovana pripremom unakrsno vezanih Fab' fragmenata za peroksidazu rena (Ishikwa, i sar., 1983a,b; Yoshitake i sar., 1982 a,b; Imagawa i sar., 1982; Uto i sar., 1991). Primena sulfo SMCC (Sulfosukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cicloheksan-1 -karboksilat) obezbeđuje rastvorljivost u vodi, tako da nije neophodan korak organske solubilizacije, što dalje omogućava veću fleksibilnost i manji gubitak aktivnosti u reakciji sa proteinima.

[0156]Reakcija ćilibarne kiseline i anhidrida drugih karboksilnih kiselina sa lizinskim i aminokiselinskim ostacima, menja naelektrisanje lizinskih ostataka. Ostali pogodni reagensi za izmenu ostataka koji sadrže alfa-amino grupu su imidoestri, kao što je metil-pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hloroborohidrid; trinitrobenzen-sulfonska kiselina; O-metil-izourea; 2,4 pentanedion; i transaminazama-katalizovana reakcija sa glioksilatom.

[0157]Ostaci arginina mogu se modifikovati u reakciji sa jednim ili više konvencionalnih reagenasa, kao što su fenil-glioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidron. Derivacija argininskih ostataka zahteva alkalne uslove reakcije, zbog visoke pKa vrednosti guanidinske funkcionalne grupe. Takođe, svi navedeni reagensi reaguju sa grupama lizina, kao i epsilon-amino grupom arginina.

[0158]Specifične modifikacije tirozinskih ostataka široko su izučavane, sa posebnim interesom za uvođenje spektralnih obeležja u tirozinske ostatke, reakcijom sa aromatičnim diazonijumskim jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se koriste N-acetilimidizol i tetranitrometan da bi se dobile O-acetil tirozilske vrste, odnosno, 3-nitro derivati.

[0159]Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) mogu se selektivno modifikovati reakcijom sa karbo-di-imidima (R'-N=C=N-R'), kao što je l-cikloheksil-3-(2-morfolinil-(4-etil) karbodiimid ili l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) karbo-di-imid. Takođe, aspartilski i glutamilski ostaci mogu se konvertovati u asparaginil i glutaminilske ostatke, reakcijom sa amonijumovim jonima.

[0160]Glutaminilski i asparaginilski ostaci mogu se deamidovati do odgovarajućih glutamil i aspartil ostataka. Ove amino-kiselinske ostatke je moguće deamidovati pod blago kiselim uslovima. Svi potpadaju pod domen predmetnog pronalaska.

[0161]Cisteinil ostaci se mogu zameniti drugim amino-kiselinskim ostacima ili grupama, kako bi se eliminisalo disulfidno vezivanje ili, kako bi se stabilizovala unakrsna veza. Videti, na primer, Bhatnagar i sar., (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9.

[0162]Derivacija bifunkcionalnim agensima korisna je za unakrsno povezivanje peptida ili njihovih funkcionalnih derivata za hidro-solubilni potporni matriks ili za druge makromolekulske nosače. Uobičajeni agensi za unakrsno povezivanje obuhvataju, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimid estre, na primer, estre sa 4-azido-salicilnom kiselinom, homobifunkcionalnim imidoestrima, uključujući disukcinimidil estre, kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidil-propionat) i bifunkcionalne maleimide, kao što je bis-N-maleimid-l,8-oktan. Derivirajući agensi kao što su metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat daju fotoaktivirajuće intermedijere, sposobne da uspostave unakrsne veze na svetlosti. Nasuprot tome, za imobilizaciju proteina primenjuju se reaktivni hidro-solubilni matriksi, kao što su cijanogen-bromidom aktivirani ugljenihidrati i reaktivni supstrati opisani u U.S. Pat. pod brojevima 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440.

[0163]Ugljenohidratne (oligosaharidne) grupe mogu se vezati sa mesta za koja je poznato da predstavljaju mesta glikozilacije u proteinima. Načelno, O-vezani oligosaharidi vezuju se za serinske (Ser) ili treoninske (Thr) ostatke, dok su N-vezani oligosaharidi vezani za asparaginske (Asn) ostatke, kada je Asp deo sekvence Asn-X-Ser/Thr, u kojoj X može biti bilo koja amino kiselina osim prolina. Poželjno je da je X jedna od 19 prirodnih amino kiselina, sa izuzetkom prolina. Strukture N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i šećera se razlikuju. Šećer koji se najčešće nalazi u oba tipa vezanih molekula je N-acetil-neuraminska kiselina (pozanta i kao sijalinska kiselina). Sijalinska kiselina se često javlja kao terminalni ostatak N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i usled negativnog naelektrisanja koje nosi, ona uslovljava kisela svojstva glikozilovanih jedinjenja. Ovo mesto(a) može se ugraditi u veznik jedinjenja saglasno pronalasku i poželjno je da se glikoziluje u ćeliji tokom rekombinantne produkcije polipeptidnih jedinjenja (na primer, u sisarskim ćelijama, kao što su CHO, BHK, COS). Međutim, ova mesta mogu dodatno biti glikozilovana sintetskim ili polu-sintetskim postupcima poznatim u stanju tehnike.

[0164]Ostale moguće modifikacije obuhvataju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilne grupe serilskog ili treonilskog ostatka, oksidaciju atoma sumpora u Cys, metilaciju alfa-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), str. 79-86 (1983).

[0165]Jedinjenja saglasno pronalasku mogu se takođe, izmeniti na nivou DNK. Sekvenca DNK bilo kog dela jedinjenja može se izmeniti kodonima koji su kompatibilniji sa izabranom ćelijom domaćina. ZaE. coli,koja je poželjni domaćin, optimizovani kodoni su poznati u stanju tehnike. Kodoni se mogu supstituisati kako bi se eliminisala restrikciona mesta ili kako bi se oformila tiha restrikciona mesta, koja mogu da poboljšaju obradu DNK u izabranom domaćinu. Nosač, veznik i DNK sekvenca izabranog peptida mogu se modifikovati tako da uključe bilo koju od prethodno spomenutih izmena sekvence.

[0166]Izotopima i toksinima konjugovani derivati. Još jedna grupa poželjnih derivata su prethodno opisani molekuli konjugovani za toksine, obeleživače ili radioizotope. Ove konjugacije su naročito pogodne za molekule koji obuhvataju peptidne sekvence koje se vezuju za tumorske ćelije ili patogene. Ovi molekuli se mogu koristiti kao terapeutski agensi ili kao pomoć pri hirurškim intervencijama (na primer, radioimunvođena hirurgija ili RIGS) ili kao dijagnostički agensi (na primer, radioimunodijagnostici ili RID).

[0167]Kao terapeutski agensi, ovi konjugovani derivati poseduju brojne prednosti. Oni olakšavaju primenu toksina i radioizotopa, koji bi bili toksični kada bi se administrirali nepovezani za peptidne sekvence. Oni takođe mogu da smanje neželjene efekte koji se javljaju tokom primene radijacije i hemoterapije, jer omogućavaju smanjenje efektivne doze konjugacionog partnera.

[0168]Pogodni konjugacioni partneri obuhvataju: • radioizotope, kao što je 90 Itrijum, 131 Jod, 225 Aktinijum, i<213>Bizmut; • ricin A toksin, toksin poreklom od mikroba, kao što je Pseudomonas endotoxin (na primer, PE38, PE40) i slični; • partnerski molekuli u sistemu za hvatanje (vidi kasnije); • biotin, streptavidin (korisni kao partnerski molekuli u sistemu hvatanje ili kao obeleživači, naročito u dijagnostičkoj primeni); i

• citotoksični agensi (na primer, doksorubicin).

[0169]Jedna korisna adaptacija ovih konjugovanih derivata je primena u sistemu za detekciju i oslikavanje. U ovakvom sistemu molekul saglasno pronalasku obuhvata neki neškodljiv "hvatački" molekul. Taj deo molekula specifično se vezuje za drugi efektorski molekul, kao što je na primer, neki toksin ili radioizotop. Pacijent prima i molekul konjugovan sa nosačem i efektorski molekul. U takvom sistemu efektorski molekul ima kratak vek trajanja, osim kada je vezan za hvatački molekul konjugovan sa nosačem, čime se umanjuju toksični neželjeni efekti. Molekul konjugovan sa nosačem ima relativno dug polu-život, ali je neškodljiv i ne-toksičan. Vezujući delovi oba molekula mogu biti delovi poznatih vezujućih parova (na primer, biotin, streptavidin) ili se mogu dobiti postupcima sinteze peptida, kao što je ovde opisano.

[0170]Konjugovani derivati mogu se dobiti postupcima poznatim u stanju tehnike. U slučaju proteinskih efektornih molekula (na primer, Pseudomonas endotoxin), ovi molekuli se mogu eksprimirati kao fuzioni proteini od odgovarajućih DNK konstrukata. Derivati konjugovani sa radioizotopima mogu se dobiti, na primer, postupkom koji je opisan za BEXA antitelo (Coulter). Derivati koji uključuju citotoksične agense ili mikrobijalne toksine mogu se dobiti, na primer, kao što je opisano za BR96 antitelo (Bristol-Myers Squibb). Molekuli koji se primenjuju u sistemima za detekciju mogu se dobiti na primer, postupkom koji je opisan patentima, patentnim prijavama i publikacija od NeoRx. Molekuli koji se primenjuju za RIGS i RID mogu se dobiti, na primer, postupcima koji su opisani patentima, patentnim prijavama i publikacijama od NeoProbe.

Nosači

[0171]Pronalazak zahteva prisustvo najmanje jednog nosača vezanog za peptid preko N-terminusa, C- terminusa ili bočnog lanca jednog od aminokiselinskih ostataka. Moguće je primeniti više nosača. U jednom aspektu, Fc domen je nosač. Fc domen se može fuzionisati za N ili C krajeve peptida ili i na N i na C krajeve.

[0172]U različitim oblicima izvođenja pronalaska, Fc komponenta je nativni Fc ili neka varijanta Fc. Imunoglobulinski izvor nativnog Fc je, u jednom aspektu, humanog porekla i može, u drugim oblicima izvođenja, biti iz bilo koje klase imunoglobulina. Nativni Fc domeni su izgrađeni od monomernih polipeptida koji se mogu povezati u dimerne i multimerne forme, kovalentnim (odnosno, disulfidnim vezama) i/ili ne-kovalentnim vezama. Broj intermolekulskih disulfidnih veza između monomernih podjedinica nativnih Fc molekula kreće se od jednog do četiri zavisno od klase (na primer, IgG, IgA, IgE) ili podklase (na primer, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Primer nativnog Fc je disulfidno povezan dimer koji nastaje digestijom IgG pomoću papaina (videti, Ellison i sar., (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9).

[0173]Treba naglasiti da monomeri Fc sponatno dimerizuju kada su prisutni odgovarajući cisteinski ostaci, osim u specifičnim uslovima koji sprečavaju dimerizaciju fomiranjem disulfidnih veza. Čak i ako se uklone cisteinski ostaci koji normalno formiraju disulfidnu vezu u Fc dimeru ili se oni zamene drugim ostacima, monomerni lanci će formirati dimer putem nekovalentnih interakcija. Termin "Fc" ovde je primenjen u svim narednim značenjima: nativni monomer, nativni dimer (povezan disulfidnom vezom), modifikovani dimeri (povezani disulfidno i/ili nekovalentno) i modifikovani monomeri (odnosno, derivati).

[0174]Kao što je rečeno, varijante Fc su pogodni nosači unutar domena predmetnog pronalaska. Nativni Fc može se veoma široko modifikovati kako bi se dobila varijanta Fc, pod uslovom da se očuva vezivanje za spasonosni receptor; videti na primer, WO 97/34631 i WO 96/32478. Kod ovakvih varijanti Fc, moguće je ukloniti jedno ili više mesta za nativni Fc koja obezbeđuju strukturne odlike ili funkcionalnu aktivnost koja nije potrebna fuzionim molekulima iz ovog pronalaska. Ova mesta je moguće ukloniti, na primer, supstitucijom ili deletiranjem ostataka, insertovanjem ostataka na određeno mesto, ili skraćivanjem dela koji sadrži mesto. Insertovani ili supstituisani ostaci mogu biti izmenjene amino kiseline, kao što su peptidomimetici ili D-amino kiseline. Varijante Fc mogu biti korisne zbog brojnih razloga, od kojih je nekoliko ovde opisano. Reprezentativni primeri varijanti Fc obuhvataju molekule i sekvence u kojima: 1. Uklonjena su mesta uključena u formiranje disulfidnih veza. Ovim uklanjanjem se izbegava reakcija sa drugim cistein-sadržućim proteinima koji su prisutni u ćeliji-domaćinu koja se koristi za proizvodnju molekula saglasno pronalasku. Za ove potrebe, može se iseći segment na N-terminusu koji sadrži cistein ili se cisteinski ostatak može deletirati ili supstituisati drugom amino kiselom (na primer, alanil, seril).

Čak i kada se uklone cisteinski ostaci, jednolančani Fc domeni i dalje mogu da formiraju dimerni Fc domen koji se drži na okupu neko valentnom vezom.

2. Nativni Fc se modifikuje kako bi postao kompatibliniji izabranom domaćinu. Na

primer, moguće je ukloniti PA sekvencu sa N-terminusa tipičnog nativnog Fc, koja može biti prepoznata od strane digestivnog enzima u E. coli, kao što je prolin iminopeptidaza. Moguće je dodati metioninski ostatak na N-terminus, naročito kada se molekul eksprimira rekombinantno u baketrijama, kao što je E. coli.

3. Deo N-terminusa nativnog Fc se uklanja kako on ne bi bio različiti u odnose druge

N-terminuse u izabranoj ćeliji-domaćinu. Za ove svrhe, moguće je deletirati bilo koju od prvih 20 amino-kiselinskih ostataka na N-terminusu, naročito one na pozicijama 1, 2, 3, 4 i 5.

4. Uklanja se jedno ili više mesta glikozilacije. Ostaci koji su najčešće glikozilovani

(na primer, asparagin) mogu da izazovu citolitički odgovor. Ovi ostaci se mogu deletirati ili supstituisati neglikozilovanim ostacima (na primer, alaninom).

5. Uklanjaju se mesta uključena u interakcije sa komplementom, kao što su C1q

vezujuće mesto. Na primer, moguće je deletirati ili supstituisati EKK sekvencu humanog IgGl. Regrutacija komplementa nije poželjna za molekule u okviru ovog pronalaska, pa se može izbeći ovakvom varijantom Fc.

6. Uklanjaju se mesta koja učestvuju u vezivanju za Fc receptore, osim za spasonosni

receptor. U nativnom Fc nalaze se mesta preko kojih se ostvaruje interakcija sa određenim klasama belih krvnih ćelija, a koja nisu potrebna fuzionim molekulima saglasno pronalasku, pa se ta mesta mogu ukloniti.

7. Uklanjanju se ADCC mesta. ADCC mesta su poznata u stanju tehnike; videti, na

primer, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) u vezi sa ADCC mestima na IgGl. Ova mesta, takođe nisu poželjna u fuzionim molekulima saglasno pronalasku, pa se mogu ukloniti.

8. Kada se nativni Fc dobija iz antitela koje nije poreklom od čoveka, taj nativni Fc se

može humanizirati. Tipično, da bi se humanizirani nativni Fc, moguće je supstituisati izabrane ostatke u nativnom Fc ne-humanog porekla, ostacima koji se normalno nalaze u humanim nativnim Fc. Postupci humaniziranja dobro su poznati u stanju tehnike.

[0175] Alternativni nosač je protein, polipeptid, peptid, antitelo, fragment antitela ili mali molekul (na primer, peptidomimetičko jedinjenje), sposobno da se veže za spasonosni receptor. Na primer, nosač može da bude polipeptid, kao što je opisano u U.S. Pat. No. 5,739,277, obelodanjen 14. aprila 1998, od Presta i sar. Izlaganjem u fagu peptidi se selektuju za vezivanje za FcRn spasonosni receptor. Ovakva jedinjenja koja vezuju spasonosni receptor takođe su obuhvaćena značenjem termina "nosač" i potpadaju pod domen predmetnog pronalaska. Nosači ovog tipa produžavaju polu-život (na primer, tako što sprečavaju prepoznavanje sekvence od strane proteaza) i smanjuju imunogenost (na primer, favorizujući ne-imunogene sekvence, kao što je otrkiveno kod humaniziranih antitela).

[0176]Variante, analozi ili derivati Fc dela mogu se konstruisati, na primer, supstitucijama amino kiselina unutar sekvence.

[0177]Varijante (ili analogni) polipeptida obuhvataju insercione varijante, naznačene time da je jedna ili više amino kiselina pridodata u amino-kiselinsku sekvencu Fc. Insercije se mogu uvesti na oba kraja tog proteina, ili se mogu naći unutar integralnih regiona Fc amino-kiselinske sekvence. Insercione variante, sa dodatnim ostacima na oba terminusa, mogu da obuhvate na primer, fuzione proteine i proteine koji imaju markirane ili označene amino-kiseline. Na primer, Fc molekul može opciono da sadrži Met na N-terminusu naročito kada se molekul rekombinantno eksprimira u bakterijskoj ćeliji, kao što je E. coli.

[0178]U Fc delecionim varijantama, iz Fc polipeptida se uklanja jedan ili više amino-kiselinskih ostataka. Delecije se mogu izvesti na oba kraja Fc polipeptida ili se mogu ukloniti ostaci unutar sekvence Fc. Delecione varijante, dakle, obuhvataju sve fragmente Fc polipeptidne sekvence.

[0179]U Fc supstitucionim varijantama, jedan ili više amino-kiselinskih ostataka Fc polipeptida se uklanja i zamenjuje drugim ostacima. U jednom aspektu, supstitucije su konzervativne prirode, a konzervativne supstitucije su dobro poznate u stanju tehnike. Pronalazak obuhvata ne-i konzervativne supstitucije. Reprezentativni primeri konzervativnih supstitucija opisani su u Lehninger, [Biochemistrv, 2nd Edition; Worth Publishers, hic.New York (1975), pp.71-77] i predstavljeni odmah ispod.

[0180]Reprezentativni primeri konzervativnih supstitucija predstavljeni su u tekstu koji sledi.

[0181]Na primer, cisteinski ostaci mogu se deletirati ili zameniti drugim amino kiselinama, kako bi se onemogućilo formiranje nekih ili svih unakrsnih disulfidnih veza te Fc sekvence. Cisteinski ostatak se može se ukloniti i/ili može se zameniti nekom drugom amino kiselinom, kao što su, Ala ili Ser. Modifikacije se mogu izvesti supstitucijom amino kiselina, kako bi se (1) uklonilo vezujuće mesto Fc receptora; (2) uklonilo vezujuće mesto komplementa (Clq); i/ili da bi se (3) uklonilo mesto odgovorno za ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC). Ova mesta su poznata u stanju tehnike i sve poznate supstitucije pripadaju domenu predmetnog pronalaska. Na primer, videti Molecular Immunologv, Vol. 29, No. 5, 633-639

(1992) u odnosu na ADCC mesta u IgGl.

[0182] Slično tome, jedan ili više tirozinskih ostataka može se zameniti ostacima fenilalanina. I ostale varijante insercija, delecija i/ili supstitucija amino kiselina su predviđene i spadaju u domen predmetnog pronalaska. Načelno, poželjne su konzervativne amino-kiselinske supstitucije. Promene je moguće uvesti u vidu izmenjenih amino kiselina, kao što su peptidomimetici ili D-amino kiseline.

[0183]Fc sekvence jedinjenja mogu se promeniti na sličan način kao što je već opisano za peptide, odnosno, modifikacijama koje nisu insercije, delecije ili supstitucije amino-kiselinskih ostataka. Poželjno je da su modifikacije kovalentne i da obuhvataju hemijsko vezivanje sa polimerima, lipidima, drugim organskim i neorganskim grupama. Ovi derivati se dobijaju sa ciljem da im se poveća polu-život u cirkulaciji, a mogu se konstruisati sa ciljem da povećanja afiniteta prema prema željenim ćelijama, tkivima ili organima.

[0184]Fc deo molekula predmetnog pronalaska može biti i vezujući domen spasonosnog receptora intaktnog Fc molekula, kao što je opisano u WO 96/32478, pod nazivom "Altered Polypeptides with Increased Half-Life." ("Lzmenjeni polipeptidi sa produženim poluživotom"). Dodatni članovi klase molekula koja je ovde označena kao Fc su oni koji su opisani u WO 97/34631, pod nazivom "Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives." ("Imunoglobilinima-slični domeni sa produženim polu-životom").

WSPkomponente

[0185]Jedinjenja saglasno pronalasku mogu dalje da obuhvate najmanje jedan WSP. Ovakav WPS deo molekula može biti razgranat ili nerazgranat. Za pripremu krajnjeg proizvoda za potrebe terapeutske primene, polimer mora biti farmaceutski prihvatljiv. Načelno, željeni polimer se pre svega bira na osnovu toga da li će konjugat polimera biti korišćen u terapeutske svrhe, a ukoliko je tako, uzimaju se u obzir željena doza, vreme cirkulacije, rezistencija na proteolizu i druga razmatranja. U različitim aspektima, prosečna molekulska masa hidrosolubilnog polimera je između 2 kDa i oko 100 kDa, između oko 5 kDa i oko 50 kDa, između 12 kDa i oko 40 kDa i između 20 kDa i oko 35 kDa. U narednom aspektu molekulska masa svakog polimera je između 6 kDa i oko 25 kDa. Termin "oko" u značenju koje je ovde primenjeno, ukazuje da će u preparatima hidrosolubilnog polimera, neki molekuli imati veću, a neki manju molekulsku masu od one koja je naznačena. Načelno govoreći, što je veća molekulska masa ili što je više ogranaka, veći je odnos polimer/protein. Moguće je primeniti i druge veličine molekula, zavisno od željenog terapeutskog profila, koji uključuje, na primer, vreme odloženog oslobađanja; efekti, ukoliko ih ima, na biološku aktivnost; lakoća rukovanja; stepen ili nedostatak antigenosti ili drugi poznati efekti hidrosolubilnog polimera na terapeutski protein.

[0186]Trebalo bi da je WSP vezan za polipeptid ili peptid, imajući u vidu date efekte na funkciju ili antigene domene polipeptida ili peptida. Načelno, hemijske promene se mogu izvesti pod svim pogodnim uslovima za reakciju proteina sa aktiviranim polimernim molekulom. Aktivirajuće grupe obuhvataju, bez ograničenja sulfonsku, maleimidnu, sulfhidrilnu, tiolnu, triflatnu, trezilat, azidirin, oksiran i 5-piridil. Ako je vezan za peptid redukcionom alkilacijom, izabrani polimer treba da ima jedan reaktivni aldehid, čime se kontroliše stepen polimerizacije.

[0187]Pogodni, klinički prihvatljivi hidrosolubilni polimeri obuhvataju, bez ograničenja, PEG, polietilen glikol propionaldehid, kopolimer etilen glikola/propilen glikol, monometoksi-polietilen glikol, karboksimetil-celuloza, poliacetali, polivinil alkohol (PVA), polivinil pirolidon, poli-l,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleid anhidrid, poli (beta-amino kiseline) (bilo homopolimeri ili nasumični kopolimeri), poly(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere (PPG) i druge polialkilen oksidi, polipropilen oksid/etilen oksidni kopolimeri, polioksietilovani polioli (POG) (na primer, glicerol) i drugi polioksietilovani polioli, polioksietilovani sorbitol, ili polioksietilovana glukoza, kolonska kiselina i drugi ugljeno-hidratni polimeri, Fikol ili dekstran i njihove smeše.

[0188]Hidrosolubilni polimeri mogu se načiniti da budu termo-senzitivni, kao kod formiranja gelova sa reverznom toplotnom zavisnošću. Primeri obuhvataju Tetronike, sa tetra-armiranom osnovama i PEG-PLGA kopolimere. Hidrofilnost ovih polimera može se varirati supstituisanjem hidrofobnih delova lanca polimera. Na primer, menjanjem odnosa mlečne prema glikolnoj kiselini prilikom proizvodnje PLGA, moguće je dobiti polimere sa manjom rastvorljivošću u vodi. Manje rastvorljivi polimeri poželjni su nekim aplikacijama, na primer, kada je potrebno povećati potencijalne interakcije sa ćelijskom membranom. Formiranje micela ili lipozoma u rastvoru nakon rekonstitucije moguće je indukovati izborom odgovarajućeg odnosa fosfolipida. U ovakvom sistemu moguće je obuhvatiti proteine unutar micele, što potencijalno predstavlja mogućnost odloženog oslobađanja. Fosfolipidi koji mogu da formiraju lipozome ili micele uključuju DMPG, DMPC, DOPC, DOPG i odgovarajuće sekundarne komponente koje olakšavaju formiranje lipozoma, kao što je holesterol. Neke pomoćne materije, kao što je DEA olet-10 fosfat i olet 10-fosfat, sposobne su da formiraju micele u rastvoru.

[0189]Polisaharidni polimeri su naredni tip hidrosolubilnih polimera koji se mogu primeniti u modifikaciju proteina ili peptida. Modifikovanje proteina ili peptida dodavanjem polisaharida, na primer, glikozilacijom, može da poveća polu-život, smanji antigenost, poveća stabilnost i smanji proteolizu. Dekstrani su polisaharidni polimeri koji obuhvataju pojedinačne podjedinice glukoze prevashodno vezane al-6 vezama. Sam dekstran je dostupan u širokom opsegu molekulskih masa, od oko 1 kD do oko 70 kD. Dekstran je pogodan hidrosolubilan polimer koji u kontekstu predmetnog pronalaska može da se primeni kao nosač, samostalno ili u kombinaciji sa drugim nosačem (na primer, Fc). Videti, na primer, WO 96/11953 i WO 96/05309. Ranije je prikazana primena dekstrana konjugovanog za terapeutske ili dijagnostičke imunoglobuline; videti, na primer, Evropsku patentnu publikaciju broj 0 315 456. Kada se dekstran koristi kao nosač saglasno predmetnom pronalasku, poželjno je ima molekulsku masu od oko 1 kD do oko 20 kD.

[0190]U jednom obliku izvođenja, WSP je PEG i pronazak predviđa preparate, naznačene time daje jedinjenje modifikovano tako da obuhvati bilo koju formu PEG koja je primenjena za derivaciju drugih proteina, kao što su, bez ograničenja, mono-(Cl-ClO) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikoli. Polietilen-glikol propionaldehid može biti poželjan proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. PEG grupe mogu biti bilo koje molekulske težine i mogu biti linearne ili razgranate. Prosečna molekulska težina PEG predviđena za primenu u okviru pronalaska, kreće se u opsegu od oko 2 kDa do oko 100 kDa, od oko 5 kDa do oko 50 kDa, od oko 5 kDa do oko 10 kDa. U narednom aspektu, PEG delovi imaju molekulsku masu od oko 6 kDa do oko 25 kDa. PEG grupe mogu se vezati za peptide ili proteine, acilalovanjem ili redukcionom alkilacijom preko reaktivnih grupa na ciljne peptide ili proteine (na primer, aldehid, amino, ili estarska grupa). Primenom opisanih postupaka može se dobiti smeša polimer/peptid konjugovanih molekula, a postupak predviđa mogućnost izbora proporcije polimera i peptidnog konjugata koja će se uključiti u smešu. Stoga, ako je poželjno, smeša peptida sa različitim brojem vezanih polimernih delova (to jeste, nula, jedan ili dva) može se dobiti sa prethodno određenom proporcijom polimer/proteinski konjugat.

[0191]Pogodna strategija za PEGilaciju (ostali postupci su ovde detaljno opisani) sintetičkih peptida sastoji se od spajanja peptida i PEG dela, formiranjem njihovog konjugata u rastvoru, pri čemu oba dela uzajamno reaktivna, ispoljavaju svoju aktivnost jedan prema drugom. Peptidi se lako dobij aju primenom konvencionalne sinteze u čvrstoj fazi. Peptidi su "prethodno aktivirani" odgovarajućom funkcionalnom grupom na specifičnom mestu. Prekursori su prečišćeni i potpuno okaraktersiani pre reakcije sa PEG delom. Ligacija peptida i PEG najčešće se odvija u vodenoj fazi i može se lako kontrolisati reverzno-faznom analitičkom HPLC hromatografijom. PEGilovani peptidi lako se prečišćavaju preparativnom HPLC i mogu se okarakterisati primenom postupaka analitičke HPLC, analizom amino kiselina i laserskom desoprcionom masenom spektroskopijom.

Veznici

[0192]Po potrebi je moguće primeniti svaku "veznu" grupu, bilo da je ona pozicionirana između peptida, peptida i nosača ili nosača i WSP. Hemijska struktura veznika nije kritično važna, jer on prvenstveno služi kao razmizač. Poželjno je da je veznik sačinjen od amino kiselina međusobno povezanih peptidnim vezama. Stoga je, u poželjnim oblicima izvođenja, veznik sačinjen od 1 do 20 amino kiselina povezanih peptidnim vezama, naznačeno time da su amino kiseline izabrane iz grupe 20 prirodnih amino kiselina. Kao što je poznato u stanju tehnike, neke od ovih amino kiselina mogu biti glikozilovane. U poželjnijim oblicima izvođenja, 1 do 20 amino kiselina može biti izabrana između glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. Još je poželjnije da je veznik pretežno sačinjen od amino kiselina koje su stereoizomerno nisu ograničene, kao što su glicin i alanin. Stoga su poželjni veznici poliglicini (naročito (Gly)4, (Gly)5, (Gly)8, poly(Gly-Ala) i polialanini. Ostali specifični primeri veznika su: (Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 1018);

(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 1019);

(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO: 1020); i

GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 1021).

[0193]Kao objašnjenje prethodne nomenklature, na primer, (Gly)3Lys(Gly)4 označava Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Takođe su poželjne kombinacije Gly i Ala. Veznici koji su ovde prikazani samo su reprezentativni; veznici u okviru ovog pronalaska mogu biti znatno duži i mogu sadržati i druge ostatke. [0194JMogući su i ne-peptidni veznici. Na primer, alkil veznici, kao što je -NH-(CH2)s-C(O)- naznačeni time da je s = 2-20. Ovi alkilni linkeri mogu dodatno biti supstituisani nekom sterično ne-ograničavajućom grupom, kao što je neki niži alkil (na primer, C1-C6) niži acil, halogen (na primer, Cl, Br), CN, NH2, fenil i td. Primer ne-peptidnog veznika je PEG,

naznačen time da je vrednost n takva da veznik ima molekulsku masu od 100 do 5000 kD, poželjno od 100 do 500 kD. Peptidni veznici mogu se izmeniti tako da formiraju derivate na isti način kao što je opisano.

Proizvodnja polipeptida i peptida

[0195]Identifikovani peptid može se proizvesti u transformisanoj ćeliji domaćinu, primenom tehnologije rekombinantne DNK. Ukoliko je kao nosač primenjen polipeptid, taj polipeptid ili fuzioni proizvod peptid-nosač mogu se eksprimirati kao jedan. Da bi se to postiglo, najpre treba dobiti rekombinantni DNK molekul koji kodira peptid, primenom postupaka poznatih u stanju tehnike. Na primer, sekvence koje kodiraju peptide mogu se iseći iz DNK, pomoću odgovarajućih restrikcionih enzima. Alternativno, DNK molekul se može sintetisati primenom postupaka hemijske sinteze, kao što je postupak fosforamidatne sinteze. Moguće je primeniti i kombinaciju ovih postupaka. Pronalazak stoga obezbeđuje polinukleotide koji kodiraju jedinjenje saglasno pronalasku.

[0196]Pronalazak takođe obezbeđuje vektore koji kodiraju jedinjenja saglasno pronalasku u odgovarajućem domaćinu. Vektor uključuje polinukleotid koji kodira jedinjenje operativno vezano za odgovarajuću ekspresionu kontrolnu sekvencu. Postupci za postizanje ovog operativnog vezivanja, bilo pre ili posle insertovanja polinukleotida u vektor, dobro su poznati u stanju tehnike. Ekspresione kontrolne sekvence uključuju promotore, aktivatore, pojačivače, operatore, vezujuća mesta za ribozome, start signale, stop signale, signale za kapovanje, signale za poliadenilaciju i druge signale uključene u kontrolu transkripcije ili translacije.

[0197]Rezultujući vektor sa polinukleotidom koristi se za transformaciju odgovarajućeg domaćina. Ova transformacija se može postići primenom postupaka dobro poznatih u stanju tehnike.

[0198]Za praktično izvođenje pronalaska moguće je primeniti neku iz velikog izbora dostupnih i poznatih ćelija domaćina. Izbor konkretnog domaćina zavisi od nekoliko faktora poznatih u stanju tehnike. Neki od njih su, na primer, kompatibilnost sa izabranim ekspresionim vektorom, toksičnost peptida kodiranog DNK molekulom, brzina transformacije, lakoća oporavka peptida, ekspresione karakteristike, biološka bezbednost i troškovi. Potrebno je usaglasiti sve navedene faktore, imajući u vidu da nisu sve ćelije domaćini jednako efikasni u pogledu ekspresije konkretne DNK sekvence. U okviru ovih načelnih smernica, korisni mikrobni domaćini obuhvataju bakterije, (kao što je E. coli), kvasce (kao što je Saccharomvces) i druge gljive, insekte, biljke, sisarske (uključujući i ljudske) ćelije u kulturi i druge domaćine poznate u stanju tehnike.

[0199]Uz to, transformisane ćelije-domaćina se kultivišu i prečišćavaju. Ćelije-domaćini mogu se kultivisati pod konvencionalnim uslovima fermentacije, tako da se eksprimiraju željena jedinjenja. Uslovi fermentacije su poznati u stanju tehnike. Na kraju, peptidi se prečišćavaju iz kulture, primenom postupaka poznatih u stanju tehnike.

[0200]Zavisno od ćelije-domaćina koja je izabrana za ekspresiju jedinjenja saglasno pronalasku, poželjno je vezati ugljenohidratne (oligosaharidne) grupe za mesta za koje zna da su mesta glikozilacije u proteinima. Načelno, O-vezani oligosaharidi su vezani za ostatke serina (Ser) ili treonina (Thr), dok su N-vezani oligosaharid povezani preko ostataka asparagina (Asn) kada je on deo sekvence Asn-X-Ser/Thr, u kojoj X može biti bilo koja amino kiselina, osim prolina. X je poželjno bilo koja od 19 prirodnih amino kiselina, osim prolina. Strukture N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i šećera u svakom tipu se razlikuju. Šećer koji se tipično nalazi kod oba tipa vezanih oligosaharida je N-acetilneuraminska kiselina (poznata i kao sijalinska kiselina). Sijalinska kiselina je najčešće terminalni ostatak i N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i, zbog svog negativnog naelektrisanja, ona daje kisela svojstva glikozilovanim jedinjenjima. Ova mesta se mogu ugraditi u veznik ovog jedinjenja saglasno pronalasku, a poželjno je da su ta mesta glikozilovana u ćeliji tokom rekombinante produkcije polipeptidnog jedinjenja (na primer, u sisarskim ćelijama, kao što su CHO, BHK, COS). Međutim, ova mesta mogu dodatno biti glikozilovana sintetičkim ili polusintetičkim postupcima poznatim u stanju tehnike.

[0201]Alternativno, jedinjenja se mogu dobiti sintetskim putem. Na primer, mogu se primeniti postupci sinteze u čvrstoj fazi. Pogodne tehnike su poznate u stanju tehnike, i obuhvataju one opisane kod Merrifield (1973), Chem. Polvpeptides, str. 335-61 (Katsovannis i Panavotis urednici); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Daviš i sar. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stevvart i Young (1969), Solid Phase Peptide Svnthesis; U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn i sar., (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; i Erickson i sar.,

(1976), The Proteins (3rd ed.) 2:257-527. Sinteza u čvrstoj fazi je tehnika izbora u pravljenju pojedinačnih peptida, jer je to najefikasniji postupak pravljenja malih peptida.

[0202] Jedinjenja koja sadrže derivirane peptide ili koja sadrže ne-peptidne grupe naročito su pogodna da budu sintetisana primenom poznatih tehnika organske hernije.

WSP modifikacije

[0203] Za dobijanje jedinjenja kovalentno vezanih za WSP, primenjuju se postupci koji su opisani ovde ili su na drugi način poznati u stanju tehnike. Postupci pripreme hemijskih derivata polipeptida načelno obuhvataju korake (a) reakcije peptida sa aktiviranim polimernom molekulom (kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat polimernog molekula), pod uslovima u kojima se polipeptid vezuje za jedan ili više polimernih molekula, i (b) dobijanja reakcionog(ih) proizvoda. Optimalni uslovi reakcije određuju se na osnovu poznatih parametara i željenih rezultata. Na primer, što je veći odnos polimernog molekula prema proteinu, to je veći procenat vezanog polimernog molekula.

[0204] Biološki aktivni molekuli mogu se vezati za polimer preko svake dostupne funkcionalne grupe, primenom standardnih postupaka poznatih u stanju tehnike. Primeri funkcionalnih grupa, na polimeru i na biološki aktivnom molekulu, preko kojih se mogu formirati ove veze, obuhvataju amino i karboksilnu grupu, tiolnu grupu, kao što je cisteinski ostatak, aldehidne i keto grupe i hidroksilne grupe, koje se nalaze u ostacima serina, treonina, tirozina, hidroksiprolina i hidroksilizina.

[0205] Polimer se može aktivirati povezivanjem reaktivne grupe, kao što je trihloro-s-triazinska [Abuchowski i sar., (1977), J. Biol. Chem. 252:3582-3586], karbonil-imidazolska [Beauchamp i sar., (1983), Anal. Biochem. 131:25-33] ili sukcinimidil sukcinatna [Abuchowski i sar., (1984), Cancer Biochem. Biophvs. 7:175-186, ], koja reguju sa amino-grupom biološki aktivnog molekula. Drugi postupak vezivanja obuhvata formiranje glioksilil grupe najednom molekulu i arninooksi, hidrazid ili semikarbazidne grupe, na drugom od dva molekula koja se konjuguju [Fields i Dixon, (1968), Biochem. J. 108:883-887; Gaertner i sar.,

(1992), Bioconjugate Chem. 3:262-268; Geoghegan i Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3:138-146; Gaertner i sar., (1994), J. Biol. Chem. 269:7224-7230]. Ostali postupci uključuju formiranje aktivnog estra na slobodnoj alkoholnoj grupi prvog molekula, primenom hloroformata ili disukcinimidil-karbonata, koji se zatim konjuguje sa amino grupom na drugom molekulu [Veronese, i sar., (1985), Biochem. and Biotech. 11:141-152; Nitecki, i sar., U.S. Patent No. 5,089,261; Nitecki, U.S. Patent No. 5,281,698]. Druge reaktivne grupe koje se mogu vezati preko slobodnih alkoholnih grupa predstavljene su kod Wright, EP 0539167A2, koja takođe opisuje primenu imidata za kuplovanje sa slobodnim amino grupama.

[0206]Naredni postupci obuhvataju acilovanje primarnih amina ciljnog molekula, primenom NHS-estrametoksi-PEG-(0-[(N-sukcinimiđiloksikarbonil)-metil]-O' -metilpolietilen glikola). Acilovanje metoksi-PEG-NHS dovodi do nastanka amidne veze koja uklanja naelektrisanje sa originalnog primarnog amina. U ostalim postupcima primenuje se blaga oksidacija ciljnog molekula pod uslovima izabranim da se diol pretposlednje glikozilne jedinice sijalinske kiseline oksiduje do aldehida. Nastali gliko-oaldehid zatim reaguje sa metoksi-PEG-hidrazidom (O-(Hidrazinokarbonilmetil)-O'-metilpolietilen glikolom), da bi se dobio polu-stabilni hidrazon PEG-a i ciljnog molekula. Hidrazon se zatim redukuje u prisustvu natrijum cijanoborohidrida, da bi nastao stabilni PEG konjugat. Videti, na primer, U.S. Patent No. 6,586,398 (Kinstler, i sar., 1. juli, 2003).

[0207]U specifičnim primenama postupaka hemijske modifikacije, na primer, U.S. Patent No. 4,002,531 specifikuje da se reduktivna alkilacija primenjena za vezivanje molekula polietilen glikola za enzim. U.S. Patent No. 4,179,337 opisuje konjugat PEG:protein, koji uključuje, enzime i insulin. U.S. Patent No. 4,904,584 opisuje modifikacije velikog broja lizinskih ostataka u proteinima sa ciljem vezivanja polietilen-glikolnog molekula, preko reaktivnih amino grupa. U.S. Patent No. 5,834,594 obelodanjuje suštinski ne-imunogene hidrosolubilne konjugate PEG:protein, koji uključuju, na primer, proteine IL-2, interferon alfa i IL-lra. Postupci opisani kod Hakimi i sar., uključuju primenu jedinstvenih veznika za povezivanje različitih slobodnih amino grupa u proteinima za PEG. U.S. Patent Nos. 5,824,784 i 5,985,265 obznanjuju postupke koji omogućavaju dobijanje selektivno N-terminalno hemijski modifikovanih proteina i njihovih analoga, uključujući G-CSF i konsezusni interferon. Treba naglasiti, da ovi modifikovani proteini imaju prednost u smislu svoje stabilnosti, kao i u smislu postupaka pripreme.

[0208]Modifikacije WSP opisane su takođe kod Francis i sar., u: Stabilitv of protein pharmaceuticals:in vivopathways of degradation and strategies for protein stabilization (Ur. Ahern., T. i Manning, M. C.) Plenum, N. Y., 1991. U narednom aspektu, postupak opisan kod Delgado i sar., "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Celi Preparation", u: Fisher i sar., ur., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Celi Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y., N.Y., 1989 str. 211-213, koji uključuje primenu trezil-hlorida, što rezultira odsustvom veznih grupa između WSP dela i polipeptidnog dela. U narednom aspektu, vezivanje WSP je omogućeno preko N-hidroksi sukcinimidil estara karboksimetil metoksi polietilen glikola, kao što je poznato u stanju tehnike.

[0209]Za dodatne opise modifikacija ciljnih molekula WSP-om, videti, na primer, U.S patentnu prijavu No. 20030096400; EP 0 442724A2; EP 0154316; EP 0401384; WO 94/13322; U.S. Patent Nos. 5,362,852; 5,089,261; 5,281,698; 6,423,685; 6,635,646; 6,433,135; međunarodnu prijavu WO 90/07938; Gaertner i Offord, (1996), Bioconjugate Chem. 7:38-44; Greemvald i sar., Crit Rev Therap Drug Carrier Syst. 2000;17:101-161; Kopecek i sar., J Controlled Release., 74:147-158, 2001; Harris i sar., Clin Pharmacokinet. 2001; 40(7):539-51; Zalipsky i sar., Bioconjug Chem. 1997;8:111-118; Nathan i sar., Macromolecules. 1992; 25:4476-4484; Nathan i sar., Bioconj Chem. 1993;4:54-62; i Francis i sar., Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992).

Reduktivna alkilacija

[0210]U jednom aspektu, kovalentno vezivanje WSP sprovodi se postupkom hemijske modifikacije reduktivnoma alkilacijom, kao što je to u ovom pronalasku primenjeno za selektivnu modifikaciju N-terminalne a-amino grupe, i testiranja nastalog proizvoda u odnosu na željena biološka svojstva, kao što je ovde opisan test biološke aktovnosti.

[0211]Reduktivna alkilacija za vezivanje WSP za neki protein ili peptid zasniva se na diferencijalnoj reaktivnosti različitih tipova primarnih amino grupa (na primer, lizina u odnosu na amino kiselinu na N-terminusu), koje u konkretnom proteinu mogu da se izmene. Pod odgovarajućim reakcionim uslovima, moguće je postići suštinski selektivnu izmenu proteina na N-terminusu, karbonilnom grupom koja sadrži polimer.

[0212]Da bi se izvela selektivna alkilacija, izabrani polimer(i) mogu imati jednu reaktivnu aldehidnu grupu. Reaktivni aldehid je, na primer, polietilen glikol propionaldehid, koji je stabilan u vodi, ili mono Cl-ClO-alkoksi ili njihovi ariloksi-derivati (videti U.S. Patent No. 5,252,714). U jednom aspektu, reduktivna alkilacija je primenjena sa ciljem da su konjuguje PEG-aldehid (0-(3-Oksoprapil)-0'-metilpolietilen glikol) za neki primarni amin. Pokazano je da pod odgovarajućim uslovima, ovaj pristup daje PEG konjugate, koji su prevashodno modifikovani preko a-amina na N-terminusu proteina.

[0213]Aldehidna funkcionalna grupa korisna za konjugovanje biološki aktivnog molekula može se generisati od funkcionalne grupe koja poseduje susedne amino i hidrolskilne grupe. U polipeptidu, na primer, serin, treonin ili hidroksilizin na N-terminusu mogu se iskoristiti da se generiše aldehidna grupa, putem oksidativnog raspada, pod blagim uslovima primenom perjodata. Ovi ostaci ili njihovi ekvivalenti mogu biti normalno prisutni na primer, na N-terminusu polipeptida, mogu biti izloženi hemijskoj ili enzimskoj digestiji, ili se mogu uvesti putem rekombinantnih ili hemijskih postupaka. Reakcioni uslovi za odvijanje reakcije generisanja aldehida uobičajeno uključuju dodavanje molarnog suviška natrijum meta perjodata i blage uslove, kako bi se izbegla oksidacija na drugim mestima na proteinu. Poželjno je daje pH oko 7.0. Tipična reakcija uključuje dodavanje natrijum meta perjodata, u 1.5 puta molarnom suvišku, nakon čega sledi inkubacija 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku.

[0214]Aldehidna funkcionalna grupa može se vezati za aktivirani polimer koji sadrži hidrazidnu ili semikarbazidnu grupu, kako bi se formirala hidrazonska ili semikarbazonska veza. Polimeri koji sadrže hidrazid dostupni su komercijalni, i mogu se sintetisati, ako je neophodno, primenom standardnih postupaka. PEG hidrazidi za primenu saglasno pronalasku mogu se nabaviti kod Sheanvater Polvmers, Inc., 2307 Spring Branch Road, Huntsville, Ala. 35801 (sada deo Nektar Therapeutics, 150 Tndustrial Road, San Carlos, CA 94070-6256). Aldehid se vezuje za polimer mešanjem rastvora sastavljenog od ove dve komponente i grejanjem na oko 37°C sve do gotovo potpunog završetka reakcije. Višak hidrazidnog polimera se najčešće koristi kako bi se povećao prinos konjugata. Tipično reakciono vreme je 26 sati. Zavisno od termalne stabilnost reaktanta, reakciona temperatura i vreme mogu se izmeniti kako bi se obezbedili poželjni rezultati. Detaljno određivanje reakcionih uslova za odvijanje oksidacije i kuplovanja predstavljeni su u Geoghegan i Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3:138-146, i u Geoghegan, U.S. Patent broj 5,362,852.

[0215]Za pravilno odvijanje reduktivne alkilacije, redukujući agens treba da bude stabilan u vodenom rastvoru, a poželjno je da je sposoban da redukuje samo Sifove baze formirane u inicijalnom procesu reduktivne alkilacije. Redukujući agens se, bez ograničenja, bira između natrijum borohidrata, natrijum cijanoborohidrida, dimetilamin-borata, trimetilamin -borata i piridin-.borata

[0216]pH reakcione smeše utiče na to koji će odnos polimera prema proteinu biti izabran. Načelno, ukoliko je pH reakcije niža od pKa ciljne reaktivne grupe, poželjan je veći suvišak polimera u odnosu na protein. Ukoliko je pH viša od pKa, odnos polimer/protein ne treba da bude veliki (odnosno, dostupno je više reaktivnih grupa, pa je potrebno manje polimernih molekula).

[0217]U skladu sa tim, reakcija se u jednom aspektu odvija na pH vrednosti koja dozoljava da se iskoriste razlike pKa između e-amino grupa lizinskih ostataka i a-amino grupa na N-terminalnim ostacima proteina. Ovakvom selektivnom derivacijom, postiže se kontrola vezivanja hidrosolubilnog polimera za protein; konjugacija sa polimerom se odvija predominantno na N-terminusu proteina, a ne odvija se u značajnoj meri modifikacija ostalih reaktivnih grupa, kao što su one na bočnim lancima lizina.

[0218]U jednom aspektu, stoga, obezbeđeni su postupci za kovalentno vezivanje WSP za ciljno jedinjenje, koje obezbeđuje suštinski homogen molekul konjugata WSP/protein, bez potrebe za drugim temeljnim postupcima prečišćavanja, kao što je to potrebno tokom primene ostalih hemijskih modifikacija. Konkretno, ukoliko se koristi polietilen-glikol, ovde opisani postupci omogućavaju proizvodnju N-terminalno PEGilovanih proteina, koji nemaju potencijalno antegene spojne grupe, odnosno, polietilen glikolni deo molekula je direktno vezan za proteinski deo, bez potencijalno toksičnih sporednih proizvoda.

[0219]Proporcija WSP molekula vezanih za ciljni peptid ili protein, kao i njihova koncentracija u reakcionoj smeši varira zavisno od izabranog postupka vezivanja WSP. Načelno, optimalni odnos (u smislu efikasnosti reakcije i odustva viška neizreagovanog proteina ili polimera), određuje se na osnovu molekulske mase izabranog WSP. Kada izabrani postupak uključuje nespecifično vezivanje i kasnije prečišćavanja željenih molekulskih vrsta, odnos zavisi od broja dostupnih reaktivnih (najčešće amino) grupa.

Prečišćavanje

[0220]Postupak dobijanja suštinski homogenog WSP-modofikovanog preparata, u jednom aspektu, podrazumeva postupak prečišćavanja specifične vrste modifikovanog jedinjenja iz smeše različitih vrsta. Na primer, suštinski homogena vrsta najpre se razdvaja jono-izmenjivačkom hromatografijom, čime se dobij a materijal sa naelektrisanjem koje odgovara jednoj vrsti (čak iako su prisutne i druge vrste koje poseduju isto naelektrisanje), a zatim se željena vrsta izdvaja primenom hromatografije na osnovu veličine. Ostali postupci, prijavljeni predviđeni pronalaskom, uključuju, na primer, PCT WO 90/04606, objavljen 3. maja 3, 1990, koji opisuje postupak frakcionisanja smeše PEGilovanih proteina, koji uključuju razdvajanje PEG/proteinskih proizvoda iz vodenog dvofaznog sistema koji sadrži PEG.

[0221]Stoga jedan aspekt je postupak pripreme WSP-modifikovanih konjugata koji obuhvata (a) reakciju jedinjenja, koje poseduje jednu ili više amino grupa, sa hidrosolubilnim polimerom, pod uslovima redukcione alkilacije, na pH reakcione smeše koja je pogodna za selektivnu aktivaciju a-amino grupe na N-terminusu proteinskog dela, tako da se naznačeni hidrosolubilni polimer selektivno vezuje za naznačenu a-amino grupu; i (b) dobijanje reakcionog proizvoda. Opciono, naročito kada je reč o terapeutskom proizvodu, reakcioni proizvodi se razdvajaju od neizreagovanih komponenti.

[0222]Kao što je utvrđeno peptidnim mapiranje i sekvencioniranjem N-terminusa, obelodanjen je preparat koji uključuje smeđu od najmanje 50 % PEGilovanog peptida i neizreagovanog peptidom. Obelodanjeni su drugi preparati koji obuhvataju najmanje 75% PEGilovanih peptida u smeši pegilovanog peptida i neizreagovanog peptida; najmanje 85 % PEGilovanog peptida u smeši PEGilovanog peptida i neizreagovanog peptida; najmanje 90 % PEGilovanog peptida u smeši PEGilovanog peptida i neizreagovanog peptida; najmanje 95% PEGilovanog peptida u smeši PEGilovanog peptida i neizreagovanog peptida; i najmanje 99 % PEGilovanog peptida u smeši PEGilovanog peptida i neizreagovanog peptida.

[0223]Naredni primeri ne treba da ograniče, već da reprezentuju specifične oblike izvođenja pronalaska.

Primer 1

Povezivanje mFc-TMP ekspresionog konstrukta

[0224]Polinukleotid koji kodira TMP-fuzioni protein sa mišjim Fc regionom (mFc-TMP) konstruisan je kombinovanjem nukleotidnih sekvenci koje pojedinačno kodiraju mišji Fc i TMP (opisan u EP01124961A2). U prvom krugu PCR, mišja Fc-kodirajuća komponenta je umnožena pomoću PCR prajmera 3155-58 (SEQ ID NO: 1022) and 1388-00 (SEQ ID NO: 1023). [0225]U izdvojenoj reakciji, polinukleotid koji kodira TMP umnožen je pomoću prajmera

[02261Dobijeni PCR fragmenti su prečišćeni na gelu i spojeni u istoj tubici za drugi krug PCR, sa prajmerima 1209-85 (SEQ ID NO: 1030) i 1388-00 (SEQ ID NO: 1031). Formirani PCR proizvod nakon druge runde umnožavanja prečišćen je na gelu i digestiran restrikcionim enzimimaNdelandXhol.Isečeni fragmenti su prečišćeni i povezani u vektor pAMG21, prethodno obrađen istim restrukcionim enzimima. Ova ligaciona smeša je transformisana putem elektroporacije uE. colii zasejana na medijumu LB + Kanamvcin. Kolonije su pretražene pomoću PCR i DNK sekvencioniranja. Identifikovani su pozitivni klonovi, koji

sadrže nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 1032) koja kodira mFc-TMP fuzioni protein (SEQ ID NO: 1033) i oni su označeni oznakom 6397.

[0227JMišji polinukleotid koji kodira Fc-TMP fuzioni protein (SEQ ID NO: 1034) 1

GATTTGATTC TAGATTTGTT TTAACTAATT AAAGGAGGAA TAACAT

Otvoreni okvir čitanja:

3' Sekvenca:

[0228]Sekvenca mišjeg Fc-TMP proteina (SEQ ID NO: 1035)

Primer2

Fermentacija soja 6397

[0229] Fermentacija soja 6397 započeta je inokulacijom 500 mL sterilisane hranljive podloge Luria, semenom kulture soja u posudi za trešenje. Kada je gustina ćelija dostigla 0.9 na 600 nm, sadržaj je inokuliran u fermentor zapremine 15 1, koji je sadržao 10 L kompleksa na bazi hranljivog medijuma (800 g glicerola, 500 g triptikaze, 3 g natrijum citrata, 40 g KH2P04, 20 g (NH4)7S04, 5 ml Fluka P-2000 antipene, 10 ml metala u tragovima (gvožđe hlorid 27.0 g/L, cink-hlorid 2.00 g/L, kobalt-hlorid 2.00 g/L, natrijum-molibdat 2.00 g/L, kalcijum-hlorid 1.00 g/L, bakar-sulfat 1.90 g/L, borna kiselina 0.50 g/L, mangan- hlorid 1.60 g/L, natrijum-citrat dihidrat 73.5 g/L), 10 ml vitaminina (biotin 0.060 g/L, folna kiselina 0.040 g/L, riboflavin 0.42 g/L, piridoksin HC1 1.40 g/L, niacin 6.10 g/L, pantotenska kiselina 5.40 g/L, natrijum-hidroksid 5.30 ml/L), i voda do prstena od 10 L). Fermentator je držan na 37°C na pH 7, sa rastvorenim kiseonikom na nivou od minimalno 30 % saturacije. Kada je ćelijska gustina dostigla 13.1 OD jedinica na 600 nm, kultura je indukovana dodavanjem 10 ml 0.5 mg/ml N-(3-okso-heksanoil) homoserin-laktona. Šest sati nakon indukcije, hranljivi medijum je ohlađen na 10°C, i ćelije su skupljene centrifugiranjem na 4550xg tokom 60 min na 5°C. Ćelijska pasta je ostavljena na -80°C.

Primer 3

Pakovanje proteina

[0230] PastaE. coli(300 g) soja 6397 koji eksprimira mFc-TMP, rastvorena je u u 2250 ml pufera za lizu (50 mM Tris HC1, 5 mM EDTA, pH 8.0) i propuštena je dva puta kroz rashlađeni mikrofluidizer na 13,000 PSI. Homogenat je centrifugiran pri 11,300 x g, tokom 60 minuta na 4°C. Supernatant je odbačen, a talog je resuspendovan u 2400 ml vode uz upotrebu tkivnog sekača. Homogenat je zatim centrifugiran na 11,300xg tokom 60 minuta na 4°C. Supernatan je odbačen, a talog je resuspendovan u 200 ml vode, pomoću tkivnog sekača. Homogenat je centrifugiran na 27,200 x g tokom 30 minuta, na 4 °C i supernatan je odbačen. Oko 12.5 % taloga je resuspendovano u 28 ml 20 mM Tris HC1, pH 8.0, sa 35 mg lizozima belanca jajeta (Sigma, St Louis, MO), pomoću tkivnog sekača, a zatim je inkubirano na 37°C tokom 20 min. Nakon inkubacije, supsenzija je centrifugirana na 27,200xg tokom 30 minuta, na 22°C i supernatant je odbačen. Talog je resupsnedovan u 35 ml 8 M guanidin HC1, 50 mM Tris HC1, pH 8.0, nakon čega je u materijal dodato 350 ml 1 M DTT (Sigma, St Louis, MO) i inkubirano 37 °C na 30 minuta. Rastvor je centrifugiran na 27,200 x g, 30 minuta na 22°C. Supernatant je zatim prebačen u 3.5 L pufera za pakovanje (50 mM Tris baza, 160 mM arginin HC1, 3 M urea, 20% glicerol, pH 9.5, 1 mM cistein, 1 mM cistamin HC1) na 1 ml/min, uz blago mešanje na 4°C.

Primer 4

Prečišćavanje konstrukta

[0231] Četrdesetak časova nakon inkubacije na 4°C uz blago mešanje, rastvor za umotavanje proteina, opisan u Primeru 3, koncentrovan je do zapremine od 500 ml, primenom aparata za tangencijalnu protočnu ultrafiltraciju sa kasetom od 30 kDa (Satorius,Goettingen, Germanv), nakon čega je sledila diafiltracija nasuprot 3 L Q-pufera A (20 mM Tris HC1, pH 8.0). Koncentrovani materijal je filtriran kroz Whatman GF/A filter i nanesen na 86-ml Q-Sepharose kolonu sa brzim protokom (2.6 cm ID) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) od 15 ml/min. Nakon ispiranja smole sa nekoliko kolonskih zapremina Q-pufera A, protein je eluiran pomoću 20 zapremina kolone rastvora sa linearnim gradijentom koncentracije do 60% Q-pufera B (20 mM Tris HC1, 1 M NaCl, pH 8.0) pri 10 ml/min. Maksimumi frakcija su objedinjen)i i taj materijal je propušten kroz Mustang E špric filter (Pali Corporation, East Hills, NY) pri 1 ml/min. Filtrirani materijal je filtriran drugi put kroz celulozno-acetatni filter od 0.22Lim i deponovan je na -80°C.

Primer 5

PEGilacija proteina

[0232] Ohlađenom (4°C), izmešanom rastvoru mFc-TMP (3.5 ml, 0.8 mg/ml) u 100 mM natrijum-acetatnom puferu, pH 5, koji je sadržao 20 mM NaCNBH3, dodat je metoksipolietilen glikol aldehid (MPEG) (prosečne molekulske mase, 20 kDa) (Nektar), u 3.8-puta molarnom suvišku. Mešanje reakcione smeše nastavljeno je na istoj temperaturi. Domet proteinske modifikacije tokom reakcije praćen je pomoću SEC HPLC, na Superose 6 HR 10/30 koloni (Amersham Biosciences) eluiranoj rastvorom 0.05 M fosfatnog pufera sa 0.15 M NaCl, pH 7.0 na 0.4 ml/min. Nakon 16 sati, SEC HPLC analiza je ukazala da se najveći deo proteina konjugovao za MPEG. Nakon toga pufer u reakcionoj smeši zamenjen je rastvorom 20 mM Tris/HCl pufera, pH 8.12. Konjugati MPEG-mFc-AMP2 izolovani su jono-izmenjivačkom hromatografijom, na 1 ml Hi Trap HP Q koloni (Amersham Biosciences), ekvilibrisanoj sa 20 mM Tris/HCl puferom, pH 8.12. Reakciona smeša je naneta na kolonu, pri brzini protoka od 0.5 ml/min i neizreagovani MPEG aldehid je eluiran polaznim puferom, u zapremini tri puta većoj od zapremine kolone. Protein-polimer konjugati eluirani su sa 20 kolonskih zapremina linearnog gradijenta od 0% do 100 % 20 mM Tris/HCl pufera, pH 8.12, koji je sadržao 0.5 M NaCl. Frakcije (2 ml) prikupljene tokom jono-izmenjivačke hromatografske separacije analizirane su HPLC SEC postupkom, kao što je opisano. Frakcija koja je sadržala mono- i di-MPEG-mFc-TMP konjugate u okvirnom odnosu od 2.3 do 1 (kao što je utvrđeno SEC HPLC) koncentrovana je i sterilno profiltrirana.

Primer 6

In vivoTestiranje

[0233] BDF1 miševi (Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts) podeljeni su u grupe od po 10 i subkutano su injektovane u dane 0, 21 i 42, rastvaračem (Dulbecco PBS sa 0.1% goveđim serum albuminom) ili rastvaračem sa 50 ug testiranih mono- i di-MPEG-mFc-TMP proteinskih konjugata (kao što je opisano) po kg telesne mase životinje. Obe grupe su podeljena na dva dela i uzeta je krv, iskrvavljenjem (140 ml) iz retroorbitalnog sinusa, svakog drugog dana (0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 19, 24, 26, 28, 31, 33, 40, 45, 47, 49, 52 i 59). Na dan 59, miševi su anestezirani izofluranom pre iskrvavljenja. Prikupljena krv je analizirana na kompletnu i diferencijalno brojanje primenom ADVIA 120 automatizovanog analizatora krvi, a rezultati su obrađeno pomoću softverskog paketa za mišje analize (Bayer Diagnostics, New York, NY).

Primer 7

Liofilizovani humani Fc- TMP

Studije pretraživanja inicijalnih liofilizovanih formulacija

[0234] Humano Fc-TMP peptitelo, opisano u Primeru 7, odgovara dimernoj formi SEQ ID NO:1017, naznačenoj time da humani Fc ima sekvencu SEQ ID NO: 1, sa inicijatorskim metioninom na N-terminusu.

[0235] Stabilnost Fc-TMP procenjena je primenom nekoliko hromatografskih postupaka: Reverzno-fazna HPLC, Katjon-izmenjivačka HPLC, HPLC na osnovu veličine i SDS-PAGE, a sve one svedoče o stabilnosti na povišenim temperaturama. Formulacije u opsegu koncentracija od 0.1 do 40 mg/ml ispitane su po pitanju hemijske i fizičke degradacije pri ubrzanoj, rashlađenoj i temperaturi smrzavanja. Stabilnost Fc-TMP procenjena jepri različitim pH i uz uključivanje manitola ili glicina, kao agenasa za formiranje kolača, i saharoze, kao agensa koji deluje kao krioprotektor. Manitol i saharoza su izabrani za dalju optimizaciju nakon što je pokazano da drugi kandidati (glicin) nisu doveli do poboljšanja stabilnosti proteina. Pokazano je da Tween-20 (polisorbat-20) takođe ispoljava sposobnost inhibicije agregacije nakon liofilizacije u opsegu koncentracija od 0.002 do 0.1 %. U ovim studijama pretraživanja ispitani su naredni puferi u opsegu pH od 4-8: glicin, sukcinat, histidin, fosfat i Tris. Na osnovu ovih studija, pokazalo se daje za stabilnost Fc-TMP optimalna formulacija u histidinskom puferu na pH 5, sa malom količinom dodatog Tween-20 (0.004%).

Validnost saharoze i Tween- 20 u Fc- TMP formulacijama

[0236]Naredni koraci u razvoju formulacija bili su usmereni na procenu validnosti nivoa saharoze, manitola i Tween-20 u formulacijama sa koncentracijom proteina od oko 0.5 mg/ml (kako bi se prilagodili na dozne zahteve u klinikama). U ovim studijama pokazan je uticaj saharoze, manitola i Tween-20 na poboljšanje stabilnosti. Započete su naknadne studije sa ciljem da se predvidi proces proizvodnje i mogući izazovi.

Saharoza je korisna u smanjivanju hemijske degradacije pri povišenoj temperaturi

[0237]Testiran je uticaj različitih koncentracija saharoze i manitola na stabilnost Fc-TMP. Protein je formulisan u koncentracijama od 0.3 i 2 mg/ml, kako bi se testirale granične vrednosti predviđenog opsega koncentracija u kliničkoj praksi. Uz to, uzorci su pripremljeni sa ili bez 0.004% Tween-20. Odnos saharoza:manitol je promenjen variranjem količine saharoze i podešavanjem nivoa manitola pri svakoj koncentraciji saharoze, kako bi se održala izotoničnost. Ispitan je uticaj narednih proporcija saharoza:manitol (predstavljene kao procenat mase po zapremini): 0.2:5.1; 0.5:4.8; 1:4.5; 1.5:4.3 i 2:4.

[0238]Pokazano je da veći odnos saharoza:manitol smanjuje hemijsku degradaciju, koja je praćena katjon-izmenjivačkom i reverzno-faznom HPLC hromatografijom. Kao što je prikazano u Tabeli 39, procenat glavnog maksimuma je upoređen inicijalno i nakon deponovanja Fc-TMP na povišenoj temperaturi tokom 18 nedelja na 37°C. Najveći gubitak glavnog maksimuma na katjon-izmenjivačkoj hromatografiji dešava se u tečnoj formulaciji (Fc-TMP formulisan u 10 mM acetatu, 5 % sorbitolu na pH 5), zatim slede liofilizovane formulacije sa 0.2, 0.5 i 1.0% saharozom. Zaštitni efekat saharoze u smanjenju hemijske degradacije takođe je uočen reverzno-faznom HPLC analizom uzoraka nakon skladištenja na povišenoj temperaturi (Tabela 39). Procenat glavnog maksimuma (u reverzno-faznoj HPLC analizi Fc-TMP) opada značajno pri nižim nivoima saharoze, ali se i ne menja značajno u formulacijama sa koncentracijom saharoze većom od 1 %. Uzeti zajedno ovi rezultati ukazuju daje održavanje nivoa saharoze na vrednosti od 1.5 % ili više kritično za stabilnost Fc-TMP nakon liofilizacije.

[0239]Iako Fc-TMP u tečnoj kontroli (formulacije u 10 mM acetat, 5% sorbitol, pH 5) pokazuje značajno povećanje površine pre i posle glavnog maksimuma, protein ispoljava veću degradaciju u blasti iza maksimuma, nakon analize liofilizovanih uzoraka sa nižim sadržajem saharoze. Prethodne studije stabilnosti tečnih uzoraka (nakon skladištenja na povišenoj temperaturi), pokazale su da deamidacija potiče od glutamina i arginina iz proteina, što doprinosi povećanju površine pre glavnog maksimuma u tečnim uzorcima.

[0240]Na rashlađenoj temperaturi, katjon-izmenjivačka i reverzno-fazna HPLC nisu ukazale na hemijsku degradaciju u liofilizovanim formulacijama nakon dugotrajnog skladištenja. Na primer, katjon-izmenjivački hromatogrami nisu pokazali očite promene na različitim temperaturama (-80°C, 4°C i kontrolisana sobna temperatura tokom 6 meseci). S obzirom na to da u liofilizovanoj formulaciji nije uočena hemijska degradacija tokom vremena na kontrolisanoj sobnoj temperaturi i nižoj, najveći deo rada na razvoju formulacije fokusirano je na smanjenje fizičke agregacije uslovljene smrzavanjem i topljenjem.

Tween- 20 minimizuje agregaciju izazvanu liofilizacijom

[0241]Uključivanje Tween-20 u niskoj koncentraciji (0.004%) dovodi do smanjenja nivoa agregacije nakon liofilizacije. Ovo se može demonstrirati ispitivanjem relevantnih rezultata iz nekoliko studija stabilnosti u kojima je stabilnost uzoraka procenjena nakon dodavanju ili u odsustvu Tween-20. [0242J Najpre je testiran uticaj širokog opsega Tween-20 koncentracija na Fc-TMP pri višoj koncentraciji, sa ciljem da se utvrde količina potrebna da se umanji agregacija. Koncentracija Fc-TMP u ovom istraživanju bila je 20 mg/ml, a nivo Tween-20 0.002, 0.004, 0.006 i 0.01%. Nakon jedne godine skladištenja na 4°C, u svim formulacijama koje su sadržale Tween-20 uočena je agregacija od 0.1 % ili manje. Rezultati nakon šest meseci takođe ukazuju na neznatnu agregaciju. Za dalja razmatranja u razvijanju formulacije izabran je Tween-20 u koncentraciji od 0.004% i Fc-TMP u koncentraciji od 0.5 mg/ml.

[0243] Tabela 40 prikazuje nivo agregacije Fc-TMP, određen u nultom vremenu i nakon 3 i 11 meseci skladištenja na 4°C. U ovoj studiji, Fc-TMP je liofilizovan pri 0.5 mg/ml u prethodno navedenoj formulaciji i u formulacijama sa različitim odnosima saharoza:manitol, bez dodavanja Tween-20. Uz to, stabilnost je praćena u formulacijama koje nisu sadržale Tween-20 i koje su puferisane na pH 4.5, 5 i 5.5. Rezultati pokazuju da samo navedenaa formulacija ima minimalnu agregaciju na pH 5. U formulacijama bez Tween-20, agregacija varira između 0.5% do oko 5 %. Agregacija je takođe veća pri pH 4.5 i 5.5, u odnosu na onu koja je detektovana na pH 5. Niži odnosi saharoza:manitol (0.2,0.5 i 1% saharozne formulacije) utiču na veću agregaciju, od oko 5%. Sa protokom vremena, nivo agregacije u navedenoj formulaciji ostaje konstantan, kao i u formulaciji bez Tween-20, sve do vremenske tačke od jedne godine.

[0244]Osmišljena su dodatna istraživanja formulacija kako bi se potvrdio uticaj Tween-20 na smanjenje agregacije. Svi uzorci u ovim studijama su formulisani na pH 5, sa ili bez dodatog 0.004% Tween-20. Tabela 41 daje procenat agregacije nakon skladištenja na 4°C, nakon vremenskih intervala nula, 18 nedelja i godinu dana. U nultom vremenu, neposredno nakon liofilizacije, agregacija je minimalna u svim uzorcima u prisustvu 0.004 % Tween-20. Nizak nivo agregacije uočen je u uzorcima bez Tween-20, a najveći nivo je utvrđen u formulacijama sa 0.2% saharoze. Efektivnost Tween-20 u smanjenju agregacije produžava se do vremenske tačke od 18 nedelja, sa većim procentom agregacije koji je utvrđen u uzorcima kojima nedostaje Tween-20 i pri nižim odnosima saharoza:manitol. U uzorcima koji sadrže Tween-20 agregacija je dosledno niska i nakon jedne godine na 4°C.

[0245]Naredna studija stabilnosti, osmišljena da testira efektivnost antioksidanata u smanjenju efekata hemijske degradacije, učvrstila je uverenje o protektivnom efektu Tween-20. Antioksidanti nisu imali uticaj na minimalizovanje efekata hemijske degradacije nakon povećanja temperature tokom skladištenja. Međutim prethodno pomenuta formulacija, sa 0.004 % Tween-20 i koncentraciji Fc- TMP od 0.2 mg/ml, imala je < 0.1 % agregacije u nultoj vremenskoj tački i 0.1 % nakon 5 meseci skladištenja na 4°C. Ista formulacija bez Tween-20 imala je 0.4% agregacije u nultom vremenu i 1%> agregacije nakon skladištenja od 5 meseci.[0246]Rezultati studije stabilnosti prezentovani su u Tabelama II, III i te studije ilustruju protektivni efekat Tween-20 u smanjenju agregacije nakon liofilizacije. Porast agregacije tokom vremena je minimalan, budući da u vremenskoj tački od 1 godine na 4°C, nije uočeno značajno smanjenje agregacije u uzorcima formulisanim sa 0.004% Tween-20. Na osnovu ovih studija, koje pokazuju da dodavanje Tween-20 smanjuje agregaciju nakon liofilizacije, iniciranje rad na proizvodnji predloženih formulacija.

Scale- up studije

A<g>regacija je zavisna od koncentracije

[0247]Inicijalna scale-up studija je osmišljena da simulira proizvodne uslove i da ispita robusnost formulacija u odnosu na stres tokom transporta i stabilnosti nakon rekonstitucije. Pufer je zamenjen puferom za formulisanje, pomoću tangencijalne protočne filtracije, slično postupcima većih razmera. Protein je zatim razblažen do koncentracija od 0.5 i 0.1 mg/ml i Tween-20 je dodat pre finalnog filtracionog koraka. Nakon punjenja uzoraka, izvedena je liofilizacija. Reprezentativni primer postupka liofilizacije predstavljen je ispod:

Sekundarna temperatura 28C

[0248]Pasivno skladištenje na 4°C uslovilo je veći stepen agregacije pri niskoj koncentraciji Fc-TMP (0.1 mg/ml). U nultom vremenu agregacija određena pomoću SEC-HPLC bila je 0.4 % u formulaciji 0.1 mg/ml, dok je 0.1 % agregacije detektovan u proteinima formulisanim pri 0.5 mg/ml. Nakon šest meseci skladištenja na ohlađenoj temperaturi, agregacija je ostala na istom nivou koji je uočen za uzorke na nultom vremenu, za obe koncentracije Fc-TMP, u saglasnosti sa rezultatima prethodnih studija stabilnosti. Usled visokog stepena agregacije uočene pri nižoj koncentraciji (0.1 mg/ml) odlučeno je da je koncentracija od 0.5 mg/ml najbolje podešena potrebama i izabrana je za dalji rad u velikoj razmeri.

Agregacija se ne povećava nakon stimulacije jakog stresa

[0249]Liofilizovani uzorci (ne rekonstituisani) iz inicijalne scale-up studije su takođe podvrgnute simuliranom transportu, kontinentalnom i vazdušnom, pomoću opreme za simulaciju transporta. Ukratko, protokol je naveden u ASTM (American Societv of Testing Methods), primenjen je Postupak # D-4728. Simulacija kontinenalnog i vazdušnog transporta postignuta je zahvaljujući Electrodvnamic Vibration Table, Model S202 i pojačivaču Power Amplifier, Model # TA240 (Unholtz-Dickie Corpration, Wallingford, CT). Nakon stresa transporta, fizički izgled liofilizovanog kolača je upoređen sa pasivnim kontrolama, sa rezultatom da nisu uočene morfološke promene kolača. I hemijska i fizička stabilnost je prihvatljiva, sa agregacijom koja je dosledna u uzorcima izloženim stresu i pasivnim kontrolama (< 0.1% u uzorcima od 0.5 mg/ml u poređenju sa 0.4% u uzorcima od 0.1 mg/ml).

[0250JStabilnost nakon rekonstitucije je ispitana u ovom studiji, pripremom sveže rekonstituisanih uzoraka i inkubiranjem tokom 3, 7 i 14 dana, bilo pasivno uz sporo tumbanje, ili uz snažno mešanje. Tabela 42 prikazuje rezultate dobijene za formulacije od 0.1 i 0.5 mg/ml. Kao što je očekivano, nivo agregacije je smanjen u formulacijama sa 0.5 mg/ml. U poređenju sa sporim tumbanjem tokom vremena u poređenju sa uzorci koji nisu tumbani, nije uočeno povećanje agregacije nakon perioda od 14 dana. Stepen dimerizacije u ovim formulacijama (ne-tumbane i tumbane) takođe je dosledan. Zanimljivo je da rezultati nakon mešanja ukazuju na trend; agregacija se smanjuje na nivo ispod granice detekcije i u uzorcima od 0.1 i u uzorcima od 0.5 mg/ml. U isto vreme, uočena je odgovarajuća količina dimera u najmešanijim uzorcim u svim vremenskim tačkama, što ukazuje da postoji izvesna reverzibilnost u prelaženju iz agregata u stanje dimera nakon jakog stresiranja Fc-TMP.

Sekundarno sušenje u trajanju od 12 sati u liofilizacionom ciklusu dovoljno je da rezidualnu

vlažnost svede na minimalnu meru

[0251]Izvedena je druga studija velikih razmera u kojoj je izmenjen pufer u Fc-TMP i konjugat je razblažen na 0.5 mg/ml u preporučenoj formulaciji. Liofilizacija je izvedena u ciklusu koji se sastojao od inicijalnog smrzavanja na -50°C, nakon čega je sledila temperatura od -13°C. Temperatura je snižena na -50°C, održavana 1 sat, a primarno sušenje je započeto na na -50°C sa vakuumom podešenim na 100 mTorr. Nakon kratkog perioda zadržavanja na - 50°C, temperatura je promenjena na -25°C tokom perioda od dva sata, a zatim je održavana na tom nivou od -25°C tokom narednih 20 sati, i onda je postepeno podignuta na 25°C tokom 27 sati, kada je otpočeto sekundarno sušenje. Sekundarno sušenje je nastavljeno tokom najmanje 12 sati na 25°C. Tokom ciklusa liofilizacije, uzorci su sakupljani nakon 12, 18 i 24 sati od sekundarnog sušenja, kako bi se proverila stabilnost i uporedio nivo rezidualne vlažnosti. Rezultati pokazuju da rezidualna vlažnost, u svim ispitianim uzorcima, izmerena postupkom Karl Fisher titracije, iznosi oko 0.6% ili manje (Tabela 43). Nivo vlažnosti je sličan u kolačima sa placebo puferom. Na osnovu ovog posla, vreme sekundardnog sušenja u liofilizacionom ciklusu može se skratiti na opseg od 12 - 18 sati.

[0252]Rezultati testiranja stabilnosti uporedivi su tokom celog perioda sekundarnog sušenja, s obzirom na to da uzorci nisu ispoljili razlike u pogledu hemijske i fizičke stabilnosti. Na primer, količina agregacije je < 0.1%> za sve ispitane uzorke, dok je procenat dimera dosledno 0.1 %. Ovi rezultati potvrđuju da se sekundarno sušenje može skratiti na manje od 24 sata, bez uticaja na inicijalnu stabilnost proteina.

[0253]Obavljeni su dodatni testovi da bi se procenila otpornost formulacije u odnosu na različite koncentracije pomoćnih materija. S obzirom na to da su prethodni testovi stabilnosti pokazali da saharoza, na primer, može da utiče na stabilnost, bilo je neophodno da se ispita robustnost Fc-TMP na male promene nivoa pomoćnih materija.

Statistička studija Fc- TMP

Otpornost formulacije

[0254]Inicijalna statistička studija osmišljena je da ispita male promene varijabli unutar formulacije, kao što su pH, jačina histidinskog pufera i odnos saharoza:manitol u formulaciji, primenom E-chip softverskog paketa. Uzorci su liofilizovani, ali je primenjen ne-optimalni ciklus smrzavanja-otapanja, koji je rezultirao većom agregacijom nego što se obično dobij a. Ispitivanje je sprovedeno kao studija pretraživanja, uz pretpostavku o linearnom odgovoru. Rezultati procene stabilnosti pokazali su da su pH (4.7 do 5.3) i jačina histidinskog pufera (u opsegu 5 do 15 mM) imale mali uticaj na stabilnost Fc-TMP. Da bi verifikovao doprinos Tween-20 i odnos saharoza:manitol na ukupnu stabilnost Fc-TMP, inicirana je naknadna statistička studija, primenom optimalnog ciklusa liofilizacije.

Kvadratna statistička studija stabilnosti

[0255]Druga statistička studija ispitala je varijacije u sadržaju Tween-20 (0.001 %, 0.0045% i 0.008%), odnosa saharoza:manitol (1.7:4.2, 2:4 i 2.3:3.8) i varijacija u koncentraciji proteina (0.3, 0.65 i 1 mg/ml). pH vrednost formulacija je podešena na 4.7, 5 i 5.3, dok je jačina histidinskog pufera varirala između 7, 10 i 13 mM. Uzorci su pripremljeni i liofilizovani pomoću Virtis liofilizera (SP Industries, Inc., Gardiner, NY), sa optimizovanim konzervativnim ciklusom koji je korišćen u prethodnim studijama stabilnosti. Rezultati studija stabilnosti analizirani su pomoću E-chip (softverski paket za statističke analize, Hockessin, DE) na dva načina: procena uticaja varijabli unutar formulacije na količinu agregacije i dimerizacije u nultom vremenu i efekat varijabli unutar formulacije na stabilnost formulacije prilikom skladištenja na povišenoj temperaturi (37°C) izražena kao veličina promene u odnosu na nulto vreme.

Rezultati kvadratne statističke studije formulacije u nultom vremenu

[0256]Rezultati procene u nultom vremenu pokazali su, kao što je bilo očekivano, da Tween-20 minimizuje agregaciju, mada i koncentracija proteina ostvaruje značajan uticaj na agregaciju nakon smrzavanja-topljenja. Softverski paket E-chip procenjuje kakve efekte različite vrednosti varijabli (uslovi formulacije) ostvaruju na agregaciju i dimerizaciju Fc-TMP tokom smrzavanja topljenja. U pogledu dimerizacije Fc-TMP u nultom vremenu, ni jedna pomoćna materija nije ispoljila značajan uticaj (na osnovu E-chip rezultata). Nekoliko varijabli u formulaciji uticalo je na količinu agregacije koja je uočena nakon smrzavanja-topljenja Fc-TMP. Na osnovu zbirnih rezultata koji su dobijeni posredstvom E-chip, najjači uticaj na stepen agregacije u nultom vremenu ostvaruje koncentracija Fc-TMP, a zatim nivo Tween-20. Uočena je najveća agregacija u nultom vremenu pri najnižoj koncentraciji uzorka. Slično tome, veće količine Tween-20 imale su jači protektivni efekat u minimiziranju agregacije u nultom vremenu, iako ovaj trend nije uočljiv u meri u kojoj je uočljiv trend koji ostvaruje koncentracija proteina. U ovoj studiji dobijen je veći nivo agregacije u odnosu na rezulate prethodnih studija, a oko 0.5 % agregacije uočeno je u nekim uzorcima sa najnižom koncentracijom proteina u Tween-20.

[0257]Uočeno je da varijabilnost u agregaciji pada sa povećanjem koncentracije proteina. Pri 0.5 mg/ml i višim koncentracijama, Fc-TMP ima prosečno nižu agregaciju nego u uzorcima formulisanim na 0.3 mg/ml ili manje.

Tween- 20 u koncentraciji od 0. 004% efikasano smanjuje agregaciju u uslovima skladištenja

na povišenoj temperaturi

[0258]Statistička studija je takođe primenjena za procenu promena nakom skladištenja na povišenoj temperaturi. Upoređene su brzine agregacije pri različitim uslovima formulacije, nakon 16 dana na 37°C, oduzimanjem rezultata dobijenih na povišenoj temperaturi od inicijalnih rezultata dobijenih u nultom vremenu, i normalizacijom na vreme od 1 meseca. Brzine koje su imale negativnu vrednost svedoče o gubitku merenih svojstava tokom vremena. Promenene varijable (koje odgovaraju rezultatima iz prethodnih testova) određene su RP-HPLC (procenat glavnog maksimuma i procent pre-maksimuma), jono-izmenjivačkom HPLC hromatografijom (procenat prečišćenosti glavnog maksimuma), HPLC na osnovu veličine (agregacija i formiranje dimera) i NIR-voda (rezidualna vlažnost infracrvenom spektorskopijom, koja je sa rezultatima Karl Fisher Titracije u nekim uzorcima, kako bi se potvrdila preciznost merenja).

[0259]Rezultati dobijeni upoređivanjem brzina promene primenom pojedinačnih postupaka pokazuju da su promene agregacije i RP-HPLC oksidacije statistički značajne pri različitim koncentracijama Fc-TMP i kvadratnim koncentracijama Tween-20, unutar raspona od dve standardne devijacije. Kvadratni odnos Tween-20 najverovatnije potiče od kvadratne prirode ove studije, koja polazi od pretpostavke o zakrivljenoj funkciji zavisnosti. U ovom slučaju, kvadratna zavisnost Tween-20 bolje odgovara modelu, a dodatno sugeriše da postoji interaktivni efekat Tween-20, koji utiče na stabilnost. Ostale izmerene reakcije, kao što je čistoća glavnog maksimuma katjon-izmenjivačke HPLC ili razlličite vrednosti pH, nisu ispoljile značajan uticaj na stabilnost proteina.

[0260]Kao što je to bio slučaj sa prethodno opisanom inicijalnom scale-up studijom, (tumbani, netumbani i mešani uzorci), nivo agregacije bio je niži nakon skladištenja na višoj temperaturi. Brzina promene u ovim uzorcima korišćena je da se naprave predviđanja na osnovu statističkog modela (kvadratna studija), kako bi se predvideo protektivni efekat Tween-20. Tabela 44 prikazuje predviđanja očekivane količine agregacije, na osnovu statističkog modela, kada se koncentracija Tween-20 poveća sa 0 do 0.008%. Kao što je prikazano, brzina agregacije, normalizovana na period od jednog meseca na 37°C, ima negativnu vrednost (što ukazuje na gubitak agregacije u ovim uslovima), sa izuzetkom 0 % Tween-20, u čijem je slučaju predviđen porast agregacije. Brzina gubitka agregacije pokazuje plato pri koncentracijama Tween-20 od 0.002% i više, što ukazuje daje Tween-20, pri niskim koncentracijama (0.002-0.006%) dovoljan da minimizuje fizičku degradaciju. Brzina porasta dimera je odgovarajuće slična pod ovim uslovima i nije u statističkoj korelaciji ni sa jednom pomoćnom materijom formulacije, kao što je prethodno pomenuto.

[0261]Brzina promene RP-HPLC postupkom izmerene oksidacije pri 0.5 mg/ml, pod pretpostavkom da ona odgovara promenama regiona ispred maksimuma svakog hromatograma, nije statistički značajna u odnosu Tween-20 kvadratnu zavisnost. U ovom slučaju, model (kao što je pokazano u Tabeli 44) predviđa da se sa variranjem koncentracije Tween-20, brzina oksidacije dosledno menja unutar limita predviđanja. Koncentracija proteina utiče na oksidaciju, jer sa povećanjem brzine rasta od 0.58 do 2.69, koncentracija proteina opada od 0.3 do 0.1 mg/ml (dok je koncentracija Tween-20 konstantna pri 0.004%).

[0262]Ovi rezultati ukazuju da je održavanje koncentracije Tween-20 između 0.002 do 0.006% poželjno sa tačke gledišta stabilnosti. Količina proteina je takođe važna, jer se stabilnost pogoršava pri koncentracijama ispod 0.5 mg/ml.

Stabilnost na temperaturi rashlađivani a

[0263]Imajući u vidu sve navedeno, naredne formulacije su korišćene za procenu stabilnosti liofilizovanog Fc-TMP na temperaturi rashlađivan]a: 0.5 mg/ml Fc-TMP u 10 mM histidinu puferisanom na pH 5, 2% saharoza, 4% manitol i 0.004% Tween-20.

[0264]Praćena je stabilnost formulacije na temperaturi rashlađivanja tokom perioda od jedne godine. Tabela 45 prikazuje rezultate studije stabilnosti, sa rezultatima dobijenim pri nultom vremenu, nakon 3 meseca i 1 godine. Kao što je prikazano, procenat prečišćenosti glavnog maksimuma, izmeren reverzno-faznom i katjon-izmenjivačkom HPLC hromatografijom, ne smanjuje se sa vremenom. Male razlike čistoće glavnog maksimuma tokom vremena su uobičajene normalne varijacije rezolucije hromatografskih kolona i uočavaju se u smrznutim standardima. Procenat agregacije je dosledan i ne menja se sa vremenom od jedne godine.

[0265]Fc-TMP je formulisan u 10 mM histidinu, puferisanom na pH 5.0 sa 2% saharoze, 4% manitola i 0.004 % Tween-20. Pokazano je da je pH 5 pogodniji za stabilnost i da je odnos saharoza/manitol kritičan u eliminisanju hemijske degradacije nakon skladištenja ovog proteinskog sistema na povišenoj temperaturi. Tween-20 je neophodan u niskoj koncentraciji, kako bi se smanjila količina agregacije koja se dešava usled procesa liofilizacije. Studije stabilnosti za primenu u proizvodnji podupiru ove zaključke. Izvedene su statističke studije koje su potvrdile nivo svake pomoćne materije u formulaciji, kao i zahtev da koncentracija proteina bude na nivou 0.5 mg/ml. Stabilnost preporučne formulacije na temperaturi rashlađivanja ne pokazuje značajnu degradaciju nakon jednogodišnjeg skladištenja na 4°C.

Primer 8

Liofilizovani Fc- Ang- 2 vezujući peptid

[02661Da bi se odredila optimalna formulacija liofilizovanog Fc-Ang-2 vezujućeg peptida, izvršene su analize koje se procenile agregaciju Fc-Ang-2 vezujućeg peptida i stabilnost na različitim pH vrednostima, koncentracijama pomoćnih materija i koncentracijama proteina.

[0267]Fc-Ang-2 vezujući peptid sastoji se od dva farmaceutski aktivna polipeptidna molekula povezana za C-terminus Fc dela IgGl antitela. Ovaj molekul se sastoji od 574 amino-kiselinskih ostataka, sa ukupnom molekulskom masom od 63,511 Daltona. Vrednost pl ovog molekula je 5.45. Postoje dve disulfidne veze na svakom aktivnom polipeptidu. Postoji ukupno 20 cisteinskih ostataka u molekulu, od kojih je većina oksidovana u disulfidnim vezama. Sekvenca Fc-Ang-2 vezujućeg peptida je sledeća:

[0268]Fc deo IgGl molekula završava se na K228. G229-G233 sačinjava veznu sekvencu. Aktivni polipeptid počinje na A234 i pruža se do kraja sekvence.

Ispitivanje zavisnosti liofilizovanog Fc- Ang- 2 vezujućeg peptida od pH

[0269]Ispitivanje zavisnosti stabilnosti Fc-Ang-2 vezujućeg peptida od pH, sprovedeno je na pH 4.0, 7.0, i 8.0. Na pH 4.0, kao puferi su ispitani glutamatna kiselina, natrijum-citrat i natrijum-sukcinat, svaki u koncentraciji od 10 mM. Na pH 7.0, ispitani su histidin i Tris, oba u koncentraciji od 10 mM. Hisitidin i Tris su takođe ispitani na pH 8.0, oba u koncentraciji od 10 mM. Svi puferi su sadržali 4% manitol, kao agens za liofilizovani kolač i 2 % saharozu, kao pomoćnu materiju. Osim toga, ispitan je hisitidinski pufer na pH 7.0, sa ili bez prisustva površinski aktivne materije, 0.01% Tween 20 (w/w). Protein je razblažen do 5 mg/ml u svakom od formulacionih pufera. Ovaj rastvor je dijalizovan u svakoj formulaciji, pomoću cevčica za dijalizu sa limitom veličine od 10,000 Da, pri čemu je izvedeno ukupno 6 razmena sa najmanje 4 sata ekvilibracije između razmena. Nakon dijalize, protein je alikvotiran u staklene vajle od 3 cc, ukupne zapremine od 1 ml. Vajle su liofilizovane pomoću laboratorijskog instrumenta za suvo smrzavanje. Nakon liofilizacije, vajle su zaptivene i stavljene na inkubaciju na 4°C, 29°C i 37°C, gde je sadržaj pojedinačnih vajli analiziran u različitim vremenskim tačkama, počev neposredno nakon liofilizacije, sve do perioda od 24 meseca. Uzorci su rekonstituisani odgovarajućom zapreminom vode i analizirana je stabilnost proteina, primenom tečne hromatografije na osnovu veličine i gel elektroforeze (kojom se detektuje agregacija, dimerizacija i proteolitička razgradnja), anjon-izmenjivačke tečne hromatografije (kojom se detektuje oksidacija). Uz to, analizirana su svojstva kolača, kao što je vreme rekonstitucije i vlažnost i svojstva rekonstituisanog tečnog rastvora (kao što je pH).

Izučavanje pomoćnih materija formulacije Fc- Ang- 2 vezujućeg peptida

[0270]Ispitivanje pomoćnih materija je izvedeno u jednom puferu, 10 mM hisitidinu na pH 7.0. Dve pomoćne materije upoređene ovom studijom su 0.85% arginin i 1% saharoza. Agens za pravljenje kolača koji je primenjen uz arginin bio je 4% manitol, dok je uz saharozu korišćen 2%> glicin. Obe formulacije su testirane pri koncentracijama proteina od 1 mg/ml, 30 mg/ml, i 60 mg/ml. Uz to, jedna formulacija koja je sadržala kombinaciju manitola i saharoze testirana je pri koncentraciji od 30 mg/ml. Obe formulacije su sadržale 0.01 % Tween 20. Protein je najpre koncentrovan do 70 mg/ml i dijaliziran u odgovarajuću formulaciju pomoću laboratorijskog uređaja za ultrafiltraciju/dijafiltraciju. Protein je zatim razblažen na svaku od tri koncentracije odgovarajućim puferom za formulacije. Protein je alikvotiran u 3 cc staklene vajle zapremine od 1 ml. Vajle su zatim liofilizovane pomoću laboratorijske sprave za suvo smrzavanje. Nakon liofilizacije, vajle su zaptivene i stavljene na inkubaciju na 4°C, 29°C, 37°C, i 52°C, gde su pojedinačne vajle analizirane u različitim vremenima, počev od trenutka neposredno nakon liofilizacije, sve do perioda od 24 meseca. Uzorci su analizirani vezano za stabilnost proteina, primenom hromatograije na osnovu veličine, anjon-izmenjivačke hromatografije i SDS-PAGE. Takođe su analizirana svojstva liofilizovanog kolača i rekonstituisanih rastvora.

Isptivanje koncentracione zavisnosti liofilizovanog Fc- Ang- 2 vezujućeg peptida

[0271] Ispitivanje koncentracione zavisnosti izvedeno je u 10 mM histidinu, na pH 7.2, sa 4 % manitolom, kao agensom za pravljenje kolača i 2% saharozom, kao pomoćnom materijom. Protein je koncentrovan na oko 140 mg/ml i dijalizovan je u formulaciju primenom laboratorijskog instrumenta za ultrafiltraciju/dijafiltraciju. Dijalizovani protein je zatim razblažen na 30 mg/ml, 60 mg/ml i 120 mg/ml u formulacionom puferu. Rastvori su zatim alikvotirani u 3 cc staklene vajle zapremine od 1 ml. Vajle su liofilizovane pomoću laboratorijske sprave za suvo smrzavanje. Nakon liofilizacije, vajle su zaptivene i stavljene na inkubaciju na 4°C, 29°C, 37°C i 52°C, a zatim su pojedinačne vajle analizirane u različito vreme, počevši odmah nakon liofilizacije, sve do perioda od 24 meseca. Uzorci su analizirani u pogledu stabilnosti proteina primenom hromatografije na osnovu veličine, anjon-izmenjivačke hromatografije i SDS-PAGE. Takođe su analizirana svojstva liofilizovanog kolača i rekonstituisanih tečnih rastvora.

... Zaključak

[0272] Uzimajući sve u obzir, optimalna formulacija(e) uključuje 10 mM histidin, 4% manitol, 2% saharozu, 0.01% Tween-20, pH 7.0.

Primer 9

Liofilizovani Fc- Agp- 3 vezujući peptid

[0273] Da bi se odredila optimalna formulacija za liofilizaciju Fc-Agp-3 vezujućeg peptida, sprovedene su analize koje su procenile agregaciju Fc-Agp-3 vezujućeg peptida i stabilnost na različitim pH vrednostima, koncentracije pomoćnih materija i koncentracije proteina.

[0274] Fc-Agp-3 vezujući peptid je N-vezano peptitelo usmereno protiv aktivacionog faktora B limfocita (BAFF), sa ulogom u bolestima povezanim sa B limfocitima. Peptitelo je konstruisano od dva neglikozilovana disulfidno povezana polipeptida, sa ukupnom masom od~63.6 kD. Izolelektrična tačka ovog peptitela je procenjena na oko pH 7.36.

[0275] Fc SEKVENCA ( SEO ID NO: 1696) :

[0276]SEKVENCA Agp- 3 VEZUJUĆEG PEPTIDA ( SEO ID NO: 1697) :

[0277]Dakle, sekvenca Fc-Agp-3 vezujućeg peptida je sledeća:

Ispitivanje stabilnosti liofilizovanog Fc- Agp- 3 vezujućeg peptida na 10 mg/ ml u širokom

opsegu pH

[0278]Stabilnost je procenjena primenom HPLC na osnovu veličine (SE-HPLC), koja ukazuje na stabilnost na povišenim temperaturama. Da bi se procenila stabilnost i svojstva rekonstitucije liofilizovanog Fc-Agp-3 vezujućeg peptida u opsegu pH 3.85-7.6, formulisan je Fc-Agp-3 vezujući peptid u koncentraciji od 10 mg/mL u različitim 10 mM puferima u prisustvu 2.5% manitola i 2.0% saharoze. Testirani su sledeći puferi sa narastajućom pH od po 0.5 pH: acetatni, sukcinatni, histidinski, pirofosfatni, fosfatni i Tris.

[0279]Za razvijanje formulacije, prečišćena masa materijala dobijena je u koncentraciji od 30 mg/mL u vidu smrznute tečne formulacije. Materijal je dijaliziran u odgovarajući pufer za formulaciju i liofilizovan u Virtis liofilizeru, pomoću konzervativnog ciklusa. Korak vezivanja je obavljen na -20°C i trajao je 4 sata, kako bi se odigrao proces kristalizacije manitola. Primarno sušenje je izvedeno na temperaturi od -25°C tokom 20 sati. Primarno sušenje je završeno na -25°C, jer nije bilo skoka u vakuumu, kada je temperatura podignuta na 0°C. Nije uočen pad i uzorci su uspešno uvedeni u fazu sekundarnog sušenja, najpre na 0°C, a zatim na 25°C. Nakon rekonstitucije, formulacije na pH 7 ili više bile su blago zamućene, dok su formulacije na ostalim pH bile bistre. Ovo je objašnjeno bliskim vrednostima pH formulacija sa izolektričnom tačkom Fc-Agp-3 vezujućeg peptida (pl=7.36). SE-HPLC analiza je pokazala da je dimer glavna visoko molekulska vrsta. Uočeno je da relativni procenat dimera striktno zavisi od pH, sa najmanjom akumulacijom na pH 5 i manje. Količina solubilnih agregata takođe je ispoljila izvesnu pH zavisnost. Nisu uočeni solubilni agregati u uzorcima pre liofilizacije. Suprotno tome, mala količina dimera bila je prisutna u svim formulacijama pre liofilizacije, i ona je dalje rasla u rekonstituisanim uzorcima, nakon liofilizacije. Nije uočen značajan stepen isecanja u formulacijama. Najveća količina intaktnog monomera utvrđena je u acetatnoj, sukcinatnoj i histidinskoj formulaciji, na pH ispod 5.

Ispitivanje stabilnosti liofilizovanog Fc- Asg- 3 vezujućeg peptida na 30 mg/ ml u širokom

opsegu pH: stabilišući efekat saharoze i manitola

[0280] Stabilnost je procenjena primenom HPLC na osnovu veličine (SE-HPLC), koja ukazuje na stabilnost. Da bi se procenio efekat prisustva 2.5% manitola i 3.5% saharoze na stabilnost i rekonstituciona svojstva liofilizovanog Fc-Agp-3 vezujućeg peptida u opsegu pH od 4.5-7.5, Fc-Agp-3 vezujući peptid je formulisan u koncentraciji od 30 mg/mL u 10 mM sukcinatnom, histidinskom i fosfatnom puferu. Pirofosfatni i Tris puferi nisu uključeni u ovu studiju usled slabih karakteristika u prethodnom ispitivanju vezanom za širok opseg pH. Acetatni pufer je isključen usled mogućnosti pH promena u rekonstituisanim uzorcima, zbog sublimacije acetata tokom suvog smrzavanja.

[0281] Za potrebe razvoja formulacije, prečišćena masa materijala dobijena je u koncentraciji od 30 mg/mL, u vidu smrznute tečne formulacije. Materijal je dijaliziran u odgovarajućim formulacionim puferima i liofilizovan u Virtis liofilizatoru, primenom konzervativnog ciklusa. Korak vezivanja je izveden na -20°C i trajao je 5 sati kako bi se omogućila kristalizacija manitola. Primarno sušenje je obavljeno na temperaturi -25°C tokom 20 sati. Primarno sušenje nije se u potpunosti završilo na -25°C, i skokovi vakuuma su uočeni kada je temperatura povećana do 0°C. Nisu uočeni veliki pad i uzorci su uspešno prevedeni u fazu sekundarnog sušenja, najpre na 0°C, a zatim na 25°C. Nakon rekonstitucije, formulacije na pH oko 7 bile su blago zamućene, dok su ostale formulacije bile bistre. Kao što je prethodno rečeno, ovo bi moglo biti objašnjeno bliskim vrednostima pH formulacija i izoeletrične tačke Fc-Agp-3 vezujućeg peptida. SE-HPLC analiza pokazala je da je dimer glavna visoko molekulska vrsta. Opet je uočeno da relativni % dimera snažno zavisi od pH, sa najnižom akumulacijom na pH ispod 5. Količina solubilnih agregata nije pokazala jasnu pH zavisnost. Nisu uočeni solubilni agregati u uzorcima pre liofilizacije. Uočeno je da je~0.6%> dimera u ne-GMP masi pre formulacije, a da to raste sve do 3.0% u formulacije sa visokim pH pre liofilizacije, usled promene koncentracije pufera.

[0282] Zavisnost akumulacije dimera od pH takođe je potvrđena bliskom korelacijom relativne količine dimera na određenim pH, nezavisno od tipa pufera. Procenat dimera nije se značajno povećao nakon liofilizacije, što je dokazano uzorcima T=0. Jedini izuzetak bili su uzorci koji nisu sadržali ni jednu od dve pomoćne materije, saharozu i manitol, a koji su pokazali značajno povećanje % dimera, -0.25-0.5%. Smanjenje glavnog maksimuma u prisustvu saharoze bilo je neznatno, čak i nakon izmene pufera/liofilizacije u formulacijama sa sukcinatom i histidinom na pH 4.1, odnosno, 4.7. U poređenju sa njima, sve fosfatne formulacije pokazale su~3% smanjenja glavnog maksimuma pre liofilizacije. Iako se kolač formira čak i u odsustvu saharoze i manitola, odgovarajući glavni maksimum opada za 0.5-0.7% u poređenju sa formulacijama koje sadrže šećer. Uz to, rekonstitucija formulacija bez šećera bila je znatno duža (>2 min) i zahtevala je mešanje. Da bi se osigurala robusnost kolača, u sve naredne formulacije su kao sredstva za dopunjavanje uključeni manitol ili glicin, uprkos tome što je i sama saharoza bila sposobna da obezbedi stabilnost proteina.

Ispitivanje pH zavisnosti liofilizovanog Fc- Agp- 3 vezujućeg peptida u uskoj oblasti pH pri

30 mg/ ml

[0283] Stabilnost je procenjena primenom HPLC na osnovu veličine (SE-HPLC) i reverzno-fazne HPLC (RP- HPLC), koje ukazuju na stabilnost na povišenim temperaturama. S obzirom na to daje % oporavka glavnog maksimuma veći na vrednostima pH ispod 5, fosfatni pufer je izostavljen iz ovog pretraživanja u uskom pH opsegu. Osim, sukcinatnog i histidinskog pufera, koji su se dobro pokazali u ispitivanjima širokog opsega pH, u ovo ispitivanje uključenje 10 mM glutamat, pri pH 4-6. Formulacije su testirane u puferima sa pH vrednošću većom za po 0.2 pH jedinice. Sadržaj saharoze i manitola je držan na stalnom nivou od 3.5%>, odnosno, 2.5%, osim za dve sukcinatne formulacije na pH 4.5, sa 2.0 % i 5.0 % saharozom. Takođe, šest potencijalnih generičkih lioformulacija testirano je na svim variranim pH, kao što su:

1) 20 mM histidin, 2.0% glicin, 1.0% saharoza na pH 5.0

2) 20 mM histidin, 2.0% glicin, 1.0% saharoza na pH 6.0

3) 20 mM histidin, 2.0% glicin, 1.0% saharoza na pH 7.0

4) 20 mM histidin, 4.0% manitol, 2.0%> saharoza na pH 5.0

5) 20 mM histidin, 4.0% manitol, 2. 0% saharoza na pH 6.0

6) 20 mM histidin, 4.0% manitol, 2.0%> saharoza na pH 7.0

[0284] Za razvoj formulacija dobijen je prečišćeni materijal u koncentraciji od 30 mg/mL u vidu smrznute tečne formulacije. Ovaj materijal je dijalizovan u odgovarajuće pufere za formulaciju i liofilizovan primenom Virtis liofilizera, u konzervativnom ciklusu. Ciklus liofilizacije je dalje modifikovan. Korak vezivanja je izveden na -15°C kako bi se omogućila kristalizacija glicina i trajao je 5 sati. Primarno sušenje je obavljeno inicijalno na -30°C tokom kratkog perioda vremena (4 h). Zatim je temperatura podignura na - 25°C i držana na istom nivou sledeća 24 sata. Međutim, primarno sušenje nije se u potpunosti završilo na -25°C što je uočeno pojavom skoka u vakuumu, pa je temperatura skladištenja dodatno povećana na 0°C. Nije uočen značajan pad i uzorci su uspešno uvedeni u sekundarno sušenje, najpre na 0°C, a zatim na 25°C. Podaci o stabilnosti u liofilizovanom stanju praćeni su 6 meseci na 37°kako bi se dobila precizna slika o dugoročnoj stabilnosti Fc-Agp-3 vezujućeg peptida. Povećanje pH rezultira gubitkom glavnog maksimuma za sve histidinske formulacije. Samo su generičke formulacije praćene 6 meseci, ali je prednost pH na vrednostima oko 5 bila očigledna već nakon vremenske tačke od 1 i 3 meseca. Štaviše, podaci za generičke formulacije nakon 6 meseci ukazuju da formulacije manitol+saharoza stabilnije od formulacija glicin+saharoza, naročito na pH 6 i višim vrednostima.

[0285]U slučaju formulacija glutamata i sukcinata, uočeno je jasno pH-zavisno povećanje količine dimera, glavnog degradacionog proizvoda, na manje kiselim pH vrednostima. Slična pH zavisnost je uočena za agregate. Najveći oporavak glavnog maksimuma uočen je na pH 5 i niže. Inicijalni gubitak glavnog maksimuma za T=0 može se objasniti degradacijom proteina tokom izmene pufera i koncentrovanja, što je pokazano sličnim gubitkom u formulacijama pre liofilizacije. Međutim, podaci o 3-mesečnoj stabilnosti ukazuju da glutamatne formulacije ispoljavaju veću fizičku stabilnost od svojih sukcinatnih analoga (na istoj pH). Treba naglasiti da je u ovoj studiji testiran i uticaj povećanja koncentracije saharoze na stabilnost sukcinatnih formulacija. Osim 3.5% saharoze, uporedili smo i formulacije sa 2.0% i 5.0% saharozom u sukcinatu, na pH 4.5. Povećanje saharoze je do izvesne mere smanjilo molekulsku masu vrsta, ali nije značajno uticalo na glavni maksimum. Stoga je 3.5% saharoza smatrana optimalnom jer su ove formulacije najbliže odgovarale fiziološkoj toničnosti.

[0286]Jedna vrsta nastala isecanjem uočena je na niskim pH pomoću RP-HPLC. Značajan deo pH-zavisnog isecanja liofilizovanih formulacija dešava se pre liofilizacije, usled dugotrajne izmene pufera i koraka koncentrovanja proteina. Nakon liofilizacije nije uočeno značajno povećanje količine isečaka, čak i 3- do 6 meseci nakon skladištenja na 37°C. Uopšteno, podaci sugerišu primenu formulacija na višim pH kako bi se ublažilo isecanje, jer isecanje nije uočeno na pH 6 i više. Međutim, količina dimera je značajna na višim pH i može dostići i 2.5-4.5% na pH 6 i više. Stoga je nađen kompromis da se Fc-Agp-3 vezujući peptid formuliše na pH 5, na kojoj je isecanje umereno, naročito u glutamatnom i histidinskom puferu, a formiranje dimera još uvek značajno suprimirano.

Zaključak

[0287]Primena 2.5% manitola i 3.5% saharoze obezbeđuje dovoljnu stabilnost kolača i proteina, što je potvrđeno 6-mesečnom studijom skladištenja na 37°C. Stoga se može primeniti 10 mM histidin, 2.5% manitol, 3.5% saharoza na pH 5.0 i 10 mM glutamat, 2.5% manitol, 3.5% saharoza na pH 5.0, za fonriulisanje 30 mg/mL Fc-Agp-3 vezujućeg peptida. Osim toga, ova studija pokazuje da 20 mM histidin, 4.0% manitol, 2.0% saharoza na pH 5.0 takođe daju dobre efekte i da se mogu smatrati mogućim generičkim lioformulacijama za peptitela.

Primer 10

Liofllizovani Fc- Mvo vezujući peptid

[0288]Da bi se odredila optimalna formulacija za liofllizovani Fc-Myo vezujući peptid, sprovedene su analize sa ciljem da se procene agregacija i stabilnost Fc-Myo vezujućeg peptida na različitim pH vrednostima, koncentracije ekscipijenasa i koncentracije proteina.

[0289]Fc-Myo vezujući peptid je C-vezano peptitelo koje specifično prema miostatinu, sa ulogom u bolestima u kojima se javlja gubitak mišićne mase. Peptitelo je konstruisano od dva neglikozilovana disulfidno povezana polipeptida, ukupne mase od -59.1 kD. Određena je izoelektrična tačka ovog peptitela na vrednosti pH 6.88.

Fc SEKVENCA ( SEO ID NO: 1699) :

SEKVENCA MIOSTATIN VEZUJUĆEG PEPTIDA ( SEQ ID NO: 1700) :

[0290]Stoga je sekvenca Fc-Myo vezujućeg peptida kao što sledi:

Određivanje pH uslova za liofllizovani Fc- Mio vezujući peptid

[0291]Stabilnost je procenjena primenom HPLC na osnovu veličine (SE-HPLC), koja ukazuje na stabilnost na povišenim temperaturama. Studija ispitivanja pH zavisnosti osmišljena je i sprovedena da se odredi optimalna pH formulacije u tečnom stanju pre liofilizacije. Protein je formulisan na pH 4.5, 4.75, 5.0, 5.5 i 6.0 sa puferskim agensima acetatom i histidinom, i saharozom kao stabilizatorom (ili lioprotektorom). Formulisane vajle su ostavljene na 29°C sve do 1 godine. Stabilnost je praćena pomoću SE-HPLC. Konstanta brzine agregacije je izračunata za svaki uslov formulacije posebno. Utvrđeno je daje brzina agregacije na pH 4.5 minimalna, pa je pH 4.5 izabrana kao poželjan pH uslov za formulaciju.

Ispitivanje puferskog agensa za formulaciju liofilizovanog Fc- Myo vezujućeg peptida pri 30

mg/ mL.

[0292]Stabilnost je procenjena HPLC na osnovu veličine (SE-HPLC), koja ukazuje na stabilnost. Istražena je koncentracija od 30 mg/mL primenom tri različita puferska agensa: 10 mM glutamat, 10 mM histidin i 10 mM sukcinat, na pH 4.5. Sve formulacije su sadržale 0.004% polisorbat 20.

[0293]Za razvoj formulacija, prečišćeni materijal je dobijen u koncentraciji od 30 mg/mL u vidu smrznute tečne formulacije. Materijal je dijalizovan u odgovarajuće pufere i liofilizovan u Virtis liofilizeru, primenom konzervativnog ciklusa. Formulacija liofilizovanog proteina je ispoljila prihvatljive karateristike kolača. Nakon rekonstitucije, formulacije Fc-Myo vezujućeg peptida bile su bistre i skladištene su na 4, 29, 37 i 52°C. Studije stabilnosti u realnom vremenu sprovedene na 4°C pokazale su sličnu stabilnost kod svih formulacija nakon 3 meseca. Međutim, skladištenje na 52°C tokom 3 meseca za formulacije sa histidinom bilo je nešto bolje nego kod formulacija sa glutamatom. Formulacije sa sukcinatom bile su značajno manje stabilne od preostale dve formulacije. Na osnovu ovih rezultata, histidin i glutamat su dalje uzeti u razmatranje kao poželjni puferski agensi za finalnu formulaciju Fc-Myo vezujućeg peptida.

Studija pomoćnih materija za liofllizovani Fc- Myo vezujući peptid pri 30 mg/ ml: stabilišući

uticaj saharoze, trehaloze i hidroksietil škroba

[0294]Stabilnost je procenjena primenom HPLC na osnovu veličine (SE-HPLC. Da bi se procenio efekat prisustva trehaloze, hidroksietil škroba i saharoze na stabilnost liofilizovanog Fc-Myo vezujućeg peptida, Fc-Myo vezujući peptid je formulisan u koncentraciji od 30mg/mL u 10 mM glutamatnom puferu, sa 4% manitola. Primenjene koncentracije trehaloze i saharoze su 2.0 %, a 1 % hidroksietil skorb je dodat formulaciji saharoze kako bi se dobila finalna formulacija 10 mM glutamat, 4% manitola, 2% saharoze, 1% hidroksietil škroba. Sve formulacije sadržale su 0.004% polisorbat-20.

[0295]Za razvoj formulacija, prečišćena masa materijala je dobijena u koncentraciji od 30 mg/mL, u vidu smrznute tečne formulacije. Ovaj materijal je dijalizovan u odgovorajući pufer za formulisanje i liofilizovan primenom Virtis liofilizera, u konzertavnom ciklusu. Liofilizovana proteinska formulacija ispoljila je kolač zadovoljavajućih karakteristika. Nakon rekonstitucije, formulacije su bile bistre. Stabilnost ovi formulacije je praćena primenom SE-HPLC.

[0296]Liofllizovani Fc-Myo vezujući peptid je deponovan na 4, 29, 37 i 52°C. Sve formulacije su pokazale sličnu stabilnost pri realnim uslovima skladištenja (4°C) sve do perioda od 3 meseca. Međutim, pod uslovima skladištenja na 52°C tokom 3 meseca, formulacija koja je sadržala saharozu bila je nešto bolja od formulacije koja je sadržale trehalozu. Dodavanje hidroksietil škroba nije ispoljilo nikakav negativan uticaj na stabilnost. Na osnovu ovih rezultata zaključeno je da je saharoza poželjan stabilizator u finalnoj formulaciji Fc-Myo vezujućeg peptida.

Studija pomoćnih materija liofilizovanog Fc- Myo vezujućeg peptida pri 30 mg/ ml: stabilišući

efekat saharoze i manitola

[0297]Stabilnost je procenjena primenom HPLC na osnovu veličine (SE-HPLC), koja može da ukaže na stabilnost formulacije. Da bi se procenio efekat prisustva različitih količina manitola i saharoze na stabilnsot i rekonstuticiona svojstva liofilizovanog Fc-Myo vezujućeg peptida u opsegu manitola od 4.0 do 8% i saharoze od 1.0% do 4. 0%, Fc- Myo vezujući peptid je formulisan pri koncentraciji od 30 mg/mL u 10 mM glutamatnom puferu. Sve formulacije su sadržale 0.004% polisorbat-20.

[0298]Za razvoj formulacije, prečišćena glavnina materijala je dobijena u koncentraciji od 30 mg/mL u vidu smrznute tečne formulacije. Ovaj materijal je dijalizovan u odgovarajuće pufere za formulaciju i liofilizovan pomoću Virtis liofilizera, u konzervativnom ciklus. Liofilizovana formulacija proteina je ispoljila kolač prihvatljivih karakteristika. Nakon rekonstitucije sve formulacije su bile bistre.

[0299]Stabilnost ovih formulacija je praćena primenom SE-HPLC postupka. Liofllizovani Fc-Myo vezujući peptid je skladišten na 4, 29, 37 i 52°C. Sve formulacije su ispoljile sličnu stabilnost pri realnim uslovima skladištenja (4°C) do perioda od 3 meseca. Međutim, u uslovima skladištenja na 52°C tokom 3 meseca, povećana količina saharoze ispoljila je pozitivan uticaj na stabilnost u odnosu na agregaciju. Međutim, da bi se održali potrebni izotonični uslovi u finalnoj formulaciji, što ograničava ukupnu količinu disaharida, kao i da bi se održao odgovarajući odnos manitola i saharoze sa ciljem očuvanja svojstva lioflilizovanog kolača, zaključeno je da su 4.0% manitol i 2.0% saharoza poželjne pomoćne materije u finalnim formulacijama.

Studija pomoćnih materija liofilizovanog Fc- Myo vezujućeg peptida u koncentracijama 1, 30,

85 mg/ mL

[0300]Stabilnost je procenjena HPLC na osnovu veličine (SE-HPLC). Za procenu efekta koncentracije proteina na stabilnost i rekonstituciona svojstva liofilizovanog Fc-Myo vezujućeg peptida, Fc-Myo vezujući peptid je formulisan u koncentracijama od 1, 30, 85 mg/mL u 10 mM glutamatnom puferu sa 4% manitolom i 2% saharozom. Sve formulacije su sadržale 0.004% polisorbat-20.

[0301]Za razvoj formulacije, prečišćeni materijal je dobijen u vidu 30 mg/mL smrznute tečne formulacije. Materijal je puferski izmenjen u odgovarajući pufer za formulacije primenom UF/DF, i liofiliozovan je pomoću Virtis liofilizera u konzervativnom ciklusu. Liofilizovana formulacija proteina pokazala je zadovoljavajuća svojstva kolača. Nakon rekonstitucije, formulacije su bile bistre.

[0302]Stabilnost ovih formulacija je praćena primenom SE-HPLC postupka. Liofllizovani Fc-Myo vezujući peptid je skladišten na 4, 29, 37°C. U svim formulacijama stabilnost u realnim uslovima skladištenja (4°C) bila je slična sve do perioda od 6 meseci. Stabilnost svih testiranih koncentracija je prihvatljiva za primenu u komercijalnim formulacijama.

Zaključak

[03031Zaključeno je da 4.0 % manitol i 2.0%> saharoza obezbeđuju prihvatljive karateristike kolača i stabilnost proteina, što je potvrđeno 12-mesečnom studijom na 4°C. Stoga, 10 mM histidin, 4.0% manitol, 2.0% saharoza, na pH 4.5 i 10 mM glutamat, 4.0% manitol, 2.0% saharoza na pH 4.5 mogu se primeniti za formulisanje 1 do 100 mg/mL Fc-Myo vezujućeg peptida.

Claims

1. Kompozicija lifilizovanog peptitela koja uključuje pufer, sredstvo za dopunjavanje, stabilizator, i površinski aktivnu materiju; naznačena time da pufer obuhvata pH puferski agens, naznačen time daje: a) navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i daje pH 5.0; navedena sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je is 0.004% w/v polisorbat-20; ili b) navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i pH je 7.0; navedena sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je 0.01 % w/v polisorbat-20; ili c) navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i pH je 5.0; navedena sredstvo za dopunjavanje je 2.5% w/v manitol; i navedeni stabilizator je 3.5 % w/v saharoza; ili d) navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i pH je 4.5; navedena sredstvo za dopunjavanje je 4 % w/v manitol; navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je 0.004% w/v polisorbat-20; ili e) navedeni pH puferski agens je 20 mM histidin i pH 5.0; navedena sredstvo za dopunjavanje je 4.0 % w/v manitol; i navedeni stabilizator je 2.0 % w/v saharoza; i naznačeno time da peptitelo uključuje strukturu predstavljenu Formulom I, naznačena time da: F<1>je neki Fc domen; X<1>je izabran između: x<2>je izabran između: naznačeno time da su P<1>,<p2>,<p3>?i<p4>svaki za sebe, sekvence farmakološki aktivnih peptida; L<1>, L<2>, l<3>, l<4>, i L<$>su svaki za sebe veznici; a, b, c, e, f, g, i h su nezavisno jedan od drugog 0 ili 1, uz uslov da najmanje jedan od njih, a ili b, ima vrednosti 1; d je 0, 1, ili veće od 1; i WSP hidrosolubilni polimer, čije je vezivanje pod uticaj em svih reaktivnih grupa naFl.

Kompozicija saglasno zahtevu 1, naznačena time da peptitelo uključuje a) strukturu predstavljenu Formulom II naznačenu time da je Fc domen vezan za C-terminus X<l>, i da je nula, jedan ili više WSP vezano za Fc domen, opcioni preko veznika L; ili b) strukturu predstavljenu Formulom III naznačenu time da je Fc domen vezan za N-terminus X<2>, i da je nula, jedan ili više WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika L; ili c) strukturu predstavljenu Formulom IV naznačenu time da je Fc domen vezan za N-terminus -(L<l>)c-P<l>i da je nula, jedan ili više WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika L<1>; ili d) strukturu prikazanu Formulom V naznačenu time daje Fc domen vezan za N-terminus -L<l->P<l->L<2->?<2>i daje nula, jedan ili više, WSP vezano za Fc domen, opciono preko veznika L<1>.

3. Kompozicija saglasno zahtevima 1 ili 2, naznačena tima da je peptitelo multimer ili dimer.

4. Kompozicija saglasno svim zahtevima 1 do 3, naznačena time da su P<1>, P<2>,<p3>i/ili<p4>nezavisno izabrani između peptida predstavljenih u nekoj od Tabela 4 do 38.

5. Kompozicija saglasno zahtevu 4, naznačena time da P<1>, P<2>,<p3>i/ili<p4>poseduju istu amino-kiselinsku sekvencu.

6. Kompozicija saglasno svakom od zahteva 1 do 5, naznačena time da je Fc domen predstavljen sekvencom SEQ ID NO: 1.

7. Kompozicija saglasno svakom od zahteva 1 do 6, naznačena time da WSP jeste PEG.

8. Kompozicija saglasno svim zahtevima 1 do 7, naznačena time da je sekvenca Fc domena predstavljena u SEQ ID NO: 1 i da WSP jeste PEG.

9. Kompozicija saglasno zahtevu 8, naznačena time da PEG ima molekulsku masu od oko 2 kD do oko 100 kDa ili od oko 6 kDa do 25 kDa.

10. Kompozicija saglasno zahtevu 9, naznačena time da kompozicija uključuje najmanje 50 % PEGilovanih peptitela, ili najmanje 75% PEGilovanih peptitela, ili najmanje 85% PEGilovanih peptitela, ili najmanje 90% PEGilovanih peptitela, ili najmanje 95% PEGilovanih peptitela.

11. Kompozicija saglasno svakom svim zahtevima 1 do 10, naznačena time da je koncentracija peptitela između oko 0.25 mg/mL i 250 mg/mL.

12. Kompozicija saglasno svakom od zahteva 1 do 11, naznačena time daje sekvenca Fc domena SEQ ID NO:l, Lje (Gly)5, P<1>i P<2>su SEQ ID NO:459, L2 je (Gly)s; e =1, f=l,c = 0, id=0.

13. Kompozicija saglasno svim zahtevima od 1 do 11, naznačena time da je sekevnca Fc domena predstavljena u SEQ ID NO:l, peptitelo obuhvata strukturu Formule V, L<1>je (Gly)5, P<l>i P<2>imaju sekvencu SEQ ID NO:459, L<2>je (Gly)g; e =1, f=1, c = 0, i d=0.

14. Kompozicija saglasno svim zahtevima 1 do 11, naznačena time daje sekvenca Fc domena predstavljena u SEQ ID NO: 1 i naznačena time da peptitelo uključuje SEQ IDNO: 1017.

15. Kompozicija saglasno zahtevu 14, naznačena time da je metionin na N-terminusu peptitela, SEQ ID NO; 1017 je na C-terminusu navedenog metionina i SEQ ID NO: 1 je na C-terminusu peptitela.

16. Kompozicija saglasno zahtevu 14, naznačena time da je metionin na N-terminusu peptitela, SEQ ID NO: 1 je na C- terminusu navedenog metionina i SEQ ID NO: 1017 je na C-terminusu peptitela.

17. Kompozicija saglasno svim zahtevima 12 do 16, naznačena time daje: navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i da je pH 5.0; navedena sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je 0.004 % w/v polisorbat-20.

18. Kompozicija saglasno zahtevima 1 do 11, naznačena time da peptitelo uključuje sekvencu SEQ ID NO: 2.

19. Kompozicija saglasno zahtevu 18, naznačena time daje: navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i da je pH 7.0; navedena sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je 0.004 % w/v polisorbat-20.

20. Kompozicija saglasno svim zahtevima 1 do 11, naznačena time da peptitelo uključuje sekvencu SEQ ID NO: 1698.

21. Kompozicija saglasno zahtevu 20, naznačena time daje: a) navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i da je pH 5.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 2.5% w/v manitol i navedeni stabilizator je 3.5 % w/v saharoza; ili b) navedeni pH puferski agens je 20 mM histidin i daje pH 5.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza.

22. Kompozicija saglasno svakom od zahteva 1 do 11, naznačena time da sekvenca peptitela uključujue SEQ ID NO: 1701.

23. Kompozicija saglasno zahtevu 23, naznačena time daje: navedeni pH puferski agens je 10 mM histidin i da je pH 4.5; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2 % w/v saharoza.

24. Postupak pripreme kompozicije peptitela, navedene u svakom od zahteva 1 do 24, gde postupak obuhvata korake: i) pripremu rastvora pufera, sredstva za dopunjavanje, stabilizatora i površinski aktivne materije; naznačenu time da se pufer sastoji od pH puferskog agensa , naznačenog time daje a) navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i da je pH 5.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2% w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je 0.004% w/v polisorbat-20; ili b) navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i da je pH 7.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2% w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je 0.004% w/v polisorbat-20; ili c) navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i pH 5.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 2.5% w/v manitol; i navedeni stabilizator je 3.5% w/v saharoza; ili d) navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i da je pH 4.5; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 2.5% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2% w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je 0.004% w/v polisorbat-20; ili e) navedeni pH puferski agens 20 mM histidin i daje pH 5.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 4 % w/v manitol; i navedeni stabilizator je 2% w/v saharoza; ii) i liofilizacije navedenog rastvora.

25. Postupak dobijanja kompozicije rekonstituisanog peptitela, koji uključuje korake: a) pravljena liofilizovane kompozicije peptitela, saglasno zahtevu 25; i b) rekonstitucije navedene liofilizovane kompozicije peptitela.

26. Komplet za dobijanje vodene farmaceutske kompozicije, koji obuhvata jedan kontejner sa liofiliozovanom kompozicijom peptitela saglasno svakom od zahteva 1 do 24 i drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv rastvarač liofilizovane kompozicije peptitela.

27. Postupak iz zahteva 25, naznačen time da je Fc domen sekvenca SEQ ID NO:l peptitela koju uključuje strukturu Formule V, L<1>je (Gly)5, P<1>i P<2>su svaki nezavisno SEQ ID NO:459, L<2>je (Gly)g; e =1, f=1, c = 0, i d=0.

28. Postupak saglasno zahtevu 25, naznačen time daje Fc domen sekvence SEQ ID NO:l peptitela koji uključuje strukturu Formula V, Lje (Gly)5, P<1>i P<2>su SEQ ID NO:459, L<2>je (Gly)g; e =1, f=1, c = 0, i d=0.

29. Postupak saglasno zahtevu 25, naznačen time da je Fc domen SEQ ID NO: 1 i naznačen time da peptitelo uključuje SEQ ID NO: 1017.

30. Postupak saglasno zahtevu 25, naznačen time daje metionin na N-terminusu peptitela, SEQ ID NO; 1017 je na C- terminusu navedenog metionina i SEQ ID NO: 1 je na C-terminusu peptitela.

31. Postupak saglasno zahtevu 25, naznačen time daje metionin na N-terminusu peptitela, SEQ ID NO: 1 je na C- terminusu navedenog metionina i SEQ ID NO: 1017jenaC-terminusu peptitela.

32. Postupak saglasno svakom od zahteva 28 do 32, naznačen time daje: navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i da je pH 5.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2% w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je 0.004% w/v polisorbat-20.

33. Postupak saglasno zahtevu 25, naznačen time da peptitelo uključuje SEQ ID NO:2.

34. Postupak saglasno zahtevu 34, naznačen time daje: navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i da je pH 7.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; navedeni stabilizator je 2% w/v saharoza; i navedena površinski aktivna materija je 0.004% w/v polisorbat-20.

35. Postupak saglasno zahtevu 25, naznačen time da peptitelo uključuje SEQ ID NO:1698.

36. Postupak saglasno zahtevu 36, naznačen time daje: a) navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i da je pH 5.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 2.5% w/v manitol; i navedeni stabilizator je 3.5% w/v saharoza; ili b) navedeni pH puferski agens 20 mM histidin i da je pH 5.0; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; i navedeni stabilizator je 2% w/v saharoza.

37. Postupak saglasno zahtevu 25, naznačen time da peptitelo uključuje sekvencu SEQ ID NO: 1701.

38. Postupak saglasno zahtevu 38, naznačen time daje: navedeni pH puferski agens 10 mM histidin i daje pH 4.5; navedeno sredstvo za dopunjavanje je 4% w/v manitol; i navedeni stabilizator je 2% w/v saharoza.