CN101863966B - 抗轮状病毒药物作用靶标及其构建方法和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗轮状病毒药物作用靶标，为轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的复合物三维结构模型，其中VP6蛋白的功能区为第52至第100位和第343至第392位氨基酸，活性位点包括Asn 53、Ala 348、Val 349、Ile 355和Pro 363；亲环素A的功能区为第54至第150位氨基酸，活性位点包括Arg 55、Gln 63、Lys 125和Arg 148；本发明还公开了该靶标的构建方法和应用方法，利用该靶标及其应用方法能够简便快速地筛选或设计能阻断轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的化合物，研发出高效低毒的特异性抗轮状病毒药物；该靶标的构建方法有助于其它药物作用靶标的构建。

Description

抗轮状病毒药物作用靶标及其构建方法和应用方法

技术领域

本发明涉及一种药物作用靶标，特别涉及一种抗轮状病毒药物作用靶标，还涉及该靶标的构建方法，以及应用该靶标筛选抗轮状病毒药物的方法。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)感染是导致婴幼儿腹泻的主要病因，每年引起约1.25亿例儿童胃肠炎，导致352,000-592,000例5岁以下儿童因轮状病毒感染死亡，主要发生在发展中国家。

轮状病毒属于呼肠弧病毒科，为无胞膜双链RNA(dsRNA)病毒，11条dsRNA各缠绕1分子的RNA依赖RNA多聚酶(VP1)和1分子的鸟苷酸及甲基转移酶(VP3)位于病毒颗粒的核心，编码12种蛋白质，包括6种结构蛋白(VP1～4、6～7)与6种非结构蛋白(NSP1～6)。VP2构成轮状病毒的内层衣壳包裹病毒基因组；VP6构成的中层衣壳包绕VP2形成轮状病毒双层衣壳颗粒(DLP)；VP4和VP7构成的外层衣壳再包绕DLP形成完整的轮状病毒三层衣壳颗粒(TLP)。轮状病毒在受体的介导下穿过细胞膜进入细胞，脱掉外层衣壳形成DLP开始复制过程，新生成的病毒dsRNA与蛋白在胞浆中聚集形成病毒质粒，并在其中组装生成DLP，DLP不具有感染能力，其随后进入内质网，与新合成的VP4和VP7装配成具有感染能力的TLP并分泌出宿主细胞，完成病毒的复制过程。

在病毒复制过程中，病毒组分(新生的病毒核酸与蛋白等)装配成完整的病毒颗粒是非常关键的步骤，正确而高效地装配直接决定着病毒产生的水平。在病毒装配过程中，病毒各组分被转运到细胞内的特定位置，自发地或在病毒编码的形态发生因子指导下进行衣壳装配。宿主因素对病毒颗粒的组装有着重要的影响。病毒核酸或蛋白必须在细胞内经过合适的折叠及修饰(如糖基化等)并被转运到正确的位置才能有效的进行装配。目前已经发现一些宿主蛋白如groE、ABCE1、Staufen1等在病毒颗粒的组装过程中发挥着重要作用。一旦这些宿主蛋白的功能出现异常，就会导致病毒颗粒结构或功能的缺陷，影响病毒的有效复制。

目前对感染后宿主细胞对病毒感染的反应机制知之甚少。对轮状病毒感染宿主细胞后引起宿主细胞的反应进行研究，有助于深入了解轮状病毒与宿主细胞间相互作用的特点，从而为进一步研究如何预防或治疗轮状病毒感染及开发抗轮状病毒药物提供有益的借鉴。病毒感染宿主细胞后引起宿主细胞发生一系列反应，包括基因与蛋白表达的改变、干扰素反应及细胞表面分子的调节。研究表明，轮状病毒感染后会导致宿主细胞出现一系列变化，引起细胞蛋白表达水平显著下降，细胞内Ca²⁺浓度改变(与病毒成熟也可能与细胞死亡有关)，细胞骨架的组织构建的改变，细胞间紧密连接的结构与功能的改变及细胞死亡裂解。对轮状病毒感染的细胞中蛋白质表达特点的研究有助于了解病毒的致病机理。近年来对轮状病毒感染细胞中一些细胞基因的mRNA及蛋白质表达水平已经有了一些研究。AIMIN等通过Northern blot和二维凝胶电泳技术发现，在轮状病毒SA11株感染的MA104细胞中，两种存在于内质网中的分子伴侣GRP78和GRP94在mRNA及蛋白水平表达均升高。Rollo等研究发现在猴轮状病毒感染的HT-29细胞中，多种趋化因子及干扰素的mRNA表达水平升高。Mariela等用含人类38,000种cDNA的基因芯片对轮状病毒感染的人肠细胞系Caco-2研究发现，在感染后16小时，508种基因的表达发生大于2倍的变化，其中73％是上调且大部分发生在感染12小时后。但是鉴于细胞内复杂的基因表达和翻译调控机制，mRNA的改变并不必然等同于蛋白质的改变，而蛋白质才是各种生命活动的直接参与者。因此，对轮状病毒感染后尤其是在感染早期细胞蛋白表达谱改变的研究，将有助于深入认识宿主细胞对轮状病毒感染的反应特点。

蛋白质组学研究是近年来生命科学领域热点之一。蛋白质组是指由一个细胞或组织的基因组表达的全部蛋白质，是生命状态的直接体现。不仅同一生物体的细胞蛋白质组成和数量随细胞的种类和功能状态不同，而且在发育的不同阶段、所处环境的变迁都会使蛋白表达发生改变。蛋白质组学将先进的蛋白分离技术、现代质谱学技术和生物信息学结合起来从整体的蛋白质水平探讨、发现生命活动的规律和重要生理、病理现象的本质。除了大量的双向电泳数据库和蛋白质组数据库建立外，蛋白质组学的技术方法已经在细胞生长发育调节、信号转导、蛋白质的磷酸化和糖基化、蛋白-蛋白间相互作用、疾病诊断的分子标记以及药物开发研究等多领域被广泛应用，成为功能基因组学的重要部分。通过蛋白组学技术鉴定轮状病毒感染宿主细胞后蛋白谱系的变化，进而结合生物信息学分析可能相互作用的潜在靶蛋白，最后采用分子生物学技术进行确证可望揭示轮状病毒干扰的分子机制、发展潜在抗病毒制剂和找出理想的疫苗靶抗原表位。

迄今为止，人们对轮状病毒感染机制研究还很不充分，临床上主要是对症治疗，缺乏直接针对病毒感染的安全有效的药物。传统的抗病毒药物γ干扰素及代谢类抗病毒药物由于毒副作用或效果不佳等原因较少用于抗轮状病毒感染。为降低感染率和死亡率，临床上对能够抗轮状病毒感染的特效药物有着十分紧迫的需求。

药物作用靶标是指疾病发生和发展过程中能够在最关键病理环节上起决定作用的关键功能生物大分子，包括受体、酶、转运蛋白、DNA、RNA等。找到药物作用靶标的前提是能从蛋白分子水平对病毒宿主相互作用关系有系统的理解和认识。蛋白组学的核心是从蛋白水平诠释病毒感染后宿主蛋白与病毒蛋白、宿主蛋白与宿主蛋白、病毒蛋白与病毒蛋白之间的相互作用对病毒复制、装配等的影响。筛选出病毒复制或装配过程中关键作用宿主蛋白即可找到药物作用靶标。现代药物研究的核心是以药物作用靶标为基础，筛选或设计能与靶标结构互补、激动或拮抗靶标介导的生物功能的药物先导物，从而研发出高效低毒的特异性药物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种抗轮状病毒药物作用靶标；目的之二在于提供所述抗轮状病毒药物作用靶标的构建方法；目的之三在于提供应用所述抗轮状病毒药物作用靶标筛选抗轮状病毒药物的方法。

为达到上述目的，本发明首先对轮状病毒感染细胞的蛋白表达谱系进行了全面的组学分析，对轮状病毒的基因表达产物进行了深入的生物信息学分析，识别出轮状病毒感染人体的途径，然后用分子生物学方法验证这一作用途径，再根据这一作用途径筛选活性化合物并进行病毒水平的测试，确证抗轮状病毒药物作用靶标，从而完成了本发明。

1、抗轮状病毒药物作用靶标，为轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A(CyclophilinA，CypA)相互作用的复合物三维结构模型，所述轮状病毒VP6蛋白的氨基酸序列如SEQ No.1所示，与人亲环素A相互作用的功能区域为第52至第100位和第343至第392位氨基酸，其中活性位点包括Asn 53、Ala 348、Val 349、Ile 355和Pro 363；所述人亲环素A的氨基酸序列如SEQ No.2所示，与轮状病毒VP6蛋白相互作用的功能区域为第54至第150位氨基酸，其中活性位点包括Arg 55、Gln 63、Lys 125和Arg 148。

2、抗轮状病毒药物作用靶标的构建方法，包括以下步骤：

a、用蛋白组学方法对轮状病毒感染细胞进行全细胞表达谱分析，发现轮状病毒感染可诱导人亲环素A表达升高；

b、用生物信息学方法对轮状病毒蛋白质与人亲环素A的相互作用进行网络分析，揭示轮状病毒VP6蛋白和人亲环素A有相互作用；

c、用同源蛋白模建方法构建轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的复合物三维结构模型，确定轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的功能区域和活性位点；

d、用分子生物学方法验证轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A的相互作用，证明轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A确实存在相互作用；

e、针对轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的功能区域和活性位点，用计算机虚拟筛选方法搜寻活性化合物，并对所得活性化合物进行病毒水平的测试，确证抗轮状病毒药物作用靶标的建立。

3、应用抗轮状病毒药物作用靶标筛选抗轮状病毒药物的方法，包括以下步骤：

a、针对抗轮状病毒药物作用靶标中轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的功能区域和活性位点，检测候选化合物与轮状病毒VP6蛋白的功能区域和活性位点的结合常数，或者检测候选化合物与人亲环素A的功能区域和活性位点的结合常数，筛选出具有较强亲和力的化合物；

b、检测步骤a所得化合物抑制轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A结合的能力，筛选出具有较强抑制能力的化合物；

c、检测步骤b所得化合物对轮状病毒感染细胞的保护作用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种抗轮状病毒药物作用靶标及其构建方法和应用方法，采用本发明的抗轮状病毒药物作用靶标及其应用方法，能够简便快速地筛选或设计能阻断轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的化合物，从而研发出高效低毒的特异性抗轮状病毒药物；参照本发明的抗轮状病毒药物作用靶标的构建方法，本领域技术人员可以构建出其它药物作用靶标，从而大大推进我国新药研发。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1显示轮状病毒感染诱导人亲环素A表达升高，其中A为二维电泳筛选轮状病毒感染12小时后上调表达的蛋白质，箭头所指处为一表达明显上调的蛋白质；B为A中箭头所指处的放大图；C为质谱结合数据库检索鉴定该蛋白质为亲环素A；D为Western-blot证实该蛋白质为亲环素A；

图2显示轮状病毒VP6蛋白含有人亲环素A识别、结合并催化的af-ag结构域；

图3显示轮状病毒VP6蛋白和人亲环素A相互作用的复合物三维结构模型，其中轮状病毒VP6蛋白由蓝色和绿色带状结构显示，绿色部分表示与人亲环素A相互作用的功能区域；亲环素A由橙色和黄色带状结构显示，黄色部分表示与轮状病毒VP6蛋白相互作用的功能区域；

图4显示轮状病毒VP6蛋白和人亲环素A的细胞共同定位，其中轮状病毒VP6蛋白用绿色荧光抗体标记；人亲环素A用红色荧光抗体标记；图B为相应图A中方框处的放大图；

图5显示环孢素A对感染轮状病毒的MA104细胞的保护作用，其中A为2μM环孢素A(CsA)对感染过程中轮状病毒产量的影响(C-为未加环孢素A，C+为加环孢素A)；B为2μM FK506对感染过程中轮状病毒产量的影响(F-为未加FK506，F+为加FK506)。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1、蛋白组学方法分析宿主细胞被轮状病毒感染后的蛋白变化谱用13cm pH3-11NL的IPG预制胶条做双向电泳(IEF)，分析感染了轮状病毒Wa株或SA11株及模拟感染(mock infected)的MA104细胞蛋白谱表达情况(图1A，B)。以模拟感染组为对照，Wa株感染组分别可检测出772和798个蛋白点，SA11株感染组分别可检测出1230和1312个蛋白点。通过图像分析及胶与图像的比对，重复3次，发现Wa株感染组感染12小时后，有14个蛋白点表达上调2倍以上，37个蛋白点表达下调50％以上；SA11株感染组感染12小时后，有24个蛋白点表达上调2倍以上，29个蛋白点表达下调50％以上。鉴于轮状病毒感染后会引起细胞蛋白表达的普遍下降，那些感染后表达反而上调的蛋白在轮状病毒与宿主细胞相互作用中更有意义，故选择在感染后表达上调的蛋白点进行蛋白鉴定。

采用MALDI-TOF-MS技术，并通过mascot用NCBInr数据库进行数据库检索以鉴定在感染后表达上调的蛋白。质谱分析结果显示，表达升高的蛋白包括：轮状病毒非结构蛋白NSP3，plectin 1isoform 6，cortactin-binding protein 2与leucine-zipper-like transcription regulator，1isoform 1的复合物，KRT8 protein与reticulocalbin 1的复合物，亲环素A等(图1C)。这些蛋白可能与抑制宿主蛋白表达、胞内信号传递、胞内代谢、病毒复制与运输及宿主细胞发育分化相关，显示出轮状病毒感染后对宿主细胞的改造，使之适合于自身在胞内生存。进一步Western-blot结果证实亲环素A等在轮状病毒感染后上调表达(图1D)。

2、生物信息学分析轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A的相互作用

生物信息学分析轮状病毒VP6蛋白的氨基酸一级结构和三维晶体结构发现，VP6蛋白C末端序列af-ag环中含有亲环素A最易识别、结合并催化其中的脯氨酸构象改变的X-GP-X序列(图2)。提示轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A有相互作用，推测这种作用对病毒的成熟、病毒的复制和新病毒颗粒的形成起重要作用。

3、同源蛋白模建方法构建轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的复合物三维结构模型

根据轮状病毒Wa株VP6蛋白(登录号为P03530)三维晶体结构和人亲环素A三维晶体结构(蛋白质三维结构数据库PDB编号为1AK4)，采用INSIGHTII工作站，将轮状病毒VP6蛋白Leu 343到Arg 392组成的loop区对接到人亲环素A结合口袋中，获得轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A的复合物的初始结构，再用分子力学进行优化，采用的力场参数为Amber力场和Kollman-all-atom电荷。优化的复合物三维结构模型如图3所示。由该复合物三维结构模型可以获知：轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的功能区域为第52至第100位和第343至第392位氨基酸，其中主要活性位点为Asn 53，Ala 348，Val 349，Ile 355和Pro 363；人亲环素A与轮状病毒VP6蛋白相互作用的功能区域为第54至第150位氨基酸，其中主要活性位点为Arg 55，Gln 63，Lys 125和Arg 148。

4、免疫荧光激光共聚焦验证轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A的相互作用在确定轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的功能区域和活性位点的基础上，本发明用不同颜色荧光抗体分别标记轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A，免疫荧光激光共聚焦显示VP6蛋白与亲环素A在轮状病毒感染细胞中共同定位(图4)，证明轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A之间确实存在相互作用。这种相互作用可能有助于轮状病毒VP6蛋白的多聚、DLP形成以及后期与VP4、VP7等外壳蛋白共同组装成TLP，形成成熟的轮状病毒颗粒。

5、计算机虚拟筛选方法针对轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的功能区域和活性位点搜寻活性化合物及所得活性化合物的抗轮状病毒活性测试

由上述结果可以初步判定，轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A的相互作用与轮状病毒感染人体有关，二者相互作用的复合物三维结构模型可能作为药物作用靶标用于筛选抗轮状病毒药物。为此，按照通常的药物作用靶标确证原则，本发明对轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的复合物三维结构模型用作抗轮状病毒药物作用靶标进行了确证。

首先，本发明针对轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的功能区域和活性位点，用计算机虚拟筛选方法筛选了MDL公司的药物数据库CMC和现有化合物数据库ACD的化合物样品库，获得了一批与亲环素A具有较强亲和力的化合物，包括已知免疫抑制剂环孢素A。

其次，本发明采用等离子表面激光共振生物传感(SPR)研究了环孢素A抑制轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A结合的能力：先用100mM NHS/400mM EDC活化BIAcore传感芯片(Pharmacia LKB Biotechnology)，注入VP6蛋白通过活化的表面，未反应的活性基团用1M乙醇胺(pH 8.5)失活，再将不同浓度的环孢素A和亲环素A以10ul/min的流速注入流动池，连续记录所得的共振信号(RU)，用BIAevaluation 2.1软件(Pharmacia Biosenor)分析所得的结合曲线，计算VP6蛋白与亲环素A的表观解离常数。结果显示，VP6蛋白与亲环素A的结合速率常数ka＝3.16x10³s，解离速率常数kd＝2.56x10^-4s^-1，结合平衡常数Ka＝1.38x10⁸M^-1，解离平衡常数Kd＝7.89x10^-9M；环孢素A能够有效地抑制轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A的结合，且随着环孢素A的浓度增加，其抑制VP6蛋白与亲环素A结合的强度也增加，呈现出良好的剂量效应关系。

再次，本发明在病毒水平上测试了环孢素A对轮状病毒感染细胞的保护作用：将MA104细胞接种于96孔培养板，在温度37℃、二氧化碳气体体积分数为5％的条件下培养，加入轮状病毒和不同稀释浓度的环孢素A，同时设病毒空白对照、293FT细胞对照和样品FK506对照，观察细胞变性反应(CPE)，并用轮状病毒特异性荧光抗体染色测定病毒滴度记录FFU值。结果如图5所示，浓度为1uM或2uM的环孢素A均对轮状病毒感染MA104细胞有较明显的保护作用。

根据以上实验结果，本发明确证了轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的复合物三维结构模型可以作为抗轮状病毒药物作用靶标，用于筛选或设计能阻断轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的化合物，从而研发出高效低毒的特异性抗轮状病毒药物。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>抗轮状病毒药物作用靶标及其构建方法和应用方法

<160>2

<210>1

<211>397

<212>PRT

<213>轮状病毒(Rotavirus)

<220>

<223>轮状病毒VP6蛋白

<400>1

Met Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg

  1               5                  10                  15

Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu

                 20                  25                  30

Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Asp

                 35                  40                  45

Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Val Arg Asn Trp Thr

                 50                  55                  60

Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala

                 65                  70                  75

Asn Tyr Val Glu Asn Ala Arg Thr Ile Ile Glu Tyr Phe Ile Asp

                 80                  85                  90

Phe Ile Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Ala Arg Glu Ser Gln

                 95                 100                 105

Arg Asn Gly Val Ala Pro Gln Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ala

                110                 115                 120

Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr

                125                 130                 135

Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe

                140                 145                 150

Val Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr

                155                 160                 165

Leu Asn Arg Ser Gln Pro Met His Asp Asn Leu Met Gly Thr Met

                170                 175                 180

Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr

                185                 190                 195

Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe Glu His

                200                 205                 210

Ile Val Gln Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu

                215                 220                 225

Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser

                230                 235                 240

Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Phe Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg

                245                 250                 255

Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile

                260                 265                 270

Asn Thr Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe

                275                 280                 285

Asp Ala Ile Arg Leu Leu Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met

                290                 295                 300

Thr Pro Ala Val Asn Ala Leu Phe Pro Gln Ala Gln Pro Phe Gln

                305                 310                 315

His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val

                320                 325                 330

Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Asn Glu Thr Leu Leu Ala Asn

                335                 340                 345

Val Thr Ala Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val

                350                 355                 360

Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Glu Leu Ile Thr Asn Tyr Ser

                365                 370                 375

Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser

                380                 385                 390

Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys

                395

<210>2

<211>165

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<220>

<223>亲环素A

<400>2

Met Val Asn Pro Thr Val Phe Phe Asp Ile Ala Val Asp Gly Glu

  1               5                  10                  15

Pro Leu Gly Arg Val Ser Phe Glu Leu Phe Ala Asp Lys Val Pro

                 20                  25                  30

Lys Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Ser Thr Gly Glu Lys Gly

                 35                  40                  45

Phe Gly Tyr Lys Gly Ser Cys Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe

                 50                  55                  60

Met Cys Gln Gly Gly Asp Phe Thr Arg His Asn Gly Thr Gly Gly

                 65                  70                  75

Lys Ser Ile Tyr Gly Glu Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe Ile Leu

                 80                  85                  90

Lys His Thr Gly Pro Gly Ile Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro

                 95                 100                 105

Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile Cys Thr Ala Lys Thr Glu

                110                 115                 120

Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val Phe Gly Lys Val Lys Glu Gly

                125                 130                 135

Met Asn Ile Val Glu Ala Met Glu Arg Phe Gly Ser Arg Asn Gly

                140                 145                 150

Lys Thr Ser Lys Lys Ile Thr Ile Ala Asp Cys Gly Gln Leu Glu

                155                 160                 165

Claims (2)

1.抗轮状病毒药物作用靶标，其特征在于：为轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的复合物，所述轮状病毒VP6蛋白的氨基酸序列如SEQ No.1所示，与人亲环素A相互作用的功能区域为第52至第100位和第343至第392位氨基酸，其中活性位点包括Asn53、Ala348、Val349、Ile355和Pro363；所述人亲环素A的氨基酸序列如SEQ No.2所示，与轮状病毒VP6蛋白相互作用的功能区域为第54至第150位氨基酸，其中活性位点包括Arg55、Gln63、Lys125和Arg148。

2.权利要求1所述抗轮状病毒药物作用靶标的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、用蛋白组学方法对轮状病毒感染细胞进行全细胞表达谱分析，发现轮状病毒感染可诱导人亲环素A表达升高；

b、用生物信息学方法对轮状病毒蛋白质与人亲环素A的相互作用进行网络分析，揭示轮状病毒VP6蛋白和人亲环素A有相互作用；

c、用同源蛋白模建方法构建轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的复合物三维结构模型，确定轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的功能区域和活性位点；

d、用分子生物学方法验证轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A的相互作用，证明轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A确实存在相互作用；

e、针对轮状病毒VP6蛋白与人亲环素A相互作用的功能区域和活性位点，用计算机虚拟筛选方法搜寻活性化合物，并对所得活性化合物进行病毒水平的测试，确证抗轮状病毒药物作用靶标的建立。

Images