KR20070103506A - 경구 투여용의 약독된 생 로타바이러스 백신 - Google Patents

경구 투여용의 약독된 생 로타바이러스 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 유아에게 경구 투여하기에 적합한 액체 로타바이러스 제형을 제공한다. 특히, 본 발명은 로타바이러스 항원, 당 및 카르복실레이트를 포함하는 약제 조성물 및 백신을 제공하고, 여기서 상기 제형은 pH 5.0 내지 pH 8.0의 pH를 지니고, 포스페이트를 포함하지 않거나 5 mM 미만의 포스페이트를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 로타바이러스 제형을 제조하는 방법 및 인간의 로타바이러스 관련 질병의 예방 또는 치료에 있어서의 이의 용도를 제공한다.

Description

경구 투여용의 약독된 생 로타바이러스 백신 {LIVE ATTENUATED ROTAVIRUS VACCINE FOR ORAL ADMINISTRATION}
기술 분야
본 발명은 로타바이러스, 특히 인간 로타바이러스 관련 질병의 예방을 위한, 약제 조성물 및 백신으로 유용한 신규한 액체 로타바이러스 제형, 및 이를 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
기술 배경
급성 감염성 설사는 세계 각지의 질병 및 사망의 주요 원인이다. 개발 도상국에서는, 설사 질병의 영향이 매우 중요하다. 아시아, 아프리카 및 라틴 아메리카에서는 매년 30 내지 40억명의 설사 환자가 존재하고, 이중 약 500만 내지 1000만명이 사망하는 것으로 추정되고 있다 (Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)).
로타바이러스는 유아 및 연소한 아동의 중증 설사의 가장 중요한 원인중 하나로 인지되고 있다 (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, edited by Fields et al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). 로타바이러스 질병으로 매년 600,000명 이상이 사망하는 것으로 추정된다. 로타바이러스에 의해 유도된 질병은 6 내지 24개월의 연령의 아동에게 가장 일반적으로 영향을 미치고, 이러한 질병의 최고 이환율은 일반적으로 온대성 기후의 서늘한 달, 및 열대 지역의 연중 동안 발생한다. 로타바이러스는 통상적으로 약 1 내지 약 3일의 잠복 기간으로 배설물-경구 경로에 의해 인간 대 인간으로 전염된다. 6개월 내지 24개월 연령 그룹에서의 감염과는 달리, 신생아는 일반적으로 징후가 없거나 단지 가벼운 질병을 지닌다. 연소한 아동에서 일반적으로 조우되는 중증 질병과는 대조적으로, 대부분의 성인은 기존의 로타바이러스 감염의 결과로 보호되어, 성인 감염은 가벼운 감염이거나 징후가 없다 (Offit, P.A. et al. Comp. Ther., 8(8):21-26, 1982).
로타바이러스는 구의 형태이고, 이의 명칭은 이의 독특한 외부 및 내부 또는 이중-쉘(shell) 캡시드 구조로부터 유래된 것이다. 통상적으로, 로타바이러스의 이중-쉘 캡시드 구조는 내부 단백질 쉘 또는 유전체를 함유하는 코어를 둘러싼다. 로타바이러스의 유전체는 11개 이상의 별개의 바이러스 단백질을 엔코딩하는 이중가닥 RNA의 11개 분절로 구성되어 있다. VP4 (P 단백질) 및 VP7 (G 단백질)로 명명된 상기 바이러스 단백질중 2개는 이중쉘 캡시드 구조의 외부에 배열된 구조 단백질이다. 로타바이러스의 내부 캡시드에는 VP6으로 명명된 로타바이러스 단백질인 하나의 단백질이 존재한다. 로타바이러스 감염에 따른 면역 반응의 유도에서의 상기 3개의 특정 로타바이러스 단백질의 상대적 중요성은 아직 명백하지 않다. 그럼에도 불구하고, VP6 단백질은 그룹 및 서브그룹 항원을 결정하고, VP4 및 VP7 단백질은 혈청형 특이성의 결정인자이다.
지금까지, 14개 이상의 로타바이러스 G 혈청형 및 11개의 로타바이러스 P 혈청형이 확인되었다 (Linhares A.C. & Bresse J.S., Pan. Am. J. Publ. Health 2000, 9, 305-330). 이들 중에서, 10개의 G 혈청형 및 6개의 P 혈청형이 인간 로타바이러스 중 하나로 확인되었다.
VP7 단백질은 균주에 따라 유전체 분절 7, 8 또는 9의 번역 생성물인 38,000 MW의 당단백질 (당화되지 않은 경우, 34,000 MW)이다. 이러한 단백질은 로타바이러스 감염 후 주요 중화 항체의 형성을 자극한다. VP4 단백질은 유전체 분절 4의 번역 생성물인 약 88,000 MW의 당화되지 않은 단백질이다. 이러한 단백질은 또한 로타바이러스 감염 후에 중화 항체를 자극한다. VP4 및 VP7 단백질은 중화 항체에 의해 표적화되는 바이러스 단백질로, 이들은 로타바이러스 질병에 대한 보호를 제공하는 로타바이러스 백신의 개발에서 주요 후보자인 것으로 생각된다.
어린 유년기 동안의 천연 로타바이러스 감염은 보호 면역을 유도하는 것으로 공지되어 있다.
로타바이러스 감염을 예방하기 위한 초기의 백신 개발은 바이러스의 발견 후 1970년대에 시작되었다. 최초로, 동물 및 인간으로부터 약독된 균주가 연구된 반면, 보다 최근의 연구는 인간-동물 재조합체에 초점을 맞추고 있다.
신규한 로타바이러스 제형의 개발은 광범위한 환경 및 보관 상태하에서의 세계적인 판매 잠재성 및 안정성을 포함하는 다수의 필요 조건에 따라야 한다. 특히, 제형, 특히 약제 조성물 또는 백신 조성물의 안정성은 일반적으로 실온 또는 보다 고온에 비해 낮은 온도에서 보다 나을 것이다.
그 결과, 하나의 안정화 방법으로 동결 (-20℃ 내지 -70℃) 저장될 수 있는 백신 제형 또는 대안적으로 냉장장치 온도 주위 (2℃ 내지 8℃)에서 장기간 유지될 수 있는 동결 건조된 백신이 개발되었다. 그러나, 동결 건조 방법은 그 수용량에 한계가 있고, 높은 생성 비용과 직결된다는 사실이 공지되어 있다. 더욱이, 동결건조된 백신은 투여시 정교한 취급을 필요로 하므로, 이들은 보다 복잡하므로 보다 고비용인 장치, 예를들어 하나의 챔버에 활성 성분을 지니고 또 다른 챔버에 재구성 액체를 지니는 멀티챔버/바이얼 백신을 필요로 할 수 있다. 동결건조된 백신은 또한 보다 높은 적하 및 보관 비용과 관련된다. 이러한 옵션은 투여 장치가 재정적으로 감당될 수 없고 생산 및 보관 산업기반의 이용도가 존재하지 않거나 신뢰할 수 없는 개발도상국의 몇몇 국가에 대해서 부적절할 수 있다.
로타바이러스는 통상적으로 인간 유아에 경구 투여되고, 이러한 경로는 면역원성 로타바이러스 조성물에 대한 다수의 투여를 가능케 한다.
로타바이러스는 산성 환경, 예를들어 산성 완충용액 또는 산성 위액에 노출시 신속하게 불활성화된다 (C. Weiss and H.F. Clark, 1985, J. Gen. Virol., 66, 2725-2730; T. Vesikari et al., 1984, The Lancet, page 700 ; R.H.Foster and A.J.Wagstaff, 1998, BioDrugs Feb: 9(2) 155-178). 따라서, 로타바이러스 조성물은 이들이 보관 동안과 숙주 수용체로 투여후에 안정적인 방식으로 제형화되는 것이 바람직하다.
로타바이러스 백신은 주로 4주의 연령과 같이 매우 어린 유아에 투여되도록 의도된다. 소량의 백신 투여량, 예를들어 2 ml 미만 또는 1.5 ml 미만의 투여량이 상기 집단에 이로울 것이다. 따라서, 로타바이러스 조성물이 소량의 투여량으로 제형화되는 것이 바람직하다.
액체 바이러스 백신용의 안정화된 백신은 공지되어 있다. 예를들어, EP 0 065 905에는 일반적으로 일련의 바이러스, 예를들어 홍역 또는 인플루엔자를 야기시키는 바이러스에 적합한 안정화된 조성물, 특히 약독된 생 바이러스에 적합한 용액을 함유하는 안정화된 포스페이트 완충용액이 기술되어 있다.
기타 안정화된 제형은 WO 98/13065 및 문헌[Clark et al. (Pediatr Infect Dis J. 2003 Oct; 22(10):914-20)]에 기술되어 있다. 이러한 제형은 또한 기타 성분중에서 위의 산성을 중화시키는 완충제로 작용하는 포스페이트의 존재를 필요로 한다. 그러나, 이들 제형은 로타바이러스 제형의 성공적인 개발을 위한 상기 기술된 필요조건과 양립되지 않고, 특히 이들은 인간 유아에 가장 적합화된 감소된 백신 투여량과 양립되지 않는다. 특히, 본 발명자들은 이러한 기존의 제형을 효과적인 제산 능력을 유지시키면서 적은 부피의 세팅, 예를들어 1.5 ml 이하의 낮은 부피로 적합화시키는 것이 제형 성분, 특히 포스페이트 완충용액의 부적절한 농도로부터 발생하는 문제점을 야기시키는 것을 발견하였다.
따라서, 위의 산성에 저항할 수 있고, 포스페이트의 부재에도 냉동장치에서 안정적인 대안적 로타바이러스 제형, 특히 대안적 액체 제형을 개발하는 것이 요구된다. 또한, 이러한 대안적 제형이 또한 가능한 한 소량의 백신 투여량으로 성공적으로 제형화되는 것이 요구된다.
따라서, 본 발명자들은 포스페이트가 전혀 없거나 단지 최소량의 포스페이트를 함유하는 안정한 대안적 면역원성 조성물을 제공할 뿐만 아니라, 로타바이러스가 인간 유아에 대한 경구 투여에 적합한 소량의 투여량으로 제형화되는 것을 가능케 한다.
도면의 간단한 설명
도 1 - 4개의 카르복실레이트에 대한 표준 산성 염기 적정 곡선
도 2A - 다양한 아디페이트 함유 제형의 제산 능력
도 2B - 베이비 로셋-라이스 (Baby Rossett-Rice) 분석의 실험적 구성
도 3 - 아디페이트 함유 제형의 굴절 지수. 도 3A는 아디페이트 완충 단계에서, 목표 값이 혼합물에서 1.4578의 굴절 지수를 발생시키는 수크로오스 58.5% w/w임을 나타낸다. 도 3B는 최종 제형화 단계에서, 목표가 1.4480의 굴절 지수를 야기시키는 수크로오스 55% w/w임을 나타낸다.
도 4 - 단계 Ⅱ 임상 연구 계획 개관
발명의 진술
따라서, 본 발명의 첫번째 양태에서, 로타바이러스 항원, 당 및 카르복실레이트를 포함하는, 인간 유아에 경구 투여하기에 적합한 액체 로타바이러스 면역원성 조성물이 제공되고, 이러한 조성물은 pH 5.0 내지 pH 8.0의 pH를 지니고, 5 mM 미만의 포스페이트를 포함한다. 적합하게는, 청구되는 조성물 내의 포스페이트의 농도는 1 mM을 초과하지 않는다.
본 발명의 한 특정 양태에서, 적절한 백신은 보통 유아 또는 아동에 경구 투여하기에 적합한 1.5 ml 또는 적합하게는 2.5 ml 미만의 임의의 부피, 예를들어 2 ml 이하의 부피일 것이다. 특히, 투여량은 제형의 기술적 실현성이 가능하고 제형의 면역원성 잠재성에 유해한 효과를 나타내지 않는 양일 것이다. 청구된 조성물은 기존의 포스페이트 함유 제형에 비해, 일반적인 투여량보다 적은 투여량, 예를들어 2.0 ml 보다 적은 투여량의 제형과 양립되거나 1.5 ml 이하의 투여량과 양립되면서, 장기간의 저장 기간에 걸쳐 위의 산성에 저항하고, 면역원성을 유지하고, 안정적일 수 있는 이점을 제공한다.
한 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 액체 면역원성 조성물은 베이비 로셋-라이스 분석 (기본적인 로셋-라이스 시험으로부터 실시예 Ⅲ.2.2에 상세하기 기술된 바와 같이 적합화됨)에 의해 측정시 6 내지 23분의 제산 능력을 지닌다. 적합하게는, 제산 능력은 8분 이상, 통상적으로 12분 이상일 것이고, 적합한 범위는 12 내지 20분이다. 놀랍게도, 청구된 조성물은 기존의 포스페이트 함유 제형에 비해 소량의 투여량에서도 조건에 맞을 뿐만 아니라 보다 높은 제산 능력을 나타내었다.
또 다른 양태에서, 로타바이러스 항원, 당 및 카르복실레이트와 약학적으로 허용되는 희석제를 혼합시키는 것을 포함하여, 액체 로타바이러스 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 제공된다.
본 발명은 또한 또 다른 양태에서 인간의 로타바이러스 관련 질병을 예방하거나 치료하기 위한 경구용 면역원성 조성물의 제조를 위한 카르복실레이트 및 당과 혼합된 로타바이러스 항원의 용도를 포함하고, 이러한 조성물은 5 mM 이상의 포스페이트를 함유하지 않고, 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0의 pH를 지닌다.
한 추가 양태에서, 유효량의 액체 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 인간 피검체에 투여함으로써 인간의 로타바이러스 관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 기타 양태 및 이점은 하기의 바람직한 구체예의 상세한 설명에 추가로 기술된다.
상세한 설명
본 발명자들은 경구 투여시 위의 고유의 산성 특성에 저항할 수 있고, 소량의 투여량과 양립되는, 냉동장치 온도 (2 내지 7℃, 통상적으로 4℃)에서 안정적이고 면역원성인 신규한 액체 로타바이러스 조성물을 개발하였다.
액체 조성물은 이의 부피가 일정한 특정 조건 (예를들어, 실온 또는 냉동장치 온도, 대기압)에 고착되고, 이의 형태가 이를 채우는 용기에 의해 결정되는, 건조 형태와는 다른 액체 형태의 제형을 의미한다.
본 명세서에 언급된 간행물 및 특허 또는 특허 출원 내에 기술된 주제 및 정보는 본원에 참조로 포함된다.
본원의 용어 '포함하는' 및 '포함하다'는 모든 경우에 용어 '구성되는' 및 '구성하다'와 각각 임의로 대용될 수 있다.
본 발명자들은 로타바이러스 항원, 당 및 카르복실레이트를 포함하는 액체 로타바이러스 면역원성 조성물을 제공하고, 이러한 조성물은 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0의 pH를 지니고, 5 mM 미만의 포스페이트를 포함한다. 본 발명의 조성물은 면역원성을 유지하면서, 포스페이트 함유 제형과 비교시 매우 우수한 안정성 프로파일을 나타낸다. 이러한 조성물은 최소한 이의 포스페이트 함유 대응물만큼 안정하다. 본 발명의 조성물의 추가 장점은 포스페이트가 존재하는 기존의 제형과 비교하여 이들이 소량의 투여량, 예를들어 2.0 ml 미만, 통상적으로 1.5 ml로 제조될 수 있다는 점이다.
한 특정 구체예에서, 면역원성 조성물 내의 포스페이트의 농도는 5 ml 이하, 적절하게는 1 ml이고, 특히 0.5 ml를 초과하지 않는다. 포스페이트는 인산 (오르토인산 (H3OP4)으로도 공지되어 있음)의 염을 의미하고, 보통 나트륨 또는 칼륨 또는 나트륨과 칼륨의 혼합물이 사용된다 (예를들어: Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4). 적절하게는, 포스페이트 농도는 0.4 mM 이하, 통상적으로 0.2 mM 이하, 이상적으로는 0.1 mM 이하이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 청구된 조성물은 포스페이트가 존재하지 않는다. 통상적으로, 존재시 포스페이트는 희석제로 사용되는 세포 배양 배지 또는 염수 완충용액, 예를들어 DMEM (둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle Medium)), 이글 BME 기초 배지 또는 PBS로부터 유래된다.
본 명세서에 걸쳐 언급되는 포스페이트 농도는 청구된 조성물(들)의 제조에서 작용된 포스페이트 함유 화학물질의 양(들)로부터 결정되는 바와 같이 계산된 농도일 것이다. 대안적으로, 본원에 청구된 조성물에 존재하는 포스페이트의 농도는 통상적인 분석 기술을 이용하여 실험적으로 측정될 수 있다.
하나의 적절한 기술은 마체레이-나겔 (Macherey-Nagel)사에 의해 시판되는 상품명 '나노컬러 (Nanocolor)' (카탈로그 n°918 78)로 명명된 비색 분석이다. 이러한 방법은 산성 용액 중의 인산-몰리브데이트-바나데이트에 의해 형성된 황색 착물의 광도 측정 결정을 기초로 한다. 분석량의 한도는 2 μg/ml의 포스페이트 또는 0.02 mM이다.
대안적 방법은 원자 발광 분광 기술, 예를들어 유도결합플라즈마분광광도계 (Incutively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy, ICP-AES) 에 의한 인(P)의 조사량이다 (Boss & Fredeen, in Concepts, Instrumentation, and Techniques in Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy, Perkin Elmer eds, second edition, 1997 - see Methodology on page 72 onwards). 상기 분석량의 한계는 0.00032 mM의 포스페이트 농도에 상응하는 0.030 μg/ml의 인이다.
한 구체예에서, 조성물의 pH는 pH 5.0 내지 pH 8.0이다. 또 다른 특정 구체예에서, 청구된 조성물의 pH는 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.5이다. '약 pH'는 언급된 pH 값의 0.2 단위 이내를 의미한다. 특히, 조성물의 pH는 pH 5.5 내지 pH 7.5이다. 예를들어, 조성물의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 특히 pH 6.0 내지 pH 7.0, 통상적으로 pH 6.0 내지 pH 6.8 또는 pH 6.2 내지 pH 6.6이다. 약 6.4, 특히 6.4의 pH가 고려된다. 로타바이러스는 산성 pH, 예를들어 4.0 미만의 pH에서 부정적으로 영향을 받는 것으로 공지되어 있고, 예를들어 기존의 포스페이트 완충된 제형에서 수득된 중성 또는 약간 염기성 pH, 즉 7.0 내지 8.0의 pH 범위에서 최대 안정성이 수득되는 것으로 예상된다. 실험 섹션에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 포스페이트의 부재에도 불구하고 청구된 pH 범위에서 우수한 안정성 프로파일을 나타내고, 더욱이 놀랍게도 약간의 산성 조건, 즉 pH 6.0 내지 7.0 주위, 예를들어 6.4 주위의 pH에서 허용가능한 안정성 및 면역원성 프로파일을 나타내었다.
본원에 청구된 액체 조성물은 카르복실레이트를 포함한다.
카르복실레이트 ("-COO-")는 염기 물질에 의한 산성 작용기 ("-COOH")의 중화의 결과로 생성된 카르복실산의 해리된 형태이다. 카르복실산은 카르복실기 "-COOH"를 함유하는 화합물로, 이는 카르보닐기 ("-CO-")와 히드록실기 ("-OH")를 결합시킴으로써 정식으로 제조된다. 그러나, 이들 두개의 부분 사이의 상호작용은 전체 기가 이의 자신의 특성과 함께 새로운 작용으로 간주되는 이의 화학적 특성을 변형시킨다 (Organic Chemistry by J.B. Hendrickson, D.J. Cram, and G.S. Hammond, McGraw-Hill Book Company, third edition 1970 page 131). 비록 국제 순수 및 응용화학연맹 (IUPAC)은 알칸산 (alkaneoic acid) (모노카르복실산에 대해) 및 알칸이산 (alkanedioic acid) (디카르복실산에 대해)을 사용하는 것을 권고하나, 대부분 카르복실산의 통칭명을 본원에서 사용하였는데, 이는 이들 생성물이 당업자에게 널리 공지되어 있기 때문이다. 예를들어, 아세트산의 IUPAC명은 에탄산이고, 아디프산은 헥산이산이 될 것이다.
한 특정 구체예에서, 무기산으로부터의 카르복실레이트염 또는 적합하게는 유기산으로부터의 카르복실레이트염이 사용된다. 한 특정 구체예에서, 이러한 카르복실레이트는 약산으로부터 유래된다. 예를들어, 이러한 카르복실레이트는 아디페이트, 시트레이트, 말레이트, 아세테이트, 숙시네이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 말로네이트, 글루타레이트, 말레에이트, 글리콜레이트, 락테이트, 글루코네이트, 푸마레이트, 타르타레이트, 피멜레이트 및 이들중 두개 이상의 임의의 배합물로 구성된 군으로부터 선택된 카르복실레이트염이다. 적절한 카르복실레이트는 4를 초과하는 pKa를 지닌 카르복실산으로부터 유래된 카르복실레이트 또는 4를 초과하는 수평균 pKa를 지닌 디카르복실산 또는 트리카르복실산으로부터 유래된 카르복실레이트 (디-카르복실레이트 또는 트리-카르복실레이트)이다 (표 9). 전자의 부류의 예는 프로피온산, 부티르산 및 아세트산으로부터 유래된 카르복실레이트를 포함한다. 후자의 부류의 예는 시트르산, 말레산, 말론산, 숙신산, 아디프산, 글루타르산 및 말산으로부터 유래된 카르복실레이트를 포함한다.
한 특정 구체예에서, 카르복실레이트는 GRAS 목록, 즉 '미국 식품의약안전청에 의한 일반적으로 안전한' 카르복실레이트에 속하고, 아세테이트, 프로피오네이트, 말레이트, 글루타레이트, 아디페이트, 락테이트, 푸마레이트, 및 타르트레이트를 포함하는 목록으로부터 선택된다. 적절하게는, 카르복실레이트는 아디프산의 염, 즉 아디프산의 일나트륨염, 아디프산의 일칼륨염, 적절하게는 이나트륨 아디페이트 또는 이칼륨 아디페이트, 또는 칼슘 아디페이트이다.
한 특정 구체예에서, 적절하게는 50 mM 내지 2 M 사이의 카르복실레이트 농도가 액체 로타바이러스 조성물에 사용된다. 상기 언급된 범위 이내의 카르복실레이트 농도가 카르복실레이트의 특성, 달성되는 제산 능력 및 백신 투여량에 따라 통상적인 실험을 통해 적절하게 적합화될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를들어, 1.5 ml의 투여량에 대해 베이비 로셋-라이스 시험으로 측정시 8분 초과, 적합하게는 10분 초과, 또는 12분 초과의 높은 제산 잠재성이 요구되는 경우 1 M을 초과하는 높은 카르복실레이트 농도가 사용될 수 있다. 1 M 이하의 농도, 예를들어 100 mM 내지 1 M의 농도, 통상적으로 200 mM 내지 800 mM의 농도가 사용된다. 적절한 카르복실레이트 농도는 약 300 mM 내지 약 800 mM, 적절하게는 400 mM 내지 700 mM를 포함한다. 특히, 카르복실레이트가 아디페이트인 경우, 적절한 농도 범위는 400 내지 500 mM이다. 그러나, 당업자는 100 mM이 언급된 경우 80-90 mM 내지 110-120 mM의 범위가 또한 기술되고 포함되는 것을 의미하는 바와 같이, 상기 언급된 값의 10 내지 20 퍼센트 내의 농도가 적절할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 다양한 카르복실레이트에 대한 예시적 농도가 하기 표 1에 제시된다.
표 1 - 특정 농도에서의 카르복실레이트의 제산 능력
이러한 예시적 파라미터는 1.5 ml의 투여량에 대해 제공되고, 이는 표 1에 제공된 언급된 예시적 수에 해당한다.
카르복실레이트 (Mw) 카르복실레이트 농도 (M) t=0에서의 BRR의 pH 제산 능력 (분)* 실시예 Ⅱ에서의 샘플 N°
아디페이트 (144) 0.372 6.38 8 91
아디페이트 (144) 0.465 6.24 12 92
아디페이트 (144) 0.548 6.50 16 93
아디페이트 (144) 0.652 6.11 20 94
D,L-말레이트 (132) 0.621 6.15 8 72
D,L-말레이트 (132) 0.746 6.08 12 64
D,L-말레이트 (132) 0.895 5.35 15 77
아세테이트 (59) 1.000 6.14 12 89
시트레이트 (189) 0.441 6.55 12 129
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
본원에 청구된 액체 로타바이러스 면역원성 조성물의 pH는 카르복실산과 카르복실레이트염을 혼합하여 수득될 수 있다. 특히, 카르복실산은 다양한 카르복실레이트염과 혼합하여 사용될 수 있고, 예를들어 시트레이트는 아디프산과 배합된다. 이는 일부가 용이하게 입수가능하지 않은 시판되는 화학물질을 이용하거나, 제형화 단계를 간소화하기에 이로울 수 있다. 예를들어, 하나 (또는 이 이상)의 상기 카르복실산(들)은 아디프산, 시트르산, 말산, 아세트산, 숙신산, 탄산, 프로피온산, 부티르산, 말론산, 글루타르산, 말레산, 글리콜산, 락트산, 글루콘산, 푸마르산, 타르타르산 및 피멜산으로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있고, 아디페이트, 시트레이트, 말레이트, 아세테이트, 숙시네이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 말로네이트, 글루타레이트, 말레에이트, 글리콜레이트, 락테이트, 글루코네이트, 푸마레이트, 타르타레이트 및 피멜리에이트로 구성된 목록으로부터 선택된 카르복실레이트염중 하나 (또는 이 이상)과 적절한 비율로 혼합된다.
본원에 청구된 액체 조성물은 당을 포함한다. 수크로오스가 특히 적합하다. 덱스트로오스는 또 다른 적합한 당이다. 예를들어, 글리세롤, 에리트로오스, 에리트리올, 자일리톨, 아라비톨, 리보오스, 자일로오스, 아라비노오스, 글루코오스, 타갈로오스, 만노오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 이노지톨, 소르비톨, 만니톨, 갈락티톨, 글루코오스와 프룩토오스 혼합물, 말토오스, 소포로오스, 락토오스, 셀로비오스, 멜리비오스, 트레할로오스, 수크로오스, 팔라티노오스, 말툴로오스, 락툴로오스, 말티톨, 락티톨, 라피노오스, 말토트리오스, 멜레지토오스, 셀로트리오스, 시리톨, 말토테트라오스, 스타키오스, 셀로테트라오스, 말토펜타오스, 셀로펜타오스, 말토헥사오스, 셀로헥사오스 및 올리고당류를 포함하는 기타 당 또는 당 알코올이 또한 수크로오스 또는 덱스트로오스 대신 사용될 수 있다.
통상적인 당 농도는 약 1% w/w 내지 약 70% w/w, 예를들어 약 25% w/w 내지 약 60% w/w의 범위이다. 그러나, 당업자는 당의 특성 및 농도가 제형화의 분리정제 단계, 예를들어 여과와 양립되는 수준에서 점성을 유지하면서 만족스러운 바이러스 생활성을 보장하도록 최적화되어야 한다는 것을 인지할 것이다. 한 특정 구체예에서, 수크로오스가 사용된다. 통상적으로, 이의 농도는 최소 30% w/w로 유지된다. 또한, 이러한 제형의 높은 등삼투압이 박테리아 성장을 방지하는 것으로 예상되므로 장기간의 보관을 위해 30% w/w 이상의 보다 높은 수크로오스 농도가 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 청구된 액체 조성물 내의 수크로오스의 농도에 대한 하한은 적절하게는 30% w/w 이상, 예를들어 35% w/w 이상, 적절하게는 40% w/w 이상이다. 적절한 수크로오스 약 45% w/w 내지 약 70% w/w 범위이다. 예를들어, 수크로오스의 적절한 농도는 40% w/w 내지 60% w/w, 적절하게는 50% w/w 내지 55% w/w이다. 특히, 약 50% w/w 또는 약 55% w/w의 농도의 수크로오스가 사용된다. 50% w/w 또는 55% w/w의 최종 수크로오스 농도가 적절하다.
또 다른 당이 수크로오스를 대체하는 경우 바이러스 생활성을 보장하기 위해 당 농도의 통상적 최적화가 수행될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
더욱이, 당에 대해 언급된 값은 제형화/제조 파라미터, 예를들어 투여량을 고려하여 약간 적합화될 수 있다. 따라서, 당업자는 50% w/w가 언급되는 경우 45% w/w 내지 55% w/w의 범위가 또한 기재되고 포함되는 것을 의미하는 바와 같이, 상기 언급된 값의 10% 이내의 농도가 적절할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 액체 로타바이러스 면역원성 조성물은 또한 로타바이러스 항원을 포함한다. 특히, 본원에 청구된 액체 조성물은 면역원성 조성물, 예를들어 백신 조성물이다. 로타바이러스 항원은 백신 제형에 사용하기에 적합한 임의의 로타바이러스 항원을 의미하는 것으로 이해된다. 경구용 생 로타바이러스 항원이 특히 고려된다. 예를들어, 임의의 적절한 로타바이러스 항원은 동물 또는 인간으로부터의 약독된 생 로타바이러스, 특히 약독된 인간 생 로타바이러스; 인간-인간 재조합체 (reassortant) 로타바이러스, 소-인간 재조합체 로타바이러스 또는 붉은털 원숭이-인간 재조합체 로타바이러스를 특히 포함하나 이에 제한되지 않는 재조합체 로타바이러스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
모든 로타바이러스 균주, 인간 또는 동물 균주가 본 발명에서 고려된다. 인간 로타바이러스 균주가 적절하다. 특히, 로타바이러스 항원은 한 구체예에서 단일한 변이체 또는 실질적으로 단일한 변이체를 포함하는 약독된 인간 로타바이러스 집단으로, 이러한 변이체는 WO 01/12797에 기술된 VP4 및 VP7로 명명된 주요 바이러스 단백질중 하나 이상을 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 의해 정의된 변이체, 특히 WO 01/12797의 표 2, 표 3.1 및 3.2에 기술된 돌연변이로 정의된 변이체중 하나 이상을 포함하는 임의의 변이체이다. 특정 구체예에서, 로타바이러스 항원은 하기의 약독된 인간 생 로타바이러스 균주중 임의의 것이다: 수탁 번호 ATCC VR 2272로 수탁된 HRV 89-12C2 균주 (EP 0 557 427에 기술됨), 이의 프로제니 (progeny), 재조합체 및 면역학적 활성 유도체; 및 수탁 번호 ECACC 99081301로 수탁된 HRV P43 균주 (WO 01/12797에 기술됨), 이의 프로제니, 재조합체 및 면역학적 활성 유도체.
상기 언급된 수탁 균주중 임의의 균주의 특성을 지니는 로타바이러스 집단이 또한 적절한 백신 균주이다. 상기 수탁된 균주로부터의 유도체는 상기 균주를 추가의 공정, 예를들어 이들을 추가의 계대, 클로닝, 또는 생 바이러스를 이용하는 기타 공정에 의해 증식시키거나, 상기 수탁된 균주를 유전 공학 기술 또는 재조합체 기술을 포함하는 임의의 방식으로 변형시킴으로써 수득될 수 있다. 이러한 단계 및 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 특히 관심있는 로타바이러스 항원은 상기 수탁된 균주중 임의의 균주의 프로제니 및 이의 면역학적으로 활성인 유도체이다. 면역학적으로 활성인 유도체는 수탁된 균주중 임의의 것, 특히 수탁 번호 ECACC 99081301로 수탁된 HRV P43 균주, 특히 숙주 동물에 주입시 로타바이러스에 대해 반응적인 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스의 항원으로부터 수득되거나 이를 이용한 물질을 의미한다.
상기 언급된 수탁 균주로부터 유도된 물질이 또한 적절한 로타바이러스 항원이고, 이는 단백질 및 유전물질을 포함한다. 특히 흥미로운 것은 상기 수탁된 균주중 임의의 것의 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 분절을 포함하는 재조합체 로타바이러스, 예를들어 11 유전체 분절줄 하나 또는 하나의 일부가 상기 수탁된 균주중 임의의 것의 유전체 분절 또는 이의 일부로 대체된 로타바이러스의 유독성 균주를 포함하는 재조합체이다. 특히, NSP4를 코딩하는 분절 또는 부분적 분절이 상기 수탁된 균주중 임의의 것의 분절 또는 부분적 분절인 로타바이러스 재조합체가 유용한 특성을 지닐 수 있다. 재조합체 로타바이러스 및 이를 제조하기 위한 기술은 널리 공지되어 있다 (Foster, R.H. and Wagstaff, A.J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998).
청구된 조성물의 로타바이러스 항원은 통상적인 생성 기술에 따라 생성될 수 있다. 통상적으로, 로타바이러스 항원 제법은 바이러스를 증식시키거나 재조합 로타바이러스 항원을 발현시키는데 사용되는 조직 배양 방법으로부터 유래될 수 있다. 바이러스를 증식시키기에 적절한 세포 기질은 예를들어 개 신장 세포, 예를들어 MDCK 또는 MDCK의 클론으로부터의 세포, MDCK-유사 세포, 원숭이 신장 세포, 예를들어 AGMK 세포, 예를들어 특히 적절한 Vero 세포, 원숭이 신장 기원의 기타 세포주, 예를들어 BSC-1, LLC-MK2 및 MA104, 적절한 돼지 세포주, 또는 백신용의 로타바이러스 생성에 적합한 임의의 기타 포유동물 세포 타입을 포함한다. 적절한 세포 기질은 또한 인간 세포, 예를들어 MRC-5 세포를 포함한다. 적절한 세포 기질은 세포주에 제한되지 않고; 예를들어 1차 세포가 또한 포함된다.
또한, 상기 언급된 수탁 균주중 임의의 것과 기타 로타바이러스 변이체, 예를들어 기타 클로닝된 변이체 또는 기타 재조합체 로타바이러스, 또는 기타 바이러스, 특히 기타 약독된 바이러스의 혼합물이 본 발명의 범위에 포함된다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 두개의 로타바이러스 항원을 함유한다. 특히, 조성물 내의 하나의 항원은 수탁 번호 ECACC 99081301로 수탁된 HRV P43 균주이고, 나머지 항원은 이의 재조합체 유도체 또는 이의 임의의 면역학적으로 활성인 유도체이다.
청구된 조성물에 포함시키기 위한 로타바이러스 항원은 단일한 로타바이러스 균주를 함유하는 1가 로타바이러스 균주이거나, 두개 이상의 로타바이러스 균주를 함유하는 다가일 수 있다.
당업자는 수탁 기관으로부터 입수가능한 인간 또는 동물 기원의 기타 용이하게 이용가능한 약독된 균주가 또한 적합하고, 인용된 수탁 균주에 대한 대체물로 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따르면, 적절한 면역원성 조성물은 용량당 105-106 ffu (또는 용량당 CCID50으로 표현시 105.5-106.5와 동등함)의 농도의 로타바이러스 항원, 특히 약독된 인간 P43 균주 (수탁 번호 ECACC 99081301로 수탁되어 있음, WO 01/127017 참조), 55% 수크로오스 w/w, 이나트륨 아디페이트 0.465 M (용량당 132.74 mg에 해당함)를 함유하고, 1.5 ml의 투여량에서 약 6.2 내지 6.6의 pH를 지닌다. 이러한 조성물의 DMEM 함량은 6% w/w이고, 따라서 0.1 mM 미만의 포스페이트가 존재한다.
본 발명에 따른 조성물은 추가의 제산 성분, 예를들어 무기 제산제, 예를들어 수산화알루미늄 Al(OH)3 및 수산화마그네슘 Mg(OH)2를 추가로 포함한다. 수산화알루미늄이 특히 적합하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 기타 시판되는 제산제는 수산화알루미늄 및 수산화마그네슘을 함유하는 밀란타(Mylanta™)를 포함한다. 이는 물에 불용성이고, 현탁액으로 제공된다. 본 발명의 백신 조성물에 추가로 사용될 수 있는 또 다른 특히 적합한 제산제는 불용성 무기염인 탄산칼슘 (CaCO3)이다. 통상적인 CaCO3 농도는 예를들어 백신 용량당 80 mg이다.
기타 적절한 수 불용성 제산제는 탄산마그네슘, 탄산알루미늄, 인산알루미늄, 수산화알루미늄과 탄산마그네슘의 혼합물, 알루미늄-마그네슘-히드리카르보네이트, 수산화알루미늄-탄산마그네슘-소르비톨-만니톨, 히드록시-알루미늄-나트륨-카르보네이트, 디히드록시-알루미늄-칼륨-카르보네이트, 마갈드레이트 (magaldrate), 히드로탈시트 (hydrotalcite), 알마그시트 (almagcit), 마그네슘-알루미늄-실리케이트-히드레이트이다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물은 특히 유아에 경구 투여하기에 적합한 것으로 특히 당 분야에 공지된 약학적으로 적합한 화합물 및/또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 담체는 카르보히드레이트, 폴리알코올, 아미노산, 수산화알루미늄, 수산화마그네슘, 히드록시아파타이트, 활석, 티타늄 옥시드, 수산화철, 마그네슘 스테아레이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 젤라틴, 식물성 펩톤, 크산탄, 카라게난 (caraghenane), 아라비아 검, β-시클로덱스트린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 조성물은 로타바이러스를 안정화시키는 것으로 제안된 칼슘 이온을 추가로 포함할 수 있다.
점액제가 본 발명의 조성물에 추가로 포함될 수 있다.
사용될 수 있는 가능안 점액제는 유사소성 부형제를 포함한다. 적절한 점액제는 프로필렌 글리콜, 아라비아 검, 아드라간트 검 (adragant gum), 아가-아가, 알지네이트, 펙틴, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 (틸로스 (Tyloses C®)), 메틸셀룰로오스 (메토셀 (Methocels A®), 비스코트란 (Viscotrans MC®), 틸로스 MH® 및 MB®), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (클루셀 (Klucels®)), 히드록시프로필셀룰로오스 (메토셀 E® 및 K®, 비코트란 MPHC®), 카르보폴 (Carbopol®), 크산탄 검, 비검 (Veegum®) (마그네슘-알루미늄 실리케이트), 아비셀 (Avicel®) (약 89%의 미정질 셀룰로오스 및 11 %의 카르복시메틸셀룰로오스 Na)을 포함한다. 크산탄 검 또는 당이 본 발명에 따른 액체 조성물에 추가로 사용하기에 특히 적합한 점액제이다.
청구된 조성물에 지질 기재 비히클, 예를들어 바이로솜 또는 리포솜, 수중유 에멀젼 또는 담체 입자를 포함시키는 것이 또한 이로울 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 경구 백신용의 당 분야에 공지된 것과 같은 면역자극제가 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 면역자극제는 박테리아 독소, 특히 홀로톡신 (holotoxin) (완전 분자) 형태의 콜레라 독소 (CT) 또는 B 사슬 단독 (CBT) 및 대장균 (E. coli)의 이열성 장독소 (LT)를 포함한다. 천연 LT에 비해 활성 형태로 덜 전환되는 변이된 LT (mLT)가 WO 96/06627, WO 93/13202 및 US 5,182,109에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 조성물은 예를들어 임의의 공급원으로부터의 무독화된 지질 A 및 지질 A의 무독성 유도체, 사포닌 및 TH1 타입 반응을 자극할 수 있는 기타 시약을 포함하나 이에 제한되지 않는 애쥬번트 또는 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다.
장내세균 지질다당류 (LPS)가 면역계의 효능있는 자극제임이 예전부터 공지되어 왔으나, 애쥬번트로서의 이의 용도는 이의 독성 효과로 인해 제한되어 왔다. 중심 탄수화물기 및 환원말단 글루코사민으로부터의 포스페이트가 제거되어 생성된 LPS의 비독성 유도체인 모노포스포릴 지질 A (MPL)은 문헌[Ribi et al (1986, Immunology and lmmunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)]에 기술되어 있고, 하기 구조를 지닌다:
Figure 112007066733916-PCT00001
MPL의 추가의 무독화된 형태는 이당류 백본의 3-위치로부터의 아실 사슬의 제거에 의해 생성되고, 이는 3-O-데아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)로 언급된다. 이는 GB 2122204B에 교시된 방법에 의해 정제되고 제조될 수 있고, 이러한 참조는 또한 디포스포릴 지질 A, 및 이의 3-O-데아실화된 변이체의 제법일 기술한다.
3D-MPL의 적절한 형태는 0.2μm 미만의 직경의 작은 입자 크기를 지니는 에멀젼의 형태이고, 이의 제조 방법은 WO 94/21292에 기술되어 있다. 모노포스포릴 지질 A 및 계면활성제를 포함하는 수성 조성물이 WO9843670A2에 기술되어 있다.
본 발명의 조성물에 제형화되는 박테리아 지질다당류에 의해 유래된 애쥬번트는 박테리아 공급원으로부터 정제되고 가공될 수 있거나, 대안적으로 이들은 합성될 수 있다. 예를들어, 정제된 모노포스포릴 지질 A는 문헌[Ribi et al 1986 (상기)]에 기술되어 있고, 살모넬라종으로부터 유래된 3-O-데아실화된 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A는 GB 2220211 및 US 4912094에 기술되어 있다. 기타 정제되고 합성된 지질다당류는 문헌[Hilgers et al., 1986, Int.Arch.Allergy.lmmunol., 79(4):392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6; and EP 0 549 074 B1]에 기술되어 있다. 특히 적합한 박테리아 지질다당류 애쥬번트는 3D-MPL이다.
따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 LPS 유도체는 LPS 또는 MPL 또는 3D-MPL의 구조와 유사한 구조인 면역자극제들이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, LPS 유도체는 MPL의 상기 구조의 하위부분인 아실화된 단당류일 수 있다.
지질 A의 합성 유도체는 또한 하기의 화합물을 포함하는 것으로 공지되어 있으나, 이에 제한되지는 않는다:
OM 174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트), (WO 95/14026)
OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트) (WO99/64301 및 WO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트) (WO 01/46127)
경구용 애쥬번트로서의 정제된 사포닌이 WO 98/56415에 기술되어 있다. 사포닌 및 모노포스포릴 지질 A는 단독으로 사용될 수 있거나 배합하여 사용될 수 있고 (예를들어, WO 94/00153), 기타 작용제와 함께 애쥬번트 시스템으로 제형화될 수 있다. 3D-MPL은 리비 이뮤노켐 (Ribi Immunochem, Montana)에 의해 제조된 널리 공지된 애쥬번트로, 이의 제법은 GB 2122204에 기술되어 있다.
본 발명에 사용하기 위한 또 다른 바람직한 면역자극제는 Quil A 사포닌 및 이의 유도체이다. 사포닌은 문헌[Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)]에 교시되어 있다. 사포닌은 식물 및 해양 동물계에 널리 분포하는 스테로이드 또는 트리테르펜 글리코시드이다. 사포닌은 진탕시 거품을 일으키고 콜레스테롤을 침전시키는 수중 콜로이드 용액을 형성시키는 것을 주의해야 한다. 사포닌이 세포막 근처에 존재하는 경우, 이는 막에 기공 유사 구조를 생성시켜 상기 막을 파열시킨다. 적혈구의 용혈이 이러한 현상의 예로, 이는 사포닌의 특정한 특성이나, 이러한 특성이 사포닌의 모든 특성은 아니다.
사포닌은 전신 투여용 백신에서 애쥬번트로 공지되어 있다. 개별적 사포닌의 애쥬번트 및 용혈 활성은 당 분야에서 광범위하게 연구되어 있다 (Lacaille-Dubois and Wagner, 상기). 예를들어, Quil A (남아메리카의 나무인 퀼라자 사포나리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)의 나무껍질로부터 유래됨), 이의 분획은 US 5,057,540 및 문헌["Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; and EP 0 362 279 B1]에 기술되어 있다. Quil A의 분획을 포함하는 면역자극복합체 (ISCOM)로 명명된 미립자 구조는 용혈성이고, 백신의 제조에 사용되어 왔다 (Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17 (Quil A의 HPLC 정제된 분획)은 효능있는 전신 애쥬번트로 기재되어 있고, 이의 생성 방법은 미국 특허 제 5,057,540호 및 EP 0 362 279 B1에 기술되어 있다. QS-21은 CD8+ 세포독성 T 세포 (CTL), Th1 세포 및 우세한 IgG2a 항체 반응을 유도하는 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유래된 천연 사포닌이고, 본 발명의 상황에서 적절한 사포닌이다. 전신 백신화 연구에서 사용된 기타 사포닌은 다른 식물종, 예를들어 집소필라 (Gypsophila) 및 사포나리아 (Saponaria)로부터 유래된 것을 포함한다 (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).
향상된 시스템은 비독성 지질 A 유도체와 사포닌 유도체의 배합물, 특히 WO 94/00153에 기술된 바와 같은 QS21과 3D-MPL의 배합물을 포함하거나, WO 96/33739에 기술된 바와 같이 QS21이 콜레스테롤로 켄칭된 덜 반응성인 조성물을 포함한다. 본 발명의 일부를 형성하는 사포닌은 미셀 (micelle)의 형태로 분리될 수 있거나, 콜레스테롤 또는 지질과 함께 제형화되는 경우 ISCOM (EP 0 109 942 B1) 또는 리포솜과 같은 거대한 정돈된 구조의 형태, 또는 수중유 에멀젼 (WO 95/17210)의 형태일 수 있다. 사포닌은 적절하게는 금속염, 예를들어 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄과 회합될 수 있다 (WO 98/15287).
수중유 에멀젼 내에 QS21 및 3D-MPL을 포함하는 특히 효능있는 애쥬번트 조성물은 WO 95/17210, WO 99/11241 및 WO 99/12565에 기술되어 있고, 이들은 적합한 조성물이다.
경구 면역화를 위한 비히클 및 애쥬번트의 일반적인 논의는 문헌[Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995]에서 발견될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 예를들어 착향제 (특히 경구용 백신) 및 정균제를 포함하는 추가 성분을 함유할 수 있다.
한 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 액체 조성물은 베이비 로셋-라이스 분석 (기본 로셋-라이스 시험으로부터 실시예 Ⅲ.2.2에서 상세하게 적합화됨)에 의해 측정시 6 내지 23분의 제산 능력을 지닌다. 본 발명에 따르면, '제산 능력'은 시험중인 제형의 pH가 실시예 Ⅲ.2.2에 제공된 실험 방법에 따라 측정시 4를 초과하여 유지되는 기간 동안의 분으로 표현된 시간을 의미한다. 적절하게는, 제산 능력은 12 내지 20분일 것이다. 23분 보다 높은, 예를들어 29 내지 30분의 제산 능력이 또한 백신 개발 전망으로부터 완전하게 허용되나, 이러한 높은 능력은 불필요하다. 특히, 8분 이상, 10분 이상, 12분 이상의 제산 능력이 특히 고려된다. 12분 이상, 13분 이상, 14분 이상, 15분 이상, 16분 이상의 제산 능력이 적합하다. 3시간 동안 음식을 섭취하지 않은 유아의 위는 매우 산성이고, 로타바이러스가 이러한 산성 pH에 의해 부정적으로 영향을 받는다는 사실이 공지되어 있다. 본 발명자들의 작업에서, 요망되는 적은 부피의 제형으로 작업하는 경우, 포스페이트 용해도가 용이하게 초과되고 제형화 및/또는 단기간의 보관 동안 성분의 결정화가 발생하므로, 고전적인 포스페이트 함유 제형의 제산 능력을 측정하는 것이 불가능하였다. 대조적으로, 청구된 조성물은 놀랍게도 조건에 맞으면서, 포스페이트를 함유하는 기존의 제형에 비해 보다 소량의 투여량에서도 보다 높은 제산 능력을 나타내었다.
또 다른 특정 구체예에서, 액체 면역원성 조성물은 하기 조건중 하나 이상에서 안정적이다: 37에서 7일, 4℃에서 1년, 4℃에서 18개월, 4℃에서 2년. 본 발명에 따르면, 제공된 조성물의 안정성은 제공된 온도에서 규정된 기간 동안 제형을 보관한 후, 실시예 Ⅲ.1에 기술된 방법에 따라 바이러스 역가 (즉, 바이러스 안정성)을 측정함으로써 평가된다. 조성물의 안정성은 예를들어 37℃에서 1주 동안 제형을 보관한 후 가속화된 안정성 시험에 의해 평가될 수 있다. 조성물의 안정성은 대안적으로 냉동장치 온도 (2 내지 7℃, 통상적으로 4℃) 또는 실온 (20-22℃)에서 장기간, 예를들어 수개월에 걸쳐 평가될 수 있다. 이러한 조건하에서, 안정한 조성물은 규정된 시험 조건에서 log10 ffu/용량으로 표현시 1의 최대 로타바이러스 역가 손실을 지니는 것이다. 특히 적절한 조성물은 1주 동안의 37℃에서의 가속화된 안정성 시험시 최대 0.5 log10, 예를들어 0.4 이하, 0.3 이하, 0.2 이하 또는 적절하게는 0.1 log10 ffu/백신 용량이 손실된 것이다.
대안적으로, 본원에 청구된 액체 면역원성 조성물은 동결되고 -20℃ 이하, 또는 -70℃에서 수년 동안 동결 보관될 수 있고, 해동후 1년 이상 동안 4℃에서 안정적일 수 있다. 통상적으로, 동결된 제형은 6개월 이상, 12개월 이상, 18개월 이상, 2년 이상, 또는 3년 이상 동안 안정적일 것이고, 해동후 1년 이상, 적절하게는 18개월 또는 2년 동안 4℃에서 안정적일 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 면역원성 조성물, 예를들어 백신이다. 예를들어, 청구된 면역원성 조성물은 통상적으로 1 또는 2개월 간격의 1회, 적절하게는 2회의 투여후에 면역 반응, 예를들어 우수한 백신 흡수 및 혈청 로타바이러스 특이적 IgA 반응을 유도할 수 있다. '백신 흡수'는 임의의 용변 샘플에서 혈청학적 반응, 예를들어 면역화후 혈청에서의 20 U/ml 이상의 역가의 로타바이러스에 대한 혈청 IgA의 출현 (ELISA), 및/또는 로타바이러스 쉐딩 (shedding) (ELISA)을 나타내는 피검체의 백분율로 정의된다. 백신 흡수는 첫번째 투여와 두번째 투여 후 1 내지 2개월 사이에 수집된 임의의 용변 샘플에서의 백신 바이러스 쉐딩으로 정의될 수 있다. 한 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 백신은 위약에 비해 임의의, 바람직하게는 중증의 로타바이러스 위장염의 발병을 감소시킬 수 있다. 통상적으로, 백신은 백신에 존재하는 것이 아닌 순환 균주에 대해 교차 보호를 부여할 수 있다. 통상적으로, 백신이 G1 타입 균주, 예를들어 약독된 인간 바이러스 P43의 균주를 함유하는 경우, 면역 반응은 G1; 및 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 비-G1 혈청형중 하나 이상에 대해 유도된다. 적절하게는, G1 균주를 함유하는 백신은 G1 및 비-G1 균주, 예를들어 G2, G3 및/또는 G4 균주 둘 모두, 특히 전세계적으로 발생하는 G9 혈청형에 대한 보호를 부여할 수 있다.
한 특정 구체예에서, 위장염 또는 중증 위장염은 청구된 조성물에 함유된 상이한 혈청형의 로타바이러스 균주에 의해 야기된다. 특히, 청구된 조성물에 존재하는 로타바이러스 균주가 G1 혈청형, 예를들어 비제한적인 약독된 인간 생 로타바이러스 균주 HRV P43 (ECACC 99081301)인 경우, G1 혈청형의 로타바이러스 균주 및 비-G1 혈청형의 로타바이러스 균주, 예를들어 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14로 구성된 목록으로부터 선택된 혈청형을 지니는 로타바이러스 균주에 의해 야기된 위장염 또는 중증 위장염에 대한 예방이 부여된다. 한 특정 구체예에서, 본원에 청구된 면역원성 조성물은 G2, G3, G4 및 G9의 비-G1 혈청형중 하나 이상, 적절하게는 이의 모든 혈청형에 의해 야기된 위장염 또는 중증 위장염에 대한 면역 반응을 유도하고/하거나 이에 대한 보호를 제공할 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 청구된 조성물에 존재하는 로타바이러스 균주가 P[8] 로타바이러스 타입, 비제한적인 예로 약독된 인간 생 로타바이러스 균주 HRV P43 (ECACC 99081301)인 경우, P[8] 타입의 로타바이러스 균주 및 비-P[8] 타입, 예를들어 P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P9 및 P11 타입으로 구성된 목록으로부터 선택된 혈청형을 지니는 로타바이러스 균주에 의해 야기된 위장염 또는 중증 위장염에 대한 예방이 부여된다. 특히, 본원에 청구된 면역원성 조성물은 P4 및 P6의 비-P[8] 타입중 하나 이상, 적절하게는 모든 타입에 의해 야기된 위장염 또는 중증 위장염에 대한 면역 반응을 유도하고/하거나 이에 대한 보호를 제공할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 청구된 조성물은 투여된 조성물에 존재하는 다양한 G 타입 및 다양한 P 타입의 로타바이러스 균주에 의해 야기된 위장염 또는 중증 위장염에 대한 면역 반응을 유도하고/하거나 이에 대한 보호를 제공할 수 있다. 특히, 청구된 조성물은 G1P[8] 로타바이러스 균주를 포함하고, 이는 또한 G2P[4] 로타바이러스 균주에 의해 야기된 위장염 또는 중증 위장염에 대한 면역 반응을 유도하고/하거나 이에 대한 보호를 제공할 수 있다.
적절하게는, 본 발명에 따른 조성물은 경구 투여로 투여된다. 적절하게는, 조성물은 유아에게 전달하기에 적합한 단일 투여 장치, 예를들어 유리 또는 플라스틱 바이얼 또는 주사기로 공급된다.
본 발명의 백신은 통상적인 백신 접종자의 유의한 해로운 부작용이 없이 로타바이러스 감염에 대한 효과적인 보호를 제공하기 위해 적절한 양의 생 바이러스를 이용하여, 공지된 기술에 의해 제형화되고 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 로타바이러스 항원, 당 및 카르복실레이트와 약학적으로 허용되는 희석제를 혼합하는 것을 포함하여, 본원에 기술된 액체 로타바이러스 제형 또는 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
생 바이러스의 적절한 양은 보통 용량당 104 내지 107 ffu일 것이다. 백신의 통상적인 양은 용량당 105 내지 106 ffu를 포함할 수 있고, 2개월 간격으로 2회 투여되는 바와 같이 어떠한 기간에 걸쳐 수회 투여로 제공될 수 있다. 로타바이러스 역가는 CCID50으로 표현될 수 있고, 106.0의 CCOD50이 용량당 105.5의 ffu와 동등한 것으로 본 발명의 문맥에서 추정될 수 있다. 그러나, 특히 개발도상국에서는 2회 이상의 투여, 예를들어 3 또는 4회의 투여 요법이 이로울 수 있다. 적합하게는, 첫번째 투여는 4주 내지 14 또는 15주의 연령, 적절하게는 6 내지 14주의 연령의 유아에 제공될 수 있다. 투여 간격은 4주 이상일 수 있으나, 예를들어 두번째 투여까지 2개월 이상 또는 이하일 수 있고, 적절한 경우 임의의 이후의 투여가 국소적 면역화 스케줄에 따라 이전의 투여 후 1개월 또는 3개월 후에 제공될 수 있다. 단일 투여 또는 다중 투여 요법을 위한 생 바이러스의 최적량, 및 상기 투여를 위한 최적의 시기는 피검체의 항체 역가 및 기타 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다.
통상적으로, 본 발명에 따른 백신의 투여량은 일반적으로 2.5 ml 이하, 통상적으로 0.5 ml 내지 2.5 ml일 것이다. 본 발명의 한 특정 양태에서, 적절한 백신 용량은 유아 또는 아동에 경구 투여하기에 적합한, 보통 1.5 ml 또는 적절하게는 2.5 ml 보다 적은 임의의 부피, 예를들어 2 ml 이하의 부피일 것이다. 특히, 투여량은 제형의 기술적 실현성이 가능하고, 제형의 면역원성 잠재성에 유해한 효과가 없는 양일 것이다. 청구된 조성물은 기존의 포스페이트 함유 제형에 비해 보통 보다 적은 투여량, 예를들어 2.0 ml 이하, 적절하게는 1.5 ml 이하의 제형과 양립되면서, 위의 산성에 저항할 수 있고, 장기간의 저장 수명에 걸쳐 면역원성이 유지되고 안정적일 수 있는 장점을 부여한다. 통상적으로, 본 발명에 따른 백신의 투여량은 0.5 ml 내지 2.0 ml, 적절하게는 약 1.0 ml 내지 1.5 ml, 예를들어 약 1.3 ml 또는 약 1.4 ml 또는 약 1.5 ml이다. 통상적인 투여량은 또한 2 ml 이하, 예를들어 1.1 ml, 1.2 ml, 1.3 ml, 1.4 ml 또는 1.5 ml일 수 있다. 1 ml의 부피 또는 1 ml 보다 작은 부피, 예를들어 200 μl 내지 800 μl의 부피가 또한 본 발명의 범위 내로 고려된다. 경구 투여될 수 있는 액체의 부피는 또한 백신 전달 장치에 의해 부분적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 또한 기타 항원, 특히 기타 질병에 대한 보호를 위한 기타 적절한 생 바이러스, 예를들어 폴리오바이러스로부터의 항원을 함유하도록 제형화될 수 있다. 경구 투여에 적합한 추가의 활성 성분은 로타바이러스 조성물과 혼합하여 제공되거나, 대안적으로 본원에 청구된 로타바이러스 조성물과 공동 투여 (즉, 동시가 아닌 별개의 투여)될 수 있다.
청구된 조성물은 또한 의사의 진료수를 최적화시키기 위해, 기타 비경구 백신, 예를들어 DTPw 또는 DTPa 백신과 같은 소아 백신 접종자 집단에 적합한 비경구 백신 (보르데텔라 백일해 (Bordetella pertussis) - 백일해, 디프테리아, 파상풍에 대한 백신), 헤모필루스 인플루엔자 B에 의해 유도된 수막염, B형 간염, 또는 홍역, 유행성 이하선염, 풍진 (MMR)에 대한 백신, 및 폐렴연쇄구균에 대한 백신과 동시에 제공될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 액체 제형, 특히 본원에 청구된 면역원성 조성물 또는 백신의 유효량을 이를 필요로 하는 인간 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 인간, 특히 유아 또는 아동과 같은 연소한 어린이의 로타바이러스 관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 특히, 청구된 조성물은 로타바이러스 감염을 예방할 것이다. 한 특정 구체예에서, 본원에 청구된 조성물은 로타바이러스 위장염, 특히 중증 위장염에 대한 보호를 제공할 수 있다. 중증 위장염은 의료 시설에서의 입원 및/또는 수분보충 요법 (WHO 플랜 B 또는 C에 해당함)을 필요로 하는 증상, 또는 20 포인트의 베시카리 (Vesikari) 스케일 (Ruuska T and Vesikari T. Rotavirus disease in Finnish children: use of numerical scores for severity of diarrheal episodes. Scand J Infect Dis 1990, 22:259-67)중 11을 초과하는 스코어를 지니는 증상으로 정의된다.
하나의 추가 구체예에서, 본 발명은 인간의 로타바이러스 관련 질병을 치료하거나 예방하기 위한 면역원성 조성물, 예를들어 백신의 제조에서의 로타바이러스 항원, 카르복실레이트 및 당의 용도를 제공하고, 이러한 면역원성 조성물은 pH 5.0 내지 pH 8.0의 pH를 지니고, 5 mM 미만의 포스페이트를 포함한다. 특히, 로타바이러스 감염의 예방, 및/또는 위장염, 더욱 특히 중증 위장염에 대한 보호가 특히 고려된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 장중첩증을 야기하지 않고 로타바이러스 관련 질병을 치료하거나 예방하기 위한 본원에 청구된 면역원성 조성물을 제조하기 위한 약독된 인간 생 로타바이러스의 용도를 제공한다. 특히, 상기 치료 또는 예방은 1회 투여의 시점에서 4 내지 14 또는 15주의 연령 이내의 유아에 약독된 인간 생 로타바이러스 조성물의 안전하고 유효한 양을 2회 또는 이 이상의 경구 투여하는 것을 포함한다. 통상적으로, 유아는 첫번째 투여의 시점에서 6 내지 14주의 연령일 것이다. 본 발명의 문맥에서, 인간 유아는 탄생 후 4 내지 14 또는 15주의 연령의 유아를 의미하는 것으로 해석된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 로타바이러스 항원, 당, 포스페이트 및 카르복실레이트를 포함하는 액체 면역원성 조성물을 제공하고, 이러한 조성물은 약 5.0 내지 약 8.0의 pH를 지니고, 카르복실레이트는 아디페이트, 말레이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 말로네이트, 글루타레이트, 글리콜레이트, 글루코네이트, 피멜레이트, 및 이들중 두개 이상의 임의의 배합물로 구성된 목록으로부터 선택된다. 한 특정 구체예에서, 카르복실레이트는 아디페이트이다. 통상적으로, 포스페이트는 10 mM 내지 1 M의 농도로 존재할 것이다. 본 발명자들은 경구용 백신 제형의 개발과 관련되지 않았던 상기 특정 카르복실레이트가 인간 유아에 적합한 경구용 로타바이러스 백신의 개발을 위한 본 발명의 상세한 설명에 기술된 바와 같은, 안정성, 산 내성, 면역원성 및 소량의 투여량의 제형화의 요망되는 필요조건을 모두 성취하는 것을 발견하였다. 특히, 상기 카르복실레이트는 제형에서의 로타바이러스 역가에 유해한 효과를 지니지 않는다. 이러한 카르복실레이트는 포스페이트 함유 로타바이러스 제형에서 통상적인 카르복실레이트, 예를들어 숙시네이트, 글루타메이트 및 시트레이트에 대한 대안으로 적절하게 작용할 수 있다. 본원의 상기에 기술된 모든 기타 특정 구체예는 본 발명의 이러한 양태에 동등하게 적용된다. 통상적으로, 조성물의 pH 범위는 제산 능력 및 저장 수명 안정성으로 인해 본원에 기술된 바와 같다. 본 발명은 또한 상기 조성물의 제조하기 위한 방법, 상기 조성물의 용도 및 상기 조성물을 이용하여 인간 유아를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 참조로 하여 추가로 기술될 것이다:
실시예 Ⅰ - ⅰ) 첨가된 포스페이트 및 카르복실레이트의 부재하, 및 ⅱ) 첨가된 포스페이트의 부재 하의 카르복실레이트로서 시트레이트의 존재하에서의 약독된 인간 생 로타바이러스 액체 백신의 제형화
Ⅰ.1. 제형의 제조
Ⅰ.1.1. DMEM 배지의 조성 (1 리터의 DMEM 제조시):
주사용수: 0.8 리터
하기의 화합물을 연속적으로 용해시켰다:
염화나트륨: 6.40 g
염화칼륨: 0.40 g
황산마그네슘.7 H2O: 0.20 g
0.1g/L의 질산철 용액 첨가: 1.00 ml
NaH2PO4.2H2O: 0.1412 g
나트륨 피루베이트: 0.11 g
글루코오스 언하이드레 (anhydre): 4.50 g
비타민 용액 (50Ox 농축): 2.00 ml
주사용수: 1.50 ml
클로르히드릭산 (Chlorhydric acid, 농축): 0.083 ml
L-시스테인: 0.048 g
L-티로신: 0.072 g
주사용수: 2.00 ml
아미노산 용액: 20.00 ml
L-글루타민: 0.5846
염화칼슘.2H2O: 0.2649 g
중탄산나트륨: 3.70 g
주사용수: 1 리터까지 채움.
DMEM은 실시예 Ⅱ에서 상술된 5%, 6% 또는 8%의 제형으로, 이는 하기에 해당한다:
- 각각 0.059 mM, 0.071 mM 및 0.094 mM의 최종 포스페이트 농도, 및
- 각각 0.065 mM, 0.078 mM 및 0.104 mM의 최종 피루베이트 농도.
비타민 용액 (50Ox 농축):
주사용수: 80.00 L
엽산: 200.1O g
칼슘 판테노에이트: 200.10 g
염화콜린: 200.1O g
이노지톨: 350.00 g
니코틴아미드: 200.00 g
피리독신 클로르히드레이트: 200.1Og
티아민 클로르히드레이트: 200.10 g
리보플라빈: 20.002 g
주사용수: 100 리터까지 채움.
아미노산 용액:
주사용수: 144.00 L
L-아르기닌: 755.70 g
글리신: 270.1O g
L-히스티딘: 378.00 g
L-이소루신: 943.40 g
L-루신: 943.50 g
L-리신 2 HCl: 1,315.8O g
L-메티오닌: 270.00 g
L-페닐알라닌: 594.10 g
L-트레오닌: 856.30 g
L-트립토판: 144.00 g
L-세린: 377.90 g
L-발린: 842.00 g
주사용수: 180 리터까지 채움.
질산철 용액
주사용수: 1,035.000 ml
질산철.9H2O: 0.115 g
주사용수: 1.150 리터까지 채움.
Ⅰ.1.2. 첨가된 포스페이트 및 카르복실레이트의 부재하에서의 로타바이러스 제형의 제조
표 2에 나타낸 제형 60을 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g (250 ml)의 전체 스케일로 제조하였다.
제형 n°60: 143 g의 물(최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 162.5 g의 수크로오스 (50% w/w)를 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm의 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 투여량은 1.5 ml이다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제산 능력, 최초 바이러스 역가 및 바이러스 안정성의 결과를 표 2 내지 4에 나타내었다.
표 2: 1.5 ml 투여량
N° 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
60 50.0% 6% 7.82 <1 6.3 5.4 0.9
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
표 3: 1.5 ml 투여량 - 실온에서의 바이러스 안정성
n° 실온에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7 m* 8 m* 9 m* 10 m*
60 5.6 5.6 5.0 ND ND ND ND ND ND ND
* = 개월(들); ND = 결정되지 않음.
표 4: 1.5 ml 투여량 - 4℃에서의 바이러스 안정성
n° 4℃에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
T = 0 1주 37℃ 후 1 m* 4℃ 2 m* 4℃ 4 m* 4℃ 6 m* 4℃ 9 m* 4℃ 12 m* 4℃
60 6.3 5.4 6.2 5.8 6.0 5.5 ND ND
* = 개월(들); ND = 결정되지 않음.
Ⅰ.1.3. 카르복실레이트를 함유하는 로타바이러스 제형의 제조
시트르산 (존재시) 및 시트레이트염을 표 5 및 6에 예시된 비율 및 조건으로 혼합시켰다. 제형의 로타바이러스 안정성 및 제산 능력을 실시예 Ⅲ.1 및 Ⅲ.2 각각에 제공된 방법에 따라 평가하였다.
제형 110-115 및 128-130을 제조하였다. 투여량은 제형 110-115는 2.5 ml이었고, 제형 128-130은 1.5 ml이었다. 표 5에 나타낸 제형 110-115를 각각 2.5 ml (3.25 g)의 100회의 투여량에 해당하는 325 g (250 ml)의 전체 스케일로 제조하였다.
제형 110을 다음과 같이 제조하였다. 123.71 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 19.29 g의 트리-나트륨 시트레이트 (Na3시트레이트.2H2O, Mw 294) (262 mM의 최종 농도에 해당하는 양) 및 162.50 g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2 μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 단일 투여량은 2.5 ml 또는 3.25 g이다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다.
본 실시예에서, DMEM 배지는 0.059 mM의 최종 포스페이트 농도에 해당하는 6% w/w이었다.
제형 111-115를 성분의 양을 표 5에 상술된 바와 같이 적합화시킨 것을 제외하고, 제형 110에 대해 설명된 것과 유사한 방법에 따라 제조하였다. 예를들어, 제형 111을 123.73 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양), 19.07 g의 트리-나트륨 시트레이트 (Na3시트레이트.2H2O, Mw 294) (259 mM의 최종 농도에 해당함), 0.197 g의 시트르산 (Mw 192) (4 mM의 최종 농도에 해당함) 및 162.50 g의 수크로오스 (50% w/w)의 성분을 혼합시킴으로써 제조하였다. 나머지 방법을 제형 110과 같이 수행하였다.
제산 능력, 최초 바이러스 역가 및 바이러스 안정성의 결과를 표 5 내지 8에 나타내었다.
표 5: 2.5 ml 투여량
N° 시트르산 (M) Na3 시트레이트.2H2O (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
110 0 0.262 50% 6% 8.15 14 5.7 4.8 0.9
111 0.004 0.259 50% 6% 6.95 14 5.3 5.4 0
112 0.010 0.256 50% 6% 6.51 12-13 5.6 5.6 0
113 0.014 0.249 50% 6% 6.34 12 5.6 5.4 0.2
114 0.034 0.283 50% 6% 5.94 12-13 5.6 5.3 0.3
115 0.093 0.333 50% 6% 5.37 14 5.7 5.6 0.1
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
표 6에 나타낸 제형을 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g (250 ml)의 전체 스케일로 제조하였다. 제산 물질: 시트르산.1H2O (Mw 210), Na3시트레이트.2H2O (Mw 294).
제형 128을 110.89 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)과 31.78 g의 트리-나트륨 시트레이트 (Na3시트레이트.2H2O, Mw 294) (432 mM의 최종 농도에 해당함), 0.328 g의 시트르산 (시트르산.1H2O, Mw 210) (6 mM의 최종 농도에 해당함) 및 162.50 g의 수크로오스 (50% w/w)의 성분을 혼합시킴으로써 제조하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다.
멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM 배지는 0.059 mM의 최종 포스페이트 농도에 해당하는 6% w/w이었다.
제형 129 및 130을 표 6에 따라 성분의 양을 적합화시키면서 제형 128에 대해 기술된 방법과 유사하게 제조하였다. 간단히, 제형 129를 0.77 g의 시트르산 (시트르산.1H2O, Mw 210) (15 mM의 최종 농도에 해당함)과 31.36 g의 트리-나트륨 시트레이트 (426 mM의 최종 농도에 해당하는 Na3시트레이트.2H2O (Mw 294))를 혼합시킴으로써 제조하였다. 제형 130을 2.75 g의 시트르산 (시트르산.1H2O, Mw 210) (52 mM의 최종 농도에 해당함)과 34.7 g의 트리-나트륨 시트레이트 (472 mM의 최종 농도에 해당하는 Na3시트레이트.2H2O (Mw 294))를 혼합시킴으로써 제조하였다. 나머지 성분 및 비율은 표 6에 제시되어 있다.
표 6: 1.5 ml 투여량
N° 시트르산.1H2O (M) Na3시트레이트.2H2O (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
128 0.006 0.432 50.0% 6% 6.97 13 6.1 5.8 0.3
129 0.015 0.426 50.0% 6% 6.55 12 5.9 5.8 0.1
130 0.052 0.472 50.0% 6% 5.92 13 5.9 5.8 0.1
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
표 7: 1.5 ml 투여량 - 실온에서의 바이러스 안정성
n° 실온에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7 m* 8 m* 9 m* 10 m*
128 ND ND ND ND 5.4 5.1 ND ND ND ND
129 ND ND ND ND 5.4 5.0 ND ND ND ND
130 ND ND ND ND 5.6 5.0 ND ND ND ND
* = 개월(들); ND = 결정되지 않음.
표 8: 1.5 ml 투여량 - 47℃에서의 바이러스 안정성
n° 4℃에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
T=0 1주 37℃ 후 1 m* 4℃ 2 m* 4℃ 4 m* 4℃ 6 m* 4℃ 9 m* 4℃ 12 m* 4℃
128 6.1 5.8 ND ND ND 5.8 ND 5.7
129 5.9 5.8 ND ND ND 5.8 ND 5.6
130 5.9 5.8 ND ND ND 5.9 ND 5.4
* = 개월(들); ND = 결정되지 않음.
Ⅰ.2 로타바이러스 안정성 및 제산 능력 - 결과
다양한 시점에서 로타바이러스 바이러스 적정을 실시예 Ⅲ.1에 제공된 방법에 따라 평가하고, 제형의 제산 능력을 실시예 Ⅲ.2에 제공된 프로토콜에 따라 평가하였다. 결과를 표 2 내지 8에 나타내었다.
카르복실레이트 및 첨가된 포스페이트가 결여된 대조군 제형 60에 대한 pH는 제산 능력을 지니지 않았고, 또한 바이러스 안정성에 대해 pH 8.0의 상한에 근접한 pH를 나타내었다.
표 5 내지 8에 시험된 모든 실험 제형에서, pH는 8.0을 초과하는 pH를 나타낸 제형 110을 제외하고는 약 5.0 내지 7.0의 범위로 유지되었다. 바이러스 역가 및 바이러스 손실 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 액체 제형에서의 로타바이러스 안정성은 이러한 제형의 pH와 관련된다. 약 pH 5.4 (즉, 제형 115) 내지 pH 7.0 (즉, 제형 111 및 128)의 범위에서, 37℃에서 7일 후의 바이러스 손실은 낮은 수준 (즉 0.5 log 미만)으로 유지되었고, 이는 제형 110에서 수득된 결과 (pH >8, 0.9 log의 바이러스 역가 손실)와 대조적이다.
또한, 제형 111-115 및 128-130은 베이비 로셋-라이스 분석으로 측정시 제형 110과 유사한 제산 능력을 나타내었다 (실시예 Ⅲ.2.2 참조). 이러한 제산 능력은 2.5 ml 뿐만 아니라 1.5 ml의 투여량에 대해 8분의 제형의 하한을 초과하였고, 실제로 최소 12분에 도달하였으므로, 매우 만족스러운 것으로 간주되었다.
대안적 카르복실레이트를 또한 시험하였는데, 이는 비교적 소량의 카르복실레이트가 요망되는 경우, 예를들어 매우 적은 투여량으로 작업하는 경우 이들이 기술적으로 실현 가능한 대안물일 수 있기 때문이다.
이러한 대안적 카르복실레이트를 함유하는 제형의 예를 실시예 Ⅱ 및 표 10-39에 나타내었다.
실시예 Ⅱ - 첨가된 포스페이트의 부재하에서의 대안적 카르복실레이트염을 지닌 제형
완충 능력을 생성시키기 위해 아세테이트, 말로네이트, 숙시네이트, 글루타레이트, 아디페이트 및 말레이트와 같은 카르복실레이트염을 사용하였다. 제공된 카르복실산의 pKa 및 이의 분자량에 따라서, pH 5.0 내지 pH 8.0 사이의 pH 윈도우 (window)를 지니면서 BRR 시험에 의해 측정시 8분 이상, 적절하게는 12분 이상의 목표 제산 능력을 달성시키기 위해 제형화되는 양을 찾는 것이 가능하다.
화학적으로 말하자면, "완충" 효과는 강산 (예를들어, HCl)과 약산으로부터 유래된 염 (예를들어, 나트륨 아세테이트)을 혼합시킬 때 수득된다. 완충 편평기 (plateau)의 중앙에 해당하는 pH 값은 약산의 pKa와 동일하다. 카르복실산의 pKa는 산 강도의 척도이고, 달리 말하면 화합물의 효과적인 완충 범위의 인디케이터이다.
로타바이러스는 pH 4 미만에서 신속하게 분해되므로 (C. Weiss and H.F. Clark, 1985 J. Gen. Virol.,66, 2725-2730), pH 4를 초과하는 완충 편평기, 즉 4를 초과하는 pKa를 지닌 카르복실레이트 또는 4를 초과하는 평균 pH를 지닌 디-카르복실레이트가 바람직하다. 적절한 카르복실레이트는 표 9에 제시되어 있다. 수평균 pKa값이 제공된다.
표 9: 다양한 카르복실레이트의 특성
카르복실산 MW pKa1 pKa2 pKa3 평균 pKa 독성 (LD50 경구, 래트)
시트르산* 192 6.39 4.76 3.13 4.76 3.0 g/kg
4를 초과하는 pKa를 지니는 기타 카르복실산
프로핀산* (propinic) 74 4.88 2.6 g/kg
부티르산 88 4.82
아세트산* 60 4.76 3.3 g/kg
4를 초과하는 평균 pKa를 지니는 디카르복실산
말레산 116 6.23 1.92 4.07
말론산 104 5.7 2.83 4.26 1.31 g/kg
숙신산 118 5.6 4.21 4.90 2.26 g/kg
아디프산* 146 5.4 4.43 4.91 5.7 g/kg
글루타르산 132 5.22 4.34 4.78
말산* 134 5.05 3.40 4.22 1.6 g/kg
* 5개의 카르복실산은 "식품 첨가물" 자격을 지닌다: 시트르산 E330, 아세트산 E260, 프로피온산 E280, 말산 E296 및 아디프산 E355.
네 개의 카르복실레이트 (나트륨 말레이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트 및 나트륨 아디페이트)에 대한 표준 산-염기 적정 곡선을 도 1에 도시하였다. 이는 예를들어 pH 4.0 내지 pH 7.0 사이의 유용한 제산 능력이 나트륨 아디페이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트 및 나트륨 말레이트 각각에 대해 72.50%, 68.75%, 57.70% 및 41.25%임을 나타낸다.
제형을 아세테이트, 말로네이트, 숙시네이트, 글루타레이트, 아디페이트 및 말레이트와 같은 카르복실레이트를 이용하여 제조하였다. 본 실시예에 나타낸 모든 제형을 1.5 ml 투여량으로 제조하였다.
Ⅱ.1. 아세테이트를 지닌 제형
Ⅱ.1.1. 표 10에 나타낸 제형을 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g의 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 아세트산 (Mw 60), NaOH (Mw 40).
제형 36: 148.84 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기에 충분한 양)에 10.66 g의 NaOH, pH 7.16을 맞추는 빙초산 및 130 g의 수크로오스 (40% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하든데 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 용액에 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 37 및 42: 표 10에 따라 조정된 양을 제외하고는 제형 36과 같이 제조하였다.
제형 87: 75.00 g의 물에 8.00 g의 NaOH, 15.00 g의 빙초산, 7.00의 pH에 도달하기에 충분한 1N NaOH 용액 (이 경우, 2 g의 1N NaOH가 첨가됨), 325 g의 충분량에 도달하기 위한 추가의 물 (이 경우, 43.00 g의 물이 첨가됨), 및 162.50 g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 방법은 제형 36과 같이 수행하였다.
제형 88-90에 대한 예: 양을 표 10에 언급된 바와 같이 적합화시킨 것을 제외하고는 제형 n°87과 같이 제조하였다.
제형 33-35에 대한 예: 양을 표 10에 언급된 바와 같이 적합화시키고, NaOH를 Ca(OH)2로 대체한 것을 제외하고는 제형 n°36과 같이 제조하였다. 37℃에서의 1주의 안정성 시험에 따르는데 실패하여 제형 33-35를 단기간 안정성 연구에 포함시키지 않았다. 그럼에도 불구하고, 추가의 칼슘 이온의 존재하에서의 만족스러운 결과가 아디페이트 시리즈에서 나타났다 (참조: 실시예 Ⅱ.5.4, 및 표 26).
표 10
N° NaOH (M) 아세트산 (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시 간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
36 1.07 pH 7.16까지 40% 6% 7.2/7.23° 13/14° 5.8 5.3 0.5
37 1.07 pH 7.55까지 50% 6% 7.62/7.63° 13/15° 5.8 5.4 0.4
42 1.05 pH 7.7까지 50% 6% 8.06/8.03° 15/16° 5.9 5.1 0.8
87 pH 7.0이상 1 50% 6% 7.24 13 6.2 6.1 0.1
88 pH 6.5이상 1 50% 6% 6.7 13 5.8 5.9 0
89 pH 6.0이상 1 50% 6% 6.14 12 5.9 5.5 0.4
90 pH 6.0이상 1 55% 6% 6.10 13 6.0 5.5 0.5
Ca(OH)2
33 0.540 pH 7.32까지 40% 6% 7.66 12 5.8 4.3 >1
34 0.540 pH 7.55까지 45% 6% 8.09 13 5.9 <3.8 >1
35 0.540 pH 7.35까지 50% 6% 7.76 13 6.3 <3.8 >1
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
° = 반복.
Ⅱ.1.2. 표 1에 나타낸 제형을 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 나트륨 아세테이트.3H2O (Mw 136).
제형 58에 대한 예: 113.00 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 30.00 g의 나트륨 아세테이트 3 H2O 및 162.50 g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 용액에 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 59, 66, 69 및 70: 조정된 양 (참조: 표 11)을 이용하여 제형 58과 유사하게 제조하였다.
표 11
N° Na 아세테이트.3 H2O (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
58 0.882 50% 6% 7.98 11 6.3 5.6 0.7
59 0.706 50% 6% 7.94 7 6.2 5.4 0.8
66 0.941 54% 6% 8.13/8.14° 13 5.9 5.3 0.6
69 0.753 55% 6% 8.15 8 6.0 5.3 0.7
70 1.338 50% 6% 8.23 20 6.0 5.4 0.6
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨; ° = 반복.
Ⅱ.1.3. 로타바이러스 안정성 및 제산 능력 - 결과
다양한 시점에서 로타바이러스 바이러스 적정을 실시예 Ⅲ.1에 제공된 방법에 따라 평가하고, 제형의 제산 능력을 실시예 Ⅲ.2.2에 제공된 프로토콜에 따라 평가하였다. 결과를 표 10, 11, 12 및 13에 나타내었다.
결론적으로, 액체 아세테이트 제형에서의 로타바이러스 안정성은 pH와 관련이 있다. 적절한 작용 범위는 pH 6.0 내지 7.5이다.
표 12 - 실온에서의 바이러스 안정성
n° 실온에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7 m* 8 m* 9 m* 10 m*
36 5.8 5.2 4.7
37 5.8 5.5 5.3 5.0 5.0 4.4
42 5.2 5.4 5.1
87 6.0 5.9 5.6 5.3 5.3 4.7
88 5.9 5.6
89 5.2 4.7
90 4.8 4.6
58 5.6 5.4 4.9
59 5.7 5.5 4.9
66 5.8 5.4 5.5
69 5.9 5.5 5.5
70 5.9 5.5 5.4
* = 개월(들); 공백인 칸 = 기준이 결정되지 않음.
표 13 - 4℃에서의 바이러스 안정성
n° 4℃에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
T=0 1주 37℃ 후 1 m* 4℃ 2 m* 4℃ 4 m* 4℃ 6 m* 4℃ 9 m* 4℃ 12 m* 4℃ 15 m* 4℃
36 5.8 5.3 5.8 5.8 5.6
37 5.8 5.4 5.9 5.8 5.8 5.7
42 5.9 5.1 5.9 5.7 5.7
87 6.2 6.1 6.3 6.1 6.1
88 5.8 6.0 6.0
89 5.9 5.5 5.8
90 6.0 5.5 5.7
58 6.3 5.6 6.2 5.8 6.0
59 6.2 5.4 6.2 5.7 6.0
66 5.9 5.3 5.9 5.8
69 6.0 5.3 6.0 5.9
70 6.0 5.4 6.0 5.9
* = 개월(들); 공백인 칸 = 기준이 결정되지 않음.
Ⅱ.2. 말로네이트를 지닌 제형
Ⅱ.2.1. 제형 67 (표 14 참조)을 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g의 전체 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 말론산 (Mw 104), NaOH (Mw 40).
제형 54 (표 14 참조)를 각각 1.75 ml (2.2 g)의 20회의 투여량에 해당하는 44 g의 전체 스케일 (35 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 말론산 (Mw 104), NaOH (Mw 40).
제형 n°67: 110.70 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 14.00 g의 NaOH, 18.230 g의 말론산 및 162.5 g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 n°54: 16.64 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 2.4 g의 NaOH, 3.1213 g의 말론산 및 19.5 g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
표 14
N° NaOH (M) 말론산 (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
67 1.4 0.701 50% 6% 6.53 11-12 6.0 5.7 0.3
54 1.71 0.857 44% 6% 8.36 23 °° °° °°
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨. °° 제형 54는 이의 8.0을 초과하는 최초 pH로 인해 장기간의 안정성 연구로부터 폐기하였다.
Ⅱ.2.2. 표 15에 나타낸 제형을 각각 1.75ml (2.20 g)의 147.7회의 투여량에 해당하는 325 g의 전체 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 이나트륨 말로네이트 (Mw 148).
제형 n°62: 138.50 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 23.00 g의 이나트륨 말로네이트 및 144.00 g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2 μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 용액에 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.20 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기로 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
표 15
N° Na 말로네이트 (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
62 0.601 44% 6% 8.21 12 6.1 5.0 0.9
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
Ⅱ.2.3. 로타바이러스 안정성 및 제산 능력 - 결과
결론적으로, 액체 말로네이트 제형에서의 로타바이러스 안정성은 pH와 관련되고: pH 6.5는 37℃에서의 1주 동안 우수한 안정성을 발생시킨 반면, pH 8.2에서는 0.9 log 이상의 손실이 관찰되었다.
Ⅱ.3 숙시네이트를 지닌 제형
Ⅱ.3.1. 제형 127 (표 16 참조)를 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g의 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 숙신산 (Mw 118), NaOH (Mw 40).
제형 51 (표 16 참조)을 각각 1.75 ml (2.2 g)의 20회의 투여량에 해당하는 44 g의 스케일 (35 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 숙신산 (Mw 118), NaOH (Mw 40).
제형 127: 120.16 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 9.1O g의 NaOH, 13.74 g의 숙신산 및 162.5 g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 제형화 단계는 제형 67에 대해 기술된 것과 동일하다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 51: 16.22 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 2.4 g의 NaOH, 3.5414 g의 숙신산 및 19.5 g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
표 16
N° NaOH (M) 숙신산 (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
127 0.91 0.466 50% 6% 6.33 9 5.9 5.7 0.2
51 1.71 0.857 44% 6% 7.20 >29 °° °° °°
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨. °° 제형 51는 이의 제산 능력이 너무 긴 것으로 결정되어 장기간의 안정성 연구로부터 폐기하였다.
Ⅱ.3.2. 제형 56을 표 17에 나타내고, 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g의 전체 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 이나트륨 숙시네이트 (Mw 162).
제형 56: 122.50 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 20.50 g의 이나트륨 숙시네이트 및 162.50 g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 제형화 단계는 제형 62에 대해 기술된 것과 동일하였다. 본 실시예에서, DMEM는 6% w/w이었다.
표 17
N° 이나트륨 숙시네이트 (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
56 0.506 50% 6% 8.12/8.30° 13 6.3 5.5 0.8
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨; ° = 반복.
Ⅱ.3.3. 로타바이러스 안정성 및 제산 능력 - 결과
결론적으로, 액체 숙시네이트 제형에서의 로타바이러스 안정성은 pH와 관련이 있다: pH 6.3은 37℃에서의 1주 동안 우수한 안정성을 생성시킨 반면, pH 8.1에서는 0.8 log의 손실이 관찰되었다.
Ⅱ.4. 글루타레이트를 지닌 제형
Ⅱ.4.1. 글루타레이트를 지닌 제형을 표 18에 나타내었다.
제형 65를 각각 1.5 ml (1.95 g)의 164회의 투여량에 해당하는 320.8 g 전체 스케일 (246 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 글루타르산 (Mw 132), NaOH (Mw 40). 114.1 g의 물 (최종적으로 320.8 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 9.3 g의 NaOH, 15.40 g의 글루타르산 및 162.5g의 수크로오스 (50.6% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막에 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기로 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM는 6.08% w/w이었다.
제형 50을 각각 1.75 ml (2.2 g)의 20회의 투여량에 해당하는 44 g의 전체 스케일 (35 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 글루타르산 (Mw 132), NaOH (Mw 40). 15.8 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 2.4 g의 NaOH, 3.964 g의 글루타르산 및 19.5g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 125 및 126을 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g의 전체 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 글루타르산 (Mw 132), NaOH (Mw 40).
제형 125: 100.35 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 9.10 g의 NaOH, 15.40 g의 글루타르산 및 162.5g의 수크로오스를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 제형화 단계는 제형 67을 제조하기 위해 기술된 것과 동일하였다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 126: 조정된 양 (표 18 참조)을 이용한 것을 제외하고 제형 125와 같이 제조하였다.
표 18
N° NaOH (M) 글루타르산 (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
125 0.910 0.467 50% 6% 6.17 10-11 5.8 5.7 0.1
65 0.945 0.474 50.6% 6% 6.49 11 6.0 5.6 0.4
126 0.950 0.467 50% 6% 8.13 12 6.1 5.4 0.7
50 1.71 0.858 44% 6% 8.45 >29 °° °° °°
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨. °° 제형 50는 이의 최초 pH (8.0 이상) 및 이의 제산 능력 (너무 긴 것으로 결정됨)으로 인해 장기간의 안정성 연구로부터 폐기하였다.
Ⅱ.4.2. 로타바이러스 안정성 및 제산 능력 - 결과
결론적으로, 액체 글루타레이트 제형에서의 로타바이러스 안정성은 pH와 관련이 있다: pH 6.17은 37℃에서의 1주 동안 우수한 안정성을 생성시킨 반면, pH 8.1에서는 0.7 log의 손실이 관찰되었다.
Ⅱ.5. 아디페이트를 지닌 제형
Ⅱ.5.1. 표 19에 나타낸 아디페이트 함유 제형을, 각각 1.75ml (2.2 g)의 20회의 투여량에 해당하는 44 g의 스케일 (35 ml)로 제조된 제형 n°45, 및 각각 1.5ml (1.95 g)의 164회의 투여량에 해당하는 320.8 g의 스케일 (247 ml)로 제조된 n°63을 제외하고, 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g의 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: 아디프산 (Mw 146), NaOH (Mw 40).
제형 45: 15.38 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 2.4 g의 NaOH, 4.3809 g의 아디프산 및 19.5g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm의 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6%w/w이었다.
제형 63: 112.50 g의 물 (최종적으로 320.8 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 9.3 g의 NaOH, 17.00 g의 아디프산 및 162.5g의 수크로오스를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6.08% w/w이었다.
제형 81: 116.70 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 9.28 g의 NaOH, 17.00 g의 아디프산 및 162.5g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 제형화 단계는 제형 67에 대해 기술된 것과 동일하였다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 82, 83, 91-97, 100-109, 122-124, 131-134, 136-145, 147, 148: 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 NaOH, 표 19 및 23에 기술된 양의 아디프산 및 수크로오스를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2 μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 생성된 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제산 능력 및 바이러스 안정성과 관련하여 생성된 제형의 성능을 시험하기 위해 표 19에 굵은 글씨로 나타낸 여러 파라미터를 변화시켰다.
표 19
Figure 112007066733916-PCT00002
Figure 112007066733916-PCT00003
Figure 112007066733916-PCT00004
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨; ND = 결정되지 않음; °= 반복.
°°제형 45는 제산 능력이 너무 길어 폐기하였다.
°°제형 103, 104 및 108, 109는 아디프산이 4-8℃에서 방치시 재결정화되므로 폐기하였다.
°°제형 n°107, 141 및 142는 평가시에 이미 존재하는 제형과 유사하여 폐기하였다.
°°제형 n°136-140은 최초 pH가 너무 높아 폐기하겠다.
Ⅱ.5.2. 로타바이러스 안정성 및 제산 능력 - 결과
다양한 시점에서 로타바이러스 바이러스 적정을 실시예 Ⅲ.1에 제공된 방법에 따라 평가하고, 제형의 제산 능력을 실시예 Ⅲ.2.2.에 제공된 프로토콜에 따라 평가하였다. 결과를 표 19, 20, 21 및 22에 나타내었다.
표 20 - 실온에서의 바이러스 안정성
n° 실온에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7 m* 8 m*
63 5.8 5.8 5.5 5.5 5.0
81 5.5 4.9
82 5.4 4.9
83 5.6 5.1 5.0
91 5.6 5.4 5.3 5.0
92 5.5 5.3 5.2 5.0
93 5.6 5.5 5.5 5.2 4.9
94 5.6 4.6
95 5.6 5.5 5.4 5.4 5.4 5.1
96 5.8 5.8 5.5 5.7 5.7 5.2
97 5.7 5.5 5.4 5.3 5.4 4.9
105 4.8
106 5.2 4.7
132 5.8 5.8 5.5
* = 개월(들); 공백인 칸 = 결정되지 않음.
표 21 - 4℃에서의 바이러스 안정성
n° 4℃에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
후 1 m* 2 m* 4 m* 6 m* 9 m* 12 m* 15 m*
T=0 1주 37℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃
63 6.0 5.6 6.0 5.9 6.1 6.0 5.8
81 5.9 5.7 5.6 5.4 6.0
82 5.9 5.7 5.7 5.4 5.8
83 5.9 5.8 5.8 5.7 5.9
91 6.0 5.7 5.8 5.8 5.8
92 6.0 5.7 5.9 5.9 5.8
93 6.1 5.8 5.7 6.1 5.7
94 5.9 5.8 6.1 6.2 5.8
95 6.0 5.9 5.9 5.8 5.8 5.9
96 6.1 6.0 5.7 5.9 5.9 5.8
97 5.9 5.8 5.7 5.8 5.8 5.9
105 5.8 5.5 5.9 5.7
106 6.1 6.0 6.0 5.8
132 6.1 5.8 5.8 5.8
122 6.0 5.9 5.8 5.9
123 5.8 5.7 5.9 5.8
133 5.8 5.8 6.0 5.8
134 6.3 5.8 6.0 5.7
143 6.0 5.5 5.5
144 6.1 6.0 5.4
145 6.1 5.8 5.4
* = 개월(들); 공백인 칸 = 결정되지 않음.
제형 91-94의 제산 능력을 '베이비 로셋-라이스 방법' (실시예 Ⅲ.2.2 참조)으로 평가하였고, 이는 4를 초과하는 pH에서 8, 12, 16 또는 20분에 도달하는 가능성을 나타내었다. 결과를 표 22 및 도 2A에 나타내었다.
표 22
시간 (분) 제형 94 제형 93 제형 92 제형 91
pH pH pH pH
0 6.11 6.5 6.24 6.37
1 5.11 5.07 4.93 4.79
2 5.03 4.98 4.84 4.67
3 4.96 4.9 4.75 4.56
4 4.90 4.83 4.67 4.45
5 4.85 4.76 4.58 4.34
6 4.79 4.69 4.51 4.23
7 4.74 4.62 4.42 4.12
8 4.68 4.56 4.34 4.00
9 4.63 4.49 4.26 3.86
10 4.57 4.42 4.17 3.70
11 4.51 4.36 4.08
12 4.46 4.29 3.98
13 4.40 4.22 3.87
14 4.35 4.15 3.75
15 4.29 4.07 3.6
16 4.23 3.98
17 4.17 3.88
18 4.11 3.78
19 4.05 3.66
20 3.98
21 3.91
22 3.83
23 3.75
24 3.65
결론적으로, 기타 카르복실레이트 제형에서 관찰된 바와 같이, 아디페이트 시리즈에서 높은 pH 값은 우수한 안정성 데이터를 생성시키지 않았다 (예를들어, 9.5의 pH를 지니고, 37℃에서 1주의 보관후 2.85 log를 초과하는 바이러스 손실을 나타내는 제형 124 참조).
가장 높이 허용가능한 pH 한도 값은 37℃에서 1주 후에 0.5 log의 바이러스 손실이 관찰된 약 8.0 (예를들어, 제형 143에 대해 수득된 7.96의 pH 값 참조)이다.
이러한 제형에 대해 적절한 pH 범위는 약 pH 5.5 내지 약 pH 8이고, 가장 적절한 범위는 pH 6.0 내지 pH 7.7이다.
아디페이트 (식품 첨가 물질) 제형은 적당한 양의 물질 (용량당 약 100 mg)을 이용하여 목표 제산 능력 (예를들어, t = 12분)에 도달되는 것을 가능케하는 최적 pKa 값 (pKa1 5.4 및 pKa2 4.43)과 우수하게 절충된다. 또한, 이러한 양은 가용성 파라미터와 양립되므로, 1.5 ml의 투여량으로 백신을 제형화시키는 것을 가능케 한다. 이는 기술적 실행 불능, 예를들어 포스페이트의 결정화로 인해 고전적인 시트레이트 포스페이트 제형으로는 불가능하다 (참조: 비교 실시예 Ⅳ). 이들은 또한 기타 카르복실레이트와 비교하는 경우 독성 데이터가 아디페이트에 대해 다소 낮기 때문에 (래트에서의 경구 LD50: 5.7 g/kg) 독성 파라미터와도 양립된다.
Ⅱ.5.3. 바이러스 안정성에 대한 백신 용량에서의 바이러스 역가의 효과
로타바이러스 안정성에 대한 1.5 ml의 백신 용량에서의 최초 로타바이러스 역가 (106.0, 106.5, 105.2)의 효과를 측정하기 위해 하기 실험을 수행하였다.
다양한 시점에서 로타바이러스 바이러스 적정을 실시예 Ⅲ.1에 제공된 방법에 따라 평가하였고, 제형의 제산 능력을 실시예 Ⅲ.2.2에 제공된 프로토콜에 따라 평가하였다. 결과를 표 23, 24 및 25에 나타내었다.
표 23
N° NaOH (M) 아디프산 (M) 목표 바이러스 역가 log10 ffu 수크로오스 % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
100 0.928 0.466 6.0 55% 6.59 12 6.0 5.7 0.3
101 0.928 0.466 6.5 55% 6.96 12 6.7 6.5 0.2
102 0.928 0.466 5.2 55% 6.45 12 5.4 5.4 0
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
표 24: 실온에서의 바이러스 안정성
N° 실온에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7 m* 8 m* 9 m* 10 m*
100 5.4 5.0
101 6.0 5.5
102 4.9 4.4
* = 개월(들); 공백인 칸 = 결정되지 않음.
표 25: 4℃에서의 바이러스 안정성
N° t=0에서의 바이러스 역가 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 6 m* 12 m*
100 6.0 5.7 6.0 5.8
101 6.7 6.5 6.6 6.4
102 5.4 5.4 5.3 5.2
* = 개월(들); 공백인 칸 = 결정되지 않음.
결론적으로, 측정된 범위에서, 로타바이러스 안정성은 최초 바이러스 역가가 무엇이든지 간에 유사하고 허용되었다.
Ⅱ.5.4. 칼슘 이온의 존재하에서의 아디페이트를 지니는 제형
칼슘은 딕티오스텔리움 디스코이듐 (Dictyostelium discoideum)에서 발현된 로타바이러스 SA11 당단백질 VP7의 안정성 및 형태에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되어 있다 (K.R. Emslie et al., 1996, Journal of Biotechnology 50, 149-159). 칼슘은 제형 내의 로타바이러스의 안정성에 기여할 수 있으므로, 이를 본 발명의 아디페이트 로타바이러스 액체 제형에 첨가하는 것이 이로울 수 있다. 따라서, 다양한 양의 칼슘 이온을 아디페이트 제형에서 시험하였다 (표 26). 두개의 대안물인 CaCl2 및 Ca(OH)2를 시험하였다.
제형 98, 116-118: 9.28 g의 NaOH에 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양), 17.00 g의 아디프산, 표 26에 특정된 CaCl2 (침전이 발생하나, 제형 n°117을 제외하고는 실온에서 1시간의 교반 후에 이러한 침전은 재용해됨), 및 178.75 g의 수크로오스를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 제형화 단계는 제형 82에 대해 기술된 것과 동일하였다. 이 제형에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 99: 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 표 26에 특정된 Ca(OH)2, 17.00 g의 아디프산, 9.02 g의 NaOH 및 178.75 g의 수크로오스를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 제형화 단계는 제형 82에 기술된 것과 동일하였다. 이 제형에서, DMEM은 6% w/w이었다. 다양한 시점에서 로타바이러스 바이러스 적정을 실시예 Ⅲ.1에 제공된 방법에 따라 평가하였고, 제형의 제산 능력을 실시예 Ⅲ.2.2에 제공된 프로토콜에 따라 평가하였다. 결과를 표 26, 27 및 28에 나타내었다.
제형 119-121: 표 26에 특정된 CaCl2에 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양), 9.28 g의 NaOH (이 경우, Ca(OH)2의 침전이 발생하나, 제형 n°121을 제외하고는 이러한 침전은 아디프산 첨가 후에 재용해됨), 17.00 g의 아디프산 및 178.75 g의 수크로오스를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 제형화 단계는 제형 82에 대해 기술된 것과 동일하였다. 이 제형에서, DMEM은 6% w/w이었다.
표 26
N° NaOH (M) 아디프산 (M) CaCl2 (M) 수크로오스 % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
98 0.928 0.466 0.013 55% 6.59 12-13 6 5.8 0.2
118 0.928 0.466 0.004 55% 6.96 12 6.1 5.8 0.3
116 0.928 0.466 0.0129 55% 6.45 12 5.9 5.8 0.1
119 0.928 0.466 0.0132 55% 6.36 12 5.9 6 0
117 0.928 0.466 0.018 55% °° °° °° °° °°
120 0.928 0.466 0.019 55% 6.18 11-12 6 5.8 0.2
121 0.928 0.466 0.051 55% °° °° °° °° °°
Ca(OH)2 (M)
99 0.902 0.466 0.0086 55% 6.54 13-14 5.8 5.7 0.1
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
°°제형 117 및 121은 이들의 제조 동안 몇몇 불용성 물질의 침전물이 발생하여 폐기하였다.
표 27: 실온에서의 바이러스 안정성
N° 실온에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7 m* 8 m* 9 m* 10 m*
98 5.5 5.7 5.5 5.2
118 6.0 5.7 5.0
116 5.9 5.6 5.1
119 5.8 5.3
120 5.7 5.1
99 5.4 5.4 5.2 4.9
* = 개월(들); 공백인 칸 = 결정되지 않음.
표 28: 4℃에서의 바이러스 안정성
N° t=0에서 의 바이러스 역가 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 6 m* 12 m*
98 6 5.8 5.8 6.0
118 6.1 5.8 6.2 6.1
116 5.9 5.8 5.9 6.1
119 5.9 6 5.9 5.9
120 6 5.8 5.9 5.9
99 5.8 5.7 5.9 5.9
* = 개월(들); 공백인 칸 = 결정되지 않음.
결론: 칼슘 이온의 존재하에서의 로타바이러스의 안정성은 다음과 같았다: 37℃에서의 1주 후에 0.3 log를 초과하지 않는 손실이 발생하였고, 이는 첨가된 칼슘 이온을 제외하고는 동일한 성분을 함유하고, 동일한 조건하에서 제조된 제형에서 수득된 결과와 유사하다 (예를들어, 표 19-21의 제형 83 참조).
Ⅱ.5.5. 구강 폴리오 바이러스의 존재하에서 아디페이트를 지닌 제형
몇몇 통상적인 면역화 계획은 동일한 시점에서 경구 폴리오 및 로타바이러스 백신화와 관련될 수 있다. 하기 실험의 목적은 둘 모두의 백신화가 양립될 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 것이다. 따라서, 실험용 경구 폴리오/로타바이러스 배합 백신을 제조하였다.
제형 149, 151-155에 사용된 OPV 배지의 조성
주사용수: 80.00L
락트알부민 가수분해물: 1500.0Og
주사용수: 200.00L
염화나트륨: 2040.0Og
염화칼륨: 120.0Og
황산마그네슘 7.H2O: 30.0Og
KH2PO4: 38.0Og
글루코오스 안히드레 (Glucose anhydre): 1200.0Og
네오마이신 설페이트: 15.0Og
Tween 80: 6.0Og
염화칼슘.2H2O: 80.0Og
수산화나트륨: 30.0Og
중탄산나트륨: 660.0Og
페놀 레드: 6.0Og
L-시스테인: 30.0Og
염산 1 N: 550.0Og
폴리믹시크신 (Polymixixine) B 설페이트: 30.0Og
주사용수로 300.0OL까지 채움.
제형 149-155: 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 표 29에 기술된 양의 NaOH 및 아디프산, 및 178.75g의 수크로오스를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2 μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 표 29에 기술된 양에 따라, 용량당 106.5 CCID50을 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 DMEM 배지 및 용량당 106.6의 타입 Ⅰ, 105.6의 타입 Ⅱ, 106.1의 타입 Ⅲ의 CCID50을 수득하기 위해 필요한 양의 폴리오 바이러스를 함유하는 OPV 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 생성된 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w, 수크로오스는 55% w/w, NaOH는 0.92M, 아디프산은 0.466M이었다.
표 29
NaOH 아디프산 물 로타바이러스 배지 DMEM 로타바이러스 OPV 배지 OPV 타입 Ⅰ OPV 타입 Ⅱ OPV 타입 Ⅲ
g g g g g g g g g
149 9.2 17 92.55 19.5 - 8.00 - - -
150 9.2 17 100.55 14.24 5.26 - - - -
151 9.2 17 92.55 14.24 5.26 8.00 - - -
152 9.2 17 92.55 19.5 - 0.07 5.30 0.53 2.10
153 9.2 17 92.55 19.5 - 2.70 5.30 - -
154 9.2 17 92.55 19.5 - 7.47 - 0.53 -
155 9.2 17 92.55 19.5 - 5.90 - - 2.10
다양한 시점에서 로타바이러스 바이러스 적정을 실시예 Ⅲ.1에 제공된 방법에 따라 평가하였고, 제형의 제산 능력을 실시예 Ⅲ.2.2에 제공된 프로토콜에 따라 평가하였다. 결과를 표 30에 나타내었다.
표 30 (본 표에서: 모든 바이러스 역가는 CCID50/용량이다**)
BRR* 분 목표 로타바이러스 목표 OPV 타입 Ⅰ 목표 OPV 타입 Ⅱ 목표 OPV 타입 Ⅲ t=0 4℃에서의 로타바이러스 역가 1주 37℃ 후의 로타바이러스 역가 OPV Ⅰ 역가 OPV Ⅱ 역가 OPV Ⅲ 역가
149 12 no no no no
150 106.5 no no no 106.2 106.2
151 106.5 no no no 106.3 106.3
152 no 106.6 105.6 106.1 106.7 105.6 106.2
153 no 106.6 no no
154 no no 105.6 no
155 no no no 106.1
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
** ffu와 CCID50 사이의 대응은 약 0.5 log로 평가될 수 있다 (예를들어, CCID50으로 표현된 106.0은 용량당 ffu로 표현시 대략 105.5와 동등하다).
공백인 칸 = 결정되지 않음.
"no"은 상응하는 바이러스가 상기 식에 포함되지 않음을 의미한다.
결론:
1) 폴리오 배지는 제산 능력 (제형 n°149에서의 BRR 12 분)과 양립된다.
2) 폴리오 배지는 로타바이러스와 양립된다 (제형 n°150와 제형 n°151을 비교시, t=0 4℃에서 및 37℃에서 1주 후 둘 모두가 상기 두 제형에 대해 동일한 역가가 수득되는 것이 관찰된다).
3) 로타바이러스 조성물은 폴리오바이러스 (제형 n°152에서 수득된 예상 폴리오 바이러스 역가)와 양립된다.
Ⅱ.5.6. 동결 후의 아디페이트 제형의 안정성
Ⅱ.5.6.1. -20℃에서의 동결
+4℃ 내지 +8℃에서의 보관 6개월 후의 로타바이러스 제형 n°95를 다음과 같은 시기 (표 31)에 따라 3회의 연속적인 동결 (-20℃)에 적용시켰다.
Ⅱ.5.6.2. -70℃에서의 동결
+4℃ 내지 +8℃에서의 보관 14개월 후의 로타바이러스 제형 n°95를 다음과 같은 시기 (표 31)에 따라 -70℃에서 1회 동결시켰다.
표 31
-20℃에서의 지속 기간 T = +4℃ T = -20℃ T = -70℃
t = 0 (4-8℃에서 6개월 후) 9 바이얼
t = 120일 -20으로부터 회수: 9 바이얼
t = 120일 3 바이얼: 1 x -20℃ 6 바이얼
t = 196일 -20으로부터 회수: 6 바이얼
t = 197일 3 바이얼: 2 x -20℃ 3 바이얼
t = 224일 -20으로부터 회수: 3 바이얼: 3 x -20℃
-70℃에서의 지속 기간
t = 0 (4-8℃에서 14개월 후) 3 바이얼
t = 15일 -70으로부터 회수: 3 바이얼 1 x -70℃
샘플을 분석하고, t = 0 (4℃)에서 바이러스 역가 및 보통의 냉동장치 온도에서 보관된 동일한 연대 (이 경우 +4℃에서 15개월)의 샘플의 바이러스 역가와 비교하였다. 결과를 표 32에 나타내었다.
표 32
t=0, 4℃ t=15 개월, 4℃
N°95 6.0 5.9
N°95 1x-20℃ 5.8
N°95 2x-20℃ 5.9
N°95 3x-20℃ 5.9
N°95 1x-70℃ 5.9
결론적으로, 제형 n°95 (아디페이트 제형)의 조성물은 -20℃에서의 3회 이상의 연속적인 동결과 양립된다. 이는 또한 -70℃에서의 1회 이상의 동결과 양립된다.
Ⅱ.6. 카르복실레이트로서 말레이트를 지닌 제형
Ⅱ.6.1. 표 33에 나타낸 제형 (제형 46, 64, 84, 85 및 86 제외)을 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g의 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: D,L-말산 (Mw 146), NaOH (Mw 40).
제형 n°46을 각각 1.75 ml (2.2 g)의 20회의 투여량에 해당하는 44g의 스케일 (35 ml)로 제조하였다. 제산 물질: D,L-말산 (Mw 146), NaOH (Mw 40).
제형 46: 15.74 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 2.4 g의 NaOH, 4.0211 g의 말산 및 19.5g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 n°64를 각각 1.5 ml (1.95 g)의 163회의 투여량에 해당하는 318.4g의 스케일 (244.5 ml)로 제조하였다. 제산 물질: D,L-말산 (Mw 146), NaOH (Mw 40).
제형 n°84를 각각 1.5 ml (1.95 g)의 66.6회의 투여량에 해당하는 13Og의 스케일 (100ml)으로 제조하였다. 제산 물질: D-말산 (Mw 146), NaOH (Mw 40).
제형 n°85를 각각 1.5 ml (1.95 g)의 66.6회의 투여량에 해당하는 13Og의 스케일 (100ml)로 제조하였다. 제산 물질: L-말산 (Mw 146), NaOH (Mw 40).
제형 n°86을 각각 1.5 ml (1.95 g)의 66.6회의 투여량에 해당하는 13Og의 스케일 (100 ml)로 제조하였다. 제산 물질: D,L-말산 (Mw 146), NaOH (Mw 40).
제형 64: 97.3 g의 물 (최종적으로 318.4g을 제조하기 위해 결정된 양)에 14.6 g의 NaOH, 24.50 의 말산 및 162.5g의 수크로오스 (51% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6.12% w/w이었다.
제형 71: 103.9 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 14.90 g의 NaOH, 25.00 g의 아디프산 및 162.5g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 제형화 단계는 제형 67에 대해 기술된 것과 동일하였다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 72-77, 84-86: 조정된 양 (표 33 참조)으로 제형 71과 같이 제조하였다.
제형 78: 75.00 g의 물에 8.00 g의 NaOH, 25.00 g의 말산, 6.48의 pH를 만들기에 충분한 1 N NaOH 용액, 325 g을 채우기 위한 추가의 물 및 162.50 g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 나머지 제형화 단계는 제형 67에 대해 기술된 것과 동일하였다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 79 및 80: 조정된 양 (표 33 참조)으로 제형 78과 같이 제조하였다.
표 33
N° NaOH (M) 말산 (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
46 1.71 0.787 44% 6% 6.92 20 6.0 5.9 0.1
64 1.490 0.747 51% 6.12% 6.08 11-12 6.0 5.9 0.1
71 1.490 0.746 50% 6% 5.67 11 5.9 5.8 0.1
72 1.240 0.621 50% 6% 6.15/6.16° 8 5.8 5.8 0
73 2.00 0.918 50% 6% °° °° °° °° °°
74 1.490 0.746 53% 6% 5.19 8 5.8 5.8 0
75 1.490 0.746 56% 6% °° °° °° °° °°
76 1.79 0.896 47% 6% 5.21 14 5.7 5.8 0
77 1.79 0.896 44% 6% 5.35 15 5.8 5.9 0
78 pH 6.48까지 0.746 50% 6% 7.1/7.05° 9 5.9 5.6 0.3
79 pH 5.98까지 0.746 50% 6% 6.42/6.41° 9 5.9 5.5 0.4
80 pH 7.05까지 0.746 50% 6% 7.43 9-10 6.0 5.4 0.6
86 1.490 0.746 50% 6% 5.82 11 6.1 5.8 0.3
84 1.490 0.746 50% 6% 5.82 11 5.8 5.8 0
85 1.490 0.746 50% 6% 6.03 11 5.7 5.7 0
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨; ° = 반복.
°°제형 73은 용액의 높은 점성으로 인해 멸균 여과가 어려우므로 폐기하였다.
°°제형 75는 수크로오스의 낮은 용해성으로 인해 폐기하였다.
다양한 시점에서 로타바이러스 바이러스 적정을 실시예 Ⅲ.1에 제공된 방법에 따라 평가하였고, 제형의 제산 능력을 실시예 Ⅲ.2.2에 제공된 프로토콜에 따라 평가하였다. 결과를 표 33, 34 및 35에 나타내었다.
표 34: 실온에서의 바이러스 안정성
N ° 실온에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7 m* 8 m* 9 m* 10 m*
64 5.8 5.9 5.6 5.7 5.2 ND ND ND ND ND
85 ND 5.7 5.2 ND ND 4.7 ND ND ND ND
* = 개월(들); ND = 결정되지 않음.
표 35 - 4℃에서의 바이러스 안정성
N° t=0에서의 바이러스 역가 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 6 m* 12 m*
64 6.0 5.9 5.8 5.8 ND 5.8 ND 5.5
85 5.7 5.8 ND 5.8 ND ND 5.6 5.7
* = 개월(들); ND = 결정되지 않음.
Ⅱ.6.2. 로타바이러스 안정성 및 제산 능력 - 결과
액체 말레이트 제형에서의 로타바이러스 안정성은 pH와 관련이 있다. 연구된 pH의 범위, 즉 6.0 내지 7.0의 pH 범위는 37℃에서 1주 동안 우수한 안정성을 나타내었다.
Ⅱ.7. 글루타메이트를 지닌 제형
아스파테이트 및 글루타메이트는 이들의 측쇄에 카르복실레이트기를 지닌 아미노산이다. 이들 측쇄 카르복실산의 pKa 값은 각각 3.65 및 4.25이다. 따라서, 4보다 높은 pKa를 지니는 글루타메이트가 제산 능력을 확립하기 위해 완충제로 사용될 수 있다. 표 36 참조.
제형 41: 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 표 36에 기술된 양의 NaOH, 글루탐산 및 수크로오스를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2 μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 생성된 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 43: 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 7.1 g의 일나트륨 글루타메이트 1H2O 및 19.50 g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.64 g의 DMEM 배지를 용액에 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 61: 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 52.43 g의 일나트륨 글루타메이트 1H2O 및 144 g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 용액에 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 68: 물 (최종적으로 250 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 0.2 g의 일나트륨 글루타메이트 1H2O, 2.5g의 우 혈청 알부민, 0.25Og의 Na2HPO4.2H2O, 0.125g의 KH2PO4, 0.5g의 EDTA 및 18.75 g의 수크로오스 (7.5% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 역과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 용액에 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml이거나 1.5 g에 가까웠다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 7.8% w/w이었다.
다양한 시점에서 로타바이러스 바이러스 적정을 실시예 Ⅲ.1에 제공된 방법에 따라 평가하였고, 제형의 제산 능력을 실시예 Ⅲ.2.2에 제공된 프로토콜에 따라 평가하였다. 결과를 표 36, 37 및 38에 나타내었다.
표 36
N° NaOH (M) 글루탐산 (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR* pH pH >4에서의 BRR* 시간 (분) t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
41 1.06 0.542 51% 6% 10.36 15 °° °°
Na 글루타메이트 (M)
43 1.088 44% 6% 6.92 12 6.0 5.8 0.2
61 1.085 44% 6% 6.93 11-12 6.1 6.1 0
68 0.0043 7.5% 7.8% 6.85 <1 6.0 <3 >3
* 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨.
°°제형 41은 이의 최초 pH가 높아서 폐기하였다.
°°제형 68은 37℃에서의 1주 후에 수득된 불만족스러운 바이러스 손실 결과로 인해 장기간 안정성 연구에서 폐기하였다.
표 37: 실온에서의 바이러스 안정성
N° 실온에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7 m* 8 m* 9 m* 10 m*
41
43
61 6.1 5.7 5.6
68
* = 개월(들); 공백인 칸 = 결정되지 않음.
표 38: 4℃에서의 바이러스 안정성
N ° t = 0에서의 바이러스 역가 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 1 m* 2 m* 18 m*
41
43
61 6.1 6.1 6.1 6.0 5.6
68
* = 개월(들); 공백인 칸 = 결정되지 않음.
액체 글루타메이트 제형에서의 로타바이러스 안정성은 본원의 상기에 기술된 기타 카르복실레이트로 수득된 안정성과 유사하다. 요컨대:
- 안정성은 보다 염기성인 매질 (제형 n°43에서의 pH 10.36)에 비해 7 근처의 pH (제형 n°61에서의 6.93)가 보다 낫다.
- 안정성은 높은 수크로오스 백분율 (제형 n°68에서의 7.5% 수크로오스에 비해 제형 °61에서의 44% 수크로오스)이 보다 낫다.
- 37℃, 실온, 및 4-8℃에서의 1주의 안정성의 프로파일 곡선은 본원에 상기 기술된 기타 카르복실레이트와 유사하다.
Ⅱ.8. 푸마레이트를 지닌 제형
제형 44: 16.28 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 2.4 g의 NaOH, 3.4811 g의 푸마르산 및 19.5 g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 불용성 물질을 현탁된 채로 두었다. 제조물을 폐기하였다.
Ⅱ.9. 락토비오네이트를 지닌 제형
제형 47: 16.02 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 1.2 g의 NaOH, 10.7414 g의 락토비온산 및 13.7g의 수크로오스 (31% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml or 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
Ⅱ.10. 말레에이트를 지닌 제형
제형 48: 16.88 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 2.4 g의 NaOH, 2.8821 g의 말레산 무수물 및 19.5g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
제형 57: 110.3 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 32.7 g의 이나트륨 말레에이트 및 162.5g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 19.5 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.5 ml 또는 1.95 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
Ⅱ.11. 글루코로네이트를 지닌 제형
제형 49: 16.14 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 1.2 g의 NaOH, 5.8211 g의 글루쿠론산 및 18.5 g의 수크로오스 (42% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
Ⅱ.12. 갈락투로네이트를 지닌 제형
제형 52: 16.14 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 1.2 g의 NaOH, 5.8218 g의 갈락투론산 및 18.5g의 수크로오스 (42% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
Ⅱ.13. 갈락타레이트를 지닌 제형
제형 53: 15.96 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 2.4 g의 NaOH, 6.3008 g의 갈락타르산 및 17.O g의 수크로오스 (38% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반시킨 후, 불용성 물질을 현탁된 채로 두었다. 제조물을 폐기하였다.
Ⅱ.14. 타르타레이트를 지닌 제형
제형 55: 15.26 g의 물 (최종적으로 44 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 2.4 g의 NaOH, 4.4996 g의 타르타르산 및 19.5 g의 수크로오스 (44% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서, 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 2.34 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 이 경우, 용량은 1.75 ml 또는 2.2 g이었다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다.
Ⅱ.15. 첨가된 포스페이트의 부재하에서의 카르복실레이트를 함유하는 제형에 대한 종합적 결론
첨가된 포스페이트의 부재하에서 여러 카르복실레이트를 이용하여 여러 안정적인 제형을 제조하였다. 이들 실험 제형에 존재하는 포스페이트는 단지 DMEM 완충용액으로부터 유래하였고, 0.059 mM (5% w/w DMEM), 0.071 mM (6% w/w DMEM), 또는 0.094 mM (8% w/w DMEM)을 초과하지 않았다. 모든 시험된 카르복실레이트는 위의 산성을 중화시키는 완충제로서 작용하는 능력을 나타내었고, 이에 따라 제형에 존재하는 활성 성분, 즉 로타바이러스 항원의 불활성화를 예방하거나 최소화시켰다. 다양한 투여량 (즉, 1.5 ml, 2.0 ml 및 2.5 ml)으로 제조된 모든 시험된 제형은 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0의 pH, 대부분의 제형에 대해서는 약 pH 5.5 내지 약 7.5의 pH를 나타내었다. 이들 제형은 3개의 시험 보관 온도 (즉 37℃, 실온 또는 4℃)에서 안정성 시험 동안 잘 작용하였다. 또한, 3개의 제형은 BRR 시험 (실시예 Ⅲ.2.2의 방법 참조)으로 측정시 만족스러운 제산 능력, 즉 약 8분 이상, 대부분의 제형에 대해서는 12분 이상의 제산 능력을 나타내었다.
하기에서, 표 39는 제형의 pH에 따른 선택된 아디페이트 제형에 대해 수득된 안정성 데이터의 간단한 개요를 나타낸다. 하기의 기준을 측정하였다: ⅰ) 37℃에서의 1주 동안 보관후 바이러스 손실 (가속화된 안정성)(*), ⅱ) 바이러스 역가 손실이 1.0 log 미만 (실온에서 보관후)으로 유지되는 개월로 표시된 시간과 함께 이러한 기간에서 도달한 바이러스 역가 (**), ⅲ) 4℃에서 1년 (12개월) 동안 보관 후에 도달한 ffu/백신 용량의 바이러스 역가 (***).
표 39
Figure 112007066733916-PCT00005
M = 개월.
$ = 실시예 Ⅲ.2.2에 따른 BRR 시험에 의해 T = 0 (4℃)에서 측정된 pH.
* 1주 37℃ 안정성 시험에 기초한 최고의 결과 - 0.5 log의 최대 바이러스 역가 손실이 용인됨.
** 실온 안정성 시험에 기초한 최고의 결과 - 1.0 log의 최대 바이러스 역가 손실이 용인됨.
*** 4-8℃ 안정성 시험에 기초한 최고의 결과 - 0.5 log의 최대 바이러스 역가 손실이 용인됨.
**** 누적 최고 결과 - 둘 모두의 바이러스 역가 손실은 0.5 log 이상이나 1.0 log 미만이고, 0.5 log 미만의 역가 손실이 용인되고, 이러한 기준에 따라 둘 모두가 허용된다.
회색 명암: 0.5 log 미만의 바이러스 손실을 지니는 것으로 측정된 기준 (*, **, *** 또는 ****)에 대해 허용되는 제형; 쇄선 칸: 0.5 log 이상이나 1.0 log 미만인 바이러스 손실을 지니는 것으로 측정된 기준 (*, **, *** 또는 ****)에 대해 허용되는 제형; 검정색 명암: 결정화가 발생하는 허용되지 않는 제형.
명백하게, 시험된 아디페이트 제형에서, 약 6.0 내지 약 8.0 (6-8)의 pH 범위가 1.0 log의 최대 바이러스 역가 손실과 양립가능한 우수하고, 허용가능하고, 안정적인 프로팔일을 나타내었고, 약 6.0 내지 약 6.8의 pH 하위범위는 0.5 log의 최대 바이러스 역가 손실과 양립가능한 우수하고, 허용가능하고, 안정적인 프로파일을 나타내었다.
실시예 Ⅲ - 방법
Ⅲ.1 로타바이러스 바이러스 적정
감염성 로타바이러스의 검출을 로타바이러스 및 증식허용 MA104 세포 (ATCC CRL 2378)의 다양한 성분을 함유하는 제형을 인큐베이션시킴으로써 수행하였다.
로타바이러스 (예를들어, P43 로타바이러스, ECACC 99081301)를 상기 실시예에 기술된 바와 같이 제형화시켰다. 바이러스 샘플의 접종 후, 세포를 16시간 내지 18시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 세포를 고정시키고, 아세톤 80%로 투과화 (permeabilize)시켰다. 감염된 세포를 플루오로세인이 컨쥬게이션된 IgG에 의해 검출되고 UV 현미경하에서 검사되는 VP6 단백질 (Mab 9F6)에 특이적인 모노클로날 항-로타바이러스 항체를 이용하는 직접 면역-형광에 의해 확인하였다). 로타바이러스 VP6 단백질에 대한 임의의 시판되는 모노클로날 항체가 적합하고, 적절한 작용 희석액은 통상적인 실험에 의해 결정될 것이다. 예를들어, 하기의 모노클로날이 적합하다:
- 루럴 테크놀로지스 인크사 (Rural Technologies lnc, www.ruraltechinc.com)로부터의 RV 11-2 (플루오레세인 이소티오시아네이트와 컨쥬게이션된 복수 (ascites fluid)의 IgG2a),
- 오스트랄 바이올로지컬스사 (Austral Biologicals, www.australbiologicals.com)로부터의 5F8 F9 (IgG1, 카탈로그 번호 RVM-1601A-5) 또는 2F2 I9 (IgG2b, 카탈로그 번호 RVM-1601B-5),
- 이뮤놀로지컬 앤드 바이오케미컬 테스트시스템즈 게엠베하사 (Immunological and Biochemical testsystems Gmbh, www.afsbio.com)로부터의 MABR10 (IgG 분획).
항-Vp6 로타바이러스 폴리클로날 항체, 예를들어 케미콘사 (Chemicon, www.chemicon.com)로부터의 AB1129F가 또한 적합하다.
각각의 형광 부위는 하나의 감염성 바이러스에 해당한다. 역가는 ml당 단위를 형성하는 부위의 대수 (log (ffu/ml))로 표현된다. 바이러스 역가의 정밀도는 + 또는 - 0.2 log 주변이다. ffu/ml의 바이러스 적정의 결과를 최초 샘플 투여량에 따라 ffu/용량으로 전환시켰다. 표에 나타낸 모든 데이터는 용량당 로그 베이스 10 (log10) ffu이다.
"37℃에서 1주" 동안 0.5 log 미만이 감소된 우수한 결과 (가속화된 안정성 시험)가 달성되었다. 1 log 이상의 바이러스 손실을 나타내는 제형을 추가의 안정성 시험으로부터 폐기하였다.
Ⅲ.2 제산 측정 방법: 베이비 로셋-라이스 (BRR) 적정
Ⅲ.2.1. 서문
본래 성인 집단을 위해 개발한 로셋-라이스 적정 시험으로부터의 베이비 로셋-라이스 (BRR) 적정 시험을 유아 집단에 적합화시켰다.
로셋-라이스 적정은 제산 분야에서 사용되는 널리 공지된 시험법이다 (참조: N.E. Rossett and Marion L. Rice in Gastroenterology, 1954 volume 26 pages 490-495: 'An in vitro evaluation of the efficacy of the more frequently used antacids with particular attention to tablets'). 로셋-라이스 적정은 0.1N 염산을 이용한 시험하에서의 제산 물질의 반응 속도 및 상승된 pH의 지속기간을 측정한다. 공복의 위의 상태를 자극하기 위해, 새로이 제조된 염산을 측정 시작시에 한번에 첨가하였다. 소화 과정 동안의 위의 상태를 자극하기 위해, 새로이 제조된 염산을 시험 하의 반응 혼합물에 일정한 속도로 첨가하였다.
간단히, 성인 로셋-라이스 적정을 두개의 부분으로 나누었다:
- 공복의 위의 볼루스 (bolus)의 산 함량인 30 ml의 0.1N HCl의 최초 첨가;
- 이후, 소화 동안의 위산 분비를 모방하는 4 ml/분의 속도의 0.1 N HCl의 지속적 첨가.
이들은 보통 평균 성인 위와 유사한 것으로 간주되는 실험 조건이다.
Ⅲ.2.2. 베이비 로셋-라이스 적정 분석
본래의 방법에 기술된 표준 로셋-라이스 조건을 기초로 하여, 상기 시험법을 6개월된 유아의 위에 유사하도록 적합화시켰고, 이를 '베이비 로셋-라이스 (BRR) 적정 분석법'으로 명명하였다.
가이지 사이언티픽 테이블 (Geigy Scientific Table) (Volume 1 page 126, Ciba-Geigy 1981, eds)에 따르면, 하기 데이터는 위 HCl 분비가 관련되는 한 중요하다 (표 40 참조):
표 40
기본 산 결과 최대 산 결과
아동 평균 최대 범위 평균 최대 범위
9-11 주 0.149 mmol/h 0.05-0.30 mmol/h 0.56 mmol/h 0.39-0.84 mmol/h
6-7 개월 0.193 mmol/h 0.07-0.40 mmol/h 2.08 mmol/h 1.33-2.88 mmol/h
따라서, 상기 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 모든 상황을 포함하도록 하기 위해 가장 중증인 질환을 선택하였다:
- 최초 HCl 양: 0.40 mmol (4ml의 0.1 N HCl)
- 0.1 N HCl 양의 지속적 첨가: 2.90 mmol/h (또는 0.048 mmol/분). 실제로, 0.5 ml/분 속도의 0.1 N HCl을 사용하였다.
BRR의 실험 구성의 개요를 도 2B에 나타내었다.
표 41에 BRR과 본래 공개된 방법 사이의 차이점을 요약하였다.
표 41
시험명 로셋-라이스 베이비-로셋-라이스
참조 - 문헌[Gastroenterology 1954 vol. 26 pages 490-495]. - 또한, 약전의 제산 시험을 참조 - GSK의 공개되지 않은 데이터 - 유아에 대한 위의 HCl 분비 속도 값은 문헌[Geigy Scientific Tables (1981) Volume 1 page 126]에 있다.
적용 대상 성인 6개월의 유아
시험 동안 적용되는 온도 37℃ 37℃
비커 부피 400 ml 50 ml
최초 물 부피 70 ml 제산 샘플이 1.5 ml인 경우 8.5 ml 제산 샘플이 2.0 ml인 경우 8.0 ml 제산 샘플이 2.5 ml인 경우 7.5 ml
제산량 0.330 g Al2O3와 동등함 시험되는 샘플 및 투여량에 따라 다양함; 보통 HCl의 0.8 내지 1.8 밀리-당량
t=0에서 첨가되는 최초 0.1 N HCl 양 30 ml 4 ml
측정 동안 첨가되는 추가 0.1N HCl의 속도 4 ml/분 0.5 ml/분
도달하기 위한 pH 크기 pH = 3 pH = 4
통상적 결과 pH 3 초과에서 3-4 시간 pH 4 초과에서 8-20분
Ⅲ.2.2.1. BRR 분석의 작업 과정
실험 구성을 도 2B에 나타내었다.
1° 50 ml 비커에 단계 n°4 (이후) 후에 10 ml의 최종 액체 부피를 지니기 위해 충분한 주사용수를 두었다.
2° 비커를 수조에 비치하였다.
3° 수조의 온도를 비커의 내부가 37℃가 되도록 조정하였다.
4° 측정되는 제산 샘플을 비커에 첨가하였다.
5° 이 단계에서의 pH 값의 치수를 "최초 pH"로 하였다 (데이터 표의 t = 0).
6° 4 ml의 0.1 N HCl (0.40 mmol)을 한번에 첨가하고, 동시에 시간을 재고 펌프를 시작하였다 (0.5 ml/분의 0.1 N HCl의 지속적 첨가). 이러한 세 작업은 시간을 재기 시작한지 5초 이내에 모두 수행하여야 한다.
7° pH 4가 수득될 때까지 시간에 따라 pH 값을 기록하였다. 작업자의 임의로, pH 3 (본래의 로셋-라이스 방법에서와 같음)이 수득될 때까지 pH의 감소가 진행되도록 둘 수 있으나, pH 4에 도달한 후에 관련 제산 능력 값을 기록하였다.
8° 시계와 펌프를 중지시켰다.
Ⅲ.2.2.2. 실험 데이터의 제시
실험 데이터를 표에 나타내었고 (예를들어, 표 22 참조), 이로부터 도표가 작성될 수 있었다 (예를들어 도 2A 참조).
Ⅲ.2.2.3. 결과 해석
로타바이러스는 4 미만의 pH에 배치시 파괴된다. 바이러스를 보호하기 위해, 4 이상의 pH가 고려된다. 베이비 로셋-라이스 적정의 결과는 시간 단위 (분)로 표현된다. 이는 pH 값이 4를 초과하는 것으로 측정된 시간, 즉 소위 제형의 제산 능력이다. 몇몇 경우에서, 두개의 값이 기록된다 (예를들어, 표 22의 제형 n°92에서의 같은 11-12분, 여기서 11분에서 pH는 4.08이었고 12분에서 pH는 3.98이었으며, 이는 pH 4.00에서의 경과가 11분 보다 12분에 가까움을 나타낸다).
Ⅲ.2.2.4. 교정
온도를 교정된 온도계 (-10℃ - +50℃ 스케일)로 측정하였다. pH 측정기는 시판되는 pH 7 및 pH 4의 표준 완충용액을 이용하여 측정하였다.
펌프 속도를 0.5 ml/분을 수득하기 위해 시간에 대한 부피 측정값으로 조정하였다. 연동 펌프는 이스마텍 (Ismatec) S.A. 모델 MS-Reglo로부터의 8개의 롤러모델이다. 점적의 형성을 피하기 위해, 관 말단 (tubing extremity)을 액체 높이 위의 비커벽에 따라 배치하였다.
염산 0.1 N은 시판되는 표준 적정 용액이다.
공지되지 않은 제산 샘플을 분석하기 전에 실험 구성을 체크하기 위해 공지된 표준 완충용액을 사용하였다. 이러한 표준 완충용액은 1리터의 용액을 수득하기에 충분한 물에 용해된 24.066 g의 트리나트륨포스페이트 도데카히드레이트 (Merck product n°1.06578.1000)로 구성된다. 통상적으로, 이러한 용액의 10 ml는 기술된 베이비 로셋-라이스 적정 구성에서 6분 내지 7분 사이 (첫번째 포스페이트 pH 점프)에서 9.0의 pH를 발생시킬 것이고, 19 내지 20분 사이 (두번째 포스페이트 pH 점프)에서 4.0의 pH를 발생시킬 것이다. 결과를 표 42에 나타내었다.
표 42
24.066 g/리터에서의 10 ml의 Na3PO4.12H2O 10 ml의 물
시간 (분) 제산 없음
pH pH
0 12.4 5.94
1 11.7 1.31
2 11.58 1.23
3 11.44 1.18
4 11.27 1.14
5 11.02 1.11
첫번째 pH 점프 6 10.6 1.10
7 8.86 1.07
8 7.95 1.05
9 7.6 1.03
10 7.38 1.01
11 7.19 0.99
12 7.03 0.98
13 6.88 0.97
14 6.74 0.96
15 6.58 0.95
16 6.41 0.95
17 6.21 0.94
18 5.93 0.93
두번째 pH 점프 19 5.45 0.92
20 3.47 0.91
21 2.88 0.90
22 2.62 0.89
23 2.44 0.88
24 2.3 0.87
25 2.18 0.87
26 2.09 0.86
27 2.01 0.86
28 1.93 0.86
29 1.87 0.85
30
Ⅲ.3. 제공된 제형의 굴절 지수의 측정
높은 수크로오스 농도 (예를들어, 55%)를 함유하고, 안정성 및 제산 능력 필요 조건을 따르는 본 발명에 예시된 여러 제형을 소량 (예를들어, 1.5 ml 이하)의 투여량으로 제조하였다. 따라서, 제형이 성공적으로 제조되었고, 각각의 성분의 완전한 용해가 달성되었음을 증명하는 것이 중요할 수 있다. 이를 수행하기 위한 하나의 간단한 방법은 제형의 굴절 지수를 측정하는 것이다. 굴절 지수는 카르복실레이트 완충 단계 (로타바이러스 첨가 전) 및 최종 제형화 단계 (로타바이러스 첨가 후) 둘 모두에서 사용될 수 있는 널리 공지된 간단한 측정법이다.
Ⅲ.3.1. 방법
수용액의 굴절 지수는 용액 중의 수크로오스 농도를 결정하기 위한 표준 방법이다. 굴절 지수 대 수크로오스 농도의 표는 논문집[Chemistry and Physics 70th edition 1989-1990 CRC Press page E 386]에서 발견할 수 있다.
지수 계기 자동 굴절계 (Index Instrument Automatic Refractometer) GPR 11-37 기계를 이용하여, 용액의 점적을 기계에 배치시키고, 굴절 지수를 기록하였다. 물을 기계를 체크하기 위한 표준으로 사용하였다 (1.3330의 굴절 지수).
다양한 양의 수크로오스를 함유하는 여러 아디페이트 제형을 제조하고, 굴절 지수 측정하였다. 이를 반복 측정하였다.
Ⅲ.3.2. 결과
측정 결과를 도 3A 및 3B에 나타내었다. 결론적으로, 시험된 농도 윈도우에서 당 농도 및 기타 가용성 성분과 측정된 굴절 지수 사이에 선형 상관 관계가 존재하였다.
예를들어, 제형 n°95에서, 성분을 완전히 용해시킨 후, 카르복실레이트 완충 단계 (로타바이러스 첨가 전)에서 1.4578의 굴절 지수 값 (이 경우 목표 수크로오스 농도는 58.5% w/w임)이 수득되는 반면; 제형화의 최종 단계 (로타바이러스 첨가 또는 위약 제조의 경우 6% w/w DMEM 첨가 후)에서는 1.4480의 굴절 지수 (이 경우 목표 수크로오스 농도는 55% w/w임)가 수득될 것이다. 둘 모두의 경우, 측정된 굴절 지수 값은 수용액 중의 단일한 58.5% (1.4385의 굴절 지수) 또는 55% (1.4307의 굴절 지수) 수크로오스에 대해 수득된 것보다 높다.
Ⅲ.3.3. 결론
따라서, 굴절 지수 측정은 처리 조절 동안 제형의 모든 첨가된 성분의 완전한 용해를 신속하게 체크하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 Ⅳ - 시트레이트 포스페이트 완충용액을 지니는 제형 - 비교예
Ⅳ.1. 제형의 제조 (표 43 & 44)
표 43
N° NaH2 PO4 2H2O (M) Na2HPO4.2H2O (M) Na3시트레이트.2H2O (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR$ pH t=0 pH>4에서의 BRR$ 시간 t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
2.5 ml 투여량 - 포스페이트 농도 = 0.390 M
1 0.195 0.195 0.135 50% 3.33% 6.66 9 5.9 5.4 0.5
2 0.195 0.195 0.135 50% 5% 6.65 10 5.8 5.4 0.4
3 0.195 0.195 0.135 50% 8% 6.67 9 5.6 5.3 0.3
4 0.195 0.195 0.135 45% 3.33% 6.67 10 5.8 5.3 0.5
5 0.195 0.195 0.135 40% 3.33% 6.69 11 5.8 5.5 0.3
6 0.195 0.195 0.135 30% 3.33% 6.71 10 5.7 5.5 0.2
7 0.195 0.195 0.135 20% 3.33% 6.75 11 5.6 4.1 1.5
8 0.195 0.195 0.135 45% 8% 6.69 12 5.7 5.4 0.3
9 0.195 0.195 0.135 40% 8% 6.70 12 6.1 5.6 0.5
10 0.195 0.195 0.135 30% 8% 6.72 11 6.1 5.4 0.5
11 0.195 0.195 0.135 20% 8% 6.73 11 6.1 4.4 1.7
2 ml 투여량 - 포스페이트 농도 = 0.488 M**
17 0.244 0.244 0.162 50% 6% 6.68 10 5.7 5.5 0.2
1.5 ml 투여량 - 포스페이트 농도 = 0.650 M**
12 0.325 0.325 0.216 40% 6% °° °° °° °° °°
13 0.325 0.325 0.216 40% 8% °° °° °° °° °°
14 0.325 0.325 0.216 40% 10% °° °° °° °° °°
15 0.325 0.325 0.216 45% 6% °° °° °° °° °°
16 0.325 0.325 0.216 45% 8% °° °° °° °° °°
$ 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨;
** 이는 2.5 ml 투여량중 0.390 M과 동등함.
°°제형 12-16은 4-8℃에서 방치시 재결정화가 발생하였으므로 폐기하였다.
표 44 - 1.5 ml 투여량의 감소된 포스페이트 양
N° NaH2 PO4 2H2O (M) Na2HPO4.2H2O (M) Na3시트레이트.2H2O (M) 수크로오스 % w/w DMEM % w/w t=0에서의 BRR$ pH t=0 pH>4에서의 BRR$ 시간 t=0에서의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 역가 (백신 용량당 log10 ffu) 1주 37℃ 후의 바이러스 손실 (백신 용량당 log10 ffu)
1.5 ml 투여량 - 감소된 포스페이트 양 (제형 25-29에 대해 0.420 M)**
25 0.225 0.225 0.285 40% 6% 6.69 12 6.2 5.8 0.4
26 0.225 0.225 0.285 40% 8% 결정화 발생 - 데이터 이용 불가능
27 0.225 0.225 0.285 40% 10% 6.67 12 6.2 6.0 0.2
28 0.225 0.225 0.285 45% 6% 결정화 발생 - 데이터 이용 불가능
29 0.225 0.225 0.285 45% 8% 6.69/6.72° 12/12-13° 6.1 6.1 0
1.5 ml 투여량 - 감소된 포스페이트 양 (제형 30-32, 38-40에 대해 0.0085 M)***
30 0.00424 0.00424 0.438 40% 6% 7.75 12-13 6.2 5.3 0.8
31* 0.00424 0.00424 0.438 45% 6% 7.9 13 6.1 5.8 0.3
32* 0.00424 0.00424 0.438 50% 6% 7.76 13-14 6.0 5.7 0.3
38 0.0042 0.0042 0.435 45% 6% 7.76 14 5.7 5.2 0.5
39 0.00424 0.00424 0.446 50% 6% 7.74 14 5.6 5.3 0.3
40 0.0043 0.0043 0.448 54% 6% 7.73 15 5.6 5.4 0.2
1.5 ml 투여량 - 포스페이트가 첨가되지 않음
18 - - 0.438 40% 6% 8.42 12 5.7 4.5 1.2
19 0.437 40% 8% 8.42 11 5.7 4.3 1.4
20 0.437 40% 10% 8.31 11 5.7 4.4 1.3
21 0.437 45% 6% 8.35 11 5.9 4.7 1.2
22 0.437 45% 8% 8.35 10 5.8 4.9 0.9
23 0.437 45% 10% 8.37 12 5.7 4.7 1.0
24 - - 0.438 50% 6% 8.31 11 5.7 4.9 0.8
°= 반복.
$ 실시예 Ⅲ.2.2에 따라 적합화된 베이비 로셋 라이스 (BRR) 시험에 의해 측정됨;
* 제형 31 & 32는 유사한 날짜에서 다양한 순이론적 시험을 반복하였다 (제형 38 & 39 각각, 본원에 나타내지는 않음).
** 이는 2.5 ml 투여량중 0.271 M과 동등함; 즉 감소된 포스페이트.
*** 이는 2.5 ml 투여량중 0.0051 M과 동등함; 즉 감소된 포스페이트.
표 44의 제형 18-24, 26-30의 결과에 대한 설명
제형 18-24 및 30은 37℃에서의 1주의 안정성 시험 동안 수득된 불만족스러운 결과로 인해 장기간의 안정성 연구에서 폐기하였다. 제형 26 및 28은 4-8℃에서 방치시 결정화가 발생하였으므로 폐기하였다. 제형 25, 27 및 29는 4-8℃에서 방치시 높은 재결정화 위험으로 인해 폐기하였다.
Ⅳ.1.1. 제형 1-11: 2.5 ml 투여량 제형
제형 1-11 (표 43 참조)을 각각 2.5 ml (3.25 g)의 100회의 투여량에 해당하는 325 g 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: NaH2PO4.2H2O (Mw 156); Na2HPO4.2H2O (Mw 178); Na3시트레이트.2H2O (Mw 294).
액체 제형 1을 하기와 같이 제조하였다. 125.84 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)에 7.605 g의 NaH2PO4.2H2O, 8.677 g의 Na2HPO4.2H2O, 9.555 g의 Na3시트레이트.2H2O 및 162.5 g의 수크로오스를 연속적으로 첨가하였다. 완전히 용해시킨 후, 용액을 0.2 μm 막으로 여과하여 멸균시켰다. 멸균 상태하에서 용량당 106.0 ffu를 수득하기 위해 필요한 양의 로타바이러스를 함유하는 10.82 g의 DMEM 배지를 첨가하였다. 혼합물을 균질화시키고, 적절한 투여 용기에 분배시켰다. 이 경우, 하나의 용량은 2.5 ml 또는 3.25 g의 최종 제형화된 제조물로 구성되었다. 본 실시예에서, DMEM 배지는 3.33 % w/w이었다.
제형 2-11을 유사하게 제조하였다 (표 43의 성분 및 비율 참조). 이러한 시리즈에서, 다양한 양의 수크로오스 및 DMEM을 시험하였다. 로타바이러스를 적절하게 안정화시키지 않는, 낮은 (20%) 수크로오스 농도를 이용하여 제조된 제형 7 및 11을 제외하고는 유사한 결과가 수득되었다.
Ⅳ.1.2. 제형 17: 2.0 ml 투여량 제형
제형 17 (표 43 참조)을 각각 2.0 ml (2.60 g)의 125회의 투여량에 해당하는 325 g의 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 제산 물질: NaH2PO4.2H2O (Mw 156); Na2HPO4.2H2O (Mw 178); Na3시트레이트.2H2O (Mw 294). 간단히, 110.7 g의 물 (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양)을 칭량하고, 9.51 g의 NaH2PO4.2H2O, 10.84 g의 Na2HPO4.2H2O, 11.94 g의 Na3시트레이트.2H2O 및 162.5 g의 수크로오스 (50% w/w)를 연속적으로 첨가하였다. 본 실시예에서, 12.5 g의 DMEM을 사용하였고, 이는 6 % w/w이었다.
Ⅳ.1.3. 제형 12-16: 1.5 ml 투여량 제형
시트레이트/포스페이트 제형 (상세하게는 표 43 참조)의 투여량을 2 ml 미만의 부피로 감소시키기 위한 추가의 시도는 실패하였다.
제형 17 (2 ml 투여량)에 사용된 성분의 농도를 1.5 ml 투여량으로 조정하였다. 포스페이트 성분의 재결정화가 4℃에서의 제형의 보관 후에 급속하게 발생하였다. 이러한 현상은 포스페이트 시트레이트 성분 내에서의 Na2HPO4의 다소 낮은 가용성에 기인된다 (표 45 참조).
표 45 - 포스페이트 및 시트레이트에 대한 이론적 가용성 한계
물에서의 가용성
NaH2PO4.2H2O 5.44 M (20℃)
Na2HPO4.2H2O 0.52 M (20℃)
Na3시트레이트.2H2O 1.44 M (25℃)
이러한 파라미터에 따르면, 제형 17을 1.5 ml의 투여량으로 제형화하려는 시도는 0.65 M ((0.244 M + 0.244 M) * 2/1.5)의 최종 포스페이트 농도를 이론적으로 생성시킬 수 있고, 이는 Na2HPO4 가용성 데이터 (0.52 M)보다 높았다.
이러한 포스페이트의 낮은 가용성 문제를 피하기 위해, 추가의 포스페이트를 사용하지 않고, 카르복실산 형태 (R-COOH)와 카르복실레이트염 형태 (R-COO-) 사이의 균형을 맞춤으로써 pH를 조정하는 것이 제안되었다. 이의 예는 2.5 ml 투여량으로 제조된 제형 100-115 (표 5 참조) 또는 1.5 ml 투여량으로 제조된 제형 128-130 (표 6 참조)으로 제공된다.
Ⅳ.1.4. 제형 25-32 및 38-40: 1.5 ml 투여량 제형 및 감소된 양의 포스페이트
감소된 양의 포스페이트를 함유하는 여러 제형 (상세하게는 표 44 참조)을 각각 1.5 ml (1.95 g)의 166.6회의 투여량에 해당하는 325 g 스케일 (250 ml)로 제조하였다. 허용되는 제산 능력을 유지하면서 포스페이트의 상기 감소를 보충하기 위해, 시트레이트 농도를 증가시켰다. 간단히, 제형 25를 8.76 g의 NaH2PO4.2H2O, 10.00 g의 Na2HPO4.2H2O, 21.00 g의 Na3시트레이트.2H2O 및 130 g의 수크로오스 (40% w/w)를 연속적으로 첨가하고 혼합시킴으로써 제조하였다. 본 실시예에서, DMEM은 6% w/w이었다. 수크로오스 및 DMEM 농도를 약간 변형시켜, 제형 26-29를 유사하게 제조하였다 (표 44 참조). 제형 30을 0.1653 g의 NaH2PO4.2H2O, 0.1884 g의 Na2HPO4.2H2O, 32.16 g의 Na3시트레이트.2H2O 및 130 g의 수크로오스 (40% w/w)를 연속적으로 첨가하고 혼합시킴으로써 제조하였다. 본 실시예에서, DMEM은 6 % w/w이었다. 수크로오스 및 DMEM 농도를 약간 변형시켜, 제형 31 및 32를 유사하게 제조하였다 (표 44 참조).
제형 25-29에서 전체 포스페이트 농도가 0.45M, 즉 Na2HPO4에 대한 0.52M의 이론적 가용성 한계 미만임에도 불구하고, 제형의 일부 (예를들어, 제형 26 및 28)는 +4℃에서의 보관 동안 재결정화를 나타내었다. 이론적 가용성 값과 실제 가용성 값 사이의 이러한 실제 차이는 배지 내에 용해된 기타 화합물 (수크로오스, 시트레이트 또는 DMEM 배지를 통해 내포된 기타 물질)의 존재로 인한 것이긴 하나, 일치하지 않는 결과 (예를들어 제형 26 및 27에 비해)가 유사한 제형에 대해 수득되었다. 이러한 제형이 겪은 변화성은 최소 기간에 걸쳐 물리적으로 안정되게 유지되어야 하는 대규모의 제형의 제조시 신뢰할 수 없다.
제형 (표 44의 n°30-32 및 38-40 참조)에서의 포스페이트의 양의 추가 감소는 4-8℃에서의 바이러스 안정성에 불량한 결과를 발생시켰다 (표 47 참조).
다른 1.5 ml 투여량 제형 (18-24)을 또한 첨가되는 포스페이트의 부재하에서 제조하였다 (상세하게는 표 44 참조). 이들 제형에 대한 제산 능력을 보다 높은 농도 (438 mM)에서 트리나트륨 시트레이트를 이용하여 12분의 목표 값으로 유지시켰다. 간단히, 제형 18을 물 143.34 g (최종적으로 325 g을 제조하기 위해 결정된 양), 32.16 g의 Na3시트레이트.2H2O 및 130 g의 수크로오스 (40% w/w)를 연속적으로 첨가하고 혼합시킴으로써 제조하였다. 제형 n°19-23에 대해, 다양한 양의 수크로오스 및 DMEM을 시험하였다 (표 44 참조). 제형 24에 대해, 수크로오스를 50% w/w의 농도 (162.5 g)로 사용하였다. 이들 제형에서, DMEM은 6% w/w이었다.
이들 제형 (n°18-24)의 pH는 8.3을 초과하였고, 여기서 37℃에서의 1주 보관 후에 0.8을 초과하는 바이러스 손실에 의해 입증되는 바와 같이 로타바이러스 안정성이 영향을 받았다.
37℃에서 신속한 시험 동안의 이들 제형의 불량한 안정성이 발생하여, 실온 또는 4℃에서의 중간 기간의 안정성 시험을 수행하지 않았다.
이들 결과는 제형 내에 포스페이트가 적게 포함되고, 시트레이트 (제산 능력 유지)가 더욱 포함될수록 제형의 pH가 더욱 증가하는 것을 나타낸다:
- 제형 25-29에서 약 pH 6.7
- 제형 30-32 및 38-40에서 약 pH 7.7
- 포스페이트가 존재하지 않는 제형 n°18-24에서 약 pH 8.3
하기 (표 46 및 47)에 나타낸 바와 같이, 보다 높은 pH 값은 우수한 로타바이러스 안정성에 바람직하지 않다.
추가로, 이러한 결과는 제형 110-115 (표 5 참조) 및 128-130 (표 6 참조)에 대해 수득된 결과에 따른 것으로, 여기서 pH는 시트르산/나트륨 시트레이트 비 만을 조정 (따라서, 추가 포스페이트 없이)함으로써 교정된다.
Ⅳ.2. 로타바이러스 바이러스 역가 및 제산 능력
다양한 시점에서 로타바이러스 바이러스 적정을 실시예 Ⅲ.1에 제공된 방법에 따라 평가하였고, 제형의 제산 능력을 실시예 Ⅲ.2에 제공된 프로토콜에 따라 평가하였다. 결과를 표 46 및 47에 나타내었다.
표 46 - 실온에서의 바이러스 안정성
n° 실온에서의 보관후 바이러스 적정 (20-22℃)
1 개월 2 개월 3 개월 4 개월 5 개월 6 개월
1 6.0 6.0 5.8 5.6 5.1
2 6.3 5.9 6.0 5.6 5.0
3 6.2 6.0 5.9 5.5 5.0
4 6.0 6.0 5.5 5.0
5 6.0 5.7 5.3 4.5
6 5.5 5.1 4.8
7 °° °° °° °° °° °°
8 6.0 5.6 5.5 4.9
9 5.9 5.6 5.1
10 5.6 5.1 4.6
11 °° °° °° °° °° °°
17 6.0 5.8 5.8 5.7 5.0
25 5.9 5.5 4.8
27 5.8 5.1 4.7
29 6.1 5.7 5.5 5.4 3.9
31 5.7 5.3 4.7
32 5.9 5.5 5.0
38 °° °° °° °° °° °°
39 5.3 5.5 4.5
40 5.5 5.2 4.8 4.6
공백인 칸 = 결정되지 않음.
°°제형 7, 11 및 38은 37℃에서 1주의 시험 동안 수득된 불량한 결과로 인해 장기간 안정성 시험으로부터 폐기하였다.
표 47 - 4℃에서의 바이러스 안정성
n° 4℃에서의 보관후 바이러스 적정 (백신 용량당 log10 ffu)
T = 0 1주 37℃ 후 1 m* 4℃ 2 m* 4℃ 4 m* 4℃ 6 m* 4℃ 7 m* 4℃ 9 m* 4℃ 12 m* 4℃
1 5.9 5.4 5.9 6.0 6.1 6.1 5.9 5.9
2 5.8 5.4 5.9 6 6 6 5.9 5.8
3 5.6 5.3 6 6 6.2 6 6 5.9
4 5.8 5.3 5.7 6.0 6.1 5.9 5.9 5.7
5 5.8 5.5 6.1 6.1 6.1 5.8 6.0 5.7
6 5.7 5.5 6.0 6.0 5.9 5.4 5.6 4.9
7 5.6 4.1
8 5.7 5.4 5.9 6.0 5.9 5.8 5.9 5.6
9 6.1 5.6 6.1 6.1 5.8 5.7 5.6 5.5
10 6.1 5.4 6.0 5.5 5.5
11 6.1 4.4
17 5.7 5.5 5.7 5.9 6 5.8 5.9 5.9
25 6.2 5.8 5.9 5.9 NA* NA* NA* NA*
27 6.2 6.0 6 5.8 NA* NA* NA*
29 6.1 6.1 6.1 5.9 5.9 6.2
31 6.1 5.8 5.7 5.7 5.6 5.6
32 6.0 5.7 6 5.8 5.6 5.6
38 5.7 5.2
39 5.6 5.3 5.7 5.4
40 5.6 5.4 5.7 5.3
*NA = 이용가능하지 않음 - 실온에서 안정성 시험 동안 실패.
공백인 칸 = 결정되지 않음.
Ⅳ.3. 결과 및 결론
제형 2-3 (2.5 ml의 투여량) 및 제형 17 (2.5 ml에서 2 ml로 감소된 투여량):
표 46 및 47에 나타낸 바와 같이, 제형 2, 3 및 17에 대한 실온에서의 6-개월의 보관으로부터 바이러스 역가에서의 1-log 손실이 발생하였다. 4℃에서, 12개월 이하의 보관 기간에 걸쳐 바이러스 역가의 현저한 손실이 발생하지 않았다.
제형 25, 27, 29 및 31-32 (1.5 ml로 감소된 투여량):
4개월의 기간에 걸친 제형 29를 제외하고, 실온에서 일반적으로 바이러스 역가에서 1-log 손실이 3개월 이하에서 발생하였다. 제형 25 내지 27은 4℃에서 보관 기간 동안 재결정화되었고, 이는 상기 기재된 바와 같이 포스페이트 농도의 감소가 충분하지 않았다는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 제형은 4℃에서 1년 이상일 수 있는 보관 기간에 적합하지 않다.
포스페이트 농도가 추가로 감소되는 경우 (제형 30-32), 제산 능력의 동일한 값을 유지시키기 위해 필요한 시트레이트의 양이 비례적으로 증가하므로 최종 제형의 pH가 증가한다. 이러한 pH의 증가는 로타바이러스의 안정성에 영향을 줄 수 있고, 실온에서의 안정성 연구 동안 신속하게 검출될 수 있다. 이러한 경향은 포스페이트가 제형에서 완전히 제거되는 경우 (제형 18 및 24)에 확증된다.
실시예 Ⅳ의 종합적 결론
이러한 결과는 2.5 ml의 투여량에 비해 2 ml 미만의 투여량에 도달하기 위해, 포스페이트가 낮은 물 가용성을 지니고 재결정화되는 경향으로 인해 제형에 존재하는 포스페이트의 양이 감소되어야 한다는 것을 나타낸다. 결과적으로, 제산 능력의 동일한 목표 값을 유지시키기 위해 (즉, BBR 시험으로 측정시 최소 8분 이상, 적절하게는 12분 이상), 시트레이트염의 양이 증가되어야 한다. 이는 제형의 최종 pH의 증가를 발생시키고, 액체 제형에서의 로타바이러스의 안정성에 유해하다.
실시예 Ｖ - 추가 제형
하기의 제형을 제조하였으나 (표 48), 하나 이상의 일련의 기준을 충족시키는데 실패하여 장기간 안정성 계획에는 포함시키지 않았다. 몇몇 제형을 폐기한 특정 이유를 표 48의 설명 컬럼에 간략히 기재하였다.
표 48
N° 제형의 간단한 설명 참조 제형 + 표 설명
7 2.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 20% 수크로오스 Ⅳ.1 표 43 1주 37℃에서 >1 log 손실
11 2.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 20% 수크로오스 Ⅳ.1 표 43 1주 37℃에서 >1 log 손실
12 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 40% 수크로오스 Ⅳ.1 표 43 +4℃에서 방치시 결정화
13 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 40% 수크로오스 Ⅳ.1 표 43 +4℃에서 방치시 결정화
14 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 40% 수크로오스 Ⅳ.1 표 43 +4℃에서 방치시 결정화
15 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 45% 수크로오스 Ⅳ.1 표 43 +4℃에서 방치시 결정화
16 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 45% 수크로오스 Ⅳ.1 표 43 +4℃에서 방치시 결정화
18 1.5 ml; 시트레이트; 40% 수크로오스; pH 8.42 Ⅳ.1 표 44 1주 37℃에서 >1 log 손실
19 1.5 ml; 시트레이트; 40% 수크로오스; pH 8.42 Ⅳ.1 표 44 1주 37℃에서 >1 log 손실
20 1.5 ml; 시트레이트; 40% 수크로오스; pH 8.31 Ⅳ.1 표 44 1주 37℃에서 >1 log 손실
21 1.5 ml; 시트레이트; 45% 수크로오스; pH 8.35 Ⅳ.1 표 44 1주 37℃에서 >1 log 손실
22 1.5 ml; 시트레이트; 45% 수크로오스; pH 8.35 Ⅳ.1 표 44 1주 37℃에서 >1 log 손실
23 1.5 ml; 시트레이트; 45% 수크로오스; pH 8.37 Ⅳ.1 표 44 1주 37℃에서 >1 log 손실
24 1.5 ml; 시트레이트; 50% 수크로오스; pH 8.31 Ⅳ.1 표 44 1주 37℃에서 >1 log 손실
25 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 40% 수크로오스 Ⅳ.1 표 44 +4℃에서 결정화 위험
26 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 40% 수크로오스 Ⅳ.1 표 44 +4℃에서 방치시 결정화
27 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 40% 수크로오스 Ⅳ.1 표 44 +4℃에서 결정화 위험
28 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 45% 수크로오스 Ⅳ.1 표 44 +4℃에서 방치시 결정화
29 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 45% 수크로오스 Ⅳ.1 표 44 +4℃에서 결정화 위험
30 1.5 ml; 시트레이트; 포스페이트; 40% 수크로오스 Ⅳ.1 표 44 1주 37℃에서 0.8 log 손실
33 1.5 ml; 아세테이트 + 칼슘 Ⅱ.1 표 10 1주 37℃에서 >1 log 손실
34 1.5 ml; 아세테이트 + 칼슘 Ⅱ.1 표 10 1주 37℃에서 >1 log 손실
35 1.5 ml; 아세테이트 + 칼슘 Ⅱ.1 표 10 1주 37℃에서 >1 log 손실
41 1.5 ml 글루타메이트; 50% 수크로오스 Ⅱ.7 표 36 pH가 너무 높은: 10.36
44 1.75 ml; 푸마레이트; 44% 수크로오스 Ⅱ.8 불용성 물질
45 1.75 ml; 아디페이트; 44% 수크로오스 Ⅱ.5 표 19 BRR이 너무 김: >29 분
47 1.75 ml; 락토비오네이트; 31% 수크로오스 Ⅱ.9 BRR이 너무 짧음: <1분
48 1.75 ml; 말레에이트; 44% 수크로오스 Ⅱ.10 pH가 너무 높음:10.4, BRR이 너무 김: 24분
49 1.75 ml; 글루쿠로네이트; 42% 수크로오스 Ⅱ.11 pH가 너무 높음: 8.45; BRR이 너무 짧음: <1 분
50 1.75 ml; 글루타레이트; 44% 수크로오스 Ⅱ.4 표 18 BRR이 너무 김: >29분
51 1.75 ml; 숙시네이트; 44% 수크로오스 Ⅱ.3 표 16 BRR이 너무 김: >29분
52 1.75 ml; 갈락투로네이트; 42% 수크로오스 Ⅱ.12 pH가 너무 높음: 10.69, BRR이 너무 짧음: <1분
53 1.75 ml; 갈락타레이트; 38% 수크로오스 Ⅱ.13 불용성 물질
54 1.75 ml; 말로네이트; 44% 수크로오스 Ⅱ.2 표 14 pH가 너무 높음: 8.36
55 1.75 ml; 타르타레이트; 44% 수크로오스 Ⅱ.14 BRR이 너무 짧음: <1분
57 1.75 ml; 말레에이트; 44% 수크로오스 Ⅱ.10 1주 37℃에서 >1 log 손실
68 1.5 ml; 글루타메이트; 7.5% 수크로오스 Ⅱ.7 표 36 1주 37℃에서 >1 log 손실
73 1.5 ml; 말레이트 0.597M; 50% 수크로오스 Ⅱ.6 표 33 멸균 여과시키기가 너무 어려움
75 1.5 ml; 말레이트; 56% 수크로오스 Ⅱ.6 표 33 수크로오스를 용해시키기 어려움
103 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스; pH 5.09 Ⅱ.5.1 표 19 +4℃에서 방치시 아디프산 결정화
104 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스; pH 5.12 Ⅱ.5.1 표 19 +4℃에서 방치시 아디프산 결정화
107 1.5 ml; 아디페이트 0.466M; 55% 수크로오스 Ⅱ.5.1 표 19 적합하나 이미 진행한 안정성 데이터와 유사함
108 1.5 ml; 아디페이트 0.63M; 53.15% 수크로오스; pH 5.38 Ⅱ.5.1 표 19 +4℃에서 방치시 아디프산 결정화
109 1.5 ml; 아디페이트 0.63M; 55% 수크로오스; pH 5.38 Ⅱ.5.1 표 19 +4℃에서 방치시 아디프산 결정화
117 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스; Ca++ Ⅱ.5.4 표 26 칼슘 아디페이트의 침전
121 1.5 ml, 아디페이트; 55% 수크로오스; Ca++ Ⅱ.5.4 표 26 칼슘 아디페이트의 침전
135 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스 n°와 같음 로타바이러스를 지니지 않는 위약
136 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스 Ⅱ.5.1 표 19 pH가 너무 높음: 9.36
137 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스 Ⅱ.5.1 표 19 pH가 너무 높음: 9.37
138 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스 Ⅱ.5.1 표 19 pH가 너무 높음: 9.67
139 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스 Ⅱ.5.1 표 19 pH가 너무 높음: 9.92
140 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스 Ⅱ.5.1 표 19 pH가 너무 높음: 10.25
141 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스; pH 6.47 Ⅱ.5.1 표 19 적합하나 이미 진행한 안정성 데이터와 유사함
142 1.5 ml; 아디페이트; 55% 수크로오스; pH 6.30 Ⅱ.5.1 표 19 적합하나 이미 진행한 안정성 데이터와 유사함
146 1.5 ml, 아디페이트; 50% 수크로오스 n°93과 같음 로타바이러스를 지니지 않는 위약
149 1.5 ml, 아디페이트; 55% 수크로오스 n°151과 같음 로타바이러스를 지니지 않는 위약
실시예 Ⅵ - 건강한 유아에서의 인간 일가 로타바이러스 액체 백신의 2회의 경구 투여의 상 Ⅱ 면역원성, 부반응성 및 안정성
Ⅵ.1. 서문
유아 면역화를 위한 약독된 인간 G1P8 로타바이러스 균주 (수탁 번호 99081301로 ECAAC에 수탁됨 - WO 01/12797 참조)를 함유하는 백신의 면역원성, 부반응성 및 안정성을 평가하기 위해 단계 Ⅱ의 무작위화된 이중맹검 위약-조절 단계 Ⅱ 시험을 수행하였다. 핀란드의 다수의 센터에서 연구를 수행하였다. 연구 계획의 개관을 도 4에 도시하였다.
이 연구 동안, 후보 HRV (인간 로타바이러스) 백신 (N=100)의 액체 제형 또는 HRV 백신 (N=100)의 동결건조된 제형 및 각각의 위약 (각각 N=25를 지닌 2개의 그룹)의 첫번째 투여량을 의사의 첫번째 진료시에 약 2.5개월의 연령 (6 내지 12주의 연령)에 투여하였다. 두번째 투여량을 약 3.5 개월의 연령 (의사의 두번째 진료 동안, 통상적으로 첫번째 투여후 4주 후)에 투여하였다. 두번째 투여 후 1개월 후에 약 4.5개월의 연령에서 후속 진료를 채혈 및 면역원성의 평가에 대해 수행하였다.
임상 연구는 무작위화되고, 위약 조절되고, 자가 제어된다. HVR 그룹당 100명 및 위약 그룹당 25명의 전체 250명의 환자를 기록하였다. 각각의 HRV 백신 제형과 이의 각각의 위약 사이의 이중 맹검 방식으로 수행하였다. 그러나, 2개의 상이한 제형 사이에서, 맹검은 기술적으로 불가능하다.
통상적인 유아 백신접종을 지역적 진료소에 따라 투여하나, HRV 백신의 각각의 투여로부터 최소한 14일 간격으로 투여하여야 한다.
Ⅵ.2. 백신의 기술
특히, 사용되는 백신은 로타바이러스 성분으로서 ECACC 수탁번호 99081301 (WO 01/12797)으로 수탁된 약독된 G1 인간 균주를 포함한다.
백신은 미국의 신시네티의 15개월된 아동의 용변으로부터 분리된 혈청형 G1 P1A 및 혈청형 [P8]에 속하는 89-12 HRV 균주로부터 유래된 약독된 인간 로타바이러스 (HRV) 후보 백신이다. 89-12 균주를 이용한 천연 감염은 이후의 질병 및 2년의 전향 연구에서의 재감염에 대한 보호를 제공하는 것으로 나타났다 (Bernstein Dl, et al. Protection from rotavirus reinfection: 2 years prospective study. J Infect Dis. 1991; 164: 277-83).
제산은 위를 통한 통과시 HRV의 불활성화를 예방할 것이다.
표 49는 WO 01/12797에 따라 제조된 아디페이트 액체 제형과 동결건조된 제형을 비교하며, 대규모의 임상 시험에서 유효한 것으로 입증되었다 (De Vos et al. Pediatr Infect Dis J. 2004 Oct 23 (10 Suppl): S179-82).
표 49. HRV 백신 (명목상의 용량)의 아디페이트 액체 제형 및 동결건조된 제형의 양적 조성물
아디페이트 액체 제형 동결건조된 제형 (재구성 후)
활성 물질 P43 균주 - 저장 수명의 종료시 용량당 106.0 이상의 CCID50 (1.5 ml 투여량) P43 균주 - 저장 수명의 종료시 용량당 106.0 이상의 CCID50 (1.0 ml 투여량)
안정제 수크로오스 55% w/w(1.073 g) 수크로오스 9 mg 덱스트란 18 mg 소르비톨 13.5 ml 아미노산 9 mg
제산 이나트륨 아디페이트 132.74 mg 탄산칼슘 60 mg
증점제 - 크산탄 2.5 mg
벌크 희석제 DMEM** 6% w/w DMEM** 2.25 mg
용매 주사용수로 1.5 ml까지 채움 주사용수로 1 ml까지 채움
** 둘베코 (Dulbecco) 변형 이글 (Eagle) 배지.
HRV 백신의 두개의 제형의 부피 및 제산 능력의 요약을 표 50에 나타내었다.
표 50 . HRV 백신의 아디페이트 액체 제형 및 동결건조된 제형의 부피 및 제산 능력
제형 용량당 충전 부피 제산 능력 (BRR* 분)
아디페이트 액체 HRV 백신 1.5 ml 12
동결건조된 제형 1.3 ml 17
* BRR = 베이비 로셋-라이스 (BRR) 적정 시험: 0.1 N 염산을 이용한 제산 물질의 반응 속도 및 4를 초과하는 pH로 유지시키는 지속 기간을 측정하기 위한 것임. 실시예 Ⅲ.2.2의 방법 참조.
제형화된 아디페이트 액체 HRV 백신의 단일 용량을 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 단일 용량 유리 주사기에 충전시켰다.
로타바이러스 바이러스 역가 (즉, 로타바이러스 효능)는 간접 면역형광에 의해 확인되는 MA104 감염된 세포를 이용하여, 실시예 Ⅲ.1에 상세하게 기술된 방법에 따라 측정될 수 있다. 대안적으로, 이는 특이적 항로타바이러스 항체를 이용하는 직접 면역형광에 의해 검출되는 바이러스를 지닌 MA104 세포에서의 바이러스의 시험관내 적정에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은 세포 배양물의 50%를 감염시키는 용량을 결정하고, 로타바이러스 역가는 정중 세포 배양 감염 용량 (CCID50)으로 표시된다. 분석간 및 분석내 재현성을 평가하였고, 동등한 결과를 나타내었다 (변동성은 0.3 log로 측정되었다).
Ⅵ.3. 투여
Ⅵ.3.1. HRV 백신 또는 위약의 동결건조된 제형
투여용 백신 또는 위약을 제조하기 위해, 탄산칼슘 완충용액을 함유하는 미리 충전된 주사기의 전체량을 동결건조된 생성물 (백신 또는 위약)의 바이얼에 주사하고, 재현탁된 생성물을 단일 경구 용량으로 천천히 투여하였다.
Ⅵ.3.2. HRV 백신 또는 위약의 액체 제형
미리 충전된 주사기를 사용전에 흔들었다. 이후, 생성물 (백신 또는 위약)을 단일 구강 용량으로 천천히 투여하였다.
Ⅵ.4. 안정성 및 부반응성
하기 기준의 안정성 및 부반응성을 적용하였다: 필요치 않은 부작용은 열, 과민성/퍼시니스 (fussiness), 설사, 구토, 식욕 손실 및 기침/콧물이다. 관찰된 증상을 기록하기 위해 피검체의 부모/보호자에게 제공된 일지 카드를 이용하여 각각의 연구 백신 투여후 15일 동안 부작용을 기록하였다. 진료 사이에 발생한 모든 위장염 발병 (설사)을 문서화하고, 용변 샘플을 수거하였다 (위장염의 발병후 7일 이내). 각각의 투여 후 31일 이내에 발생한 필요치 않은 부작용을 기록하였다. 심각한 부작용을 전체 연구 기간 동안 기록하였다.
Ⅵ.5. 실험 분석
Ⅵ.5.1. 용변 분석
각각의 연구 백신 투여일 또는 이의 하루전, 각각의 투여후 7+1 및 15+1일, 및 진료 3의 날짜 또는 이의 하루 전에 모든 피검체로부터 수득된 용변 샘플을 바이러스 쉐딩을 측정하기 위한 효소면역측정법 (ELISA - 섹션 Ⅵ.6.1 참조)을 이용하여 백신 RV의 존재를 검출하기 위해 GSK 바이오로지칼스 (GSK Biologicals)에 의해 지정된 GSK 생물학적제제 또는 실험실에서 분석하였다.
진료 3까지의 투여 1 후의 미리결정된 시점에서 수득된 임의의 용변에서의 ELISA에 의해 입증된 로타바이러스 항원의 존재는, 피검체가 HRV 백신 또는 위약의 투여 1의 날짜에 로타바이러스에 대해 네거티브인 경우, 백신 바이러스 쉐딩으로 간주되고, 백신 반응 (즉, 백신 흡수)의 증거로 고려된다. 위약 피검체의 경우, 서열분석이 수행된다.
둘 모두의 결과가 이용가능하거나, 단지 하나의 결과가 이용가능시 이들 마커의 하나 이상에 대해 네거티브인 경우, 로타바이러스에 대해 처음에 네거티브인 피검체를 백신화 전의 시점에서 혈청에서 항-로타바이러스 IgA 항체 및 용변 샘플에서 로타바이러스 항원에 대해 네거티브인 피검체로 정의한다.
또한, 진료 1 에서 진료 3까지의 각각의 GE 에피소드 동안에 수득된 용변 샘플을 RV를 검출하기 위해 ELISA를 이용하는 GSK 바이올로지컬스에 의해 지정된 GSK 생물학적제제 또는 실험실에서 시험하였다. 포지티브인 경우, G 타입을 PCR 기재 방법으로 결정하였다. 이들 분자 방법은 다양한 G 타입 사이에서 매우 구별되고, 각각의 제공된 G 타입 내에서 매우 보존적인 VP7 유전자 내의 영역을 표적으로 한다. 예를들어, 구베아 (Gouvea) 등에 의해 개발된 RT-PCR 방법 (1990, J Clin Microbiol., 28:276-282)은 VP7 유전자의 다양한 영역에 위치된 다양한 유전형 특이적 프라이머의 칵테일 (cocktail)을 사용하였다. 젤 전기영동에 의해 판단된 생성된 PCR 생성물의 크기는 상응하는 G-유전형을 확인하기 위한 정보를 제공한다. 임의의 G1 RV가 검출되는 경우, 서열 분석 또는 상응하는 방법에 의해 백신 바이러스가 야생형 혈청형으로부터 구별된다.
진료 3까지 수거된 임의의 용변에서의 백신 바이러스의 임의의 검출이 백신 반응 (즉, 백신 흡수)의 증거로 간주된다.
Ⅵ.5.1. 혈청 분석
각각의 연구 진료시에 피검체로부터 수거된 전체 혈액 샘플로부터 수득된 혈청을 혈청 항로타바이러스 IgA 항체 농도를 측정하기 위해 GSK 바이오로지컬스에 의해 지정된 실험실에서 ELISA로 시험하였다. 분석 컷오프는 20 U/ml이었다. 항로타바이러스 IgA 항체에 대한 음성혈청반응 피검체를 분석 컷오프 값 미만의 항체 농도를 지니는 피검체로 규정하였다. 항로타바이러스 IgA 항체에 대해 양성혈청반응 피검체를 분석 컷오프 값을 초과하거나 이와 동등한 항체 농도를 지니는 피검체로 규정하였다.
Ⅵ.6. 면역원성: 혈청 분석
Ⅵ.6.1. ELISA에 의한 IgA 항체의 측정
이러한 분석은 인간 혈청에서의 로타바이러스 IgA의 검출을 가능케 하고, R. 워드 (R. Ward (1, 2))에 의해 최초로 고안되었으며, GSK 바이올로지컬스에 의해 적합화되었다. 이는 백신화 및/또는 감염 후의 면역 반응을 측정하기 위해 사용된다. 샘플을 GSK 바이올로지컬스 (GSK Biologicals, Rixensart, Belgium (또는 지정된 실험실))에서 분석하였다.
ELISA 분석의 기술
96-웰 플레이트를 항로타바이러스 항체 희석액으로 밤새 코팅시켰다. 웰을 세척하고, 백신 균주로 감염된 세포 (포지티브 웰) 또는 감염되지 않은 세포 (네거티브 웰)의 용해질을 첨가하였다. 회전 플랫폼에서 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 혈청 샘플 또는 표준 혈청의 희석액을 둘 모두의 웰 (포지티브 및 네거티브)에서 인큐베이션시켰다. 네거티브 웰의 사용은 비특이적 IgA 결합의 측정을 가능케 한다.
플레이트를 세척하고, 결합된 인간 IgA를 비오티닐화된 래빗 항-인간 IgA (진탕하에서 30분)를 첨가하여 검출하였다. 플레이트를 세척한 후, 최적 농도의 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 아비딘-비오틴을 각가의 웰에 첨가하고, 인큐베이션 (진탕하에서 30분 및 RT)시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 오르토페닐렌디아민 (OPD)를 첨가하였다. 이후, 플레이트를 인큐베이션 (어두운 곳에서 30분, 실온 (RT))시키고, 2N H2SO4로 반응을 중지시켰다. 최적 흡수를 490/620 nm에서 측정하였다. 포지티브와 네거티브 웰 사이의 차이를 측정함으로써 각각의 샘플/표준에 대해 특정 광학 밀도를 계산하였다. 표준 곡선에 의해 생성된 4개 파라미터 산정 함수를 이용하여 샘플의 농도를 결정하였다. 결과의 계산을 위해 표준 곡선 (작용 범위)의 가장 정확한 부분을 결정하였다. 표준 곡선의 작용 범위에 해당하는 각각의 공지되지 않은 미지수에 대한 값의 평균을 구하고, 희석 인자를 교정함으로써 표준 (농도 = 1000U/ml)에 대해 밀리리터당 유닛 (U/ml)의 항체 농도를 계산하였다. 각각의 실험은 네거티브 및 포지티브 대조군을 포함하였다. 모든 시약에 대해, 최적 농도를 미리 결정하였다.
참고문헌
Figure 112007066733916-PCT00006
Ⅵ.7. 결과: 항로타바이러스 IgA 항체 반응
표 51에 항로타바이러스 IgA 항체 GMC 및 혈청전환 속도 (면역원성에 대한 전체 백신화된 코호트)를 나타내었다. 표 52에 전체 백신화된 코호트에서 계산된 항로타바이러스 IgA 항체에 대해 혈청포지티브인 피검체에서 계산된 항로타바이러스 IgA 항체 GMC를 나타내었다.
혈청전환 속도와 관련하여 HRV 백신에 대한 항체 반응은 두번째 투여 후 1개월 후의 둘 모두의 백신 그룹에서 유사하였다 (HRV_Lyo 그룹에서 82.2% 및 HRV_Liq 그룹에서 90.1%). 풀링된 위약 그룹에서, 두번째 투여 후 1개월 후에 0%의 피검체가 혈청전환되었고, 이는 상기 연구가 집단에서 야생형 감염이 없는 시점에서 수행되었다는 것을 나타낸다.
표 51. 항로타바이러스 IgA 항체 GMC 및 혈청포지티브 속도 - 면역원성에 대한 전체 백신화된 코호트
≥20 U/ML GMC
95% Cl 95% Cl
그룹 시기 N n % LL UL 값 LL UL
HRV_LYO PRE 98 0 0.0 0.0 3.7 <20 - -
PⅠ(M1) 96 68 70.8 60.7 79.7 191.3 122.7 298.2
PⅡ(M2) 90 74 82.2 72.7 89.5 330.4 217.5 502.0
HRV_LIQ PRE 98 0 0.0 0.0 3.7 <20 - -
PⅠ(M1) 87 66 75.9 65.5 84.4 172.9 112.1 266.7
PⅡ(M2) 81 73 90.1 81.5 95.6 292.3 199.3 428.8
PL_POOL PRE 49 0 0.0 0.0 7.3 <20 - -
PⅠ(M1) 46 0 0.0 0.0 7.7 <20 - -
PⅡ(M2) 48 0 0.0 0.0 7.4 <20 - -
1. N = 이용가능한 결과를 지닌 피검체의 수.
2. n/% = 컷오프 이상의 농도를 지닌 피검체의 수/백분율.
3. 95% Cl = 95% 신뢰 구간; LL = 하한, UL = 상한.
4. PRE = 백신화전.
5. PⅠ(M1) = HRV 백신 또는 위약의 첫번째 투여후 1개월 후 (진료 2).
6. PⅡ(M2) = HRV 백신 또는 위약의 두번째 투여후 1개월 후 (진료 3).
7. 데이터베이스 배포 = 07DEC2005.
표 52. 항로타바이러스 IgA 항체에 대해 혈청포지티브인 피검체에 대해 계산된 항로타바이러스 IgA 항체 GMC - 면역원성에 대한 전체 백신화된 코호트
GMC
95% Cl
그룹 시기 N 값 LL UL
HRV_LYO PⅠ(M1) 68 644.7 471.4 881.8
PⅡ(M2) 74 703.8 525.0 943.6
HRV_LIQ PⅠ(M1) 66 428.1 302.1 606.8
PⅡ(M2) 73 423.1 305.9 585.2
1. N = 항로타바이러스 IgA 항체에 대해 혈청포지티브인 피검체의 수.
2. 95% Cl = 95% 신뢰 구간; LL = 하한, UL = 상한.
3. PⅠ(M1) = HRV 백신 또는 위약의 첫번째 투여후 1개월 후 (진료 2).
4. PⅡ(M2) = HRV 백신 또는 위약의 두번째 투여후 1개월 후 (진료 3).
5. 데이터베이스 배포 = 07DEC2005.
Ⅵ.8. 결론
● 혈청전환 속도와 관련된 면역원성은 두개의 백신 제형 사이에서 유사하였다.
● 백신의 액체 제형은 0, 1 개월 스케줄에 따라 아동에게 투여시 매우 면역원성이었다.
IgA는 로타바이러스 백신의 효능에 대한 우수한 마커이므로, 상기 데이터는 진료소에서 시험된 제형의 보호 효과를 뒷받침한다.

Claims (45)

  1. 로타바이러스 항원, 당 및 카르복실레이트를 포함하는, 인간 유아의 경구 투여에 적합한 액체 로타바이러스 면역원성 조성물로서, 약 5.0 내지 약 8.0의 pH를 지니고, 5 mM 미만의 포스페이트를 포함하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 조성물이 1 mM 미만의 포스페이트를 포함함을 특징으로 하는 액체 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 조성물이 0.1 mM 미만의 포스페이트를 포함함을 특징으로 하는 액체 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 포스페이트가 존재하지 않음을 특징으로 하는 액체 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 pH가 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.5임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 조성물의 pH가 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 카르복실레이트가 4를 초과하는 pKa를 지닌 카르복실산으로부터 유래되거나, 4를 초과하는 평균 pKa를 지닌 디카르복실산 또는 트리카르복실산으로부터 유래됨을 특징으로 하는 액체 조성물.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 카르복실레이트가 아디페이트, 시트레이트, 말레이트, 아세테이트, 숙시네이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 말로네이트, 글루타레이트, 말레에이트, 글리콜레이트, 락테이트, 글루코네이트, 푸마레이트, 타르타레이트, 및 이들의 두개 이상의 임의의 배합물로 부터 선택됨을 특징으로 하는 액체 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 카르복실레이트가 아디페이트임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 카르복실레이트가 약 50 mM 내지 약 2 M의 농도로 존재함을 특징으로 하는 액체 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 카르복실레이트가 약 100 mM 내지 약 1 M의 농도로 존재함을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 카르복실레이트가 약 400 mM 내지 약 700 mM의 농도로 존재함을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 12항중 어느 한 항에 있어서, 당이 글리세롤, 에리트로오스, 에리트리올, 자일리톨, 아라비톨, 리보오스, 자일로오스, 아라비노오스, 글루코오스, 타갈로오스, 만노오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 이노지톨, 소르비톨, 만니톨, 갈락티톨, 글루코오스와 프룩토오스의 배합물, 말토오스, 소포로오스, 락토오스, 셀로비오스, 멜리비오스, 트레할로오스, 수크로오스, 팔라티노오스, 말툴로오스, 락툴로오스, 말티톨, 락티톨, 라피노오스, 말토트리오스, 멜레지토오스, 셀로트리오스, 시리톨, 말토테트라오스, 스타키오스, 셀로테트라오스, 말토펜타오스, 셀로펜타오스, 말토헥사오스, 셀로헥사오스, 및 올리고당류로 구성된 목록으로부터 선택됨을 특징으로 하는 액체 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 당이 수크로오스 또는 덱스트로오스임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 14항중 어느 한 항에 있어서, 당의 농도가 약 1 w/w 내지 약 70% w/w임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 당의 농도가 약 25 w/w 내지 약 60% w/w임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 당의 농도가 50% w/w 또는 55% w/w임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  18. 제 1항 내지 제 17항중 어느 한 항에 있어서, 카르복실산을 추가로 포함함을 특징으로 하는 액체 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 카르복실산이 아디프산, 시트르산, 말산, 아세트산, 숙신산, 탄산, 프로피온산, 부티르산, 말론산, 글루타르산, 말레산, 글리콜산, 락트산, 글루콘산, 푸마르산 및 타르타르산으로 구성된 목록으로부터 선택됨을 특징으로 하는 액체 조성물.
  20. 제 1항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 이온을 추가로 포함함을 특징으로 하는 액체 조성물.
  21. 제 1항 내지 제 20항중 어느 한 항에 있어서, 로타바이러스 항원이 생 로타바이러스, 예를들어 약독된 생 로타바이러스임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 약독된 생 로타바이러스가 약독된 인간 생 로타바이러스임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 약독된 인간 생 로타바이러스가 수탁 번호 ATCC VR 2272로 수탁된 HRV 89-12C2 균주, 이의 프로제니 (progeny), 재조합체 (reassortant) 및 면역학적 활성 유도체; 및 수탁 번호 ECACC 99081301로 수탁된 HRV P43 균주, 이의 프로제니, 재조합체 및 면역학적 활성 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 액체 조성물.
  24. 제 1항 내지 제 23항중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 베이비 로셋-라이스 (Baby Rosett-Rice) 분석으로 측정시 8분 이상의 제산 능력을 지님을 특징으로 하는 액체 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, 조성물이 베이비 로셋-라이스 분석으로 측정시 12분 이상의 제산 능력을 지님을 특징으로 하는 액체 조성물.
  26. 제 24항에 있어서, 조성물이 베이비 로셋-라이스 분석으로 측정시 8 내지 23분의 제산 능력을 지님을 특징으로 하는 액체 조성물.
  27. 제 25항에 있어서, 조성물이 베이비 로셋-라이스 분석으로 측정시 12 내지 23분의 제산 능력을 지님을 특징으로 하는 액체 조성물.
  28. 제 25항 또는 제 27항에 있어서, 조성물이 베이비 로셋-라이스 분석으로 측정시 12 내지 20분의 제산 능력을 지님을 특징으로 하는 액체 조성물.
  29. 제 1항 내지 제 28항중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 37℃에서 7일, 4℃에서 1년, 또는 4℃에서 2년의 조건중 하나 이상에서 안정적임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  30. 제 1항 내지 제 29항중 어느 한 항에 있어서, 백신임을 특징으로 하는 액체 조성물.
  31. 제 1항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 0.2 ml 내지 2.0 ml의 투여량으로 제공됨을 특징으로 하는 액체 조성물.
  32. 제 31항에 있어서, 조성물이 0.5 ml 내지 1.5 ml의 투여량으로 제공됨을 특징으로 하는 액체 조성물.
  33. 제 32항에 있어서, 조성물이 약 1.5 ml의 투여량으로 제공됨을 특징으로 하는 액체 조성물.
  34. 로타바이러스 관련 질병을 치료하거나 예방하기 위한 면역원성 조성물의 제조에서의 로타바이러스 항원, 당 및 카르복실레이트의 용도로서, 상기 면역원성 조성물이 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0의 pH를 지니고, 5 mM 미만의 포스페이트를 포함함을 특징으로 하는 용도.
  35. 로타바이러스 관련 질병의 예방을 위한 제 1항 내지 제 30항중 어느 한 항에 청구된 액체 조성물의 제조에서 약독된 인간 생 로타바이러스의 용도.
  36. 제 34항 또는 제 35항에 있어서, 치료 또는 예방이 1회 투여 시점에서 4-15 내의 연령의 유아에게 안전하고 유효한 양의 약독된 인간 생 로타바이러스 조성물을 2회 경구 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 용도.
  37. 제 1항 내지 제 30항중 어느 한 항에 따른 액체 제형의 유효량을 이를 필요로 하는 인간 피검체에 투여함으로써 인간의 로타바이러스 관련 질병을 예방하거나 치료하는 방법.
  38. 인간의 로타바이러스 감염을 예방하기 위한, 제 34항 내지 제 36항중 어느 한 항에 청구된 용도 또는 제 37항에 청구된 방법.
  39. 인간의 로타바이러스 위장염을 예방하기 위한, 제 34항 내지 제 36항중 어느 한 항에 청구된 용도 또는 제 37항에 청구된 방법.
  40. 인간의 로타바이러스 중증 위장염을 예방하기 위한, 제 39항에 청구된 용도 또는 방법.
  41. 제 38항 내지 제 40항중 어느 한 항에 있어서, 위장염 또는 중증 위장염이 액체 제형에 함유된 로타바이러스 균주와 같은 혈청형이 상이한 로타바이러스 균주에 의해 야기됨을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
  42. 조성물이 0.2 ml 내지 2.0 ml의 투여량으로 제공되는, 제 34항 내지 제 36항 또는 제 38항 내지 제 41항중 어느 한 항에 청구된 용도 또는 제 37항 내지 제 41항에 청구된 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 조성물이 0.5 ml 내지 1.5 ml의 투여량으로 제공됨을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
  44. 제 42항 또는 제 43항에 있어서, 조성물이 약 1.5 ml의 투여량으로 제공됨을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
  45. 로타바이러스 항원, 당 및 카르복실레이트와 약학적으로 허용되는 희석제를 혼합시키는 것을 포함하여, 제 1항 내지 제 33항중 어느 한 항에 따른 액체 로타바이러스 조성물을 제조하는 방법.
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