EA022424B1 - Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела - Google Patents

Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела Download PDF

Info

Publication number
EA022424B1
EA022424B1 EA201270625A EA201270625A EA022424B1 EA 022424 B1 EA022424 B1 EA 022424B1 EA 201270625 A EA201270625 A EA 201270625A EA 201270625 A EA201270625 A EA 201270625A EA 022424 B1 EA022424 B1 EA 022424B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
peptide
protein
concentration
peptides
another embodiment
Prior art date
Application number
EA201270625A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201270625A1 (ru
Inventor
Уильям Дж. Кэллэхэн
Джр. Ричард Л. Реммеле
Гаятри Рэтнасуами
Рамиль Ф. Латыпов
Дингджианг Лиу
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38625630&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA022424(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA201270625A1 publication Critical patent/EA201270625A1/ru
Publication of EA022424B1 publication Critical patent/EA022424B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение включает устойчивые при длительном хранении рецептуры лиофилизированного терапевтического пептидного антитела и способы получения лиофилизированной композиции, содержащей терапевтическое пептидное антитело.

Description

Изобретение в целом относится к препаратам лиофилизированных терапевтических пептидных антител и способам получения лиофилизированной композиции, содержащей терапевтические пептидные антитела.
Предпосылки создания изобретения
Рекомбинантные белки представляют собой новый класс терапевтических агентов. Такие рекомбинантные лекарства привели к успехам в области приготовления и химической модификации белков. Идентифицированы модификации, которые могут защитить терапевтические белки, главным образом, за счёт блокирования их подверженности воздействию протеолитических ферментов. Модификации белков могут также повышать стабильность, время циркуляции в кровотоке и биологическую активность терапевтических белков. Обзорная статья Тгапе18 (1992), Тоеиз оп ОгоМй Тае1огз 3: 4-10 (МеШзепр!, Ьопйоп), в которой описываются модификация белков и слитые белки, вводится в данное описание в качестве ссылки.
Одна применимая модификация представляет собой объединение (комбинацию) полипептида с Те доменом антитела. Антитела содержат две функционально независимых области, вариабельный домен, известный как Тай, который связывает антиген, и константный домен, называемый Те, который связывается с такими эффекторными функциями как активация комплемента и атака фагоцитарных клеток. Те имеет продолжительный период полужизни в сыворотке, тогда как Тай является короткоживущим. Сароп е! а1. (1989), Х'аШге 337: 525-31. См. также, например, патент США № 5428130. При конструировании вместе с терапевтическим пептидным антителом или белком Те домен может обеспечить более продолжительный период полужизни или включить такие функции, как Те рецепторное связывание (связывание с Те рецептором), связывание белка А, фиксацию комплемента и, возможно, даже переход через плаценту. И. В табл. 1 суммируются данные о применении слияний Те с терапевтическими белками, известные в уровне техники.
Таблица 1. слияние Те с терапевтическими белками
Форма Рс Партнёр по слиянию Терапевтическое действие Ссылка
1§О1 Ν-конец СЦЗО-Ь Болезнь Ходжкина; анапластическая лимфома; Т- клеточный лейкоз Патент США 5480981
Мышиный Рсу2а 1Б-10 Противовоспалительное; отторжение трансплантата гЬепде1а1. (1995). I 1ттипо1. 154: 5590- 600
1§О1 ΤΝΡ рецептор Септический шок Р18Ьеге1а1.11996), Ν.ΕηεΙ. I Мей. 334: 1697- 1702; Уап Ζεε, К. е1 а1. (1996), Ь 1ттипо1. 156: 2221-30
Ιδθ,ΙβΑ, ΙβΜ или 1§Е (за исключением первого домена ΤΝΡ рецептор Воспаление, аутоиммунные Патент США Νο. 5808029, расстройства выданный 15 сентября 1998 года
1ёС1 С 04 рецептор СПИД Сароп е1 а1. (1989), ИаШге 337: 525-31
ΐεθι, Ν- конец противораковый, НапйН е1 а1. (1995).
ΙβΟ3 1Б-2 антивирусный 1ттипо1есН. 1: 95-105
ΙβΟΙ С- конец ОРО остеоартрит; плотность кости ν/Ο 97/23614, опубликована 3 июля 1997 года
1§С1 Ν- конец лептина против ожирения РСТ/υδ 97/23183, подана 11 сентября 1997 года
Человеческий ΙβΟγΙ СТЬА-4 аутоиммунные расстройства 1лп51еу(1991), 1. Ехр. Мей. 174:561-9
Конъюгированные или слитые с полиэтиленгликолем (ПЭГ, РЕО) белки и пептиды также изучали с целью применения в фармацевтических препаратах, искусственных имплантатах и в других случаях, когда имеет значение биосовместимость. Предлагались различные ПЭГ-производные, содержащие активный фрагмент, позволяющий ПЭГ связываться с препаратами и имплантатами и в целом с молекулами и поверхностями. Например, ПЭГ-производные предлагались для связывания ПЭГ с поверхностями с целью контроля увлажнения, повышения статических свойств и связывания молекул других типов с поверхностью, включая белки и остатки белков.
В других исследованиях показано, что связывание ПЭГ (пегилирование) желательно для того, чтобы преодолеть затруднения, встречающиеся при клиническом применении биологически активных молекул. Например, как утверждается в опубликованной патентной заявке ^О 92/16221, найдено, что многие потенциальные терапевтические белки имеют короткий период полужизни в сыворотке крови.
Пегилирование снижает скорость выведения из организма (кровотока) за счёт повышения средней
- 1 022424 молекулярной массы. До определённого размера скорость гломерулярной фильтрации белков обратно пропорциональна размеру белка. Следовательно, способность пегилирования снижать клиренс в целом является функцией не числа групп ПЭГ, присоединённых к белку, а общей молекулярной массы конъюгированного белка. Пониженный клиренс может привести к повышенной эффективности по сравнению с непегилированным материалом. См., например, Соп&тЬ е! а1., РЬагт. КекеатсЬ Соттип. νοί. 19, рд. 287 (1987) и Ка1ге е1. а1., Ргос. ЫаИ. Асай. 8οί. υ.δ.Α. νοί. 84, рд. 1487 (1987).
Помимо этого пегилирование может снизить агрегацию белка (διι/ιιΚί е! а1., ВюсЬет. ВюрЬук. Лс1а νοί. 788, рд. 248 (1984)), изменить иммуногенность белка (АЬисЬотеЫ е! а1., 1. Βίοί. СЬет. νοί. 252 рд. 3582 (1977)) и повысить растворимость белка, как описано, например, в опубликованной международной заявке АО 92/16221.
В целом взаимодействие белкового лиганда с его рецептором часто имеет место при относительно большой области контакта (границе раздела). Однако, как показано в случае человеческого гормона роста, лишь малое число ключевых (важнейших) остатков в области контакта действительно вносят основной вклад в энергию связывания. С1асккои, Т. е! а1., δ^ι^ 267: 383-386 (1995). Это наблюдение и тот факт, что оставшаяся основная часть белкового лиганда служит только для визуализации связывающих эпитопов в правильной топологии, позволяет обнаруживать активные лиганды значительно меньшего размера. Так, молекулы только пептидной длины по данному описанию могут связываться с рецепторным белком данного большого белкового лиганда (белка-лиганда). Такие пептиды могут имитировать биоактивность большого белка-лиганда(пептидные агонисты) или, за счёт конкурентного связывания, ингибировать биоактивность большого белкового лиганда (белка-лиганда, пептидные антагонисты).
Пептидные фаг-дисплейные библиотеки предоставляют мощный метод идентификации таких пептидных агонистов и антагонистов. См., например, δ^Π е! а1. (1990), δ^ι^ 249: 386; ИеуПп е! а1. (1990), δ^ι^ 249: 404; патент США № 5223409, выданный 29 июня 1993 г.; патент США № 5733731, выданный 31 марта 1998 г.; патент США № 5498530, выданный 12 марта 1996 г.; патент США № 5432018, выданный 11 июля 1995 г.; патент США № 5338665, выданный 16 августа 1994 г.; патент США № 5922545, выданный 13 июля 1999 г.; международную патентную заявку АО 96/40987, опубликованную 19 декабря 1996 г.; и международную патентную заявку АО 98/15833, опубликованную 16 апреля 1998 г., каждый из этих материалов вводится в данное описание в качестве ссылки. В таких библиотеках случайные пептидные последовательности визуализируются с помощью слияния с оболочечными белками нитевидного фага. Обычно визуализируемые пептиды выделяются аффинной элюцией относительно иммобилизованного на антителе внеклеточного домена рецептора. Удержанные фаги можно обогащать в ходе последовательных циклов аффинной очистки и выращивания, и устанавливать последовательность пептидов с наилучшим связыванием для определения ключевых остатков в одном или более родственных по структуре семейств пептидов. См., например, работу СлуМа е! а1. (1997), δ^ι^ 276: 1696-9, в которой идентифицированы два различных семейства. Можно также предвидеть пептидные последовательности, остатки в которых можно безболезненно заменить сканированием аланином или мутагенезом на уровне ДНК. Можно создавать библиотеки с помощью мутагенеза и подвергать их скринингу на дальнейшую оптимизацию последовательности наилучших связующих. Ьо\утап (1997), Апп. Реу. ВюрЬук. Вюто1. δΙπιΠ. 26: 401-24.
Другие методы являются конкурентами фагового дисплея при поиске пептидов. Пептидную библиотеку можно связывать с карбоксильным концом 1ас репрессора и экспрессировать в Е. соЬ. Другой метод на основе Е. соЬ позволяет визуализировать на внешней клеточной мембране за счёт слияния с липопротеином, ассоциированным с пептидогликаном (РАЬ). Эти и родственные методы совместно называются Е. соЬ дисплей (визуализация). В другом биологическом методе скрининга растворимых пептидных смесей для экспрессии и секреции используют дрожжи. См. διηίΐΐι е! а1. (1993), Μοί. РЬагтасо1. 43: 741-8. Метод δт^!Ь е! а1. и родственные методы называются скринингом в дрожжах. В другом методе трансляцию случайной РНК останавливают перед высвобождением рибосомы, в результате получают библиотеку полипептидов, всё ещё связанных с их ассоциированной РНК. Этот и родственные методы в целом называют рибосомный дисплей. В других методах используют связывание пептида с РНК химической связью; см., например, РоЬейк & δζο5ίак (1997), Ргос. ЫаИ. Асай. δ^. υδΑ, 94: 12297-303. Этот и родственные методы в целом называют скрининг РНК-пептидов. Химическим синтезом получают библиотеки, в которых пептиды иммобилизованы на стабильных небиологических материалах, таких как стержни из полиэтилена и проницаемые для растворителя смолы. В другой полученной химическими методами библиотеке используют фотолитографию для сканирования пептидов, иммобилизованных на стеклянных пластинах. Эти и родственные методы в целом называют химикопептидный скрининг. Химико-пептидный скрининг может быть предпочтительным, так как он позволяет использовать Ό-аминокислоты и другие неприродные аналоги, а также непептидные элементы. Обзор как биологических, так и химических методов дан в Ае11к & Ьо\утап (1992), Сигг. Орт. Вю!есЬпо1. 3: 355-62.
В случае известных биоактивных пептидов можно провести рациональный дизайн пептидных лигандов с подходящими терапевтическими свойствами. В таком методе постепенно осуществляют изменения в пептидной последовательности и определяют влияние замены на биоактивность или прогнози- 2 022424 руемое биофизическое свойство пептида (например, структуру раствора). Эти методы в целом называют рациональный дизайн. В одном таком методе получают группу пептидов, в которых за один раз единственный остаток заменяют на аланин. Этот метод обычно называют ход (шаг) аланином или сканирование аланином. Когда заменяют два остатка (соседних или стоящих отдельно), это называют двойным ходом (шагом) аланином. Результирующие аминокислотные замены можно использовать самостоятельно или в комбинации для получения новой пептидной частицы с подходящими терапевтическими свойствами.
Структурный анализ взаимодействия белок-белок можно также использовать для того, чтобы предложить пептиды, которые имитируют связывающую активность больших белковых лигандов. В таком анализе кристаллическая структура может навести на мысль об идентичности и относительной ориентации важнейших остатков большого белкового лиганда, из которых можно создать пептид. См., например, ТаказаИ е! а1., (1997), ЫаШге ВЫесЬ. 15, 1266-70. Эти и родственные методы в целом называют структурный анализ белков. Эти аналитические методы можно также использовать для исследования взаимодействия между рецепторным белком и пептидами, выбранными с помощью фагового дисплея, который может предполагать последующую модификацию пептидов с целью повышения аффинности связывания.
В принципе пептидные миметики любого белка можно идентифицировать, используя фаговый дисплей и другие указанные выше методы. Эти методы можно также использовать для эпитопного картирования, для идентификации важнейших (критических) аминокислот в белок-белковых взаимодействиях и в качестве руководства при поиске новых терапевтических агентов. Например, Сог1езе е! а1. (1996), Сигг. Ορίπ. Вю1есй. 7: 616- 21. В настоящее время пептидные библиотеки чаще всего используются в иммунологических исследованиях, таких как эпитопное картирование. Кгеедег (1996), ТНе Зшепйз! 10(13): 19-20.
Особый интерес представляет применение пептидных библиотек и других методов для поиска фармацевтически активных пептидов. Ряд таких пептидов, идентифицированных в уровне техники, приводится в табл. 2. Пептиды описаны в приведённых публикациях, каждая из которых вводится в данное описание в качестве ссылки. Указывается фармакологическая активность пептидов, и во многих случаях за ней в скобках следует его сокращённый термин. Некоторые из этих пептидов модифицированы (например, с образованием сшитых по С-концу димеров). Обычно пептидные библиотеки подвергают скринингу на связывание с рецептором фармакологически активного белка (например, ЕРО рецептором). По меньшей мере, в одном примере (СТЬЛ4) проводят скрининг пептидной библиотеки на связывание с моноклональным антителом.
Таблица 2. Фармакологически активные пептиды
Форма Гс Партнёр по связыванию/белок, представляющий интерес1 Т ерапевтическое действие Ссылка
с внутрипептидной дисульфидной связью ЕРО рецептор ЕРО- миметик \νπ§Ηΐοη е! ак( 1996), 8с1епсе 273: 458- 63; Патент США 5773569, выданный 30 июня 1998 года УУпдЫоп е1 ак
Сшитый по Сконцу димер ЕРО рецептор ЕРО- миметик ЫупаЬ е1 ак (1996), ЗНепсе 273: 464-71; АУпёМоп е! ак (1997), Иа1иге Вю1есЬпо1о§у 15:1261-5; Международная патентная заявка \νθ 96/40772, опубликованная 19 декабря 1996 года
линейная ЕРО рецептор ЕРО- миметик Хагапйа е1 а1. (1999). Ргос. Иа11. Асай. 8с1. Ц8А. 96: 7569- 74: ΨΟ 99/47151, опубликова- на 23 сентября 1999 года
линейная с-Мр1 ΤΡΟ- миметик С\уи1а е! а1.( 1997) Зтепсе 276: 1696-9; Патент США Νο. 5869451, выдан 9 февраля 1999 года; Патент США Νο. 5932946, выдан 3 авг. 1999 г.
Сшитый по Сконцу димер с-Мр1 ТРО- миметик С\уМа е! ак! 19971 8с1епсе 276: 1696-9
димер, связанный дисульфидной связью стимуляция гемопоэза (С- С8Р- миметик) Раикоукз е! ак (1984), Нооое- Зеу1егз Ζ. ΡΗνχίοΙ. СЬет. 365: 303- 11: Ьаегит е1 ак (1988), Ехо. Нетак 16: 274- 80
димер, связанный алкиленом О-С8Р- миметик ВЬатадаг е! ак (1996), 1. Мей. СЬет. 39: 3814- 9: СиЙЛейзоп е1 ак 11997). 1. Мей. СЬет. 40: 287682; Κϊηε е! ак (19911. Ехр. НетаЮк 19: 481: Κϊηε е! ак (1995). В1оой 86 (Зиррк 1): 309а
линейный 1Ь-1 рецептор воспалительные и аутоиммунные заболевания (1Ь-1 антагонист*' или 1Ь-1га- миметик) Пат. США Νο. 5608035; Пат. США Νο. 5786331; Пат. США Νο. 5880096; УапоГзку е1 ак 11996), Ргос. Иай. Асай. Зек 93: 7381- 6; Акезоп е(ак (1996), I Βΐοΐ. СЬет. 271:30517- 23: \\йекгогек е! ак (1997), Рок 1. РЬагтасок 49:107- 17: УапоГзку (1996), ΡΝΑδ, 93: 7381- 7386.
- 3 022424
линейный Сывороточный тимический фактор стимуляция лимфоцитов (РТ8- миметик) 1па§ак1-ОЬага е1 ак (1996), Се11и1аг 1ттипо1. 171: 30-40; УозЫаа(1984), ΙηΙ. 1. 1ттшюрЬагтасок 6:141-6.
с внутри- СТЬА4 МАЬ СТЬА4- миметик Рикито1о е! а1. (1998),
пептидной дисульфидной ИаЩге ΒϊοΙεοΗ. 16:267-70
СВЯЗЬЮ
экзоциклический рецептор ΤΝΡ- а антагонист ΤΝΡ- а Таказак! е1 ак (1997). №1иге Вю1есЬ. 15: 1266-70; АО 98/53842, опубликована 3 декабря 1998 года
линейный рецептор ΤΝΡ- а антагонист ΤΝΡ- а СЫппоз-К.о)аз(1998),Ь 1тт., 5621- 5626.
с внутри- СЗЬ ингибирование ЗаЬи е! ак (1996). 1.1ттипо1.157:
пептидной активации 884- 91; МопЫз е1 а1. (1998),
дисульфидной комплемента (СЗЬ- Ρτοίεΐη 8οϊ. 7:619-27
связью антагонист)
линейный винкудин процессы адгезии Айеу е!а1. (1997).
клеток - рост, дифференцировка ВюсЬет. 1. 324: 523- 8
клеток, заживление
ран, метастазы опухолей (связывание винкулина”)
линейный С4- связывающий антитромботический Ыпзе е! а1. (1997). 1. Βΐοΐ. СЬет.
белок (С4ВР) 272: 14658- 65
линейный рецептор урокиназы процессы, ассоции- Ооойзоп е1 ак (1994), Ргос. №(1.
рованные взаимо- Аса<1. Зек 91: 7129-33:
действием уроки- назы Международная заявка АО
с её рецепто- ром 97/35969, опубликованная 2
(например, ангиогенез, инвазия опухолевых клеток и метастаз); (ЦКК антагонист) октября 1997 года
линейный Мйт2, Ηώη2 ингибирование Р1скз1еу е1 ак11994), Опсогепе 9:
инактивации р53, 2523- 9; ВоПдег е1 ак (1997) к
опосредуемой Мйт2 Мок Βΐοΐ. 269; ВоПеег е! а1. е! ак
~^2Γ^- или Ь<1т2; (МсЬп/Ьйтанта- гонист) 119961. Опсогепе 13: 2141-7
линейный противоопухолевая за ВаИ е! ак 11997). Сшт. Βΐοΐ. 7: 71-
счёт имитации 80
активности ρ21χνΑΡ1
линейный фарнезил- противоопухолевая за СНЬЬз е! ак (1994). Се1177:175-
трансфераза счёт предупре- ждения 178
газ онкогена
линейный домен Ваз эффектора противоопухолевая за МоосЬе е! ак (1994), Тгепбз Оепе!
счёт ингибирова- ния 10:44-48; Κούηβΐιβζ е1 ак (1994),
биологической функции газ онкогена ИаШге 370: 527- 532
линейный 8Н2/8НЗ противоопухолевая за Ра\¥зоп е1 а111993), Сигт. Βΐοΐ. 3:
домены счёт ингибирова- ния роста опухоли при 434- 432; Υυ е! ак (1994), Се11 76: 933-945; К1ск1ез е1ак (1994), ЕМВО к 13:5598-
участии активированных 5604: Зрагкзе1 ак(1994).кВюк СЬет. 269:23853- 6; Зрагкз е1 ак
тирозинкиназ; лечение болезненных 119961. Ргос. №Й. Асаб. Зек 93: 1540- 4; Пат. США Νο. 5886150,
состояний, обусловленных 8НЗ выданный 23 марта 1999 года; Пат. США Νο. 5888763,
(8НЗ антагонист) выданный 30 марта 1999 года
- 4 022424
линейный - противоопухолевая за счёт имитации активности р16; например, ингибирования комплекса циклин ϋ- Сёк (р16- миметик) РаЬгаеиз еГ а1. (1996). Сигг. ΒίοΙ. 6: 84- 91
линейный 8гс, Ьуп ингибирование активации тучных клеток, 1§Е- связанные состояния, типа I гиперчувствительность (Антагонист тучных клеток) 31аийег е1 а1. (19971. ВюсЬеш. 36: 9388- 94
линейный протеаза тучных клеток лечение воспалительных нарушений, опосредованных высвобождением триптазы- 6 (ингибиторы протеаз тучных клеток) Международная заявка ЗУО 98/33812, опубликованная 6 августа 1998 года
линейный НВУ коровый антиген (НВсАд) лечение НВУ вирусных инфекций (анти- НВУ') ϋνδοη &Мигау (1995), Ргос. №И. Асаб. 8с1. 92: 2194-8
линейный селектины адгезия нейтрофилов; воспа- лительные заболевания (антаго- нист селектина”) МаПепх еГ а1. (1995). 1. ΒίοΙ. СЬет. 270:21129-36; Европейская патентная заявка ЕР 0 714 912, опубл. 5 июня 1996 года
линейный, цикпизованный калмодулин антагонист калмодулина Р1егсе е1а1. (1995), Мо1ес. ϋίνβΓδίΐν 1:259- 65; Оебшап еГ а1. 11993). 1. ΒίοΙ. СЬет. 268: 2302530; Абеу & Кау(1996), Оепе 169: 133-4
линейный, цикпизованный интегрины хоуминг клеток опухоли;лечение состояний связан- ных с опосредован- ными с интегрином событиями в клетке, включая агрегацию тромбоцитов, тромбоз, заживле- ние ран, остеопороз, репарацию тканей, ангиогенез (например, при лечении рака) и инвазию опухоли (связывание интегрина) Международные заявки ЗУ О 95/14714, опубликована 1 июня 1995 года; ЗУО 97/08203, опубликована 6 марта 1997 года; ЗУО 98/10795, опубликована 19 марта 1998 года; ЗУО 99/24462, опубликована 20 мая 1999 года; Кгай е1 а1. (1999), 1. ΒίοΙ. СЬет. 274: 1979- 1985
циклический, фибронектин и лечение воспали- ЗУО 98/09985, опубликована 12
линейный компоненты внеклеточного матрикса Т клеток и макрофагов тельных и аутоиммунных состояний марта 1998 года
линейный соматостатин и кортистатин лечение или предупреждение гормонпродуцирующих опухолей, акромегалии, гигантизма, деменции, язвы Европейская патентная заявка ЕР 0 911 393, опубликована 28 апреля 1999 года
- 5 022424 желудка, роста опухолей, ингибирование секреции гормонов, модуляция сна или
линейный бактериальный липополисахарид антибиотик; септический шок; расстройства, модулируемые САР37 Пат. США Νο. 5877151, выдан 2 марта 1999 года
линейный или пардаксин, меллитин антипатогенная XV О 97/31019, опубликована 18
циклический, августа 1997 года
включающий ϋ-
аминокислоты
линейный, νιρ импотенция, \УО 97/40070, опубликована 30
циклический нейродегенеративные октября 1997 года
расстройства
линейный СТЬк рак ЕР 0 770 624, опубликована 2 мая
1997 года
линейный ТНР-гамма2 Вигп51ет(1988), ВюсЬет., 27:
4066-71.
линейный Амилин Соорег (1987). Ргос. Νβΐΐ. А саб.
8с1.. 84: 8628-32.
линейный Адреномедуллин Кйатига(1993), ВВКС, 192:553-
60.
циклический, УБОР антиангиогенная; рак, РаиЬго1Нег(1998), ВюсЬет.. 37:
линейный ревматоидный артрит, 17754-17764.
диабетиче- ская
ретинопатия, псориаз
(УБОР антагонист”)
циклический ММР воспалительные и Коттеп (1999), ИаШге Вю1есЪ..
аутоиммунные 17: 768- 774.
расстройства; рост
опухоли (ММР
ингибитор)
фрагмент НОН лечение ожирения Пат. США Νο. 5869452
Эхистатин ингибирование Сап 11988), 1. Βϊοΐ. СЬет.,
агрегации 263: 19827- 32.
тромбоцитов
линейный ЗБЕ аутоантитело ЗБЕ 9/О 96/30057, опубликована 3
октября 1996 года
ΟϋΙ альфа супрессия метастази- НЫкахуа е1 а1.( 1998).
рования опухолей РЕВ8 Бей. 441 (1): 20-4
Антифосфолипидные антитела против бета- 2- гликопротеина- 1 (Р2ОР1) активация эндотелиальных клеток, антифосфолипидный синдром (АР8), тромбоэмболические явления, тромбоцитопения и
В1апк е1 ак (1999), Ргос. ИаЙ. Асаб. 8ск Ц8А 96: 5164-8
линейный бета цепь Т- клеточного рецептора диабет \УО 96/11214, опубликована 18 апреля 1996 года.
Антипролиферативная, \УО 00/01402, опубликована 13
антивирусная января 2000 года.
антиишемическая; 9/О 99/62539, опубликована 9
высвобождение декабря 1999.года
гормона роста
антиангиогенная 9/О 99/61476, опубликована 2
декабря 1999 года.
- 6 022424
линейный Агонист апоптоза; лечение расстройств, ассоциированных с Тклетками (например, аутоиммунные заболевания, вирусная инфекция, Т- клеточный лейкоз, Т- клеточная лимфома) №0 99/38526, опубликована. 5 августа 1999 года.
линейный МНС класс II лечение аутоиммунных заболеваний Пат. США Νο. 5880103, выдан 9 марта 1999 года.
линейный андроген К, р75, МЛ), ИСС, гантингтин проапоптотический, применимый для лечения рака №0 99/45944, опубликована 16 сентября 1999 года.
линейный Фактор фон Виллебранда; Фактор VIII ингибирование взаимодействия Фактора VIII; антикоагулянты №О 97/41220, опубликована 29 апреля 1997 года.
линейный лентивирус ЬЬР1 противомикробный Пат. США Νο. 5945507, выдан 31 августа 1999 года.
линейный Дельта- сон- индуцирующий пептид нарушения сна СгаГ(19861. РецНбез 7: 1165.
линейный С- реактивный белок (СИР) воспаление и рак Вата (19941. Сапсег 1ттипо1. 1ттипо(Ьег. 38: 38(1994).
линейный Пептиды, активирующие сперматозоиды бесплодие Зигикл (19921. Сото. ВюсЬет. РЬузюк 102В: 679.
линейный ангиотензины гемопоэтические факторы для гемопоэтических состояний при раке, СПИДе и т.д. Ьипбегеап( 19991,1. Репобоп1а1 Коз. 34(4):223- 228.
линейный §р41 ВИЧ-1 против СПИДа СЬап (1998). СеИ 93:681-684
линейный РКС ингибирование резорбции кости Моопда (1998), Ехр. РЬузюк 83:717- 725.
линейный дефензины (ΗΝΡ-1, -Р185^Ас-- егЬВ- 2 противомикробная Напчд (1994), МеГЬобз Εηζ. 236: 160- 172.
линейный ΑΗΝΡ- миметическая: противоопухолевая активность Рагк (2000), №1. ВюГесЬпок 18:194-198.
линейный 8Р130 1Ь-6 антагонист №О 99/60013, опубликована 25 ноября 1999 года.
линейный коллаген, другие белки суставов, хряща, связанные с артритом аутоиммунные заболевания №О 99/50282, опубликована 7 октября 1999 года.
линейный оболочечный белок ВИЧ- 1 лечение неврологических дегенеративных заболеваний №О 99/51254, опубликована 14 октября 1999 года.
линейный 1Б-2 аутоиммунные расстройства (например, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит) №О 00/04048, опубликована 27 января 2000 года; №О 00/11028, опубликована 2 марта 2000 года.
'Белок в этой колонке может быть связан с помощью ассоциированного пептида (например, ЕРО рецептора, 1Б-1 рецептора) или имитирован ассоциированным пептидом. В приводимых ссылках поясняется для каждого, связана ли или имитируется молекула пептидами.
Пептиды, идентифицированные скринингом пептидных библиотек, рассматриваются скорее как ведущие, главные (1еад§) при разработке терапевтических агентов, а не используются сами в качестве терапевтических агентов. Подобно другим белкам и пептидам они быстро удаляются ϊπ νινο либо по механизмам почечной фильтрации, клеточного клиренса в ретикулоэндотелиальной системе, либо протеолитической деградацией. (Ргапшз (1992), Росиз οη ίίϊΌνΐΙι Рас1огз 3: 4-11.). В результате этого в уровне техники в настоящее время используют идентифицированные белки для оценки лекарственных мишеней или в качестве каркаса для создания органических соединений, которые нельзя так легко или так быстро идентифицировать скринингом химической библиотеки. Рсжтап (1997), Αηη. Нес. ΒϊορΡγδ. Бюто1. 8Пис1. 26: 401-24; Кау е1 а1. (1998), Эгид Όϊδπ Тодау 3: 370-8.
Обычно очищенные пептиды малоустойчивы в воде и подвергаются химическому и физическому распаду, что приводит к потере биологической активности при обработке и хранении. Кроме того, пептидные соединения в водном растворе подвергаются гидролизу, такому как деамидирование и расщепление пептидной связи. Эти процессы представляют серьёзную проблему для терапевтически активных пептидов, которые предполагают вводить людям в определённом диапазоне доз, исходя из биологической активности.
Введение очищенных пептидов остаётся весьма перспективной стратегией лечения многих заболе- 7 022424 ваний, которые поражают человеческую популяцию. Однако способность терапевтического пептидного антитела оставаться в виде устойчивой фармацевтической композиции во времени в различных условиях хранения, а затем быть эффективным в отношении пациентов ΐη νίνο не рассматривалась. Поэтому в уровне техники остаётся потребность в получении терапевтических пептидных антител в виде устойчивых препаратов, которые пригодны в качестве терапевтических агентов для лечения заболеваний и расстройств.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение включает препараты, пригодные для лиофилизации терапевтических пептидных антител, что даёт в результате высокоустойчивый продукт терапевтического пептидного антитела. Устойчивый продукт терапевтического пептидного антитела применим в качестве терапевтического агента для лечения людей, страдающих расстройствами или состояниями, на которые может благотворно подействовать введение терапевтического пептидного антитела.
В одном аспекте изобретение включает лиофилизированную композицию терапевтического пептидного антитела, содержащую буфер, наполнитель, стабилизирующий агент и необязательно поверхностно-активное вещество; причём буфер состоит из рН буферизующего агента с концентрацией в примерном диапазоне 5-20 мМ, а значение рН находится в примерном диапазоне 3,0-8,0; примерная концентрация наполнителя равна 0-4,5% вес./об.; примерная концентрация стабилизирующего агента равна 0,120% вес./об.; примерная концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,004-0,4% вес./об.; и терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой I.
Формула I: [(Х’)а- Р1- (Х2)ь]- (1?)с- \У5Ра где
Р1 обозначает Ре домен; X1 выбирают из
где Р1, Р2, Р3 и Р4, каждый независимо, обозначают последовательности фармакологически активных пептидов;
Ь1, Ь2, Ь3, Ь4 и Ь5, каждый независимо, обозначают линкеры;
а, Ь, с, е, ί, д и Ь, каждый независимо, обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из а и Ь обозначает 1;
ά обозначает 0, 1 или более 1 и \\'8Р обозначает водорастворимый полимер, присоединение которого осуществляется по любому реакционноспособному (реактивному) элементу Р1.
В другом варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой II
Формула И: [X1- Р1]- (1?)с- ΨδΡά где Рс домен присоединён по С-концу X1, а ноль, один или более \8Р связано с Рс доменом необя1 зательно через линкер Р .
Ещё в одном варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой III
Формула III: [р’-Х2]- (1?)с- \УЗРс1 где Рс домен присоединён по Ν-концу X1, а ноль, один или более \8Р связано с Рс доменом необязательно через линкер Ь1.
Ещё в одном варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой IV
Формула IV: [Р’-ф’^-Р1]- (Ь’Ц \УЗРа где Рс домен присоединён по Ν-концу (Ь1)с-Р1, а ноль, один или более \8Р связано с Рс доменом необязательно через линкер Ь1.
В другом варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой V
Формула V: [Р’-^-Р’-^уР2]- (1?)с- \¥ЗРа
- 8 022424 где Ре домен присоединён по Ν-концу -Р1-Р1-Р2-Р2, а ноль, один или более \У8Р связано с Ре доменом необязательно через линкер Ь1.
В другом варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело представляет собой мультимер или димер. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р1, Р2, Р3 и/или Р4 независимо выбирают из пептидов, представленных в любой из табл. 4-38. В родственном варианте изобретения Р1, Р2, Р3 и/или Р4 имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В другом варианте изобретения домен Рс представлен в 8ЕО ГО N0: 1. В другом варианте изобретения \У8Р представляет собой ПЭГ. Ещё в одном варианте изобретения ПЭГ имеет молекулярный вес около 2-100 кДа или около 6-25 кДа. В другом варианте изобретения композиция содержит по меньшей мере на 50, 75, 85, 90 или 95% пегилированное терапевтическое антитело.
Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рН буферизующий агент выбирают из группы, состоящей из глицина, гистидина, глутамата, сукцината, фосфата, ацетата и аспартата. Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой наполнитель выбирают из группы, состоящей из маннита, глицина, сахарозы, декстрана, поливинилпирролидона, карбоксиметилцеллюлозы, лактозы. сорбита, трегалозы или ксилита.
Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой стабилизирующий агент выбирают из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннозы, мальтозы, лактозы, глюкозы, раффинозы, целлобиозы, гентобиозы, изомальтозы, арабинозы, глюкозамина, фруктозы, маннита, сорбита, глицина, аргинина НС1, многоатомных спиртов, включая полисахариды, такие как декстран, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, циклодекстрины, Ν-метилпирролидон, целлюлоза и гиалуроновая кислота, хлорид натрия.
Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из лаурилсульфата натрия, диоктилсульфосукцината натрия, диоктилсульфоната натрия, хенодезоксихолевой кислоты, натриевой соли Νлаурилсаркозина, додецилсульфата лития, натриевой соли 1-октансульфокислоты, гидрата холата натрия, дезоксихолата натрия, натриевой соли гликодезоксихолевой кислоты, бензалконийхлорида или бензетонийхлорида, моногидрата цетилпиридинийхлорида, гексадецилтриметиламмония бромида, СНАР8, СНАР80, 8В3-10, 8В3-12, дигитонина, Тритона Х-100, Тритона Х-114, лауромакрогола 400, полиоксил-40-стеарата, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 10, 40, 50 и 60, моностеарата глицерина, полисорбата 20, 40, 60, 65 и 80, лецитина из сои, Э0РС. ЭМРС, ЭМРС и Э0РС; эфира сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы. Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация терапевтического пептидного антитела равна примерно 0,25-250 мг/мл.
Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рНзабуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ, а величина рН равна 5,0; наполнитель представляет собой маннит в концентрации 4% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес./об.; и поверхностно- активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,004% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р1 содержит последовательность, представленную в табл. 6. Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 0,5 мг/мл. В другом варианте изобретения терапевтическое антитело представляет собой пептидное антитело с любой последовательностью из 8ЕО ГО N0: 993, 8ЕО ГО N0: 994, 8ЕО ГО N0: 995, 8ЕО ГО N0: 996, 8ЕО ГО N0: 997, 8ЕО ГО N0: 998, 8ЕО ГО N0: 999, 8ЕО ГО N0: 1000, 8ЕО ГО N0: 1001, 8ЕО ГО N0: 1002, 8ЕО ГО N0: 1003, 8ЕО ГО N0: 1004, 8ЕО ГО N0: 1005, 8ЕО ГО N0: 1006, 8ЕО ГО N0: 1007, 8ЕО ГО N0: 1008, 8ЕО ГО N0: 1009, 8ЕО ГО N0: 1010, 8ЕО ГО N0: 1011, 8ЕО ГО N0: 1012, 8ЕО ГО N0: 1013, 8ЕО ГО N0: 1014, 8ЕО ГО N0: 1015, 8ЕО ГО N0: 1016 или 8ЕО ГО N0: 1017.
Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рНзабуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ, а величина рН равна 7,0; наполнитель представляет собой маннит в концентрации 4% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес./об.; и поверхностно- активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,004% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р1 содержит последовательность, представленную в табл. 32. Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 30 мг/мл.
Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рНзабуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 20 мМ, а величина рН равна 5,0; наполнитель представляет собой маннит в концентрации 3,3% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес./об.; и поверхностно- активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,01% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р1 содержит последовательность, представленную в табл. 4. Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация
- 9 022424 терапевтического пептидного антитела составляет 100 мг/мл.
Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рНзабуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ, а величина рН равна 5,0; наполнитель представляет собой маннит в концентрации 2,5% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 3,5% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р1 содержит последовательность, представленную в табл. 31. Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 30 мг/мл.
Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, которую выбирают из группы, состоящей из: а) 10 мМ гистидина, рН 4,7, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; б) 10 мМ гистидина, рН 5, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; в) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; г) 10 мМ сукцината, рН 4,5, 4% маннита, 2% сахарозы, полисорбат-20 в концентрации 0,004%; д) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 9% сахарозы и полисорбат-20 в концентрации 0,004%; е) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита, 2% сахарозы, 1% гидроксиэтилкрахмала, 0,004% полисорбата-20; ж) 5 мМ глутамата, рН 4,5, 2% маннита, 1% сахарозы, 0,004% полисорбата-20 и з) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита, 2% трегалозы, 0,004% полисорбата-20. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р1 содержит последовательность, представленную в табл. 21-24. Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрацию терапевтического пептидного антитела выбирают из группы, состоящей из 1,30, 85 и 100 мг/мл.
Настоящее изобретение также относится к способам получения лиофилизированных терапевтических пептидных антител по настоящему изобретению. В одном варианте изобретение включает способ получения лиофилизированного терапевтического пептидного антитела, содержащий стадии: а) приготовление раствора буфера, наполнителя, стабилизирующего агента и необязательно поверхностноактивного вещества; причём буфер состоит из рН-забуферивающего агента с концентрацией в примерном интервале 5-20 мМ и величина рН находится в примерном интервале 3,0-8,0; наполнитель присутствует в примерной концентрации 2,5-4% вес./об.; стабилизирующий агент присутствует в примерной концентрации 0,1-5% вес./об.; поверхностно-активное вещество присутствует в примерной концентрации 0,004-0,04% вес./об.; и б) лиофилизация терапевтического антитела; отличающийся тем, что указанное терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой I.
Формула I: [(Х^- Р1- (Х2)ь]- (Ь‘)с- \У5Ра где
Р1 обозначает Ре домен;
X1 выбирают из
Р4-(Ь5)ь-Р3-(Е4)ё-Р2-(Е3)г-Р1-(Е2)еX2 выбирают из
-(Щ-р1,
-(Щ-р'ЧьУр2,
ТЩгРЧЩ-рЧЩ-р3, и -(ь2)=-р'- (ЩгРДьНв-р’-аЛ-р4 где Р1, Р2, Р3 и Р4 каждый независимо обозначают последовательности фармакологически активных пептидов;
Ь1, Ь2, Ь3, Ь4 и Ь5 каждый независимо обозначают линкеры;
а, Ь, с, е, ί, д и Ь каждый независимо обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из а и Ь обозначает 1;
ά обозначает 0, 1, или число больше 1; и \\ЖР обозначает водорастворимый полимер, связывание которого происходит по любому реакционноспособному фрагменту в Р1.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой II
Формула II: [X1- р']- (Ь’Е- \У5Ра где Рс домен присоединён по С-концу X1, и ноль, один или более фрагментов \8Р связаны с Рс доменом необязательно через линкер Ь1.
- 10 022424
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой III
Формула III: [Р1- X2]- (1?)с- λΥ8Ρά где Ре домен присоединён по Ν-концу X и ноль, один или более фрагментов \\'8Р связаны с Ре доменом необязательно через линкер Ь1.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой IV
Формула IV: [Р1- ДЛ-Р1]- (Ь')с- λ^δΡά где Рс домен присоединён по Ν-концу -(Ь1)с-Р1 и ноль, один или более фрагментов \\ХР связаны с Рс доменом необязательно через линкер Ь1.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой V
где Рс домен присоединён по Ν-концу -Ь1-Р1-Ь2-Р2 и ноль, один или более фрагментов \\ХР связаны с Рс доменом необязательно через линкер Ь1.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело представляет собой мультимер или димер. В другом варианте изобретения Р1, Р2, Р3 и/или Р4 независимо выбирают из пептидов, представленных в любой из табл. 4-38. В другом варианте изобретения Р1, Р2, Р3 и/или Р4 имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В другом варианте изобретения Рс домен представлен в 5ЕР ГО N0: 1. В другом варианте изобретения \\ХР представляет собой ПЭГ (РЕО). В другом варианте изобретения Рс домен представлен в 5ЕР ГО N0: 1 и \\'8Р представляет собой ПЭГ (РЕО). В другом варианте изобретения ПЭГ имеет молекулярную массу в примерном интервале 2-100 кДа. В другом варианте изобретения ПЭГ имеет молекулярную массу в примерном интервале 6-25 кДа. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, в котором композиция содержит по меньшей мере на 50, 75, 85, 90 или 95% пегилированное терапевтическое пептидное антитело.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН-забуферивающий агент выбирают из группы, состоящей из глицина, гистидина, глутамата, сукцината, фосфата, ацетата и аспартата. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что наполнитель выбирают из группы, состоящей из маннита, глицина, сахарозы, декстрана, поливинилпирролидона, карбоксиметилцеллюлозы, лактозы, сорбита, трегалозы или ксилита. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что стабилизирующий агент выбирают из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннозы, мальтозы, лактозы, глюкозы, раффинозы, целлобиозы, гентиобиозы, изомальтозы, арабинозы, глюкозамина, фруктозы, маннита, сорбита, глицина, аргинина НС1, полигидроксильных соединений, включая полисахариды, такие как декстран, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, циклодекстрины, целлюлоза и гиалуроновая кислота, -Ν-метилпирролидон и хлорид натрия.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из лаурилсульфата натрия, диоктилсульфосукцината натрия, диоктилсульфоната натрия, хенодезоксихолевой кислоты, Ν-лаурилсаркозина натрия, додецилсульфата лития, натриевой соли 1-октансульфоновой кислоты, гидрата холата натрия, дезоксихолата натрия, натриевой соли гликодезоксихолевой кислоты, бензалконийхлорида или бензэтонийхлорида, цетилпиридинийхлорида моногидрата, гексацетилтриметиламмония бромида, СНЛР5, СНЛР50, 5В3-10, 5В3-12, дигитонина, Тритона Х-100, Тритона Х-114, лауромакрогола 400, полиоксил40- стеарата, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 10, 40, 50 и 60, моностеарата глицерина, полисорбата 20, 40, 60, 65 и 80, лецитина из сои, Э0РС, ЭМРО, ЭМРС и Э0РО; эфира сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что концентрация терапевтического пептидного антитела равна, примерно, 0,25-250 мг/мл.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН-забуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ и величина рН равна 5,0; и тем, что наполнитель представляет собой маннит в концентрации 4% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес/об.; и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,004% вес/об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что Р содержит последовательность, представленную в табл. 6. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 0,5 мг/мл.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН-забуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ и величина рН равна 7,0; и тем, что наполнитель представляет собой маннит в концентрации 4% вес/об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес/об.; и поверхностно-активное вещество представля- 11 022424 ет собой полисорбат-20 в концентрации 0,01% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что Р1 содержит последовательность, представленную в табл. 32. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 30 мг/мл.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН-забуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 20 мМ и величина рН равна 5,0; и тем, что наполнитель представляет собой маннит в концентрации 3,3% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес./об.; и поверхностно- активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,01% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что Р1 содержит последовательность, представленную в Таблице 4. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 100 мг/мл.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН- забуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ и величина рН равна 5.0; и тем, что наполнитель представляет собой маннит в концентрации 2.5% вес./об.; и стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 3.5% вес/.объ. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что Р1 содержит последовательность, представленную в табл. 31. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 30 мг/мл.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что композицию выбирают из группы, состоящей из: а) 10 мМ гистидина, рН 4,7, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; б) 10 мМ гистидина, рН 5, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; в) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; г) 10 мМ сукцината, рН 4.5, 4% маннита, 2% сахарозы, полисорбат-20 в концентрации 0,004%; д) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 9% сахарозы и полисорбат-20 в концентрации 0,004%; е) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита, 2% сахарозы, 1% гидроксиэтилкрахмала, 0,004% полисорбата-20; ж) 5 мМ глутамата, рН 4,5, 2% маннита, 1% сахарозы, 0,004% полисорбата-20 и з) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита, 2% трегалозы, 0,004% полисорбата-20. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что композиция, в которой Р1 содержит последовательность, представленную в табл. 21-24. Ещё в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, в котором концентрацию терапевтического пептидного антитела выбирают из группы, состоящей из 1, 30, 85 и 100 мг/мл.
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, дополнительно включающий перед стадией лиофилизации стадии: б) доведение рН раствора до значения примерно 4,0-8,0; в) приготовление раствора, содержащего терапевтическое пептидное антитело; г) буферный обмен между раствором стадии (в) и раствором стадии (б); д) добавление соответствующего количества поверхностноактивного вещества и е) лиофилизация смеси со стадии (е).
В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что предлагается способ приготовления восстановленной (реконституированной) композиции терапевтического пептидного антитела, включающий стадии: а) лиофилизация вышеуказанной композиции терапевтического антитела; и б) восстановление (реконституция) лиофилизированной композиции терапевтического пептидного антитела.
В другом варианте изобретения предусматривается набор для приготовления водной фармацевтической композиции, включающий первый контейнер, содержащий лиофилизированную композицию терапевтического пептидного антитела, и второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый носитель для лиофилизованной композиции.
Подробное описание изобретения Определение терминов
Термин содержащий по отношению к пептидному соединению означает, что соединение может включать дополнительные аминокислоты на любом конце (либо на амино-, либо на карбоксиконце) или на обоих концах (и на амино-, и на карбоксиконце) данной последовательности. Само собой разумеется, что эти дополнительные аминокислоты не должны заметно влиять на активность соединения. Что касается композиции по настоящему изобретению, термин содержащий означает, что композиция может включать дополнительные компоненты. Эти дополнительные компоненты не должны заметно влиять на активность композиции.
Термин пептидное антитело относится к молекуле, содержащей пептид(ы), слитые, либо непосредственно, либо опосредованно с другими молекулами, такими как Ре домен антитела, там где пептидная частица связывается с заданной мишенью. Пептид(ы) может (могут) быть либо слит(ы) с областью Рс, либо встроены в Рс-петлю, модифицированную молекулу Рс. Рс-петли описаны в опубликованной патентной заявке США № 2006/0140934, введённой в данное описание в качестве ссылки во всей полноте. Изобретение включает такие молекулы, содержащие Рс домен, модифицированные таким образом,
- 12 022424 чтобы включать пептид в качестве внутренней последовательности (предпочтительно, на петлевом участке) Ре домена. Внутренние пептидные молекулы Ре могут включать более одной пептидной последовательности в тандемном повторе в конкретной внутренней области, и они могут включать другие пептиды в других внутренних областях. Хотя в качестве примера приводятся предполагаемые петлевые участки, любые другие неконцевые домены Рс также считаются часть данного изобретения. Термин пептидное антитело не включает Рс-слитые белки (например, полноразмерные белки, слитые с Рс доменом).
Термин носитель, среда относится к молекуле, которая предупреждает разложение (деградацию) и/или повышает период полужизни, снижает токсичность, иммуногенность или повышает биологическую активность терапевтического белка. Примеры носителей включают Рс домен, описанный в патенте США № 5428130 на имя Сароп е! а1., выданный 27 июня 1995 г.
Термин нативный Рс относится к молекуле или последовательности, имеющей последовательность не-антигенсвязывающего фрагмента, полученного из целого антитела, либо в мономерной, либо в мультимерной форме. Обычно нативный Рс содержит СН2 и СН3 домен. Исходный иммуноглобулин сточник нативного Рс в одном аспекте человеческого происхождения и может являться любым иммуноглобулином. Нативный Рс является мономерным полипептидом, который может быть связан ковалентной связью (например, дисульфидными связями), нековалентной связью или их комбинацией с образованием димерной или мультимерной форм. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных Рс молекул равно от одного до четырёх в зависимости от класса (например, 1дО, 1дА, 1дЕ) или подкласса (например, 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дА1, 1дОА2). Примером нативного Рс является связанный дисульфидной связью димер, полученный при расщеплении 1дО папаином. ЕШзоп е! а1. (1982), ИисЫс АсЫ§ Ке§. 10: 4071-9. Термин нативный Рс по данному описанию является общим (родовым) для мономерных, димерных и мультимерных форм.
Термин Рс вариант относится к молекуле или последовательности, которая получена модификацией нативного Рс, но всё ещё содержит сайт связывания рецептором- мусорщиком, РсКп. В международных патентных заявках Ж.) 97/34631 (опубликованной 25 сентября 1997 г.) и Ж.) 96/32478 описаны типичные Рс варианты, а также взаимодействие с рецептором-мусорщиком, обе заявки вводятся в данное описание в качестве ссылки. В одном аспекте термин Рс вариант включает молекулу или последовательность, полученную гуманизацией нативного Рс нечеловеческого происхождения. В другом аспекте нативный Рс содержит сайты, которые можно удалить, так как они сообщают структурные признаки или биологическую активность, которые не требуются для слитых молекул по настоящему изобретению. Так термин Рс вариант включает молекулу или последовательность, в которой отсутствует один или более сайтов или остатков нативного Рс, которые влияют на или вовлечены в (1) образование дисульфидной связи, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) гетерогенность по Ν-концу при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с Рс рецептором, отличным от рецептора-мусорщика, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (АИСС). Рс варианты подробнее описаны ниже.
Термин Рс домен охватывает молекулы и последовательности нативного Рс и Рс вариантов по описанию выше. Как и в случае Рс вариантов и нативных Рс термин Рс домен включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, либо образующиеся при расщеплении целого антитела, либо полученные другими способами. Например, в одном варианте изобретения Рс область может представлять собой
ОКТНТСРРСРАРЕЬЬООР8УРЬРРРКРКОТЬМ15КТРЕУТСУУУОУ5НЕОРЕУКРКУУ¥ νΟΟνΓνίΙΝΑΚΤΚΡΚΓΕρΥΝδΤΥΒννδνΐ/ΓνΓηρον/ΙΝΟΚΓΥΚί'ΚνδΝΚΑΙΙ^ΑΡΙΓ ΚΤΙδΚΑΚΟρΡΚΕΡφνΥΤΓΡΡδΚϋΕΐη'ΚΝρνδΡΤαΑΚΟΡΥΡδΟΙΑνΕΑΈδΝϋρΡΕΝΝ ΥΚΤΤΡΡνΕΕ>δΟΟδΡΕΕΥδΚΕΤνΩΚδΚ\ν()()ΟΝνΕδί:δνΜΗΕΑΕΙΙΝΗΥΤΕ)Κ.δΕδΕδΡΟ К (δΕφΙΟΝΟ: 1).
В уровне техники известны другие Рс последовательности и рассматривается их применение по данному изобретению. Например, Рс 1дО1 (в ОепБапк Регистрационный № Р01857), Рс 1дО2 (в ОепБапк Регистрационный № Р01859), Рс 1дО3 (в ОепБапк Регистрационный № Р01860), Рс 1дО4 (в ОепБапк Регистрационный № Р01861), Рс 1дА1 (в ОепВапк Регистрационный № Р01876), Рс 1дА2 (в ОепВапк Регистрационный № Р01877), Рс ΙηΙ) (в ОепВапк Регистрационный № Р01880), Рс 1дМ (в ОепВапк Регистрационный № Р01871) и Рс 1дЕ (в ОепВапк Регистрационный № Р01854) представляют собой некоторые дополнительные Рс последовательности, применение которых рассматривается в данном описании.
Необязательно к вышеуказанным последовательностям можно добавлять Ν-концевую аминокислотную последовательность (например, при экспрессии в бактериях).
Термин мультимер в применении к Рс доменам или молекулам, содержащим Рс домены, относится к молекулам, имеющим две или более полипептидные цепи, связанные ковалентной связью, нековалентной связью или как за счёт ковалентных, так и за счёт нековалентных взаимодействий. Молекулы 1дО обычно образуют димеры; 1дМ - пентамеры; ΙηΙ) - димеры; и 1дА - мономеры, димеры, триммеры или тетрамеры. Мультимеры могут образоваться при усовершенствовании последовательности и результирующей активности исходного 1д, источника нативного Рс, или при дериватизации (как описано ниже)
- 13 022424 такого нативного Рс.
Термины дериватизация, производное, дериватизированный означают процессы и получающиеся в результате соединения, в которых, например, но без ограничения, (1) соединение содержит циклический фрагмент; например, сшивание цистеинильных остатков в соединении; (2) соединение сшивается (перекрёстно связывается) или содержит сайт перекрёстного связывания (сшивания); например, соединение содержит цистеинильный остаток и поэтому образует сшитые (перекрёстно-связанные) димеры в культуре или ίη νίνο; (3) одна или более пептид(иль)ных связей заменяются непептид(иль)ной связью; (4) Ν-конец заменяют на ΝΚΚ1, ΝΚΟ(Θ)Κ1, -ΝΚΟ(Θ)ΘΚ1, -ΝΚδ(Θ)2Κ1, -ΝΗΟ(Θ)ΝΗΚ, сукцинимидную группу или замещённую или незамещённую группу бензилоксикарбонил-ΝΗ-, где К и К1 и заместители в цикле имеют значение по определению ниже в данном описании; (5) С-конец заменяют на -С(О)К2 или -ΝΚ3Κ4, где К2, К3 и К4 имеют значение по определению ниже; и (6) соединения, в которых отдельные аминокислотные фрагменты модифицированы агентом, способным реагировать с выбранными остатками боковых цепей или концевыми остатками.
Термин пептид по данному описанию относится к молекулам, состоящим из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более аминокислот, связанных пептидными связями. Обычно пептиды имеют случайную и/или гибкую (лабильную) конформацию, такую как конформации, наблюдаемые в белках/пептидах большего размера, как правило, за счёт вторичной и третичной структур. В конкретных вариантах изобретения в данном описании рассматриваются пептиды различного размера, такие как имеющие длину, примерно 390, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30; 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20 аминокислот, и т.п.. В других вариантах изобретения пептиды, используемые в данном описании, имеют длину 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислот. Типичные пептиды могут быть получены любыми методами по данному описанию, например с помощью пептидной библиотеки (например, библиотеки фагового дисплея), химическим синтезом, расщеплением белков или методами рекомбинантной ДНК. Пептиды включают Ό и Ь форму, либо в очищенном виде, либо в виде смеси двух форм.
Кроме того, рассматриваются физиологически приемлемые соли соединений по данному изобретению. Под физиологически приемлемыми солями понимают любые соли, как известно или станет известно позже, являющиеся фармацевтически приемлемыми. Некоторые конкретные примеры представляют собой ацетат, трифторацетат; гидрогалогениды, такие как гидрохлорид и гидробромид; сульфат; цитрат; тартрат; гликолят и оксалат.
Термин рандомизированный по отношению к пептидным последовательностям обозначает полностью случайные последовательности (например, выбранные методами фагового дисплея) и последовательности, в которых один или более остатков природной молекулы заменяется на аминокислотный остаток, не встречающийся в этом положении в природной молекуле. Типичные методы идентификации пептидных последовательностей включают фаговый дисплей, рибосомный дисплей, скрининг в дрожжах, скрининг РНК-пептидов, химический скрининг, рациональный дизайн, структурный анализ белков и т.п.
Термин фармакологически активный означает, что определяемое таким образом вещество обладает активностью, которая влияет на медицинский показатель (например, но без ограничения, кровяное давление, число гемоцитов, уровень холестерина) или болезненное состояние (например, но без ограничения, рак, аутоиммунные расстройства). Так, фармакологически активные пептиды включают агонистические, или миметические, и антагонистические пептиды по определению ниже.
Термины -миметический пептид и -агонистический пептид относятся к пептиду, обладающему биологической активностью, сравнимой с белком (например, но без ограничения, ЕРО, ТРО, С-С8Р и другими белками по данному описанию), который реагирует с представляющим интерес белком. Кроме того, эти термины включают пептиды, которые неявно (косвенно) имитируют активность представляющего интерес белка, например, усиливая действие (потенцируя) природного лиганда представляющего интерес белка; см., например, О-С8Р- миметические пептиды, приведённые в табл. 2 и 7. Например, термин ЕРО-миметический пептид включает любые пептиды, которые можно идентифицировать или получить как описано в ХУпдЫоп е! а1. (1996), 8с1епсе 273: 458-63; ЫагапДа е! а1. (1999), Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8с1. И8А 96: 7569-74, или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится ЕРО-миметический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек.
Другой пример, термин ТРО-миметический пептид или ТМР относится к пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в С\уп1а е! а1. (1997), 8с1епсе 276: 1696-9, патенты США № 5869451 и 5932946 или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится ТРОмиметический предмет рассмотрения (пептид), а также в международной патентной заявке \УО 00/24770, опубликованной 4 мая 2000 г., которая вводится в данное описание в качестве ссылки. Рядовые специа- 14 022424 листы в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек.
Другой пример, термин О-С8Р-миметический пептид относится к любым пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Раикоуйк с1 а1. (1984), Норре-8еу1ег5 Ζ. ΡΗνδίοΙ. СНст. 365: 303-11, или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится О-С8Р-миметический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек.
Термин СТРЛ4-миметический пептид относится к любым пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Рикито1о е1 а1. (1998), Ыа1иге Вю1есй 16: 267-70. Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек.
Термин антагонистический пептид или ингибиторный пептид относится к пептиду, который блокирует или каким-то образом вмешивается в биологическую активность соответствующего (ассоциированного) представляющего интерес белка, или проявляет биологическую активность, сравнимую с биологической активностью известного антагониста или ингибитора соответствующего (ассоциированного) белка, представляющего интерес. Так, термин ΤΝΡ-антагонистический пептид включает пептиды, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Такакай е1 а1. (1997), №Циге Вю1еск. 15: 1266-70, или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится ΤΝΡ-антагонистический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек.
Термины 1Ь-1 антагонист и Ш-йа-миметический пептид относятся к пептидам, которые ингибируют или подавляют активацию 1Ь-1 рецептора с помощью 1Ь-1. Активация 1Ь-1 рецептора является результатом образования комплекса между 1Ь-1, 1Ь-1 рецептором и 1Ь-1 вспомогательным рецепторным белком. 1Ь-1 антагонистические или 1Ь-1та- миметические пептиды связываются с 1Ь-1, 1Ь-1 рецептором или 1Ь-1 вспомогательным рецепторным белком и затрудняют образование комплекса между любыми двумя или тремя компонентами комплекса. Типичные 1Ь-1 1Ь-1 антагонистические или 1Ь-1тамиметический пептиды можно идентифицировать или получить, как описано в патентах США № 5608035; 5786331, 5880096 или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится Ш-1 антагонистический или Ш-На-миметический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек.
Термин УЕОР-антагонистический пептид относится к пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в РайЬгоЙег (1998), Вюсйет. 37: 17754- 64, или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится УЕОР-антагонистический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек.
Термин ММР ингибиторный пептид относится к пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Кооппеп (1999), №Циге Вю1есй 17: 768-74 и в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится ММР ингибиторный предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек.
Термин миостатин-ингибиторный (ингибирующий) пептид относится к пептидам, которые можно идентифицировать по их способности снижать или блокировать активность миостатина или передачу сигнала, как показано в ίη уйго анализах, например, таких как анализ активности миостатина в клетках рМАКЕ С2С12 или ίη У1уо анализ на животных, описанный в опубликованной патентной заявке США № 20040181033А1 и в опубликованной патентной заявке \УО 2004/058988. Примеры миостатинингибиторных пептидов представлены в табл. 21-24.
Термин антагонист интегрина/адгезии относится к пептидам, которые ингибируют или подавляют активность интегринов, селектинов, молекул клеточной адгезии, интегриновых рецепторов, селектиновых рецепторов или рецепторов молекул клеточной адгезии. Примеры антагонистов интегрина/адгезии включают ламинин, эхистатин, пептиды, описанные в табл. 25-28.
Термин ингибитор резорбции кости относится к таким молекулам, как приводятся в примерах 4 и 11 международной патентной заявки \УО 97/23614, которая вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. Примеры ингибиторов резорбции кости включают ОРО и ОРО-Ь антитела, которые описаны соответственно в международных патентных заявках \УО 97/23614 и \У098/46751. которые вводятся в
- 15 022424 данное описание ссылкой во всей полноте.
Термин ингибитор фактора роста нервной ткани или агонист фактора роста нервной ткани относится к пептиду, который связывается с фактором роста нервной ткани (ΝΟΕ) и ингибирует активность и передачу сигнала ΝΟΕ Примеры пептидов этого типа представлены в табл. 29.
Термин ТЛЬЬ-1 модулирующий домен относится к любой аминокислотной последовательности, которая связывается с ТЛЬЬ-1 и содержит природные последовательности или рандомизированные (случайные) последовательности. Типичные ТЛЬЬ-1 модулирующие домены можно идентифицировать или получать методом фагового дисплея или другими методами, указанными в данном описании. Примеры пептидов этого типа представлены в табл. 30 и 31.
Термин ТЛЬЬ-1 антагонист относится к молекуле, которая связывается с ТЛЬЬ-1 и повышает или снижает один или более аналитических показателей по сравнению с действием на эти показатели полноразмерного нативного ТЛЬЬ-1. Такую активность можно определить, например, такими анализами, которые описаны в подразделе, озаглавленном Биологическая активность АСР- 3 (Вю1одюа1 асЩйу о! АОР-3) в разделе Материалы и Методы (Ма1епа15 & МеШоДк) патентной заявки, озаглавленной ТОТ1гс1а1сД ргоГешк (ТОТ-родственные белки), \О 00/47740, опубликованной 17 августа 2000 г.
Термин Апд 2-антагонистический пептид относится к пептидам, которые можно идентифицировать или получать как проявляющие Апд-2-антагонистические характеристики. Примеры пептидов такого типа представлены в табл. 32-38.
Термин \8Р относится к водорастворимому полимеру, который предупреждает преципитацию пептида, белка или другого соединения с которым он связан, в водной среде, например такой, как физиологическая среда. Более подробное описание различных вариантов \8Р, рассматриваемых в данном изобретении, приводится ниже.
Лиофилизация и введение
Терапевтические пептидные антитела применяются в фармацевтических препаратах для лечения человеческих заболеваний по данному описанию. В одном варианте изобретения композиции терапевтического пептидного антитела являются лиофилизированными. Лиофилизацию проводят общепринятыми в технике методами и их следует оптимизировать для разработанных композиций [Тапд е! а1., РЬагт Кек. 21: 191-200, (2004) и СЬапд е! а1., РЬагт Кек. 13: 243-9 (1996)].
В одном аспекте цикл лиофилизации включает три стадии: замораживание, первичная сушка и вторичная сушка [А.Р. Маскеп/1е. РЫ1 Тгапк К. 8ос ЬопДоп, 8ег В., Βίο1 278: 167 (1977)]. На стадии замораживания раствор охлаждают, инициируя льдообразование. Кроме того, на этой стадии индуцируется кристаллизация наполнителя. Лёд сублимируется (возгоняется) на стадии первичной сушки, которую проводят путём понижения давления в камере ниже давления паров льда, подключая вакуум и включая нагрев с целью инициировать сублимацию (возгонку). Наконец, абсорбированную или связанную воду удаляют на стадии вторичной сушки при пониженном давлении и повышенной температуре. В результате получают материал, называемый лиофилизированным брикетом (лиофилизированной биомассой). Затем брикет (биомассу) реконституируют (восстанавливают) либо стерильной водой, либо подходящим разбавителем для инъекции.
Цикл лиофилизации не только определяет конечное физическое состояние эксципиентов, но также влияет на другие показатели, такие как время реконституции (восстановления), внешний вид, стабильность и конечное содержание влаги. Структура композиции в замороженном состоянии проходит через несколько переходов (преобразований) (например, стеклование, увлажнения и кристаллизации), которые происходят при определённых температурах, и их можно использовать для того, чтобы понять и оптимизировать процесс лиофилизации. Температура стеклования (Тс (Тд) и/или Тс' (Тд')) может дать информацию о физическом состоянии раствора, и её можно определить методом дифференциальной сканирующей калориметрии (Э8С). Тс и Тс' являются важными характеристиками, которые следует учитывать при планировании цикла лиофилизации. Например, значение Тс' важно для первичной сушки. Кроме того, температура стеклования даёт информацию о температуре хранения конечного продукта в высушенном состоянии.
Общие сведения об эксципиентах
Эксципиенты представляют собой добавки, которые включают в состав препарата, так как они либо обеспечивают, либо улучшают стабильность, доставку и технологичность лекарственного продукта. Вне зависимости от причины их включения в состав препарата эксципиенты являются неотъемлемым компонентом лекарственного продукта и, следовательно, должны быть безопасными и должны хорошо переноситься пациентами. В случае белковых лекарств выбор эксципиентов особенно важен, так как они должны влиять как на эффективность (активность), так и на иммуногенность лекарства. Следовательно, белковые препараты необходимо разрабатывать с использованием соответствующего подбора эксципиентов, которые придают стабильность, безопасность и товарные качества.
Лиофилизированный препарат обычно содержит буфер, наполнитель и стабилизатор. Пригодность поверхностно-активного вещества следует оценить и выбрать в тех случаях, в которых агрегация во время стадии лиофилизации или в процессе реконституции является проблемой. Подходящий забуферивающий агент включают с целью поддерживать рН препарата во время лиофилизации в постоянном диа- 16 022424 пазоне. Сравнение компонентов эксципиента в жидких и лиофилизированных белковых препаратах даётся в табл. А.
Таблица А. Компоненты эксципиента в лиофилизированных белковых препаратах
Компонент эксципиента Функция в лиофилизированном препарате
Буфер о Сохранение рН препарата во время лиофилизации и реконституции
Агент, регулирующий тоничность/стабилизатор о Стабилизаторы включают крио- и лиопротекторы о Примеры включают полиолы, сахара и полимеры о Криопротекторы предотвращают стрессы белков при замораживании о Лиопротекторы стабилизируют белки в лиофилизированном состоянии
Наполнитель о Применяется для улучшения внешнего вида продукта и для
предупреждения выброса продукта о Обеспечивает структурную прочность лиофилизированной прессованной биомассы (брикета) о Примеры включают маннит и глицин
Поверхностно- активное вещество о Применяют, если проблемой становится агрегация в процессе лиофилизации о Может служить для сокращения времени реконституции о Примеры включают полисорбат 20 и 80
Антиоксидант о Обычно не применяется, молекулярные реакции в лиофилизированной биомассе очень замедлены
Ионы металлов/хелатирующий агент о Могут вводиться, если конкретный ион металла включается лишь в качестве кофактора или если металл необходим для протеазной активности о Хелатирующие агенты обычно не требуются в лиофилизированных препаратах
Консерванты о Только препараты для многократного приёма о Предупреждают рост микробов в препарате о обычно входят в состав разбавителя для реконституции (например, ЪЛМР!)
Основной проблемой при разработке препаратов терапевтических белков является увеличение стабильности продукта в условиях производства, перевозки и хранения. Роль эксципиентов в препарате это обеспечение устойчивости к этим стрессам. Эксципиенты можно также использовать для уменьшения вязкости препаратов с высокой концентрацией белка, чтобы содействовать их доставке и сделать их более удобными для пациентов. Вообще эксципиенты можно классифицировать в зависимости от механизмов, с помощью которых они повышают устойчивость белков к различным химическим и физическим стрессам. Некоторые эксципиенты используют для того, чтобы ослабить воздействие конкретного стресса или регулировать конкретную чувствительность (восприимчивость) конкретного белка. Другие эксципиенты оказывают более общее действие на физическую устойчивость белков и стабильность ковалентного связывания белков. Эксципиенты по данному описанию объединяют либо в зависимости от их химического типа, либо в зависимости от их функции в препаратах. Краткие описания способов стабилизации приводятся при обсуждении каждого типа эксципиентов.
Учитывая рекомендации и указания в данном описании, специалисты в данной области техники поймут, в каком количестве или диапазоне количеств эксципиент можно включать в состав любого конкретного препарата для того, чтобы получить биофармацевтический препарат по изобретению, который промотирует сохранение стабильности биофармацевтического соединения. Например, количество и тип соли, которую включают в состав биофармацевтического препарата по изобретению, можно выбирать с учётом заданной осмолярности (осмотической концентрации) (а именно, изотонической, гипотонической или гипертонической) конечного раствора, а также количества и осмолярности других компонентов, ко- 17 022424 торые следует включить в состав препарата. Также, например, что касается типа полиола или сахара, входящего в состав препарата, количество такого эксципиента зависит от его осмолярности.
Например, введение примерно 5% сорбита может обеспечить изотоничность, тогда как для достижения изотоничности требуется около 9% сахарозы. Выбор количества или диапазона концентраций одного или более эксципиентов, которые можно включить в состав биофармацевтического препарата по изобретению, показан выше на примерах солей, полиолов (многоатомных спиртов) и сахаров. Однако специалист в данной области техники понимает, что соображения в данном описании и дополнительно поясняемые со ссылкой на конкретные эксципиенты, равно применимы ко всем типам и комбинациям эксципиентов, включая, например, соли, аминокислоты, другие агенты, регулирующие тоничность, поверхностно- активные вещества, стабилизаторы, наполнители, криопротекторы, лиопротекторы, антиоксиданты, ионы металлов, хелатирующие агенты и/или консерванты.
Кроме того, если конкретный эксципиент указан в препарате, например, в виде процентного содержания (%) вес./об., специалист в данной области техники понимает, что рассматривается также эквивалентная молярная концентрация.
Само собой разумеется, что рядовой специалист в данной области техники понимает, что концентрации вышеуказанных эксципиентов зависят от конкретного препарата. Например, концентрацию наполнителя можно уменьшить в тех случаях, когда концентрация белка/пептида высока или когда высока концентрация стабилизирующего агента. Кроме того, рядовой специалист в данной области техники понимает, что для поддержания изотоничности конкретного препарата, в котором отсутствует наполнитель, концентрацию стабилизирующего агента следует соответствующим образом корректировать (например, следует взять тонизирующее количество стабилизатора). В уровне техники известны другие эксципиенты, их можно найти в Ро\\е11 с1 а1., Сотрепйшт оБ ЕхарюпЦ Бог Рагеп1ега1 Рогти1айоп8 (1998), ΡΌΆ 1. РЬагт. 8сБ ТесЬпо1о§у, 52: 238-311.
Буферы
Обычно наблюдают, что устойчивость белкового лекарства максимальна в узком диапазоне рН. Этот рН диапазон оптимальной устойчивости (стабильности) следует определить заранее в ходе предварительных исследований. Показано, что для этого применимы некоторые подходы, такие как ускоренные исследования стабильности и калориметрический скрининг (Котте1е К.Ь. 1г., е1 а1., ВюсНетЩгу. 38(16): 5241-7 (1999)). Когда препарат окончательно одобрен, лекарственный продукт нужно получить промышленно и поддерживать в пределах заданных характеристик в течение всего времени хранения. Поэтому для контроля рН препарата почти всегда используют забуферивающие агенты.
В белковых препаратах обычно в качестве буферов используют органические кислоты, фосфаты и Трис (таблица В). Буферная ёмкость буферов максимальна при значении рН, равном рКа, и понижается по мере того, как рН увеличивается или уменьшается по сравнению с этим значением. Девяносто процентов буферной ёмкости находится в пределах одной рН единицы от величины рКа. Буферная ёмкость также увеличивается пропорционально увеличению концентрации буфера.
При выборе буфера следует принимать во внимание несколько факторов. Первый и основной вид буфера и его концентрацию следует определять с учётом его рКа и рН заданного препарата. Также важно гарантировать, чтобы буфер был совместим с белковым лекарством, другими эксципиентами препарата и не катализировал никаких реакций расщепления. Недавно показано, что буферы, содержащие соли полианионных карбоксилатов, образуют ковалентные аддукты с остатками боковых цепей белков. Третьим важным аспектом, который следует учитывать, является чувствительность к жжению и раздражение, которые может вызвать буфер. Например, известно, что инъекция цитрата вызывает жжение и боль (Ьашъеп Т., е1 а1., Вайс СПп РЬагтасо1 ТойсоБ, 98(2): 218-21 (2006)). Вероятность жжения и раздражения выше в случае лекарств, которые вводят либо 8С (подкожным), либо ΙΜ (внутримышечным)способом, когда раствор лекарства остаётся в месте введения относительно более продолжительное время, чем при 1В (внутривенном) введении, когда препарат после введения быстро разбавляется в крови. В случае препаратов, которые вводятся непосредственно внутривенной (IV) инфузией, следует проводить мониторинг общего количества буфера (и любого другого компонента препарата). Следует быть особенно осторожным в отношении ионов калия, вводимых в виде калийфосфатного буфера, который может оказать влияние на сердечно-сосудистую систему пациента (НоПапйег-Войпдие/ 1С, е1 а1., Ат. Рат. РЬуйаап., 73(2): 283-90 (2006).
Следует подробнее рассмотреть буферы для лиофилизированных препаратов. Некоторые буферы, подобно натрийфосфатному буферу, могут кристаллизоваться из белковой аморфной фазы в процессе замораживания, что приводит к значительным смещениям значений рН. Других обычных буферов, таких как ацетатный и имидазольный, следует избегать, так как они могут сублимироваться или испаряться в процессе лиофилизации, тем самым изменяя рН препарата во время лиофилизации или после восстановления (реконституции).
- 18 022424
Таблица В. Общеупотребительные забуферивающие агенты и величины их рКа
Буфер рКа Пример лекарственного продукта
Ацетатный 4.8 Нейпоген, Нейласта
Сукцинатный рКа1 = 4.8, рКа2 = 5.5 Актиммун
Цитратный ρΚαι = 3.1^32 = 4.8, рКзз = 6.4 Гумира
Гистидиновый (имидазол) 6.0 Ксолер
Фосфатный рКа1 = 2.15, рКа2 = 7.2, рКзз = 12.3 Энбрел (жидкий препарат)
Трис 8.1 Лейкин
Буферную систему для композиций выбирают таким образом, чтобы она была физиологически совместимой и поддерживала заданную величину рН в восстановленном (реконституированном) растворе, а также в растворе перед лиофилизацией. В одном варианте изобретения значение рН раствора перед лиофилизацией находится в диапазоне 2.0 - рН 12.0. Например, в одном варианте изобретения рН раствора перед лиофилизацией составляет 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7 или 12.0. В другом варианте изобретения рН восстановленного раствора находится в диапазоне 4.59.0. В одном варианте изобретения величина рН восстановленного раствора равна 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7 или 9.0.
В одном варианте изобретения рН буферизующий агент, используемый в препарате, представляет собой аминокислоту или смесь аминокислот. В одном аспекте рН-забуферивающий агент представляет собой гистидин или смесь аминокислот, одной из которых является гистидин.
рН-забуферивающее соединение может присутствовать в любом количестве, пригодном для поддержания рН препарата на заданном уровне. В одном варианте изобретения, в котором рНзабуферивающим агентом является аминокислота, концентрация аминокислоты находится в интервале 0,1-1000 мМ (1 М). В одном варианте изобретения концентрация рН забуферивающего агента составляет по меньшей мере 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700 или 900 мМ. В другом варианте изобретения концентрация рН забуферивающего агента находится в интервале между 1, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 и 100 мМ. Ещё в одном варианте изобретения концентрация рН забуферивающего агента находится в интервале между 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 или 40 и 50 мМ. Ещё в одном варианте изобретения концентрация рНзабуферивающего агента составляет 10 мМ.
Другие примеры рН-забуферивающих агентов, применимых для забуферивания препарата по данному описанию, включают, но без ограничения, глициновый, гистидиновый, глутаматный, сукцинатный, фосфатный, ацетатный и аспартатный буферы.
Стабилизаторы и наполнители
Наполнитель в лиофилизированных препаратах обычно используют для улучшения внешнего вида и предотвращения выброса. Обычно задают такие условия получения препарата, что наполнитель кристаллизуется из замороженной аморфной фазы (либо во время замораживания, либо при отжиге выше Тс'), придавая биомассе (брикету) структуру и объём. Примерами применяемых обычно наполнителей являются маннит и глицин.
Стабилизаторы включают класс соединений, которые служат в качестве криопротекторов, лиопротекторов и стеклообразующих агентов. Криопротекторы стабилизируют белки в процессе замораживания или в замороженном состоянии при низких температурах (Р. Сатегоп, ей., Ооой Рйагтасеийса1 Ргее7е-0гутд Ргасйсе, 1п1егрйагт Ргезз, 1пс., Би££а1о Отоуе, 1Ь, (1997)). Лиопротекторы стабилизируют белки в твёрдой лиофилизированной лекарственной форме, в процессе дегидратации во время лиофилизации сохраняя конформацию белка, аналогичную естественной. Свойства стеклообразного состояния классифицируют как прочное или хрупкое в зависимости от их пластических свойств как функции температуры. Важно, что криопротекторы, лиопротекторы и стеклообразующие агенты остаются в той же фазе, что и белок, для придания стабильности. Сахара, полимеры и полиолы (многоатомные спирты) попадают в ту же категорию и могут иногда играть все три роли.
Полиолы охватывают класс эксципиентов, который включает сахара (например, маннит, сахарозу, сорбит) и другие многоатомные спирты (например, глицерин и пропиленгликоль). Полимерный полиэтиленгликоль (ПЭГ) также входит в эту группу. Полиолы обычно применяются в качестве стабилизирующих эксципиентов и/или изотонизирующих агентов как в жидких, так и в лиофилизированных белковых препаратах для парентерального введения. Что касается ряда Гофмейстера, полиолы являются космотропными и предпочтительно исключаются из белковой поверхности. Полиолы могут защитить
- 19 022424 белки как от физической деструкции, так и от химического расщепления. Предпочтительно исключённые растворители повышают эффективное поверхностное натяжение растворителя на границе с белком, при этом наиболее энергетически выгодными конформациями белка являются конформации с наименьшей площадью поверхности.
Маннит широко распространён в качестве наполнителя в лиофилизированных препаратах, так как он кристаллизуется из аморфной белковой фазы в процессе лиофилизации, сообщая стабильность биомассе (брикету) (например, Лейкин®, Энбрел®-лио, Бетасерон). Обычно его применяют в комбинации с крио- и/или лиопротектором, таким как сахароза. Вследствие склонности маннита к кристаллизации в замороженном состоянии сорбит и сахароза являются предпочтительными регулирующими тоничность агентами/стабилизаторами в жидких препаратах для защиты продукта от стрессов замораживанияоттаивания при транспортировке или при замораживании массы перед приготовлением. Сорбит и сахароза значительно труднее кристаллизуются и, следовательно, менее вероятно их фазовое разделение с белком. Интересно отметить, что хотя маннит используется в сообщающих тоничность количествах в некоторых продажных жидких препаратах, таких как Актиммун®, Фортео® и Ребиф®, на товарных этикетках этих лекарств имеется предостережение Не замораживать. Следует избегать применения восстанавливающих сахаров (содержащих свободную альдегидную или кетогруппу), таких как глюкоза и лактоза, так как они могут реагировать и гликозилировать остатки лизина и аргинина на поверхности белка по реакции альдегидов с первичными аминами (реакция Мейяра) (СНетаПег Р. е! а1., ИаЬгипд, 46(2): 58-63 (2002); Нитепу А., е! а1., 1 Адпс Роой СЬет. 50(7): 2153-60 (2002)). В кислой среде сахароза может гидролизоваться, давая фруктозу и глюкозу (Каи!/ С. Р. апй РоЫпкоп А. Ь., ^ΑСδ, 50(4) 1022-30 (1928)), что затем может вызывать гликозилирование.
Полимерный полиэтиленгликоль (ПЭГ) может стабилизировать белки по двум механизмам в зависимости от температуры. При более низких температурах он предпочтительно, вытесняется с поверхности белка, но, как показано, взаимодействует с нескрученной формой белка при более высокой температуре, что следует из его амфипатической природы (Бее Ь.Ь., апй Ьее ЕС., ВюсЬет15йу, 26(24): 7813-9 (1987)). Таким образом, при более низких температурах он может защищать белки по механизму предпочтительного исключения (вытеснения), но при более высоких температурах, вероятно, за счёт снижения числа результативных столкновений между нескрученными молекулами. ПЭГ является также криопротектором и используется в Рекомбинате®, лиофилизированном препарате рекомбинантного антигемофильного фактора, в котором применяют ПЭГ(РЕС) 3350 в концентрации 1,5 мг/мл. Низкомолекулярные жидкие ПЭГ (ПЭГ(РЕС) 300-600) могут содержать примеси пероксидов и вызывать окисление белков. В случае их применения содержание пероксидов в сыром материале следует свести к минимуму и контролировать в период хранения. То же самое верно для полисорбатов.
В отдельном варианте композиций по настоящему изобретению к лиофилизированному препарату добавляют стабилизатор (или комбинацию стабилизаторов) для предупреждения или уменьшения агрегации и химического расщепления в процессе лиофилизации или хранения. Мутный или непрозрачный раствор после реконституции является показателем выпадения белка. Термин стабилизатор означает эксципиент, способный предупреждать агрегацию или другого рода физическое разрушение, а также химические реакции (например, саморазложение, деамидирование, окисление и т.д.) в водной среде и в твёрдом состоянии. Стабилизаторы, применяемые обычно в фармацевтических композициях, включают, но без ограничения, сахарозу, трегалозу, маннозу, мальтозу, лактозу, глюкозу, раффинозу, целлобиозу, гентобиозу изомальтозу, арабинозу, глюкозамин, фруктозу, маннит, сорбит, глицин, аргинин НС1, многоатомные спирты, включая полисахариды, такие как декстран, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, циклодекстрины, целлюлоза и гиалуроновая кислота, Ν-метилпирролидон, хлорид натрия, [Сагреп!ег е! а1., Иеνеίοр. Вю1. δΠιιΗΗ^ 74: 225, (1991)]. В одном варианте изобретения стабилизатор вводят в концентрации около 0-40% вес./об. В другом варианте изобретения стабилизатор вводят в концентрации по меньшей мере 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 или 40% вес./об. В другом варианте изобретения стабилизатор вводят в концентрации примерно от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 до 10% вес./об. Ещё в одном варианте изобретения стабилизатор вводят в примерной концентрации 2-4% вес./об.
Ещё в одном варианте изобретения стабилизатор вводят в примерной концентрации 2% вес./об.
При желании лиофилизированные композиции также включают соответствующие количества агентов, регулирующих объём и осмолярность, пригодных для получения лиофилизированного брикета (биомассы). Наполнители могут быть либо кристаллическими (например, маннит, глицин), либо аморфными (например, сахароза, полимеры, такие как декстран, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза). Другие примеры наполнителей включают лактозу, сорбит, трегалозу или ксилит. В одном варианте изобретения наполнителем является маннит. В другом варианте изобретения наполнитель вводят в примерной концентрации 0-10% вес./об. В другом варианте изобретения наполнитель вводят в концентрации по меньшей мере 0.2, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 или 9.5% вес./об. Ещё в одном варианте изобретения наполнитель вводят в примерной концентрации 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 до 5.0% вес./об, получают механически и химически устойчивый и красивый брикет (биомассу). В другом варианте изобретения концентрация маннита составляет 4% вес./об.
- 20 022424
Поверхностно-активные вещества
Белковые молекулы проявляют большую склонность к взаимодействию с поверхностями, что делает их чувствительными к адсорбции и денатурации на границах раздела воздух-жидкость, сосуджидкость и жидкость-жидкость (силиконовое масло). Согласно наблюдениям этот путь распада находится в обратной зависимости от концентрации белка и приводит либо к образованию растворимых и нерастворимых белковых агрегатов, либо к потере белка из раствора за счёт адсорбции на поверхностях. Помимо адсорбции на поверхности контейнера (ёмкости) поверхностное разрушение интенсифицируется при физическом взбалтывании, что наблюдается при транспортировке и обработке продукта.
Обычно поверхностно-активные вещества применяются в белковых препаратах для предупреждения разложения, индуцируемого на поверхности. Поверхностно-активные вещества являются амфипатическими молекулами, способными вытеснять белки с границы раздела. Гидрофобные участки молекул поверхностно-активных веществ занимают положение на границе раздела фаз (например, воздух/жидкость), тогда как гидрофильные участки молекул остаются ориентированными к массе растворителя. В достаточных концентрациях (обычно около критической мицеллярной концентрации (мицелл) детергента) поверхностный слой молекул поверхностно-активного вещества предотвращает адсорбцию белковых молекул на поверхности. Тем самым снижается до минимума деградация на поверхности. Наиболее часто применяемыми поверхностно- активными веществами являются сложные эфиры жирных кислот полиэтоксилаты сорбитана, а именно, полисорбат 20 и полисорбат 80 (например, авонекс®, нейпоген®, нейласта®). Они различаются только длиной алифатической цепи, которая придаёт гидрофобный характер молекулам, С-12 и С-18 соответственно. Поэтому полисорбат-80 является более поверхностно-активным и имеет более низкую критическую мицеллярную концентрацию, чем полисорбат-20. Поверхностно-активный полоксамер 188 также применяется в некоторых продажных жидких продуктах, таких как гонал-Р®, нордитропин и овидрел.
Детергенты могут также влиять на термодинамическую конформационную стабильность белков. В данном случае опять же влияние данного эксципиента является специфическим в отношении белка. Показано, например, что полисорбаты понижают устойчивость некоторых белков и повышают устойчивость других. Дестабилизацию белков детергентами можно обосновать, если принять во внимание гидрофобные хвосты молекул детергента, которые могут участвовать в специфическом связывании с частично или полностью раскрученными белками. Взаимодействия такого типа могут вызывать сдвиг конформационного равновесия в белках в сторону более протяжённого состояния (а именно, в сторону увеличения экспозиции гидрофобных участков белковой молекулы в дополнение к связыванию полисорбата). Или же, если белок в нативном состоянии экспонирует некоторые гидрофобные поверхности, связывание детергента с белком в нативном состоянии может стабилизировать эту конформацию.
Другой особенностью полисорбатов является то, что они по своей природе чувствительны к окислительному расщеплению. Часто в сыром виде они содержат достаточные количества пероксидов для того, чтобы вызвать окисление боковых цепей белка, в особенности метионина. Возможность разрушения под действием кислорода после добавления стабилизатора подсказывает, что в препаратах следует применять самые низкие эффективные концентрации эксципиентов. Для поверхностно-активных веществ эффективная концентрация для данного белка зависит от механизма стабилизации. Утверждается, что если механизм стабилизации поверхностно- активным веществом связан с предупреждением поверхностной денатурации, эффективная концентрация равна, примерно, критической мицеллярной концентрации детергента. Напротив, если механизм стабилизации связан со специфическими взаимодействиями белок- детергент, эффективная концентрация поверхностно- активного вещества зависит от концентрации белка и стехиометрии взаимодействия (Ραηύοίρΐι Т.^. с1 а1., РЬагт Вю1ссЬпо1., 13: 159- 75 (2002)).
Поверхностно-активные вещества можно также добавлять в соответствующих количествах для предупреждения связанного с поверхностью явления агрегации во время замораживания и сушки [СЬаид, В, 1. РЬагт. 8с1. 85: 1325, (1996)]. Примеры поверхностно-активных веществ включают анионные, катионные, неионные, цвиттерионные и амфотерные поверхностно-активные вещества, в том числе поверхностно-активные вещества, образованные из природных аминокислот. Анионные поверхностноактивные вещества включают, но без ограничения, лаурилсульфат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия и диоктилсульфонат натрия, хенодезоксихолевую кислоту, натриевую соль ^лаурилсаркозина, додецилсульфат лития, натриевую соль 1-октансульфокислоты, гидрат холата натрия, дезоксихолат натрия и натриевую соль гликодезоксихолевой кислоты. Катионные поверхностно- активные вещества включают, но без ограничения, бензалконийхлорид или бензетонийхлорид, моногидрат цетилпиридинийхлорида и гексадецилтриметиламмония бромид. Цвиттерионные поверхностно-активные вещества включают, но без ограничения, СНАР8, СНАР80, 8В3-10 и 8В3-12. Неионные поверхностно-активные вещества включают, но без ограничения, дигитонин, Тритон Х-100, Тритон Х-114, Т\УЕЕ^20 и Т\УЕЕ^80. В другом варианте изобретения поверхностно-активные вещества включают лауромакрогол 400, полиоксил-40-стеарат, полиоксиэтилен гидрогенизированное касторовое масло 10, 40, 50 и 60, моностеарат глицерина, полисорбат 20, 40, 60, 65 и 80, лецитин из сои и другие фосфолипиды, такие как И0РС, ИМРС, ИМРС и И0РС; эфир сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу. Компо- 21 022424 зиции, содержащие такие поверхностно-активные вещества, либо самостоятельно, либо в виде смеси при различных соотношениях, приводятся далее. В одном варианте изобретения поверхностно-активное вещество вводится с концентрацией около 0-5% вес./об. В другом варианте изобретения поверхностноактивное вещество вводится с концентрацией по меньшей мере 0.001, 0.002, 0.005, 0.007, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 или 4.5% вес./об. В другом варианте изобретения поверхностно-активное вещество вводится с концентрацией около 0,001-0,5% вес./об. Ещё в одном варианте изобретения поверхностно-активное вещество вводится с примерной концентрацией от 0.004, 0.005, 0.007, 0.01, 0.05 или 0.1% вес./об, примерно до 0.2% вес./об. Ещё в одном варианте изобретения поверхностно-активное вещество вводится с примерной концентрацией 0,01-0,1% вес./об.
Соли
Часто соли добавляют для увеличения ионной силы препарата, которая может иметь значение для растворимости, физической стабильности и изотоничности белков.
Соли могут воздействовать на физическую стабильность белков различными способами. Ионы могут стабилизировать нативное состояние белков, связываясь с заряженными остатками на поверхности белков. Или же они могут стабилизировать белки в денатурированном состоянии, связываясь с пептидными группами, расположенными вдоль белкового каркаса (-ΕΘΝΗ-). Также соли могут стабилизировать нативную конформацию белка, экранируя электростатическое отталкивание остатков в белковой молекуле. Электролиты в белковых препаратах также могут экранировать электростатическое притяжение между белковыми молекулами, что в конечном счёте приводит к агрегации и ухудшению растворимости белков.
Влияние соли на стабильность и растворимость белков заметно меняется в зависимости от характеристик ионных соединений. Ряд Гофмейстера (Хофмейстера), предложенный в 1880-х гг., - это способ упорядочить электролиты в зависимости от их способности осаждать белки (Сасасе М.С. е! а1., Оиаг1ег1у Рс\'1С\У5 о£ ВюрЬу81С8., 30(3): 241-277 (1997)). В данной работе ряд Гофмейстера использован для того, чтобы проиллюстрировать степень влияния ионных и неионных сорастворителей на стабилизацию белков. В табл. С сорастворители расположены в порядке их общего воздействия на белки в растворённом состоянии, от стабилизирующих (космотропные) до дестабилизирующих (хаотропные). В целом различие эффектов между анионами значительно больше, чем между катионами, и для обоих типов эффекты являются наиболее явными при более высоких концентрациях, чем допустимо для парентеральных препаратов. Высокие концентрации космотропов (например, концентрация сульфата аммония >1 молярной) обычно используют для осаждения белков из раствора в процессе, называемом высаливание, где космотроп предпочтительно исключается с поверхности белка, снижая растворимость белка в его нативной (скрученной) конформации. Удаление или разбавление соли способствует обратному растворению белка. Термин всаливание относится к использованию дестабилизирующих ионов (например, таких как гуанидин и хлорид), которые повышают растворимость белков, сольватируя пептидные связи белкового каркаса. Повышение концентрации хаотропа сдвигает равновесие в сторону конформации белка в денатурированном (раскрученном) состоянии по мере повышения растворимости пептидной цепи. Относительная эффективность ионов в процессах всаливания и высаливания определяет их положение в ряду Гофмейстера.
Для поддержания изотоничности в парентеральном препарате концентрацию солей обычно ограничивают до концентрации ниже 150 мМ для комбинаций одновалентных ионов. В этом диапазоне концентраций механизм стабилизации солями определяется силами электростатического отталкивания или притяжения при взаимодействии (теория Дебая-Хюккеля). Следует отметить, как было показано, по этому механизму хаотропные соли более эффективно стабилизируют структуру белков, чем космотропы с аналогичной концентрацией. Полагают, что хаотропные анионы прочнее связываются, чем космотропные ионы. Что касается расщепления ковалентных связей в белках, предполагается, что различное влияние ионной силы на этот механизм объясняется теорией Дебая-Хюккеля. Соответственно наряду с опубликованными сообщениями о стабилизации белков хлоридом натрия имеются такие, в которых хлорид натрия ускоряет расщепление ковалентных связей. Механизмы влияния солей на стабильность белка являются специфическими в отношении белка и могут заметно меняться в зависимости от рН раствора. Примером того, как эксципиент может применяться для того, чтобы содействовать доставке белкового лекарства, являются некоторые высококонцентрированные препараты антител. Недавно было показано, что соли эффективно снижают вязкость таких препаратов (Ьш 1., е! а1., 1. РЬагт δει., 94(9): 1928-40 (2005); Ошибка в: 1 РЬатт δει., 95(1): 234-5. (2006)).
- 22 022424
Таблица С. Ряд Гофмейстера для солей
Сорастворители Шкала стабильности
Анион Катион . Другое
г <СНЭ)Х Глицерин/Сорбит Стабилизирующий (высаливание) Δ V Дестабилизирующий (всаливание) Космотропные Хаотропные
ΡΟΖ (СНЩМН* Сахароза/Трегалоза
50/ ΝΗΖ ТМАО
СНСОО' к*
сг Ыа*
Вг' Сз*
Г Ы
Мд2* Гуанидин
Са2* Аргинин
Ва2* Мочевина
Аминокислоты
Аминокислоты нашли разнообразное применение в белковых препаратах в качестве буферов, наполнителей, стабилизаторов и антиоксидантов. Гистидин и глутаминовую кислоту применяют для забуферивания белковых препаратов в интервале рН 5.5-6.5 и 4.0-5.5 соответственно. Имидазольная группа гистидина имеет значение рКа = 6.0, а рКа карбоксильной группы боковой цепи глутаминовой кислоты составляет 4.3, что позволяет применять их для забуферивания в соответствующих диапазонах рН. Ацетат, наиболее общеупотребительный буфер в диапазоне кислых рН 4.0-5.5, сублимирует в процессе лиофилизации и, следовательно, не может использоваться в лиофилизированных препаратах. Глутаминовая кислота особенно полезна в таких случаях (например, 8!еш§еп® (стемген)). В продаваемых белковых препаратах широко применяют гистидин (например, ксолер®, герцептин®, рекомбинат®). Он является хорошей альтернативой цитрату, буферу, который, как известно, причиняет боль и вызывает жжение при инъекции. Интересно отметить, сообщалось, что высокие концентрации гистидина оказывают стабилизирующее действие на ΑВX-I^8 (антитело к ^02) в том, что касается агрегации как в жидком, так и в лиофилизированном виде (Сйеп В. е! а1., Рйагш Кез., 20(12): 1952-60 (2003)). Наблюдали также, что гистидин (в концентрации до 60 мМ) снижает вязкость высококонцентрированного препарата этого антитела. Однако в том же исследовании авторы наблюдали в препаратах, содержащих гистидин, повышенную агрегацию и обесцвечивание во время изучения лиофилизации антитела в ёмкостях (контейнерах) из нержавеющей стали. Авторы отнесли этот результат за счёт действия ионов железа, выделяющихся при коррозии стальных контейнеров. Другое замечание об осторожности при работе с гистидином заключается в том, что он подвергается фотоокислению в присутствии ионов металла (Тошйа М. е! а1., Вюсйеш1з!гу, 8(12): 5149-60 (1969)). Применение метионина в препаратах в качестве антиоксиданта кажется многообещающим; наблюдали, что он эффективен против ряда окислительных стрессов (Ьаш ХМ. е! а1., I. Рйагш. δοί., 86(11): 1250-5 (1997)).
Показано, что аминокислоты глицин, пролин, серин и аланин стабилизируют белки по механизму предпочтительного исключения. Глицин является также наполнителем, широко применяемым в лиофилизированных препаратах (например, немига®, генотропин®, гуматроп®). Он кристаллизуется из замороженной аморфной фазы, придавая структуру и объём брикету (биомассе). Показано, что аргинин является агентом, который эффективно ингибирует агрегацию и используется как в жидких, так и в лиофилизированных препаратах (например, активаза®, авонекс®, энбрел жидкость). Кроме того, повышенную эффективность рефолдинга (повторного скручивания) некоторых белков в присутствии аргинина относят за счёт подавления конкурентной реакции агрегации в процессе рефолдинга).
Антиоксиданты
Окисление белковых остатков происходит по ряду различных причин. Помимо добавления специфических антиоксидантов, предупреждение окислительного расщепления белков включает тщательный контроль за рядом факторов в процессе производства и при хранении продукта, таких как атмосферный кислород, температура, действие света и химические примеси. Наиболее широко применяемыми фармацевтическими антиоксидантами являются восстановители, утилизаторы кислорода/свободных радикалов или хелатирующие агенты. Антиоксиданты в препаратах терапевтических белков должны быть водорастворимыми и оставаться активными в течение всего времени хранения продукта. Восстановители и утилизаторы кислорода/свободных радикалов удаляют из раствора активные кислородные частицы. Хелатирующие агенты, такие как НОТА. эффективно связываются со следовыми примесями металлов, которые вызывают образование свободных радикалов. Например, НОТА используют в жидком препарате кислого фактора роста фибробластов для ингибирования катализируемого ионами металлов окисления
- 23 022424 цистеиновых остатков. ΕΌΤΆ используется в выпускаемых продуктах, таких как Кинерет® и Онтак®.
Помимо оценки эффективности различных эксципиентов по предупреждению окисления белков учёные, разрабатывающие препараты, должны знать, могут ли сами антиоксиданты вызывать другие изменения ковалентных связей и физические изменения в белках. Некоторые такие примеры приводятся в литературе. Восстановители (такие как глутатион) могут вызывать разрыв внутримолекулярных дисульфидных связей, что может привести к перетасовке (шаффлингу) дисульфидов. Показано, что в присутствии ионов переходных металлов ΕΌΤΆ вызывает окисление метионина в ряде белков и пептидов (Акегк М1, апй ЭеГеПрр^ МК. Рерййек апй РгсИеиъ ак Рагеп!ега1 8о1ийоп8. 1п: РЬагтаееи!1еа1 Рогти1айоп Эеуе1ортеп1 оГ Рерййек апй Рго!еш8. §уеп Ргок)аег, Ьагк Ноудаагй, ейЬогк. РЬагтаееиЬеа1 8е1епее. Тау1ог апй Ргапе18, ИК (1999)); Ргапккоп 1.К., 1. РЬагт. §ет 86(9): 4046-1050 (1997); Уш 1, е! а1., РЬагт Кек., 21(12): 2377-83 (2004)). Сообщалось, что тиосульфат натрия снижает уровни окисления метионина под действием света и температуры в гЬцМаЬ НЕК2; однако, в этом же исследовании сообщается также об образовании аддукта тиосульфат-белок (Ьат ХМ, Уапд 1Υ, е! а1., 1 РЬагт §ег 86(11): 1250-5 (1997)). Выбор подходящего антиоксиданта делают в соответствии с конкретными воздействиями и конкретной чувствительностью белка.
Ионы металлов
Вообще говоря, ионы переходных металлов нежелательны в белковых препаратах, так как они могут катализировать физический и химический распад белков. Однако конкретные ионы металлов вводят в состав препаратов, если они являются кофаторами белков, и в состав суспензионных препаратов, если они образуют координационные комплексы (например, суспензия цинка с инсулином). Недавно было высказано предположение, что ионы магния (10-120 мМ) ингибируют изомеризацию аспарагиновой кислоты в изоаспарагиновую кислоту (международная патентная заявка \УО 2004/039337).
Человеческая дезоксирибонуклеаза (гЬДНК-аза, пульмозим®) и Фактор VIII представляют собой два примера, когда ионы металлов сообщают стабильность или повышенную активность в белках. В случае гЬДНК-азы ионы Са'2 (до 100 мМ) повышают стабильность фермента через сайт специфического связывания (СЬеп В., е! а1., 1 РЬагт δΰ., 88(4): 477-82 (1999)). Действительно, выведение ионов кальция из раствора с ЕОТА вызывало увеличение деамидирования и агрегации. Однако, такой эффект наблюдается только в случае ионов Са'2; наблюдали, что другие двухвалентные катионы -Мд'2. Мп'2 и Ζη'2 дестабилизировали гЬДНК-азу. Подобные эффекты наблюдаются в Факторе VIII. Ионы Са'2 и §г+2 стабилизируют белок, тогда как другие ионы, такие как Мд'2, Мп'2 и Ζη'2, Си'2 и Ре+2 дестабилизируют фермент (Ра!оиго8 А., е! а1., Ш!. 1. РЬагт., 155, 121-131 (1997). В отдельном исследовании Фактора VIII в присутствии ионов А1'3 наблюдали значительное повышение скорости агрегации (Эегпек Τδ, е! а1., 1. РЬагт. 8е1., 93(10): 2549-57 (2004)). Авторы отмечают, что в других эксципиентах, таких как буферные соли, часто бывают примеси ионов А1'3 и иллюстрируют необходимость применения в приготовляемых продуктах эксципиентов подходящей степени чистоты.
Консерванты
Консерванты необходимы при создании парентеральных препаратов для многократного применения, которые включают извлечение лекарства из одного и того же контейнера. Их основная функция заключается в том, чтобы ингибировать рост микробов и гарантировать стерильность продукта в течение всего периода хранения или применения лекарственного продукта. Применяемы обычно консерванты включают бензиловый спирт, фенол и м-крезол. Хотя консерванты применяются давно, разработка белковых препаратов, которые включают консерванты, может стать сложной задачей.
Консерванты почти всегда оказывают дестабилизирующее действие на белки (агрегация), и это стало основной причиной ограничения их применения в белковых препаратах многократного применения (Коу δ. е! а1., 1 РЬагт δά., 94(2): 382-96 (2005)).
В настоящее время содержащие белки лекарства готовят только для однократного приёма. Однако когда возможны препараты многократного применения, их дополнительное преимущество заключается в том, что они более удобны для пациента и имеют лучшие товарные качества. Хорошим примером является случай с препаратом человеческого гормона роста (ЬОН), когда разработка консервированных препаратов привела к промышленному выпуску более удобных шприц-ручек многократного действия. По меньшей мере четыре таких устройства в виде ручек, содержащих препараты ЬОН с консервантом, выпускаются в настоящее время. Нордитропин® (жидкость, Ыоуо ЫогФкк), Нутропин Ар® (жидкость, Оепеп!ееЬ) и Генотропин (лиофилизированный - двухкамерный картридж, РЬагтае1а & Ыр)оЬп) содержат фенол, тогда как препарат δотаί^оре® (соматроп) (ЕЬ Ы11у) готовят с м-крезолом.
При разработке лекарственных форм с консервантами следует принимать во внимание некоторые аспекты. Эффективную концентрацию консерванта в лекарственном продукте необходимо оптимизировать. Для этого требуется тестирование данного консерванта в лекарственной форме в интервале концентраций, которая сообщает противомикробную активность, не нарушая стабильности белка. Например, три консерванты были успешно проверены при создании жидкого препарата рецептора интерлейкина-1 (Типа I) методом дифференциальной сканирующей калориметрии (Όδί'.’). Консерванты классифицируют на основании их влияния на стабильность в концентрациях, обычно применяемых в продажных продук- 24 022424 тах (Кетте1е КЬ 1г., е! а1., РЬагт Ке8., 15(2): 200-8 (1998)).
Как можно ожидать, разработка жидких препаратов, содержащих консерванты, является более сложной задачей, чем разработка лиофилизированных препаратов. Лиофилизированные продукты можно получать без консервантов и восстанавливать перед применением с помощью разбавителя, содержащего консервант. Это сокращает время, которое консервант находится в контакте с белком, что значительно снижает обусловленный этим контактом риск дестабилизации белка. В жидких препаратах эффективность консервантов и стабильность следует поддерживать в течение всего времени хранения продукта (—18-24 месяца). Следует отметить, что эффективность консерванта должна проявляться в конечном препарате, содержащем активное лекарство и все компоненты эксципиента.
Некоторые консерванты могут вызывать при инъекции побочные реакции, это является вторым фактором, который следует учитывать при выборе консерванта. В клинических испытаниях по оценке консервантов и буферов в Нордитропине, наблюдали, что восприятие боли было слабее в случае препаратов, содержащих фенол и бензиловый спирт, нежели при введении препаратов, содержащих м-крезол (Карре1даагб А.М., Ногт Кек. 62 8ирр1 3: 98-103 (2004)). Интересно, что обычно применяемый консервант бензиловый спирт обладает анестезирующими свойствами (Мшодие 8.С. апб 8ип Э.А.. Апек!ЬАпа1§., 100(3): 683-6 (2005)).
Принимая во внимание раскрытие и указания в данном описании, специалисты в данной области техники будут знать, в каком количестве или в каком интервале количеств можно вводить эксципиент в какой-либо конкретный препарат для того, чтобы получить биофармацевтическую рецептуру (препарат) по изобретению, инициирующую сохранение стабильности биофармацевтической составляющей. Например, количество и тип соли, которую следует включить в биофармацевтический препарат по изобретению, можно выбирать в зависимости от нужной осмолярности (а именно, изотонической, гипотонической или гипертонической) конечного раствора, а также от количеств и осмолярности других компонентов, вводимых в препарат. Аналогично, что касается типа полиола или сахара, входящего в состав препарата, количество такого эксципиента зависит от осмолярности.
Например, при включении примерно 5% сорбита можно достичь изотоничности, тогда как для достижения изотоничности требуется около 9% эксципиента сахарозы. Примеры выбранного количества или интервала концентраций одного или более эксципиентов, которые можно ввести в состав биофармацевтического препарата по изобретению, а именно солей, полиолов и сахаров, приводятся выше. Однако специалисты в данной области техники понимают, что соображения (принципы) в данном описании и показанные на примерах конкретных эксципиентов, равно применимы ко всем типам и комбинациям эксципиентов, включая, например, соли, аминокислоты, другие агенты, регулирующие тоничность, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, наполнители, криопротекторы, лиопротекторы, антиоксиданты, ионы металлов, хелатирующие агенты и/или консерванты.
Далее, если в препарате приводится содержание конкретного эксципиента, например, в процентах (%) вес./об., специалисты в данной области техники понимают, что также предполагается (рассматривается) эквивалентная молярная концентрация этого эксципиента.
Разумеется, специалист в данной области техники понимает, что концентрация вышеуказанных эксципиентов зависит от конкретной рецептуры. Например, концентрацию наполнителя можно уменьшить в тех случаях, когда высока концентрация белка/пептида, или например, когда высока концентрация стабилизирующего агента. Кроме того, специалист в данной области техники понимает, что для сохранения изотоничности конкретного препарата, не содержащего наполнитель, концентрацию стабилизирующего агента следует соответствующим образом корректировать (например, используя тонизирующее количество стабилизатора).
Композиции являются стабильными по меньшей мере в течение двух лет при температуре 2-8°С в лиофилизированном состоянии. Стабильность в течение такого длительного времени делает возможным продолжительное хранение фармацевтического продукта.
Способы приготовления препаратов
Помимо этого в настоящем изобретении рассматриваются способы приготовления препаратов терапевтических белков. В одном аспекте рассматриваются способы приготовления лиофилизированного препарата терапевтического пептидного антитела, включающие стадию лиофилизации композиции терапевтического пептидного антитела в буфере, содержащем забуферивающий агент, стабилизирующий агент и поверхностно-активное вещество.
Способы по настоящему изобретению включают одну или более следующих стадий: добавление стабилизирующего агента к указанной смеси до лиофилизации, добавление по меньшей мере одного агента, выбранного из наполнителя, агента, регулирующего осмолярность, и поверхностно-активного вещества к указанной смеси перед лиофилизацией. Наполнителем может быть любой наполнитель по данному описанию. В одном аспекте наполнителем является маннит. В другом варианте изобретения стабилизирующим агентом является сахароза. Поверхностно-активное вещество может представлять собой любое поверхностно-активное вещество по данному описанию. В одном варианте изобретения поверхностно-активным веществом является полисорбат-20.
Обычно на практике восстановление (реконституция) лиофилизированного материала представляет
- 25 022424 собой добавление некоторого объёма чистой воды или стерильной воды для инъекций (^ΡΙ) (обычно эквивалентное объёму воды, удалённому в процессе лиофилизации), хотя иногда при получении фармацевтических препаратов для парентерального введения используют разбавленные растворы антибактериальных агентов |СНсп. Эгад ЭсускртсШ аиб 1пби51па1 РЬаттасу, 18: 1311-1354 (1992)]. Соответственно предусматриваются способы приготовления восстановленных (реконституированных) терапевтических пептидных антител, включающие стадии добавления разбавителя к лиофилизированной композиции терапевтического антитела по изобретению.
Лиофилизированную композицию терапевтического пептидного антитела можно восстанавливать в виде водного раствора. Различные водные носители, например стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многократного приёма или вода с соответствующим количеством поверхностноактивных веществ (например, полисорбата-20), 0,4% физиологический раствор, 0,3% раствор глицина или водные суспензии могут содержать активное соединение в смеси с эксципиентами, пригодными для приготовления суспензий. В различных аспектах такие эксципиенты представляют собой суспендирующие агенты, например натрий карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакант и аравийскую камедь; диспергирующие или увлажняющие агенты могут представлять собой природный фосфатид, например лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксиэтанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбита, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и безводных гекситов, например, моноолеат полиэтиленсорбитана. Водные суспензии могут содержать также один или более консервантов, например, этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат.
В одном аспекте композиции для введения композиций человеку или подопытным животным содержат один или более фармацевтически приемлемый носитель. Выражения фармацевтически или фармацевтически приемлемый относятся к молекулярным частицам и композициям, которые являются устойчивыми продуктами, ингибируют деградацию белка, такую как агрегация и расщепление и, кроме того, не вызывают аллергических и других побочных реакций при введении общеизвестными в уровне техники способами, описанными ниже. Фармацевтически приемлемые носители включают все без исключения применяемые в клинике растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и т.п., включая такие агенты, которые раскрываются выше.
Композиции терапевтических пептидных антител можно вводить перорально, топически, трансдермально, парентерально, с помощью спрея для ингаляций, ректально или с помощью интракраниальной инъекции. Термин парентеральный по данному описанию включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или инфузии. Также рассматривается введение с помощью внутривенной, интрадермальной, внутримышечной, интрамаммарной, интраперитонеальной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилёгочной инъекции м/или хирургической имплантации в конкретное место. Обычно композиции практически не содержат пирогенов, а также других примесей, могущих принести вред реципиенту.
Разовые или многократные введения композиций можно осуществлять при уровнях доз и по схеме, выбранным лечащим врачом. Доза, подходящая для предупреждения или лечения заболевания, зависит от типа заболевания, которое следует лечить, по определению выше, тяжести и течения заболевания, от того, применяется лекарство с целью предупреждения или терапии, от предыдущего лечения, анамнеза пациента и реакции на лекарство, и предписания лечащего врача.
Наборы
В дополнительном аспекте изобретение включает наборы, которые содержат одно (одну) или более лиофилизированных соединений или композиций в таком виде, который облегчает их введение субъекту. В одном варианте изобретения такой набор включает соединение или композицию по данному описанию (например, композицию, содержащую терапевтический белок или пептид), упакованную в контейнер, такой как герметизированный флакон или сосуд (ёмкость), с этикеткой, прикреплённой к контейнеру или вложенной в упаковку, на которой описано применение соединения или композиции на практике. В одном варианте изобретения набор включает первый контейнер, содержащий лиофилизированную композицию терапевтического белка или пептида, и второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый раствор для реконституции лиофилизованной композиции. В одном аспекте соединение или композиция упакована в виде разовой (стандартной) лекарственной формы. Кроме того, набор может включать устройство, пригодное для введения композиции конкретным способом. Предпочтительно набор содержит этикетку, на которой описано применение композиции белка или пептида.
Дозы
Схема введения лекарства в способе лечения состояния по данному описанию определяется лечащим врачом с учётом различных факторов, которые модифицируют действие лекарств, например, возраста, состояния, массы тела, пола и диеты пациента, тяжести любой инфекции, времени введения и дру- 26 022424 гих клинических факторов. В различных аспектах ежедневный приём составляет 0,1-1000 мкг препарата на килограмм массы тела (в расчёт берётся только вес белка, без химической модификации) или 0,1-150 мкг/кг. В некоторых вариантах изобретения доза может превышать 1, 3 или 10 мг/кг.
Препараты по изобретению можно вводить в виде первичного болюса с последующей непрерывной инфузией для поддержания терапевтических уровней лекарственного продукта в кровотоке. В другом примере соединение по изобретению можно вводить в виде одноразовой дозы. Специалисты в данной области техники легко смогут оптимизировать эффективные дозы и схемы введения, определяемые надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием отдельного пациента. Частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров агентов и способа введения. Оптимальную фармацевтическую рецептуру определяет специалист в данной области техники в зависимости от способа введения и требуемой дозы. См., например, КеттдШп'з РЬагтасеиЕса1 8с1епсез, 181'1 Εά. (1990, Маск РиЬНзЫпд Со., Еаз1оп, РА 18042), стр.1435-1712, раскрытие которого вводится в данное описание в качестве ссылки. Такие рецептуры могут оказывать влияние на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ίπ У1уо и скорость выведения ίη У1уо введённых агентов. В зависимости от способа введения можно рассчитать подходящую дозу в соответствии с массой тела, площадью поверхности тела или размера органа. При лечении каждым из вышеприведённых препаратов необходимое дополнительное уточнение для определения соответствующей дозы обычно проводят рядовые специалисты в данной области техники без утомительных экспериментов, в частности, на основании сведений о дозах и анализов, раскрываемых в данном описании, а также на основании фармакокинетических данных в клинических испытаниях на людях, обсуждавшихся выше. Соответствующие дозы можно выяснить с помощью известных анализов определения уровней доз в крови в сочетании с соответствующими данными о зависимости дозаэффект. Окончательную схему лечения определяет лечащий врач, принимая во внимание различные факторы, модифицирующие действие лекарств, например, специфическую активность лекарства, тяжесть поражения и реактивность пациента, возраст, состояние, массу тела, пол и диету пациента, тяжесть какой-либо инфекции, время введения и другие клинические факторы. По мере проведения исследований выяснятся дополнительные сведения относительно подходящих уровней доз и длительности лечения в случае различных заболеваний и состояний.
Структура соединений
Общие сведения. В препаратах по изобретению пептид связан с носителем по Ν-концу пептида, Сконцу пептида, или по обоим концам, и полученную структуру можно далее модифицировать за счёт связанного ковалентной связью ^8Р, который связывается с частицей носителя с образованием продукта носитель- пептид. Так например, молекулы терапевтического пептидного антитела по изобретению можно описать нижеприведённой формулой I
I [(X1),- Р1- (Х2)ь]- (1?)с- Ш8Ра где
Е обозначает носитель (переносчик); X1 выбирают из
где Р1, Р2, Р3 и Р4 каждый независимо обозначают последовательности фармакологически активных пептидов;
Е1, Е2, Е3, Е4 и Е5 каждый независимо обозначают линкеры;
а, Ь, с, е, £, д и Ь каждый независимо обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из а и Ь обозначает 1;
ά обозначает 0,1 или более 1 и \У8Р обозначает водорастворимый полимер, присоединение которого осуществляется по любому реакционноспособному (реактивному) элементу в Е1.
Так например, соединение I включает соединения формул [X1- р1]- (Ь')с- ΑνδΡα
II включая его мультимеры, где Е1 обозначает Ес домен и присоединён по С-концу X1, а один или бо- 27 022424 лее ΑδΡ связан с Ре доменом необязательно через линкер Б1;
III [Р'-Х2]- (1?)с- \У5Ра включая его мультимеры, где Р1 обозначает Рс домен и присоединён по Ν-концу X2, а один или более ΑδΡ связан с Рс доменом, необязательно, через линкер Б1;
ιν [р’-оЛ-р1]- (ь’Эс- ΑδΡά включая его мультимеры, где Р1 обозначает Рс домен и присоединён по Ν-концу (Б1)с-Р1, а один или более ΑδΡ связан с Рс доменом необязательно через линкер Б1; и
включая его мультимеры, где Р1 обозначает Рс домен и присоединён по Ν-концу -Б1-Р1-Б2-Р2, а один или более ΑδΡ связан с Рс доменом необязательно через линкер Б1.
В одном варианте изобретения Р1 обозначает Рс домен и присоединён по Ν-концу или С-концу пептида. В другом варианте изобретения Рс связан в димерную форму по данному описанию, к которой присоединены 2 (или более) пептида. Пептиды могут быть гомодимерными (т.е. с одинаковой аминокислотной последовательностью) или гетеродимерными (т.е. с различными аминокислотными последовательностями, которые связываются с одинаковой мишенью или которые связываются с различными мишенями).
В другом варианте изобретения предусматриваются Рс-петли, содержащие пептид(ы). Рс-петли, содержащие пептид(ы), получают в процессе, в ходе которого по меньшей мере один биологически активный пептид вводят в Рс домен в виде внутренней последовательности. Такую внутреннюю последовательность можно добавлять с помощью инсерции (а именно, между аминокислотами в имевшийся ранее Рс домен) или заменой аминокислот в имевшемся ранее Рс домене (а именно, удаляя аминокислоты в имевшемся ранее Рс домене и добавляя аминокислоты пептида). В последнем случае число добавленных пептидных аминокислот необязательно соответствует числу аминокислот, удалённых из имевшегося ранее Рс домена. Например, в одном аспекте предусматривается молекула, в которой удалено 10 аминокислот, а добавлено 15 аминокислот. Предусматриваемые фармакологически активные соединения получают способом, включающим: а) отбор по меньшей мере одного пептида, который модулирует активность белка, представляющего интерес; и б) получение фармакологического агента, содержащего аминокислотную последовательность выбранного пептида в качестве внутренней последовательности Рс домена. Этот способ можно применять для модификации Рс домена, который уже связан с пептидом по Νили С-концу или через боковую цепь, например, как описано в патентных заявках США № 20030195156, 20030176352, 20030229023 и 20030236193 и в опубликованных международных патентных заявках АО 00/24770 и АО 04/026329. Способ, описанный в опубликованной патентной заявке США № 20060140934, также можно применять для модификации Рс домена, который является частью антитела. Таким образом, можно получать различные молекулы, которые имеют дополнительные функциональности, такие как домен связывания с другим эпитопом или дополнительный домен связывания с эпитопом в молекуле-предшественнике. Молекулы, содержащие внутреннюю пептидную последовательность, также относятся к Рс внутренним пептидным антителам или Рс внутренним пептидным молекулам.
Рс внутренние пептидные молекулы могут включать более одной пептидной последовательности в тандемном повторе в конкретной внутренней области, и они могут включать другие пептиды в других внутренних областях. Хотя предпочтительными являются области предполагаемой петли, инсерции в любые другие не-концевые домены Рс также считаются частью изобретения. Варианты и производные вышеуказанных соединений (описанных ниже) также охватываются данным изобретением.
Соединения по данному изобретению можно получать обычными методами синтеза, методами рекомбинантной ДНК или любыми другими методами получения пептидов и слитых белков.
Рассматривается применение Рс внутренних пептидных молекул в качестве терапевтического или профилактического агента. Выбранный пептид может иметь активность, сравнимую с, или даже выше, чем активность природного лиганда, имитируемая пептидом. Кроме того, некоторые терапевтические агенты на основе природных лигандов, вероятно, могут индуцировать антитела против собственного эндогенного лиганда пациента. Напротив, уникальная последовательность пептида, связанного с носителем, позволяет обойти это затруднение, так как она в малой степени идентична или обычно не идентична последовательности природного лиганда. Кроме того, Рс внутренние пептидные антитела могут иметь преимущества при рефолдинге и очистке по сравнению с Рс молекулами, связанными по Ν- или С-концу. Далее Рс внутренние пептидные антитела могут быть более устойчивы как термодинамически, за счёт стабилизации химерных доменов, так и химически, вследствие повышенной устойчивости к протеолитическому расщеплению под действием амино- и карбоксипептидаз. Рс внутренние пептидные антитела могут также проявлять улучшенные фармакокинетические свойства.
Пептиды
Можно использовать любое число пептидов в сочетании с настоящим изобретением. Особый интерес представляют пептиды, которые имитируют активность ЕРО, ТРО, гормона роста, Ο-СδР, ΟΜ-СδР, Ш-1га, СТЕЛ4, ТКА1Б, Т\Т, УБОР, ММР, миостатина, интегрина, ОРО, ОРО-Б, NΟР, ТЛББ-1, партнёра(ов) по связыванию Апд-2, ТОР-α и ТОР-α. Пептидные антагонисты также представляют интерес, в
- 28 022424 особенности проявляющие активность, антагонистическую активности ΤΝΕ, любого из интерлейкинов (ГБ-1, 2, 3,...) и белков, принимающих участие в активации комплемента (например, С3Ь). Нацеливающие пептиды также представляют интерес, включая пептиды хоуминга клеток опухоли, пептиды для переноса через клеточную мембрану. Все эти классы пептидов можно обнаружить методами, описанными в цитированных в данном описании ссылочных материалах и в других ссылочных материалах.
В частности, фаговый дисплей применим для получения пептидов с целью применения в настоящем изобретении. Было установлено, что аффинную селекцию библиотек случайных пептидов можно использовать для идентификации пептидных лигандов для любого сайта любого генного продукта. Эейтап е! а1. (1993), I. Вю1. СЬеш. 268: 23025-30. Фаговый дисплей особенно подходит для идентификации пептидов, которые связываются с такими интересными белками, как рецепторы клеточной поверхности или любые белки, имеющие линейные эпитопы. Айзоп е! а1. (1998), Сап. I. М1сгоЬю1. 44: 313-29; Кау е! а1. (1998), Эгид ϋίδσ Тойау 3: 370-8. Такие белки подробно описаны в обзоре Нет/ е! а1. (1997), I. Кесер!ог & §1§па1 Тгапзйисйоп Кез. 17(5): 671-776, который вводится в данное описание в качестве ссылки. Такие представляющие интерес белки предпочтительны для применения в данном изобретении.
Например, но не в качестве ограничения, охватывается группа пептидов, которые связываются с рецепторами цитокинов. Недавно цитокины были классифицированы в соответствии с их рецепторным кодом. См. статью 1пд1о! (1997), АгсЫуиш 1шшипо1о§1ае е! ТЬегар1ае Ехрепшеп!аНз 45: 353-7, вводимую в данное описание в качестве ссылки. Среди этих рецепторов СКК (семейство I в табл. 3). Классификация рецепторов представлена в табл. 3.
Таблица 3. Классификация рецепторов цитокинов в соответствии с рецепторным кодом
Цитокины (лиганды) Тип рецептора
семейство подсемейство семейство подсемейство
I. Гемопоэтические, цитокины 1. 1Б-2,1Б-4,1Б-7, 1Б-9ДБ-13, ΙΕ-15 I. Цитокин К (СКК) 1. общие уСг, 1Б-9К, 1Б-4К
2. 1Б-3, 1Б-5, ОМСЗР 3. ΙΕ-6, ΙΕ-11, ΙΕ-12, Б1Р.О8М, ΟΝΤΡ, Лептин (ОВ) 4. С-СЗР, ЕРО, ТРО, РКБ, ОН 5. ΙΕ-17, НУЗ-1Е17 2. общие ОР 140 βΚ 3. З.общие КР 130, 1Б-6 К, Лептин К 4. одноцепочечный К, ОСЗР-К, ТРО-К, СН-К 5. другие К2
II. ΙΕ-10 лиганды ΙΕ-10, ВСКР-1, НЗУΙΕ-10 II. 1Б-10К
НЕ Интерфероны 1. ΙΡΝ-αΙ, α2, α4, т, 1, ΙΡΝ-β3 2. ΙΡΝ-γ III. Интерферон К 1. ΙΡΝΑΚ 2 ΙΡΝΟΚ
IV. ΙΕ-1 и1Б-1подобные лиганды 1. ΙΕ-Ια, ΙΕ-Ιβ, ΙΕ1Ка 2. ΙΕ-18, ΙΕ-18ΒΡ IV. 1Б-1К 1. ГОЛКЛБ- 1КАсР 2. 1Б-18К, 1Б-18КАсР
V. ΤΝΡ семейство 1. ΤΝΡ-α,ΤΝΡ-β (БТ), РАЗЕ, СЭ40 Б, СОЗОЕ, Οϋ27 Ε, ОХ40Б, ОРОБ, ТКА1Б, АРК1Б, ΑΟΡ3, ВБуз, ТБ5, Νίη-2, ΚΑΥ, Нейтрокин- α 3. ΝΟΡ/ΤΝΡΚ4 ΤΝΡ-ΚΙ, АСР-ЗК, ϋΚ4, ϋΚ5,0X40, ΟΡΟ, ТАС1, Οϋ40, РАЗ, ΟϋΚ
VI. Хемокины 1. α хемокины: 4. Хемокин К 1. СХСК
'ГЬ- 17К принадлежит к семейству СКК, но не относится к 4 указанным подсемействам 2Другие подтипы ΙΙ'Ν типа I остаются не отнесёнными. Гемопоэтические цитокины, ГБ-10 лиганды и интерфероны не имеют функциональных имманентных протеинкиназ. Молекулы, передающие сигналы цитокинам, это 1АК'з, ЗТАТз и родственные нерецепторные молекулы. П.-14. 11,-16 и 1Б-18 клонировались, но остаются не отнесёнными в соответствии с рецепторным кодом.
3Т№ рецепторы используют мультиплетные, отдельные внутриклеточные молекулы для сигнальной трансдукции, включая домен клеточной гибели РАЗ К и 55 кДа ТЫР-К, который вносит вклад в их цитотоксические эффекты. ΝΩΤ/ΊΝΕ К может связывать как ΝΩΡ, так и родственные факторы, а также ТИР лиганды. Рецепторы хемокинов представляют собой семь транмембранных (7ТМ, серпентин) рецепторов. Они связаны с О-белком.
- 29 022424
VI. Хемокины 1. а хемокины; 4. ХемокинК 1. СХСК
1Ь-8, ОКО а, β, γ, ΙΡ-10, РР-4, δϋΡ-1 2. β хемокины: ΜΙΡΚΜΙΡΙβ, 2. ССК
МСР-1,2,3,4, ΚΑΝΤΕδ, эотаксин 3 γ хемокины: лимфотактин 3. СК
4. ОАКС5
VII. Факторы роста 1.1 8СР, М-С8Р, ΡϋΟΡ-ΑΑ, АВ, ВВ, ΚϋΚ, РЬТ-ДРЬТ- ЗЬ, νΕΟΡ, δδν- ΡϋΟΡ, НСР, δΡ 1.2 ΡΟΡα, ΓΟΡβ, 1.3 ЕСР, ΤΟΡ-α, νν-Ρ19(ΕΟΡподобный) 1.41СР-1,ΙΟΡ-ΙΙ, инсулин 1.5 ΝΟΡ, ΒϋΝΡ,ΝΤ-3, ΝΤ-46 2. ΤΟΡ- βΐ, β2, β3 VII. ΚΚΡ 1. ΤΚ подсемейство 1.1 Ι§ΤΚΙΙΙΚ, νΕΟΡ-ΚΙ, νΕΟΡ-ΚΙΙ 1.2 ΙβΤΚίνΚ 1.3 Обогащённый цистеином ΤΚ-Ι 1.4 Обогащённые цистеином ΤΚ-ΙΙ, ΙΟΡ-ΚΙ 1.5 цистеиновый узел ΤΚ V 2. Подсемейство серин- треонин киназ (8ТК8)7
4Антиген Даффи (ОАКС) представляет собой рецептор эритроцитов, который может связывать несколько различных хемокинов. 1Ь-1К относится к суперсемейству иммуноглобулинов, но характеристики их событий сигнальной трансдукции остаются неясными.
5Нейротрофические цитокины могут также ассоциироваться с рецепторами ΝΟΡ/ΤΝΡ.
65ТК5 может также охватывать другие родственные ΤΟΡ-β, которые остаются неотнесёнными. Протеинкиназы являются неотъемлемой частью внутриклеточного домена семейства рецепторных киназ (ККР). Ферменты принимают участие в передаче сигнала через рецепторы.
Другие белки, представляющие интерес в качестве мишеней для получения пептидов в данном изобретении, включают следующие белки:
ανβ3 ανβΐ
Αη§-2
В7
В7КР1
СКР1
Кальцитонин
СО28
СЕТР сМе1
Комплементарный фактор В
С4Ь
СТЬА4
Глюкагон
Рецептор глюкагона
ПРО
МРЬ варианты, полученные в результате сплайсинга молекул, предпочтительно экспрессирующихся в опухолевых клетках; например СЭ44, СЭ30;
негликозилированные варианты муцина и Льюиса Υ поверхностные гликопротеины СЭ19, СО20, СП33, СЭ45;
простатоспецифичный мембранный антиген и простатоспепифичный клеточный антиген; матриксные металлопротеиназы (ММП, ММР), как секретированные, так и мембраносвязанные
- 30 022424 (е.д., ММР-9);
Катепсины ΤΙΕ-2 рецептор гепараназа урокиназный плазминогенный активатор (иРА), иРА рецептор паратиреоидный гормон (РТН), белок, родственный паратиреоидному гормону (РТНгР), РТН-ΚΙ, РТН-КП Нег2 НегЗ Инсулин Миостатин ТАЬЬ-1
Фактор роста нервных клеток
Интегрины и рецепторы
Селектины и их рецепторы
Молекулы клеточной адгезии и их рецепторы
Примеры пептидов представлены ниже в табл. 4-38. Эти пептиды можно получать любыми методами, раскрываемыми в уровне техники, многие из которых обсуждаются в данном описании. В большинстве нижеприведённых таблиц для аминокислот используются однобуквенные сокращения. X в этих последовательностях (в описании в целом, если в конкретном примере не указывается иначе) означает, что могут присутствовать любые из 20 природных аминокислотных остатков. Любые из этих пептидов могут быть связаны в тандемный повтор (т.е. последовательно), с линкерами или без них, и некоторые примеры тандемных повторов приводятся в таблице. Линкеры приводятся как Л и могут представлять собой любые линкеры по данному описанию. Тандемные повторы и линкеры для ясности разделены чертой. Любой пептид, содержащий цистеинильный остаток, может быть сшит с другим Суз-содержащим пептидом, либо оба они могут быть связаны с носителем. Некоторые примеры сшитых пептидов представлены в таблице. В любом пептиде, содержащем более одного Суз остатка, может также образовываться внутрипептидная дисульфидная связь; см., например, ЕРО-миметические пептиды в табл. 5. Несколько примеров пептидов с внутрипептидной дисульфидной связью приводится в таблице. Любые из этих пептидов могут быть дериватизированы по данному описанию, и некоторые примеры дериватизированных пептидов приводятся в таблице. Дериватизированные пептиды представлены в таблицах скорее в качестве примеров, нежели для ограничения, так как ассоциированные дериватизированные пептиды также можно использовать в данном изобретении. В случае производных, в которых карбоксильные группы могут быть кэпированы аминогруппой, кэпирующая аминогруппа показана как -ΝΗ2. В случае производных, в которых аминокислотные остатки заменены фрагментами, отличными от аминокислотных остатков, заместители показаны буквой σ, которая обозначает любые фрагменты (частицы), описанные в ВЬаШадаг е1 а1. (1996), I. Меб. СЕет. 39: 3814-9 и СнбтЪеПзоп е1 а1. (1997), I. Меб. СЕет. 40: 287682, вводимых в данное описание в качестве ссылки. Заместитель .1 и заместители Ζ (Ζ5, Ζ6,...Ζ40) имеют значение по определению в патентах США № 5608035, 5786331 и 5880096, которые вводятся в данное описание ссылкой. В случае ЕРО-миметических последовательностей (табл. 5) заместители Х2-Х11 и целое число п имеют значение по определению в международной заявке УО 96/40772, которая вводится в данное описание ссылкой. Также в случае ЕРО-миметических последовательностей заместители Хпа, Χία, Х2а, Х3а, Хда, Х5а и Хса после определений Хп, Х1 Х2, Х3, Х4, Х5 и Хс соответственно даются по УО 99/47151, вводимой в данное описание в качестве ссылки. Заместители ψ, Θ и + даются по определению в статье 8рагкз е1 а1. (1996), Ргос. N6. Асаб. 8сЁ 93: 1540-4, вводимой в данное описание в качестве ссылки. Х4, Х5, Х6 и Х7 имеют значения по определению в патенте США № 5773569, который вводится в данное описание в качестве ссылки, за исключением следующего: в случае интегрин-связывающих пептидов, Х1, Х2, Х3, Х4, Х5, Х6, Х7 и Х8 имеют значения по определению в международных патентных заявках: УО 95/14714, опубликованной 1 июня 1995 г. и УО 97/08203, опубликованной 6 марта 1997 г., также вводимых в данное описание в ссылками; и в случае У1Р-миметических пептидов Х1, Х1', Х'', Х2, Х3, Х4, Х5, Х6 и Ζ и целые числа т и η имеют значение по определению в международной заявке УО 97/40070, опубликованной 30 октября 1997 г., также вводимой в данное описание ссылкой. Хаа и Уаа (см. ниже) имеют значение по определению в международной заявке УО 98/09985, опубликованной 12 марта 1998 г., вводимой в данное описание ссылкой. АА1, АА2, АВ1, АВ2 и АС имеют значение по определению в международной заявке УО 98/53842, опубликованной 3 декабря 1998 г., вводимой в данное описание ссылкой. Х1, Х2, Х3 и Х4 в табл. 17 только имеют значение по определению в Европейской заявке ЕР 911393, опубликованной 28 апреля 1999 г. Остатки, выделенные жирным шрифтом, представляют собой Ό-аминокислоты. Если не указано иначе, все пептиды связаны пептидными связями. Сокраще- 31 022424 ния даны в конце данного описания. В столбце 8ЕР ГО N0. ΝΚ означает, что в перечне отсутствует перечень последовательностей для данной последовательности.
Таблица 4. Последовательности Ж-! антагонистических пептидов
Последовательность/структура 8ЕЦ ГО ΝΟ:
Ζ| |Ζ7ΖίΟΖιΥΖβΖ9Ζ|ο 3
ΧΧΟΖίΥΖβΧΧ 4
Ζ7ΧΟΖ5ΥΖ6ΧΧ 5
Ζ7Ζ8ΟΖ5ΥΖ6Ζ9Ζι0 6
Ζ| (ΖγΖβΡΖ^ΥΖβΖφΖιΟ 7
Ζ|2ΖυΖι«Ζ|$Ζ|6Ζ|7ΖιιΖ|9Ζ2οΖ2ΐ2^3Ζι ιΖ^ΖιΟΖίΥΖβ-Ζ^ΖιοΕ 8
Ζ23ΝΖ24Ζ3»Ζ23Ζ26Ζ27ΖΜΖ2»Ζ,οΖ4Ο 9
ΤΑΝν58ΡΕ\νΤΡΥΥ\ν(}ΡΥΑΙ.ΡΕ 10
5\νΤϋΥΟΥλν0ΡΥΑΕΡΙ5ΟΕ 11
ΕΤΡΡΤ\νΕΕ$ΝΑΥΥ\ν<3ΡΥΑΙ-ΡΕ 12
ΕΝΤΥδΡΝλΥΑΟδΜΥννρΡΥΑΕΡΕ 13
δνΟΕΟΗΝΕννΤδΕΥΧνΟΡΥΑΕΡΙ. 14
ΟΟΥΟΚ\νΚς>δΟΕΚΥ\ν(}ΡΥΑΕΡΕ 15
ΡΕ\ντραγ\νρργ 16
ΡΕ\νΤΡΟΥ^0ΗΥ 17
ΡΕ\νΤΡΟ\νΥ(51Υ 18
ΑοΡΕΧνΤΡΟλΥΥρΓΥ 19
ΡΕίντρανρΥΟίΥ 20
ΡΑ\ντρογ\νςργ 21
ΡΕ\νΑΡΟΥ\ν(3ίΥ 22
ΡΕ\ννΡΟΥννθΙΥ 23
ΡΕν/ΤΡΟΥΑΥΟΙΥ 24
АсРЕ\¥ТРС¥Ж)1У 25
- 32 022424
ΡΕν/τρβννγςπγ 26
ΡΕ\νΤΡ5»ΓλνΥΟ1Υ 27
ΡΕ\νΤΡΟΥΥφΡΥ 28
ΡΕ\νΤΡΟ\ν\ΥφΡΥ 29
ΡΕΑνΤΡΝΥλΥρΡΥ 30
ΡΕ^νΤΡνΥΜνφίΥ 31
ΡΕλνΤΡίχΟΥλΥφΙΥ 32
ΡΕ\νΤΡΑϋ?Υ\νφΙΥ 33
ΡΕ\νΤ53τΟΥ\νφΙΥ 34
ΡΕλΥΤΡΟΥν/φΡΥ 35
ΡΕ\ντρογννφΗΥ 36
ΡΕΧνΈΡΟννΥφΙΥ 37
ΑϋΡΕλνΤΡΟ\νΥφ/Υ 38
ΡΕ\νΤΡΟ\ν-ρΥ-φΙΥ 39
ΡΑ\νΤΡΟΥ\νφΙΥ 40
ΡΕ\ΥΑΡΟΥ\νφΙΥ 41
ΡΕ\ννροΥλνφΐγ 42
ΡΕ\νΤΡΟΥ\νφΙΥ 43
ΑοΡΕ\νΤΡ6Υ\νφΙΥ 44
ΡΕν/ΤΡΑ\νΎφΙΥ 45
ΡΕ\νΤΡδ8Γ\νΥφΙΎ 46
ΡΕν/ΤΡΟΥΥφΡΥ 47
ΡΕ\νΤΡΟ\νν/φΡΥ 48
ΡΕλν'ΓΡΝΥλΥφΡΥ 49
ΕΈ\νΤΡνΥλΥφΙΥ 50
ΡΕλνΤΡβοΟΥλνφΙΥ 51
ΡΕν/ΎΡΑΦΥν/φΙΥ 52
ΡΈ\νΤ$ΗΓθΥ\νςΠΥ 53
ΡΕλντραγχνφργΑυΡΕ 54
ΙΝβρΕλνΤΡΟΥΥφΙΥ 55
ΥΕν/ΤΡΟΥΥφΙΥ 56
ΡΕλννΡΟΥΥφΙΥ 57
ΡΕΧνΤΡδΥΥφίΥ 58
ΡΕλΥΤΡΝΥΥΟίΥ 59
ΤΚΡΚ 60
ΚΚ53Κ 61
κκφϋκ 62
ΝΚΚφϋΚ 63
- 33 022424
ΚΚΟϋΚΚ 64
ΕΝΚΚΟϋΚΚΡ 65
ντκργρ 66
ντκργ 67
ντηργ 68
δΗΐΎλνρργδνρ 69
ΊΈνΥ\νρΡΥ5υ3Τ 70
Κ.ΟϋΥ\ν0ΡΥ5ν(55 71
νΗνγλνορΥ5νς>τ 72
ΚΙΛΎΑΟΡΥδνΟΤ 73
8ВЛЛУР<)РУ5Е<)8 74
ΝΜνΥ\ν<3ΡΥ5Ι<3Τ 75
3ννΡ\ν<2ΡΥ$ν<3Τ 76
ΤΕνΥΑΟΡΥΑΙ/ΡΕ 77
ΤΕνΥΑΟΡΥδΙΟΚ 78
Κ.ΙΛ'ΎΆΟΡΥδνρΚ. 79
5ΡνΡ\ν(3ΡΥ81(31 80
ΑΙΕΑΑρΡΥδνΟδ 81
3Ε1Υ\ν<2ΡΥ3Ε<)Μ 82
ΤΚ.ΕΥ\ν0ΡΥ$ν<3Κ 83
КСОУАОРУЗУОТ 84
ΜΚνΡΑ(}ΡΥ8νθΝ 85
ΚίνΥΑΟΡΥδνΟΤ 86
ΚΗΕΥΑΟΡΥΕνΟΚ 87
ΑΕν\ν\νρΡΥ5Ε.()Ι 88
3Κν\νΡρΡΥ5Ερ5 89
ΆΕ<}ΡΥΑΕΡΕΕ 90
ς>Εν\ν\ν<5ΡΥ5ν()Κ 91
ϋΕΕΥΑΟΡΥδνον 92
ΕΕν\ν\ν(2ΡΥ3Ε<2Ε 93
□Εν\ν\¥<3ΡΥ5ν(3\ν 94
ΝΟΝΥ\νθΡΥ5Ρ()ν 95
ΕΕνγν/ρργδίοκ 96
ΕΕΜΥ\νρΡΥ5ν<}Ε 97
ΝΕΕΥΑΟΡΥ8ΜΟΟ 98
ΟΥΕΑΥζ?ΡΥ5ν<5Κ 99
5Κν\νΥ0ΡΥ5ν0Κ 100
ΕδΕΟΥΟΡΥδΥΟΚ 101
- 34 022424
ΟΟΟΑΑΟΡΥδνρΚ 102
νακ.\νγ<2ΡΥδν<3κ 103
νΗνγχνοργδνοκ 104
ΡΑΚΑΎρΡΥδνΟΚ 105
νΗνΥΑςργδνρτ 106
Κ$νΥλνρΡΥδν<3Κ. 107
ΤΚ.ν\νΡ<3ΡΥ5ν<3Κ 108
ΟΚΙΑΡΟΡΥδνΟΚ 109
ΟΚνΑΡΟΡΥδνΟΚ 110
ΑΚΤΑΥΟΡΥδνρΚ 111
ΑΚ.ν\ν\ν<3ΡΥ5νρΜ 112
ΚΕΜΡΥΟΡΥδνΟΚ 113
ΕδΜΑΥΟΡΥδνρΚ 114
ΗΡΟΑΧνρΡΥδνΗΜ 115
ΑΚΓΑΑΟΡΥδν<3Κ 116
κι,νγλνο ΡΥΑΡΙΥ I17
Κ±νΥ Α()Ρ ΥδΥζ)Τ 118
κτνγ АО ργδυρι 119
Κί,ν ΥА<Э Р Υδ ν<5Α 120
5Κ.νΑΥ<3 ΡΥΑΚΟΕ 121
δΚνΑΥΟ ΡΥΑΟΟί 122
5ΚνΑΥ<3 ΡΥΑΜΡυ 123
δΚ,νΑΥΟ ΡΥδνΟΑ 124
δΚ,νΑΥΟ ΡΥδίΟί 125
δΚνΑΥΟ ΡΥΑΚΕΕ 126
δΚνΑΥΟ ΡΥδΚΟΡ 127
5Κ.νΑΥ<2 ργρνςρ 128
ΕΥΕΑΥζ) РУАЬРЬ 129
ΙΡΕΥΑΟ РУАЕРБ 130
5ΚΙΑΑ<3 РУАБРЬ 131
ОРБРАО ΡΥΑίΡί 132
5Κ<}Αν<5 РУАБРБ 133
ΙΚ8 ΑΑζ> ΡΥΑίΡί 134
ΚΟΥ Αζ> Ρ УАБРБ 135
ΚΕΕΑνΟ РУАБРБ 136
ΕΥΚ.ΑΡ<3 РУАБРБ 137
□ΑΥΑνί) РУАБРБ 138
Α5ΟΥΡ0 ΡΥΑΕΡΕ 139
- 35 022424
ΝΙΕΡλνρ ΡΥΑΕΡΕ 140
ΤΚϋ\νν<3 ΡΥΑΕΡΕ 141
О55\¥У<5 РУАЕРЬ 142
ΙΟΝ\ΥΥ<5 РУАЕРЬ 143
Ν1.Κ\νΐΧ? Ρ УАЕРЬ 144
ЕРЕР\УО ΡΥΑίΡΕ 145
ϋ5Υ\ν\νρ ΡΥΑΕΡΕ 146
Κ5ΡΥΥ(3 ΡΥΑΕΡΕ 147
ΑΚΕΧνίΟ ΡΥΑΕΡΕ 148
ΝδΥΡν/Ο ΡΥΑΙΡΈ 149
ΚΡΜΥ\νρΡΥ5ν<2Κ 150
ΑΗΕΡ\ν0ΡΥ5νρΚ 151
\ν\νθΡΥΑΕΡΕ 152
ΥΥφΡΥΑΕΡΕ 153
ΥΡ<?ΡΥΑΕΟΕ 154
ΥΙΥΥΡΡΥΑΕΡΕ 155
ΚνηνρΡΥΑΤΡΕ 156
0ν/Υς>ΡΥΑΕ6Ρ 157
УХУУОРУАЬСЬ 158
Ι%ΓΥΟΡΥΑΜΡΕ 159
δΝΜ<5ΡΥ()ΚΕδ 160
ΤΓνΥ\ν<3ΡΥ АУСЕРААЕТАСЫ 161
τρνγ^ργδνοΜτιτοκντΜ 162
ΤΡνΥν/ΟΡΥ 88НХХУРХСРРЕ 163
τρνγχνρργ ΥσΝΡΟλΥΑΙΗνΚΗ 164
ΤΡνΥ\νθΡΥ УЕЕЕЕРЕОАУКА 165
τρνγ\νοργ νϋΥννζρΐΡίΑρν 166
Ον/γρργνΐχ3\νκ 167
κ\νΕ<}ργνιακ3\ν3 168
ΕλΥΥ<?ΡΥΑΕΟ\νΑΚ 169
Ο\ν\ν<2ΡΥΑΚΟΕ 170
ΕΡΕΟΡΥΑΚΑΕΟΕ 171
С\УЕрРУАКОЕАО 172
Α\νν(}ΡΥΑΤΡΕΟΕ 173
Μ\ΥΥΟΡΥ55<2ΡΑΕ 174
Ον/ΤΟΡΥδΟΟΟΕν 175
υν/ΡΟΡΥδίΟδοε 176
Ρν/1ΟΡΥΑΚΟΡΟ 177
- 36 022424
κρι,γχνρργδνρν 178
ΤΈ(Υ\νς)ΡΥ5νρΐ . 179
κτογχνοργδυοτ 180
ν/ΗΟΡνΟΡΥΑΕΡΕ 181
Ε\νθ5 VΥν/ΟΡΥδνΟ ΊΤΧΚ 182
ν/ΕΟΝ νΥ\νς>ΡΥ5ν(3 5ΡΑΟ 183
8ϋν νγν/<3ΡΥ5νς> $ьем 184
υυιχϊ νγχνοργδνρ умра 185
δϋΙΑΥΥΟ ΡΥΑΕΡΕ 186
<ЗК1\УЗУ<Э ΡΥΑΕΡΕ 187
5ЯЖЖ} ΡΥΑΕΡΕ 188
К5ЬУ\У0 ΡΥΑΕΡϋ 189
ТП\УЕ<3 ΡΥΑΕΡΕ 190
\УЕТ\УУ<2 ΡΥΑΕΡΕ 191
5УЕЖЕ0 ΡΥΑΕΡΕ 192
5КЛ У/СО ΡΥΑΙ.ΡΕ 193
Е1МРЖ? ΡΥΑΕΡΕ 194
ϋΥν\νθΟ ΡΥΑΕΡΕ 195
МОЬЬУр ν/ΥΟΡΥΑΕΡί 196
С5КУ1Е ν/Υ(}ΡΥΑΕΡΕ 197
ΚΟΟΑΝΙ ννΥΟΡΥΛυΈ 198
ОССОЕР ν/ΥΟΡΥΑΕΡΕ 199
5ΟΕΕΚΤ \νΥ<2ΡΥΑΕΡΕ 200
ЕТХУУКЕ \νΥ(}ΡΥΑΕΡΙ. 201
ΚΚΟ5Τ0 ЗУУОРУАЬРЬ 202
ΕΟΑΚΜΝ ΧνΥΟΡΥΑΏΡΕ 203
ΕΡΚ5<3Κ. \ν υορυαερε 204
νΚΟΚν/Ρ ШУОРУАЕРЬ 205
ΕΚΚΗΟν ν/ΥΟΡΥΑυΈ 206
Κ5ΤΑ51 ν/ΥΟΡΥΑΕΡί 207
Е5КЫМ? XV УрРУАЬРЕ 208
ΕΟΕΤΜΚ \νΥΟΡΥΑΕΡΕ 209
ЕС5КЕС \νΥΟΡΥΑΕΡΕ 210
У1ЕЗУ>УО ΡΥΑΕΡΕ 211
У\У Υν/Ер РУАЕРЬ 212
А5ЕУ/У/О ΡΥΑΕΡΕ 213
ΡΥΕ\νν/Ο ΡΥΑΕΡΕ 214
ЕОХУЗУ УО ΡΥΑΕΡΕ 215
- 37 022424
№СЕ\УЬ<3 РУАЬРЕ 216
ΟΥν\νΕΟ РУАЬРЬ 217
АНТ№№0 РУАЬРЬ 218
Р1Е№Р<3 РУАЕРЬ 219
№ЬА№ЕО Р УАЕРЬ 220
νΜΕ№\νς) РУАЬРЬ 221
ЕРМ№<) РУАЬРЬ 222
ΝΧΧ№ΧΧ РУАЬРЬ 223
№ΟΝ\νΥΟ РУАЬРЬ 224
ТЬУ№Е<Э РУАЬРЬ 225
у\уК№Е<3 РУАЬРЬ 226
ЕЬ№ТО РУАЬРЬ 227
8КЛ№ХХ РУАЬРЬ 228
5ΟΙ№Υ<2 РУАЬРЬ 229
№ОУУХХ РУАЬРЬ 230
Т5О\УУ() РУАЬРЬ 231
УНРУХХ РУАЬРЬ 232
ΕΗδΥΡΡ РУАЬРЬ 233
χχίχνγρ РУАЬРЬ 234
Α0ΕΗ50 РУАЬРЬ 235
№ΑΝ№Ρ<) РУАЬРЬ 236
δΚΕΥδί} РУАЬРЬ 237
σνΤΡδΟ РУАЬРЬ 238
δΐν№80 РУАЬРЬ 239
вКЮЬУ<3 РУАЬРЬ 240
н№он νγ\ν<3ΡΥδνρ поьс 241
8№Η5 УУ\У<ЗРУ8Ур 5УРЕ 242
\νΚΌδ νΥ\ν<3ΡΥδν<3 ΡΕδΑ 243
Τ№ΌΑ УУ№()РУ5У<3 К\УЬЭ 244
ΤΡΡ№ νΥ\νρΡΥδνθ 5ЬОР 245
Υλνδδ νγ\νοργδνο δνΗδ 246
Υ№Υ ОРУ АЬСЬ 247
Υ№Υ ()ΡΥ АЬРЬ 248
Ε\νΐ ζ>ΡΥ АТСЕ 249
Ν№Ε ΟΡΥ АКРЬ 250
ΑΡΥ <?ΡΥ АЬРЬ 251
ГЬУ <}ΡΥ АЬРЬ 252
УСК ОРУ ЬЕ№С 253
- 38 022424
ΕΤΡΡΤλνΕΕδΝΑΥΥ^ρΡΥΑΕΡΕ
0ά\νΕΤΥνΰϋ5νθΜΥ\ν<)ΡΥΑΕΡΕ
Ρ3ΕΑΟΥΤ\νΡΕΝΤΥν/ζ)ΡΥΑΕΡΕ ΤΕ5ΡΟ6ΐη\νΑΚΙΥ\ν0ΡΥΑΕΡΙ. ϋΟΥΟΚ\νΚ05ΟΕΕΥν<}ΡΥΑΕΡΙ. ΤΑΝνδδΡΕ\νΤΡΟΥ\νθΡΥΑΕΡΕ δ ν0ΕϋΗΝΡ\νΤ5Ε ΥλνρΡ ΥΑΕΡί ΜΝΓ>ΟΤ8Εν8ΤΡΡ УАУрРУАЁРЁ
ЗАУЗЕАРЕОРНКЬУЖЗРУАЬРЬ <)ΥΑΕΡδΑΕΝΟ\νΌ У^ОРУАЬРЬ Νΰϋ\νΑΤΑΕΛνδΝΥ Υν/ΟΡΥΑΕΡί ΤΗϋΕΗΙ Υ^ΟΡΥΑΕΡΕ ΜΕΕΚΤΥΤΤ1ΛΓΓΡΟ ΥΥ/<3ΡΥΑΕΡΕ ШЗОРЕТКОАОЬ Υ\νθΡΥ АБРЕ δΟΑΡΤΤ<5Ο8<3ΑΜ ΥλΥ(?ΡΥΑΕΡΕ <ГООАА\УКТО5ЬТ У^рРУАЬРЕ ΑΙΙΚΟΕΥΚ\νδΕΜ УАУОРУАЬРЬ ΕΝΤΥδΡΝλνΑΟδΜ Υν/ΟΡΥΑΙΤΕ ΜΝΙΧ}ΤδΕνδΤΕΡ ΥννρΡΥΑΙΙΈ δνθΕΕ>ΗΝΡλνΤδΕ Υ\ν(}ΡΥΑΕΡΕ ρΤΡΡΤ\νΕΕδΝΑΥ ΥλΥςΡΥΑΕΡΕ .....ΕΝΡΕΤ\ν(}ΕδΝΑΥ УЖ?РУАЬРЬ νΤΡΡΤΑΥΕΟδΝνΡ УЖ^РУАЕРЬ ρίΡΡΊΠΥΕΟδΝΑΥ ΥΥνΟΡΥΑίΡΕ ()ΑΡΕΤ\ν<2Ε3ΑΑΥ УЗУОРУАБРЕ ΕΡΤΡΤ\νΕΕ8ΚΑΤ Υ\ν<3ΡΥΑΕΡΕ ΓΓΓΕΤΆΈΕδΝΑΥ Υ\νζ)ΡΥΑΕΡΕ ΕδΡΕΤλΥΕΕδδΑΕ Υλ¥<3ΡΥΑΕΡΕ .....ΕΤΡΕΤλνΕΕδΝΑΥ ΥΧΥρΡΥΑΙΙΈ
ΕΛΤΡΤλΥΑΕδΝΑΥ Υλ¥<3ΡΥΑΕΡΕ ΕΑΕΡΤλΥΚΕδΤΑΥ ΥΑΥΟΡΥΑΕΡΕ...........
δΤΡ-ΤλΥΕΕδΝΑΥ Υν/ρΡΥΑίΡΕ ΕΤΡΡΤΠνΕΕδΝΑΥ Υ\ν<2ΡΥΑΕΡΕ ΚΑΡΡΤλνΕΕδΟΑΥ ΥλΥρΡΥΑίΡΕ δΤδΡΤλΥΕΕδΝΑΥ УХМОРУАЕРЬ ΟδΤΡΤλΥΕΕδΝΑΥ ΥΧΥΟΡΥΑΕΡΕ ΥΙΡΡΤλΥΕΕδΝΑΥ Υ1Υ0ΡΥΑΕΡΕ <5ΤΑΡΤ\νΕΕ5ΝΑΥ Υν/ζ^ΡΥΑΕΡΕ
254
255
256
257
259
260 ~2бГ
262
263
264 265
266
267 ~26Ζ
269
270 ~τη
272
273“
274
275
276
277
278
280
281
282
283
284~
286
287
288
290
291
- 39 022424
ΕΤΕΡΤν/ΕΕδΝΑΤ ΥΥ/рР УАЬРЕ 292
ΥδδΡΤλνΕΕδΝΑΥ У^РУАЬРЬ 293
рРУАЕРЬ 294
Ρχ-1-ΝβρΡΥ<μΥΑΕΡΕ 295
ΤΑΝνδδΡΕν/ТРС У^/рРУАЬРЬ 296
ΡΕλΥΤΡΟΥΑΥΡΡΥΑΕΡΕ 297
РЕХУТРСУУУСУУАЕРЕ 298
ΡΕ^ΤΡΟΥΥρίΥΑυΈ 299
ΕΤΡΡΤλνΕΕ5ΝΑΥΥ\νς>ΡΥΑΕΡΕ 300
Ρ’ΠνΕΕδΝΑΥΥΑΥΟίΥΑΕΡΕ 301
ΑϋνΕ Υ\ν()ΡΥΑ ΡνΤίλΥν 302
СОУАЕ ΥΧνΟΡΥΑ БРЬТБЕ 303
δ\ΥΤΟΥΟ ΥΙΥΡΡΥΑ ΕΡΙδΟί 304
ΡΈ\νΤΡΟΥ\ν(}ΡΥΑΕΡΕ 305
ΡΕ\νΤΡ6Υ\ν()1ΥΑΕΡΕ 306
ΡΕ’ΛΓΓΡΟΑΥΥΡΡΥΑΕΡΕ 307
РЕХУТРСАУУОГУАЕРЬ 308
ΡΕ\νΤΡΟΥΥ<)ΡΥΑΕΡΕ 309
ΡΕλνΤΡΟΥΥρΤΥΑΙΙΈ 310
ΤΑΝνδδΡΕΧνΤΡΟΥνΟΡΥΑΕΡΕ 311
δ^νΤΟΥΟΥλνΟΡΥΑΕΡΙδΟΕ 312
ΕΤΡΡΤλνΕΕδΝΑΥΥλν<5ΡΥΑΕΡΕ 313
ΕΝΤΥδΡΝν/ΑϋδΜΥΛνΟΡΥΑΕΡΕ 314
5νθΕΟΗΝΡ\νΤδΕΥ\ν<2ΡΥΑΕΡΕ 315
ΠΟΥΟΚ,νκρδΟΕΚΥννρΡΥΑΕΡΕ 316
ΡΕ\νΤΡΟΥΑνρΡΥΑΕΡΕ 317
ΡΕ\νΤΡΟΥ\ν<3ΡΥ 318
ΡΕλνΤΡΟΥΧνΟίΥ 319
Ε\νΤΡΟΥ\ν()ΡΥ 320
ГЕШТРС\УУ<ЦУ 321
Α£ν/ΤΡΟΥ\ν<2ΙΥ 322
ΕΑ\νΤΡΟΥ\νζμΥ 323
ΡΕΑΤΡΟΥλνΟίΥ 324
ΡΕλνΑΡΟΥλΥΟίΥ 325
РЕХУТАОУУ/СЦУ 326
ΡΕ\νΤΡΑΥν/01Υ 327
ΕΕ\νΤΡΌΑ\ν<ΝΥ 328
ΡΕνΛΓΡΟΥΑΟΙΥ 329
- 40 022424
ΡΕ\νΤΡΟΥ\νθΣΑ 330
ΡΕλντοογχνοίγ 331
ΡΕ\νΤΡΟΥ\ν()1Υ 332
ΡΕ\νπαγν/ςΗΥ 333
ΡΕ\νΤΡεοΟΥ\νςΗΥ 334
ΕΕ\νΤΡΑίάΥ\ν(ΗΥ 335
ΡΕν/ΤΡ5»τ5νΥ<}ίΥ 336
ΕΕ\νΤδ3ΓθΥ\ν<ΗΥ 337
ΡΕ\ν'ΓΡΝΎ\ν<3ΣΥ 338
ΡΕ\νΤΡνΥλν<)ΣΥ 339
ΡΕ\ντνργΛνοΐγ 340
ΑοΡΕ\νΤΡΟ\νΥ(}1Υ 341
ΑεΡΕλνΤΡΟΥν/ςίΥ 342
ΙΝβρ-ΕΜΓΓΡΟΥΥρίΥ 343
ΥΕ\νΤΡΟΥΥΟΣΥ 344
ΡΕ\ννΡΟΥΥΟΣΥ 345
ΡΕλνΤΡΟΥΥΟΣΥ 346
ΡΕλΥΤΡδΥΥρΣΥ 347
ΡΕ\νΤΡηΥΥΟΣΥ 348
δΗΙ-Υ-Νίρ-ΟΡΥδνΟΜ 349
ΤρνΥ-ΝβρΟΡΥδΙΧ^Τ 350
ΚΟΟΥ-Νβρ-ΟΡΥδνΟδ 351
ΝΜνΥ-Νβρ-ΟΡΥδΚ/Γ 352
νΥ1Υ<?ΡΥδν<3 353
νΥ-Ν3ρ-ΟΡΥ5νθ 354
трууауолуаьрь 355
ΡΕλνΤΡΟΥΥΟΣ-Вра 356
ХааРЕ\УТРСУ¥(?1-Вра 357
ΡΕ\νΤΡΟΥ-Βρβ-<ΗΥ 358
АсР£\УТРСУ-Вра-СНУ 359
ΡΕ\νΤΡ0-Βρ3-Υ<μΥ 360
АсРЕУПТО-Вра-ΥΟΙΥ 361
АсРЕ-Вра-ΤΡΟΥΥρΐΥ 362
АсРЕ-Вра-ΤΡΟΥΥΟΙΥ 363
Вра-Εν/ΤΡΟΥΥΟΙΥ 364
АсВра-Εν/ΤΡΟΥΥΟΣΥ 365
νγλνοργδνο 366
8Ι.νΥλν(3ΡΥδν<}Κ 367
- 41 022424
ίανγ-Νβρ-ρργδνρκ 368
ΚΕθΥ\νρργδν<3Κ 369
κυν\νρρργ5νς>κ 370
ιυυνγνοργδίοη 371
ΟΝδδλνΥΡδΡΕΙ. 372
ϋΝΤΑλΥΥΕδΡΈΑ 373
ϋΝΤΑνηΈΝΡΙΑ 374
РАКЕ ΟΝΤΑΙΥΥΟδΡΙΛ ХМС 375
ΤδΕΥ ΟΝΤΠνΥΕΚΡΕΑ 8<5 376
δΟΙΡ ΟΝΤΑν/ΥρδΗΧ НС 377
5ΡΡΙ ϋΝΤΑννΥΕΝΡίΕ ΤΥ 378
Εζ>1Υ ΩΝΤΑν/ΥΟΗΡΕΕ δΥ 379
ΤΡΡ1 ΟΝΤΑν/ΥΕΝΤΕί ΤΥ 380
ΤΥΤΥ ϋΝΤΑ\νΥΕΚΡΕΜ 5Υ 381
ΤΜΤς ΩΝΤΑλνΥΕΝΡίΕ 5Υ 382
ΤΙ ϋΝΤΑλΥΥΑΝΕνΟ ΊΎΡζ) 383
ΤΙ ϋΝΤ ΑΎΥΕΚΡΕΑ рУГО 384
ΗΙ ϋΝΤΑΥ/ΥΕΝΤΕΕ ΤΥΤΡ 385
δζ> ϋΝΤΑλνΥΕΝΡΕΕ 5ΥΚ.Α 386
ΟΙ ϋΝΤΑλνΥΕΚΡΕΕ (}ΥΝΑ 387
N9 ϋΝΤΑ\νΥΕ5ΡΕΕ <}ΥΝΤ 388
ΤΙ ϋΝΤΑν/ΥΕΝΡίΕΝΗΝΕ 389
ΗΥ ΟΝΤΑϊνΥΕΚΓΕ<? <ЗС\УН 390
ΕΤΡΡΤ\νΕΕ5ΝΑΥΥν/<3ΡΥΑΕΡΕ 391
ΥΙΡΡΤν/ΕΕδΝΑΥΥν/ρΡΥΑΕΡΕ 392
Е>ОУПК.\УКР5СЕКУ\УОРУАЕРЕ 393
ρΥ-ΙΝβρ-ρΥ-<31ΥΑΙ_ΡΙ. 394
ΤΑΝνδδΡΕν/ΤΡΟΥλνρΡΥΑΕΡΕ 395
ΡΕν/ΤΡΟΥ\ν(ΉΥΑΕΡΕ 396
ΡΕννΤΡΟΥ^ΟΡΥΑΕΡΕδΟ 397
ΡΕ5ΥΤΡΟΥΥ(21ΥΑΕΡΕ 398
ΡΕ\νΤΡΟΥ\ν<ΉΥ 399
ΑοΡΕ\νΤΡ6Υ\ν(ΉΥ 400
АсРЕ\УТРС\УУО1У 401
ΑεΕΕ\νΤΡΟΥΥ<ΉΥ 402
ΑοΡΕ^ΥΤΡβΥΧνΟίΥ 403
ΑεΕΕ\νΤΡ3\νΥ<51Υ 404
ΑοΡΕννΤΡβΥΥΟΙΥ 405
ΡΕΥνΤΡΟΥΥΟΙΥΑΕΡί 406
ΡΕΑΥΤΡΟΥΜΡΥΑΕΡΕ 407
ΡΕ\νΤΡΟ\νΥ0ΙΥΑΕΡΕ 408
ΤΑΝν55ΡΕ\νΤΡΟΥ\ν<)ΡΥΑΕΡΕ 409
ΑοΡΕλντΡΟΥΑνζ>ΙΥ 410
АсРЕ\УТРО\УУ<М 411
ΑςΡΕ\ΥΤΡΟΥΥ<ΉΥ 412
ΑοΡΕ\νΤΡΑΥ\ν()ίΥ 413
ΑοΡΕ\νΤΡΑ\νΥ(ΉΥ 414
ΑοΡΕ\νΤΡΑΥΥ<ΉΥ 415
- 42 022424
Т аблица 5. Последовательности ЕРО-миметических пептидов
УХСХХОРХТАХСХР 416
УХСХХСРХТАХСХР-УХСХХОРХТАХСХР 417
УХСХХСРХТАХСХР-Л-УХСХХОРХТАХСХР 418
УХСХХСРХТАХСХР-Л- , . ν 419
Ч (ε-апипе)
/к
/βΑ
УХСХХСРХТУУХСХР-Л- (α-атте)
ССТУ5СНРОРЬТАУУСКРОСС 420
ссоунскморипуускрьоо 421
СОУУАСВМОР1ТАУС5РЬОО 422
νΟΝΥΜΟΗΡΟΡΙΤΑνΟΚΡΟΟα 423
СС1ЛЪСКРСРУТ\¥Е>ССУКСС 424
ОСТУЗСНРСРЬТАУСКРРОО- 425
СОТУ5СНРСРЬТАУСКР<ЗСС.
ООТУЗСНРСРЬТАУСКРрСО -л- 426
ССТУЗСНРОРЬТАУСКРРОС
ССТУЗСНРСРЬТАУСКРООСЗЗК 427
ССТУ5СНРСР1Л7¥УСКР()СО55К- 428
ОСТУЗСР1РОРЬТАУСКР<)СС5$К
ССТУ5СНРОРЬТАУСКР<ЗОО55К-Л- 429
СОТУ5СНРОРЬТ\УУСКР<}ОО55К
- 43 022424
СеТУЗСНРСР1ТУ/УСКРСКЗв58ч , . 4 \ (Е-атше) ζκ χβΑ 00ΤΥ50ΗΗ3ΡΙ_τννν0ΚΡα0053 (а-апипе) 430
СОТУ5СНРСРЬТ№УСКР0О055К(Л -Είοΐίη) 431
сх4х5арх6т№х7с 432
ООТУЗСНОРЬТЗУУСКРОСО 433
νΟΝΥΜΑΗΜΟΡΙΤν/νΟΚΡΟΟ 434
ООРННУУАСКМОРЕТ№1С 435
σοτΥδϋΗΡΟΡίΤψνϋΚΡρ 436
ООЕУАСНМОРМТ№УСОР1-КО 437
Т1АОУ1СУМСРЕТ№ЕСКР8РКА 438
УЗСНРСРЕПУУСК 439
УСНРСРЦТЗУУС 440
Х3Х,Х5СРХ6Т№Х7Х, 441
УХ2Х3Х4Х5СРХ6Т№Х7Х, 442
X, ΥΧ2Χ3Χ4Χ5ΟΡΧ6Τ№Χ7ΧίΧ9Χ1(>Χ1, 443
X, ¥Х2СХ<ХзСРХбТ№Х7СХ9Х,0Х,, 444
ООЬУЬСКРОРУТЗУОСОУКСС 445
сстузснрсрипуускросс 446
ОООУНСКМОРЬТУУУСКРЬСО 447
νΟΝΥΜΟΗΡΟΡΙΤΧννϋΚΡΟΟΟ 448
ОСУУАСКМОР1Т№УС8РЬОС 449
νΟΝΥΜΑΗΜΟΡΙΤνζνΟΚΡΟΟ 450
ОСТУЗСНРСРЫПУУСКРО 451
ООЬУАСНМОРМТХУУСОРЬКО 452
Т1А(}У1СУМОРЕТи/ЕСКР5РКА 453
УБСНРОРЬТУ/УСК 454
УСНРОРЬТХУУС 455
5СНРОРЬТ\УУСК 456
(АХДнХрСЛОРХбТ'Л/ХАа 457
ХпСХ1Х7О№УОХ3СХ4Х3№Хс 458
- 44 022424
Таблица 6. Последовательности ТРО-миметических пептидов
Последовательность/структура 8Е0 ГО ΝΟ:
1ЕОРТиЮ\УЬААКА 459 |
ШОРТЬКО^ЬААКА 460
1ЕСРТЦКЕ\УЕААКА 461
1ЕОРТЕЯО\УЬААКА-Л-1ЕСРТЬКр\УЕААКА 462
ΙΕΟΡΤΕΚΟ\νΐ_ΑΑΚΑ-Λ-ΙΕΟΡΤΕΚΟλνΐ_ΑΑΚ.Α 463
1ЕСРТЦКОСЕААКА-Л-1ЕОРТЕКОСЕААКА ! 1 464
1БСРТ1Лр5УЕААКА-Л-К(ВгАс)-Л4ЕСРТЕК<3>УЕААКА 465
ΙΕΟΡΤΕΡθν/ΕΑΑΠΛΛ-Κ(ΡΕΟ)-Λ-ΙΕΟΡΤΕΚ9\νΕΑΑΚΑ 466
1ЕОРТЕкОСЕААКА-Л-1ЕаРТЕЯО\УЕААКА I 467
1 ΙΕΟΡΤΕΚί^ΕΑΑ&Α-Λ-ΙΕΟΡΤΕΚρΑνΕΑΑΧΑ
ШСРТЕкрАУЕААКА-АЛЕСРТШОСЕААкА | 468
1 1ЕСРТЕК9\УЕААЯА-Л-1ЕСРТЕК0СЕААКА
νΚ!Χ?ΙΧΧΧΕ 469
ΤΕΚΕν/Б 470
ΟΚνΚΙΧ}νΑθν/ 471
ΟΚνΚΟρίΑΟΕ 472
θνΚΟθν5λ¥ΑΕ 473
ΕδνΚΕΟνΜΚΥ 474
5νΚδΟΙ5Α8Ε 475
ΟνΚΕΤνΥΚΗΜ 476
ОУКЕУ1УМНМЕ 477
СКУКЕКЗПУААЕ 478
ΑΟνΚΟΟΙΕΙΑΥΕ 479
ΟΚνΚΓΧ}ΙΜΕ5Ε 480
окукххзкхье 481
СТБК<3\УЕОСС 482
СТЕРЕРБЕСС „ 483
СТКТЕ\УЕНСС 484
СТБКЕУ/ЕНООРС 485
СТЕКЕ^УРАСБС 486
стыиэлуышомс 487
СТБАЕРБАЗСУЕОС 488
С5Е<5ЕРЕ8НООУУС 489
СТБКЕРЕОРТТАУС 490
СТЕКЕУ/ЕУЗНЕУ^С 491
СТЕКЕ5УЕ(Х)2.6С 492
- 45 022424
К.ЕОРТБКОМ/М 493
ЕСРТШОХУБА 494
ЕКСРРХУАКАС 495
КЕОРРСУМАУМ 496
СОТЕОРТБЗТУ/БОС 497
СЕОООРТШЕУ/БКС 498
СЕЬУСРЗШЗ^ЬТС 499
СЬТСРРУТО^БУЕС 500
СРАОРТЕЕЕ\У1/П.С 501
САЕХЗРТЕКЕ\У18РС 502
С(Х)мЕОРТ1.К£\УЕ(Х),.2С 503
СеСТ1ЛЕ\У1йНССРССС 504
ООСАООРТЬКЕ\У15РСОО 505
ΟΝΑΙΧίΡΤΕΡρν/Ι.ΕΟΗΚΡΚΝ 506
ΕΑΙΕΟΡΤΕΚΟΧνΕΗΟΝΟΚϋΤ 507
ΗΟΚνΟΡΤΙΛίΕλνΚΤΟνΑΤΚΚ 508
Т1КСРТи«ЖЬК8КЕНТ5 509
15ЕЮРТиСЕ^Ь8\ГГЯСА5 510
51Е<ЗРТиРЕ1¥ЬТ5аТРН8 511
Таблица 7. Последовательности О-С8Р-миметических пептидов
Последовательность/структура 8Ε<} ГО ΝΟ:
ЕЕЕХЖ 512
ЕЕ1ЭСК 513
1 ЕЕОСК
ΕΕΟσΚ 514
ΕΕϋσΚ 515
1 ΕΕϋσΚ.
ρΟΙοΕΟσΚ 516
ρΟΙυΕΟσΚ I 517
1 ρΟΙιιΕΟσΚ
ΡΐοδϋαΚ 518
ΡΐοδϋσΚ 1 519
Ρ«8ϋσΚ
ЕЕЕКЖ-Л-ЕЕПСК 520
ΕΕϋΧΚ-Λ-ΕΕϋΧΚ 521
- 46 022424
Таблица 8. Последовательности ΤΝΡ-миметических пептидов
Последовательность/структура 8Εζ> Π) ΝΟ:
ΥΟΡΤΑδΕΝΗΟΥ ; 522
ΥΟΓΓΝδΕΝΗΟΥ 523
ΥΟΡΤΚδΕΝΗΟΥ 524
ΡΟΑδΕΝΗϋΥ 525
ΥϋΑδΕΝΗΟΥ 526
ΡΟΝδΕΝΗΟΥ 527
ΡΟΝδΕΝΚΟΥ 528
ΡΟΝδνΕΝΚΟΥ 529
γεδΟδνδΝοορ 530
ΡΟνδΝΏΚΟΥ 531
γοκκΕίοονεγ 532
ΥΟΚΕΡΟΟΟΥ 533
УСККЕМССУ 534
РСЯКЕМОСУ 535
ΥΟΑδΟΝΙΧΎ 536
ΥΟΕΏδΟΥΙΧΥ 537
ΥΟΑ5<3ΝΥΟΥ 538
ΥΟΑδΟΥίΟΥ 539
ΟΡΕΡΗΥΚΝΤδΙΧίΗΚΡ 540
ΑΑ,-ΑΒ, ΝΚ
\ АС Ζ
ΑΑ2-ΑΒ2
Таблица 9. Интегрин-связывающие пептидные последовательности
Последовательность/структура 8Ε<2 Ш ΝΟ:
κχ,ετχ2αχ3 541
кх,етх2ах3 542
- 47 022424
асосх 543
СЯСЕЮХС 544
СХ.ХгЯЬОХ^С 545
САНЯЬОАРС 546
СР8НШ8РС 547
χ,χ^κουχ^ΧίΧί 548
сх2сасосх5с 549
сосасосгс 550
сосвоекхс 551
СЕСКООС1С 552
Χ,ΧϊϋΟΧίΧ,ΧίΧβ 553
Χ,ΧίΧ,ϋΟΧ,ΧΡΟΧϊΧ» 554
СЖИХЖЬС 555
САООЬААЕС 556
САОГХЗЬМС 557
САЭЭСАМС 558
СЗАООСАЬС 559
СРООЬААЬС 560
ΝΟΚ ΝΒ
081. ыа
КСО ΝΚ
ССКЕСРКЬС058С 561
СИОКСУЗОСАСКС 562
СЬ5С8Ь8С 563
асо ΝΚ
ΝΟΗ ΝΚ
О5Ь ΝΚ.
Ν0ΗΑΗΑ 564
СЫСКС 565
сосасосгс 566
ссзьуас 567
оьххь 568
атоьозьятуп. 569
ятоиэзьяту 570
ятотзьят 571
атоихзья 572
оокои-кииль 573
ооЕнзьао1Хза 574
агэоьнмьвиэьА 575
БЗОЪНАЬККЯУС 576
В0ШЖрЬ5Е1.Т\У 577
ЯСОЬААЬЗАРРУ 578
- 48 022424
Таблица 10. Пептидные последовательности антагонистов селектина
Последовательность/структура 8Ε<2 Ιϋ ΝΟ:
ШТЗУООПМОШК 579
Ο1Τ\νθΕΙΛνΚΙΜΝ 580
ογτλνΡΕίΛνοΜΜς 581
ΟΙΤΥ/ΑΟΙΛνΝΜΜΚ 582
ОМТХУНОВУТЬМЗ 583
ϋΥ5\νΗΟΙΛ¥ΕΜΜ5 584
ΕΙΤνίχ^ΕνΜΝ 585
НУЗ\УЕ<НДУО1МЫ 586
Ηΐτχνιχ^ίΛνκίΜΤ 587
{ШМ5\УБЕ1?УЕНМК 588
ΑΕ\ντν/Ε>9Ε\νΗνΜΝΡΑΕ59 589
НКАЕ^ЬАЬАУЕРМЗР 590
ККЕО^БАЬЗУШМЗУ 591
тУООБШМ-МК. 592
О1Т\У1Х5ЬАУ1>ЕМК 593
ЭПЛУОрПУОШК 594
О1Т\У1Х)ЬАУОШК 595
ΟΟΝΚΥΤΟΕνΑΙΟΝΚΝΕ 596
ΑΕΝν/ΑΟΝΕΡΝΝΚΚΝΝΕΟ 597
ΚΚΝ^Τ\νΤ5ννθΤΚΚΑΤΠ4Ε 598
ΚΚΑΕΤΝΕΑΕΝλνΑΏ 599
С0ХЯУТОЬУА10МКХЕ 600
ΚΚΧΝΧΧΨΤλννΟΤΧΙϋα,ΤΕΕ 601
Α£Ν\νΑΐΧ3ΕΡΝΝΚΧΝΧΕΟ 602
СхххгГХЬУАКЗЫКХЕ 603
ΚΚΧΧΧΧ\νΧ\νναΤΧΚΧΕΤΧΕ 604
ΑΧΝλνΧΧΧΕΡΝΝΧΧΧΕΏ 605
ΧΚΧΚΤΧΕΑΧΝ\νΧΧ 606
- 49 022424
Таблица 11. Антипатогенные пептидные последовательности
- 50 022424
КРРН1ЕНЕ 643
КШК.1К.1КПК 644
ΚΙΙ1ΚΙΚ1ΚΙ1Κ. 645
Κ1ΠΚΙΚΙΚΙΙΚ 646
ΚΙΡΙΚΙΚΙΚΙΡΚ. 647
КШЮКШУК 648
К.ШК1МКИЯ 649
ЮИК1Я1К11К 650
ΜΙΙΚΙΚΙΚΙΙΚ 651
мушммлк 652
киуикькнк 653
ккнкекукнк 654
шуишикик 655
Κ.ΙΑνΚ\νΚί.Κ.ΠΚ 656
КЮМКХКУКЖ 657
ккюжлкукк 658
κινικικικυκικ 659
ΜίνΜκυυικνκ 660
шсиикукикку 661
ΚίνίΚΙΚΑΚΕΙΚΙΚΙΚ 662
ίυινκικυυϊκκικΕ 663
ΚΙΟΙΚΑΚνΜΙΚνΚΠ 664
КИУШКЕКЛНШКЬ 665
нюисанукпкунп 666
шуукшькупскпи. 667
КЮНКАКУННКУКН 668
ΚΙΥνΚΡΗΡΚΥΙΚΚΙΚΕ 669
ΚΡΟΗΚΑΚΡΗΙ1ΚΥΚΙΙ 670
κινικικικΕίκικικκιν 671
ΜίνΚΙΚΕΚΙΙΚΚΙΚΕΙΚΚ 672
КЮАУКЕКУКПКУКЮКЕК 673
κινικικικυκικικκινκνκκικ 674
ΚΡΑνΚΙΚΕΚΙΙΚΚΙΚΕΙΚΚΙΚΚΚνίΚ 675
КАС\УКЕКУКПКУКЮКЕКК1С1УКККУК1К 676
ΜΥνΚΡΗΡΚΥΙΚΚΙΜΙ 677
ΚΡΟΗΚΑΚΡΗΙΙΚΥΚΗ 678
ΚΤνίΚίΜΚΕΙΚΙΜΚΚίν 679
κιινκϊΚΕΚιικκικηκκ 680
ΚΙΥνδΚΙδΙΥΙΚΚΙΚΙ,
ΚίνίΓΓΜΚΕΤδΙΚΙΚδίν
ΚΡΙΗΚΑΚΡΤΙ1ΚΥΚΜΙ сус11<ЮКСРРАиРК1185РЁРКТ1Х5АУС сккоррАЫРклВзритспхзАУС “ “
СусНсСШУШКЛИЛЮКС
СусНсСКРОНКАКРНИКУКПС
Сус11сСКРАУК1КЕК11КК1КЕ1КК1КККУ1КС кихкихкижс кихкихюхк.
кылжьшсшс
681
682 _
684 _
686
687
688 _
690
69?
692~
69?
- 51 022424
Таблица 12. Последовательности УГР-миметических пептидов
Последовательность/структура 8Εζ> Ш ΝΟ:
ΗδϋΛνΡΥΟΝΥΤΚ ЬККОМАУККУЕИ 51124 694
141е ΗδΟΑνηΌΝΥΤΚ иШ}МАУККУЦ4 51124 695
х, χ,-χ,-χ, 696
ХЭ5Х«124 697
ΝΗ СН СО ΚΚΥΧ5 ΝΗ СН СО Х6 1 1 <СН2)т Ζ 1СН2)п 698
ΚΚΥΙ. 699
N51124 700
ΚΚΥί 701
ΚΚΥΑ 702
ΑνΚΚΥΕ 703
N51124 704
κκγν 705
51ϋ»ΒΝ 706
ΚΚΥΕΝΙβ 707
Ν5Υ124 708
Ν5ΙΥΝ 709
ΚΚΥ12*ΡΝ5Ι124 710
ишккуь 711
СарККУЬ 712
- 52 022424
КУЬ 713
ΚΚΥΝΙβ 714
νΚΚΥΕ 715
ΕΝ8ΙΕΝ 716
ΥΕΝ3ΙΕΝ 717
ΚΚΥΕΝ 718
ΚΚΥΕΝδ 719
ΚΚΥΕΝ81 720
ΚΚΥΕΝ81Ε 721
ΚΚΥί. 722
ΚΚΥΟΑ 723
АУККУЬ 724
Ν81ΕΝ 725
ΚΚΥν 726
5ΙΕβυΝ 727
ΝδΥίΝ 728
ΝδΙΥΝ 729
ΚΚΥΕΝΚ 730
ΚΚΥΕΡΡΝ3ΙΕΝ 731
ΚΚΥΕ 732
ΚΚΥϋΑ 733
АУККУЬ 734
Ν51ΕΝ 735
κκγν 736
δίίβιιΝ 737
ЬаиККУЕ 738
СарККУЬ 739
КУБ 740
ΚΥΕ 741
ΚΚΥΝΙε 742
νκκΥΣ 743
ίΝδΙΕΝ 744
ΥΕΝδΙίΝ 745
ΚΚΥΣΝΙε 746
ΚΚΥΕΝ 747
ΚΚΥΕΝδ 748
ΚΚΥίΝδΙ 749
ΚΚ.ΥΕΝ5ΙΕ 750
- 53 022424
КККУЬО 751
сусИсСККУЬС 752
СККУЬК I 1 753
1 1 5-СН2~СО
ΚΚΥΑ 754
ν/\νΤΡΤΟΕλν 755
ιννιτοοοην 756
\ν\νϋΤΚΟΕ\ννλνΤ1 757
ΡνΟΝϋΟΙΨΙΈδΟ 758
ОАЛГОрРСЕ^КСАА 759
лзуЬЬъю ыууууь 760
5СМ\У5НУСЖМС 761
ΟΟΚννϋΟ АСЬУ/УА 762
ΚΧΛνδΕΟΟηνΜΟΕ 763
СЗУ5МН Οίν/ЬС 764
οανοΝτοιννρο 765
ϋν/ϋΤΚΟΕν/νΥ 766
δΙ^νΟΕΝΟΑλνΐ 767
ΚννΟΟΚΟΕν/ΜΗ 768
ΟΑ\νΝΕΚΟΕ\νΤ 769
ОХУОТКСЬХУУА 770
ν/ΝνΗΟίν/ΟΕ 771
8\νθΊΓΚθΕνΑΈ 772
ϋ\νϋΤΚΟΕ\ννΑ 773
δν/ακοοί-ν/ΐΕ 774
ΕλνΤΟΝΟίν/ΑΕ 775
5ЖЕКС1ДУ5А 776
5ИГО55СЕЛУМО 777
Таблица 13. Последовательности Мбт/Ьбт-антагонистических пептидов
- 54 022424
Таблица 14. Последовательности пептидных антагонистов кальмодулина
Последовательность/структура 8Ε<2 Π) ΝΟ:
5СУК^СККЕРСО5 795
$ОУКУАУСКЕСС5 796
8СУЕ\УаК.1ГО\УСС8 797
δσυκ,χνοκν/δΝΟΟδ 798
δονκνοκγριααδ 799
5СУ51¥ОАЬ1СШ35 800
5С1КЧ/СОКТРСС5 801
5ϋν/ρ\νθΝΕΚ1005 802
δονκν/οοοκοδ 803
εκκενακκκεκοαιεγγμεακ 804
ΚΚνν'ΚΚΝΡΙΑνΧΑΑΡΠΗΡΚΧ 805
ККШ0КТСНАУКА1СКЕ88 806 >
ΙΝΕΚΑΕΑΑΕΛΚΚ1Ε 807
К1\У51ЕАРЕСТТЕУКЕУА 808
искьисЕьккЕькь 809
ЕК\УККЕЕКЕЕККЕЕККЕЕ 810
ΑΕ^ΡδΙ/ΤΕΙΚΤΕδΗΡδν 811
ΑΕ^ΡδΡΤΚντδΤΤΥΕΟδ 812
АЕЕАН\УРРУКТУЕКБГГ 813
ΑΕΟ5\νΡρΡυΝΙ.ΜΚ<}ΜΝΝ 814
Α£\νΡ5ΕΤΕ1Κ 815
Таблица 15. Пептидные последовательности антагонистов тучных клеток/ингибиторов протеаз тучных клеток
Последовательность/структура 8Ε0 Π) ΝΟ:
Бозоуискрьргорута 816
К\УЕ85КРЕРРЕРЕРРКТ 817
ΟδΟδΥΠΤΕΑΕΡδΕΡΙΠΡΜδδ 818
οδΟδΥΟΤΚΑΕΡδυΡΕΗΡΜδδ 819
ΟδΟδδΟνΤΜΥΡΚΧΡΡΗννδΜΑ 820
οδαδδονκΜΥΡΚχρρΗ^δΜΑ 821
ΟδΟδδδΜΚΜνΡΤΙΡΟδΑΚΗΟ 822
ΚΝΚ ΝΚ
ОТ ΝΚ
κοκ ΝΚ
ΝΚ0 ΝΚ
ΚΟΚ ΝΚ
ΚΝΚΟΚΤ 823
ΚΝΚΟ 824
ΚΝΚΟΚ 825
ΝΚΟΚΤ 826
κοκτ 827
- 55 022424
Таблица 16. Пептидные последовательности 8Н3-антагонистов
- 56 022424
Таблица 17. Пептидные последовательности миметиков соматостатина или кортистатина
Последовательность/структура 8Е<2 ГО ΝΟ:
Х'-Х<А5П-Р11е-РЬе-Тф-Ьув-ТЬг-РНе.Х<5ег-Х* 863
Аяр Аф Мех Рго Су» Аф А«п РЬе РЬе Тгр Еу» ТЬг РЬе Зег Зег Су» Еу» 869
Мех Рго Су» Аф Аяп РЬе РЬе Тф Ьу» ТЬг РЬе Зег Зег Суя Ьу» 870
Су» Аф Акп РЬе РЬе Тгр Ьу» ТЬг РЬе Зег 5ег Су» Ьу» 871
Аяр Аф МеХ Рго Су» Аф А»п РЬе РЬе Тф Ьу» ТЪг РЬе Зег Зег Су» 872
Мех Рго Су» Аф А»п РЬе РЬс Тгр Еу» ТЪг РЬе ЗетЗет Суя 873
Су» Аф А»п РЬе РЬе Тгр Ьу» ТЬг РЬе Зет Зет Су» 874 ,
Аяр Аф Мех Рго Су» Ьу» Аал РЬс РЬе Тгр ЕуаТЬг РЬе Зег Зет Су» 875
Ме» Рго Су» Еуя Аяп РЬе РЬе Τιρ Еу» ТЪг РЬе Зет Зет Су» 1_у» 876
Суз Ьуз Аяп РЬе РЬе Тгр Еув ТЪг РЬе Зет Зет Су» Еу» 877
Акр Аф Мех Рго Суз 1_уз Аяп РЬе РЬе Тгр Ьуз ТЪг РЬе Зег Зет Су» 878
Мех Рго Су» Ьу» Аяп РЬе РЬе Тф Су» ТЪг РЬе Зет Зет Су» 879
Су» Ьу» А»п РЬе РЬе Тф Ьуя ТЬг РЬе Зег 3« Су» 880
Αερ Аф Мех Рго Су» Агв Аяп РЬе РЬе Тф Ьу» ТЬг РЬе ТЬг Зет Су» Еу» 881
МеХ Рго Су» Αχβ Азп РЬе РЬе Тф Ьу» ТЬг РЬе ТЬг Зег Су» Еуя 882
Су» Аф Азп РЬе РЬе Тф Еуя ТЬг РЬе ТЬг Зег Суз Ьуз 883
Аф Ате Мех Рго Су» Аф А»П РЬе РЬе Тф Ьуз ТЬг РЬе ТЬг Зег Су» 884
МеХ Рго Су» Аф Азп РЬе РЬе Тф Ьу» ТЬг РЬе ТЬг Зег Су» 885
Суз Аф Азп РЬе РЬе Тф Ьу» ТЬг РЬе ТЬг Зет Су» 886
Αερ Аф Мех Рго Суя Еу» А»п РЬе РЬе Тф Буя ТЬг РЬе ТЬг Зет Су» Бу» 887
МеХ Рго Суз Буя Аяп РЬе РЬе Тф Бу» ТЬг РЬе ТЬг Зег Су» Буя 888
Су» Еуа Азп РЬе РЬе Тф Бу» ТЬг РЬе ТЬг Зег Су» Буя 889
Аяр Аф Мех Рго Суя Буя Аяп РЬе РЬе Тф Суз ТЬг РЬе ТЬг Зег Су» 890
Мех Рго Су» Еуя Аяп РЬе РЬе Тф Буя ТЬг РЬе ТЬг Зег Су» 89)
Су» Бу» А»п РЬе РЬе Тф Буя ТЬг РЬе ТЬг Зет Су» 892
Таблица 18. Пептидные последовательности иКК антагонистов
Последовательность/структура 8Е<3 Π) ΝΟ:
АЕРМРН51Ж5ОУШУТ 893
АЕНТУЗЗЕАУОТУЗРЕАР 894
АЕЬОЬ^МЯНУРЬЗРЗЫК 895
ΑΕ551ΛνΤΕΥΑ\νΡ5ΜΡ5Υ 896
АЕ^НРСЬЗГОЗУЬМ/ЗКТ 897
АЕРАЕЕЬПУЗРРРОТСЕН 898
ΑΕ№5ΓΥΝΕΗΕΡΕΡΡΤΙΡ 899
АЕРЬОЬ^ЗЬУЗЬРРЬАМ 900
АЕРПЛУРЬУОРРЬНЬЗО 901
А£15Р5ЕЕМ\УЕК5ТРАР 902
АЕЕ5ЕАПЕ№ТГ№РСМС5 903
аеззе^уюгзрзаеммз 904
АЕЗБРТЕТЗИЛУСКЕЗУ 905
АЕТБРМОЕ^НБКНШЕТ 906
ΑΕΙΕΝΡΡΕ^ΗΕΡΕλνδΤΕ 907
ΑΕ5ζ?Τ€ΤΕΝΤΕΡ№ΝΤΕΚ 908
АЕРУУОУЕЮЗУЕКЗУУ 909
АЕЕПЕЗТРУШрУЕЕЯТ 910
ΑΕΡΡΚΕΟΡΝΟΥνΥΕΗδΑ 911
РКБХХХОУУУЕ 912
ΑΕ5ΤΥΗΗΕ3ΕΟΥΜΥΤΕΝ 913
УНХБХХОУМУТ 9)4
- 57 022424
Таблица 19. Пептидные последовательности ингибиторов для макрофагов и Т-клеток
Последовательность/структура 8Е<2 ГО ΝΟ:
Хаа-Уаа-АГ£ Ж
Агд-УааХаа Ж
Хаа-Агд-Уаа Ж
Уаа-Агд-Хаа Ж
А1а-Агд Ж
АГ£-АГ£ Ж
Αδη-Ατβ Ж
Аар-Аг£ Ж
Суз-Агц Ж
Οίη-Ατβ Ж
С1и-Аг£ Ж
О1у-Аге ж
Ηΐ$-8Γβ ж
Не-Ац» ж
Ьеи-Аг8 ж
Ьуа-Αΐβ ж
Ме1-Аг£ ж
РЬе-Ατβ ж
5ег-Аг§ ж
ТЬг-Аг8 ж
Тгр-Ατβ ж
Туг-Аг® ж
Уа1-Агв ж
А1а-О1иАг£ ж
Аг£-С1и-Аг£ ж
- 58 022424
Азп-СЛи-Ахд ΝΚ.
Аяр-С1и*Аг£ ΝΚ
Су5-О1и-Агд Ж
С1п-С1и-Аг£ ΝΚ
СкнО1о-Аг£ ΝΚ
О1у-О1и-Агд ΝΚ
НйкОНьАгр Ж
Ие-С1и-Аг£ Ж
Беи-ОЫ-Агд ΝΚ
БузЧИи-Агв Ж
Ме!-О1и-Аг£ Ж
РЬс-С1и-Ах£ Ж
Рго-ΟΙυ-ΑΓβ Ж
5ег-С!«-Агв Ж.
ТЬг-СПи-Агд ΝΕ
ТгрО1и-Ах£ Ж
Туг-О1и-Аг£ Ж
Уа1-О1и-Аг8 Ж
Аг£-А1а Ж
Αϊβ-Αδρ Ж
Аге-Су« Ж
Аг£-С1п Ж
Αϊβ-ΟΙυ ж
Агв-СПу ж
Агв-Нй ж
Ατβ-Ис ж
Ατβ-Εβο ж
Ατβ-Буз ж
Ατβ-Μεί ж
Αΐβ-РЬе ж
Α/β-Рго ж
Агд-5ег ж
Агд-ТЬт ж
Агд-Тгр ж
Аге-Туг ж
Аг'в-Уа! ж
Аг£-С1и-А1а ж
Аг£-С1и«А5п ж
- 59 022424
Аг£-О1и-Азр ΝΚ
Аг§-О1и-Суз ΝΚ
Аг§-О1и-О1п ΝΚ
АгВ’СПи-СЯи ΝΤΚ
Аг$-С1и-С1у ΝΚ
Аг£-О1и-Н15 ΝΚ
Аг£-С1и-11с ΝΚ
Аг£-С1и-1хи ΝΚ.
Аге-О1и-Буз ΝΚ
Аг£-С1и-Ме( ΝΚ
Аг£-С)и-РЬе ΝΚ
Аг^-Ои-Рго ΝΚ.
Аг£-С1и-Зсг ΝΚ
Аг£-О1и-ТЪг ΝΚ
Аг£-О1и-Тгр ΝΚ
Ατβ-ΟΙιι-Туг ΝΚ
Ατι-ΟΙϋ-ν·1 ΝΚ
А1а-Агд-С1и ΝΚ
Ατβ-Ατ^ΟΙυ ΝΚ
Азп-Агд-СПи ΝΚ
Аар-Аге-С1и ΝΚ
Суз-Агд-Ои ΝΚ.
С1п-Аг£-О1и ΝΚ
О1и-Аг£-О1и ΝΚ
01у-Аг8-01и ΝΚ
Ηίβ-ΑϊΒ-ΟΙν ΝΚ
|]е*Аг£-СНи ΝΚ
1_си-Аг£-О1и ΝΚ
Буз-Агв-СНи ΝΚ
Мс1-Аг£-О1и ΝΚ
РЬс-Аге-О1и ΝΚ
Рго-Агд-О1и ΝΚ
5ег-Аг8-О!и ΝΚ
ТНг-Агд-ОЬ ΝΚ
Тгр-Ах£-О1и ΝΚ
Туг-Агд-СЛи ΝΚ
¥а!-Агв-О1ц ΝΚ
О1и-Аг£-А1а, ΝΚ
- 60 022424
ОЫ-Агд-Агд ΝΕ
Ои-Агд-Азп ΝΚ
СПи-Агв-Азр ΝΚ
ОЫ-Агд-Суз ΝΚ
(Ии-Аг^-Ол ΝΚ
О1и-Аг8-О1у ΝΚ.
С1в-Аг«-Н« ΝΜ
<31ы-Агд41е ΝΚ
О1и-Аге-Ьси ΝΚ
О1и-Аг£-Еу8 ΝΚ
О1и-Агв-Ме1 ΝΚ
ОЬ-Агд-РЬе ΝΗ
ОЬ-Агд-Рго ΝΚ.
О1и-Лг£-5ег ΝΚ
О1и-Аг£-ТЬг ΝΚ
О1и-Аг£-Тгр ΝΚ
С1и-Агв-Туг ΝΗ
О1и-Аге~Уа1 ΝΚ
Таблица 20. Дополнительные примеры фармакологически активных пептидов
- 61 022424
СХРХС 929 ММР- ингибитор
СКЯНЗУСРЕРС 930 ММР- ингибитор
8ТГН1УСРТЕ5 931 ММР- ингибитор
С5ЕН№ОР№№С 932 СТЬА4- миметик
СРУС5С1РАУСУСКС 933 СТЬА4- миметик
ароуш-Осаушкус 934 СТЬА4- миметик
ьизкмк 935 Антивирусный (НВУ)
1СУУрО№СННКСТАОНМАКЬТ8НА8А1 936 СЗЬ- антагонист
1суу<зо№сннаст 937 СЗЬ- антагонист
СУУРО№ОННАС 938 СЗЬ- антагонист
5ТООРООУ¥О№АКОУ55АЕТТТЬУАТК 939 Винкулин- связывающий
8ТСОРРОУУО№АККУ55АЕТТТЪУАТЯ 940 Винкулин- связывающий
8ΚθνΝΡ5Ε№ΕΥΟΜ5ΑΑΜΚΕΑ5ΝνΡΡ8ΚΚδΚ 941 Винкулин- связывающий
85РИ№ПМЕАОУЕЬеТААМЕОЕЕ8ПН888К 942 Винкулин- связывающий
55Ρ5ΕΥΤΟΡΕνΝΥΕ5ΑΑΤΚΚ?ΟΕΕΙΑ5ΚΡ5Κ 943 Винкулин- связывающий
55ТС№УОЕЕСАЕОЯААОАТаТ8П»Р8ЕОН5К 944 Винкулин- связывающий
ОУУТККЕЕ1ЕСАКЛУ5ЕК 945 Винкулин- связывающий
ΕΚΟδΥΥΗΟδΟΙΑρΡΗΙΟΥΝΝνβ 946 С4ВР- связывающий
5С1АОРНГОУ№ЧУ55АЕО№НУЪ1 947 С4ВР- связывающий
ΕνΤνΕΚ08ΥΥΡ0501Α0ΡΗ1ΟΥΝΝν88ΑΕΟ№ΗνΝ 948 С4ВР- связывающий
δΟΙΑΟΡΗΙΟΥΝΝνδ 949 С4ВР- связывающий
ЕБСКМК 950 анти-НВУ
ΑΕΕΰΚΜΚΟ 951 анти-НВУ
ЬОРАРЯ 952 анти-НВУ
СХХКООС 953 Ингибирование агрегации тромбоцитов
ΚΡΕΡΡΙ.Ρ 954 8гс- антагонист
РРУРРК 955 8гс- антагонист
ХРХРХ1УХХЕХХ 956 Противораковый (в частности, при саркомах)
КАСККЕРСРУОЗЕОЕЗКЛСО 957 Р16- миметик
Κ.ΕΚ№ΝΡΟΡντεΤΡΕΕΟΟΓΑ\ν 958 Р16- миметик
ΚΚΚφΤδΜΤΟΡΥΗδΚΚΚΕΪΓδ 959 Р16- миметик
Τ3ΜΤΟΡΥΗ3ΚΚΚΕΙΡ5ΚΒΚΡ 960 Р16- миметик
ккш 961 Р16- миметик
КЯК0Т5АТОРУН5ККЯиР8а01К1№Р0МККМК№КК 962 Р16- миметик
КККЕ1Р5ККС?1К1№РОЫККМК№КК 963 Р16- миметик
- 62 022424
Азп О1п О1у Агд ΗΪ5 РЬе Суз О1у 01у А1а Еем Не Ни А1а Агд РЬе Уа1 Ме1 ТЬг А1а А1а 5сг Суз РЬе <31п 964 САР37 миметик/ЬР8 связывающий
Агд РЬе Суз О1у О1у А1а Ьеи Не Же А1а Агд РЬе Уа1 Ме1 ТЬг А1а Л1а Бег Суз 965 САР37 миметик/ЬРЗ связывающий
С1у ТЬг Агд Суя С1п V»! А1а С1у Τιρ С1у 5ег С1а Агд 5ег С1у О1у Агд Еси 5ег Агд РЬе Рго Агд РЬе Уа1 Азп Уа1 966 САР37 миметик/ЬРЗ связывающий
АНАКНЫРЕОЕААСЯ 961 миметик углеводов (Οϋΐ альфа)
ЕКТРКУ 968 β2ΟΡΙ АЬ - связывающий
КТЕКТРКУ 969 β20ΡΙ АЬ - связывающий
КГЕКТРКУССС 970 β20ΡΙ АЬ - связывающий
КОКАТР 971 β2ΟΡΙ АЬ - связывающий
КОКАТРССНО 972 β20ΡΙ АЬ - связывающий
КПКАТРССНОСС 973 β2ΟΡΙ АЬ - связывающий
ΤΕΚνΥΚ. 974 β2ΟΡΙ АЬ - связывающий
АТЬКУУКСС 975 β20ΡΙ АЬ - связывающий
САТЕЯУУКОС 976 β2ΟΡΙ АЬ - связывающий
977 перенос через мембрану
САТ ΝΚ перенос через мембрану
ΟΑΤΕΝδΑΟΥΕΕΟ 978 перенос через мембрану
ΟΑ-ΓΕΝδΑΟΥΕΕΟΚΙΝΕΚΑΕΑΑΕΑΚΚΙΕ 919 перенос через мембрану
СУНАУКЗ 980 Антипролиферативный, противовирусный
СУНАУКА 981 Антипролиферативный, противовирусный
СУНАРЯ5 982 Антипролиферативный, противовирусный
СУН АРКА 983 Антипролиферативный, противовирусный
СУН5УЯ8 984 Антипролиферативный, противовирусный
СУН5УЯА 985 Антипролифератив- ный, противовирусный
СУН5РЯ5 986 Антипролифератив- ный, противовирусный
СУНЗРЯА 987 Антипролифератив- ный, противовирусный
СУНТУЯЗ 988 Антипролифератив- ный, противовирусный
СУНТУКА 989 Антипролифератив- ный, противовирусный
СУНТРКЗ 990 Антипролифератив- ный, противовирусный
СУНТРКА 991 Антипролифератив- ный, противовирусный
НАААРК 992 антиишемический, высвобождающий гормон роста
- 63 022424
Таблица 21. Миостатин-ингибиторные пептиды
НАЗВАНИЕ ПЕПТИДНОГО АНТИТЕЛА 8Е<) ГО ПЕПТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Муо«аип-ТЛ8-Соп1 1036 ЮКСКМАНАМСКРР
Μγο5ί3ΐϊη-ΤΝ8-Οαη2 1037 КОЬСАМАНАМСКРР
Муо5Шйп-ТЫ8-СопЗ 1038 КОЬСКМАКАМСКРР
МуоМайп-ТШ-СопД 1039 КПЕСКМАНАМСКРК
Муо«а11п-Т№-Соп5 1040 АУРСУЕРНРАСУШ.
Μγθϋΐ3ΐίη-ΤΝ8-Οοη6 1041 АУРСУЕСНРАСУОЬ
Муови6п-ТЫ8-Соп7 1042 1РО<ЖАЧЛС>У<ЭСУ<}Р
Муоз1а(«п-ПМ8 -Соп8 1043 1Р<зскааоу1>су<эр
Муоз1а1т-ТМ8-Соп9 1044 АОАСУЗРЫАРСМУМ
Муоз1а6п-ТИ8-Соп 10 »045 НКРСРАААЕРСАОР
Муоз1а11П-ТМ8-1 1046 КПЕСКМАНАМСКРР
Муоз1аНп-Т1Ч8-2 1047 ГОКСА1АСАМСРРЬ
Муоз(аПп-ТМ8-3 1048 АУРССЕРСМАСичУ
Муо51апп-ТК8-4 1049 ΑΕΤΟΕΑΝΟϋΝΕ
Муо51аип-ТЛ8-5 1050 НТРСРАРАРЬСУЕА
Муок1аЬпТЫ8-6 1051 КЕАСАКАКАМСКРЕ
Муоз1аПп-'ПЧ8-7 1052 РЕТСР5ААУРС1ЛД
Му оз(а) ί Π-ΤΝ8-8 1053 АУКСЕАКОАССААЕ
Муоыайп-ТИ8-9 1054 ШАСЕ1Х>АНК.СААЕ
Муо51а»п-ТП8-10 1055 А5АСУАСНРАСУОЕ
Муойайп-Т148-11 1056 АКАСУЗРКАРСМУМ
Муоайайл-ТИв-12 1057 АТЕСУООЕРАСАЪЯ.
- 64 022424
Μγο813«η-ΤΝ8-13 1058 ЕМТСЕЮУКХУМСРРК
Μγο5θΙίηΤΝ8-И 1059 иЩРСНрЕОРХУСМКР
МуОЯШ.п-ТЪ8-15 1060 ЗТМСЗОХУРПУМСИРР
Μγο5ΐίΐίη-ΤΝ8-16 1061 ΙΡΟϋΗλνλνόνΟϋΥΟΡ
Μγοκωύη-ΤΝδ-17 1062 1ΥΟΟΚ\ν\νϋΙ0ΟΥΟ1
Μ>Ό5ΐ8ήη-ΤΝ8-18 1063 РО\¥СЮРО\УУ/СКРУ/
Муоз1а1т-ТО8-19 1064 ООНСГКХУРХУМСРРУ
Муо51а«п-Т7Ч8-20 1065 У/<ЗЕСУкЕСРШСИЗТ
Μγο:5ΐ3ΐίη-ΤΝ8-21 1066 шрс>суорсркс\у5р
Муо81а<т-ТЫ8-22 1067 ОУКСРКОНПУСЕУР
Муох1а1т-ТЫ8-23 1068 ΗΧΥΑΟΟΥΐνΡΧνδϋΚλνν
Μνοβ«ΐ1η-ΤΝ8-24 1069 οΡΑθΗ$ρ\ν\ν\νσνρο
ΜγοΜ3ΐίη-ΤΝ8-25 1070 ТТЖЯЗРМЗУРСЗОР
Муомайп-ТЫ8’2б 1071 НКГСРР\УА1РСХУОР
Муояаип-ТМ8-27 1072 ΡΟλνονδΡΚλΥΥϋΝΜίν
Муо«а1яъТПМ8-28 1073 УХУКСНЭТОМОСЕРТ
Муоаи<т-ТЫ8.29 1074 ККНСЦТОТУУМСАРК
ΜγοϊΙ3Ιιη-ΤΝ8-30 1075 ΧνΡΟΓΟδΤΕΡννΟΥΝΕ
Μγθ!>ΐ3ΐιη-ΤΝ8-31 1076 \У5РСУОНУРУСУТ1
ΜγοίΙίΙίη-ΤΝ8-32 1077 5ХУМСОРРК£УСМ\УУ
Μχο8ΐβ1«η-ΤΝ8-33 1078 ЕМЬСМШР νΡΟΝΡΗ
Μγοϊί3ίΐη-ΤΝ8-34 1079 ЕКТО4Е1УР\УМСРРЕ
Μνοδ»<ϊη-ΤΝ8-35 1080 ννΟΌΚΧΥΥΕΑΧνΟΥΝΚ
Μγο«ΐί£ίη-ΤΝ8-36 ИМИ Р1НСГ<31УА1АЛМСРРТ
Μ}Ό4ΐ8ΐ!η-ΤΝ8-37 1082 Ο5ΝϋΡ\νΥΡΕ50νΐΡ
Μγοϊ«ΐιη-ΤΝ8-38 1083 ΗΙΎΟΝΕΑΜΜΚΟνΕΜ
Муояа»»п-Т!48-39 1084 ΝΠχΠΥΤϋΟΚϋΙΥΡ
Μγοβ1β<ίπ-ΤΝ8-40 1085 АХУНСМХУГЗОУСТРС
МуоЯайп-ТЫЯ-Д 1 1086 \УРКСРЕОАП\УСТ5У
Μ>Ό5Οΐίη-ΤΝ8-42 1087 ЕК1С(?М\¥8ХУМСАРР
Муох1а1т-'ПЧ8-43 1088 ХУРУСНЕИКЗЕСТЕР
ΜγοχΙϊΐίπ-ΤΝ8-44 1089 ПУКСАЮЮКСККУ
ΜγοϊΙβΙίη-ΤΝ8-45 1090 Ν1χ3ΟΚΐνΥΕν\νθΡΤΥ
Μ>Ό81»Ιίη-ΤΝ8-46 1091 ЮЕС1ЧМХУ1ХЗМСУРР
Муо51аПп-ТМ8-47 1092 ЕМРСМЖЖМСРРУ
Μγο5Μίη-ΤΝ12-1 1093 ХУРКСУЬТС1УО\У5ЕСРОЬ
Муохиап-ΤΝ 12-2 1094 ОРЗСТРаБОЕРУУЛСБРР
Муо81аПп-ТМ 12-3 1095 ЕРМ/СН1Х>УЫАЕГУСРСМЕ\У
- 65 022424
Муомайп-ΤΝ 12-4 1096 УРТС8ЕКРЗУГКЗ<ЗТСУБ\У
Μγθ3ΐ3ΐίη-ΤΝ12-5 1097 ШРСРШНСР1УРрУСУУ\¥
Муо5{аПп-ТЫ12-6 1098 РРРСЕТН(315\УЕСНСЕ5Р
Муо»айп-ТЫ12-7 1099 №УОСЕОШ\У8ЖНРЕСККР
Μγο5ΐ3ΐιηΤΝ12-8 1100 ЬРЬСОАОММРТЮРСУАУ
Μγοϊΐίΐΐπ-ΤΝΙ 2-9 1101 5Н9/СЕТПЧУМХУАКСУНА
Муойайп-ΤΝΙ 2-10 1102 ЕРКСТНУРРЕКЗССКСПУУ
Μγθϊΐ8»:η-ΤΝ12-11 ПОЗ Р55САМ5РУ5К<Д>МРСУРУ
Μγθ8ΐΛΐίη-ΤΝ12-13 1104 8НКСЕУ5О99иЭРЕСУКР
МуозШ) η-ΤΝ 12-14 1105 Ρ\νν/ϋΟΟΝΥνρΗΜΙ-Η€Ο5Ρ
Μγθ3ΐ»1ίη-ΤΝ12-15 1106 νη^0ΜΙΜΝ8ΡΟΑΡ<20νδΥ
МуовШш-ΤΝ 12-16 1107 РОАСКООРХУУМРМССМЬС
Μχο5ΐ8ίΐη-ΤΝ12-17 1108 РЕАСРУЕРЕЬСРШ
Му<кайп-ТК12-18 1109 ЗАУСИТЕЗОРУУЕСУРЬ
ΜγοβΙβΙίη-ΤΝ 12-19 1110 Ρ5Ι€Ε5Υ8ΤΜ\νΕΡΜΟ<5ΗΝ
Муовийп-ΤΝ 12-20 1111 1УЬОСН0051УАУГТКМСК5Н
МуоМайп-ΤΝ 12-21 1112 УБЫСУММЫТЯРРУЕСУРЫ
Муомахт-ТЫ 12-22 1113 γρννϋϋΟΡΜίοοοιτοΜΡΥ
Муо5»айп-ТМ 12-23 1114 ρογστν/ΕΝΟΡΚϋλνκολνδΚ
МуоМайп-ΤΝ 12-24 1115 ЕРЕОМЕКЕ15НУ<}АСУЕР
Муояайп-ТЫ 12-25 1116 5РЕСАРАЯЖ-О1Е0С0КО
Муомайп-ΤΝ 12-26 1117 ΥΡφΟΡΝΕΗΕΙ.Ε'ΥΤΕΟΟλνΡ
Муоаийп-ΤΝ 12-27 1118 К1УЯСЕГУО5ЕРЕРКСАУГР
Муолайп-ТЫ 12-28 1119 ЬУССОМУШНКСКЬР
Муоз(аХ1П-ТМ 12-29 1120 АОЗУСНУ\УОЕМРСМОС8АЬ
Муозийп-ΤΝ 12-30 1121 ННЕСЕ\УМАК\УМ5Г.ОСУСЕ
Муозхайп-ТЫ 12-31 1122 РРМСО1АСМКОРОРСУ\УУ
ΜγοϊΙβίίη-ΤΝ 12-32 1123 1Ш1ХЛТУЛРЕ9УЕ99КЕСЕКР
Муозийв-ΤΝ 12-33 1124 ΥΝΡΟδΥυΡΟνδΚΕΑϋΟΕΡ
Μγο31»1ιη-ΤΝ 12-34 1125 АНЗУСЕООРТУКУСЪПСМАУ
Муозхайп-ΤΝ 12-35 1126 ЫЬУССК15А\УСОЕАСАКА
Μ уояаЙп-ΤΝ 12-36 1127 ΗΝνοτΐΜαρ8ΜΚ\νρονζΝο
МуовХайп-ΤΝ 12-37 1128 ΝΟΕ0ΑΜ\νθ\νΚΝΤΐν/Ο<5Ν5
Муозайп-ΤΝ 12-38 1129 РРЕСОЪГОРГОМЕО5ЕСК.1_Е
МуозХайп-ΤΝ12-39 ИЗО ΐνΥΙΧΝνΡΝΕΕΕδΟΕΟΚΕΡ
МуозШ) η-ΤΝ 12-40 1131 ΥΟΟϋΐΧ)ΝΗλνΜ%ΦΡΤ€Ε5Ε
Муов«йп-ТМ12-41 1132 &ШСНР&СНЖ6АТС<ЗРО
Муозайп-ΤΝ 12-42 1133 УРНСМРССНЕРЕУНСЕБР
- 66 022424
ΜχοδΙβηη-ΤΝ 12-43 1134 ΑΥν/ον/ΗΟΟσνκρ
Муся1а (ϊ η-ипеаг-1 1135 5ΕΗ\νΤΡΓΟ\νϋΟΝΕν/\ννΚΡΡ
МуовхаМп-Ыл саг-2 1136 ΜΕΜΕΟδΙΡΈΛΧΚΟΜνΡΙΚΚΑ
Муо&айп-Етеаг-З 1137 5ΡΡΕΕΑΕΜΕ\ΥΕΟ\ν(3ΥΟΚΕΤ
Мус»ми»п-ипеаг-4 1138 δΡΕΜΛΝΟΕΥΙΕΜτΚφΕνΥΟ
Муон<11н1~1Ллеаг-5 1139 ΕΗΐνΕΕΟΗ’ΡΗννΤΡΥδΥΟΚΜ
МуО51апл-Етеаг-6 1140 ΚΛΙΧερΡΜΝΟΕΑΕΕνδβΗδ
Муоз1аПлЕтеаг-7 1141 ОТЮЭАЕРОЕРУЕРУКЗ&ЕУ!
МуояиНп-Ыпеаг-8 1142 ΚΜ5ΑΑΡΚΡΕΤΥΜ>ΙΜΟ<3Υ\νΗ
Муо»1а1»п-Етевг-9 1143 ΝΟΚΑΗΡΡΕΜΡΜΡΟνΗΝΡΥΕδ
Муо5№Мп-1лпеаг-10 1144 ΟΤΟΑΟΚΚΧΪΕ^ΕΕΕΡδΙΚΝΟ
Муоз1а1м1-1лпеаг-11 1145 ΜΕδΕΡΕΕΠΟΝΕνΗΚΟΕΑ
Муоз<а1)п-1лги:аг-12 1146 ΥΊΡΚΜΟ8Ε1ΥΤ5Ρ1ΥΗΝΚΙΗΥΕ
Муо81а1т-1лпеаг-13 1147 ΕΝΟΤΕΕΒΕΙ^ΐΜνΕΝδΕδΟΜΚ.
Муо51а»т-1лпеаг-14 1148 ΡΟνΕΚΠίΜΚΨΕΕΟΡΜΟδΑΑΤ
Муоз1апп~ипеаг-15 1149 ΙΜΟΤΛΖΝΥΕΙΟίΟδΑΪΡρνΡΕΑλνν
Муоз(а(т-1ляеаг-16 1150 νΕδΙΉΟΕΟΜίνΐΙίρΚΕΑδΟΡΗ
МуосШ11Я-Ыпежг-17 1151 ΚΑΤ1ΧΚΙ>Ρ^Εν^3ΥΟΟΝ
Муокиит-Цлеаг-18 1152 ЕЕЕЕКЕРУКРУЗАРОУ
Муоз1а«1п-1ипеаг-19 1153 ΟΕΕΟΕΡδΗΗΑΕΟΡΥΟΜΡΟα
Мускиип-Ьтеаг»20 1154 УКЕШМЕЕОЕШУЕЕКЕОНУ
Му<ж(а<ш-Ешсаг-21 1155 ΗΝδδΟΜΕΕδΕΕΧΜΕΥΟδΜΜΟ
Муо51аХ1П-ипеаг-22 1156 ν9ΚΕΗΡΕΝδΟΥ1ΚϋΚΕΙΑ1ΙΧ3
Муо9и6п-Етеаг-23 1157 <}ΡΡΡγνΡΟϋΕΡΑ<?ΕΕΥ\νΐΑ
Муо5СаПп-ипеаг-24 1158 ΕΓΡΗν/ΕΗΝΗΚδΕνΝΗννΈϋΜΝ
Муоа1а(1я-Етеаг-25 1159 ΕΑΕΡΟΝΤΓΚΟνΕΤΕδΕΚΕΥ
Муо8»1»п-йпеаг-26 1160 ΡΥλνΕΟΟΙΥΜΤΥΡΚΕΝΟΕΗνΟΥ
М уо51а»п-ипеаг-27 1161 ΝΟΚΜΜΕΕΟΕΙΜΛΙΜΤΡΜΡΟΚδ
Муоз1айп-1дпсаг-29 1162 ΡΕΟΕΕΚΑΕΕδΚΗΥΑΕϋϋΕΟΕ
М уо51аПп-Ыпеаг-30 1163 ΟΚΕΙΕΟΕΕΝΕΕΜ<5ΕΕΤΡΜΡϋ
Муо8(айп-1_1пеаг-31 1164 11ΕΕί)ΕΥΚΚΕ)ν/Κ.5\νΡ
Муо81а1»»-2хТ148-19 кс 1165 ОСНСТК’АТ>'АГМСРРУС5С5АТСС2С2ТА58С5С5АТС ΟΟΗΟΤΚν/Ρν/ΜΟΡΡΥ
Муо81аПп-2хТ7Ч8-соп6 1166 1УУРС¥ЕОНР^СУПЕС8О8ТА85О5С5АТС\УУРС¥ЕС НР^СУОБ
Μγο3ίβ(ιπ-2χΤΝ8-5 кс 1167 ΗΤΡα»νΡΑΡΕ0νΕν0δΟ5ΑΤ005ΟδΤΑ5δ0δΟ5ΑΤ0Η ТТСР\УРАРЕСУЕ%?
Муо51аХ1п-2хТП^8-18 кс 1168 РО\УС1ОРО\У\УСКЕУ/ОЗС5АТСС8С8ТА55С5С5АТС ршусюрохухускрж
Муо$1а()п-2хТЛ8-11 кс 1169 АЬПЛГСУ5Р№Л1РСМУМО5О5АТСС»5<35ТА58<35О§АТ САЫ1УСУ8РМЗ¥РСМУМ
Μχο«β6η-2χΤΝ8-25 кс 1170 ΡΟ^ϋΙϋΡΟΜννϋΚΡνΟδΟδΑΤΟΟδΟδΤΑδδΟδΟδΑΤΟ ρο\ναορο\ν\ν<;κρ\ν
Муо51а1!п-2хТК8-23 кс 1171 ΗνΑΟΟΥΛτνδϋκνπ/αδΟδΑΊΌΟδΟδΤΑδδΟδΟδΑΤ О1ШАССУ\УРЗУ5СК1УУ
Муо51айа-ТН8-29-19 кс 1172 ККНС91\УГ^МСАРК08С5АТС05С8ТА5505С5АТС Оонстк\ур\ммерру
Муо51апп-ТМ8-19-29 кс 1173 0ОНСТКЗУРАУМСРРУС8С5АТОО8С8Т^5О5С8АТС ККНСОИАГПУМСАРК
Μγο»ΐ3ηη-ΤΝ8-29-19 кп 1174 10КМСр1МГПУМСАРК08С5АТС<35С8ТА8$С8С8АТС ОСНСТК\УР\УМСРР¥
ΜγοβΙ»ΐίη-ΤΝ8-29-19-8β 1175 ккнсо1\¥т^мсарксосоооссоонстя\ур\умср РУ
ΜγοδΙβΙΐη-ΤΝβ-19-29-6{>с 1176 0СНСТКЗУРАУМСРРУОС<3€5ООККНСр11УТ1УМСАРК
- 67 022424
Таблица 22. Миостатин-ингибиторные пептиды
Пептидное антитело (аффинное созревание) δΕΟ Π) ΝΟ: Пептидная последовательность
ιηΤΝ8-19·1 1177 УАЬНООСТКУ/РЗУМСРРОКЕО
ΓηΤΝ8-19-2 1178 УРЕОС1_СТК\УР\УМСРРОТЬА
Π1ΤΝ8-19-3 1179 ΟΕΝΟΟΙΙΟΤΚν/Ρν/ΜΟΡΡρΟδΝ
ιηΤΝ8-19~4 1180 М1тооостк\ур\умсррор80
ΓηΤΝδ-19-5 1181 ΑΟΑΟΕΗΟΤΚννΡν/ΜΟΑΡΝΟν/Ι
ΓηΤΝδ-19-6 1182 ονΝθοοστκλνκ\νΜθΡΡΝθ\νε
γπΤΝ8-19-7 1183 ЕАОНС<ЗС1К\УР\ММСРРЕО\УЕ
Π1ΤΝ84Μ 1184 1ЕЕОАОСТК\УР\УМСРРОКОО
ητΤΝ8-19-9 1185 ТОТНАОСТК\УР\УМСРР<3\¥ЕО
ΓηΤΝδ-19-10 1186 УУТООНСТЕХУРЗА/МСРРОКУ/К
γπΤΝ8-19-11 1187 ιγρΗθοστχ\νρ\νΜθΡΡ<3ΡΥΡ
ΓηΤΝ8-19-12 1188 8УУ/(5ООСТК.\УР\УМСРРрУ/КО
Π1ΤΝ8-19-13 1189 м1Уроенстк\ур1Умсррро^с
ΓΠΤΝ8-19-14 1190 ЕРТрХУНСТКЧУРШМСРРрКЗО
ΓΠΤΝ8-19-15 1191 υ>ορινοετκινρ\νΜθΡΡθ€ϊΡδ
ητΤΓΝ8-ΐ9-ΐ6 1192 УрТ0ОЬСП1^Р1УМСРР050К
тТМ8-19«17 1193 ΕδΝΟΟοστχνζρχνΜσρροοοκν
тТМ8-19-18 1)94 ΙΥΤΠΚΟΡσΓΚνΡίνΜϋΡΡΟΑΝΟ
ωΤΝ8-19-19 1195 УОТОООСТКХУРУ/МСРРУЕТО
(«ΤΝ8-19-20 1196 ΡΥΕΟΟΚσίΚν/ΡλνΜΟΡΡΥΕνΕ
тТМ8-19-21 1197 ЗЕУОСЬСТКУ/РУ^МСРРОСУ/К
ηαΤΝ8-19-22 1198 ТЕ80СНСТК\УР\УМСРР0С\УС
πϊΓΝ8-19-23 1199 РОАЗЮНСТК\УР\УМСРР<Э5КУ
ΓηΤΝ8-19-24 1200 УАЕЕ\УНСХКЛУР\УМСРР<ЗОУ/Х
ιηΤΝ8»19-25 1201 УОТООНСТКУ/РУ/МСРРОРАО
ιϊϊΤΝ8-19-26 1202 ЕЕЕК5АНСК39/Ри/МСРРОО\УУ
тТН8-19-27 1203 АОТООНСТК\УР\УМСРР(}Н\УЕ
ιηΤΝ8-ϊ9-28 1204 5СРООНСТК.\УР\УМСАРОО\УР
ΓηΤΝδ-19-29 1205 ТЬУООНСТКЛУРХУМСРРрЮУУ
γπΤΝ8-19-30 1206 ОМАНОКСТК\УА9/МСРРС38\УК
ΓηΤΝ8-19-31 1207 ЕЕУНООСТК\УРМ/МСРР<}5\УА
πτΤΝ8-19-32 1208 УАЛНОНСТКЧТР/МСРРОСАУС
ιηΤΝ8-19-33 1209 РЕЗРОНСТЯУ/РУ/МСРРООУ/О
γπΤΝ8-19-34 1210 1РАНОНСТКЛУР\УМСРР<ЗК\УК
ηηΤΝ8-19-35 1211 ЕТУНОНСТК\УР\УМСРРУО\УУ
πιΤΝ8-19-36 1212 РОЕРОНСТКУ/КУ/МСРРООУ/Е
ιηΤΝ8-19-37 1213 <ЗЫ¥рОРСТр\УРЗУМСРРКОЯУ
πϊΓΝ8-19-38 1214 НАМХШСТК\¥р\УМСРР<ЗЖЗС
γπΤΝ8-19-39 1215 ЕТОНСЕСТК\УР\УМСРРУОАК
ίηΤΝ8-19-40 1216 СТ^ООЕСТК1УР1УМСРРрО1У0
ιηΤΝ8-19βοη1 1217 УАТ000СТК9/РУ/МСРР0О\УО
ηιΤΝ8-ΐ9 соп2 1218 УАТОСОСТКЧ/Р\УМСРРОК\¥0
ΓηΤΝδ сопб-1 1219 ОКЕ\УУРСУОСНЕ\УСУОЕНКА
σιΊΓΝδ сопб-2 1220 15А\УУ8СУАСНЕ9/С9/О1,крк
γπΤΝ8 сопб-3 1221 9УГС\УУОСУООН нусуоьккк
ητΤΝδ сопб-4 тТМ8 сопб-5 1222 1223 КТР \УУРС УЕЮНПУСУНЬКБ 5 ЕЗЮУУГСУЕСНЬи'СГОЕТЕТ
- 68 022424
Таблица 23. Миостатин-ингибиторные пептиды
Пептидное антитело (аффинное созревание) 8Е<2 ГО ΝΟ: Пептидная последовательность
ь2 1224 МЕМЕОВЕРЕШКОМУИВКА
тЬ2-Соп1 1225 ΚΜΕΜΕΕδΕΕΕΙ-ΕΚΕίνΡΜδΚΑΟ
тЕ2-Соп2 1226 ΚΜΕΜΕΕδΕΕΕΙ,ΕΚΕίνΡΜδΚΑΚ
тЬ2-1 1227 КМЕМЕЕ5ЕЬЕЬЕК.О1УРМ5КР5
тЬ2-2 1228 СМЕМ12Е5ЕРЕЕ£ОШУРМ5КАР
тЕ2-3 1229 ΚΜΕΜΕΕδΕΕΕΕ-ΕΚΠίνΡΙδΝΡΡ
тЕ2-4 1230 К1ЕМЕЕ8ЕЕЕШрЕ1УР18КАЕ
тЬ2~5 1231 ΚΜΕΜΕΟδΕΕΕΕΕΚΠϊνΡΜδΝΑΚ
тЬ2-6 1232 ΚΜΕΜΕΕδΕΕΕΕΕΚΕίνρΤδΝΟΤ
тЬ2-7 1233 ΚΜΕΜΕΕδΕΡΕΕΕΧΕίνΡΜδΚΑΟ
тЕ2-8 1234 ΚΜΕΜΕΟδΕΕΕΕΕΚΕίνΡΜδΚΑΚ
тЕ2-9 1235 ОМЕШЭБЕГЕЕЕКЫУРКЗДРА
тЬ2-10 1236 ΚΜΕΜΕΟδΙΧΕΙΧΚΕίνΡΜδΝΑΚ
тЕ2-11 1237 ΚΜΕΜΕΕδΕΕΕΕΕΗΕΐνΡΜδΟΑΟ
тЬ2-12 1238 ΟΜΕΜΕΕδΕΕΟΕΕΚΕίνΡΜδΚΑδ
тЬ2-13 1239 КМЕМиЭЗЕЕЕШаЗМУРМТГСА
тЬ2-14 1240 1«БМЕЕ5ЕЕЕЕиа>МУРМАМА5
тЬ2-15 1241 ΚΜΕΜΕΕδΕΕΟΕΕΝΕίνΡΜδΙΕΧΚ
тЬ2-16 1242 ΚΜΕΜΙΕΐδ ΕΡΟΙΧΚΕΕνΡΜδΚΟ V
тО-17 1243 ΙΟΕΜΕΕδΕΕΕΕΟίΟίνΡίρΚΑΚ
тЬ2-18 1244 ΚΜΕΕΕΕ5ΕΕΕΕΕΚΓ>ΜνΡΜ5Ώ55
тЬ2-19 1245 ЯМЕМЬЕ$ЕЕЕУЕрЕ1УРЯАКОА
тЬ2-2О 1246 ΚΜΕΜΙΧ>5ΕΕΟΕΕΝΕΐνΡΜδΗΑΚ
тЬ2-21 1247 ΚΜΕΜΕΕδΕΕΕΙΧΚΠίνΡΜδΝΑΟ
тЕ2-22 1248 КМШ4Ер8ЕРЕЕЕКОМУР18КАС
тЕ2-23 1249 ΚΜΕΜΕΕ5 ΕΕΕΙΧΚΕΪ νΡΝδΤΑΑ
ПЛ2-24 1250 КМЕМЕрЗЕЕЕ ΕΕΚΕΙ νΡΙδΚΑΟ
тЬ2-25 1251 ΚΙΕΜΕΟδΕΕΕΕΕΝΕΕνΡΜδΚΑΚ
£-75 1252 ΗΗΟν/ΝΥΕΚΚαδΑΡΟν/ΓΕΑν/ν
тЫ5-соп! 1253 ρνΕ51-Ο0ΕΕΜΑνΕβ0ΚΕΑ5θΡ0Ο
т!Л5»1 1254 ΕΜΕΕΕΕδΕΡΕΕΕΚΕΚίνΡΚδΚΑν
тЕ15-2 1255 рАУ5Е<ЗНЕЕМ\УЕОдКЕА5аР<)11
тЫ5-3 1256 ОЕП5ЕООЕЕМ\УЕПрКЕА5СРОЕ
тЬ15-4 1257 РУА5Е<ЗОЬи5УиХ>КЕАОСРНА
тИ5-5 1258 ΕνΟΕΕΟΟΕΕΝλνΕΟΗΚΕΑδΟΡΕς)
т1Л5~б 1259 ΟνΕδΕΕΟΕΕΜννΕΟΗΟΕΑδΟΡΗΟ
тЫ5-7 1260 ОУГ>$Е<Э<УУЕЕМ^НКЕАЕСР<5У
тЫ 5-8 1261 аоЕ8Е<эн1хмигЕЕ<зкьАизрна
тШ-9 1262 0ΙΕΜΕΕ5ΕΟ3ΕΕΚΧ>ΜνΡΜ5ΝΑΓ
т1Л5-10 1263 ЕУ1>5Е0рЕЕМ9/Е1ХЗКЕА5ОР0А
тЫ5-11 1264 ΕηΕδΕΟΟΙΧΙΥΕΟΚΜΕδδΟΡΟν
тЬ15-12 1265 ΑΜίΧ^ΙΜΟΙΧΙλΜΙΛΗΚΕΑδΟΡρΑ
тЬ15-13 1266
тЫ5-14 1267 Ενν5ΙΛ3ΗΙΧΜλνΕΕΗΚΕΑδ<3ΡΕΧ3
ШЫ5-15 1268 ООЕ8ЕО<ЗЕЕМ1УЕ1Х}рЕА5СР<Эа
т!Л5-16 1269 СУЕ5Е00ИЛРИ>НМЕУ50РНО
тП5-17 1270 ΝνΕ5ΕΕΗΕΜΜ\νΏΕΚΕΕΑ5ΟΡΥΑ
тЫ5-18 1271 0УО8Е0рЕЕ1\УЕОНрЕА8СРКЯ
тЫ5-19 1272 ЕУЕЗиЗОЕЕМУ/ЕЕНКЕАООРОО
тЬ 15-20 1273 ΕνθδΕ00ΕΕΜ\ΥΕίΧ3ΚΕΑδΟΡΗΑ
тЕ 15-21 1274 ЕУ081ХгОЬ04^ЫХг<ЗЕА80РОК
тЫ5-22 1275 ОУЕрЕРОЕЕМУ/ЕЕрКЕАЗОРрК
тЫ5-23 1276 СЕШЕ<3(}ЕЕМЗУЕООРЕААСРОУ
тЬ 15-24 1277 АОСвЬОрЫ-МУ/ЕОЯКЕАХОРНУ
лг!Л5-25 1278 ΡνΟδΕΟΟΕΕίν/ΕϋΟΚΕΑδΟΡΟΟ
1,-17 1279 ЯАТШСОРЗУрЬУЕС ΥΟϋΝ
тЫ 7-соп1 1280 Ον/ΚΑΤΕΕΚΕΡν/ΟΕνΕΟΕΟΟΝΕν
тЫ7-соп2 1281 ОБКАТЕЕКЕРУ/ОЕУЕСЕСОКОА
πΕ17-1 1282 ОСЯАТЕЕТЕГЖЭЕУООШРКЕЛ
- 69 022424
тЫ7-2 1283 Ь АКАТЬЬКЕР\У ОЬУЕС ЬС ΕΚ УУ
тЬ17-3 1284 сзмупхкепуоьуусьсомот
шЫ7-4 1285 ОАЯАТЫКЕРЗУрЬУОАУООКМУ
тЬ17-5 1286 ЬГОКАОЬЫШРЛУ9ЬУООЬОУК5\У
т!Л7-6 1287 ОУКЕТХЬУЕЬХМУЬЬКОЬОАЫОО
т1.17-7 1288 рАХАТЬЬКЕРСрЬУСССЗСОКЬЗ
тЫ7-8 1289 ОЕКАТЕЕКЕРАГОЕУАСЕСГОЬГМК
тЫ7-9 1290 8СКАТ1ХКЕР1У<}ЬУ0СЬСЕУЯЛУ
тЫ7-1О 1291 ТМЯАТ1ХКЕРУ/ЬРУОО<2КЕМ<Ж
тЕ.17-11 1292 СЕЮЧТЬЕРГОРЖ?ЬУОС(ЗСОМТС
ШЫ7-12 1293 ОЕКЕТЬиСЕЕХУрЕУНСАУООКУА
тЫ7-13 1294 ССКАТЕЬКЕЬ^ЕЕЕСрСАМЕУ
тЬ17-14 1295 ТАКАТЫ-МЕЬУрЬУКСУОПКЬУ
тЫ7-15 1295 ОМКАТЪЕ<ЭЕРУ/рЕУССОСПТЧ\УМ
тЫ7-16 1297 ЗТКАТШОЬ^<5ЬМКСАУАЕОКС
тЫ7-17 1298 5ЕКАТЬЬКЕЬ\У0ЬУСС^СОМРС
ШЫ7-18 1299 УОКЛТЕЕКЕР\У<ЗЕУЕСЕУО<Э5К.
тЫ7-19 1300 Е1КАТЫ-КЕРЛУрЬУОЕ\УК.Е0РМ
тЫ7-2О 1301 ОЕКАТЬЬКЕРЬрЬУНСЕСЕТОЗ
тЫ7-21 1302 ТрКАТЬЬКЕРУ/рЫЕОЬООКНУ
тЕ 17-22 1303 НУКАТ1ХКЕПУ<2ЬУОСЬКЕ0аУ
ШЫ7-23 1304 ΡδΚνΤΕΕΚΕΡννΟΕνΕδΥΚΡίνΝ
тЫ7-24 1305 Ι^ΚΑΤΕΕΝΕΡ\νρΡνθΟΟΚηΚΚΜ
т!Л7-25 1306 ^ОЯАТЬЬМОРЗУНЬМЕЕЬЗОКРС
тЫ7-26 1307 ΟΕΚΑΤΕΕΚΕΡλνΚΜνΕΟΕΟΚΝΚΟ
тЫ7-27 1308 ЫЕКАТЕЕЯЕРТУ^ЕУССУСУКОК
Е-20 1309 УКЕМЗМЬЕОЬЬОУЬЕКЬСЗНУ
тЬ20-1 1310 НО1ШМ5М1АУЕШ>У11ХЗЬ&ОУ5
тЬ20-2 1311 Тф1ШМ5МЬ1Х»ЬЬБУ12Х}ЬКО(ЗК
тЬ20~3 13)2 ГЗМЖЗиЛУЕЕЕЕЕиЖЕСНрЯ
тЬ20-4 1313 М<?НЛМ5МЬУОЬУЕ1ЛЕ5ЬСН<31
тХ.20-5 1314 1УЪЯШМКМЬЕ5ЬРЕУЬОаЬК0<ЭУ
тЬ20-6 1315 ОУКОМЗМЬЕСЬЬАУШКЬСРрЬ
тЬ2О соп1 1316 ТрКОМ5МЕЕСЕЕЕУЕОК.ЕС0<?К
тЬ20 соп2 1317 \УУЩЭМ5МЬЕОЬЬЕУ1Д)1ШЗррК.
Ь-21 1318 НКЗЗОМИЗЕЫМЬУСЗММр
тЬ2Ь1 1319 Г9ШКрМ1Л5ВРММЬУС5М10С
тЬ21-2 1320 М0ТЗЮШЛ5ЕРММЬУС81МНС
тЬ21-3 1321 НОМ5ЯрМЬЬ5О1ХНЬУСТМ100
тЬ21-4 1322 ΜΕΝ5Κ<5ΝΙΧΚΕΐΙΜΙ.νθΝΜ5Η<3
п»Ь2Ь5 1323 рОТЗКНМЬЬЯЕРММЬУСЕМКХЗ
тЬ21 соп! 1324 ОрЖЖОМЬЬЗОЬМГОУСШКЗС
Е-24 1325 ΕΡΡΗν/ΕΗΝΗΚ5ΕνΝΗ\νΕΟΜΝ
ШЕ24-1 1326 ί4νρρ9\ννοκΗθκννγρν/ΕθϊΝν
тЬ24-2 1327 РОГ1Л}\УЬр1ЧНК5ЕУЕН\УЬУМОУ
- 70 022424
Таблица 24. Миостатин-ингибиторные пептиды
Название пептидного антитела Пептид
2х тТН8-Соп6- (Ν>ΙΚ М-43А0-АУУРС¥ЕСНПУС¥ОЬ- ОЗОЗАТООЗОЗТАЗЗОЗОЗАТС-УГУРСУЕСНРХУСУОи ЬЕ-50-РС {ЗЕфГОЬЮ: 1328)
2х тТТ48-Соп6- (С)-1К Р€-5С-АО-^¥РСУЕОНР5¥СУОЕ- ОЗОЗАТООЗОЗТАЗЗОЗОЗАТО- ^УРСУЕОНР^СУОЕ- ЕЕ (5Е0ШКО: 1329)
2х пТПЧ8-Соп7- (Ν>-1Κ м-сАО-шсскдужтзсУОР- ОЗСЗАТООЗОЗТАЗЗаЗСЗАТС-ШССК^АУОУОСУОРЬЕ-50-РС (8ΕΟΙΟΝΟ: 1330)
2х тТЙ8-Соп7- (СНК РС-5О-А0-1РСХЖ^УП)У0С¥0Р- С5С5АТОС5С5ТА5$0$С5АТС“1РССКиПУОУОСУОР- ίΕ (ЗЕОЮМО: 1331)
2х τηΤΝ8-€οη8- (Ν)-1Κ м-СА0-1Р0ск\утт>е¥0Р- О508АТССЗО5ТА55С5О5АТО-1РОСКЛУ^ОУОСУ0Р- ЕЕ-5С-РС (5Ε0Π3ΝΟ: 1332)
2х тТЫ8-Соп8~ <С)-1К рс-за-АочгасюутоУосУогС5С5АТО0508ТАЗЗСЗСЗАТС-ГРОСК%(Л¥НУйС¥ОРЕЕ (3Ε01ΟΝΟ: 1333)
2ΧπιΤΝ8-19-7 РС-5С-АО- ЕАОНС0С1К^Р1УМСРРЕСМ(ЕЕЕО5СЗАТОО5ОЗТАЗЗО 5СЗАТОЕАГ>Не0С!К^Р\УМСРРЕа\УЕ-ЕЕ (8Е<) ГО ΝΟ: 1334)
2ΧιηΤΝ8-19-7 5Т—СС4е12х ЬЕ ЕС-5О-А0- ЕАОН00С1К9/Р\УМСРРЕС\УЕО5О5АТОС5СССА55С5С 5АТСЕАОНСОС1К.1УРШ4СРРЕСЗ¥Е (ЗЕр ГО ΝΟ: 1335)
2Х ιηΤΝ8-ΐ9—21 РО5С-А0- 5Е¥ООЕСГК.%П»Ш4СРРО0АУ1С1ЕО5О5АТ0СЗО5ТАЗЗС 505АТО5Е¥ООЕСТК%Ф\УМСРРОО УГК -ЕЕ (5Е<) ГО N0:1336)
2Х τπΤΝ8-19-2) зт—оа <«2х ЬЕ РС-5С-АО- ЗЕУОСЗЕСТКЗУРШЛСРРООАУКОЗОЗАТССЗССОАЗЗСЗ 35АТС5ЕУ0ОЕСТК.\УР\УМСРР0С\УК (3ΕΟΙΟΝΟ: 1337)
- 71 022424
2Х γπΤΝ8-19-22 ЕС-5С-АО- ТР8р0НСТЯиг™СРР0С^СЕЕО8О5АТ0О5О5ТА55О 505АТОТР5(ХШСТЮУР¥¥МСРРОСЗУ<3 -Е Е (5ЕЦ ГО ΝΟ: 1338)
2ΧπίΓΝ8-19-32 РС-5С-АО- УАОНОНС1К\УР\УМСРРОО\¥ОЕЕС5С5АТСС505ТА55 С5О5АТОУАОНОНСТЯ\УРШМСРР0О^О-ЕЕ (8Ε<)Π>Ν0: 1339)
2Χ ιηΤΝ8~ 19-32 5Т—СО 4е12х ίΕ ЕС-50-А0- уапнонстк*т9/мсррос^сс505атоо5СООА5505 С5АТСУАОНСНСТЕ\УР\¥¥СРР0С9/С (5Ер ГО ΝΟ: 1340)
2Χ ΒΐΤΝδ-19-33 РС-5О-А0- РЕ500НСТК\УР\УМСРР0О\¥0ЕЕ05О5АТОО5О5ТА580 805АТ0РЕ50ОНСТК\УР\¥МСРР0О\УОЕЕ <5Е<3 ГО ΝΟ: 1341)
2Χ πίΓΝδ—19-33 5Τ—СО Йе12х ЕЕ РС—50—Αζ)— РЕ500НСТКА¥РЗУМСРР009/00505АТ005000А5505 05ЛТ0РЕ8<ХЗНСТК\УРШМСР ΡΟ<3\νθ (5Ε()1ΟΝΟ: 1342)
- 72 022424
Таблица 25. Пептидные последовательности антагонистов интегрина
Последовательность/структура 5Е<2 ГО ΝΟ:
СБСКС1ЭС1С 1344
с\уоосхуие 1345
САООЕААБС 1346
СЖГООБМС 1347
САООСАМС 1348
СЗАОООАЕС 1349
сросьи/ч/ьс 1350
ΝΟΚ 1351
С8Б 1352
кш 1353
ссаесраЕсрззс 1354
СИОКСУЗОСАОКС 1355
СЕ5С5Е5С 1356
С8Ь 1357
ΝΟ&ΑΗΑ 1358
СНСЖС 1359
С1ХЖГОСРС 1360
ССЗБУ&С 1361
ИЕХХБ 1362
ΚΤΟΕΟ51ΑΤΥΤΕ 1363
ΗΤΟΕΟ8ΕΪΠΎ 1364
КТОШ5ЕЯТ 1365
КТОЕОЗБК 1366
ООБОБЕКЕКЕТЕ 1367
СОЕНХЕКОБЕЗК 1368
КООЕНМЕК.Е0ЕА 1369
δδΟΕΗΑΕΚΚΒΥΟ 1370
ЯООЕКРЕ5ЕЕТА 1371
СХХКСОС 1372
8ТССРОО¥¥О^АЯСУ88АЕТТТЕУАТК 1373
5ΤΟΟΡηονΥϋνΑΚΚν88ΑΕΤΤΤΕνΑΤΚ 1374
δΕΟνΝΡδΕΑΕΥϋΜδΑΑΜΚΕΑδΝνΡΡδΗΚδΚ 1375
58С?РГтЭМЕАС¥ЕПЕТААМЕОЕЕ5Т1Н§5 5К 1376
5δΡδΕΥΤ9ΡΕνΝΥΕ5ΑΑΤΚΐΡ0ΕΕ1ΑδΗΡ5Κ 1377
δδΤΟννΟΕΕΟΑΕρΗΑΑΠΑΤΚΤδΙΡΡδΕΟΝδΚ 1378
ОУ¥ТККЕЕ1ЕСАККУ8ЕК 1379
кооох 1380
сксэохс 1381
САКЯБОАРС 1382
СР5КЫ)5РС 1383
СОСКСВСРС 1384
СЕСКСОСБС 1385
ΚΟΟΕΑΑΕδΑΡΡν 1386
- 73 022424
Таблица 26. Пептидные последовательности антагонистов селектина
Последовательность/структура 8Ε<2 Ш ΝΟ:
ΟΖΤλΥΟφΙΛνΟΕΜΚ Γ387-
ΟίΤλνΟΕΙΛνΚΙΜΝ 1388
ОУТАУРЕМУОММО 1389
ΟίτνΑουψΝΜΜΚ 1390
ОМПУНОЬ^ТЕМЗ 1391
ΟΥ5ΐνΗΟΙ2ΛΈΜΜ5 1392
ΕΙΤν/ΟφΕν/ΕνΜΝ 1393
Ην5\νΕφΙ-\νηΐΜΝ 1394
Н1ТШОфЕ\УК1МТ 1395
ΚΝΜ8\νΕΡ.ί\νΕΗΜΚ 1396
ΑΕλνΤλΥΟφΙΛνΗνΜΝΡΑΕδφ 1397
НКАЕ\УЬАЕ9/ЕфМ5Р 1398
Κ.ΚΕϋλνΕΑΕ\νΚ!Μ5ν 1399
ιτν/ϋΟΕ'νοΕΜΚ 1400
01-ПУООЕЖЭШК 1401
отУЕЮ^вьмк 1402
отуоОЕЛУОЬМК 1403
ΟφΝΚΥΤϋΕνΑΙφΝΚΝΕ 1404
ΑΕΝλνΑϋΝΕΡΝΝΚΚΝΝΕϋ 1405
ΚΚΝΝΚΤνντν/νΟΤΚΚΑΕΤΝΕ 1406
ΚΚΑΕΤΝΕΑΕΝλνΑϋ 1407
ϋφΧΚΥΤΟΕνΑΙφΝΚΧΕ _
ΑΕΝλνΑΠΟΕΡΝΝΚΧΝΧΕΟ 1409
Таблица 27. Винкулин-связывающие пептиды
Последовательность/структура 8Ε<2 Ш ΝΟ:
550МХУОМЕАОУЕПЬТААМШ1Х8Т1Н585К. 1410
55Ρ5ΕΥΤΟΡΕνΝΎΕδΑΑΤΚΙφΟΕΕΙΑ5ΚΡ5Κ 1411
55Τ6ν/νθΕΕθΑΕΟΚΑΑΟΑΤΧΤ51ΡΡ5ΕφΝ8Κ 1412
ОУУТККЕЫЕСАЖУБЕК. 1413
5ТООРООУУЕ«УАЯаУ88АЬТПгУАТК 1414
5ТСОРПОУУПЗУАККУ55АЬТТТЕУАТК 1415
5ΚανΝΓ5ΕνΐΎΟΜ5ΑΑΜΚΕΑ5ΝνΡΡ5ΚΚδΚ 1416
Таблица 28. Родственные ламинину пептидные последовательности
Таблица 29. ΝΘΓ-модулирующие пептиды
5Ε<5 Π) ΝΟ: Последовательность участка пептида продукта слияния Ес-пептида
1427 ТСУТЕУТЕЕ1УРМОРСУ<Ж5Р
1428 ГО^ШЭРРГУБОУРСЬМРРС
- 74 022424
1429 ΡΜΚΡΡΝΡλνΚ.ΙΛ'ΕΡΡρσν/ΎΥΟ
1430 ννΚΑΡΗΡΕΡίΑΡΡΗΡΗΕΡΡΡ
1431 Ρ5Υ11ΑΠΟΕΤΡ5Ν1ΟΚΥΜΙΛΥΕ
1432 νΝΓΡκνΡΕονΕΡ\νρ\ν5υ<χγ
1433 ΤλνΗΡΚΤΥΕΕΡΑΕΡΡΡνΡΕΑΡ
1434 λΥΗΡΟΤΡΥΙΟΟΟΡΟνγν/ΕΟΑΡ
1435 νλνΚΥΟΡΡΡΜΝΡΡΟδΤΥΡΙ-ΗΕ
1436 1УШН5КРЬОУ5НУ1УРРРАЕ>Р
1437 РЖ^МфРРШЬУШУРУ/ЫРРУ
1438 РУ5ЬЕ1УиШН8ЕРР9ТУТЕ1У
1439 <5ΡΜΕΙΧΚΡΓΝ5ΡΟΟ85ΗΗΡΙ,
1440 ΤΝνθ\νΐ5ΝΝλνΕΗΜΚ5ΡΡΤ£Ο
1441 ΡΝΕΚΡΥΟΜΟδ^ΡΡΡϋνΦνΡΥ
1442 \ν5ΗΤΕν/νΡ0νν/\νΚΡΡΝΗΡΥν
1443 1УСЕ1У1М>аОУНМНЁСР15Е5
1444 νΡλν£ΗΟΗσΐ_ΛνΕΠ50Ο\νΗ1Α
1445 ¥ЬНИД>РКе\У8МРРРСУ1ЕЬ
1446 1НОС\УРТЕЕОСУ\У9
1447 УМрСрРАЮОСРрМ
1448 К.ЬОСО¥5Е50СРТ1
1449 Р1Л}СЕ18ООАСРАР
1450 ктиеЕРзтзасрць
1451 ЮиЗСЕЕЗТОССРОЬ
1452 К1Х}СЕР5Т5ССР\УЕ
1453 ЮОСМ/ГГЕЕССРЖ?
1454 5РОСОЫР\УОНУЕ05СРСР
1455 ЗРПСОНР^СНКХРБСРОР
Таблица 30. ЛЬЬ-модулирующие пептиды
Последовательность/структура 8Е<2 Ю ΝΟ:
и’ССКЖЭ1Х1К25УУСОРЬЛ~¥· -1455—
ν’- л - ьроскшоьикр^усорь 1457
ьроск.¥цэилс9^усорь - л ЬРССЮ&ГОШКртГСОРЕ- л -ν’ 1458
V- л. ичзаимошко^усорь - л - ЬРССК\УОЕиКр\УУСОРЬ 145?
δΑΪΧΎΡηΐΕΤΚ3θν€ΤΈ5’ Л -V1 1460
V1- Л - 5АПС¥РП1ЬТК§О¥СТ§§ 1461
ЗАПСУГОЦЛКЗОУТЗЗ- л - 5АПС¥РО1ЬТК5ОУТ5Б - Λ -V* 1462
ν'- л - δΑϋϋΥΡΟίΕΤΚδϋντδδ - л - ЗАОСУРОШТКЗОУТЗЗ 1463
рнлсюутхтко^снсьл-у1 1464
V*- Л - РНОСК1¥ОЬЕТК01УУСНОЬ 1465
ЕНОСКХУОЕЦТКр^УСНОЕ- А РНОСКШОЕЕТКОАУУСНСЬ- Λ -V1 1466
V1- Л - РНОСК\¥Е>илК<ЖУСНбЕ - А - РНОСК\УО1ХТК0\УУСНСЬ 1467
- 75 022424
Таблица 31. ΤΑΙ.Ι.-1 ингибиторные пептидные антитела
Пептидное антитело 8Е<2 Ιϋ ΝΟ пептидного антитела Пептидная последовательность
ТАЕЕ-1-8-1-» 1468 МРОТСРРРР№ ЕСТНЛОСССС УЭКТНТСРРС РАРЕШЗОР5 УРЬРРРКРКО ΤΕΜΙδΚΤΡΕν ТСУУУОУ5НЕ ОРЕУКРМ№УУ ОСУБУНИАКТ ΚΡΚΕΕ0ΥΝ5Τ УЯУУЗУЕТУЬ НООТУШСКЕУ ΚΓΚνδΝΚΑυ ΑΡΙΕΚΤ15ΚΑ КООРКЕРЦУУ ТЬРРЗКОЕЪТ ΚΝΟνδυΤΟΙ,ν ΚΟΡΥΡδΟΙΑν Ε№Ε5ΝΟΟΡΕΝ ΝΎΚηΤΡνίΧ) δΟΟδΡΡΕΥδΚ ЫУОК5К.№00 С1ХУР5С8УМН ΕΑίΗΝΗΥΤΟΚ δίδίδροκ
ΤΑΙΧ-Ι-8-2-0 1469 М\УОАС№РРР№ ЕСЕКЕСОССС УЕЖТНТСРРС РАРЕ1ХССР8 νΡΙ,ΡΡΡΚΡΚΟ ΙΧΜΙδΚΤΡΕν ΤΓνννηνδΗΕ ΟΡΕνΚΡΝΧνγν ГХЗУЕУНЫАКТ ΚΡΚΕΕ0ΥΝ5Τ УЯУУЗУЬТУЕ ΗρΟΆΧΝαΚΕΥ ΚΟΚνδΝΚΑΕΡ ΑΡΙΕΚΤΙδΚΑ ΚΟ<2ΡΚΕΡ<?νΥ ТЕРР5ЯПЕЕТ ΚΝΟνδΕΚΧν ΚΟΓΥΡδϋΐΑν Ε№Ε5ΝΟζ>ΡΕΝ ΝΥΚΤΤΡΡνΕΗ 5ΟΟδΕΡΕΥ5Κ ЬТУСК5К\УО<? ОЫУР5С5УМН ΕΑΕΗΝΗΥΓΟΚ. 5Ε5ΕδΡΟΚ
ТАИ,-1-8-4-а 1470 МУРРСО1ХТК НСРЕАООССС УОКТНТСРРС РАРЕ1ХССР5 УРЬРРРКРКО ТЕМ15ЯТРЕУ ТСУУУОУБНЕ ОР£УКП4\УУУ ϋΟνενΗΝΑΚΤ ΚΡΚΕΕΟΥΝδΤ ТЯУУЗУЬТУЕ НОШУШСКЕ Υ КСКνδΝΚΑΕΡ ΑΡΙΕΚΤΙδΚΑ КСфРЯЕРОУУ ТЕРРЗКПЕЬТ ΚΝ<}ν5Ι,ΤίΧν ΚΟΡΥΡδϋΙΑν ΕλνΕ$ΝΟζ?ΡΕΝ ΝΥΚΤΤΡΡνί,Ο δοοδρρεγδκ ετνοκδκλνοφ очурзсхумн εαεηνηυτοκ
51.51.5РСК .
ТА1Х-Ы2-4- а 1471 МС5ЯСКУК№О УЬТКОСРННО СССОУОКТНТ СРРСРАРЕЕЕ ООРЗУРиРР КРКОТЕМ15Я ΤΡΕντσνννΟ У5НЕОРЕУКР Νν/ΥνΟΟνενΗ ΝΑΚΤΚΡΚΕΕΡ ΥΝδΤΥΚννδV ΙΧνί-ΗΟΟν/εΝ ακ,ΕΥκσκνδΝ καεραριεκτ ккаксорке р<эуутерр$я ΟΕΕΤΚΝ()νδΕ ТСЕУКСРУР8 О«АУЕ\УЕ5№3 ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡ ρνυΟδΟΟδΡΡ ΕΥδΚΕΤΛΌΚδ ΚννΟΟΟΝνΡδϋ δνΜΗΕΑΕΗΝΗ ΥΤ<5Κ8υ51_5Ρ ΟΚ
ΤΑ1Χ-)-12*3~ а 1472 МЬРОСКЗУОи. 1К<?№УСОРЕО СССОУОКТНТ СРРСРАРЕЕЕ οορ$νρυρρ кркотемкктреутсуууо узнеореукр РПУУУОСУЕУН ΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟ УЫ5Т¥ИУУ5У 1.ТУ1Л<}О№и4 ΟΚΕΥΚΟΚνδΝ ΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤ 15ΚΑΚΟ9ΡΚΕ ΡΟνΥΊΧΡΡδΚ ОЕЬТКМРУБЬ Τ(ΧνΚΟΡΥΡ5 ϋΙΑνΕ№Ε5ΝΟ ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡ РУШ5ОС5РР ΕΥδΚΕΤνΟΚδ Κ№<3φΟΝνΡ5Ο δΥΜΗΕΑΙΗΝΗ ΥΤ<3Κ5Ε5ί5ΡΟΚ
ТАЬЫ-12-5- а ' 1473 ΜδΑΟΟΥΡΟΗ. ТК8ОУСТ58О СССО νϋΚΤΗΤ СРРСР АРЕЕЬ СОРЗУИТРР КРКОТЕМ18Я ТРЕУТСУ ννϋ УЗНЕОРЕУКР РПУУУОСУЕУН ΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟ ΥΝδΤΥΚννδν ί.τνΐ-Η{}Ο№ΕΝ ΟΚΕΥΚϋΚνδΝ ΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤ 18КАКС0РЯЕ Р0УУТЕРР8Я ϋΕΕΤΚΝρνδΕΤϋΙ-νΚΟΡΥΡδ ΟΙΑνΕλΥΕδΝΟ ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡ ρνεοδοοδΕΡ υγδκυτνϋκδ κνοοοΝνρδο зумнеашын ΥΤφΚδΙΛΙΛΡ οκ
ТАЕЫ42-8- а 1474 МБООСМ УЕКЭЬ ΤΚΜΡίεδΝί,ΰ СОСО νΟΚΤΗΤ СРРСРАРЕ1Х ССР5УРЕРРР КРКОТЕМ18Я ΤΡΕνΤϋνννη νδΗΕϋΡΕνΚΡ РПУУУОСУЕУН ΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟ ΥΝδΤΥΚ,ννδν ΕΤνί,Η<)Ο№1,Ν σΚΕΥΚϋΚνδΝ ΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤ15КАКСОРКЕ РОУУТЕРР5К ΟΕΕΤΚΝΟνδε ТСЕУКСРУР5 О1АУЕ№Е514С ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡ РУИЙООЗРР ΕΥδΚΕΤνβΚδ Κν/ςΟΟΝνΡδϋ δνΜΗΕΑΕΗΝΗ γτςκδΕδυρ οκ
ТАЬЬ-М2-9- а 1475 ΜΟΕΝϋΚΥϋΕΕ ΤΥΚΕ№θςΡΝΟ СССОУОКТНТ СРРСРАРЕ1Х ΟΟΡδνηΧΡΡ ΚΡΚΟΤΕΜΙ5Κ ΤΡΕνΤΟνννϋ УЗНЕОРЕУКР ЬПУУУОСУЕУН ΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟ ΥΝδΤΥΚννδν εΤνΕΗΟΟν/ΕΝ αΚΕΥΚΟΚνδΝ ΚΑΟΡΑΡΙΕΚΤ ШКАКСОРЯЕ РОУУТЕРРЗК ΟΕΕΤΚΝΟνδΙ. ТСБУКСРУРЗ ΟΙΑνΕ№ΕδΝΟ ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡ ΡνίΟδΟΟδΡΕ ΕΥδΚΕΤνϋΚδ ΚΆΌΟΌΝνΡδΟ δνΜΗΕΑΕΗΝΗ γτοκδίδΐ^ρ οκ
ТАЕХ-1-12- 10-а 1476 ΜΡΗϋΟΚΥΟΕΕ ТКОМУСНСЬС СССОУОКТНТ СРРСРАРЕЕЕ ССР5УГЕРРР ΚΡΚΟΤΕΜΙ5Κ ТРЕУТСУУ УО УЗНЕОРЕУКР ЬПУУУОСУЕУИ ΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟ ΥΝδΤΥΚννδν ΕΤνίΗΟΟν/ΕΝ ΟΚΕΥΚϋΚΥδΝ ΚΑίΡΑΡΙΕΚΤ Ι5ΚΑΚΟΟΡΚΕ РОУУТЕРРЗК.
- 76 022424
ΟΕΕΤΚΝρνδΕ ΤίΧνΚΟΡΥΡδ ϋ1ΑνΕ\νΕ8ΝΟ <3ΡΕΝΝΥΚΪΤΡ руеозоозрр еузкхгупкз юусзоомурзс зумнеаппчн ΥΤ<)Κ3Ε3Ε5ΡΟΚ
ТАЕН-12- 11» 1477 МЮЧНСГ№ОИЕ 1Х0Р1СР5РС ССССУОКТНТ СРРСРАРЕ1Х ССР8УР1РРР КРКЛТЕМ13К ТРЕУТСУУУО У8НЕОРЕУКР Νν/ΥνΟΟνενΗ ΝΑΚΤΚΡΚΕΕ9 ΥΝδΤΥΚννδν ЕТУЬНООУ/ΕΝ ΟΚΕΥΚΟΚνδΝ ΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤ ΙδΚΑΚΟςΡΚΕ РЦУУТЬРРЗК ΟΕΕΤΚΝΟνδΙ. ТСЬУКОРУРЗ ΟΙΑνΕΆΈδΝΟ ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡ ΡνίΛδΟΟδΡΡ ЬУ8КХТУОК5 ΚΑνΟΟΌΝΥΡδΟ δνΜΗΕΑίΗΝΗ γττ^κδί-δίδΡ οκ
ΤΑΙΧ-1-12. 14-а 1478 ΜΑΝΟΓν/ΆΌδί ΤΚΚΝνΟΕΡΡΟ СССОУОКТНТ СРРСРАРЕ1Х ССРЗУРЕРРР ΚΡΚΒΤΕΜΙδΚ ТРЕУТСУУУО УЗНЕОРЕУКР Ν\νΥνΐΧϊνΕνΗ ΝΑΚΤΚΡΚΕΕ<3 ΥΝδΤΎΚννδν ίΤνΕΗ0Ο№ΕΝ αΚΕΥΚΟΚνδΝ καιραριεκτ бкакссзряе ΡρνΥΤΧΡΡδΚ Ι3ΕΕΤΚΝ0 νδΕ Τ(ΧνΚΟΡΥΡ5 ШАУЕХУЕЗМО φΡΕΝΝΥΚ,ΤΤΡ ΡνίΟδΟΟδΡΕ ΕΥδΚΕΤνϋΚδ Κν/ΟΟΟΝνΡδσ δνΜΗΕΑΕΗΝΗ ΥΤΟΚΕίδΙΕΡΟΚ
ταιχ-1* сопзспзиз 1479 мрноекжнх тк<э№Уенсьс сссауоктатсрреРАРЕи. осрзуреррр κρκοτι.Μίδκ треутсуууц узнеореукр ТФУУУООУЕУН ΝΑΚΤΚΡΚΕΕζ} ΥΝδΤΥΚννδν ΕΤνΕΗ0Ο\νίΝ ΟΚΕΥΚΟΚνδΝ ΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ5ΚΑΚΟζ?ΡΚΕ ΡΟνΥΤΙΡΡδΚ ϋΕΕΤΚΝΟνδΙ. ΤίΧνΚΟΡΥΡδ О1АУЕ№Е5ЫО ρΡΕΝΝΥΚΤΤΡ РУЦЭЗООЗРР Ι-ΥδΚΧΤνΟΚδ ЮУ00С14УР5С δνΜΗΕΑΕΗΝΗ УТОКЗЕЗЬвР ΟΚ
ΤΑΙΧ-1 12-3 (апйегп <йтег 1480 МБРССКЖЭ1Х 1КО1УУСОРЕО 5СЗАТСС5С5 ΤΑδδΟδΟδΑΤ НМ1.РССК№ОЬ ЫКОШУСОРЕ ОООООУОКТН тсррсраррь ЕООРЗУР1_РР РКРКОТЬМ18 КТРЕУТСУУУ ОУ5НЕОРЕУК РЪПУУУЦОУЕУ ΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ ΟΥΝδτγκννδ УЬТУЫКЗПУГЕ ΝΟΚΕΥΚΟΚΥδ ΝΚΑίΡΑΡΙΕΚ ΤΙδΚΑΚΟ<}ΡΚ. ЕРЦУУПРРЗ ΚΠΕΕΤΚΝΟνδ ЕТСЕУКСГУР 5МАУЕ№ЕЗМ Ο<?ΡΕΝΝΥΚΤΓ ρρνίϋδυοδΡ π,ΥδΚΕτνοκ δίονοοοΝνρδ сзумнеаеипч ΗΥΤΟΚδίδΕδ ΡΟΚ
ΤΑΙΧ-Ι сотетиз юпйет <Ктег 1481 МРНЕ>СК№О1Х ТК()№УСНСЕС 8С5АТСО5С8 ΤΑδδΟδΟδΑΤ НМРРГОСКЛУОЕ ЕГКОХУУСНОЕ ОООСОУОК'ГН ТСРРСРАРЕЕ ΕΟΟΡδνΓΙΡΡ ΡΚΡΚΟΤΕΜΙδ КТРЕУТСУУУ ονδΗΕϋΡΕνΚ ΡΝίνγνΟΟνΕΥ ΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ <3ΥΜ5ΤΥΚννδ УХГУЕН<5О№Е. ΝΟΚΕΥΚΟΚΥδ ΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚ ΤΙδΚΑΚΟΟΡΚ. ΕΡΟνΥΤΕΡΡδ ΚΟΕΕΤΚΝΟνδ ЕТСХУКСРУР 5О1АУЕ№Е8М Ο<?ΡΕΝΝΥΚΤΤ РРУ1Л55ОО8Р РЕУЗКЬТУОК ЗК№<50С14УР5 Ο5νΜΗΕΑ1_ΗΝ ΗΥΤΟΚ5Ε5Ε5 ΡΟΚ
- 77 022424
Таблица 32. ΑΝΟ-2 ингибиторные пептиды
ПЕПТИД 8Е<) ГО ΝΟ ПЕПТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ |
Соп4-44 1482 РЖОЕБСОАЛРАГСЕНМАЕУ
Соп4-40 1483 ТЪПрЕЕСЕАОРАТСОНМРСК
Соп4-4 1484 АУЕООАСЕАОРАТСЕНМАЕУ
Соп4-31 1485 ЦКЕОЕУСЕАОРАТСЕНМЕЦУ
Соп4-С5 1486 ААТ0ЕЕСЕАОРАТСЕНМРК5
Сог»4-42 1487 ЕВНРЕОСЕХУОРАТСЕНМРЦА
Соп4-35 1488 УРКОКЦСЕАОРАТСЕНМУУО
Соп4-43 1489 515НЕЕСЕАВРАТСЕНМ<ЗУО
Соп4^9 1490 АААОЕЕСЕАОРАТСЕНМСЯМ
Соп4-27 1491 ТАРООКСЕАОРАТСЕНМС5Т
Соп4-48 1492 СНЗфЕЕСОАВРАТСЕНМСТЗ
СОП4-46 1493 рНАОЕЕСЕЗУОРАТСОНМР51С
Соп4-41 1494 ЫУЯРЕКСЕХУОРАТСЕММРУЯ
Соп4 36 1495 К5<ЗОУЕСЫЗАТ)РадГГСЕНМРКМ
Соп4-34 1496 УКТрЕНСОАОРАТСЕНМЯЕА
Соп4-28 1497 ААСОЕССЭАОРАТСЕНМЕРМ
Соп4-39 1498 РУЫОЕОСБАОРАГСЕНМРРМ
Соп4-25 1499 ЯАРрЕЕ>СЕ\УОР\УТСАНМО1К
Соп4-50 1500 НСОЫМЕСЕАОРАТСЕНМРЯУ
Соп4-38 1501 РЯЬОЕЕСУАОРАТСЕНМРЕК
Соп4-29 1502 КТТ0ЕК.СЕАОРАТСЕНМЕ50
СОП4-47 1503 0Т5()Е[>СУАОРАТСЦНМУ58
Соп4-20 1504 ОУЮЯРСЕАОРАТСЕНЕЕСЕ
Соп4-45 1505 ААОрЕЕСААОРАТСПНМУСЬ
Соп4-3? 1506 ЕРС0ЕОСЕАОРАТСЕНМУК5
Соп4-33 1507 РМЫС)УЕСОА1>РАГСБНМРЯ5
АС2-Соп4 1508 РОА5НОСЕАОРАТСЕНМО5Т
Соп4-32 1509 КЗТрОЭСОАОРАТСЕНМУОР
Соп4-17 1510 ОРМ5ТС<ЗАЦРАТСЕНМ[Х)Е
Соп4-8 1511 5Т1СОМС£\УПРАГСАНМОУО
АС4-Соп4 1512 УЕССОССЕАОРАТСЯЕЕОСА
Соп4-1 1513 УЬССОСС<5АОРАТС5НЕЕ1ХЗ
Соп4-С1 1514 ТПС5МСЕАОРАТСАНМ0СС
Соп4-21 1515 ТКСК5УС0АЦРАТС5НМ05О
Соп4-С2 1516 ТТ1О5МС0АОРАТСАНМ0СС
Соп4-18 1517 АУНЕУУСЕАОРАТСЦНАОТР
Соп4-19 1518 УУдУОМСОАОРАТСКЛМЯЦО
Соп4-16 1519 АУСЗОТСЕАОРАТСАНЕУЕУ
Соп4-11 1520 ОСМКМРСЕАОРАТСАШУУК
Соп4-С4 1521 ТПОЗМСОАЦРАТСЕНМОСС
Соп4-23 1522 Т8рЯУССЕАОРАТСС)НЬТУТ
Соп4-15 1523 рАЗАРРСЕАОРАТСОТУАРЗ
Соп4-9 1524 СТ5Р5РСОАОРАТС5НМУОО
ТЫ8-Соп4* 1525 рЕЕСЕАОРАТСЕНМ
- 78 022424
Таблица 33. АNС-2 ингибиторные пептиды
ПЕПТИД 8Е<2 ГО ΝΟ ПЕПТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Е1-1 1526 φΝΥΚΡΕΟΕΙΧ>ΑΤΕΥΕΗΡΙΡΗΥΤ
П-2 1527 ΕΝΠΤίηΕΕΕΟΤΕΥΈΟ^νηΟΡδ
П-3 1528 1ХИЧРи>ЕЕЕрТЪУЕ(ЖШЗН<г
П-4 1529 νΚΕΚΡΕΟΑΙΈΟΏ-ΥΒΗ^ΜΕΟΟΑ
П-5 1530 УКУКРШЕЬПЕШУЕОРТРОЕК
1Л-7 1531 ΓΝΡΜΡΜϋΟΕΕρΚΕΥΕρΠΕΟΟΟ
П-9 1532 5К1етШЕШ)ТЬУЕ(ЖТЬрНА
пло 1533 рКРОРШЕЕЕОТЬУЕрРМЕООА
п-п 1534 ОЖКРМПЕЕЕОТЕУКРРЬРСНБ
ПЛ2 1535 ΥΚΡΤΡΕΟΟΕΕΟΤΧΥΕΟνΤΙΟΙίν
1Л-1Э 1536 рЕУЕРЬОЕШЕТЪУЫр1¥МРНОК
П-14 1537 КНРМРиЭЕЕЕОТЬУЕрРМЬОНО
ПЛЗ 1538 РКУРРЬПЕЕОКТЬУООРМЕООС
И-16 1539 СгКРОРиЗЕЬЕЕТЪУКО^УТЬООЯ
П-17 1540 УКУКРиЗЕШБ^ЕУНдРТШНр
П-18 1541 ОКРМРиЗЕЮЕЖУЕОРМРООЗ
П-19 1542 3ΤΡ0ΡΕΟΟΕΕΕΥΕΥΕ0\νΐΚΚΥΗ
П-20 1543 ЕОУМРЬОАЬОАОЕУЕОР1ПЛО
П-21 1544 НТРрР1ОЕЬЕЕТЕУУ<5^1-УО9Ь
Ы-22 1545 УКРМРМОЕЬЕОТЕУЕЕРЬРСЗНА
АС6-Е1 1546 П4УКРЕОЁЕОАТЬУЕН\¥1Е(2Н5
П-С1 1547 ОКРКРЬОЕЕЕОТЪУЕОЗУШЭОЯ
П-С2 1548 ТКРрРШЕЫХгТ1»УЕр1УТЕ09К
Ы-СЗ 1549 ГЫР<ЗРЬОЕЫХгТЬУЕр%ПГЕООЯ
п 1550 ΚΓΝΡΕΟΕΕΕΕΤ1ΎΕΟΡΤΡΟΟ
Таблица 34. АNС-2 ингибиторные пептиды
ПЕПТИД 8ЕЦ ГО ΝΟ ПЕПТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Сол 11 1551 Α0ΟΜΚΡΥΙΧ3ΜΕΟ\νΡΝΥθν<)Α
Соп1-2 1552 ОТХУППРСМИШОРХТПУККС!
Соп 1-3 1553 ΑΡθρΚΡΥΕ>ΟΜΕΟ\νΡΤΥρΚΐν
Соп1-4 1554 5СОЕЯРСЕЕ1РСССТОИЕАЬ
Соп1-5 1555 РОПККРЕЕСМРССР10ЕСРЯ
Соп1-6 1556 □ООЕЯРСЕПМРОССТКПЗУУО
Соп! 1557 ККРСЕЕ1РСССТУ()
Таблица 35. АNС-2 ингибиторные пептиды
ПЕПТИД 8Е<2 ГО ΝΟ ПЕПТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
12-9-1 1558 среуспомеорртросокот
12-9-2 1559 1О£УСЁЮМН)РРТ<}СС1Ж)8
12-9-3 1560 Ы5Е5УСЕОУЕОРРТРССЕКОК
12-9-4 1561 АСДОУСЕСМЕОРРТРОСЕМЗК
12-9-5 1562 ЕЕОУСЕСУрОРРТРССЕИП)
12-9-6 1563 НОЕУСЕСМЕОРРТРССЕУОС
12-9-7 1564 МЕОУСЕОМОйРРТРССОКОМ
12-9-С2 1565 ΕρΟΥΟΕΟνΕΟΡΕΤΡΟΟΕΝΟΚ.
12-9-С1 1566 ЕрПУСЕОУЕОРРТРССЕКОЯ
12-9 1567 ПЭУСЕОУЕОРРТРССОЫН
- 79 022424
Таблица 36. ΑΝΟ-2 связывающие пептиды
Таблица 37. ΑΝΟ-2 связывающие пептиды
Пептидное антитело 1 Последовательность пептидного антитела
и<М) МОАОКТПРЕОЕБЕЕТЕУЕОГГРОРЕЕОСОСО-Рс (8Ер Ю N0:1575)
ΕΙ (Ν)λνΤ М10Р№ШЕЕЕЕТЕУЕрРТТ<Х)ЬЕО<ЗО<ЗО-Рс (5Еф ГО N0:1576)
Ы(Ы) 1К\УТ МКРЫРЕОЕЕЕЕТЕУЕрГГР00ОЗС5АТСС5С5ТА55О5О5АТ НБЕООООО-Рс (5ЕС? ГО N0:1577)
2хБ1 (Ν) МОАрКГНРЕОЕЕЕЕТЕУЕрРТРООООООООООКЛЧПЮЕЕЕ ЕТЕУЕрГГРОрЬЕООООС-Рс (5Е0 Ю N0:1578)
2хЫ (Ν) \УТ МКЗПМР120ЕЕ№ТЕУЕрРТРОООСЮСО<ГОК™рЕОЕЕЕЕТЕУЕ ОРТРООЕЕООССО-Рс (5 ЕС? ГО N0.1579)
Соп4 (Ν) МС А00ЕЕСЕ¥ГОР9/ТСЕНМЕЕСлОООа-Рс <5Б(? ГО N0:1580)
Соп4 (Ν) 1Κ-\νΤ МОЕЕСЕ1¥ОР7УТСЕНМ08С5АТСС8С5ТА55С5С5АТНЕЕСС ОСС-Рс (5Е0 ГО N0:1581)
- 80 022424
2хСоп4 (Ν) ΙΚ МСА00ЕЕСЕАОРАТСЕНМО5О5АТОС5О5ТА55О5С5АТН ОЕЕСЕАЛРАТСЕНМЬЕООСОС-Рс (5ЕО ГО ΝΟ: 1582)
и (С) М-Рс-ССОСОА0КП4РЕПЕЕЕЕТЕУЕ0РТЕ00ЬЕ (5ЕС?10 N0:1583)
и (о1К М-Ро 00Ο00Α0Ο505ΑΤ<Χ5808ΤΑ85Ο5Ο5ΑΤΗΚΤΝΡΕβΕΕΕΕΤΕΥ ЕрРТРООЕЕ (8Е0 ГО N0:1584)
2хЫ (С) М-Рс- ΟΟΟΟΟΑΟΚΕΝΡΕϋΕΕΕΕΤΕΥΕΟΡΤΡΟΟαΟΟΟΟΟΟΟΚΓΝΡΕΟ ЕЕЕЕТЬУЕОРТРООЕЕ (5Εζ) ГО N0:1585)
Соп4 (С) М-Рс-ООООСАООЕЕСЕАОРАТСЕНМЕЕ (5Ер ГО ΝΟ: 1586)
Соп4 (С) 1К М-Рс- 0ООООА0С505АТСО5О5ТА58О5О5АТН0ЕЕСЕАОР№ТСЕ НМЕЕ (5Е0 ГО N0:1587)
2хСоп4 (С) ΙΚ М-Рс- 0ОСООА00ЕЕСЕАОРАТаШМ05С8АТСО5С!5ТА55С8С5 АТНОЕЕСЕАВР АТСЕНМЦЕ (5Е0 ГО ΝΟ: 1588)
Соп4-Б1 (Ν) МОАОЕЕСЕАОРАТСЕНМССССССССКРНРЕОЕЬЕЕТЕУЕО РТР00О8С5АТ0О5О8ТА55С5С8АТНЕЕООССС-Рс (5Е<3 ГО N0:1589)
Соп4-Ы (С) М-Рс- 0ОСССА0С5С8АТОО8О8ТА85О5О8АТНКРМРи>ЕЕЕЕТЕУ ЕОПТООСССОООЕКСЕАОРАТСЕНМЕЕ (5Е0 ГО N0:1590)
ΤΝ-12-9(Ν) ΜΟΑΟ-ΡΟΥΟΕΟνΕϋΡΡΤΡΟΟΟΝΗΕΕΧκϊΟΟΟ-Ρο (5Е0 ГО N0:1591)
С17(Ы) МОАО-ОУОСОСРЕУОСМГОиЕ-ООООО-Рс (5Ер ГО N0:1592)
ΤΝ8-8(Ν) ΜΟΑΟ-ΚΚΡΟΕΕΜΑΟΟΟΝΥΟυΕΟΟΟΟΟ-Ρο (5Е0 ГО N0:1593)
ΤΝ8-14 (Ν) МСА0-Н01СКАОР№ТС1СН№ЕЕСОССС-Рс (5Еф ГО N0:1594)
Соп1(Ν) МОА9-КЯРСЕЕ1РОССТУ<)ШЗСОСа-Рс (8Ер ГО N0:1595)
- 81 022424
Таблица 38. ΆΝΘ-2 связывающие пептиды
Соп4 образованные РЪ» (аффинное созревание) Последовательность пептидного антитела (8Еф II) ΝΟ:)
Соп4-44(С) М-ЕеЮО<ЮОАф-МКфЕЕСО\УОРУЛГЕНМУ/ЕУ-1 Е [5Εφ1ϋΝΟ: 1596)
Соп4-40{С) М-Рс-ООССОАО-ТИ1фЕЕСЕЗУИР\УТСОНМРСК.4.Е (5Еф ΙϋΝΟ: 1597)
Соп4-4 (С) Μ-Ρΰ-ΌσαΟαΑΟ-λνΥΕΟΟΑσΕννΟΡΧνΤϋΕΗΜΑΕν-ΕΕ (5Еф ГО N0:1598)
Соп4-31 (С) Μ-Ρε-ΟΟΟΟΟΑΟ-ΝΧΕφΕνεΕλνΟΡ^νΤϋΕΗΜΕΝν-Ι,Ε (ЗЕфЮИО: 1599)
СЗоп4-С5(С) М-Рс-С0С0СА0-ААТфЕЕСЕШ0РЧГГСЕНМРК8-ЕЕ (5ЕфЮИ0:1600)
Соп4-42 (С) М-РсЧ5ССССАф-1ЯН0ЕССЕ%?ОРМТСЕНМРО^-ЕЕ [5Εφ!ΟΝΟ: 1602)
Соп4-35 (С) М-Рс-ООСООАО-УРЯфКОСЕ^ОР^ТСЕНМУУО-ЕЁ [5Еф ГОИО: 1602)
Соп4-43(С) М-Рс-ОООООАф-518НЕЕСЕ9ШР\УТСЕНМфУО-1.Е (ЗЕфГОМО: 1603)
Зоп4-49(С) М.Рс-ОСССЮА0-\УААфЕЕСЕ9ГОР)УТСЕНМакМ-1.Е [5Еф ЮНО: 1604)
Соп4-27{С) Μ-Ρ€-<Χ30ίκ7Α0-Τ\νΡ<5ηΚ€Ε\νθΡ\ντσΕΗΜΟ5Τ-ΕΕ (8Е0 ГО N0:1605)
Соа4-48 (С) М-Рс^ООСАфХ»Н80ЕЕСС%?ОР1УГСЕНМСТ8-ЕБ (503 ГО N0:1606)
Соп4-46(С) М-Рс-ССССОАО-ОН\УОЕЕСЕУ/ОРиПГСОНМР5К-ЕЕ (5Ε<?ΙΟΝΟ:1607)
Соп4-41 (С) М-Рс-СООСОАО-НУКОЕКСЕУ/ОР\¥ТС£НМРУК-ЕЕ (ВЕфЮНО: 1608)
Соп4-36(С) М-РсЮО<ЮОАф-К$ОфУЕСЮУОР\УТСЕНМРК>Б1.Е (8Ε0ΙΟΝΟ 1609)
СоМ-34 (С) М-Рс-СССССАО-УКТОЕНСО^ОРУИ-СЕИМКЕ^ЕЕ (5Еф ГО N0: 1610)
Соя4-28 (С) Μ-Εε-ΟθαθθΑ0-Α\νθ0Ε(Χ:θν/ΟΡ\νΤ€ΕΗΜΕΡΜ-ΕΕ
- 82 022424
(ЗЕОИЖО: 1611)
Соп4-39 (С) М-Рс-ОаОССАО-РУКЭЕОСЕХУОРХУТСЕНМРРМ-ЕЕ (ЗЕО ГО N0:1612)
СОП4-25 (С) Μ-ΡсССΟΟΟΑ^4^ΛΡ^Ε^СΕV7^Ρ^V^СΑНΜ^ιΚ-^Ε (5Ε0Ι0ΝΟ: 1613)
Соп4-50 (С) М-Гс-ССОООА0-НО0ЧМЕСЕХУОР\УГСЕНМРКУ-ЬЕ (ЗЕО ГО N0: 1614)
Соп4-38 (С) М-Рс-СССССАО-РКХРЕЕСУХУОРУГТСЕНМРЬК-ЕЕ (ЗЕОГО N0:1615)
Соо4-29 (С) М-Рс-СССООАр-КТТ0ЕКСЕЧГОР\УТСЕНМЕ50-ЕЕ (5Ε0ΙΟΝΟ: 1616)
Соп4-47 (С) М-Рс-СССССАО-ОТЗРЕОСУХУОРХУТСПНМУЗЗ-ЕЕ (5Е0 ГО N0:1617)
Соп4-20 (С) М-Рс-СООООАО-ОУЮКРСЕХУОРХАГГСЕНЕЕОЬ-ЕЕ (5Ε0ΙΟΝΟ: 1618)
Соп4-45 (С) М-Рс-ОООСОАО-ХУАООЕЕСАХУОРХУТСОНМУСЬЕЕ (ЗЕОГО N0:1619)
Соп4-37 (С) М-Рс-ООООСА0-иРО0ЕОСЕ\УОР\УТСЕНМУЯ5-ЕЕ (ЗЕОГОИО: 1620)
Соп4-33 (С) М-Гс-СОССаА0-РМте0УЕСО\УОР\УТСЕНМРН5-ЕЕ (ЗЕОГО N0:1621)
АС2-Соп4(С) М-Рс-СООСОА0-РСХУЗНССЕХ¥ОРХУТСЕНМОЗТ-ЕЕ (ЗЕО ГО ΝΟ: 1622)
Соп4-32 (С) М-Рс-ОООСОА0-К5Т0ООСОХУОР\УТСЕНМУОР-ЕЕ (5Ε01ϋΝΟ: 1623)
Соп4-17 (С) М-Рс-ООООСА0-СРК15ТС0\УОРХУТСЕНМО0Е-ЕП (5ΕΟΠ5ΝΟ: 1624)
Соп4-8 (С) М-Рс-ОООСОАО-ЗТЮОМСЕУГОРЗУТСАНМОУО-ЕБ (5Ε01ΟΝΟ: 1625)
АС4-Соп4 (С) М-Рс-ОССССА0-УЕСС0ССЕ\УОР\УТСК1Х0С\У-ЕЕ (ЗЕО ГО ΝΟ: 1626)
Соп4-1 (С) М-Рс-СООООАО-УЕОСОССОХУОРЛТСЗНЕЕОО-ЕЕ (5Ε0ΪΟΝΟ: 1627)
Соп4-С1 (С) М-Рс-СССССА0ТТ105МСЕ\УОР\УТСАНМ0Са-ЕЕ (ЗЕО ИЗ ΝΟ: 1628)
Соп4-21 (С) М-Ре-СССОСАО-ТКОКЗУСОЗАГОРХУТСЗНМОЗО-ЕЕ (ЗЕО ГОРЮ; 1629)
Соп4-С2 (С) М-Рс-ССОООАО-ТТЮЗМСОХУОРМ/ТСАНМООО-ЕЕ
- 83 022424
(5Ер 1ΟΝΟ: 1630)
Соп4-18 (С) Μ-Ρε-αοα(5ΌΑΡ-\ννΝΕνν€Ε\νϋΡ\νΤ€·ΝΗ\νθΓΡ-ΕΕ (8ΕΟΙΟΝΟ: 1631)
СОП4-19 (С) М-Рс-ОСОООЛ<3*УУрУОМС<39/ОР\УТСКНМ1<ЕС)-ЕЕ (ЗЕрГОЫО: 1632)
Соп4-16(С) М-Рс-СС000А0-АУО50ТСЕ\УОР^УГСАНЕУЕУ-ЕЕ (5Ер ГО ΝΟ: 1633)
Соп4-11 (С) М-Гс-<ГОС0ОА0-9СМК]МРСЕ\УОР\УТСАН1УУК-1_Е (δΕΟΙΟΝΟ: 1634)
Соп4-С4 (С) М-Рс43СС»ША0-ТТ1С5МС01УОР*ТСЕНМ00С-ЕЕ (Ш}Ю14О: 1635)
Соп4-23 (С) М.Рс-СССК;ОА0-Т80КУССЕЛУОР5УТСрНЕТУТ-ЕЕ (ЗЕрИЖО: 1636)
Соп4-15(С) М-Рс-СССС0АЧ4г\У59УРРСЕУУЬр1ОС(ЗТУЗУР8-ЕЕ (5Ε0ΙΟΝΟ: 1637)
С0П4-9 (С) М-Рс-ОСОССА(}-<ЗТ5Р5РСС)\УОР\УГС5НМУС)О-1.Е (5ЕО ΙΟ ΝΟ: 1638)
Соп4-10(С) М.Рс-ССОССА0-Т0СЕН0СЕ1УОРУГГСКУЕ\?/РБ-ЕЕ (5Ε<3ΙΟΝΟ: 1639)
Сот»4-22(С) Μ-Εε-Τ1ΟθαθΑΟ-νλνΚ5ρν€0\νηΡ\νΤΟΝΕΟΟΟ\ν-ΕΕ (δΕΟΙϋΝΟ: 1640)
Соп4-3 (С) М-Рс-ООООСАО-ОЮЕЕЕСХЗУГВРЗУТСРРРУСА-ЕЕ (ЗЕрГОЫО: 1641)
Соп4-5 (С) Μ-Ρο-ΟΟΟΟΟΑΟ-ΑΤΤΑΚΟΟΟίνΟΡΙίνΤΟΑΕΟΟΝν-ΕΕ [3Ε()ΙϋΝΟ: 1642)
Соп4-30 (С) М-Ес-ОССООАО-СРА<}ЕЕСЕ5УОР\УТСЕР1.РЕМ-ЕЕ (δΕζ? Ю ΝΟ: 1643)
Соп4-2б (С) М-РсТЗСОООАО-КРЕОМС50\УОР\¥ТУ/НЕООУС-ЕЕ (5Ε01ΟΝΟ: 1644)
Соп4-7 (С) М-Рс-С(ЗСОСАр-Е’й/ОЕАУСд\УОР<)ТСПНМОАЕ-ЕЕ (5Е<Э П> ΝΟ: 1645)
Соп4-12(С) М-Рс-ООО0СА0-ТрЕУ8ЕСЕУ/ОР\УТСКЕ1Х>О\М-ЕЕ (3£<) И» ΝΟ: 1646)
Соп4-13 (С) М-Рс-СС5ОСХЗА0-МООАСЯСЕ>УОР\УГСрЕи501У-ЕЕ (БЕО ГО ΝΟ: 1647)
Соп4-14<С) М-Рс-ОСССОАр-МРЬРМЕС91УОР\УТС8МЕРЕА-ЕЕ (8Е<? ГО ΝΟ: 1648)
Соп4-2 (С) М-Рс-ОСОООА9-РО\У5НОСЕАУОР\УТСКЕЕОС\У-1.Е
- 84 022424
(5Е() ΙΟΝΟ: 1649)
Соп4-б (С) М-Рс-С0СССА0-ЗДР0ТЕСС0\УПР1УТСКиЛС1У-ЬЕ (δΕΟΙϋΝΟ: 1650)
Соп4-24 (С) М-Рс-ССЮСЮАО-РОТКООСО\УОР9ГГСаЬУОМ\У-ЕЕ (δΕΟΙϋΝΟ: 1651)
АС1-Сог>4 (С) М-Рс-ОООООА0-Т\УР0ОКСЕ9/ОР\УТСКЕЕ0<39/-ЬЕ (δΕΟΙϋΝΟ: 1652)
АСЗ-Соп4 (С) М-Рс-СССССАО-ОИЕЕЕСЕ^РАУТСЕЕЕОО^-ЕЕ (δΕΟΙϋΝΟ: 1653)
ЛС5-Соп4 (С) М-Ес-СООООАО-ААТ0ЕЕСЕ1УПРАУТСКЕЕ0С1У-ЕЕ (δΕΟΙΟΝΟ: 1654)
Ы образованные РЬ$ (аффинное созревание) Последовательность пептидного антитела (8Е0 Ιϋ ΝΟ:)
Ε1-7(Ν) ΜΟΑΟ-ΙΝΡΜΡΜϋϋΕΕΟΚΕΥΕΟΡΙΕΟΟΟ-ΕΕΟΟΟΟΟ-Ρο (δΕΟΙϋΝΟ: 1655)
АС6-И (Ν) ΜΟΑ0-ΤΝΥΚΡΕΟΕΕϋΑΤΕΥΕΗ\νΐΕ0Η5 ЕЕССССС-Рс (δΕΟΙϋΝΟ: 1656)
М-15 (Ν) ΜΟΑΟ-ΟΚΥΟΡΕϋΕΕϋΚΤΕΥϋΟΡΜΕΟΟΟ ЬЕООСОС Рс (δΕΟΙϋΝΟ: 1657)
П-2 (14) ΜΟΑΟ-ΕΝΡΤΡΕϋΕΕΕΟΤΕΥΕΟλΥΤΕΟΟδ ЕЕССССС-Рс (5Ε0 ГО N0; 1658)
и-ю(Ы) ΜΟΑΟ-ΟΚΚίΡΕϋΕΕΕΟΤΕΥΕΟΡΜΕΟΟΑ ЕЕССССС-Рс (8Е0 ГО ΝΟ: 1659)
0-13(14) ΜΟΑΟ-ΟΕΥΕΡΕϋΕΕϋΕΤΕΥΝΟΧνΜΡΗΟΚ ЬЕООООО-Рс (δΕΟΙϋΝΟ: 1660)
0-5(14) ΜΟΑΟ-νΚΥΚΡίϋΕΕϋΕΙΕΥΕΟΟΤΕΟΕΚ ЕЕССССС-Рс (δΕΟΙϋΝΟ: 1661)
и-сг (Ν) МС АО-ТКГОРЕОЕЕООТЕУЕО\УТЬООК ЕЕССССС-Рс (δΕΟΙϋΝΟ: 1662)
и-сэ (Ν) МСАО-ΊΓΝΡΟΡΕϋΕΕϋΟΤΕΥΕΟν/ΤΕΟΟΚ ЕЕССССС-Рс (δΕΟΙϋΝΟ: 1663)
и-п (14) ΜΟΑΟΟΝΤΚΡΜϋΕΕΕϋΤΕΥΚΟΓΕΡΟΗδ ЕЕООССО-Рс (δΕΟΙϋΝΟ: 1664)
П-17 (Ν) ΜΟΑΟ-νΚΥΚΡΕϋΕΕϋΕλνΕΥΗΟΡτΕΗΗΟ ЕЕССССС-Рс (δΕΟ Ιϋ ΝΟ: 1665)
П-12 04) ΜΟΑΟ-ΥΚΚΓΡΕϋϋΕΕΟΤΕΥΕΟνντΕΟΗν ЕЕССССС-Рс (δΕΟΙϋΝΟ: 1666)
и-ι (Ν) ΜΟΑΟ-ΟΝΥΚΡΕϋΕΕϋΑΤΕ,ΥΕΗΡΙΡΗΥΤ ЕЕССССС-Рс
- 85 022424
(δΕφΙΟΝΟ; 1667)
Μ-4(Ν) Μ0Α0-νΚΡΚΡΕϋΑΕΕ0ΤΕΥΕΗΨΜΡ(Χ?Α ЕЕОСССС-Рс (5Е<?Ю140: 1668)
ί1-2Ο (Ν) ΜΟΑΟ-ΕϋΥΜΡΕΟΑΕΟΑΟΕΥΕρΠΕΕΗΟ ЕЕССООО-Рс (5Е(? ГОРЮ: 1669)
Ы-22 (Ν) ΜΟΑ(?-ΥΚΡΝΡΜΟΡ.ΕΕ(?ΤΕΥΕΕΡΕΡ(?ΗΑ ЕЕОСССО-Рс (5Ε01ΒΝΟ: 1670)
υ-14(Ν) 40Α0-5ΝΡΜΡΕΟΕΕΕ()ΤΕΥΕ9ΡΜΕ0Η9 ЕБССССС-Рс (ЗЕ<? ГО ΝΟ: 1671)
1.1-16 (Ν) МСАр-0КРрРШЕЕЕЕТЕУ1«31тхугК ЬЕОСООО-Рс (δΕρίϋΝΟ: 1672)
Ε1-18 (Ы) МСАО-ОКРМРЬОЕЕОЕЩУЕрРМРООЗ ЬЕСОООО-Рс [8Ε01ΟΝΟ: 1673)
Б1-3 (Ν) ΜΟΑΟ-ΤΚΡΝΡΙ.ΟΕΕΕ()Τ1.ΥΕΟ\νΤΕΡΗΟ ίΕΟΟΟΟΟ-Ρο (8ЕО ГОРЮ: 1674)
Щ-21 (Ν) ΜΟΑΟ-ΗΤΡΟΡΕϋΕΕΕΕΤΕΥΥΟΑνΕΥΟρΕ ίΕΟΟΟΟΟ-Ρς (5Б<?ГОРЮ: 1675)
и-οι (Ν) ΜΟΑΟ-ΟΚΡΚΡΕΟΕΕΕρΤΕΥΕςίΥΪΙΧΧϊΚ ЕЕОСССС-Рс (5Е<? ГО N0: 1676)
ί.1-19(Ν) ΜΟΑΟ-ΟΤΡΟΡΕΟΟΙΈΕΥΕΥΕΟίνίΡΚΥΗ ЕЕСОООС-Рс (5Е(? ИЗ ΝΟ; 1677)
Μ-9(Ν) ΜθΑ0-5ΚΡΚ.ΡΕΟΕΕΕ<?ΤΕΥΕ(}\νΤΕΡΗΑ ЕЕОСССС-Рс (5Ε0ΙΟΝΟ. 1678)
Соп4 образованные РЬ$ (аффинное , созоевание) Последовательность пептидного антитела (5Е<? ГО ΝΟ:)
Соп 1-4 (С) М-Рс-ООССОА0-5С0ЕКРСЕИРСССТ01ЧЕАЕ-ЕЕ (8Е<3 ГО ΝΟ: 1679)
Соп1-1 (С) Μ-Ρε-ΟΟΟΟΟΑΟ-ΑΟΟΜΚΡΥΊΧ/ΜΕΟννΡΝΥΟνΟΑ-ΕΕ (5Е<Э ГО ПО: 1680)
Соп 1-6 (С) М-Рс-СОООСАО-ОООЕКРСЕОМРСССТКО\УУО-ЕЕ (5Е(? ГО ΝΟ: 1681)
Соп 1-3 (С) М-Рс-ССООСАО-АРСрКРУОСМЕС\УРТУр1иУ-ЕЕ [5Е<? ГО ΝΟ: 1682)
Соп 1-2 (С) М-Рс-СССССАО-ОТПАГООРСМНГОСРУТ^ККа-ЕЕ [5Ер ГО ΝΟ: 1683)
Соп 1-5 (С) М-Ре-ССССОАО-РСОКЯРЕЕСМРСОРКЗЕСРП-ЕЁ (8Е<3 ΙΟ ΝΟ: 1684)
Исходное: Соп! (С) М-Рс-ОООСОАр-ККРСЕЕ1РСОСТУО-ЕЕ
- 86 022424
12-9 образованные РЬ$ (аффинное созревание)
12-9-3 (С)
12-9-7(С)
12-9-6(0
12-9-С2(О
12-9-5(0
12-9-1 (О
12-9-4 (О
Последовательность пептидного антитела ..... (5Е<? ΙΡ ΝΟ:)_
М-Рс-ССССОА<Э-ЕОЕ\¥СЕСУБПРПТССЕКрК.-ЕЕ (5Ер ГО ΝΟ: 1686)
М-Рс-СССССАО-МШУСЕОМООРГТТОСОКрМ-ЕЕ (5ЕОГОМО; 1687) ' М-Рс-СССССАО-НРЕУСЕСМЕПРРТРССЕУОСТЁ (δΒΟΙΠΝΟ; 1688) ’ М-Рс-ШСКЮА<Э-игОУСЕСУЕЮРЙ1РССЕ1ЧрК-ЁЁ (8Е<ЗШМО: 1689) ‘ М-Рс-СССООА<5-Ь1ЛЭУСЕСУ0ОРРТРССЕНЕ1Э-ЬЕ [5Е0 1ΟΝΟ: 1690)
М-Рс-ОСОССАО-СРЕУСОСМЕОРРТРОСОКОТ-ЬЕ (5Е<3 ГОЫО. 1691) ' М-Рс-СССССАО-АОПУСЕСМЕОРРТРССЕМОК-иЕ (ЗЕРЮЫО: 1692) ' М-Рс-СЮССЮАО-ЬРОУСЕОУЕПРРТРОСЕКрк.-1 Е (5Ε<?ΙϋΝΟ: 1693) “ М-Рс-СС<ЮОА0-К^Е¥СОамШРРТ0ССО1905-ЬЕ (5ЕС? ГО ΝΟ: 1694)
12-9-С 1 (О
12-9-2(0
Помимо ТМР соединений, представленных в табл. 6, изобретение включает различные другие ТМР соединения. В одном аспекте ТМР соединения имеют следующую общую структуру:
ТМР!- (Ь1)п-ТМР2, где ТМР! и ТМР2, каждый независимо, выбирают из группы соединений, содержащих основную структуру:
Χ2-Χ3-Χ4-Χ5-Χ6-Χ7-Χ8-Χ9-Χ10, где
Х2 выбирают из группы, состоящей из О1и, Акр, Ьук и Vа1;
Х3 выбирают из группы, состоящей из О1у и А1а;
Х4 обозначает Рго;
Х5 выбирают из группы, состоящей из ТЬг и δе^;
Х6 выбирают из группы, состоящей из Ьеи, Не, Vа1, А1а и РЬе;
Х7 выбирают из группы, состоящей из Агд и Ьук;
Х8 выбирают из группы, состоящей из О1п, Акп и О1и;
Х9 выбирают из группы, состоящей из Тгр, Туг и РЬе;
Х10 выбирают из группы, состоящей из Ьеи, Не, Vа1, А1а, РЬе, Ме! и Ьук;
Ц обозначает линкер по данному описанию и п обозначает 0 или 1; и их физиологически приемлемые соли.
В одном варианте изобретения содержит (О1у)п, где п обозначает от 1 до 20, и когда п больше 1, вплоть до половины остатков О1у могут быть заменены на другую аминокислоту, выбранную из остальных 19 природных аминокислот, или на её стереоизомер.
Помимо основной (коровой) структуры Х2-Х10, представленной выше для ТМР1 и ТМР2, также возможны другие родственные структуры, в которых к основной структуре ТМР1 и/или ТМР2 добавляют один или более нижеприведённых фрагментов: Х1 присоединяют к Ν-концу и/или Х11, Х12, Х13 и/или Х14 присоединяют к С-концу, где Х1, Х11, Х12, Х13 и Х14 имеют следующие значения:
XI выбирают из группы, состоящей из Не, А1а, Vа1, Ьеи, δυϊ' и Агд;
XII выбирают из группы, состоящей из А1а, Не, Vа1, Ьеи, РЬе, δе^, ТЬг, Ьук, Н1к и О1и;
Х12 выбирают из группы, состоящей из А1а, Не, Vа1, Ьеи, РЬе, О1у, δυϊ' и О1п;
Х13 выбирают из группы, состоящей из Агд, Ьук, ТЬг, Vа1, Акп, О1п и О1у; и
Х14 выбирают из группы, состоящей из А1а, Не, Vа1, Ьеи, РЬе, ТЬг, Агд, О1и и О1у.
ТМР соединения по изобретению состоят из, т.е. содержат по меньшей мере 9 субъединиц (Х2-Х10), где Х2-Х10 представляют основную (коровую) структуру.
Субъединицы Х2-Х14 представляют собой аминокислоты, независимо выбранные из 20 природных аминокислот, однако изобретение охватывает соединения, в которых Х2-Х14 независимо выбирают из группы атипических, неприродных аминокислот, общеизвестных в уровне техники. Например, Х2 может обозначать О1и, Акр, Ьук или Vа1. В данном описании употребляются как трехбуквенные, так и однобуквенные сокращения аминокислот; в каждом случае сокращения являются стандартными, применяемыми для 20 природных аминокислот или общеизвестных их вариантов. Эти аминокислоты могут иметь стереохимию либо Ь, либо Ό (за исключением О1у, который ни Ь, ни Ό), а ТМР (так же, как все другие соединения по изобретению) могут содержать комбинацию стереоизомеров (стереохимия). Изобретение
- 87 022424 также включает обратные ТМР молекулы (а также все другие пептиды, раскрываемые в данном описании), в которых аминоконцевая последовательность является обращенной по отношению к карбоксиконцевой последовательности аминокислот. Например, обратной для молекулы, имеющей нормальную последовательность Х1-Х2-Х3, будет последовательность Х3-Х2-Х1. Изобретение также включает ретрообратные ТМР молекулы (а также все другие молекулы по изобретению, представленные в данном описании), в которых, как в обратных ТМР, аминоконцевая последовательность аминокислот является обращенной по отношению к карбоксиконцевой последовательности, а остатки, которые обычно являются Ь энантиомерами в ТМР, меняют свою стереоизомерную форму на Ό.
Следовательно, типичные ТМР соединения по изобретению включают, без ограничения, следующие соединения:
1ЕОРТЕКр^'ЕААРА-ОРЖ}4ЕСРТЕК()\УЕААКА (8Ер. ГО N0: 993)
1ЕОРТЬК.0СЬААКА-ОООООООО-1ЕОРТЬК.0СЬААКА (циклический) |_| (8Е0. ГО ΝΟ: 994)
1ЕОРТЕК0СЕААКА-ОООООООО-1ЕОРТЬК0СЕААКА (линейный) (8Е0. ГО N0: 995)
1ЕОРТЕК0АЬААКА-ООСООООО-1ЕОРТЬК0АЕААКА (8Е0. ГО N0: 996)
ΙΕΟΡΤΕΚ.0ΨΕΑΑΚΑ-ΟΟΟΚΟΟΟΟ-ΙΕΟΡΤΕΚ0ΨΕΑΑΚΑ (8Е(). ГО ΝΟ: 997) 1ЕОРТЪК0\\ГОААКА-ОООК(ВгАс)ОООО-1ЕОРТЕКО\УЬААКА (8Е0. ΙϋΝΟ: 998)
ΙΕ0ΡΤΕΚρψΕΑΑΚΑ-0(?ι0ίΧΐ60(ϊ4Ε0ΡΤΕΡ.(4)\νΕΑΑΚΑ (δΕζ). ГО N0: 999) 1ЕОРТЬК.р\УЕААКА-ОООК(РЕО)ОООО-1ЕОРТЕК.0\¥ЕААКА (5Е<3.
1ЕОРТЬК0\УЕААКА-ОООС(РЕО)ОООО-1ЕОРТЫ<0\УЕААКА (8Е0.
ΙΕΟΡΤΕΚ.0ΨΕΑΑΚΑ-ΟΟΟΝΟ8ΟΟ-ΙΕΟΡΤΕΚ0ΨΕΑΑΚΑ (8Е<}.
Π3Ν0: 1000)
ΙϋΝΟ: 1001) ΙϋΝΟ: 1002)
1ЕОРТЬК.0\УЬААКА-ОООССООО-1ЕСРТЬК0АУЬААКА
1ЕСРТЬК0АУЬААКА-ОООСССОС-1ЕОРТЫ<0^ЕААКА (ЗЕ<). ГО ΝΟ: 1003) (8Е0. ΙϋΝΟ: 1004) (8Εζ). ГОЖ): 1005) (8Е0. ГО ΝΟ: 1006)
1ЕОРТЫ<0\УЬААКА-ООССССОО-1ЕОРТЕК0\УЕААКА
Γϋ-ΙΕΟΡΤΕ1<ρ\ν’ΕΑΑΚΑ-ΟΡΝ(}-ΙΕΟΡΊΤΚ0\νΕΑΑΚΑ
Ρο-ΙΕΟΡΤΕΚΟλνΕΑΑΚΑ-ΟΡΝΟ-ΙΕΟΡΤΕΚΟΑνΕΑΑΚΑ-Ρο
1ЕОРТЬК0\УЕААБ1А-ОООООООО-1ЕОРТЕК0^ЕААКА-Рс (5Е(). ГО ΝΟ: 1007)
Ρο-ΟΟ-ΙΕΟΡΤΕΚΟΨΕΑΑΚΑ-ΟΡΝΟ-ΙΕΟΡΤΕΚΟΑνΕΑΑίΙΑ (8Е(). ГО ΝΟ: 1008)
Рс4ЕОРТЕК0АУЕААКА-ОООООООО-1ЕОРТЕК0\УЕААКА (5К(). ГО ΝΟ: 1009)
Рс-1ЕОРТЕК0СЕААКА-ОООООООО-1ЕОРТЕКрСЬААКА (циклический) |_I (8Е0. ГО ΝΟ: 1010)
РсЛЕСРТЕКрСЕААКА-ССССОООСНЕОРТЕКрСЕААИА (линейный) (3Εζ). ΙϋΝΟ: 1011)
Рс-1ЕОРТЕК0АЕААКА-ОООООООО-1ЕОРТЬК.0АЕААКА (8Е(У ΙΟ ΝΟ: 1012) Ес-1ЕСРТЕК0\УЕААКА-ОСОКСССС1-1ЕОРТЕК0'Л'ЕААКА (8Е(у II) ΝΟ: 1013) Рс-1ЕОРТЕК0АУЕААКА-еСОСОООО-1ЕОРТЕК.0А¥ЕААКА (8К(). ГО ΝΟ: 1014) Ρε-ΙΕΟΡΤΕΚΟννΈΑΑΚΑ-ΟϋΟΝΟ3Ο(ϊ-ΙΕΟΡΤΕΚ0\νΕΑАРА (8Е(). ΙΓ)ΝΟ: 1015)
Рс-1ЕОРТЕКОАУЕААКА-ОООСОООО-1ЕОРТЕКрАУЕААКА
I
Рс4ЕОРТЕКр\\ЪАА1ЕА-ОООСОСОО-1ЕОРТЕК.9АУЕААКА (8ЕЦ. ГО ΝΟ: 1016)
Рс-ООООО-1ЕОРТЕКрАУЕААКА-СООООООО-1ЕОРТЕК<3\УЕААКА (8ЕЦ. ΙΟΝΟ: 1017)
- 88 022424
Производные
Изобретение также рассматривает дериватизацию пептидного участка и/или участка носителя (как обсуждается ниже) соединений. Такие производные могут повысить растворимость, всасывание, биологический период полужизни соединений и т.п. Эти фрагменты могут либо устранять, либо ослаблять нежелательное побочное действие соединений и т.п. Типичные производные включают соединения, в которых:
1) Соединение или некоторый его участок является циклическим. Например, пептидную часть можно модифицировать таким образом, чтобы она содержала два или более Су§ остатков (например, в линкере), которые могут циклизоваться за счёт образования дисульфидной связи. Ссылки на материалы по получению циклических производных см. в табл. 2.
2) Молекулы в соединении перекрёстно связаны (сшиты) или молекулам соединения придают способность перекрёстно связываться (сшиваться) между собой. Например, пептидную часть можно модифицировать таким образом, чтобы она содержала один остаток Су§ и поэтому стала способна образовывать межмолекулярную дисульфидную связь с подобной молекулой. Соединение может также сшиваться по С-концу, как в изображённой ниже молекуле.
3) Одно или более пептидильных [-С(О)ЫК-] звеньев (связей) заменено на непептидильное звено. Примеры непептидильных звеньев включают -СН2-карбамат [-СН2-ОС(О)ЫК-], фосфонат, -СН2сульфонамид |-С11:-δ(Ο)2ΝΗ-|. мочевину [-ЫНС(О)ЫН-], -СН2-вторичный амин и алкилированный пептид [-С(О)ЫК6-, где К6 обозначает низший алкил].
4) Ν-конец дериватизирован. Обычно Ν-конец может быть ацилирован или модифицирован в замещённый амин. Типичные группы для дериватизации по Ν-концу включают -ΝΚΚ1 (отличные от -ΝΗ2), -ЫКС(О)К1, -ЫКС(О)ОК1, -ЫК5(О)2К1, -ЫНС(О)ЫНК1, сукцинимид или бензилоксикарбонил- ΝΗ-^ΒΖΝΗ-), где К и К1, каждый независимо, обозначают водород или низший алкил и где фенильное кольцо может содержать от 1 до 3 заместителей, выбранных из группы, состоящей из С1-С4-алкил, С1-С4алкокси, хлора и брома.
5) Свободный С-конец дериватизирован. Обычно С-конец этерифицирован или амидирован. Например, можно применять методы, описанные в уровне техники, для присоединения (ЫН-СН2-СН2-ЫН2)2 к соединениям по данному изобретению. Аналогично, можно применять методы, описанные в уровне техники, для присоединения -ΝΉ2 к соединениям по изобретению. Типичные группы для дериватизации по С-концу включают, например, -С(О)К2, где К2 обозначает низший алкокси или -ΝΚ3Κ4, где К3 и К4, независимо, обозначают водород или С1-С8-алкил (предпочтительно, С1-С4-алкил).
6) Дисульфидная связь замещена на другой, предпочтительно, более устойчивый, сшивающий фрагмент (например, алкилен). См., например, ВЬа!падаг е! а1. (1996), I. Мей. СЬет. 39: 3814-9; А1Ьег!§ е! а1. (1993) ТЬШеепШ Ат. Рер. δутр., 357-9.
7) Один или более отдельных аминокислотных остатков модифицирован. Известно, что различные дериватизирующие агенты реагируют с конкретно выбранными боковыми цепями или концевыми остатками, как подробнее описано ниже.
8) Для связывания белков обычно используют гетеробифункциональные полимеры. Примером является δΜίΑλ или сукцинимидил-4-(Ы-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат. ΝΙΙδ (Νгидроксисукцинимидный) конец реагирует с первичными аминами, что является оптимальным при рН ~7. После образования комплекса может протекать реакция малеимидного (малеинимидного) участка δΜί,Α с другим белком/пептидом, содержащим свободную сульфгидрильную группу, идущую со значительно более высокими скоростями, чем первичная реакция образования амида. В результате образуется связь между двумя белками, например, образуются конъюгаты антитело-фермент. Применение иллюстрируется получением сшитых фрагментов РаЬ' с пероксидазой хрена (Ыика\уа е!. а1., 1983а,Ь; УозЬЬаке е! а1., 1982а,Ь; 1таца\уа е! а1., 1982; И!о е! а1., 1991). Применение δυϊίο (Сульфо) δΜί,Α (Сульфосукцинимидил- 4-(Ы-малеидометил)циклогексан-1-карбоксилата) содействует растворимости в воде, так что не требуется стадия солюбилизации, что способствует большей гибкости и менее серьёзного нарушения активности в реакции с белками.
Лизиновые остатки и аминоконцевые остатки могут реагировать с ангидридами янтарной и других карбоновых кислот, при этом заряд лизиновых остатков меняется на противоположный. Другие подходящие реагенты для дериватизации остатков, содержащих альфа-аминогруппу, включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфокислоту; О-метилизомочевину; 2,4-пентандион и катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксилатом.
Аргинильные остатки можно модифицировать по реакции с любым из или комбинацией нескольких обычных реагентов, включая фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Для
- 89 022424 дериватизации аргинильных остатков требуется проводить реакцию в щелочной среде вследствие высокой рКа гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, эти реагенты могут реагировать с группами лизина, а также с ипсилон-аминогруппой аргинина.
Проводились тщательные исследования специфической дериватизации тирозильных остатков, при этом особый интерес вызывает введение спектральных меток в тирозильные остатки по реакции с ароматическими диазониевыми соединениями или тетранитрометаном. Чаще всего для образования Оацетилтирозильных фрагментов и 3-нитропроизводных применяют Ν-ацетилимидазол и тетранитрометан соответственно.
Карбоксильные группы в боковых цепях (аспартильный или глутамильный остатки) можно селективно модифицировать по реакции с карбодиимидами (Κ'-Ν^=Ν-Κ'), такими как 1-циклогексил-3-(2морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, аспартильный и глутамильный остатки можно превратить в аспарагиниловый и глутаминиловый остатки по реакции с ионами аммония.
Глутаминиловый и аспарагиниловый остатки можно деамидировать в соответствующие глутамиловый и аспартиловый остатки. Или же, эти остатки деамидируют в слабокислой среде. Любая форма этих остатков входит в объём данного изобретения.
Цистеинильные остатки можно заменить на аминокислотные остатки или другие фрагменты либо для того, чтобы исключить дисульфидное связывание, либо наоборот, для стабилизации сшивания (перекрёстного связывания). См., например, ВЬа!падаг е! а1. (1996), 1. МеД. СЬет. 39: 3814-9.
Дериватизацию бифункциональными агентами применяют для сшивания (перекрёстного связывания) пептидов или их функциональных производных с не растворимой в воде матрицей-носителем или с макромолекулярными носителями. Обычные сшивающие агенты включают, например, 1,1бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, Ν-гидроксисукцинимидные эфиры, например эфиры 4азидосалициловой кислоты, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат) и бифункциональные малеимиды, такие как бисМмалеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, дают фотоактивируемые интермедиаты, способные сшиваться (перекрёстно связываться) под действием света. Или же реактивные нерастворимые в воде матрицы, такие как активированные цианогенбромидом углеводы или реактивные субстраты, описанные в патентах США № 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440, применяются для иммобилизации белка.
Углеводные (олигосахаридные) группы удобно связывать с сайтами, известными как сайты гликозилирования в белках. Обычно О-связанные олигосахариды связываются с остатками серина (8ет) или треонина (ТЬг), тогда как Ν-связанные олигосахариды связываются с остатками аспарагина (Акп), когда они являются частью последовательности Акп-Х-8ет/ТЬт, где X может быть любой аминокислотой, за исключением пролина. X предпочтительно представляет собой одну из 19 природных аминокислот, отличных от пролина. Структуры Ν-связанных и О-связанных олигосахаридов и остатки сахаров, находящиеся в каждом типе, различны. Один тип сахара, обычно находящегося в обоих типах, представляет собой Ν-ацетилнейраминовую кислоту (называемую сиаловой кислотой). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком как Ν-связанных, так и О-связанных олигосахаридов, и, имея отрицательный заряд, может сообщать кислые свойства гликозилированному соединению. Такой (такие) сайт (сайты) могут включаться в линкер соединений по данному изобретению и предпочтительно гликозилируются в клетке в процессе рекомбинантного продуцирования полипептидных соединений (например, в клетках млекопитающих, таких как СНО, ВНК, СО8). Однако такие сайты можно дополнительно гликозилировать синтетическими или полусинтетическими методами, известными в уровне техники.
Другие возможные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильного или треонильного остатков, окисление атома серы в Сук, метилирование в альфа- аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина. Сге1дЬ1оп. РгоЮюк: ЗЬнсШте апД Мо1еси1аг РторетЪек (\У.Н. Ргеетап & Со., 8ап Ртапиксо), рр. 79-86 (1983).
Соединения по настоящему изобретению можно также изменять на уровне ДНК. Последовательность ДНК любой части соединения можно заменить на кодоны, более совместимые с выбранной клеткой-хозяином. Для Е.соЬ, которая является предпочтительной клеткой-хозяином, оптимизированные кодоны известны в уровне техники. Кодоны можно заменить с тем, чтобы исключить сайты рестрикции или включить молчащие сайты рестрикции, которые могут способствовать процессированию ДНК в выбранной клетке-хозяине. Последовательности носителя, линкера и пептидной ДНК можно модифицировать, чтобы она включала любое из вышеприведённых изменений.
Производные, конъюгированные с изотопами и токсинами
Другой группой применимых производных являются описанные выше молекулы, конъюгированные с токсинами, метками (мечеными веществами) или радиоизотопами. Такая конъюгация (сопряжение) особенно пригодна для молекул, содержащих пептидные последовательности, которые связываются с опухолевыми клетками или патогенами. Такие молекулы можно использовать в качестве терапевтических агентов или в качестве вспомогательного средства при хирургической операции (например, хирургическая операция под радиоиммунным контролем) или в качестве диагностических агентов (например,
- 90 022424 радиоиммунодиагностика или КТО).
В качестве терапевтических агентов эти конъюгированные производные имеют ряд преимуществ. Они содействуют применению токсинов и радиоизотопов, которые были бы токсическими, если бы вводились в отсутствие специфического связывания, предусматриваемого пептидной последовательностью. Они также могут ослабить побочные эффекты, которые сопутствуют облучению и химиотерапии, способствуя применению более низких эффективных доз партнёра по конъюгации.
Подходящие партнёры по конъюгации включают:
131 225 213 • радиоизотопы, такие как Иттрий, Иод, Актиний и Висмут;
• А токсин рицина, микробные токсины, такие как эндотоксин к Рзеиботопаз (например, РЕ38, РЕ40) и т.п.;
• молекулы партнёров в системах улавливания (см. ниже);
• биотин, стрептавидин (применимые в качестве молекул- партнёров в системе захвата или в качестве меток, в особенности для целей диагностики);
• цитотоксические агенты (например, доксорубицин).
Одним вариантом применения этих конъюгированных производных является применение в системе захвата. В такой системе молекула по настоящему изобретению содержит неопасную молекулу для захвата. Эта молекула-захватчик способна специфически связываться с отдельной эффекторной молекулой, содержащей, например, токсин или радиоизотоп. Как конъюгированная с носителем молекула, так и эффекторная молекула вводятся пациенту. В такой системе эффекторная молекула имеет короткий период полужизни за исключением тех случаев, когда она связана молекулой для захвата (захватчиком, ловушкой), конъюгированной с носителем, тем самым любые токсические побочные эффекты сводятся к минимуму. Конъюгированная с носителем молекула имеет относительно продолжительный период полужизни, но будет неопасной и нетоксической. Участки специфического связывания обеих молекул могут быть частью известной специфической связывающей пары (например, биотин, стрептавидин) или могут появляться в результате применения методов получения пептидов, таких как описанные выше.
Такие конъюгированные производные можно получать методами, известными в уровне техники. В случае белковых эффекторных молекул (например, эндотоксина к Рзеийотопаз) такие молекулы можно экспрессировать в виде слитых белков при использовании соответствующих ДНК конструкций. Производные, конъюгированные с радиоизотопами, можно получать, например, как описано для антитела ВЕХА (СоиНег). Производные, содержащие цитотоксические агенты или микробные токсины, можно получать, например, как описано для антитела ВК96 (Впз1о1-Мусгз 8с.|шЪЪ). Молекулы, используемые в системах захвата, можно получать, например, как описано в патентах, патентных заявках и публикациях от №оКх. Молекулы, применяемые для КЮ8 и КГО, можно получать, например, с помощью патентов, патентных заявок и публикаций от №оРгоЪе.
Носители
Изобретение требует присутствия по меньшей мере одного носителя, связанного с пептидом по Νконцу, С-концу или через боковую цепь одного из аминокислотных остатков. Можно также использовать несколько носителей. В одном аспекте носителем является Ес домен. Ес может быть слит с N или с Сконцом пептидов или как с Ν, так и с С-концом.
В различных вариантах изобретения Ес составляющая представляет собой либо нативный Ес, либо Ес вариант. Иммуноглобулин - источник нативного Ес в одном аспекте является иммуноглобулином человеческого происхождения, а в альтернативных вариантах изобретения может представлять собой любой класс иммуноглобулина. Нативные Ес домены состоят из мономерных полипептидов, которые могут быть связаны в димерные или мультимерные формы за счёт ковалентной (т.е. дисульфидными связями) и/или нековалентной ассоциации. Число внутримолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных Ес молекул составляет от одного до четырёх в зависимости от класса (например, 1дС, 1дА, 1дЕ) или подкласса (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дА1, 1дА2). Примером нативного Ес является связанный дисульфидной связью димер, получающийся в результате расщепления 1дС папаином (см. ЕШзоп е! а1. (1982), №.1с1ею АсМз Кез. 10:4071-9).
Следует отметить, что Ес мономеры самопроизвольно димеризуются, когда имеются подходящие цистеиновые остатки, если только нет подходящих условий, которые предупреждают димеризацию за счёт образования дисульфидных связей. Даже если цистеиновые остатки, которые обычно (в норме) образуют дисульфидные связи в Ес димере, удаляются или заменяются на другие остатки, мономерные цепи, как правило, образуют димер за счёт нековалентных взаимодействий. Термин Ес по данному описанию применяется для обозначения этих форм: нативного мономера, нативного димера (связанного дисульфидной связью), модифицированных димеров (связанных дисульфидной и/или нековалентной связью) и модифицированных мономеров (т.е. производных).
Как отмечается, Ес варианты являются подходящими носителями в объёме данного изобретения. Нативный Ес можно значительно модифицировать, получая Ес вариант, при условии, что сохраняется связывание с рецептором-мусорщиком; см., например, международные патентные заявки νΟ 97/34631 и νΟ/32478. В таких Ес вариантах можно удалить один или более сайтов нативного Ес, которые сообщают структурные признаки или функциональную активность, не требующуюся для слитых молекул по
- 91 022424 данному изобретению. Можно удалять эти сайты, например, заменяя или удаляя остатки, вводя инсерции в этот сайт или отсекая участки, содержащие этот сайт. Встроенные (инсерции) остатки или остаткизамены могут также быть изменёнными аминокислотами, такими как пептидомиметики или Όаминокислоты. Рс варианты могут быть желательны по ряду причин, некоторые из которых представлены в данном описании. Типичные Рс варианты включают молекулы и последовательности, в которых:
1) Сайты, которые участвуют в образовании дисульфидных связей, удалены. Такое удаление помогает избежать реакции с другими цистеинсодержащими белками в клетке-хозяине, используемой для продуцирования молекул по изобретению. Для этой цели может быть усечён цистеинсодержащий сегмент на Ν-конце или цистеиновые остатки могут быть удалены или заменены на другие аминокислоты (например, аланил, серил). Даже если остатки цистеина удалены, одноцепочечные Рс домены попрежнему могут образовывать димерный Рс домен, который удерживается вместе за счёт нековалентного связывания.
2) Нативный Рс модифицирован с тем, чтобы сделать его более совместимым с выбранной клеткойхозяином. Например, можно удалить РА последовательность близ Ν-конца типичного нативного Рс, который может распознаваться расщепляющим ферментом в Е.соН, таким как пролиниминопептидаза. Можно также добавлять Ν-концевой метиониновый остаток, в особенности, когда молекула рекомбинантно экспрессируется в бактериальной клетке, такой как Е.соН.
3) Часть Ν-конца нативного Рс удалена с целью предупредить Ν-концевую гетерогенность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине. Для этой цели можно удалить любой из первых 20 аминокислотных остатков на Ν- конце, в частности остатков в положениях 1, 2, 3, 4 и 5.
4) Удалены один или более сайтов гликозилирования. Остатки, которые обычно гликозилируются (например, аспарагин), могут вызвать цитолитическую реакцию. Такие остатки можно удалить или заменить на негликозилируемые остатки (например, аланин).
5) Сайты, участвующие во взаимодействии с комплементом, такие как сайт связывания с С1с|. удалены. Например, можно удалить или заменить последовательность ЕКК человеческого 1дО1. Рекрутинг комплемента может быть неблагоприятным для молекул по данному изобретению и поэтому его можно избежать с помощью такого Рс варианта.
6) Удалены сайты, которые влияют на связывание с Рс рецепторами, отличными от рецепторамусорщика. Нативный Рс может иметь сайты для взаимодействия с определёнными лейкоцитами, которые не требуются для слитых молекул по настоящему изобретению и поэтому могут быть удалены.
7) Удалён сайт АЭСС. Сайты АЭСС известны в уровне техники; см., например, Мо1ес. 1ттипо1. 29 (5): 633-9 (1992) относительно АЭСС сайтов в 1дО1. Эти сайты также не нужны слитым молекулам по настоящему изобретению и поэтому могут быть удалены.
8) Если Рс получают из антитела, отличного от человеческого, нативный Рс может быть гуманизирован. Обычно для гуманизации нативного Рс заменяют выбранные остатки в нечеловеческом наливном Рс на остатки, которые обычно находятся в человеческом нативном Рс. Методы гуманизации антител хорошо известны в уровне техники.
Альтернативным носителем является белок, полипептид, пептид, антитело, фрагмент антитела или малая молекула (например, пептидомиметик), способные связываться с рецептором-мусорщиком. Например, можно в качестве носителя (переносчика) использовать полипептид, описанный в патенте США 5739277, выданный 14 апреля 1998 Ргейа е! а1. Пептиды можно выбирать также методом фагового дисплея для связывания с рецептором-мусорщиком РсКп. Такие соединения для связывания с рецептороммусорщиком также включены в понятие носитель (переносчик) и входят в объём настоящего изобретения. Такие носители следует выбирать для повышения периода полужизни (например, избегая последовательности, узнаваемые протеазами) и понижения иммуногенности (например, за счёт предпочтения неиммуногенных последовательностей, раскрываемых при гуманизации антител).
Варианты, аналоги или производные Рс участка можно конструировать, например, делая различные замены остатков или последовательностей.
Полипептиды-варианты (или аналоги) включают инсерционные варианты, в которых один или более аминокислотных остатков дополняют Рс аминокислотную последовательность. Инсерции могут быть расположены на любом конце или на обоих концах белка или могут находиться во внутренних областях Рс аминокислотной последовательности. Инсерционные варианты с дополнительными остатками на любом конце или на обоих концах Рс аминокислотной последовательности могут включать, например, слитые белки и белки, содержащие аминокислотные концы (те(э)ги) или метки. Например, Рс молекула может необязательно содержать Ν-концевой Ме!, в особенности, когда молекула рекомбинантно экспрессируется в бактериальной клетке, такой как Е.соН.
В делеционных вариантах Рс удалён один или более аминокислотных остатков в полипептиде Рс. Делеции можно осуществлять на одном конце или на обоих концах Рс полипептида или удаляя один или более остатков внутри Рс аминокислотной последовательности. Следовательно, делеционные варианты включают все фрагменты Рс полипептидной последовательности.
В Рс вариантах с заменами удаляют один или более аминокислотных остатков Рс полипептида и заменяют альтернативными остатками. В одном аспекте замены являются консервативными по природе,
- 92 022424 а консервативные замены такого типа хорошо известны в уровне техники. Или же, изобретение охватывает замены, которые также являются неконсервативными. Типичные консервативные последовательности описаны в ЬеЬптдег, [ВюсЬет151гу, 2ηΙ Εάΐΐΐοη; \ΥοιΊΐι РиЪНзЬегз, 1пс. Хе\у Уогк (1975), рр. 71-77] и представлены ниже.
Консервативные замены
Характеристика боковой цепи Аминокислота
Неполярные (гидрофобные):
А. Алифатические АЫУР
Б. Ароматические ρ\ν
В. Серосодержащие М
Г. Промежуточные С
Незаряженные полярные:
A. Гидроксил содержащие 8 Т I
Б. Амиды N (3
B. Сульфгидрильная группа С
Г. Промежуточные О
Положительно заряженные (основные) К К Н
Отрицательно заряженные (кислые) ϋ Е
Альтернативные примеры консервативных замен представлены ниже.
Исходный остаток Типичная замена
А1а (А) Уа1, Ьеи, Не
Агё(К) Σγδ, Οϊη, Αδη
Αδη (Ν) Οΐη, Ηίδ, Ινδ, Аг§
Азр (ϋ) 01и
Су5(С) 5ег
01η (Р) Αδη
01и (Е) Αδρ
Ηίδ (Н) Αδη, Οΐη, Ι.νδ, Аг§
Ие(1) Ьеи, Уа1, Ме1, А1а, РЬе,
Ьеи (Ь) Не, Уа1, Мер А1а, РЬе
Ьу5(К) Аг§, Οΐη, Αδη
Ме1 (М) Ьеи, РЬе, Не
РЬе (Р) Ьеи, Уа1, Не, А1а
Рго (Р) О1у
Зет(8) ТЬг
ТЬг(Т) Зег
Тгр(АУ) Туг
Туг(¥) Тгр, РЬе, ТЬг, Зет
Уа1 (V) Не, Ьеи, Ме1, РЬе, А1а
Например, цистеиновые остатки можно удалить или заменить на другие аминокислоты для предупреждения образования некоторых или всех дисульфидных перекрёстных связей (сшивок) Рс последовательностей. Каждый цистеиновый остаток можно удалить и/или заменить на другие аминокислоты, такие как А1а или 8ег. Другим примером являются модификации, которые можно сделать для введения аминокислотных замен с целью (1) иссечения сайта связывания Рс рецептора; (2) иссечения сайта связывания комплемента (С1) и/или (3) иссечения сайта антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЭСС). Такие сайты известны в уровне техники, и любые известные замены входят в объём Рс по данному описанию. Например, относительно сайтов АОСС в 1дС1 см. Мо1еси1аг 1ттипо1оду, νοί. 29, N0. 5, 633-639(1992).
Аналогично один или более тирозиновых остатков можно заменить на остатки фенилаланина. Кроме того, другие вариантные аминокислотные инсерции, делеции и/или замены также рассматриваются и также входят в объём настоящего изобретения. Обычно предпочтительными являются консервативные аминокислотные замены. Кроме того, изменения могут быть в форме изменённых аминокислот, такие как пептидомиметики или Ό-аминокислоты.
Рс последовательности соединения можно также дериватизировать как указано в данном описании для пептидов, т.е. сделать несущими модификации, отличные от инсерции, делеции или замены амино- 93 022424 кислотных остатков. Предпочтительно модификации являются ковалентными по характеру и включают, например, химическое связывание с полимерами, липидами, другими органическими и неорганическими частицами. Производные по изобретению можно получать для повышения периода полужизни в кровотоке или для повышения способности нацеливания полипептида на заданные клетки, ткани или органы.
Также можно использовать домен связывания с рецептором-мусорщиком интактной молекулы Рс в качестве Рс участка соединения по изобретению, как описано в Международной заявке АО 96/32478, озаглавленной Видоизменённые полипептиды с повышенным периодом полужизни. Другими членами класса молекул, обозначенных в данном описании как Рс, являются молекулы, описанные в Международной заявке АО 97/34631, озаглавленной Иммуноглобулиноподобные домены с повышенным периодом полужизни. Обе опубликованные заявки РСТ, цитируемые в данном абзаце, вводятся в данное описание в качестве ссылки.
А8Р составляющие
Далее, соединения по изобретению могут включать, по меньшей мере, один АδР. АδР фрагмент молекулы может быть разветвлённым или неразветвлённым. Для применения препарата концевого продукта в терапии полимер является фармацевтически приемлемым. Вообще заданный полимер выбирают с учётом того, возможно ли терапевтическое применение конъюгата полимера и, если да, то учитывают нужную дозу, время пребывания в кровотоке, устойчивость к протеолизу и другие соображения. В различных аспектах средняя молекулярная масса каждого водорастворимого полимера составляет около 2100 кДа, около 5-50 кДа, около 12-40 кДа и около 20-35 кДа. Ещё в одном аспекте молекулярная масса каждого полимера равна около 6-25 кДа. Термин около, примерно по данному описанию и вообще, показывает, что в препаратах водорастворимого полимера некоторые молекулы имеют более высокую, некоторые более низкую молекулярную массу, чем указываемая. Обычно чем выше молекулярная масса или чем больше разветвлений, тем больше отношение полимер/белок. В зависимости от заданного терапевтического профиля можно использовать другие показатели, включая, например, длительность пролонгированного высвобождения; влияние, если таковое есть, на биологическую активность; простоту обработки; степень или отсутствие иммуногенности и другое известное действие водорастворимого полимера на терапевтический белок.
АδР следует связывать с полипептидом или пептидом с учётом действия на функциональные или антигенные домены полипептида или пептида. Вообще химическую дериватизацию можно осуществлять в любых подходящих условиях, применяемых для реакции белка с активированной молекулой полимера. Активирующие группы, которые можно применять для связывания водорастворимого полимера с одним или более белков, включают, но без ограничения, сульфон, малеимидную, сульфгидрильную группу, тиол, трифлат, трезилат, азидирин, оксиран и 5-пиридил. При связывании с пептидом по реакции восстановительного алкилирования выбранный полимер должен содержать одну реакционоспособную альдегидную группу с тем, чтобы можно было контролировать степень полимеризации.
Подходящие клинически приемлемые водорастворимые полимеры включают, без ограничения, ПЭГ, полиэтиленгликоль пропиональдегид, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, полиацетали, поливиниловый спирт (ПВС, РУА), поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, поли-бета-аминокислоты (либо гомополимеры или статистические сополимеры), поли-нвинилпирролидон-полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля (РРО) и другие полиалкиленоксиды, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (многоатомные спирты) (РОО) (например, глицерин и другие полиоксиэтилированные полиолы), полиоксиэтилированный сорбит или полиоксиэтилированную глюкозу, со1ошс кислоты или другие полисахариды, фиколл или декстран и их смеси.
Можно также получать термочувствительные водорастворимые полимеры, как в случае образования термореверсивных гелей. Примеры включают Тетроникс с четырёхразветвлённым скелетом и сополимеры РЕО (ПЭГ)-РЬОА. Гидрофильность полимеров может изменяться при замене гидрофобных участков на полимерную цепь. Примером этого является получение РЬОА, при котором отношение молочной кислоты к гликолевой кислоте можно повышать, что способствует более низкой растворимости в воде. Более слаборастворимые полимеры могут быть желательны в некоторых случаях, например, для повышения потенциального взаимодействия с клеточными мембранами. При реконституции (восстановлении) можно использовать более подходящее соотношение фосфолипидов с целью вызвать образование мицелл или липосом в растворе. Преимущество такой системы может заключаться в способности включать в мицеллу некоторую часть белка, что теоретически пролонгирует доставку. Фосфолипиды, способные образовывать липосомы или мицеллы, включают ЛМРО, ЛМРС, ЛОРС, ЛОРО и соответствующие вспомогательные стабилизирующие липосомы компоненты, такие как холестерин. Некоторые эксципиенты, такие как ЛЕА о1е!Ь-10 фосфат и о1е!Ь-10 фосфат, могут образовывать мицеллы в растворе.
Полисахариды представляют собой другой тип водорастворимого полимера, который можно использовать для модификации белков или пептидов. Модификацией белков или пептидов с помощью добавления полисахарида(ов), например, путём гликозилирования, можно повысить период полужизни, понизить антигенность, повысить устойчивость или уменьшить протеолиз. Декстраны представляют со- 94 022424 бой полисахариды, состоящие из отдельных субъединиц глюкозы, преимущественно связанных α1- 6 связями. Сам декстран существует в значительном диапазоне молекулярных масс и легкодоступен в примерном диапазоне молекулярных масс 1-70 кДа. Декстран является водорастворимым полимером, подходящим для применения в данном изобретении в качестве носителя либо самостоятельно, либо в комбинации с другим носителем (например, Рс). См., например, международные патентные заявки АО 96/11953 и АО 96/05309. Сообщалось о применении декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами; см., например, опубликованную Европейскую патентную заявку Νσ. 0315456, которая вводится в данное описание в качестве ссылки. Если декстран применяется в качестве носителя в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительным является декстран размером около 1-20 кДа.
В одном варианте изобретения АЗР представляет собой ПЭГ и изобретение рассматривает препараты, в которых соединение модифицировано таким образом, что оно включает формы ПЭГ, применяемые для дериватизации других белков, таких, но без ограничения, как моно-(С1-С10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль.
Полиэтиленгликоль пропиональдегид может иметь преимущества в технологическом процессе вследствие устойчивости в воде. ПЭГ- группа может иметь любую подходящую молекулярную массу и может быть линейной или разветвлённой. Средняя молекулярная масса ПЭГ для применения в изобретении находится в диапазонах, примерно 2-100 кД, примерно 5-50 кД, примерно 5-10 кД. В другом аспекте частица ПЭГ имеет молекулярную массу, примерно, 6-25 кД. Группы ПЭГ обычно связываются с пептидами или белками в процессе реакции ацилирования или восстановительного алкилирования реакционноспособной группы в ПЭГ-фрагменте (например, альдегидной, амино-, тиольной или сложноэфирной группы) с реакционноспособной группой в целевом пептиде или белке (например, альдегидной, аминоили сложноэфирной группой). Используя методы по данному описанию, можно получать молекулы конъюгата полимер/пептид, а преимуществом, предусматриваемым в данном описании, является возможность выбирать соотношение в конъюгате полимер/пептид для включения в смесь. Так, при желании, смесь пептидов с различным числом присоединённых полимерных частиц (например, ноль, одна, две) можно приготовить с заданным соотношением полимер/белок в конъюгате.
Подходящей стратегией пегилирования (другие методы более подробно обсуждаются в данном описании) синтетических пептидов заключается в объединении, за счёт образования конъюгата в растворе, пептида и частицы ПЭГ, причём пептид и ПЭГ несут специальную функциональную группу, взаимно реакционноспособную по отношению к функциональной группе партнёра. Пептиды можно легко получать обычным твердофазным синтезом. Пептиды предактивируют с помощью подходящей функциональной группы в конкретном сайте. Предшественники очищают и полностью характеризуют перед реакцией с ПЭГ- частицей. Цитирование пептида к ПЭГ обычно происходит в водной фазе, и её можно легко контролировать с помощью обращённо-фазовой аналитической ВЭЖХ. Пегилированные пептиды можно легко очищать препаративной ВЭЖХ и характеризовать методами аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и масс- спектрометрии с лазерной десорбцией.
Линкеры
Любая линкерная группа является необязательной, дополнительной вне зависимости от того, расположена она между пептидами, пептидом и носителем или носителем и А8Р. В случае присутствия линкера его химическая структура не является решающей, так как линкер служит главным образом в качестве спейсера. Линкер предпочтительно, состоит из аминокислот, связанных между собой пептидными связями. Так, в предпочтительных вариантах изобретения линкер состоит из 1-20 аминокислот, связанных пептидными связями, причём аминокислоты выбирают из 20 природных аминокислот. Некоторые из этих аминокислот могут быть гликозилированными, как хорошо понимают специалисты в данной области техники. В более предпочтительном варианте изобретения 1-20 аминокислот выбирают из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. Ещё более предпочтительно, когда линкер состоит из аминокислот, которые в большинстве своём являются стерически незатруднёнными, таким как глицин и аланин. Так, предпочтительными линкерами являются полиглицины (в частности, (О1у) 4, (О1у)5, (О1у)8, поли(О1у- А1а) и полиаланины. Другими характерными примерами линкеров являются (О1у)ЗЬу8(О1у)4 (δΕφΙϋΝΟ: 1018);
(О1у)ЗА5пО1у5ег(О1у)2 (δΕφΙϋΝΟ: 1019);
(О1у)ЗСу§(О1у)4 (δΕΟΙϋΝΟ: 1020); и О1уРгоА§пО1уО1у (δΕΟΙϋΝΟ: 1021).
Пояснение к вышеуказанной номенклатуре: например, (О1у)3Еуз(О1у)4 означает О1у-О1у-О1уЖузО1у-О1у-О1у-О1у. Также предпочтительными являются комбинации О1у и А1а. Показанные в данном описании линкеры являются типичными, приведёнными в качестве примеров; линкеры в объёме данного изобретения могут быть значительно длиннее и могут включать другие остатки.
Также возможно применение непептидных линкеров. Например, могут применяться такие линкеры,
- 95 022424 как -ХН-(СН2)з-С(О)-, где з = 2-20. Эти алкильные линкеры могут, кроме того, иметь в качестве заместителя любую пространственно незатруднённую группу, такую как низший алкил (например, С1-С6), низший ацил, галоген (например, С1, Вг), С^ ΝΗ2, фенил и т.д. Типичным непептидным линкером является ПЭГ линкер
где п имеет такое значение, что молекулярная масса линкера составляет 100-5000 кД, предпочтительно 100-500 кД. Пептидные линкеры можно изменять с образованием производных таким же образом, как описано выше.
Получение полипептидов и пептидов
Идентифицированный пептид можно получать в трансформированных клетках-хозяевах методами рекомбинантной ДНК. Если компонент-носитель представляет собой полипептид, продукт слияния полипептида или пептида-носителя можно экспрессировать в виде единого продукта. Для этого сначала методами, хорошо известными в уровне техники, получают молекулу рекомбинантной ДНК, кодирующей пептид. Например, последовательности, кодирующие пептиды, можно вырезать из ДНК с помощью подходящих рестриктаз. Или же молекулу ДНК можно синтезировать методами химического синтеза, такими как фосфорамидатный метод. Также можно применять комбинацию этих методов. Следовательно, данное изобретение включает полинуклеотиды, кодирующие соединение по изобретению.
Изобретение также включает векторы, кодирующие соединения по изобретению, в подходящем хозяине. Вектор содержит полинуклеотид, который кодирует соединение, функционально связанное с подходящими последовательностями контроля экспрессии. Методы осуществления этого функционального связывания либо до, либо после вставки полинуклеотида в вектор, хорошо известны. Последовательности контроля экспрессии включают промоторы, активаторы, энхансеры, операторы, сайты связывания рибосом, старт-сигналы, стоп-сигналы, кэп-сигналы, сигналы полиаденилирования и другие сигналы, участвующие в контроле транскрипции или трансляции.
Полученный вектор, содержащий в себе полинуклеотид, используется для трансформации соответствующего хозяина. Эту трансформацию можно осуществлять методами, хорошо известными в уровне техники.
В практике применения данного изобретения можно использовать любые из большого количества подходящих и хорошо известных клеток-хозяев. Выбор конкретного хозяина зависит от ряда факторов, известных в уровне техники. Эти факторы включают, например, совместимость с выбранным вектором экспрессии, токсичность пептидов, кодированных молекулой ДНК, скорость трансформации, лёгкость выделения пептидов, характеристики экспрессии, биобезопасность и стоимость. Соотношение этих факторов должно сочетаться с пониманием того, что не все хозяева могут быть равно эффективны для экспрессии конкретной последовательности ДНК. Этим общим принципам отвечают микробные клеткихозяева, включая клетки бактерий (таких как Е. соН), дрожжей (таких как Зассйаготусез) и других грибков, насекомых, растений, млекопитающих (включая человека) в культуре, или другие хозяева, известные в уровне техники.
Затем трансформированную клетку-хозяина культивируют и очищают. Клетки-хозяева можно выращивают в обычных условиях культивирования таким образом, чтобы экспрессировались заданные соединения. Такие условия ферментации хорошо известны в уровне техники. Наконец, пептиды очищают от культуры методами, хорошо известными в уровне техники.
В зависимости от клетки-хозяина, применяемой для экспрессии соединения по изобретению, углеводные (олигосахаридные) группы можно соответствующим образом связывать с сайтами, которые известны как сайты гликозилирования в белках. Обычно О-связанные олигосахариды связываются с остатками серина (Зег) или треонина (Тйг), тогда как Ν-связанные олигосахариды связываются с остатками аспарагина (Азп), если они являются частью последовательности Азп-Х-Зег/Тйг, в которой X может быть любой аминокислотой, за исключением пролина. X предпочтительно представляет собой одну из 19 природных аминокислот, если не учитывать пролин. Структуры Ν-связанных и О-связанных олигосахаридов и остатков сахаров, находящихся в олигосахаридах каждого типа, различны. Один тип сахара, находящегося обычно в олигосахаридах обоих типов, представляет собой Ν-ацетилнейраминовую кислоту (называемую сиаловой кислотой). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком как Ν-связанных, так и О-связанных олигосахаридов и благодаря его отрицательному заряду могут придать кислые свойства гликозилированному соединению. Такой(ие) сайт(ы) могут быть включены в линкер соединений по данному изобретению и предпочтительно гликозилируются в клетке в процессе рекомбинантного продуцирования полипептидных соединений (например, в клетках млекопитающих, таких как СНО, ВНК, СОЗ). Однако такие сайты могут дополнительно гликозилироваться синтетическими или полусинтетическими методами, известными в уровне техники.
Или же данные соединения можно получать синтетическими методами. Например, можно приме- 96 022424 нять методы твердофазного синтеза. Соответствующие методы хорошо известны в уровне техники и включают методы, описанные в работах МегпПе1б (1973), СЬет. Ро1урерббез, ρρ. 335-61 (Ка!зоуаптз апб Рапауойз ебз.); Метйе1б (1963), 1. Ат. СЬет. 8ос. 85: 2149; Эау1з е! а1. (1985), ВюсЬет. 1пИ. 10: 394-414; 81е\уаг! апб Уоипд (1969), 8оПб РЬазе Рерйбе 8уп!Ьез1з; патент США. № 3941763; Ешп е! а1. (1976), ТЬе Рго1е1п8 (3гб еб.) 2: 105-253; и Епскзоп е! а1. (1976), ТЬе Рго!ешз (3гб еб.) 2: 257- 527. Твердофазный синтез представляет собой предпочтительный способом получения отдельных пептидов, так как он является наиболее экономичным методом получения малых пептидов.
Соединения, которые включают дериватизированные пептиды или которые содержат непептидные группы, особенно подходят для синтеза хорошо известными методами органической химии.
Модификация ^8Р
Для получения соединения, ковалентно связанного с V8Р, применяется любой метод по данному описанию или другой метод, известный в уровне техники. Методы получения производных полипептидов или пептидов обычно включают следующие стадии: (а) реакцию пептида с активированной молекулой полимера (такой как реакционноспособное сложноэфирное или альдегидное производное полимерной молекулы) в условиях, в которых полипептид связывается с одной или более молекул полимера, и (б) получение продукта(ов) реакции. Оптимальные условия реакции определяют, учитывая известные показатели и нужный результат. Например, чем больше отношение молекул полимера к белку, тем выше процентное содержание связанной полимерной молекулы.
Биологически активная молекула может связываться с полимером за счёт любой подходящей функциональной группы стандартными методами, общеизвестными в уровне техники. Примеры функциональных групп либо в молекуле полимера, либо в биологически активной молекуле, которые можно использовать для образования таких связей, включают амино- и карбоксильную группы, тиольные группы, такие как в цистеиновых остатках, альдегидные и кетогруппы, и гидроксильные группы, имеющиеся в остатках серина, треонина, тирозина, гидроксипролина и гидроксилизина.
Полимер можно активировать за счёт связывания реакционноспособной группы, такой как трихлорз-триазин [статья АЪисЬо^зй е! а1., (1977), 1. Вю1. СЬет. 252: 3582-3586, вводимая в данное описание ссылкой во всей полноте], карбонилимидазол [статья ВеаисЬатр е! а1., (1983), Апа1. ВюсЬет. 131: 25-33, вводимая в данное описание ссылкой во всей полноте] или сукцинимидилсукцинат [статья АЪисЬо'етзй е! а1., (1984), Сапсег ВюсЬет. ВюрЬуз. 7: 175-186, вводимая в данное описание ссылкой во всей полноте], с аминогруппой на биологически активной молекуле. Другой метод связывания включает конденсацию глиоксилильной группы в одной молекуле с аминоокси, гидразидной или семикарбазидной группой другой молекулы [ЕтеШз апб О|хоп, (1968), ВюсЬет. 1. 108: 883-887; СаеПпег е! а1., (1992), Вюсоп)ида!е СЬет. 3: 262-268; СеодЬедап апб 8!гоЬ, (1992), Вюсоп)ида!е СЬет. 3: 138-146; Саейпег е! а1., (1994), 1. Вю1. СЬет. 269: 7224-7230, каждая из этих статей вводится в данное описание ссылкой во всей полноте]. Другие методы включают образование активной сложноэфирной группы за счёт конденсации свободной спиртовой группы первой молекулы в присутствии хлорформиата или дисукцинимидилкарбоната, с последующей конденсацией с аминогруппой другой молекулы [Уегопезе е! а1., (1985), ВюсЬет. апб Вю!есЬ. 11: 141-152; №!есй е! а1., патент США № 5089261; №!еск1, патент США № 5281698, каждая из этих работ вводится в данное описание ссылкой во всей полноте]. Другие реакционноспособные группы, которые могут связываться за счёт свободных спиртовых групп, представлены в V^^дЬ!, Европейский патент ЕР 0539167А2 (вводимый в данное описание ссылкой во всей полноте), в котором также описывается применение имидатов для связывания за счёт свободных аминогрупп.
Другие химические методы включают ацилирование первичных аминов целевых соединений из NΗ8-эфира метокси-ПЭГ (О-[^-сукцинимидилоксикарбонил)метил]-О'-метилполиэтиленгликоля). При ацилировании с помощью метокси-ПЭГ-NΗ8 образуется амидная связь, при этом элиминируется заряд исходного первичного амина. В других методах используется слабое окисление мишени в условиях, выбранных для нацеливания диола в боковой цепи предпоследнего гликозильного звена сиаловой кислоты на окисление до альдегида. Затем полученный гликольальдегид реагирует с метокси-ПЭГ-гидразид(О(гцдразинокарбонилметил)-О'-метилпропиленгликолем) с образованием полустабильного гидразона между ПЭГ и целевым соединением. Затем гидразон восстанавливают цианоборогидридом натрия, получают стабильный конъюгат с ПЭГ. См., например, патент США № 6586398 (Кшзбег е! а1., 1и1у 1, 2003), вводимый в данное описание ссылкой во всей полноте.
В конкретных примерах применения методов химической модификации, например в патенте США № 4002531 (вводимом в данное описание ссылкой во всей полноте) утверждается, что восстановительное алкилирование используют для связывания молекул полиэтиленгликоля с ферментом. В патенте США № 4179337 (вводимом в данное описание ссылкой во всей полноте) раскрываются конъюгаты ПЭГ: белок, включая, например, ферменты и инсулин. В патенте США № 4904584 (вводимом в данное описание ссылкой во всей полноте) раскрывается модификация ряда лизиновых остатков в белках с целью связывания молекул полиэтиленгликоля за счёт реакционноспособных аминогрупп. В патенте США № 5834594 (вводимом в данное описание ссылкой во всей полноте) раскрываются практически неиммуногенные конъюгаты водорастворимый ПЭГ: белок, включающие, например, белки 1Ь-2, интерферон альфа и 1Ь-1га. Методы Найт! е! а1. включают применение уникальных линкеров для связывания свободных
- 97 022424 аминогрупп в белке с ПЭГ. В патентах США № 5824784 и 5985265 (каждый из которых вводится в данное описание ссылкой во всей полноте) раскрываются методы, предусматривающие селективно химически модифицированные по Ν-концу белки и их аналоги, включающие С-СЪР и консенсусный интерферон. Важно отметить, что эти модифицированные белки имеют преимущества, связанные со стабильностью белков, а также преимущества при процессировании.
Применяется модификация \νδΡ. описанная также в Ргапс18 е! а1., Ιη: δίаЬ^1^ίу оГ рто!еш рЬаттасеийса1з: ίη у1уо ра!Ьуауз оГ бедтабайоп апй 8!та!ед1е8 Гог рто!еш 81аЫН/аНоп (Ейз. АЬегп. Т. апй Маптпд М. С.) Р1епит Ν. Υ., 1991 (вводится в данное описание ссылкой во всей полноте). Ещё в одном аспекте применяется метод, описанный в статье Ое1дабо е! а1., Соирйпд оГ РЕС !о Рто!еш Ву Асйуайоп \νίΐΗ Тгезу1 СЫопбе, АррйсаИопз 1п ПптипоаГГтИу Се11 РгерагаИоп, 1п: ИкЬег е! а1., ейз., δера^а!^оη8 Изшд Адиеоиз РЬазе δу8!ет8, АррЬсаИопз 1п Се11 Вю1оду апй Вю!есЬпо1оду, Р1епит Ргезз, Ν.Υ., Ν.Υ., 1989, рр. 211-213 (вводимой в данное описание ссылкой во всей полноте), который включает применение трезилхлорида, в результате не образуется связывающей группы между \νδΓ частицей и полипептидной частицей. В другом аспекте связывание \νδΓ осуществляют за счёт использования Ν-гидроксисукцинимидиловых эфиров карбоксиметилметоксиполиэтиленгликоля, что хорошо известно в уровне техники.
Описание других модификаций целевой молекулы с \νδΓ см., например, в патентной заявке США № 20030096400; в Европейских патентах ЕР 0442724А2; ЕР 0154316; ЕР 0401384; в международной заявке \ν() 94/13322; патентах США № 5362852; 5089261; 5281698; 6423685; 6635646; 6433135; в международной заявке ^О 90/07938; в статьях и обзорах СаеПпет апй ОГГогй, (1996), Вюсопщда!е СЬет. 7: 3844; СтеепуаЫ е! а1., Сп! Кеу ТЬегар Эгид Сатег δу8!. 2000; 17: 101-161; Коресек е! а1., 1 Соп!го11ей Ке1еа8е., 74: 147-158, 2001; Натз е! а1., С1ш РЬагтасокше!. 2001;40(7): 539-51; Ζа1^р8ку е! а1., Вюсопщд СЬет. 1997; 8: 111-118; №пЬап е! а1., Масгото1еси1е8. 1992; 25: 4476-4484; №иЬап е! а1., Вюсоп) СЬет. 1993; 4: 54-62; и Ргапшз е! а1., Росиз оп Сгоу!Ь Рас!огз, 3: 4-10 (1992), раскрытие которых вводится в данное описание ссылкой во всей полноте.
Восстановительное алкилирование
В одном аспекте ковалентное связывание \νδΓ проводят химическими методами модификации с помощью восстановительного алкилирования, представленными в данном описании, для селективной модификации Ν-концевой α-аминогруппы и проводят тестирование полученного в результате продукта на заданное биологическое свойство, такого как анализы на биологическую активность, представленную в данном описании.
При восстановительном алкилировании для связывания \νδΓ с белком или пептидом используется различная реакционная способность различных типов первичных аминогрупп (например, лизина по сравнению с Ν-концевой), пригодных для дериватизации в конкретном белке. В подходящих условиях реакции осуществляется практически селективная дериватизация белка по Ν-концу полимером, содержащим карбонильную группу.
Для восстановительного алкилирования выбранный(е) полимер(ы) могут иметь единственную альдегидную группу. Реакционноспособным альдегидом является, например, полиэтиленгликоль пропиональдегид, который является устойчивым в воде, или его С1-Сюалкокси или арилоксипроизводные (см., например, патент США № 5252714, вводимый в данное описание во всей полноте в качестве ссылки). В одном методе восстановительное алкилирование используют для конъюгации ПЭГ-альдегида (О-(3оксопропил)-О'-метилпропиленгликоля) с первичным амином. Было показано, что в подходящих условиях этим методом получают ПЭГ -конъюгаты, преимущественно модифицированные за счёт αаминогруппы на Ν-конце белка.
Альдегидную функциональную группу, применимую для конъюгации биологически активной молекулы, можно получить из функциональной группы, содержащей прилегающие амино и спиртовую группы. В полипептиде, например, можно использовать Ν-концевой серин, треонин или гидроксисилан для получения альдегидной функциональной группы путём окислительного расщепления в мягких условиях в присутствии периодата. Например, эти остатки, или их эквиваленты, обычно могут присутствовать на Ν-конце полипептида, могут экспонироваться при химическом или ферментативном расщеплении или их можно вводить рекомбинантным или химическим методами. Реакция получения альдегида обычно включает добавление молярного избытка мета-периодата натрия и мягкие условия для того, чтобы избежать окисления в других положениях белка. Значение рН, предпочтительно равно 7,0. Типичная реакция включает прибавление 1,5-кратного молярного избытка мета-периодата натрия с последующей инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте.
Альдегидная функциональная группа может конденсироваться с активированным полимером, содержащим гидразидную или семикарбазидную функциональную группу, с образованием гидразона или семикарбазона (связывание). Гидразидсодержащие полимеры выпускаются промышленностью и при необходимости их можно синтезировать обычными методами. ПЭГ- гидразиды для применения в изобретении можно получать от δ1^ΠΓ\ΥΠ^Γ Ройтетз, 1пс., 2307 δр^^η§ ВгапсЬ Коай, НипкуШе, А1а. 35801 (в настоящее время отделение №к!ат ТЬетареиИсз, 150 1пби81па1 Коай, δаη Саг1оз, СА 94070-6256). Альдегид конденсируется с полимером при смешении двух компонентов в растворе и нагревании, примерно,
- 98 022424 до 37°С практически до окончания реакции. Чтобы повысить количество полученного конъюгата, берут обычно избыток гидразидсодержащего полимера. Обычно время реакции составляет 26 ч. В зависимости от термической стабильности реагентов с целью получения подходящих результатов можно изменять температуру и время реакции. Подробное описание условий реакции окисления и конденсации даётся в СеодЬедап апД З!гоЬ (1992), Вюсоищда1е СЬет. 3: 138-146 и в СеодЬедап, патент США 5362852, каждый из этих материалов вводится в данное описание в качестве ссылки во всей полноте.
При проведении восстановительного алкилирования восстановитель должен быть устойчив в водном растворе и предпочтительно должен восстанавливать только Шиффово основание, образующееся на начальной стадии восстановительного алкилирования. Восстановители выбирают без ограничения из борогидрида натрия, цианоборогидрида натрия, диметиламина бората (диметиламинборана), триматиламина бората (триметиламинборана) и пиридина бората (пиридинборана).
рН реакционной смеси влияет на соотношение полимера и белка, применяемое в реакции. В целом, если рН реакционной смеси ниже рКа целевой реакционноспособной группы, требуется больший избыток полимера по сравнению с белком. Если рН ниже рКа, не требуется, чтобы отношение полимер:белок было таким высоким (т.е. чем более реакционноспособные группы присутствуют, тем меньше требуется молекул полимера).
Соответственно в одном аспекте реакцию проводят при рН, которая позволяет использовать преимущество различий между рКа ε-аминогрупп лизиновых остатков и α-аминогрупп Ν-концевого остатка белка. С помощью такой селективной дериватизации контролируется связывание водорастворимого полимера с белком; конъюгация с полимером происходит преимущественно по Ν-концу белка и отсутствует заметная модификация других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина.
Следовательно, в одном аспекте охватываются методы ковалентного связывания \УЗР с целевым соединением, и они дают практически гомогенный препарат молекул конъюгата ^ЗР/белок без дополнительной тщательной очистки, которая необходима в других химических методах модификации. Более конкретно, если используют полиэтиленгликоль, описанные методы позволяют получать пегилированный по Ν-концу белок, в котором отсутствуют теоретически антигенные связывающие группы, т.е. полиэтиленгликолевые фрагменты непосредственно связываются с белковыми фрагментами без образования теоретически токсических побочных продуктов.
В зависимости от выбранного метода связывания \УЗР может меняться соотношение \УЗР молекул к целевому пептиду или белку, как и их концентрация в реакционной смеси. В общем оптимальное соотношение (с точки зрения эффективности реакции, выражающейся в том, что не остаётся избыточного непрореагировавшего белка или полимера) определяется молекулярной массой выбранного \УЗР. Кроме того, когда используют метод, который включает неспецифическое связывание и последующую очистку заданных частиц, отношение может зависеть от числа имеющихся реакционноспособных групп (обычно аминогрупп).
Очистка
Метод получения практически гомогенного ^ЗР-модифицированного препарата заключается, в одном аспекте, в очистке (выделении) преимущественно единственного вида модифицированного соединения из смеси видов. Например, практически гомогенный (однородный) вид (частицы) сначала выделяют ионообменной хроматографией, получая материал, имеющий заряд, характерный для единичного вида (даже если присутствуют другие виды, имеющие такой же явный (кажущийся) заряд), а затем заданный вид выделяют эксклюзионной хроматографией. Другие методы, рассматриваемые в изобретении, включают, например, методы международной заявки \УО 90/04606, опубликованной 3 мая 1990 г., в которой описывается способ фракционирования смеси аддуктов ПЭГ-белок, заключающийся в распределение аддуктов ПЭГ/белок в ПЭГ-содержащей водной двухфазной системе.
Так в одном аспекте настоящего изобретения представлен способ получения конъюгата \УЗРмодифицированного соединения, заключающийся в (а) реакции соединения, содержащего более одной аминогруппы, с частицей водорастворимого полимера в условиях восстановительного алкилирования, при рН, подходящем для селективной активации α-аминогруппы на аминоконце белкового фрагмента, с тем, чтобы указанный водорастворимый полимер селективно связывался с указанной α-аминогруппой; и (б) получение продукта реакции. Необязательно, и в частности, в случае терапевтического продукта, продукты реакции отделяют от непрореагировавших частиц.
Как подтверждено пептидным картированием и секвенированием с Ν-конца, получают препарат, который содержит по меньшей мере на 50% пегилированный пептид в смеси пегилированного пептида и непрореагировавшего пептида. В других вариантах изобретения представлен препарат, который содержит по меньшей мере на 75% пегилированный пептид в смеси пегилированного пептида и непрореагировавшего пептида; по меньшей мере на 85% пегилированный пептид в смеси пегилированного пептида и непрореагировавшего пептида; по меньшей мере на 90% пегилированный пептид в смеси пегилированного пептида и непрореагировавшего пептида; по меньшей мере на 95% пегилированный пептид в смеси пегилированного пептида и непрореагировавшего пептида; и по меньшей мере на 99% пегилиро- 99 022424 ванный пептид в смеси пегилированного пептида и непрореагировавшего пептида.
Следующие примеры предлагаются не для ограничения, но только в качестве примеров конкретных вариантов изобретения.
Пример 1. Сборка конструкции для экспрессии тРс-ТМР
Полинуклеотид, кодирующий ТМР слитый белок, содержащий мышиную Рс область (тРс-ТМР), создают, объединяя нуклеотидные последовательности, по отдельности кодирующие мышиный Рс и ТМР (описаны в Европейской заявке ЕР 01124961А2). В первом цикле ПЦР компонент, кодирующий мышиный Рс, амплифицируют, используя ПЦР праймеры 3155-58 (8Ер ГО NО: 1022) и 1388-00 (8Ер ГО ^: 1023).
3155-58: ССОООТАААООТООАООТООТООТАТСОА (8ЕЦ ГО ΝΟ: 1024)
3155-59: ССАССТССАССТТТАССССОАОАОТОООАО (5ЕЦ ГО ΝΟ: 1025)
В отдельной реакции полинуклеотид, кодирующий ТМР, амплифицируют с помощью праймеров 1209-85 (8ЕР ГО 1026) и 3155-59 (8Ер ГО 1027).
1209-85: СОТАСАООТТТАСОСААОААААТОО (8ЕЦ ГО ΝΟ: 1028)
1388-00: СТАОТТАТТОСТСАОСОО (8ЕЦ ГО ΝΟ: 1029)
Полученные ПЦР фрагменты очищают в геле и объединяют в одной пробирке для второго цикла с использованием праймеров 1209-85 (8Ер ГО NО: 1030) и 1388-00 (8Ер ГО NО: 1031). ПЦР продукт этого второго цикла амплификации очищают в геле и расщепляют рестриктазами Ше1 и ХНо1. Фрагмент, полученный в результате расщепления, очищают и лигируют в вектор рАМО21, предварительно расщеплённый теми же ферментами. Эту смесь после лигирования трансформируют электропорацией в Е. соН и засевают в среду ЕВ + Канамицин. Колонии подвергают скринингу с помощью ПЦР и ДНК секвенирования. Позитивный клон с нуклеотидной последовательностью (8Ер ГО NО: 1032), кодирующей слитый белок тРс- ТМР (8Ер ГО NО: 1033), идентифицируют и обозначают 6397.
Полинуклеотид, кодирующий слитый белок мышиный Рс- ТМР (8Ер ГО NО: 1034)
ОАТТТОАТТС ТАОАТТТОТТ ТТААСТААТТ АААООАООАА ТААСАТ
Открытая КГ (рамка считывания):
АТООТСОАСООТТО ТААОССАТОС АТТТОТАСАО ТСССАОААОТ АТСАТСТОТС
101 ТТСАТСТТСС ССССАААОСС СААООАТОТО СТСАССАТТА СТСТОАСТСС
151 ТААСОТСАСО ТОТОТТОТОО ТАОАСАТСАО СААООАТОАТ СССОАООТСС
201 АОТТСАОСТО ОТТТОТАОАТ ОАТОТООАОО ТОСАСАСАОС ТСАОАСОСАА
251 ССССОООАОО АОСАОТТСАА САОСАСТТТС СОСТСАОТСА ОТОААСТТСС
301 САТСАТОСАС САООАСТООС ТСААТСОСАА ООАОТТСААА ТОСАОООТСА
351 АСАОТОСАСС ТТТСССТОСС СССАТССАОА АААССАТСТС СААААССААА
401 ООСАОАССОА АООСТССАСА ООТОТАСАСС АТТССАССТС ССААООАОСА
451 ОАТООССААО ОАТАААОТСА ОТСТОАССТО САТОАТААСА ОАСТТСТТСС
501 СТОААОАСАТ ТАСТОТООАО ТООСАСТООА АТОООСАОСС АОСООАОААС
551 ТАСААОААСА СТСАОСССАТ САТООАСАСА ОАТООСТСТТ АСТТССТСТА
601 САОСААОСТС ААТСТОСАОА АОАОСААСТО ООАООСАООА ААТАСТТТСА
651 ССТОСТСТОТ ОТТАСАТОАО ООССТОСАСА АССАССАТАС ТОАОААОАОС
701 СТСТСССАСТ СТССОООТАА АООТООАООТ ООТООТАТСО ААООТССОАС
751 ТСТОССТСАО ТООСТООСТО СТСОТОСТОО ТООТООАООТ ООСООСООАО
801 ОТАТТОАООО СССААСССТТ СОССААТООС ТТОСАОСАСО СОСАТАА
3' Бециепсе:
ТСТСОАООАТССО СООАААОААО ААОААОААОА АОАААОСССО АААОО
Последовательность белка мышиный Рс- ТМР (8ЕЦ ГО ΝΟ: 1035)
МУИОСКРСЮ ТУРЕУ85УР1 РРРКРКОУЬТ 1ТЬТРКУТСУ ννϋΙδΚΟβΡΕ νρρδψρνοϋν ЕУНТАЦТЦРК ΕΕφΕΝδΤΡΚδ УЗЕЬРМНСЮ АУЬИОКЕГКСК 101 νΝδΑΑΡΡΑΡΙ ΕΚΤΙδΚΤΚΟΚ ΡΚΑΡφνΥΤΙΡ РРКЕЦМАКЛК У5ЬТСМ1ТОР 151 РРЕОГГУЕЧУЦ ΨΝΟφΡΑΕΝΥΚ ΝΤφΡΙΜϋΤηΟ 8УЕУУ8КШУ φΚδΝν/ΕΑΟΝΤ 201 ЕТСЗУЬНЕСЬ ΗΝΗΗΤΕΚδΙ,δ ΗδΡΟΚΟΟΟΟΟ 1ЕСРТЬКЦ^Е ААКАОООООО 251 ΟΟΙΕΟΡΤίΚΟ ХУЬААКА*
Пример 2. Ферментация штамма 6397
Ферментацию штамма 6397 инициируют, вводя в 500 мл стерилизованного бульона Лурия засевае- 100 022424 мую культуру штамма во встряхиваемой колбе. Когда плотность клеток достигнет величины 0,9 при 600 нм, содержимое используют для внесения в 15 л ферментёр, содержащий 10 л комплексной питательной среды (800 г глицерина, 500 г триптиказы, 3 г цитрата натрия, 40 г КН2РО4, 20 г (ΝΗ4)2δΘ4, 5 мл антивспенивающего агента Р1ика Р-2000, 10 мл микроэлементов (хлорид железа(111) 27,0 г/л, хлорид цинка 2,00 г/л, хлорид кобальта 2,00 г/л, молибдат натрия 2,00 г/л, хлорид кальция 1,00 г/л, сульфат меди(11) 1,90 г/л, борная кислота 0,50 г/л, хлорид марганца 1,60 г/л, цитрат натрия дигидрат 73,5 г/л), 10 мл витаминов (биотин 0,060 г/л, фолиевая кислота 0,040 г/л, рибофлавин 0,42 г/л, пиридоксин НС1 1,40 г/л, ниацин 6,10 г/л, пантотеновая кислота 5,40 г/л, гидроксид натрия 5,30 мл/л), добавляют воду до 10 л). В ферментёре поддерживают температуру 37°С и рН 7 при уровне растворённого кислорода, поддерживаемом минимум при 30% сатурации. Когда плотность клеток достигнет 13,1 ΘΌ единиц при 600 нм, культуру индуцируют, добавляя 10 мл раствора, содержащего 0,5 мг/мл ^(3-оксогексаноил)гомосерин лактона. Через 6 ч после индукции бульон охлаждают до 10°С и клетки собирают центрифугированием при 4550 д в течение 60 мин при 5°С. Клеточную массу хранят при -80°С.
Пример 3. Рефолдинг белка
Массу Е. соП (300 г) штамма 6397, экспрессирующего тРс-ТМР, растворяют в 2250 мл буфера для лизиса (50 мМ Трис НС1, 5 мМ ΕΌΤΆ, рН 8.0) и дважды пропускают через охлаждённый микрофлюидизатор при 13000 Р§1 (89632 кПа). Затем гомогенат центрифугируют при 11300 д в течение 60 мин при 4°С. Супернатант отбрасывают, а осадок (пеллеты) ресуспендируют в 2400 мл воды с помощью измельчителя ткани. Затем гомогенат центрифугируют при 11300 д в течение 60 мин при 4°С. Супернатант отбрасывают, а осадок (пеллеты) ресуспендируют в 200 мл воды с помощью измельчителя ткани. Г омогенат центрифугируют при 27200 д в течение 30 мин при 4°С и супернатант отбрасывают. Около 12,5% осадка ресуспендируют в 28 мл 20 мМ Трис НС1, рН 8,0, с 35 мг лизоцима белка куриных яиц (§1дта, δΐ Ьош8, МО), используя измельчитель ткани, и инкубируют при 37°С в течение 20 мин. После инкубации суспензию центрифугируют при 27200 д в течение 30 мин при 22°С и супернатант отбрасывают. Осадок ресуспендируют в 35 мл раствора 8 М гуанидин НС1, 50 мМ Трис НС1, рН 8,0, после чего прибавляют 350 мкл 1 М ΌΤΤ (81дта, δΐ Ьошк, МО) и материал инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Затем раствор центрифугируют при 27200 д в течение 30 мин при 22°С. Супернатант затем переносят в 3,5 л буфера для рефолдинга (50 мМ Трис основания, 160 мМ аргинина НС1, 3М мочевины, 20% глицерина, рН 9,5, 1 мМ цистеина, 1 мМ цистамина НС1) со скоростью 1 мл/мин при осторожном перемешивании при 4°С.
Пример 4. Очистка конструкции
После инкубации в течение 40 ч при 4°С при слабом встряхивании раствор после рефолдинга, описанный в примере 3, концентрируют до 500 мкл на ультрафильтрационной установке с тангенциальным потоком жидкости с картриджем 30 кДа (ЪаЮпщ, СоеШидеи, Сеттаиу), а затем подвергают диафильтрации против 3 л 0-Буфера А (20 мМ Трис НС1, рН 8,0). Концентрированный материал фильтруют через фильтр \νΐι;·ιΙιη;πι СР/Л и наносят на скоростную колонку, содержащую 86 мл 0-Сефарозы (2,6 см ГО) (АтеткЬат Вюкшеисек, Р15са1а\\ау, N1) при скорости потока 15 мл/мин. Смолу промывают несколькими объёмами 0-Буфера А, затем белок элюируют, используя линейный градиент 20 объёмов колонки до 60% 0-Буфера В (20 мМ Трис НС1, 1М №С1, рН 8,0) при скорости потока 10 мл/мин. Фракции с максимальным (пиковым) содержанием объединяют и пул пропускают через шприцевой фильтр Ми81аид Ε (Ра11 Сотротабои, Еа§1 НШк, ΝΥ) при скорости потока 1 мл/мин. Отфильтрованный материал фильтруют второй раз через фильтр из ацетата целлюлозы 0,22 мкм и хранят при -80°С.
Пример 5. Пегилирование белка
К охлаждённому (4°С) раствору тРс-ТМР (3,5 мл, 0,8 мг/мл) в 100 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5, содержащего 20 мМ NаСNВΗз, при перемешивании прибавляют 3.8- кратный молярный избыток метоксиполиэтиленгликоль альдегида (МРЕС) (средняя молекулярная масса 20 кДа) (№к1ат). Продолжают перемешивание реакционной смеси при той же температуре. Степень модификации белка в ходе реакции проверяют с помощью δΕС (эксклюзионной) ВЭЖХ на колонке δире^о8е 6 НК 10/30 (АтеткЬат Вюкшеисек), элюируют 0,05 М фосфатным буфером с 0,15 М №С1, рН 7,0 при скорости потока 0,4 мл/мин. Через 16 ч анализ δΕС ВЭЖХ показывает, что основная часть белка конъюгирована с МРЕС. В это время реакционная смесь подвергается буферному обмену в буфер 20 мМ Трис/НС1, рН 8,12. Конъюгаты МРЕС-тРс-АМР2 выделяют ионообменной хроматографией на колонке 1 мл Н1 Тгар НР О (АтегШат Вюкаеисек), уравновешенной буфером 20 мМ Трис/НС1, рН 8,12. Реакционную смесь наносят на колонку при скорости потока 0,5 мл/мин и непрореагировавший МРЕС альдегид элюируют исходным буфером в трёхкратном объёме колонки. Линейный градиент в 20-кратном объёме колонки от 0 до 100% 20 мМ Трис/НС1 буфера, рН 8,12, содержащего 0,5 М №С1, используют для элюции конъюгатов белокполимер. Фракции (2 мл), собранные в процессе ионообменной хроматографии, анализируют методом δΕС ВЭЖХ, как описано выше. Фракцию, содержащую моно- и ди-МРЕС- тРс-ТМР конъюгаты в примерном соотношении 2.3 к 1 (по определению методом δΕС ВЭЖХ), концентрируют и подвергают стерильной фильтрации.
Пример 6. 1и У1уо тестирование
ΒΌΡ1 мышей (СЬат1е8 Кует БаЬогаЮпех V^1т^идΐои, МаккасЬикебь) делят на группы по 10 мышей и им в 0, 21 и 42 день подкожно инъецируют либо разбавитель (среда Дульбекко с фосфатным буфером
- 101 022424 (РВ8) с 0,1% альбумином бычьей сыворотки) или разбавителем с 50 мкг тестируемого моно- и ди-МРЕСтРс-ТМР конъюгата белка (описанного выше) на кг массы животного. Каждую группу делят пополам и отбирают пробу крови (140 мкл) из ретроорбитального синуса в определённые временные точки (в дни 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 19, 24, 26, 28, 31, 33, 40, 45, 47, 49, 52 и 59). На 59 день мышам дают наркоз перед взятием крови. Делают полный анализ и определяют лейкоцитарную формулу взятой крови на автоматическом анализаторе крови АЭУГА 120 с программой для анализа крови мышей (Вауег Э1адпо8Йс8, №ν Уогк, ИТ).
Пример 7. Лиофилизированный препарат человеческого Рс-ТМР
Начальные исследования, связанные с поиском (скринингом) лиофилизированного препарата
Пептидное антитело человеческий Рс-ТМР, представленное в примере 7 данного описания, соответствует димерной форме 8ЕО ГО N0: 1017, где человеческий Рс обозначает последовательность 8ЕО ГО N0: 1, содержащую начальный метионин на Оконце.
Стабильность Рс-ТМР определяют различными хроматографическими методами: обращённофазовой ВЭЖХ, катионообменной ВЭЖХ, эксклюзионной ВЭЖХ и 8Э8-РАСЕ, каждый из которых показывает устойчивость при повышенной температуре. Анализируют химическую и физическую деструкцию рецептур в диапазоне концентраций 0,1-40 мг/мл при повышенной, пониженной температуре и при замерзании. Оценивают устойчивость Рс-ТМР при различных рН и включении маннита или глицина в качестве агентов, формирующих осадок (лепёшку), и сахарозы в качестве лиопротектора. В конченом счёте выбирают маннит и сахарозу для дальнейшей оптимизации после того, как в присутствии другого кандидата (глицина) не наблюдалось никакого повышения устойчивости белка. Также было показано, что Твин-20 (полисорбат-20) ингибирует агрегацию при лиофилизации в интервале концентраций 0,0020,1%. Следующие буферы изучались в скрининге в интервале рН 4-8: глициновый, сукцинатный, гистидиновый, фосфатный и Трис. В результате этих исследований было показано, что Рс-ТМР, приготовленный в гистидиновом буфере при рН 5 с небольшой добавкой Твин-20 (0,004%) является более оптимальным для стабильности.
Определение сахарозы и Твин-20 в Те-ТМР препарате (рецептуре)
Последующие усилия по разработке препарата были сосредоточены на определении уровня сахарозы, маннита и Твин-20 в препарате при концентрации белка около 0,5 мг/мл (соответствующей прогнозируемым требованиям к дозировке в клинике). В этих исследованиях было продемонстрировано влияние сахарозы, маннита и Твин-20 на оптимизацию стабильности. Также были начаты исследования, чтобы прогнозировать технологические проблемы и трудности.
Сахароза позволяет свести к минимуму химическую деструкцию при повышенной температуре.
Проверяют влияние различных концентраций сахарозы и маннита на стабильность Рс-ТМР. Белок готовят в концентрации 0,3 и 2 мг/мл, чтобы соответствовать предполагаемому диапазону концентраций в клинике. Кроме того, образцы готовят в присутствии и в отсутствие 0,004% Твин-20. Соотношение сахароза:маннит изменяют, варьируя количество сахарозы и корректируя уровень маннита при каждой концентрации сахарозы таким образом, чтобы сохранять изотоничность. Изучают следующие соотношения сахароза:маннит (выражаемые в виде % вес./об.): 0,2:5,1; 0,5:4,8; 1:4,5; 1,5:4,3 и 2:4.
Методами катионообменной и обращённо-фазовой ВЭЖХ показано, что повышенные соотношения сахароза:маннит уменьшают химическое расщепление (деструкцию). Как показано в табл. 39, процентное содержание основного пика сравнивают сначала и после хранения Рс-ТМР в течение 18 недель при повышенной температуре (37°С). Наибольшее изменение (уменьшение) основного пика происходит в жидком препарате (Рс-ТМР приготовлен в 10 мМ ацетата, 5% сорбита при рН 5), за ним идут лиофилизированные препараты, содержащие 0,2, 0,5 и 1,0% сахарозы соответственно. Протективное действие сахарозы на уменьшение химической деструкции наблюдают также при анализе образцов методом обращённо-фазовой ВЭЖХ после хранения при повышенной температуре (табл. 39). Процентное содержание основного пика (определяемого обращённо-фазовой ВЭЖХ Рс-ТМР) заметно падает при низких уровнях сахарозы, но, по-видимому, незначительно меняется в препаратах с концентрацией сахарозы выше 1%. Эти результаты совместно показывают, что поддержание уровней сахарозы при 1,5% или выше очень важно для стабильности Рс-ТМР при лиофилизации.
- 102 022424
Таблица 39. Тс-ТМР в 10 мМ гистидина, забуференного при рН 5 Твин-20 Уменьшение основного пика в ОФ и СЕХ-ВЭЖХ через 18 недель при 37°С
Рецептура ОФ- ВЭЖХ СЕХ- ВЭЖХ
0.2% сахарозы, 5.1% маннита 78.6 72.2 79.8 62.6
0.5% сахарозы, 4.8% маннита 77.3 73.1 78.9 71.6
1% сахарозы, 4.5% маннита 78.4 78.0 80.5 73.9
1.5% сахарозы, 4.3% маннита 73.2 79.8 80.5 78.7
2% сахарозы, 3% маннита 79.2 81.3 78.6 78.9
10 мМ ацетата, 5% сорбита, рН 5 (жидкий контроль 74.7 42.8 75.5 34.1
В то время как в случае Тс-ТМР в жидком контроле (состав 10 мМ ацетата, 5% сорбита, рН 5) наблюдается заметный рост областей перед и после основного пика, наблюдается более высокая степень разложения в области после основного пика при анализе лиофилизированных образцов с пониженными количествами сахарозы. В предыдущей работе по стабильности жидких образцов (после хранения при повышенной температуре) было показано, что происходит деамидирование с образованием остатков глутамина и аргинина, которые вносят вклад в увеличение области перед пиком в жидких образцах.
По данным катионообменной и обращённо-фазовой ВЭЖХ после долговременного хранения охлаждённого (при низкой температуре) лиофилизированного препарата химическое расщепление не наблюдается. Например, хроматограммы, полученные в результате катионообменной хроматографии, не показывают явных изменений при различных температурах (-80°С, 4°С и контрольной комнатной температуре в течение 6 месяцев). Вследствие отсутствия химического расщепления в лиофилизированном препарате во времени при контрольной комнатной температуре и ниже основная работа по разработке препарата была сконцентрирована на снижении физической агрегации, обусловленной лиофилизацией.
Твин-20 снижает до минимума агрегацию, обусловленную лиофилизацией.
Введение Твин-20 в низкой концентрации (0,004%) необходимо для минимизации агрегации, которая наблюдается после лиофилизации. Это можно продемонстрировать на релевантных результатах нескольких исследований стабильности, в которых определяют стабильность образцов в присутствии и в отсутствие Твин-20.
Для того, чтобы изучить влияние Твин-20 в широком диапазоне, вначале используют более высокую концентрацию Тс-ТМР с целью определить количество Твин-20, необходимое для минимизации агрегации. Концентрация Тс-ТМР в данном исследовании составляет 20 мг/мл, при уровнях Твин-20, составляющих 0,002, 0,004, 0,006 и 0,01%. После хранения в течение одного года при 4°С агрегация во всех препаратах с Твин-20 составляет < 0,1%. Результаты после шести месяцев также показывают отсутствие значимой агрегации. Твин-20 в концентрации 0,004% выбирают для дальнейшего исследования препарата, обсуждаемого в данном описании, при концентрации Тс-ТМР 0,5 мг/мл.
В табл. 40 показана степень агрегации Тс-ТМР в моменты времени: через ноль, 3 и 11 месяцев хранения при 4°С. В данном исследовании Тс-ТМР лиофилизируют с концентрацией 0,5 мг/мл в вышеуказанном препарате и в препаратах (рецептурах) с варьирующимися соотношениями сахароза:маннит в отсутствие Твин-20. Кроме того, стабильность (устойчивость) проверяют в настоящем препарате в отсутствие Твин-20 и забуференном при рН 4,5, 5 и 5,5. Результаты показывают, что только в вышеуказанном препарате агрегация минимальна при рН 5. В препаратах, не содержащих Твин-20, агрегация варьируется от 0,5, примерно до 5%. Агрегация также выше при рН 4,5 и 5,5 по сравнению с агрегацией, обнаруживаемой при рН 5. Более низкие соотношения: маннит (препараты с содержанием сахарозы 0,2, 0,5 и 1%) дают более высокие уровни агрегации, обычно около 5%. С течением времени в вышеуказанном препарате (рецептуре) и в препарате, не содержащем Твин-20, уровень агрегации остаётся постоянным вплоть до одного года.
- 103 022424
Таблица 40.
Рс-ТМР в 10 мМ гистидина, различные препараты, 0,5 мг/мл Агрегация в % по определению методом 8ЕС ВЭЖХ
Рецептура Время ноль 3 месяца 11 месяцев
2% сахарозы, 4% маннита, рН 5.0 <0.1 <0.1 <01
(с 0.004% Твин 20)
2% сахарозы, 4% маннита, рН 4.5 2.4 2.9 -
2% сахарозы, 4% маннита, рН 5.0 0.5 1.6 0.8
2% сахарозы, 4% маннита, рН 5.5 2.3 2.5 -
0.2% сахарозы, 5.1% маннита, рН 4.8 7.3 -
5.0
0.5% сахарозы, 4.8% маннита, рН 5.1 4.4 -
5.0
1% сахарозы, 4.5% маннита, рН 5.0 4.5 4.3 -
Образцы с оптимизированной рецептурой выбирают для проверки во временной точке 11 месяцев.
Было предпринято дополнительное изучение рецептуры с целью подтвердить существенное влияние Твин-20 на минимизацию агрегации. Все образцы в этих исследованиях готовят при рН 5 в присутствии и в отсутствие 0,004% Твин-20. В табл. 41 показана степень агрегации в процентах через временные интервалы ноль, 18 недель и 1 год хранения при 4°С в стабильном состоянии. В момент ноль сразу же после лиофилизации агрегация минимальна во всех образцах, содержащих 0,004% Твин-20. Малые степени агрегации наблюдаются в образцах, не содержащих Твин-20, причём наибольшее количество агрегатов находится в препарате с 0,2% сахарозы. Эффективность Твин-20 при минимизации агрегации также проявляется во временной точке 18 недель, при этом повышенное процентное содержание агрегатов обнаруживается в образцах, в которых отсутствует Твин-20 и при низких соотношениях сахароза:маннит. После хранения в течение одного года при 4°С степень агрегации также систематически низка в образцах, содержащих Твин-20.
Таблица 41.
Рс-ТМР в 10 мМ гистидина, различные препараты, 0,5 мг/мл Агрегация в % по определению методом 8ЕС ВЭЖХ
Рецептура Время ноль 4 месяца 1 ГОД
2% сахарозы, 4% маннита, рН 5.0 <0.1 0.2 <01
(с 0.004% Твин- 20)
2% сахарозы, 4% маннита 0.2 0.2 -
2% сахарозы, 5.1% маннита <0.1 <0.1 <0.1
(с 0.004% Твин- 20)
2% сахарозы, 5.1% маннита 1.1 1.3 -
0.5% сахарозы, 4.8% маннита, (с <0.1 0.2 <0.1
0.004% Твин- 20)
0.5% сахарозы, 4.8% маннита 0.2 0.8 -
1% сахарозы, 4.5% маннита (с <0.1 <0.1 <0.1
0.004% Твин- 20)
1% сахарозы, 4.5% маннита 0.1 0.3 -
1/5% сахарозы, 4.8% маннита (с <0.1 <0.1 <0.1
0.004% Твин- 20)
1.5% сахарозы, 4.8% маннита 0.1 0.3 -
Образцы с Твин-20 выбирают для проверки во временной точке 1 год.
Другое исследование стабильности, предпринятое для того, чтобы проверить эффективность антиоксидантов, усиливающих протективный эффект Твин-20, в минимизации химического расщепления.
- 104 022424
Антиоксиданты не оказывают влияния на минимизацию химического расщепления во время хранения при повышенной температуре. Однако в вышеуказанном препарате (рецептура), содержащем 0,004% Твин-20 и Рс-ТМР с концентрацией 0,2 мг/мл, агрегация в момент ноль составляет < 0,1% после 5 месяцев хранения при 4°С. В том же препарате, не содержащем Твин-20, агрегация в момент ноль составляет 0,4%, а после хранения в течение 5 месяцев агрегация составляет 1%.
Результаты, полученные при исследовании стабильности, представлены в табл. II, III и вышеуказанные исследования иллюстрируют протективное (защитное) действие Твин-20 при минимизации агрегации в процессе лиофилизации.
Увеличение агрегации со временем минимален, так как во временных точках при хранении вплоть до 1 года при 4°С не наблюдается заметного увеличения агрегации в образцах, приготовленных с 0,004% Твин-20. На основании результатов, полученных при изучении стабильности, показывающих, что добавление Твин-20 сводит к минимуму агрегацию при лиофилизации, начинают проводить работу с рекомендованной рецептурой (препаратом) в больших масштабах.
Масштабные исследования
Агрегация зависит от концентрации
Начальное масштабное исследование предпринимают с целью смоделировать производственные условия и изучить устойчивость рецептуры при транспортировке и стабильность при реконституции (восстановлении). Рс-ТМР подвергают обмену в буфер для препарата, используя ультрафильтрационную установку с тангенциальным потоком жидкости, аналогично крупномасштабным процессам. Затем белок разводят до концентраций 0,5 и 1 мг/мл, при этом Твин-20, также добавляют перед конечной стадией фильтрации. После того, как образец приготовлен, начинают лиофилизацию. Типичный процесс лиофилизации представлен ниже.
Стадии термической обработки
Темп. Время Линейн. измен.(К)/выдерж.(Н)
Стадия #1 -50 120 К
Стадия #2 -50 120 Н
Стадия #3 -13 60 К
Стадия #4 -13 360 Н
Стадия #5 -50 60 К
Стадия #6 -50 60 н
Темп, замерзания -50°С
Дополнительное замораживание 0 мин Заданное значение в конденсаторе -60°С Заданное значение вакуума 100 мТорр (13.3 Па)
Стадии первичной сушки
Темп. Время Вак. Линейн. измен.(К)/выдерж.(Н)
Стадия #1 -50 15 100 Н
Стадия #2 -25 120 100 К
Стадия #3 -25 600 100 н
Стадия #4 -25 600 100 н
Стадия #5 0 800 100 к
Стадия #6 25 800 100 к
Стадия #7 25 800 100 н
Стадия #8 25 800 100 н
Стадия #9 25 0 100 н
Стадия #10 25 0 100 н
Стадия #11 25 0 100 н
Стадия #12 25 0 100 н
Стадия #13 25 0 100 и
Стадия #14 25 0 100 и
Стадия #15 25 0 100 н
Стадия #16 25 0 100 н
Последующ. 25 100 100 н
нагрев
Вторичная температура 28°С
Пассивное хранение при 4°С приводит к более высокой агрегации при низкой концентрации РсТМР (0,1 мг/мл). В момент ноль агрегация, по определению ЗЕС-ВЭЖХ, составляет 0,4% в препарате с концентрацией 0,1 мг/мл, тогда как в препарате с концентрацией 0,5 мг/мл эта величина равна 0,1%. После хранения в течение шести месяцев при охлаждении уровень агрегации остаётся тем же самым, что и в образцах в момент ноль при обеих концентрациях Рс-ТМР, что согласуется с результатами предыдущих исследований стабильности. Вследствие того, что при самой низкой концентрации (0,1 мг/мл) наблюдается повышенное количество агрегатов, было решено, что 0,5 мг/мл является наиболее подходящей концентрацией для дальнейшей работы в большем масштабе.
Агрегация не увеличивается при моделированном сдвиге
Лиофилизированные образцы (не восстановленные) из начального масштабного исследования под- 105 022424 вергают также моделированной наземной и воздушной транспортировке с помощью оборудования для моделирования стресса. Коротко говоря, следуют протоколу, описанному в А8ТМ (Американское общество по испытанию материалов), Метод # Ώ-4728. Моделированную наземную и воздушную транспортировку осуществляют, используя вибрационную электродинамическую установку (стол), модель 8202, и усилитель мощности модель # ТА240 (ϋηΗοΐ!ζ-ΏΚ^ Согрогайоп, А'аШпцЮгЗ, СТ). После воздействия транспортировки физические свойства лиофилизированных брикетов сравнивают с физическими свойствами пассивного контроля, в результате выясняют, что никаких морфологических изменений не наблюдается. Как химическая, так и физическая стабильность являются приемлемыми, при этом агрегация соответствует в образцах, подвергавшихся воздействию, и в пассивных контрольных образцах (<0,1% в образцах с концентрацией 0,5 мг/мл по сравнению с 0,4% в образцах с концентрацией 0,1 мг/мл).
Стабильность при восстановлении (реконституции) в данном исследовании изучают, готовя свежевосстановленные образцы и инкубируя их в течение 3, 7 и 14 дней либо пассивно, при медленном вращении (барабана), либо при энергичном встряхивании. В табл. 42 представлены результаты для рецептур с концентрацией 0,1 и 0,5 мг/мл. Как и ожидалось, степень агрегации сводится до минимума в рецептурах с концентрацией 0,5 мг/мл. При сравнении образцов, подвергавшихся медленному вращению, с образцами без перемешивания значимого повышения агрегации не наблюдается в течение 14 дней. Степень димеризации в этих рецептурах (составах, препаратах) (во вращающемся барабане и без вращения) также согласуются. Интересно отметить, что результаты, полученные на образцах при встряхивании, очевидно выявляют тенденцию; т.е. агрегация падает до уровня ниже детектируемых после времени ноль в образцах с концентрацией как 0,1, так и 0,5 мг/мл. В то же время соответствующее повышение степени димеризации наблюдается в большинстве встряхиваемых образцов в каждой временной точке, наводя на мысль, что существует некоторая обратимость в переходе от состояния агрегата к состоянию димера под действием сдвига Рс-ТМР.
Таблица 42
Рс-ТМР в 10 мМ гистидина с 2% сахарозы, 4% маннита и 0.004% Твин-20, рН 5 Агрегация и димеризация в процентах после хранения при 4°С по данным 8ЕС-ВЭЖХ
0.1 мг/мл Время ноль агр., димер 3 дня агр., димер 7 дней агр., димер 14 дней агр., димер
Без вращения 0.4, 0.3 1.2, 0.6 1.1, 0.4 1.0, 0.4
Вращение в барабане 0.4, 0.3 0.7, 0.4 0.7, 0.3 1.1, 0.3
Встряхивание 0.4, 0.3 <0.1, 0.9 <0.1, 0.1 <0.1, 1.6
0.5 мг/мл
Без вращения 0.1, 0.5 0.2, 0.5 0.2, 0.5 0.2, 0.6
Вращение в барабане 0.1, 0.5 0.2, 0.6 0.1, 0.6 0.1, 0.6
Встряхивание 0.1, 0.5 <0.1, 0.9 <0.1, 1.0 <0.1, 2.2
Вторичная сушка в течение 12 ч в цикле лиофилизации достаточна для сведения к минимуму остаточной влаги
Проводят второе масштабное исследование, в котором Рс-ТМР обменивают в буфер и разводят до концентрации 0,5 мг/мл в рекомендуемом препарате. Лиофилизацию осуществляют в цикле, состоящем из стадии начального замораживания при -50°С с последующим отжигом при -13°С. Затем температуру плавно понижают до -50°С, выдерживают один час и первичную сушку начинают при -50°С в вакууме 100 мТорр (13,3 Па). После короткого периода выдерживания при -50°С температуру постепенно доводят до -25°С в течение 2 ч, выдерживают при -25°С в течение 20 ч, а затем постепенно поднимают температуру до 25°С, примерно через 27 ч для начала вторичной сушки. Вторичную сушку проводят минимум в течение 12 ч при 25°С. В процессе цикла лиофилизации образцы вынимают через 12, 18 и 24 ч вторичной сушки для проверки стабильности и сравнения уровня остаточной влаги. Результаты показывают, что остаточная влага, определённая титрованием по Карлу Фишеру, составляет около 0,6% или менее (табл. 43) во всех изученных образцах. Содержание влаги также является низким в брикетах в буфере плацебо. На основании этой работы время вторичной сушки в цикле лиофилизации может быть сокращено до диапазона 12-18 ч.
- 106 022424
Таблица 43
Остаточная влага в Рс-ТМР Время вторичной сушки 12, 18 и 24 ч
Время вторичной сушки Влага в % по Карлу Фишеру
12 часов 0.23
12 часов 0.38
Буфер плацебо 0.43
18 часов 0.63
18 часов 0.28
Буфер плацебо 0.3
24 часа 0.46
24 часа 0.37
Буфер плацебо 0.31
Результаты изучения стабильности также сравнимы во временном диапазоне этой вторичной сушки, так как они не отличаются по химическим и физическим свойствам. Например, степень агрегации <0,1% для всех изученных образцов, тогда как процентное содержание димера постоянно равно 0,1%. Эти результаты подтверждают, что время вторичной сушки можно сократить до менее 24 ч, что не влияет на начальную стабильность белка.
Дополнительно проводят работу по оценке устойчивости (робастности) препарата (состава, рецептуры) при различных концентрациях эксципиента. Так как в предыдущем исследовании стабильности показано, что сахароза, например, может влиять на стабильность, необходимо было изучить робастность Ре-ТМР при малых изменениях уровней эксципиента.
Статистическое исследование Ре-ТМР
Робастность препарата
Начальное статистическое исследование предпринято с целью исследовать минорные изменения переменных в рецептуре, таких как рН рецептуры, концентрация гистидинового буфера и отношение сахароза: маннит, с помощью программного обеспечения Е-сЫр. Эти образцы лиофилизируют, но используют не оптимальный цикл лиофилизации, который приводит в результате к более высокой степени агрегации, чем наблюдаемый обычно. Исследование является скринингом, предполагающим линейную модель поверхности отклика. Результаты оценки стабильности показывают, что рН (4,7-5,3) и концентрация гистидинового буфера (варьирующаяся от 5 до 15 мМ) оказывает малое влияние на стабильность Рс-ТМР. Для того, чтобы проверить вклад Твин- 20 и отношения сахароза:маннит в стабильность РсТМР, предпринимают последующее исследование с применением статистического дизайна, используя более оптимальный цикл лиофилизации.
Квадратичная модель для статистического анализа стабильности
Во втором статистическом исследовании с применением статистического дизайна изучают варианты концентрации Твин-20 (0,001, 0,0045 и 0,008%), отношения сахароза: маннит (1,7:4.2, 2:4 и 2.3:3.8) и варианты концентрации белка (0,3, 0,65 и 1 мг/мл). Величину рН рецептур также доводят до 4,7, 5 и 5,3, а концентрация гистидинового буфера варьируется, составляя 7, 10 и 13 мМ. Готовят образцы и лиофилизируют в лиофилизаторе νΐΓΐΐδ (8Р ПккМпе®, 1пс., ОагШпег, ΝΥ), при этом используют оптимальный стабильный цикл, применяемый в предыдущих исследованиях стабильности. Результаты, полученные при изучении стабильности, интерпретируют, используя Е-сЫр (программное обеспечение для статистического дизайна Носкеззт, ЭЕ) двумя путями: оценивая влияния переменных в рецептуре на степень агрегации и димеризации, наблюдаемых в момент ноль, и влияние переменных рецептуры на воздействие хранения при повышенной температуры (37°С) на стабильность, измеряемое скоростями изменения по сравнению со временем ноль.
Результаты, полученные для рецептуры в начальный момент времени (время ноль) из квадратичной модели для статистического анализа
Результаты, полученные для начального момента (время ноль), показывают, что, как и ожидалось, Твин-20 сводит агрегацию до минимального значения, однако концентрация белка также важна для уменьшения тенденции к агрегации при лиофилизации. Программа Е-сЫр позволяет оценивать влияние, которое различные вводимые переменные (характеристики препарата) оказывают на агрегацию и димеризацию Рс-ТМР в процессе лиофилизации. Что касается димеризации Рс-ТМР в начальный момент (время ноль), ни один рассматриваемый эксципиент в рецептуре (по результатам, полученным с применением Е-сЫр) не оказывает заметного влияния. Некоторые переменные величины рецептуры влияют на степень агрегации, наблюдаемой при лиофилизации Рс-ТМР. Обобщая результаты, полученные с помо- 107 022424 щью программы Е-сЫр, можно сказать, что концентрация Рс-ТМР оказывает наибольшее влияние на степень агрегации в момент ноль, затем идёт уровень Твин-20. Наивысшая степень агрегации в момент ноль наблюдается в образцах с низкой концентрацией. Аналогично, более высокое содержание Твин-20 вызывает более высокий протективный эффект при минимизации агрегации в момент ноль, хотя эта тенденция не так значима, как влияние концентрации белка. В данном исследовании наблюдается более высокая степень агрегации по сравнению с результатами предыдущих исследований, а в некоторых образцах с более низкими концентрациями белка в присутствии Твин-20 получают величину агрегации около 0,5%.
Отмечают, что изменчивость (дисперсия) агрегации падает по мере повышения концентрации белка. При концентрации 0,5 мг/мл и выше средняя агрегация Рс-ТМР ниже, чем в образцах с концентрацией 0,3 мг/мл или ниже.
Твин-20 в концентрации 0,004% эффективно уменьшает до минимума агрегацию в процессе хранения при повышенной температуре
Статистический дизайн используют также для оценки изменений в процессе хранения при повышенной температуре. Сравнивают скорости агрегации при различных характеристиках рецептур после 16 дней хранения при 37°С, вычитая результаты, полученные при повышенной температуре, из исходных (момент времени ноль) результатов и нормализуют по отклику на момент один месяц. Таким образом, отрицательные скорости относятся к видимой потере определяемого свойства во времени. Переменные отклика (соответствующие результатам анализов) определяют методами ОФ-ВЭЖХ (чистота в процентах основного пика и процентное содержание области перед пиком), катионообменной ВЭЖХ (чистота в процентах основного пика), эксклюзионной хроматографии (агрегация и образование димера) и ΝΙΚ для воды (остаточная влага методом ИК-спектроскопии, которая коррелирует с результатами титрования по Карлу Фишеру в некоторых образцах для проверки точности).
Результаты сравнения скоростей изменения, полученные каждым аналитическим методом, показывают, что изменения агрегации и ОФ-ВЭЖХ окисление статистически значимы в отношении концентрации Рс-ТМР и концентрации Твин-20 в квадрате в пределах двух стандартных отклонений. Наиболее вероятно, что квадратный член для Твин-20 возникает вследствие квадратичного характера (модели) исследования, который предполагает кривую поверхность отклика. В данном случае квадратный член для Твин-20 лучше соответствует модели, помимо возможного предположения, что существует интерактивный отклик, который сам по себе влияет на стабильность. Другие определяемые показатели, например, такие как чистота в процентах основного пика по методу катионообменной ВЭЖХ или различные величины рН не показывают значимого отклика - влияния на стабильность белка.
Как и в ранее обсуждавшемся начальном масштабном исследовании (образцы с вращением в барабане, без вращения и встряхиваемые образцы), степень агрегации ниже после хранения при высокой температуре. Скорость изменения в этих образцах используют для того, чтобы делать прогнозы на основании статистической модели (квадратичное исследование), предвосхищая протективный эффект Твин20. В табл. 44 показаны прогнозируемые величины степени агрегации, ожидаемой на основании модели статистического дизайна, по мере повышения концентрации Твин-20 от 0 до 0,008%. Как видно, скорость агрегации, нормализованная по одному месяцу при 37°С, отрицательна (это указывает на потерю (уменьшение) агрегации в этих условиях) за исключением образца с 0% Твин-20, в этом случае агрегация по прогнозам должна расти. Скорость потери агрегации предстаёт в виде плато при концентрациях Твин200.002% и выше, это наводит на мысль, что для минимизации физического распада достаточно низких уровней Твин-20 (0,002-0,006%). Скорость увеличения содержания димера соответственно аналогична в этих условиях и статистически не коррелирует с какими-либо экципиентами рецептуры, как указывается ранее.
Таблица 44
Прогнозирование на основании статистической квадратичной модели Различная концентрация Твин-20 и Рс-ТМР На основании 16 дней инкубации при 37°С (нормализовано по одному месяцу)
% Рс-ТМР % 8ЕС Предсказанные %ОФ- ВЭЖХ Предсказанные
Твин 20 (мг/мл) Агрегация пределы Окисление пределы
0 0.5 0.09 (-0.32, 0.50) 0.47 (-2.59, 1.65)
0.002 0.5 -0.35 (-0.69, -0.0) -0.68 (-2.44, 1.08)
- 108 022424
0.004 0.5 -0.53 (-0.87, -0.19) -0.58 (-2.32, 1.17)
0.006 0.5 -0.45 (-0.78, -0.12) -0.17 (-1.86, 1.52)
0.008 0.5 -0.12 (-0.46, -0.21) 0.54 (-1.18, 2.26)
0.004 0.3 -0.59 (-0.94, -0.25) 0.58 (-1.18, 2.34)
0.004 0.1 -0.63 (-1.10, -0.16) 2.69 (0.28, 5.09)
Скорость изменения величины окисления, измеряемая методом ОФ-ВЭЖХ при концентрации 0,5 мг/мл, при этом предполагается, что она соответствует изменениям в области перед пиком в каждой хроматограмме, не является статистически значимой в отношении квадратного члена Твин-20. В этом случае модель (как показано в табл. 44) предсказывает, что при изменении концентрации Твин-20 скорость окисления остаётся постоянной в пределах предсказанных интервалов. Концентрация белка влияет на окисление, так как скорость повышается с 0,58 до 2,69 по мере уменьшения концентрации белка с 0,3 до 0,1 мг/мл (при этом концентрация Твин-20 постоянна и равна 0,004%.).
Эти результаты наводят на мысль, что с точки зрения стабильности поддержание концентрации Твин-20 между 0,002 и 0,006% является желательным. Количество белка также важно, так как стабильность ухудшается при концентрациях ниже 0,5 мг/мл.
Стабильность при пониженной температуре (охлаждении)
Принимая во внимание вышесказанное, для определения стабильности лиофилизированного РсТМР при пониженной температуре используют следующую рецептуру: 0,5 мг/мл Рс-ТМР в 10 мМ гистидина, забуференного при РН 5, 2% сахарозы, 4% маннита и 0,004% Твин-20.
Осуществляют мониторинг рецептуры, проверяя стабильность при пониженной температуре (охлаждении) в течение одного года. В табл. 45 приводятся результаты этого исследования по определению стабильности в момент ноль (начальный момент), через 3 месяца и через 1 год. Как видно, чистота в процентах основного пика, по определению методами обращенно-фазовой и катионообменной ВЭЖХ, уменьшается во времени. Минорные расхождения в чистоте основного пика во времени обычны для нормальной вариации разрешения хроматографических колонок и также наблюдаются в замороженном стандартном образце. Агрегация в процентах стабильна и явно не увеличивается через один год.
Таблица 45
Процентное содержание основного пика по определению методом обращённо-фазовой ВЭЖХ Временная точка
Концентрация 0 3 месяца 1 год
0.3 81.0 82.5 82.4
0.5 69.0 82.7 83.4
1.0 80.6 82.4 83.2
Замороженный 82.4 84.0 84.5
исходный материал
Процентное содержание основного пика по определению методом катионообменной ВЭЖХ Временная точка
Концентрация 0 3 месяца 1 год
0.3 67.0 71.8 81.8
0.5 73.5 83.7 80.0
1.0 74.2 79.7 80.5
Замороженный 75.3 77.0 83.6
Процентное содержание агрегатов по определению методом эксклюзионной ВЭЖХ Временная точка исходный материал
Концентрация 0 3 месяца
0.3 <0.1 0.1
0.5 <0.1 <0.1
1.0 <0.1 <0.1
Замороженный исходный материал 0.1 0.1
Рс-ТМР готовят в 10 мМ растворе гистидина, забуференном при рН 5,0, с 2% сахарозы, 4% маннита и 0,004% Твин-20. Было показано, что рН 5 является более оптимальным для стабильности и что отно- 109 022424 шение сахароза:маннит является решающим для минимизации химического расщепления в процессе хранения при повышенной температуре для данной белковой системы. Твин-20 необходим при низкой концентрации, чтобы свести к минимуму степень агрегации, которая является результатом процесса лиофилизации.
Пример 8. Лиофилизированный Рс-Апд-2 связывающий пептид
Для того, чтобы определить оптимальную рецептуру для лиофилизированного Рс-Апд-2 связывающего пептида, проводят анализы по оценке агрегации и стабильности Рс-Апд-2 связывающего пептида при различных значениях рН, концентрациях эксципиента и концентрациях белка.
Связывающий пептид Рс-Апд-2 состоит из двух фармацевтически активных полипептидных молекул, связанных с С-концом Рс участка молекулы антитела 1дС1. Молекула содержит 574 аминокислотных остатков с общей молекулярной массой 63511 Дальтон, р1 молекулы составляет 5,45. В каждом из активных полипептидов имеются две дисульфидных связи. Всего в молекуле присутствует 20 цистеиновых остатков, основная часть которых окисляется по дисульфидным мостикам. Последовательность РсАпд-2 связывающего пептида представлена ниже:
МОКТНТСРРСРАРЕЬЬООРЗУРЬРРРКРКОТЬМ18КТРЕУТСУУУОУ8НЕОРЕУКРМ
ΧνγνΟΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕρΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗρϋλνΕΝΟΚΕΥΚΟΚνδΝΚΑΕΡΑ
ΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΡΕΡρνΥΤΕΡΡδΚΟΕΕΤΚΝΟνδΕΤΟΕνΚΟΡΥΡδΟΙΑνΕλνΕδΝΟΟΡΕ
ΝΝΥΚΊΎΡΡνΕΟ3ΟΟ3ΡΡΕΥ3ΚΕΤνθΚ3ΚΛ¥(3(3ΟΝνΡ303νΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤ(3Κ3Ε3Ε3
РОКОООООАО(ЗЕЕСЕ5УЕ>Р\УТСЕР[МОЗОЗАТСОЗОЗТАЗЗОЗОЗАТН(ЗЕЕСЕ\УОР\У
ТСЕНМЬЕ (ЗЕ(3 Ю ΝΟ: 2)
Рс участок 1дС1 заканчивается К228. С229-С233 представляют собой линкерную последовательность. Активный полипептид начинается с А234 и продолжается на протяжении остальной последовательности.
Скрининг лиофилизированного Ге-Апд-2 связывающего пептида при различных значениях рН
Проводят проверку (скрининг) стабильности Рс-Апд-2 связывающего пептида при рН 4,0, 7,0 и 8,0. Проверяемые буферы с рН 4,0 включают глутаминовую кислоту, натрий-нитратный и натрийсукцинатный буфер, каждый с концентрацией 10 мМ. Проверяемые буферы с рН 7,0 представляют собой гистидиновый буфер и Трис-буфер, каждый с концентрацией 10 мМ. Гистидиновый буфер и Трис-буфер также подвергают скринингу при рН 8,0, каждый с концентрацией 10 мМ. Каждый из буферов содержит 4% маннита в качестве агента для формования (отверждения) при лиофилизации и 2% сахарозы в качестве эксципиента. Кроме того, гистидиновый буфер при рН 7,0 изучают в присутствии и в отсутствие поверхностно-активного вещества, 0,01% Твин-20 (вес./вес.). Белок разводят до концентрации 5 мм/мл каждым из буферов рецептуры. Затем этот раствор подвергают диализу в каждый из буферов рецептуры, используя диализную трубку с пределом исключения 10000 Да, где всего осуществляют 6 замен при минимальном времени равновесия между заменами 4 ч. После диализа алкивоты белка в объёме 1 мл помещают в виалы на 3 мл. Эти виалы затем лиофилизируют в лабораторном лиофилизаторе. После лиофилизации виалы герметично закрывают и хранят, инкубируя при 4, 29 и 37°С, причём отдельные виалы заполняют и анализируют в различные моменты времени, начиная сразу после лиофилизации и продолжая до момента 24 месяца. Образцы восстанавливают соответствующим объёмом воды и анализируют стабильность белка, используя эксклюзионную (гель-)жидкостную хроматографию и электрофорез в геле (которые позволяют определять агрегацию, димеризацию и протеолитическое расщепление), анионообменную хроматографию (позволяющую детектировать окисление). Кроме того, анализируют свойства отжатого осадка (лепёшки, брикета), такие как время восстановления (реконституции) и содержание влаги и свойства восстановленного раствора (такие как рН).
Скрининг (поиск) эксципиента для лиофилизированного Рс-Апд-2 связывающего пептида
Скрининг эксципиента проводят в единственном буфере, 10 мМ гистидина при рН 7,0. В данном исследовании сравнивают два эксципиента: 0,85% аргинина и 1% сахарозы. Агентом для отверждения (формования), используемым с аргинином, является 4% маннит, а агентом для отверждения (формования), используемым с сахарозой, является 2% глицин. Тестирование каждой рецептуры проводят при концентрациях белка 1, 30 и 60 мг/мл. Кроме того, проводят тестирование одной рецептуры, содержащей комбинацию маннит + сахароза, с концентрацией (белка) 30 мг/мл. Каждая рецептура содержит 0,01% Твин-20. Белок сначала концентрируют до 70 мг/мл и подвергают диализу в соответствующую рецептуру в лабораторной ультрафильтрационной/диафильтрационной установке. Затем белок разводят до каждой из трёх концентраций подходящим для рецептуры буфером. После диализа аликвоты белка в объёме 1 мл помещают в виалы на 3 мл. Эти виалы затем лиофилизируют в лабораторном лиофилизаторе. После лиофилизации виалы герметично закрывают и хранят для инкубации при 4, 29, 37 и 52°С, причём отдельные виалы заполняют и анализируют в различные моменты времени, начиная сразу после лиофилизации и продолжая до момента 24 месяца. В образцах анализируют стабильность белка, используя эксклюзионную (гель-)жидкостную хроматографию, анионообменную хроматографию и 8О8-РАСЕ. Анализируют свойства лиофилизированного (отжатого) осадка и восстановленных жидких растворов.
- 110 022424
Скрининг на концентрацию лиофилизированного Ге-Апд-2 связывающего пептида
Скрининг на концентрацию проводят в буфере 10 мМ гистидина при рН 7,0 с 4% маннита в качестве агента для отверждения и 2% сахарозой в качестве эксципиента. Белок концентрируют примерно до 140 мг/мл и подвергают диализу в соответствующую рецептуру в лабораторной ультрафильтрационной/диафильтрационной установке. Затем белок после диализа разводят до концентраций 30, 60 и 120 мг/мл в буфере для рецептуры. Далее аликвоты белка в объёме 1 мл помещают в стеклянные виалы на 3 мл. Виалы лиофилизируют в лабораторном лиофилизаторе. После лиофилизации виалы герметично закрывают и хранят для инкубации при 4, 29, 37 и 52°С, причём отдельные виалы заполняют и анализируют в различные моменты времени, начиная сразу после лиофилизации и вплоть до момента 24 месяца. В образцах анализируют стабильность белка, используя эксклюзионную (гель-)хроматографию, анионообменную хроматографию и δϋδ-РАОЕ. Анализируют также свойства лиофилизированного (отжатого) осадка и восстановленных жидких растворов.
Вывод
С учётом вышеизложенного оптимальная(ые) рецептура(ы) содержит 10 мМ гистидина, 4% маннита, 2% сахарозы, 0,01% Твин-20, рН 7,0.
Пример 9. Лиофилизированный Те-Адр-3 связывающий пептид
Для определения оптимальной рецептуры для лиофилизированного Те-Адр-3 связывающего пептида проводят анализы, позволяющие оценить агрегацию и стабильность Те-Адр-3 связывающего пептида при различных значениях рН, концентрациях эксципиента и белка.
Те-Адр-3 связывающий пептид представляет собой Ν-связанное пептидное антитело против фактора активации В клеток (ВАТТ), нацеленное на заболевания, связанные с В клетками. Пептидное антитело конструируют из двух негликозилированных связанных дисульфидным мостиком полипептидов с общей массой ~63,6 кД. Определено, что изоэлектрической точкой этого пептидного антитела является рН 7,36.
Последовательность Те ^ЕР ГО ΝΟ: 1696):
УОКТНТСРРСРАРЕЬЕООР8УРЕРРРКРКОТЬМ18КТРЕУТСУ
УУОУЗНЕОРЕУКРКАУУУООУЕУНЯАКТКРКЕЕрУКЗТУКУУ
8УЕТУЕН9О\УЕКОКЕУКСКУ5ККАЕРАР1ЕКТ18КАКОрРКЕ
ΡρνΥΤΕΡΡδΚΟΕΕΤΚΝρνδΕΤσΕνΚΟΡΥΡδΟΙΑνΕλΥΕδΝΟρΡ
Е Ν Ν Υ КТТ Р Р V Р1Э 8 О С 8 Р Р I. Υ 8 К Ь Т V I) К 8 К У/() () С Ν V Р 8 С 8 V Μ
ΗΕΑΕΗΝΗΥΤρΚδΕδΕδΡΟΚ
Последовательность Адр-3 связывающего пептида ^ЕР ГО ΝΟ: 1697):
ОСК\УОЕЫК()\УУСОРЕО8ОЗАТОО8О8ТА8О8О8АТНМЕР
ОСКАУОЬЫКРАУУСОРЬООООО
Таким образом, последовательность Те-Адр-3 связывающего пептида является следующей: ОСК\УОЕЫКр\УУСОРЕ63СЗАТООЗеЗТАЗЗОЗОЗАТНМЕР ОСКХУОЬЫКО^УСОРЕОООООУОКТНТСРРСРАРЕЕЕООРЗ VР Ь Р РРК РΚϋТЬ ΜI 3 ЯТРЕ V ТС V V V ϋ V 3 НЕ ϋРЕ VКΡΝΨ Υ Vϋ О V Е V Η N А К ТК Р ЯЕ Е () ΥΝ δ Т Υ Я V V δ V Ь Т V Ь Н <3 ϋ XV Ь N О К Е Υ К ΕΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟρΡΕΕΡρνΥΤΕΡΡδΕϋΕΕΤΚΝρ УЗ ЬТС Ь УКС Р ΥΡ3 ϋΐ А V ΕΨΕ3Ν Οί^ΡΕΝΝ Υ КТТР Р V ЬО8 ϋθ 8 Р ΡΕΥδΚΕΤνθΚ8Ε\νρ9ΟΝνΡδΕδνΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤζ)ΚδΕδΕδΡ 6Κ(δΕΟΙϋΝΟ: 1698)
Расширенный рН скрининг Ге-Адр-3 связывающего пептида при концентрации 10 мг/мл
Прежде всего определяют стабильность эксклюзионной ВЭЖХ ^Е-ВЭЖХ), она является показателем стабильности при повышенных температурах. Для определения характеристик стабильности и восстановления лиофилизированного Те-Адр-3 связывающего пептида в диапазоне рН 3,85-7,6, 10 мг/мл ТеАдр-3 связывающий пептид готовят в различных буферах с концентрацией 10 мМ в присутствии 2,5% маннита и 2,0% сахарозы. Следующие буферы тестируют в примерном инкременте 0,5 единиц рН: ацетатный, сукцинатный, гистидиновый, пирофосфатный, фосфатный и Трис.
Для исследования по разработке рецептуры получают очищенный объёмный материал в виде замороженной (жидкой) рецептуры с концентрацией 30 мг/мл. Материал подвергают диализу в соответствующие буферы для рецептур и лиофилизируют в лиофилизаторе V^^!^к, используя стабильный цикл. Стадию отжига проводят при -20°С и выдерживают в течение 4 ч, что способствует кристаллизации маннита. Первичную сушку осуществляют при температуре хранения -25°С в течение 20 ч. Первичная сушка полностью завершается при -25°С, так как никаких всплесков вакуума не наблюдается при повышении температуры до 0°С. Никакого оседания не наблюдается и образцы последовательно подвергаются вторичной сушке сначала при 0°С, а затем при 25°С. При реконституции (восстановлении) рецептуры с величиной рН 7 или выше слегка мутные, в то время как все другие рецептуры прозрачны. Это объясняется
- 111 022424 близостью рецептур с высоким рН к изоэлектрической точке Рс-Адр-3 связывающего пептида (р1=7,36). Методом ЗЕ-ВЭЖХ показано, что димер является основной высокомолекулярной частицей. Определяют, что относительное процентное содержание (%) димера строго зависит от рН, причём самая низкая аккумуляция наблюдается при рН 5 и ниже. Количество растворимых агрегатов также в некоторой степени зависит от рН. Перед лиофилизацией в образцах совсем не наблюдается растворимых агрегатов. Напротив, во всех рецептурах перед лиофилизацией присутствует малое количество димера, и оно дополнительно увеличивается в восстановленных образцах после лиофилизации. Ни в одной рецептуре не наблюдается никакого заметного усечения (сокращения). Наивысшее количество интактного мономера наблюдается в рецептурах с ацетатным, сукцинатным и гистидиновым буфером при рН 5 и ниже. Расширенный рН скрининг Гс-Ацр-3 связывающего пептида при концентрации 30 мг/мл: стабилизирующий эффект сахарозы и маннита
Прежде всего определяют стабильность эксклюзионной ВЭЖХ (ЗЕ-ВЭЖХ), она является показателем стабильности. Для определения влияния присутствия 2.5% маннита и 3.5% сахарозы на характеристики стабильности и восстановления лиофилизированного Рс-Адр-3 связывающего пептида в диапазоне рН 4.5- 7.5, готовят Рс- Адр- 3 связывающий пептид в концентрации 30 мг/мл в сукцинатном, гистидиновом и фосфатном буферах. Пирофосфатный и Трис буферы исключают из исследования ввиду плохих показателей, полученных в предыдущем рН скрининге. Ацетатный буфер исключают ввиду возможных изменений рН в восстановленных образцах в результате сублимации ацетата в процессе лиофилизации.
Для исследований по разработке рецептуры получают очищенный объёмный материал в виде замороженной (жидкой) рецептуры с концентрацией 30 мг/мл. Материал подвергают диализу в соответствующие буферы для рецептур и лиофилизируют в лиофилизаторе Уийз, используя стабильный цикл. Стадию отжига проводят при -20°С и выдерживают в течение 5 ч, что способствует более полной кристаллизации маннита. Первичную сушку осуществляют при температуре (хранения) -25°С в течение 20 ч. Первичная сушка не полностью завершается при -25°С, так как наблюдаются всплески вакуума при повышении температуры (хранения) до 0°С. Никакого оседания не наблюдается и образцы последовательно подвергаются вторичной сушке сначала при 0°С, а затем при 25°С. При реконституции (восстановлении) рецептуры с рН около 7 слегка мутные, в то время как все другие рецептуры прозрачны. Как объясняется выше, это можно объяснить близостью рецептур с высоким рН к изоэлектрической точке Рс-Адр-3 связывающего пептида. Методом ЗЕ-ВЭЖХ показано, что димер является основной высокомолекулярной частицей. Опять же, определяют, что относительное процентное содержание (%) димера строго зависит от рН, причём самая низкая аккумуляция наблюдается при рН 5 и ниже. В случае количества растворимых агрегатов чёткой зависимости от рН не наблюдается. Перед лиофилизацией в образцах совсем не наблюдается растворимых агрегатов. Перед приготовлением рецептуры в массе не-СМР (неводорастворимого полимера) присутствует ~0,6% димера, и это количество возрастает до 3,0% для рецептур с высокими рН перед лиофилизацией в результате буферного обмена/концентрации.
Зависимость аккумуляции димера от рН подтверждается также точным соответствием относительного количества димера при данном рН вне зависимости от типа буфера. Процентное содержание (%) не повышается заметно после лиофилизации, как явствует из данных для образцов при Т=0. Единственным исключением являются образцы, не содержащие как сахарозы, так и маннита, в которых наблюдается заметное ~0,25-0,5% увеличение процентного содержания (%) димера. В присутствии сахарозы потеря (уменьшение) основного пика в рецептурах с сукцинатным и гистидиновым буфером с рН 4.1 и 4.7 соответственно минимальна, даже после буферного обмена/лиофилизации. По сравнению с ними для всех рецептур с фосфатным буфером наблюдается потеря (уменьшение) основного пика перед лиофилизацией ~3%. Хотя лепёшка (формованная, высушенная масса) образуется даже в отсутствие как сахарозы, так и маннита, содержание соответствующего основного пика снижается на 0,5-0,7% по сравнению с рецептурами, содержащими сахара. Кроме того, восстановление не содержащих сахаров рецептур происходит значительно (>2 мин) дольше и требует некоторого перемешивания. Чтобы гарантировать робастность высушенной массы (лепёшки), во последующие рецептуры в качестве наполнителей включают маннит или глицин, несмотря на то, что показано, что одна сахароза придаёт достаточную стабильность белку.
Точный рН скрининг Ге-Адр-3 связывающего пептида при концентрации 30 мг/мл
Прежде всего определяют стабильность эксклюзионной ВЭЖХ (ЗЕ-ВЭЖХ) и обращённо- фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), они являются показателями стабильности при повышенных температурах. Так как % выхода основного пика (основной фракции) выше при рН 5 и ниже, фосфатный буфер исключают вследствие скрининга в узком рН. Помимо сукцинатного и гистидинового буферов, которые дают хорошие результаты при расширенном рН скрининге, точный (узкий) рН скрининг включает 10 мМ глутамата, рН 4-6. Рецептуры проверяют с инкрементами 0,2 рН единиц. Содержание сахарозы и маннита постоянны и составляют 3,5 и 2,5% соответственно, за исключением двух рецептур в сукцинатном буфере при рН 4.5, содержащих 2,0 и 5,0% сахарозы. Также при каждых инкрементах в одну рН единицу тестируют шесть потенциальных лиофилизированных стандартных рецептур, таких как представленные ниже:
1) 20 мМ гистидина, 2,0% глицина, 1,0% сахарозы при рН 5.0
2) 20 мМ гистидина, 2,0% глицина, 1,0% сахарозы при рН 6.0
- 112 022424
3) 20 мМ гистидина, 2,0% глицина, 1,0% сахарозы при рН 7,0
4) 20 мМ гистидина, 4,0% маннита, 2,0% сахарозы при рН 5,0
5) 20 мМ гистидина, 4,0% маннита, 2,0% сахарозы при рН 6,0
6) 20 мМ гистидина, 4,0% маннита, 2,0% сахарозы при рН 7,0
Для исследований по разработке рецептуры получают очищенный объемный материал в виде замороженной (жидкой) рецептуры с концентрацией 30 мг/мл. Материал подвергают диализу в соответствующие буферы для рецептур и лиофилизируют в лиофилизаторе УбИз, используя стабильный цикл. Цикл лиофилизации далее модифицируют. Стадию отжига проводят при -15°С, чтобы содействовать кристаллизации глицина, и выдерживают в течение 5 ч. Первичную сушку осуществляют сначала при температуре -30°С в течение короткого периода времени (4 ч). Затем температуру поднимают до -25°С и выдерживают при этой температуре в течение 24 ч. Однако первичная сушка не полностью завершается при -25°С, так как наблюдаются всплески вакуума при повышении температуры до 0°С. Тем не менее, никакого оседания не наблюдается и образцы последовательно подвергаются вторичной сушке сначала при 0°С, а затем при 25°С. Для оценки стабильности Ес-Адр-3 связывающего пептида данные о стабильности в лиофилизированном состоянии при 37°С получают вплоть до 6 месяцев. Повышение рН приводит к уменьшению содержания (потере) основного пика для всех рецептур с гистидином. Только стандартные рецептуры контролируют вплоть до 6 месяцев, но преимущество рН ниже 5,0 очевидно уже в моменты времени 1 и 3 месяца. Кроме того, 6-месячные данные наводят на мысль, что рецептуры с маннитом + сахарозой более устойчивы, чем рецептуры с глицином + сахарозой, в особенности при рН 6 и выше.
Для рецептур с глутаматом и сукцинатом всегда наблюдается чётко зависимое от рН увеличение количества димера, основного продукта деградации, по мере того как рН становится менее кислым. Аналогичная зависимость от рН наблюдается для агрегатов. Наивысший выход основного пика (основной фракции) наблюдается при рН 5 и ниже. Начальную потерю (уменьшение) основного пика для Т=0 можно объяснить деградацией белка в процессе буферного обмена и концентрирования, о чём свидетельствует аналогичная потеря для рецептур перед лиофилизацией. Однако данные о стабильности через 3 месяца наводят на мысль, что рецептуры в глутаматном буфере обладают более высокой физической стабильностью, чем их сукцинатные аналоги (с тем же рН). Следует отметить, что в данном исследовании мы также проверяли влияние повышенных концентраций сахарозы на стабильность рецептур с сукцинатом. Помимо рецептур с 3,5% сахарозы, мы сравнивали рецептуры в сукцинатном буфере, рН 4,5, содержащие 2,0 и 5,0% сахарозы. Повышение концентрации сахарозы вызывает уменьшение до некоторой степени количества высокомолекулярных частиц, но незначительно влияет на содержание основного пика. Следовательно, концентрацию сахарозы 3,5% считают оптимальной, так как такая рецептура более всего соответствует физиологической тоничности.
Методом ОФ-ВЭЖХ наблюдают увеличение одного из видов фрагментов при низком рН. Значительная часть рН-зависимого фрагментации в лиофилизированных препаратах происходит перед лиофилизацией в результате длительного буферного обмена и концентрирования. После лиофилизации никакого увеличения количества фрагментов не наблюдается даже при хранении в течение 3-6 месяцев при 37°С. В целом данные говорят о том, что для уменьшения фрагментации надо использовать рецептуры с более высоким значением рН, так как фрагментация не наблюдается при рН6 и выше. Однако, количество димера значительно при повышенных значениях рН и при рН 6 может составлять 2,5-4,5% и выше. Поэтому был найден компромиссный вариант, когда готовят Ес-Адр-3 связывающий пептид с рН 5, в котором фрагментация (усечение) умеренно, особенно в глутаматном и гистидиновом буферах, а образование димера всё ещё в достаточной степени подавлено.
Вывод
Содержание маннита 2,5% и сахарозы 3,5% обеспечивают достаточную стабильность белка и высушенной (формованной) массы (лепёшки, брикета), что подтверждается изучением рецептур после хранения в течение 6 месяцев при 37°С. Таким образом, для приготовления рецептуры, содержащей 30 мг/мл Ес-Адр-3 связывающего пептида, можно использовать растворы: 10 мМ гистидина, 2,5% маннита, 3,5% сахарозы с рН 5,0 и 10 мМ раствор глутамата, 2,5% маннита, 3,5% сахарозы с рН 5,0. Помимо этого данное исследование показывает, что раствор, содержащий 20 мМ гистидина, 4,0% маннита, 2,0% сахарозы с рН 5,0, также хорошо работает и его можно рассматривать в качестве вероятной стандартной рецептуры для пептидных антител.
Пример 10. Лиофилизированный Ес-Муо связывающий пептид
Для определения оптимальной рецептуры для лиофилизированного Ес-Муо связывающего пептида проводят анализы, позволяющие оценить агрегацию и стабильность Ес-Муо связывающего пептида при различных значениях рН, концентрациях эксципиентов и белка.
Ес-Муо связывающий пептид представляет собой С-связанное пептидное антитело против белка миостатина, нацеленный на заболевания, связанные с мышечным истощением. Пептидное антитело состоит из двух негликозилированных связанных дисульфидной связью полипептидов с общей массой ~59.1 кД. Изоэлектрическая точка этого пептидного антитела определена при рН 6,88.
- 113 022424
Последовательность Рс (8ЕР ΙΌ NО: 1699):
МОКТНТСРРСРАРЕЬЬООР8УРЬРРРКРКОТЕМ18КТРЕУТС νννον8ΗΕΟΡΕνΚΓΝ\νΥνθ6νΕνΗΝΑΚΤΚΡΚ.ΕΕρΥΝ3ΤΥΚ
УУЗУЕТУЕНООАУЕХеКЕУКСКУЗМКАЕРАР1ЕКТ15КАКС(3
ΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚΟΕΕΤΚΝρνδΕΤΟΕνΚΟΡΥΡδϋΙΑνΕΨΕδΝ
Ο9ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕϋδϋΟδΡΡΕΥδΚΕΤνθΚδΚΨ9ΡΟΝνΡδϋ δνΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤρΚδΕδΡδΡΟΚ
Последовательность миостатин-связывающего пептида (8ЕР ΙΌ NО: 1700):
ОООООАрЬАОНО<)С1 КАУР^УМСРРЕО\УЕ
Таким образом, последовательность Рс-Муо связывающего пептида выглядит следующим образом: МОКТНТСРРСРАРЕЬЬССР8УРЕРРРКРКОТЕМ18КТРЕУТС
V V УО V 8 Η Е О Ρ Η V К Р N А Υ V □ С V Е V 11N А КТ К Р Р Е Е () Υ N 8 Т Υ К
V У 8 V ЕТ V ЕН () I) А Е Ν (ί К Е Υ К С К V 8 N К Л ЕР А Ρ I ЕКТ I 8 К А К С ()
РКЕР(3 V ΥΊΈΡΡ8Κ.ΟΕΕΤΚΝ() УЗЬТСЬ V КСР Υ Р 8Э1 А УЕ ΨΕ8Ν
ΟΟΡΕΝΝ ΥΚΤΤΡΡ УЬО8ОО5РРЬУ8КЬТ V I ) К 8 К А р р С. Ν V Р8С ЗУМНЕАЬНМНУТ()К5ЬЗЬ5РОКООО6ОА9ЬАОНО9С1КАРА МСРРЕОУУЕ (ЗЕО ГО ΝΟ; 1701)
Определение рН для лиофилизированного Рс-Муо связывающего пептида
Прежде всего определяют стабильность методом эксклюзионной ВЭЖХ (8Е-ВЭЖХ), она является показателем стабильности при повышенных температурах. рН скрининг предпринимают и осуществляют с целью определить оптимальное значение рН 5 в жидком состоянии перед лиофилизацией. Белок готовят с рН 4,5, 4,75, 5,0, 5,5 и 6.0 с буферизующими агентами - ацетатным и гистидиновым буфером - и сахарозой в качестве стабилизатора (или лиопротектора). Приготовленные виалы хранят при 29°С вплоть до 1 года. Проводят мониторинг стабильности с помощью 8Е-ВЭЖХ. Константы скорости агрегации рассчитывают для каждого условия (рН) рецептуры. Найдено, что скорость агрегации при рН 4,5 является минимальной, поэтому рН 4,5 выбирают в качестве предпочтительного рН для рецептуры.
Изучение буферизующего агента для Рс-Муо связывающего пептида при концентрации 30 мг/мл
Прежде всего определяют стабильность эксклюзионной ВЭЖХ (8Е- ВЭЖХ), она является показателем стабильности при повышенных температурах. Лекарственную форму, содержащую 30 мг/мл белка, исследуют, используя три различных буферизующих агента: 10 мМ глутаматный, 10 мМ гистидиновый и 10 мМ сукцинатный буферы с рН 4,5. Все рецептуры содержат 0,004% полисорбата 20. Для разработки рецептуры получают очищенный объёмный материал в виде замороженной (жидкой) рецептуры с концентрацией 30 мг/мл. Материал подвергают диализу в соответствующие буферы для рецептур и лиофилизируют в лиофилизаторе νίιΐίδ, используя стабильный цикл. Лиофилизированный белковый препарат имеет хороший внешний вид. После реконституции рецептуры прозрачны. Лиофилизированный Рс-Муо связывающий пептид хранят при 4, 29, 37 и 52°С. Изучение стабильности в реальном времени проводят при 4°С и обнаруживают, что она сравнима для этих препаратов со стабильностью при хранении вплоть до 3 месяцев. Однако при хранении при 52°С в течение 3 месяцев рецептура, содержащая гистидин, имеет несколько лучшие свойства,, чем рецептура, содержащая глутамат. Рецептура, содержащая сукцинат, значительно менее стабильна, чем две другие рецептуры. Исходя из этого, гистидин и глутамат рассматривают в качестве предпочтительных буферизующих агентов для окончательной рецептуры Рс-Муо связывающего пептида.
Скрининг (поиск) эксципиента для лиофилизированного Рс-Муо связывающего пептида с концентрацией 30 мг/мл: стабилизирующий эффект сахарозы, трегалозы и гидроксиэтилкрахмала
Прежде всего определяют стабильность эксклюзионной ВЭЖХ (8Е-ВЭЖХ), она является показателем стабильности. Для оценки влияния трегалозы, гидроксиэтилкрахмала и сахарозы на стабильность лиофилизированного Рс-Муо связывающего пептида Рс-Муо связывающий пептид готовят с концентрацией 30 мг/мл в 10 мМ глутаматном буфере с 4% маннита. Концентрация трегалозы и сахарозы составляет 2,0%, к рецептуре с сахарозой добавляют 1% гидроксиэтилкрахмала, получают окончательную рецептуру, содержащую 10 мМ глутамата, 4% маннита, 2% сахарозы, 1% гидроксиэтилкрахмала. Все рецептуры включают 0,004% полисорбата 20.
Для исследования по разработке рецептуры получают очищенный объёмный материал в виде замороженной (жидкой) рецептуры с концентрацией 30 мг/мл. Материал подвергают диализу в соответствующие буферы для рецептур и лиофилизируют в лиофилизаторе νίιΐίδ, используя стабильный цикл. Лиофилизированный белковый препарат имеет хороший внешний вид. После реконституции рецептуры прозрачны.
Мониторинг стабильности этих рецептур проводят методом 8Е-ВЭЖХ.
Лиофилизированный Рс-Муо связывающий пептид хранят при 4, 29, 37 и 52°С. Изучение стабильности (времени хранения) в реальном времени при 4°С показывает, что она сравнима для этих препара- 114 022424 тов со стабильностью при хранении в течение 3 месяцев. Однако при хранении при 52°С в течение 3 месяцев рецептура, содержащая сахарозу, имеет несколько лучшие свойства, чем рецептура, содержащая трегалозу. Не выявлено никакого отрицательного влияния добавления гидроксиэтилкрахмала на стабильность. С учётом этих результатов сахарозу рассматривают в качестве предпочтительного стабилизирующего агента для окончательной рецептуры Рс-Муо связывающего пептида.
Скрининг (поиск) эксципиента для лиофилизированного Ре-Муо связывающего пептида с концентрацией 30 мг/мл: стабилизирующий эффект сахарозы и маннита
Прежде всего определяют стабильность методом эксклюзионной ВЭЖХ (ЗЕ-ВЭЖХ), она является показателем стабильности. Для оценки влияния различного количества маннита и сахарозы на стабильность и свойства восстановленного лиофилизированного Рс-Муо связывающего пептида в интервале концентраций маннита от 4,0 до 8,0% и сахарозы в интервале от 1,0 до 4,0% Рс-Муо связывающий пептид готовят с концентрацией 30 мг/мл в 10 мМ глутаматном буфере. Все рецептуры включают 0,004% полисорбата 20.
Для исследования по разработке рецептуры получают очищенный объёмный материал в виде замороженной жидкой рецептуры с концентрацией 30 мг/мл. Материал подвергают диализу в соответствующие буферы для рецептур и лиофилизируют в лиофилизаторе Уийз, используя стабильный цикл. Лиофилизированный белковый препарат имеет хороший внешний вид. После реконституции рецептуры прозрачны.
Мониторинг стабильности этих рецептур проводят методом ЗЕ-ВЭЖХ. Лиофилизированный РсМуо связывающий пептид хранят при 4, 29, 37 и 52°С. Изучение стабильности (времени хранения) в реальном времени при 4°С показывает, что она сравнима для этих препаратов со стабильностью при хранении в течение 3 месяцев. Найдено, однако, что при хранении при 52°С в течение 3 месяцев увеличивающееся количество сахарозы вносит вклад в повышение стабильности по отношению к агрегации. В связи с необходимостью сохранять изотонические условия в окончательной рецептуре, которая ограничивает диапазон общего количества дисахаридов, и поддерживать соответствующее отношение маннита к сахарозе для сохранения свойств лиофилизированной высушенной массы предпочтительными эксципиентами в окончательной рецептуре являются 4% маннита и 2% сахарозы.
Изучение эксципиента для лиофилизированного Ре-Муо связывающего пептида с концентрацией 1, 30 и 85 мг/мл
Прежде всего определяют стабильность методом эксклюзионной ВЭЖХ (ЗЕ-ВЭЖХ), она является показателем стабильности. Для оценки влияния концентрации белка на стабильность и свойства восстановленного лиофилизированного Рс-Муо связывающего пептида Рс-Муо связывающий пептид готовят с концентрацией 1, 30, 85 мг/мл в 10 мМ глутаматном буфере с 4% маннита и 2% сахарозы. Все рецептуры включают 0,004% полисорбата 20.
Для исследования по разработке рецептуры получают очищенный объёмный материал в виде замороженной жидкой рецептуры с концентрацией 30 мг/мл. Материал подвергают буферному обмену в соответствующие буферы для рецептур, используя иР/ЭР (ультрафильтрацию/диафильтрацию), и лиофилизируют в лиофилизаторе Уийз, используя стабильный цикл. Лиофилизированный белковый препарат имеет приемлемый внешний вид. После реконституции рецептуры прозрачны.
Мониторинг стабильности этих рецептур проводят методом ЗЕ-ВЭЖХ. Лиофилизированный РсМуо связывающий пептид хранят при 4, 29, 37°С. Изучение стабильности (времени хранения) в реальном времени при 4°С показывает, что она сравнима для этих препаратов со стабильностью при хранении в течение 6 месяцев. Очевидно, что стабильность для всех изученных концентраций приемлема для промышленной рецептуры.
Вывод
4% маннита и 2% сахарозы обеспечивают достаточную стабильность лиофилизированной массы и белка, что подтверждается исследованием, проведённым в процессе хранения в течение 12 месяцев при 4°С. Следовательно, для приготовления рецептуры, содержащей 1-100 мг/мл Рс-Муо связывающего белка, можно использовать 10 мМ гистидина, 2% сахарозы при рН 4,5 и 10 мМ глутамата, 4% маннита, 2% сахарозы при рН 4,5.
Данное изобретение описано на конкретных примерах, содержащих или предположительно содержащих предпочтительные способы практического применения данного изобретения. Специалисту в данной области техники в свете настоящего раскрытия будут очевидны многочисленные модификации и изменения в конкретных вариантах изобретения, приведённых в качестве примеров, не выходящие за рамки настоящего изобретения.

Claims (2)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела, содержащая буфер, наполнитель, стабилизирующий агент и поверхностно-активное вещество, отличающаяся тем, что буфер представляет собой 10 мМ гистидин и рН составляет 5,0, где наполнителем является 4% вес./об. маннитол,
    - 115 022424 где стабилизирующим агентом является 2% вес./об. сахароза и где поверхностно-активным веществом является 0,004% вес./об. полисорбат-20; и где терапевтическое пептидное антитело включает человеческий Рс-ТМР, где ТМР содержит 8ЕС)
    ГО ΝΟ: 1017, где Рс человека представляет собой последовательность 8ЕР ГО ΝΟ: 1, имеющую начальный метионин на Ν-конце.
  2. 2. Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела, содержащая буфер, наполнитель, стабилизирующий агент и поверхностно-активное вещество; отличающаяся тем, что буфер представляет собой 10 мМ гистидин и рН составляет 7,0, где наполнителем является 4% вес./об. маннитол;
    где стабилизирующим агентом является 2% вес./об. сахароза и где поверхностно-активным веществом является 0,004% вес./об. полисорбат-20, и где терапевтическое пептидное антитело содержит последовательность 8ЕС) ГО ΝΟ: 2.
    Список последовательностей
EA201270625A 2006-04-21 2007-04-20 Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела EA022424B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79399706P 2006-04-21 2006-04-21
US11/788,697 US9283260B2 (en) 2006-04-21 2007-04-19 Lyophilized therapeutic peptibody formulations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270625A1 EA201270625A1 (ru) 2012-12-28
EA022424B1 true EA022424B1 (ru) 2015-12-30

Family

ID=38625630

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200802170A EA017085B1 (ru) 2006-04-21 2007-04-20 Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела
EA201270625A EA022424B1 (ru) 2006-04-21 2007-04-20 Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200802170A EA017085B1 (ru) 2006-04-21 2007-04-20 Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела

Country Status (38)

Country Link
US (2) US9283260B2 (ru)
EP (6) EP2594284A1 (ru)
JP (6) JP5432705B2 (ru)
KR (2) KR101227278B1 (ru)
CN (2) CN107789325A (ru)
AR (1) AR060617A1 (ru)
AU (1) AU2007240656A1 (ru)
BR (1) BRPI0710508B8 (ru)
CA (1) CA2649292C (ru)
CR (3) CR20170130A (ru)
CY (1) CY1118038T1 (ru)
DK (1) DK2018183T3 (ru)
EA (2) EA017085B1 (ru)
ES (1) ES2599318T3 (ru)
GE (1) GEP20156253B (ru)
HR (1) HRP20161653T1 (ru)
HU (1) HUE032144T2 (ru)
IL (3) IL194653A (ru)
JO (1) JO3324B1 (ru)
LT (1) LT2018183T (ru)
MA (1) MA30474B1 (ru)
MX (1) MX2008013393A (ru)
MY (1) MY162816A (ru)
NO (1) NO344947B1 (ru)
NZ (1) NZ596367A (ru)
PE (1) PE20081196A1 (ru)
PH (1) PH12014502880A1 (ru)
PL (1) PL2018183T3 (ru)
PT (1) PT2018183T (ru)
RS (1) RS55428B1 (ru)
SG (2) SG10201501296SA (ru)
SI (1) SI2018183T1 (ru)
TN (1) TNSN08391A1 (ru)
TW (1) TWI352598B (ru)
UA (2) UA116080C2 (ru)
UY (1) UY30302A1 (ru)
WO (1) WO2007124090A2 (ru)
ZA (1) ZA200808485B (ru)

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI257394B (en) 1998-10-23 2006-07-01 Kirin Amgen Inc Thrombopoietic compounds
DE60035260T2 (de) 1999-02-22 2007-10-18 The University Of Connecticut, Farmington Neue albuminfreie faktor viii formulierungen
US7658938B2 (en) 1999-02-22 2010-02-09 Merrion Reasearch III Limited Solid oral dosage form containing an enhancer
EA011384B1 (ru) 1999-06-01 2009-02-27 Байоджен Айдек Ма Инк. Способ лечения воспалительного заболевания
UA83791C2 (ru) 2001-04-13 2008-08-26 Байоджен Айдек Ма Инк. Антитело против vla-1, фармацевтическая композиция, которая его содержит, и из применение для лечения индивидуума с иммунологическим расстройством, опосредованным vla-1
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
US7989160B2 (en) 2006-02-13 2011-08-02 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling
US7704977B2 (en) 2006-04-07 2010-04-27 Merrion Research Iii Limited Solid oral dosage form containing an enhancer
JO3324B1 (ar) * 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
AU2011265555B2 (en) * 2006-04-21 2016-03-10 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
DK2034830T3 (da) 2006-05-25 2014-10-27 Biogen Idec Inc Anti-vla-1-antistof til behandling af slagtilfælde
WO2009137078A1 (en) 2008-05-07 2009-11-12 Merrion Research Iii Limited Compositions of peptides and processes of preparation thereof
NZ593190A (en) * 2008-11-07 2013-01-25 Baxter Int Factor viii formulations
US20120183546A1 (en) 2009-09-23 2012-07-19 Amgen Inc. Treatment of ovarian cancer using a specific binding agent of human angiopoietin-2 in combination with a taxane
WO2011090306A2 (en) * 2010-01-19 2011-07-28 Hanmi Holdings Co., Ltd Liquid formulations for long-acting erythropoietin conjugate
US9089484B2 (en) 2010-03-26 2015-07-28 Merrion Research Iii Limited Pharmaceutical compositions of selective factor Xa inhibitors for oral administration
WO2012075379A2 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Oncolytics Biotech Inc. Liquid viral formulations
AU2011336410B2 (en) 2010-12-02 2015-01-22 Oncolytics Biotech Inc. Lyophilized viral formulations
JP5759211B2 (ja) * 2011-03-11 2015-08-05 三洋化成工業株式会社 凍結乾燥方法
EP2726088B1 (en) 2011-06-29 2019-01-02 Amgen Inc. Predictive biomarker of survival in the treatment of renal cell carcinoma
DE102011055889B4 (de) * 2011-11-30 2013-08-01 Otc Gmbh Verfahren zur Herstellung eines Protein-Hydrolysates
CN102586217A (zh) * 2011-12-16 2012-07-18 深圳市海普瑞药业股份有限公司 肝素黄杆菌肝素酶ⅰ、ⅱ、ⅲ的冻干保存方法
RU2482128C1 (ru) * 2011-12-28 2013-05-20 Замертон Холдингс Лимитед Пептиды, обладающие цитопротекторной активностью
US10160808B2 (en) 2012-02-16 2018-12-25 Santarus, Inc. Anti-VLA1 (CD49A) antibody pharmaceutical compositions
EP2644186A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-02 OTC GmbH Hair conditioning composition for permanent and semi-permanent hair coloration applications
WO2014004578A1 (en) * 2012-06-25 2014-01-03 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Temperature stable vaccine formulations
ES2723885T3 (es) 2012-07-19 2019-09-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpos anti-Siglec-15
EP2698162A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-19 Credentis AG Method for producing a composition for treating a tooth lesion
MX2015011430A (es) * 2013-03-15 2016-04-20 Amgen Inc Antagonismo de la miostatina en seres humanos.
CN104274827B (zh) * 2013-07-01 2020-07-14 上海贺普药业股份有限公司 贺普拉肽的制剂
TW201601741A (zh) * 2013-09-09 2016-01-16 品特生物療法有限公司 用於治療ｅｓｒｄ病患之ｐｅｗ的肌肉生長抑制素拮抗劑
EP3065756B1 (en) * 2013-11-07 2019-02-20 Dr. August Wolff GmbH & Co. KG Arzneimittel Storage stable lyophilized tripeptide formulations
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
WO2015085147A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
EP3076992B1 (en) * 2013-12-06 2022-04-06 The Broad Institute, Inc. Formulations for neoplasia vaccines
KR20230076867A (ko) 2013-12-20 2023-05-31 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신생항원 백신과의 병용 요법
US10357559B2 (en) 2013-12-27 2019-07-23 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Temperature stable vaccine formulations
US11299528B2 (en) 2014-03-11 2022-04-12 D&D Pharmatech Inc. Long acting TRAIL receptor agonists for treatment of autoimmune diseases
US10918698B2 (en) * 2014-03-29 2021-02-16 Intas Pharmaceuticals Ltd. Lyophilized pharmaceutical composition of Fc-peptide fusion protein
PT3149048T (pt) 2014-05-28 2020-04-21 Nono Inc Formulação liofilizada de tat-nr2b9c
TW201625675A (zh) * 2014-06-13 2016-07-16 聖塔瑪麗亞生物治療公司 經調配之受體多肽及相關方法
CA2961739C (en) * 2014-08-20 2024-04-30 Portola Pharmaceuticals, Inc. Lyophilized formulations for factor xa antidote
JP6671141B2 (ja) * 2014-10-21 2020-03-25 大日本住友製薬株式会社 懸濁液剤
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
WO2016100977A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Methods for profiling the t-cel- receptor repertoire
JP7211704B2 (ja) 2015-01-29 2023-01-24 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｇｌｐ－１アゴニスト及び腸溶コーティングを含む錠剤
US10857229B2 (en) 2015-04-30 2020-12-08 Amgen Inc. Treatment of ovarian cancer in patients with ascites using a specific binding agent of human angiopoietin-2 in combination with a taxane
MX2017014700A (es) 2015-05-20 2018-08-15 Broad Inst Inc Neoantigenos compartidos.
CA3008392C (en) 2015-12-17 2021-11-09 The Johns Hopkins University Ameliorating systemic sclerosis with death receptor agonists
JP6992262B2 (ja) * 2016-03-31 2022-02-15 東ソー株式会社 変性抗体測定試薬の製造方法
CA3020339C (en) 2016-04-07 2022-05-03 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating pancreatitis and pain with death receptor agonists
GB201608323D0 (en) 2016-05-12 2016-06-29 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical compositions
US10654922B2 (en) * 2016-05-13 2020-05-19 Askgene Pharma Inc. Angiopoietin 2, VEGF dual antagonists
WO2018140391A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
JP2017155046A (ja) * 2017-04-05 2017-09-07 イーストポンド・ラボラトリーズ・リミテッド シクロデキストリンを含有する細胞水和組成物
DK3681483T3 (da) 2017-09-15 2022-08-29 Amgen Inc Fremgangsmåde til lyofiliseret farmaceutisk formulering af et terapeutisk protein
US20200255496A1 (en) * 2017-09-18 2020-08-13 Amgen Inc. Vegfr-fc fusion protein formulations
CN108159413B (zh) * 2018-01-10 2021-07-06 杭州洪桥中科基因技术有限公司 一种动物用冻干活疫苗及其制备方法
GB201804835D0 (en) * 2018-03-26 2018-05-09 Ge Healthcare As Formulation and method of preparation
CA3105751A1 (en) * 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations of masked antibodies
CR20210435A (es) 2019-02-18 2021-09-20 Lilly Co Eli Formulación de anticuerpos terapéuticos
EP3736574A1 (en) * 2019-05-07 2020-11-11 Atlas Antibodies AB A formulation comprising an isotope labeled fusion polypeptide
DK3744319T3 (da) 2019-05-28 2023-01-16 Ilkogen Ilac Sanayi Ve Ticaret A S Stabil lyofiliseret formulering til hybrid fc-fusioneret g-csf
JP2019178154A (ja) * 2019-06-18 2019-10-17 イーストポンド・ラボラトリーズ・リミテッド シクロデキストリンを含有する細胞水和組成物
US20230026969A1 (en) * 2019-12-03 2023-01-26 China Medical University Oligopeptide, Testing Kit Thereof And Medical Composition Thereof
US11767353B2 (en) 2020-06-05 2023-09-26 Theraly Fibrosis, Inc. Trail compositions with reduced immunogenicity
JP2024514072A (ja) * 2021-03-31 2024-03-28 ハングズホウ エクセジェネシス バイオ エルティーディー． Ｖｅｇｆ及びアンジオポエチンを標的とする融合分子及びその使用
AR127813A1 (es) 2021-12-01 2024-02-28 UCB Biopharma SRL FORMULACIONES FARMACEUTICAS QUE COMRENDEN Fab-PEG
US20240076597A1 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Terumo Bct, Inc. Methods for cell expansion, differentiation, and/or harvesting of natural killer cells using hollow-fiber membranes
CN117186173B (zh) * 2023-09-14 2024-04-05 海南大学 抑制Aβ42聚集并降低其细胞毒作用的三肽化合物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997004801A1 (en) * 1995-07-27 1997-02-13 Genentech, Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
RU2180233C1 (ru) * 2001-06-26 2002-03-10 Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" Способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков
WO2004092215A2 (en) * 2003-04-09 2004-10-28 Amgen Inc. Methods of treatment of inflammatory diseases using specific binding agents of human angiopoietin-2
EA005404B1 (ru) * 1998-10-23 2005-02-24 Амген Инк. Модифицированные пептиды как терапевтические агенты

Family Cites Families (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
DE3244265A1 (de) 1982-11-30 1984-05-30 Cassella Ag, 6000 Frankfurt Weichmacheremulsion, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung
US4503235A (en) 1983-03-11 1985-03-05 Warner-Lambert Company Process for producing 4-carbamoyl-1H-imidazolium-5-olate
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5627262A (en) 1989-07-05 1997-05-06 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Method and composition for the treatment of septic shock
EP0417563B1 (de) 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
WO1992016221A1 (en) 1991-03-15 1992-10-01 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5733731A (en) 1991-10-16 1998-03-31 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
NZ244778A (en) 1991-10-21 1994-03-25 Ortho Pharma Corp Peg imidates and protein derivatives thereof
WO1993024135A1 (en) 1992-05-26 1993-12-09 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
GB9225448D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
US5922545A (en) 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US5773569A (en) 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5981478A (en) 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5786331A (en) 1994-02-02 1998-07-28 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-1 receptor
US5880096A (en) 1994-02-02 1999-03-09 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-1 receptor
US5608035A (en) 1994-02-02 1997-03-04 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-1 receptor
US5844929A (en) * 1994-02-24 1998-12-01 British Telecommunications Public Limited Company Optical device with composite passive and tapered active waveguide regions
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US20030053982A1 (en) 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
AU693478B2 (en) 1994-11-10 1998-07-02 Metabolic Pharmaceuticals Limited Treatment of obesity
IL116026A (en) 1994-11-22 2005-08-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Peptides capable of linking to the sh3 domain of gap, nucleotide sequences encoding the same, their preparation and uses
US5888763A (en) 1994-12-30 1999-03-30 The Rockefeller University Peptides specific for the first Crk-SH3 domain
DE69620877T2 (de) * 1995-02-06 2002-12-12 Genetics Inst Arzneimittelformulierungen für il-12
IL113159A0 (en) 1995-03-28 1995-06-29 Yeda Res & Dev Synthetic peptides and pharmaceutical compositions comprising them
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5767078A (en) 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
US5869451A (en) 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5746516A (en) 1995-08-11 1998-05-05 Hitachi Powdered Metals Co., Ltd. Porous bearing system having internal grooves and electric motor provided with the same
US5817750A (en) 1995-08-28 1998-10-06 La Jolla Cancer Research Foundation Structural mimics of RGD-binding sites
JPH09151200A (ja) 1995-09-29 1997-06-10 Ajinomoto Co Inc ヒト胃癌に対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含むヒト胃癌治療、予防剤
US6369027B1 (en) 1995-12-22 2002-04-09 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US5714577A (en) 1996-01-26 1998-02-03 University Of Pittsburgh Antimicrobial peptides
IL117223A0 (en) 1996-02-22 1996-06-18 Yeda Res & Dev Antipathogenic polypeptides and compositions comprising them
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
JP4088344B2 (ja) 1996-03-28 2008-05-21 カイロン コーポレイション ウロキナーゼレセプターのペプチドリガンド
IL118003A0 (en) 1996-04-23 1996-08-04 Yeda Res & Dev Novel vip fragments and pharmaceutical compositions comprising them
FR2748028B1 (fr) 1996-04-30 1998-08-14 Lab Francais Du Fractionnement Peptides derives du facteur von willebrand et leur utilisation comme anticoagulant
AU2978697A (en) 1996-06-07 1998-01-05 Takeda Chemical Industries Ltd. Novel peptide, process for the production of the same, and use of the same
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
DE69734887T2 (de) 1996-09-10 2006-08-24 The Burnham Institute, La Jolla Tumor findende moleküle, davon abstammende konjugate und verfahren zu deren verwendung
KR100408229B1 (ko) 1996-10-04 2003-12-01 암겐 인코포레이티드 Ｍｐｌ 리간드를 함유하는 제약학적 조성물
DE69718341T2 (de) 1996-10-08 2003-10-30 Bisys B V U Verfahren und mittel zur auswahl von peptiden und proteinen mit spezifischer affinität zu einem zielmolekül
US5955431A (en) 1997-02-05 1999-09-21 Brigham And Women's Hospital, Inc. Mast cell protease peptide inhibitors
SI0975754T2 (sl) 1997-04-16 2016-04-29 Amgen Inc., Vezivni proteini in receptorji osteoprotegerina
US6265535B1 (en) 1997-05-30 2001-07-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Peptides and peptide analogues designed from binding sites of tumor necrosis factor receptor superfamily and their uses
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2173641T3 (es) 1997-11-07 2002-10-16 Conjuchem Inc Composicion de derivados opiaceos para la fabricacion de medicamentos.
AU2481399A (en) 1998-01-29 1999-08-16 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Variant peptide ligands that selectively induce apoptosis
EP1062230B1 (en) 1998-03-05 2004-10-13 Chiron Corporation Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule
US6235872B1 (en) 1998-03-12 2001-05-22 The Burnham Institute Proapoptotic peptides dependence polypeptides and methods of use
AU3189299A (en) 1998-03-20 1999-10-11 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Peptide ligands for the erythropoietin receptor
EP0947524A1 (en) 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
AU744044B2 (en) 1998-04-06 2002-02-14 Advanced Immunit, Inc. Short peptides for treatment of neurological degenerative diseases
AU760381B2 (en) 1998-04-28 2003-05-15 Laboratoires Serono Sa PEG-LHRH analog conjugates
EP0972780A1 (en) 1998-05-18 2000-01-19 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Il-6 antagonist peptides
EP1078002B1 (en) 1998-05-22 2008-05-21 Abbott Laboratories Peptide antiangiogenic drugs
US5932548A (en) 1998-06-03 1999-08-03 Deghenghi; Romano Lysine containing peptides for treatment of heart disease
WO2000001402A1 (en) 1998-07-02 2000-01-13 Envision Biomedical Consulting Antiproliferative and antiviral proteins and peptides
US6168785B1 (en) 1998-07-16 2001-01-02 Institut Pasteur Biological applications of new peptides of IL-2 and derivatives and use as therapeutic agents
JP2002528389A (ja) 1998-08-21 2002-09-03 イエダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド Ｉｌ−２及びその類似体から誘導される抗炎症性ペプチド
BR9915548A (pt) 1998-10-16 2001-08-14 Biogen Inc Proteìnas de fusão de interferon-beta e usos
TWI257394B (en) 1998-10-23 2006-07-01 Kirin Amgen Inc Thrombopoietic compounds
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
AU2880400A (en) 1999-02-12 2000-08-29 Amgen, Inc. Tnf-related proteins
US6635646B1 (en) 1999-05-04 2003-10-21 Schering Corporation Pegylated interferon alfa-CCR5 antagonist combination HIV therapy
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
AU5943201A (en) 2000-05-03 2001-11-12 Amgen Inc Modified peptides as therapeutic agents
US6853809B2 (en) 2001-01-30 2005-02-08 Koninklijke Philips Electronics N.V. Camera system for providing instant switching between wide angle and full resolution views of a subject
RS51708B (sr) 2001-05-11 2011-10-31 Amgen Inc. Peptidi i njima srodni molekuli koji se vezuju za tall-1
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US20040247588A1 (en) 2002-08-28 2004-12-09 Johnson Robert E. Formulations of modified antibodies and methods of making the same
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
WO2004039337A2 (en) 2002-10-31 2004-05-13 Protein Design Labs, Inc. Stable liquid pharmaceutical formulation of antibodies that are prone to isomerization
KR101304718B1 (ko) 2002-12-20 2013-09-05 암겐 인코포레이티드 미오스타틴을 저해하는 결합제
WO2006010057A2 (en) 2004-07-08 2006-01-26 Amgen Inc. Therapeutic peptides
BRPI0516011A (pt) 2004-09-24 2008-08-19 Amgen Inc moléculas fc modificadas
JO3324B1 (ar) * 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
EP3035305B1 (en) 2014-12-18 2016-11-16 Axis AB Enclosure and arrangement for recess mounting of a camera or camera head

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997004801A1 (en) * 1995-07-27 1997-02-13 Genentech, Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
EA005404B1 (ru) * 1998-10-23 2005-02-24 Амген Инк. Модифицированные пептиды как терапевтические агенты
RU2180233C1 (ru) * 2001-06-26 2002-03-10 Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" Способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков
WO2004092215A2 (en) * 2003-04-09 2004-10-28 Amgen Inc. Methods of treatment of inflammatory diseases using specific binding agents of human angiopoietin-2

Also Published As

Publication number Publication date
GEP20156253B (en) 2015-03-10
AR060617A1 (es) 2008-07-02
BRPI0710508B1 (pt) 2018-10-23
SG182887A1 (en) 2012-08-30
WO2007124090A2 (en) 2007-11-01
PT2018183T (pt) 2016-12-02
EP2594285A1 (en) 2013-05-22
TNSN08391A1 (en) 2010-04-14
JP2014040441A (ja) 2014-03-06
SG10201501296SA (en) 2015-04-29
UA116080C2 (uk) 2018-02-12
JP2018150380A (ja) 2018-09-27
JO3324B1 (ar) 2019-03-13
EP2018183B1 (en) 2016-09-07
JP2009534392A (ja) 2009-09-24
KR101236042B1 (ko) 2013-02-21
NO344947B1 (no) 2020-07-27
KR20120114384A (ko) 2012-10-16
CR10442A (es) 2009-02-19
JP6787953B2 (ja) 2020-11-18
AU2007240656A1 (en) 2007-11-01
EA200802170A1 (ru) 2009-06-30
TWI352598B (en) 2011-11-21
CR20140274A (es) 2014-07-18
US10166189B2 (en) 2019-01-01
UA99815C2 (ru) 2012-10-10
EP2594284A1 (en) 2013-05-22
PH12014502880A1 (en) 2016-01-18
TW200744624A (en) 2007-12-16
EA017085B1 (ru) 2012-09-28
MA30474B1 (fr) 2009-06-01
KR101227278B1 (ko) 2013-01-28
US20160143852A1 (en) 2016-05-26
BRPI0710508A2 (pt) 2012-10-30
JP2021006525A (ja) 2021-01-21
EA201270625A1 (ru) 2012-12-28
CR20170130A (es) 2017-06-15
CA2649292A1 (en) 2007-11-01
SI2018183T1 (sl) 2017-01-31
JP6356106B2 (ja) 2018-07-11
IL248156B (en) 2018-07-31
EP2594287A1 (en) 2013-05-22
US9283260B2 (en) 2016-03-15
HRP20161653T1 (hr) 2017-01-13
ES2599318T3 (es) 2017-02-01
JP2022166219A (ja) 2022-11-01
MX2008013393A (es) 2009-03-06
EP2594285B1 (en) 2016-08-10
ZA200808485B (en) 2009-08-26
NZ596367A (en) 2013-09-27
MY162816A (en) 2017-07-31
CN101484185A (zh) 2009-07-15
EP2018183A2 (en) 2009-01-28
PL2018183T3 (pl) 2017-04-28
IL224966A (en) 2017-10-31
RS55428B1 (sr) 2017-04-28
LT2018183T (lt) 2016-11-25
KR20090005204A (ko) 2009-01-12
WO2007124090A3 (en) 2008-12-11
HUE032144T2 (en) 2017-08-28
CN107789325A (zh) 2018-03-13
JP5873854B2 (ja) 2016-03-01
EP2594288A1 (en) 2013-05-22
NO20084893L (no) 2009-01-20
US20090258017A1 (en) 2009-10-15
EP2594286A1 (en) 2013-05-22
BRPI0710508B8 (pt) 2021-05-25
PE20081196A1 (es) 2008-09-04
JP2016065060A (ja) 2016-04-28
IL194653A (en) 2016-10-31
DK2018183T3 (en) 2016-11-28
IL194653A0 (en) 2011-08-01
JP5432705B2 (ja) 2014-03-05
UY30302A1 (es) 2007-10-31
CY1118038T1 (el) 2017-05-17
CA2649292C (en) 2017-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA022424B1 (ru) Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела
EP1330260B1 (en) Use of il-1 inhibitors and tnf antagonists, partially in combination with recombinant erythropoietins, for the treatment of anemia
AU2011265555B2 (en) Lyophilized therapeutic peptibody formulations

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM