MX2007010075A - Vacuna de rotavirus vivo atenuado para administracion oral. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona formulaciones liquidas de rotavirus que son convenientes para la administracion oral a infantes humanos. En particular la invencion de proporciona las composiciones farmaceuticas y vacunas, que comprenden un antigeno de rotavirus, azucar y carboxilato en donde la formulacion tiene un pH entre pH 5.0 y pH 8.0 y no comprende fosfato o menos de 5 mM de fosfato. La invencion tambien proporciona metodos para preparar las formulaciones de rotavirus y uso de las mismas en la prevencion o tratamiento de enfermedades asociadas al rotavirus en humanos.

Description

VACUNA DE ROTAVIRUS VIVO ATENUADO PARA ADMINISTRACIÓN ORAL Campo de la Invención La presente invención se refiere a nuevas formulaciones líquidas de rotavirus que son útiles como composiciones farmacéuticas y vacunas, al método para prepararlas y a su uso en la prevención del rotavirus, en particular enfermedades asociadas al rotavirus humano. Antecedentes de la Invención La diarrea infecciosa aguda es una causa principal de enfermedad y muerte en muchas áreas del mundo. En países en desarrollo, el impacto de la enfermedad diarreica es muy importante. Para Asia, África y América Latina, se ha estimado que hay entre 3-4 billones de casos de diarrea cada año y de tales casos aproximadamente 5-10 millones tienen como resultado la muerte (Walsh, J. A. y col.: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)). Se ha reconocido al rotavirus como una de las causas más importantes de la diarrea severa en infantes y niños jóvenes (Estes, M. K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, editada por Fields y col., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Se estima que la enfermedad del rotavírus es responsable de más de 600,000 muertes anualmente. La enfermedad inducida por el rotavirus afecta más comúnmente a niños entre 6 y 24 meses de edad, y la prevalencia máxima de la enfermedad ocurre generalmente durante los meses más fríos en climas templados, y a lo largo de todo el año en áreas tropicales. Los rotavirus son transmitidos comúnmente de persona a persona por la ruta fecal-oral con un período de incubación de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 días. Distinto a la infección en el grupo de edades de seis meses a 24 meses, los recién nacidos son generalmente asintomátícos o tienen solamente una enfermedad moderada. En contraste a la enfermedad severa encontrada normalmente en niños jóvenes, la mayoría de los adultos están protegidos como un resultado de la infección del rotavirus previa, así la mayoría de las infecciones en adultos son moderadas o asintomáticas (Offit, P.A. y col. Comp. Ther., 8(8):21-26, 1982). Los rotavirus son esféricos, y su nombre se deriva de su estructura cápsida externa e interna o de doble capa distintiva. Comúnmente, la estructura cápsida de doble capa de un rotavirus rodea una capa o centro interno de proteína que contiene el genoma. El genoma de un rotavirus está compuesto por 11 segmentos de ARN de doble filamento que codifican por lo menos 11 proteínas virales distintas. Dos de estas proteínas virales, designadas como VP4 (proteína P) y VP7 (proteína G), son proteínas estructurales ubicadas en el exterior de la estructura cápsida de doble capa. La cápsida interna del rotavirus presenta una proteína, que es la proteína de rotavirus designada como VP6. La importancia relativa de estas tres proteínas de rotavirus particulares en la producción de la inmunorrespuesta que sigue a la infección del rotavirus, aún no es clara. Sin embargo, la proteína VP6 determina el grupo y subgrupo antígeno, y las proteínas VP4 y VP7 son las determinantes de la especificidad del serotipo. Hasta la fecha, se han identificado por lo menos 14 serotipos de rotavirus de G y 11 serotipos de rotavirus de P (Linhares A.C. & Bresse J.S., Pan. Am. J. Publ. Health 2000, 9, 305-330). Entre éstos, 10 serotipos de G y 6 serotipos de P se han identificado entre el rotavirus humano. La proteína VP7 es una glicoproteína de 38,000 PM (34,000 PM cuando no está glicosilada), que es el producto de translación del segmento genómico 7, 8 ó 9, dependiendo de la cepa. Esta proteína estimula la formación del anticuerpo de neutralización principal después de la infección del rotavirus. La proteína VP4 es una proteína no glicosilada de aproximadamente 88,000 PM que es el producto de translación del segmento genómico 4. Esta proteína también estimula el anticuerpo de neutralización después de la infección del rotavirus. Puesto que las proteínas VP4 y VP7 son las proteínas virales contra las cuales se dirigen los anticuerpos de neutralización, se cree que son los primeros candidatos para el desarrollo de vacunas contra el rotavírus, produciendo protección contra la enfermedad del rotavirus. Se conoce que la infección natural del rotavirus durante niñez temprana produce una inmunidad protectora. El desarrollo de vacunas anterior para la prevención de infecciones de rotavirus comenzó en los años 70 después del descubrimiento del virus. Inicialmente, se estudiaron las cepas atenuadas de animales y humanos, mientras que los esfuerzos más recientes se han centrado en los reasortantes de humano-animal. El desarrollo de formulaciones de rotavirus de novedad debe cumplir con un número de requisitos, incluyendo el potencial de distribución mundial y la estabilidad bajo una gama de condiciones ambientales y de almacenamiento. En particular, la estabilidad de una formulación, especialmente de una composición farmacéutica o de vacuna, en general será mejor a temperaturas inferiores en comparación al sitio o a temperaturas más altas. Por lo tanto un método de estabilización ha sido desarrollar las formulaciones de vacuna que se pueden almacenar congeladas (-20°C a -70°C) o alternativamente desarrollar las vacunas liofilizadas que pueden mantenerse durante un período de tiempo prolongado a aproximadamente la temperatura del refrigerador (2°C a 8°C). Sin embargo, es un hecho conocido que el proceso de liofilización tiene una capacidad limitada, y se asocia a un alto costo de producción. Además, las vacunas liofilizadas tienen un control más sofisticado para la administración mientras que pueden requerir de algo más complejo, por ello los dispositivos relativamente más costosos tal como vacunas de cámaras múltiples/viales, con el ingrediente activo en una cámara y el líquido de reconstitución en otro compartimiento. Las vacunas liofilizadas también se asocian a un costo más alto de envío y almacenamiento. Estas opciones pueden ser inadecuadas para algunos países en desarrollo en el mundo, en donde el dispositivo de administración tiene que ser financieramente costeable y en donde la disponibilidad de la infraestructura de producción y almacenamiento pueda ser inexistente o no confiable. Mientras que el rotavirus se administra convencionalmente oral a infantes humanos, esta ruta trae varios desafíos a las composiciones inmunogenéticas contra el rotavirus. El rotavirus se inactiva rápidamente en un ambiente ácido, durante la exposición al amortiguador ácido o jugo gástrico ácido por ejemplo (C. Weiss y H. F. Clark, 1985, J. Gen. Virol., 66, 2725-2730; T. Vesíkari y col., 1984, The lancet, página 700; R. H. Foster y A. J. Wagstaff, 1998, BioDrugs Feb: 9(2) 155-178). Por lo tanto se desea que las composiciones de rotavirus se formulen de una manera en la cual sean estables durante el almacenamiento y después de la administración en el receptor hospedador. Las vacunas de rotavirus tienen el propósito principal de administrarse a bebés, desde las 4 semanas de edad. Un volumen de dosis pequeño de vacuna, tal como inferior a 2 ml o incluso a 1.5 ml de volumen de dosis, será ventajoso para tal población. Por lo tanto, se desea que las composiciones de rotavirus se formulen en un volumen pequeño de dosis. Se conocen las formulaciones de estabilización de vacunas virales líquidas. Por ejemplo, el documento EP 0 065 905 describe en general las composiciones de estabilización convenientes para una serie de virus tal como los que causan sarampión o gripe, y en particular describe las soluciones que contienen amortiguador de fosfato de estabilización convenientes para el virus vivo atenuado. Otras formulaciones de estabilización se describen en el documento WO 98/13065 y en Clark y col. (Pediatr Infect Dis J. 2003 Oct; 22(10):914-20). Tales formulaciones también requieren, entre otros constituyentes, la presencia de fosfato para actuar como un agente de amortiguación para neutralizar la acidez del estómago. Estas formulaciones sin embargo no son compatibles con los requisitos establecidos anteriormente para el desarrollo correcto de una formulación de rotavirus, específicamente tales formulaciones no son compatibles con un volumen reducido de la dosis de vacuna que se adapta mejor para un infante humano. En particular, el presente inventor ha encontrado que adaptando esta formulación de la técnica anterior a un ajuste de volumen bajo tal como 1.5 ml o más bajo, mientras que se mantiene eficiente la capacidad antiácido, conduce a problemas que se presentan de la concentración inapropiada de los constituyentes de la formulación, en particular el amortiguador de fosfato. Por lo tanto hay una necesidad de desarrollar formulaciones de rotavirus alternativas, en particular formulaciones líquidas alternativas que puedan soportar la acidez gástrica, y que sean estables en el refrigerador a pesar de la ausencia de fosfato. Además hay una necesidad de que tales formulaciones alternativas también se formulen correctamente en un volumen de dosis de vacuna lo más pequeño posible. Por lo tanto la presente invención no proporciona solamente composiciones inmunogenéticas estables alternativas que no tienen fosfato o que contienen solamente cantidades mínimas de fosfato, sino que también permiten que el rotavirus sea formulado a un volumen de dosis bajo que es conveniente para la administración oral a infantes humanos. Breve Descripción de las Figuras Figura 1. - Curvas de titulación de base acida estándar para cuatro carboxilatos. Figura 2A - Capacidad de antiácido de varias formulaciones que contienen adipato. Figura 2B - Ajuste experimental del análisis Baby Rossett-Rice Figura 3 - índice refractivo de las formulaciones que contienen adipato. La figura 3A muestra que en la etapa del amortiguador de adipato, el valor objetivo es 58.5% p/p de sucrosa que da un índice refractivo de 1.4578 en la mezcla. La figura 3B muestra que en la etapa final de formulación el objetivo es 55% p/p de sucrosa que conduce a un índice refractivo de 1.4480. Figura 4 - Sinopsis del diseño del estudio clínico de la fase Breve Descripción de la Invención Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición inmunogenética líquida de rotavirus que es conveniente para la administración oral a un infante humano, que comprende un antígeno de rotavirus, azúcar y carboxilato, en donde la composición tiene un pH de entre aproximadamente de pH 5.0 y aproximadamente pH 8.0 y comprende menos de 5 mM de fosfato. Convenientemente la concentración del fosfato en la composición reivindicada no excede de 1 mM. En un aspecto específico de la invención, una dosis de vacuna conveniente será normalmente de 1.5 ml o convenientemente cualquier volumen más pequeño que 2.5 ml tal como un volumen de 2 ml o menos, que sea conveniente para la administración oral a bebés o infantes. En particular, el volumen de dosis será tal que la viabilidad técnica de la formulación sea posible y que no haya efecto dañino en el potencial inmunogenético de la formulación. Las composiciones reivindicadas ofrecen una ventaja sobre las formulaciones que contienen fosfato de la técnica anterior, las cuales pueden soportar la acidez gástrica, permanecen inmunogenéticas y estables durante una vida útil larga, mientras que son compatibles con la formulación a un volumen de dosis más pequeño que el común, tal como más pequeño de 2.0 ml, o incluso son compatibles con un volumen de dosis de 1.5 ml o más pequeño. En una modalidad específica, la composición inmunogenética líquida de acuerdo a la invención tiene una capacidad antiácido de entre 6 y 23 minutos según lo determinado por el análisis Baby Rossett-Rice (adaptado según lo detallado en el ejemplo lll.2.2 de la prueba Rossett-Rice básica). Convenientemente, la capacidad antiácido será de por lo menos 8 minutos, comúnmente de por lo menos 12 minutos, y un intervalo conveniente es de entre 12 y 20 minutos. Sorpresivamente, las composiciones reivindicadas han mostrado una capacidad antiácido no solamente aceptable sino más alta incluso en un volumen de dosis más pequeño, en comparación a las formulaciones que contienen fosfato de la técnica anterior. En otro aspecto, se proporciona un método para la preparación de la composición inmunogenética líquida de rotavirus, que comprende mezclar un antígeno de rotavirus, azúcar y carboxilato con un diluyente farmacéuticamente aceptable. La invención también cubre en otro aspecto, el uso de un antígeno de rotavirus mezclado con un carboxilato y azúcar para la fabricación de una composición inmunogenética oral para la prevención o tratamiento de enfermedades asociadas al rotavirus en humanos, en donde la composición no contiene más de 5 mM de fosfato y tiene un pH entre aproximadamente pH 5.0 y aproximadamente pH 8.0. En aún un aspecto adicional, también se proporciona un método para tratar o prevenir las enfermedades asociadas al rotavirus en humanos administrando a un sujeto humano en necesidad del mismo una cantidad efectiva de la composición inmunogenética líquida. Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la misma. Descripción Detallada de la Invención El presente inventor ha desarrollado las composiciones líquidas de rotavirus de novedad que son inmunogenéticas, estables a temperatura de refrigerador (entre 2 y 7°C, comúnmente a 4°C), que pueden soportar la naturaleza acida inherente del estómago cuando se administran oralmente y las cuales son compatibles con un volumen de dosis pequeño. Se desea que una composición líquida signifique una formulación en una forma fluida, en comparación a una forma seca, cuyo volumen se fija bajo condiciones específicas constantes (por ejemplo, a temperatura ambiente o temperatura de refrigerador, a presión atmosférica) y cuyo perfil es determinado por el envase que llena. La materia objeto y la información descrita dentro de las publicaciones y patentes o solicitudes de patente mencionadas en esta especificación, se incorporan por referencia en la presente. Los términos 'que comprende', 'comprende' y 'comprenden' son pensados por el inventor, para que opcionalmente se sustituyan con los términos 'que consistían de', 'consiste de', y 'consisten de', respectivamente, en cada caso. La presente invención proporciona una composición inmunogenética líquida de rotavirus que comprende un antígeno de rotavirus, azúcar y carboxilato, en donde la composición tiene un pH entre aproximadamente pH 5.0 y aproximadamente pH 8.0 y comprende menos de 5 mM de fosfato. Las composiciones de la invención muestran un perfil de estabilidad muy bueno cuando se comparan a las formulaciones que contienen fosfato, mientras que se mantiene el perfil de inmunogenicidad. Estas composiciones son por lo menos tan estables como sus contrapartes que contienen fosfato. Una ventaja adicional de las presentes composiciones es que se pueden preparar en un volumen de dosis pequeño tal como inferior a 2.0 ml, comúnmente 1.5 ml por ejemplo, en comparación a las formulaciones de la técnica anterior en las que está presente el fosfato. En una modalidad específica, la concentración de fosfato dentro de la composición inmunogenética no excede los 5 mM, convenientemente 1 mM, en particular no excede 0.5 mM. El fosfato es referido como sal de ácido fosfórico (también conocido como ácido ortofosfórico (H3PO )), generalmente se utilizan sodio o potasio o una mezcla de sales de sodio y potasio (por ejemplo: Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4). Convenientemente, la concentración de fosfato es de 0.4 mM o menor, comúnmente 0.2 mM o menor, idealmente 0.1 mM o menor. En otra modalidad específica, la composición según lo reivindicado en la presente está libre de fosfato. Comúnmente el fosfato, cuando está presente, proviene del medio de cultivo celular o del amortiguador de solución salina usado como diluyente, tal como DMEM (Eagle Médium modificado de Dulbecco), medio básico Eagle BME o PBS. La concentración de fosfato la cual es referida a través de la especificación, será una concentración calculada, según lo determinado de las cantidades de los químicos que contienen fosfato operadas en la preparación de las composiciones reivindicadas. Alternativamente, la concentración de fosfato presente en la composición según lo reivindicado en la presente se puede medir experimentalmente usando técnicas rutinarias analíticas. Una técnica conveniente es un análisis colorimétrico nombrado 'Nanocolor' comercializado por Macherey-Nagel (número de catálogo 918 78). Este método se basa en la determinación fotométrica del complejo amarillo formado por ácido fosfórico-molibdato-vanadato en una solución acida. El límite de la cuantificación del análisis es de 2 µg/ml de fosfato o 0.02 mM. Un método alternativo es la dosificación de fósforo (P) por una técnica de espectroscopia de emisión atómica tal como Incutivel Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy (ICP- AES) (Boss & Fredeen, in Concepts, Instrumentation, y Techniques in Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy, Perkin Elmer eds, segunda edición, 1997 - ver Methodology en la página 72 hacia adelante). El límite de cuantificación del análisis es de 0.030 µg/ml de fósforo que corresponde a una concentración de fosfato de 0.00032 mM. En una modalidad, el pH de la composición está entre pH 5.0 y pH 8.0. En otra modalidad específica, el pH de la composición reivindicada está entre aproximadamente pH 5.5 a aproximadamente pH 7.5. Por 'aproximadamente pH' se entiende que está dentro 0.2 unidades del valor de pH indicado. En particular, el pH de la composición está entre pH 5.5 y pH 7.5. Por ejemplo, el pH de la composición está entre aproximadamente pH 6.0 aproximadamente a pH 7.0, en particular entre pH 6.0 y pH 7.0, comúnmente entre pH 6.2 y pH 6.8 o entre pH 6.2 y pH 6.6. ue contempla Un pH de aproximadamente 6.4, en particular de 6.4. Se conoce que el rotavirus es afectado negativamente a un pH ácido tal como un pH por debajo de 4.0, y se esperaría que una estabilidad máxima se obtenga a un pH neutro o incluso ligeramente básico, es decir una pH que oscila de 7.0 a 8.0, que se obtiene por ejemplo en las formulaciones amortiguadas de fosfato de la técnica anterior. Según lo mostrado en la sección experimental, las composiciones de la invención, a pesar de la ausencia de fosfato, han mostrado un buen perfil de estabilidad en el intervalo reivindicado de pH, y además han mostrado sorpresivamente un perfil aceptable de estabilidad y inmunogenicidad incluso bajo condiciones ligeramente acidas, es decir aproximadamente un pH de 6.0 a 7.0, tal como por ejemplo a un pH de aproximadamente 6.4. La composición líquida según lo reivindicado en la presente comprende un carboxilato. El carboxilato "(-COO-)" es la forma disociada de ácido carboxílico que resulta de la neutralización de la función acida ("-COOH") mediante una sustancia básica. Un ácido carboxílico es un compuesto que contiene al grupo carboxilo: "-COOH"; que se hace formalmente combinando el grupo carbonilo ("-CO-") y un grupo oxhidrilo ("-OH"). Sin embargo, la interacción entre estas dos partes modifica tanto sus características químicas que se considera al grupo entero como una nueva función con sus propias propiedades características (Organic Chemistry de J. B. Hendrickson, D.J. Cram, y G. S. Hammond, McGraw-Hill Book Company, tercera edición 1970 página 131). Aunque la International Union for Puré and Applied Chemistry (lUPAC) recomienda utilizar la nomenclatura de ácido alcaneóico (para ácidos monocarboxílicos) y ácido alcanedióico (para ácidos dicarboxílicos), la mayoría de nombres triviales de los ácidos carboxílicos se han utilizado en este texto debido a que estos productos son bien conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo el nombre de lUPAC del ácido acético es ácido etanoico y para ácido adípico el nombre será ácido hexanodioico. En una modalidad específica, se utiliza una sal de carboxilato de un ácido inorgánico o, convenientemente, de un ácido orgánico. En una modalidad específica, el carboxilato se deriva de un ácido débil. Por ejemplo, el carboxilato es una sal de carboxilato seleccionada del grupo que consiste de: adipato, citrato, malato, acetato, succinato, propionato, butirato, malonato, glutarato, maleato, glicolato, lactato, gluconato, fumarato, tartarato, pimelato y cualquier combinación de dos o más de los mismos. Los carboxilatos convenientes son carboxilatos derivados de un ácido carboxílico con un pKa > 4 o carboxilatos derivados de un ácido di- o fri-carboxílico (di- o tri-carboxilatos) con un promedio numérico de pKa > 4 (tabla 9). Los ejemplos de la clase anterior incluyen carboxilatos derivados de ácido propiníco, butírico y acético. Los ejemplos de la última clase incluyen carboxilatos derivados de ácido cítrico, maleico, malónico, succínico, adípico, glutárico y málico. En una modalidad específica el carboxilato pertenece a la lista de GRAS, es decir los carboxilatos que son 'Generally Recognized As Safe by the Food and Drug Administration of the USA', y se seleccionan de la lista que comprende acetato, propíonato, malato, glutarato, adipato, lactato, fumarato, y tartrato. El carboxilato es convenientemente una sal de ácido adípico, es decir sal monosódica de ácido adípíco, sal monopotásica de ácido adípico, convenientemente adipato de disodio o adipato de dipotasio, o adipato de calcio. En una modalidad específica, una concentración de carboxilato de entre 50 mM a 2 M se utiliza convenientemente en la composición líquida de rotavirus. Será entendido que la concentración de carboxilato dentro del intervalo mencionado anteriormente se puede adaptar convenientemente, a través de la experimentación rutinaria, de acuerdo a la naturaleza del carboxilato, capacidad antiácido que se alcanzara y el volumen de dosis de vacuna. Por ejemplo, altas concentraciones de carboxilato de por encima de 1 M se pueden utilizar cuando un potencial antiácido alto se requiera, tal como por encima de 8 minutos, convenientemente por encima de 10 minutos, o por encima de 12 minutos según lo determinado por la prueba Baby Rossett Rice para un volumen de dosis de 1.5 ml. Las concentraciones de 1 M o inferiores se utilizan comúnmente, tal como concentraciones de entre 100 mM y 1 M, comúnmente concentraciones de entre 200 mM y 800 mM. Las concentraciones de carboxilato convenientes están comprendidas entre aproximadamente 300 mM y aproximadamente 800 mM, convenientemente entre 400 mM y 700 mM. En particular, cuando el carboxilato es adipato un intervalo de concentración conveniente está entre 400 y 500 mM. Sin embargo, el experto reconocerá que pueden ser apropiadas las concentraciones dentro de 10-20 por ciento de los valores indicados, es decir cuando se indican 100 mM, también se describe un intervalo de 80-90 mM a 110-120 mM y se entiende que está cubierto. Las concentraciones ilustrativas se dan en la tabla 1 siguiente para varios carboxilatos. Tabla 1 - Capacidad Antiácido de Carboxilatos a una Concentración Específica Estos parámetros ilustrativos se dan para un volumen de dosis de 1.5 ml y corresponden al número de ejemplo mencionado dado en la tabla 1. *determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2 El pH de la composición inmunogenética líquida de rotavirus según lo reivindicado en la presente se puede obtener mezclando ácido carboxílico y una sal de carboxilato. En particular, el ácido carboxílíco se puede utilizar en adición con una sal de carboxilato diferente, por ejemplo, un citrato se combina con ácido adípico. Esto puede ser ventajoso al usar químicos disponibles comercialmente, algunos de los cuales pueden no estar disponibles fácilmente, o para simplificar la etapa de formulación. Por ejemplo, uno o más de ácidos carboxílicos se pueden seleccionar de la lista que consiste de: ácido adípico, ácido cítrico, ácido málico, ácido acético, ácido succíníco, ácido carbónico, ácido propiónico, ácido butírico, ácido malónico, ácido glutáríco, ácido maleico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido glucónico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido pimélico, y se mezclan en proporciones convenientes con una o más sales de carboxilato seleccionadas de la lista que consiste de: adipato, citrato, malato, acetato, succinato, propionato, butirato, malonato, glutarato, maleato, glicolato, lactato, gluconato, fumarato, tartarato, pimeliato. La composición líquida según lo reivindicado en la presente comprende un azúcar. La sucrosa es particularmente conveniente. La dextrosa es otra azúcar conveniente. Otras azúcares o alcoholes de azúcar también se pueden utilizar en lugar de la sucrosa o dextrosa, incluyendo por ejemplo: glicerol, eritrosa, eritriol, xilitol, arabitol, ribosa, xilosa, arabinosa, glucosa, tagalosa, mañosa, galactosa, fructosa, inosítol, sorbitol, manitol, galactitol, mezcla de glucosa y fructosa, maltosa, soforosa, lactosa, celobiosa, melibiosa, trehalosa, sucrosa, palatinosa, maltulosa, lactulosa, maltitol, lactitol, rafinosa, maltotriosa, melecitosa, celotriosa, ciritol, maltotetraosa, estaquiosa, celotetraosa, maltopentaosa, celopentaosa, maltohexosa, celohexosa, oligosacáridos. Las concentraciones de azúcar comunes se oscilan de aproximadamente 1% p/p a aproximadamente 70% p/p, por ejemplo de aproximadamente 25% p/p a aproximadamente 60% p/p. El experto sin embargo reconocerá que la naturaleza y concentración de azúcar se deben optimizar tal que asegura la viabilidad viral satisfactoria, mientras que se mantiene la viscosidad a un nivel que es compatible con las etapas de procesamiento descendientes de la formulación, tal como filtración. En una modalidad específica, se utiliza sucrosa. Comúnmente, su concentración se mantiene a un mínimo de 30% p/p. Más altas, es decir de aproximadamente 30% p/p, las concentraciones de la sucrosa por otra parte se pueden utilizar para asegurar un almacenamiento de larga duración, mientras que se espera que la alta presión isoosmótíca de tales formulaciones prevenga el crecimiento bacteriano. Por consiguiente, el límite más bajo para la concentración de sucrosa en la composición líquida según lo reivindicado en la presente es convenientemente de 30% p/p o más alto, tal como 35% p/p o más alto, convenientemente 40% p/p o más alto. Una concentración de sucrosa conveniente oscila de aproximadamente 40% p/p a aproximadamente 70% p/p. Por ejemplo, una concentración conveniente de la sucrosa estará entre 45% p/p y 60% p/p, convenientemente entre 50% p/p y 55% p/p. En particular, se utiliza la sucrosa a una concentración de aproximadamente 50% p/p o aproximadamente 55% p/p. Las concentraciones de sucrosa finales de 50% p/p o 55% p/p son convenientes. El experto entenderá que la optimización rutinaria de la concentración de azúcar se puede realizar para asegurar la estabilidad viral cuando otra azúcar se substituye por sucrosa. Además, los valores indicados para los azúcares se pueden adaptar ligeramente para considerar los parámetros de formulación/fabricación tal como el volumen de dosis. Por lo tanto, el experto reconocerá que las concentraciones dentro del 10% de los valores indicados pueden ser apropiadas, es decir cuando se indica 50% p/p, también se describe un intervalo de 45% p/p - 55% p/p y se entiende que está cubierto. La composición inmunogenética líquida de rotavirus de la presente invención también comprende un antígeno de rotavírus. En particular la composición líquida según lo reivindicado en la presente es una composición inmunogenética, por ejemplo una composición de vacuna. Se entiende que un antígeno de rotavirus significa cualquier antígeno de rotavirus que sea conveniente para el uso en una formulación de vacuna. Se contemplan especialmente los antígenos de rotavirus vivos orales. Por ejemplo, cualquier antígeno de rotavírus conveniente se puede seleccionar del grupo que consiste de: rotavirus vivo atenuado de animales o humanos, en particular rotavirus vivo atenuado de humano; rotavirus reasortante, en particular pero sin limitar a un rotavirus reasortante humano-humano, rotavirus reasortante bovino-humano o un rotavirus reasortante de mono Rhesus-humano. Todas las cepas de rotavirus, cepas humanas o animales, se contemplan en la presente invención. Las cepas de rotavirus humanas son convenientes. En particular, el antígeno de rotavírus es en una modalidad, la población de rotavirus humana atenuada que comprende una sola variante o sustancialmente una sola variante, la variante es definida por la secuencia de nucleótido que codifica por lo menos una de las proteínas virales principales designadas como VP4 y VP7 según lo descrito en el documento WO 01/12797, en particular cualquiera, incluye una o más de las variantes definidas por las mutaciones establecidas en la tabla 2, tablas 3.1 y 3.2 del documento WO 01/12797. En modalidades específicas, el antígeno de rotavirus es cualquiera de las siguientes cepas de rotavirus vivas atenuadas humanas: cepa HRV 89-12C2 depositada bajo el número de acceso ATCC VR 2272 (según lo descrito en el documento EP 0 557 427), su progenie, derivados reasortantes e inmunológicamente activos de las misma; cepa HRV P43 depositada bajo el número de acceso ECACC 99081301 (según lo descrito en el documento WO 01/12797), su progenie, derivados reasortantes e inmunológicamente activos de las misma. Las poblaciones de rotavirus que tienen las características de cualquiera de las cepas depositadas mencionadas anteriormente también son cepas de vacuna convenientes. Los derivados de las cepas depositadas se pueden obtener sometiendo las cepas a un procesamiento adicional tal como propagándolas adicionalmente transmitiéndolas, clonándolas, u por otros procedimientos usando el virus vivo o modificando las cepas depositadas de cualquier manera incluyendo por técnicas de ingeniería genética o técnicas reasortantes. Tales etapas y técnicas son bien conocidas en la técnica. Los antígenos de rotavirus de interés particular son la progenie de cualquiera de las cepas depositadas y de derivados inmunológicamente activos de las mismas. Derivados inmunológicamente activos significan materiales obtenidos de o con cualquiera de las cepas depositadas, en particular de o con la cepa HRV P43 depositada bajo el número de acceso ECACC 99081301, particularmente antígenos del virus, que son capaces de producir una inmunorrespuesta que sea reactiva contra el rotavirus cuando se inyecte en un animal hospedador. Los materiales derivados de las cepas depositadas citadas anteriormente también son antígenos de rotavirus convenientes, e incluyen la proteína y el material genético. Son de interés particular los rotavirus reasortantes que comprenden por lo menos un antígeno o por lo menos un segmento de cualquiera de las cepas depositadas, por ejemplo los reasortantes que comprenden una cepa virulenta de rotavirus en la cual uno o parte de uno de los 11 segmentos del genoma se han sustituido por el segmento del genoma o parte del mismo de cualquiera de las cepas depositadas. Específicamente, un rotavirus reasortante en el cuál un segmento o segmento parcial codifica NSP4, es un segmento o segmento parcial de cualquiera de las cepas depositadas, puede tener propiedades útiles. Los rotavirus reasortantes y técnicas para prepararlas son bien conocidos (Foster, R. H. y Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998). El antígeno de rotavirus de la composición reivindicada se puede producir de acuerdo a las técnicas rutinarias de producción. Comúnmente las preparaciones del antígeno de rotavirus se pueden derivar de los métodos de cultivo tisular usados para propagar el virus o expresar los antígenos de rotavirus recombinantes. Los sustratos celulares convenientes para hacer crecer el virus incluyen por ejemplo las células del riñon de perro tal como MDCK o de un clon de MDCK, células de tipo MDCK, células del riñon de mono tal como células AGMK incluyendo células Vero que son particularmente convenientes, otras líneas celulares de origen del riñon de mono tal como BSC-1, LLC-MK2 y MA104, líneas celulares convenientes de cerdo, o cualquier otro tipo de célula mamífera conveniente para la producción del rotavirus para los propósitos de vacuna. Los sustratos celulares convenientes también incluyen células humanas por ejemplo células MRC-5. Los sustratos celulares convenientes no se limitan a líneas celulares; por ejemplo también se incluyen las células primarías. También dentro del alcance de la invención están las mezclas de cualquiera de las cepas depositadas citadas anteriormente con otras variantes de rotavirus, por ejemplo otras variantes clonadas u otro rotavirus reasortante, o con otros virus en particular otros virus atenuados. En particular la composición de acuerdo a la invención contiene dos antígenos de rotavirus. En particular un antígeno dentro de la composición es la cepa HRV P43 depositada bajo el número de acceso ECACC 99081301, y el otro antígeno es un derivado reasortante de la misma o cualquier derivado inmunológicamente activo del mismo. El antígeno de rotavirus para la inclusión en la composición reivindicada puede ser una cepa de rotavirus monovalente, es decir que contiene una sola cepa de rotavirus, o ser multivalente, es decir que contiene por lo menos dos o más cepas de rotavirus.

El experto entenderá que también son convenientes otras cepas atenuadas fácilmente disponibles, de origen humano o animal, que se obtienen de las instituciones depositarías y se puede utilizar como sustituyentes para las cepas depositadas citadas.

De acuerdo a la presente invención, una composición inmunogenética conveniente contiene un antígeno de rotavirus, en particular la cepa P43 atenuada humana (según lo depositado bajo el número de acceso ECACC 99081301, ver el documento WO 01/12797) a una concentración de 105-106 ffu por dosis (o equivalente a 105 5-106 5 según lo expresado en CCID50 por dosis), 55% p/p de sucrosa, adipato de di-sodio 0.465 M (que corresponde 132.74 mg por dosis), y tiene un pH de aproximadamente 6.2 a 6.6, en un volumen de dosis de 1.5 ml. Para esta composición, el contenido de DMEM es de 6% p/p y por lo tanto representa menos de 0.1 mM de fosfatos. La composición de acuerdo a la presente invención puede incluir además un componente antiácido adicional tal como un antiácido inorgánico, por ejemplo hidróxido de aluminio AI(OH)3 e hidróxido de magnesio Mg(OH)2. El hidróxido de aluminio es particularmente conveniente. Otros antiácidos comercialmente disponibles, que son convenientes para el uso en la invención, incluyen Mylanta™, que contiene hidróxido de aluminio e hidróxido de magnesio. Éstos son ¡nsolubles en agua y se dan en suspensión. Otro antiácido particularmente conveniente que se puede utilizar adicionalmente en la composición de vacuna de la presente invención es la sal inorgánica insoluble, carbonato de calcio (CaCO3). Una concentración CaCO3 común es por ejemplo de 80 mg por dosis de vacuna. Otros antiácidos insolubles en agua convenientes son carbonato de magnesio, carbonato de aluminio, fosfato de aluminio, mezcla de hidróxido de aluminio y carbonato de magnesio, aluminio-magnesio-hidrocarbonato, hidróxido de aluminio-carbonato de magnesio-sobitol-manitol, hidroxi-aluminio-sodio-carbonato, dihidroxi-aluminio-potasio-carbonato, magaldrato, hidrotalcita, almagcit, magnesío-aluminio-silicato-hidrato. La composición inmunogenética de acuerdo a la presente invención puede comprender adicionalmente compuestos y/o portadores farmacéuticamente convenientes, en particular los conocidos en la técnica que son convenientes para la administración oral, especialmente a infantes. Tales portadores incluyen y no se limitan a carbohidratos, polialcoholes, aminoácidos, hidróxido de aluminio, hidróxido de magnesio, hidroxiapatita, talco, óxido de titanio, hidróxido de hierro, estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, gelatina, peptona vegetal, xantano, carragenano, goma arábiga, ß-ciclodextrina. La composición de acuerdo a la presente invención puede comprender además iones de calcio que se han sugerido para estabilizar el rotavirus. Los agentes viscosos pueden adicionalmente estar incluidos y presentes en la composición. Los agentes viscosos posibles que se pueden utilizar incluyen excipientes seudoplásticos. Los agentes viscosos convenientes incluyen: propilenglicol, goma arábiga, goma de tragacanto, agar-agar, alginato, pectina, carboximetilcelulosa de sodio (Tyloses C®), metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® y MB®), hidroxipropilmetilcelulosa (Klucels®), hidroxipropicelulosa (Methocels E® y K®, Vicotrans MPHC®), Carbopol®, goma de xantano, Veegum® (silicato de magnesio-aluminio), Avicel® (aproximadamente 89% de celulosa microcristalina y 11% de Na de carboximetilcelulosa). La goma de xantano o almidón son particularmente agentes viscosos convenientes para el uso adicional en la composición líquida de acuerdo a la invención. También puede ser ventajoso incluir en los vehículos basados en la composición de lípidos reivindicados tal como virosomas o liposomas, emulsiones de aceite en agua o partículas de portador. Alternativamente o además de inmunoestímulantes tal como los conocidos en la técnica para las vacunas orales se pueden incluir en la composición. Tales inmunoestimulantes incluyen toxinas bacterianas, particularmente la toxina del cólera (CT) en la forma de holotoxina (molécula entera) o la cadena B solamente (CTB) y la enterotoxina inestable al calor de E. coli (LT). Las LTs mutadas (mLTs) que son menos probables que se conviertan a su forma activa que LT nativa se describen en los documentos WO 96/06627, WO 93/13202 y US 5,182,109. La composición de acuerdo a la invención puede comprender adicionalmente un adyuvante o inmunoestimulante tal como pero sin limitarse a lípido desintoxicado A de cualquier fuente y derivados no tóxicos del lípido A, saponinas y otros reactivos capaces de estimular una respuesta del tipo TH1. Durante mucho tiempo se ha conocido que el lipopolisacárido (LPS) enterobacterial es un estimulador potente del sistema inmune, aunque su uso en adyuvantes ha sido reducido por sus efectos tóxicos. Un derivado no tóxico de LPS, del lípido A de monofosforilo (MPL), producido por la remoción del grupo carbohidrato central y del fosfato de la glucosamina del extremo de reducción, se ha descrito por Ribi y col. (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419) y tiene la siguiente estructura: Una versión desintoxicada adicional de MPL resulta de la eliminación de la cadena acilo de la posición 3 de la estructura del disacárido, y es llamada lípido A de monofosforilo 3-O- desacilado (3D-MPL). Se puede purificar y preparar por los métodos enseñados en el documento GB 2122204B, cuya referencia también describe la preparación del lípido A de difosforilo, y variantes 3-O-desaciladas del mismo. Una forma conveniente de 3D-MPL está en la forma de una emulsión que tiene un tamaño de partícula pequeña de menos de 0.2 µm de diámetro, y se describe su método de fabricación en el documento WO 94/21292. Las composiciones acuosas que comprenden el lípido A de monofosforilo y un tensioactivo se han descrito en el documento WO9843670A2. Los adyuvantes derivados de lipopolisacáridos bacterianos que se formularán en las composiciones de la presente invención se pueden purificar y procesar de fuentes bacterianas, o alternativamente pueden ser sintéticos. Por ejemplo, el lípido A de monofosforilo purificado se describe en Ribi y col. 1986 (supra), y el monofosforilo 3-O-desacilado o lípido A de difosforilo derivado de Salmonella sp., se describe en los documentos GB 2220211 y US 4912094. Se han descrito otros lipopolisacáridos purificados y sintéticos (Hilgers y col., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6; Hilgers y col., 1987, Immunology, 60(1):141-6; y EP 0 549 074 B1). Un adyuvante de lipopolisacárido bacteriano particularmente conveniente es 3D-MPL. Por consiguiente, los derivados de LPS que se pueden utilizar en la presente invención son los inmunoestimulantes que son similares en estructura a LPS o MPL o 3D-MPL. En otro aspecto de la presente invención los derivados de LPS pueden ser un monosacárido acilado, que es una sub-porción a la estructura anterior de MPL. Los derivados sintéticos del lípido A también son conocidos por incluir, pero sin limitarse a: OM174 (2-deoxi-6-o-[2-deoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfono-ß-D-glucop¡ranosil]-2-[(R)-3-hidroxí te tradecanoilamino]-a-D-gluco pira nos i Idihidro gen fosfato), (WO 95/14026) OM 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxítetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1,10-bis(dihidrogenofosfato) (WO99 /64301 y WO 00/0462 ) OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1 -dihidrogenofosfato 10-(6-aminohexanoato) (WO 01/46127) Las saponinas purificadas como adyuvantes orales se describen en el documento WO 98/56415. Las saponinas y el lípido A de monofosforilo se pueden utilizar por separado o en combinación (por ejemplo el documento WO 94/00153) y se pueden formular en sistemas ayudantes junto con otros agentes. 3D-MPL es un adyuvante bien conocido fabricado por Ribí Immunochem, Montana y su fabricación se describe en el documento GB 2122204.

Otro inmunoestimulante preferido para el uso en la presente invención es saponina Quil A y sus derivados. Las saponinas se enseñan en: Lacaille-Dubois, M y Wagner H. (1996, A review of the biological and pharmacological of saponins. Phytomedicine vol. 2 pp 363-386). Las saponinas son glucósidos de esteroides o triterpeno distribuidos extensamente en los reinos de plantas y animales marinos. Se observa que las saponinas forman soluciones coloidales en agua que hacen espuma al agitarse, y precipitan colesterol. Cuando las saponinas están son cercanas a las membranas celulares crean estructuras de tipo porosas en la membrana, lo cual hace que la membrana se fracture. La hemolisis de los eritrocitos es un ejemplo de este fenómeno, que es una propiedad de ciertas, pero no de todas, saponínas. Las saponínas se conocen como adyuvantes en las vacunas para la administración sistémica. El adyuvante y la actividad hemolítica de las saponinas individuales se han estudiado ampliamente en la técnica (Lacaille-Dubois y Wagner, supra). Por ejemplo, Quil A (derivada de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y fracciones de la misma, se describen en los documentos US 5,057,540 y "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1 -2):1 -55; y EP 0 362 279 B1. Las estructuras de las partículas, llamadas Immune Stimulating Complexes (ISCOMS), que comprenden fracciones de Quil A son hemolíticas y se han utilizado en la fabricación de vacunas (Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). Las saponinas hemolíticas QS21 y QS17 (fracciones purificadas por CLAR de Quil A) se han descrito como adyuvantes sistémicos potentes, y el método de su producción se describe en la Patente Norteamericana No. 5,057,540 y EP 0 362 279 B1. QS-21 es una saponina natural derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina, que induce las células T citotóxicas de CD8+ (CTLs), células Th1 y una respuesta predominante del anticuerpo lgG2a y es una saponina conveniente en el contexto de la presente invención. Otras saponinas que se han utilizado en los estudios sistémicos de vacunación incluyen los derivados de la otra especie de planta tal como Gypsophila y Saponaria (Bomford y col., Vaccine, 10(9):572-577, 1992). Un sistema mejorado implica la combinación de un derivado del lípido A no tóxico y un derivado de saponina particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL según lo descrito en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde QS21 se apaga con colesterol según lo descrito en el documento WO 96/33739. Las saponinas que forman la parte de la presente invención se pueden separar en forma de micelas, o pueden estar en forma de estructuras ordenadas grandes tal como ISCOMs (EP 0 109942 B1) o liposomas) cuando están formuladas con colesterol y lípidos, o en forma de una emulsión de aceite en agua (WO 95/17210). Las saponinas se pueden asociar convenientemente con una sal metálica, tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio (WO 98/15287). Una composición adyuvante particularmente potente que implica QS21 y 3D-MPL en una emulsión de aceite en agua se describe en los documentos WO 95/17210 y WO 99/11241 y WO 99/12565, y son composiciones convenientes. Una discusión general de los vehículos y adyuvantes para la inmunización oral se pueden encontrar en Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995. La composición de vacuna de acuerdo a la invención puede contener componentes adicionales incluyendo por ejemplo saborizantes (particularmente para una vacuna oral) y agentes bacteriostáticos. En una modalidad específica, la composición líquida de acuerdo a la invención tiene una capacidad antiácido de entre 6 y 23 minutos según lo determinado por el análisis Baby Rossett-Rice (adaptado según lo detallado en el ejemplo lll.2.2 de la prueba básica Rossett-Rice). De acuerdo a la presente invención, por 'capacidad antiácido' se entiende el período de tiempo, expresado en minutos, durante los cuales el pH de la formulación bajo prueba permanece a aproximadamente 4 según lo determinado de acuerdo al procedimiento experimental dado en el ejemplo lll.2.2. Convenientemente la capacidad antiácido estará entre 12 y 20 minutos. Una capacidad antiácido más alta de 23 minutos tal como 29-30 minutos por ejemplo también es perfectamente aceptable desde una perspectiva del desarrollo de la vacuna pero tal capacidad alta es superflua. En particular, se contempla especialmente una capacidad antiácido de por lo menos de minutos, por lo menos 10 minutos, por lo menos 12 minutos. Es conveniente una capacidad antiácido de por lo menos 12 minutos, por lo menos 13 minutos, por lo menos 14 minutos, por lo menos 15 minutos, por lo menos 16 minutos. Se conoce que es muy ácido el estómago de los infantes pequeños que no han comido durante un período de tres horas, y que el rotavirus es afectado negativamente por un pH tan ácido. A nuestras posibilidades, al trabajar con una formulación de bajo volumen, que es deseable, ha sido imposible medir la capacidad antiácido de las formulaciones clásicas que contienen fosfato, mientras que la solubilidad del fosfato fue excedida fácilmente y la cristalización de los componentes ocurrió durante la formulación y/o almacenamiento a corto plazo. Por el contrario, las composiciones reivindicadas han mostrado sorpresivamente una capacidad antiácido aceptable pero más alta incluso en un volumen de dosis más pequeño, en comparación a las formulaciones que contienen fosfato de la técnica anterior. En otra modalidad específica, la composición inmunogenética líquida es estable bajo por lo menos una de las siguientes condiciones: durante 7 días a 37°C, durante un año a 4°C, durante 18 meses a 4°C, durante dos años a 4°C. De acuerdo a la presente invención, la estabilidad de una composición dada es determinada midiendo el título viral (es decir la estabilidad viral), de acuerdo al procedimiento establecido en el ejemplo 111.1, después del almacenamiento de la formulación durante un período de tiempo definido a una temperatura dada. La estabilidad de la composición se puede determinar por una prueba de estabilidad acelerada, por ejemplo después del almacenamiento de la formulación durante una semana a 37°C. La estabilidad de la composición se puede determinar alternativamente durante un período de tiempo más largo, tal como durante varios meses, a temperatura de refrigerador (entre 2 y 7°C, comúnmente a 4°C) o a temperatura ambiente (20-22°C). Bajo estas condiciones, una composición estable es la que tiene una pérdida de título de rotavirus máxima de 1 según lo expresado en log10 ffu/dosis a las condiciones de prueba definidas. Particularmente las composiciones convenientes son aquellas en las cuales un máximo de 0.5 log10, por ejemplo 0.4 o menos, 0.3 o menos, 0.2 o menos o convenientemente 0.1 log10 ffu por dosis de vacuna, se pierde en la prueba de estabilidad acelerada a 37°C durante una semana. Alternativamente, la composición inmunogenética líquida según lo reivindicado en la presente se puede congelar y almacenar congelada a -20°C o menos, o a -70°C durante varios años, y permanece estable a 4°C durante por lo menos un año en descongelamiento. Comúnmente la formulación congelada será estable durante por lo menos 6 meses, por lo menos 12 meses, por lo menos 18 meses, por lo menos 2 años, o por lo menos 3 años, y permanece estable a 4°C durante por lo menos un año, convenientemente 18 meses o 2 años en descongelamiento. La composición de acuerdo a la presente invención es una composición inmunogenética, por ejemplo una vacuna. Por ejemplo, la composición inmunogenética reivindicada es capaz, comúnmente después de una, convenientemente dos dosis separadas por un o dos meses, de producir una inmunorrespuesta por ejemplo una toma de vacuna excelente y las respuestas de IgA específico del suero de rotavirus. La 'toma de vacuna' se define como el porcentaje de sujetos que exhiben cualquier respuesta serológica, por ejemplo aparición de IgA de suero para rotavirus en sueros post-inmunización a un título >. 20 U/ml (ELISA), y/o vertiendo rotavirus (ELISA) en cualquier muestra del banco. La toma de la vacuna se puede definir como verter el virus de vacuna en cualquier muestra del banco recolectad entre la primera dosis y hasta 1 a 2 meses después de la segunda dosis. En una modalidad específica, la vacuna de acuerdo a la invención es capaz de disminuir la aparición de cualquiera, y preferiblemente severa, gastroenteritis por rotavirus con respecto al placebo. Comúnmente la vacuna puede conferir protección transversal contra cepas circulantes distintas de las presentes en la vacuna. Comúnmente, a cuando la vacuna contiene una cepa tipo G1 tal como la del virus humano atenuado P43, una inmunorrespuesta inducida por G1 y por al menos uno de los serotipos distintos de G1 seleccionados del grupo que consiste de: serotipos G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10. G11, G12, G13 y G14. Convenientemente una vacuna que contiene una cepa G1 es capaz de conferir protección contra las cepas G1 y distintas de G1, tal como las cepas G2, G3 y/o G4, y en particular contra el serotipo G9 que aparece globalmente. En una modalidad específica, la gastroenteritis o gastroenteritis severa es causada por una cepa de rotavirus de un serotipo diferente al contenido en la composición reivindicada. En particular, si la cepa de rotavirus está presente en la composición reivindicada es un serotipo G1, tal como pero sin limitarse a la cepa de rotavirus humana viva atenuada HRV P43 (ECACC 99081301), la prevención se confiere contra la gastroenteritis o gastroenteritis severa causada por una cepa de rotavirus de un serotipo G1 y también por una cepa de rotavirus de un serotipo distinto a G1, por ejemplo por una cepa de rotavirus que tiene un serotipo seleccionado de la lista que consiste de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10. G11, G12, G13 y G14. En una modalidad particular, la composición inmunogenética reivindicada en la presente es capaz de inducir una inmunorrespuesta contra, y/o proporcionar protección contra la gastroenteritis o gastroenteritis severa causada por, al menos uno, convenientemente todo los siguientes serotipos distintos de G1: G2, G3, G4 y G9. En otra modalidad específica, si la cepa de rotavirus está presente en la composición reivindicada es un tipo de rotavirus P[8], tal como pero sin limitarse a la cepa de rotavirus humana viva atenuada HRV P43 (ECACC 99081301), la prevención se confiere contra la gastroenteritis o gastroenteritis severa causada por una cepa de rotavírus de un tipo P[8] y por un tipo distinto de P[8], por ejemplo por una cepa de rotavirus que tiene un serotipo seleccionado de la lista que consiste de: los tipos P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P9 y P11. En particular, la composición inmunogenética reivindicada en la presente es capaz de inducir una inmunorrespuesta contra, y/o proporcionar protección contra la gastroenteritis o gastroenteritis severa causada por, al menos uno, convenientemente todos los siguientes tipos distintos de P[8]: P4, P6. En otra modalidad, la composición reivindicada es capaz de inducir una inmunorrespuesta contra, y/o proporcionar protección contra la gastroenteritis o gastroenteritis severa causada por, una cepa de rotavirus de un tipo G diferente y un tipo P diferente al presente en la composición administrada. Específicamente, la composición reivindicada comprende una cepa de rotavirus G1P[8] y es también capaz de inducir una ¡nmunorrespuesta a, y/o proporcionar la protección contra la gastroenteritis o gastroenteritis severa causada por, una cepa de rotavirus G2P[4].

La composición de acuerdo a la invención se administra convenientemente por la administración oral. La composición se proporciona convenientemente en un dispositivo de una sola dosis, tal como un frasco de cristal o plástico o una jeringa, conveniente para el suministro a infantes pequeños. Las vacunas de la invención se pueden formular y administrarse por técnicas conocidas, usando una cantidad conveniente de virus vivo para proporcionar la protección efectiva contra la infección del rotavirus sin efectos secundarios dañinos significativos en vacunas comunes. Por consiguiente la presente invención proporciona un método para la preparación una formulación líquida de rotavirus o composición inmunogenética según lo descrito en la presente, que comprende mezclar un antígeno de rotavirus, azúcar y un carboxilato con un diluyente farmacéuticamente aceptable. Una cantidad conveniente de virus vivo estará normalmente entre 104 y 107 ffu por dosis. Una dosis común de vacuna puede comprender 105-1 O6 ffu por dosis y se puede dar en varias dosis durante un periodo de tiempo, por ejemplo en dos dosis dadas en un intervalo de dos meses. El título de rotavírus también se puede expresar en CCID50 y se puede estimar en el contexto de esta invención que un CCID50 de 1060 es equivalente a un ffu de 105 5 por dosis. Los beneficios sin embargo se pueden obtener con más de 2 dosis, por ejemplo un régimen de 3 ó 4 dosis, particularmente en países en desarrollo. La primera dosis se puede dar convenientemente a infantes en 4 semanas a 14 ó 15 semanas de edad, convenientemente entre 6 y 14 semanas de edad. El intervalo entre dosis es de por lo menos 4 semanas pero puede ser de más o menos de dos meses de duración, por ejemplo la segunda dosis, y cualquier dosis subsecuente si es apropiada, se puede dar un mes o tres meses después de la dosis anterior, dependiendo del horario de inmunización local. Una cantidad óptima de virus vivo para una sola dosis o para un régimen de dosis múltiple, y la duración óptima de las dosis, se pueden comprobar por los estudios estándares que implican la observación de los títulos del anticuerpo y otras respuestas en los sujetos. Comúnmente el volumen de una dosis de vacuna de acuerdo a la invención será normalmente de 2.5 ml o más baja, comúnmente entre 0.5 ml y 2.5 ml. En un aspecto específico de la invención, una dosis de vacuna conveniente será normalmente de 1.5 ml o convenientemente cualquier volumen más pequeño que 2.5 ml tal como un volumen de 2 ml o menos, que es conveniente para la administración oral a bebés o infantes. En particular el volumen de dosis será tal que la viabilidad técnica de la formulación será posible y no habrá efecto perjudicial sobre el potencial inmunogenético de la formulación. Las composiciones reivindicadas ofrecen una ventaja sobre las formulaciones que contienen fosfato de la técnica anterior que pueden soportar la acidez gástrica, permanecen inmunogenéticas y estables durante un periodo de vida útil largo, mientras que son compatibles con la formulación en un volumen de dosis más pequeño del común, por ejemplo más pequeño de 2.0 ml o más, convenientemente, 1.5 ml o más pequeño. Comúnmente el volumen de una dosis de vacuna de acuerdo a la invención está entre 0.5 ml y 2.0 ml, convenientemente de manera aproximada entre 1.0 ml y 1.5 ml, tal como aproximadamente 1.3 ml o aproximadamente 1.4 ml o aproximadamente 1.5 ml. Un volumen de dosis común también puede ser de 2 ml o menos, tal como por ejemplo 1.1 ml, 1.2 ml, 1.3 ml, 1.4 ml o 1.5 ml. Los volúmenes de 1 ml o volúmenes más pequeños de 1 ml, por ejemplo de entre 200 µl a 800 µl, también se contemplan dentro del alcance de la presente invención. El volumen de líquido que se puede administrar oralmente también se puede determinar en parte por el dispositivo de suministro de vacuna. La composición inmunogenética de la invención también se puede formular para que contenga otros antígenos, en particular antígenos de otros virus vivos convenientes para la protección contra otras enfermedades, por ejemplo poliovirus. Los ingredientes activos adicionales convenientes para la administración oral se pueden dar mezclados con la composición de rotavirus, o alternativamente se pueden co-administrar (es decir en una dosis separada pero al mismo tiempo) con la composición de rotavirus reivindicada en la presente. La composición reivindicada también se puede dar concomitantemente con otras vacunas no orales, por ejemplo con las vacunas parenterales convenientes para la población de vacunas pediátrica tal como vacunas de DTPw o DTPa (vacunas contra Bordetella pertussis - tos ferina, difteria, tétanos), vacunas contra la meningitis inducida por la Influenza hemofílica B, hepatitis B, o sarampión, paperas, rubiola (MMR), vacunas contra el Streptococcus pneumoniae, para optimizar el número de visitas al doctor. En otra modalidad, la invención también proporciona un método para tratar o prevenir las enfermedades asociadas al rotavirus en humanos, especialmente en niños jóvenes tal como bebés o infantes, administrando al sujeto humano en necesidad del mismo una cantidad efectiva de una formulación líquida, en particular una composición inmunogenétíca o una vacuna, según lo reivindicado en la presente. En particular las composiciones reivindicadas prevendrán las infecciones del rotavirus. En una modalidad específica, las composiciones reivindicadas en la presente son capaces de proporcionar la protección contra la gastroenteritis por rotavirus, en particular contra la gastroenteritis severa. Una gastroenteritis severa se define como un episodio que requiere hospitalización y/o terapia de rehidratación (equivalente la plan B o C de WHO) en una instalación médica, o un episodio con un conteo >11 en la escala Vesikarí de 20 puntos (Ruuska T y Vesikarí T. Rotavirus disease in Finnish children: use of numerical scores for severity of diarrheal episodes. Scand J Infect Dis 1990, 22:259-67). En aún una modalidad adicional, la invención proporciona el uso de un antígeno de rotavirus, carboxilato y un azúcar en la fabricación de una composición inmunogenética, por ejemplo una vacuna, para el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas la rotavirus en humanos, en donde la composición inmunogenétíca tiene un pH entre pH 5.0 y pH 8.0 y comprende menos de 5 mM de fosfato. En particular, se contemplan especialmente la prevención de las infecciones del rotavirus, y/o protección contra la gastroenteritis y más especialmente contra la gastroenteritis severa. En otra modalidad específica, la invención también proporciona el uso de un rotavirus atenuado vivo humano para la fabricación de una composición inmunogenética según lo reivindicado en la presente para el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas al rotavirus sin causar intususcepción. En particular, el tratamiento o prevención comprende administrar dos dosis orales, o más, de una cantidad segura y efectiva de la composición de rotavirus vivo atenuado humano a un infante dentro de un periodo de 4 a 14 ó 15 semanas de edad al momento de la dosis 1. El infante comúnmente tendrá de 6 a 14 semanas de edad al momento de la primera dosis. Dentro del contexto de la presente invención un infante humano se considera para definir a un infante con una edad de 4 a 14 ó 15 semanas después del nacimiento. En otra modalidad, la invención también proporciona una composición inmunogenética líquida que comprende un antígeno de rotavírus, azúcar, fosfato y un carboxilato, en donde la composición tiene un pH de entre aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0 y en donde el carboxilato se selecciona de la lista que consiste de: adipato, malato, acetato, propionato, butirato, malonato, glutarato, glicolato, gluconato, pimelato, y cualquier combinación de dos o más de los mismos. En una modalidad específica el carboxilato es adípato. Comúnmente el fosfato estará presente a una concentración de 10 mM a 1 M. El presente inventor ha encontrado que estos carboxilatos específicos, que no se han asociado al desarrollo de las formulaciones de vacuna orales, han cumplido todos los requisitos deseados de estabilidad, resistencia a ácido, inmunogeneticidad y de formulación en un volumen pequeño de dosis, según lo establecido en la presente descripción para el desarrollo de una vacuna de rotavirus oral conveniente para infantes humanos. En particular los carboxilatos no tienen ningún efecto dañino sobre el título del rotavirus en la formulación.

Estos carboxilatos pueden actuar adecuadamente como alternativas para los carboxilatos convencionales tal como succínato, glutarato y citrato por ejemplo en las formulaciones de de rotavirus que contienen fosfato. El resto de las modalidades específicas según lo descrito anteriormente se aplican igualmente a este aspecto de la presente invención. Comúnmente el intervalo de pH de la composición es según lo definido en la presente, al igual que la capacidad antiácido y la estabilidad de la vida útil. La invención también proporciona un método de preparación de la composición, usos y métodos de prevención o tratamiento de infantes humanos utilizando la composición. La invención será descrita adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes: Ejemplo I - Formulación de una vacuna líquida contra el rotavirus humano vivo atenuado i) en ausencia de fosfato y carboxilato agregados, y ii) en presencia de citrato como un carboxilato en ausencia del fosfato agregado 1.1 Preparación de las Formulaciones 1.1.1. Composición del Medio DMEM (Para Preparar 1 Litro de DMEM): Agua para inyección: 0.8 litros Disolver sucesivamente los siguientes compuestos: Cloruro de sodio: 6.40 g Cloruro de potasio: 0.40 g Sulfato de magnesio.7 H2O: 0.20 g Agregar la solución de nitrato de hierro en 0.1 g/l : 1.00 ml NaH2PO4.H2O: 0.1412 g Piruvato de sodio: 0.11 g Anhidro de glucosa: 4.50 g Solución de vitamina (500x concentrada): 2.00 ml Agua para inyección: 1.50 ml Ácido clorhídrico (concentrado): 0.083 ml L-cistina: 0.048 g L-tirosina: 0.072 g Agua para inyección: 2.00 ml Solución de aminoácidos: 20.00 ml L-glutamina: 0.5846 Cloruro de calcio.2H2O: 0.2649 g Bicarbonato de sodio:3.70 g Agua para inyección hasta 1 litro DMEM representa el 5%, 6% ó 8% de las formulaciones detalladas en el ejemplo II. Esto corresponde a: una concentración de fosfato final de 0.059 mM, 0.071 mM y 0.094 mM respectivamente, y - una concentración de piruvato de 0.065mM, 0.078 mM y 0.104 mM respectivamente. Solución de vitamina (500x concentrada): Agua para la inyección: 80.00 I Ácido fólico: 200.10 g Pantenoato de calcio: 200.10 g Cloruro de colina: 200.10 g Inositol: 350.00 g Nicotinamída: 200.00 g Clorhidrato de piridoxina: 200.10 g Clorhidrato de tíamina: 200.10 g Riboflavina: 20.002 g Agua para inyección hasta 100 litros. Solución de Aminoácido: Agua para inyección: 144.00 I L-arginina: 755.70 g Glicina: 270.10 g L-histidina: 378.00 g L-isoleucina: 943.40 g L-leucina: 943.50 g L-lisina 2 HCl: 1,315.80 g L-metionina: 270.00 g L-penilalanina: 594.10 g L-treonina:856.30 g L-triptofano: 144.00 g L-serina: 377.90 g L-valina: 842.00 g Agua para inyección: hasta 180 litros.

Solución de Nitrato de Hierro Agua para inyección: 1,035.000 ml Nitrato de hierro.9H2O: 0.115 g Agua para inyección: hasta 1.150 litros 1.1.2. Preparación de las Formulaciones Contra Rotavirus en Ausencia de Fosfato y Carboxilato Agregados La formulación 60 presentada en la tabla 2 se ha hecho a una escala total de 325 g (250 ml), que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una.

Formulación No. 60: a 143 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega: 162.5 g de sucrosa (50% p/p). Después de completar la disolución la solución se esteriliza por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 19.5 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso el volumen de dosis es de 1.5 ml. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. Los resultados de la capacidad antiácido, título viral inicial y estabilidad viral se muestran en las tablas 2 a 4. Tabla 2: 1.5 ml de Volumen de Dosis *determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2 Tabla 3: 1.5 ml de Volumen de Dosis - Estabilidad Viral a Temperatura Ambiente r= meses; ND = sin determinar Tabla 4: 1.5 ml de Volumen de Dosis - Estabilidad Viral a 4°C *= meses; ND = sin determinar 1.1.3 Preparación de las Formulaciones Contra Rotavirus que Contienen un Carboxilato Se mezclaron ácido cítrico (cuando se presentó) y sal de citrato en las proporciones y condiciones ¡lustradas en las tablas 5 y 6. La estabilidad del rotavirus y la capacidad antiácido de las formulaciones se miden de acuerdo a los métodos dados en los ejemplos 111.1 y lll.2, respectivamente. Las formulaciones 110-115 y 128-130 se prepararon. El volumen de dosis fue de 2.5 ml para las formulaciones 110-115 y 1.5 ml para las formulaciones 128-130. Las formulaciones 110-115 presentadas en la tabla 5 se han hecho a la escala total de 325 g (250 ml), que representa 100 dosis de 2.5 ml (3. ,25 g) cada una. Formulación 110: Se preparó como sigue. A 123.71 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agregan consecutivamente: 19.29 g de citrato de trisodio (Na3Citrato.2H2O, Pm 294) (que corresponde a una concentración final de 262 mM) y 162.50 g de sucrosa (50% p/p). Después de completar la disolución, la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agrega 19.5 g del medio de DMEM que contiene una cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso el único volumen de dosis es de 2.5 ml o 3.25 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado.

En este ejemplo, el medio de DMEM representa el 6% p/p, que corresponde a una concentración final de fosfato de 0.059 mM.

Formulaciones 111-115: Se preparan de acuerdo a un procedimiento similar al explicado con respecto a la formulación 110, con la excepción de que la cantidad de ingredientes se adapte según lo detallado en la tabla 5. Por ejemplo, la formulación 111 se preparó mezclando los siguientes ingredientes: 123.73 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g), 19.07 g de citrato de trisodío (Na3Citrato.2H2O, Pm 294) (que corresponde a una concentración final de 259 mM), 0.197 g de ácido cítrico (Pm 192) (que corresponde a una concentración final de 4 mM) y 162.50 g de sucrosa (50% p/p). El resto del procedimiento fue hecho de acuerdo a la formulación 110.

Los resultados de la capacidad antiácido, título viral inicial y estabilidad viral se muestran en las tablas 5 a 8. Tabla 5: 2.5 ml de volumen de Dosis 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2 Las formulaciones presentaron en la tabla 6 se han hecho a la escala total de 325 g (250 ml), que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácido: Ácido Cítrico.1H2O (Pm 210), Na3Citrato.2H2O (Pm 294). Formulación 128: Se ha preparado mezclando 110.89 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) con los siguientes ingredientes: 31.78 g de citrato de trisodio (Na3Citrato.2H2O, Pm 294) (que corresponde a una concentración final de 432 mM), 0.328 g de ácido cítrico (Ácido cítrico.1 H2O, Pm 210) (que corresponde a una concentración final de 6 mM) y 162.50 g de sucrosa (50% p/p). Después completar la disolución, la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm.

Bajo condiciones estériles se agregó 19.5 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 1 O6 ° ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo el medio de DMEM representa el 6% p/p, que corresponde a una concentración final de fosfato de 0.059 mM. Formulaciones 129 y 130: Se han preparado de forma similar al procedimiento descrito para la formulación 128 mientras que se adaptan las cantidades de ingredientes de acuerdo a la tabla 6. Brevemente, la formulación 129 se ha preparado mezclando 0.77 g de ácido cítrico (Ácido cítrico.1H2O, Pm 210) (que corresponde a una concentración final de 15 mM) y 31.36 g de citrato de trisodío (Na3Citrato.2H2O (Pm 294) que corresponde a una concentración final de 426 mM). La formulación 130 se ha preparado mezclando 2.75 g de ácido cítrico (Ácido cítrico.1H2O, Pm 210) (que corresponde a una concentración final de 52 mM) y 34.7 g de citrato de trisodio (Na3Citrato.2H2O (Pm 294) que corresponde a una concentración final de 472 mM). El resto de los ingredientes y proporciones están en la tabla 6. Tabla 6: 1.5 ml de Volumen de Dosis 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2 Tabla 7: 1.5 ml de Volumen de Dosis - Estabilidad Viral a Temperatura Ambiente *= meses; ND = sin determinar Tabla 8: 1.5 ml de Volumen de Dosis - Estabilidad Viral a 4°C *= meses; ND = sin determinar 1.2 Estabilidad de Rotavírus y Capacidad Antiácido Resultados La titulación viral del rotavirus en diferentes puntos de tiempo se ha evaluado de acuerdo al procedimiento dado en el ejemplo 111.1 y la capacidad antiácido de la formulación se ha evaluado después del protocolo dado en el ejemplo lll.2. Los resultados se ilustran en las tablas 2 a 8 El pH para la formulación de control 60, que estuvo carente de carboxilato y fosfato agregado, no tuvo ninguna capacidad antiácido y exhibió adicionalmente un pH casi al límite superior de pH 8.0 para la estabilidad del virus. Para todas las formulaciones experimentales probadas en las tablas 5 a 8, el pH fue mantenido en un intervalo de aproximadamente 5.0-7.0 a excepción de la formulación 110, que exhibió un pH de por encima de 8.0. Como se puede considerar del título viral y de los resultados de pérdida viral, la estabilidad de rotavirus en la formulación líquida se relaciona al pH de esta formulación. En el intervalo de aproximadamente pH 5.4 (es decir la formulación 115) a pH 7.0 (es decir las formulaciones 111 y 128), la pérdida viral después de 7 días a 37°C se mantuvo a un nivel bajo (es decir por debajo de 0.5 log), y esto contrastó con el resultado obtenido para la formulación 110 (pH > 8, con una pérdida del título viral de 0.9 log). Adicionalmente, las formulaciones 111-115 y 128-130, mostraron una capacidad antiácido similar a la de la formulación 110, según lo determinado por el análisis del Baby Rossett-Rice (ver el ejemplo lll.2, 2). Esta capacidad antiácido excedió bien el límite más bajo de 8 minutos para 2.5 ml así como para las formulaciones de volumen de dosis de 1.5 ml, y alcanzó realmente un mínimo de 12 minutos, y se consideró por lo tanto altamente satisfactoria. Los carboxilatos alternativos también se han probado mientras que éstos pueden representar alternativas técnicamente factibles cuando las cantidades relativamente bajas de carboxilatos pueden ser deseables, por ejemplo al trabajar con los volúmenes de dosis muy pequeños. Los ejemplos de formulaciones que contienen tales carboxilatos alternativos se dan en ejemplo II y tablas 10-39. Ejemplo II - Formulaciones con Una Sal Alternativa de Carboxilato en Ausencia de Fosfato Agregado Las siguientes sales de carboxilato se han utilizado para crear una capacidad de amortiguador: acetato, malonato, succinato, glutarato, adipato y malato. De acuerdo a pKa de un ácido carboxílico dado, y dependiendo de su peso molecular, es posible encontrar las cantidades que se formularán para lograr la capacidad antiácido objetivo de por lo menos 8 minutos, convenientemente por lo menos 12 minutos según lo determinado por la prueba BRR, mientras está en una ventana de pH entre pH 5.0 a pH 8.0. Químicamente hablando, se obtiene un efecto "amortiguador" cuando se mezcla un ácido fuerte (como HCl) y una sal derivada de un ácido débil (como acetato de sodio). El valor de pH que corresponde al centro de la meseta del amortiguador es igual al pKa del ácido débil. El pKa de ácido carboxílico es una medida de fuerza acida, en otras palabras un indicador del intervalo de amortiguamiento efectivo del compuesto. Puesto que el rotavirus se degrada rápidamente bajo pH 4 (C. Weiss y H. F. Clark, 1985 J. Gen. Virol. 2725-2730), es deseable una meseta de amortiguador de pH por encima de 4, es decir convenientemente los carboxilatos con pKa >4 o di-carboxilatos con un pKa >4 promedio. Los carboxilatos convenientes se dan en la tabla 9. Se dan los valores numéricos de pKa promedio Tabla 9: Características de Varios Carboxilatos *Cinco ácidos carboxílicos tienen el estado "aditivo alimenticio"- cítrico E330, Acético E260, Propiónico E280, Málico E296 y Adípico E355. Una curva de titulación estándar de base acida para cuatro carboxilatos (malato de sodio, acetato de sodio, citrato de sodio y adipato de sodio), se ilustra en la figura 1. Muestra que la capacidad antiácido útil entre pH 4.0 y pH 7.0 por ejemplo, es de 72.50%, 68.75%, 57.70% y 41.25% de adipato de sodio, acetato de sodio, citrato de sodio y malato de sodio, respectivamente. Las formulaciones se han preparado con los siguientes carboxilatos: acetato, malonato, succinato, glutarato, adipato y malato. Todas las formulaciones mostradas en este ejemplo se han preparado en un volumen de dosis de 1.5 ml. 11.1. Formulaciones con Acetato 11.1.1. Las formulaciones presentadas en la tabla 10 se han hecho a la escala de 325 g (250 ml) que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada uno. Materiales antiácidos: Ácido acético (Pm 60), NaOH (Pm 40). Formulación 36: A 148.84 g de agua (cantidad suficiente para lograr una preparación final de 325 g) se agregó sucesivamente 10.66 g de NaOH, ácido acético glacial pH 7.16 y 130 g de sucrosa (40% p/p). Después de completar la disolución, la solución se esteriliza por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 19.5 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavirus a la solución, para obtener un 106 ° ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa un 6% p/p. Formulaciones 37 y 42: Se procede de acuerdo a la formulación 36, pero las cantidades se ajustan de acuerdo a la tabla 10. Formulación 87: A 75.00 g de agua se agrega sucesivamente: 8.00 g de NaOH, 15.00 g de ácido acético glacial, suficiente solución de 1N NaOH bastante lograr un pH de 7.00 (en este caso se agregó 2 g de 1N NaOH), agua adicional para lograr una cantidad suficiente de 325 g (en este caso se agregó 43.00 g de agua), y 162.50 g de sucrosa (50% p/p). El resto del procedimiento se realiza de acuerdo a a la formulación 36.

Ejemplo para las formulaciones 88-90: Se procedió de acuerdo a la formulación No. 87 con la excepción de que las cantidades se adaptan según lo mencionado en la tabla 10. Ejemplo para las formulaciones 33-35: Se procedió de acuerdo a la formulación No. 36 con la excepción de que las cantidades se adaptan según lo mencionado en la tabla 10 y de que NaOH es remplazado por Ca(OH)2. Las formulaciones 33-35 no se incluyeron en el estudio de estabilidad en términos bajos debido a que fallan en cumplir con la prueba de estabilidad de 1 semana a 37°C. Los resultados satisfactorios en presencia de un ¡ón de calcio adicional no obstante se presentan en la serie de adipato (ver el ejemplo II.5.4, y tabla 26). Tabla 10 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2; °= repetidos 11.1.2. Las formulaciones presentadas en la tabla 11 se han hecho a la escala de 325 g (250 ml) que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácido: Acetato de Sodio.3H2O (Pm 136). Ejemplo para la formulación 58: A 113.00 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) sucesivamente se agregan: 30.00 g de acetato de sodio 3 H2O y 162.50 g de sucrosa (50% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agrega 19.5 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavirus a la solución, para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa un 6% p/p. Formulaciones 59, 66, 69, y 70: Se procede de manera similar a la formulación 58 con cantidades ajustadas (ver la tabla 11). Tabla 11 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2; °= repetidos 11.1.3. Estabilidad de Rotavirus y Capacidad Antiácido -Resultados La titulación viral de rotavirus en diferentes puntos de tiempo se ha evaluado de acuerdo al procedimiento dado en el ejemplo 111.1 y la capacidad antiácido de la formulación se ha evaluado después del protocolo dado en el ejemplo lll.2.2. Los resultados se ilustran en las tablas 10. 11, 12 y 13.

En la conclusión, la estabilidad de rotavirus en una formulación líquida de acetato se relaciona al pH. Un intervalo de trabajo conveniente está entre pH 6.0 a 7.5. Tabla 12 - Estabilidad Viral a Temperatura Ambiente *= meses; Cuadros vacíos = criterios sin determinar Tabla 13 - Estabilidad Viral a 4°C = meses; Cuadros vacíos = criterios sin determinar 11.2. Formulaciones con malonato 11.2.1. Formulación 67: (Ver la tabla 14) se ha hecho a la escala total de 325 g (250 ml) que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido malónico (Pm 104), NaOH (Pm 40). Formulación 54: (Ver la tabla 14) se ha hecho a la escala total de 44 g (35 ml) que representa 20 dosis de 1.75 ml (2.2 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido malónico (Pm 104), NaOH (Pm 40). Formulación No. 67: A 110.70 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: 14.00 g de NaOH, 18.230 ácido malónico y 162.5 g de sucrosa (50% p/p). Después de completar la disolución, la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agrega 19.5 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p. Formulación No. 54: A 16.64 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 2.4 g NaOH, 3.1213 g de ácido malónico y 19.5 de sucrosa (44% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p. Tabla 14 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2. °°La formulación 54 fue eliminada del estudio de estabilidad a largo plazo debido a su pH inicial de por encima de 8.0. II.2.2. La formulación presentada en la tabla 15 se ha hecho a la escala total de 325 g (250 ml) que representa 147.7 dosis de 1.75 ml (2.20 g) cada una. Material antiácido: malonato de disodio (Pm 148). Formulación No. 62: A 138.50 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: 23.00 g de malonato de disodio y 144.00 g de sucrosa (44% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó a la solución 19.5 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavirus, para obtener 1 O6 ° ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.20 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p. Tabla 15 'determinado por la prueba del Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2. 11.2.3. Estabilidad de Rotavirus y Capacidad Antiácido - Resultados En conclusión, la estabilidad de rotavirus en una formulación líquida de malonato se relaciona con el pH: pH 6.5 da una buena estabilidad durante 1 semana a 37° C mientras que más de 0.9 log de pérdida se observa a pH 8.2. 11.3 Formulaciones con Succinato 11.3.1. Formulación 127: (Ver la tabla 16) se ha hecho a la escala de 325 g (250 ml) que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido succínico (Pm 118), NaOH (Pm 40). Formulación 51 : (Ver la tabla 16) se ha hecho a la escala de 44 g (35 ml) que representa 20 dosis de 1.75 ml (2.2 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido succínico (Pm 118), NaOH (Pm 40). Formulación 127: A 120.16 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: 9.10 g de NaOH, 13.74 g de ácido succínico y 162.5 g de sucrosa (50% p/p). El resto de las etapas de la formulación son idénticas a las descritas para la formulación 67. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p.

Formulación 51 : A 16.22 g de agua (cantidad determina para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 2.4 g de NaOH, 3.5414 g de ácido succínico y 19.5 g de sucrosa (44% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM agrega que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p.

Tabla 16 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2. °°La formulación 51 fue eliminada del estudio de estabilidad a largo plazo mientras que se determino que su capacidad antiácido es demasiada larga II.3.2. La formulación 56 se presenta en la tabla 17 y se ha hecho a la escala total de 325 g (250 ml) que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Succinato de disodio (Pm 162). Formulación 56: A 122.50 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: 20.50 g de succinato de disodio y 162.50 g de sucrosa (50% p/p). El resto de las etapas de formulación son idénticas a las descritas para la formulación 62. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p. Tabla 17 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2.; ° = repetición 11.3.3. Estabilidad de Rotavirus y Capacidad Antiácido -Resultados En conclusión, la estabilidad de rotavirus en una formulación líquida de succinato se relaciona con el pH: el pH 6.3 da buena estabilidad durante 1 semana a 37° C mientras que 0.8 log de pérdida se observa a pH 8.1. 11.4. Formulaciones con Glutarato 11.4.1. Las formulaciones con glutarato se presentan en la tabla 18. Formulación 65: Se ha hecho a la escala total de 320.8 g (246 ml) que representa 164 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido glutárico (Pm 132), NaOH (Pm 40).

A 114.1 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 320.8 g) se agrega sucesivamente: 9.3 g de NaOH, 15.40 g de ácido glutárico y 162.5 g de sucrosa (50.6% p/p). Después de completar la disolución, la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 19.5 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 1 O6 ° ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa el 6.08% p/p.

Formulación 50: Se ha hecho a la escala total de 44 g (35 ml) que representa 20 dosis de 1.75 ml (2.2 g) cada una.

Materiales antiácidos: Ácido glutárico (Pm 132), NaOH (Pm 40).

A 15.8 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 2.4 g de NaOH, 3.964 g de ácido glutárico y 19.5 g de sucrosa (44% p/p).

Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p. Las formulaciones 125 y 126 se han hecho a la escala total de 325 g (250 ml) que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido glutárico (Pm 132), NaOH (Pm 40). Formulación 125: A 100.35 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: 9.10 g de NaOH, 15.40 g de ácido glutárico y 162.5 g de sucrosa. El resto de las etapas de formulación son idénticas a las descritas para la formulación 67. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p. Formulación 126: Se procedió de acuerdo a la formulación 125 pero con cantidades ajustadas (ver la tabla 18).

Tabla 18 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2. °°La formulación 50 fue eliminada del estudio de estabilidad a largo plazo debido a su pH inicial (aproximadamente 8.0) y su capacidad antiácido (determinada que es demasiado larga). 11.4.2. Estabilidad de Rotavirus y Capacidad Antiácido -Resultados En conclusión, la estabilidad de rotavirus en una formulación líquida de glutarato se relaciona con el pH: el pH 6.17 da buena estabilidad durante 1 semana a 37° C mientras que 0.7 log de pérdida se observa a pH 8.1. 11.5. Formulaciones con Adipato 11.5.1. Las formulaciones que contienen adipato presentadas en la tabla 19 se han hecho a la escala de 325 g (250 ml) que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una a excepción de la formulación No. 45 que se ha preparado a la escala de 44 g (35 ml) que representa 20 dosis de 1.75ml (2.2 g) cada una, y de la No. 63 que se ha preparado a la escala de 320.8 g (247 ml) que representa 164 dosis de 1.5ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido adípico (Pm 146), NaOH (Pm 40).

Formulación 45: A 15.38 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 2.4 g de NaOH, 4.3809 g de ácido adípico y 19.5 g de sucrosa (44% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 1 O6 ° ffu por dosis. En este caso la dosis es d e1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p.

Formulación 63: A 112.50 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 320.8 g) se agrega sucesivamente: 9.3 g de NaOH, 17.00 g de ácido adípico y 162.5 g de sucrosa. Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 19.5 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 1 O6 ° ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa el 6.08% p/p. Formulación 81 : A 116.70 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: 9.28 g NaOH, 17.00 g de ácido adípico y 162.5 g de sucrosa (50% p/p). El resto de las etapas de formulación son idénticas a las descritas para la formulación 67. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p.

Formulaciones 82. 83, 91-97. 100-109. 122-124. 131-134. 136-145, 147, 148: A agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: NaOH, ácido adípico y sucrosa en cantidades según lo descrito en las tablas 19 y 23. Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 19.5 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla resultante se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa el 6% p/p.

Varios parámetros, mostrados en negritas en la tabla 19, se han variado para probar el rendimiento de las formulaciones resultantes con respecto a la capacidad antiácido y estabilidad del virus.

Tabla 19 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2; N'D = sin determinar; ° = repetición °° La formulación 45 fue eliminada debido a que la capacidad antiácido fue demasiado larga °° Las formulaciones 103, 104 y 108, 109 se eliminaron debido a que el ácido adípico se recristalizó en reposo a 4-8°C °° Las formulaciones Nos. 107, 141 y 142 se eliminaron debido a que son similares a la formulación ya bajo evaluación °° Las formulaciones Nos. 136-140 se eliminaron debido a que el pH inicial fue demasiado alto 11.5.2. Estabilidad de Rotavirus y Capacidad Antiácido -Resultados La titulación viral del rotavirus en diferentes puntos de tiempo se ha evaluado de acuerdo al procedimiento dado en el ejemplo 111.1 y la capacidad antiácido de la formulación se ha evaluado después del protocolo dado en el ejemplo lll.2.2. Los resultados se ilustran en las tablas 19, 20, 21 y 22. Tabla 20 - Estabilidad Viral a Temperatura Ambiente = meses; Cuadros vacíos = sin determinar Tabla 21 - Estabilidad Viral a 4°C = meses; Cuadros vacíos = sin determinar La capacidad antiácido de las formulaciones 91-94 fue medida por el 'método Baby Rossett-Rice' (ver el ejemplo lll.2.2) y muestra las posibilidades de alcanzar 8, 12, 16, ó 20 minutos a pH >4 Los resultados se muestran en la tabla 22 y en la figura 2A.

Tabla 22 En conclusión, según lo observado para las otras formulaciones de carboxilato, en la serie de adipato, un valor de pH alto no proporciona buenos datos de estabilidad (ver por ejemplo la formulación 124 que tiene un pH de 9.5 y exhibe más de 2.85 log de pérdida viral después de 1 semana de almacenamiento a 37°C). El valor límite de aceptabilidad más alto de pH es de aproximadamente 8.0 (ver por ejemplo el valor de pH de 7.96 obtenido para la formulación 143) para el cual una pérdida viral de 0.5 log se observa después de 1 semana a 37°C.

Un intervalo conveniente de pH está entre aproximadamente pH 5.5 y aproximadamente pH 8 para estas formulaciones, con un intervalo más conveniente entre pH 6.0 y pH 7.7. La formulación de adipato (un material aditivo alimenticio) es una buena adaptación con los valores de pKa óptimos (pKa 5.4 y p a24.43) que permiten que la capacidad antiácido objetivo (por ejemplo t = 12 minutos) sea alcanzada usando cantidades razonables de material (aproximadamente 100 mg por dosis). Además, estas cantidades son compatibles con los parámetros de solubilidad de tal modo se permite la formulación de la vacuna en un volumen de dosis de 1.5 ml. Esto no es posible con las formulaciones de fosfato de citrato clásicas debido a la impracticabilidad técnica tal como la cristalización de fosfato (ver el ejemplo comparativo IV). Son también compatibles con parámetros de toxicidad mientras que los datos de toxicidad son un poco bajos (LD50 oral en rata: 5.7 g/kg) para adipato con respecto a otros carboxilatos. 11.5.3. Efecto del Título de Virus en la Dosis de Vacuna sobre la Estabilidad del Virus El siguiente experimento fue realizado para evaluar el efecto inicial del título de rotavirus (de 106 0, 106 5, 105 2) en una dosis de vacuna de 1.5 ml sobre la estabilidad de rotavirus. La titulación viral de rotavirus en diferentes puntos de tiempo se ha evaluado de acuerdo al procedimiento dado en el ejemplo 111.1 y la capacidad antiácido de la formulación de acuerdo al protocolo dado en el ejemplo lll.2.2. Los resultados se ilustran en las tablas 23, 24, y 25. Tabla 23 'determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2. Tabla 24: Estabilidad Viral a Temperatura Ambiente * = meses; Cuadros vacios = sin determinar Tabla 25: Estabilidad Viral a 4°C '= meses; Cuadros vacios = sin determinar En conclusión, en el intervalo evaluado, la estabilidad de rotavirus permanece similar y aceptable al título inicial de virus. 11.5.4. Formulaciones con Adipato en Presencia de Iones de Calcio Se ha reportado que el calcio puede influenciar la estabilidad y adaptación de la glicoproteína VP7 de rotavírus SA11 expresada en Dictystelium díscodeum (K.R. Emslie y col., 1996, Journal of Biotechnology 50. 149-159). Puede ser benéfico agregar iones de calcio a la formulación líquida de rotavirus de adipato de la invención, mientras puede contribuir a la estabilización del rotavírus dentro de la formulación. Por consiguiente, varias cantidades de iones de calcio se han probado en la formulación de adipato (tabla 26). Se han probado dos alternativas: CaCI2 y Ca(OH)2. Formulaciones 98, 116-118: a 9.28 g de NaOH se agrega sucesivamente: agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g), 17.00 g de ácido adípico, CaCI2 según lo especificado en la tabla 26, (una precipitación ocurre, pero el precipitado se vuelve a disolver después de una hora de agitación a temperatura ambiente, excepto en la formulación No. 117), y 178.75 g de sucrosa. El resto de las etapas de formulación son idénticas a las descritas para la formulación 82. En esta formulación DMEM representa 6% p/p. Formulación 99: A agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: Ca(OH)2 según lo especificado en tabla 26, 17.00 g de ácido adípico, 9.02 g de NaOH y 178.75 g de sucrosa. El resto de las etapas de formulación son idénticas a las descritas para la formulación 82. En esta formulación DMEM representa 6% p/p. La titulación viral de rotavirus en diferentes puntos de tiempo se ha evaluado de acuerdo al procedimiento dado en el ejemplo 111.1 y la capacidad antiácido de la formulación se ha evaluado después del protocolo dado en el ejemplo lll.2.2. Los resultados se ilustran en las tablas 26, 27 y 28.

Formulaciones 119-121: a CaCI2 según lo especificado en la tabla 26 se agrega sucesivamente: agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g), 9.28 g de NaOH (en este caso la precipitación de Ca(OH)2 ocurre, pero el precipitado se vuelve a disolver después de la adición de ácido adípico excepto en la formulación No. 121), 17.00 g de ácido adípico y 178.75 g de sucrosa. El resto de las etapas de formulación son idénticas a las descritas para la formulación 82. En esta formulación DMEM representa 6% p/p. Tabla 26 * determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2. °° Las formulaciones 117 y 121 se eliminaron debido a que ocurrió un poco de precipitación de material ¡nsoluble durante sus preparaciones Tabla 27: Estabilidad Viral a Temperatura Ambiente r= meses; Cuadros vacios = sin determinar 7aJ /a 28: Estabilidad Viral a 4°C *= meses; Cuadros vacios = sin determinar Conclusión: se ilustra la estabilidad de rotavirus en presencia de los iones de calcio: no más de 0.3 log de pérdida se experimenta después de 1 semana a 37°C, que es similar al resultado obtenido para las formulaciones hechas en las mismas condiciones y que contienen los mismos ingredientes a excepción de los iones de calcio agregados (ver por ejemplo la formulación 83 en las tablas 19-21). 11.5.5. Formulaciones con Adipato en Presencia de Virus Orales de Polio Algunos esquemas de inmunización rutinarios pueden asociarse al mismo punto de tiempo en vacunaciones polio oral y rotavirus. El objetivo del siguiente experimento fue determinar si ambas vacunaciones fueron compatibles. Por lo tanto fue preparada una vacuna experimental combinada para polio oral/rotavirus.

Composición de Medio de OPV Utilizado para las Formulaciones 149, 151-155 Agua para inyección: 80.00 I Hidrolisato de lactoalbúmina: 1500.00 g Agua para inyección: 200.00 I Cloruro de sodio: 2040.00 g Cloruro de potasio: 120.00 g Sulfato de magnesio 7.H2O: 30.00 g KH2PO4: 38.00 g Anhidro de glucosa: 1200.00 g Sulfato de neomicina: 15.00 g Tween 80: 6.00 g Cloruro de calcio.2H2O: 80.00 g Hidróxido de sodio: 30.00 g Bicarbonato de sodio: 660.00 g Rojo de fenol: 6.00 g L-cistína: 30.00 g Ácido hidroclórico 1N: 550.00 g Sulfato de polimixina B: 30.00 g Agua para inyección hasta 300.00 I Formulaciones 149-155: A agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: NaOH y ácido adípico en cantidades según lo descrito en la tabla 29, y 178.75 g de sucrosa. Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles y siguiendo las cantidades según lo descrito la tabla 29, se agregó medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 5 CCID50 por dosis y se agregó OPV que contiene las cantidades necesarias de virus de polio para obtener CCID50 106 6 tipo I, 105 6 tipo II, 106 1 tipo lll por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla resultante es homogeneizada y distribuida en el envase de dosis apropiado. En los ejemplos DMEM representa 6% p/p, sucrosa es a 55%p/p, NaOH es 0.92M, ácido adípico es 0.466M.

Tabla 29 La titulación viral de rotavirus en diferentes puntos de tiempo se ha evaluado de acuerdo al procedimiento dado en el ejemplo 111.1 y la capacidad antiácido de la formulación se ha evaluado después del protocolo dado en el ejemplo Hl.2.2. Los resultados se ilustran en la tabla 30. \Tabla 30 (En esta Tabla: Todos los Títulos Virales en CCID50/Dosis **) * determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2. "se puede estimar entre que la correspondencia entre ffu y CCID50 es de aproximadamente 0.5 log (por ejemplo 1060 según lo expresado en CCID50 es equivalente a aproximadamente 105 5 según lo expresado en ffu por dosis). Cuadros vacios: sin determinar "no" significa que el virus correspondiente no fue incorporado a la fórmula. Conclusiones: 1) el medio de polio es compatible con la capacidad antiácido (BRR 12 minutos en la formulación No.149). 2) el medio de polio es compatible con rotavirus (comparando la formulación No. 150 a la formulación No. 151, donde se puede observar que los mismos títulos son obtenidos para ambas formulaciones, a t=0 4°C y después una semana a 37°C). 3) la composición de rotavirus es compatible con el políovirus (título viral de polio previsto obtenido en la formulación No. 152). 11.5.6 Estabilidad de las formulaciones de adipato durante un caso de congelamiento 11.5.6.1. Congelamiento a -20°C La formulación de rotavirus No. 95, después de 6 meses almacenada entre +4°C y +8°C, fue sometida a 3 casos de congelamiento sucesivos (-20°C) de acuerdo a la siguiente duración (tabla 31 ). 11.5.6.2. Congelamiento a -70°C La formulación de rotavirus No. 95, después de 14 meses almacenada entre +4°C y +8°C, fue sometida a un caso de congelamiento a -70°C de acuerdo a la siguiente duración (tabla 31): Tabla 31 Las muestras fueron analizadas y comparadas al título viral a t = 0 (4°C) y también al título viral de las muestras de la misma edad almacenadas a la temperatura de refrigerador común (15 meses a +4°C en este caso). Los resultados se muestran en la tabla 32. Tabla 32 En la conclusión, la composición de la formulación No. 95 (formulación de adipato) es compatible con por lo menos 3 casos de congelamiento a -20°C. También es compatible con por lo menos un caso de congelamiento a -70°C. 11.6. Formulaciones con Malato como Carboxilato 11.6.1. Las formulaciones presentadas en la tabla 33 (con excepción de las formulaciones 46, 64, 84, 85 y 86) se han hecho a la escala de 325 g (250 ml) que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido D, L-málico (Pm 146), NaOH (Pm 40). La formulación No. 46 se ha hecho a la escala de 44 g (35 ml) que representa 20 dosis de 1.75 ml (2.2 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido D, L-málico (Pm 146), NaOH (Pm 40).

Formulación 46: A 15.74 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 2.4 g de NaOH, 4.0211 g de ácido málico y 19.5 g de sucrosa (44% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavírus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. La formulación No. 64 se ha hecho a la escala de 318.4 g (244.5 ml) que representa 163 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido de D, L-málico (Pm 146), NaOH (Pm 40). La formulación No. 84 se ha hecho a la escala de 130 g (100 ml) que representa 66.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido de D-málico (Pm 146), NaOH (Pm 40). La formulación No. 85 se ha hecho a la escala de 130 g (100 ml) que representa 66.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una.

Materiales antiácidos: Ácido de L-málico (Pm 146), NaOH (Pm 40). La formulación No. 86 se ha hecho a la escala de 130 g (100 ml) que representa 66.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Materiales antiácidos: Ácido de D, L-málico (Pm 146), NaOH (Pm 40). Formulación 64: A 97.3 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final 318.4 g) se agrega sucesivamente: 14.6 g NaOH, 24.50 g ácido málico y 162.5 g de sucrosa (51% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 19.5 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 1 O6 ° ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6.12% p/p. Formulación 71 : A 103.9 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final 325) se agrega sucesivamente: 14.90 g de NaOH, 25.00 g ácido de adípico y 162.5 g de sucrosa (50% p/p). El resto de las etapas de formulación son idénticas a las descritas para la formulación 67. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. Formulaciones 72-77, 84-86: Se procedió de acuerdo a la formulación 71 pero con cantidades ajustadas (ver la tabla 33). Formulación 78: A 75.00 g de agua se agrega sucesivamente: 8.00 g NaOH, 25.00 g ácido málico suficiente solución de 1 N NaOH para lograr un pH de 6.48, agua adicional para lograr 325 g y 162.50 g de sucrosa (50% p/p). El resto de las etapas de formulación son idénticas a las descritas para la formulación 67. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. Formulaciones 79 y 80: Se procedió de acuerdo a la formulación 78 pero con cantidades ajustadas (ver la tabla 33).

Tabla 33 * determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2; = repetición °° La formulación 73 fue eliminada debido a dificultades durante la filtración estéril debido a la alta viscosidad de la solución °° La formulación 75 fue eliminada debido a la solubilidad lenta de la sucrosa La titulación viral de rotavirus en diferentes puntos de tiempo se ha evaluado de acuerdo al procedimiento dado en el ejemplo 111.1 y la capacidad antiácido de la formulación se ha evaluado después del protocolo dado en el ejemplo lll.2.2. Los resultados se ilustran en las tablas 33, 34 y 35. Tabla 34: Estabilidad Viral a Temperatura Ambiente *= meses; ND = sin determinar Tabla 35 - Estabilidad Viral a 4°C *= meses; ND = sin determinar 11.6.2. Estabilidad de Rotavirus y Capacidad Antiácido -Resultados La estabilidad de rotavirus en una formulación líquida de malato se relaciona al pH. El intervalo de pH que fue investigado, es decir el intervalo de pH de 6.0 a 7.0 da una buena estabilidad durante 1 semana a 37° C. 11.7. Formulaciones Con Glutamato El aspartato y glutamato son aminoácidos con un grupo carboxilato en su cadena lateral. Los valores de pKa del ácido carboxílico de cadena lateral son 3.65 y 4.25 respectívamente. Así, el glutamato con un pKa más alto que 4 se puede utilizar como amortiguador para constituir la capacidad antiácido. Ver la tabla 36. Formulaciones 41 : A agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: NaOH, ácido glutámico y sucrosa en cantidades según lo descrito en la tabla 36. Después de completar la disolución la solución se esteriliza por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 19.5 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla que resulta se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. Formulación 43: A agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 7.1 g de monosodio glutamato 1H2O y 19.50 g de sucrosa (44% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó a la solución 2.64 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavirus, para obtener 106 0 ffu por dosis. En este cas e la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. Formulación 61: A agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: 52.43 g de monosodio glutamato 1H2O y 144 g de sucrosa (44% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó a la solución 19.5 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavirus, para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p.

Formulación 68: A agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 250 g) se agrega sucesivamente: 0.2 g de monosodio glutamato 1H2O, 2.5 g albúmina de suero bovino, 0.250 g de Na2HPO4.2H2O, 0.125 g de KH2PO4, 0.5 g de EDTA y 18.75 g de sucrosa (7.5% p/p). Después de completar la disolución la solución se esteriliza por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó a la solución 19.5 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavirus, para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o casi 1.5 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 7.8% p/p. La titulación viral de rotavirus en diferentes puntos de tiempo se ha evaluado de acuerdo al procedimiento dado en el ejemplo 111.1 y la capacidad antiácido de la formulación se ha evaluado después del protocolo dado en el ejemplo lll.2.2. Los resultados se ilustran en las tablas 36, 37 y 38. Tabla 36 determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2. °° La formulación 41 fue eliminada debido a que su pH inicial fue alto °° La formulación 68 fue eliminada del estudio de estabilidad a largo plazo debido a su resultado de pérdida viral insatisfactorio obtenido después de 1 semana a 37°C Tabla 37: Estabilidad Viral a Temperatura Ambiente *= meses; Cuadros vacios = sin determinar Tabla 38: Estabilidad Viral a 4°C *= meses; Cuadros vacios = sin determinar La estabilidad de rotavirus en una formulación líquida de glutamato es similar a la estabilidad obtenida con otros carboxilatos descritos en la presente anteriormente. Brevemente: la estabilidad es mejor a un pH de aproximadamente 7 (6.93 en la formulación No. 61) comparado a un medio más básico (pH 10.36 en la formulación No. 43) la estabilidad también es mejor a un porcentaje alto de sucrosa (sucrosa a 44% en la formulación No.61 comparado a sucrosa a 7.5% en la formulación No. 68) las curvas del perfil de estabilidad a 1 semana 37°C, a temperatura ambiente, y a 4-8°C son similares a otros carboxilatos descritos aquí anteriormente. 11.8. Formulaciones con Fumarato Formulación 44: A 16.28 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 2.4 g de NaOH, 3.4811 g de ácido fumárico y 19.5 g de sucrosa (44% p/p). Después de una hora de agitación a temperatura ambiente el material insoluble permanece en la suspensión. La preparación fue eliminada. 11.9. Formulaciones con Lactobionato Formulación 47: A 16.02 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 1.2 g de NaOH, 10.7414 g de ácido lactobiónico y 13.7 g de sucrosa (31% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. 11.10. Formulaciones con Maleato Formulación 48: A 16.88 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final 44g) se agrega sucesivamente: 2.4 g de NaOH, 2.8821 g de anhídrido maléico y 19.5 g de sucrosa (44% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 1 O6 ° ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6%p/p. Formulación 57: A 110.3 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agrega sucesivamente: 32.7 g de maleato de disodio y 162.5 g de sucrosa (50% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 19.5 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.5 ml o 1.95 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. 11.11. Formulaciones con Glucuronato Formulación 49: A 16.14 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 1.2 g de NaOH, 5.8211 g de ácido glucurónico y 18.5 g de sucrosa (42% p/p). Después de completar la disolución, la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla es homogenizada y distribuida en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. 11.12. Formulaciones con Galacturonato Formulación 52: A 16.14 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 1.2 g de NaOH, 5.8218 g de ácido galacturónico y 18.5 g de sucrosa (42% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. 11.13. Formulaciones con Galactarato Formulación 53: A 15.96 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 2.4 g de NaOH, 6.3008 g de ácido galactárico y 17.0 g de sucrosa (38% p/p). Después de una hora de agitación a temperatura ambiente, el material insoluble permanece en la suspensión. La preparación fue eliminada. 11.14. Formulaciones con Tartarato Formulación 55: A 15.26 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 44 g) se agrega sucesivamente: 2.4 g de NaOH, 4.4996 g de ácido tartárico y 19.5 g de sucrosa (44% p/p). Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Bajo condiciones estériles se agregó 2.34 g de medio de DMEM que contiene la cantidad necesaria de rotavirus para obtener 106 0 ffu por dosis. En este caso la dosis es de 1.75 ml o 2.2 g. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. 11.15. Conclusión Global para las Formulaciones que Contienen un Carboxilato en Ausencia de Fosfato Agregado Varias formulaciones estables han sido preparadas con varios carboxilatos, en ausencia de fosfato agregado. El único fosfato presente en estas formulaciones experimentales se originó del amortiguador de DMEM y nunca excedió de 0.059 mM (5% p/p DMEM), 0.071 mM (6% p/p DMEM), o 0.094 mM (8% p/p DMEM). Todos los carboxilatos probados han mostrado la capacidad de actuar como agentes amortiguadores al neutralizar la acidez del estómago de tal modo se previene o minimiza la inactivación del ingrediente activo, es decir el antígeno de rotavirus, presente en la formulación. Todas las formulaciones probadas, hechas en varios volúmenes de dosis de administración (es decir 1.5 ml, 2.0 ml y 2,5 ml), exhibieron un pH entre aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0, y la mayoría de las formulaciones un pH de aproximadamente pH 5.5 a aproximadamente 7.5. Estas formulaciones se desempeñaron bien durante la prueba de estabilidad a las tres temperaturas de almacenamiento probadas (es decir 37°C, temperatura ambiente o 4°C). Además, estas formulaciones exhibieron una capacidad antiácido satisfactoria, es decir una capacidad antiácido de por lo menos 8 minutos, y la mayoría de las formulaciones por lo menos de 12 minutos, según lo determinado por la prueba de BRR (ver el procedimiento en el ejemplo lll.2.2).

En la siguiente tabla 39 se presenta una breve explicación de los datos de estabilidad obtenidos para las formulaciones de adipato seleccionadas de acuerdo al pH de la formulación. Los siguientes criterios fueron determinados: i) pérdida viral después del almacenamiento durante una semana a 37°C (estabilidad acelerada) (*), ii) tiempo expresado en los meses dentro de los cuales la pérdida del título viral permanece por debajo de 1.0 log (después del almacenamiento a temperatura ambiente) junto con el título viral alcanzado en el período mencionado (**), Mi) título viral en ffu/dosis de vacuna logrado después del almacenamiento durante un año (12 meses) a 4°C (*").

Tabla 39 50% de sucrosa ß 49 5M5.0 5.8 0.2 J L 6M4.9 55% de sucrosa M= meses $= pH según lo determinado a T = 0 (4°C) por la prueba BRR de acuerdo al ejemplo lll.2.2 * los mejores resultados basados en la prueba de estabilidad de 1 semana 37°C - es tolerada una pérdida de título viral máxima de 0.5 log " los mejores resultados basados en la prueba de estabilidad a temperatura ambiente - es tolerada una pérdida de título viral máxima de 1.0 log "* los mejores resultados basados en la prueba de estabilidad a 4-8°C - es tolerada una pérdida de título viral máxima de 0.5 log **** los mejores resultados acumulativos - son toleradas una pérdida de título viral _ 0.5 log salvo < 1.0 log, y una pérdida de título viral de < 0.5 log y ambas son aceptables de acuerdo a este criterio Sombreado gris: la formulación aceptable para el criterio determinado (*, *", ", o *") con una pérdida viral de < 0.5 log; cuadro rayado: formulación aceptable para el criterio determinado (*, *", de ", o *") con una pérdida viral > 0.5 log salvo < 1.0 log; sombreado negro: la formulación inaceptable mientras ocurre la cristalización. Claramente, en las formulaciones de adipato probadas, el intervalo de pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0 (6-8) exhibió un perfil de estabilidad bueno aceptable compatible con una pérdida del título viral máxima de 1.0 log y el sub-intervalo de pH de aproximadamente 6.0 a 6.8 (6-6.8) un perfil de estabilidad bueno, aceptable, compatible con una pérdida del título viral máxima de 0.5 log Ejemplo lll - Métodos lll.1 Titulación Viral de Rotavirus La detección de rotavirus infeccioso es hecha por incubación de la formulación que contiene el rotavirus y varios componentes en las células MA104 permisivas (ATCC CRL 2378).

El rotavirus (por ejemplo rotavirus P43, ECACC 99081301) fue formulado según lo descrito en los ejemplos anteriores. Después de la inoculación de muestras virales, las células se incuban durante 16 a 18 horas. Las células después se fijan y humedecen con acetona al 80%. Las células infectadas son identificadas por inmunofluorescencia indirecta usando un anticuerpo específico de anti-rotavirus monoclonal de la proteína VP6 (Mab 9F6) detectada por IgG conjugado con fluoresceína y examinada bajo un microscopio UV. Cualquier anticuerpo monoclonal comercialmente disponible contra la proteína VP6 de rotavírus es conveniente, y las dilusiones de trabajo apropiadas serán determinadas por la experimentación rutinaria. Por ejemplo los siguientes monoclonales son convenientes: - RV 11-2 (lgG2a, fluido de ascitis conjugado con isotiocianato de fluoresceína) de Rural Technologies Ine (www.ruraltechinc.com) 5F8 F9 (IgGI, número de catálogo RVM-1601 A-5) o 2F2 19 (lgG2b, número de catálogo RVM-1601 B-5) de Austral Biologicals (www.australbiologicals.com) MABR10 (fracción de IgG) de Immunological and Biochemical testsystems Gmbh (www.afsbio.com) También son convenientes los anticuerpos policlonales de rotavirus Anti-Vp6, por ejemplo AB1129F de Chemícon (www.chemicon.com). Cada foco fluorescente corresponde a un virus infeccioso. Los títulos se expresan según el logaritmo de la unidad de formación de foco por ml (log (ffu/ml)). La precisión de la titulación viral es de aproximadamente + o - 0.2 log. Los resultados de la titulación viral en ffu/ml se convierten a ffu/dosis de acuerdo a la dosis de volumen de muestra inicial. Todos los datos presentados en las tablas están en log base 10 ffu (log10) por dosis. Los buenos resultados son aquellos en los cuales se alcanza una disminución de < 0.5 log durante la "semana 1 a 37°C" (prueba de estabilidad acelerada). Las formulaciones, que exhiben una pérdida viral de 1 log o más, se eliminan de las pruebas de estabilidad adicionales. lll.2 Método para la Medición Antiácido: Baby Rossett-Rice (BRR) Titration lll.2.1. Introducción La prueba Baby Rossett-Rice (BRR) Titration se ha adaptado a una población de bebés de la prueba Rossett-Rice Titration desarrollada originalmente para una población de adultos. La titulación Rossett-Rice es una prueba bien conocida usada en el dominio antiácido (ver a N. E. Rossett y Marión L. Rice en Gastroenterology, 1954 volumen 26 páginas 490-495: ?n in vitro evaluation of the efficacy of the more frequently used antiacíd with particular attention to tablets'). La titulación Rossett-Rice mide la velocidad de reacción de la sustancia antiácido bajo prueba con 0.1 N ácido hidroclórico y la duración del pH elevado. Para simular las condiciones en el estómago vacío, se agrega inmediatamente ácido hidroclórico reciente una vez al principio de la medición. Para simular las condiciones en el estómago durante el proceso de digestión, se agrega ácido hidroclórico reciente a una velocidad constante a la mezcla de reacción bajo prueba.

Brevemente, la titulación Rossett-Rice en adultos se divide en dos partes: la adición inicial de 30 ml de 0.1 N HCl, que representan el contenido ácido del bolo de un estómago vacío; seguida por la adición continua, en una velocidad de 4 ml/min, de 0.1 N HCl, que es una imitación de la secreción acida del estómago durante la digestión. Ésas son condiciones experimentales consideradas comúnmente como representantes de un estómago adulto promedio. lll.2.2. Análisis de titulación Baby Rossett-Rice En base a las condiciones estándares Rossett-Rice según lo descrito en el procedimiento original, la prueba fue adaptada para que representante el estómago de un bebé de seis meses de edad y es referida posteriormente como análisis de titulación Baby Rossett-Rice (BRR).

De acuerdo a Geigy Scientific Tables (Volumen 1 página 126, Ciba-Geigy 1981, eds), los siguientes datos son de interés al grado que se relacionan a la excreción de HCl del estómago (ver la tabla 40): Tabla 40 Así, en base a esos datos, elegimos que las condiciones más severas comprendan todas las situaciones: cantidad de HCl inicial: 0.40 mmol (4 ml de 0.1 N HCl) adición continua de una cantidad de 0.1 N HCl: 2.90 mmol/h (o 0.048 mmol/min). En la práctica se usa un índice de 0.5ml/min de 0.1 N HCl. Un perfil de un ajuste experimental de BRR se muestra en la figura 2B. La tabla 41 describe brevemente la diferencia entre BRR según lo comparado al procedimiento publicado original. Tabla 41 lll.2.2.1. Procedimiento de elaboración del análisis BRR El ajuste experimental se presenta en la figura 2B. 1° usando un recipiente de 50 ml, lugar suficiente para que el agua para inyección tenga, después de la etapa No. 4 (aquí después) un volumen líquido final de 10 ml. 2° colocar el recipiente en un baño de agua. 3° la temperatura del baño de agua se ajusta para obtener 37°C dentro del recipiente. 4° la muestra del antiácido que se medirá se agrega al recipiente. 5° la medición del valor de pH en esta etapa representa el "pH inicial" (t=0 en la tabla de datos). 6° agregar inmediatamente, 4 ml de 0.1 N HCl (0.40 mmol), y al mismo tiempo activar el reloj y la bomba (adición continua de 0.5 ml/min de 0.1 N HCl). Esas tres acciones deben ocurrir dentro de los 5 primeros segundos del punto de partida del reloj. 7° registrar el valor de pH a lo largo de la duración, hasta que se obtenga el pH 4. A opción de operador, la disminución del pH se puede dejar progresar hasta que se obtenga el pH 3 (como en el método Rossett-Rice), pero se registran los valores relevantes de la capacidad antiácido después de que se alcance el pH 4. 8° detener el reloj y la bomba. 111.2.2.2. Presentación de los Datos Experimentales Los datos experimentales se presentan en tabla por ejemplo ver la tabla 22, a partir de la cual se puede dibujar una presentación gráfica: por ejemplo ver la figura 2A. 111.2.2.3. Interpretación de Resultado Se destruye el rotavirus cuando se coloca a un pH por debajo de 4. Entonces para conservar el virus, es de consideración el tiempo por encima de pH 4. El resultado de la titulación Baby Rossett-Rice se expresa en unidades de tiempo (minutos). Es el tiempo durante el cual el valor de pH fue medido por encima de 4, es decir la llamada capacidad antiácido de la formulación. En algunos casos se registran dos valores (por ejemplo 11-12 minutos como en la formulación No. 92 de la tabla 22 donde a 11 minutos el pH fue de 4.08 y a 12 min el pH fue de 3.98, indicando que la transición a pH 4.00 fue casi de 12 minutos en lugar de 11 min.). Ilt.2.2.4. Calibración La temperatura se mide con un termómetro calibrado (escala de -10°C- + 50°C). El medidor de pH se calibra usando amortiguadores estándares a pH 7 y pH 4 que están comercialmente disponibles. La velocidad de la bomba es ajustada por mediciones del volumen contra el tiempo para obtener 0.5 ml/min. La bomba peristáltica es un modelo de 8 rodillos de Ismatec S.A. Model MS-Reglo. Para evitar que disminuya la formación la extremidad del tubo se coloca a lo largo de la pared del recipiente por encima del nivel de líquido. El ácido hidroclórico 0.1 N es la solución de titulación estándar comercial. Una solución de amortiguador estándar conocida se utiliza para verificar el ajuste experimental antes del análisis de las muestras antiácido desconocidas. Esta solución de amortiguador estándar se hace de 24.066 g de dodecahidrato de trisodiofosfato (producto de Merck No. 1.06578.1000) disuelto en suficiente agua para obtener 1 litro de solución. Comúnmente, 10 ml de esta solución dará un pH de 9.0 que ocurre entre los minutos No. 6 y 7 (primer salto del pH de fosfato) y un pH de 4.0 que ocurren entre los minutos No. 19 y 20 (segundo salto del pH de fosfato) en el ajuste de titulación Baby Rossett-Rice descrito así. Los resultados se muestran en la tabla 42.

Tabla 42 lll.3 Medición del índice de Refracción de una Formulación Dada Varias formulaciones ilustradas en la presente invención son preparadas en volumen pequeño (1.5 ml de volumen de dosis por ejemplo, y menos), contienen una alta concentración de sucrosa (por ejemplo 55%) y todavía deben cumplir con los requisitos de estabilidad y capacidad de antiácido. Por lo tanto puede ser importante verificar que la formulación se haya preparado correctamente, y que la solubilidad completa de cada componente se haya logrado. Una manera simple de hacerlo es medir el índice de refracción de la formulación. El índice de refracción es una medida simple bien conocida que se puede utilizar en la etapa del amortiguador de carboxilato (antes de la adición de rotavirus) y también en la etapa final de formulación (después de la adición de rotavirus). lll.3.1. Método El índice de refracción de las soluciones acuosas es un método estándar para determinar la concentración de sucrosa en la solución. La tabla del índice de refracción contra concentraciones de sucrosa se puede encontrar en el manual de Chemístry and Physics 70th edition 1989-1990 CRC Press página E 386. Usando un ndex Instrument Automatic Refractometer GPR 11-37 instrument, se colocó una gota de solución se pone en el instrumento y se registró el índice de refracción. El agua se utilizó como un estándar para verificar el instrumento (índice de refracción de 1.3330). Varias formulaciones de adipato que contienen varias cantidades de sucrosa se han preparado y sometido a la medición del índice de refracción. Se hizo una medición repetida. 111.3.2. Resultados Los resultados de esas mediaciones se muestran en las figuras 3A y 3B. En la conclusión, en la ventana de las concentraciones probadas, hay una correlación lineal entre las concentraciones de azúcar y otros ingredientes solubles y el índice de refracción medido. Por ejemplo, en la formulación No. 95, después de la disolución completa de los ingredientes en la etapa de amortiguador de carboxilato (antes de la adición de rotavirus) se obtendrá un valor del índice de refracción de 1.4578 (concentración de sucrosa objetivo que es de 58.5% p/p en este caso); mientras que en la etapa final de formulación (después la adición de rotavirus o adición de 6% p/p de DMEM en caso de la preparación de placebo), se obtendrá un índice de refracción de 1.4480 (concentración de sucrosa objetivo que es de 55% p/p en este caso). En ambos casos, los valores del índice de refracción medido son más altos que los obtenidos para una sola solución de sucrosa en agua del 58.5% (índice de refracción de 1.4385) o 55% (índice de refracción de 1.4307), indicando la contribución del índice de refracción de otros ingredientes de la preparación de amortiguador. 111.3.3. Conclusión Así, la medición del índice de refracción se puede utilizar para verificar rápidamente, durante un control en proceso, la disolución completa de todos los ingredientes agregados de la formulación. Ejemplo IV - Formulación con Amortiguador de Fosfato de Citrato - Ejemplo Comparativo IV.1. Preparación de las Formulaciones (Tablas 43 y 44) Tabla 43 * determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo l l l .2.2; " Esto es equivalente a 0.390 M en un volumen de dosis de 2.5 ml °° Las formulaciones 12-16 fueron eliminadas debido a que recristalización ocurrió en reposo a 4 8°C Tabla 44 - Cantidad Reducida de Fosfato en un Volumen de Dosis de 1.5 ml = repetición $ determinado por la prueba Baby Rossett Rice (BRR) según lo adaptado de acuerdo al ejemplo lll.2.2; * las formulaciones 31 y 32 fueron repetidas en una diferente prueba ab initio con una fecha similar (formulaciones 38 y 39 respectivamente, no mostradas). " esto es equivalente a 0.271 M en un volumen de dosis de 2.5 ml; es decir reducido de fosfato *** esto es equivalente a 0.0051 M en un volumen de dosis de 2.5 ml; es decir fosfato reducido Observación a los Resultados de las Formulaciones 18-24, 26-30 en la Tabla 44 Las formulaciones 18-24 y 30 fueron eliminadas del estudio de estabilidad a largo plazo debido a los resultados insatisfactorios obtenidos durante la prueba de estabilidad de 1 semana a 37°C. Las formulaciones 26 y 28 fueron eliminadas debido a que la cristalización ocurrió en reposo a 4-8°C. Las formulaciones 25, 27 y 29 fueron eliminadas debido a un alto riesgo de recristalización durante el reposo a 4-8°C. IV.1.1. Formulaciones 1-11: Formulaciones de Volumen de Dosis de 2.5 ml La formulación 1-11 (ver la tabla 43) fue hecha a la escala de 325 g (250 ml) que representa 100 dosis de 2.5 ml (3.25 g) cada una. Materiales antiácidos: NaH2PO4.2H2O (Pm 156); Na2HPO4.2H2O (Pm 178); Na3Citrato.2H2O (Pm 294). La formulación líquida 1 fue preparada como sigue. A 125.84 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se agregan consecutivamente: 7.605 g de NaH2PO4.2H2O, 8.677 g de Na2HPO4.2H2O, 9.555 g de Na3Citrato.2H2O y 162.5 g de sucrosa. Después de completar la disolución la solución es esterilizada por filtración en una membrana de 0.2 µm. Se agrega 10.82 g de medio de DMEM que contienen la cantidad necesaria de rotavirus bajo condiciones estériles para obtener 106 0 ffu por dosis. La mezcla se homogeniza y distribuye en el envase de dosis apropiado. En este caso una dosis consiste en 2.5 ml o 3.25 g de la preparación formulada final. En este ejemplo el medio de DMEM representa 3.33% p/p. Las formulaciones 2-11 fueron preparadas similarmente (ver los ingredientes y proporciones en la tabla 43) en esta serie se probaron diferentes cantidades de sucrosa y DMEM. Los resultados similares fueron obtenidos a excepción de las formulaciones 7 y 11 preparadas con una concentración baja de sucrosa (20%), que no estabilizó adecuadamente el rotavirus. IV.1.2. Formulación 17: formulación de Volumen de Dosis de 2.0 ml La formulación 17 (ver la tabla 43) fue hecha a la escala de 325 g (250 ml) que representa 125 dosis de 2.0 ml (2,60 g) cada una. Materiales antiácidos: NaH2PO4.2H2O (Pm 156); Na2HPO4.2H2O (Pm 178); Na3Citrato.2H2O (Pm 294). Brevemente, 110.7 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g) se carga y se agrega 9.51 g de NaH2PO4.2H2O, 10.84 g de Na2HPO4.2H2O, 11.94 g de Na3Citrato.2H2O y 162.5 g de sucrosa (50% p/p) consecutivamente. En este ejemplo se utiliza 19.5 g de DMEM, que representa 6% p/p. IV.1.3. Formulaciones 12-16: Formulaciones de Volumen de Dosis de 1.5 ml Fallaron los intentos adicionales para reducir el volumen de dosis de administración de las formulaciones de citrato/fosfato (para detalles ver la tabla 43) a un volumen por debajo de 2 ml. Las concentraciones de los ingredientes usados para la formulación 17 (2 ml de volumen de dosis) fueron ajustadas a 1.5 ml de volumen de dosis. La recristalización del componente de fosfato ocurrió rápidamente durante el almacenamiento de la formulación a 4°C. Este fenómeno es debido a la solubilidad un poco baja de Na2HPO dentro del componente de citrato de fosfato (ver la tabla 45). Tabla 45 - Límites Teóricos de Solubilidad para Fosfato y Citrato De acuerdo a estos parámetros, los intentos de formular la formulación 17 en un volumen de dosis de 1.5 ml darían lugar teóricamente a una concentración final de fosfato de 0.65 M ((0.244 M + 0.244 M) *2/1.5), que es más alta que los datos de solubilidad de Na2HPO4 (0.52 M). Para evitar este problema de solubilidad baja de fosfato, se sugiere no utilizar fosfato adicional, y ajustar el pH alterando el equilibrio entre la forma del ácido carboxílico (R-COOH) y la forma de la sal de carboxilato (R-COO"). Un ejemplo de esto se da en las formulaciones 100-115 hechas en un volumen de administración de 2.5 ml (ver la tabla 5) o en las formulaciones 128-130 realizadas en un volumen de administración de 1.5 ml (ver la tabla 6). IV.1.4. Formulaciones 25-32 y 38-40: Formulaciones de Volumen de Dosis de 1.5 ml y Cantidad Disminuida de Fosfato Varias formulaciones (ver la tabla 44 para más detalles) que contienen una cantidad reducida de fosfato fueron preparadas a la escala de 325 g (250 ml) que representa 166.6 dosis de 1.5 ml (1.95 g) cada una. Para compensar esta disminución de fosfato mientras se mantiene una capacidad antiácido aceptable, fue aumentada la concentración de citrato. Brevemente, la formulación 25 fue preparada mezclando 8.76 g de NaH2PO4.2H2O, 10.00 g de Na2HPO4.2H2O, 21.00 g de Na3Citrate.2H2O y se agregaron consecutivamente 130 g de sucrosa (40% p/p). En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. Las formulaciones 26-29 se hicieron similarmente, esperando que las concentraciones de sucrosa y DMEM sean modificadas ligeramente (ver la tabla 44). La formulación 30 fue preparada mezclando 0.1653 g de NaH2PO4.2H2O, 0.1884 g de Na2HPO4.2H2O, 32.16 g de Na3Citrato.2H2O y se agregan consecutivamente 130 g de sucrosa (40% p/p). En este ejemplo DMEM representa 6% p/p. Las formulaciones 31 y 32 se hicieron similarmente, esperando que las concentraciones de sucrosa y DMEM sean modificadas ligeramente (ver la tabla 44). A pesar del hecho que, en las formulaciones 25-29, la concentración total de fosfato fue de 0.45 M, es decir por debajo del límite teórico de solubilidad de 0.52 M del Na2HPO4, algunas de las formulaciones (por ejemplo formulaciones 26 y 28) exhibieron recristalización durante el almacenamiento a +4°C.

Esta diferencia práctica entre el valor de solubilidad teórico y el práctico probablemente se debe a la presencia de otros compuestos disueltos en el medio (sucrosa, citrato u otros importados vía el medio de DMEM), aunque los resultados inconsistentes fueron obtenidos para formulaciones similares (comparar por ejemplo las formulaciones 26 y 27). La variabilidad experimentada con tales formulaciones no es compatible con la confiabilídad necesitada al preparar formulaciones a gran escala que deben permanecer estables físicamente durante un período mínimo de tiempo. Incluso disminuyendo adicionalmente la cantidad de fosfato en el fórmula (ver las formulaciones No. 30-32 y 38-40 en la tabla 44) proporciona resultados pobres de estabilidad viral a 4-8°C (ver la tabla 47). Otras formulaciones de volumen de dosis de 1.5 ml (18-24) también se han hecho en ausencia de fosfato agregado (ver la tabla 44 para más detalles). La capacidad antiácido de estas formulaciones fue mantenida a valor objetivo de 12 min usando citrato de trisodio a una concentración más alta (438 mM). Brevemente, la formulación 18 fue preparada mezclando 143.34 g de agua (cantidad determinada para lograr una preparación final de 325 g), 32.16 g de Na3Citrato.2H2O y se agregan consecutivamente 130 g de sucrosa (40% p/p). Para las formulaciones No. 19-23 fueron probadas varias cantidades de sucrosa y DMEM (ver la tabla 44). Para la formulación 24, fue utilizada sucrosa a una concentración de 50% p/p (162.5 g). En estas formulaciones, DMEM representa 6% p/p. El pH de estas formulaciones (No. 18-24) excedió de 8.3, al cual se afecta la estabilidad de rotavirus según lo evidenciado por una pérdida viral más alta de 0.8 después del almacenamiento de una semana a 37°C. Debido a la estabilidad pobre de estas formulaciones durante la prueba rápida a 37°C, no se condujo ningún plan de estabilidad de mediano plazo a temperatura ambiente o 4°C. Esos resultados indican que, al incluir cada vez menos fosfato en la formulación, con cada vez más citrato (para mantener la capacidad antiácido), entonces, el pH resultante de la formulación aumenta cada vez más: pH de aproximadamente 6.7 en las formulaciones 25-29 pH de aproximadamente 7.7 en las formulaciones 30-32 y 38-40, y pH de aproximadamente 8.3 en las formulaciones sin fosfato No. 18-24 Según lo mostrado posteriormente (tabla 46 y 47) los valores de pH más alto no favorecen una buena estabilidad de rotavirus. Además, los resultados son de acuerdo con los resultados obtenidos de las formulaciones 110-115 (ver la tabla 5) y 128-130 (ver la tabla 6), donde el pH fue corregido ajustando solamente la relación de ácido cítrico/citrato de sodio (así sin fosfato adicional).

IV.2. Titulación Viral de Rotavirus y Capacidad de Antiácido La titulación viral de rotavírus en diferentes puntos de tiempo se ha evaluado de acuerdo al procedimiento dado en el ejemplo 111.1 y la capacidad antiácido de la formulación se ha evaluado después del protocolo dado en el ejemplo lll.2. Los resultados se ilustran en las tablas 46 y 47. Tabla 46 - Estabilidad Viral a Temperatura Ambiente Cuadros vacios = sin determinar °° Las formulaciones 7, 11 y 38 se eliminaron de la prueba de estabilidad a largo plazo debido a los resultados pobres obtenidos durante la semana 1 a 37°C Tabla 47 - Estabilidad Viral a 4°C I5 20 * NA = no disponible - fallo durante la prueba de estabilidad a temperatura ambiente 25 Cuadros vacios = sin determinar IV.3. Resultados y Conclusiones Formulaciones 2-3 (volumen de dosis de 2.5 ml) y formulación 17 (volumen de dosis disminuido de 2.5 ml a 2 ml): Según lo mostrado en las tablas 46 y 47, una pérdida de 1-log en título viral, resultó de un almacenamiento de seis meses a temperatura ambiente de las formulaciones 2, 3 y 17. A 4°C, no se experimento una pérdida significativa del título viral durante un período de almacenamiento de hasta 12 meses. Formulaciones 25, 27, 29 y 31-32 (volumen de dosis disminuido a 1.5 ml): A temperatura ambiente, generalmente fue alcanzada una pérdida de 1 -log en la titulación viral a los 3 meses o posteriormente, a excepción de la formulación 29 que rebasó el período de tiempo de 4 meses. Las formulaciones 25 a 27 se recristalizaron durante el período de almacenamiento a 4°C, así se indicó que la disminución de la concentración de fosfato no es suficiente, según lo establecido anteriormente. Por lo tanto tales formulaciones no son convenientes durante períodos de almacenamiento que serían de por lo menos un año a 4°C.

Al disminuir incluso aún más la concentración de fosfato (formulaciones 30-32), el pH de la formulación final aumenta debido al aumento relativo de la cantidad de aumento de citrato, que es necesario para mantener el mismo valor de la capacidad antiácido. Este aumento del pH afecta la estabilidad del rotavirus y se puede detectar rápidamente durante el estudio de estabilidad a temperatura ambiente. Se confirman tales tendencias al eliminar totalmente el fosfato de la formulación (formulaciones 18 y 24).

Conclusión Total del Ejemplo IV Estos resultados indican que, para lograr un volumen de dosis debajo de 2 ml, comparado a un volumen de dosis de 2.5 ml, se debe reducir la cantidad de fosfato presente en la formulación, debido a su solubilidad en agua un poco baja y su predisposición a recristalizarse. Por consiguiente, para mantener el mismo valor objetivo de la capacidad antiácido (es decir un mínimo de por lo menos 8 minutos, convenientemente por lo menos 12 minutos según lo determinado por la prueba BRR), se debe aumentar la cantidad de sal de citrato. Esto genera un aumento en el pH final de la formulación, que es dañino para la estabilidad del rotavirus en la formulación líquida. Ejemplo V - Formulaciones Adicionales Las siguientes formulaciones fueron preparadas (tabla 48), pero no se incluyeron en el planeamiento de la estabilidad a largo plazo para que la falla cumpla por lo menos uno de los criterios establecidos. Las razones específicas para eliminar algunas de las formulaciones se describen en la columna de los comentarios de la tabla 48.

Tabla 48 Ejemplo VI - inmunogenicidad Fase II, Reactogenicidad y Seguridad de Dos Dosis Orales de una Vacuna Líquida de Rotavirus Monovalente Humano en Infantes Sanos VI.1. Introducción Un ensayo de fase II aleatorizada, doble ciego, de fase II controlado con placebo, fue conducido para evaluar la inmunogenetícidad, reactogenicidad y seguridad de una vacuna que contiene una cepa de rotavirus atenuada humana G1P8 (depositada en ECAAC bajo el número depósito 99081301 - ver el documento WO 01/12797), de la inmunización infantil. El estudio fue realizado en centros múltiples en Finlandia. Una descripción del diseño del estudio se da en la figura 4.

Durante este ensayo, una primera dosis de la vacuna, la formulación líquida de la vacuna de HRV (rotavirus humano) candidato (N = 100) o la formulación liofilizada de la vacuna de HRV (N = 100) y el placebo respectivo (2 grupos con cada N = 25), se administró a aproximadamente 2.5 meses de edad (entre 6 y 12 semanas de edad), al momento de una primera visita al doctor. Una segunda dosis se administró a aproximadamente 3.5 meses de edad (durante la segundo visita al doctor, comúnmente 4 semana después de la primera dosis). Una visita repetida fue realizada 1 mes después de la segunda dosis, a aproximadamente 4.5 meses de edad para extraer sangre y evaluar la inmunogeneticidad.

El ensayo clínico fue aleatorizado, controlado con placebo y independizó. Se reclutaron un total de 250 sujetos, 100 por grupo de HRV y 25 por grupo de placebo. Fue conducido de una manera ciego doble entre cada formulación de vacuna de HRV y su placebo respectivo. Sin embargo, entre las 2 diferentes formulaciones no fue técnicamente posible un estudio de tipo ciego.

Las vacunaciones rutinarias en infancia fueron administradas de acuerdo a la práctica local, pero por lo menos 14 días separados de cada dosis de vacuna de HRV.

VI.2. Descripción de vacuna Específicamente la vacuna usada comprende como el componente de rotavirus, la cepa humana atenuada G1 depositada como el depósito ECACC 99081301 (WO 01/12797).

La vacuna es una vacuna candidata de rotavirus (HRV) humano atenuado derivada de la cepa 89-12 HRV que pertenece al serotipo G1 P1A y al genotipo [P8] que fue aislado de las heces de un niño de 15 meses de edad en Cincinnati, E.E.U.U. Se mostró la infección natural con la cepa 89-12 para proporcionar la protección contra enfermedades subsecuentes y contra la reinfección en un estudio potencial de dos años (Bernstein DI, y col. Protección from rotavirus reinfection: 2 years prospective estudy. J Infecta Dis. 1991; 164: 277-83). El antiácido prevendrá la inactivación del HRV durante el paso a través del estómago. La tabla 49 compara las composiciones de la formulación líquida de adipato y una formulación liofilizada preparada de acuerdo al documento WO 01/12797 y demuestra que son infecciosas en un ensayo clínico a gran escala (De Vos y col. Pediatr Infecta Dis J. 23 de octubre de 2004 (10 Suppl): S179-82).

Tabla 49 - Composición Cuantitativa de la Formulación Líquida de Adipato y de la Formulación Liofilizada de la Vacuna de HRV (Dosis Nominal) ** Dulbcco's Modified Eagle Médium Una breve explicación del volumen y capacidad antiácido de las dos formulaciones de vacuna de HRV se presenta en la tabla 50. Tabla 50 - Volumen y Capacidad Antiácido de la Formulación Líquida de Adipato y de la Formulación Liofilizada de Vacuna de HRV *BRR = prueba de titulación Baby Rossett-Rice (BRR): para medir el índice de reacción de la sustancia antiácido con 0.1 N ácido hidroclórico y la duración del mantenimiento a un pH por encima de 4. Ver el procedimiento en el ejemplo lll.2.2. Monodosis de la vacuna líquida de HRV de adipato se llenan de acuerdo a Good Manufacturing Practices (GMP), en jeringas de vidrio de monodosis. El título viral de rotavirus (es decir la potencia del rotavirus) se puede medir de acuerdo al procedimiento detallado en el ejemplo 111.1, con las células infectadas MA104 que son identificadas por inmunofluorescencia indirecta. Alternativamente se mide mediante la titulación in vitro del virus en las células MA104 con el virus detectado por inmunofluorescencia directa usando anticuerpos específicos anti-rotavirus. El método determina la dosis de infección del 50% del cultivo celular y los títulos de rotavirus se expresan en la Dosis Infecciosa de Cultivo Celular (CCID50, por sus siglas en ingles) promedio. La reproductibilidad inter e intra-análisis se ha evaluado y da resultados equivalentes (la variabilidad se determina en 0.3 logs). VI.3. Administración VI.3.1. Formulación Liofilizada de la Vacuna de HRV o Placebo Para preparar la vacuna o placebo para la administración, el contenido completo de una jeringa prellenada que contiene el amortiguador de carbonato de calcio, fue inyectado en el frasco producto liofilizado (vacuna o placebo) y el producto resuspendido entonces fue administrado suavemente como una sola dosis oral. VI.3.2. Formulación Líquida de la Vacuna de HRV o Placebo La jeringa de vidrio prellenada fue agitada antes del uso. El producto (vacuna o placebo) entonces fue administrado suavemente como una sola dosis oral. VI.4. Seguridad y Reactogenicidad Los siguientes criterios de seguridad y reactogenicidad de eventos adversos generales solicitados:aplicados fueron la fiebre, irritabilidad/inquietud, diarrea, vomito, pérdida de apetito y tos/goteo nasal. Fueron registrados durante 15 días después de que cada dosis de vacuna del estudio, usando diariamente las tarjetas proporcionadas a los familiares/guardianes de los sujetos para registrar los síntomas observados. Todos los acontecimientos de la gastroenteritis (diarrea) que ocurren entre las visitas fueron documentados, y fueron recolectadas las muestras fecales (en los últimos 7 días después del inicio de la gastroenteritis). Fueron registrados los acontecimientos adversos no solicitados que ocurren dentro de un periodo de 31 días después de cada dosis. Los acontecimientos adversos serios fueron registrados durante todo el período de estudio. VI.5. Análisis de Laboratorio VI.5.1. Análisis Fecal Las muestras fecales recolectadas de todos los sujetos el día de o un día antes de cada dosis de vacuna del estudio, el día 7 +_ 1 y día 15 + 1 después de cada dosis, y el día de o un día antes de la visita 3 se analizan en GSK Biologicals o un laboratorio designado por GSK Biologicals para detectar la presencia de RV de vacuna usando Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA - ver la sección VI.6.1) para determinar el vertido viral. La presencia del antígeno de rotavirus demostrado por ELISA en cualquiera de las heces recolectadas en los puntos de tiempo predeterminados después de la dosis 1 hasta la visita 3 se consideró como el vertido de virus de vacuna y se considero como evidencia de una respuesta a la vacuna (es decir toma de vacuna), si el sujeto fue negativo al rotavirus en el día de la dosis 1 de la vacuna de HRV o placebo. En este caso se realizó la secuenciación de los sujetos de placebo. Un sujeto inicialmente negativo al rotavirus se define como un sujeto tema que fue negativo a los anticuerpos IgA anti-rotavirus en suero y al antígeno de rotavirus en una muestra fecal en un punto de tiempo de prevacunación, si ambos resultados están disponibles, o negativo a por lo menos uno de estos marcadores si solamente un resultado está disponible. También, las muestras fecales recolectadas durante cada episodio de GE a partir de la visita 1 hasta la visita 3, se probaron en GSK Biologicals o un laboratorio designado por GSK Biologicals usando a ELISA para detectar el RV. Si es positivo, el tipo G es determinado usando métodos basados en PCR. Estos métodos moleculares se dirigen a regiones dentro del gen VP7, las cuales son muy distintos entre diferentes tipos G y se conservan altamente dentro de cada tipo G dado. Por ejemplo, el método RT-PCR desarrollado por Gouvea y col. (1990. J Clin Microbiol, 28:276-282) utiliza un coctel de diferentes cebadores específicos de genotipo, localizados en diferentes regiones del gen VP7. El tamaño de los productos de PCR resultantes estimado por la electroforesis en gel proporciona la información para identificar los genotipos G correspondientes. Si se detecta cualquier G1 RV, el virus de vacuna se diferencia del serotipo de tipo silvestre mediante el análisis de secuencia o un método equivalente. Cualquier detección de virus de vacuna en cualquiera de las heces recolectadas hasta la visita 3, se considera como evidencia de una respuesta a la vacuna (es decir toma de vacuna). VI.5.1. Análisis de Suero El suero obtenido de las muestras de sangre entera recolectadas de los sujetos en cada visita de estudio, fue probado por ELISA en un laboratorio designado de GSK Biologicals para medir las concentraciones de anticuerpo IgA anti-rotavirus del suero. El corte del análisis es 20 U/ml. Un tema seronegativo a los anticuerpos IgA anti-rotavirus fue definido como un sujeto que tuvo una concentración de anticuerpo por debajo del valor límite del análisis. Un sujeto seropositivo a los anticuerpos IgA anti-rotavirus fue definido como un sujeto que tuvo una concentración de anticuerpo mayor que o igual al valor límite del análisis. VI.6. Inmunogenicidad: Análisis del Suero VI.6.1. Medición de los Anticuerpos IgA Mediante ELISA Este análisis permite la detección de de IgA de rotavirus en el suero humano y fue diseñado inicialmente por R. Ward (1,2) y ha sido adaptado por GSK Biologicals. Fue utilizado para medir la inmunorrespuesta después la vacunación y/o infección. Las muestras fueron analizadas en GSK Biologícals, Ri?ensart, Bélgica (o un laboratorio designado). Descripción del análisis ELISA Las placas de 96 pozos son revestidas por incubación durante la noche con dilusiones de anticuerpos anti-rotavirus. Se lavan los pozos y se agrega un lisato de células infectadas con la cepa de vacuna (pozos positivos) o sin infectar (pozos negativos).

Después de la incubación en una plataforma giratoria, se lavan las placas y las dilusiones de las muestras de suero o suero estándar se incuban en ambas clases de pozos (positivo y negativo). El uso de pozos negativos permite la determinación de la unión de IgA no específico. Se lavan las placas y se detecta el IgA humano unido mediante la adición de IgA anti-humano de conejo biotinilado (30 minutos bajo agitación). Después de lavar las placas, se agrega avidina-biotina conjugada con peroxidasa a una concentración óptima a cada uno pozo y se incuba (30 minutos, TA bajo agitación). Las placas se lavan nuevamente y se agrega ortofenilendiamina (OPD). Las placas entonces se incuban (30 minutos, temperatura ambiente (RT) en oscuridad) antes de detener la reacción con 2N H2SO4. La absorción óptica se mide a 490/620 nm. Las densidades ópticas específicas son calculadas para cada muestra/estándar midiendo la diferencia entre los pozos positivos y negativos. Las concentraciones de las muestras son determinadas usando la función logística de cuatro parámetros generada por la curva estándar. Se determina la parte más exacta de la curva estándar (intervalo de trabajo) para el cálculo de los resultados. Las concentraciones de anticuerpo en unidades por mililitro (U/ml) son calculadas en relación al estándar (concentración = 1000 U/ml) promediando los valores para cada desconocido que se encuentra dentro del intervalo de trabajo de la curva estándar y después se corrigen para el factor de dilusión. Cada experimento incluye controles negativos y positivos. Se predeterminan para la concentración óptima de todos los reactivos. Referencias 1. Bernstein DI, Smith VE, Sherwood JR y col. Safety and immunogenicity of a Uve attenuated human rotavirus 89-12 vaccine. Vaccine. 1998; 16:381-7. 2. Bernstein DI, Sack DA, Rothstein E y col. Efficacy of live attenuated human rotavírus vaccine 89-12 in infants: a randomised placebo-controlled trial. Lancet. 1999; 354:287-90.

VI.7. Resultados: Respuesta del Anticuerpo IgA Anti-rotavirus La tabla 51 presenta el GMC del anticuerpo IgA anti-rotavirus y los índices de seroconversión (grupo total vacunado para inmunogeneticidad). La tabla 52 presenta el GMC del anticuerpo IgA anti-rotavirus calculado en los sujetos seropositivos para los anticuerpos IgA anti-rotavírus calculados en el grupo total vacunada. La respuesta del anticuerpo a la vacuna de HRV en términos de los índices de seroconversión fue similar en ambos grupos de vacuna un mes después de la segunda dosis (82.2% en el grupo HRV_Lyo y 90.1% en el grupo HR_Liq). En el grupo de placebo reunido, 0% de los sujetos seroconvertidos un mes después de la segunda dosis, se indicó que el estudio fue conducido en un momento en el cual no hubo infecciones de tipo silvestre en la comunidad. Tabla 51 - GMC del Anticuerpo IgA Anti-rotavirus e índices de seropositividad - Grupo Total Vacunado para Inmunogeneticidad 1. N = número de sujetos con resultados disponibles 2. n/% = número/porcentaje de sujetos con una concentración por encima del límite 3. 95% Cl = 95% de intervalo correcto; LL = Límite inferior, UL = Límite Superior 4. PRE = pre-vacunación 5. PI(MI) = un mes después de la primera dosis de la vacuna de HRV o placebo (visita 2) 6. PII(M2) = un mes después de la segunda dosis de vacuna de HRV o placebo (visita 3) 7. publicación de la base de datos = 07DEC2005 Tabla 52 - GMC de Anticuerpo IgA Anti-rotavirus Calculado en los Sujetos Seropositivos a Anticuerpos IgA Anti-rotavirus -Grupo Total Vacunado para Inmunogeneticidad 1. N = número de sujetos que fueron seropositivos a anticuerpos IgA anti-rotavirus 2. 95% Cl = 95% intervalo correcto; LL = Límite Inferior, UL = Límite Superior 3. PI(MI) = un mes después de la primera dosis de vacuna de HRV o placebo (visita 2) 4. Pl l(M2) = un mes después de la segunda dosis de vacuna de HRV o placebo (visita 3) 5. Publicación de la base de datos =07DEC2005 VI.8. Conclusiones La inmunogeneticidad en términos de los índices de seroconversión fue similar entre las dos formulaciones de vacuna. • La formulación líquida de vacuna fue muy inmunogenética cuando se administró a los niños de acuerdo al horario de 0, 1 meses. Puesto que IgA es un buen marcador de la eficacia de una vacuna de rotavirus, estos datos confirman el efecto protector de la formulación probada en las clínicas.

Claims (41)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogenética líquida de rotavirus conveniente para la administración oral a un infante humano, que comprende un antígeno de rotavirus, un azúcar y un carboxilato en donde la formulación tiene un pH entre aproximadamente pH 5.0 y aproximadamente pH 8.0 y comprende menos de 5 mM de fosfato, en donde el carboxilato se (i) deriva del ácido carbo?ílico cpm ima pKa 4 o del ácido di-carboxílico con un pKa promedio de >4, se selecciona del grupo que consiste de: adipato, malato, acetato, succinato, propionato, butirato, malonato, glutarato, maleato, glicolato, lactato, gluconato, fumarato, tartarato, y cualquier combinación de dos o más de los mismos.

2. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 1, en donde la composición comprende menos de 0.1 mM de fosfato.

3. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la composición está libre de fosfato.

4. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el pH de la composición está entre aproximadamente pH 5.5 a aproximadamente pH 7.5.

5. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 4, en donde el pH de la composición está entre aproximadamente pH 6.0 y aproximadamente pH 7.0.

6. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el carboxilato es adípato.

7. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el carboxilato está presente a una concentración de entre aproximadamente 50 mM y entre aproximadamente 2 M.

8. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 7, en donde el carboxilato está presente a una concentración de entre aproximadamente 100 mM y entre aproximadamente 1 M.

9. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 8, en donde el carboxilato está presente a una concentración de entre aproximadamente 400 mM y entre aproximadamente 700 mM.

10. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el azúcar se selecciona de la lista que consiste de: glicerol, eritrosa, eritriol, xilitol, arabitol, ribosa, xilosa, arabinosa, glucosa, tagalosa, mañosa, galactosa, fructosa, inositol, sorbitol, manitol, galactitol, una combianación de glucosa y fructosa, maltosa, soforosa, lactosa, celobiosa, melibiosa, trehalosa, sucrosa, palatinosa, maltulosa, lactulosa, maltitol, lactitol, rafinosa, maltotriosa, melecitosa, celotriosa, cirítol, maltotetraosa, estaquiosa, celotetraosa, maltopentaosa, celopentaosa, maltohexosa, celohexosa, oligosacáridos.

11. La composición líquida de la reivindicación 10, en donde el azúcar es sucrosa o dextrosa.

12. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la concentración de azúcar está entre aproximadamente 1 p/p y entre aproximadamente 70% p/p.

13. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 12, en donde la concentración del azúcar está entre aproximadamente 25 p/p y entre aproximadamente 60% p/p.

14. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 13, en donde la concentración de azúcar es de 50% p/p o 55% p/p.

15. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende adicionalmente un ácido carboxílico.

16. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 15, en donde el ácido carboxílico se selecciona de la lista que consiste de: ácido adípico, ácido málíco, ácido acético, ácido succínico, ácido carbónico, ácido propiónico, ácido butírico, ácido malónico, ácido glutárico, ácido maleico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido glucónico, ácido fumárico, ácido tartárico.

17. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que adicionalmente comprende iones de calcio.

18. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el antígeno de rotavirus es un rotavirus vivo, tal como un rotavirus atenuado vivo.

19. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 18, en donde el rotavirus atenuado vivo es un rotavirus humano atenuado vivo.

20. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 19, en donde el rotavirus humano atenuado vivo se selecciona del grupo que consiste de: cepa HRV 89-12C2 depositada bajo el número de acceso ATCC VR 2272, progenie, derivados reasortantes e inmunológicamente activos de la misma; cepa HRV P43 depositada bajo el número de acceso ECACC 99081301, progenie, derivados reasortantes e inmunológicamente activos de la misma.

21. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde la composición tiene una capacidad antiácido de por lo menos de 8 minutos según lo determinado por el análisis Baby Rosett-Rice.

22. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 21, en donde la composición tiene una capacidad antiácido de por lo menos 12 minutos según lo determinado por el análisis Baby Rosett-Rice.

23. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 22, en donde la composición tiene una capacidad antiácido de entre 8 y 23 minutos según lo determinado por el análisis Baby Rosett-Rice.

24. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 23, en donde la composición tiene una capacidad antiácido de entre 12 y 23 minutos según lo determinado por el análisis Baby Rosett-Rice.

25. La composición líquida de acuerdo a la reivindicación 22 ó 24, en donde la composición tiene una capacidad antiácido de entre 12 y 20 minutos según lo determinado por el análisis Baby Rosett-Rice.

26. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en donde la composición es estable bajo por lo menos una de las siguientes condiciones: durante 7 días a 37°C, durante un año a 4°C, durante dos años a 4°C.

27. La composición líquida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, que es una vacuna.

28. La composición líquida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde la composición se proporciona en un volumen de dosis entre 0.2 ml y 2.0 ml.

29. La composición líquida de conformidad con la reivindicación 28, en donde la composición se proporciona en un volumen de dosis de entre 0.5 ml y 1.5 ml.

30. La composición líquida de conformidad con la reivindicación 29, en donde la composición se proporciona en un volumen de dosis de aproximadamente 1.5 ml.

31. El uso de un antígeno de rotavirus, un azúcar y un carboxilato en la fabricación de una composición inmunogenética para el tratamiento o prevención de las enfermedades asociadas al rotavirus, en donde la composición inmunogenética es según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30.

32. El uso de acuerdo a la reivindicación 31, en donde el tratamiento o prevención comprende administrar dos dosis orales de una cantidad segura y efectiva de la composición de rotavírus vivo atenuado humano a un infante dentro del periodo de 4-15 semanas de edad a momento de la dosis 1.

33. Un método de prevención o tratamiento del rotavirus asociado a enfermedades en humanos, administrando a un sujeto humano en necesidad del mismo una cantidad efectiva de una formulación líquida de acuerdo a cualquier de las reivindicaciones 1 a 27.

34. El uso de conformidad con la reivindicación 31 a 32 o método de conformidad con la reivindicación 33 para la prevención de la infección por rotavirus en humanos.

35. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 31, 32 ó 34 o método de conformidad con la reivindicación 33 para la prevención de la gastroenteritis por rotavirus en humanos.

36. El uso o método de conformidad con reivindicaciones 35 para la prevención de la gastroenteritis severa por rotavirus en humanos.

37. El uso o método de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, en donde la gastroenteritis o gastroenteritis severa es causada por una cepa de rotavirus de un diferente serotipo al de la cepa de rotavirus contenido en la formulación líquida.

38. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31, 32 y 34 a 37 o método de conformidad con la reivindicaciones 33 a 37, en donde la composición se proporciona en un volumen de dosis de entre 0.2 ml y 2.0 ml.

39. El uso o método de conformidad con la reivindicación 38, en donde la composición se proporciona en un volumen de dosis de entre 0.5 ml y 1.5 ml.

40. El uso o método de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, en donde la composición se proporciona en un volumen de dosis de aproximadamente 1.5 ml.

41. Un método para la preparación de una composición líquida de rotavirus de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, que comprende mezclar un antígeno de rotavirus, azúcar y carboxilato con un diluyente farmacéuticamente aceptable.