JP5873854B2 - 凍結乾燥された治療用ペプチボディ製剤 - Google Patents

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Description

一般に、本発明は、凍結乾燥された治療用ペプチボディの製剤及び治療用ペプチボディを含む凍結乾燥された組成物を作製するための方法に関する。
組み換えタンパク質は、新たに登場しつつある治療剤のクラスである。このような組み換え治療剤は、タンパク質製剤及び化学的修飾に進歩をもたらしてきた。治療用タンパク質がタンパク質分解酵素に曝露されるのを主として遮断することによって、治療用タンパク質を保護することができる修飾が同定されてきた。タンパク質修飾は、治療用タンパク質の安定性、循環時間及び生物学的活性も増加させ得る。タンパク質修飾及び融合タンパク質を記載する総説論文は、「Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２），Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，Ｌｏｎｄｏｎ）」であり、参照により、本明細書に組み込まれる。
１つの有用な修飾は、ポリペプチドの、抗体の「Ｆｃ」ドメインとの組み合わせである。抗体は、「Ｆａｂ」として知られる可変ドメイン（抗原に結合する。）及び「Ｆｃ」として知られる定常ドメイン（補体活性化及び貪食細胞による攻撃としてのエフェクター機能に関連する。）という機能的に独立した２つの部分を含む。Ｆｃは長い血清半減期を有するのに対して、Ｆａｂは短寿命である。Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−３１。例えば、米国特許第５，４２８，１３０号も参照。治療用ペプチボディ又はタンパク質と一緒に構築されると、Ｆｃドメインは、より長い半減期を与えることができ、又は、Ｆｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固定などの機能、及びおそらくは胎盤伝達のような機能さえ取り込むことが可能である。同文献。表１は、本分野で公知の治療用タンパク質とともに、Ｆｃ融合タンパク質の使用を要約している。
Figure 0005873854
ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）連結されたタンパク質及びペプチド又は融合タンパク質及びペプチドも、医薬中での使用、人工のインプラント上での使用及び生体適合性が重要であるその他の用途に適している。医薬及びインプラントに、並びに分子及び表面全般にＰＥＧを付着させるための活性部分を有するＰＥＧの様々な誘導体が提案されてきた。例えば、湿潤、帯電及びタンパク質又はタンパク質残基などの表面への分子の他の種類の付着を調節するために、ＰＥＧを表面に連結させるためのＰＥＧ誘導体が提案されてきた。
他の研究では、ＰＥＧの連結（「ＰＥＧ化」）は、生物学的に活性な分子の臨床的使用において遭遇される障害を克服する上で望ましいことが示されている。公開されたＰＣＲ公開ＷＯ９２／１６２２１は、例えば、多くの治療用タンパク質候補は血清中で短い半減期を有することが見出されたことを述べている。
ＰＥＧ化は、分子の見かけの分子量を増加させることによって、血流からのクリアランス速度を減少させる。ある種のサイズまで、タンパク質の糸球体ろ過の速度はタンパク質のサイズに反比例する。従って、ＰＥＧ化が排除を減少させる能力は、一般に、タンパク質に付着されているＰＥＧ基の数の関数ではなく、連結されたタンパク質の総分子量の関数である。減少したクリアランスは、ＰＥＧ化されていない材料に比べて増加した効力をもたらし得る。例えば、Ｃｏｎｆｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．ｖｏｌ．１９，ｐｇ．２８７（１９８７）及びＫａｔｒｅ ｅｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ｖｏｌ．８４，ｐｇ．１４８７（１９８７）を参照されたい。
さらに、ＰＥＧ化はタンパク質凝集を減少させることができ（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａｖｏｌ．７８８，ｐｇ．２４８（１９８４））、（すなわち）タンパク質の免疫原性を変化させ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２５２ｐｇ．３５８２（１９７７））、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１６２２１に記載されているように、タンパク質の溶解度を増加させることができる。
一般に、タンパク質リガンドの、その受容体との相互作用は、しばしば、相対的に大きな界面において起こる。しかしながら、その受容体に結合されたヒト成長ホルモンの場合に示されているように、実際には、界面に位置する僅か数個の中心的残基が結合エネルギーの殆どに寄与している。Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：３８３−３８６（１９９５）。残りのタンパク質リガンドの多くは結合するエピトープを正しい立体配置で提示する役割のみを果たしているというこの観察及び事実によって、ずっと小さなサイズの活性なリガンドを見出すことが可能となる。したがって、本明細書において定義される「ペプチド」長のみの分子が、所定の大きなタンパク質リガンドの受容体タンパク質へ結合することができる。このようなペプチドは、大きなタンパク質リガンドの生物活性を模倣し得（「ペプチドアゴニスト」）、又は、競合的結合を通じて、大きなタンパク質リガンドの生物活性を阻害し得る（「ペプチドアンタゴニスト」）。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、このようなペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを同定する上での強力な方法として登場した。例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４；１９９３年６月２９日に付与された米国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日に付与された米国特許第５，７３３，７３１号；１９９６年３月１２日に付与された米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月１１日に付与された米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日に付与された米国特許第５，３３８，６６５号；１９９９年７月１３日に付与された米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日に公開されたＷＯ９６／４０９８７；及び１９９８年４月１６日に公開されたＷＯ９８／１５８３３（これらの各々は、参照により組み込まれる。）を参照されたい。このようなライブラリーでは、糸状ファージのコートタンパク質との融合によって、ランダムなペプチド配列が提示される。典型的には、提示されたペプチドは、受容体の抗体固定された細胞外ドメインに対してアフィニティー溶出される。保持されたファージは、アフィニティー精製及び再増殖を連続して繰り返すことによって濃縮され得、ペプチドの１つ又はそれ以上の構造的に関連するファミリー内の中心的残基を同定するために、もっとも優れた結合ペプチドが配列決定される。例えば、２つの異なるファミリーが同定された「Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１６９６−９」を参照されたい。ペプチド配列は、アラニンスキャニングによって、又はＤＮＡレベルでの突然変異導入によって、何れの残基を安全に置換させ得るかについても示唆し得る。最も優れた結合物質の配列をさらに最適化するために、突然変異導入ライブラリーを作製し、スクリーニングし得る。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４。
他の方法は、ペプチド研究において、ファージディスプレイと競合する。ペプチドライブラリーは、ｌａｃレプレッサーのカルボキシ末端に融合させ、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させることができる。イー・コリをベースとする別の方法は、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合によって、細胞の外膜上での提示を可能とする。これらの及び関連する方法は、「イー・コリディスプレイ」と総称されている。可溶性ペプチド混合物をスクリーニングするための別の生物学的アプローチは、発現及び分泌のために酵母を使用する。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３：７４１−８を参照されたい。Ｓｍｉｔｈらの方法及び関連する方法は、「酵母をベースとしたスクリーニング」と称されている。別の方法では、リボソーム放出の前に、ランダムなＲＮＡの翻訳が停止され、付随するＲＮＡがまだ付着されたままのポリペプチドのライブラリーが得られる。この方法及び関連する方法は、「リボソームディスプレイ」と総称されている。他の方法は、ＲＮＡへのペプチドの化学的結合を使用する。例えば、「Ｒｏｂｅｒｔｓ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３」を参照されたい。この方法及び関連する方法は、「ＲＮＡペプチドスクリーニング」と総称されている。ポリエチレンの棒又は溶媒透過性樹脂などの安定な非生物学的材料上にペプチドが固定化されている、化学的に誘導されたライブラリーが開発されてきた。化学的に誘導された別のペプチドライブラリーは、ガラススライド上に固定化されたペプチドを走査するために、光リソグラフィーを使用する。これらの方法及び関連する方法は、「化学的ペプチドスクリーニング」と総称されている。化学的ペプチドスクリーニングは、Ｄアミノ酸及びその他の非天然類縁体並びに非ペプチド要素の使用を可能とする点で有利であり得る。生物学的方法及び化学的方法の両者が、「Ｗｅｌｌｓ ＆ Ｌｏｗｍａｎ（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３５５−６２」に概説されている。
公知の生物活性ペプチドの場合には、好ましい治療特性を有するペプチドリガンドの合理的な設計を実施することができる。このようなアプローチでは、段階的な変化がペプチド配列に施され、生物活性に対する置換の効果又はペプチドの予想生物物理学的特性（例えば、溶液構造）が決定される。これらの技術は、「合理的設計」とも総称される。１つのこのような技術では、一度に１つの残基がアラニンと置換されたペプチドの系列が作成される。この技術は、一般に、「アラニンウォーク」又は「アラニンスキャン」と称される。２つの残基（連続又は空間的に離れている）が置換される場合、「ダブルアラニンウォーク」と称される。得られたアミノ酸置換は、好ましい治療特性を有する新たなペプチド体を与えるために、単独で又は組み合わせて使用することができる。
大きなタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを推定するために、タンパク質−タンパク質相互作用の構造的分析も使用し得る。このような分析では、結晶構造は、ペプチドがそこから設計され得る大きなタンパク質リガンドの重要な残基の正体及び相対的配向性を推定し得る。例えば、「Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７），ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１５：１２６６−７０」を参照のこと。これらの方法及び関連する方法は、「タンパク質構造分析」と称されている。ファージディスプレイによって選択される受容体タンパク質とペプチド間の相互作用を調べるために、これらの分析方法も使用し得、これは、結合親和性を増大させるためにペプチドのさらなる修飾を示唆し得る。
概念的には、何れのタンパク質のペプチド模倣体も、ファージディスプレイ及び上記されているその他の方法を用いて同定することができる。これらの方法は、エピトープマッピングのために、タンパク質−タンパク質相互作用中の重要なアミノ酸の同定のために、新たな治療剤を発見するための基礎としても使用されてきた。例えば、「Ｃｏｒｔｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：６１６−２１」。ペプチドライブラリーは、現在、エピトープマッピングなどの免疫学的研究において、最も頻繁に使用されている。Ｋｒｅｅｇｅｒ（１９９６），Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １０（１３）：１９−２０。
特に興味深いのは、薬理学的に活性なペプチドの発見におけるペプチドライブラリー及びその他の技術を使用することである。本分野において同定されたこのような多数のペプチドが表２に要約されている。ペプチドは、列記されている公報（これらの各々は、参照により、本明細書に組み込まれる。）中に記載されている。ペプチドの薬理学的活性が記載されており、多くの事例では、括弧内にそれらの短縮された用語が後記されている。これらのペプチドの幾つかは、（例えば、Ｃ末端に架橋された二量体を形成するために）修飾されている。典型的には、ペプチドライブラリーは、薬理学的に活性なタンパク質に対する受容体（例えば、ＥＰＯ受容体）への結合に関してスクリーニングされた。少なくとも１つの例（ＣＴＬＡ４）において、ペプチドスクリーニングは、モノクローナル抗体への結合に関してスクリーニングされた。
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ペプチドライブラリースクリーニングによって同定されたペプチドは、治療剤そのものとして使用されるよりむしろ、治療剤の開発における「先導物質」とみなされてきた。他のタンパク質及びペプチドのように、それらは、腎臓によるろ過、細網内皮系中の細胞クリアランス機構又はタンパク分解による分解の何れかによって、インビボでは急速に除去される（Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２），Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１１）。その結果、本分野では、現在、薬物標的を検証するために、又は、化学的ライブラリースクリーニングを通じては、容易に又は迅速に同定され得なかった有機化合物を設計するための足場として、同定されたペプチドを使用している。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ ３：３７０−８。
典型的には、精製されたペプチドは、水性状態中でわずかに安定であるに過ぎず、化学的分解及び物理的分解を受けて、加工処理及び保存中に生物学的活性を喪失する。さらに、水溶液中のペプチド組成物は、脱アミド化及びペプチド結合切断などの加水分解を受ける。これらの効果は、生物学的活性を基礎とする所定の投薬量範囲内でヒトに投与されることが予定している治療的に活性なペプチドに深刻な問題をもたらす。
精製されたペプチドの投与は、ヒト集団が罹患する多くの疾病に対する有望な治療戦略であり続けている。しかしながら、治療的ペプチボディが、様々な保存条件において、長期にわたって、安定な医薬組成物を保ち続けることができ、次いで、インビボで患者に対して有効となるようにすることは解決されていない。したがって、疾病及び疾患の治療のために治療剤として有用である安定な製剤中に治療用ペプチボディを提供することが、本分野において必要とされ続けている。
米国特許第５，４２８，１３０号明細書 国際公開第９２／１６２２１号 米国特許第５，２２３，４０９号明細書 米国特許第５，７３３，７３１号明細書 米国特許第５，４９８，５３０号明細書 米国特許第５，４３２，０１８号明細書 米国特許第５，３３８，６６５号明細書 米国特許第５，９２２，５４５号明細書 国際公開第９６／４０９８７号 国際公開第９８／１５８３３号
Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２），Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，Ｌｏｎｄｏｎ） Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−３１ Ｃｏｎｆｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．ｖｏｌ．１９，ｐｇ．２８７（１９８７） Ｋａｔｒｅ ｅｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ｖｏｌ．８４，ｐｇ．１４８７（１９８７） Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａｖｏｌ．７８８，ｐｇ．２４８（１９８４） Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２５２ｐｇ．３５８２（１９７７） Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：３８３−３８６（１９９５） Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６ Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４ Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１６９６−９ Ｌｏｗｍａｎ（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４ Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３：７４１−８ Ｒｏｂｅｒｔｓ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３ Ｗｅｌｌｓ ＆ Ｌｏｗｍａｎ（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３５５−６２ Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７），ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１５：１２６６−７０ Ｃｏｒｔｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：６１６−２１ Ｋｒｅｅｇｅｒ（１９９６），Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １０（１３）：１９−２０ Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２），Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１１ Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ ３：３７０−８
発明の要旨
本発明は、治療用ペプチボディの凍結乾燥に有用であり、高度に安定な治療用ペプチボディ産物をもたらす製剤を提供する。安定な治療用ペプチボディ産物は、治療用ペプチボディの投与が有益であり得る疾患又は症状に罹患している個体の治療において治療剤として有用である。
一態様において、本発明は、緩衝剤、充填剤、安定化剤及び場合によって界面活性剤を含む、凍結乾燥された治療用ペプチボディ組成物であり、前記緩衝剤は約５ｍＭから約２０ｍＭの範囲のｐＨ緩衝剤から構成され、及びｐＨは約３．０から約８．０の範囲であり、前記充填剤は約０％から約４．５％ｗ／ｖの濃度であり、前記安定化剤は約０．１％から約２０％ｗ／ｖの濃度であり、前記界面活性剤は約０．００４％から約０．４％ｗ／ｖの濃度であり、及び前記治療用ペプチボディは、式Ｉ
式Ｉ：［（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（式中：
Ｆ１は、Ｆｃドメインであり、
Ｘ１は、
Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−
Ｐ２−（Ｌ３）ｆ −Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−
Ｐ３−（Ｌ４）ｇ−Ｐ２ −（Ｌ３）ｆ −Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−及び
Ｐ４−（Ｌ５）ｈ−Ｐ３−（Ｌ４）ｇ−Ｐ２−（Ｌ３）ｆ−Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−
から選択され、
Ｘ２は、
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１、
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１−（Ｌ３）ｆ−Ｐ２、
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１−（Ｌ３）ｆ−Ｐ２−（Ｌ４）ｇ−Ｐ３及び
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１−（Ｌ３）ｆ−Ｐ２−（Ｌ４）ｇ−Ｐ３−（Ｌ５）ｈ−Ｐ４
から選択され、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立に、薬理学的に活性なペプチドの配列であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、各々独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立に、０又は１であり、
但し、ａ及びｂの少なくとも１つは１であり、
ｄは、０、１又は１より大きく、並びに
ＷＳＰは、その結合がＦ１中の何れかの反応性部分において実施される水溶性ポリマーである。）
で表される構造を含む、前記組成物を提供する。
別の実施形態において、治療用ペプチボディは、式ＩＩで表される構造を含む。
式ＩＩ：［Ｘ１−Ｆ１］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（ＦｃドメインはＸ１のＣ末端に付着されており、及び０、１又はそれ以上のＷＳＰは、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
さらに別の実施形態において、治療用ペプチボディは、式ＩＩＩで表される構造を含む。
式ＩＩＩ：［Ｆ１−Ｘ２］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（ＦｃドメインはＸ２のＮ末端に付着されており、及び０、１又はそれ以上のＷＳＰは、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
さらに別の実施形態において、治療用ペプチボディは、式ＩＶで表される構造を含む。
式ＩＶ：［Ｆ１−（Ｌ１）ｅ−Ｐ１］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（Ｆｃドメインは、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１のＮ末端に付着されており、及び０、１又はそれ以上のＷＳＰは、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
別の実施形態において、治療用ペプチボディは、式Ｖで表される構造を含む。
式Ｖ：［Ｆ１−（Ｌ１）ｅ−Ｐ１−（Ｌ２）ｆ−Ｐ２］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（Ｆｃドメインは、−Ｌ１−Ｐ１−Ｌ２−Ｐ２のＮ末端に付着されており、及び０、１又はそれ以上のＷＳＰが、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
別の実施形態において、治療用ペプチボディは多量体又は二量体である。別の実施形態において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及び／又はＰ４が表４から３８の何れか１つに記載されているペプチドから独立に選択される、先述の組成物が提供される。関連する実施形態において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及び／又はＰ４が同一のアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、Ｆｃドメインは配列番号１に記載されている。別の実施形態において、ＷＳＰはＰＥＧである。さらに別の実施形態において、Ｆｃドメインは配列番号１に記載されており、及びＷＳＰはＰＥＧである。別の実施形態において、ＰＥＧは約２ｋＤａと１００ｋＤａの間又は６ｋＤａと２５ｋＤａの間の分子量を有する。別の実施形態において、組成物は、少なくとも５０％、７５％、８５％、９０％又は９５％のＰＥＧ化された治療用ペプチボディを含む。
本発明のさらに別の実施形態において、前記ｐＨ緩衝剤はグリシン、ヒスチジン、グルタメート、サクシナート、ホスファート、アセタート及びアスパルタートからなる群から選択される先述の組成物が提供される。本発明のさらに別の実施形態において、充填剤が、マニトール、グリシン、スクロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ラクトース、ソルビトール、トレハロース又はキシリトールからなる群から選択される先述の組成物が提供される。
本発明のさらに別の実施形態において、安定化剤がスクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、マニトール、ソルビトール、グリシン、アルギニン塩酸塩、デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、シクロデキストリン、Ｎ−メチルピロリデン、セルロース及びヒアルロン酸などの多糖を含むポリヒドロキシ化合物、塩化ナトリウムからなる群から選択される先述の組成物が提供される。
本発明のさらに別の実施形態において、界面活性剤が、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ジオクチルスルホン酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム一水和物、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３−１０、ＳＢ３−１２、ジギトニン、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ１、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、４０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート２０、４０、６０、６５及び８０、大豆レシチン、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ及びＤＯＰＧ、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される先述の組成物が提供される。本発明のさらに別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が約０．２５ｍｇ／ｍＬと２５０ｍｇ／ｍＬの間にある先述の組成物が提供される。
本発明の別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤が１０ｍＭヒスチジンであり、及びｐＨが５．０であり、充填剤が４％ｗ／ｖマニトールであり、安定化剤が２％ｗ／ｖスクロースであり、並びに界面活性剤が０．００４％ｗ／ｖポリソルベート−２０である先述の組成物が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表６に記載されている配列を含む先述の組成物が提供される。本発明のさらに別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が０．５ｍｇ／ｍＬである先述の組成物が提供される。別の実施形態において、治療用ペプチボディは、配列番号９９３、配列番号９９４、配列番号９９５、配列番号９９６、配列番号９９７、配列番号９９８、配列番号９９９、配列番号１０００、配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００３、配列番号１００４、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７、配列番号１００８、配列番号１００９、配列番号１０１０、配列番号１０１１、配列番号１０１２、配列番号１０１３、配列番号１０１４、配列番号１０１５、配列番号１０１６又は配列番号１０１７の何れか１つである。
本発明のさらに別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤が１０ｍＭヒスチジンであり、及びｐＨが７．０であり、充填剤が４％ｗ／ｖマニトールであり、安定化剤が２％ｗ／ｖスクロースであり、並びに界面活性剤が０．０１％ｗ／ｖポリソルベート−２０である先述の組成物が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表３２に記載されている配列を含む先述の組成物が提供される。本発明のさらに別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が３０ｍｇ／ｍＬである先述の組成物が提供される。
本発明のさらに別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤が２０ｍＭヒスチジンであり、及びｐＨが５．０であり、充填剤が３．３％ｗ／ｖマニトールであり、安定化剤が２％ｗ／ｖスクロースであり、並びに界面活性剤が０．０１％ｗ／ｖポリソルベート−２０である先述の組成物が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表４に記載されている配列を含む先述の組成物が提供される。本発明のさらに別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が１００ｍｇ／ｍＬである先述の組成物が提供される。
本発明のさらに別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤が１０ｍＭヒスチジンであり、及びｐＨが５．０であり、充填剤が２．５％ｗ／ｖマニトールであり、及び安定化剤が３．５％ｗ／ｖスクロースである先述の組成物が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表３１に記載されている配列を含む先述の組成物が提供される。本発明のさらに別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が３０ｍｇ／ｍＬである先述の組成物が提供される。
本発明の別の実施形態において、組成物が、ａ）１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ４．７、４％マニトール及び２％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０あり及びなし、ｂ）１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５、４％マニトール及び２％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０あり及びなし、ｃ）１０ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、４％マニトール及び２％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０あり及びなし、ｄ）１０ｍＭサクシナート、ｐＨ４．５、４％マニトール及び２％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０、ｅ）１０ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、９％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０、ｆ）１０ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、４％マニトール、２％スクロース、１％ヒドロキシエチルデンプン、０．００４％ポリソルベート−２０、ｇ）５ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、２％マニトール、１％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０並びにｈ）１０ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、４％マニトール、２％トレハロース、０．００４％ポリソルベート−２０からなる群から選択される先述の組成物が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表２１から２４に記載されている配列を含む先述の組成物が提供される。さらに別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が１、３０、８５及び１００ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される先述の組成物が提供される。
本発明は、本発明の凍結乾燥された治療用ペプチボディを作製する方法も想定する。一実施形態において、本発明は、凍結乾燥された治療用ペプチボディを作製するための方法であり、ａ）緩衝剤、充填剤、安定化剤及び場合によって界面活性剤の溶液を調製する工程と（前記緩衝剤は、約５ｍＭから約２０ｍＭの範囲のｐＨ緩衝剤から構成され、及びｐＨは約３．０から約８．０の範囲であり、前記充填剤は約２．５％から約４％ｗ／ｖの濃度であり、前記安定化剤は約０．１％から約５％ｗ／ｖの濃度であり、前記界面活性剤は約０．００４％から約０．４％ｗ／ｖの濃度である。）及びｂ）前記治療用ペプチボディを凍結乾燥させる工程とを含み、前記治療用ペプチボディは、式Ｉ
式Ｉ：［（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（式中：
Ｆ１は、Ｆｃドメインであり、
Ｘ１は、
Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−
Ｐ２−（Ｌ３）ｆ−Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−
Ｐ３−（Ｌ４）ｇ−Ｐ２−（Ｌ３）ｆ−Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−及び
Ｐ４−（Ｌ５）ｈ−Ｐ３−（Ｌ４）ｇ−Ｐ２−（Ｌ３）ｆ−Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−
から選択され、
Ｘ２は、
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１、
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１−（Ｌ３）ｆ−Ｐ２、
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１−（Ｌ３）ｆ−Ｐ２−（Ｌ４）ｇ−Ｐ３及び
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１−（Ｌ３）ｆ−Ｐ２−（Ｌ４）ｇ−Ｐ３−（Ｌ５）ｈ−Ｐ４
から選択され、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立に、薬理学的に活性なペプチドの配列であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、各々独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立に、０又は１であり、
但し、ａ及びｂの少なくとも１つは１であり、
ｄは、０、１又は１より大きく、並びに
ＷＳＰは、その結合がＦ１中の何れかの反応性部分において実施される水溶性ポリマーである。）
で表される構造を含む、前記方法を提供する。
別の実施形態において、治療用ペプチボディが式ＩＩ
式ＩＩ：［Ｘ１−Ｆ１］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（ＦｃドメインはＸ１のＣ末端に付着されており、及び０、１又はそれ以上のＷＳＰは、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
で表される構造を含む、先述の方法が提供される。
別の実施形態において、治療用ペプチボディが式ＩＩＩ
式ＩＩＩ：［Ｆ１−Ｘ２］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（ＦｃドメインはＸ２のＮ末端に付着されており、及び０、１又はそれ以上のＷＳＰは、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
で表される構造を含む、先述の方法が提供される。
別の実施形態において、治療用ペプチボディが式ＩＶ
式ＩＶ：［Ｆ１−（Ｌ１）ｅ−Ｐ１］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（Ｆｃドメインは、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１のＮ末端に付着されており、及び０、１又はそれ以上のＷＳＰは、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
で表される構造を含む、先述の方法が提供される。
別の実施形態において、治療用ペプチボディが式Ｖ
式Ｖ：［Ｆ１−（Ｌ１）ｅ−Ｐ１−（Ｌ２）ｆ−Ｐ２］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（Ｆｃドメインは、−Ｌ１−Ｐ１−Ｌ２−Ｐ２のＮ末端に付着されており、及び０、１又はそれ以上のＷＳＰが、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
で表される構造を含む、先述の方法が提供される。
別の実施形態において、治療用ペプチボディが多量体又は二量体である先述の方法が提供される。別の実施形態において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及び／又はＰ４は、表４から３８の何れか１つに記載されているペプチドから独立に選択される。別の実施形態において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及び／又はＰ４が同一のアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、Ｆｃドメインは配列番号１に記載されている。別の実施形態において、ＷＳＰはＰＥＧである。別の実施形態において、Ｆｃドメインは配列番号１に記載されており、及びＷＳＰはＰＥＧである。別の実施形態において、ＰＥＧは約２ｋＤａと１００ｋＤａの間又は約６ｋＤａと２５ｋＤａの間の分子量を有する。別の実施形態において、組成物が少なくとも５０％、７５％、８５％、９０％又は９５％のＰＥＧ化された治療用ペプチボディを含む先述の方法が提供される。
別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤が、グリシン、ヒスチジン、グルタメート、サクシナート、ホスファート、アセタート及びアスパルタートからなる群から選択される先述の方法が提供される。別の実施形態において、充填剤が、マニトール、グリシン、スクロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ラクトース、ソルビトール、トレハロース又はキシリトールからなる群から選択される先述の方法が提供される。別の実施形態において、安定化剤がスクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、マニトール、ソルビトール、グリシン、アルギニン塩酸塩、デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、シクロデキストリン、Ｎ−メチルピロリデン、セルロース及びヒアルロン酸などの多糖を含むポリヒドロキシ化合物、塩化ナトリウムからなる群から選択される先述の方法が提供される。
別の実施形態において、界面活性剤が、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ジオクチルスルホン酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム一水和物、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３−１０、ＳＢ３−１２、ジギトニン、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、４０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート２０、４０、６０、６５及び８０、大豆レシチン、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ及びＤＯＰＧ、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される先述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が約０．２５ｍｇ／ｍＬと２５０ｍｇ／ｍＬの間にある先述の方法が提供される。
別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤が１０ｍＭヒスチジンであり、及びｐＨが５．０であり、充填剤が４％ｗ／ｖマニトールであり、安定化剤が２％ｗ／ｖスクロースであり、並びに界面活性剤が０．００４％ｗ／ｖポリソルベート−２０である先述の方法が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表６に記載されている配列を含む先述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が０．５ｍｇ／ｍＬである先述の方法が提供される。
別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤が１０ｍＭヒスチジンであり、及びｐＨが７．０であり、充填剤が４％ｗ／ｖマニトールであり、安定化剤が２％ｗ／ｖスクロースであり、並びに界面活性剤が０．０１％ｗ／ｖポリソルベート−２０である先述の方法が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表３２に記載されている配列を含む先述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が３０ｍｇ／ｍＬである先述の方法が提供される。
別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤が２０ｍＭヒスチジンであり、及びｐＨが５．０であり、充填剤が３．３％ｗ／ｖマニトールであり、安定化剤が２％ｗ／ｖスクロースであり、並びに界面活性剤が０．０１％ｗ／ｖポリソルベート−２０である先述の方法が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表４に記載されている配列を含む先述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が１００ｍｇ／ｍＬである先述の方法が提供される。
別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤が１０ｍＭヒスチジンであり、及びｐＨが５．０であり、充填剤が２．５％ｗ／ｖマニトールであり、及び安定化剤が３．５％ｗ／ｖスクロースである先述の方法が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表３１に記載されている配列を含む先述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が３０ｍｇ／ｍＬである先述の方法が提供される。
本発明の別の実施形態において、組成物が、ａ）１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ４．７、４％マニトール及び２％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０あり及びなし、ｂ）１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５、４％マニトール及び２％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０あり及びなし、ｃ）１０ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、４％マニトール及び２％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０あり及びなし、ｄ）１０ｍＭサクシナート、ｐＨ４．５、４％マニトール及び２％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０、ｅ）１０ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、９％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０、ｆ）１０ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、４％マニトール、２％スクロース、１％ヒドロキシエチルデンプン、０．００４％ポリソルベート−２０、ｇ）５ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、２％マニトール、１％スクロース、０．００４％ポリソルベート−２０及びｈ）１０ｍＭグルタメート、ｐＨ４．５、４％マニトール、２％トレハロース、０．００４％ポリソルベート−２０からなる群から選択される先述の方法が提供される。別の実施形態において、Ｐ１が表２１から２４に記載されている配列を含む先述の方法が提供される。さらに別の実施形態において、治療用ペプチボディ濃度が１、３０、８５及び１００ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される先述の方法が提供される。
別の実施形態において、凍結乾燥の前に、ｂ）溶液のｐＨを、約４．０と約８．０の間のｐＨに調整する工程と、ｃ）前記治療用ペプチボディを含有する溶液を調製する工程と、ｄ）工程（ｃ）の溶液を工程（ｂ）の溶液に緩衝液交換する工程と、ｅ）界面活性剤の適切な量を添加する工程と、及びｆ）工程（ｅ）から得られた混合物を凍結乾燥する工程とをさらに含む先述の方法が提供される。
別の実施形態において、ａ）先述の治療用ペプチボディ組成物を凍結乾燥する工程と、及びｂ）前記凍結乾燥された治療用ペプチボディ組成物を再構成する工程とを含む、再構成された治療用ペプチボディ組成物を調製するための先述の方法が提供される。
別の実施形態において、先述の凍結乾燥された治療用ペプチボディ組成物を有する第一の容器及び凍結乾燥された組成物用の生理的に許容される溶媒を有する第二の容器を含む、水性医薬組成物を調製するためのキットが提供される。
発明の詳細な説明
用語の定義
ペプチド化合物に関連する「含む」という用語は、化合物が、所定の配列のアミノ又はカルボキシ末端の一方又は両方の上に追加のアミノ酸を含み得ることを意味する。もちろん、これらの追加のアミノ酸は、化合物の活性を著しく妨害すべきでない。本発明の組成物に関する「含む」という用語は、組成物がさらなる成分を含み得ることを意味する。これらのさらなる成分は、組成物の活性を著しく妨害すべきでない。
「ペプチボディ」という用語は、ペプチド部分が所望の標的に特異的に結合する、抗体のＦｃドメインなどの他の分子に直接又は間接的に融合されたペプチドを含む分子を表す。ペプチドは、Ｆｃ領域に融合され、又は修飾されたＦｃ分子であるＦｃループ中に挿入され得る。Ｆｃループは、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開ＵＳ２００６／０１４０９３４に記載されている。本発明には、Ｆｃドメインの（好ましくはループ領域中の）内部配列としてペプチドを含むように修飾されたＦｃドメインを含むこのような分子が含まれる。Ｆｃ内部ペプチド分子は、特定の内部領域中に、２以上のペプチド配列を直列で含み得、他の内部領域中にさらなるペプチドを含み得る。ループ領域の候補が例示されている場合、Ｆｃの他の何れの非末端ドメイン中の挿入も、本発明の一部と考えられる。「ペプチボディ」という用語は、Ｆｃ融合タンパク質（例えば、Ｆｃドメインに融合された完全長タンパク質）を含まない。
「ビヒクル」という用語は、分解を抑制し、及び／又は半減期を増加させ、毒性を低下し、免疫原性を低下し、又は治療用タンパク質の生物学的活性を増加させる分子を表す。典型的なビヒクルには、１９９５年６月２７日にＣａｐｏｎらに付与された米国特許第５，４２８，１３０号に記載されているようにＦｃドメインが含まれる。
「天然のＦｃ」という用語は、単量体形態であれ、又は多量体形態であれ、完全な抗体の消化から得られる非抗原結合断片の配列を含む分子又は配列を表す。典型的には、天然のＦｃはＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。天然のＦｃの元の免疫グロブリン源は、一態様において、ヒト起源であり、免疫グロブリンの何れでもあり得る。天然のＦｃは、共有会合（すなわち、ジスルフィド結合）、非共有会合又は両方の組み合わせによって、二量体又は単量体形態中に連結され得る単量体ポリペプチドである。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１から４の範囲である。天然のＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合された二量体である。Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：４０７１−９。本明細書において使用される「天然のＦｃ」という用語は、単量体、二量体及び多量体形態の総称である。
「Ｆｃバリアント」という用語は、天然のＦｃから修飾されているが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎに対する結合部位をなお含む分子又は配列を表す。国際出願ＷＯ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日公開）及びＷＯ９６／３２４７８は、典型的なＦｃバリアント及びサルベージ受容体との相互作用を記載しており、参照により、本明細書に組み込まれる。一態様において、「Ｆｃバリアント」という用語には、ヒト以外の天然のＦｃからヒト化された分子又は配列が含まれる。別の態様において、除去され得る部位は本発明の融合分子に対して必要とされない構造的特徴又は生物学的活性を与えるので、天然のＦｃは、除去され得る部位を含む。従って、「Ｆｃバリアント」という用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との非適合性、（３）選択された宿主細胞中で発現された際のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与え、又はこれらに関与する１つ又はそれ以上の天然のＦｃ部位又は残基を欠如する分子又は配列を含む。Ｆｃバリアントは、以下でさらに詳しく記載されている。
「Ｆｃドメイン」という用語は、上記定義の天然のＦｃ及びＦｃバリアント分子及び配列を包含する。Ｆｃバリアント及び天然のＦｃにおけるごとく、「Ｆｃドメイン」という用語には、完全な抗体から消化されたものであれ、又はその他の手段によって産生されたものであれ、単量体又は多量体形態の分子が含まれる。一実施形態において、例えば、Ｆｃ領域は、以下のとおりであり得る。
Figure 0005873854
さらなるＦｃ配列が本分野において公知であり、本発明での使用が想定される。例えば、ＦｃＩｇＧ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８５７）、ＦｃＩｇＧ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８５７）、ＦｃＩｇＧ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８６０）、ＦｃＩｇＧ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８６１）、ＦｃＩｇＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８７６）、ＦｃＩｇＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８７７）、ＦｃＩｇＤ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８８０）、ＦｃＩｇＭ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８７１）及びＦｃＩｇＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８５４）が、本明細書における使用に関して想定される幾つかのさらなるＦｃ配列である。
場合によって、（例えば、細菌中で発現される場合には）Ｎ末端アミノ酸配列が上記配列に付加され得る。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に対して適用される「多量体」という用語は、共有的に、非共有的に、又は共有的相互作用及び非共有的相互作用の両者によって会合された２つ又はそれ以上のポリペプチド鎖を有する分子を表す。ＩｇＧ分子は、典型的には、二量体を形成し、ＩｇＭは五量体、ＩｇＤは二量体及びＩｇＡは単量体、二量体、三量体又は四量体を形成する。多量体は、Ｆｃの天然Ｉｇ源の配列若しくは生じた活性を調べることによって、又はこのような天然のＦｃを誘導体化（以下に定義されている。）することによって形成され得る。
「誘導体化する」、「誘導体」又は「誘導体化された」という用語は、例えば、限定されるものではないが、（１）化合物が、環状部分、例えば、化合物内のシステイン残基間の架橋を有する；（２）化合物が架橋され、又は架橋部位を有する、例えば、化合物がシステイン残基を有し、従って、培養若しくはインビボにおいて架橋された二量体を形成する；（３）非ペプチド結合によって、１つ又はそれ以上のペプチド結合が置換されている；（４）Ｎ末端が、−ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基又は置換された若しくは置換されていないベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（Ｒ及びＲ１及び環置換基は、以下で定義されているとおりである。）；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２又は−ＮＲ３Ｒ４によって置換されている（Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、以下に定義されているとおりである。）；並びに（６）選択された側鎖又は末端残基と反応することができる因子での処理を通じて、各アミノ酸部分が修飾されている化合物、プロセス及び生じた化合物を意味する。誘導体は、さらに、以下に記載されている。
本明細書において使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結された、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００又はそれ以上のアミノ酸の分子を表す。ペプチドは、典型的には、ランダムコイルなどのランダムな及び／又は柔軟な立体構造を含有し、典型的には、通例、二次及び三次構造を介して、より大きなタンパク質／ポリペプチド中に観察されるものなどの安定な立体構造を欠如する。具体的な実施形態において、約３−９０、３−８０、３−７０、３−６０、３−５０；５−９０、５−８０、５−７０、５−６０、５−５０、５−４０、５−３０；１０−９０、１０−８０、１０−７０、１０− ６０、１０−５０、１０−４０、１０−３０、１０−２０アミノ酸長など、ペプチドの多数のサイズ範囲が本明細書において想定される。さらなる実施形態において、本明細書において使用されるペプチドは、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０又は２０アミノ酸長以下である。典型的なペプチドは、ペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）中に担持され、化学合成によって作製される、タンパク質の消化によって得られる、又は組み換えＤＮＡ技術を用いて作製されるなど、本明細書に記載されている方法の何れによっても作製され得る。ペプチドには、精製されたＤ型及びＬ型又はＤ型とＬ型の混合物が含まれる。
さらに、本発明の化合物の生理的に許容される塩も想定される。「生理的に許容される」塩とは、医薬として許容されることが公知であり、又は後に発見されるすべての塩を意味する。幾つかの具体例は、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩化水素酸塩及び臭化水素酸塩などのハロゲン化水素、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩及びシュウ酸塩である。
ペプチド配列を表すために使用される「無作為化された」という用語は、（例えば、ファーディスプレイ法によって選択された）完全に無作為な配列及び天然に存在する分子の１つ又はそれ以上の残基が、天然に存在する分子中の位置に出現しないアミノ酸残基によって置換された配列を表す。ペプチド配列を同定するための典型的な方法には、ファージディスプレイ、イー．コリディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母を基礎としたスクリーニング、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング、合理的設計、タンパク質構造分析などが含まれる。
「薬理学的に活性な」という用語は、このようにして記載された物質が、医学的パラメータ（例えば、血圧、血液細胞数、コレステロールレベル（但し、これらに限定されない。））又は病状（例えば、癌、自己免疫疾患（但し、これらに限定されない。））に影響を与える活性を有することが決定される。従って、薬理学的に活性なペプチドは、以下に定義されている、アゴニストペプチド又は模倣的ペプチド及びアンタゴニストペプチドを含む。
「模倣ペプチド」及び「アゴニストペプチド」という用語は、対象のタンパク質と相互作用するタンパク質（例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ及び本明細書に記載されている他のタンパク質（但し、これらに限定されない。））と同等の生物学的活性を有するペプチドを表す。さらに、これらの用語には、対象タンパク質の天然リガンドの効果を強化することによるなど、対象タンパク質の活性を間接的に模倣するペプチドが含まれる。例えば、表２及び７に列記されているＧ−ＣＳＦ模倣ペプチドを参照されたい。例として、「ＥＰＯ模倣ペプチド」という用語は、ＥＰＯ模倣材料を有するとして特定された、「Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：４５８−６３，Ｎａｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：７５６９−７４」又は表２中の他の全ての参考文献に記載されているように同定又は誘導され得る全てのペプチドを含む。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて、開示された手順を踏むことによって、参考文献中に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
別の例として、「ＴＰＯ模倣ペプチド」又は「ＴＭＰ」という用語は、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１６９６−９、米国特許第５，８６９，４５１号及び米国特許第５，９３２，９４６号並びにＴＰＯ模倣材料を有するとして同定された表２中の他の何れかの参考文献並びに２０００年５月４日に公開された国際出願ＷＯ００／２４７７０（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているように同定又は誘導され得るペプチドを表す。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて、開示された手順を踏むことによって、参考文献中に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
別の例として、「Ｇ−ＣＳＦ模倣ペプチド」という用語は、Ｇ−ＣＳＦ模倣物材料を有するとして同定された、Ｐａｕｋｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｈｏｐｐｅ−Ｓｃｙｌｅｒｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６５：３０３−１１又は表２中の参考文献の何れかの中で同定又は記載され得る全てのペプチドを表す。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて、開示された手順を踏むことによって、参考文献中に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
「ＣＴＬＡ４模倣ペプチド」という用語は、「Ｆｕｋｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：２６７−７０」に記載されているように、同定又は誘導され得るあらゆるペプチドを表す。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて、開示された手順を踏むことによって、参考文献中に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
「アンタゴニストペプチド」又は「阻害剤ペプチド」という用語は、対象の会合されたタンパク質の生物活性を遮断し、若しくは何らかの方法で妨害するペプチド、又は対象の会合されたタンパク質の公知のアンタゴニスト若しくは阻害剤と同等の生物活性を有するペプチドを表す。従って、「ＴＮＦアンタゴニストペプチド」という用語は、ＴＮＦアンタゴニスト材料を有するとして同定された、「Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１２６６−７０」又は表２中の参考文献の何れかに記載されているように同定又は誘導され得るペプチドを含む。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて、開示された手順を踏むことによって、参考文献中に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
「ＩＬ−１アンタゴニスト」及び「ＩＬ−１ｒａ模倣ペプチド」という用語は、ＩＬ−１によるＩＬ−１受容体の活性化を阻害又は下方制御するペプチドを表す。ＩＬ−１受容体の活性化は、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体及びＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質間の複合体の形成から生じる。ＩＬ−１アンタゴニスト又はＩＬ−１ｒａ模倣ペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体又はＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質に結合し、及び複合体の２つ又は３つの何れかの成分間の複合体形成を妨害する。典型的なＩＬ−１アンタゴニスト又はＩＬ−１ｒａ模倣ペプチドは、ＩＬ−１ｒａ模倣性又はＩＬ−１拮抗性材料を有するとして同定された、米国特許第５，６０８，０３５号；同第５，７８６，３３１号、同第５，８８０，０９６号又は表２中の参考文献の何れかに記載されているように同定又は誘導することができる。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて、開示された手順を踏むことによって、参考文献中に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
「ＶＥＧＦアンタゴニストペプチド」という用語は、ＶＥＧＦ拮抗性材料を有するとして同定された、「Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ（１９９８），ＢｉｏＣｈｅｍ．３７：１７７５４−６４）及び表２中の参考文献の何れかに記載されているように同定又は誘導され得るペプチドを表す。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて、開示された手順を踏むことによって、参考文献中に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
「ＭＭＰ阻害剤トペプチド」という用語は、ＭＭＰ阻害性材料を有するとして同定された、「Ｋｏｉｖｕｎｅｎ（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：７６８−７４」及び表２中の参考文献の何れかに記載されているように同定又は誘導され得るペプチドを表す。これらの参考文献の各々は、様々なペプチドライブラリーを用いて、開示された手順を踏むことによって、参考文献中に実際に開示されているペプチドとは異なるペプチドを選択可能とすることを、当業者は理解する。
「ミオスタチン阻害剤トペプチド」という用語は、例えば、ｐＭＡＲＥＣ２Ｃ１２細胞をベースとしたミオスタチン活性アッセイなどのインビトロアッセイで示されるように、又は米国特許出願公開ＵＳ２００４０１８１０３３Ａ１及びＰＣＴ出願公開ＷＯ２００４／０５８９８８に記載されているインビボ動物検査によって示されるように、ミオスタチン活性又はシグナル伝達を低下又は遮断する能力によって同定され得るペプチドを表す。典型的なミオスタチン阻害剤ペプチドは、表２１から２４に記載されている。
「インテグリン／接着アンタゴニスト」という用語は、インテグリン、セレクチン、細胞接着分子、インテグリン受容体、セレクチン受容体又は細胞接着分子受容体の活性を阻害又は下方制御するペプチドを表す。典型的なインテグリン／接着アンタゴニストには、ラミニン、エキスタチン、表２５から２８に記載されているペプチドが含まれる。
「骨吸収阻害剤」という用語は、ＷＯ９７／２３６１４（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）の実施例４及び１１のアッセイによって決定されるこのような分子を表す。典型的な骨吸収阻害剤には、それぞれ、ＷＯ９７／２３６１４及びＷＯ９８／４６７５１（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているＯＰＧ及びＯＰＧ−Ｌ抗体が含まれる。
「神経増殖因子阻害剤」又は「神経増殖因子アゴニスト」という用語は、神経増殖因子（ＮＧＦ）に結合し、ＮＧＦ活性又はシグナル伝達を阻害するペプチドを表す。この種類の典型的なペプチドは、表２９に記載されている。
「ＴＡＬＬ−１調節ドメイン」という用語は、ＴＡＬＬ−１に結合する全てのアミノ酸配列を表し、天然に存在する配列又はランダム化された配列を含む。典型的なＴＡＬＬ−１調節ドメインは、ファージディスプレイ又は本明細書に挙げられている他の方法によって、同定又は誘導することができる。この種類の典型的なペプチドは、表３０及び３１に記載されている。
「ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト」という用語は、ＴＡＬＬ−１に結合し、完全長の天然のＴＡＬＬ−１による１つ又はそれ以上のアッセイパラメータに対する効果とは反対方向に、１つ又はそれ以上のアッセイパラメータを増加又は減少させる分子を表す。このような活性は、例えば、２０００年８月１７日に公開された「ＴＮＦ−ＲＥＬＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ」という名称の特許出願ＷＯ００／４７７４０の材料と方法の部に「ＡＧＰ−３の生物活性」という副題で記載されているようなアッセイによって測定することができる。
「Ａｎｇ−２アンタゴニストペプチド」という用語は、Ａｎｇ−２拮抗性特性を有すると同定され又は誘導され得るペプチドを表す。この種類の典型的なペプチドは、表３２から３８に記載されている。
「ＷＳＰ」という用語は、水溶性ポリマーが付着しているペプチド、タンパク質又は他の化合物が、例えば、生理的環境などの水性環境中で沈殿するのを防ぐ水溶性ポリマーを表す。本発明によって想定される様々なＷＳＰの実施形態のさらに詳しい記載は、以下のとおりである。
凍結乾燥及び投与
治療用ペプチボディは、本明細書に記載されているヒト疾病を治療するための医薬製剤において有用である。一実施形態において、治療用ペプチボディ組成物は凍結乾燥される。凍結乾燥は本分野において一般的な技術を用いて実施され、開発されている組成物に対して最適化されるべきである［Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２１ ：１９１−２００，（２００４）及びＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１３：２４３−９（１９９６）］。
凍結乾燥サイクルは、一態様において、凍結、一次乾燥及び二次乾燥という３つの工程から構成される［Ａ．Ｐ．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓｅｒ Ｂ，Ｂｉｏｌ ２７８：１６７（１９７７）］。凍結工程において、氷形成を開始するために、溶液は冷却される。さらに、この工程は、充填剤の結晶化を誘導する。氷は、一次乾燥段階において昇華し、一次乾燥段階は、真空を用いて氷の蒸気圧未満にチャンバー圧を低下させ、昇華を促進するために熱を導入することによって実施される。最後に、吸着された又は結合された水が、低下したチャンバー圧下及び上昇した保存温度での二次乾燥段階において除去される。本工程は、凍結乾燥されたケーキとして知られる物質を生成する。その後、無菌水又は適切な注射用希釈剤の何れかを用いて、ケーキを再構成することができる。
凍結乾燥サイクルは、賦形剤の最終的な物理的状態を決定するのみならず、再構成時間、外観、安定性及び最終的な水分含量などの他のパラメータにも影響を与える。凍結乾燥された状態の組成物構造は、特定の温度で起こる幾つかの遷移（例えば、ガラス遷移、湿潤及び結晶化）を通じて進行し、凍結乾燥工程を理解し、最適化するために使用することができる。ガラス遷移温度（Ｔｇ及び／又はＴｇ’）は、溶質の物理的状態についての情報を提供し、示差操作熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定することができる。Ｔｇ及びＴｇ’は、凍結乾燥サイクルを設計するときに考慮しなければならない重要なパラメータである。例えば、Ｔｇ’は、一次乾燥にとって重要である。さらに、乾燥された状態では、ガラス遷移温度は、最終産物の保存温度に関する情報を与える。
賦形剤全般
賦形剤とは、薬品の安定性、送達及び製造の容易さを付与又は増強するので、製剤中に含められる添加物である。賦形剤を含める理由の如何を問わず、賦形剤は、薬品と一体を成す成分であり、従って、安全であり、患者によって良好に耐容される必要がある。賦形剤は薬物の効力及び免疫原性の両方に影響を与え得るので、タンパク質薬物に関しては、賦形剤の選択は特に重要である。従って、タンパク質製剤は、適切な安定性、安全性及び市場性を与える賦形剤の適切な選択を用いて開発する必要がある。
凍結乾燥された製剤は、通常、緩衝剤、充填剤及び安定化剤から構成される。凍結乾燥工程中又は再構成中の凝集が問題になる場合に、界面活性剤の有用性を評価及び選択し得る。適切な緩衝剤は、凍結乾燥中にｐＨの適切な帯域内に製剤を維持するために含められる。液体及び凍結乾燥されたタンパク質製剤中の賦形剤成分の比較が、表Ａ中に提供されている。
Figure 0005873854
治療用タンパク質用の製剤を開発する上での主な困難は、製造、運搬及び保存の負荷に対して製品を安定化することである。製剤賦形剤の役割は、これらの負荷に対する安定化を与えることである。賦形剤は、高濃度タンパク質製剤の粘度を低下させて、それらの送達を可能として、患者の利便性を増強させるためにも使用され得る。一般に、賦形剤は、様々な化学的及び物理的負荷に対してタンパク質を安定化させる機序に基づいて分類することができる。幾つかの賦形剤は、特定の負荷の効果を軽減するために、又は特定のタンパク質の特定の感受性を制御するために使用される。他の賦形剤は、タンパク質の物理的及び共有的安定性に対してより一般的な効果を有する。本明細書に記載されている賦形剤は、製剤中でのそれらの化学種又はそれらの機能的役割の何れかによって整理される。各賦形剤種について考察する場合には、安定化の様式の簡潔な記載が提供されている。
本明細書に提供されている教示及び指針が与えられれば、当業者は、生物薬剤の安定性の保持を促進する本発明の生物薬剤製剤を達成するために、賦形剤のどのような量又は範囲をある製剤中に含めることができるかが分かる。例えば、本発明の生物薬剤製剤中に含められるべき塩の量及び種類は、最終溶液の所望される浸透圧（すなわち、等張、低張又は高張）並びに製剤中に含められるべき他の成分の量及び浸透圧に基づいて選択することができる。同様に、製剤中に含められるポリオール又は糖の種類に関する例示によって、このような賦形剤の量はその浸透圧に依存する。
例として、約５％のソルビトールを含めることによって、等張性を達成することができるのに対して、等張性を達成するために、スクロース賦形剤の約９％が必要とされる。本発明の生物薬理学的製剤内に含めることができる１つ又はそれ以上の賦形剤の濃度の量又は範囲の選択は、塩、ポリオール及び糖に対する参照によって、上に例示されている。しかしながら、当業者は、本明細書に記載されており、及び特定の賦形剤への参照によってさらに例示されている濃度は、例えば、塩、アミノ酸、他の等張剤、界面活性剤、安定化剤、充填剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、抗酸化剤、金属イオン、キレート剤及び／又は防腐剤などの賦形剤の全ての種類及び組み合わせに対して等しく適用され得ることを理解する。
さらに、ある賦形剤が、製剤中で、例えば、パーセント（％）ｗ／ｖによって報告されている場合には、当業者は、この賦形剤の等モル濃度も想定されることを認識する。
もちろん、当業者は、先述の賦形剤の濃度が特定の製剤内で相互依存を有することを認識する。例として、充填剤の濃度は、例えば、高いタンパク質／ペプチド濃度が存在する場合、又は、例えば、高い安定化剤濃度が存在する場合には低下させ得る。さらに、当業者は、その中に充填剤が存在しない製剤の等張性を維持するために、安定化剤の濃度がしかるべく（すなわち、安定化剤の「等張化」量が使用される。）調節されることを認識する。他の賦形剤が本分野において公知であり、「Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｉｒ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９８），ＰＤＡＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５２：２３８−３１１」に見出すことができる。
緩衝剤
タンパク質薬物の安定性は、通常、狭いｐＨ範囲内において最大であることが観察される。最適な安定性のこのｐＨ範囲は、前製剤研究中の初期に特定する必要がある。加速された安定性試験及び熱量測定スクリーニング研究などの幾つかのアプローチが、この努力において有用であることが示されている（ＲｅｍｍｅｌｅＲ．Ｌ．Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８（１６）：５２４１−７（１９９９））。製剤が完成したら、薬品は、その保管寿命を通じて、所定の規格内で製造及び維持しなければならない。従って、製剤中のｐＨを調節するために、ほとんど常に緩衝剤が使用される。
有機酸、ホスファート及びＴｒｉｓが、タンパク質製剤中の緩衝剤として一般的に使用されてきた（表Ｂ）。緩衝種の緩衝能はｐＫａに等しいｐＨにおいて最大であり、ｐＨがこの値から増加又は減少するにつれて減少する。緩衝能の９０％がそのｐＫａの１単位内に存在する。緩衝能は、増大する緩衝剤濃度にも比例して増加する。
緩衝剤を選択するときには、幾つかの因子を考慮する必要がある。何よりもまず、緩衝種及びその濃度は、そのｐＫａ及び所望される製剤ｐＨに基づいて規定される必要がある。等しく重要であるのは、緩衝剤は、タンパク質薬、他の製剤賦形剤と適合的であり、分解反応を一切触媒しないことを確保することである。最近、シトラート及びサクシナートなどの多陰イオン性カルボキシラート緩衝剤は、タンパク質の側鎖残基とともに共有結合性付加物を形成することが示されている。検討すべき第三の重要な側面は、緩衝剤が誘導し得る、刺すような痛み及び刺激の感覚である。例えば、シトラートは、注射に際して、刺すような痛みを引き起こすことが知られている（Ｌａｕｒｓｅｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．，９８（２）：２１８−２１（２００６））。刺すような痛み及び刺激の可能性は、製剤が投与時に血中へ迅速に希釈される静脈内経路によって投与された場合より、比較的長期間にわたって、薬物溶液が当該部位に留まる皮下又は筋肉内経路を介して投与される薬物においてより大きくなる。直接的な静脈内注入によって投与される製剤に関しては、緩衝剤（及び他の何れかの製剤成分）の総量をモニターする必要がある。患者に心血管効果を誘導し得るリン酸カリウム緩衝剤の形態で投与されるカリウムイオンについて特に注意を払わなければならない（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．，７３（２）：２８３−９０（２００６））。
凍結乾燥された製剤用の緩衝剤は、さらなる検討を必要とする。リン酸ナトリウムのような幾つかの緩衝剤は、凍結中にタンパク質非晶質相から結晶化し、ｐＨのかなり大きなシフトをもたらし得る。アセタート及びイミダゾールなどの他の一般的な緩衝剤は凍結乾燥工程中に昇華又は蒸発し、これにより、凍結乾燥中に又は再構成後に、製剤のｐＨをシフトさせ得るので、これらは避けるべきである。
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組成物中に存在する緩衝系は、生理学的に適合性があるように、並びに再構成された溶液中で及び凍結乾燥前の溶液中で所望のｐＨを維持するように選択される。一実施形態において、凍結乾燥前の溶液のｐＨは、ｐＨ２．０とｐＨ１２．０の間である。例えば、一実施形態において、凍結乾燥前の溶液のｐＨは、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、４．０、４．３、４．５、４．７、５．０、５．３、５．５、５．７、６．０、６．３、６．５、６．７、７．０、７．３、７．５、７．７、８．０、８．３、８．５、８．７、９．０、９．３、９．５，９．７、１０．０、１０．３、１０．５、１０．７、１１．０、１１．３、１１．５、１１．７又は１２．０である。別の実施形態において、再構成された溶液のｐＨは、４．５と９．０の間である。一実施形態において、再構成された溶液中のｐＨは、４．５、４．７、５．０、５．３、５．５、５．７、６．０、６．３、６．５、６．７、７．０、７．３、７．５、７．７、８．０、８．３、８．５、８．７又は９．０である。
一実施形態において、製剤中で使用されるｐＨ緩衝剤は、アミノ酸又はアミノ酸の混合物である。一態様において、ｐＨ緩衝剤はヒスチジン又はその一つがヒスチジンであるアミノ酸の混合物である。
ｐＨ緩衝化合物は、製剤のｐＨを所定のレベルに維持するのに適した何れの量でも存在し得る。一実施形態において、ｐＨ緩衝剤がアミノ酸である場合、アミノ酸の濃度は、０．１ｍＭと１０００ｍＭ（１Ｍ）の間である。一実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、少なくとも０．１、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、７００又は９００ｍＭである。別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤の濃度は、１、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０ｍＭ及び１００ｍＭである。さらに別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤の濃度は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０又は４０ｍＭ及び５０ｍＭである。さらに別の実施形態において、ｐＨ緩衝剤の濃度は１０ｍＭである。
本明細書に記載されている製剤を緩衝化するために使用される他の典型的なｐＨ緩衝剤には、グリシン、ヒスチジン、グルタメート、サクシナート、ホスファート、アセタート及びアスパルタートが含まれるが、これらに限定されない。
安定化剤及び充填剤
充填剤は、典型的には、製品の上品さを増強させ、噴出を抑制するために、凍結乾燥された製剤中で使用される。製剤中の状態は、一般に、（凍結又はＴｇを上回る徐冷の間に）凍結した非晶質相から充填剤が結晶化し、ケーキ構造及び原体を与えるように設計される。マニトール及びグリシンは、一般的に使用される充填剤の例である。
安定化剤には、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤及びガラス形成剤としての役割を果たすことができる化合物のクラスが含まれる。凍結保護剤は、凍結中の又は低温で凍結された状態のタンパク質を安定化させるように作用する（Ｐ．Ｃａｍｅｒｏｎ，ｅｄ．，Ｇｏｏｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，（１９９７））。凍結乾燥保護剤は、凍結乾燥の脱水段階中にタンパク質の原型状態様立体構造特性を保持することによって、凍結乾燥された固体剤形のタンパク質を安定化させる。ガラス状状態の特性は、温度の関数としてのそれらの緩和特性に応じて、「強固」又は「脆弱」として分類されてきた。凍結保護剤、凍結乾燥保護剤及びガラス形成剤は、安定性を与えるために、タンパク質と同じ相に留まることが重要である。糖、ポリマー及びポリオールはこのカテゴリーに属し、時には、３つの役割を全て果たすことができる。
ポリオールは、糖（例えば、マニトール、スクロース、ソルビトール）及び他の多価アルコール（例えば、グリセロール及びプロピレングリコール）を含む賦形剤のクラスを包含する。ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、このカテゴリーに含まれる。ポリオールは、一般に、液体及び凍結乾燥された非経口タンパク質製剤中で、安定化賦形剤及び／又は等張剤として使用される。ホフマイスター系列に関して、ポリオールはコスモトロピックであり、優先的に、タンパク質表面から排除される。ポリオールは、物理的及び化学的分解経路の両方からタンパク質を保護することができる。優先的に排除された共溶媒は、タンパク質界面における溶媒の有効表面張力を増加させ、エネルギー的に最も好ましいタンパク質立体構造は最も小さな表面積を有する立体構造である。
マニトールは、凍結乾燥中に非晶質タンパク質相から結晶化し、ケーキに構造的安定性を与えるので、凍結乾燥された製剤中の一般的な充填剤である（例えば、Ｌｅｕｋｉｎ（Ｒ）、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）−Ｌｙｏ、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（Ｒ））。マニトールは、一般に、スクロースのような凍結保護剤及び／又は凍結乾燥保護剤と組み合わせて使用される。凍結された条件下で結晶化するマニトールの傾向の故に、ソルビトール及びスクロースは、輸送中に又は製造前に原体を凍結させるときに遭遇する凍結融解から製品を保護するための、液体製造中の好ましい等張化剤／安定化剤である。ソルビトール及びスクロースは、結晶化に対する抵抗性がはるかに大きく、従って、タンパク質から相分離する可能性がより低い。マニトールは、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（Ｒ）、Ｆｏｒｔｅｏ（Ｒ）及びＲｅｂｉｆ（Ｒ）などの幾つかの市販されている液体製剤中において、等張化量で使用されるのに対して、これらの薬物製品ラベルには、「凍結禁止」という注意書きが記載されていることに注目することは興味深い。（遊離のアルデヒド又はケトン基を含有する）グルコース及びラクトースなどの還元糖の使用はタンパク質の表面リジン及びアルギニン残基と反応し、アルデヒドと第一級アミンとのメイラード反応を介して、タンパク質の表面リジン及びアルギニン残基を糖化し得るので、これらの使用は避けるべきである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｈｒｕｎｇ，４６（２）：５８−６３（２００２）；Ｈｕｍｅｎｙ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５０（７）：２１５３−６０（２００２））。スクロースは、酸性条件下で、フルクトースとグルコースへ加水分解し得（Ｋａｕｔｚ Ｃ． Ｆ． ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ａ．Ｌ．，ＪＡＣＳ，５０（４）１０２２−３０（１９２８））、その結果、糖化を引き起こし得る。
ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、２つの異なる温度依存性機序によってタンパク質を安定化させ得る。より低い温度では、ポリエチレングリコールはタンパク質表面から優先的に排除されるが、その両親媒性のために、より高い温度では、タンパク質の折り畳まれていない形態と相互作用することが示されている（ＬｅｅＬ．Ｌ．，ａｎｄ ＬｅｅＪ．Ｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６（２４）：７８１３−９（１９８７））。従って、より低い温度では、ＰＥＧは優先的な排除の機序を介してタンパク質を保護し得るが、より高い温度では、おそらく、折り畳まれていない分子間の生産的衝突の数を低下させることによってタンパク質を保護し得る。ＰＥＧは凍結保護剤でもあり、１．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＥＧ３３５０を使用する組み換え抗血友病因子の凍結乾燥された製剤であるＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（Ｒ）中において使用されてきた。低分子量液体ＰＥＧ（ＰＥＧ３００−６００）には、過酸化物がきょう雑し、タンパク質の酸化が引き起こされ得る。使用されるのであれば、原材料中の過酸化物含量は、その保管寿命を通じて最小化され、調節されなければならない。同じことが、ポリソルベートに当てはまる。
本組成物の特定の実施形態において、凍結乾燥によって誘導された又は保存によって誘導された凝集及び化学的分解を抑制し、又は低下させるために安定化剤（又は安定化剤の組み合わせ）が凍結乾燥製剤に添加される。再構成時のかすんだ又は濁った溶液は、タンパク質が沈殿したことを示す。「安定化剤」という用語は、水性及び固体状態での、凝集又はその他の物理的分解及び化学的分解（例えば、自己分解、脱アミド化、酸化など）を防ぐことができる賦形剤を意味する。医薬組成物中で慣用される安定化剤には、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、マニトール、ソルビトール、グリシン、アルギニン塩酸塩、デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、シクロデキストリン、Ｎ−メチルピロリデン、セルロース及びヒアルロン酸などの多糖を含むポリヒドロキシ化合物、塩化ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ ７４：２２５，（１９９１）］。一実施形態において、安定化剤は、約０％から約４０％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。別の実施形態において、安定化剤は、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０又は４０％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。別の実施形態において、安定化剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９％から約１０％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。さらに別の実施形態において、安定化剤は、約２％から約４％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。さらに別の実施形態において、安定化剤は、約２％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。
所望であれば、凍結乾燥された組成物は、凍結乾燥された「ケーキ」を形成するのに適した充填剤及び浸透圧制御剤の適切な量も含む。充填剤は、結晶性（例えば、マニトール、グリシン）又は非晶質（例えば、スクロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー）の何れかであり得る。他の典型的な充填剤には、ラクトース、ソルビトール、トレハロース又はキシリトールが含まれる。一実施形態において、充填剤はマニトールである。さらなる実施形態において、充填剤は、約０％から約１０％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。別の実施形態において、充填剤は、少なくとも０．２、０．５、０．７、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０又は９．５％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。さらなる実施形態において、機械的に及び医薬的に安定で、上品なケーキを作製するために、約１、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５％から５．０％ｗ／ｖの濃度で。別の実施形態において、マニトール濃度は４％ｗ／ｖである。
界面活性剤
タンパク質分子は、表面と相互作用する高い傾向を有し、空気−液体、容器−液体及び液体−液体（シリコーン油）界面で吸着及び変性を起こしやすい。この分解経路は、タンパク質濃度に逆依存することが観察されており、可溶性及び不溶性のタンパク質凝集物の形成又は表面への吸着を介した溶液からのタンパク質の喪失をもたらす。容器表面吸着に加えて、製品の搬送及び取り扱いの間に経験されるように、表面によって誘導される分解は、物理的な撹拌によって悪化される。
界面活性剤は、表面によって誘導される分解を防ぐために、タンパク質製剤中で一般に使用される。界面活性剤は、界面位置に関してタンパク質に打ち勝つ能力を有する両親媒性の分子である。界面活性剤分子の疎水性部分は界面位置（例えば、空気／液体）を占めるのに、分子の親水性部分はバルク溶媒の方向に配向された状態を保つ。十分な濃度（典型的には、界面活性剤の臨界ミセル濃度付近）において、界面活性剤分子の表面層は、タンパク質分子が界面において吸着するのを防ぐ役割を果たす。これにより、表面によって誘導される分解は最小化される。最も一般的に使用される界面活性剤は、ソルビタンポリエトキシラート、すなわち、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（Ｒ）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））の脂肪酸エステルである。２つは、それぞれ、分子Ｃ−１２及びＣ−１８に、疎水性特性を付与する脂肪族鎖の長さのみが異なる。従って、ポリソルベート−８０は、より界面活性であり、ポリソルベート−２０より低い臨界ミセル濃度を有する。界面活性剤ポロキサマー１８８は、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（Ｒ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）及びＯｖｉｄｒｅｌ（Ｒ）のような幾つかの市販されている液体製品中にも使用されてきた。
界面活性剤は、タンパク質の熱力学的な立体構造的安定性にも影響を与えることができる。この場合にも、所定の賦形剤の効果はタンパク質特異的である。例えば、ポリソルベートは、幾つかのタンパク質の安定性を低下させ、他のタンパク質の安定性を増加させることが示されている。界面活性剤によるタンパク質の不安定化は、部分的に又は完全に折り畳まれていないタンパク質状態との特異的な結合に関与し得る界面活性剤分子の疎水性尾部の観点から合理的に説明することができる。相互作用のこれらの種類は、より拡張されたタンパク質状態（すなわち、結合しているポリソルベートを補充して、タンパク質分子の疎水性部分の露出を増加させる）への立体構造の平衡化のシフトをもたらし得る。あるいは、タンパク質の原型状態が幾つかの疎水性表面を示す場合には、原型状態への界面活性剤の結合はその立体構造を安定化させ得る。
ポリソルベートの別の側面は、それらが、本質的に、酸化的な分解を受けやすいということである。しばしば、原材料として、ポリソルベートは、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な過酸化物の量を含有する。安定化剤の添加から酸化的損傷が発生する可能性があるので、製剤中では、賦形剤の最低有効濃度を使用すべきであるという点が強調される。界面活性剤に関しては、あるタンパク質に対する有効濃度は安定化の機序に依存する。界面活性剤の安定化の機序が表面変性の抑制に関与しているとすれば、有効濃度は界面活性剤の臨界ミセル濃度付近であることが推測される。逆に、安定化の機序が特異的なタンパク質−界面活性剤相互作用と関連しているのであれば、有効界面活性剤濃度はタンパク質濃度及び相互作用の化学量論と関連する（Ｒａｎｄｏｌｐｈ Ｔ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３：１５９−７５（２００２））。
界面活性剤は、凍結及び乾燥の間に、表面に関連する凝集現象を防ぐための適切な量でも添加され得る［Ｃｈａｎｇ，Ｂ，Ｊ． Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：１３２５，（１９９６）］。典型的な界面活性剤には、天然に存在するアミノ酸に由来する界面活性剤などの陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、双性イオン性及び両性界面活性剤が含まれる。陰イオン性界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム及びジオクチルスルホン酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム及びグリコデオキシコール酸ナトリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。陽イオン性界面活性剤には、塩化ベンズアルコニウム又は塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム一水和物及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドが含まれるが、これらに限定されない。双性イオン性界面活性剤には、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３−１０及びＳＢ３−１２が含まれるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤には、ジギトニン、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＴＷＥＥＮ−２０及びＴＷＥＥＮ−８０が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、界面活性剤には、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアラート、ポリオキシエチレン硬化ひまし油１０、４０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ及びＤＯＰＧなどの大豆レシチン及びその他のリン脂質、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース並びにカルボキシメチルセルロースが含まれる。従って、個別に又は異なる比率の混合物としてこれらの界面活性剤を含む組成物がさらに提供される。一実施形態において、界面活性剤は約０％から約５％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。別の実施形態において、界面活性剤は、少なくとも０．００１、０．００２、０．００５、０．００７、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０又は４．５％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。別の実施形態において、界面活性剤は約０．００１％から約０．５％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。さらに別の実施形態において、界面活性剤は約０．００４、０．００５、０．００７、０．０１、０．０５又は０．１％ｗ／ｖから約０．２％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。さらに別の実施形態において、界面活性剤は約０．０１％から約０．１％ｗ／ｖの濃度で取り込まれる。
塩
製剤のイオン強度を増加させるために、しばしば、塩が添加され、これは、タンパク質の溶解度、物理的安定性及び等張性にとって重要であり得る。塩は、様々な様式でタンパク質の物理的安定性に影響を与えることができる。イオンは、タンパク質の表面上の帯電した残基に結合することによって、タンパク質の天然状態を安定化させることができる。あるいは、イオンは、タンパク質骨格に沿ったペプチド基（−ＣＯＮＨ−）に結合することによって、変性された状態を安定化することができる。塩は、タンパク質分子内の残基間の反発性静電的相互作用を遮蔽することによって、タンパク質の原型状態の立体構造を安定化させることもできる。タンパク質製剤中の電解質は、タンパク質の凝集及び不溶性をもたらし得るタンパク質分子間の誘引的な静電的相互作用を遮蔽することもできる。
タンパク質の安定性及び溶解度に対する塩の効果は、イオン種の特徴とともに大幅に変動する。ホフマイスター系列は、電解質がタンパク質を沈殿させる能力に基づいて、電解質に順位付けする方法として、１８８０年代に開始された（Ｃａｃａｃｅ Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．，３０（３）：２４１−２７７（１９９７））。この報告では、ホフマイスター系列は、イオン性及び非イオン性共溶質によるタンパク質安定化効果の規模を表すために使用される。表Ｃでは、安定化（コスモトロピック）から不安定化（カオトロピック）へと、溶液状態のタンパク質に対する共溶質の一般的効果に関連して、共溶質が順番に配置されている。一般的には、陰イオン間の効果の差は、陽イオンに対して観察されるものよりずっと大きく、両種とも、非経口製剤中で許容され得るより高い濃度において、効果が最も明白である。「塩析」と称される方法によって、タンパク質を溶液から沈殿させるために、一般に、コスモトロープの高濃度（例えば、１モル濃度超の硫酸アンモニウム）の高い濃度が使用され、コスモトロープは、タンパク質表面から優先的に排除され、その天然状態の（折り畳まれた）立体構造にあるタンパク質の溶解度を低下させる。塩の除去又は希釈は、タンパク質を溶液に復活させる。「塩溶」という用語は、タンパク質骨格のペプチド結合を溶媒和させることによって、タンパク質の溶解度を増加させる（例えば、グアニジン及び塩化物のような）不安定化イオンを使用することを表す。カオトロープの漸増濃度は、ペプチド鎖の溶解度が増加するにつれて、タンパク質の変性された（折りたたまれていない）状態の立体構造を好む。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な有効性が、ホフマイスター系列中の位置を規定する。
非経口製剤中での等張性を維持するために、一価イオンの組み合わせに対して、塩濃度は、一般に、１５０ｍＭ未満に限定される。この濃度範囲では、塩安定化の機序は、おそらく、静電的な反発性分子内力又は誘因性の分子間力のスクリーニング（デバイ・ヒュッケルスクリーニング）によるものである。興味深いことに、カオトロープ塩は、この機序によって、コスモトロープの類似の濃度より、タンパク質構造を安定化する上でより効果的であることが示されている。カオトロープ陰イオンは、コスモトロープイオンより強く結合すると考えられている。共有性タンパク質分解に関して、デバイ・ヒュッケル理論を通じて、この機序に対するイオン強度の効果は異なることが予想される。従って、塩化ナトリウムによるタンパク質安定化の公表された報告には、塩化ナトリウムが共有性分解を加速したという報告が付随している。塩がタンパク質の安定性に影響を与える機序はタンパク質特異的であり、溶液ｐＨの関数として著しく変動し得る。タンパク質薬の送達を可能とする上で有用であり得る賦形剤の例は、幾つかの高濃度抗体製剤の賦形剤である。最近、このような製剤の粘度を低下させる上で、塩が有効であることが示された（Ｌｉｕ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＰｈａｒｍＳｃｉ．，９４（９）：１９２８−４０（２００５）；Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，９５（１）：２３４−５．（２００６））。
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アミノ酸
アミノ酸には、タンパク質製剤中での緩衝剤、充填剤、可溶化剤及び抗酸化剤として、多様な用途が見出されてきた。ヒスチジン及びグルタミン酸は、それぞれ、５．５から６．５及び４．０から５．５のｐＨ範囲にタンパク質製剤を緩衝化するために使用される。ヒスチジンのイミダゾール基はｐＫａ＝６．０を有し、グルタミン酸側鎖のカルボキシル基は４．３のｐＫａを有するので、これらは、それぞれのｐＨ範囲中での緩衝化に適している。４．０から５．５の酸性ｐＨ範囲で最も一般的に使用される緩衝剤であるアセタートは、凍結乾燥中に昇華し、従って、凍結乾燥された製剤中で使用すべきでない。グルタミン酸は、このような事例において（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎ（Ｒ））、特に有用である。ヒスチジンは、市販されているタンパク質製剤（例えばＸｏｌｉａｒ（Ｒ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（Ｒ））中で一般に見出される。ヒスチジンは、注射時に刺すような痛みを与えることが知られている緩衝剤であるシトラートの優れた代用物である。興味深いことに、液体および凍結乾燥された形態の両者において、高濃度で使用された場合に、ヒスチジンは、凝集に関して、ＡＢＸ−ＩＬ８（ＩｇＧ２抗体）に対して安定化効果を有することも報告されている（Ｃｈｅｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，２０（１２）：１９５２−６０（２００３））。ヒスチジン（最大６０ｍＭ）は、本抗体の高濃度製剤の粘度を低下させることも観察された。しかしながら、同じ研究において、筆者らは、ステンレス鋼容器中での抗体の凍結融解研究の間に、ヒスチジン含有製剤中で、増加した凝集および脱色を観察した。著者らは、これは鋼容器の腐食から浸出した鉄イオンの効果が原因であると考えた。ヒスチジンに関する注意としてさらに挙げられるのは、ヒスチジンは金属イオンの存在下で光酸化を受けるということである（Ｔｏｍｉｔａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８（１２）：５１４９−６０（１９６９））。製剤中で抗酸化剤としてメチオニンを使用することは有望であるように見受けられる。多数の酸化的ストレスに対して効果的であることが観察されている（Ｌａｍ ＸＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，８６（１１）：１２５０−５（１９９７））。
アミノ酸グリシン、プロリン、セリン及びアラニンは、優先的な排除の機構によって、タンパク質を安定化させることが示されている。グリシンも、凍結乾燥された製剤（例えば、Ｎｅｕｍｅｇａ（Ｒ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）、Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（Ｒ））中で一般的に使用される充填剤である。これは、凍結された非晶質相から結晶化して、ケーキ構造および原体を与える。アルギニンは、凝集を阻害する上で有効な因子であることが示されており、液体および凍結乾燥された製剤の両者において使用されてきた（例えば、Ａｃｔｉｖａｓｅ（Ｒ）、Ａｖｏｎｅｘ（Ｒ）、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）液体）。さらに、アルギニンの存在下におけるある種のタンパクの再折り畳みの強化された効率は、アルギニンが再折り畳み中の競合する凝集反応を抑制することによるものであると考えられている。
抗酸化剤
タンパク質残基の酸化は、多数の異なる原因から生じる。特定の抗酸化剤の添加以外に、酸化的なタンパク質の損傷の予防では、大気の酸素、温度、光への曝露及び化学的な汚染など、製造工程及び製品の保存を通じた多数の要因が慎重に調節される。最も一般的に使用される医薬用抗酸化剤は、還元剤、酸素／フリーラジカルスケベンジャー又はキレート剤である。治療用タンパク質製剤中の抗酸化剤は水溶性でなければならず、製品の保存寿命を通じて活性な状態を保たなければならない。還元剤及び酸素／フリーラジカルスカベンジャーは、溶液中の活性酸素種を切断することによって機能する。ＥＤＴＡなどのキレート剤は、フリーラジカルの形成を促進する微量金属きょう雑物を結合することによって効果を発揮し得る。例えば、金属イオンによって触媒されるシステイン残基の酸化を阻害するために、酸性繊維芽細胞増殖因子の液体製剤中でＥＤＴＡが使用された。ＥＤＴＡは、Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ）及びＯｎｔａｋ（Ｒ）のような市販の製品中において使用されてきた。
タンパク質の酸化を抑制する上での様々な賦形剤の有効性を評価することに加えて、製剤学者は、抗酸化剤そのものが、タンパク質に対して、他の共有結合的又は物理的な変化を誘導する可能性に気づくはずである。多数のこのような事例が、文献に報告されている。（グルタチオンのような）還元剤は分子内ジスルフィド結合の破壊を引き起こすことができ、これはジスルフィドのシャフリングをもたらし得る。遷移金属イオンの存在下において、アスコルビン酸及びＥＤＴＡは、多数のタンパク質及びペプチド中でメチオニン酸化を促進することが示されている（Ａｋｅｒｓ ＭＪ，ａｎｄ Ｄｅｆｅｌｉｐｐｉｓ ＭＲ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｖｅｎ Ｆｒｏｋｊａｅｒ，Ｌａｒｓ Ｈｏｖｇａａｒｄ，ｅｄｉｔｏｒｓ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ． Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，ＵＫ（１９９９））；Ｆｒａｎｓｓｏｎ Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６（９）：４０４６−１０５０（１９９７）；Ｙｉｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，２１（１２）：２３７７−８３（２００４））。チオ硫酸ナトリウムは、光及び温度によって誘導されたｒｈｕＭａｂＨＥＲ２中のメチオニン酸化のレベルを低減させることが報告されている。しかしながら、本研究では、チオ硫酸−タンパク質付加物の形成も報告されている（Ｌａｍ ＸＭ，Ｙａｎｇ ＪＹ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８６（１１）：１２５０−５（１９９７））。適切な抗酸化剤の選択は、具体的なストレス及びタンパク質の感受性に従って行われる。
金属イオン
一般に、遷移金属イオンはタンパク質中の物理的及び化学的分解反応を触媒することができるので、タンパク質製剤中において、遷移金属イオンは望ましくない。しかしながら、遷移金属イオンがタンパク質に対する補因子である場合には、製剤中に特定の金属イオンが含められ、特定の金属イオンが配位錯体を形成する場合には、タンパク質の懸濁液製剤（例えば、インシュリンの亜鉛懸濁液）中に含められる。最近、アスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために、マグネシウムイオン（１０から１２０ｍＭ）の使用が提案された（ＷＯ２００４０３９３３７）。
金属イオンがタンパク質に安定性又は増加した活性を付与する２つの例は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼ（ｒｈＤＮａｓｅ、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（Ｒ））及び第ＶＩＩＩ因子である。ｒｈＤＮａｓｅの場合には、Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、特異的な結合部位を通じて、酵素の安定性を増加させた（Ｃｈｅｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，８８（４）：４７７−８２（１９９９））。実際、ＥＧＴＡで溶液からカルシウムイオンを除去することによって、脱アミド化と凝集の増加が引き起こされた。しかしながら、この効果は、Ｃａ２＋イオンを用いた場合にのみ観察された。他の二価の陽イオン（Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２）は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させることが観察された。同様の効果は、第ＶＩＩＩ因子において観察された。Ｃａ＋２及びＳｒ＋２イオンはタンパク質を安定化させたのに対して、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２のような他のイオンは酵素を不安定化させた（Ｆａｔｏｕｒｏｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１５５，１２１−１３１（１９９７）。第ＶＩＩＩ因子を用いた別個の研究において、Ａｌ＋３イオンの存在下で、凝集速度の顕著な増加が観察された（Ｄｅｒｒｉｃｋ ＴＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９３（１０）：２５４９−５７（２００４））。著者は、緩衝剤の塩のような他の賦形剤には、しばしば、Ａｌ＋３イオンがきょう雑していることを指摘しており、製剤化された製品中で、適切な品質の賦形剤を使用することの必要性を例示している。
防腐剤
同じ容器から２回以上の抽出を伴う複数回使用の非経口製剤を開発する場合には、防腐剤が必要である。それらの主な機能は微生物の増殖を阻害することであり、薬品の保存寿命又は使用期間を通じて、製品の無菌性を確保することである。一般に使用されている防腐剤には、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが含まれる。防腐剤は長い使用歴を有しているが、防腐剤を含むタンパク質製剤の開発は困難な課題であり得る。防腐剤は、殆ど常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有しており、これは、複数回投薬タンパク質製剤において防腐剤の使用を制約する主要な原因となっている（Ｒｏｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，９４（２）：３８２−９６（２００５））。
現在まで、多くのタンパク質薬は、単回用途のためにのみ製剤化されてきた。
しかしながら、複数回投薬製剤が可能である場合には、患者の利便性を可能にし、市場価値を高めるというさらなる利点を有する。好例は、防腐された製剤の開発がより便利な複数回使用の注入ペン形態の市販化に結びついたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である。現在、ｈＧＨの防腐された製剤を含有する少なくとも４つのこのようなペン装置が市販されている。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（Ｒ）（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥されている−二重チャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）はフェノールを含有するのに対して、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｒ）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）には、ｍ−クレゾールが調合されている。
防腐された剤形の製剤を開発する際には、幾つかの側面を検討する必要がある。薬品中の有効な防腐剤濃度は最適化しなければならない。これには、タンパク質の安定性を損なわずに抗微生物効果を付与する濃度域を有する剤形で、所定の防腐剤を検査することが必要である。例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて、３つの防腐剤が、インターロイキン−１受容体（Ｉ型）に対する液体製剤の開発において、首尾よくスクリーニングされた。防腐剤は、市販されている製品中で一般に使用されている濃度での安定性に対する影響に基づいて、順位付けされた（Ｒｅｍｍｅｌｅ ＲＬ Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，１５（２）：２００−８（１９９８））。
予想され得るように、防腐剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥された製剤より困難である。凍結乾燥された製品は、防腐剤なしに凍結乾燥し、使用の時点で希釈剤を含有する防腐剤とともに再構成することができる。これは、防腐剤がタンパク質と接触している時間を短縮し、付随する安定性リスクを著しく最小化する。液体製剤を用いる場合、防腐剤の有効性と安定性は、製品の保存寿命（約１８から２４月）全体にわたって維持されなければならない。留意すべき重要な点は、活性な薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤中で、防腐剤の有効性が示されなければならないということである。
幾つかの防腐剤は、注射部位反応を引き起こすことができ、これは、防腐剤を選択する場合に検討する必要がある別の要因である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ中の防腐剤及び緩衝剤の評価に焦点を当てた臨床試験において、ｍ−クレゾールを含有する製剤と比べて、フェノール及びベンジルアルコールを含有する製剤中では、疼痛の知覚がより低いことが観察された（Ｋａｐｐｅｌｇａａｒｄ Ａ．Ｍ．，Ｈｏｒｍ Ｒｅｓ．６２ Ｓｕｐｐｌ ３：９８−１０３（２００４））。興味深いことに、一般的に使用される防腐剤のうち、ベンジルアルコールは麻酔特性を有する（Ｍｉｎｏｇｕｅ ＳＣ，ａｎｄ Ｓｕｎ ＤＡ．，Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ．，１００（３）：６８３−６（２００５））。
本明細書に提供されている教示及び指針が与えられれば、当業者は、生物薬剤の安定性の保持を促進する本発明の生物薬剤製剤を達成するために、賦形剤のどのような量又は範囲をある製剤中に含めることができるかが分かる。例えば、本発明の生物薬剤製剤中に含められるべき塩の量及び種類は、最終溶液の所望される浸透圧（すなわち、等張、低張又は高張）並びに製剤中に含められるべき他の成分の量及び浸透圧に基づいて選択することができる。同様に、製剤中に含められるポリオール又は糖の種類に関する例示によって、このような賦形剤の量はその浸透圧に依存する。
例として、約５％のソルビトールを含めることによって、等張性を達成することができるのに対して、等張性を達成するために、スクロース賦形剤の約９％が必要とされる。本発明の生物薬剤製剤内に含めることができる１つ又はそれ以上の賦形剤の量又は濃度の範囲の選択は、塩、ポリオール及び糖に対する参照によって、上に例示されている。しかしながら、当業者は、本明細書に記載されており、及び特定の賦形剤への参照によってさらに例示されている濃度は、例えば、塩、アミノ酸、他の等張剤、界面活性剤、安定化剤、充填剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、抗酸化剤、金属イオン、キレート剤及び／又は防腐剤などの賦形剤の全ての種類及び組み合わせに対して等しく適用され得ることを理解する。
さらに、ある賦形剤が、製剤中で、例えば、パーセント（％）ｗ／ｖによって報告されている場合には、当業者は、この賦形剤の等モル濃度も想定されることを認識する。
もちろん、当業者は、先述の賦形剤の濃度が特定の製剤内で相互依存を有することを認識する。例として、充填剤の濃度は、例えば、高いタンパク質／ペプチド濃度が存在する場合、又は、例えば、高い安定化剤濃度が存在する場合には低下させ得る。さらに、当業者は、その中に充填剤が存在しない製剤の等張性を維持するために、安定化剤の濃度がしかるべく（すなわち、安定化剤の「等張化」量が使用される。）調節されることを認識する。
組成物は、凍結乾燥された状態において、２℃から８℃で、少なくとも２年間安定である。この長期安定性は、医薬品の保存寿命を延長するために有益である。
調製の方法
さらに、本発明は、治療用タンパク質製剤の調製のための方法を想定する。一態様において、緩衝剤、充填剤、安定化剤及び界面活性剤を含む緩衝液中で、治療用ペプチボディ組成物を凍結乾燥する工程を含む凍結乾燥された治療用ペプチボディ製剤を調製する方法。
本方法は、以下の工程、すなわち、凍結乾燥の前に前記混合物に安定化剤を添加する工程、充填剤、浸透圧制御剤及び界面活性剤から選択される少なくとも１つの因子を、凍結乾燥前に前記混合物に添加する工程の１つ又はそれ以上をさらに含む。充填剤は、本明細書に記載されている何れの充填剤でもあり得る。一態様において、充填剤はマニトールである。別の実施形態において、安定化剤はスクロースである。界面活性剤は、本明細書に記載されている何れの界面活性剤でもあり得る。一実施形態において、界面活性剤はポリソルベート−２０である。
凍結乾燥された物質に対する標準的な再構成手技は、純水又は注射用無菌水（ＷＦＩ）のある容量（典型的には、凍結乾燥中に除去された容量に等しい容量）を添加し直すことであるが、非経口投与用医薬の製造において、抗菌剤の希薄溶液が使用される場合もある［Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１８：１３１１−１３５４（１９９２）］。従って、本発明の凍結乾燥された治療用ペプチボディ組成物に希釈剤を添加する工程を含む、再構成された治療用ペプチボディを調製するための方法が提供される。
凍結乾燥された治療用ペプチボディ組成物は、水溶液として再構成され得る。様々な水性担体（例えば、注射用無菌水）、複数回使用のために防腐剤を加えた水又は界面活性剤（例えば、ポリソルベート−２０）、０．４％生理的食塩水、０．３％グリシンの適切な量を加えた水又は水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合された活性化合物を含有し得る。様々な態様において、このような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアラビアゴムであり；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合産物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドの長鎖脂肪酸アルコールとの縮合産物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなどのエチレンオキシドの脂肪酸由来部分エステル及びヘキシトールとの縮合産物、又はエチレンオキシドの脂肪酸由来部分エステル及びヘキシトール無水物との縮合産物、例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。水性懸濁液は、１つ又はそれ以上の防腐剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル及びｎ−プロピルも含有し得る。
ヒト又は試験動物に組成物を投与するために、一態様において、組成物は、医薬として許容される１つ又はそれ以上の担体を含む。「医薬として」又は「医薬として許容される」という用語は、安定であり、凝集及び切断産物などのタンパク質分解を阻害することに加え、以下に記載されているような、本分野で周知の経路を用いて投与される場合に、アレルギー又はその他の有害な反応を引き起こさない分子体又は組成物を表す。「医薬として許容される担体」には、上に開示されているものを含む、臨床的に有用な全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤がなど含まれる。
治療用ペプチボディ組成物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入スプレーによって、経膣的に、経直腸的に、又は脳内注射によって投与され得る。本明細書において使用される非経口という用語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入技術が含まれる。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、くも膜下内、眼球後方、肺内注射による投与及び／又は特定の部位への外科的埋め込みも想定される。一般に、組成物は、発熱物質及び服用者に対して有害であり得る他の不純物を実質的に含まない。
組成物の単回又は複数回投与は、治療担当医によって選択される投薬レベル及びパターンで実施することができる。疾病の予防又は治療に関して、適切な投薬量は、上述のような治療されるべき疾病の種類、疾病の重度及び期間、薬物が予防又は治療目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴並びに薬物に対する応答並びに担当医の裁量に依存する。
キット
さらなる態様として、本発明には、対象への投与のためにそれらの使用を容易にする様式で包装された、１つ又はそれ以上の凍結乾燥された化合物又は組成物を含むキットが含まれる。一実施形態において、このようなキットは、密閉された瓶又は容器などの入れ物に包装された、本明細書に記載された化合物又は組成物（例えば、治療用タンパク質又はペプチドを含む組成物）を含み、前記入れ物には、前記方法を実施する上での化合物又は組成物の使用を記載するラベルが貼付され、又は前記包装中に同封されている。一実施形態において、キットは、凍結乾燥された治療用タンパク質又はペプチド組成物を有する第一の入れ物と及び凍結乾燥された組成物に対する生理的に許容される再構成溶液を有する第二の入れ物とを含有する。一態様において、化合物又は組成物は、単位剤形で包装されている。キットは、投与の特定の経路に従って組成物を投与するのに適した装置をさらに含み得る。好ましくは、キットは、治療用タンパク質又はペプチド組成物の使用を記載するラベルを含有する。
投薬量
本明細書に記載されている症状を治療する方法に関わる投与計画は、薬物の作用を改変する種々の要因（例えば、患者の年齢、状態、体重、性別及び食事、いずれかの感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的要因）を考慮して担当医により決定される。様々な態様において、一日の投薬計画は、調製物の０．１から１０００μｇ／ｋｇ体重（化学的な修飾なしのタンパク質のみの質量を計算する。）又は０．１から１５０μｇ／ｋｇの範囲にある。本発明の幾つかの実施形態において、投薬量は１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇを超過し得る。
本発明の調製物は、初期大量瞬時投与後に、薬品の治療用循環レベルを維持するための継続的な注入によって投与され得る。別の例として、本発明の化合物は、一回の投薬として投与され得る。当業者は、優良医薬品製造基準及び各患者の臨床症状によって決定される有効投薬量及び投与計画を容易に最適化する。投薬の頻度は、薬剤の薬物動態学的パラメータ及び投与の経路に依存する。最適な医薬製剤は、投与の経路及び所望される投薬量に応じて、当業者によって決定される。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２） ｐａｇｅｓ １４３５−１７１２」（その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。このような製剤は、投与される薬剤の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボクリアランス速度に影響を与え得る。投与の経路に応じて、適切な投薬量は、体重、体表面積又は臓器サイズに従って計算され得る。上記製剤の各々を伴う治療のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる精緻化は、特に、本明細書に開示されている投薬情報及びアッセイ並びに上に論述されているヒト臨床試験中で観察された薬物動態学的データに照らして、過度の実験操作なしに、当業者によって定型的に為される。適切な投薬量は、適切な投薬量−応答データとともに、血液レベル投薬量を測定するための確立されたアッセイの使用を通じて確認され得る。最終の投薬量計画は、薬物の作用を改変する様々な要因（例えば、薬物の具体的な活性、障害の重度及び患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別及び食事、いずれかの感染の重症度、投与時間並びに他の臨床的要因）を考慮して担当医により決定される。研究が実施されるにつれて、様々な疾病及び症状に対する適切な投薬レベル及び治療の期間に関して、さらなる情報が出現する。
化合物の構造
総論
本発明の調製物において、ペプチドは、該ペプチドのＮ末端、該ペプチドのＣ末端又は両方を通じてビヒクルに付着され、生じた構造は、ビヒクル−ペプチド産物中のビヒクル部分に付着されている、共有結合されたＷＳＰでさらに修飾され得る。従って、本発明の治療用ペプチボディ分子は、以下の式Ｉによって記載され得る。
Ｉ ［（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（Ｆ１は、ビヒクルであり、
Ｘ１は、
Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−
Ｐ２−（Ｌ３）ｆ−Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−
Ｐ３−（Ｌ４）ｇ−Ｐ２−（Ｌ３）ｆ−Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−及び
Ｐ４−（Ｌ５）ｈ−Ｐ３−（Ｌ４）ｇ−Ｐ２−（Ｌ３）ｆ−Ｐ１−（Ｌ２）ｅ−
から選択され
Ｘ２は、
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１、
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１−（Ｌ３）ｆ−Ｐ２、
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１−（Ｌ３）ｆ−Ｐ２−（Ｌ４）ｇ−Ｐ３及び
−（Ｌ２）ｅ−Ｐ１−（Ｌ３）ｆ−Ｐ２−（Ｌ４）ｇ−Ｐ３−（Ｌ５）ｈ−Ｐ４
から選択され、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立に、薬理学的に活性なペプチドの配列であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５は、各々独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立に、０又は１であり、
但し、ａ及びｂの少なくとも１つは１であり、
ｄは、０、１又は１より大きく、並びに
ＷＳＰは、その結合がＦ１中の何れかの反応性部分において実施される水溶性ポリマーである。）
従って、化合物Ｉは、式
ＩＩ ［Ｘ１−Ｆ１］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（Ｆ１はＦｃドメインであり、Ｘ１のＣ末端に付着されており、及び１又はそれ以上のＷＳＰが、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
の化合物（その多量体を含む。）；
ＩＩＩ ［Ｆ１−Ｘ２］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（Ｆ１はＦｃドメインであり、Ｘ２のＮ末端に付着されており、及び１又はそれ以上のＷＳＰが、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
の化合物（その多量体を含む。）；
ＩＶ ［Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（Ｆ１はＦｃドメインであり、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１のＮ末端に付着されており、及び１又はそれ以上のＷＳＰが、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
の化合物（その多量体を含む。）；
Ｖ ［Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｆ−Ｐ２］−（Ｌ１）ｃ−ＷＳＰｄ
（Ｆ１はＦｃドメインであり、及び−Ｌ１−Ｐ１−Ｌ２−Ｐ２のＮ末端に付着されており、及び１又はそれ以上のＷＳＰが、場合によってリンカーＬ１を通じて、Ｆｃドメインに付着されている。）
の化合物（その多量体を含む。）を含む。
一実施形態において、Ｆ１はＦｃドメインであり、ペプチドのＮ末端又はＣ末端の何れかに付着されている。関連する実施形態において、Ｆｃは、２（又はそれ以上の）ペプチドが付着されている、本明細書に記載の二量体形態中に連結される。ペプチドは、ホモ二量体（すなわち、同じアミノ酸配列）又はヘテロ二量体（すなわち、同じ標的を結合する又は異なる標的を結合する異なるアミノ酸配列）であり得る。
別の実施形態において、ペプチドを含むＦｃループが提供される。ペプチドを含むＦｃループは、少なくとも１つの生物学的に活性なペプチドが、内部配列として、Ｆｃドメイン中に取り込まれる方法において調製される。このような内部配列は、挿入によって（すなわち、予め存在しているＦｃドメイン中のアミノ酸の間）又は予め存在しているＦｃドメイン中のアミノ酸の置換によって（すなわち、予め存在しているＦｃドメイン中のアミノ酸を除去し、ペプチドアミノ酸を付加する。）付加され得る。後者の場合には、付加されるペプチドアミノ酸の数は、以前に存在したＦｃドメインから除去されるアミノ酸の数と対応する必要はない。例えば、一態様において、１０個のアミノ酸が除去され、及び１５個のアミノ酸が付加されている分子が提供される。提供される薬理学的に活性な化合物は、ａ）目的のタンパク質の活性を調節する少なくとも１つのペプチドを選択すること、及びｂ）Ｆｃドメインの内部配列として、選択されたペプチドのアミノ酸配列を含む薬剤を調製することを含む方法によって調製される。本方法は、例えば、米国特許出願２００３／０１９５１５６号、２００３／０１７６３５２号、２００３／０２２９０２３号及び２００３／０２３６１９３号；国際公開ＷＯ００／２４７７０号及びＷＯ０４／０２６３２９号に記載されているように、Ｎ末端若しくはＣ末端又は側鎖を通じてペプチドに既に連結されているＦｃドメインを修飾するために使用され得る。米国特許出願公開ＵＳ２００６／０１４０９３４に記載されている方法は、抗体の一部であるＦｃドメインを修飾するためにも使用され得る。このようにして、異なるエピトープへの結合ドメイン又は前駆体分子の既存のエピトープへの追加結合ドメインなど、追加機能を有する様々な分子を作製することが可能である。内部ペプチド配列を含む分子は、「Ｆｃ内部ペプチボディ」又は「Ｆｃ内部ペプチド分子」とも称される。
Ｆｃ内部ペプチド分子は、特定の内部領域中に、２以上のペプチド配列を直列で含み得、他の内部領域中にさらなるペプチドを含み得る。ループ領域の候補が好ましいが、Ｆｃの他の何れの非末端ドメイン中の挿入も、本発明の一部と考えられる。上記化合物のバリアント及び誘導体（以下に記載されている。）も、本発明によって包含される。
本発明の化合物は、標準的な合成法、組換えＤＮＡ技術又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他のあらゆる方法によって調製され得る。
Ｆｃ内部ペプチド分子に対して想定される使用は、治療剤又は予防剤としての使用である。選択されたペプチドは、該ペプチドによって模倣される天然リガンドと同等の活性を有し得、又は該ペプチドによって模倣される天然リガンドを上回る活性さえ有し得る。さらに、天然リガンドをベースとするある種の治療剤は、患者自身の内在性リガンドに対する抗体を誘導し得る。これに対して、ビヒクルが連結されたペプチドの特有の配列は、天然リガンドとほとんど又は通例全く配列同一性を有さないことによって、この欠陥を回避する。さらに、Ｆｃ内部ペプチボディは、Ｎ末端又はＣ末端に連結されたＦｃ分子に比べて、再折り畳み及び精製において利点を有し得る。さらに、Ｆｃ内部ペプチボディは、キメラドメインの安定化のために熱力学的により安定的であり得、且つアミノ及びカルボキシペプチダーゼからのタンパク分解に対する増加した耐性のために化学的にもより安定的であり得る。Ｆｃ内部ペプチボディは、改善された薬物動態学的特性も示し得る。
ペプチド
ペプチドのあらゆる数を、本発明に関連して使用し得る。特に興味深いのは、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−Ｉｒａ、ＣＴＬＡ４、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ、ミオスタチン、インテグリン、ＯＰＧ、ＯＰＧ−Ｌ、ＮＧＦ、ＴＡＬＬ−１、Ａｎｇ−２結合対、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βの活性を模倣するペプチドである。ペプチドアンタゴニスト、特に、ＴＮＦ、インターロイキンの全て（ＩＬ−１、２、３・・・）及び補体活性化に関与するタンパク質（例えば、Ｃ３ｂ）の活性に対して拮抗的なものも興味深い。腫瘍ホーミングペプチド、膜輸送ペプチドなどの標的化ペプチドも興味深い。ペプチドのこれらのクラスは全て、本明細書及びその他の参考文献に引用されている参考文献中に記載されている方法によって発見され得る。
本発明において使用するためのペプチドを作製する上で、ファージディスプレイが特に有用である。任意の遺伝子産物の任意の部位に対してペプチドリガンドを同定するために、ランダムペプチドのライブラリーからの親和性選択を使用できることが記載されている。Ｄｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３０２５−３０。ファージディスプレイは、細胞表面受容体又は直鎖エピトープを有するあらゆるタンパク質としてのこのような対象タンパク質に結合するペプチドを同定するために特に極めて適している。Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８），Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３１３−２９；Ｋａｙ ｅｔ ａＬ（１９９８），Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ ３：３７０−８。このようなタンパク質は、「Ｈｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ＆Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓ．１７（５）：６７１−７７６」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に広く概説されている。このような興味深いタンパク質は、本発明において使用するのに適している。
例として、限定することなく、サイトカイン受容体に結合するペプチドの群が提供される。最近、サイトカインは、それらの受容体コードに従って分類された。「Ｉｎｇｌｏｔ（１９９７），Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ ４５：３５３−７」（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。これらの受容体としては、ＣＫＲ（表３中のファミリー１）がある。受容体の分類は、表３に示されている。
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本発明におけるペプチド作製のための目標として興味深い他のタンパク質には、以下のものが含まれる。
αｖβ３
αＶβ１
Ａｎｇ−２
Ｂ７
Ｂ７ＲＰ１
ＣＲＰ１
カルシトニン
ＣＤ２８
ＣＥＴＰ
ｃＭｅｔ
補体因子Ｂ
Ｃ４ｂ
ＣＴＬＡ４
グルカゴン
グルカゴン受容体
ＬＩＰＧ
ＭＰＬ
腫瘍細胞上に優先的に発現される分子（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ３０）のスプライスバリアント、
ムチン及びルイスＹ表面糖タンパク質の非グリコシル化バリアント
ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４５
前立腺特異的膜抗原及び前立腺特異的細胞抗原
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（分泌型及び膜結合型の両方）（例えば、ＭＭＰ−９）
カテプシン
ＴＩＥ−２受容体
ヘパラナーゼ
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ＵＰＡ）、ＵＰＡ受容体、
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨ−ＲＩ、ＰＴＨ−ＲＩＩ
Ｈｅｒ２
Ｈｅｒ３
インシュリン
ミオスタチン
ＴＡＬＬ−１
神経成長因子
インテグリン及び受容体
セレクチン及びその受容体
細胞接着分子及びその受容体
典型的なペプチドは、以下の表４から３８に記載されている。これらのペプチドは、本分野で開示された何れの方法（その多くは、本明細書中に論述されている。）によっても調製され得る。以下の多くの表では、一文字アミノ酸略号が使用されている。これらの配列中の「Ｘ」（及び、特定の事例において別段の記載がなければ、本明細書を通じて）は、天然に存在する２０のアミノ酸残基の何れもが存在し得ることを意味する。これらのペプチドの何れも、リンカーを用いて又は用いずに、直列に（すなわち、連続的に）連結され得、表中には、直列に連結された数例が記載されている。リンカーは、「Λ」として列記されており、本明細書に記載されているリンカーの何れでもあり得る。直列のリピート及びリンカーは、明確化するために、ハイフンで区切って示されている。システイン残基を含有するペプチドは何れも、別のＣｙｓ含有ペプチドを用いて架橋され得、これらの一方又は両方はビヒクルに連結され得る。架橋された数例が、表中に記載されている。２以上のＣｙｓ残基を有するペプチドは全て、ペプチド内ジスルフィド結合も形成し得る。例えば、表５中のＥＰＯ模倣ペプチドを参照されたい。ペプチド内ジスルフィド結合された数例が、表中に明記されている。これらのペプチドの何れもが、本明細書に記載されているように誘導体化され得、表中には、誘導体化された数例が記載されている。関連する誘導体化されていないペプチドも本発明において使用され得るので、表中の誘導体化されたペプチドは限定的なものではなく例示的なものである。カルボキシル末端がアミノ基でキャッピングされ得る誘導体に関して、キャッピングアミノ基は、−ＮＨ２として示されている。アミノ酸残基がアミノ酸残基以外の部分によって置換されている誘導体に関しては、置換はσによって表記されており、これは、「Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９」及び「Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２」（参照により、組み込まれる。）に記載されている部分の何れをも表す。Ｊ置換基及びＺ置換基（Ｚ５、Ｚ６、・・・Ｚ４０）は、米国特許第５，６０８，０３５号、同第５，７８６，３３１号及び同第５，８８０，０９６号（参照により、組み込まれる。）に定義されているとおりである。ＥＰＯ模倣配列に関しては（表５）、置換基Ｘ２からＸ１１及び整数「ｎ」は、ＷＯ９６／４０７７２号（参照により、組み込まれる。）に定義されているとおりである。ＥＰＯ模倣配列に関しても、置換基Ｘｎａ、Ｘ１ａ、Ｘ２ａ、Ｘ３ａ、Ｘ４ａ、Ｘ５ａ及びＸｃａの後には、それぞれ、ＷＯ９９／４７１５１（同じく、参照により、組み込まれる。）のＸｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸｃの定義が続く。置換基「Ψ」、「Θ」及び「＋」は、「Ｓｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１５４０−４」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に定義されているとおりである。インテグリン結合ペプチドに関して、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８が１９９５年６月１日に公開された国際出願ＷＯ９５／１４７１４及び１９９７年３月６日に公開されたＷＯ９７／０８２０３（これらも、参照により、組み込まれる。）に定義されているとおりであり、ＶＩＰ模倣ペプチドＸ１、Ｘ１ ’、Ｘ１ ’’、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＺ並びに整数ｍ及びｎが１９９７年１０月３０日に公開されたＷＯ９７／４００７０（同じく、参照により組み込まれる。）に定義されていることを除き、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、米国特許第５，７７３，５６９号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に定義されているとおりである。以下のＸａａ及びＹａａは、１９９８年３月１２日に公開されたＷＯ９８／０９９８５（参照により、組み込まれる。）に定義されているとおりである。ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＢ１、ＡＢ２及びＡＣは、１９９８年１２月３日に公開された国際出願ＷＯ９８／５３８４２（参照により、組み込まれる。）に定義されているとおりである。表１７中のＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のみは、１９９９年４月２８日に公開された欧州特許出願ＥＰ０９１１３９３に定義されているとおりである。太字で表記されている残基は、Ｄアミノ酸である。別段の記載がなければ、全てのペプチドは、ペプチド結合を通じて連結される。略号が、本明細書の末尾に列記されている。「配列番号」の欄において、「ＮＲ」は、当該配列に対して、配列表が不要であることを意味する。
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表６に記載されているＴＭＰ化合物に加えて、本発明は数多くの他のＴＭＰ化合物を提供する。一態様において、ＴＭＰ化合物は、以下の一般構造を含む。
ＴＭＰ１−（Ｌ１）ｎ−ＴＭＰ２
（ＴＭＰ１及びＴＭＰ２は、各々独立に、以下のコア構造を含む化合物の群から選択される。）
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０
（式中：
Ｘ２は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ及びＶａｌからなる群から選択され；
Ｘ３は、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｐｒｏであり；
Ｘ５は、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選択され；
Ｘ６は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びＰｈｅからなる群から選択され；
Ｘ７は、Ａｒｇ及びＬｙｓからなる群から選択され；
Ｘ８は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びＧｌｕからなる群から選択され；
Ｘ９は、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅからなる群から選択され；
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ及びＬｙｓからなる群から選択され；
Ｌ１は、本明細書に記載されているリンカーであり；並びに
ｎは、０又は１である。）
及び生理学的に許容されるその塩。
一実施形態において、Ｌ１は、（Ｇｌｙ）ｎ（ｎは、１から２０であり、及びｎが１より大きい場合には、Ｇｌｙ残基の最大半分は、残りの１９の天然アミノ酸又はその立体異性体から選択される別のアミノ酸によって置換され得る。）を含む。
ＴＭＰ１及びＴＭＰ２に関して上記されているコア構造Ｘ２−Ｘ１０の他に、以下の１つ又はそれ以上が、ＴＭＰ１及び／又はＴＭＰ２コア構造に付加されており、Ｘ１がＮ末端に付着されており、及び／又はＸ１１、Ｘ１２、Ｘ１３及び／又はＸ１４がＣ末端に付着されている（Ｘ１、Ｘ１２、Ｘ１３及びＸ１４は、以下のとおりである。）他の関連構造も可能である。
Ｘ１は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ及びＡｒｇからなる群から選択され；
Ｘ１１は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＧｌｕからなる群から選択され；
Ｘ１２は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及びＧｌｎからなる群から選択され；
Ｘ１３は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＧｌｙからなる群から選択され；並びに
Ｘ１４は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ及びＧｌｙからなる群から選択される。
本発明のＴＭＰ化合物は、少なくとも９つのサブユニット（Ｘ２−Ｘ１０）（Ｘ２−Ｘ１０は、コア構造を含む。）から構成される（すなわち、含む。）。Ｘ２−Ｘ１４サブユニットは、天然に存在する２０個のアミノ酸の中から独立に選択されるアミノ酸であるが、本発明は、Ｘ２−Ｘ１４が、天然に存在しない非典型的な本分野で周知のアミノ酸の群から独立に選択される化合物を包含する。各位置に対して、特異的なアミノ酸が同定される。例えば、Ｘ２は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ又はＶａｌであり得る。
本明細書では、アミノ酸に対する三文字略号及び一文字略号の両方が使用されている。何れの事例においても、略号は、天然に存在する２０のアミノ酸又はその周知の変形物に対して使用される標準的な略号である。これらのアミノ酸は、Ｌ又はＤ立体化学（ＬでもＤでもないＧｌｙを除く。）の何れかを有し得、ＴＭＰ（及び本発明の他の化合物）は、立体化学の組み合わせを含み得る。本発明は、アミノ酸のアミノ末端配列からカルボキシ末端配列が逆転している逆転ＴＭＰ分子（及び本明細書に開示されている他の全てのペプチド）も提供する。例えば、正常な配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する分子の逆転は、Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１である。本発明は、逆転ＴＭＰのように、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端配列が逆転し、及び、本来、ＴＭＰ中の「Ｌ」鏡像異性体である残基が「Ｄ」立体異性体形態へと変化しているレトロ逆転ＴＭＰ分子（及び本明細書に記載されている本発明の他の全ての分子）も提供する。
従って、本発明の典型的なＴＭＰ化合物には、以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
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誘導体
本発明は、化合物のペプチド及び／又は（以下で論述されているような）ビヒクル部分を誘導体化することも想定している。このような誘導体は、化合物の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。あるいは、前記部分は、化合物の全ての望ましくない副作用などを削除又は軽減し得る。典型的な誘導体には、以下のとおりである化合物が含まれる。
１．化合物又はそのある部分が環状である。例えば、ペプチド部分は、（例えばリンカー中に）２つ又はそれ以上のＣｙｓ残基を含有するように修飾され得、ジスルフィド結合形成によって環状化し得る。環状化された誘導体の調製に関する参考文献の引用に関しては、表２を参照されたい。
２．化合物は、架橋され、又は分子間を架橋できるようにされる。例えば、ペプチド部分は、１つのＣｙｓ残基を含有し、これにより、リンカー分子（ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と分子間ジスルフィド結合を形成することができるように修飾され得る。化合物は、以下に示されている分子におけるように、そのＣ末端を通じても架橋され得る。
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３．非ペプチド連結によって、１つ又はそれ以上のペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）が置換されている。典型的な非ペプチド連結は、−ＣＨ２−カルバマート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホナート結合、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−二級アミン及びアルキル化されたペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６（Ｒ６は、低級アルキルである。）］である。
４．Ｎ末端が、誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端は、アシル化され、又は置換されたアミンへと修飾され得る。典型的なＮ末端誘導体基には、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）（Ｒ及びＲ１は、各々独立に、水素又は低級アルキルであり、並びにフェニル環は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群から選択される１から３個の置換基で置換され得る。）が含まれる。
５．遊離のＣ末端が、誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端は、エステル化され又はアミド化される。例えば、本発明の化合物に、（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加するために、本分野で記載されている方法を使用し得る。同様に、本発明の化合物に、−ＮＨ２を付加するために、本分野で記載されている方法を使用し得る。典型的なＣ末端誘導体基には、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（Ｒ２は、低級アルコキシ又は−ＮＲ３Ｒ４である（Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素又はＣ１−Ｃ８アルキル（好ましくは、Ｃ１−Ｃ４アルキル）である。）。）が含まれる。
６．ジスルフィド結合は、別の、好ましくはより安定な、架橋部分（例えば、アルキレン）と置換される。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９；Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＴｈｉｒｔｅｅｎｔｈＡｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．，３５７−９を参照されたい。
７．１つ又はそれ以上の各アミノ酸残基が修飾される。以下に詳しく記載されているように、様々な誘導体化剤が、選択された側鎖又は末端残基と特異的に反応することが知られている。
８．タンパク質を連結するために、典型的には、ヘテロ二官能性ポリマーが使用される。例は、ＳＭＣＣ、すなわちサクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラートである。ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド）末端は、第一級アミンと反応し、ｐＨ約７での連結が最適である。一旦、複合体が形成されたら、ＳＭＣＣのマレイミド部分の反応は、遊離のスルフヒドリル基を含有する別のタンパク質／ペプチドと進行することが可能となり、これは、最初の反応におけるアミドの形成よりずっと速い速度で起こる。その結果は、２つのタンパク質間の連結、例えば、抗体−酵素連結物である。応用の実例は、西洋ワサビペルオキシダーゼに架橋されたＦａｂ’断片の調製である（Ｉｓｈｉｋｗａ，ｅｔ． ａｌ．，１９８３ａ，ｂ；Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２ａ，ｂ；Ｉｍａｇａｗａ ｅｔａｌ，１９８２；Ｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。スルホＳＭＣＣ（スルホサクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）の使用によって、有機的可溶化工程が必要とされないような水溶性が実現され、タンパク質との反応におけるより大きな柔軟性及びより小さな活性の破壊がもたらされる。
リジン残基及びアミノ末端残基を、コハク酸又は他のカルボキシル酸無水物と反応させ得、これは、リジン残基の電荷を逆転させる。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、イミドエステル（メチルピコリンイミダートなど）、ピリドキサルリン酸、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４ペンタンジオン、及び（グリオキシラートとの）トランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
アルギン残基は、何れかの１個又は数個の慣用の試薬の組み合わせ（フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンなど）との反応により修飾され得る。グアニジン官能基の高いｐＫａのため、アルギニン残基の誘導体化には、反応をアルカリ条件中で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンのεアミノ基と反応し得る。
チロシン残基の具体的な修飾は広範に研究されており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基内へのスペクトル標識の導入に関心がもたれている。最も一般的には、それぞれＯ−アセチルチロシン種及び３−ニトロ誘導体を形成させるために、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンが使用される。
カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾され得る。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基へ転化され得る。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミド化され得る。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化され得る。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲に属する。
システイン残基は、ジスルフィド結合を除去するために、又は、逆に架橋を安定化させるために、アミノ酸残基又は他の部分によって置換することが可能である。例えば、「Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９」を参照されたい。
二官能性因子での誘導体化は、ペプチド若しくはそれらの機能的誘導体を水不溶性支持マトリックスに、又は他の高分子ビヒクルに架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（サクシンイミジルプロピオナートなどのジサクシンイミジルエステルなど）、及びビス−Ｎ−マレイミド−１−オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化中間体を与える。あるいは、臭化シアンで活性化された炭水化物などの反応性の水不溶性マトリックス、並びに米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号、第４，１９５，１２８号、第４，２４７，６４２号、第４，２２９，５３７号及び第４，３３０，４４０号に記載の反応性基質が、タンパク質の固定化のために使用される。
炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に都合よく結合させ得る。一般には、それらが配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る。）の一部である場合には、Ｏ−結合型オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基に付着され、Ｎ結合型オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に付着される。Ｘは、好ましくは、プロリン以外の、天然に存在する１９個のアミノ酸の１つである。Ｎ結合型及びＯ−結合型オリゴ糖並びに各タイプ中に見出される糖残基の構造は異なっている。両方に一般に見出される糖の１つの種類は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は、通常、Ｎ−結合型及びＯ−結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のため、グリコシル化された化合物に酸性特性を付与し得る。このような部位を本発明の化合物のリンカー内に取り込ませることができ、該部位は、好ましくは、（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳動物細胞中で）ポリペプチド化合物の組換え産生中に、細胞によりグリコシル化される。しかしながら、このような部位は、本分野で公知の合成又は半合成手法により更にグリコシル化され得る。
他の可能な修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ．７９−８６（１９８３）。
本発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも帯電させ得る。化合物の何れの部分のＤＮＡ配列も、選択された宿主細胞とより適合的なコドンへと変化させ得る。好ましい宿主細胞であるイー・コリの場合、最適化されたコドンが本分野において公知である。制限部位を除去するために、又はサイレントな制限部位を含めるためにコドンを置換することができ、これは、選択された宿主細胞中でのＤＮＡのプロセッシングを補助し得る。ビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列は、先述の配列の変化の何れをも含むように修飾され得る。
同位体及びトキシンが連結された誘導体。有用な誘導体の別の組は、トキシン、トレーサー又は放射性同位体に連結された上記分子である。このような連結は、腫瘍細胞又は病原体に結合するペプチド配列を含む分子に対して特に有用である。このような分子は、治療剤として、又は手術の補助として（例えば、放射線免疫でガイドされた手術又はＲＩＧＳ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｇｕｉｄｅｄ ｓｕｒｇｅｒｙ））又は診断剤として（例えば、放射線免疫診断薬又はＲＩＤ）として使用され得る。
治療剤として、これらの連結された誘導体は、多数の利点を有している。これらは、ペプチド配列によって与えられる特異的結合なしに投与された場合に有毒であるトキシン及び放射性同位体の使用を容易にする。これらは、連結対のより低い有効用量を促進することによって、放射線及び化学療法の使用に付随する副作用を低減することもできる。
有用な連結対には、以下のものが含まれる。
・９０イットリウム、１３１ヨウ素、２２５アクチニウム及び２１３ビスマスなどの放射性同位体：
・リシンＡトキシン、シュードモナス内毒素（例えばＰＥ３８、ＰＥ４０）などの微生物由来のトキシンなど；
・捕捉系中の対分子（以下参照）；
・ビオチン、ストレプトアビジン（捕捉系中の対分子として、又は特に、診断用の追跡物質として有用）；及び
・細胞毒性剤（例えば、ドキソルビシン）。
これらの連結された誘導体の１つの有用な適合は、捕捉系での使用である。このような系において、本発明の分子は、良性捕捉分子を含む。この捕捉分子は、例えば、トキシン又は放射性同位体を含む別個のエフェクター分子へ特異的に結合することが可能である。ビヒクル連結された分子及びエフェクター分子の両方が患者に投与される。このような系において、エフェクター分子は、ビヒクル連結された捕捉分子に結合された場合を除き、短い半減期を有するので、あらゆる有毒な副作用を最小限に抑える。ビヒクル連結された分子は、相対的に長い半減期を有するが、良性及び無毒である。両分子の特異的結合部分は、公知の特異的結合対（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）の一部であり得、又は本明細書に記載されている方法などのペプチド作製方法から得ることが可能である。
このような連結された誘導体は、本分野で公知の方法によって調製され得る。タンパク質エフェクター分子（例えば、シュードモナス内毒素）の場合には、このような分子は、相関的ＤＮＡ構築物から融合タンパク質として発現され得る。放射性同位体連結された誘導体は、例えば、ＢＥＸＡ抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ）について記載されているように調製され得る。細胞毒製剤又は微生物のトキシンを含む誘導体は、例えば、ＢＲ９６抗体（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）について記載されているように調製され得る。捕捉系において使用された分子は、例えば、ＮｅｏＲｘからの特許、特許出願及び公報によって記載されているように調製され得る。ＲＩＧＳ及びＲＩＤに対して使用された分子は、例えば、ＮｅｏＰｒｏｂｅからの特許、特許出願及び公報によって調製され得る。
ビヒクル
本発明は、Ｎ末端、Ｃ末端又はアミノ酸残基の１つの側鎖を通じてペプチドに付着された少なくとも１つのビヒクルの存在を必要とする。複数のビヒクルも使用し得る。一態様において、Ｆｃドメインはビヒクルである。Ｆｃドメインは、ペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に又はＮ末端及びＣ末端の両方に融合され得る。
本発明の様々な実施形態において、Ｆｃ成分は、天然のＦｃ又はＦｃバリアントの何れかである。天然のＦｃの免疫グロブリン源は、一態様において、ヒト起源であり、別の実施形態において、免疫グロブリンの何れのクラスのものでもあり得る。天然のＦｃドメインは、共有（すなわち、ジスルフィド結合）及び／又は非共有的会合によって、二量体又は多量体形態へと連結され得る単量体ポリペプチドから構成される。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１から４の範囲である。天然のＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合された二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１−９参照）。
適切なシステイン残基が存在する場合、ジスルフィド結合の形成を通じた二量体化を妨げる条件が存在しなければ、Ｆｃ単量体は自発的に二量体化することに注意すべきである。Ｆｃ二量体中で通常ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去され又は他の残基によって置換されているとしても、単量体の鎖は、一般に、非共有的相互作用を通じて二量体を形成する。本明細書において「Ｆｃ」という用語は、これらの形態の全て、すなわち、天然の単量体、天然の二量体（ジスルフィド結合によって連結される。）、修飾された二量体（ジスルフィド及び／又は非共有的に連結される。）及び修飾された単量体（すなわち、誘導体）を意味するために使用される。
上述のように、Ｆｃバリアントは、本発明の範囲に属する適切なビヒクルである。天然のＦｃは、サルベージ受容体への結合が維持される限り、Ｆｃバリアントを形成するように広く修飾され得る。例えば、ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３４２７８を参照されたい。このようなＦｃバリアントにおいて、本発明の融合分子によって必要とされない構造的特徴又は機能的活性を与える天然のＦｃの１つ又はそれ以上の部位を除去し得る。例えば、残基を置換若しくは欠失させ、部位中に残基を挿入し、又は部位を含有する部分を末端切断させることによって、これらの部位を除去し得る。挿入された又は置換された残基は、ペプチド模倣体又はＤアミノ酸などの変化されたアミノ酸でもあり得る。多くの理由のために、Ｆｃバリアントは、望ましい場合があり得、これらの幾つかは本明細書に記載されている。典型的なＦｃバリアントには、以下の分子及び配列が含まれる。
１．ジスルフィド結合の形成に関与する部位が除去される。このような除去は、本発明の分子を作製するために使用される宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避し得る。この目的のために、Ｎ末端のシステイン含有セグメントは末端切断され得、又はシステイン残基は他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で欠失若しくは置換され得る。システイン残基が除去されている場合でさえ、一本鎖Ｆｃドメインは、非共有的に互いに結合された二量体Ｆｃドメインをなお形成することができる。
２．天然のＦｃは、選択された宿主細胞とより適合性があるように修飾される。例えば、プロリンイミノペプチダーゼなどの、イー・コリ中の消化酵素によって認識され得る典型的な天然のＦｃのＮ末端に近いＰＡ配列を除去し得る。特に、分子がイー・コリなどの細菌細胞中で組み換え的に発現されている場合には、Ｎ末端メチオニン残基も付加し得る。
３．天然のＦｃのＮ末端の一部は、選択された宿主細胞中で発現されたときにＮ末端の不均一性を防ぐために除去される。この目的のために、Ｎ末端の最初の２０アミノ酸残基、特に位置１、２、３、４及び５のアミノ酸残基の何れをも欠失させ得る。
４．１つ又はそれ以上のグリコシル化部位が除去される。典型的にグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解応答を付与し得る。このような残基は、欠失され得、又はグリコシル化されない残基（例えば、アラニン）で置換され得る。
５．Ｃ１ｑ結合部位などの補体との相互作用に関与する部位が除去される。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失又は置換し得る。補体の動員は、本発明の分子にとって有利でない場合があり得るので、このようなＦｃバリアントを用いて回避され得る。
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を与える部位が除去される。天然のＦｃは、本発明の融合分子に対して必要とされないある種の白血球との相互作用するための部位を有し得、従って、除去され得る。
７．ＡＤＣＣ部位が除去される。ＡＤＣＣ部位は、本分野において公知である。例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関して「Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）」を参照。これらの部位も、本発明の融合分子にとって不要であり、従って、除去し得る。
８．天然のＦｃが非ヒト抗体に由来する場合には、天然のＦｃはヒト化され得る。典型的には、天然のＦｃをヒト化するために、ヒトの天然のＦｃ中に通常見出される残基で、ヒト以外の天然のＦｃ中の選択された残基を置換する。抗体のヒト化のための技術は、本分野において周知である。
別のビヒクルは、サルベージ受容体に結合することが可能な、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片又は小分子（例えば、ペプチド模倣化合物）である。例えば、１９９８年４月１４日にＰｒｅｓｔａらに付与された米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているようなポリペプチドを、ビヒクルとして使用することが可能である。ペプチドは、ＦｃＲｎサルベージ受容体への結合について、ファージディスプレイによって選択することも可能である。このようなサルベージ受容体結合化合物も、「ビヒクル」の意味の中に含まれ、本発明の範囲に属する。このようなビヒクルは、（例えば、プロテアーゼによって認識される配列を避けることによって）増加した半減期に関して選択されるべきであり、及び（例えば、抗体のヒト化で発見されるように、非免疫原性配列を優先することによって）減少した免疫原性に関して選択されるべきである。
Ｆｃ部分のバリアント、類縁体又は誘導体は、例えば、残基又は配列の様々な置換を作製することによって構築され得る。
バリアント（又は類縁体）ポリペプチドには、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基がＦｃアミノ酸配列を補充する挿入バリアントが含まれる。挿入は、タンパク質の一方若しくは両方の末端に位置し得、又はＦｃアミノ酸配列の内部領域内に位置し得る。一方又は両方の末端に追加の残基を有する挿入バリアントには、例えば、融合タンパク質及びアミノ酸タグ又は標識を含むタンパク質が含まれ得る。例えば、特に、Ｆｃ分子がイー・コリなどの細菌細胞中で組み換え的に発現される場合には、Ｆｃ分子は、場合によって、Ｎ末端Ｍｅｔを含有し得る。
Ｆｃ欠失バリアントでは、Ｆｃポリペプチド中の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が除去される。欠失は、Ｆｃポリペプチドの一方若しくは両方の末端において実施することが可能であり、又はＦｃアミノ酸配列内の１つ若しくはそれ以上の残基を除去して実施することが可能である。従って、欠失バリアントには、Ｆｃポリペプチド配列の全ての断片が含まれる。
Ｆｃ置換バリアントでは、Ｆｃポリペプチド中の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が除去され、別の残基で置換される。一態様において、置換は、性質上、保存的であり、この種の保存的置換は、本分野において周知である。あるいは、本発明は、非保存的である置換を包含する。典型的な保存的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］に記載されており、すぐ下に記載されている。
保存的置換Ｉ
特徴的な側鎖 アミノ酸
非極性（疎水性）：
Ａ．脂肪族 Ａ Ｌ Ｉ Ｖ Ｐ
Ｂ．芳香族 Ｆ Ｗ
Ｃ．含硫 Ｍ
Ｄ．ボーダーライン Ｇ
非帯電極性：
Ａ．ヒドロキシル Ｓ Ｔ Ｙ
Ｂ．アミド Ｎ Ｑ
Ｃ．スルフヒドリル Ｃ
Ｄ．ボーダーライン Ｇ
正に帯電（塩基性） Ｋ Ｒ Ｈ
負に帯電（酸性） Ｄ Ｅ
別の典型的な保存的置換は、すぐ下に記載されている。
保存的置換ＩＩ
元の残基 典型的な置換
Ａｌａ（Ａ） Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ａｒｇ（Ｒ） Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
Ａｓｎ（Ｎ） Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ａｓｐ（Ｄ） Ｇｌｕ
Ｃｙｓ（Ｃ） Ｓｅｒ
Ｇｌｎ（Ｑ） Ａｓｎ
Ｇｌｕ（Ｅ） Ａｓｐ
Ｈｉｓ（Ｈ） Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ｉｌｅ（Ｉ） Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
Ｌｅｕ（Ｌ） Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
Ｌｙｓ（Ｋ） Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
Ｍｅｔ（Ｍ） Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ（Ｆ） Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ
Ｐｒｏ（Ｐ） Ｇｌｙ
Ｓｅｒ（Ｓ） Ｔｈｒ
Ｔｈｒ（Ｔ） Ｓｅｒ
Ｔｒｐ（Ｗ） Ｔｙｒ
Ｔｙｒ（Ｙ） Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ
Ｖａｌ（Ｖ） Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ
例えば、Ｆｃ配列の幾つか又は全部のジスルフィド架橋の形成を防ぐために、システイン残基を欠失させること又は別のアミノ酸で置換することができる。各システイン残基は、除去することができる及び／又はＡｌａ若しくはＳｅｒなどの他のアミノ酸で置換することができる。別の例として、（１）Ｆｃ受容体結合部位を除去するために、（２）補体（ＣＩｑ）結合部位を除去するために及び／又は（３）抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）部位を除去するために、アミノ酸置換を導入するためにも修飾を施し得る。このような部位は本分野において公知であり、あらゆる公知の置換が本明細書において使用されるＦｃの範囲に属する。例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関しては、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．５，６３３−６３９（１９９２）」を参照されたい。
同様に、１つ又はそれ以上のチロシン残基は、フェニルアラニン残基によって置換することが可能である。さらに、他のバリアントアミノ酸挿入、欠失及び／又は置換も想定され、本発明の範囲に属する。一般に、保存的なアミノ酸置換が好ましい。さらに、変化は、ペプチド模倣体又はＤアミノ酸などの変化されたアミノ酸の形態であり得る。
化合物のＦｃ配列は、ペプチドに関して本明細書に記載されているように誘導体化することもできる。すなわち、アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換以外の修飾を有する。好ましくは、修飾は、性質上、共有結合であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機及び無機部分との化学結合が含まれる。本発明の誘導体は、循環半減期を増加させるために調製され得、又は所望の細胞、組織若しくは臓器へのポリペプチドの誘導能を改善するために設計され得る。
「Ａｌｔｅｒｅｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ」という名称のＷＯ９６／３２４７８に記載されているような、完全な状態のＦｃ分子のサルベージ受容体結合ドメインを本発明の化合物のＦｃ部分として使用することも可能である。本明細書においてＦｃと表記されている分子のクラスのさらなる要素は、「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｈａｌｆ−Ｌｉｖｅｓ」という名称のＷＯ９７／３４６３１に記載されているものである。本パラグラフ中に引用されている公開されたＰＣＴ出願は何れも、参照により、本明細書に組み込まれる。
ＷＳＰ成分
本発明の化合物は、少なくとも１つのＷＳＰをさらに含み得る。分子のＷＳＰ部分は、分岐又は非分岐であり得る。最終産物調製物の治療用途に関しては、このポリマーは医薬適合性である。一般に、ポリマー連結物が治療的に使用されるかどうかの検討、治療的に使用される場合には、所望される投薬量、循環時間、タンパク分解への耐性及び他の検討事項についての検討に基づいて、所望されるポリマーが選択される。様々な態様において、各水溶性ポリマーの平均分子量は、約２ｋＤａと約１００ｋＤａの間、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａの間、及び約２０ｋＤａと約３５ｋＤａの間である。さらに別の実施形態において、各ポリマーの分子量は、約６ＫＤａと約２５ｋＤａの間である。ここで及び全体を通じて使用される「約」という用語は、水溶性ポリマーの調製において、幾つかの分子の重量が表記されている分子量より大きく、幾つかの分子の重量がより小さいことを示す。一般に、分子量が高いほど（又は分岐が多いほど）、ポリマー／タンパク質の比率が高くなる。例えば、持続的放出の期間、生物活性に対する効果が存在する場合、生物活性に対する効果、取り扱いの容易さ、治療用タンパク質に対する水溶性ポリマーの抗原性及び他の公知の効果の程度又は欠如など、所望される治療特性に応じて、他のサイズを使用し得る。
ＷＳＰは、ポリペプチド又はペプチドの機能的又は抗原性ドメインに対する効果を考慮して、ポリペプチド又はペプチドに付着させるべきである。一般に、化学的な誘導体化は、タンパク質を活性化されたポリマー分子と反応させるために使用されるあらゆる適切な条件下で実施され得る。１つ又はそれ以上のタンパク質へ水溶性ポリマーを連結させるために使用することができる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン（ａｚｉｄｉｒｉｎｅ）、オキシラン及び５−ピリジルが含まれるが、これらに限定されない。還元的アルキル化によってペプチドに付着されるのであれば、選択されるポリマーは、重合の程度が調節されるように、単一の反応性アルデヒドを有するべきである。
臨床的に許容される適切な水溶性ポリマーには、ＰＥＧ、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマー又はランダム共重合体の何れか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化されたポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）及び他のポリオキシエチル化されたポリオール、ポリオキシエチル化されたソルビトール又はポリオキシエチル化されたグルコース、コロン酸又は他の炭水化物ポリマー、Ｆｉｃｏｌｌ又はデキストラン並びにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
逆温熱ゲル（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｇｅｌ）の形成におけるように、水溶性ポリマーは、熱感受性であるように作製することもできる。例には、４アームの骨格を有するＴｅｔｒｏｎｉｃｓ及びＰＥＧ−ＰＬＧＡ共重合体が含まれる。ポリマーの親水性は、疎水性部分をポリマー鎖中に置換することによって変動させることができる。この例はＰＬＧＡの製造であり、ＰＬＧＡの製造では、より低い水溶性を可能にするためにグリコール酸に対する乳酸の比を増加させることができる。より低い水溶性ポリマーは、ある種の用途において、例えば、細胞膜と相互作用する可能性を増加させる上で所望され得る。再構成の際には、溶液中にミセル又はリポソームの形成を誘導するために、リン脂質の適切な比を使用し得る。このような系の利点は、ミセル内のタンパク質の幾つかを取り込む能力に存在し得、延長された送達という利点が得られる可能性を秘めている。リポソーム又はミセルを形成することができるリン脂質には、ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＯＧ及びコレステロールなどの適切な二次リポソーム強化成分が含まれる。ＤＥＡｏｌｅｔｈ−１０ホスファート及びｏｌｅｔｈ１０−ｐｈｏｓｐｈａｔｅなどのある種の賦形剤は、溶液中にミセルを形成することができる。
多糖ポリマーは、タンパク質又はペプチド修飾のために使用され得る水溶性ポリマーの別の種類である。多糖を添加することによってタンパク質又はペプチドを修飾すること（例えば、グリコシル化）は、半減期を増加させ、抗原性を減少させ、安定性を増加させ及びタンパク分解を減少させ得る。デキストランは、主にα１−６結合によって連結されたグルコースの各サブユニットから構成される多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤまでの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、ビヒクルとして、単独で、又は別のビヒクル（例えば、Ｆｃ）と組み合わせて、本発明において使用するための適切な水溶性ポリマーである。例えば、ＷＯ９６／１１９５３及びＷＯ９６／０５３０９を参照されたい。治療用免疫グロブリン又は診断用免疫グロブリンに連結されたデキストランの使用が報告されており、例えば、欧州特許公報０３１５４５６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。本発明において、ビヒクルとしてデキストランが使用される場合、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランが好ましい。
一実施形態において、ＷＳＰはＰＥＧであり、本発明は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシポリエチレングリコールなどの（これらに限定されない。）他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態の何れかを含むように化合物が修飾されている調製物を想定する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水溶性のために、製造において利点を有し得る。ＰＥＧ基は、あらゆる便利な分子量のものであり得、直鎖又は分岐であり得る。本発明における使用に関して想定されるＰＥＧの平均分子量は、約２ｋＤａから約１００ｋＤ、約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、約５ｋＤａから約１０ｋＤａの範囲である。別の態様において、ＰＥＧ部分は、約６ｋＤａから約２５ｋＤａの分子量を有する。ＰＥＧ基は、一般に、ＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）を通じた、標的ペプチド又はタンパク質上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ又はエステル基）へのアシル化又は還元的アルキル基を介して、ペプチド又はタンパク質へ付着される。本明細書に記載されている方法を用いて、ポリマー／ペプチド連結物分子の混合物を調製することが可能であり、ここで与えられる長所は、混合物中に含めるためのポリマー／ペプチド連結物の比を選択することが可能であるということである。従って、所望であれば、ポリマー／タンパク質連結物の所定の割合を用いて、付着されたポリマー部分の様々な数（すなわち、ゼロ、１つ又は２つ）を有するペプチドの混合物を調製することが可能である。
合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略（他の方法は、本明細書中に、より詳しく論述されている。）は、溶液中での連結体結合を形成することを通じて、ペプチド及びＰＥＧ部分（各々が他のＰＥＧ部分に対して相互に反応性である特別な官能性を有する。）を結合させることからなる。ペプチドは、慣用の固相合成を用いて容易に調製することが可能である。ペプチドは、特異的な部位における適切な官能基で「予め活性化」される。前駆体は、ＰＥＧ部分との反応前に精製され、完全に性質決定される。ペプチドのＰＥＧとの連結は、通常、水相で起こり、逆相分析ＨＰＬＣによって容易にモニターすることが可能である。ＰＥＧ化されたペプチドは、調製用ＨＰＬＣによって容易に精製され、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析法によって性質決定することが可能である。
リンカー
ペプチドの間、ペプチドとビヒクルの間又はビヒクルとＷＳＰの間に配置されているかどうかに関わらず、全ての「リンカー」基は、場合によって使用される。リンカーが存在する場合、リンカーは、主にスペーサーとして働くので、その化学構造がどのようなものであるかは重要でない。リンカーは、好ましくは、ペプチド結合により一緒に連結されたアミノ酸から構成される。したがって、好ましい実施形態において、リンカーは、ペプチド結合により連結された１から約２０個のアミノ酸から構成され、アミノ酸は、天然に存在する２０個のアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸の幾つかは、当業者によって十分に理解されているように、グリコシル化され得る。より好ましい実施形態において、１から２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。より好ましくは、リンカーは、グリシン及びアラニンなどの、立体的に妨害されないアミノ酸の過半数から構成される。従って、好ましいリンカーは、ポリグリシン（特に、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）８、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンである。リンカーの他の具体例は、
Figure 0005873854
 である。
上記命名法を説明するために、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、ＧＩｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。Ｇｌｙ及びＡｌａの組み合わせも好ましい。本明細書に示されているリンカーは、典型的なものであり、本発明の範囲に属するリンカーは、さらに長くしてもよく、他の残基を含み得る。
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ−２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２〜２０）などのアルキルリンカーを使用することが可能である。これらのアルキルリンカーは、さらに、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの、立体的に妨害を生じない全ての基によって置換され得る。典型的な非ペプチドリンカーは、ＰＥＧリンカー、
Figure 0005873854
 （ｎは、リンカーが１００から５０００ｋＤ、好ましくは１００から５００ｋＤの分子量を有するようなｎである。）
である。ペプチドリンカーは、上記と同一の様式で誘導体を形成するために改変され得る。
ポリペプチド及びペプチドの作製
これまでに同定されたペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いて、形質転換された宿主細胞中で作製され得る。ビヒクル成分がポリペプチドであれば、ポリペプチド又はペプチドビヒクル融合産物は１つとして発現され得る。このようにするために、ペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子は、まず、本分野において周知の方法を用いて調製される。例えば、ペプチドをコードする配列は、適切な制限酵素を用いてＤＮＡから切り出すことが可能である。あるいは、ＤＮＡ分子は、ホスホルアミダート法などの化学的合成技術を用いて合成することが可能である。また、これらの技術の組み合わせを使用することも可能である。従って、本発明は、本発明の化合物をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、適切な宿主中で本発明の化合物をコードするベクターも提供する。ベクターは、適切な発現調節配列に作用可能に連結された化合物をコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドの前又は後の何れかに、ベクター中に作用可能な結合を挿入する方法は、周知である。発現調節配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル及び転写又は翻訳の調節に関わる他のシグナルが含まれる。
その中にポリヌクレオチドを有する生じたベクターは、適切な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換は、本分野において周知な方法を用いて実施し得る。
多数の利用可能な、周知の宿主細胞の何れをも、本発明の実施において使用し得る。特定の宿主の選択は、本分野によって認知される多数の因子に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収の容易さ、発現の特徴、生物学的安全性及び費用が含まれる。全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に対して等しく効果的であり得るわけではないことを理解して、これらの因子のバランスを決定しなければならない。これらの一般的な指針の中で、有用な微生物宿主には、細菌（イー・コリなど）、酵母（サッカロミセスなど）及び他の真菌、昆虫、植物、培養中の哺乳動物（ヒトを含む。）細胞又は本分野において公知の他の宿主が含まれる。
次に、形質転換された宿主は、培養及び精製される。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように慣用の発酵条件下で培養され得る。このような発酵条件は、本分野において周知である。最後に、ペプチドは、本分野において周知の方法によって、培養物から精製される。
本発明の化合物を発現させるために使用された宿主細胞に応じて、炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に都合よく結合させ得る。一般には、それらが配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る。）の一部である場合には、Ｏ結合型オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基に付着され、Ｎ結合型オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に付着される。Ｘは、好ましくは、プロリンを除く、天然に存在する１９個のアミノ酸の１つである。Ｎ結合及びＯ結合型オリゴ糖並びに各タイプ中に見出される糖残基の構造は様々である。両方の上に一般に見出される糖の１つの種類は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は、通常、Ｎ結合型及びＯ結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のため、グリコシル化された化合物に酸性特性を付与し得る。このような部位を本発明の化合物のリンカー内に含めることができ、このような部位は、好ましくは、（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳動物細胞中で）ポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞によりグリコシル化される。しかしながら、このような部位は、本分野で公知の合成又は半合成手法により更にグリコシル化され得る。
あるいは、化合物は、合成的方法によって作製され得る。例えば、固相合成技術を使用し得る。適切な技術は、本分野において周知であり、「Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｐａｎａｙｏｔｉｓ ｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５），ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（１９６９），Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ ｅｄ．）２：１０５−２５３；ａｎｄ Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ ｅｄ．）２：２５７−５２７」に記載されているものが含まれる。固相合成は、小ペプチドを作製する最も費用対効果が優れた方法であるので、各ペプチドを作製する好ましい技術である。
誘導体化されたペプチドを含有し、又は非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技術による合成に特に適している。
ＷＳＰの修飾
ＷＳＰに共有結合された化合物を得るために、本明細書に記載されている又はその他本分野で公知の全ての方法が使用される。ポリペプチド又はペプチドの化学的誘導体を調製する方法は、一般に、（ａ）ポリペプチドが１つ又はそれ以上のポリマー分子に付着される条件下で、ペプチドを活性化されたポリマー分子（ポリマー分子の反応性エステル又はアルデヒド誘導体など）と反応させる工程、及び（ｂ）反応産物を取得する工程を含む。最適な反応条件は、公知のパラメータ及び所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比が大きくなるほど、付着されたポリマー分子の％は大きくなる。
本分野で周知の標準的な方法を用いて、利用可能なあらゆる官能基を通じて、生物学的に活性な分子をポリマーに連結することが可能である。このような結合を形成するために使用することが可能な、ポリマー又は生物学的に活性な分子上の官能基の例には、アミン及びカルボキシ基、システイン残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）中のものなどのチオール基、アルデヒド及びケトン、並びにセリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシプロリン及びヒドロキシリジン残基中に見出され得るような水酸基が含まれる。
ポリマーは、生物学的に活性な分子上のアミン官能基と反応させるために、トリクロロ−ｓ−トリアジン［Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９７７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５８２−３５８６、参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。］、カルボニルイミダゾール［Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，ｅｔ ａｌ．，（１９８３），Ａｎａｌ．ＢｉｏＣｈｅｍ．１３１：２５−３３、参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。］又はサクシンイミジルサクシナート［Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８４），Ｃａｎｃｅｒ ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５−１８６、参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。］などの反応性の基を結合させることによって活性化させることができる。別の結合法は、ある分子上にグリオキシリル基を形成すること及び連結されるべき他の分子上にアミノオキシ、ヒドラジド又はセミカルバジド基を形成することを含む［Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ，（１９６８），ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｊ．１０８：８８３−８８７；Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２），Ｂｉｏｃｏηｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈ，（１９９２），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０、これらの各々の全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。］。他の方法では、クロロホルマート又はジサクシンイミジルカルボナートを用いて、連結されるべき第一の分子の遊離のアルコール基に活性エステルを形成し、次いで、活性エステルは、連結されるべき他の分子上のアミン基に連結させることができる［Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９８５），ＢｉｏＣｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−１５２；Ｎｉｔｅｃｋｉ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０８９，２６１号；Ｎｉｔｅｃｋｉ，米国特許第５，２８１６９８号、これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。］。遊離のアルコール基を介して付着され得る他の反応性基が、遊離のアミン基を介して連結するためのイミダートの使用についても記載しているＷｒｉｇｈｔ、ＥＰ０５３９１６７Ａ２（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
別の化学は、メトキシ−ＰＥＧのＮＨＳエステル（Ｏ−［（Ｎ−サクシンイミジルオキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）を用いて、標的の第一級アミンをアシル化することを含む。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳでのアシル化は、元の第一級アミンから電荷を除去するアミド結合をもたらす。他の方法は、アルデヒドへの酸化のための最後から二番目のグリコシル単位シアル酸のペンダントジオールを標的とするように選択された条件下における標的の穏やかな酸化を使用する。次いで、得られたグリコアルデヒドをメトキシ−ＰＥＧ−ヒドラジド（Ｏ−（ヒドラジノカルボニルメチル）−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）と反応させて、ＰＥＧと標的間で半安定的なヒドラゾンを形成する。続いて、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによって、ヒドラゾンを還元して、安定なＰＥＧ連結物を得る。例えば、参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第６，５８６，３９８号（Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｕｌｙ １，２００３）を参照されたい。
化学的修飾ための技術の具体的な応用において、例えば、米国特許第４，００２，５３１号（参照により、その全体が、本明細書中に組み込まれる。）は、ポリエチレングリコール分子の酵素への付着のために、還元的アルキル化が使用されたことを述べている。米国特許第４，１７９，３３７号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）は、例えば、酵素及びインシュリンを含むＰＥＧ：タンパク質連結物を開示している。米国特許第４，９０４，５８４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）は、反応性アミン基を介してポリエチレングリコール分子を付着するためのタンパク質中のリジン残基の数を修飾することを開示している。米国特許第５，８３４，５９４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）は、例えば、タンパク質ＩＬ−２、インターフェロンα及びＩＬ−１ｒａを含む実質的に非免疫原性の水溶性ＰＥＧ：タンパク質連結物を開示している。Ｈａｋｉｍｉらの方法は、タンパク質中の様々な遊離アミノ基をＰＥＧに接続するための独特のリンカーを使用することを含む。米国特許第５，８２４，７８４号及び同第５，９８５，２６５号（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）は、Ｇ−ＣＳＦ及びコンセンサスインターフェロンを含む、Ｎ末端が選択的に化学的に修飾されたタンパク質及びその類縁体を可能とする方法を教示する。重要なことに、これらの修飾されたタンパク質は、タンパク質の安定性に関して利点を有するのみならず、加工に関する利点も提供する。
ＷＳＰ修飾は、Ｆｒａｎｃｉｓらの「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ ｖｉｖｏ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｅｄｓ．Ａｈｅｒｎ．，Ｔ． ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．）Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．，１９９１」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）中にも記載されており、使用されている。さらに別の態様において、Ｄｅｌｇａｄｏらの「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＰＥＧ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｔｒｅｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」、Ｆｉｓｈａｅｒら編集のＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８９ ｐｐ．２１１−２１３（参照により、全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている方法は、塩化トレシルを使用し、ＷＳＰ部分とポリペプチド部分の間に連結基をもたらさない。別の態様において、ＷＳＰの付着は、本分野において周知であるように、カルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシサクシニミジルエステルの使用を通じて実施される。
ＷＳＰを用いた標的の修飾についてのその他の記述に関しては、例えば、米国特許出願２００３００９６４００；ＥＰ０４４２７２４Ａ２；ＥＰ０１５４３１６；ＥＰ０４０１３８４；ＷＯ９４／１３３２２；米国特許第５，３６２，８５２号；同第５，０８９，２６１号；同第５，２８１，６９８号；同第６，４２３，６８５号；同第６，６３５，６４６号；同第６，４３３，１３５号；国際出願ＷＯ９０／０７９３８；Ｇａｅｒｔｎｅｒ ａｎｄ Ｏｆｆｏｒｄ，（１９９６），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：３８−４４；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒａｐ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２０００；１７：１０１−１６１；Ｋｏｐｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．，７４：１４７−１５８，２００１；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２００１；４０（７）：５３９−５１；Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．１９９７；８：１１１−１ １８；Ｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９９２；２５：４４７６−４４８４；Ｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ．１９９３；４：５４−６２；及びＦｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０（１９９２）（これらの開示内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
還元的アルキル化
一態様において、ＷＳＰの共有結合は、Ｎ末端αアミノ基を選択的に修飾するために、本明細書に記載されている還元的アルキル化化学的修飾手法及び本明細書に記載されている生物学的活性アッセイなどの所望の生物学的特徴に関して、得られた産物を検査することによって実施される。
タンパク質又はペプチドへＷＳＰを付着させるための還元的アルキル化は、あるタンパク質中の誘導体化のために利用可能な第一級アミノ基の異なる種類（例えば、リジンとＮ末端）の反応性の差を活用する。適切な反応条件下において、カルボニル基含有ポリマーをＮ末端に有するタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
還元的アルキル化のために、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有し得る。例えば、反応性アルデヒドは、水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド又はそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ若しくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号（その全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）参照）。１つのアプローチにおいて、ＰＥＧ−アルデヒド（Ｏ−（３−オキソプロピル）−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）を第一級アミンに連結するために、還元的アルキル化が使用される。適切な条件下で、このアプローチは、主としてタンパク質のＮ末端のα−アミンを通じて修飾されたＰＥＧ連結物を生成することが示された。
生物学的に活性な分子を連結させるのに有用なアルデヒド官能基は、隣接するアミノ及びアルコール基を有する官能基から生じさせることができる。ポリペプチドでは、例えば、過ヨウ素酸塩を用いた穏やかな条件下での酸化的切断を介して、アルデヒド官能基を生成させるために、Ｎ末端のセリン、スレオニン又はヒドロキシリジンを使用することができる。これらの残基又はそれらの均等物は、通常、例えばポリペプチドのＮ末端に存在することができ、化学的な若しくは酵素的な消化を介して露出され得、又は組み換え若しくは化学的方法を介して導入され得る。アルデヒドを生成させるための反応条件は、典型的には、メタ過ヨウ素酸ナトリウムのモル過剰を添加すること及びタンパク質中の他の位置での酸化を避けるための穏やかな条件下を含む。ｐＨは、好ましくは、約７．０である。典型的な反応は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムの１．５倍モル濃度過剰を添加し、続いて、暗所にて、室温で１０分間温置することを含む。
アルデヒド官能基は、ヒドラゾン又はセミカルバゾン結合を形成するために、ヒドラジド又はセミカルバジド官能基を含有する活性化されたポリマーに結合させることができる。ヒドラジド含有ポリマーは市販されており、必要であれば、標準的な技術を用いて合成することができる。本発明において使用するためのＰＥＧヒドラジドは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，２３０７ Ｓｐｒｉｎｇ Ｂｒａｎｃｈ Ｒｏａｄ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．３５８０１（現在は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１５０ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ ９４０７０−６２５６の一部）から入手することができる。アルデヒドは、２つの成分の溶液を一緒に混合し、反応が実質的に完了するまで、約３７℃まで加熱することによって、ポリマーに結合される。得られる連結物の量を増加させるために、典型的には、ポリマーヒドラジドの過剰が使用される。典型的な反応時間は２６時間である。反応試薬の熱的安定性に応じて、適切な結果を得るために、反応温度及び時間を変化させることができる。酸化及び連結の両者に対する反応条件の詳細な測定は、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈ，（１９９２），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６，及びＧｅｏｇｈｅｇａｎ，米国特許第５，３６２，８５２号（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
還元的アルキル化を用いる場合、還元剤は、水溶液中において安定であるべきであり、好ましくは、還元的アルキル化の最初プロセスにおいて形成されるシッフ塩基のみを還元することができる。還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ酸トリメチルアミン及びホウ酸ピリジンから選択されるが、これらに限定されない。
反応ｐＨは、使用されるタンパク質に対するポリマーの比に影響を及ぼす。一般に、反応ｐＨが標的反応性基のｐＫａより低ければ、タンパク質に対するポリマーのより大過剰が望ましい。ｐＨが標的ｐＫａより高ければ、ポリマータンパク質比はさほど高いことを要しない（すなわち、より反応性の基が利用可能であれば、より少ないポリマー分子が必要とされる。）。
従って、一態様において、リジン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα−アミノ基間のｐＫａ差を活用することができるｐＨで反応が実施される。このような選択的誘導体化によって、タンパク質への水溶性ポリマーの付着は制御される。ポリマーとの連結は、主として、タンパク質のＮ末端において起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性基の著しい修飾は起こらない。
従って、一態様において、ＷＳＰを標的化合物に共有結合するための方法が提供され、該方法は、他の化学的修飾化学を用いた場合に必要とされるようなさらなる大規模な精製の不存在下で、ＷＳＰ／タンパク質連結物分子の実質的に均一な調製物を与える。より具体的には、ポリエチレングリコールが使用される場合には、記載されている方法は、抗原性を示し得る結合基を欠く、Ｎ末端がＰＥＧ化されたタンパク質の作製を可能とする。すなわち、ポリエチレングリコール部分は、有毒な可能性がある副産物なしに、タンパク質部分に直接連結される。
選択されたＷＳＰの結合の方法に応じて、標的ペプチド又はタンパク質分子に結合されるＷＳＰ分子の割合は、反応混合物中におけるそれらの濃度と同様に変動する。一般に、（過剰な非反応タンパク質又はポリマーが存在しなくなるという反応効率の観点での）最適な比率は、選択されたＷＳＰの分子量によって決定される。さらに、非特異的な付着及び所望される種のその後の精製を伴う方法を使用する場合には、この比は、使用される反応性基（典型的には、アミノ基）の数に依存し得る。
精製
実質的に均一なＷＳＰ修飾された調製物を得る方法は、一態様において、種の混合物から修飾された化合物の主として単一の種を精製することによる。例として、実質的に均一な種は、（たとえ、同じ見かけの電荷を有する他の種が存在する可能性があったとしても）単一種に特徴的な電荷を有する物質を得るために、まず、イオン交換クロマトグラフィーによって分離され、次いで、所望の種が、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分離される。他の方法が報告されており、本発明によって想定されており、例えば、ＰＥＧを含有する水性二相系中でＰＥＧ／タンパク質付加物を分配することを含む、ＰＥＧ−タンパク質付加物の混合物を分画するための方法を記載する、１９９０年５月３日に公開されたＰＣＴＷＯ９０／０４６０６が含まれる。
従って、本発明の一態様は、ＷＳＰ−修飾された化合物の連結物を調製する方法であり、（ａ）水溶性ポリマーがα−アミノ基へ選択的に付着するように、タンパク質部分のアミノ末端のα−アミノ基を選択的に活性化するのに適したｐＨにおいて、還元アルキル下条件下で、２以上のアミノ基を有する化合物を水溶性ポリマー部分と反応させること、及び（ｂ）反応産物を得ることから構成される前記方法である。場合によって、特に、治療用産物に関して、反応産物は未反応部分から分離される。
ペプチドマッピング及びＮ末端配列決定によって確認されるように、ＰＥＧ化されたペプチド及び未反応ペプチドの混合物中に少なくとも５０％のＰＥＧ化されたペプチドを含む調製物が提供される。別の実施形態において、ＰＥＧ化されたペプチド及び未反応ペプチドの混合物中に少なくとも７５％のＰＥＧ化されたペプチド、ＰＥＧ化されたペプチド及び未反応ペプチドの混合物中に少なくとも８５％のＰＥＧ化されたペプチド、ＰＥＧ化されたペプチド及び未反応ペプチドの混合物中に少なくとも９０％のＰＥＧ化されたペプチド、ＰＥＧ化されたペプチド及び未反応ペプチドの混合物中に少なくとも９５％のＰＥＧ化されたペプチド及びＰＥＧ化されたペプチド及び未反応ペプチドの混合物中に少なくとも９９％のＰＥＧ化されたペプチドを含む調製物が提供される。
以下の実施例は、限定を意図するものではなく、本発明の具体的な実施形態を例示するものにすぎない。
ｍＦｃ−ＴＭＰ発現構築物の集合
マウスＦｃ及びＴＭＰを個別にコードするヌクレオチド配列（ＥＰ０１１２４９６１Ａ２に記載されている。）を組み合わせることによって、マウスＦｃ領域（ｍＦｃ−ＴＭＰ）を含むＴＭＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを構築した。ＰＣＲの第一巡において、ＰＣＲプライマー３１５５−５８（配列番号１０２２）及び１３８８−００（配列番号１０２３）を用いて、マウスＦｃをコードする成分を増幅した。
Figure 0005873854
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得られたＰＣＲ断片をゲル精製し、プライマー１２０９−８５（配列番号１０３０）及び１３８８−００（配列番号１０３１）を用いるＰＣＲの第二巡のために、単一のチューブ中にまとめた。増幅のこの第二巡から得られるＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化した。消化断片を精製し、同じ酵素で予め消化されたベクターｐＡＭＧ２１中に連結した。電気穿孔を介して、この連結混合物をイー・コリ中に形質転換し、ＬＢ＋カナマイシン培地上に播種した。ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定を介して、コロニーをスクリーニングした。ｍＦｃ−ＴＭＰ融合タンパク質（配列番号１０３３）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０３２）を有する陽性クローンを同定し、６３９７と名付けた。
マウスＦｃ−ＴＭＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３４）
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マウスＦｃ−ＴＭＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３５）
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株６３９７の発酵
震盪フラスコ中での株６３９７の種培養を加えた、滅菌されたＬｕｒｉａブロス５００ｍＬの接種によって、株６３９７の発酵を開始した。細胞密度が６００ｎｍにおいて０．９に達した時点で、錯体をベースとした増殖培地１０Ｌ（グリセロール８００ｇ、トリプチカーゼ５００ｇ、クエン酸ナトリウム３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４２０ｇ、ＦｌｕｋａＰ−２０００消泡剤５ｍｌ、微量金属１０ｍＬ（塩化第二鉄２７．０ｇ／Ｌ、塩化亜鉛２．００ｇ／Ｌ、塩化コバルト２．００ｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２．００ｇ／Ｌ、塩化カルシウム１．００ｇ／Ｌ、硫酸銅１．９０ｇ／Ｌ、ホウ酸０．５０ｇ／Ｌ、塩化マンガン１．６０ｇ／Ｌ、クエン酸ナトリウム二水和物７３．５ｇ／Ｌ）、ビタミン１０ｍＬ（ビオチン０．０６０ｇ／Ｌ、葉酸０．０４０ｇ／Ｌ、リオフラビン０．４２ｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸１．４０ｇ／Ｌ、ナイアシン６．１０ｇ／Ｌ、パントテン酸５．４０ｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム５．３０ｍｌ／Ｌ）及び１０Ｌになるようにする水）を含有する１５Ｌの発酵装置に接種するために、本内容物を使用した。発酵装置は３７℃及びｐＨ７に維持し、溶解酸素レベルを３０％飽和の最小限に保った。細胞密度が６００ｎｍにおいて１３．１ＯＤ単位に達した時点で、Ｎ−（３−オキソ−ヘキサノイル）ホモセリンラクトン０．５ｍｇ／ｍＬの１０ｍＬを添加することによって、培養を誘導した。誘導から６時間後に、ブロスを１０℃まで冷却し、５℃で６０分間、４５５０ｇでの遠心によって、細胞を採集した。次いで、細胞ペーストを−８０℃で保存した。
タンパク質の再折り畳み
ｍＦｃ−ＴＭＰを発現する株６３９７から得られたイー・コリペースト（３００ｇ）を２２５０ｍＬ溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に溶解し、冷却された微溶液化装置を、１３，０００ＰＳＩで２回通過させた。次いで、４℃で６０分間、１１，３００ｇにてホモジネートを遠心した。上清を廃棄し、組織粉砕機を用いて、水２４００ｍＬ中にペレットを再懸濁した。次いで、４℃で６０分間、１１，３００ｇにてホモジネートを遠心した。上清を廃棄し、組織粉砕機を用いて、水２００ｍＬ容積中にペレットを再懸濁した。４℃で３０分間、２７，２００ｇで、ホモジネートを遠心し、上清を廃棄した。組織粉砕機を用いて、ニワトリ卵白リゾチーム３５ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えた２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０の２８ｍＬ中に、ペレットの約１２．５％を再懸濁し、３７℃で２０分間温置した。温置後、２２℃で３０分間、２７，２００ｇで、懸濁液を遠心し、上清を廃棄した。８Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０の３５ｍＬ中に、ペレットを再懸濁し、その後、１ＭＤＴＴ３５０μＬ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、３７℃で３０分間、物質を温置した。次いで、２２℃で３０分間、２７，２００ｇで溶液を遠心した。次いで、４℃で、穏やかに撹拌しながら、１ｍＬ／分で、再折り畳み緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ塩基、１６０ｍＭアルギニン塩酸塩、３Ｍ尿素、２０％グリセロール、ｐＨ９．５、１ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミン塩酸塩）に上清を移した。
構築物の精製
穏やかに撹拌しながら、４℃で、約４０時間温置した後、３０ｋＤａカートリッジ（Ｓａｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた接線流限外ろ過装置、続いて、Ｑ−ＢｕｆｆｅｒＡ（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０）の３Ｌに対する透析ろ過によって、実施例３に記載されている再折り畳み溶液を５００μＬまで濃縮した。Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ａフィルターを通して、濃縮された材料をろ過し、１５ｍＬ／分で、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅファーストフローカラム８６ｍｌ（２．６ｃｍ ＩＤ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に搭載した。Ｑ−ＢｕｆｆｅｒＡの数カラム容積で樹脂を洗浄した後、１０ｍＬ／分で、６０％Ｑ−ＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）への２０カラム容積線形グラジエントを用いて、タンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、１ｍＬ／分で、プールをＭｕｓｔａｎｇＥシリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）に通した。０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターを通して、ろ過された物質に２度目のろ過を行い、−８０℃で保存された。
タンパク質のＰＥＧ化
２０ｍＭＮａＣＮＢＨ３を含有する１００ｍＭ中の酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中のｍＦｃ−ＴＭＰの、冷却され（４℃）、撹拌された溶液（３．５ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ）に、メトキシポリエチレングリコールアルデヒド（ＭＰＥＧ）（平均分子量、２０ｋＤａ）（Ｎｅｋｔａｒ）の３．８倍モル過剰を添加した。同じ温度で、反応混合物の撹拌を継続した。反応の間のタンパク質修飾の程度は、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０を加えた０．０５Ｍリン酸緩衝液を用いて、０．４ｍＬ／分で溶出されるＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ１０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＳＥＣＨＰＬＣによってモニターした。１６時間後に、ＳＥＣＨＰＬＣ分析は、タンパク質の大半がＭＰＥＧに連結されたことを示した。この時点で、反応混合物を、２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．１２へ緩衝液交換した。２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．１２で平衡化されたＨｉＴｒａｐＨＰＱカラム１ｍＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーによって、ＭＰＥＧ−ｍＦｃ−ＡＭＰ２連結物を単離した。０．５ｍＬ／分の流速で、反応混合物をカラム上に搭載し、出発緩衝液の３カラム容量を用いて未反応のＭＰＥＧアルデヒドを溶出した。タンパク質−ポリマー連結物を溶出するために、０．５ＭＮａＣｌを含有する２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．１２の０％から１００％への線形２０カラム容量グラジエントを使用した。上述のように、ＨＰＬＣＳＥＣによって、イオン交換クロマトグラフィー分離中に集められた画分（２ｍＬ）を分析した。（ＳＥＣＨＰＬＣによって測定された）概ね２．３：１の比でモノ及びジ−ＭＰＥＧ−ｍＦｃ−ＴＭＰ連結物を含有する画分を濃縮し、滅菌ろ過した。
インビボでの試験
ＢＤＦ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を、１０の群に分け、希釈剤（０．１％のウシ血清アルブミンを加えたＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ）又は試験モノ及びジ−ＭＰＥＧ−ｍＦｃ−ＴＭＰ連結物タンパク質５０μｇ（上述のとおり）／ｋｇ動物を加えた希釈剤の何れかを、０、２１及び４２日目に皮下注射した。各群を半分に分け、日を隔てて（０、３、５、７、１０、１２、１４、１９、２４、２６、２８、３１、３３、４０、４５、４７、４９、５２及び５９日目）、後眼窩洞から採血（１４０μＬ）した。５９日目に、採血に先立って、イソフルランでマウスを麻酔した。マウスソフトウェアを備えたＡＤＶＩＡ１２０自動血液分析装置（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を用いて、全血球数及び白血球百分率に関して、収集した血液を分析した。
凍結乾燥されたヒトＦｃ−ＴＭＰ
最初の凍結乾燥された製剤のスクリーニング研究
本実施例７に記載されているヒトＦｃ−ＴＭＰペプチボディは、Ｎ末端に開始メチオニンを有する配列番号１０１７に示す二量体形態に対応する（ヒトＦｃは、配列番号１である。）。
幾つかのクロマトグラフィー技術、すなわち、逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（これらは全て、上昇した温度で安定性を示した。）によって、Ｆｃ−ＴＭＰの安定性を評価した。加速された、冷蔵された及び凍結された温度での化学的及び物理的分解に関して、０．１から４０ｍｇ／ｍＬの濃度にわたる製剤を調べた。変動するｐＨ並びにケーキ形成剤としてマニトール又はグリシンを含めること並びに凍結乾燥保護剤としてショ糖を含めることに関して、Ｆｃ−ＴＭＰの安定性を評価した。他の候補（グリシン）はタンパク質の安定性の改善を示さなかったので、さらなる最適化のために、マニトール及びスクロースを最終的に選択した。０．００２から０．１％の濃度範囲にわたって凍結乾燥した際に、Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート−２０）も凝集を阻害することが示された。４から８のｐＨ範囲にわたって、スクリーニング研究において、以下の緩衝液、すなわち、グリシン、サクシナート、ヒスチジン、ホスファート及びＴｒｉｓを調べた。これらのスクリーニング研究から、Ｔｗｅｅｎ−２０の少量（０．００４％）が添加された、ｐＨ５のヒスチジン緩衝液中に調合されたＦｃ−ＴＭＰが、安定性のためにより最適であることが示された。
Ｆｃ−ＴＭＰ製剤中のスクロース及びＴｗｅｅｎ−２０の検証
その後の開発の努力は、（病院において予想される投薬必要量を含めるために）約０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の製剤中におけるスクロース、マニトール及びＴｗｅｅｎ−２０のレベルを検証することに集中した。安定性を最適化する上でのスクロース、マニトール及びＴｗｅｅｎ−２０の効果が、これらの研究において示された。製造上の問題及び懸念を予想するために、追跡研究も開始した。
スクロースは、上昇した温度での化学的分解を最小限に抑える上で有益である。
変動するスクロース及びマニトール濃度の、Ｆｃ−ＴＭＰの安定性に対する影響を検査した。病院で予想される濃度範囲を包含するために、０．３及び２ｍｇ／ｍＬでタンパク質を調合した。さらに、０．００４％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えて及び加えずに、試料を調製した。スクロースの量を変動させ、等張性を維持するために、各スクロース濃度にマニトールのレベルを調整することによって、スクロース：マニトールの比を変化させた。スクロース：マニトールの以下の比を調べた（容量当りの％重量として表されている。）。０．２：５．１；０．５：４．８；１：４．５；１．５：４．３及び２：４。
スクロース：マニトールのより高い比が、陽イオン交換及び逆相ＨＰＬＣによってモニターした場合の化学的分解を最小化することが示されている。表３９に示されているように、当初及び３７℃で１８週間にわたるＦｃ−ＴＭＰの高温保存後に、パーセント主ピークを比較する。陽イオン交換主ピークの最大の喪失は、液体製剤（１０ｍＭアセタート、５％ソルビトール、ｐＨ５中に調合されたＦｃ−ＴＭＰ）、次いで、それぞれ、０．２、０．５及び１．０％スクロースを有する凍結乾燥された製剤において生じる。化学的分解を最小化する上でのスクロースの保護的効果は、高温保存後の試料の逆相ＨＰＬＣ分析によっても観察された（表３９）。（Ｆｃ−ＴＭＰの逆相ＨＰＬＣ分析から測定された）パーセント主ピークは、低スクロースレベルで大幅に低下するが、１％超のスクロース濃度を有する製剤では、有意に変化するようには見受けられない。総合して解釈すると、これらの結果は、スクロースレベルを１．５％又はそれ以上に維持することが凍結乾燥時のＦｃ−ＴＭＰの安定性にとって不可欠であることを示している。
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液体対照（１０ｍＭアセタート、５％ソルビトール、ｐＨ５製剤）中のＦｃ−ＴＭＰの前及び後主ピーク領域は著しく増大しているのに対して、スクロースのより低量を有する凍結乾燥された試料を分析すると、タンパク質は後主ピーク領域中により多量の分解を示す。（高温保存後に）液体安定性試料を加えた従前の研究は、タンパク質中のグルタミン及びアルギニンから脱アミド化が生じ、これは、液体試料中の前ピーク領域の増大に寄与している。
冷蔵温度では、長期保存後の凍結乾燥された製剤中に、陽イオン交換及び逆相ＨＰＬＣによって、化学的分解は観察されない。例えば、陽イオン交換クロマトグラムは、様々な温度（−８０℃、４℃及び調節された室温、６ヶ月）下で明白な変化を示さなかった。調節された温度及びこれより低い温度で、長期にわたり、凍結乾燥された製剤中に化学的分解は存在しなかったので、凍結乾燥に付随する物理的凝集を最小限に抑えることに製剤開発作業の多くを集中した。
Ｔｗｅｅｎ−２０は、凍結乾燥によって誘導された凝集を最小化する
凍結乾燥後に明白である凝集の少量を最小化するために、低濃度（０．００４％）のＴｗｅｅｎ−２０を含めることが必要である。これは、Ｔｗｅｅｎ−２０を添加して及び添加せずに、安定性に関して試料を評価する幾つかの安定性研究から得られる関連する結果を調べることによって示すことができる。
Ｔｗｅｅｎ−２０の幅広い範囲を探索して、凝集を最小化するために必要とされる量を調べるために、まず、Ｆｃ−ＴＭＰのより高いタンパク質濃度を使用した。本研究におけるＦｃ−ＴＭＰ濃度は２０ｍｇ／ｍＬであり、Ｔｗｅｅｎ−２０のレベルは、０．００２、０．００４、０．００６及び０．０１％に設定した。４℃での１年間の保存後に、Ｔｗｅｅｎ−２０を加えた全ての製剤中で、凝集は０．１％未満に限定される。６ヶ月の結果も、有意な凝集を示さなかった。本明細書に論述されているように、０．５ｍｇ／ｍＬのＦｃ−ＴＭＰに対して設計された製剤研究において、さらなる検討のために０．００４％のＴｗｅｅｎ−２０を選択した。
表４０は、４℃で０、３及び１１ヶ月保存した後にモニターされたＦｃ−ＴＭＰ中の凝集の量を示している。本研究では、先述された製剤中において及びＴｗｅｅｎ−２０が添加されていない、変動するスクロース：マニトール比を有する製剤中において、０．５ｍｇ／ｍＬでＦｃ−ＴＭＰを凍結乾燥した。さらに、Ｔｗｅｅｎ−２０が加えられておらず、ｐＨ４．５、５及び５．５で緩衝化された現行製剤中で安定性を追跡した。結果は、先述の製剤のみがｐＨ５で最小の凝集を有することを示している。Ｔｗｅｅｎ−２０を含まない製剤では、凝集は０．５％から約５％まで変動する。また、ｐＨ５で検出されたものに比べて、ｐＨ４．５及び５．５では、凝集はより高い。典型的には、レベルは約５％であるので、より低いスクロース：マニトール比（０．２、０．５及び１％スクロース製剤）はより高い凝集を有する。時間が経過するにつれて、凝集のレベルは、先述の製剤中で、及びＴｗｅｅｎ−２０を含まない製剤中で、１年を通じて一貫している。
Figure 0005873854
 １１１ヶ月の時点での評価のために、最適化された製剤試料を選択した。
凝集を最小化する上でのＴｗｅｅｎ−２０の有益な効果を確認するために、さらなる製剤研究を設計した。これらの研究における試料の全ては、０．００４％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えて及び加えずに、ｐＨ５で調合した。表４１は、安定状態で、ゼロ、１８週及び１年にわたって、４℃で保存した後の％凝集を列記している。ゼロの時点（凍結乾燥直後）では、０．００４％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えた試料の全てにおいて、凝集は最小限である。Ｔｗｅｅｎ−２０を加えていない試料中では、凝集の少量が観察され、０．２％スクロースを加えた製剤中に、最高量が見出された。凝集を最小化する上でのＴｗｅｅｎ−２０の有効性は、１８週の時点まで持続し、Ｔｗｅｅｎ−２０を欠く試料及び低スクロース：マニトール比の試料中で、より高い％凝集が見出された。４℃での１年間の保存後に、Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する試料中で、凝集は一貫して低い。
Figure 0005873854
 １１年の時点での評価のために、Ｔｗｅｅｎ−２０を加えた試料を選択した。
化学的分解を最小限に抑える上での抗酸化剤の有効性を検査するために設計された別の安定性研究は、Ｔｗｅｅｎ−２０の保護効果を補強した。抗酸化剤は、高温保存時に、化学的分解を最小限に抑える上で影響を有していなかった。しかしながら、０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０を有し、０．２ｍｇ／ｍＬのＦｃ−ＴＭＰ濃度の前記製剤は、ゼロ時点で、０．１％未満の凝集を有し、４℃で５ヶ月間の保存後に０．１％の凝集を有していた。Ｔｗｅｅｎ−２０を加えていない同じ製剤は、ゼロ時点で０．４％の凝集を有しており、５ヶ月間の保存後に１％の凝集を有していた。
表ＩＩ、ＩＩＩ及び先述の研究に示されている安定性研究の結果は、凍結乾燥時に凝集を最小化する上でのＴｗｅｅｎ−２０の保護効果を示している。４℃で１年の時点まで、０．００４％Ｔｗｅｅｎ−２０とともに調合された試料中の凝集の有意な増加を示さないので、経時的な凝集の増大は最小限である。Ｔｗｅｅｎ−２０の添加が凍結乾燥時に凝集を最小化することを示すこれらの安定性研究の結果に基づいて、推奨される製剤を用いて、スケールアップ研究を開始した。
スケールアップ研究
凝集は濃度依存的である
製造条件の模擬実験を行い、運送時の負荷及び再構成時の安定性に関する製剤の頑強性を調べるために、最初のスケールアップ研究を設計した。より大規模なプロセスと同様に、接線流ろ過装置を用いて、Ｆｃ−ＴＭＰを製剤緩衝液中に緩衝液交換した。続いて、０．５及び０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで、タンパク質を希釈し、最終ろ過工程前に、Ｔｗｅｅｎ−２０も添加した。試料を充填した後、凍結乾燥を行った。典型的な凍結乾燥工程が以下に記載されている。
Figure 0005873854
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熱処理工程
４℃での受動的保存は、低いＦｃ−ＴＭＰ濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ）で、より多くの凝集をもたらした。ゼロ時点で、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、０．１ｍｇ／ｍＬ製剤中での凝集は０．４％であると測定されたのに対して、０．５ｍｇ／ｍＬで調合されたタンパク質中には、０．１％凝集が検出された。冷蔵された温度での６ヶ月の保存後、Ｆｃ−ＴＭＰの両濃度に対して、ゼロ時点の試料に関して観察されたとおり、凝集は同じレベルに留まっており、以前の安定性研究の結果と合致していた。最低濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ）で、凝集のより高い量が観察されたので、さらなるスケールアップ研究のために選択する濃度として、０．５ｍｇ／ｍＬが最も適していることが決定された。
模擬剪断応力時に、凝集は増加しない
ストレスシミュレーション装置の補助を得て、最初のスケールアップ研究から得られた（再構成されていない）凍結乾燥された試料を模擬陸上輸送及び空輸にも供した。要約すれば、米国試験方法協会（ＡＳＴＭ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ）に概説されているプロトコール、方法＃Ｄ−４７２８に従った。模擬陸上輸送及び空輸は、Ｅｌｅｃｔｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｖｉｂｒａｔｉｏｎ Ｔａｂｌｅ，Ｍｏｄｅｌ Ｓ２０２及びＰｏｗｅｒ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ，Ｍｏｄｅｌ＃ ＴＡ２４０（Ｕｎｈｏｌｔｚ−Ｄｉｃｋｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＣＴ）を用いて行った。輸送ストレス後に、凍結乾燥されたケーキの物理的概観を受動対照と比較したが、ケーキの形態学的な変化は明確でないという結果が得られた。化学的安定性と物理的安定性は何れも許容され、ストレス負荷された試料と受動対照における凝集は一致していた（０．１ｍｇ／ｍＬ試料における０．４％と比べて、０．５ｍｇ／ｍＬ試料では０．１％未満）。
本研究では、再構成直後の試料を調製し、受動的に、ゆっくりと回転させ、又は激しく震盪して、３、７及び１４日間温置することによって、再構成時の安定性を調べた。表４２は、０．１及び０．５ｍｇ／ｍＬ製剤に対する結果を示している。予想通り、０．５ｍｇ／ｍＬの製剤において、凝集の量は最小限である。期間中遅く回転している試料と回転されていない試料を比較したが、１４日の期間にわたって、凝集の有意な増加は見られない。これらの製剤（非回転及び回転）中の二量体化の量も一貫している。興味深いことに、震盪結果は、ある傾向を示すように見受けられる。すなわち、０．１及び０．５ｍｇ／ｍＬの両試料で、ゼロ時点後に、凝集が検出可能なレベル未満に低下する。一方、各時点で、震盪された試料の多くで、観察された二量体化の量の対応する増加が存在し、Ｆｃ−ＴＭＰへの剪断応力に際して、凝集から二量体状態へ移行する上で、幾らかの可逆性が存在することを示唆している。
Figure 0005873854
凍結乾燥サイクル中での１２時間にわたる二次乾燥は、残留水分を最小化するのに十分である。
Ｆｃ−ＴＭＰが緩衝液交換され、推奨される製剤中に０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈される第二のスケールアップ研究を行った。凍結乾燥は、−５０℃での最初の凍結工程に続く、−１３℃での徐冷からなるサイクルを用いて達成した。次いで、−５０℃まで温度を低下させ、一時間維持し、１００ｍＴｏｒｒの真空設定点で、−５０℃で一次乾燥を開始した。−５０℃での短時間の保持期間後に、２時間にわたって、温度を−２５℃まで減少させ、−２５℃に２０時間維持し、二次乾燥の開始のため、約２７時間後に、２５℃まで徐々に上昇させた。二次乾燥は、２５℃で最短１２時間にわたって継続した。凍結乾燥サイクルの間、安定性をチェックし、残留水分のレベルを比較するために、二次乾燥の１２、１８及び２４時間後に、試料を抜き取った。結果は、ＫａｒｌＦｉｓｈｅｒ滴定によって測定したところによれば、調べた全ての試料で、残留水分が約０．６％又はそれ以下である（表４３）ことを示している。緩衝液プラセボケーキにおいて、水分は、同様に、低い。この研究に基づいて、凍結乾燥サイクルの二次乾燥時間は、１２から１８時間の間の範囲まで短縮することができる。
Figure 0005873854
試料は化学的又は物理的安定性に関して差を有していなかったので、安定性の結果も、この二次乾燥時間の範囲にわたって同等である。例えば、調査した全ての試料に関して、凝集の量は０．１％未満であるのに対して、％二量体は、一貫して０．１％である。これらの結果は、タンパク質の初期安定性に影響を与えずに、二次乾燥時間を２４時間未満まで短縮することができることを確認する。
変動する賦形剤濃度に関して、製剤の頑強性を評価するために、さらなる研究を実施した。以前の安定性研究は、例えば、スクロースが安定性に対して影響を有し得ることを示しているので、賦形剤レベルの僅かな変化に際してのＦｃ−ＴＭＰの頑強性を調べる必要があった。
Ｆｃ−ＴＭＰの統計学的研究
製剤の頑強性
製剤ｐＨ、ヒスチジン緩衝液強度及びスクロース：マニトール比などの製剤変数の僅かな変化を調べるために、Ｅ−ｃｈｉｐソフトウェアパッケージを用いて初期統計学的研究を設計した。これらの試料は凍結乾燥されたが、最適でない凍結乾燥サイクルが使用され、典型的に観察される凝集より高い凝集がもたらされた。本研究は、線形応答表面を仮定するスクリーニング研究であった。安定性評価の結果は、ｐＨ（４．７から５．３）及びヒスチジン緩衝液強度（５から１５ｍＭを変動）、Ｆｃ−ＴＭＰの安定性に対してほとんど影響を与えなかった。Ｆｃ−ＴＭＰの全体的な安定性における、Ｔｗｅｅｎ−２０及びスクロース：マニトール比の寄与を確認するために、より最適な凍結乾燥サイクルを用いて、追跡統計的設計研究を開始した。
二次統計的安定性研究
第二の統計設計研究は、Ｔｗｅｅ−２０（０．００１％、０．００４５％及び０．００８％）、スクロース：マニトール比（１．７：４．２、２：４及び２．３：３．８）の変動並びにタンパク質濃度の変動（０．３、０．６５及び１ｍｇ／ｍＬ）を調べた。製剤のｐＨも、４．７、５及び５．３に調整し、ヒスチジン緩衝液強度は、７、１０及び１３ｍＭから変動した。試料を調製し、前の安定性研究のために使用された、最適化された保守的サイクルを用い、Ｖｉｒｔｉｓ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ（ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ）を使用して凍結乾燥した。安定性の結果は、Ｅ−ｃｈｉｐ（統計的設計ソフトウェアパッケージ、Ｈｏｃｋｅｓｓｉｎ，ＤＥ）を用いて、ゼロ時点で観察された凝集及び二量体化の量に対する製剤変数の影響の評価並びにゼロ時点からの変化の速度によって測定された、高温（３７℃）保存安定性に影響を与える上での製剤変数の効果という２つの方法で解釈された。
二次統計的研究から得られたゼロ時点製剤の結果
ゼロ時点での評価から得られた結果は、予想通り、Ｔｗｅｅｎ−２０が凝集を最小化することを示したが、凍結乾燥時に凝集する傾向を低下させる上で、タンパク質濃度も有意であった。Ｅ−ｃｈｉｐソフトウェアプログラムは、凍結乾燥の間に、異なる入力変数（製剤条件）がＦｃ−ＴＭＰ凝集及び二量体化合に対して及ぼす影響を評価する。ゼロ時点でのＦｃ−ＴＭＰ二量体化に関して、製剤の１つの賦形剤は有意な効果を有しないと考えられた（Ｅ−ｃｈｉｐの結果に基づく。）。幾つかの製剤変数が、Ｆｃ−ＴＭＰの凍結乾燥に際して観察される凝集の量に影響を与えた。Ｅ−ｃｈｉｐによって与えられたまとめの結果に基づけば、Ｆｃ−ＴＭＰ濃度は、ゼロ時点で観察された凝集の程度に対して最も大きな効果を有し、その後に、Ｔｗｅｅｎ−２０レベルが続いた。凝集は、ゼロ時点では、低濃度産物で最も高いことが観察される。同様に、Ｔｗｅｅｎ−２０のより高い量は、ゼロ時点での凝集を最小限に抑える上でより高い保護効果を有するが、この傾向は、タンパク質濃度の効果ほど有意ではない。本研究では、以前の研究と比べて、凝集のより高い量が観察され、幾つかの試料では、Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたより低いタンパク質濃度で、０．５％の凝集が観察された。
タンパク質濃度が増加するにつれて、凝集の変動が低下することが観察された。０．５ｍｇ／ｍＬ及びこれより高い濃度で、Ｆｃ−ＴＭＰは、０．３ｍｇ／ｍｌで又は０．３ｍｇ／ｍｌ未満で調合された試料中において、より低い平均凝集を有する。
０．００４％のＴｗｅｅｎ−２０は、高温保存時の凝集を最小限に抑える上で有効である。
本統計的設計研究は、高温保存時の変化を評価するためにも使用された。最初の（ゼロ時点）結果から高温結果を差し引き、一ヶ月の時点に標準化することによって、３７℃で１６日後に、様々な製剤条件中での凝集の割合を比較した。従って、負の割合は、時が経過するにつれて、測定された特性が明白に喪失することを表す。応答変数（アッセイから得られた結果に対応する。）は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（パーセント主ピーク純度及び前ピークパーセント）、陽イオン交換ＨＰＬＣ（パーセント主ピーク純度）、サイズ排除ＨＰＬＣ（凝集及び二量体形成）及びＮＩＲ−水（赤外線分光法による残留水分、これは、正確性を確認するために、幾つかの試料では、ＫａｒｌＦｉｓｈｅｒ滴定の結果と相関付けられた。）を通じて測定した。
各アッセイ技術から得られた変化の割合の比較から得られた結果は、凝集及びＲＰ−ＨＰＬＣ酸化の変化が、２標準偏差以内まで、Ｆｃ−ＴＭＰ濃度及びＴｗｅｅｎ−２０二乗濃度に関して統計学的に有意であることを示している。Ｔｗｅｅｎ−２０の二乗項は、曲線状応答表面を仮定する本研究の二次的性質に起因するものである可能性が最も高い。本事例では、おそらく、安定性に影響を与えるそれ自身との相互作用効果が存在することを示唆することに加え、二乗されたＴｗｅｅｎ−２０項は、モデルによりよく適合する。陽イオン交換ＨＰＬＣ主ピーク純度または変動されたｐＨ条件などの測定された他の応答は、例えば、タンパク質の安定性に影響を与える上で、有意な応答を全く示さなかった。
先述した最初のスケールアップ研究（回転、非回転及び震盪試料）の場合と同じように、凝集の量は、高温保存後により低い。Ｔｗｅｅｎ−２０の保護効果を予想するための統計モデル（二次研究）に基づく予想を行うために、これらの試料の変化率を使用した。表４４は、Ｔｗｅｅｎ−２０濃度が０から０．００８％まで上昇するにつれて、統計的設計モデルに基づいて予想された凝集の量に関する予測を示している。示されているように、凝集が増大すると予想される０％Ｔｗｅｅｎ−２０の場合を除き、３７℃で１ヶ月に標準化された凝集の割合は負である（これらの条件での凝集物の喪失を示す。）。０．００２％及びこれより高いＴｗｅｅｎ−２０濃度では、凝集物の喪失速度は一定となり、物理的分解を最小限に抑える上で、低レベルのＴｗｅｅｎ−２０（０．００２から０．００６％）が十分であることを示唆している。二量体の増殖速度は、これに対応して、これらの条件下では類似しており、先述のように、製剤賦形剤の何れとも統計的に相関していなかった。
Figure 0005873854
０．５ｍｇ／ｍＬで、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定された酸化の変化率は、これが各クロマトグラムの前ピーク領域の変化に対応すると仮定すると、Ｔｗｅｅｎ−２０二乗項に関して、統計的に有意でない。この場合には、（表４４に示されているような）モデルは、Ｔｗｅｅｎ−２０濃度が変動されるにつれて、酸化率は予測区間の限界と合致することを予測する。（Ｔｗｅｅｎ−２０を０．００４％に保ちながら）タンパク質濃度が０．３から０．１ｍｇ／ｍＬまで低下するにつれて、増殖の速度が０．５８から２．６９まで増加するので、タンパク質濃度は酸化に影響を与える。
これらの結果は、Ｔｗｅｅｎ−２０濃度を０．００２から０．００６％まで維持することが安定性の見地から望ましいことを示唆している。０．５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度では、安定性がより悪いので、タンパク質の量も重要である。
冷蔵温度安定性
上記を検討して、凍結乾燥されたＦｃ−ＴＭＰ：１０ｍＭヒスチジン緩衝化ｐＨ５、２％スクロース、４％マニトール及び０．００４％Ｔｗｅｅｎ−２０中の０．５ｍｇ／ｍＬＦｃ−ＴＭＰの冷蔵温度安定性を評価するために、以下の製剤を使用した。
１年の期間にわたって、冷蔵温度安定性に関して、製剤をモニターした。表４５は、本研究から得られた安定性の結果を示しており、ゼロ時点、３ヶ月及び１年から得られた結果が列記されている。示されているとおり、逆相及び陽イオン交換ＨＰＬＣによって測定されたパーセント主ピーク純度は、時間とともに減少しないように見受けられる。経時的な主ピーク純度の僅かな差は、クロマトグラフィーカラムの分解における正常な変動の典型であり、凍結された標準中でも観察される。パーセント凝集は一貫しており、１年後に増大するようには見受けられない。
Figure 0005873854
Ｆｃ−ＴＭＰを、２％スクロース、４％マニトール及び０．００４％Ｔｗｅｅｎ−２０を有する、ｐＨ５．０で緩衝化された１０ｍＭヒスチジン中に調合する。ｐＨ５は安定性に関してより適しており、このタンパク質系に対する高温での保存に際する化学的分解を最小限に抑える上で、スクロース：マニトール比が重要であることが示された。凍結乾燥プロセスの結果として生じる凝集の量を最小限に抑えるために、Ｔｗｅｅｎ−２０は低濃度で必要とされる。スケールアップ用途のための安定性研究は、これらの結論を裏付ける。タンパク質濃度が０．５ｍｇ／ｍＬである必要があることなど、製剤中の各賦形剤のレベルを検証するための統計学的研究も設計した。推奨される製剤の冷蔵温度安定性は、４℃で１年間の保存後に、有意な分解を示さない。
凍結乾燥されたＦｃ−Ａｎｇ−２結合ペプチド
凍結乾燥されたＦｃ−Ａｎｇ−２結合ペプチドに対する最適な製剤を決定するために、様々なｐＨ値、賦形剤濃度及びタンパク質濃度でＦｃ−Ａｎｇ−２結合ペプチド凝集及び安定性を評価する分析を行った。
Ｆｃ−Ａｎｇ−２結合ペプチドは、ＩｇＧ１抗体分子のＦｃ部分のＣ末端に連結された、医薬として活性な２つのポリペプチド分子からなる。分子は、６３，５１１ダルトンの総分子量を有する５７４アミノ酸残基から構成される。分子のｐＩは、５．４５である。活性なポリペプチドのそれぞれの上に、２つのジスルフィド結合が存在する。分子全体に計２０のシステイン残基が存在し、これらの多くは、ジスルフィド架橋において酸化されている。Ｆｃ−Ａｎｇ−２結合ペプチドの配列は、以下のとおりである。
Figure 0005873854
ＩｇＧ１のＦｃ部分は、Ｋ２２８で終了する。Ｇ２２９−Ｇ２３３は、リンカー配列から構成される。活性なポリペプチドはＡ２３４から始まり、配列の残部に及ぶ。
凍結乾燥されたＦｃ−Ａｎｇ−２結合ペプチドのｐＨスクリーニング
ｐＨスクリーニングは、ｐＨ４．０、７．０及び８．０でのＦｃ−Ａｎｇ−２結合ペプチドの安定性を調べた。ｐＨ４．０で、スクリーニングされた緩衝液は、グルタミン酸、クエン酸ナトリウム及びコハク酸ナトリウム（それぞれ、１０ｍＭの濃度）を含んだ。ｐＨ７．０で、スクリーニングされた緩衝液は、ヒスチジン及びｔｒｉｓ（何れも、１０ｍＭ濃度）であった。ヒスチジン及びＴｒｉｓ（それぞれ、１０ｍＭ）は、ｐＨ８．０でもスクリーニングした。緩衝液の各々は、凍結乾燥ケーキ剤として４％マニトールを、賦形剤として２％スクロースを含有した。さらに、界面活性剤０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｗ／ｗ）の存在下及び不存在下で、ｐＨ７．０のヒスチジン緩衝液を調べた。製剤緩衝液の各々を用いて、タンパク質を５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ついで、１０，０００Ｄａ分子量排除限界を有する透析チューブを用いて、この溶液を製剤緩衝液の各々の中に透析した。ここでは、交換間の平衡化を最短４時間として、計６つの交換を行った。透析後に、１ｍＬの充填容積で、３ｃｃのガラス容器中にタンパク質を分取した。次いで、実験室規模の凍結乾燥装置を用いて、これらの容器を凍結乾燥した。凍結乾燥後に、容器を密封し、４℃、２９℃及び３７℃での温置のために保存し、凍結乾燥直後に始まり、２４ヶ月の期間に及ぶ時間にわたる様々な時点で、それぞれの容器を抜き取り、分析した。水の適切な容積で試料を再構成し、サイズ排除液体クロマトグラフィー及びゲル電気泳動（凝集、二量体化及びタンパク分解切断を検出する）、陰イオン交換液体クロマトグラフィー（酸化を検出する）を用いて、タンパク質の安定性に関して分析した。さらに、再構成時間及び水分などのケーキの特性並びに再構成された液体溶液の特性を分析した（ｐＨなど）。
凍結乾燥されたＦｃ−Ａｎｇ−２結合ペプチド賦形剤研究
単一の緩衝液１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７．０中で、賦形剤スクリーニングを実施した。本研究で比較された２つの賦形剤は、０．８５％アルギニン及び１％スクロースであった。アルギニンとともに使用されたケーキ剤は４％マニトールであり、スクロースとともに使用されたケーキ剤は２％グリシンであった。各製剤は、１ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ及び６０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で調べた。さらに、マニトール・スクロースの組み合わせを含有する１つの製剤を３０ｍｇ／ｍＬで調べた。各製剤は、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有した。まず、タンパク質を７０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、実験室規模の限外ろ過／透析ろ過装置を用いて、適切な製剤中に透析した。次いで、適切な製剤緩衝液を用いて、タンパク質を３つの各濃度まで希釈した。次いで、１ｍＬの充填容積で、３ｃｃのガラス容器中にタンパク質を分取した。次いで、実験室規模の凍結乾燥装置を用いて、容器を凍結乾燥した。凍結乾燥後に、容器を密封し、４℃、２９℃、３７℃及び５２℃での温置のために保存し、凍結乾燥直後に始まり、２４ヶ月に及ぶ時間にわたる様々な時点で、それぞれの容器を抜き取り、分析した。サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、タンパク質の安定性に関して試料を分析した。凍結乾燥されたケーキ及び再構成された液体溶液の特性も分析した。
凍結乾燥されたＦｃ−Ａｎｇ−２結合ペプチドの濃度スクリーニング
ケーキ剤として４％マニトール、及び賦形剤として２％スクロースとして用いて、ｐＨ７．２の１０ｍＭヒスチジン中で、濃度スクリーニングを行った。タンパク質を約１４０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、実験室規模の限外ろ過／透析ろ過装置を用いて、製剤中に透析した。次いで、製剤緩衝液中に、凍結乾燥されたタンパク質を３０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ及び１２０ｍｇ／ｍＬまで希釈した。次いで、１ｍＬの充填容積で、３ｃｃのガラス容器中に溶液を分取した。実験室規模の凍結乾燥装置を用いて、容器を凍結乾燥した。凍結乾燥後に、容器を密封し、４℃、２９℃、３７℃及び５２℃での温置のために保存し、凍結乾燥直後に始まり、２４ヶ月に及ぶ時間にわたる様々な時点で、それぞれの容器を抜き取り、分析した。サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、タンパク質の安定性に関して試料を分析した。凍結乾燥されたケーキ及び再構成された液体溶液の特性も分析した。
結論
上記を検討すると、最適な製剤は、１０ｍＭヒスチジン、４％マニトール、２％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０を含む。
凍結乾燥されたＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチド
凍結乾燥されたＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドに対する最適な製剤を決定するために、様々なｐＨ値、賦形剤濃度及びタンパク質濃度でＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチド凝集及び安定性を評価する分析を行った。
Ｆｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドは、Ｂ細胞関連疾患を目標とする、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）に対するＮ結合型ペプチボディである。本ペプチボディは、約６３．６ｋＤの総質量を有する、グリコシル化されていない、ジスルフィド結合された２つのポリペプチドから構築されている。本ペプチボディに対する等電点は、ｐＨ７．３６であると推定されている。
Figure 0005873854
Figure 0005873854
従って、Ｆｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチド結合ペプチドの配列は、以下のとおりである。
Figure 0005873854
１０ｍｇ／ｍＬでの、凍結乾燥されたＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドの広範なｐＨスクリーニング
安定性は、主として、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって評価され、これは高温で示す安定性であった。３．８５から７．６のｐＨ範囲にわたって、凍結乾燥されたＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドの安定性及び再構成特性を評価するために、２．５％マニトール及び２．０％スクロースの存在下で、様々な１０ｍＭ緩衝液中において、１０ｍｇ／ｍＬＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドを調合した。約０．５ｐＨ単位の増分で、以下の緩衝液を検査した。アセタート、サクシナート、ヒスチジン、ピロホスファート、ホスファート及びＴｒｉｓ。
製剤開発作業のために、３０ｍｇ／ｍＬの凍結された液体製剤中に、精製されたバルク材料を取得した。適切な製剤緩衝液中に材料を透析し、保守的サイクルを用いて、Ｖｉｒｔｉｓ凍結乾燥装置中で凍結乾燥した。−２０℃でアニーリング工程を実施し、マニトールを結晶化させるために、４時間継続した。−２５℃の保存温度で、２０時間、一次乾燥を行った。保管温度が０℃まで増加するにつれて、真空の急上昇は観察されなかったので、一次乾燥は−２５℃で完了に達した。大きな破損は観察されず、まず、０℃で、次いで、２５℃での二次乾燥を通じて、試料は首尾よく進行した。再構成すると、７又はそれ以上のｐＨを有する製剤は僅かに濁るのに対して、他の製剤はすべて透明であった。これは、高ｐＨ製剤がＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドの等電点（ｐＩ＝７．３６）に近づくことによって説明された。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析によって、主な高分子量種として二明らかとなった。相対％二量体は強くｐＨ依存性であることが観察され、ｐＨ５及びそれ以下で蓄積が最低であった。可溶性凝集物の量も、若干のｐＨ依存性を示した。凍結乾燥前には、可溶性凝集物が試料中に観察されなかった。これに対して、凍結乾燥前に、二量体の少量が全ての製剤中に存在し、二量体は、凍結乾燥後、再構成された試料中でさらに増加した。すべての製剤中で、著しいエンド型タンパク質分解性切断（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）は観察されなかった。完全な状態の単量体の最高量は、ｐＨ５及びそれ未満のアセタート、サクシナート及びヒスチジン製剤の場合であった。
３０ｍｇ／ｍＬでの、凍結乾燥されたＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドの広範なｐＨスクリーニング：スクロース及びマニトールの安定化効果
安定性は、主として、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって評価し、これは安定性を示す。４．５から７．５のｐＨ範囲にわたって、凍結乾燥されたＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドの安定性及び再構成特性に対する、２．５％マニトール及び３．５％スクロースの存在の効果を評価するために、１０ｍＭサクシナート、ヒスチジン及びホスファート緩衝液中において、３０ｍｇ／ｍＬのＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドを調合した。以前の広範なｐＨスクリーニングでの成績が不良であったので、ピロホスファート及びＴｒｉｓ緩衝液は本研究から除外した。凍結乾燥中のアセタートの昇華の結果、再構成された試料中でのｐＨ変化の可能性のために、アセタ−ト緩衝液は除外した。
製剤開発作業のために、３０ｍｇ／ｍＬの凍結された液体製剤中に、精製されたバルク材料を取得した。適切な製剤緩衝液中に材料を透析し、保守的サイクルを用いて、Ｖｉｒｔｉｓ凍結乾燥装置中で凍結乾燥した。−２０℃でアニーリング工程を実施し、マニトールをより完全に結晶化させるために、５時間継続した。−２５℃の保存温度で、２０時間、一次乾燥を行った。保存温度が０℃まで増加するにつれて、真空の幾らかの急上昇が観察されたので、一次乾燥は−２５℃まで完全には到達しなかった。大きな破綻は観察されず、まず、０℃で、次いで、２５℃での二次乾燥を通じて、試料は首尾よく進行した。再構成すると、７付近のｐＨを有する製剤は僅かに濁ったのに対して、他の製剤はすべて透明であった。先述されているように、これは、高ｐＨ製剤がＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドの等電点に近づくことによって説明することができた。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析によって、主な高分子量種が二量体であることが明らかとなった。同じく、相対％二量体は強くｐＨ依存性であることが観察され、ｐＨ５及びそれ以下で蓄積が最低であった。可溶性凝集物の量は、明瞭なｐＨ依存性を示さなかった。凍結乾燥前には、可溶性凝集物が試料中に観察されなかった。調合前に、非ＧＭＰバルク中に、約０．６％の二量体が観察され、これは、緩衝液交換／濃縮の結果、凍結乾燥前に、高ｐＨ製剤において最大３．０％まで増加した。
二量体蓄積のｐＨ依存性は、緩衝液の種類に関わらず、所定のｐＨで、二量体の相対的量が密接に対応していることによっても確認された。Ｔ＝Ｏ試料によって証明されたとおり、％二量体は、凍結乾燥後に、著しく増加しなかった。唯一の例外は、スクロース及びマニトールの両方を含有しない試料であり、これは、約０．２５から０．５％にわたる％二量体の注目すべき増加を示した。スクロースの存在下では、それぞれ、ｐＨ４．１及び４．７を有するサクシナート及びヒスチジン製剤に対する緩衝液交換／凍結乾燥後でさえ、主ピークの喪失は最低であった。これらと比べて、全てのホスファート製剤は、凍結乾燥前に、主ピークの約３％の喪失を示した。スクロース及びマニトールの両者の不存在下でさえ、ケーキが形成されたが、糖を含有する製剤と比べて、対応する主ピークは０．５から０．７％低下した。さらに、非糖製剤の再構成はずっと長く（２分超）、若干の撹拌を必要とした。ケーキの頑強性を確保するために、スクロースのみでも、十分なタンパク質安定性が付与されることが示されたとしても、全てのその後の製剤中に充填剤として、マニトール又はグリシンを含めた。
３０ｍｇ／ｍＬでの、凍結乾燥されたＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドの狭いｐＨスクリーニング
主として、安定性は、高温での安定性を示すサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）及び逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって評価した。主ピークの％回収は、ｐＨ５及びそれ未満で、より高かったので、ホスファート緩衝液は、狭いｐＨスクリーニングから除外した。広範なｐＨスクリーニングで優れた成績を示したサクシナート及びヒスチジン緩衝液に加え、狭いｐＨスクリーニングには、１０ｍＭグルタマートｐＨ４から６を含めた。０．２ｐＨ単位の増分で、製剤を調べた。２．０％及び５．０％のスクロースを有するｐＨ４．５の２つのサクシナート製剤を除き、スクロース及びマニトール含量は、それぞれ、３．５％及び２．５％に保たれた。また、以下のような、６つの一般的な凍結乾燥製剤候補を全てのｐＨ単位増分で検査した。
１）２０ｍＭヒスチジン、２．０％グリシン、１．０％スクロース、ｐＨ５．０
２）２０ｍＭヒスチジン、２．０％グリシン、１．０％スクロース、ｐＨ６．０．
３）２０ｍＭヒスチジン、２．０％グリシン、１．０％スクロース、ｐＨ７．０．
４）２０ｍＭヒスチジン、４．０％マニトール、２．０％スクロース、ｐＨ５．０
５）２０ｍＭヒスチジン、４．０％マニトール、２．０％スクロース、ｐＨ６．０
６）２０ｍＭヒスチジン、４．０％マニトール、２．０％スクロース、ｐＨ７．０
製剤開発作業のために、３０ｍｇ／ｍＬの凍結された液体製剤中に、精製されたバルク材料を取得した。適切な製剤緩衝液中に材料を透析し、保守的サイクルを用いて、Ｖｉｒｔｉｓ凍結乾燥装置中で凍結乾燥した。凍結乾燥サイクルは、さらに改変した。グリシンを結晶化させるために、−１５℃でアニーリング工程を実施し、５時間継続した。まず、短期間（４時間）、−３０℃で、一次乾燥を行った。次いで、保管温度を−２５℃まで上昇させ、２４時間、一定に保った。しかしながら、保管温度が０℃までさらに増加するにつれて、真空の僅かな急上昇によって明らかとなったように、一次乾燥は、−２５℃において、完全には完遂しなかった。それにも拘らず、大きな破綻は観察されず、まず、０℃で、次いで、２５℃での二次乾燥を通じて、試料は首尾よく進行した。Ｆｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドの長期安定性を評価するために、最長６ヶ月まで、凍結乾燥状態の安定性データを３７℃で作製した。ｐＨの増加は、全てのヒスチジン製剤に対して、主ピークの喪失をもたらす。一般的な製剤のみ、最長６ヶ月までモニターしたが、５．０付近のｐＨという利点は、１及び３ヶ月の時点で、既に明白であった。さらに、一般的な製剤に対する６ヶ月のデータは、マニトール＋スクロース製剤が、特に、ｐＨ６及びそれ以上において、グリシン＋スクロースより安定であることを示唆している。
グルタマート及びサクシナート製剤の場合には、ｐＨがより酸性でなくなるにつれて、主要な分解産物である二量体の量の明瞭なｐＨ依存的増加も存在していた。凝集物に対して、同様のｐＨ依存性が見られる。主ピークの最も高い回収は、ｐＨ５及びそれ未満に対して観察された。Ｔ＝Ｏに対する主ピークの当初の喪失は、凍結乾燥前の製剤に対する同様の喪失によって示されるように、緩衝液交換及び濃縮中のタンパク質分解によって説明することができる。しかしながら、３ヶ月の安定性データは、グルタマート製剤が、それらのサクシナート対応物（同じｐＨを有する。）より高い物理的安定性を有していたことを示唆する。本研究において、本発明者らは、サクシナート製剤の安定性に対する増加したスクロース濃度の効果も調べたことに注目しなければならない。３．５％スクロースの他に、本発明者らは、サクシナートｐＨ４．５中の２．０％及び５．０％スクロース製剤を比較した。スクロースの増加は、ある程度まで、高分子量種を減少させたが、主ピークの量に著しい影響を与えなかった。従って、３．５％スクロースは生理的浸透圧と最も近接していたので、このような製剤が最適であると考えられた。
ＲＰ−ＨＰＬＣによって、低ｐＨにおいて、エンド型タンパク質分解性切断種の１つが増大することが観察された。時間がかかる緩衝液交換及びタンパク質濃縮工程の結果、凍結乾燥された製剤中のｐＨ依存性エンド型タンパク質分解性切断のかなりの割合が、凍結乾燥前に生じた。凍結乾燥後に、３７℃で３ヶ月ないし６ヶ月の保存後でさえ、エンド型タンパク質分解性切断の量の著しい増加は観察されなかった。全般に、これらのデータは、ｐＨ６及びそれ以上では観察できないので、エンド型タンパク質分解性切断を軽減するために、より高いｐＨ製剤を使用することを示唆している。しかしながら、二量体の量は、より高いｐＨにおいて顕著であり、ｐＨ６及びそれ以上では、２．５から４．５％の高さに及び得る。従って、特に、グルタマート及びヒスチジン緩衝液中において、及び二量体形成がなお十分に抑制している場合に、エンド型タンパク質分解性切断があまり多くないｐＨ５でＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドを調合する際には妥協を認め得る。
結論
３７℃で６ヶ月の保存研究によって確認されたとおり、２．５％マニトール及び３．５％スクロースは、十分なケーキ及びタンパク質安定性を与えた。従って、３０ｍｇ／ｍＬのＦｃ−Ａｇｐ−３結合ペプチドを調合するために、１０ｍＭヒスチジン、２．５％マニトール、３．５％スクロース、ｐＨ５．０及び１０ｍＭグルタマート、２．５％マニトール、３．５％スクロース、ｐＨ５．０を使用することができる。さらに、本研究は、２０ｍＭヒスチジン、４．０％マニトール、２．０％スクロース、ｐＨ５も優れた成績を示し、ペプチボディ用の一般的な凍結乾燥製剤の候補と考え得ることを示している。
凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチド
凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドに対する最適な製剤を決定するために、様々なｐＨ値、賦形剤濃度及びタンパク質濃度でＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチド凝集及び安定性を評価する分析を行った。
Ｆｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドは、筋消耗関連疾患を目標とする、ミオスタチンタンパク質に対するＣ結合型ペプチボディである。本ペプチボディは、約５９．１ｋＤの総質量を有する、グリコシル化されていない、ジスルフィド結合された２つのポリペプチドから構築されている。本ペプチボディに対する等電点は、ｐＨ６．８８であると推定されている。
Figure 0005873854
ミオスタチン結合ペプチド配列（配列番号１７００）
ＧＧＧＧＧＡＱＬＡＤＨＧＱＣＩＲＷＰＷＭＣＰＰＥＧＷＥ
従って、Ｆｃ−Ｍｙｏ結合ペプチド結合ペプチドの配列は、以下のとおりである。
Figure 0005873854
Figure 0005873854
凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドに対するｐＨ条件の決定
安定性は、主として、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって評価し、これは高温で示す安定性であった。凍結乾燥前の液体状態の最適な製剤ｐＨを決定するために、ｐＨスクリーニング研究を設計し、実施した。アセタート及びヒスチジンの緩衝剤並びに安定化剤（又は凍結乾燥保護剤）としてのスクロースとともに、ｐＨ４．５、４．７５、５．０、５．５及び６．０でタンパク質を調合した。調合された容器を、最長１年間、２９℃で保存した。ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて、安定性をモニターした。各製剤条件に対して、凝集速度定数を計算した。ｐＨ４．５での凝集速度が最低であることが明らかとなり、従って、好ましい製剤ｐＨ条件としてｐＨ４．５を選択した。
３０ｍｇ／ｍＬでの、凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチド緩衝剤研究
安定性は、主として、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって評価し、これは安定性を示す。１０ｍＭグルタマート、１０ｍＭヒスチジン及び１０ｍＭサクシナート、ｐＨ４．５という３つの異なる緩衝剤を用いて調査された、３０ｍｇ／ｍＬ剤形。全ての製剤は、０．００４％ポリソルベート２０を含有する。
製剤開発作業のために、３０ｍｇ／ｍＬの凍結された液体製剤中に、精製されたバルク材料を取得した。適切な製剤緩衝液中に材料を透析し、保守的サイクルを用いて、Ｖｉｒｔｉｓ凍結乾燥装置中で凍結乾燥した。凍結乾燥されたタンパク質製剤は、許容される上品なケーキを示した。再構成時に、製剤は透明であった。凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドは、４、２９、３７及び５２℃で保存した。リアルタイムの安定性研究を４℃で実施し、最長３ヶ月間、これらの製剤に対して同等であることが明らかとなった。しかしながら、５２℃で３ヶ月の保存で、ヒスチジン含有製剤は、グルタマート含有製剤より僅かに優れていた。サクシナート含有製剤は、他の２つの製剤より有意に安定性が低かった。これらの結果に基づいて、最終Ｆｃ−Ｍｙｏ結合ペプチド製剤に対する好ましい緩衝剤として、ヒスチジン及びグルタマートを検討した。
３０ｍｇ／ｍＬでの凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチド賦形剤研究：スクロース、トレハロース及びヒドロキシエチルデンプンの安定化効果
安定性は、主として、安定性を示すサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって評価した。凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドの安定性に対するトレハロース、ヒドロキシエチルデンプン及びスクロースの存在の効果を評価するために、４％マニトールを加えた１０ｍＭグルタマート緩衝液中に３０ｍｇ／ｍＬで、Ｆｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドを調合した。使用されたトレハロース及びスクロースの濃度は、２．０％であった。１０ｍＭグルタマート、４％マニトール、２％スクロース、１％ヒドロキシデンプンの最終製剤を作製するために、１％ヒドロキシエチルデンプンをスクロース製剤に添加した。全ての製剤は、０．００４％ポリソルベート２０を含有する。
製剤開発作業のために、３０ｍｇ／ｍＬの凍結された液体製剤中に、精製されたバルク材料を取得した。適切な製剤緩衝液中に材料を透析し、保守的サイクルを用いて、Ｖｉｒｔｉｓ凍結乾燥装置中で凍結乾燥した。凍結乾燥されたタンパク質製剤は、許容される上品なケーキを示した。再構成すると、製剤は透明であった。
ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて、これらの製剤の安定性をモニターした。
凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドは、４、２９、３７及び５２℃で保存した。これらの製剤間で、最長３ヶ月間、リアルタイム保管時間条件の安定性（４℃）は同等であることが明らかとなった。しかしながら、５２℃で３ヶ月間の保存条件下では、スクロース含有製剤は、トレハロース含有製剤より僅かに優れていた。ヒドロキシエチルデンプンの添加は、安定性に対して負の影響を全く示さなかった。これらの結果に基づいて、最終Ｆｃ−Ｍｙｏ結合ペプチド製剤に対する好ましい安定化剤として、スクロースを検討した。
３０ｍｇ／ｍＬでの凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチド賦形剤研究：スクロース及びマニトールの安定化効果
安定性は、主として、安定性を示すサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって評価した。４．０から８％のマニトール及び１．０％から４．０％のスクロース範囲にわたって、凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドの安定性及び再構成特性に対する、マニトール及びスクロースの可変量の存在の効果を評価するために、Ｆｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドを、３０ｍｇ／ｍＬで、１０ｍＭグルタマート緩衝液中に調合した。全ての製剤は、０．００４％ポリソルベート２０を含有する。
製剤開発作業のために、３０ｍｇ／ｍＬの凍結された液体製剤中に、精製されたバルク材料を取得した。適切な製剤緩衝液中に材料を透析し、保守的サイクルを用いて、Ｖｉｒｔｉｓ凍結乾燥装置中で凍結乾燥した。凍結乾燥されたタンパク質製剤は、許容される上品なケーキを示した。再構成すると、製剤は透明であった。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法を用いて、これらの製剤の安定性をモニターした。凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドは、４、２９、３７及び５２℃で保存した。これらの製剤間で、最長３ヶ月間、リアルタイム保管時間条件の安定性（４℃）は同等であることが明らかとなった。しかしながら、５２℃で３時間保存された場合、スクロースの増加する量は、凝集に対する安定性の増加に寄与することが見出された。最終製剤に対して等張条件を維持する（これは、二糖の総量を制約する。）ことに関する懸念のために、及び凍結乾燥されたケーキの特性を保持するためにマニトールとスクロースの適切な比を維持することに関する懸念のために、４．０％マニトール及び２．０％スクロースが、最終製剤のために好ましい賦形剤であった。
１、３０、８５ｍｇ／ｍＬでの、凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチド賦形剤研究
安定性は、主として、安定性を示すサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって評価した。凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドの安定性及び再構成特性に対するタンパク質濃度の効果を評価するために、４％マニトール及び２％スクロースを加えた１０ｍＭグルタマート緩衝液中に１、３０、８５ｍｇ／ｍＬで、Ｆｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドを調合した。全ての製剤は、０．００４％ポリソルベート２０を含有する。
製剤開発作業のために、３０ｍｇ／ｍＬの凍結された液体製剤中に、精製されたバルク材料を取得した。ＵＦ／ＤＦを用いて、適切な製剤緩衝液中に材料を緩衝液交換し、保守的サイクルを用いて、Ｖｉｒｔｉｓ凍結乾燥装置中で凍結乾燥した。凍結乾燥されたタンパク質製剤は、許容される上品なケーキを示した。再構成すると、製剤は透明であった。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法を用いて、これらの製剤の安定性をモニターした。
凍結乾燥されたＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドは、４、２９、３７℃で保存した。これらの製剤間で、最長６ヶ月間、リアルタイム保管時間条件の安定性（４℃）は同等であることが明らかとなった。この安定性は、市販製品製剤として研究された全ての濃度に対して許容されると思われる。
結論
４℃で１２ヶ月の保管研究によって確認されたとおり、４．０％マニトール及び２．０％スクロースは、十分なケーキ及びタンパク質安定性を与えた。従って、１から１００ｍｇ／ｍＬのＦｃ−Ｍｙｏ結合ペプチドを調合するために、ｐＨ４．５の１０ｍＭヒスチジン、４．０％マニトール、２．０％スクロース及びｐＨ４．５の１０ｍＭグルタマート、４．０％マニトール、２．０％スクロースを使用することができる。
本発明を実施するための好ましい形態を含むことが見出された又は提案された具体的な実施形態の観点で、本発明を記載してきた。本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示されている具体的な実施形態に数多くの修飾及び変更を施すことができることが当業者に自明である。

Claims (3)

  1. 緩衝剤、充填剤及び安定化剤を含む凍結乾燥された治療用ペプチボディ組成物であって、前記緩衝剤はｐＨ緩衝剤であり、ここで、
    ａ）前記ｐＨ緩衝剤が１０ｍＭヒスチジン且つｐＨが５．０であり、
    前記充填剤が２．５％ｗ／ｖマニトールであり、及び
    前記安定化剤が３．５％ｗ／ｖスクロースである；又は
    ｂ）前記ｐＨ緩衝剤が２０ｍＭヒスチジン且つｐＨが５．０であり、
    前記充填剤が４．０ｗ／ｖマニトールであり、及び
    前記安定化剤が２．０％ｗ／ｖスクロースであり、且つ
    治療用ペプチボディが配列番号１６９８の配列を含む、
    治療用ペプチボディ組成物。
  2. 前記治療用ペプチボディ濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬと２５０ｍｇ／ｍＬの間にある、請求項１に記載の治療用ペプチボディ組成物。
  3. 請求項1又は２に記載の凍結乾燥された治療用ペプチボディ組成物を作製するための方法であって、
    ｉ）ｐＨ緩衝剤、充填剤及び安定化剤の溶液を調製する工程であって、ここで、
    ａ）前記ｐＨ緩衝剤が１０ｍＭヒスチジン且つｐＨ５．０であり、
    前記充填化剤が２．５％ｗ／ｖマニトールであり、及び
    前記安定化剤が３．５％ｗ／ｖスクロースである；又は
    ｂ）前記ｐＨ緩衝剤が２０ｍＭヒスチジン且つｐＨ５．０であり、
    前記充填剤が４．０％２／ｖマニトールであり、及び
    前記安定化剤が２．０ｗ／ｖスクロースである工程、並びに
    ｉｉ）前記溶液を凍結乾燥させる工程
    を含み、
    前記治療用ペプチボディが配列番号１６９８の配列を含む、方法。
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