BRPI0710508A2 - composição de pepticorpo terapêutico liofilizado, métodos para fabricar um papticorpo terapêutico liofilizado e para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico liofilizado e para preparar uma composição farmacêutica aquosa - Google Patents

composição de pepticorpo terapêutico liofilizado, métodos para fabricar um papticorpo terapêutico liofilizado e para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico liofilizado e para preparar uma composição farmacêutica aquosa Download PDF

Info

Publication number
BRPI0710508A2
BRPI0710508A2 BRPI0710508-8A BRPI0710508A BRPI0710508A2 BR PI0710508 A2 BRPI0710508 A2 BR PI0710508A2 BR PI0710508 A BRPI0710508 A BR PI0710508A BR PI0710508 A2 BRPI0710508 A2 BR PI0710508A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
sucrose
therapeutic peptibody
mannitol
composition according
protein
Prior art date
Application number
BRPI0710508-8A
Other languages
English (en)
Inventor
William J Callahan
Richard L Remmele Jr
Gayathri Ratnaswamy
Ramil F Latypov
Dingjiang Liu
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38625630&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0710508(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of BRPI0710508A2 publication Critical patent/BRPI0710508A2/pt
Publication of BRPI0710508B1 publication Critical patent/BRPI0710508B1/pt
Publication of BRPI0710508B8 publication Critical patent/BRPI0710508B8/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

COMPOSIçãO DE PEPTICORPO TERAPêUTICO LIOFILIZADO, MéTODOS PARA FABRICAR UM PEPTICORPO TERAPêUTICO LIOFILIZADO E PARA PREPARAR UMA COMPOSIçãO DE PEPTICORPO TERAPêUTICO RECONSTITUìDO, E, KIT PARA PREPARAR UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA AQUOSA. A presente invenção fornece formulações estáveis de longa duração de um pepticorpo terapêutico liofilizado e métodos para fabricar uma composição liofilizada compreendendo um pepticorpo terapêutico.

Description

"COMPOSIÇÃO DE PEPTiCORPO TERAPÊUTICO LIOFlL IZ ADO, MÉTODOS PARA FABRICAR UM PEPTICORPO TERAPÊUTICO LIOFILIZADO E PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE PEPTICOiajO TERAPÊUTICO RECONSTITUÍDO, E, KIT PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA" CAMPO DA INVENÇÃO
No geral, a invenção diz respeito às formulações de pepticorpos terapêuticos liofilizados e métodos para fabricar uma composição liofilizada compreendendo os pepticorpos terapêuticos. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
As proteínas recombinantes são uma classe emergente de agentes terapêuticos. Tais produtos terapêuticos recombinantes têm engendrado avanços na formulação e modificação química de proteína. Modificações foram identificadas que podem proteger proteínas terapêuticas, primariamente pelo bloqueio da sua exposição às enzimas proteolíticas. As modificações de proteína também podem aumentar a estabilidade da proteína terapêutica, tempo de circulação e atividade biológica. Um artigo de revisão que descreve a modificação de proteína e proteínas de fusão é Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Mediscript, Londres), que é aqui incorporada por referência.
Uma modificação útil é a combinação de um polipeptídeo com um domínio "Fc" de um anticorpo. Os anticorpos compreendem duas partes funcionalmente independentes, um domínio variável conhecido como "Fab," que liga antígeno e um domínio constante conhecido como "Fc," que se liga a tais funções efetoras como ativação de complemento e ataca pelas células fagocíticas. Um Fc tem uma meia vida sérica longa, ao passo que um Fab é de vida curta. Capon et al. (1989), Nature 337: 525-31. Ver também, por exemplo, Patente U.S. N0 5.428.130. Quando construído junto com um pepticorpo ou proteína terapêuticos, um domínio Fc pode fornecer meia vida mais longa ou incorporar funções tais como ligação de receptor de Fc, ligação de proteína A, fixação de complemento e talvez até a transferência placentária. Id. A Tabela 1 resume o uso de fusões de Fc com proteínas terapêuticas conhecidas na técnica. Tabela 1 - Fusão de Fc com proteínas terapêuticas <table>table see original document page 3</column></row><table>
Polietileno glicol ("PEG") conjugado ou proteínas de fusão e peptídeos também foram estudados para o uso em produtos farmacêuticos, em implantes artificiais e outras aplicações onde a biocompatibilidade é de importância. Vários derivados de PEG foram propostos que têm uma porção ativa para permitir que o PEG seja ligado a produtos farmacêuticos e implantes e às moléculas e superfícies no geral. Por exemplo, derivados de PEG foram propostos para ligar PEG às superfícies para controlar umectação, desenvolvimento de estática e ligação de outros tipos de moléculas à superfície, incluindo proteínas ou resíduos de proteína.
Em outros estudos, a ligação de PEG ("PEGuilação") tem sido mostrada ser desejável na superação de obstáculos encontrados em uso clínico de moléculas biologicamente ativas. A Publicação PCT publicada N0 WO92/16221 estabelece, por exemplo, que muitas proteínas potencialmente terapêuticas foram descobertas ter uma meia vida curta no soro sangüíneo.
A PEGuilação diminui a taxa de depuração da corrente sangüínea aumentando-se o peso molecular aparente da molécula. Até um certo tamanho, a taxa de filtração glomerular de proteínas é inversamente proporcional ao tamanho da proteína. A capacidade de PEGuilação para diminuir a depuração, portanto, no geral não é uma função de quantos grupos de PEG estão ligados à proteína, mas do peso molecular global da proteína conjugada. A depuração diminuída pode levar à eficácia aumentada em relação ao material não PEGuilado. Ver, por exemplo, Conforti et al., Pharm. Research Commun. vol. 19, pg. 287 (1987) e Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. vol. 84, pg. 1487 (1987).
Além disso, a PEGuilação pode diminuir a agregação de proteína, (Suzuki et al., Biochem. Biophys. Acta vol. 788, pg. 248 (1984)), alterar (i.e.,) a imunogenicidade da proteína (Abuchowski et al., J. Biol. Chem. vol. 252 pg. 3582 (1977)) e aumentar a solubilidade da proteína como descrito, por exemplo, na Publicação PCT N0 WO 92/16221.
No geral, a interação de um ligando de proteína com seu receptor freqüentemente ocorre em uma interface relativamente grande. Entretanto, como demonstrado no caso do hormônio do crescimento humano ligado ao seu receptor, apenas uns poucos resíduos chave na interface realmente contribuem para a maior parte da energia de ligação. Clackson, T. et al., Science 267: 383-386 (1995). Esta observação e o fato de que o grosso do ligando de proteína remanescente serve apenas para demonstrar os epítopos de ligação na topologia certa torna possível descobrir ligandos ativos de tamanho muito menor. Assim, moléculas de comprimento apenas de "peptídeo" como aqui definidas podem ligar-se à proteína receptora de um dado ligando de proteína grande. Tais peptídeos podem imitar a bioatividade do ligando de proteína grande ("agonistas de peptídeo") ou, através da ligação competitiva, inibem a bioatividade do ligando de proteína grande ("antagonistas de peptídeo").
As bibliotecas de peptídeo de demonstração de fago têm emergido como um método poderoso na identificação de tais agonistas e antagonistas de peptídeo. Ver, por exemplo, Scott et al. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990), Science 249: 404; Pat. U.S. N0 5.223.409, concedida em 29 de junho de 1993; Pat. U.S. N0 5.733.731, concedida em 31 de março de 1998; Pat. U.S. N0 5.498.530, concedida em 12 de março de 1996; Pat. U.S. N0 5.432.018, concedida em 11 de julho de 1995; Pat. U.S. N0 5.338.665, concedida em 16 de agosto de 1994; Pat. U.S. N0 5.922.545, concedida em 13 de julho de 1999; WO 96/40987, publicada em 19 de dezembro de 1996; e WO 98/15833, publicada em 16 de abril de 1998, cada uma da qual é incorporada por referência. Em tais bibliotecas, as seqüências de peptídeo aleatórias são demonstradas pela fusão com proteínas de revestimento de fago filamentoso. Tipicamente, os peptídeos demonstrados são eluídos por afinidade contra um domínio extracelular imobilizado por anticorpo de um receptor. Os fagos retidos podem ser enriquecidos pelas rodadas sucessivas de purificação por afinidade e repropagação e os melhores peptídeos de ligação são seqüenciados para identificar resíduos chave dentro de uma ou mais famílias estruturalmente relacionadas de peptídeos. Ver, por exemplo, Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, em que duas famílias distintas foram identificadas. As seqüências de peptídeo também podem sugerir que resíduos podem ser substituídos com segurança pela varredura de alanina ou pela mutagênese ao nível de DNA. As bibliotecas de mutagênese podem ser criadas e triados para otimizar ainda mais a seqüência dos melhores aglutinantes. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24.
Outros métodos competem com a demonstração de fago na pesquisa de peptídeo. Uma biblioteca de peptídeo pode ser fundida ao terminal carboxila do repressor lac e expressada na E. coli. Um outro método com base na E. coli permite demonstrar na membrana externa da célula pela fusão com uma lipoproteína associada com peptidoglicano (PAL). Estes e métodos relacionados são coletivamente aludidos como "demonstração de E. coli." Um outro método biológico para triar misturas de peptídeo solúveis usa levedura para a expressão e secreção. Ver Smith et al. (1993), Mol. Pharmacol. 43: 741-8. O método de Smith et al. e métodos relacionados são aludidos como "triagem com base em levedura." Em um outro método, a tradução de RNA aleatório é parada antes da liberação de ribossoma, resultando em uma biblioteca de polipeptídeos com seu RNA associado ainda ligado. Estes e métodos relacionados são coletivamente aludidos como "demonstração dc ribossoma." Outros métodos utilizam a ligação química de peptídeos ao RNA; ver, por exemplo, Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 12297-303. Estes e métodos relacionados são coletivamente aludidos como "triagem de RNA-peptídeo." As bibliotecas de peptídeo quimicamente derivadas foram desenvolvidas em que peptídeos são imobilizados em materiais estáveis, não biológicos, tais como varetas de polietileno ou resinas permeáveis a solvente. Uma outra biblioteca de peptídeo quimicamente derivada usa fotolitografia para varrer peptídeos imobilizados em lâminas de vidro. Estes e métodos relacionados são coletivamente aludidos como "triagem química de peptídeo." A triagem química de peptídeo pode ser vantajosa em que a mesma permite o uso de D- aminoácidos e outros análogos não naturais, assim como elementos não peptídicos. Os métodos tanto biológicos quanto químicos são revisados em Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62.
No caso de peptídeos bioativos conhecidos, o planejamento racional de ligandos de peptídeo com propriedades terapêuticas favoráveis pode ser realizado. Em um tal método, mudanças escalonadas são feitas a uma seqüência de peptídeo e o efeito da substituição na bioatividade ou em uma propriedade biofísica previsível do peptídeo (por exemplo, estrutura da solução) é determinado. Estas técnicas são coletivamente aludidas como "planejamento racional." Em uma tal técnica, uma série de peptídeos é fabricada em que um único resíduo de uma vez é substituído com alanina. Esta técnica é habitualmente aludida como uma "marcha de alanina" ou uma "varredura de alanina." Quando dois resíduos (contíguos ou espaçados) são substituídos, é aludido como uma "marcha de alanina dupla." As substituições de aminoácido resultantes podem ser usadas sozinhas ou em combinação para resultar em uma nova entidade de peptídeo com propriedades terapêuticas favoráveis.
A análise estrutural da interação de proteína-proteína também pode ser usada para sugerir peptídeos que imitem a atividade de ligação de ligandos de proteína grandes. Em uma tal análise, a estrutura cristalina pode sugerir a identidade e orientação relativa de resíduos críticos do ligando de proteína grande, a partir do qual um peptídeo pode ser planejado. Ver, por exemplo, Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70. Estes e métodos relacionados são aludidos como "análise estrutural de proteína." Estes métodos analíticos também podem ser usados para investigar a interação entre uma proteína receptora e peptídeos selecionados pela demonstração de fago, que pode sugerir outra modificação dos peptídeos para aumentar a afinidade de ligação. Conceitualmente, miméticos de peptídeo de qualquer proteína podem ser identificados usando a demonstração de fago e os outros métodos mencionados acima. Estes métodos também foram usados para o mapeamento de epítopo, para a identificação de aminoácidos críticos nas interações de proteína-proteína e como guias para a descoberta de novos agentes terapêuticos. Por exemplo, Cortese et al. (1996), Curr. Opin. Biotech. 7: 616-21. As bibliotecas de peptídeo estão agora sendo usadas mais freqüentemente em estudos imunológicos, tais como no mapeamento de epítopo. Kreeger (1996), The Scientist 10(13): 19-20.
De interesse particular é o uso de bibliotecas de peptídeo e outra técnicas na descoberta de peptídeos farmacologicamente ativos. Vários de tais peptídeos identificados na técnica são resumidos na Tabela 2. Os peptídeos são descritos nas publicações listadas, cada uma da qual é aqui incorporada por referência. A atividade farmacológica dos peptídeos é descrita e em muitos casos é seguida por um termo resumido para a mesma em parênteses. Alguns destes peptídeos foram modificados (por exemplo, para formar dímeros reticulados de terminal C). Tipicamente, bibliotecas de peptídeo foram tríadas quanto a ligação a um receptor para uma proteína farmacologicamente ativa (por exemplo, receptor EPO). Em pelo menos um caso (CTLA4), a biblioteca de peptídeo foi tríada quanto a ligação a um anticorpo monoclonal.
Tabela 2 - Peptídeos farmacologicamente ativos
<table>table see original document page 8</column></row><table>
A proteína listada nesta coluna pode ser ligada pelo peptídeo associado (por exemplo, receptor de EPO, receptor de EL-I) ou imitado pelo peptídeo associado. As referências listadas para cada <table>table see original document page 9</column></row><table> <table>table see original document page 10</column></row><table> <table>table see original document page 11</column></row><table> <table>table see original document page 12</column></row><table> <table>table see original document page 13</column></row><table>
Os peptídeos identificados pela triagem de biblioteca de peptídeo foram considerados como "guias" no desenvolvimento de agentes terapêuticos ao invés de serem usados como os próprios agentes terapêuticos. Como outras proteínas e peptídeos, estes podem ser rapidamente removidos in vivo pela filtração renal, mecanismos de depuração celular no sistema reticuloendotelial ou degradação proteolítica. (Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-11.) Como um resultado, a técnica presentemente usa os peptídeos identificados para validar alvos medicamentosos ou como esqueletos para o planejamento de compostos orgânicos que não teriam sido tão facilmente ou tão rapidamente identificados através da triagem de biblioteca química. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: .401-24; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8.
Tipicamente, os peptídeos purificados são apenas marginalmente estáveis em um estado aquoso e sofrem de degradação química e física resultando em uma perda de atividade biológica durante o processamento e armazenagem. Adicionalmente, as composições de peptídeo em solução aquosa sofre hidrólise, tal como a desamidação e clivagem de ligação de peptídeo. Estes efeitos representam um sério problema para os peptídeos terapeuticamente ativos que são intencionados a serem administrados aos seres humanos dentro de uma faixa de dosagem definida com base na atividade biológica.
A administração de peptídeos purificados permanece uma estratégia de tratamento promisssora para muitas doenças que afetam a população humana. Entretanto, a capacidade do pepticorpo terapêutico para permanecer em uma composição farmacêutica estável com o tempo em uma variedade de condições de armazenagem e ser então eficaz para os pacientes in vivo não foi tratada. Assim, permanece uma necessidade na técnica para fornecer pepticorpos terapêuticos em formulações estáveis que são úteis como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças e distúrbios. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece formulações úteis para a liofilização de pepticorpos terapêuticos, resultando em um produto de pepticorpo terapêutico altamente estável. O produto de pepticorpo terapêutico estável é útil como um agente terapêutico no tratamento de indivíduos que sofrem de distúrbios ou condições que podem se beneficiar da administração do pepticorpo terapêutico.
Em um aspecto, a invenção fornece uma composição de pepticorpo terapêutico liofilizado que compreende um tampão, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e opcionalmente um tensoativo; em que o tampão é compreendido de um agente de tamponamento de pH em uma faixa de of cerca de 5 mM a cerca de 20 mM e em que o pH está em uma faixa de cerca de 3,0 a cerca de 8,0; em que o agente de encorpamento está em uma concentração de cerca de 0 % a cerca de 4,5 % p/v; em que o agente estabilizante está em uma concentração de cerca de 0,1 % a cerca de 20 % p/v; em que o tensoativo está em uma concentração de cerca de 0,004 % a cerca de 0,4 % p/v; e em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula I,
Fórmula I: [(X1)a - F1-(X2)J-(L1)cWSPd em que:
F1 é um domínio Fc; X1 é selecionado de P1-(L2)e- P2(L3)rP1-(L2)e- P3(L4)g-P2(L3)rP1-(L2)e- e P4(L5)h-P3(L4)g-P2(L3)rP1-(L2)e- X2 é selecionado de:
-(L2)e-P1
-(L2)e-P1-(L3)rP2
-(L2)e-P1-(L3)rP2-(L4)g-P3 e
-(L2)e-P1-(L3)rP2-(L4)g-P3-(L5)h-P4
em que P1, P2, P3 e P4 são cada um independentemente seqüências de peptídeos farmacologicamente ativos; L ,L ,L ,L e L são cada um independentemente ligadores;
a, b, c, e, f, g e h são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de a e b seja 1; d é 0, 1, ou maior do que 1: e
WSP é um polímero solúvel em água, a ligação do qual é efetuada em qualquer porção reativa em F1.
Em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula II Fórmula II: [X1-F1I-(L1)c-WSPd
em que o domínio Fc está ligado no término C de X1 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
Ainda em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula III Fórmula III: [F1-X2]-(L^c-WSPd em que o domínio Fc está ligado ao término N de X2 e zero,
um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
Ainda em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula IV Fórmula IV: [F1-(L1)e-P1I-(L1)c-WSPd
em que o domínio Fc está ligado ao término N de -(L1)c-P1 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
Em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula V
Fórmula V: [F1-(LVP1-(L2)f-P2KL1)c-WSPd
em que o domínio Fc é ligado ao término N de -L1-P1-L2-P2 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
Em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico é um multímero ou dímero. Em uma outra forma de realização, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que P1, P2, P3 e/ou P4 são independentemente selecionados de um peptídeo apresentado em qualquer uma das Tabelas de 4 até 38. Em uma forma de realização relacionada, P1, P2, P3 e/ou P4 têm a mesma seqüência de aminoácido. Em uma outra forma de realização, o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1. Em uma outra forma de realização, WSP é PEG. Ainda em uma outra forma de realização, o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1 e WSP é PEG. Em uma outra forma de realização, o PEG tem um peso molecular dentre cerca de 2 kDa e .100 kDa, ou entre 6 kDa e 25 kDa. Em uma outra forma de realização, a composição compreende pelo menos 50 %, 75 %, 85 %, 90 %, ou 95 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é selecionado do grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato e aspartato. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de encorpamento é selecionado do grupo que consiste de manitol, glicina, sacarose, dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose ou xilitol.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente estabilizante é selecionado do grupo que consiste de sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCl, compostos de poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o tensoativo selecionado do grupo que consiste de lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio, dioctil sulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal sódico de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal sódico do ácido 1-octanossulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio, sal sódico do ácido glicodesoxicólico, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado, brometo de hexadeciltrimetilamônio, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, lauromacrogol 400, esterarato de polioxil 40, óleo de mamona polioxietileno hidrogenado 10, 40, 50 e 60, monoesterarato de glicerol, polissorbato 20, 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja, DOPC, DMPG, DMPC e DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico está entre cerca de 0,25 mg/ml e 250 mg/ml.
Em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,004 % p/v. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 6. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 0,5 mg/ml. Em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico é qualquer uma da SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016 ou SEQ ID NO: 1017.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 7,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 32. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 20 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 3,3 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 4. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 100 mg/ml.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 2,5 % p/v; e em que o agente estabilizante é sacarose a 3,5 % p/v. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 31. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml.
Em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a composição é selecionada do grupo que consiste de: a) histidina a 10 mM, pH 4,7, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; b) histidina a 10 mM, pH 5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; c) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose com e sem 0,004 % de polissorbato20; d) succinato a 10 mM, pH .4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 9 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; f) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de sacarose, 1 % de hidroxietil amido, 0,004 % de polissorbato-20; g) glutamato a 5 mM, pH 4,5, .2 % de manitol, 1 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e h) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de trealose, 0,004 % de polissorbato- .20. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P1 compreende uma seqüência apresentada nas Tabelas 21 a 24. Ainda em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é selecionada do grupo que consiste de 1, 30, 85 e 100 mg/ml.
A presente invenção também considera métodos de fabricar pepticorpos terapêuticos liofilizados da presente invenção. Em uma forma de realização, a invenção fornece um método para fabricar um pepticorpo terapêutico liofilizado que compreende as etapas de: a) preparar uma solução de um tampão, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e opcionalmente um tensoativo; em que o tampão é compreendido de um agente de tamponamento de pH em uma faixa de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM e em que o pH está em uma faixa de cerca de 3,0 a cerca de 8,0; em que o agente de encorpamento está em uma concentração de cerca de 2,5 % a cerca de 4 % p/v; em que o agente estabilizante está em uma concentração de cerca de 0,1 % a cerca de 5 % p/v; em que o tensoativo está em uma concentração de cerca de 0,004 % a cerca de 0,04 % p/v; e b) liofilizar o pepticorpo terapêutico; em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula I,
Formulai: [(X l)a-¥l-(X2)b]-(L1l)cWSPd em que:
F1 é um domínio Fc;
X1 é selecionado de
P1-(L2)e-
P2(L3)rP1-(L2)e-
P3(L4)g-P2(L3)f-P1-(L2)e- e
P4(L5)h-P3(L4)g-P2(L3)rP1-(L2)e-
X é selecionado de:
-(L2)e-P1
-(L2)e-P1-(L3)rP2 <formula>formula see original document page 21</formula> em que P1, P2, P3 e P4 são cada um independentemente seqüências de peptídeos farmacologicamente ativos;
<formula>formula see original document page 21</formula>são cada um independentemente ligadores; a, b, c, e, f, g e h são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de a e b seja 1; d é 0, 1, ou maior do que 1; e
WSP é um polímero solúvel em água, a ligação do qual é efetuada em qualquer porção reativa em F1.
Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula II
<formula>formula see original document page 21</formula> em que o domínio Fc é ligado ao término C de X1 e zero, um ou mais WSP são ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula III
<formula>formula see original document page 21</formula> em que o domínio Fc é ligado ao término N de X2 e zero, um ou mais WSP são ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula IV
<formula>formula see original document page 21</formula> <formula>formula see original document page 21</formula> um ou mais WSP são ligados ao domínio Fc5 opcionalmente através do ligador L1.
Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula V
Fórmula V: [F1-CL Vpl-(LVP2HL1)C-WSPd em que o domínio Fc é ligado ao término N de -L1-P1-L2-P2 e zero, um ou mais WSP são ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligadorL1.
Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico é um multímero ou dímero. Em uma outra forma de realização, o P1, P2, P3 e/ou P4 são independentemente selecionados de um peptídeo apresentado em qualquer uma das Tabelas 4 até 38. Em uma outra forma de realização, o P1, P2, P3 e/ou P4 têm a mesma seqüência de aminoácido. Em uma outra forma de realização, o domínio Fc é apresentado in SEQ ID NO: 1. Em uma outra forma de realização, WSP é PEG. Em uma outra forma de realização, o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1 e WSP é PEG. Em uma outra forma de realização, PEG tem um peso molecular dentre cerca de 2 kDa e 100 kDa ou entre cerca de 6 kDa e 25 kDa. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a composição compreende pelo menos 50 %, 75 %, 85 %, 90 % ou 95 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é selecionado do grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato e aspartato. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de encorpamento é selecionado do grupo que consiste de manitol, glicina, sacarose, dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose ou xilitol. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente estabilizante é selecionado do grupo que consiste de sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, fratose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCl, compostos de poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio.
Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o tensoativo selecionados do grupo que consiste de lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio, dioctil sulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal sódico de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal sódico do ácido 1-octanossulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio, sal sódico do ácido glicodesoxicólico, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado, brometo de hexadeciltrimetilamônio, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, lauromacrogol 400, esterarato de polioxil 40, óleo de mamona polioxietileno hidrogenado 10, 40, .50 e 60, monoesterarato de glicerol, polissorbato 20, 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja, DOPC, DMPG, DMPC e DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico está entre cerca de 0,25 mg/ml e 250 mg/ml.
Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a .4 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,004 % p/v. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 6. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 0,5 mg/ml.
Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 7,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 32. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml.
Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 20 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 3,3 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 4. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 100 mg/ml.
Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 2,5 % p/v; e em que o agente estabilizante é sacarose a 3,5 % p/v. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 31. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção, um método anteriormente mencionado é fornecido em que a composição é selecionada do grupo que consiste de: a) histidina a 10 mM, pH 4,7, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; b) histidina a 10 mM, pH 5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; c) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose com e sem 0,004 % de polissorbato20; d) succinato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 9 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; f) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 10 % de manitol, 2 % de sacarose, 1 % de hidroxietil amido, 0,004 % de polissorbato-20; g) glutamato a 5 mM, pH 4,5, 2 % de manitol, 1 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e h) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de trealose, 0,004 % de polissorbato-20. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P1 compreende uma seqüência apresentada nas Tabelas de 21 a 24. Ainda em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é selecionada do grupo que consiste de 1, 30, 85 e 100 mg/ml.
Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido compreendendo ainda, antes da liofilização, as etapas de: b) ajustar o pH da solução a um pH entre cerca de 4,0 e cerca de 8,0; c) preparar uma solução contendo o pepticorpo terapêutico; d) trocar o tampão da solução da etapa (c) na solução da etapa (b); e) adicionar uma quantidade apropriada de um tensoativo; e f) liofilizar a mistura da etapa (e). Em uma outra forma de realização, o método anteriormente
mencionado é fornecido em que um método para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico reconstituído é fornecido que compreende as etapas de: a) liofilizar uma composição de pepticorpo terapêutico anteriormente mencionada; e b) reconstituir a composição de pepticorpo terapêutico liofilizado.
Em uma outra forma de realização, um kit para preparar uma composição farmacêutica aquosa é fornecida que compreende um primeiro recipiente tendo uma composição de pepticorpo terapêutico anteriormente mencionada liofilizada e um segundo recipiente tendo um solvente fisiologicamente aceitável para a composição liofilizada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definição de termos
O termo "compreendendo," com respeito a um composto de peptídeo, significa que um composto pode incluir aminoácidos adicionais em cada um ou ambos dos terminais amino ou carbóxi da seqüência dada. Naturalmente, estes aminoácidos adicionais não devem interferir significantemente com a atividade do composto. Com respeito a uma composição da presente invenção, o termo "compreendendo" significa que uma composição pode incluir componentes adicionais. Estes componentes adicionais não devem interferir significantemente com a atividade da composição.
O termo "pepticorpo" refere-se a uma molécula que compreende peptídeo(s) fimdido(s) direta ou indiretamente a outras moléculas tais como um domínio Fc de um anticorpo, onde a porção de peptídeo especificamente se liga a um alvo desejado. O(s) peptídeo(s) pode(m) ser fundido(s) a uma região Fc ou inserido(s) em uma Alça Fc, uma molécula Fc modificada. As Alças Fc são descritas na Publicação do Pedido de Patente U.S. Ne US2006/0140934 aqui incorporada por referência em sua totalidade. A invenção inclui tais moléculas que compreendem um domínio Fc modificado para compreender um peptídeo como uma seqüência interna (preferivelmente em uma região de alça) do domínio Fe. As moléculas de peptídeo Fc internas podem incluir mais do que uma seqüência de peptídeo em tandem em uma região interna particular e elas podem incluir outros peptídeos em outras regiões internas. Embora as regiões de alça putativas sejam exemplificadas, inserções em quaisquer outros domínios que não de terminal do Fc também são consideradas parte desta invenção. O termo "pepticorpo" não inclui proteínas de fusão de Fc (por exemplo, proteínas de tamanho natural fundidas a um domínio Fc).
O termo "veículo" refere-se a uma molécula que impede a degradação e/ou aumenta a meia vida, reduz a toxicidade, reduz a imunogenicidade ou aumenta a atividade biológica de uma proteína terapêutica. Os veículos exemplares incluem um domínio Fc como descrito na Patente U.S. Nfi 5.428.130 concedida a Capon et al., concedida em 27 de junho de 1995.
O termo "Fc nativo" refere-se à molécula ou seqüência que compreende a seqüência de um fragmento de ligação a não antígeno que resulta da digestão de anticorpo inteiro, seja na forma monomérica ou multimérica. Tipicamente, um Fc nativo compreende um domínio CH2 e CH3. A fonte de imunoglobulina original da Fc nativa é em um aspecto de origem humana e pode ser qualquer uma das imunoglobulinas. Um Fc nativo é um polipeptídeo monomérico que pode estar ligado em formas diméricas ou multiméricas pela associação covalente (isto é, ligações de dissulfeto), associação não covalente ou uma combinação de ambos. O número de ligações de dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativo varia de um a quatro dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA, IgE) ou subclasse (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Um exemplo de um Fc nativo é um diéter ligado a dissulfeto que resulta da digestão com papaína de uma IgG. Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9. O termo "Fe nativo" como aqui usado é genérico para as formas monoméricas, diméricas e multiméricas.
O termo "variante de Fc" refere-se a uma molécula ou seqüência que é modificada a partir de um Fc nativo, mas ainda compreende um sítio de ligação para o receptor de recuperação, FcRn. Os pedidos internacionais WO 97/34631 (publicado em 25 de setembro de 1997) e WO 96/32478 descrevem variantes de Fc exemplares, assim como a interação com o receptor de recuperação e são aqui incorporadas por referência. Em um aspecto, o termo "variante de Fc" compreende uma molécula ou seqüência que é humanizada a partir de um Fc nativo não humano. Em um outro aspecto, um Fc nativo compreende sítios que podem ser removidos porque eles fornecem características estruturais ou atividade biológica que não são requeridos para as moléculas de fusão da presente invenção. Assim, o termo "variante de Fc" compreende uma molécula ou seqüência que carece de um ou mais sítios Fc nativos ou resíduos que afetam ou estão envolvidos na (1) formação da ligação de dissulfeto, (2) incompatibilidade com uma célula hospedeira selecionada (3) heterogeneidade de terminal N na expressão em uma célula hospedeira selecionada, (4) glicosilação, (5) interação com complemento, (6) ligação a um receptor Fc outro que não um receptor de recuperação ou (7) citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). As variantes Fc são descritas em mais detalhes em seguida.
O termo "domínio Fc" abrange Fc nativo e moléculas e seqüências variantes de Fc como definido acima. Como com variantes de Fc e Fc nativos, o termo "domínio de Fe" inclui moléculas nas formas monoméricas ou multiméricas, sejam digeridas a partir de anticorpo inteiro ou produzidas por outros meios. Em uma forma de realização, por exemplo, a região de Fc pode ser:
K (SEQID NO:I).
As seqüências de Fc adicionais são conhecidas na técnica e são consideradas para o uso na invenção. Por exemplo, IgGl de Fc (Acesso no GenBank N0 PO1857), IgG2 de Fc (Acesso no GenBank Na PO1859), IgG3 de Fe (Acesso no GenBank N2 PO1860), IgG4 de Fc (Acesso no GenBank N2 PO1861), IgAl de Fc (Acesso no GenBank Ne P01876), IgA2 de Fc (Acesso no GenBank N2 PO1877), IgD de Fc (Acesso no GenBank Ns PO1880), IgM de Fc (Acesso no GenBank N- POl871) e IgE de Fc (Acesso no GenBank N2 PO1854) são algumas seqüências Fc adicionais consideradas para o uso aqui.
Opcionalmente, uma seqüência de aminoácido de terminal N pode ser adicionada às seqüências acima (por exemplo, quando expressadas em bactérias).
O termo "multímero" como aplicado aos domínios Fcs ou moléculas que compreendem os domínios Fcs refere-se às moléculas tendo duas ou mais cadeias de polipeptídeo covalentemente associadas, não covalentemente ou pelas interações tanto covalentes quanto não covalentes. As moléculas de IgG tipicamente formam dímeros; IgM, pentâmeros; IgD, dímeros; e IgA, monômeros, dímeros, trímeros ou tetrâmeros. Os multímeros podem ser formados explorando-se a seqüência e a atividade resultante da fonte de Ig nativa do Fc ou pela derivatização (como definido abaixo) tal um Fc nativo.
Os termos "derivatização," "derivado" ou "derivatizado" significam processos e compostos resultantes em que, por exemplo e sem limitação, (1) o composto tem uma porção cíclica; por exemplo, reticulação entre resíduos de cisteinila dentro do composto; (2) o composto é reticulado ou tem um sítio de reticulação; por exemplo, o composto tem um resíduo de cisteinila e assim forma dímeros reticulados em cultura ou in vivo; (3) uma ou mais ligações de peptidila é substituído por uma ligação não peptidílica; (4) o término N é substituído por - NRR1, NRC(O)Ri, -NRC(O)ORi, -NRS(O)2Ri, -NHC(O)NHR, um grupo succinimida ou benziloxicarbonil-NH- substituído ou não substituído, em que R e R1 e os substituintes do anel são como definidos em seguida; (5) o término C é substituído por -C(O)R2 ou -NR3R4 em que R2, R3 e R4 são como definidos em seguida; e (6) compostos em que porções de aminoácido individuais são modificadas através do tratamento com agentes capazes de reagir com cadeias laterais ou resíduos de terminal selecionados. Derivados são ainda descritos em seguida.
Como aqui usado o termo "peptídeo" refere-se a moléculas de .2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14 ,15, 16 ,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, .25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, .46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, .67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, .88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou mais aminoácidos ligados pelas ligações de peptídeo. Os peptídeos tipicamente contêm conformações aleatórias e/ou flexíveis, tais como espirais aleatórias; e tipicamente carecem de conformações estáveis, tais como aquelas observadas em proteínas/polipeptídeos maiores, tipicamente por intermédio de estruturas secundárias e terciárias. Em formas de realização particulares, numerosas faixas de tamanho de peptídeos são aqui consideradas, Tais como de cerca de: .3 a 90, 3 a 80, 3 a 70, 3 a 60, 3 a 50; 5 a 90, 5 a 80, 5 a 70, 5 a 60, 5 a 50, 5 a .40, 5 a 30, 10 a 90, 10 a 80, 10 a 70, 10 a 60, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 10 a .20 aminoácidos no comprimento e outros. Em outras formas de realização, os peptídeos aqui usados não têm mais do que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 ou .20 aminoácidos no comprimento. Os peptídeos exemplares podem ser gerados por qualquer um dos métodos aqui apresentados, tais como os realizados em uma biblioteca de peptídeo (por exemplo, uma biblioteca de demonstração de fago), gerados pela síntese química, derivados pela digestão de proteínas ou gerados usando técnicas de DNA recombinantes. Os peptídeos incluem as formas DeL, purificada ou em uma mistura das duas formas.
Adicionalmente, os sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos desta invenção também são considerados. Por "sais fisiologicamente aceitáveis" é intencionado quaisquer sais que são conhecidos ou mais tarde descobertos como sendo farmaceuticamente aceitáveis. Alguns exemplos específicos são: acetato, trifluoroacetato; hidrohaletos, tais como cloridreto e bromidreto; sulfato; citrato; tartarato; glicolato; e oxalato.
O termo "randomizado" como usado para se referir às seqüências de peptídeo refere-se às seqüências aleatórias completas (por exemplo, selecionadas pelos métodos de demonstração de fago) e seqüências em que um ou mais resíduos de uma molécula que ocorre naturalmente é substituído por um resíduo de aminoácido que não aparece naquela posição na molécula que ocorre naturalmente. Os métodos exemplares para identificar seqüências de peptídeo incluem demonstração de fago, demonstração de E. coli, demonstração de ribossoma, triagem com base em levedura, triagem de RNA-peptídeo, triagem química, planejamento racional, análise estrutural de proteína e outros.
O termo "farmacologicamente ativo" significa que uma substância assim descrita é determinada ter atividade que afeta um parâmetro médico (por exemplo, mas não limitado a pressão sangüínea, contagem de célula sangüínea, nível de colesterol) ou estado de doença (por exemplo, mas não limitado a câncer, distúrbios autoimunes). Assim, os peptídeos farmacologicamente ativos compreendem peptídeos agonísticos ou miméticos e antagonísticos como definidos abaixo.
Os termos "peptídeo mimético" e "peptídeo agonista" referem- se a um peptídeo tendo atividade biológica comparável com uma proteína (por exemplo, mas não limitado a EPO, TPO, G-CSF e outras proteínas aqui descritas) que interage com uma proteína de interesse. Estes termos incluem ainda peptídeos que indiretamente imitam a atividade de uma proteína de interesse, tal como pela potenciação dos efeitos do ligando natural da proteína de interesse; ver, por exemplo, os peptídeos miméticos de GCSF listados nas Tabelas 2 e 7. Como um exemplo, o termo "peptídeo mimético de EPO" compreende quaisquer peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Wrighton et al. (1996), Science 273: 458-63, Naranda et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 756974 ou qualquer outra referência na Tabela 2 identificados como tendo o assunto objeto de mimético de EPO. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.
Como um outro exemplo, o termo "peptídeo mimético de TPO" ou "TMP" refere-se a peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, Pat. U.S. N- 5.869.451 e 5.932.946 e qualquer outra referência na Tabela 2 identificados como tendo o assunto objeto de mimético de TPO, assim como o Pedido Internacional WO 00/24770 publicado em 4 de maio de 2000, aqui incorporada por referência. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.
Como um outro exemplo, o termo "peptídeo mimético de G- CSF" refere-se a quaisquer peptídeos que podem ser identificados ou descritos em Paukovits et al. (1984), Hoppe-Seilers Z. Physiol. Chem. 365:303-11 ou qualquer uma das referências na Tabela 2 identificadas como tendo o assunto objeto de mimético de G-CSF. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.
O termo "peptídeo mimético de CTLA4" refere-se a quaisquer peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Fukumoto et al. (1998), Nature Biotech. 16: 267-70. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.
O termo "peptídeo antagonista" ou "peptídeo inibidor" refere- se a um peptídeo que bloqueia ou de algum modo interfere com a atividade biológica da proteína associada de interesse ou tem atividade biológica comparável com um antagonista ou inibidor conhecidos da proteína associada de interesse. Assim, o termo "peptídeo antagonista de TNF" compreende peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70 ou qualquer uma das referências na Tabela 2 identificadas como tendo a matéria objeto de antagonístico de TNF. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.
Os termos "antagonista de IL-1" e "peptídeo mimético de IL- lra" referem-se aos peptídeos que inibem ou infra-regulam a ativação do receptor IL-I pelo IL-1. A ativação do receptor de IL-I resulta da formação de um complexo entre IL-1, receptor de IL-I e proteína acessória do receptor de IL-1. Antagonista de IL-I ou peptídeos miméticos IL-Ira se ligam ao IL-1, receptor de IL-I ou proteína acessória do receptor de IL-I e obstruem a formação de complexo entre quaisquer dois ou três componentes do complexo. Os antagonistas de IL-I ou peptídeos miméticos de IL-Ira exemplares podem ser identificados ou derivados como descrito na Pat. U.S. <formula>formula see original document page 33</formula>; ou qualquer uma das referências na Tabela 2 identificadas como tendo o assunto objeto de mimético de IL-Ira ou antagonístico de IL-1. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.
O termo "peptídeo antagonista de VEGF" refere-se a peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Fairbrother (1998), Biochem. 37: 17754-64 e em qualquer uma das referências na Tabela 2 identificadas como tendo o assunto objeto de antagonístico de VEGF. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.
O termo "peptídeo inibidor de MMP" refere-se a peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Koivunen (1999), Nature Biotech. 17: 768-74 e em qualquer uma das referências na Tabela 2 identificadas como tendo o assunto objeto de inibidor de MMP. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.
O termo "peptídeo inibidor de miostatina" refere-se a peptídeos que podem ser identificados pela sua capacidade para reduzir ou bloquear a atividade ou sinalização de miostatina como demonstrado em ensaios in vitro tais como, por exemplo o ensaio de atividade de miostatina com base em célula pMARE C2C12 ou pelo teste em animal in vivo como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. N- US20040181033A1 e publicação do pedido PCT N2 W02004/058988. Os peptídeos inibidores de miostatina exemplares são apresentados nas Tabelas 21 a 24.
O termo "antagonista de integrina/adesão" refere-se a peptídeos que inibem ou infra-regulam a atividade de integrinas, selectinas, moléculas de adesão celular, receptores de integrina, receptores de selectina ou receptores de molécula de adesão celular. Os antagonistas de integrina/adesão exemplares compreendem laminina, equistatina, os peptídeos descritos nas Tabelas de 25 a 28.
O termo "inibidor da reabsorção óssea" refere-se a moléculas tais como determinadas pelos ensaios de Exemplos 4 e 11 da WO 97/23614:, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Os inibidores da reabsorção óssea exemplares incluem anticorpo OPG e OPG-L, que são descritos na WO 97/23614 e W098/46751, respectivamente, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
O termo "inibidor de fator de crescimento de nervo" ou "agonista de fator de crescimento de nervo" refere-se a um peptídeo que se liga a e inibe a atividade ou sinalização do fator de crescimento de nervo (NGF). Os peptídeos exemplares deste tipo são apresentados na Tabela 29.
O termo "domínio modulador de TALL-1" refere-se a qualquer seqüência de aminoácido que se liga ao TALL-I e compreende seqüências que ocorrem naturalmente ou seqüências randomizadas. Os domínios moduladores TALL-I exemplares podem ser identificados ou derivados pela demonstração de fago ou outros métodos aqui mencionados. Os peptídeos exemplares deste tipo são apresentados nas Tabelas 30 e 31.
O termo "antagonista de TALL-1" refere-se a uma molécula que se liga ao TALL-I e aumenta ou diminui um ou mais parâmetros de ensaio oposto do efeito naqueles parâmetros pelo TALL-I nativo de tamanho natural. Tal atividade pode ser determinada, por exemplo, por ensaios tais como descritos na subseção intitulada "Atividade biológica de AGP-3" na seção Materials & Methods do pedido de patente intitulada, "TNF-RELATED PROTEINS", WO 00/47740, publicado em 17 de agosto de 2000.
O termo "peptídeo antagonista de Ang 2" refere-se a peptídeos que podem ser identificados ou derivados como tendo características antagonísticas de Ang-2. Os peptídeos exemplares deste tipo são apresentados nas Tabelas 32 a 38. O termo "WSP" refere-se a um polímero solúvel em água que impede um peptídeo, proteína ou outro composto ao qual o mesmo é ligado de precipitar em um ambiente aquoso, tal como, por via de exemplo, um ambiente fisiológico. Uma descrição mais detalhada de várias formas de realização de WSP considerada pela invenção segue. Liofilização e Administração
Pepticorpos terapêuticos são úteis em formulações farmacêuticas de modo a tratar doenças humanas como aqui descritas. Em uma forma de realização as composições de pepticorpo terapêutico são liofilizadas. A liofilização é realizada usando técnicas comuns na técnica e devem ser otimizadas para a composição que é desenvolvida [Tang et al., Pharm Res. 21: 191-200, (2004) e Chang et al., Pharm Res. 13: 243-9 (1996)].
Um ciclo de liofilização é, em um aspecto, composto de três etapas: congelamento, secagem primária e secagem secundária [A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc Londres, Ser B, Biol 278: 167 (1977)]. Na etapa de congelamento, a solução é esfriada para iniciar a formação de gelo. Além disso, esta etapa induz a cristalização do agente de encorpamento. O gelo sublima no estágio de secagem primária, que é conduzida pela redução da pressão da câmara abaixo da pressão de vapor do gelo, usando um vácuo e introduzindo calor para promover a sublimação. Finalmente, a água absorvida ou ligada é removida no estágio de secagem secundária sob pressão reduzida da câmara e em uma temperatura de prateleira elevada. O processo produz um material conhecido como uma torta liofilizada. Em seguida a torta pode ser reconstituída com água estéril ou diluente adequado para injeção.
O ciclo de liofilização não apenas determina o estado físico final dos excipientes mas também afeta outros parâmetros tais como tempo de reconstituição, aspecto, estabilidade e teor de umidade final. A estrutura da composição no estado congelado prossegue através de várias transições (por exemplo, transições vítreas, umectações e cristalizações) que ocorrem em temperaturas específicas e podem ser usadas para entender e otimizar o processo de liofilização. A temperatura de transição vítrea (Tg e/ou Tg') pode fornecer informação a cerca do estado físico de um soluto e pode ser determinado pela calorimetria de varredura diferencial (DSC). A Tg e Tg' são um parâmetro importante que devem ser levados em conta quando da designação do ciclo de liofilização. Por exemplo, a Tg' é importante para a secagem primária. Além disso, no estado seco, a temperatura de transição vítrea fornece informação sobre a temperatura de armazenagem do produto final.
Excipientes no geral
Os excipientes são aditivos que são incluídos em uma formulação porque eles comunicam ou realçam a estabilidade, liberação e manufaturabilidade de um produto medicamentoso. Independente da razão para a sua inclusão, os excipientes são um componente integral de um produto medicamentoso e portanto necessitam ser seguros e bem tolerados pelos pacientes. Para os medicamentos de proteína, a escolha de excipientes é particularmente importante porque eles podem afetar tanto a eficácia quanto a imunogenicidade do medicamento. Por este motivo, as formulações de proteína necessitam ser desenvolvidas com seleção apropriada de excipientes que proporcionam estabilidade, segurança e negociabilidade adequadas.
Uma formulação liofilizada é usualmente compreendida de um tampão, um agente de encorpamento e um estabilizador. A utilidade de um tensoativo pode ser avaliada e selecionada em casos onde a agregação durante a etapa de liofilização ou durante a reconstituição torna-se um problema. Um agente de tamponamento apropriado é incluído para manter a formulação dentro de zonas estáveis de pH durante a liofilização. Uma comparação dos componentes de excipiente nas formulações de proteína líquidas e liofilizadas é fornecida na Tabela A. <table>table see original document page 38</column></row><table> O desafio principal nas formulações de desenvolvimento para proteínas terapêuticas é estabilizar o produto contra os estresses de fabricação, envio e armazenagem. O papel dos excipientes de formulação é fornecer estabilização contra estes estresses. Os excipientes também podem ser utilizados para reduzir a viscosidade de formulações de proteína de alta concentração de modo a permitir a sua liberação e realçar a conveniência do paciente. No geral, excipientes podem ser classificados com base nos mecanismos pelos quais eles estabilizam as proteínas contra vários estresses químicos e físicos. Alguns excipientes são usados para aliviar os efeitos de um estresse específico ou para regular uma suscetibilidade particular de uma proteína específica. Outros excipientes têm efeitos mais gerais sobre as estabilidades físicas e covalentes de proteínas. Os excipientes aqui descritos são organizados pelo seu tipo químico ou seu papel funcional nas formulações. Descrições resumidas dos modos de estabilização são fornecidas quando do debate de cada tipo de excipiente.
Dadas as divulgações e orientações aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica saberão que a quantidade ou faixa de excipiente que podem ser incluídas em qualquer formulação particular para se obter uma formulação biofarmacêutica da invenção que promova a retenção em estabilidade do biofarmacêutico. Por exemplo, a quantidade e tipo de um sal a ser incluído em uma formulação biofarmacêutica da invenção podem ser selecionados com base na osmolalidade desejada (isto é, isotônica, hipotônica ou hipertônica) da solução final assim como as quantidades e osmolalidade de outros componentes a serem incluídos na formulação. Similarmente, pela exemplificação com referência ao tipo de poliol ou açúcar incluídos em uma formulação, a quantidade de um tal excipiente dependerá da sua osmolalidade.
Por via de exemplo, a inclusão de cerca de 5 % de sorbitol pode obter isotonicidade enquanto que cerca de 9 % de um excipiente de sacarose é necessário para se obter isotonicidade. A seleção da quantidade ou faixa de concentrações de um ou mais excipientes que podem ser incluídos dentro de uma formulação biofarmacêutica da invenção foi exemplificada acima por referência aos sais, polióis e açúcares. Entretanto, aqueles habilitados na técnica entenderão que as considerações aqui descritas e ainda exemplificadas por referência aos excipientes específicos são igualmente aplicáveis a todos os tipos e combinações de excipientes incluindo, por exemplo, sais, aminoácidos, outros agentes de tonicidade, tensoativos, estabilizadores, agentes de encorpamento, crioprotetores, lioprotetores, anti- oxidantes, íons metálicos, agentes queladores e/ou conservantes.
Além disso, onde um excipiente particular é relatado em uma formulação, por exemplo, pelo percentual (%) p/v, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a concentração molar equivalente deste excipiente também é considerada.
Naturalmente, uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconheceria que as concentrações dos excipientes anteriormente mencionados compartilham uma interdependência dentro de uma formulação particular. Por via de exemplo, a concentração de um agente de encorpamento pode ser diminuída onde, por exemplo, existe uma alta concentração de proteína/peptídeo ou onde, por exemplo, existe uma alta concentração de agente estabilizante. Além disso, uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconheceria que, de modo a manter a isotonicidade de uma formulação particular em que não existe nenhum agente de encorpamento, a concentração de um agente estabilizante seria ajustada conseqüentemente (isto é, uma quantidade "tonificante" de estabilizador seria usada). Outros excipientes são conhecidos na técnica e podem ser encontrados em Powell et al., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sei. Technology, 52: 238-311. Tampões
A estabilidade de um medicamento de proteína é usualmente observada ser máxima em uma faixa de pH estreita. Esta faixa de pH de estabilidade ótima precisa ser identificada cedo durante os estudos de pré- formulação. Diversos métodos tais como os estudos de estabilidade acelerada e os estudos de triagens calorimétricas têm demonstrado serem úteis neste empenho (Remmele R. L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Uma vez que uma formulação é finalizada, o produto medicamentoso deve ser fabricado e mantido dentro de uma especificação pré definida por toda a sua vida de prateleira. Por este motivo, agentes de tamponamento são quase sempre utilizado para controlar o pH na formulação.
Ácidos orgânicos, fosfatos e Tris têm sido rotineiramente utilizados como tampões nas formulações de proteína (Tabela Β). A capacidade das espécies de tamponamento é máxima em um pH igual ao pKa e diminui conforme o pH aumenta ou diminui fora deste valor. Noventa porcento da capacidade de tamponamento existe dentro de uma unidade de pH do seu pKa. A capacidade de tamponamento também aumenta proporcionalmente com a concentração de tampão crescente.
Diversos fatores necessitam ser considerados quando da escolha de um tampão. Primeiramente, a espécie de tampão e a sua concentração necessitam ser definidas com base no seu pKa e no pH da formulação desejada. Igualmente importante é garantir que o tampão seja compatível com o medicamento de proteína, outros excipientes de formulação e não catalise quaisquer reações de degradação. Recentemente, tampões de carboxilato polianiônicos tais como citrato e succinato foram mostrados formar adutos covalentes com os resíduos de cadeia lateral de proteínas. Um terceiro aspecto importante a ser considerado é a sensação de pungência e irritação que o tampão pode induzir. Por exemplo, o citrato é conhecido por causar pungência na injeção (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). O potencial para pungência e irritação é maior para os medicamentos que são administrados por intermédio das vias SC ou LM, onde a solução de medicamento permanece no local por um período relativamente mais longo de tempo do que quando administrados pela via IV onde a formulação é diluída rapidamente no sangue na administração. Para as formulações que são administradas pela infusão IV direta, a quantidade total de tampão (e qualquer outro componente de formulação) necessita ser monitorada. Uma pessoa deve ser particularmente cuidadosa a cerca de íons potássio administrados na forma do tampão de fosfato de potássio, que pode induzir efeitos cardiovasculares em um paciente (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).
Tampões para formulações liofilizadas necessitam consideração adicional. Alguns tampões como fosfato de sódio podem cristalizar da fase amorfa da proteína durante o congelamento resultando em mudanças muito maiores no pH. Outros tampões comuns tais como acetato e imidazol devem ser evitados visto que eles podem sublimar ou evaporar durante o processo de liofilização, mudando deste modo o pH da formulação durante a liofilização ou depois da reconstituição.
Tabela B: Agentes de tamponamento habitualmente usados e seus valores de pH
Tampão pKa Produto medicamentoso de exemplo
<table>table see original document page 42</column></row><table>
O sistema de tampão presente nas composições é selecionado para ser fisiologicamente compatível e para manter um pH desejado na solução reconstituída assim como na solução antes da liofilização. Em uma forma de realização, o pH da solução antes da liofilização está entre pH 2,0 e pH 12,0. Por exemplo, em uma forma de realização o pH da solução antes da liofilização é 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, .5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, .10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7 ou 12,0. Em uma outra forma de realização, o pH da solução reconstituída está entre 4,5 e 9,0. Em uma forma de realização, o pH na solução reconstituída é 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, .6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7 ou 9,0.
Em uma forma de realização, o agente de tamponamento de pH usado na formulação é um aminoácido ou mistura de aminoácidos. Em um aspecto, o agente de tamponamento de pH é histidina ou uma mistura de aminoácidos um dos quais sendo histidina.
O composto de tamponamento de pH pode estar presente em qualquer quantidade adequada para manter o pH da formulação em um nível pré-determinado. Em uma forma de realização, quando o agente de tamponamento de pH é um aminoácido, a concentração do aminoácido está entre 0,1 mM e 1000 mM (1 M). Em uma forma de realização, o agente de tamponamento de pH é de pelo menos 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700 ou 900 mM. Em uma outra forma de realização, a concentração do agente de tamponamento de pH está entre 1, 1,2, 1,5, 1,7, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 mM e 100 mM. Ainda em uma outra forma de realização, a concentração do agente de tamponamento de pH está entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 ou 40 mM e 50 mM. Ainda em uma outra forma de realização, a concentração do agente de tamponamento de pH é de 10 mM.
Outros agentes de tamponamento de pH exemplares usados para tamponizar a formulação como aqui apresentada incluem, mas não são limitados a glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato e aspartato.
Estabilizadores e agentes de encorpamento
Os agentes de encorpamento são tipicamente usados em formulações liofilizadas para realçar a elegância do produto e para prevenir colapso. As condições na formulação são no geral planejadas de modo que o agente de encorpamento cristalize da fase amorfa congelada (durante o congelamento ou recozimento acima da Tg') dando à torta estrutura e volume. Manitol e glicina são exemplos de agentes de encorpamento habitualmente usados. Os estabilizadores incluem uma classe de compostos que podem servir como crioprotetores, lioprotetores e agentes formadores de vidro. Os crioprotetores atuam para estabilizar proteínas durante o congelamento ou no estado congelado em temperaturas baixas (P. Cameron, ed., Good Pharmaceutic Freeze-Drying Practice, Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, (1997)). Os lioprotetores estabilizam as proteínas na forma de dosagem sólida secada por congelamento pela preservação das propriedades conformacionais equivalentes às naturais da proteína durante os estágios de desidratação da secagem por congelamento. As propriedades de estado vítreo foram classificadas como "forte" ou "frágil" dependendo das suas propriedades de relaxação como uma função da temperatura. É importante que os crioprotetores, lioprotetores e agentes formadores de vidro permaneçam na mesma fase com a proteína de modo a comunicar estabilidade. Açúcares, polímeros e polióis caem dentro desta categoria e pode algumas vezes servir a todos os três papéis.
Os polióis abrangem uma classe de excipientes que inclui açúcares, (por exemplo manitol, sacarose, sorbitol) e outros álcoois poliídricos (por exemplo, glicerol e propileno glicol). O polímero polietileno glicol (PEG) é incluído nesta categoria. Os polióis são habitualmente usados como excipientes de estabilização e/ou agentes de isotonicidade nas formulações de proteína parenterais tanto líquidas quanto liofilizadas. Com respeito à série Hofmeister, os polióis são cosmotrópicos e são preferencialmente excluídas da superfície da proteína. Os polióis podem proteger proteínas dos caminhos da degradação tanto física quanto química. Preferencialmente excluídos os co-solventes aumentam a tensão de superfície eficaz do solvente na interface da proteína por meio do qual as conformações de proteína mais energeticamente favoráveis são aquelas com as áreas de superfície menores.
Manitol é um agente de encorpamento popular em formulações liofilizadas porque o mesmo cristaliza da fase de proteína amorfa durante a secagem por congelamento levando à estabilidade estrutural da torta (por exemplo Leukine Enbrel - Lyo, Betaseron®). Este é no geral usado em combinação com um crio e/ou lioprotetores como a sacarose. Por causa da propensão do manitol para cristalizar sob as condições de congelamento, sorbitol e sacarose são os agentes de tonicidade/ estabilizadores preferidos em formulações líquidas para proteger o produto contra estresses do congelamento-descongelamento encontrados durante o transporte ou quando do congelamento volumoso antes da fabricação. Sorbitol e sacarose são muito mais resistentes à cristalização e portanto menos prováveis de separar de fase da proteína. É interessante mencionar que embora o manitol tenha sido usado nas quantidades tonificantes em diversas formulações líquidas comercializadas tais como Actimmune®, Forteo® e Rebit®, os rótulos de produto destes medicamentos portam uma advertência 'Não Congelar'. O uso de açúcares redutores (contendo grupos de aldeído ou cetona livres) tais como glicose e lactose devem ser evitados porque eles podem reagir e glicar resíduos de lisina e arginina da superfície de proteínas por intermédio da reação de Maillard de aldeídos e aminas primárias (Chevalier F, et al., Nahrung, 46(2): 58-63 (2002); Humeny A, et al., J Agric Food Chem. 50(7): .2153-60 (2002)). A sacarose pode hidrolisar para frutose e glicose sob condições ácidas (Kautz C. F. e Robinson A. L., JACS, 50(4) 1022-30 (1928)) e conseqüentemente pode causar glicação.
O polímero polietileno glicol (PEG) pode estabilizar proteínas por dois mecanismos dependentes de temperatura diferentes. Em temperaturas mais baixa, é preferencialmente excluído da superfície da proteína mas foi mostrado interagir com a forma não dobrada da proteína em temperatura mais alta dada a sua natureza anfípática (Lee L. L. e Lee J. C., Biochemistry, .26(24): 7813-9 (1987)). Assim em temperaturas mais baixas o mesmo pode proteger proteínas por intermédio do mecanismo de exclusão preferencial, mas em temperaturas mais altas possivelmente pela redução do número de colisões produtivas entre moléculas não dobradas. PEG também é um crioprotetor e foi utilizado no Recombinate®, uma formulação liofilizada do Fator Anti-hemofílico recombinante, que utiliza PEG 3350 a uma concentração de 1,5 mg/ml. Os PEGs líquidos de peso molecular baixo (PEG .300 a 600) podem estar contaminados com peróxidos e causam a oxidação da proteína. Se usados, o teor de peróxido na matéria prima deve ser minimizado e controlado por toda a sua vida de prateleira. O mesmo é verdadeiro para os polissorbatos.
Em uma forma de realização particular das presentes composições, um estabilizador (ou uma combinação de estabilizadores) é adicionada à formulação de liofilização para prevenir ou reduzir a agregação e degradação química induzida pela liofilização ou induzida pela armazenagem. Uma solução nebulosa ou turva na reconstituição indica que a proteína precipitou. O termo "estabilizador" significa um excipiente capaz de prevenir a agregação ou outra degradação física, assim como degradação química (por exemplo, autólise, desamidação, oxidação, etc.) em um estado aquoso e sólido. Os estabilizadores que são convencionalmente utilizado em composições farmacêuticas incluem, mas não são limitados a, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCl, compostos de poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio, [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74: 225, (1991)]. Em uma forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de cerca de 0 % a cerca de 40 % p/v. Em uma outra forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de pelo menos 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, .16, 17, 18, 19, 20, 30 ou 40 % p/v. Em uma outra forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9 % a cerca de 10 % p/v. Ainda em uma outra forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de cerca de 2 % a cerca de4 % p/v. Ainda em uma outra forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de cerca de 2 % p/v.
Se desejado, as composições liofilizadas também incluem quantidades apropriadas de agentes de encorpamento e reguladores de osmolaridade adequadas para formar uma "torta" liofilizada. Os agentes de encorpamento podem ser cristalinos (por exemplo, manitol, glicina) ou amorfo (por exemplo, sacarose, polímeros tais como dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose). Outros agentes de encorpamento exemplares incluem lactose, sorbitol, trealose ou xilitol. Em uma forma de realização, o agente de encorpamento é manitol. Em uma outra forma de realização, o agente de encorpamento é incorporado em uma concentração de cerca de 0 % a cerca de 10 % p/v. Em uma outra forma de realização, o agente de encorpamento é incorporado em uma concentração de pelo menos0,2, 0,5, 0,7, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0,8,5, 9,0 ou 9,5 % p/v. Ainda em uma outra forma de realização em uma concentração de cerca de 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 % a 5,0 % p/v, para produzir uma torta mecânica e farmaceuticamente estável e elegante. Em uma outra forma de realização, a concentração de manitol é de 4 % p/v. Tensoativos
As moléculas de proteína têm uma alta propensão para interagir com superfícies tornando-as suscetíveis à adsorção e desnaturação nas interfaces ar-líquido, frasco-líquido e líquido-líquido (óleo de silicona). Este caminho de degradação foi observado ser inversamente dependente da concentração de proteína e resulta na formação de agregados de proteína solúveis e insolúveis ou a perda de proteína da solução por intermédio da adsorção nas superfícies. Além da adsorção na superfície do recipiente, a degradação induzida pela superfície é exacerbada com a agitação física, como seria experienciado durante o envio e manuseio do produto.
Os tensoativos são habitualmente usados em formulações de proteína para prevenir a degradação induzida pela superfície. Os tensoativos são moléculas anfipáticas com a capacidade de proteínas que competem quanto as posições interfaciais. As porções hidrofóbicas das moléculas tensoativas ocupam posições interfaciais (por exemplo, ar/ líquido), enquanto que as porções hidrofílicas das moléculas permanecem orientadas na direção do solvente volumoso. Nas concentrações suficientes (tipicamente em torno da concentração da micelar crítica do detergente), uma camada de superfície de moléculas de tensoativo serve para prevenir as moléculas de proteína de adsorver na interface. Deste modo, a degradação induzida pela superfície é minimizada. Os tensoativos mais habitualmente usados são ésteres de ácido graxo de polietoxilatos de sorbitano, isto é, polissorbato 20 e polissorbato 80 (por exemplo, Avonex®, Neupogen®, Neulasta®). Os dois diferem apenas no comprimento da cadeia alifática que comunica caráter hidrofóbico às moléculas, C-12 e C-18, respectivamente. Conseqüentemente, polissorbato-80 é mais ativo na superfície e tem uma concentração micelar crítica mais baixa do que o polissorbato-20. O tensoativo poloxâmero 188 também foi usadas em diversos produtos líquidos comercializados tais como Gonal-F®, Norditropin® e Ovidrel®.
Os detergentes também podem afetar a estabilidade conformacional termodinâmica de proteínas. Aqui mais uma vez, os efeitos de um dado excipiente será específico de proteína. Por exemplo, polissorbatos foram mostrados reduzir a estabilidade de algumas proteínas e aumentar a estabilidade de outras. A desestabilização pelo detergente de proteínas pode ser racionalizada em termos das caudas hidrofóbicas das moléculas de detergente que podem prender na ligação específica com estados de proteína parcial ou totalmente desdobrados. Estes tipos de interações causariam uma mudança no equilíbrio conformacional voltado para os estados de proteína mais expandidos (isto é, aumentando a exposição de porções hidrofóbicas da molécula de proteína no complemento para a ligação de polissorbato). Alternativamente, se o estado nativo da proteína exibe algumas superfícies hidrofóbicas, a ligação de detergente ao estado nativo pode estabilizar esta conformação.
Um outro aspecto dos polissorbatos é que eles são inerentemente suscetíveis à degradação oxidativa. Freqüentemente, como matérias primas, eles contêm quantidades suficientes de peróxidos para causar a oxidação de cadeias laterais de resíduo proteína, especialmente metionina. O potencial para o dano oxidativo que surge da adição de estabilizador enfatiza o ponto que concentrações eficazes mais baixas de excipientes devem ser usadas nas formulações. Para os tensoativos, a concentração eficaz para uma dada proteína dependerá do mecanismo de estabilização. Foi postulado que se o mecanismo de estabilização de tensoativo está relacionado para prevenir a desnaturação da superfície a concentração eficaz estará em torno da concentração micelar crítica do detergente. Ao contrário, se o mecanismo de estabilização está associado com interações de proteína-detergente específicas, a concentração de tensoativo eficaz estará relacionada com a concentração de proteína e a estequiometria da interação (Randolph T. W., et al., Pharm Biotechnol., 13: 159-75 (2002)).
Os tensoativos também podem ser adicionados em quantidades apropriadas para prevenir o fenômeno de agregação relacionado com a superfície durante o congelamento e secagem [Chang, B, J. Pharm. Sei. 85:1325, (1996)]. Os tensoativos exemplares incluem tensoativos aniônicos, catiônicos, não iônicos, zwitteriônicos e anfotéricos incluindo tensoativos derivados de aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os tensoativos aniônicos incluem, mas não são limitados a, lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal sódico de N-lauroil-sarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal sódico do ácido 1-octano-sulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio e sal sódico do ácido glicodesoxicólico. Os tensoativos catiônicos incluem, mas não são limitados a, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado e brometo de hexadeciltrimetilamônio. Os tensoativos zwitteriônicos incluem, mas não são limitados a, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 e SB3-12. Os tensoativos não iônicos incluem, mas não são limitados a, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20 e TWEEN-80. Em uma outra forma de realização, os tensoativos incluem lauromacrogol 400, esterarato de polioxil 40, óleo de mamona polioxietileno hidrogenado 10, 40, 50 e 60, monoesterarato de glicerol, polissorbato 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja e outros fosfolipídeos tais como DOPC, DMPG, DMPC e DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. As composições que compreendem estes tensoativos, individualmente ou como uma mistura em razões diferentes, são portanto ainda fornecidas. Em uma forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0 % a cerca de 5 % p/v. Em uma outra forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de pelo menos 0,001, 0,002, 0,005, 0,007, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 ou 4,5 % p/v. Em uma outra forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,001 % a cerca de 0,5 % p/v. Ainda em uma outra forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,004, 0,005, 0,007, 0,01, 0,05 ou 0,1 % p/v a cerca de 0,2 % p/v. Ainda em uma outra forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,01 % a cerca de 0,1 % p/v. Sais
Os sais são freqüentemente adicionados para aumentar a concentração iônica da formulação, que pode ser importante para a solubilidade, estabilidade física e isotonicidade da proteína. Os sais podem afetar a estabilidade física das proteínas em uma variedade de modos. íons podem estabilizar o estado nativo das proteínas pela ligação aos resíduos carregados na superfície da proteína. Alternativamente, estes podem estabilizar o estado desnaturado pela ligação aos grupos de peptídeo ao longo da cadeia principal da proteína (-CONH-). Os sais também podem estabilizar a conformação da proteína nativa pela proteção de interações eletrostáticas repulsivas entre resíduos dentro de uma molécula de proteína. Os eletrólitos nas formulações de proteína também podem proteger das interações eletrostáticas atrativas entre as moléculas de proteína que podem levar à agregação e insolubilidade da proteína.
O efeito de sal sobre a estabilidade e solubilidade de proteínas varia significantemente com as características das espécies iônicas. A série Hofmeister originada nos idos de 1880 como um caminho para classificar os eletrólitos com base na sua capacidade para precipitar proteínas (Cacace M. G., et al., Quarterly Reviews of Biophysics., 30(3): 241-277 (1997)). Neste relato, a série Hofmeister é usada para ilustrar uma escala de efeitos de estabilização de proteína pelos co-solutos iônicos e não iônicos. Na Tabela C, os co-solutos são ordernados com respeito a aos seus efeitos gerais sobre as proteínas no estado de solução, de estabilizante (cosmotrópico) a desestabilizante (caotrópico). No geral, as diferenças nos efeitos através dos ânions são muito maiores do que aquelas observadas para os cátions, e, para ambos os tipos, os efeitos são mais evidentes em concentrações mais altas do que são aceitáveis nas formulações parenterais. As concentrações altas de cosmótropos (por exemplo, sulfato de amônio >1 molar) são habitualmente usadas para precipitar proteínas da solução por um processo chamado 'precipitação' onde o cosmótropo é preferencialmente excluído da superfície da proteína reduzindo a solubilidade da proteína na sua conformação nativa (dobrada). A remoção ou diluição do sal retornará a proteína à solução. O termo 'dissolução' refere-se ao uso de íons desestabilizantes (por exemplo, como guanidina e cloreto) que aumentam a solubilidade de proteínas pela solvatação das ligações de peptídeo da cadeia de proteína. Aumentando as concentrações do caótropo favorecerá a conformação no estado desnaturado (não dobrado) da proteína conforme a solubilidade da cadeia de peptídeo aumenta. A eficácia relativa dos íons para 'dissolver' e 'precipitar' define a sua posição na série de Hofmeister.
De modo a manter a isotonicidade em uma formulação parenteral, as concentrações salinas são no geral limitadas a menos do que 150 mM para as combinações iônicas monovalentes. Nesta faixa de concentração, o mecanismo de estabilização salina é provavelmente devido à triagem de forças intramoleculares repulsivas eletrostáticas ou forças intermoleculares atrativas (triagem de Debye-Huckel). De maneira interessante, os sais caotrópicos foram mostrados serem mais eficazes na estabilização da estrutura de proteína do que as concentrações similares de cosmótropos por este mecanismo. Acredita-se que os ânions caotrópicos se liguem mais fortemente do que os íons cosmotrópicos. Com respeito à degradação da proteína covalente, efeitos diferenciais de concentração iônica neste mecanismo são esperados através da teoria de Debye-Huckel. Conseqüentemente, relatos publicados de estabilização de proteína pelo cloreto de sódio são acompanhados por aqueles onde o cloreto de sódio acelerou a degradação covalente. Os mecanismos pelos quais os sais afetam a estabilidade da proteína são específicos de proteína e podem variar significantemente como uma função do pH da solução. Um exemplo onde um excipiente pode ser útil em permitir que a liberação de um medicamento de proteína seja aquela de formulações de anticorpo de concentração um tanto alto. Recentemente, os sais foram mostrados serem eficazes na redução da viscosidade de tais formulações (Liu J., et ai., J. Pharm Sci., 94(9): 1928-40 (2005); Errata em: J Pharm Sci., 95(1): 234-5. (2006)). Tabela C: A série de Hofineister de sais
<table>table see original document page 53</column></row><table>
Aminoácidos
Os aminoácidos têm encontrado uso versátil em formulações de proteína como tampões, agentes de encorpamento, estabilizadores e antioxidantes. A histidina e o ácido glutâmico são utilizados para tamponar formulações de proteína na faixa de pH de 5,5 a 6,5 e 4,0 a 5,5 respectivamente. O grupo imidazol de histidina tem um pKa = 6,0 e o grupo carboxila da cadeia lateral do ácido glutâmico tem um pKa de 4,3 que os tornam adequados para tamponar nas suas respectivas faixas de pH. O acetato, o tampão mais habitualmente usado na faixa de pH ácido de 4,0 a 5,5, sublima durante a liofilização e por este motivo não devem ser usados em formulações secadas por congelamento. O ácido glutâmico é particularmente útil em tais casos (por exemplo, Stemgen®). A histidina é habitualmente encontrada em formulações de proteína comercializadas (por exemplo, Xolair®, Herceptin®, Recombinate®). Esta fornece uma boa alternativa ao citrato, um tampão conhecido por causar dor na injeção. De maneira interessante, a histidina também foi relatada ter um efeito estabilizante sobre ABX-IL 8 (um anticorpo de IgG2) com respeito à agregação quando usada em concentrações altas tanto em apresentações líquidas e liofilizadas (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). A histidina (até 60 mM) também foi observada reduzir a viscosidade de uma formulação de concentração alta deste anticorpo. Entretanto, no mesmo estudo, os autores observaram agregação e descoloração aumentadas em formulações contendo histidina durante os estudos de congelamento-descongelamento do anticorpo em recipientes de aço inoxidável. Os autores atribuíram isto a um efeito de íons ferro lixiviados da corrosão de recipientes de aço. Uma outra precaução com a histidina é que ela sofre foto-oxidação na presença de íons metálicos (Tomita M5 et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). O uso de metionina como um antioxidante nas formulações parece promissor; o mesmo foi observado ser eficaz contra vários estresses oxidativos (Lam XM, et al., J Pharm Sci.,86(11): 12505 (1997)).
Os aminoácidos glicina, prolina, serina e alanina foram mostrados estabilizar proteínas pelo mecanismo de exclusão preferencial. A glicina também é um agente de encorpamento habitualmente usado em formulações liofilizadas (por exemplo, Neumega®, Genotropin®, Humatrope®). A mesma cristaliza da fase amorfa congelada dando à torta estrutura e volume. A arginina tem mostrado ser um agente eficaz na inibição da agregação e tem sido usada em formulações tanto líquida quanto liofilizada (por exemplo, Activase®, Avonex®, Enbrel® líquidos). Além disso, a eficiência realçada de redobrar de certas proteínas na presença de arginina tem sido atribuída à sua supressão da reação de agregação competidora durante a redobra. Antioxidantes
A oxidação de resíduos de proteína surge de várias fontes diferentes. Além da adição de antioxidantes específicos, a prevenção do dano oxidativo à proteína envolve o controle cuidadoso de vários fatores por todo o processo de fabricação e armazenagem do produto tais como oxigênio atmosférico, temperatura, exposição à luz e contaminação química. Os antioxidantes farmacêuticos mais habitualmente usados são agentes redutores, descontaminantes de oxigênio/radical livre ou agentes queladores. Os antioxidantes nas formulações de proteína terapêuticas devem ser solúveis em água e permanecem ativos por toda a vida de prateleira do produto. Os agentes redutores e descontaminantes de oxigênio/radical livre funcionam pela remoção de espécies de oxigênio ativo em solução. Agentes queladores tais como EDTA podem ser eficazes pela ligação de contaminantes de metal traço que promovem a formação de radical livre. Por exemplo, EDTA foi utilizado na formulação líquida do fator de crescimento de fibroblasto ácido para inibir a oxidação catalisada por íon metálico de resíduos de cisteína. EDTA foi usado em produtos comercializados como Kineret® e Ontak®.
Além de avaliar a eficácia de vários excipientes na prevenção da oxidação de proteína, os cientista de formulação devem estar cientes do potencial para os próprios antioxidantes induzirem outras mudanças covalentes ou físicas à proteína. Vários de tais casos foram relatados na literatura. Os agentes redutores (como glutationa) pode causar o rompimento de ligações de dissulfeto intramoleculares, que podem levar ao embaralhamento de dissulfeto. Na presença de íons metálicos de transição, ácido ascórbico e EDTA foram mostrados promover a oxidação da metionina em várias proteínas e peptídeos (Akers MJ e Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. Em: Pharmaceutic Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editores. Pharmaceutic Science. Tailor e Francis, UK (1999)); Fransson J. R., J. Pharm. Sei. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). O tiossulfato de sódio foi relatado reduzir os níveis de oxidação da metionina induzida por luz e temperatura em rhuMab HER2; entretanto, a formação de um aduto de tiossulfato-proteína também foi relatado neste estudo (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sei. 86(11): 1250-5 (1997)). A seleção de um antioxidante apropriado é feito de acordo com os estresses e sensibilidades específicos da proteína. íons metálicos
No geral, os íons metálicos de transição são indesejados nas formulações de proteína porque eles podem catalisar reações de degradação física e química em proteínas. Entretanto, íons metálicos específicos são incluídos nas formulações quando eles são co-fatores para proteínas e em formulações de proteínas em suspensão onde eles formam complexos de coordenação (por exemplo, suspensão de zinco de insulina). Recentemente, o uso de íons magnésio (10 a 120 mM) foi proposto para inibir a isomerização de ácido aspártico ao ácido isoaspártico (WO 2004039337).
Dois exemplos onde íons metálicos conferem estabilidade ou atividade aumentada em proteínas são desoxirribonuclease humana (rhDNase, Pulmozyme®) e Fator VIII. No caso de rhDNase, os íons Ca+2 (até 100 mM) aumentaram a estabilidade da enzima através de um sítio de ligação específico (Chen B, et al., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). De fato, a remoção de íons cálcio da solução com EGTA causou um aumento na desamidação e agregação. Entretanto, este efeito foi observado apenas com íons Ca+2; outros cátions divalentes - Mg+2, Mn+2 e Zn+2 foram observados desestabilizar a rhDNase. Efeitos similares foram observados no Fator VIII. Os íons Ca+2 e Sr+2 estabilizaram a proteína enquanto que outros como <formula>formula see original document page 56</formula> desestabilizaram a enzima (Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). Em um estudo separado com o Fator VIII, um aumento significante na taxa de agregação foi observada na presença de íons Al+3 (Derrick TS, et al., Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). Os autores mencionam que outros excipientes como sais de tampão são freqüentemente contaminados com íons Al+3 e ilustram a necessidade de usar excipientes de qualidade apropriada nos produtos formulados. Conservantes
Os conservantes são necessários quando do desenvolvimento de formulações parenterais de uso múltiplo que envolvem mais do que uma extração do mesmo recipiente. A sua função primária é inibir o crescimento microbiano e garantir a esterilidade do produto por toda a vida de prateleira ou data de vencimento de uso do produto medicamentoso. Os conservantes habitualmente usados incluem álcool benzilíco, fenol e m-cresol. Embora os conservantes tenham uma longa história de uso, o desenvolvimento de formulações de proteína que incluem conservantes pode ser desafiador. Os conservantes quase sempre têm um efeito desestabilizante (agregação) sobre as proteínas e isto tem se tornado um fator principal na limitação de seu uso em formulações de proteína de dose múltipla (Roy S, et al., J Pharm Sci.,94(2): 38296 (2005)).
Até agora, a maioria dos medicamentos de proteína foram formulados apenas para o uso único. Entretanto, quando formulações de dose múltipla são possíveis, estas têm a vantagem adicional de permitir a conveniência do paciente e negociabilidade aumentada. Um bom exemplo é aquele de hormônio do crescimento humano (hGH) onde o desenvolvimento de formulações preservadas tem levado à comercialização de apresentações de mais canetas de injeção de uso múltiplo, convenientes. Pelo menos quatro de tais dispositivos de caneta contendo formulações preservadas de hGH são correntemente disponíveis no mercado. Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (líquido, Genentech) & Genotropin (liofilizado - cartucho de câmara dupla, Pharmacia & Upjohn) contêm fenol enquanto Somatrope® (Eli Lilly) é formulado com m-cresol.
Diversos aspectos necessitam ser considerados durante o desenvolvimento da formulação de formas de dosagem preservadas. A concentração conservante eficaz no produto medicamentoso deve ser otimizado. Isto requer testar um dado conservante na forma de dosagem com faixas de concentração que conferem eficácia antimicrobiana sem comprometer a estabilidade da proteína. Por exemplo, três conservantes foram triados com êxito no desenvolvimento de uma formulação líquida para o receptor de interleucina 1 (Tipo I), usando calorimetria de varredura diferencial (DSC). Os conservantes foram classificados com base no seu impacto na estabilidade em concentrações habitualmente usadas em produtos comercializados (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).
Como seria esperado, o desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes é mais desafiador do que as formulações liofilizadas. Os produtos secados por congelamento podem ser liofilizados sem o conservante e reconstituído com um diluente contendo conservante no momento de uso. Isto encurta o tempo para que um conservante esteja em contato com a proteína minimizando significantemente os riscos de estabilidade associados. Com formulações líquidas, a eficácia de conservante e estabilidade tem que ser mantida durante a vida de prateleira do produto inteira (~ 18 a 24 meses). Um ponto importante a mencionar é que a eficácia conservante tem que ser demonstrada na formulação final contendo o medicamento ativo e todos os componentes excipientes.
Alguns conservantes podem causar reações no local da injeção, que é um outro fator que necessita consideração quando da escolha de um conservante. Em testes clínicos que focalizaram na avaliação de conservantes e tampões em Norditropin, a percepção de dor foi observada ser mais baixa nas formulações contendo fenol e álcool benzilíco quando comparadas com uma formulação contendo m-cresol (Kappelgaard A. M., Harm Res. 62 Supl 3: 98-103 (2004)). De maneira interessante, entre os conservantes habitualmente usados, o álcool benzilíco possui propriedades anestésicas (Minogue SC e Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)).
Dadas as divulgações e orientação aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica saberão qual quantidade ou faixa de excipiente pode ser incluída em qualquer formulação particular para se obter uma formulação biofarmacêutica da invenção que promova a retenção em estabilidade do produto biofarmacêutico. Por exemplo, a quantidade e tipo de um sal a ser incluído em uma formulação biofarmacêutica da invenção podem ser selecionados com base na osmolalidade desejada (isto é, isotônica, hipotônica ou hipertônica) da solução fmal assim como as quantidades e osmolalidade de outros componentes a serem incluídos na formulação. Similarmente, pela exemplificação com referência ao tipo de poliol ou açúcar incluídos em uma formulação, a quantidade de um tal excipiente dependerá da sua osmolalidade.
Por via de exemplo, a inclusão de cerca de 5 % de sorbitol pode alcançar a isotonicidade enquanto cerca de 9 % de um excipiente de sacarose são necessários para se obter isotonicidade. A seleção da quantidade ou faixa de concentrações de um ou mais excipientes que podem ser incluídos dentro de uma formulação biofarmacêutica da invenção foi exemplificada acima por referência aos sais, polióis e açúcares. Entretanto, aqueles habilitados na técnica entenderão que as considerações aqui descritas e outras exemplificadas por referência aos excipientes específicos são igualmente aplicáveis a todos os tipos e combinações de excipientes incluindo, por exemplo, sais, aminoácidos, outros agentes de tonicidade, tensoativos, estabilizadores, agentes de encorpamento, crioprotetores, lioprotetores, anti- oxidantes, íons metálicos, agentes queladores e/ou conservantes.
Além disso, onde um excipiente particular é relatado em uma formulação, por exemplo, em porcentagem (%) p/v, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a concentração molar equivalente deste excipiente também é considerada.
Naturalmente, uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconheceria que as concentrações dos excipientes anteriormente mencionados compartilham uma interdependência dentro de uma formulação particular. Por via de exemplo, a concentração de um agente de encorpamento pode ser diminuída onde, por exemplo, existe uma alta concentração de proteína/peptídeo ou onde, por exemplo, existe uma alta concentração de agente estabilizante. Além disso, uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconheceria que, de modo a manter a isotonicidade de uma formulação particular em que não existe nenhum agente de encorpamento, a concentração de um agente estabilizante seria ajustada conseqüentemente (isto é, uma quantidade "tonificante" de estabilizador seria usada).
As composições são estáveis por pelo menos dois anos de 2o C a 8o C no estado liofilizado. Esta estabilidade de longa duração é benéfica para prolongar a vida de prateleira do produto farmacêutico. Métodos de Preparação
A presente invenção considera ainda métodos para a preparação de formulações de proteína terapêutica. Em um aspecto, métodos para preparar uma formulação de pepticorpo terapêutico liofilizado que compreende a etapa de liofilizar uma composição de pepticorpo terapêutico em um tampão que compreende um agente de tamponamento, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e um tensoativo;
Os presentes métodos compreendem ainda uma ou mais das seguintes etapas: adicionar um agente estabilizante à dita mistura antes de liofilizar, adicionar pelo menos um agente selecionado de um agente de encorpamento, um agente regulador de osmolaridade e um tensoativo à dita mistura antes da liofilização. O agente de encorpamento pode ser qualquer agente de encorpamento aqui descrito. Em um aspecto, o agente de encorpamento é manitol. Em uma outra forma de realização, o agente estabilizante é sacarose. O tensoativo pode ser qualquer tensoativo aqui descrito. Em uma forma de realização, o tensoativo é polissorbato-20.
A prática da reconstituição padrão para material liofilizado é adicionar de volta um volume de água pura ou água estéril para injeção (WFI) (tipicamente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam algumas vezes usadas na produção de produtos farmacêuticos para a administração parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18: 1311-1354 (1992)]. Conseqüentemente, os métodos são fornecidos para a preparação de pepti corpos terapêuticos reconstituídos que compreendem a etapa de adicionar um diluente a uma composição de pepticorpo terapêutico liofilizado da invenção.
A composição de pepticorpo terapêutico liofilizado pode ser reconstituída como uma solução aquosa. Uma variedade de carregadores aquosos, por exemplo, água estéril para injeção, água com conservantes para uso em dose múltipla ou água com quantidades apropriadas de tensoativos (por exemplo, polissorbato-20), 0,4 % de solução salina, 0,3 % de glicina ou as suspensões podem conter o composto ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas. Em vários aspectos, tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropil-metilcelulose, alginato, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes de dispersão ou umectação podem ser um fosfatídeo que ocorra naturalmente, por exemplo lecitina ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo esterarato de polioxietileno ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo heptadecaetileno-oxicetanol ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol tal como monooleato de polioxietileno sorbitol ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo monooleato de polietileno sorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo etil ou n-propil, p-hidroxibenzoato.
Para administrar composições a seres humanos ou animais de teste, em um aspecto, as composições compreendem um ou mais carregadores farmaceuticamente aceitáveis. As frases "farmaceuticamente" ou "farmacologicamente aceitável" referem-se às entidades e composições moleculares que são estáveis, inibem a degradação da proteína tais como agregação e produtos de clivagem e além disso não produzem reações alérgicas ou outras adversas quando administradas usando vias bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. "Carregadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem qualquer e todos os solventes clinicamente úteis, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e outros, incluindo aqueles agentes divulgados acima.
As composições de pepticorpo terapêutico podem ser administradas oral, tópica, transdérmica, parenteral, pela pulverização de inalação, vaginal, retalmente ou pela injeção intracraniana. O termo parenteral como aqui usado inclui injeções subcutâneas, técnicas de injeção ou infusão intravenosas, intramusculares, intracistérnicas. A administração pela injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e ou implantação cirúrgica em um sítio particular também é considerada. No geral, as composições são essencialmente livres de pirogênios, assim como de outras impurezas que seriam nocivas ao receptor.
As administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser realizadas com os níveis de dose e padrão que são selecionados pelo médico tratador. Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da gravidade e curso da doença, se o medicamento é administrado com propósitos preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, da história clínica do paciente e da resposta ao medicamento e do critério do médico atendente. Kits
Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits que compreendem um ou mais compostos liofilizados ou composições empacotadas em uma maneira que facilita o seu uso para a administração aos pacientes. Em uma forma de realização, um tal kit inclui um composto ou composição aqui descritos (por exemplo, uma composição que compreende uma proteína ou peptídeo terapêuticos), embalados em um recipiente tal como um frasco ou recipiente selados, com um rótulo fixado ao recipiente ou incluído na embalagem que descreve o uso do composto ou composição na prática do método. Em uma forma de realização, o kit contém um primeiro recipiente tendo uma composição de proteína ou peptídeo terapêuticos liofilizada e um segundo recipiente tendo uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição liofilizada. Em um aspecto, o composto ou composição são embalados em uma forma de dosagem unitária. O kit pode incluir ainda um dispositivo adequado para a administração da composição de acordo com uma via específica de administração. Preferivelmente, o kit contém um rótulo que descreve o uso da composição terapêutica de proteína ou peptídeo. Dosagens
O regime de dosagem envolvido em um método para tratar uma condição aqui descrita será determinada pelo médico atendente, considerando vários fatores que modificam a ação de medicamentos, por exemplo a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores clínicos. Em vários aspectos, o regime diário está na faixa de 0,1 a 1000 μg de uma preparação por quilograma de peso corporal (calculando a massa da proteína sozinha, sem modificação química) ou de 0,1 a 150 μg/kg. Em algumas formas de realização da invenção, a dose pode exceder 1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg.
As preparações da invenção podem ser administradas por um bolo inicial seguido por uma infusão contínua para manter os níveis circulantes terapêuticos de produto medicamentoso. Como um outro exemplo, o composto inventivo pode ser administrado como uma dose de tempo único. Aqueles de habilidade comum na técnica facilmente otimizarão dosagens eficazes e regimes de administração como determinado pela boa prática médica e a condição clínica do paciente individual. A freqüência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e da via de administração. A formulação farmacêutica ótima será determinada por uma pessoa habilitada na técnica dependendo da via de administração e dosagem desejada. Ver por exemplo, Remington's Pharmaceutic Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435 a 1712, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência. Tais formulações podem influenciar o estado físico, a estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de depuração in vivo dos agentes administrados. Dependendo da via de administração, uma dose adequada pode ser calculada de acordo com o peso corporal, área de superfície corporal ou tamanho do órgão. Refinamentos dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento que envolve cada uma das formulações acima mencionadas é rotineiramente feita por aqueles de habilidade comum na técnica sem experimentação indevida, especialmente considerando-se a informação de dosagem e os ensaios aqui divulgados, assim como os dados farmacocinéticos observados nos testes clínicos humanos debatidos acima. As dosagens apropriadas podem ser averiguadas através do uso de ensaios estabelecidos para a determinação de dosagens de nível sangüíneo em conjunção com dados de dose-resposta apropriados. O regime de dosagem final será determinado pelo médico atendente, considerando vários fatores que modificam a ação de medicamentos, por exemplo a atividade específica do medicamento, a severidade do dano e a responsividade do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores clínicos. Conforme os estudos são conduzidos, informação adicional emergirá com respeito aos níveis de dosagem apropriada e duração de tratamento para várias doenças e condições. Estrutura dos compostos No Geral.
Nas preparações de acordo com a invenção, um peptídeo é ligado a um veículo através do término N do peptídeo, término C do peptídeo ou ambos e a estrutura resultante pode ser modificados ainda com um WSP covalentemente ligado que é ligado à porção de veículo no produto veículo- peptídeo. Assim, as moléculas de pepticorpo terapêutico desta invenção podem ser descritas pela seguinte Fórmula I:
I [(X1)a - F1-(X2)J-(L1)cWSPd
em que:
F1 é um veículo;
X1 é selecionado de P1-(L2)e- P2(L3)rP1-(L2)e- P3(L4)g-P2(L3)rP1-(L2)e- e
P4(L5)h-P3(L4)g-P2(L3)rP1-(L2)e-
X2 é selecionado de: -(L2)e-P1
-(L2)e-P1-(L3)rP2 -(L2)e-P1-(L3)rP2-(L4)g-P3 e -(L2)e-P1-(L3)rP2-(L4)g-P3-(L5)h-P4
em que P , P2, P3 e P4 são cada um seqüências independentes de peptídeos farmacologicamente ativos;
L1, L2, L3, L4 e L5 são cada um independentemente ligadores; a, b, c, e, f, g e h são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de a e b seja 1; d é 0, 1, ou maior do que 1; e
WSP é um polímero solúvel em água, a ligação do qual é efetuada em qualquer porção reativa em F1.
Assim, o composto I compreende os compostos das fórmulas II <formula>formula see original document page 66</formula> incluindo seus multímeros em que F1 é um domínio Fc e está ligado ao término C de X1 e um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
III <formula>formula see original document page 66</formula> incluindo seus multímeros em que F1 é um domínio Fc e está ligado ao término N de X2 e um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc5 opcionalmente através do ligador L1.
IV <formula>formula see original document page 66</formula> incluindo seus multímeros em que F1 é um domínio Fc e está ligado ao término N de -(L1)c-P1 e um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1 e
<formula>formula see original document page 66</formula> incluindo seus multímeros em que F1 é um domínio Fc e está
ligado ao término N de -L1-P1-L2-P2 e um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
Em uma forma de realização, F1 é um domínio Fc e é ligado ao término N ou término C de um peptídeo. Em uma forma de realização relacionada, o Fc é ligado em uma forma dimérica como aqui descrita à qual 2 (ou mais) peptídeos são ligados. Os peptídeos podem ser homodiméricos (isto é, a mesma seqüência de aminoácido) ou heterodinâmica (isto é, seqüências de aminoácido diferentes que ligam o mesmo alvo ou que ligam alvos diferentes).
Em uma outra forma de realização, as Alças Fc que compreendem um peptídeo ou peptídeos são fornecidas. As Alças Fc que compreendem um peptídeo ou peptídeos são preparadas em um processo em que pelo menos um peptídeo biologicamente ativo é incorporado como uma seqüência interna em um domínio Fe. Uma tal seqüência interna pode ser adicionada pela inserção (isto é, entre aminoácidos no domínio Fc anteriormente existente) ou pela substituição de aminoácidos no domínio Fc anteriormente existente (isto é, removendo aminoácidos no domínio Fc anteriormente existente e adicionando aminoácidos peptídicos). No último caso, o número de aminoácidos de peptídeo adicionados não precisam corresponder ao número de aminoácidos removidos do domínio Fc anteriormente existente. Por exemplo, em um aspecto, uma molécula em que .10 aminoácidos são removidos e 15 aminoácidos são adicionados é fornecida. Os compostos farmacologicamente ativos fornecidos são preparados por um processo que compreende: a) selecionar pelo menos um peptídeo que module a atividade de uma proteína de interesse; e b) preparar um agente farmacológico que compreenda uma seqüência de aminoácido do peptídeo selecionado como uma seqüência interna de um domínio Fc. Este processo pode ser utilizado para modificar um domínio Fc que já está ligado através de um terminal N ou C ou cadeia lateral a um peptídeo, por exemplo, como descrito nos Pedidos de Pat. U.S. N- 2003/0195156, 2003/0176352,2003/0229023 e 2003/0236193 e publicação internacional números WO .00/24770 e WO 04/026329. O processo descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. Ns US2006/0140934 também pode ser utilizado para modificar um domínio Fc que é parte de um anticorpo. Deste modo, moléculas diferentes podem ser produzidas que têm funcionalidades adicionais, tais como um domínio de ligação a um epítopo diferente ou um domínio de ligação adicional ao epítopo existente da molécula precursora. As moléculas que compreendem uma seqüência de peptídeo interna também são aludidas como "pepticorpos Fc internos" ou "moléculas de peptídeo de Fc interno."
As moléculas de peptídeo de Fc interno podem incluir mais do que uma seqüência de peptídeo em tandem em uma região interna particular e estas podem incluir outros peptídeos em outras regiões internas. Embora as regiões de alça putativas sejam preferidas, as inserções em quaisquer outros domínios não terminais do Fc também são considerados parte desta invenção. As variantes e derivados dos compostos acima (descritos abaixo) também são abrangidos por esta invenção.
Os compostos desta invenção podem ser preparados pelos métodos sintéticos padrão, técnicas de DNA recombinante ou quaisquer outros métodos de preparar peptídeos e proteínas de fusão.
Um uso considerado para as moléculas de peptídeo de Fc interno é como um agente terapêutico ou um profilático. Um peptídeo selecionado pode ter atividade comparável com — ou ainda maior do que ~ o ligando natural imitado pelo peptídeo. Além disso, certos agentes terapêuticos com base em ligando natural podem induzir anticorpos contra o ligando endógeno do próprio paciente. Ao contrário, a seqüência única do peptídeo ligado ao veículo evita este cilada por ter pouca ou tipicamente nenhuma identidade de seqüência com o ligando natural. Além disso, os pepticorpos internos de Fc podem ter vantagens na redobra e purificação em moléculas Fc terminalmente ligados em N ou C. Além disso ainda, pepticorpos internos de Fc podem ser mais estáveis tanto termodinamicamente, devido à estabilização de domínios quiméricos quanto quimicamente, devido à resistência aumentada à degradação proteolítica de amino- e carbóxi-peptidases. Os pepticorpos internos de Fc também podem exibir propriedades farmacocinéticas melhoradas. Peptídeos.
Qualquer número de peptídeos pode ser usado em conjunção com a presente invenção. De interesse particular são peptídeos que imitam a atividade de EPO, TPO, hormônio do crescimento, G-CSF, GM-CSF, IL-Ira, CTLA4, TRAIL, TNF, VEGF, MMP, miostatina, integrina, OPG, OPG-L, NGF, TALL-1, Ang-2 parceiro(s) de ligação, TGF-α e TGF-β. Os antagonistas de peptídeo são também de interesse, particularmente aqueles antagonísticos para a atividade de TNF, qualquer uma das interleucinas (IL-1, .2, 3, ...) e proteínas envolvidas na ativação de complemento (por exemplo, C3b). Os peptídeos alvejadores também são de interesse, incluindo peptídeos autodirecionais de tumor, peptídeos que transportam membrana e outros. Todas destas classes de peptídeos podem ser descobertas pelos métodos descritos nas referências citadas neste relatório descritivo e outras referências.
A demonstração de fago, em particular, é útil na geração de peptídeos para o uso na presente invenção. Foi estabelecido que a seleção por afinidade a partir de bibliotecas de peptídeos aleatórios pode ser usada para identificar ligandos de peptídeo para qualquer sítio de qualquer produto de gene. Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025-30. A demonstração de fago é particularmente bem adaptada para identificar peptídeos que ligam a tais proteínas de interesse como receptores de superfície celular ou quaisquer proteínas tendo epítopos lineares. Wilson et al. (1998), Can. J. Microbiol. 44: 313-29; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. Tais proteínas são extensivamente revisadas em Herz et al. (1997), J. Receptor & Signal Transduction Res. 17(5): 671-776, que é aqui incorporada por referência. Tais proteínas de interesse são preferidas para o uso nesta invenção.
Por via de exemplo e sem limitação, um grupo de peptídeos que se ligam aos receptores de citocina é fornecido. As citocinas foram recentemente classificadas de acordo com seu código de receptor. Ver Inglot (1997), Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 45: 353-7, que é aqui incorporada por referência. Entre estes receptores estão os CKRs (família I na Tabela 3). A classificação de receptor aparece na Tabela 3.
Tabela 3 - Receptores de Citocina Classificados pelo Código do Receptor
<table>table see original document page 69</column></row><table> <table>table see original document page 70</column></row><table>
.1IL-17R-pertence a familia CKR mas não é designado para as 4 subfamilias indicadas.
.2 Outros subtipos de IFN tipo I permanecem não designados. Citocinas hematopoiéticas, ligandos de IL-IO e interferons não possuem quinases de proteína intrínsecas funcionais. As moléculas de sinalização para as citocinas são JAK's, STATs e moléculas não receptoras relacionadas. IL-14, IL-16 e IL-18 foram clonadas mas de acordo com o código de receptor elas permanecem não designadas.
.3 Receptores de TNF de uso múltiplo, moléculas intracelulares distintas para a transdução de sinal incluindo "domínio morto" de FAS R e 55 kDa TNF-DR que participa em seus efeitos citotóxicos. NGF/TNF R podem ligar-se tanto a NGF quanto a fatores relacionados assim como ligandos de TNF. Os receptores de quimiocina são sete receptores de domínio de transmembrana (7TM, serpentina). Estes são ligados à proteína G.
<table>table see original document page 70</column></row><table> <table>table see original document page 71</column></row><table> Outras proteínas de interesse como alvos para a geração de peptídeo na presente invenção incluem os seguintes: <formula>formula see original document page 71</formula> O antígeno de grupo sangüíneo Duffy (DARC) é um receptor de eritrócito que pode ligar diversas quimiocinas diferentes. IL-I R pertence à superfamília da imunoglobulina mas os seus eventos de transdução de sinal característicos permanecem incertos.
5 As citocinas neurotrópicas podem associar-se também com receptores de NGF/TNF.
6 STKS pode abranger muitos outros fatores relacionados com TGF-β que permanecem não designados. As quinases de proteína são partes intrínsecas do domínio intracelular da família quinase de receptor (RKF). As enzimas participam na transmissão de sinais por intermédio dos receptores.
B7RP1 CRPl
Calcitonina CD28
CETP cMet
Fator de complemento B C4b
CTLA4
Glucagon Receptor de Glucagon
LIPG
MPL
variantes de junção de moléculas preferencialmente expressadas em célula de tumor; por exemplo, CD44, variantes não glicosiladas CD30 de mucina e glicoproteínas de superfície Y de Lewis CD19, CD20, CD33, CD45
antígeno de membrana específico da próstata e antígeno de célula específica da próstata
metaloproteinases de matriz (MMPs), tanto secretadas quanto
ligadas a membrana (por exemplo, MMP-9) Catepsinas Receptor TIE-2 heparanase
Ativador de plasminogênio da uroquinase (UPA), receptor
UPA
Hormônio da paratireóide (PTH), proteína relacionada com o hormônio da paratireóide (PTHrP), PTH-RI, PTH-RII Her2
Her3
Insulina
Miostatina
TALL-I
Fator de crescimento de nervo
Integrinas e receptores
Selectinas e seus receptores moléculas de adesão celular e seus receptores Os peptídeos exemplares aparecem nas Tabelas 4 até 38 abaixo. Estes peptídeos podem ser preparados por quaisquer métodos divulgados na técnica, muitos dos quais são aqui debatidos. Na maioria das tabelas que seguem, as abreviações de aminoácido de letra única são usadas. O "X" nestas seqüências (e por todo este relatório descritivo, a menos que de outro modo especificado em um caso particular) significa que qualquer um dos 20 resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente podem estar presentes. Qualquer um destes peptídeos podem ser ligados em tandem (isto é, seqüencialmente), com ou sem ligadores e uns poucos exemplos ligados em tandem são fornecidos na tabela. Os ligadores são listados como "A" e podem ser qualquer um dos ligadores aqui descritos. As repetições e ligadores em tandem são mostrados separadamente por traços para clareza. Qualquer peptídeo contendo um resíduo de cisteinila pode ser reticulado com um outro peptídeo contendo Cys, cada um ou ambos dos quais podem ser ligados a um veículo. Uns poucos exemplos reticulados são fornecidos na tabela. Qualquer peptídeo tendo mais do que um resíduo Cys também pode formar uma ligação de dissulfeto intrapeptídico; ver, por exemplo, peptídeos Mimético de EPO na Tabela 5. Uns poucos exemplos de peptídeos ligados a dissulfeto intrapeptídicos são especificados na tabela. Qualquer um destes peptídeos podem ser derivatizados como aqui descritos e uns poucos exemplos derivatizados são fornecidos na tabela. Os peptídeos derivatizados nas tabelas são exemplares ao invés de limitantes, como os peptídeos não derivatizados associados também podem ser utilizados nesta invenção. Para derivados em que a carboxila terminal pode ser encapuzada com um grupo amino, o grupo amino encapuzado é mostrado como -NH2. Para os derivados em que resíduos de aminoácido são substituídos por porções outras que não de resíduos de aminoácido, as substituições são denotadas por σ, que significa qualquer uma das porções descritas em Bhatnagar et al. (1996), J. Med, Chem. 39: 3814-9 e Cuthbertson et al. (1997), J. Med. Chem. 40: 2876-82, que são incorporadas por referência. O substituinte J e os substituintes Z (Z5, Z6, ...Z40) são como definidos nas Pat. U.S. Nes 5.608.035, 5.786.331 e 5.880.096, que são incorporadas por referência, Para as seqüências Miméticas de EPO (Tabela 5), os substituintes X2 até Xn e o número inteiro "n" são como definidos na WO 96/40772, que é incorporada por referência. Também para as seqüências Miméticas de EPO, os substituintes Xna, Xla, X2a, X3a, X4a, X5a e Xca seguem as definições de Xn, X1, X2, X3, X4, X5 e Xc, respectivamente, da WO 99/47151, que também é incorporada por referência. Os substituintes "Ψ", "Θ" e "+" são como definidos em Sparks et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sei.93: 1540-4, que é aqui incorporada por referência. X4, X5, X6 e X7 são como definidos na Pat. U.S. N2 5.773.569, que é aqui incorporada por referência, exceto que: para peptídeos de ligação de integrina, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 e X8 são como definidos nos Pedidos Internacionais WO 95/14714, publicado em 1 de junho de 1995 e WO 97/08203, publicado em 6 de março de 1997, que também são incorporadas por referência; e para peptídeos miméticos VIP, X1, X1', X1", X2, X3, X4, X5, X6 e Z e os números inteiros m e η são como definidos na WO 97/40070, publicado em 30 de outubro de 1997, que é também incorporada por referência. Xaa e Yaa abaixo são como definidos na WO 98/09985, publicado em 12 de março de 1998, que é incorporada por referência. AA1, AA2, AB1, AB2 e AC são como definidos no Pedido Internacional WO 98/53842, publicado em 3 de dezembro de 1998, que é incorporada por referência. X1, X2, X3 e X4 na Tabela 17 apenas são como definidos no pedido Europeu EP 0 911 393, publicado em 28 de abril de 1999. Os resíduos que aparecem em negrito são D-aminoácidos. Todos os peptídeos são ligados através de ligações de peptídeo a menos que de outro modo mencionado. As abreviações são listadas no final deste relatório descritivo. Na coluna "SEQ ID NO.", "NR" significa que nenhuma listagem de seqüência é requerida para a dada seqüência. Tabela 4 - Seqüências de peptídeo antagonistas de IL-I
<table>table see original document page 75</column></row><table> <table>table see original document page 76</column></row><table> <table>table see original document page 77</column></row><table> <table>table see original document page 78</column></row><table> <table>table see original document page 79</column></row><table> <table>table see original document page 80</column></row><table> <table>table see original document page 81</column></row><table> <table>table see original document page 82</column></row><table> <table>table see original document page 83</column></row><table> <table>table see original document page 84</column></row><table> <table>table see original document page 85</column></row><table> <table>table see original document page 86</column></row><table> Tabela 5 - Seqüências de peptídeo miméticas de EPO <table>table see original document page 86</column></row><table> <table>table see original document page 87</column></row><table> Tabela 6 - Seqüências de peptídeo miméticas de TPO <table>table see original document page 87</column></row><table> <table>table see original document page 88</column></row><table> <table>table see original document page 89</column></row><table> Tabela 7 - Seqüências de peptídeo miméticas de G-CSF
<table>table see original document page 89</column></row><table> Tabela 8 - Seqüências de peptídeo antagonistas de TNF
<table>table see original document page 90</column></row><table>
Tabela 9 - Seqüências de peptídeo de ligação de integrina
<table>table see original document page 90</column></row><table> <table>table see original document page 91</column></row><table> 91
Tabela 10 - Seqüências de peptídeo de antagonista de selectina
<table>table see original document page 92</column></row><table> Tabela 11 - Seqüências de peptídeo de antipatogênicas <table>table see original document page 93</column></row><table> <table>table see original document page 94</column></row><table> <table>table see original document page 95</column></row><table> Tabela 12 - Seqüências de peptídeo de miméticas de VIP
<table>table see original document page 95</column></row><table> <table>table see original document page 96</column></row><table> <table>table see original document page 97</column></row><table>
Tabela 13 - Seqüências de peptídeo de antagonistas de Mdm/hdm
<table>table see original document page 97</column></row><table> <table>table see original document page 98</column></row><table> Tabela 14 - Seqüências de peptídeo de antagonistas de Calmodulina <table>table see original document page 98</column></row><table> Tabela 15 - Seqüências de peptídeo antagonistas de mastóide/inibidoras de protease de mastóide <table>table see original document page 99</column></row><table> Tabela 16 - Seqüências de peptídeo antagonistas de SH3
<table>table see original document page 99</column></row><table> <table>table see original document page 100</column></row><table>
Tabela 17 - Seqüências de peptídeo miméticas de somatostatina ou cortistatina
<table>table see original document page 100</column></row><table> <table>table see original document page 101</column></row><table>
Tabela 18 - Seqüências de peptídeo antagonistas de UKR
<table>table see original document page 101</column></row><table> <table>table see original document page 102</column></row><table> Tabela 19 - Seqüências de peptídeo inibidoras de macrófago e/ou célula T
<table>table see original document page 102</column></row><table> <table>table see original document page 103</column></row><table>
Tabela 20 - Peptídeos farmacologicamente ativos exemplares adicionais
<table>table see original document page 103</column></row><table> <table>table see original document page 104</column></row><table> <table>table see original document page 105</column></row><table> <table>table see original document page 106</column></row><table>
Tabela 21 Inibidores de peptídeo de miostatina
<table>table see original document page 106</column></row><table> <table>table see original document page 107</column></row><table> <table>table see original document page 108</column></row><table> <table>table see original document page 109</column></row><table> 109
Tabela 22 Inibidores de peptídeo de miostatina
<table>table see original document page 110</column></row><table> <table>table see original document page 111</column></row><table>
<table>table see original document page 111</column></row><table> Tabela 23 Inibidores de peptídeo de miostatina <table>table see original document page 112</column></row><table> <table>table see original document page 113</column></row><table> <table>table see original document page 114</column></row><table> <table>table see original document page 115</column></row><table> <table>table see original document page 116</column></row><table> <table>table see original document page 117</column></row><table> Tabela 25 Seqüências de peptídeo de antagonista de integrina <table>table see original document page 118</column></row><table> <table>table see original document page 119</column></row><table> Tabela 27 Peptídeos de ligação de vinculina <table>table see original document page 120</column></row><table>
Tabela 28 Seqüências de peptídeo relacionadas com laminina
<table>table see original document page 120</column></row><table>
Tabela 29 Peptídeos Moduladores de NGF
<table>table see original document page 120</column></row><table> <table>table see original document page 121</column></row><table> <table>table see original document page 122</column></row><table> <table>table see original document page 123</column></row><table> <table>table see original document page 124</column></row><table> <table>table see original document page 125</column></row><table> <table>table see original document page 126</column></row><table> <table>table see original document page 127</column></row><table>
Tabela 34 Inibidores de peptídeo de ANG-2
<table>table see original document page 127</column></row><table>
Tabela 35 Inibidores de peptídeo de ANG-2
<table>table see original document page 127</column></row><table>
Tabela 36 Peptídeos de ligação de ANG-2
<table>table see original document page 127</column></row><table>
Tabela 37 Peptídeos de ligação de ANG-2
<table>table see original document page 127</column></row><table> <table>table see original document page 128</column></row><table> Tabela 38 Peptídeos de Ligação de Ang-2
<table>table see original document page 129</column></row><table> <table>table see original document page 130</column></row><table> <table>table see original document page 131</column></row><table> <table>table see original document page 132</column></row><table>
Além dos compostos de TMP apresentados na Tabela 6, a invenção fornece numerosos outros compostos de TMP. Em um aspecto, os compostos TMP compreendem a seguinte estrutura geral:
TMP1-(L1)n-TMP2
em que TMP1 e TMP2 são cada um independentemente selecionados do grupo de compostos que compreendem a estrutura de núcleo:
X2-Xa-X^X5-X6-X7-X8-X9-X10,
em que,
X2 é selecionado do grupo que consiste de Glu, Asp, Lys e Vai;
X3 é selecionado do grupo que consiste de Gly e Ala; X4 é Pro;
X5 é selecionado do grupo que consiste de Thr e Ser;
X6 é selecionado do grupo que consiste de Leu, lie, Vai, Ala e Phe;
X7 é selecionado do grupo que consiste de Arg e Lys; X8 é selecionado do grupo que consiste de Gln, Asn e Glu;
Xg é selecionado do grupo que consiste de Trp5 Tyr e Phe;
Xio é selecionado do grupo que consiste de Leu, Ile5 Vai, Ala, Phe, Met e Lys;
Li é um ligador como aqui descrito; e
η é 0 ou 1;
e sais destes fisiologicamente aceitáveis.
Em uma forma de realização, Lj compreende (Gly)n, em que η é de 1 a 20 e quando η é maior do que 1, até metade dos resíduos Gly podem ser substituídos por um outro aminoácido selecionado dos 19 aminoácidos naturais remanescentes ou um estereoisômero destes.
Além da estrutura de núcleo X2-Xio apresentada acima para TMPι e TMP2, outras estruturas relacionadas também são possíveis em que uma ou mais das seguintes são adicionadas às estruturas de núcleo TMPi e/ou TMP2: Xi é ligado ao término N e/ou X11, X12, X13, e/ou X14 são ligados ao término C, em que X1, X12, X13 e X14 são como segue:
XI é selecionado do grupo que consiste de lie, Ala, Vai, Leu,
Ser e Arg;
XII é selecionado do grupo que consiste de Ala, lie, Vai, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His e Glu;
X12 é selecionado do grupo que consiste de Ala, lie, Vai, Leu, Phe, Gly, Ser e Gln;
X13 é selecionado do grupo que consiste de Arg, Lys, Thr, Vai, Asn, Gln e Gly; e
X14 é selecionado do grupo que consiste de Ala, lie, Vai, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu e Gly.
Os compostos TMP da invenção são fabricados de, isto é, compreendendo, pelo menos 9 subunidades (X2-X10), em que X2-Xi0 compreendem a estrutura de núcleo. As subunidades X2-Xi4 são aminoácidos independentemente selecionados dentre os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente, entretanto, a invenção abrange compostos onde X2-X14 são independentemente selecionados do grupo de aminoácidos atípicos, que não ocorrem naturalmente bem conhecidos na técnica. Os aminoácidos específicos são identificados para cada posição. Por exemplo, X2 podem ser Glu, Asp, Lys ou Vai.
Tanto as abreviações de três letras quanto as de letra única para os aminoácidos são aqui usados; em cada caso, as abreviações são aquelas padrão usadas para os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente ou variações bem conhecidas destes. Estes aminoácidos podem ter estereoquímica L ou D (exceto para Gly, que não é nem L nem D) e os TMPs (assim como todos os outros compostos da invenção) podem compreender uma combinação de estereoquímicas. A invenção também fornece moléculas TMP reversas (assim como para todos os outros peptídeos aqui divulgados) em que a seqüência do terminal amino ao terminal carbóxi dos aminoácidos é invertida. Por exemplo, o inverso de uma molécula tendo a seqüência normal X1-X2-X3 seria X3-X2-Xi. A invenção também fornece moléculas de TMP retro-reversas (assim como para todas as outras moléculas da invenção aqui descritas) em que, como um TMP reverso, a seqüência do terminal amino para o terminal carbóxi de aminoácidos é invertida e os resíduos que são normalmente enanciômeros "L" no TMP são alterados para a forma estereoisomérica "D".
Os compostos de TMP exemplares da invenção portanto incluem sem limitação os seguintes compostos: <formula>formula see original document page 135</formula> <formula>formula see original document page 136</formula> consiste de alquila C1-C4, alcóxi C1-C4, cloro e bromo.
.5.0 término C livre é derivatizado. Tipicamente, o término C é esterificado ou amidado. Por exemplo, pode-se usar métodos descritos na técnica para adicionar (NH-CH2-CH2-NH2)2 aos compostos desta invenção. Do mesmo modo, pode-se usar métodos descritos na técnica para adicionar - NH2 aos compostos desta invenção. Os grupos derivados de terminal V exemplares incluem, por exemplo, -C(0)R2 em que R2 é alcóxi inferior ou - NR3R4 em que R3 e R4 são independentemente hidrogênio ou alquila C1-C8 (preferivelmente alquila C1-C4).
ó.Uma ligação de dissulfeto é substituída com uma outra, preferivelmente porção de reticulação, mais estável (por exemplo, um alquileno). Ver, por exemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39:38149; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9.
.7.Um ou mais resíduos de aminoácido individuais são modificados. Vários agentes derivatizantes são conhecidos por reagir especificamente com cadeias laterais selecionadas ou resíduos terminais, como descrito em detalhes abaixo.
.8.Os polímeros heterobifuncionais são tipicamente usados para ligar a proteínas. Um exemplo é SMCC ou Succinimidil-4-(N- maleimidometilcicloexano-l-carboxilato. A extremidade de NHS (N- Hiroxilsuccinimida) reage com as aminas primárias, que na conjugação no pH ~ 7 é ótimo. Uma vez que o complexo é formado, a reação da porção de maleimida de SMCC pode se processar com uma outra proteína/peptídeo contendo um grupo sulfidrila livre, que ocorre em uma taxa muito mais rápida do que a formação da amida na reação inicial. O resultado é uma ligação entre duas proteínas, por exemplo, conjugados de anticorpo-enzima. Uma aplicação é ilustrada pela preparação de fragmentos de Fab' reticulados à peroxidase de rábano (Ishikwa, et al., 1983a,b; Yoshitake et al., 1982a,b; Imagawa et al.,1982; Uto et al., 1991). O uso de Sulfo SMCC (Sulfossuccinimidil-4-(N- compostos. As porções podem alternativamente eliminar ou atenuar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis dos compostos e outros. Os derivados exemplares incluem compostos em que:
1.0 composto ou alguma porção deste são cíclicos. Por exemplo, a porção de peptídeo pode ser modificada para conter dois ou mais resíduos Cys (por exemplo, no ligador), que pode ciclizar pela formação da ligação de dissulfeto. Para citações às referências na preparação de derivados ciclizados, ver a Tabela 2.
2. O composto é reticulado ou é tornado capaz de reticulação entre as moléculas. Por exemplo, a porção de peptídeo pode ser modificada para conter um resíduo Cys e deste modo ser capaz de formar uma ligação de dissulfeto intermolecular com uma molécula equivalente. O composto também pode ser reticulado através do seu término C, como na molécula mostrada abaixo.
<formula>formula see original document page 138</formula>
3. Uma ou mais ligações de peptidila [-C(O)NR-] (uniões) são substituídas por uma ligação que não de peptidila. As ligações que não de peptidila exemplares são -CH2-Carbamato [-CH2-OC(O)NR-], fosfonato, - CH2-Sulfonamida [-CH2-S(O)2NR-], uréia [-NHC(O)NH-], -CH2-amina secundária e peptídeo alquilado [-C(0)NR6- em que R6 é alquila inferior].
4. O término N é derivatizado. Tipicamente, o término N pode ser acilado ou modificado para uma amina substituída. Os grupos derivados de terminal N exemplares incluem -NRRl (outro que não -NH2), - NRC(O)Rl, -NRC(O)ORl, -NRS(0)2R1, -NHC(O)NHRl, succinimida ou benziloxicarbonil-NH- (CBZ-NH-), em que R e Rl são cada um independentemente hidrogênio ou alquila inferior e em que o anel de fenila pode ser substituído com 1 a 3 substituintes selecionados do grupo que maleimidometil) cicloexano-l-carboxilato) permite quanto a solubilidade em água de modo que uma etapa de solubilização orgânica não é necessária, permitindo maior flexibilidade e menos rompimento de atividade na reação com proteínas.
Os resíduos de lisina e resíduos de terminal amino podem ser reagidos com anidridos do ácido succínico ou outro ácido carboxílico, que inverte a carga dos resíduos de lisina. Outros reagentes adequados para derivatizar resíduos contendo alfa-amino incluem imidoésteres tais como picolinimidato de metila; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroboroidreto; ácido trinitrobenzenossulfônico; O-metilisouréia; 2,4 pentanodiona; e reação catalisada por transaminase com glioxilato.
Os resíduos de arginila podem ser modificados pela reação com qualquer um ou combinação de diversos reagentes convencionais, incluindo fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-cicloexanodiona e ninidrina. A derivatização de resíduos de arginila requer que a reação seja realizada em condições alcalinas por causa do pKa alto do grupo funcional de guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina assim como o grupo épsilon-amino da arginina.
A modificação específica de resíduos de tirosila tem sido extensivamente estudada, com interesse particular na introdução de rótulos espectrais dentro de resíduos de tirosila pela reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais habitualmente, N- acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies de O-acetil tirosila e derivados 3-nitro, respectivamente.
Os grupos de cadeia lateral de carboxila (aspartila ou glutamila) podem ser seletivamente modificados pela reação com carbodiimidas (R'-N=C=N-R') tais como l-cicloexil-3-(2-morfolinil-(4- etil) carbodiimida ou l-etil-3-(4-azônia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, os resíduos de aspartila e glutamila podem ser convertidos para resíduos de asparaginila e glutaminila pela reação com íons amônio.
Os resíduos de glutaminila e asparaginila podem ser desamidados para os resíduos de glutamila e aspartila correspondentes. Alternativamente, estes resíduos são desamidados sob condições ácidas brandas. Cada forma destes resíduos cai dentro do escopo desta invenção.
Os resíduos de cisteinila podem ser substituídos por resíduos de aminoácido ou outras porções para eliminar a ligação de dissulfeto ou, ao contrário, para estabilizar a reticulação. Ver, por exemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9.
A derivatização com agentes bifuncionais é útil para a reticulação dos peptídeos ou seus derivados funcionais a uma matriz de suporte insolúvel em água ou a outros veículos macromoleculares. Os agentes de reticulação habitualmente usados incluem, por exemplo, 1,1- bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidróxi-succinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílicos, imidoésteres homobifuncional, incluindo ésteres de dissuccinimidila tais como 3,3'- ditiobis(succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais tais como bis-N- maleimido-1,8-octano. Os agentes derivatizantes tais como 3-[(p- azidofenil)ditio]propioimidato de metila produziram intermediários fotoativáveis que são capazes de formar reticulação na presença de luz. Alternativamente, as matrizes insolúveis em água reativas tais como carboidratos ativados pelo brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos nas Pat. U.S. N- 3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537 e 4.330.440 são utilizados para a imobilização de proteína.
Os grupos de carboidrato (oligossacarídeo) podem ser convenientemente ligados aos sítios que são conhecidos como sendo sítios de glicosilação em proteínas. No geral, oligossacarídeos ligados em O são ligados aos resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto que os oligossacarídeos ligados em N são ligados aos resíduos de asparagina(Asn) quando eles são parte da seqüência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. X é preferivelmente um dos 19 aminoácidos que ocorrem naturalmente outros que não prolina. As estruturas de oligossacarídeos ligados em N e ligados em O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é habitualmente encontrado em ambos é o ácido N-acetilneuramínico (aludido como ácido siálico). O ácido siálico é usualmente o resíduo terminal de oligossacarídeos tanto ligados em N quanto ligados em O e, em virtude da sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas ao composto glicosilado. Tal(is) sítio(s) pode(m) ser incorporado(s) no ligador dos compostos desta invenção e são preferivelmente glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos de polipeptídeo (por exemplo, em células de mamífero tais como CHO, BHK, COS). Entretanto, tais sítios podem ser ainda glicosilados pelos procedimentos sintéticos ou semi- sintéticos conhecidos na técnica.
Outras modificações possíveis incluem a hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, a oxidação do átomo de enxofre em Cys, metilação dos grupos alfa- amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983).
Os compostos da presente invenção também podem ser trocados ao nível do DNA. As seqüências de DNA de qualquer porção do composto podem ser trocados para códons mais compatíveis com a célula hospedeira escolhida. Para a E. coli, que é a célula hospedeira preferida, os códons otimizados são conhecidos na técnica. Os códons podem ser substituídos para eliminar sítios de restrição ou para incluir sítios de restrição silenciosos, que podem ajudar no processamento do DNA na célula hospedeira selecionada. O veículo, ligador e seqüências de DNA peptídicas podem ser modificados para incluir qualquer uma das mudanças de seqüência precedentes.
Derivados conjugados a isótopo e toxina. Um outro conjunto de derivados úteis são as moléculas descritas acima conjugadas às toxinas, traçadores ou radioisótopos. Tal conjugação é especialmente útil para as moléculas que compreendem seqüências de peptídeo que se ligam às células de tumor ou patógenos. Tais moléculas podem ser usadas como agentes terapêuticos ou como um auxiliar em cirurgia (por exemplo, cirurgia radioimunoguiada ou RIGS) ou como agentes de diagnóstico (por exemplo, radioimunodiagnósticos ou RID).
Como agentes terapêuticos, estes conjugado derivados possuem várias vantagens. Eles facilitam o uso de toxinas e radioisótopos que seriam tóxicos se administrados sem a ligação específica fornecida pela seqüência de peptídeo. Estes também podem reduzir os efeitos colaterais que acompanham o uso de radiação e quimioterapia pela facilitação de doses eficazes mais baixas do parceiro de conjugação.
Os parceiros de conjugação úteis incluem:
• radioisótopos, tais como 90Ítrio, 131Iodo, 225Actínio e 213Bismuto;
• toxina de ricina A, toxinas microbianamente derivadas tais como endotoxina de Pseudomonas (por exemplo, PE38, PE40) e outras;
• moléculas parceiras em sistemas de captura (ver abaixo);
• biotina, estreptavidina (úteis como moléculas parceiras em sistemas de captura ou como traçadores, especialmente para o uso em diagnóstico); e
• agentes citotóxicos (por exemplo, doxorrubicina).
Uma adaptação útil destes derivados conjugados é o uso em um sistema de captura. Em um tal sistema, a molécula da presente invenção compreenderia uma molécula de captura benigna. Esta molécula de captura seria capaz de ligar-se especificamente a uma molécula efetora separada que compreende, por exemplo, uma toxina ou radioisótopo. Ambas as molécula conjugadas a veículo e a molécula efetora seriam administradas ao paciente. Em um tal sistema, a molécula efetora teria uma meia vida curta exceto quando ligada à molécula de captura conjugada ao veículo, minimizando assim quaisquer efeitos colaterais tóxicos. A molécula conjugada a veículo teria uma meia vida relativamente longa mas seria benigna e não tóxica. As porções de ligação específica de ambas as moléculas podem ser parte de um par de ligação específica conhecida (por exemplo, biotina, estreptavidina) ou pode resultar de métodos de geração de peptídeo tais como aqueles aqui descritos.
Tais derivados conjugados podem ser preparados pelos métodos conhecidos na técnica. No caso de moléculas efetoras de proteína (por exemplo, endotoxina de Pseudomonas), tais moléculas podem ser expressadas como proteínas de fusão de construções de DNA correlativas. Os derivados conjugados a radioisótopo podem ser preparados, por exemplo, como descrito para o anticorpo BEXA (Coulter). Os derivados que compreendem agentes citotóxicos ou toxinas microbianas podem ser preparados, por exemplo, como descrito para o anticorpo BR96 (Bristol- Myers Squibb). As moléculas utilizadas em sistemas de captura podem ser preparadas, por exemplo, como descrito pelas patentes, pedidos de patente e publicações da NeoRx. As moléculas utilizadas para RIGS e RID podem ser preparadas, por exemplo, pelas patentes, pedidos de patente e publicações da NeoProbe. Veículos
A invenção requer a presença de pelo menos um veículo ligado a um peptídeo através do término N, término C ou uma cadeia lateral de um dos resíduos de aminoácido. Os veículos múltiplos também podem ser usados. Em um aspecto, um domínio Fc é o veículo. O domínio Fc pode ser fundido aos terminais N ou C dos peptídeos ou tanto ao terminal N quanto ao C.
Em várias formas de realização da invenção, o componente Fc é um Fc nativo ou uma variante de Fe. A fonte de imunoglobulina do Fc nativo é, em um aspecto, de origem humana e, em formas de realização alternativas, pode ser de qualquer classe de imunoglobulina. Os domínios Fc nativos são fabricados de polipeptídeos monoméricos que podem ser ligados em formas diméricas ou multiméricas pela associação covalente (isto é, ligações de dissulfeto) e/ou não covalente. O número de ligações de dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativo varia de um a quatro dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA, IgE) ou subclasse (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Um exemplo de um Fc nativo é um dímero ligado a dissulfeto resultante da digestão com papaína de uma IgG (ver Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071- .9).
Deve ser mencionado que os monômeros Fc espontaneamente dimerizarão quando os resíduos de cisteína apropriados estão presentes, a menos que condições particulares estejam presentes que impedem a dimerização através da formação da ligação de dissulfeto. Mesmo se os resíduos de cisteína que normalmente formam ligações de dissulfeto no dímero de Fc são removidos ou substituídos por outros resíduos, as cadeias monoméricas no geral formarão um dímero através de interações não covalentes. O termo "Fc" aqui é usado para significar qualquer uma destas formas: o monômero nativo, o dímero nativo (ligados pela ligação de dissulfeto), dímeros modificados (por dissulfeto e/ou não covalentemente ligados) e monômeros modificados (isto é, derivados).
Como mencionado, variantes de Fc são veículos adequados dentro do escopo desta invenção. Um Fc nativo pode ser extensivamente modificado para formar uma variante de Fc, contanto que a ligação ao receptor de recuperação seja mantida; ver, por exemplo a WO 97/34631 e WO 96/32478. Em tais variantes de Fc, pode-se remover um ou mais sítios de um Fc nativo que forneça características estruturais ou atividade funcional não requerida pelas moléculas de fusão desta invenção. Pode-se remover estes sítios, por exemplo, pela substituição ou deleção de resíduos, inserção de resíduos no sítio ou porções truncadas contendo o sítio. Os resíduos inseridos ou substituídos também podem ser aminoácidos alterados, tais como peptidomiméticos ou D-aminoácidos. As variantes de Fc podem ser desejáveis por várias razões, diversas das quais são aqui descritas. As variantes de Fc exemplares incluem moléculas e seqüências em que:
1. Os sítios envolvidos na formação da ligação de dissulfeto são removidos. Tal remoção pode evitar a reação com outras proteínas contendo cisteína presentes na célula hospedeira usadas para produzir as moléculas da invenção. Para este propósito, o segmento contendo cisteína ao término N pode ser trancado ou resíduos de cisteína podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos (por exemplo, alanila, serila). Mesmo quando resíduos de cisteína são removidos, os domínios de cadeia única Fc podem ainda formar um domínio dimérico Fc que é mantido junto não covalentemente.
2. Um Fc nativo é modificado para torná-lo mais compatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exemplo, pode-se remover a seqüência de PA próxima ao término N de um Fc nativo típico, que pode ser reconhecido por uma enzima digestiva na E. coli tal como prolina iminopeptidase. Pode-se também adicionar um resíduo de metionina de terminal N, especialmente quando a molécula é expressada recombinantemente em uma célula bacteriana tal como a E. coli.
3. Uma porção do término N de um Fc nativo é removida para prevenir a heterogeneidade de terminal N quando expressada em uma célula hospedeira selecionada. Para este propósito, pode-se deletar qualquer um dos primeiros 20 resíduos de aminoácido do término N, particularmente aqueles nas posições 1, 2, 3, 4 e 5.
4. Um ou mais sítios de glicosilação são removidos. Os resíduos que são tipicamente glicosilados (por exemplo, asparagina) podem conferir resposta citolítica. Tais resíduos podem ser deletados ou substituídos com resíduos não glicosilados (por exemplo, alanina).
5. Os sítios envolvidos na interação com complemento, tais como o sítio de ligação Clq, são removidos. Por exemplo, pode-se deletar ou substituir a seqüência EKK de IgGl humana. O recrutamento de complemento pode não ser vantajoso para as moléculas desta invenção e assim pode ser evitado com uma tal variante de Fc.
6. Os sítios são removidos que afetam a ligação aos receptores Fc outros que não um receptor de recuperação. Um Fc nativo pode ter sítios para a interação com certas células brancas do sangue que não são requeridas para as moléculas de fusão da presente invenção e assim podem ser removidos.
7. O sítio ADCC é removido. Os sítios ADCC são conhecidos na técnica; ver, por exemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) com respeito aos sítios ADCC em IgGl. Estes sítios, também, não são requeridos para as moléculas de fusão da presente invenção e assim podem ser removidos.
8. Quando o Fc nativo é derivado de um anticorpo não humano, o Fc nativo pode ser humanizado. Tipicamente, para humanizar um Fc nativo, substituir-se-á resíduos selecionados no Fc nativo não humano com resíduos que são normalmente encontrados no Fc nativo humano. As técnicas para a humanização de anticorpo são bem conhecidas na técnica.
Um veículo alternativo seria uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula pequena (por exemplo, um composto peptidomimético) capazes de ligarem-se a um receptor de recuperação. Por exemplo, usar-se-ia como um veículo um polipeptídeo como descrito na Pat. U.S. Ne 5.739.277, concedida em 14 de abril de 1998 concedida a Presta et al. Os peptídeos também podem ser selecionados pela demonstração de fago quanto a ligação ao receptor de recuperação FcRn. Tais compostos de ligação ao receptor de recuperação também são incluídos dentro do significado de "veículo" e estão dentro do escopo desta invenção. Tais veículos devem ser selecionados quanto à meia vida aumentada (por exemplo, evitando-se seqüências reconhecidas pelas proteases) e imunogenicidade diminuída (por exemplo, favorecendo-se seqüências não imunogênicas, como descoberto na humanização de anticorpo).
Variantes, análogos ou derivados da porção Fc podem ser construídos, por exemplo, fabricando-se várias substituições de resíduos ou seqüências.
Os polipeptídeos variantes (ou análogos) incluem variantes de inserção, em que um ou mais resíduos de aminoácido suplementam uma seqüência de aminoácido Fe. As inserções podem estar localizadas em cada um ou ambos os terminais da proteína ou podem estar posicionados dentro de regiões internas da seqüência de aminoácido de Fe. As variantes de inserção, com resíduos adicionais em cada um ou em ambos os terminais, podem incluir por exemplo, proteínas de fusão e proteínas incluindo etiquetas ou rótulos de aminoácido.
Por exemplo, a molécula de Fc pode opcionalmente conter um terminal N Met, especialmente quando a molécula é expressada recombinantemente em uma célula bacteriana tal como E. coli.
Nas variantes de deleção de Fc, um ou mais resíduos de aminoácido em um polipeptídeo Fc são removidos. As deleções podem ser efetuadas em um ou ambos os terminais do polipeptídeo Fc ou com a remoção de um ou mais resíduos dentro da seqüência de aminoácido Fe. As variantes de deleção, portanto, incluem todos os fragmentos de uma seqüência de polipeptídeo Fc.
Nas variantes de substituição Fc5 um ou mais resíduos de aminoácido de um polipeptídeo Fc são removidos e substituídos com resíduos alternativos. Em um aspecto, as substituições são conservativas por natureza e as substituições conservativas deste tipo são bem conhecidas na técnica.
Alternativamente, a invenção abrange substituições que também são não conservativas. As substituições conservativas exemplares são descritas em Lehninger, [Biochemistry, 2a Edição; Worth Publishers, Inc. Nova Iorque (1975), pp. 71-77] e apresentadas imediatamente abaixo.
SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS I CARACTERÍSTICAS DA CADEIA LATERAL AMINOÁCIDO
Não polar (hidrofóbicas):
A. Alifática ALIVP
B. Aromática F W
C. Contendo enxofre M
D. Limítrofe G Polar não carregado:
A. Hidroxila STY
B. Amidas NQ
C. Sulfidrila C
D. Limítrofe G Positivamente carregada (básica) KRH Negativamente carregada (ácida) DE
As substituições conservativas exemplares, alternativas são
apresentadas imediatamente abaixo.
SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS Π RESÍDUO ORIGINAL SUBSTITUIÇÃO EXEMPLAR
Ala (A) Vai, Leu, Ile
Arg (R) Lys, Gln, Asn
Asn (N) Gln, His, Lys, Arg
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg
He (I) Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Leu (L) lie, Vai, Met, Ala, Phe
Lys (K) Arg, Gln, Asn
Met (M) Leu, Phe, Ile
Phe (F) Leu, Val5 lie, Ala
Pro (P) Gly
Ser (S) Thr
Thr(T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V) lie, Leu, Met, Phe, Ala
Por exemplo, os resíduos de cisteína podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos para prevenir a formação de algumas ou todas as reticulações de dissulfeto das seqüências de Fc. Cada resíduo de cisteína pode ser removido e/ou substituído com outros aminoácidos, tais como Ala ou Ser. Como um outro exemplo, modificações também podem ser feitas para introduzir substituições de aminoácido para (1) remover o sítio de ligação de receptor de Fc; (2) remover o sítio de ligação de complemento (Clq); e/ou para (3) remover a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Tais sítios são conhecidos na técnica e quaisquer substituições conhecidas estão dentro do escopo de Fc como aqui usado. Por exemplo, ver Molecular Immunology, Vol. 29, N° 5, 633-639 (1992) com respeito aos sítios ADCC na IgGl.
Do mesmo modo, um ou mais resíduos de tirosina podem ser substituídos pelos resíduos de fenilalanina. Além disso, outras inserções, deleções e/ou substituições de aminoácido variante também são consideradas e estão dentro do escopo da presente invenção. As substituições de aminoácido conservativas no geral serão preferidas. Além disso, as alterações podem estar na forma de aminoácidos alterados, tais como peptidomiméticos ou D-aminoácidos.
As seqüências de Fc do composto também podem ser derivatizadas como aqui descrito para peptídeos, isto é, carregando modificações outras que não inserção, deleção ou substituição de resíduos de aminoácido. Preferivelmente, as modificações são covalentes por natureza e incluem por exemplo, ligação química com polímeros, lipídeos, outras porções orgânicas e inorgânicas. Os derivados da invenção podem ser preparados para aumentar a meia vida circulante ou podem ser planejados para melhorar a capacidade alvej adora para o polipeptídeo às células, tecidos ou órgãos desejados.
Também é possível usar o domínio de ligação do receptor de recuperação da molécula de Fc intacta como a parte Fc de um composto da invenção, tal como descrito na WO 96/32478, intitulada "Altered Polypeptides with Increased Half-lives." Os membros adicionais da classe de moléculas designadas como Fc aqui são aquelas que são descritos na WO .97/34631, intitulada "Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half- Lives." Ambos os pedidos PCT publicados citados neste parágrafo são aqui incorporados por referência.
Componentes WSP
Os compostos da invenção podem incluir ainda pelo menos um WSP. A porção WPS da molécula pode ser ramificada ou não ramificada. Para o uso terapêutico da preparação de produto final, o polímero é farmaceuticamente aceitável. No geral, um polímero desejado é selecionado com base em considerações tais como se o conjugado polimérico será usado terapeuticamente e se assim, a dosagem desejada, tempo de circulação, resistência à proteólise e outras considerações. Em vários aspectos, o peso molecular médio de cada polímero solúvel em água está entre cerca de 2 kDa e cerca de 100 kDa, entre cerca de 5 kDa e cerca de 50 kDa, entre cerca de 12 kDa e cerca de 40 kDa e entre cerca de 20 kDa e cerca de 35 kDa. Ainda em um outro aspecto o peso molecular de cada polímero está entre cerca de 6 kDa e cerca de 25 kDa. O termo "cerca de" como aqui usado e do começo ao fim, indica que em preparações de um polímero solúvel em água, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que o peso molecular estabelecido. No geral, quanto mais alto o peso molecular ou quanto mais ramificações, mais alta a razão de polímero/proteína. Outros tamanhos podem ser usados, dependendo do perfil terapêutico desejado incluindo por exemplo, a duração da liberação prolongada; os efeitos, se algum, sobre a atividade biológica; a facilidade no manuseio; o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos de um polímero solúvel em água on uma proteína terapêutica.
O WSP deve ser ligado a um polipeptídeo ou peptídeo com consideração dada aos efeitos sobre os domínios funcionais ou antigênicos do polipeptídeo ou peptídeo. No geral, a derivatização química pode ser realizada sob qualquer condição adequada usada para reagir uma proteína com uma molécula polimérica ativada. Os grupos ativadores que podem ser usados para ligar o polímero solúvel em água a uma ou mais proteínas incluem sem limitação sulfona, maleimida, sulfidrila, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano e 5-piridila. Se ligados ao peptídeo pela alquilação redutiva, os polímeros selecionados devem ter um único aldeído reativo de modo que o grau de polimerização seja controlado.
Os polímeros solúveis em água, clinicamente aceitáveis, adequados incluem sem limitação, PEG, polietileno glicol propionaldeído, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, monometóxi-polietileno glicol, carboximetilcelulose, poliacetais, álcool polivinílico (PV A), polivinil pirrolidona, poli-l,3-dioxolano, poli-1,3,6- trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poli (beta-aminoácidos) (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol (PPG) e outros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (POG) (por exemplo, glicerol) e outros polióis polioxietilados, sorbitol polioxietilado ou glicose polioxietilada, ácidos colônicos ou outros polímeros de carboidrato, Ficoll ou dextrano e misturas destes.
Os polímeros solúveis em água também podem ser fabricados para serem termicamente sensíveis, como na formação de géis térmicos reversos. Os exemplos incluem Tetronics, com cadeias principais armadas em tetra e copolímeros de PEG-PLGA. A hidrofilicidade de polímeros pode ser variada substituindo-se as porções hidrofóbicas na cadeia polimérica. Um exemplo disto está na fabricação de PLGA, em que a razão de ácido láctico para ácido glicólico pode ser aumentada para permitir a solubilidade em água mais baixa. Os polímeros solúveis em água inferiores podem ser desejados em certas aplicações, por exemplo no aumento do potencial para interagir com membranas celulares. Na reconstítuição, uma razão apropriada de fosfolipídeos pode ser usada para induzir a formação de micelas ou lipossomas em solução. A vantagem de um tal sistema pode estar na capacidade para incorporar um pouco da proteína dentro da micela, com o benefício potencial de prolongar a liberação. Os fosfolipídeos capazes de formar lipossomas ou micelas incluem DMPG, DMPC, DOPC, DOPG e componentes reforçadores de lipossoma secundário apropriados tais como colesterol. Certos excipientes, tais como DEA olet-10 fosfato e olet 10- fosfato, são capazes de formar micelas em solução.
Os polímeros de polissacarídeo são um outro tipo de polímero solúvel em água que pode ser usado para a modificação de proteína ou peptídeo. A modificação de proteínas ou peptídeos pela adição de polissacarídeo(s), por exemplo, glicosilação, pode aumentar a meia vida, diminuir a antigenicidade, aumentar a estabilidade e diminuir a proteólise. Dextranos são polímeros de polissacarídeo compreendidos de subunidades individuais de glicose predominantemente ligadas pelas ligações α 1-6. O próprio dextrano está disponível em muitas faixas de peso molecular e é facilmente disponível em pesos moleculares de cerca de 1 kD a cerca de 70 kD. O dextrano é um polímero solúvel em água adequado para o uso na presente invenção como um veículo por si só ou em combinação com um outro veículo (por exemplo, Fc). Ver, por exemplo, WO 96/11953 e WO 96/05309. O uso de dextrano conjugado a imunoglobulinas terapêuticas ou de diagnóstico tem sido relatado; ver, por exemplo, Publicação de Patente Européia Ns 0 315 456, que é aqui incorporada por referência. O dextrano de cerca de 1 kD a cerca de 20 kD é preferido quando dextrano é usado como um veículo de acordo com a presente invenção.
Em uma forma de realização, o WSP é PEG e a invenção considera preparações em que um composto é modificado para incluir qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como e sem limitação mono-alcóxi (Cl-ClO) ou arilóxi- polietileno glicol. O polietileno glicol propionaldeído pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em água. O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio de PEG considerado para o uso na invenção varia de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Em um outro aspecto, a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 6 kDa a cerca de 25 kDa. Os grupos PEG no geral são ligados aos peptídeos ou proteínas por intermédio da acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reativo na porção de PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reativo no peptídeo ou proteína alvos (por exemplo, um grupo aldeído, amino ou éster). Usando métodos aqui descritos, uma mistura de moléculas conjugadas de polímero/peptídeo pode ser preparada e a vantagem aqui fornecida é a capacidade para selecionar a proporção de conjugado de polímero/peptídeo para incluir na mistura. Assim, se desejado, uma mistura de peptídeos com vários números de porções poliméricas ligadas (isto é, zero, uma ou duas) pode ser preparada com uma proporção pré determinada de conjugado de polímero/proteína.
Uma estratégia útil para a PEGuilação (outros métodos são debatidos aqui em mais detalhes) de peptídeos sintéticos consiste de combinar, através da formação de uma ligação conjugada em solução, um peptídeo e uma porção de PEG, cada uma carregando uma funcionalidade especial que é mutuamente reativa contra a outra. Os peptídeos podem ser facilmente preparados com a síntese de fase sólida convencional. Os peptídeos são "pré ativados" com um grupo funcional apropriado em um sítio específico. Os precursores são purificados e totalmente caracterizados antes de reagir com a porção de PEG. A ligação do peptídeo com PEG usualmente ocorre em fase aquosa e pode ser facilmente monitorada pela HPLC analítica de fase reversa. Os peptídeos PEGuilados podem ser facilmente purificados pela HPLC preparativa e caracterizados pela HPLC analítica, análise de aminoácido e espectrometria de dessorção a laser. Ligadores
Qualquer grupo "ligador" é opcional, seja posicionado entre peptídeos, peptídeo e veículo ou veículo e WSP. Quando presente, a sua estrutura química não é crítica, visto que o mesmo serve primariamente como um espaçador. O ligador é preferivelmente fabricado de aminoácidos ligados juntos pelas ligações de peptídeo. Assim, nas formas de realização preferidas, o ligador é fabricado de 1 a 20 aminoácidos ligados pelas ligações de peptídeo, em que os aminoácidos são selecionados dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente. Alguns destes aminoácidos podem ser glicosilados, como é bem entendido por aqueles na técnica. Em uma forma de realização mais preferida, o 1 a 20 aminoácidos são selecionados de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Ainda mais preferivelmente, um ligador é fabricado de uma maioria de aminoácidos que não são estericamente impedidos, tais como glicina e alanina. Assim, os ligadores preferidos são poliglicinas (particularmente (Gly)4, (Gly)5, (Gly)8, poli(Gly-Ala) e polialaninas. Outros exemplos específicos de ligadores são:
(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 1018);
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 1019);
(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO: 1020); e GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 1021).
Para explicar a nomenclatura acima, por exemplo, (Gly)3Lys(Gly)4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Combinações de Gly e Ala também são preferidas. Os ligadores aqui mostrados são exemplares; ligadores dentro do escopo desta invenção podem ser muito mais longos e podem incluir outros resíduos.
Ligadores não peptídicos também são possíveis. Por exemplo, ligadores de alquila tais como -NH(CH2)S-C(O)-, em que s = 2 a 20 podem ser usados. Estes ligadores de alquila podem ser ainda substituídos por qualquer grupo não estericamente impedido tais como alquila inferior (por exemplo, C1-C6) acila inferior, halogênio (por exemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenila, etc. Um ligador não peptídico exemplar é um ligador de PEG,
<formula>formula see original document page 155</formula>
em que n é tal que o ligador tenha um peso molecular de 1OOa .5000 kD, preferivelmente de 100 a 500 kD. Os ligadores de peptídeo podem ser alterados para formar derivados da mesma maneira como descrito acima. Produção de polipeptídeo e Peptídeo
Um peptídeo tendo sido identificado pode ser fabricado em células hospedeiras transformadas usando técnicas de DNA recombinantes. Se o componente de veículo é um polipeptídeo, o produto de fusão do polipeptídeo ou peptídeo-veículo pode ser expressado como um. Para assim fazê-lo, uma molécula de DNA recombinante que codifica o peptídeo é primeiro preparada usando métodos bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as seqüências que codificam os peptídeos podem ser excisadas do DNA usando enzimas de restrição adequadas. Alternativamente, a molécula de DNA pode ser sintetizada usando técnicas de síntese química, tais como o método do fosforamidato. Também, uma combinação destas técnicas pode ser usada. A invenção portanto fornece polinucleotídeos que codificam um composto da invenção.
A invenção também fornece vetores que codificam compostos da invenção em um hospedeiro apropriado. O vetor compreende o polinucleotídeo que codifica o composto operativamente ligado às seqüências de controle de expressão apropriadas. Os métodos de efetuar esta ligação operativa, antes ou depois que o polinucleotídeo seja inserido no vetor, são bem conhecidos. As seqüências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, realçadores, operadores, sítios de ligação de ribossoma, sinais de início, sinais de parada, sinais de encapuzamento, sinais de poliadenilação e outros sinais envolvidos com o controle de transcrição ou tradução.
O vetor resultante tendo o polinucleotídeo nele é usado para transformar um hospedeiro apropriado. Esta transformação pode ser realizada usando métodos bem conhecidos na técnica.
Qualquer uma de um grande número de células hospedeiras disponíveis e bem conhecidas pode ser usada na prática desta invenção. A seleção de um hospedeiro particular é dependente de vários fatores reconhecidos pela técnica. Estes incluem, por exemplo, a compatibilidade com o vetor de expressão escolhido, a toxicidade dos peptídeos codificados pela molécula de DNA, taxa de transformação, facilidade de recuperação dos peptídeos, características de expressão, bio-segurança e custos. Um equilíbrio destes fatores deve ser encontrado com o entendimento de que nem todos os hospedeiros podem ser igualmente eficazes para a expressão de uma seqüência de DNA particular. Dentro destas diretrizes gerais, os hospedeiros microbianos úteis incluem bactérias (tais como E. coli), levedura (tais como Saccharomyces) e outras células de fungos, insetos, plantas, mamíferos (incluindo o ser humano) em cultura ou outros hospedeiros conhecidos na técnica.
Em seguida, o hospedeiro transformado é cultivado e purificado. As células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições de fermentação convencionais de modo que os compostos desejados sejam expressados. Tais condições de fermentação são bem conhecidas na técnica. Finalmente, os peptídeos são purificados a partir da cultura pelos métodos bem conhecidos na técnica.
Dependendo da célula hospedeira utilizada para expressar um composto da invenção, grupos de carboidrato (oligossacarídeo) podem ser convenientemente ligados aos sítios que são conhecidos serem sítios de glicosilação em proteínas. No geral, os oligossacarídeos ligados em O são ligados aos resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto que os oligossacarídeos ligados em N são ligados aos resíduos de asparagina (Asn) quando eles são parte da seqüência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. X é preferivelmente um dos 19 aminoácidos que ocorrem naturalmente não contando prolina. As estruturas de oligossacarídeos ligados em N e ligados em O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é habitualmente encontrado em ambas é o ácido N-acetilneuramínico (aludido como ácido siálico). O ácido siálico é usualmente o resíduo terminal dos oligossacarídeos tanto ligados em N quanto ligados em O e, em virtude da sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas ao composto glicosilado. Tal(is) sítio(s) pode(m) ser incorporado(s) no ligador dos compostos desta invenção e são preferivelmente glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos de polipeptídeo (por exemplo, em células de mamífero tais como CHO, BHK, COS). Entretanto, tais sítios podem ser ainda glicosilados pelos procedimentos sintéticos ou semi-sintéticos conhecidos na técnica.
Alternativamente, os compostos podem ser fabricados pelos métodos sintéticos. Por exemplo, as técnicas de síntese de fase sólida podem ser usadas. As técnicas adequadas são bem conhecidas no ramo e incluem aquelas descritas em Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis e Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soe. 85:2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart e Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; Pat. U.S. Ne 3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 105-253; e Erickson et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 257-527. A síntese de fase sólida é a técnica preferida de fabricar peptídeos individuais visto que é o método mais eficaz em custo de fabricar peptídeos pequenos.
Os compostos que contêm peptídeos derivatizados ou que contêm grupos não peptídicos são particularmente passíveis de sintetizar pelas técnicas da química orgânica bem conhecidas. Modificação de WSP
Para a obtenção de um composto covalentemente ligado a um WSP, qualquer método aqui descrito ou de outro modo conhecido na técnica é utilizado. Os métodos para preparar derivados químicos de polipeptídeos ou peptídeos no geral compreenderão as etapas de (a) reagir o peptídeo com a molécula de polímero ativada (tal como um éster reativo ou aldeído derivado da molécula polimérica) sob condições por meio das quais o polipeptídeo torna-se ligado a uma ou mais moléculas poliméricas e (b) obter o(s) produto(s) de reação. As condições de reação ótimas serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e nos resultados desejados. Por exemplo, quanto maior a razão das moléculas de polímero :proteína, maior a porcentagem de moléculas de polímero ligadas.
Uma molécula biologicamente ativa pode ser ligada a um polímero através de qualquer grupo funcional disponível usando métodos padrão bem conhecidos na técnica. Os exemplos de grupos funcionais na molécula polimérica ou biologicamente ativa que podem ser usados para formar tais ligações incluem grupos amina e carbóxi, grupos tiol tais como em resíduos de cisteína, aldeídos e cetonas e grupos hidróxi como podem ser encontrados em resíduos de serina, treonina, tirosina, hidroxiprolina e hidroxilisina.
O polímero pode ser ativado pela ligação de um grupo reativo tal como tricloro-estriazina [Abuchowski, et al., (1977), J. Biol. Chem. 252:3582-3586, aqui incorporada por referência em sua totalidade], carbonilimidazol [Beauchamp, et al., (1983), Anal. Biochem. 131: 25-33, aqui incorporada por referência em sua totalidade] ou succinato de succinimidila [Abuchowski, et al., (1984), Câncer Biochem. Biophys. 7: 175-186, aqui incorporada por referência em sua totalidade] de modo a reagir com uma funcionalidade de amina na molécula biologicamente ativa. Um outro método de ligação envolve a formação de um grupo glioxilila em uma molécula e um grupo aminoóxi, hidrazida ou semicarbazida na outra molécula a ser conjugada [Fields e Dixon, (1968), Biochem. J. 108: 883-887; Gaertner, et al., (1992), Bioconjugate Chem. 3: 262-268; Geoghegan e Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138146; Gaertner, et al., (1994), J. Biol. Chem. 269:7224-7230, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade]. Outros métodos envolvem a formação de um éster ativo em um grupo de álcool livre da primeira molécula a ser conjugada usando cloroformiato ou carbonato de dissuccinimidila, que podem ser depois conjugados a um grupo amina na outra molécula a ser ligada [Veronese, et al., (1985), Biochem. e Biotech. 11: 141-152; Nitecki, et al., Patente U.S. Ns 5.089.261; Nitecki, Patente U.S. Ns 5.281.698, cada uma da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade]. Outros grupos reativos que podem ser ligados por intermédio dos grupos de álcool livres são apresentados em Wright, EP 0539167A2 (aqui incorporada por referência em sua totalidade), que também descreve o uso de imidatos para a ligação por intermédio de grupos de amina livres.
Uma outra química envolve a acilação das aminas primárias de um alvo usando o NHS-éster de metóxi-PEG (O-[(N- succinimidiloxicarbonil)-metil]-0'-metilpolietileno glicol). A acilação com metóxi-PEG-NHS resulta em uma ligação de amida que eliminará a carga da amina primária original. Outros métodos utilizam a oxidação branda de um alvo sob condições selecionadas para alvejar o diol pendente da penúltima unidade de glicosila do ácido siálico para a oxidação a um aldeído. O glicoaldeído resultante foi depois reagido com um metóxi-PEG-hidrazida (O- (Hidrazinocarbonilmetil)-0'metil-polietileno glicol) para formar uma hidrazona semi-estável entre PEG e o alvo. A hidrazona é subseqüentemente reduzida pelo cianoboroidreto de sódio para produzir um conjugado de PEG estável. Ver por exemplo, a Patente U.S. N- 6.586.398 (Kinstler, et ai., 1 de julho de 2003), aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Em aplicações específicas de técnicas para a modificação química, por exemplo, a Patente U.S. N2 4.002.531 (aqui incorporada por referência em sua totalidade) estabelece que a alquilação redutiva foi usada para a ligação de moléculas de polietileno glicol a uma enzima. A Patente U.S. N- 4.179.337 (aqui incorporada por referência em sua totalidade) divulga PEG: conjugados de proteína que envolvem, por exemplo, enzimas e insulina. A Patente U.S. N2 4.904.584 (aqui incorporada por referência em sua totalidade) divulga a modificação do número de resíduos de lisina em proteínas para a ligação de moléculas de polietileno glicol por intermédio de grupos amina reativos. A Patente U.S. N2 5.834.594 (aqui incorporada por referência em sua totalidade) divulga conjugados de PEG:proteína solúveis em água substancialmente não imunogênicos, envolvendo por exemplo, as proteínas IL-2, interferon alfa e IL-Ira. Os métodos de Hakimi et al. envolvem a utilização de ligadores únicos para conectar os vários grupos amino livre na proteína a PEG. As Patentes U.S. N- 5.824.784 e 5.985.265 (cada uma da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade) divulgam métodos que permitem proteínas quimicamente modificadas seletivamente de terminal N e análogos destas, incluindo G-CSF e interferon de consenso. De maneira importante, estas proteínas modificadas têm vantagens com respeito à estabilidade da proteína, assim como fornecendo vantagens de processamento.
A modificação de WSP também é descrita em Francis et al., Em: Stability of protein pharmaceutics: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahern., T. e Manning, M. C.) Plenum, N. Y., 1991 (aqui incorporada por referência em sua totalidade), é usada. Ainda em um outro aspecto, o método descrito em Delgado et al., "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Clhoride, Applications In Immunoaffmity Cell Preparation", Em: Fisher et al., eds., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y., N.Y., 1989 pp. 211-213 (aqui incorporada por referência em sua totalidade), que envolve o uso de cloreto de tresila, que resulta em nenhum grupo de ligação entre a porção WSP e a porção de polipeptídeo. Em outros aspectos, a ligação de um WSP é efetuada através do uso de ésteres de N-hidróxi succinimidila de carboximetil metóxi polietileno glicol, como bem conhecido na técnica.
Para outras descrições de modificação de um alvo com um WSP, ver, por exemplo, o pedido de patente U.S. N- 20030096400; EP 0442724A2; EP 0154316; EP 0401384; WO 94/13322; Patentes U.S. N^5.362.852, 5.089.261, 5.281.698, 6.423.685, 6.635.646, 6.433.135, Pedido Internacional WO 90/07938; Gaertner e Offord, (1996), Bioconjugate Chem.7: 38-44; Greenwald et al., Crit Rev Therap Drug Carrier Syst. 2000; 17: 101-161; Kopecek et al., J Controlled Release., 74: 147-158, 2001; Harris et al., Clin Pharmacokinet. 2001; 40(7): 539-51; Zalipsky et al., Bioconjug Chem.1997;8: 111-118; Nathan et al., Macromolecules. 1992; 25: 4476-4484; Nathan et al., Bioconj Chem. 1993; 4: 5462; e Francis et al., Focus on Growth Factors, 3: 4-10 (1992), as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Alquilação redutiva Em um aspecto, a ligação covalente de um WSP é realizada pelos procedimentos de modificação química pela alquilação redutiva como aqui fornecida para modificar seletivamente o grupo α-amino de terminal N e testando o produto resultante quanto a característica biológica desejada, tal como os ensaios de atividade biológica aqui fornecidos.
A alquilação redutiva para a ligação de um WSP a uma proteína ou peptídeo explora a reatividade diferencial de tipos diferentes de grupos amino primário (por exemplo, lisina versus o terminal N) disponível para a derivatização em uma proteína particular. Sob as condições de reação apropriadas, a derivatização substancialmente seletiva da proteína ao término N com um polímero contendo grupo carbonila é obtida.
Para a alquilação redutiva, o(s) polímero(s) selecionado(s) podem ter um único grupo aldeído reativo. Um aldeído reativo é, por exemplo, propionaldeído de polietileno glicol, que é estável em água ou mono alcóxi C1-C10 ou derivados de arilóxi destes (ver a Patente U.S. N2 5.252.714, aqui incorporada por referência em sua totalidade). Em um método, a alquilação redutiva é utilizada para conjugar um PEG-aldeído (0-(3- oxopropil)-0'-metilpolietileno glicol) a uma amina primária. Sob condições apropriadas, este método foi demonstrado produzir conjugados de PEG predominantemente modificados através da α-amina no término N da proteína.
Uma funcionalidade de aldeído útil para conjugar a molécula biologicamente ativa pode ser gerada a partir de uma funcionalidade tendo grupos amino e álcool adjacentes. Em um polipeptídeo, por exemplo, uma serina, treonina ou hidroxilisina de terminal N pode ser usada para gerar uma funcionalidade de aldeído por intermédio da clivagem oxidativa sob condições brandas usando periodato. Estes resíduos ou seus equivalentes, podem estar normalmente presentes, por exemplo no término N de um polipeptídeo, podem ser expostos por intermédio da digestão química ou enzimática ou podem ser introduzidos por intermédio de métodos recombinantes ou químicos. As condições de reação para gerar o aldeído tipicamente envolve a adição de um excesso molar de meta periodato de sódio e sob condições brandas para evitar a oxidação em outras posições na proteína. O pH é preferivelmente de cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de um excesso molar de 1,5 vezes de meta periodato de sódio, seguida pela incubação por 10 minutos na temperatura ambiente no escuro.
O grupo funcional de aldeído pode ser ligado a um polímero ativado contendo uma funcionalidade hidrazida ou semicarbazida para formar uma ligação de hidrazona ou semicarbazona. Os polímeros contendo hidrazina são comercialmente disponíveis e podem ser sintetizados, se necessário, usando técnicas padrão. As PEG hidrazidas para o uso na invenção podem ser obtidas da Shearwater Polymers, Inc., 2307 Spring Branch Road, Huntsville, Ala. 35801 (agora parte da Nektar Therapeutics, . 150 Industrial Road, San Carlos, CA 94070-6256). O aldeído é ligado ao polímero misturando-se a solução dos dois componentes juntos e aquecendo a cerca de 37° C até que a reação esteja substancialmente completa. Um excesso da hidrazida polimérica é tipicamente usada para aumentar a quantidade de conjugado obtido. Um tempo de reação típico é de 26 horas. Dependendo da estabilidade térmica dos reagentes, a temperatura e o tempo de reação podem ser alterados para fornecer resultados adequados. A determinação detalhada de condições de reação tanto para a oxidação quanto para a ligação é apresentada em Geoghegan e Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138-146 e em Geoghegan, Patente U.S. N- 5.362.852, cada uma da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Usando a alquilação redutiva, o agente de redução deve ser estável em solução aquosa e preferivelmente ser capaz de reduzir apenas a base de Schiff formada no processo inicial de alquilação redutiva. Os agentes redutores são selecionados de e sem limitação, boroidreto de sódio, cianoboroidreto de sódio, borato de dimetilamina, borato de trimetilamina e borato de piridina.
O pH da reação afeta a razão de polímero para proteína a ser usada. No geral, se o pH da reação é mais baixo do que o pKa de um grupo reativo alvo, um excesso grande de polímero para proteína será desejado. Se o pH é mais alto do que o pKa alvo, a razão de polímero:proteína não precisa ser tão grande (isto é, mais grupos reativos estão disponíveis, de modo que menos moléculas de polímero são necessárias).
Conseqüentemente, a reação é realizada em um aspecto em um pH que permite que se tire vantagem das diferenças de pKa entre os grupos ε- amino dos resíduos de lisina e aquele do grupo α-amino do resíduo de terminal N da proteína. Por tal derivatização seletiva, a ligação de um polímero solúvel em água a uma proteína é controlada; a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no término N da proteína e nenhuma modificação significante de outros grupos reativos, tais como os grupos amino da cadeia lateral de lisina, ocorra.
Em um aspecto, portanto, métodos são fornecidos para a ligação covalente de um WSP a um composto alvo e que fornecem uma preparação substancialmente homogênea de conjugado de moléculas WSP/proteína, na ausência de outra purificação extensiva como é requerido usando outras químicas de modificação química. Mais especificamente, se polietileno glicol é usado, os métodos descritos permitem a produção de uma proteína carecendo possivelmente de grupos de ligação antigênica, isto é, a porção de polietileno glicol é diretamente ligada à porção de proteína sem subprodutos potencialmente tóxicos.
Dependendo do método de ligação de WSP escolhido, a proporção de moléculas de WSP ligada ao peptídeo ou molécula de proteína alvos variará, como as suas concentrações na mistura de reação. No geral, a razão ótima (em termos de eficiência de reação em que não existe nenhum excesso de proteína ou polímero não reagidos) é determinada pelo peso molecular do WSP selecionado. Além disso, quando do uso de métodos que envolvam ligação não específica e posteriormente purificação de uma espécie desejada, a razão pode depender do número de grupos reativos (tipicamente grupos amino) disponíveis. Purificação
O método de obtenção de uma preparação modificada por WSP substancialmente homogênea é, em um aspecto, pela purificação de uma espécie predominantemente única de composto modificado de uma mistura de espécie. Por via de exemplo, uma espécie substancialmente homogênea é primeiro separada pela cromatografia de troca iônica para se obter material tendo uma característica de carga de uma espécie única (embora outras espécies tendo a mesma carga aparente possam estar presentes) e depois a espécie desejada é separada usando a cromatografia de exclusão de tamanho. Outros métodos são relatados e considerados pela invenção, incluindo por exemplo, a PCT WO 90/04606, publicada em 3 de maio de 1990, que descreve um processo para o fracionamento de uma mistura de adutos de PEG-proteína que compreendem dividir os adutos de PEG/proteína em um sistema bifásico aquoso contendo PEG. Assim, um aspecto da presente invenção é um método para
preparar um conjugado de composto modificado por WSP compreendido de (a) reagir um composto tendo mais do que um grupo amino com uma porção de polímero solúvel em água sob condições de alquilação redutiva, em um pH adequado para ativar seletivamente o grupo α-amino no terminal amino da porção de proteína de modo que o dito polímero solúvel em água seletivamente se ligue ao dito grupo α-amino; e (b) obter o produto de reação. Opcional e particularmente para um produto terapêutico, os produtos de reação são separados das porções não reagidas.
Como averiguado pelo mapeamento de peptídeo e seqüenciamento de terminal N, uma preparação é fornecida que compreende pelo menos 50 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido. Em outras formas de realização, as preparações são fornecidas compreendendo pelo menos 75 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido; pelo menos 85 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido; pelo menos 90 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido; pelo menos .95 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido; e pelo menos 99 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido.
Os seguintes exemplos não são intencionados a serem limitantes mas apenas exemplares de formas de realização específicas da invenção. Exemplo 1
Montagem de Construção de Expressão de mFc-TMP
Um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de TMP que compreende uma região Fc de murino (mFc-TMP) foi construída combinando-se seqüências de nucleotídeo que codificam individualmente Fc de murino e um TMP (descrito na EPOl 124961A2). Na primeira rodada de PCR, o componente que codifica Fc de murino foi amplificado com iniciadores de PCR 3155-58 (SEQ ID NO: 1022) e 1388-00 (SEQ ID NO:1023).
.3155-58: CCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGA (SEQ ID NO:1024)
.3155-59: CCACCTCCACCTTTACCCGGAGAGTGGGAG (SEQ ID NO:1025)
Em uma reação separada, um polinucleotídeo que codifica TMP foi amplificado com os iniciadores 1209-85 (SEQ ID NO: 1026) e 3155- .59 (SEQ ID NO: 1027).
.1209-85: CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (SEQ ID NO: 1028) .1388-00: CTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID NO: 1029)
Os fragmentos de PCR resultantes foram purificados em gel e combinados em um único tubo para uma segunda rodada de PCR com os iniciadores 1209-85 (SEQ ID NO: 1030) e 1388-00 (SEQ ID NO: 1031). O produto de PCR desta segunda rodada de amplificação foi purificada em gel e digerida com enzimas de restrição NdeI e XhoI. O fragmento de digestão foi purificado e ligado no vetor pAMG21, previamente digerido com as mesmas enzimas. Esta mistura de ligação foi transformada por intermédio da eletroporação na E. coli e plaqueada em meios de LB + Canamicina. As colônias foram triadas por intermédio da PCR e seqüenciamento de DNA. Um clone positivo com uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1032) que codifica a proteína de fusão mFc-TMP (SEQ ID NO: 1033) foi identificada e designada 6397.
O polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão Fc-TMP de murino (SEQ ID NO: 1034) .1 GATTTGATTC TAGATTTGTT TTftACTAATT AAAGGAGGAA TAACAT
RP Aberta
ATGGTCGACGGTTG TAAGCCATGC ATTTGTACAG TCCCAGAAGT ATCATCTGTC
.101 TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAtSGATGTG CTCACCATTA CTCTGACTCC
.151 TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TftGACATCWS CAAGGATGAT CCCGAGGTCC
.201 AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG TGCACACAGC TCAGACGCAA
.251 CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACITTC CGCTCAGTCA GTGAACTTCC
.301 CATÇATGCAC CAGGtACTGGC TCAATGGCAA GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA
.351 ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAACCAAA
.401 GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC ATTCCACCTC CCAAGGAGCA
.451 GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG CATGATAACA GACTTCTTCC
.501 CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC
.551 TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA GATGGCTCTT ACTTCGTCTA
.601 CAGCAAGCTC AATGTGCAGA ASAGCAACTG GGAGGCAGGA AATACTTTCA
.651 CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA ACCACCATAC TGAGAAGAGC
.701 CTCTCCCACT CTCCGGGTAA AGGTGGAOGT GGTGGTATCG AAGGTCCGAC .751 TCTGCGTCAG TÜGCTGGCTG CTCGTGCTGG TGGTGGAGGT GGCGGCGGAG .801 GTATTGAGGG CCCAACCCTT CGÇCAATGGC TTGCAGCACG CGCATAA
Seqüência 3':
TCTCGAGGATCCG CGGAAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAAGCCCG AAAGG
A seqüência de proteína Fc-TMP de murino (SEQ ID NO: 1035) .1 MVDGCKEsClC TVPEVSSVFI FPPKPKBVLf ITI/ÍPKVTCV WDISKDDPE
.51 VQFSSfflFVDDVh EVHTAQTQPR EEQFN5TFRS VSELPIMHQD WLNGKEFKCR
.101 VKSAAFPAPI EKTXSKTiCGR PKAPQVYTIP FPKgQMAKDK VSLTCMIT0F
.15l FPÊDITVEWQ WNGQPAENYX NTQPIMMPUG SYFVYSXLNV QKSNVÍEAGNT
.201 FTCSVMSGL HNHHTEKSLS HSPGKGGCiGG IEGPTLRQWL AARAGGGGGG
.251 GOIEGFnjRQ WIAAHA*
Exemplo 2
Fermentação da Cepa 6397
A fermentação da cepa 6397 foi iniciada pela inoculação de .500 ml de caldo de Luria esterilizado com uma cultura de semente da cepa em um frasco agitado. Quando a densidade de célula atingiu 0,9 a 600 nm, os conteúdos foram usados para inocular um fermentador de 15 L contendo 10 L de meio de crescimento com base no complexo (800 g de glicerol, 500 g de tripticase, 3 g de citrato de sódio, 40 g de KH2PO4, 20 g de (NH4)2SO4, 5 ml de anti-espumante Fluka P-2000, 10 ml de metais traço (cloreto férrico 27,0 g/L, cloreto de zinco 2,00 g/L, cloreto de cobalto 2,00 g/L, molibdato de sódio .2,00 g/L, cloreto de cálcio 1,00 g/L, sulfato cúprico 1,90 g/L, ácido bórico .0,50 g/L, cloreto de manganês 1,60 g/L, citrato de sódio diidratado 73,5 g/L), .10 ml de vitaminas (biotina 0,060 g/L, ácido fólico 0,040 g/L, riboflavina .0,42 g/L, piridoxina HCl 1,40 g/L, niacina 6,10 g/L, ácido pantotênico 5,40 g/L, hidróxido de sódio 5,30 ml/L), adicionar água para levar a 10 L). O fermentador foi mantido a 37° C e pH 7 com os níveis de oxigênio dissolvido mantidos a um mínimo de 30 % de saturação. Quando a densidade de célula atingiu 13,1 unidades OD a 600 nm, a cultura foi induzida pela adição de 10 ml de 0,5 mg/ml de N-(3-oxo-hexanoil) homosserina lactona. Em 6 horas após a indução, o caldo foi esfriado a 10° C e as células foram colhidas pela centrifiigação a 4550g por 60 min a 5o C. A pasta de célula foi depois armazenada a -80° C. Exemplo 3 Redobra da Proteína
A pasta de E. coli (300 g) da cepa 6397 que expressa mFc- TMP foi dissolvida em 2250 ml de tampão de Iise (50 mM de Tris HCl, 5 mM de EDTA, pH 8,0) e passada através de um microfluidizador gelado duas vezes a 13.000 PSI (89,6 MPa). O homogeneizado foi depois centrifugado a .11.300g por 60 minutos a 4o C. O sobrenadante foi descartado e a pelota foi recolocada em suspensão em 2400 ml de água usando um triturador de tecido. O homogeneizado foi depois centrifugado a 11.3OOg por 60 minutos a 4o C. O sobrenandante foi descartado e a pelota foi recolocada em suspensão em 200 ml volumes de água usando um triturador de tecido. O homogeneizado foi centrifugado a 27.200g por 30 minutos a 4o C e o sobrenandante foi descartado. Cerca de 12,5 % da pelota foi recolocada em suspensão em 28 ml de Tris HCl a 20 mM, pH 8,0, com 35 mg de lisozima da clara de ovo de galinha (Sigma, St Louis, MO) usando um triturador de tecido e incubados a .37° C por 20 min. A seguir da incubação, a suspensão foi centrifugada a .27.200g por 30 minutos a 22° Ceo sobrenandante foi descartado. A pelota foi recolocada em suspensão em 35 ml de guanidina HCl a 8 M,50 mM de Tris HCl, pH 8,0, depois que 350 μΐ de DTT a 1 M (Sigma, St Louis, MO) foram adicionados e o material foi incubado a 37° C por 30 minutos. A solução foi depois centrifugada a 27.200g por 30 minutos a 22° C. O sobrenandante foi depois transferido para 3,5 L de tampão de redobra (50 mM de Tris base, 160 mM de arginina HCl, 3 M de uréia, 20 % de glicerol, pH .9,5, 1 mM de cisteína, 1 mM de cistamina HO) a 1 ml/min com agitação suave a 4o C.
Exemplo 4
Purificação da Construção
Depois de cerca de 40 horas de incubação a 4o C com agitação suave, a solução de redobra descrita no Exemplo 3 foi concentrada a 500 μΐ usando um aparelho de ultrafiltração de fluxo tangencial com um cartucho de .30 kDa (Satorius, Goettingen, Alemanha) seguido pela diafiltração contra 3 L de Q-Tampão A (20 mM de Tris HCl, pH 8,0). O material concentrados foi filtrado através de um filtro Whatman GF/A e carregado em uma coluna de fluxo rápido Q-Sepharose de 86 ml (2,6 cm Dl) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a 15 ml/min. Depois de lavar a resina com vários volumes da coluna de Q-Tampão A, a proteína foi eluída usando um gradiente linear de volume da coluna de 20 a 60 % de Q-Tampão B (20 mM de Tris HCl, 1 M de NaCl, pH 8,0) a 10 ml/min. As frações de pico foram reunidas e a reunião foi passada através de um filtro de seringa Mustang E (Pall Corporation, East Hills, NY) a 1 ml/min. O material filtrado foi filtrado uma segunda vez através de um filtro de acetato de celulose a 0,22 μηι e armazenado a -80° C. Exemplo 5
PEGuilação de Proteína
A uma solução esfriada (4o C), agitada de mFc-TMP (3,5 ml,0,8 mg/ml) em um tampão de acetato de sódio a 100 mM, pH 5, contendo 20 mM de NaCNBH3, foi adicionado um excesso molar de 3,8 vezes de metoxipolietileno glicol aldeído (MPEG) (peso molecular médio, 20 kDa) (Nektar). A agitação da mistura de reação foi continuada na mesma temperatura. O grau da modificação de proteína durante o curso da reação foi monitorado pela HPLC SEC usando uma coluna Superose 6 HR 10/30 (Amersham Biosciences) eluída com um tampão de fosfato de 0,05 M com .0,15 M de NaCl, pH 7,0 a 0,4 ml/min. Depois de 16 horas a análise pela HPLC SEC indicou que a maioria da proteína foi conjugada ao MPEG. Neste tempo a mistura de reação foi trocada de tampão em um tampão de Tris 20 mM/HCl, pH 8,12. Os conjugados de MPEG-mFc-AMP2 foram isolados pela cromatografia de troca iônica usando uma coluna Hi Trap HP Q de 1 ml (Amersham Biosciences) equilibrada com um tampão de Tris 20 mM/HCl, pH 8,12. A mistura de reação foi carregada na coluna a uma taxa de fluxo de .0,5 ml/min e o aldeído MPEG não reagido foi eluído com três volumes de coluna do tampão de partida. Um gradiente linear de 20 volumes da coluna de 0 % a 100 % de tampão de Tris 20 mM/HCl, pH 8,12, contendo 0,5 M de NaCl foi usado para eluir os conjugados de proteína-polímero. As frações (2 ml) coletadas durante a separação pela cromatografia de troca iônica foram analisadas pela HPLC SEC como descrito acima. Uma fração contendo os conjugados de mono- e di-MPEG-mFc-TMP em uma razão aproximada de 2,3 para 1 (como determinado pela HPLC SEC) foi concentrada e filtrada estéril. Exemplo 6
Teste In Vivo
Camundongos BDFl (Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts) foram divididos em grupos de 10 e injetados nos dias 0, 21 e 42 subcutaneamente com agente de diluição (PBS de Dulbecco com 0,1 % de albumina sérica bovina) ou agente de diluição com 50 μg de proteína conjugada mono- e di-MPEG-mFc-TMP de teste (como descrito acima) por kg de animal. Cada grupo foi dividido na metade e sangrado (140 μl) a partir do sino retro-orbital em pontos de tempo alternados (dias 0, 3, 5,7, 10, 12, 14, 19, 24, 26, 28, 31, 33, 40, 45, 47, 49, 52 e 59). No dia 59, os camundongos foram anestesiados com isoflurano antes da sangria. O sangue coletado foi analisado quanto a uma contagem completa e diferencial usando um analisador de sangue automatizado ADVIA 120 com software de murino (Bayer Diagnostics, Nova Iorque, ΝΎ). Exemplo 7
Fc-TMP Humano Liofilizado
Estudos de Triagem de Formulação Liofilizada Inicial
O pepticorpo Fc-TMP humano aqui descrito no Exemplo 7 corresponde a uma forma dimérica da SEQ ID NO: 1017, em que o Fc humano é a SEQ ID NO: 1, tendo uma metionina iniciadora no término N. A estabilidade de Fc-TMP foi avaliada por diversas técnicas cromatográficas: HPLC de Fase Reversa, HPLC de Troca Iônica, HPLC de Exclusão de Tamanho e SDS-PAGE, todas as quais indicaram estabilidade em temperatura elevada. As formulações variando em concentração de 0,1 a 40 mg/ml foram examinadas tanto quanto à degradação química quanto à física na temperatura acelerada, refrigerada e congelada. A estabilidade de Fc- TMP foi avaliada com respeito ao pH variável e a inclusão de manitol ou glicina como agentes formadores de torta e sacarose como um lioprotetor. Manitol e sacarose foram eventualmente escolhidos para otimização adicional depois que o outro candidato (glicina) não apresentou nenhuma melhora na estabilidade da proteína. Tween-20 (polissorbato-20) também foi mostrado inibir a agregação na liofilização em uma faixa de concentração de 0,002 a0,1 %. Os seguintes tampões foram examinados em estudos de triagem em uma faixa de pH de 4 a 8: glicina, succinato, histidina, fosfato e Tris. A partir destes estudos de triagem, Fc-TMP formulado em tampão de histidina no pH 5 com uma quantidade pequena de Tween-20 (0,004 %) adicionado foi mostrado ser mais ideal para a estabilidade. A Validação da Sacarose e Tween-20 na formulação de Fc-TMP
Os esforços de desenvolvimento subseqüentes foram focalizados na validação do nível de sacarose, manitol e Tween-20 na formulação a uma concentração de proteína de aproximadamente 0,5 mg/ml (para acomodar as exigências de dosagem previstas na clínica). O efeito de sacarose, manitol e Tween-20 na otimização da estabilidade foi demonstrado nestes estudos. Seguimento dos estudos também foram iniciados com o propósito de prever problemas e preocupações de fabricação.
A Sacarose é Benéfica em Minimizar a Degradação Química em Temperatura Elevada
O efeito de variar as concentrações de sacarose e manitol na estabilidade de Fc-TMP foi testado. A proteína foi formulada a 0,3 e 2 mg/ml de modo a agrupar a faixa de concentração prevista na clínica. Além disso, amostras foram preparadas com e sem 0,004 % de Tween-20. A razão de sacarose:manitol foi mudada variando-se a quantidade de sacarose e ajustando-se o nível de manitol em cada concentração de sacarose para manter a isotonicidade. As seguintes razões de sacarose:manitol foram examinadas (expressadas como porcentagem em peso por volume): 0,2:5,1;0,5:4,8; 1:4,5; 1,5:4,3 e 2:4.
Razões mais altas de sacarose:manitol são mostradas minimizar a degradação química quando monitoradas pela HPLC de Troca de Cátion e Fase-Reversa. Como é mostrado na Tabela 39, a porcentagem de pico inicial é comparada inicialmente e depois da armazenagem em temperatura elevada de Fc-TMP por 18 semanas a 37° C. A perda maior de pico principal na troca de cátion ocorre na formulação líquida (Fc-TMP formulado em 10 mM de acetato, 5 % de sorbitol no pH 5), seguido pelas formulações liofilizadas com 0,2, 0,5 e 1,0 % de sacarose, respectivamente. O efeito protetor da sacarose na minimização da degradação químico também foi observado pela análise pela HPLC de Fase Reversa de amostras depois da armazenagem em temperatura elevada (Tabela 39). A porcentagem de pico inicial (determinada a partir da análise de HPLC de fase reversa de Fc-TMP) cai significantemente nos níveis de sacarose baixos, mas não parecem mudar significativamente nas formulações com concentrações de sacarose de mais do que 1 %. Interpretados juntos, estes resultados indicam que manter os níveis de sacarose a 1,5 % ou mais altos é crítico para a estabilidade de Fc- TMP na liofilização. Tabela 39
Fc-TMP em 10 mM de Histidina1 tamponado no pH 5 com Tween-20
Perda do Pico Principal de RP e CEX-HPLC Depois de 18 Semanas a 37° C
RP-HPLC CEX-HPLC
Formulação Tempo Zero 18 semanas Tempo Zero 18 semanas
0,2 % de Sacarose, 5,1 % de Manitol 78,6 72,2 79,8 62,6
0,5 % de Sacarose, 4,8 % de Manitol 77,3 73,1 78,9 71,6
1 % de Sacarose, 4,5 % de Manitol 78,4 78,0 80,5 73,9 <table>table see original document page 175</column></row><table>
Ao passo que Fc-TMP no controle líquido (a formulação de 10 mM de acetato, 5 % de sorbitol, pH 5) tem crescimento significante na área do pico pré- e pós-principal, a proteína mostra mais degradação na região de pico pós-principal na análise de amostras liofilizadas com quantidades mais baixas de sacarose. Trabalho anterior com amostras de estabilidade líquida (depois da armazenagem em temperatura elevada) tem mostrado que a desamidação surge de glutamina e arginina na proteína, o que contribui para o crescimento na região de pré-pico em amostras líquidas.
Em temperatura refrigerada, a degradação química não é observada pela troca de cátion e HPLC de fase reversa na formulação liofilizada depois da armazenagem de longa duração. Por exemplo, cromatogramas de troca de cátion não mostram mudanças evidentes sob temperaturas variadas (-80° C, 4o C e temperatura ambiente controlada por 6 meses). Devido à falta de degradação químico na formulação liofilizada com o tempo em temperatura ambiente controlada e mais baixa, muito do trabalho de desenvolvimento de formulação centralizou na minimização da agregação física associada com a secagem por congelamento. Tween-20 Minimiza a Agregação Induzida pela Liofilização
A inclusão de Tween-20 em uma concentração baixa (0,004 %) é necessária para minimizar uma quantidade pequena de agregação que é evidente a seguir da liofilização. Isto pode ser demonstrado examinando-se os resultados relevantes de diversos estudos de estabilidade em que as amostras são avaliadas quanto a estabilidade com e sem a adição de Tween-20.
Uma concentração de proteína mais alta de Fc-TMP foi primeiro usada para explorar uma ampla faixa de Tween-20 de modo a investigar a quantidade necessária para minimizar a agregação. A concentração de Fc-TMP neste estudo foi de 20 mg/ml, com os níveis de Tween-20 ajustados em 0,002, 0,004, 0,006 e 0,01 %. Depois da armazenagem por um ano a 4o C, a agregação é limitada a < 0,1 % em todas as formulações com Tween-20. Resultados de seis meses também não apresentaram nenhuma agregação significativa. Tween-20 a 0,004 % foi escolhido para consideração adicionais nos estudos de formulação, como aqui debatido, designado para Fc-TMP a 0,5 mg/ml.
A Tabela 40 mostra a quantidade de agregação em Fc-TMP monitorado em tempo zero, 3 e 11 meses depois de armazenagem a 4o C. Neste estudo, Fc-TMP foi liofilizado a 0,5 mg/ml na formulação anteriormente mencionada e nas formulações com razões de sacarose:manitol variáveis sem Tween-20 adicionado. Além disso, a estabilidade foi seguida na formulação corrente sem Tween-20 e tamponada no pH 4,5, 5 e 5,5. Os resultados mostram que apenas a formulação anteriormente mencionada teve agregação mínima no pH 5. Nas formulações sem Tween-20, a agregação varia de 0,5 % até em torno de 5 %. A agregação também é mais alta no pH 4,5 e 5,5 comparada com aquela detectada no pH 5. Razões de sacarose:manitol mais baixas (formulações a 0,2, 0,5 e 1 % de sacarose) têm agregação mais alta, quando os níveis estão tipicamente em torno de 5 %. Com o tempo, o nível de agregação permanece compatível na formulação anteriormente mencionada e na formulação sem Tween-20 dentro do ponto de tempo de 1 ano. Tabela 40
<table>table see original document page 176</column></row><table> 1 As amostras de formulação otimizadas foram selecionadas para avaliação no ponto de tempo de 11 meses. Estudos de formulação adicionais foram planejados para confirmar o efeito benéfico de Tween-20 na minimização da agregação. Todas as amostras nestes estudos foram formulados no pH 5 com e sem0,004% de Tween-20. A Tabela 41 lista a agregação percentual depois da armazenagem a 4°C para os intervalos de tempo de zero, 18 semanas e 1 ano na estabilidade. No tempo zero, imediatamente a seguir da liofilização, a agregação é minimizada em todas as amostras com 0,004% de Tween-20. Quantidades pequenas de agregação são observadas nas amostras sem Tween-20, com a quantidade mais alta encontrada na formulação com 0,2% de sacarose. A eficácia de Tween-20 na minimização da agregação também estende-se ao ponto de tempo de 18 semanas, com percentual mais alto de agregação encontrado em amostras que carecem de Tween-20 e nas razões de sacarose:manitol baixas. Depois da armazenagem por um ano a 4°C, a agregação é também compativelmente baixa nas amostras contendo Tween- 20.
Tabela 41
Fc -TMP em 10 mM de Histi dina, formulações variadas, 0,3 mg/ml pH 5 Agregação Percentual Medida pela SEC-HPLC depois da Armazenagem a4°C
1 Ano1
<0,1
<0,1 <0,1
<0.1
Formulação Tempo Zero 4 Meses 2% de Sacarose, 4% de Manitol <0,1 0,2 (com 0,004% de Tween-20) 2% de Sacarose, 4% de Manitol 0,2 0,2 0,2% de Sacarose, 5,1% de Manitol <0,1 <0,1 (com 0,004% de Tween-20) 0,2% de Sacarose, 5,1% de Manitol 1,1 1,3 0,5% de Sacarose, 4,8% de Manitol <0,1 0,2 (com 0,004% de Tween-20) 0,5% de Sacarose, 4,8% de Manitol 0,2 0,8 1% de Sacarose, 4,5% de Manitol <0,1 <0,1 (com 0,004% de Tween-20) 1% de Sacarose, 4,5% de Manitol 0,1 0,3 1,5% de Sacarose, 4,8% de Manitol <0,1 <0,1 (com 0,004% de Tween-20) 1,5% de Sacarose, 4,8% de Manitol 1 As amostras com Tween-20 foram 0,1 0,3 selecionadas para a avaliação
<0,1
ano. Um outro estudo de estabilidade, planejado para testar a eficácia de antioxidantes na minimização da degradação química, reforçou o efeito protetor de Tween-20. Os antioxidantes não têm um impacto na minimização da degradação química da armazenagem em temperatura elevada. Entretanto, a formulação anteriormente mencionada, com 0,004% de Tween-20 e em uma concentração de Fc-TMP de 0,2 mg/ml, tiveram < 0,1% de agregação no tempo zero e 0,1% depois de 5 meses de armazenagem a 4°C. A mesma formulação sem Tween-20 teve 0,4% de agregação no tempo zero e 1% de agregação depois da armazenagem por 5 meses.
Os resultados do estudo de estabilidade apresentados nas Tabelas II, III e os estudos anteriormente mencionados ilustram o efeito protetor de Tween-20 na minimização da agregação na liofilização. O crescimento de agregação com o tempo é mínima, quando os pontos de tempo se estendem a 1 ano a 4°C não apresentam nenhum aumento significativo na agregação em amostras formuladas com 0,004% de Tween-20. Com base nestes resultados do estudo de estabilidade que mostram que a adição de Tween-20 minimiza a agregação na liofilização, o trabalho escalonado foi iniciado com a formulação recomendada. Estudos de Aumento em Proporção Agregação é Dependente da Concentração
Um estudo de aumento em proporção inicial foi planejado para simular as condições de fabricação e examinar a robustez da formulação com respeito ao estresse de envio e estabilidade na reconstituição. Fc-TMP foi trocado de tampão no tampão de formulação usando um dispositivo de filtração em fluxo tangencial, similar aos processos em escala maior. A proteína foi subseqüentemente diluída nas concentrações de 0,5 e 0,1 mg/ml com Tween-20 também adicionado antes da etapa de filtração final. Depois que as amostras foram enchidas, a liofilização foi realizada. Um processo de liofüização exemplar é apresentado abaixo: <table>table see original document page 179</column></row><table> Temperatura Secundária 28 C
A armazenagem passiva a 4°C resultou em mais agregação na concentração de Fc-TMP baixa (0,1 mg/ml). No tempo zero, a agregação foi determinada pela SEC-HPLC ser de 0,4% na formulação de 0,1 mg/ml, ao passo que 0,1% de agregação foi detectado nas proteínas formuladas a 0,5 mg/ml. Depois de seis meses de armazenagem na temperatura refrigerada, a agregação permaneceu nos mesmos níveis como observados para as amostras em tempo zero para ambas as concentrações de Fc-TMP, de acordo com os resultados dos estudos de estabilidade anterior. Devido à quantidade mais alta de agregação observada na concentração mais baixa (0,1 mg/ml) foi decidido que 0,5 mg/ml seria melhor adaptado como a concentração de escolha para o trabalho de aumento em proporção adicional. A Agregação Não Aumenta No Estresse de Cisalhamento Simulado
As amostras liofilizadas (não reconstituídas) do estudo de aumento em proporção inicial também foram submetidas ao transporte por terra e por ar simulados com a ajuda de equipamento de simulação de estresse. Em resumo, o protocolo como esboçado na ASTM (American Society of Testing Methods), Método # D-4728, foi seguido. O transporte por terra e ar simulado foi realizado usando uma Mesa de Vibração Eletrodinâmica, Modelo S202 e um Amplificador de Energia, Modelo # TA240 (Unholtz-Dickie Corporation, Wallingford, CT). A seguir do estresse de transporte, o aspecto físico das tortas liofilizadas foi comparado com controles passivos, com o resultado de que nenhuma mudança morfológica da torta foi óbvia. A estabilidade tanto química quanto física foi aceitável, com agregação compatível nas amostras estressadas e controles passivos (<0,1% nas amostras de 0,5 mg/ml comparadas com 0,4% nas amostras de 0,1 mg/ml).
A estabilidade na reconstituição foi examinada neste estudo preparando-se amostras recém reconstituídas e incubando por 3, 7 e 14 dias passivamente, com balançar lento ou agitação vigorosa. A Tabela 42 mostra os resultados para as formulações de 0,1 e 0,5 mg/ml. Como é esperado, a quantidade de agregação é minimizada nas formulações a 0,5 mg/ml. Comparado com o balançar lento com o tempo vs. as amostras não balançadas, nenhum aumento significativo na agregação é evidente durante o período de 14 dias. A quantidade de dimerização nestas formulações (Não Balançadas e Balançadas) também é compatível. De maneira interessante, os resultados de agitação parecem demonstrar uma tendência; isto é, a agregação cai a menos do que os níveis detectáveis depois do tempo zero tanto nas amostras de 0,1 quanto nas de 0,5 mg/ml. Entretanto, existe um aumento correspondente na quantidade de dimerização observada na maioria das amostras agitadas em cada ponto de tempo, sugerindo que existe alguma reversibilidade em ir do estado de agregado para o de dímero no Fc-TMP estressado pelo cisalhamento. Tabela 42
<table>table see original document page 181</column></row><table>
A Secagem Secundária por 12 Horas no Ciclo de Liofílizacão é Suficiente para Minimizar a Umidade Residual
Um segundo estudo de aumento em proporção foi realizado em que Fc-TMP foi trocado de tampão e diluído a 0,5 mg/ml na formulação recomendada. A liofilização foi obtida com um ciclo consistindo de uma etapa de congelamento inicial a -50°C, seguida por recozimento a -13°C. A temperatura foi depois reduzida para -50°C, mantida por uma hora e a secagem primária iniciada a -50°C com um ponto de fixação do vácuo de 100 mTorr. A seguir de um breve período de contenção a -50 C, a temperatura foi reduzida para -25°C em um período de duas horas, mantida a -25°C por 20 horas e depois gradualmente elevada para 250C depois em torno de 27 horas para o começo da secagem secundária. A secagem secundária foi continuada por um mínimo de 12 horas a 25°C. Durante o ciclo de liofilização, as amostras foram puxadas depois de 12, 18 e 24 horas de secagem secundária de modo a checar a estabilidade e comparar o nível de umidade residual. Os resultados mostram que a umidade residual, como medida pela titulação de Karl Fisher, está em torno de 0,6% ou menos (Tabela 43) em todas as amostras examinadas. A umidade é similarmente baixa nas tortas de placebo de tampão. Com base neste trabalho, o tempo de secagem secundária do ciclo de liofilização pode ser encurtado para uma faixa entre 12 a 18 horas. Tabela 43
Umidade Residual em Fc -TMP Tempos de Secagem Secundária Mantida a 12. 18 e 24 Horas
Tempo de Secagem Secundária Umidade Percentual por Karl Fisher .12 horas 0,23
.12 horas 0,38
Placebo de Tampão 0,43
.18 horas 0,63
.18 horas 0,28
Placebo de Tampão 0,3
.24 horas 0,46
.24 horas 0,37
Placebo de Tampão 0,31
Os resultados de estabilidade também são comparáveis em relação a esta faixa de faixa tempo de secagem secundária, visto que as amostras não têm diferenças com respeito à estabilidade química ou física. Por exemplo, a quantidade de agregação é <0,1% para todas as amostras examinadas, enquanto que a porcentagem de dímero está compativelmente a .0,1%. Estes resultados confirmam que o tempo de secagem secundária pode ser encurtado a menos do que 24 horas sem afetar a estabilidade inicial da proteína.
Trabalho adicional foi realizado para avaliar a robustez da formulação com respeito às concentrações de excipiente variáveis. Visto que o trabalho de estabilidade anterior mostrou que a sacarose, por exemplo, pode ter um impacto sobre a estabilidade, foi necessário examinar a robustez de Fc- TMP nas mudanças menores nos níveis de excipiente. Estudo Estatístico de Fc-TMP Robustez da Formulação
Um estudo estatístico inicial foi planejado para examinar mudanças menores nas variáveis da formulação tais como o pH da formulação, concentração de tampão de histidina e a razão de sacarose:manitol, usando um pacote de software E-chip. Estas amostras foram liofilizadas mas um ciclo de secagem por congelamento não ótimo foi usado que resultou em agregação mais alta do que tipicamente observada. O estudo foi um estudo de triagem, assumindo uma superfície de resposta linear. Os resultados da avaliação de estabilidade mostrou que o pH (4,7 a 5,3) e a concentração de tampão de histidina, (variada de 5 a 15 mM), tiveram pouco impacto sobre a estabilidade de Fc-TMP. De modo a verificar a contribuição de Tween-20 e da razão de sacarose:manitol na estabilidade global de Fc- TMP, um estudo de planejamento estatístico de acompanhamento foi iniciado usando o ciclo de liofilização mais ideal. Estudo da Estabilidade Estatística Ouadrática
O segundo estudo de planejamento estatístico examinou variações em Tween-20 (0,001%, 0,0045% e 0,008%), na razão de sacarose:manitol (1,7:4,2, 2:4 e 2,3:3,8) e variações na concentração de proteína (0,3, 0,65 e 1 mg/ml). O pH das formulações foi também ajustado a 4,7, 5 e 5,3 e a concentração do tampão de histidina variou de 7, 10 e 13 mM. As amostras foram preparadas e liofilizadas usando um liofilizador Virtis (SP Industries, Inc., Gardiner, NY), com um ciclo conservativo otimizado usado para os estudos de estabilidade anteriores. Os resultados de estabilidade foram interpretados usando E-chip (pacote de software de planejamento estatístico, Hockessin, DE) em duas maneiras: uma avaliação do impacto das variáveis da formulação sobre a quantidade de agregação e dimerização observada no tempo zero e o efeito das variáveis da formulação em afetar a estabilidade de armazenagem em temperatura elevada (37°C) como medida pelas taxas de mudança de tempo zero. Resultados de Formulação em Tempo Zero de Estudo Estatístico Quadrático Os resultados da avaliação em tempo zero mostrou que, como esperado, Tween-20 minimiza a agregação, entretanto a concentração de proteína também foi significante em reduzir a tendência para agregar na secagem por congelamento. O programa de software E-chip avalia os efeitos que diferentes variáveis que entram (as condições de formulação) têm sobre a agregação e dimerização de Fc-TMP durante a secagem por congelamento. Com respeito à dimerização de Fc-TMP no tempo zero, nenhum excipiente da formulação foi considerado (com base nos resultados de E-chip) ter um efeito significante. Diversas variáveis de formulação impactaram a quantidade de agregação observada na secagem por congelamento de Fc-TMP. Com base nos resultados resumidos fornecidos por E-chip, a concentração de Fc-TMP teve o maior efeito sobre o grau de agregação observada no tempo zero, seguido pelo nível de Tween-20. A agregação é observada ser a mais alta, no tempo zero, nas amostras de concentração baixa. Do mesmo modo, quantidades mais altas de Tween-20 têm mais de um efeito protetor na minimização da agregação em tempo zero, embora esta tendência não seja tão significativa como o efeito de concentração de proteína. Quantidades mais altas de agregação foram observadas neste estudo comparada com resultados de estudo anterior e em torno de 0,5% de agregação foi observada em algumas amostras nas concentrações de proteína mais baixas com Tween-20.
Foi observado que a variabilidade na agregação cai conforme a concentração de proteína aumenta. Em 0,5 mg/ml e concentrações mais altas, Fc-TMP tem agregação mais baixa média do que em amostras formuladas em ou abaixo de 0,3 mg/ml.
Tween-20 a 0,004% é eficaz em Minimizar a Agregação na Armazenagem em Temperatura Elevada
O estudo de planejamento estatístico também foi usado para avaliar mudanças na armazenagem em temperatura elevada. As taxas de agregação foram comparadas nas condições de formulação variada depois de .16 dias a 37°C subtraindo-se os resultados de temperatura elevada dos resultados iniciais (tempo zero) e normalizando para o tempo de um mês. As taxas que são negativas assim se referem a uma perda aparente da propriedade medida com o tempo. As vaiáveis de resposta (correspondendo aos resultados dos ensaios) foram determinados através da RP-HPLC (pureza de pico principal percentual e porcentagem pré-pico), HPLC de troca de cátion (pureza de pico principal percentual), HPLC de exclusão de tamanho (agregação e formação de dímero) e NIR-água (umidade residual pela espectroscopia de infra vermelho, que foi correlacionada com os resultados da Titulação de Karl Fisher em algumas amostras para verificar a precisão).
Os resultados de uma comparação das taxas de mudança obtidas de cada técnica de ensaio mostra que as mudanças na agregação e oxidação pela RP-HPLC foram estatisticamente significantes com respeito à concentração de Fc-TMP e concentração elevada ao quadrado de Tween-20, dentro de dois desvios padrão. O termo quadrado de Tween-20 mais provavelmente surge da natureza quadrática do estudo que assume uma superfície de resposta de curva. Neste caso, o termo Tween-20 elevado ao quadrado ajusta-se ao melhor modelo, além de possivelmente sugerir que exista um efeito interativo consigo mesmo que afeta a estabilidade. As outras respostas medidas, tais como a pureza de pico principal da HPLC ou as condições de pH variadas, por exemplo, não exibiram nenhuma resposta significante que afetasse a estabilidade da proteína.
Como é o caso com o estudo de aumento em proporção inicial anteriormente debatido (amostras balançadas, não balançadas e amostras agitadas), a quantidade de agregação é mais baixa depois armazenagem em temperatura alta. A taxa de mudança nestas amostras foi usada para fazer prognósticos com base no modelo estatístico (estudo quadrático) para prever o efeito protetor de Tween-20. A Tabela 44 mostra prognósticos quanto a quantidade de agregação esperada, com base no modelo de planejamento estatístico, conforme a concentração de Tween-20 é elevada de 0 a 0,008%. Como é mostrado, a taxa de agregação, normalizada a um mês a 37°C, é negativa (indicando a perda de agregado nestas condições) com a exceção de .0% de Tween-20, caso este em que a agregação seria prognosticada crescer. A taxa de perda de agregado parece atingir o platô nas concentrações de Tween- .20 de 0,002% e mais altas, sugerindo que o Tween-20 em níveis baixos (0,002-0,006%) é suficiente na minimização da degradação física. A taxa de crescimento de dímero é correspondentemente similar sob estas condições e não foi estatisticamente correlacionada com qualquer um dos excipientes de formulação, como anteriormente mencionado. Tabela 44
Prognósticos de Modelo Quadrático Estatístico
Concentração de Tween-20 e Fc-TMP Variadas com base em 16 Dias de Incubação a 37°C (normalizado para um mês)
% de Fc-TMP % de Limites de % de oxidação Limites de Tween-20 (mg/ml) Agregação SEC prognósticos pela RP-HPLC prognósticos 0 0,5 0,09 (-0,32, 0,50) 0,47 (-2,59, 1,65) 0,002 0,5 -0,35 (-0,69, -0,0) -0,68 (-2,44, 1,08) 0,004 0,5 -0,53 (-0,87, -0,19) -0,58 (-2,32, 1,17) 0,006 0,5 -0,45 (-0,78, -0,12) -0,17 (-1,86, 1,52) 0,008 0,5 -0,12 (-0,46, 0,21) 0,54 (-1,18, 2,26) 0,004 0,3 -0,59 (-0,94, -0,25) 0,58 (-1,18, 2,34) 0,004 0,1 -0,63 (-1,10, -0,16) 2,69 (0,28, 5,09)
A taxa de mudança na oxidação medida pela RP-HPLC a 0,5 mg/ml, assumindo que isto corresponde às mudanças na região de pré-pico de cada cromatograma, não é estatisticamente significante com respeito ao termo elevado ao quadrado de Tween-20. Neste caso, o modelo (como mostrado na Tabela 44) prognostica que conforme a concentração de Tween-20 é variada a taxa de oxidação é compatível com os limites dos intervalos de prognóstico. A concentração de proteína afeta a oxidação, conforme a taxa de crescimento aumenta de 0,58 a 2,69 conforme a concentração de proteína cai de 0,3 a 0,1 mg/ml (enquanto se mantém o Tween-20 constante a 0,004%).
Estes resultados sugerem que manter a concentração de Tween-20 entre 0,002 a 0,006% é desejável de um ponto de vista de estabilidade. A quantidade de proteína é também importante, visto que a estabilidade é pior nas concentrações abaixo de 0,5 mg/ml. Estabilidade em Temperatura Refrigerada
Considerando o acima, a seguinte formulação foi usada para avaliar a estabilidade em temperatura refrigerada de Fc-TMP liofilizado: 0,5 mg/ml de Fc-TMP em 10 mM de Histidina tamponada no pH 5, 2% de Sacarose, 4% de Manitol e 0,004% de Tween-20.
A formulação foi monitorada quanto a estabilidade em temperatura refrigerada por um período de um ano. A Tabela 45 mostra os resultados de estabilidade deste estudo, com resultados de tempo zero, 3 meses e 1 ano listados. Como é mostrado, a pureza de pico principal percentual, como medida pela HPLC de Fase Reversa e Troca de Cátion, não parece diminuir com tempo. As diferenças menores na pureza de pico principal com o tempo são típicas da variação normal na resolução das colunas cromatográficas e também são observadas no padrão congelado. A agregação percentual é compatível e não parece crescer depois de um ano. Tabela 45
Pico Principal Percentual na HPLC de Fase Reversa Ponto no Tempo
Concentração 0 3 meses 1 Ano
.0,3 81,0 82,5 82,4
.0,5 69,0 82,7 83,4
.1,0 80,6 82,4 83,2
Material de Partida 82,4 84,0 84,5 Congelado
Pico Principal Percentual na HPLC de Troca de Cátion Ponto no Tempo
Concentração 0 3 meses 1 Ano
.0,3 67,0 71,8 81,8
.0,5 73,5 83,1 80,0
.1,0 74,2 79,7 80,5
MaterialdePartida 75,3 77,0 83,6 Congelado
Agregação Percentual na HPLC de Exclusão de Tamanho
Ponto no Tempo
Concentração 0 3 meses 1 Ano
.0,3 <0,1 0,1 0,1
.0,5 <0,1 <0,1 0,1
.1,0 <0,1 <0,1 <0,1
MaterialdePartidaCongelado 0,1 0,1 <0,1 Fc-TMP é formulado em 10 mM de Histidina, tamponado no pH 5,0 com 2% de sacarose, 4% de manitol e 0,004% de Tween-20. Foi mostrado que o pH 5 é mais ideal para a estabilidade e que a razão de sacarose rmanitol é crítica na minimização da degradação química na armazenagem em temperatura elevada para este sistema de proteína. Tween- 20 é necessário em uma concentração baixa de modo a minimizar a quantidade de agregação que ocorre como um resultado do processo de liofilização. Os estudos de estabilidade para aplicações de aumento em proporção sustentam estas conclusões. Os estudos estatísticos também foram planejados que validam o nível de cada excipiente na formulação, incluindo a necessidade quanto a concentração de proteína estar a 0,5 mg/ml. A estabilidade em temperatura refrigerada da formulação recomendada não mostra degradação significativa depois da armazenagem por um ano a 4°C. Exemplo 8
Peptídeo de Ligação de Fc-Ang-2 Liofilizado
De modo a determinar a formulação ótima para peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 liofilizado, as análises foram realizadas que avaliaram a agregação e estabilidade do peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 em vários valores de pH, as concentrações excipientes e concentrações de proteína.
O peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 consiste de duas moléculas de polipeptídeo farmaceuticamente ativo ligadas ao término C da porção Fc de uma molécula de anticorpo de IgGl. A molécula é compreendida de 574 resíduos de aminoácido com um peso molecular total de 63.511 Daltons. O pi da molécula é de 5,45. Existem duas ligações de dissulfeto em cada um dos polipeptídeos ativos. Existe um total de 20 resíduos de cisteína por toda a molécula, a maior parte dos quais são oxidados em pontes de dissulfeto. A seqüência de peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 é como segue: MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEV1TNAKTKPREEQ YNSTYR VVS VLTVLHQD WLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGA QQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPW TCEHMLE (SEQ ID NO: 2)
A porção Fc da IgGl termina em K228. G229-G233 compõem uma seqüência ligadora. O polipeptídeo ativo começa em A234 e estende-se ao resto da seqüência.
Triagem de pH do Peptídeo de Ligação de Fc-Ang-2 Liofílizado
A triagem de pH testou a estabilidade de um peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 no pH 4,0, 7,0 e 8,0. No pH 4,0, os tampões triados incluíram ácido glutâmico, citrato de sódio e succinato de sódio, cada um em uma concentração de 10 mM. No pH 7,0, os tampões triados foram histidina e tris, ambos a 10 mM de concentração. Hisitidina e Tris foram também triados no pH 8,0, cada um a 10 mM. Cada um dos tampões contiveram 4% de manitol como um agente de formação de torta por liofilização e 2% de sacarose como um excipiente. Além disso, o tampão de histidina no pH 7,0 foi examinado com e sem a presença de um tensoativo, 0,01% de Tween 20 (p/p). A proteína foi diluída a 5 mg/ml com cada um dos tampões de formulação. Esta solução foi depois dialisada em cada um dos tampões da formulação usando tubo de diálise com um limite de exclusão de peso molecular de 10.000 Da, onde um total de 6 trocas foi realizada com um mínimo de 4 horas de equilíbrio entre as trocas. Depois da diálise, a proteína foi aliquotada em frascos de vidro de 3 cc com um volume de enchimento de .1 ml. Estes frascos foram depois liofilizados usando um instrumento de secagem por congelamento em escala de laboratório. Depois da liofilização, os frascos foram selados e armazenados para a incubação a 4°C, 29°C e 37°C, onde os frascos individuais foram rompidos e analisados em vários pontos de tempo, começando imediatamente depois da liofilização e estendendo-se a um período de 24 meses. As amostras foram reconstituídas com o volume apropriado de água e analisado quanto a estabilidade da proteína usando a cromatografia líquida de exclusão de tamanho e eletroforese em gel (que detecta a agregação, dimerização e clivagem proteolítica), cromatografia líquida de troca aniônica (que detecta a oxidação). Além disso, as propriedades da torta tais como tempos de reconstituição e umidade e propriedades da solução líquida reconstituídas foram analisadas (tais como PH).
Estudo de Excipiente de Peptídeo de Ligação de Fc-Ang-2 Liofilizado
A triagem de excipiente foi realizada em um único tampão, 10 mM de histidina no pH 7,0. Os dois excipientes comparados neste estudo foram 0,85% de arginina e 1% de sacarose. O agente de formação de torta usado com a arginina foi 4% de manitol e o agente de formação de torta usado com a sacarose foi 2% de glicina. Cada uma das formulações foi testada nas concentrações de proteína de 1 mg/ml, 30 mg/ml e 60 mg/ml. Além disso, uma formulação contendo uma combinação de manitol sacarose foi testada a .30 mg/ml. Cada uma das formulações conteve 0,01% de Tween 20. A proteína foi primeiro concentrada a 70 mg/ml e dialisada na formulação apropriada usando um dispositivo de ultrafiltração/diafiltração em escala de laboratório. A proteína foi depois diluído a cada uma das três concentrações com o tampão de formulação apropriado. A proteína foi depois aliquotada em frascos de vidro de 3 cc com um volume de enchimento de 1 ml. Os frascos foram depois liofilizados usando um instrumento de secagem por congelamento de escala de laboratório. Depois da liofilização, os frascos foram selados e armazenados para incubação a 4°C, 29°C, 37°C e 52°C, onde os frascos individuais foram rompidos e analisados em vários pontos no tempo, começando imediatamente depois da liofilização e estendendo-se a um período de 24 meses. As amostras foram analisadas quanto a estabilidade da proteína usando a cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca aniônica e SDS-PAGE. As propriedades da torta liofilizada e soluções líquidas reconstituídas também foram analisadas.
Triagem da Concentração de Peptídeo de Ligação de Fc-Ang-2 Liofilizado
A triagem de concentração foi realizada em histidina a 10 mM no pH 7,2, com 4% de manitol como o agente formador de torta e 2% de sacarose como um excipiente. A proteína foi concentrada a aproximadamente .140 mg/ml e dialisada na formulação usando um dispositivo de ultrafiltração/diafiltração em escala de laboratório. A proteína dialisada foi depois diluída a 30 mg/ml, 60 mg/ml e 120 mg/ml no tampão de formulação. As soluções foram depois aliquotadas em frascos de vidro de 3 cc a um volume de enchimento de 1 ml. Os frascos foram liofilizados usando um instrumento de secagem por congelamento de escala de laboratório. Depois da liofilização, os frascos foram selados e armazenados para incubação a 4°C, .29°C, 37°C e 52°C, onde os frascos individuais foram rompidos e analisados em vários pontos com o tempo, começando imediatamente depois da liofilização e estendendo-se a um período de 24 meses. As amostras foram analisadas quanto a estabilidade da proteína usando a cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca aniônica e SDS-PAGE. As propriedades da torta liofilizada e as soluções líquidas reconstituídas também foram analisadas. Conclusão
Considerando o acima, a(s) formulação(ões) ótima(s) compreende(m) histidina a 10 mM, 4% de manitol, 2% de sacarose, 0,01% de Tween-20, pH 7,0. Exemplo 9
Peptídeo de Ligação de Fc-Agp-3 Liofilizado
De modo a determinar a formulação ótima para o peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 Liofilizado, as análises foram realizadas que avaliaram a agregação e estabilidade do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 em vários valores de pH, concentrações de excipiente e concentrações de proteína.
O peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 é um pepticorpo ligado em N contra o fator de ativação de célula B (BAFF) intencionado contra doenças relacionadas com a célula Β. O pepticorpo é construído de dois polipeptídeos ligados em dissulfeto não glicosilados com uma massa total de -63,6 kD. O ponto isoelétrico para este pepticorpo foi estimado ser no pH 7,36. SEQÜÊNCIA de Fc (SEO ID NO: 1696
VDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP K D T L M I S RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLD SDG SFFLYS KLTVDKSRWQQGNVF S CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQÜÊNCIA DO PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE Agp-3 (SEO ID NO:1697):
GCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGS GSTAS SGSG SATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGG
Assim, a seqüência do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 é como segue:
GCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGS GS TAS SGSG SATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMI SRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAP IEKTI SKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SC SVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1698) Triagem em pH Amplo do Peptídeo de Ligação de Fc-Agp-3 Liofilizado a 10 mg/ml
A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicadora de estabilidade em temperaturas elevadas. Para avaliar as propriedades de estabilidade e reconstituição de peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 liofilizado na faixa de pH de 3,85 a 7,6, 10 mg/ml de peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 foram formulados em vários tampões a 10 mM na presença de 2,5% de manitol e .2,0% de sacarose. Os seguintes tampões foram testados em incrementos unitários de pH de aproximadamente 0,5: acetato, succinato, histidina, pirofosfato, fosfato e Tris.
Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material volumoso purificado foi obtido na formulação líquida congelada de 30 mg/ml. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A etapa de recozimento foi realizada a -20°C e durou 4 horas para permitir a cristalização do manitol. A secagem primária foi realizada na temperatura de prateleira de -25°C por 20 horas. A secagem primária atingiu a conclusão a -25°C visto que nenhum pico no vácuo foi observado conforme a temperatura de prateleira foi aumentada até 0°C. Nenhum colapso maior foi observado e as amostras ocorreram com sucesso através da secagem secundária primeiro a O0C e depois a 25°C. Na reconstituição as formulações com pH em ou acima de 7 foram levemente turvas, enquanto que todas as outras formulações foram claras. Isto foi explicado pela proximidade das formulações em pH alto para o ponto isoelétrico do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 (pi = 7,36). A análise de SE-HPLC revelou um dímero como a espécie de peso molecular alto principal. Foi observado que a% relativa de dímero foi fortemente dependente do pH com o acúmulo mais baixo no pH 5 e abaixo. A quantidade de agregados solúveis também mostrou alguma dependência do pH. Nenhum agregado solúvel foi observado nas amostras antes da liofilização. Ao contrário, uma quantidade pequena de dímero foi presente em todas as formulações antes da liofilização e a mesma aumentou ainda mais nas amostras reconstituídas, após a liofilização. Nenhum corte significante foi observado em todas as formulações. A quantidade mais alta do monômero intacto foi no caso de acetato, succinato e histidina no pH 5 e abaixo. Triagem de pH Amplo de Peptídeo de Ligação de Fc-Agp-3 Liofilizado a 30 mg/ml: efeito de estabilização de sacarose e manitol
A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Para avaliar o efeito da presença de 2,5% de manitol e 3,5% de sacarose nas propriedades de estabilidade e reconstituição de peptídeo de ligação de Fc- Agp-3 liofilizado na faixa de pH de 4,5 a 7,5, o peptídeo de ligação de Fc- Agp-3 foi formulado a 30 mg/ml em succinato a 10 mM, tampões de histidina e fosfato. Os tampões de pirofosfato e Tris foram excluídos deste estudo devido ao desempenho deficiente na triagem de pH amplo anterior. O tampão de acetato foi excluído devido pela possibilidade de mudanças de pH nas amostras reconstituídas como um resultado da sublimação de acetato durante a secagem por congelamento.
Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, material volumoso purificado foi obtido no 30 mg/ml de formulação líquida congelada. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A etapa de recozimento foi realizada a -20°C e durou 5 horas para permitir a cristalização de manitol mais completa. A secagem primária foi realizada na temperatura de prateleira de -250C por 20 horas. A secagem primária não atingiu completamente a conclusão a -25°C e algum pico no vácuo foi observado conforme a temperatura de prateleira foi aumentada até 0°C. Nenhum colapso maior foi observado e as amostras se processaram com êxito através da secagem secundária primeiro a O0C e depois a 25°C. Nas formulações de reconstituição com pH em torno de 7 foram levemente turvas, enquanto todas as outras formulações foram claras. Conforme foi mencionado anteriormente, isto pode ser explicado pela proximidade das formulações de pH alto do ponto isoelétrico do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3. A análise de SE-HPLC revelou o dímero como a espécie de peso molecular alto principal. Mais uma vez, foi observado que a% relativa de dímero foi fortemente dependente do pH com o acúmulo mais baixo no pH 5 e abaixo. A quantidade de agregados solúveis não mostra dependência de pH evidente. Nenhum agregado solúvel foi observado nas amostras antes da liofilização. -0,6% de dímero foi observado no volume não GMP antes da formulação e o mesmo aumentou até .3,0% para as formulações de pH alto antes da liofilização como um resultado de troca/concentração de tampão. A dependência do pH do acúmulo de dímero também foi confirmada pela correspondência próxima da quantidade relativa de dímero em um dado pH independente do tipo de tampão. A% de dímero não aumenta significantemente após a liofilização como evidenciado pelas amostras T = 0. A única exceção foi as amostras não contendo ambos, sacarose e manitol, que mostrou aumento perceptível, de -0,25 a 0,5% na% de dímero. Na presença de sacarose a perda de pico principal foi mínima mesmo depois da troca de tampão/liofilização para formulações de succinato e histidina com pH 4,1 e 4,7, respectivamente. Comparado com estas, todas as formulações de fosfato mostraram -3% de perda do pico principal antes da liofilização. Contudo, a torta foi formada mesmo na ausência tanto de sacarose quanto de manitol, o pico principal correspondente caiu em 0,5 a .0,7% comparado com as formulações contendo açúcar. Além disso, a reconstituição das formulações que não de açúcar foi muito mais longa (>2 min) e requereram alguma agitação. De modo a garantir a robustez da torta manitol ou glicina foram incluídos como agentes de encorpamento em todas as formulações subseqüentes embora a sacarose sozinha fosse mostrada conferir estabilidade de proteína suficiente.
Triagem de pH do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 liofílizado estreita a 30 mg/ml
A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC) e HPLC de fase reversa (RP-HPLC), que foram indicativas da estabilidade em temperaturas elevadas. Visto que a% de recuperação do pico principal foi mais alto no pH 5 e abaixo, o tampão de fosfate foi omitido da triagem de pH estreito. Além dos tampões de succinato e histidina, que desempenharam bem nas triagens de pH amplo, as triagens de pH estreitas incluíram glutamato a 10 mM, pH 4 a 6. As formulações foram testadas em incrementos unitários de pH de 0,2. O teor de sacarose e manitol foi mantido constante a 3,5% e 2,5%, respectivamente, exceto para duas formulações de succinato no pH 4,5 com 2,0% e 5,0% de sacarose. Também, seis formulações liofilizadas genérico potenciais foram testadas em cada um dos incrementos de unidade de pH, tais como:
.1) histidina a 20 mM, 2,0% de glicina, 1,0% de sacarose no pH 5,0
.2) histidina a 20 mM, 2,0% de glicina, 1,0% de sacarose no pH 6,0
.3) histidina a 20 mM, 2,0% de glicina, 1,0% de sacarose no pH 7,0
.4) histidina a 20 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 5,0
.5) histidina a 20 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 6,0
.6) histidina a 20 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 7,0
Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material volumétrico purificado foi obtido na formulação líquida congelada de 30 mg/ml. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofílizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. O ciclo de liofilização ciclo ainda modificado. A etapa de recozimento foi realizada a - 15°C para permitir a cristalização da glicina e durou 5 horas. A secagem primária foi realizada inicialmente a -30°C por um período mais curto de tempo (4 h). Depois a temperatura de prateleira foi elevada a -250C e mantida constante por 24 horas. Entretanto, a secagem primária não atingiu completamente a conclusão a -250C como evidenciado por um pico pequeno no vácuo conforme a temperatura de prateleira foi aumentada ainda mais até .0°C. Não obstante, nenhum colapso maior foi observado e as amostras se processaram com êxito até a secagem secundária primeiro a 0°C e depois a .25°C. Até 6 meses os dados de estabilidade no estado de liofilizado foram gerados a 37°C para avaliar a estabilidade de longa duração do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3. Aumentos no pH resulta na perda do pico principal para todas as formulações de histidina. Apenas formulações genéricas foram monitoradas até 6 meses, mas a vantagem do pH próximo a 5,0 já foi óbvia para os pontos de tempo de 1 e 3 meses. Além disso, os dados de 6 meses para as formulações genéricas sugerem que as formulações de manitol + sacarose são mais estáveis do que a glicina + sacarose, especialmente no pH 6 e mais alto.
No caso de formulações de glutamato e succinato houve também um aumento dependente de pH evidente na quantidade de dímero, o produto de degradação principal, conforme o pH tornou-se menos ácido. A dependência de pH similar é observada para os agregados. A recuperação mais alta do pico principal foi observada para o pH 5 e abaixo. A perda inicial do pico principal para T = O pode ser explicada pela degradação de proteína durante a troca de tampão e concentração como evidenciado por uma perda similar para as formulações antes da liofilização. Entretanto, os dados de estabilidade de 3 meses sugerem que as formulações de glutamato tiveram estabilidade física mais alta do que as suas contrapartes de succinato (com o mesmo pH). Deve ser mencionado que neste estudo nós também testamos o efeito das concentrações de sacarose aumentadas sobre a estabilidade das formulações de succinato. Além de 3,5% de sacarose, nós comparamos as formulações de 2,0% e 5,0% de sacarose em succinato, pH 4,5. O aumento na sacarose diminuiu as espécie de peso molecular alto em algum grau, mas a mesma não afetou significantemente a quantidade do pico principal. Portanto, .3,5% de sacarose foram considerados ótimos visto que tais formulações mais intimamente se igualaram com a tonicidade fisiológica.
Uma das espécies cortadas foi observada crescer em pH baixo pela RP-HPLC. Uma porção significante do corte dependente do pH nas formulações liofilizadas ocorreu antes da liofilização como um resultado da troca de tampão consumidora de tempo e etapas de concentração de proteína. Depois da liofilização nenhum aumento significante na quantidade de cortes foi observado mesmo depois da armazenagem por 3 a 6 meses a 37°C. No geral os dados sugerem usar formulações de pH mais alto para mitigar o corte visto que o mesmo não é observável no pH 6 e acima. Entretanto, a quantidade do dímero é significante no pH mais alto e pode ser tão alto quanto 2,5 a 4,5% no pH 6 e acima. Portanto, uma ajuste pode ser encontrado na formulação do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 no pH 5, onde o corte é moderado, especialmente nos tampões de glutamato e histidina e quando a formação de dímero é ainda suficientemente suprimida. Conclusão
2,5% de manitol e 3,5% de sacarose forneceram estabilidade de torta e proteína suficiente como confirmado pelo estudo de prateleira em 6 meses a 37°C. Portanto, a histidina a 10 mM, 2,5% de manitol, 3,5% de sacarose no pH 5,0 e glutamato a 10 mM, 2,5% de manitol, 3,5% de sacarose no pH 5,0 podem ser usados para formular 30 mg/ml de peptídeo de ligação de Fc-Agp-3. Além disso, este estudo mostra que a histidina a 20 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 5,0 também desempenha bem e pode ser considerada como uma formulação de liofilização genérica possível para os pepticorpos. Exemplo 10
Peptídeo de ligação de Fc-Myo Liofilizado
De modo a determinar a formulação ótima para o peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado, análises foram realizadas que avaliaram a agregação e estabilidade do peptídeo de ligação de Fc-Myo em vários valores de pH, as concentrações excipientes e concentrações de proteína.
O peptídeo de ligação de Fc-Myo é um pepticorpo ligado em C contra a proteína de miostatina intencionada contra as doenças relacionadas com o enfraquecimento muscular. O pepticorpo é construído de dois polipeptídeos ligados dissulfeto não glicosilados com uma massa total de .-59,1 kD. O ponto isoelétrico para este pepticorpo foi estimado estar no pH .6,88.
SEQÜÊNCIA Fc (SEO ID NO: 1699):
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMI S RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KV SNKALPAPIEKTI SKAK GQPREP QVYTLPP SRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQÜÊNCIA DE PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE MIOSTATINA (SEO ID NO: 1700): GGGGGAQLADH G QCIRWP WMCPPEGWE
Assim, a seqüência de peptídeo de ligação de Fc-Myo é como segue:
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMI S RTPEVTCVVVDV S HEDP EVKFNWYVD GVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGAQLAD HGQCIRWPWMCPPEGWE (SEQ ID NO: 1701)
Determinação da condição de pH para o peptídeo de ligação de Fc-Mvo liofílizado
A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade em temperaturas elevadas. Um estudo de triagem de pH foi planejado e realizado para determinar o pH de formulação ótimo no estado líquido antes da liofilização. A proteína foi formulada nos pHs 4,5, 4,75, 5,0, 5,5 e 6,0 com agentes de tampão de acetato e histidina e sacarose como o estabilizador (ou lio protetores). Os frascos formulados foram armazenados a 29 C por até 1 ano. A estabilidade foi monitorada usando SE-HPLC. As constantes de taxa de agregação foram calculadas para cada uma das condições de formulação. A taxa de agregação no pH 4,5 foi descoberta ser a mínima, portanto o pH 4,5 foi selecionado como a condição de pH de formulação preferida. Estudo do agente de tampão do peptídeo de ligação de Fc-Myo liofílizado a .30 mg/ml.
A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Uma forma de dosagem de 30 mg/ml como investigada usando três agentes de tamponamento diferentes: glutamato a 10 mM, histidina a 10 mM e succinato a 10 mM no pH 4,5. Todas as formulações contêm 0,004% de polissorbato .20.
Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material de volume purificado foi obtido na formulação líquida congelada de 30 mg/ml. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofílizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A formulação de proteína liofilizada demonstrou elegância de torta aceitável. Na reconstituição as formulações foram claras. O peptídeo de ligação de Fc-Myo liofílizado foi armazenado a 4, 29, 37 e 52°C. Os estudos de estabilidade em tempo real foram realizados a 4°C e descobertos ser comparáveis para estas formulações por até 3 meses. Entretanto em 3 meses de armazenagem a 52°C, a formulação contendo histidina foi levemente melhor do que a formulação contendo glutamato. A formulação contendo succinato foi significantemente menos estável do que as outras duas formulações. Com base nestes resultados, a histidina e glutamato foram consideradas como os agentes de tampão preferidos para a formulação de peptídeo de ligação de Fc-Myo final. Estudo de Excipiente de Peptídeo de Ligação de Fc-Mvo Liofilizado a 30 mg/ml: efeito de estabilização da sacarose, trealose e hidroxietil amido A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Para avaliar o efeito da presença de trealose, hidroxietil amido e sacarose sobre a estabilidade do peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado, o peptídeo de ligação de Fc-Myo foi formulado a 30 mg/ml em tampão de glutamato a 10 mM com 4% de manitol. A concentração de trealose e sacarose usada foi de .2,0%, 1% de hidroxietil amido foi adicionado à formulação de sacarose para compor uma formulação final de glutamato a 10 mM, 4% de manitol, 2% de sacarose, 1% de hidroxietil amido. Todas as formulações contêm 0,004% de polissorbato 20.
Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material volumoso purificado foi obtido na formulação líquida a 30 mg/ml congelada. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A formulação de proteína liofilizada demonstrou elegância aceitável. Na reconstituição as formulações foram claras.
A estabilidade destas formulações foi monitorada usando a SE-HPLC.
O peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado foi armazenado a .4, 29, 37 e 52°C. A estabilidade na condição de tempo de prateleira em tempo real (4°C) foi descoberto ser comparável entre estas formulações por até 3 meses. Entretanto sob condição de armazenagem a 52°C por 3 meses, a formulação contendo sacarose foi levemente melhor do que a formulação contendo trealose. A adição de hidroxietil amido não demonstra nenhum impacto negativo sobre a estabilidade, com base nestes resultados, a sacarose foi considerada como o estabilizador preferido para a formulação de peptídeo de ligação de Fc-Myo final.
Estudo de Excipiente de Peptídeo de Ligação de Fc-Myo Liofílizado a 30 mg/ml: efeito estabilizante de sacarose e manitol
A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Para avaliar o efeito da presença de quantidade variável de manitol e sacarose sobre as propriedades de estabilidade e reconstituição de peptídeo de ligação de Fc-Myo liofílizado na faixa de manitol de 4,0 a 8% e a faixa de sacarose de .1,0% a 4,0%, o peptídeo de ligação de Fc-Myo foi formulado a 30 mg/ml em tampão de glutamato a 10 mM. Todas as formulações contiveram 0,004% de polissorbato 20.
Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material de volume purificado foi obtido na formulação líquida congelada de 30 mg/ml. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizados em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A formulação de proteína liofilizada demonstrou elegância de torta aceitável. Na reconstituição as formulações foram claras.
A estabilidade destas formulações foi monitorada usando o método de SE-HPLC. O peptídeo de ligação de Fc-Myo liofílizado foi armazenado a 4, 29, 37 e 52°C. A estabilidade na condição de prateleira em tempo real (4°C) foi descoberta ser comparável entre estas formulações por até 3 meses. Entretanto quando armazenadas a 52°C por 3 meses, uma quantidade crescente de sacarose foi descoberta contribuir para o aumento na estabilidade contra a agregação. Devido a um interesse em manter a condição isotônica para a formulação final que limita a quantidade total de dissacarídeos e para manter uma razão apropriada de manitol e sacarose para preservar a propriedade da torta liofilizada, 4,0% de manitol e 2,0% de sacarose foram os excipientes preferidos para a formulação final.
Estudo de Excipiente de Peptídeo de Ligação de Fc-Myo Liofilizado a 1, 30, .85 mg/ml
A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Para avaliar o efeito da concentração da proteína sobre as propriedades de estabilidade e reconstituição do peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado, o peptídeo de ligação de Fc-Myo foi formulado a 1, 30, 85 mg/ml em tampão de glutamato a 10 mM com 4% de manitol e 2% de sacarose. Todas as formulações contêm 0,004% de polissorbato 20.
Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material volumoso purificado foi obtido na formulação líquida congelada a 30 mg/ml. O material foi trocado de tampão nos tampões de formulação apropriados usando UF/DF e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A formulação de proteína liofilizada demonstrou elegância de torta aceitável. Na reconstituição as formulações foram claras.
A estabilidade destas formulações foi monitorada usando o método de SE-HPLC. O peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado foi armazenado a 4, 29, 37°C. a estabilidade na condição de tempo de prateleira em tempo real (4°C) foi descoberta ser comparável entre estas formulações por até 6 meses. A estabilidade é provavelmente aceitável para todas as concentrações estudadas como a formulação de produto comercial. Conclusão
.4,0% de manitol e 2,0% de sacarose forneceram estabilidade de torta e proteína suficientes como confirmado pelo estudo de prateleira de .12 meses a 4°C. Portanto, a histidina a 10 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 4,5 e glutamato a 10 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 4,5 podem ser usados para formular de 1 a 100 mg/ml de peptídeo de ligação de Fc-Myo.
A presente invenção foi descrita em termos das formas de realização particulares descobertas ou propostas para compreender os modos preferidos para a prática da invenção. Será avaliado por aqueles de habilidade comum na técnica que, considerando a presente divulgação, numerosas modificações e mudanças podem ser feitas nas formas de realização particulares exemplificadas sem divergir do escopo pretendido da invenção.

Claims (81)

1. Composição de pepticorpo terapêutico liofilizado, caracterizada pelo fato de que compreende um tampão, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e opcionalmente um tensoativo; em que o dito tampão é compreendido de um agente de tamponamento de pH em uma faixa de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM e em que o pH está em uma faixa de cerca de 3,0 a cerca de 8,0; em que o dito agente de encorpamento está em uma concentração de cerca de 0 % a cerca de 4,5 % p/v; em que o dito agente estabilizante está em uma concentração de cerca de 0,1 % a cerca de 20 % p/v; em que o dito tensoativo está em uma concentração de cerca de 0,004 % a cerca de 0,4 % p/v; e em que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula I, Fórmula I: [(X1)a - F1-(X2)J-(L1)cWSPd em que: F1 é um domínio Fc; X1 é selecionado de P1-(L2)e- P2(L3)rP1-(L2)e- P3(L4)g-P2(L3)rP1-(L2)e- e P4(L5)h-P3(L4)g-P2(L3)rP1-(L2)e- X é selecionado de: -(L2)e-P1 -(L2)e-P1-(L3)rP2 -(L2)e-P1-(L3)rP2-(L4)g-P3 e -(L2)e-P1-(L3)rP2-(L4)g-P3-(L5)h-P4 em que P1, P2, P3 e P4 são cada um independentemente seqüências de peptídeos farmacologicamente ativos; L^1, L^2, L^3,L^4 e L^5 são cada um independentemente ligadores; a, b, c, e, f, g e h são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de a e b seja 1; d é 0, 1, ou maior do que 1; e WSP é um polímero solúvel em água, a ligação do qual é efetuada em qualquer porção reativa em F1.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula II Fórmula II: [X1-F1]-(L1)c-WSPd em que o domínio Fc está ligado no término C de X1 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula III Fórmula III: [F1-X2I-(L1)c-WSPd em que o domínio Fc está ligado ao término N de X2 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula IV Fórmula IV: [F1-(L1)e-P1I-(L1)c-WSPd em que o domínio Fc está ligado ao término N de -(L1)c-P1 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula V Fórmula V: [F1-(L1)e-P1-(L2)f-P2]-(Ll)C-WSPd em que o domínio Fc é ligado ao término N de -L1-P1-L2-P2 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico é um multímero.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico é um dímero.
8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que P1, P2, P3 e/ou P4 são independentemente selecionados de um peptídeo apresentado em qualquer uma das Tabelas de 4 a 38.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que P1, P2, P3 e/ou P4 têm a mesma seqüência de aminoácido.
10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1.
11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que WSP é PEG.
12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1 e WSP é PEG.
13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que PEG tem um peso molecular dentre cerca de 2 kDae 100 kDa.
14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o dito PEG tem um peso molecular dentre cerca de 6 kDa e 25 kDa.
15. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita composição compreende pelo menos 50 .5 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
16. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 75 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
17. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 85 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
18. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 90 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
19. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 95 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é selecionado do grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato e aspartato.
21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o dito agente de encorpamento é selecionado do grupo que consiste de manitol, glicina, sacarose, dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose ou xilitol.
22. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o dito agente estabilizante é selecionado do grupo que consiste de sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, fratose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCl, compostos de poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio.
23. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o dito tensoativo selecionado do grupo que consiste de lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio, dioctil sulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal sódico de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal sódico do ácido .1-octanossulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio, sal sódico do ácido glicodesoxicólico, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado, brometo de hexadeciltrimetilamônio, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, lauromacrogol 400, esterarato de polioxil 40, óleo de mamona polioxietileno hidrogenado 10, 40, 50 e 60, monoesterarato de glicerol, polissorbato 20, 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja, DOPC, DMPG, DMPC e DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose.
24. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico está entre cerca de 0,25 mg/ml e 250 mg/ml.
25. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o dito agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o dito agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o dito tensoativo é polissorbato-20 a 0,004 % p/v.
26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 6.
27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é de0,5 mg/ml.
28. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 7,0; em que o dito agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o dito agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o dito tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v.
29. Composição de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 32.
30. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é de30 mg/ml.
31. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é histidina a 20 mM e em que o pH é 5,0; em que o dito agente de encorpamento é manitol a 3,3 % p/v; em que o dito agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o dito tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v.
32. Composição de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 4.
33. Composição de acordo com a reivindicação 32. Caracterizada pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é de100 mg/ml.
34. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o dito agente de encorpamento é manitol a 2,5 % p/v e em que o dito agente estabilizante é sacarose a 3,5 % p/v.
35. Composição de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 31.
36. Composição de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é de .30 mg/ml.
37. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a composição é selecionada do grupo que consiste de: a) histidina a 10 mM, pH 4,7, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; b) histidina a 10 mM, pH 5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; c) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose com e sem 0,004 % de polissorbato-20; d) succinato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 9 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; f) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de sacarose, 1 % de hidroxietil amido, 0,004 % de polissorbato-20; g) glutamato a 5 mM, pH 4,5, 2 % de manitol, 1 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato20; e h) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de trealose, 0,004 % de polissorbato-20.
38. Composição de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada nas Tabelas 21 a 24.
39. Composição de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é selecionada do grupo que consiste de 1, 30, 85 e 100 mg/ml.
40. Método para fabricar um pepticorpo terapêutico liofilizado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) preparar uma solução de um tampão, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e opcionalmente um tensoativo; em que o dito tampão é compreendido de um agente de tamponamento de pH em uma faixa de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM e em que o pH está em uma faixa de cerca de 3,0 a cerca de 8,0; em que o dito agente de encorpamento está em uma concentração de cerca de 2,5 % a cerca de 4 % p/v; em que o dito agente estabilizante está em uma concentração de cerca de 0,1 % a cerca de 5 % p/v; em que o dito tensoativo está em uma concentração de cerca de 0,004 % a cerca de 0,04 % p/v; e b) liofilizar o dito pepticorpo terapêutico; em que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula I, Fórmula I: [(X1)a - F1(X2)b]-(L1)cWSPd em que: F1 é um domínio Fc; X1 é selecionado de P1-(L2)e- P2(L3)fP1-(L2)e- P3(L4)g-P2(L3)rP1-(L2)e- e P4(L5)h-P3(L4)g-P2(L3)rP1-(L2)e- X2 é selecionado de: -(L2)e-P1 -(L2)e-P1-(L3)rP2 -(L2)e-P1-(L3)rP2-(L4)g-P3 e -(L2)e-P1-(L3)rP2-(L4)g-P3-(L5)h-P4 em que P1, P2, P3 e P4 são cada um independentemente seqüências de peptídeos farmacologicamente ativos; L1, L2, L3, L4 e L5 são cada um independentemente ligadores; a, b, c, e, f, g e h são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de a e b seja 1; d é 0, 1, ou maior do que 1; e WSP é um polímero solúvel em água, a ligação do qual é efetuada em qualquer porção reativa em F1.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula II Fórmula II: [X1-F1I-(L1)c-WSPd em que o domínio Fc está ligado no término C de X1 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
42. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula III Fórmula III: [F1-X2J-(L1)c-WSPd em que o domínio Fc está ligado ao término N de X2 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
43. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula IV Fórmula IV: [F1-(L1)e-P1]-(L1)c-WSPd em que o domínio Fc está ligado ao término N de -(L1)c-P1 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
44. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula V Fórmula V: [F1 -(L1l)e-P:'-(L2)rP2]--(L:VWSPd em que o domínio Fc é ligado ao término N de -L1-P1-L2-P2 e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L1.
45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 44, caracterizado pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico é um multímero.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o dito pepticorpo terapêutico é um dímero.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 46, caracterizado pelo fato de que P1, P2, P3 e/ou P4 são independentemente selecionados de um peptídeo apresentado em qualquer uma das Tabelas de 4 a 38.
48. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que P1, P2, P3 e/ou P4 têm a mesma seqüência de aminoácido.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 46, caracterizado pelo fato de que o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 46, caracterizado pelo fato de que WSP é PEG.
51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 46, caracterizado pelo fato de que o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1 e WSP é PEG.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o PEG tem um peso molecular dentre cerca de 2 kDa e 100 kDa.
53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o dito PEG tem um peso molecular dentre cerca de 6 kDa e 25 kDa.
54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a dita composição compreende pelo menos 50 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 75 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
56. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 85 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
57. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 90 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
58. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 95 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.
59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 58, caracterizado pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é selecionado do grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato e aspartato.
60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 58, caracterizado pelo fato de que o dito agente de encorpamento é selecionado do grupo que consiste de manitol, glicina, sacarose, dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose ou xilitol.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 58, caracterizado pelo fato de que o dito agente estabilizante é selecionado do grupo que consiste de sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCl, compostos de poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio.
62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 58, caracterizado pelo fato de que o dito tensoativo é selecionado do grupo que consiste de lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio, dioctil sulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal sódico de N- lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal sódico do ácido 1- octanossulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio, sal sódico do ácido glicodesoxicólico, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado, brometo de hexadeciltrimetilamônio, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonina, Triton X-100, Triton X- .114,, lauromacrogol 400, esterarato de polioxil 40, óleo de mamona polioxietileno hidrogenado 10, 40, 50 e 60, monoesterarato de glicerol, polissorbato 20, 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja, DOPC, DMPG, DMPC e DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose.
63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 58, caracterizado pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico está entre cerca de 0,25 mg/ml e 250 mg/ml.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 58, caracterizado pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o dito agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o dito agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o dito tensoativo é polissorbato-20 a 0,004 % p/v.
65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 6.
66. Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 0,5 mg/ml.
67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 58, caracterizado pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 7,0; em que o dito agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o dito agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o dito tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v.
68. Método de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 32.
69. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml.
70. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 58, caracterizado pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é histidina a 20 mM e em que o pH é 5,0; em que o dito agente de encorpamento é manitol a 3,3 % p/v; em que o dito agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o dito tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v.
71. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 4.
72. Método de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 100 mg/ml.
73. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 58, caracterizado pelo fato de que o dito agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o dito agente de encorpamento é manitol a 2,5 % p/v; e em que o dito agente estabilizante é sacarose a 3,5 % p/v.
74. Método de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada na Tabela 31.
75. Método de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml.
76. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de .40 a 58, caracterizado pelo fato de que a composição é selecionada do grupo que consiste de: a) histidina a 10 mM, pH 4,7, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; b) histidina a 10 mM, pH 5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; c) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose com e sem 0,004 % de polissorbato-20; d) succinato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 9 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; f) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de sacarose, 1 % de hidroxietil amido, 0,004 % de polissorbato-20; g) glutamato a 5 mM, pH 4,5, 2 % de manitol, 1 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato20; e h) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de trealose, 0,004 % de polissorbato-20.
77. Método de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que P1 compreende uma seqüência apresentada nas Tabelas de 21 a 24.
78. Método de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que a concentração de pepticorpo terapêutico é selecionada do grupo que consiste de 1, 30, 85 e 100 mg/ml.
79. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 75, caracterizado pelo fato de que ainda compreende, antes da liofilização, as etapas de: b) ajustar o pH da solução a um pH entre cerca de 4,0 e cerca de 8,0; c) preparar uma solução contendo o dito pepticorpo terapêutico; d) trocar o tampão a solução da etapa (c) na solução da etapa (b); e) adicionar um quantidade apropriada de um tensoativo; e f) liofilizar a mistura da etapa (e).
80. Método para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico reconstituído, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) liofilizar uma composição de pepticorpo terapêutico como definida em qualquer uma das reivindicações de 40 a 78; e b) reconstituir a dita composição liofllizada de pepticorpo terapêutico.
81. Kit para preparar uma composição farmacêutica aquosa, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro recipiente tendo uma composição de pepticorpo terapêutico liofilizado como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 36 e um segundo recipiente tendo um solvente fisiologicamente aceitável para a composição liofllizada.
BRPI0710508A 2006-04-21 2007-04-20 composição de pepticorpo terapêutico liofilizado estável, kit para preparar uma composição farmacêutica aquosa, e métodos para fabricar um pepticorpo terapêutico liofilizado e para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico reconstituído BRPI0710508B8 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79399706P 2006-04-21 2006-04-21
US60/793997 2006-04-21
US11/788,697 US9283260B2 (en) 2006-04-21 2007-04-19 Lyophilized therapeutic peptibody formulations
US11/788697 2007-04-19
PCT/US2007/009712 WO2007124090A2 (en) 2006-04-21 2007-04-20 Lyophilized therapeutic peptibody formulations

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0710508A2 true BRPI0710508A2 (pt) 2012-10-30
BRPI0710508B1 BRPI0710508B1 (pt) 2018-10-23
BRPI0710508B8 BRPI0710508B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=38625630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0710508A BRPI0710508B8 (pt) 2006-04-21 2007-04-20 composição de pepticorpo terapêutico liofilizado estável, kit para preparar uma composição farmacêutica aquosa, e métodos para fabricar um pepticorpo terapêutico liofilizado e para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico reconstituído

Country Status (38)

Country Link
US (2) US9283260B2 (pt)
EP (6) EP2594288A1 (pt)
JP (6) JP5432705B2 (pt)
KR (2) KR101227278B1 (pt)
CN (2) CN101484185A (pt)
AR (1) AR060617A1 (pt)
AU (1) AU2007240656A1 (pt)
BR (1) BRPI0710508B8 (pt)
CA (1) CA2649292C (pt)
CR (3) CR20170130A (pt)
CY (1) CY1118038T1 (pt)
DK (1) DK2018183T3 (pt)
EA (2) EA017085B1 (pt)
ES (1) ES2599318T3 (pt)
GE (1) GEP20156253B (pt)
HR (1) HRP20161653T1 (pt)
HU (1) HUE032144T2 (pt)
IL (3) IL194653A (pt)
JO (1) JO3324B1 (pt)
LT (1) LT2018183T (pt)
MA (1) MA30474B1 (pt)
MX (1) MX2008013393A (pt)
MY (1) MY162816A (pt)
NO (1) NO344947B1 (pt)
NZ (1) NZ596367A (pt)
PE (1) PE20081196A1 (pt)
PH (1) PH12014502880A1 (pt)
PL (1) PL2018183T3 (pt)
PT (1) PT2018183T (pt)
RS (1) RS55428B1 (pt)
SG (2) SG10201501296SA (pt)
SI (1) SI2018183T1 (pt)
TN (1) TNSN08391A1 (pt)
TW (1) TWI352598B (pt)
UA (2) UA99815C2 (pt)
UY (1) UY30302A1 (pt)
WO (1) WO2007124090A2 (pt)
ZA (1) ZA200808485B (pt)

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL219605B1 (pl) 1998-10-23 2015-06-30 Kirin Amgen Inc Dimeryczne mimetyki peptydów trombopoetynowych wiążące się z receptorem MP1 i wykazujące aktywność trombopoetyczną
US7658938B2 (en) 1999-02-22 2010-02-09 Merrion Reasearch III Limited Solid oral dosage form containing an enhancer
BR0008405B1 (pt) 1999-02-22 2014-04-22 Baxter Int Composição de fator viii formulada sem a adição de albumina, uso de uma composição de fator viii, e, método de liofilizar uma formulação farmacêutica aquosa
BR0011250A (pt) 1999-06-01 2002-03-05 Biogen Inc Anticorpo monoclonal de bloqueio a vla-1 e seu uso para o tratamento de distúrbios inflamatórios
CA2443903C (en) 2001-04-13 2018-03-20 Biogen, Inc. Antibodies to vla-1
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
CA2822302A1 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Alethia Biotherapeutics Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation
WO2007117706A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Merrion Research Iii Limited Solid oral dosage form containing an enhancer
AU2011265555B2 (en) * 2006-04-21 2016-03-10 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
JO3324B1 (ar) * 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
AU2007267579B2 (en) 2006-05-25 2013-05-30 Biogen Ma Inc. Methods of treating stroke
CA2723541A1 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Merrion Research Iii Limited Compositions of peptides and processes of preparation thereof
JP5779780B2 (ja) * 2008-11-07 2015-09-16 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 第ｖｉｉｉ因子製剤
US20120183546A1 (en) 2009-09-23 2012-07-19 Amgen Inc. Treatment of ovarian cancer using a specific binding agent of human angiopoietin-2 in combination with a taxane
JP5638628B2 (ja) * 2010-01-19 2014-12-10 ハンミ サイエンス カンパニー リミテッドＨａｎｍｉ Ｓｃｉｅｎｃｅｃｏ．，Ｌｔｄ． 持続型エリスロポエチン結合体の液剤
WO2011120033A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Merrion Research Iii Limited Pharmaceutical compositions of selective factor xa inhibitors for oral administration
MX349294B (es) 2010-12-02 2017-07-21 Oncolytics Biotech Inc Formulaciones virales liofilizadas.
CN103347535B (zh) 2010-12-02 2015-11-25 昂科利蒂克斯生物科技公司 液体病毒制剂
JP5759211B2 (ja) * 2011-03-11 2015-08-05 三洋化成工業株式会社 凍結乾燥方法
WO2013003606A1 (en) 2011-06-29 2013-01-03 Amgen Inc. Predictive biomarker of survival in the treatment of renal cell carcinoma
DE102011055889B4 (de) * 2011-11-30 2013-08-01 Otc Gmbh Verfahren zur Herstellung eines Protein-Hydrolysates
CN102586217A (zh) * 2011-12-16 2012-07-18 深圳市海普瑞药业股份有限公司 肝素黄杆菌肝素酶ⅰ、ⅱ、ⅲ的冻干保存方法
RU2482128C1 (ru) * 2011-12-28 2013-05-20 Замертон Холдингс Лимитед Пептиды, обладающие цитопротекторной активностью
US10316095B2 (en) * 2012-02-16 2019-06-11 Santarus, Inc. Antibody formulations
EP2644186A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-02 OTC GmbH Hair conditioning composition for permanent and semi-permanent hair coloration applications
WO2014004578A1 (en) * 2012-06-25 2014-01-03 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Temperature stable vaccine formulations
CA2928851A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-siglec-15 antibodies
EP2698162A1 (en) 2012-08-15 2014-02-19 Credentis AG Method for producing a composition for treating a tooth lesion
MX2015011430A (es) * 2013-03-15 2016-04-20 Amgen Inc Antagonismo de la miostatina en seres humanos.
CN104274827B (zh) * 2013-07-01 2020-07-14 上海贺普药业股份有限公司 贺普拉肽的制剂
WO2015035405A1 (en) * 2013-09-09 2015-03-12 Pinta Biotherapeutics, Inc. Myostatin antagonist for treatment of pew in esrd patients
HUE043367T2 (hu) * 2013-11-07 2019-08-28 Dr August Wolff Gmbh & Co Kg Arzneimittel Tárolás során stabil liofilizált tripeptid készítmények
US10801070B2 (en) 2013-11-25 2020-10-13 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer
US11725237B2 (en) 2013-12-05 2023-08-15 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
EP4052724A1 (en) * 2013-12-06 2022-09-07 The Broad Institute Inc. Formulations for neoplasia vaccines
KR20230076867A (ko) 2013-12-20 2023-05-31 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신생항원 백신과의 병용 요법
WO2015100344A1 (en) 2013-12-27 2015-07-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Temperature stable vaccine formulations
WO2015138638A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Theraly Pharmaceuticals, Inc. Long acting trail receptor agonists for treatment of autoimmune diseases
CA2943919A1 (en) * 2014-03-29 2015-10-08 Intas Pharmaceuticals Ltd. Lyophilized pharmaceutical composition of fc-peptide fusion protein
RS60625B1 (sr) * 2014-05-28 2020-09-30 Nono Inc Hloridna so tat-nr2b9c
KR20170035891A (ko) * 2014-06-13 2017-03-31 산타 마리아 바이오테라퓨틱스, 인코포레이티드 제형화된 수용체 폴리펩타이드 및 관련 방법
KR20230007550A (ko) * 2014-08-20 2023-01-12 포톨라 파마슈티컬스, 인코포레이티드 인자 xa 해독제용 동결건조된 제형
JP6671141B2 (ja) * 2014-10-21 2020-03-25 大日本住友製薬株式会社 懸濁液剤
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
EP3234130B1 (en) 2014-12-19 2020-11-25 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t-cell- receptor repertoire
US10265384B2 (en) 2015-01-29 2019-04-23 Novo Nordisk A/S Tablets comprising GLP-1 agonist and enteric coating
WO2016176427A1 (en) 2015-04-30 2016-11-03 Amgen Inc. Treatment of ovarian cancer in patients with ascites using a specific binding agent of human angiopoietin-2 in combination with a taxane
AU2016264623B2 (en) 2015-05-20 2022-06-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Shared neoantigens
CN108601819B (zh) 2015-12-17 2022-03-15 约翰霍普金斯大学 用死亡受体激动剂改善系统性硬化症
JP6992262B2 (ja) * 2016-03-31 2022-02-15 東ソー株式会社 変性抗体測定試薬の製造方法
JP7281795B2 (ja) 2016-04-07 2023-05-26 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 膵炎および疼痛をデス受容体アゴニストで処置するための組成物および方法
GB201608323D0 (en) 2016-05-12 2016-06-29 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical compositions
CN109310756B (zh) * 2016-05-13 2022-06-28 奥美药业有限公司 新型血管生成素2，vegf双特异性拮抗剂
US11549149B2 (en) 2017-01-24 2023-01-10 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
JP2017155046A (ja) * 2017-04-05 2017-09-07 イーストポンド・ラボラトリーズ・リミテッド シクロデキストリンを含有する細胞水和組成物
CN111148510A (zh) 2017-09-15 2020-05-12 美国安进公司 用于治疗性蛋白质的冻干药物配制品的方法
EP3684332A1 (en) * 2017-09-18 2020-07-29 Amgen Inc. Vegfr-fc fusion protein formulations
CN108159413B (zh) * 2018-01-10 2021-07-06 杭州洪桥中科基因技术有限公司 一种动物用冻干活疫苗及其制备方法
GB201804835D0 (en) * 2018-03-26 2018-05-09 Ge Healthcare As Formulation and method of preparation
SG11202013248YA (en) * 2018-07-31 2021-02-25 Amgen Inc Pharmaceutical formulations of masked antibodies
CA3129901A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Eli Lilly And Company Therapeutic antibody formulation
EP3736574A1 (en) * 2019-05-07 2020-11-11 Atlas Antibodies AB A formulation comprising an isotope labeled fusion polypeptide
EP3744319B1 (en) 2019-05-28 2022-10-19 Ilkogen Ilac Sanayi Ve Ticaret A.S. A stable lyophilized formulation for hybrid fc fused g-csf
JP2019178154A (ja) * 2019-06-18 2019-10-17 イーストポンド・ラボラトリーズ・リミテッド シクロデキストリンを含有する細胞水和組成物
JP7471688B2 (ja) * 2019-12-03 2024-04-22 中國醫藥大學 オリゴペプチド、検出キット及び医薬組成物
US11767353B2 (en) 2020-06-05 2023-09-26 Theraly Fibrosis, Inc. Trail compositions with reduced immunogenicity
JP2024514072A (ja) * 2021-03-31 2024-03-28 ハングズホウ エクセジェネシス バイオ エルティーディー． Ｖｅｇｆ及びアンジオポエチンを標的とする融合分子及びその使用
CA3239280A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 UCB Biopharma SRL Formulations comprising fab-peg
US20240076597A1 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Terumo Bct, Inc. Methods for cell expansion, differentiation, and/or harvesting of natural killer cells using hollow-fiber membranes
CN118126120A (zh) * 2023-09-14 2024-06-04 海南大学 抑制Aβ42聚集并降低其细胞毒作用的三肽化合物

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
DE3244265A1 (de) 1982-11-30 1984-05-30 Cassella Ag, 6000 Frankfurt Weichmacheremulsion, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung
US4503235A (en) 1983-03-11 1985-03-05 Warner-Lambert Company Process for producing 4-carbamoyl-1H-imidazolium-5-olate
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
EP0315456B1 (en) 1987-11-05 1994-06-01 Hybritech Incorporated Polysaccharide-modified immunoglobulins having reduced immunogenic potential or improved pharmacokinetics
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5627262A (en) 1989-07-05 1997-05-06 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Method and composition for the treatment of septic shock
EP0939121B2 (de) 1989-09-12 2007-12-26 AHP Manufacturing B.V. TFN-bindende Proteine
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DK0575545T3 (da) 1991-03-15 2003-09-15 Amgen Inc Pegylering af polypeptider
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5733731A (en) 1991-10-16 1998-03-31 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
NZ244778A (en) 1991-10-21 1994-03-25 Ortho Pharma Corp Peg imidates and protein derivatives thereof
WO1993024135A1 (en) 1992-05-26 1993-12-09 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
GB9225448D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
US5922545A (en) 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US5773569A (en) 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5981478A (en) 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5608035A (en) 1994-02-02 1997-03-04 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-1 receptor
US5786331A (en) 1994-02-02 1998-07-28 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-1 receptor
US5880096A (en) 1994-02-02 1999-03-09 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-1 receptor
US5844929A (en) * 1994-02-24 1998-12-01 British Telecommunications Public Limited Company Optical device with composite passive and tapered active waveguide regions
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US20030053982A1 (en) 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
AU693478B2 (en) 1994-11-10 1998-07-02 Metabolic Pharmaceuticals Limited Treatment of obesity
IL116026A (en) 1994-11-22 2005-08-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Peptides capable of linking to the sh3 domain of gap, nucleotide sequences encoding the same, their preparation and uses
US5888763A (en) 1994-12-30 1999-03-30 The Rockefeller University Peptides specific for the first Crk-SH3 domain
WO1996024369A1 (en) 1995-02-06 1996-08-15 Genetics Institute, Inc. Formulations for il-12
IL113159A0 (en) 1995-03-28 1995-06-29 Yeda Res & Dev Synthetic peptides and pharmaceutical compositions comprising them
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5767078A (en) 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
US5869451A (en) 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
EP1516628B1 (en) * 1995-07-27 2013-08-21 Genentech, Inc. Stable isotonic lyophilized protein formulation
US5746516A (en) 1995-08-11 1998-05-05 Hitachi Powdered Metals Co., Ltd. Porous bearing system having internal grooves and electric motor provided with the same
US5817750A (en) 1995-08-28 1998-10-06 La Jolla Cancer Research Foundation Structural mimics of RGD-binding sites
JPH09151200A (ja) 1995-09-29 1997-06-10 Ajinomoto Co Inc ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含むヒト胃癌治療、予防剤
US6369027B1 (en) 1995-12-22 2002-04-09 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US5714577A (en) 1996-01-26 1998-02-03 University Of Pittsburgh Antimicrobial peptides
IL117223A0 (en) 1996-02-22 1996-06-18 Yeda Res & Dev Antipathogenic polypeptides and compositions comprising them
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
EP0906419A2 (en) 1996-03-28 1999-04-07 Chiron Corporation Peptide ligands of the urokinase receptor
IL118003A0 (en) 1996-04-23 1996-08-04 Yeda Res & Dev Novel vip fragments and pharmaceutical compositions comprising them
FR2748028B1 (fr) 1996-04-30 1998-08-14 Lab Francais Du Fractionnement Peptides derives du facteur von willebrand et leur utilisation comme anticoagulant
EP0911393B1 (en) 1996-06-07 2007-01-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Peptide having cortistatin or somatostatin activity, process for the production of the same, and use of the same
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
EP0927045B1 (en) 1996-09-10 2005-12-14 The Burnham Institute Tumor homing molecules, conjugates derived therefrom, and methods of using same
KR100408229B1 (ko) 1996-10-04 2003-12-01 암겐 인코포레이티드 Ｍｐｌ 리간드를 함유하는 제약학적 조성물
DK0934526T3 (da) 1996-10-08 2003-05-05 Bisys B V U Fremgangsmåder og midler til udvælgelse af peptider og proteiner, der har specifik affinitet til et mål
US5955431A (en) 1997-02-05 1999-09-21 Brigham And Women's Hospital, Inc. Mast cell protease peptide inhibitors
EP0975754B2 (en) 1997-04-16 2016-01-06 Amgen Inc., Osteoprotegerin binding proteins and their receptors
US6265535B1 (en) 1997-05-30 2001-07-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Peptides and peptide analogues designed from binding sites of tumor necrosis factor receptor superfamily and their uses
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
EP1007561B1 (en) 1997-11-07 2002-04-17 Conjuchem, Inc. Novel conjugates of opioids and endogenous carriers
WO1999038526A1 (en) 1998-01-29 1999-08-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Variant peptide ligands that selectively induce apoptosis
JP2002505338A (ja) 1998-03-05 2002-02-19 カイロン コーポレイション 生物学的に活性な分子の血清半減期を増加するための方法
US6235872B1 (en) 1998-03-12 2001-05-22 The Burnham Institute Proapoptotic peptides dependence polypeptides and methods of use
WO1999047151A1 (en) 1998-03-20 1999-09-23 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Peptide ligands for the erythropoietin receptor
EP0947524A1 (en) 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
WO1999051254A1 (en) 1998-04-06 1999-10-14 Advanced Immunit, Inc. Short peptides for treatment of neurological degenerative diseases
DE69925830T2 (de) 1998-04-28 2006-05-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Peg-lhrh analog konjugate
EP0972780A1 (en) 1998-05-18 2000-01-19 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Il-6 antagonist peptides
PL200471B1 (pl) 1998-05-22 2009-01-30 Abbott Lab Związki peptydowe, kompozycje je zawierające i ich zastosowania
US5932548A (en) 1998-06-03 1999-08-03 Deghenghi; Romano Lysine containing peptides for treatment of heart disease
WO2000001402A1 (en) 1998-07-02 2000-01-13 Envision Biomedical Consulting Antiproliferative and antiviral proteins and peptides
US6168785B1 (en) 1998-07-16 2001-01-02 Institut Pasteur Biological applications of new peptides of IL-2 and derivatives and use as therapeutic agents
WO2000011028A2 (en) 1998-08-21 2000-03-02 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory peptides derived from il-2 and analogues thereof
PT1121382E (pt) 1998-10-16 2006-10-31 Biogen Idec Inc Proteinas de fusao do interferao beta e as respectivas utilizacoes
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
PL219605B1 (pl) * 1998-10-23 2015-06-30 Kirin Amgen Inc Dimeryczne mimetyki peptydów trombopoetynowych wiążące się z receptorem MP1 i wykazujące aktywność trombopoetyczną
WO2000047740A2 (en) 1999-02-12 2000-08-17 Amgen Inc. Tnf-related proteins
US6635646B1 (en) 1999-05-04 2003-10-21 Schering Corporation Pegylated interferon alfa-CCR5 antagonist combination HIV therapy
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
WO2001083525A2 (en) 2000-05-03 2001-11-08 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
US6853809B2 (en) 2001-01-30 2005-02-08 Koninklijke Philips Electronics N.V. Camera system for providing instant switching between wide angle and full resolution views of a subject
CN100448891C (zh) 2001-05-11 2009-01-07 安姆根有限公司 与tall-1结合的肽和相关分子
RU2180233C1 (ru) 2001-06-26 2002-03-10 Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" Способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7138370B2 (en) * 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
AU2003276844A1 (en) 2002-08-28 2004-03-19 Pharmacia Corporation Formulations of modified antibodies and methods of making the same
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
WO2004039337A2 (en) 2002-10-31 2004-05-13 Protein Design Labs, Inc. Stable liquid pharmaceutical formulation of antibodies that are prone to isomerization
WO2004058988A2 (en) 2002-12-20 2004-07-15 Amgen, Inc. Binding agents which inhibit myostatin
EP1773400A2 (en) 2004-07-08 2007-04-18 Amgen Inc. Therapeutic peptides
ES2629397T3 (es) 2004-09-24 2017-08-09 Amgen Inc. Moléculas de Fc modificadas
JO3324B1 (ar) * 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
EP3035305B1 (en) 2014-12-18 2016-11-16 Axis AB Enclosure and arrangement for recess mounting of a camera or camera head

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009534392A (ja) 2009-09-24
JP6356106B2 (ja) 2018-07-11
KR101236042B1 (ko) 2013-02-21
US20090258017A1 (en) 2009-10-15
HUE032144T2 (en) 2017-08-28
RS55428B1 (sr) 2017-04-28
EP2018183A2 (en) 2009-01-28
JP5873854B2 (ja) 2016-03-01
CY1118038T1 (el) 2017-05-17
JP2022166219A (ja) 2022-11-01
KR20120114384A (ko) 2012-10-16
EP2594285A1 (en) 2013-05-22
UY30302A1 (es) 2007-10-31
EP2594287A1 (en) 2013-05-22
WO2007124090A2 (en) 2007-11-01
LT2018183T (lt) 2016-11-25
MY162816A (en) 2017-07-31
MA30474B1 (fr) 2009-06-01
TNSN08391A1 (en) 2010-04-14
EP2594288A1 (en) 2013-05-22
JP2016065060A (ja) 2016-04-28
US10166189B2 (en) 2019-01-01
BRPI0710508B1 (pt) 2018-10-23
KR20090005204A (ko) 2009-01-12
NO344947B1 (no) 2020-07-27
SI2018183T1 (sl) 2017-01-31
IL248156B (en) 2018-07-31
EP2594286A1 (en) 2013-05-22
US20160143852A1 (en) 2016-05-26
TW200744624A (en) 2007-12-16
ES2599318T3 (es) 2017-02-01
PL2018183T3 (pl) 2017-04-28
EP2594285B1 (en) 2016-08-10
UA116080C2 (uk) 2018-02-12
EA022424B1 (ru) 2015-12-30
MX2008013393A (es) 2009-03-06
JP2018150380A (ja) 2018-09-27
CA2649292A1 (en) 2007-11-01
JO3324B1 (ar) 2019-03-13
EA200802170A1 (ru) 2009-06-30
BRPI0710508B8 (pt) 2021-05-25
PE20081196A1 (es) 2008-09-04
SG10201501296SA (en) 2015-04-29
JP6787953B2 (ja) 2020-11-18
IL224966A (en) 2017-10-31
NZ596367A (en) 2013-09-27
IL194653A0 (en) 2011-08-01
CR20170130A (es) 2017-06-15
EA201270625A1 (ru) 2012-12-28
IL194653A (en) 2016-10-31
US9283260B2 (en) 2016-03-15
CR20140274A (es) 2014-07-18
CN101484185A (zh) 2009-07-15
PH12014502880A1 (en) 2016-01-18
DK2018183T3 (en) 2016-11-28
EP2594284A1 (en) 2013-05-22
TWI352598B (en) 2011-11-21
JP5432705B2 (ja) 2014-03-05
CR10442A (es) 2009-02-19
PT2018183T (pt) 2016-12-02
ZA200808485B (en) 2009-08-26
JP2014040441A (ja) 2014-03-06
CA2649292C (en) 2017-01-17
AU2007240656A1 (en) 2007-11-01
WO2007124090A3 (en) 2008-12-11
EP2018183B1 (en) 2016-09-07
AR060617A1 (es) 2008-07-02
UA99815C2 (ru) 2012-10-10
SG182887A1 (en) 2012-08-30
CN107789325A (zh) 2018-03-13
GEP20156253B (en) 2015-03-10
KR101227278B1 (ko) 2013-01-28
NO20084893L (no) 2009-01-20
EA017085B1 (ru) 2012-09-28
HRP20161653T1 (hr) 2017-01-13
JP2021006525A (ja) 2021-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6787953B2 (ja) 凍結乾燥された治療用ペプチボディ製剤
JP6549104B2 (ja) 持続型ヒト成長ホルモン製剤
JP2018115166A (ja) 持続型ヒト成長ホルモン結合体の高濃度液剤
AU2011265555B2 (en) Lyophilized therapeutic peptibody formulations
ES2794449T3 (es) Formulación líquida que comprende un compuesto neutralizante del GM-CSF

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 23/10/2018, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 20/04/2007 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

B15V Prolongation of time limit allowed