TWI358303B - Composition - Google Patents

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1358303 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用作醫藥組合物及疫苗之新穎液體輪狀病 毒調配物’關於製備其之方法及關於其在預防輪狀病毒相 關疾病，尤其為人類輪狀病毒相關疾病上的用途。 【先前技街】 在世界許多地區，急性、感染性腹填為疾病與死亡之主 導原因。在發展令國家’腹瀉疾病之影響非常重大。對亞 洲、非洲及拉丁美洲而言，已估計每年有3〇億至4〇億之腹 瀉病例且彼等病例中約500萬至1000萬導致死亡（Waish， J.A.等人：Ν· Engl. J. Med.，301:967-974 (1979))。 已認識到輪狀病毒為幼兒及幼童中嚴重腹瀉之最重要原 因之一（Estes，M.K. Rotaviruses and Their Replication in

Fields Virology，第三版，Fields等人編輯，Raven pubHshers， Philadelphia, 1996)。據估計，每年輪狀病毒疾病造成超過 600,000之死亡。輪狀病毒誘發之疾病最通常影響年齡在6 與24個月之間的兒童，且該疾病之流行高峰一般發生在溫 帶氣候中之較冷月份及熱帶地區之全年。輪狀病毒通常藉 由糞便·口腔途徑自人至人傳播，潛伏期為約i至約3天。與 6個月至24個月之年齡組中之感染不同，新生兒一般無症狀 或僅具有輕微疾病。與通常幼童中所遇之嚴重疾病對照， 由於先前輪狀病毒感染使大部分成人受到保護，所以大部 分成人感染為輕微或無症狀（0ffit，PA等人，c〇mp Ther， 8(8):21·26，1982)。 108304.doc 1358303 t'

輪狀病毒為球形，；5甘々必# A 八名稱係源自其獨特外層及内層或 雙層殼之衣殼結構。通常輪狀病毒之雙層殼衣殼結構圍繞 3有基因”且之内層蛋白質殼或核心。輪狀病毒之基因组包 含雙股RNA之11個片段，該等職段編碼至少U種獨特病 毒蛋白質。此等病毒蛋白質之兩者被指定為VP4㈣白質） 及VP7(G蛋白質其為排列在雙層殼之衣殼結構之外部上 的結構蛋白質。輪狀病毒之内層衣殼呈現一種蛋白質其 為指定為VP6之輪狀病毒蛋白質。在引起跟隨輪狀病毒❹ 之免疫反應上，此等三種特定輪狀病毒蛋白質之相對重要 性尚不清楚HVP6蛋白質決定群抗原及子群抗原，且 VP4及VP7蛋白質為血清型特異性之決定因素。 迄今為止，已識別至少14種輪狀病毒G幻青型Μ種輪狀 病毒仏清型（1^1咖过&七_181)抓八111】1^

Health2〇〇〇,9,3〇5-33〇)。其中，已在人類輪狀病毒中識別 出此等血清型中之10種(3血清型及6種1>血清型。 VP7蛋白質為-種38，_廳糖蛋白（當非糖基化 巩_娜)，其為基因組片段7、8或9之翻譯產物，此取決 於株。此蛋白質跟隨輪狀病毒之感染刺激主要中和抗體的 形成》VP4蛋自質為近似88,〇〇〇MW之非糖基化蛋白質，其 為基因組片段4之翻譯產物。此蛋白f亦跟隨輪狀病毒之感 染刺激中和抗體。由於VP4及VP7蛋白f係中和抗體所針對 之病毒蛋白質，故咸信其為研製輪狀病毒疫苗之主要 物，該輪狀病毒疫苗為抵抗輪狀病毒疾病提供保護。、' 。人已知在童年早期天然輪狀病毒感染引起保護性免 108304.doc 1358303 疫。 發現病毒後，用於預防輪狀病毒感染之早期疫苗研製始 於20世紀70年代。最初研究來自動物及人類之減毒株同 時更多近期努力已集中於人類_動物基因重置。 新穎輪狀病毒調配物之研製必須遵從許多要求，包括在 廣泛範圍之環境及儲存條件下全世界之分佈潛能及穩定 性詳0之，與至/JBL或較尚溫度相比，調配物之穩定性， 尤其醫藥或疫苗組合物之穩定性一般在較低溫下將更好。 因此已有一種穩定方法來研製可冷凍（_2〇<t至_7〇<t )儲 存之疫苗調配物或研製在大約冰箱溫度（2<t至8<t )可長時 間保持的經冷凍乾燥之疫苗^然而冷凍乾燥方法具有有限 的能力且與高生產成本關聯，此為一已知事實。此外，經 冷束乾燥之疫苗具有更複雜之加工以用於投與，因為其可 需要更複雜因此相對昂貴的裝置，諸如多腔室/瓶疫苗，該 等疫涪在一腔室中具有活性成分且在另一腔室中具有復水 液體。經冷凍乾燥之疫苗亦與較高船運成本及儲存成本關 聯。對發展中世界的一些國家而言，此等選擇可能不充分， 在該等國家中，必須財政上在負擔得起投藥裝置且生產及 儲存之基礎設施的可用性可能不存在或不可靠。 因為習知將輪狀病毒經口投與人類幼兒，所以此途徑給 致免疫輪狀病毒組合物帶來若干挑戰。 輪狀病毒在酸性環境下迅速失活，例如曝露於酸性緩衝 液或酸性胃液中（C. Weiss 及 H.F. Clark，1985，J. Gen. Virol.，66, 2725-2730; Τ· Vesikari等人，1984, The Lancet， I08304.doc 1358303 第 700 頁；R.H.Foster及 A.J.Wagstaff，1998, BioDrugs Feb: 9(2) 155-178)。因此需要輪狀病毒組合物以一種使其在儲存 期間及投與進入宿主接受體後穩定的方式調配。 主要忍欲將輪狀病毒在早在嬰兒4週時投與嬰兒。小疫苗 劑1體積’諸如低於2 ml或甚至1.5 ml劑量體積將對該人群 有利。因此需要輪狀病毒組合物以小劑量體積調配。 吾人已知用於液體病毒疫苗之穩定調配物。例如EP 〇 〇65 905大體上揭示適於一系列病毒之穩定組合物，諸如引起麻 疹或流行性感冒之彼等病毒，且其尤其揭示適於活減毒病 毒的含磷酸鹽緩衝液之穩定溶液。 其他穩定調配物揭示於\^〇 98/13065及（：1&4等（？6£14“ Infect Dis J. 2003 Oct; 22(10):914-20)中。在其他組分中， 該等調配物亦要求填酸鹽之存在以充當緩衝劑來中和胃部 酸度。然而，此等調配物與成功研製輪狀病毒調配物之上 述要求不相容，特定而言其與減少之疫苗劑量體積不相 容’此減少之劑量體積最適於人類幼兒。詳言之，本發明 之發明者已發現：將此先前技術之調配物修改為低量設定 (諸如15 ml或更低），同時保持有效抗酸能力導致問題產 生’該等問題由調配物組分，尤其為磷酸鹽緩衝液之不適 當濃度產生。 因此需要研製替代輪狀病毒調配物，尤其為可承受胃部 酸度且儘管缺乏磷酸鹽但在冷箱中穩定之替代液體調配 物。另外需要使該等替代調配物亦以盡可能小之疫苗劑量 體積成功調配。 108304.doc ⑧ 1358303 因此本發明不僅提供缺乏磷酸鹽或僅含有最小量磷酸鹽 之替代穩定致免疫組合物，亦使得輪狀病毒以適於經口投 與人類幼兒之低劑量體積進行調配。 【發明内容】 因此，在本發明之第一態樣中提供適於經口投與人類幼 兒之液體輪狀病毒致免疫組合物，其包含輪狀病毒抗原、 糖及缓酸鹽，丼中該組合物具有約pH 5·〇與約pH 8.0之間的 pH值且包含少於5 mM之磷酸鹽。所主張組合物中磷酸鹽濃 度適合不超過1 mM。 在本發明之一特定態樣中，適合疫苗劑量通常為丨5如 或少於2.5 ml之任何適合體積，諸如2 或更少之體積，此 劑量適於經口投與嬰兒或幼兒。詳言之此劑量體積將使得 調配物之技術可行性成為可能並對調配物之致免疫潛能無 有害影響。所主張之組合物提供優於先前技術之含磷酸鹽 調配物的優勢，其可承受胃部酸度、保持致免疫及經長期 存放期穩定’同時與劑量體積少於通常劑量體積之調配物 相容’諸如少於2.0 ml，或甚至與1.5 ml或更少之劑量體積 相容。 在一特定實施例中，如藉由嬰兒羅塞特-賴斯檢定評價 (Baby Rossett-Rice assay)(如實例m 2.2中所詳述’自基本 羅塞特-賴斯測試修改），根據本發明之液體致免疫組合物具 有ό與23分鐘之間的抗酸能力。抗酸能力將適合為至少8分 鐘’通常至少12分鐘且適合範圍在12與20分鐘間。與含磷 酸鹽之先前技術調配物相比，令人驚奇地該等所主張的組 108304.doc 1358303 合物甚至在較少劑量體積時不僅顯示可接受之抗酸能力而 且顯示更高之抗酸能力。 在另一態樣中’提供一種用於製備該液體輪狀病毒致免 疫組合物的方法，該方法包含將輪狀病毒抗原、糖及羧酸 鹽與醫藥學上可接受之稀釋劑混合。 在另一態樣中本發明亦包括與羧酸鹽及糖混合之輪狀病 毒抗原的用途’其用於製備供預防或治療人類輪狀病毒相 關疾病的經口致免疫組合物，其中該組合物含有不多於5 mM之麟酸鹽及具有約pH 5.0與約pH 8.0之間的pH值。 在又一態樣中亦提供一種方法，該方法藉由將有效量之 該液體致免疫組合物投與需要其之人類受試者來治療或預 防人類輪狀病毒相關疾病。 本發明之其他態樣及優勢在其較佳實施例之以下詳細描 述中進一步予以描述。 【實施方式】 本發明之發明者已研製新穎液體輪狀病毒組合物，該組 合物致免疫、在冷箱溫度（2°C與7°C之間，通常在4°C )下穩 定’經口投與時其可承受胃之固有酸性且與小劑量體積相 容。 液體組合物意指以與乾燥形式對立之流體形式存在的調 配物’其體積在恒定特定條件（例如在室溫或冷箱溫度下 在大氣壓力下）下固定及其形狀由其填充之容器決定。 此說明書中提及之公告及專利或專利申請案内的主題物 質及所揭示之資訊以引用的方式倂入本文中。 I08304.doc 10· ⑧ 1358303 在每一情況下’本文中發明者意欲將術語”包含"視情況 用術語"由…組成"替代。 本發明提供一種包含輪狀病毒抗原、糖及羧酸鹽之液體 輪狀病毒致免疫組合物，其中該組合物具有約pH 50與約 pH 8.0之間的PH值且包含少於5 mM之磷酸鹽β當其與含磷 酸鹽之調配物比較時，本發明之組合物顯示非常好的穩定 性概況，同時維持致免疫性概況。此等組合物至少如其含 構酸鹽之對應物一樣穩定。與存在磷酸鹽之先前技術調配 物比較’本組合物之又一優勢為其可以小劑量體積製備， 諸如低於2.0 ml(通常例如i.5 。 在一特定實施例中，致免疫組合物内的磷酸鹽濃度不超 過5 mM，適合地為1 mM，尤其不超過〇 5 mM。磷酸鹽稱 為璃酸（亦稱為正磷酸（H3P〇4))之鹽，通常使用鈉鹽或鉀鹽 或鈉鹽及鉀鹽之混合物（例如：Na3p〇4、Na2HP04、

NaH2P04、K3P〇4、Κ2ΗΡ04、KH2P04)。磷酸鹽濃度適合為 0.4mM或0.4mM以下，通常為〇2mM或0.2mM以下，理想 地為0.1 mM或0.1 mM以下。在另一特定實施例中，本文所 主張之組合物無磷酸鹽。當磷酸鹽存在時，其通常來自細 胞培養基或用作豨釋劑之鹽水緩衝液，諸如DMEM(達爾伯 克改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified Eagle Medium))、 伊格爾 BME 基礎培養基（Eagle BME basal medium)或 PBS。 整個說明書中所提及之磷酸鹽濃度為經計算之濃度，其 由在製備所生張之組合物中起作用的含磷酸鹽之化學品的 量來測定。或者’存在於本文所主張之組合物中的磷酸鹽 108304.doc ⑤ 1358303 濃度可使用常規分析技術在實驗上量測。 一種適合技術為名為"Nanocolor"之比色檢定，其由 Macherey-Nagel出售（目錄n。918 78)。此方法係基於磷酸-鉬酸鹽-釩酸鹽在酸性溶液中形成之黃色錯合物的光度測 定。該檢定之數量限制為2 pg/ml璃酸鹽或0.02 mM。 另一方法為藉由原子發射光譜技術，諸如感應耦合電漿· 原子發射光譜法（ICP-AES)(Boss & Fredeen，in Concepts， Instrumentation, and Techniques in Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy, Perkin Elmer編輯， 第二版’ 1997-在先前之第72頁上參見方法）量測磷（p)之劑 量。該檢定之數量限制為0.030 pg/ml磷，對應於0.00032 mM 之磷酸鹽濃度。 在一實施例中’組合物之pH值在pH 5.0與pH 8.0之間。在 另一特定實施例中’所主張組合物之pH值在約pH 5 · 5至約 pH 7.5之間《"約pH"意謂在所述pH值之〇2單位内。特定言 之，組合物之pH值在ΡΗ 5.5與pH 7.5之間。舉例而言，組合 物之pH值在約pH 6.0至約pH 7.0之間，尤其在pH 0.0與pH 7.0之間，通常在pH 6 2與1)^[ 6 8之間或pH 6二與^^ 6 6之 間。預期約6.4之pH值’尤其為6·4之pn值。吾人已知輪狀 病毒在酸性pH值（諸如低於4.〇ipH值）下受到負面影響，且 吾人預期在中性或甚至輕微鹼性pH值下，意即pH值範圍為 7.0至8.0時獲得最大穩定性，例如在先前技術之磷酸鹽緩衝 調配物中所獲得之穩定性°如實驗部分所示，儘管缺乏鱗 鷇鹽，但本發明之組合物在所主張之pH值範圍已顯示良好 108304.doc 的穩定性概況，且此外，甚至在略微酸性條件下已令人驚 奇地顯示可接受之穩定性概況及致免疫性概況，略微酸性 條件意即大約pH 6.0至7.0，諸如大約6.4之pH值。 本文所主張之液體組合物包含羧酸鹽。 羧酸根（"-COO·")為羧酸之解離形式，其係鹼性物質中和 酸性官能基（"-COOH")之結果。羧酸為含有羧基”_c〇〇H" 之化合物；其形式上由羰基（"-CO-")及羥基（"·〇η")組合而 成。然而此等兩部分間之相互反應改變其化學特性以使得 遇為整個基團係具有自身特徵特性之新官能基（JB Hendrickson 之 Organic Chemistry, D.J. Cram 及 G S Hammond，McGraw-Hill Book Company，1970年第三版第 1 3 1頁）。雖然國際純化學及應用化學聯合會（internati〇nai

Union for Pure and Applied Chemistry，IUPAC)推薦使用術 語烧酸（對一元羧酸而言）及院二酸（對二元缓酸而言），但在 本文中已使用大部分該等羧酸之俗名，因為此等產品為熟 習此項技術者所熟知。舉例而言，乙酸（acetic acid)之IUPAC 名稱為乙酸（ethanoic acid)及對於己二酸（adipic acid)而言 IUPAC名稱為己二酸（hexanedioic acid)。 在一特定實施例中，使用來自無機酸或適合地來自有機 酸之羧酸鹽。在一特定實施例中，該羧酸鹽衍生自弱酸。 例如該羧酸鹽為選自由以下各物組成之群的一種羧酸鹽： 己二酸鹽、檸檬酸鹽、頻果酸鹽、乙酸鹽、丁二酸鹽、丙 酸鹽、丁酸鹽、丙二酸鹽、戊二酸鹽、順丁烯二酸鹽、乙 醇酸鹽、乳酸鹽、葡糖酸鹽、反丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、 108304.doc •13- 1358303 庚二酸鹽及其中兩者或兩者以上之任一組合。適合羧酸鹽 為衍生自pKa>4之羧酸的羧酸鹽或衍生自用數值平均pKa>4 之二元羧酸或三元羧酸的羧酸鹽（二元羧酸鹽或三元羧酸 鹽）（表9)。前一種類之實例包括衍生自丙酸、丁酸及乙酸之 缓酸鹽。後一種類之實例包括衍生自檸檬酸、順丁烯二酸、 丙二酸、丁二酸、己二酸、戊二酸及蘋果酸之羧酸鹽。 在—特定實施例中該羧酸鹽屬於GRAS目錄，意即美國食 口口藥物官理局（Food and Drug Administration of the USA)普 遍認為安全之羧酸鹽，且其係選自包含乙酸鹽、丙酸鹽、 蘋果酸鹽、戊二酸鹽、己二酸鹽、乳酸鹽、反丁烯二酸鹽 及酒石酸鹽之目錄。該羧酸鹽適合為一種己二酸鹽，意即 己二酸一鈉鹽、適合地為己二酸二鈉或己二酸二鉀或己二 酸約。 在一特定實施例中’ 50 mM至2M間之羧酸鹽濃度適用於 液體輪狀病毒組合物。應瞭解經由常規實驗、根據缓酸鹽 之性質、待達成之抗酸能力及疫苗劑量體積，可適當修改 以上所提及之範圍内的羧酸鹽濃度。舉例而言，當需要高 抗酸潛能時，可使用1 Μ以上之高羧酸鹽濃度，諸如藉由嬰 兒羅塞特-賴斯測試針對1.5 mi劑量體積所評價之8分鐘以 上、適合地10分鐘以上或12分鐘以上的高抗酸潛能。通常 使用1 Μ或1 Μ以下之濃度，諸如1〇〇爪^與i ¥之間的濃 度，通常200 mM與800 mM之間的濃度。適合羧酸鹽濃度包 含於約300 mM與約800 mM之間，適合地在4〇〇 mM與700 mM之間。詳言之，當羧酸鹽為己二酸鹽時，適合濃度範圍 108304.doc ίΑ … ⑧ 1358303 在400與500 mM之間。然而熟習此項技術者將意識到所述 數值之10-20%内的濃度可為適當，意即當陳述100 mM時， 亦揭示並意謂包含80-90 mM至110-120 mM之範圍。針對各 種羧酸鹽，在下表1中給出說明性濃度。 表1-在特定濃度下羧酸鹽之抗酸能力 此等說明性參數針對1.5 ml之劑董體積給出且對應於表1 中給出之所提及實例號。 缓酸鹽(Mw) 羧酸鹽濃度 (M) 在t=0時 BRR中之 pH值 抗酸能力 (分鐘)1 在實例II中 樣品N° 己二酸鹽(144) 0.372 6.38 8 91 己二酸鹽(144) 0.465 6.24 12 92 己二酸鹽(144) 0.548 6.50 16 93 己二酸鹽(144) 0.652 6.11 20 94 D，L-蘋果酸鹽(132) 0.621 6.15 8 72 D，L-蘋果酸鹽(132) 0.746 6.08 12 64 D，L-蘋果酸鹽(132) 0.895 5.35 15 77 乙酸鹽(59) 1.000 6.14 12 89 檸檬酸鹽(189) 0.441 6.55 12 129 108304.doc -15 - ⑧ 1 藉由根據實例ΠΙ.2.2修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試評價 藉由混合羧酸與羧酸鹽可獲得本文所主張之液體輪狀病 毒致免疫組合物之pH值。詳言之，羧酸可與不同羧酸鹽混 合來使用，例如檸檬酸鹽與己二酸組合。當一些化學品不 易得到或為簡化調配步驟而使用市售化學品時此可為有 利。舉例而言，該（等）羧酸之一種（或多種）可選自由以下各 物組成之列：己二酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸、丁二酸、 碳酸、丙酸、丁酸、丙二酸、戊二酸、順丁烯二酸、乙醇 酸、乳酸、葡糖酸、反丁烯二酸、酒石酸、庚二酸，且以 適合比例與選自由以下各物組成之列之羧酸鹽的一種（或 多種）混合：己二酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、乙酸鹽、^ 二酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、丙二酸鹽、戊二酸鹽、順丁歸 二酸鹽、乙靜酸鹽、乳酸鹽、葡糖酸鹽、反丁烯二酸鹽、 酒石酸鹽、庚二酸鹽。 1 本文所主張之液體組合物包含糖^蔗糖尤其適合。右旋 糖為另—適合糖。亦▼使用其他糖或糖醇來代替薦糖或右 旋糖，包括例如：丙三醇、赤藻糖、赤蕩糖醇、木糖醇、 阿拉伯糖醇、核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、塔格糖、 甘露糖、半乳糖、果糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、半乳 糖醇、葡萄糖與果糖之混合物、麥芽糖、槐糖、乳糖、1 維二糖、蜜二糖、海藻糖、蔗糖、巴拉金糖、麥芽輞糖' 乳果糖、麥芽糖醇、乳糖醇、蜜三糖、麥芽三糖、松三糖、 纖維三糖、ciritol、麥芽四糖、水蘇糖、纖維四糖、麥芽五 糖、纖維五糖、麥芽六糖、纖維六糖、寡醣。 典型糖濃度自約1% w/w至約70% w/w變化，例如約 w/w至約60% w/w。然而熟習此項技術者將意識到糖之性質 及濃度必須最優化，以使得確保滿意的病毒生存力同時將 黏度維持在與調配物之後續加工步驟（如過濾）相容之水 平》在一特定實施例中使用蔗糖。通常其濃度維持在最小 值3〇% W/W。此外，可用更高糖濃度，意即30% w/w以上之 糖濃度以確保長期儲存，因為吾人預期該等調配物之高等 滲壓將預防細菌生長β因此，本文所主張之液體組合物中 庶糖濃度的下限適合為3〇%w/w或更高，諸如35%w/w或更 108304.doc -16- 1358303

高’適合地為40% w/w或更高。適合蔗糖濃度自約40% w/w 至約70°/。w/w變化。例如蔗糖之適合濃度將在45% w/w與 60〇/〇 w/w之間，適合地在50%评/评與55% w/w之間。尤其使 用約50°/。w/w或約55% w/w之濃度的蔗糖》最終蔗糖濃度適 合為 50% w/w或 55% w/w。 熟習此項技.術者將瞭解當用另一種糖代替蔗糖時，可進 行糖;辰度之常規最優化以確保病毒穩定性。

此外’糖之所述數值可略微修改以考慮諸如劑量體積之 調配/製造參數。因此，熟習此項技術者將意識到在所述數 值之10〇/°内的濃度可為適當，意即當陳述50% w/w時，亦揭 示並意謂包含45% w/w-5 5% w/w之範圍。

本發明之液體輪狀病毒致免疫組合物亦包含輪狀病毒名 原。詳言之，本文所主張之液體組合物為一種致免疫組< 物，如疫苗組合物。應瞭解輪狀病毒抗原意謂適用於疫j 調配物之任何輪狀病毒抗原。尤其涵蓋經口之活輪狀病^ 抗原《舉例而言，任何適合的輪狀病毒抗原可選自由以_ 各物組成之群：來自動物或人類之活減毒輪狀病毒，尤4 為人類活減毒輪狀病毒；基因重置輪狀病毒，尤其為（伸_ 限於)人類-人類基因重置輪狀病毒、牛-人類基因重置輪; 病毒或恆河猴-人類基因重置輪狀病毒。 在本發明十涵蓋所有輪狀病毒株（人類株或動物株 > 人妻 輪狀病毒株為適合。詳言之’在一實施例中輪狀病毒心 為包含單-變異體或實質上單-變異體之減毒人; 毒群，該變異體由編碼至少一種主要病毒 ' |贫臼質之核苷g 108304.doc -17- 1358303 序列界定’該等主要病毒蛋白質被指定為如W〇 0 i Η 2797 中揭示的VP4及VP7，詳言之該變異體為由w〇 〇1/12797之 表2、表3.1及3·2闡明之突變所界定的任何（包括一或多種） 變異體。在特定實施例中，輪狀病毒抗原為以下人類活減 毒輪狀病毒株之任一種：以登記號八1(：(： VR 2272寄存之 HRV 89-12C2株（如EP 0 557 427中描述）’其後代、基因重 置及其免疫學活性衍生物；以登記號ECACC99〇813〇1寄存 之HRV P43株（如WO 01/12797中描述），其後代、重組及其 免疫學活性衍生物。 具有任一以上所提及之寄存株之特徵的輪狀病毒群亦為 適合疫苗株。藉由使該等株經受進一步處理，諸如藉由使 用活病毒繼代、選殖或其他程序來繁殖該等株；或藉由以 任何方式，包括藉由基因工程技術或基因重置技術來修飾 該等寄存株可獲得自該等寄存株之衍生物。該等步驟及技 術為此項技術t所熟知。特別關注之輪狀病毒抗原為任一 該等寄存株之後代及其免疫學活性衍生物。免疫學活性衍 生物意謂獲自或具有任一該等寄存株之物質，尤其獲自或 具有以登記號ECACC 99081301寄存之HRVp43株，尤其當 注入宿主動物時能引起反應性抵抗輪狀病毒之免疫反應的 病毒抗原。 衍生自上述寄存株之物質亦為適合輪狀病毒抗原，且包 括蛋白質及遺傳物質。尤其關注基因重置輪狀病毒，其包 含任-該等㈣株之至少—種抗原或至少—個片段，例如 包含輪狀病毒之有毒株的基因重置輪狀病毒其中任一該 108304.doc • 18 - 等寄存株之基因組片段或其部分已替代11個基因組片段之 一個或一個之部分。特定而言，輪狀病毒基因重置可具有 有用特性，在該基因重置輪狀病毒中為NSP4編碼之片段或 部分片段為任一該等寄存株之片段或部分片段。基因重置 輪狀病毒及其製備技術為吾人所熟知（Foster，R. H.及 Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs，Gev，9 (2)，155-178, 1998)。 根據常規生產技術可生產所主張之組合物的輪狀病毒抗 原。通常輪狀病毒抗原製備可衍生自組織培養方法，該等 方法用以繁殖病毒或表達重組輪狀病毒抗原。用於生長病 毒之適合細胞基質包括：例如，諸如MDCK之狗腎臟細胞 或來自MDCK之純系的細胞；MDCK樣細胞；諸如包括尤其 適合之Vero細胞之AGMK細胞的猴腎臟細胞；諸如BSC-1、 LLC-MK2及MA104之猴腎臟源的其他細胞株；適合之豬細 胞株；或適於生產用於疫苗之目的之輪狀病毒的任何其他 哺乳動物細胞類型。適合細胞基質亦包括人類細胞，如 MRC-5細胞。適合細胞基質不限於細胞株；例如亦包括初 生細胞。

以上所述之寄存株與其他輪狀病毒變異體（例如其他經 選殖之變異體或其他基因重置輪狀病毒）的混合物，或與其 他病毒、尤其為其他減毒病毒的混合物亦在本發明之範疇 内。詳言之，根據本發明之組合物含有兩種輪狀病毒抗原。 詳言之，該組合物内的一種抗原為以登記號ECACC 108304.doc •19- 1358303 9908 1301寄存之HRVP43株，且另一種抗原為其基因重置衍 生物或任何其免疫學活性衍生物。 包括於所主張之組合物中的輪狀病毒抗原可為單價抗原 輪狀病毒株，意即含有單一輪狀病毒株；或多價輪狀病毒 株，意即含有至少兩種或兩種以上的輪狀病毒株β 熟習此項技術者將瞭解可從寄存機構獲得之來自人類或 動物來源的其他易得減毒株亦適合及可用作所述寄存株的 替代品。 根據本發明，適合致免疫組合物在15…之劑量體積中含 有·輪狀病毋抗原，尤其濃度為每劑量1〇5_ 1〇6 或等於 用每劑量CCID50表示之10”_ 1〇“）之人類減毒p43株（如 以登記號ECACC 99081301 寄存之株，見 w〇〇1/12797); 55 重量％蔗糖；己二酸二鈉0.465 Μ(對應於每劑量132 74毫克） 且具有約6.2至6.6之PH值。對於此組合物，DMEM含量為6% w/w且因此表示鱗酸鹽少於0.1 mM。 根據本發明之組合物可進一步包括額外抗酸組分，諸如 無機抗酸劑，如氩氧化鋁A1(0H)3及氫氧化鎂Mg(0H)2。氫 氧化鋁尤其適合。適用於本發明之其他市售抗酸劑包括 MylantaTM，其含有氫氧化鋁及氫氧化鎂。此等抗酸劑不溶 於水且以懸濁液形式給出。可另外用於本發明之疫苗組合 物的另一尤其適合抗酸劑為不溶性無機鹽碳酸鈣 (CaC〇3)。例如典型CaC〇3濃度為每疫苗劑量8〇毫克。 其他適合之不溶於水抗酸劑為碳酸鎂、碳酸鋁、磷酸鋁、 氫氧化鋁與碳酸鎂之混合物、碳酸氫鋁鎂、氩氧化鋁-碳酸 108304.doc 1358303 、糸糖醇-甘露醇、經基-紹-納-碳酸鹽、二經基_铭_狎_ 碳酸鹽、氫氧化鎂铭、水滑石、㈣西特（almageit)、水合 矽酸鎂鋁。 根據本發明之致免疫組合物可另外包含醫藥學上適合之 及/或載劑，尤其為此項技術中所知之適於經口投 特別對嬰兒而言的彼等化合物及/或載劑。該等載劑包 括且不限於碳水化合物、多元醇、胺基酸、氩氧化鋁、氫 氧化鎂、經磷灰石、滑石、氧化鈦、氫氧化鐵、硬脂酸錢、 羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、明膠、 植物蛋白脒、三仙膠、Caraghenane、阿拉伯膠、p環糊精。 根據本發明之組合物可另外包含鈣離子，已建議其穩定 輪狀病毒^ 可另外包括黏性劑存在於組合物中。 可使用之可能黏性劑包括假塑性賦形劑。適合黏性劑包 括：丙二醇、阿拉伯膠、黃蓍膠、洋菜 '海藻酸鹽、果膠、 羧曱基纖維素鈉（Tyloses C®)、甲基纖維素（Meth〇ceis Α@、 Viscotrans MC®、Tylose ΜΗ®及 MB®) ' 羥丙基甲基纖維素 (Klucels®)、經丙基纖維素（Methocels E®及 K®、Vicotrans MPHC®)、Carbopol®、三仙膠、Veegum®(矽酸鎂鋁）、 Avicel®(約89%微晶纖維素及11%羧甲基纖維素鈉）。三仙膝 或澱粉為額外用於根據本發明之液體組合物中的尤其適人 之黏性劑。 所主張之組合物中包括脂質基媒劑亦可為有利，諸如病 108304.doc 21 ⑤ 1358303 毒顆粒或脂質體、水包油型乳液或載劑微粒。或者或另外， 諸如此項技術中所知之用於經口疫苗的彼等免疫刺激劑可 包括於組合物中。該等免疫刺激劑包括細菌毒素，尤其以 全毒素（整個分子）或僅B鏈（CTB)之形式的霍亂毒素（CT)及 大腸桿菌（E. coli)(LT)之熱不穩定腸毒素。經變異之LT(mLT) 揭示於 WO 96/06627、WO 93/13202 及 US 5，182，109中，其 轉變成其活性形式的可能性比天然LT小。 根據本發明之組合物可進一步包含一種佐劑或免疫刺激 劑，諸如（但不限於）來自任何來源之經解毒脂質A及脂質A 之非毒性衍生物、皂素及能夠刺激TH1型反應之其他試劑。 長期以來吾人已知腸内細菌脂多糖（LPS)為免疫系統之 有效刺激物，雖然其在佐劑上之用途已被其毒性影響所縮 減。一種LPS之非毒性衍生物單磷醯基脂質A(MPL)已由 Ribi 等人（1986，Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp·，NY，第 407-419 頁） 揭示，其藉由自末端減少之葡糖胺移除核心碳水化合物基 團及磷酸鹽而產生，且其具有以下結構： I08304.doc 22- ⑤ 1358303

(CHj)u MPL之進一步經解毒之變形由自雙醣主鏈之3-位移除醯 基鏈而產生，且其被稱為3-0-去醯基單磷醯基脂質 A(3D-MPL)。其可藉由GB 2122204B中教示之方法純化及製 備，該參考案亦揭示二磷醯基脂質A及其3-0-去醯基變異體 之製備。 3D-MPL之適合形式係具有直徑小於〇·2 μιη之小粒度的 乳液形式，且其製造方法揭示於WO 94/21292中。包含單磷 醯基脂質Α及界面活性劑之水性組合物已揭示於WO 9843670A2 中。 本發明之組合物中待調配之細菌脂多糖衍生之佐劑可自 細菌來源純化及加工，或者其可為合成。舉例而言，經純 化之單磷醯基脂質A在Ribi等人1986(見上）中予以描述，且 衍生自沙門桿菌屬（Salmonella sp.)之3-0-去醯基單磷醯基 或二磷醯基脂質A在GB 2220211及US 4912094中予以描 108304.doc -23- 1358303 述。已揭示其他經純化及合成之脂多糖（Hilgers等人，1986, Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4):392-6; Hilgers等人，1987, ' Immunology，60( 1): 141 ·6;及EP 0 549 074 B 1)。一種尤其適 -i 合之細菌脂多糖佐劑為3D-MPL。 ft 因此，可用於本發明之LPS衍生物為結構上類似於LPS或 MPL或3D-MPL之結構的彼等免疫刺激劑。本發明之另一態 樣中，LP.S衍生物可為醯化單醣，其為以上MPL結構之子部 分。 # 亦已知脂質A之合成衍生物包括但不限於： OM174 (2-脫乳- 6-o-[2-脫氧- 2-[(R)-3-十二酿氧基十四酿 胺基]-4-0-膦醯基-β-D-葡萄吡喃糖基]-2-[(R)-3-羥基十四 醯胺基]-<x-D-葡萄《比喃糖基二氫磷酸鹽），（WO 95/14026) OM 294 DP (3S，9R)_3-[(R)-十二醯氧基十四醯胺基]-4-氧-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四醯胺基]癸-1，10-二醇，1，1〇· 雙（二氫磷酸鹽）（WO 99 /64301 及 WO 00/0462) OM 197 MP-Ac DP ( 3S-，9R)-3-[(R)-十二醢氧基十四醯 • 胺基]-4-氧-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四醯胺基]癸- l，l〇-二 醇，1-二氫磷酸鹽10-(6-胺基己酸鹽）（WO 01/46127) 作為口服佐劑之經純化之皂素揭示於WO 98/56415中。皂 素及單磷醯基脂質A可單獨使用或組合使用（如WO 94/ 00153)且可在佐劑系統中與其他試劑一起調配。3D-MPL為 熟知之佐劑，其由Ribi Immunochem，Montana製造且其製造 揭示於GB 2122204中。 用於本發明之另一較佳免疫刺激劑為Quil A皂素及其衍 108304.doc •24· ⑤ 1358303 生物。皂素教示於：Lacaille-Dubois，M及WagnerH.(1996. A review of the biological and pharmacological activities of . saponms. Phytomedicine 第 2卷第 363-386頁）。皂素為廣泛 分佈於植物界及海洋動物界中之甾類或三萜糖苷。皂素以 ‘·. 在水中形成一經振盪即起泡之膠狀溶液及沉澱膽固醇而著 稱。當皂素靠近細胞膜時，其在膜内建立孔樣結構，其引 起膜破裂。红血球溶解係此現象之實例，其為某些皂素之 特性但非所有皂素之特性。 鲁 已知皂素作為用於全身性投與之疫苗中之佐劑。佐劑及 個別皂素之溶血活性已在此項技術中廣泛研究 (Lacaille-Dubois及 Wagner，見上）。舉例而言，Quil A(衍生 自南美石驗木（Quillaja Saponaria Molina)之樹皮）及其部分 描述於 US 5,057,540 及"Saponins as vaccine adjuvants"，

Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (l-2):l-55;及EP 0 362 279 Bl*。稱為免疫刺激錯合物 ^ (ISC0M)之微粒結構包含Quil A之部分，其為溶血且已用於 疫苗之製造 t (Morein，B·，EP 0 109 942 Bl; WO 96/11711. WO 96/33739)。溶血皂素 QS21 及 QS17(Quil A 之經 HPLC 純 化部分）已描述為有效全身性佐劑，且其生產方法揭示於美 國專利第5,05 7,540號及EP 0 362 279 B1中。QS-21為衍生自 石驗木之樹皮的一種天然皂素’其誘發CD8 +細胞毒素τ細 胞（CTL)、Thl細胞及主要IgG2a抗體反應且在本發明之上丁 文中為一種適合皂素》已用於全身性疫苗接種研究中之其 他皂素包括衍生自其他植物種類之彼等皂素，該等植物種 108304.doc -25- 類諸如石竹屬（Gypsophila)及石驗屬（Saponaria)(Bomford等 人，Vaccine，10(9):572-577, 1992)。 一種強化系統包括非毒性脂質A衍生物與皂素衍生物之 組合，尤其如W0 94/00153所揭示之QS21與3D-MPL之組 合，或較少反應原性組合物，其中如W0 96/33739所揭示用 膽固醇抑制QS21。本發明之皂素形成部分可以微胞形式單 獨存在，或當用膽固醇及脂質調配時，可以大的規則結構 (諸如ISC0M(EP 0 109 942 B1)或脂質體）之形式存在，或以 水包油型乳液形式（W0 95/172 10)存在。該等皂素可適合與 諸如氫氧化鋁或磷酸鋁之金屬鹽聯合（WO 98/15287)。 在水包油型乳液中包括QS21及3D-MPL之特別有效佐劑 組合物係描述於W0 95/17210及W0 99/11241及W0 99/ 12565中，且為適合組合物。 用於經口免疫之媒劑及佐劑之一般討論可發現於Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及 Newman編輯，Plenum Press，紐約，1995。 根據本發明之疫苗組合物可含有額外組分，該等額外組 分包括如調味劑（尤其對於經口疫苗）及抑菌劑。 在一特定實施例中，根據本發明之液體組合物具有藉由 嬰兒羅塞特-賴斯檢定（如實例III.2.2詳述之自基本羅塞特-賴斯測試修改）評價之在6與23分鐘之間的抗酸能力。根據 本發明，”抗酸能力”意謂用分鐘表示的時間週期，在此期 間，根據實例III.2.2中給出之實驗程序所評價之測試調配物 的pH值保持在4以上。抗酸能力將適合在12與20分鐘之間。 108304.doc -26- 1358303 從疫苗研製觀點看，高於23分鐘之抗酸能力（如29-30分鐘） 亦較佳可接受，但此高能力過剩。詳言之，吾人尤其預期 至少8分鐘、至少10分鐘、至少12分鐘之抗酸能力。至少12 分鐘、至少13分鐘、至少14分鐘、至少15分鐘、至少16分 鐘之抗酸能力為適合。吾人已知已三小時未吃之幼兒之胃 的酸性很大，且輪狀病毒受此酸性pH值的負面影響《在吾 人之考慮中，當與所需之低體積調配物合作時，已不可能 量測含磷酸鹽之常規調配物的抗酸能力，因為磷酸鹽溶解 度易於超越且在調配及/或短期儲存中產生組分之結晶。相 反’與先前技術之含磷酸鹽調配物比較，所主張之組合物 甚至在小劑量體積時亦令人驚奇地顯示可接受但更高之抗 酸能力。 在另一特定實施例中該液體致免疫組合物在以下條件 之至少一者下穩定：37°C下7天、4°C下1年、4°C下18個月、 4 C下2年。根據本發明，根據實例ΙΠ1所闡明程序在給定 溫度下調配物儲存所界定之時間週期後，藉由量測病毒滴 度（意即病毒穩定性）評價給定組合物之穩定性。組合物之穩 定性可藉由加速穩定性測試來評價，例如調配物在37<>c下 儲存週後。或者組合物之穩定性可經更長時間週期來評 價，諸如在冷箱溫度下（2與7。〇之間，通常在或室溫下 (20-22°C)储存若干月期間。在此等條件下，穩定組合物係 最大輪狀病毒滴度損失為丨之組合物，在所界定測試條件下 滴度拍失以每劑量lc)gIQ ffu表示。尤其適合之組合物為彼等 組合物’其t經加速穩定性測試，在听下—週期間損失 108304.doc •27- ⑤ 1358303 最大值為0.5 log1〇，例如〇 4或更少，〇 3或更少，〇 2或更少 或適合地每疫苗劑量0.1 l〇gl0 ffu。

或者本文所主張之液體致免疫組合物可冰凍及在_2〇。〇 或-20°C以下冰凍儲存，或在_7〇〇c下冰凍儲存若干年，及一 旦融化在下保持穩定至少1年》通常冰凍調配物將穩定 至少6個月、至少12個月、至少18個月、至少2年或至少3年， 及一旦融化在4°C下保持穩定至少1年，適合地18個月或2 年。

根據本發明之組合物為致免疫組合物 7又田 5，通常在一次給藥、適合地間隔一或兩個月之兩次給藥 後，所主張之致免疫組合物能夠引起免疫反應，如優良疫 田攝入及血清輪狀病毒特異性IgA反應》"疫苗攝入"定義為 以下党試者之百分比，該等受試者顯示任一血清學反應， 如對在後免疫血清中之輪狀病毒在滴度^2〇 u/m時血清

IgA之出現（ELIS A),及/或在任一糞便樣品中具有輪狀病毒

$出（EUSA)。疫苗攝入可定義為在任一糞便樣品中疫苗病 母排出’ t便樣品在第一二欠給藥與第二次給藥後多達丄至2 個月之間收集。在一特定實施例中，與安慰劑比較，根據 本發明之疫苗能減少任何輪狀病毒胃腸炎之發生及較佳減 ;少厫重輪狀病毒胃腸炎之發生。通常疫苗能賦予交叉保 護二用以抵抗除存在於疫苗中之株之外的循環株。通常當 疫田3有GlfH諸如減毒人類病毒州之⑺型株時，誘 發免疫反應，其針對G1及選自由以下各物組成之群的非⑴ 企清型之至少-者：G2、G3、G4、G5、g6、g7、g8、G9、 108304.doc -28- 1358303

Gio、Gil、G12、G13及G14灰清型。適合地，含G1株之疫 苗能夠賦予保護，用以抵抗G1株與諸如G2、G3及/或G4株 之非G1株’且尤其抵抗全球出現之企清型β 在一特定實施例中，該胃腸炎或嚴重胃腸炎由不同於所 主張之組合物中所含有之血清型的血清型之輪狀病毒株引 起。詳言之，若存在於所主張組合物中之輪狀病毒株為⑴ 血凊型，諸如但不限於活減毒人類輪狀病毒株HRV P43(ECACC 99081301)，則賦予預防由⑺血清型之輪狀病 毒株引起及亦由非G1血清型之輪狀病毒株引起的胃腸炎或 嚴重胃腸炎，例如由具有選自由以下各物組成之列之血清 型的輪狀病毒株引起：G2、G3、G4、G5、G0、G7、G8、 G9、G10、Gil、G12、G13及G14»在一特定實施例中，本 文所主張之致免疫組合物能夠誘發免疫反應及/或提供保 護來抵抗胃腸炎或嚴重胃腸炎，該胃腸炎由以下非G1血清 型之至少一者引起，適合地全部由其引起：G2、G3、& 及G9。在另一特定實施例中，若存在於所主張之組合物中 的輪狀病毒株為Ρ[8]輪狀病毒型，諸如但不限於活減毒人 類輪狀病毒株HRV P43(ECACC 99081301)，則賦予預防胃 腸炎或嚴重胃腸炎，該胃腸炎由P[8]型之輪狀病毒株及由 非P[8]型引起’例如由具有選自由以下各物組成之列之血 清型的輪狀病毒株引起：PI、P2、P3、P4、p5、P6、p7 P9及P11型》詳言之，本文所主張之致免疫組合物能夠誘發 免疫反應及/或提供保護來抵抗胃腸炎或嚴重胃腸炎，該胃 腸炎由以下非P[8]型之至少一者引起，適合地全部由其引 108304.doc •29- ⑧ 1358303 起.P4、P6。在另一實施例中，所主張之組合物能夠誘發 免疫反應及/或提供保護來抵抗胃腸炎或嚴重胃腸炎，該胃 腸炎由不同於存在於所投與組合物中之G型及p型的G型及 p型輪狀病毒株引起。特定而言，所主張之組合物包含G1P[8] 輪狀病毒株且亦能夠誘發免疫反應及或提供保護來抵抗由 G2P[4]輪狀病毒株引起之胃腸炎或嚴重胃腸炎。 根據本發明之組合物適合藉由經口投與來投與。組合物 適合以單劑量裝置提供，諸如適於傳遞給小幼兒之玻璃或 塑料小瓶或注射器。 本發明之疫苗可藉由已知技術調配及投與，使用適合量 的活病毒以提供有效保護來抵抗輪狀病毒感染而對一般接 受疫苗者無頬著有害副作用。 因此如本文所描述，本發明提供用於製備液體輪狀病毒 調配物或致免疫組合物之方法，其包含將輪狀病毒抗原、 糖及羧酸鹽與醫藥學上可接受之稀釋劑混合。 適合活病毒量通常在每劑量1〇4與1〇7 ffu之間。典型疫苗 里可包含每劑量1〇5·1〇6 ffu且可經一段時間週期以若干次 給藥投與，例如以兩個月之時間間隔給藥2次。輪狀病毒滴 度亦可以CCID50表示且在本發明之上下文中可估計1〇6〇之 CCID50等於每劑量1〇5.5 ffu。然而，尤其在發展中國家， 藉由進行多於2次給藥（如3次或4次給藥）的方式可獲得益 處。第一次給藥可適於在嬰兒4週至14或15週大時給予嬰 兒，適合地在6與14週之間。給藥之時間間隔為至少4週但 可多於或少於兩個月，例如若適合，％第二次給藥及任何 108304.doc -30- 1358303

，此取決於當 而言，最佳活 定’該標準研 隨後給藥可在前一次給藥後一或三個月給予 地免疫時程。對於單次給藥或多次給藥方式 病毒量及給藥最佳時間可藉由標準研究來確 究包括觀察抗體滴度及受試者之其他反應。

通常根據本發明之一次給藥的疫苗體積應為2·5 Μ或更 低，通常在0.5 ml與2.5 ml之間。在本發明之_特定態樣中， 適合疫苗劑量通常應為i.5 ml或適合地少於2 5…之任何體 積，諸如2 ml或更少之體積，其適於經口投與嬰兒或幼兒。 詳5之，此劑量體積將使得調配物之技術可行性成為可能 且對調配物之致免疫潛力無有害影響。所主張之組合物提 供超越先前技術之含磷酸鹽調配物的優勢，其可承受胃酸 度、經長期存放期保持致免疫及穩定，同時與劑量體積少 於通常劑量體積之調配物相容，諸如少於2.0 mi或甚至適合 地1.5 ml或更少。根據本發明之一次給藥的疫苗體積通常在 0.5 ml與2.0 ml之間，適合地約在1.0 ml與1.5 mi之間，諸如

約1.3 ml或約1.4 ml或約1.5 ml。典型劑量體積亦可為2 ml 或2 1111以下，諸如1.11111、1.21111、1.31111、1.41111或1.51111。 在本發明之範疇内亦涵蓋1 ml之體積或少於1 ml之體積，如 200 pL至800 μί之間的體積》可經口投與之液體體積亦可 藉由疫苗傳遞裝置部分測定。 亦可調配本發明之致免疫組合物以含有其他抗原，尤其 來自其他適合活病毒之抗原，用以起保護作用以抵抗其他 疾病，諸如脊髓灰白質炎病毒。適於經口投與之該等額外 活性成分可與輪狀病毒組合物混合給予’或者與本文所主 108304.doc -31· 1358303 張之輪狀病毒組合物共投與(意即給藥分開但時機相同)。 所主張之組合物亦可伴隨其他非經口疫苗给予，以優化 醫師檢查之次數，例如伴隨適於兒科受疫苗接種人群之非 經勝疫苗’諸如DTPW或DTPa疫苗（抵抗百日咳博德氏桿菌_ 百日咳、白喉、破傷風之疫苗），抵抗B型流行性感冒嗜血 桿菌誘發的腦膜炎、B型肝炎或麻疹、腮腺炎、風疹（mmr) 之疫田’抵抗肺炎雙球菌之疫苗。 在另一實施例中，本發明亦提供治療或預防人類（尤其為 如嬰兒或幼兒之幼童）輪狀病毒相關疾病的方法，該方法藉 由將有效量之液體調配物，尤其如本文所主張之致免疫組 合物或疫苗投與需要其之該人類受試者。詳言之，所主張 之組合物將預防輪狀病毒感染。在一特定實施例中，本文 所主張之組合物能提供保護以抵抗輪狀病毒胃腸炎，尤其 抵抗嚴重胃腸炎。嚴重胃腸炎被定義為需要住院治療及/或 需要在醫學設施中之復水療法（等同於WHO計劃B或C)之事 件’或在20分Vesikari範圍上分數大於丨丨之事件（Ruuska τ 及 Vesikari T. Rotavirus disease in Finnish children: use of numerical scores for severity of diarrheal episodes. Scand J Infect Dis 1990, 22:259-67) 〇 在又一實施例中，本發明提供輪狀病毒抗原、緩酸鹽及 糖在製造如疫苗之致免疫組合物上之用途，該致免疫組合 物用於治療或預防人類輪狀病毒相關疾病，其中該致免疫 組合物具有pH 5.0與pH 8.0之間的pH值且包含少於5 mM之 磷酸鹽。詳言之’尤其涵蓋預防輪狀病毒感染，及/或保護 108304.doc -32- 1358303 抵抗月腸炎且更尤其抵抗嚴重胃腸炎。 在另一特疋實施例中，本發明亦提供人類活減毒輪狀病· 毒在製造本文所主張之致免疫組合物上的用途，該致免疫 ，-且。物用於治療或預防輪狀病毒相關疾病而不引起腸套 疊。詳言之，該治療或預防包含將安全及有效量之人類活 減毒輪狀病毒組合物的兩次經口給藥或更多次給藥投與在 給藥時4週至14或15週大的幼兒。通常在第一次給藥時該幼 兒將為6至14週大。在本發明之上下文内使用人類幼兒來意 謂出生後4至14或15週大之幼兒。 在另一實施例中，本發明亦提供包含輪狀病毒抗原、糖、 磷酸鹽及羧酸鹽之液體致免疫組合物，其中該致免疫組合 物具有約5.0至約8.0之間的pH值且其中該羧酸鹽係選自由 以下各物組成之列：己二酸鹽、蘋果酸鹽、乙酸鹽、丙酸 鹽、丁酸鹽、丙二酸鹽、戊二酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、 庚二酸鹽及其兩者或兩者以上之任一組合。在一特定實施 例中’該羧酸鹽為己二酸鹽。通常磷酸鹽以1〇 至1 μ之 濃度存在。本發明之發明者已發現，尚未與經口疫苗調配 物研製有關之此等特定羧酸鹽已滿足穩定性、抗酸性、致 免疫性及小劑量體積調配物之所有所需要求，該等特定叛 酸鹽在本發明之描述中闡明，其用於研製適於人類幼兒之 經口輪狀病毒疫苗。詳言之，該等羧酸鹽對調配物中之輪 狀病毒滴度無有害影響。例如在含磷酸鹽之輪狀病毒調配 物中，此等羧酸鹽可充分充當如丁二酸鹽、麵胺酸鹽及檸 檬酸鹽之習知羧酸鹽的替代物。如上文所描述之所有其他 108304.doc -33- 1358303

特定實施例同樣應用於本發明之該態樣β通常組合物 值範圍如本文所界定，抗酸能力及存放期穩定性亦如本^ 所界定。本發明亦提供製備該組合物之方法、使用該組合 物預防或治療人類幼兒之用途及方法》 參考以下非限制性實例將進一步描述本發明。

實例I-活減毒人類輪狀病毒液體疫苗之調配物i)缺乏添加 的磷酸鹽及羧酸鹽，及Π)存在作為羧酸鹽之檸檬酸鹽而缺 乏添加的磷酸鹽 1.1調配物之製備 1.1.1 DMEM培養基之組成（製備1公升DMEM) 注射用水：0.8公升 依次溶解以下化合物： 氣化鈉：6.40 g 氣化鉀：0.40 g 七水舍硫酸鎂：0.20 g 添加0.1 g/L的硝酸鐵溶液：1.00 ml

NaH2P〇4.2H20 : 0.1412 g 丙酮酸鈉：0.11 g 無水葡萄糖：4.50 g 維生素溶液（濃縮500倍）：2.00 ml 注射用水：1.50 ml 鹽酸（濃）：0.083 ml L-胱胺酸：0.048 g L-酪胺酸：0.072 g 108304.doc -34- ⑧ 1358303 注射用水：2.00 ml 胺基酸溶液：20.00 ml L-麩胺醯胺：0.5846 g 二水合氯化鈣：0.2649 g 碳酸氫鈉：3.70 g 注射用水直至1公升 DMEM表示實例II中詳述之調配物的5%、6%或8%。此對 應於： -最終磷酸鹽濃度分別為0.05 9 mM、0.071 mM及0.094 mM， 及 -最終丙酮酸鹽濃度分別為0.065 mM、0.078 mM及0.104 mM。 維生素溶液（濃缩500倍）： 注射用水：80.00 L 葉酸：200.10 g 泛酸鈣：200.10 g 氯化膽鹼：200.10 g 肌醇：350.00 g 煙鹼醯胺：200.00 g 鹽酸吡哆醇：200.10 g 鹽酸噻胺：200.10 g 核黃素：20.002 g 注射用水直至100公升。 胺基酸溶液： 108304.doc •35- ⑧ 1358303

注射用水：144.00 L L-精胺酸：755.70 g 甘胺酸：270.10 g L-組胺酸：378.00 g L-異白胺酸：943.40 g L-白胺酸：943.50 g L-離胺酸二鹽酸鹽：1,315.80 g L-甲硫胺酸：270.00 g L-苯丙胺酸：594.10 g L-酥胺酸： 856.30 g L-色胺酸： 144.00 g L-絲胺酸： 377.90 g L-纈胺酸： 842.00 g 注射用水： 直至180公升。 硝酸鐵溶液 注射用水： 1,035.000 ml 九水合硝酸鐵：0.115 g 注射用水： 直至1.150公升 1.1.2缺乏添加的構酸鹽及叛酸鹽之輪狀病毒調配物的 製備 已經以325 g(250 ml)總規模製成表2中所呈現的調配物 60 ’其表示每次1.5 ml( 1.95 g)之給藥166.6次。 調配物η0 60 :將162.5 g蔗糖（50% w/w)添加至143 g水中 (其量係經定為可達到325 g之最終製備物）。完全溶解後， 108304.doc -36 * 藉由0_2 μιη膜過濾將溶液滅菌。在無菌條件下添加含有必 要數量之輪狀病毒的DMEM培養基19.5 g以獲得每劑量 106G ffu。在此狀況下，劑量體積為1.5 nd。使混合物均勻 化並將其分佈在適當給藥容器中。在此實例中DMEM表示 6% w/w。 抗酸能力、初始病毒滴度及病毒穩定性之結果顯示於表2 至4中。 表2 : 1.5 ml劑量體積 N° 蔗糖％ w/w DMEM % w/w 在t=0時之 BRR*pH 在pH>4時 之BRR*時 間 (分鐘） 在t=o時之 病毒滴度 (每疫ΐ 37〇C ' lw 後之病 毒滴度 ί劑量logi 37〇C ' lw 後之病 毒損失 )fiu) 60 50.0% 6% 7.82 <1 6.3 5.4 0.9 *藉由根據實例III.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試 來評價 表3 : 1.5 ml劑量體積-室溫下之病毒穩定性

n° 室溫下儲存後之病毒滴定(每疫苗劑量log10 ίϊύ) 1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7m* 8m* 9m* 10m* 60 5.6 5.6 5.0 ND ND ND ND ND ND ND * =月；ND=未測定 表4: 1.5 ml劑量體積-4°C下之病毒穩定性

n° 4°C_ F儲存後之病毒滴定(每疫苗劑量l〇g1〇 ffii) T=0 37〇C， lw後 1 m* 4°C 2 m* 4°C 4 m* 4°C 6 m* 4°C 9 m* 4°C 12 m* 4°C 60 6.3 5.4 6.2 5.8 6.0 5.5 ND ND * =月；ND=未測定 1.1.3含有羧酸鹽之輪狀病毒調配物的製備 擰檬酸（當存在時）及檸檬酸鹽在表5及表6中所說明之比 108304.doc -37· 1358303 例及條件下混合。根據實例III. 1及實例ΙΠ 2給出之方法分 別量測調配物之輪狀病毒穩定性及抗酸能力。 製備調配物110-115及128-130。對於調配物110-115，劑 量體積為2.5 ml且對於調配物128-130，劑量體積為1.5 ml。 已經以325 g(25 0 ml)總規模製成表5中所呈現的調配物 110-115 ’其表示每次2.5 ml(3.25 g)之給藥1〇〇次。 調配物110如下製備《連續將19.29 g檸檬酸三鈉（二水合 檸檬酸三納’ Mw 294)(對應於最終濃度262 m]VI)及I62.50 g 蔗糖（50°/〇 w/w)添加至123.71 g水中（其量係經定為可達到 325 g之最終製備物）。完全溶解後，藉由〇 2 μιη膜過濾將溶 液滅菌。在無菌條件下添加含有必要數量之輪狀病毒的 DMEM培養基19.5 g以獲得每劑量i〇6 G ffu。在此狀況下， 單次劑量體積為2.5 ml或3 _25 g。使混合物均勻化並將其分 佈在適當給藥容器中。 在此實例令DMEM培養基表示6 % w/w，對應於最終璃酸 鹽濃度0.059 mM。 除了如表5中詳述而修改成分量之外’根據與調配物ι1〇 所說明之程序類似的程序製備調配物i丨15。例如藉由混 合以下成分製備調配物111 : 123.73 g水（其量係經定為可達 到325 g之最終製備物），19.07 g檸檬酸三鈉（二水合檸檬酸 三納，Mw 294)(對應於最終濃度259 mM)，0.197 g檸檬酸 (Mw 192)(對應於最終濃度4 mM)及162 5〇 g蔗糖（5〇% w/w)。如製備調配物110進行該程序之剩餘部分。 抗酸能力、初始病毒滴度及病毒穩定性之結果顯示於表5 108304.doc -38- 1358303 至8中。 表5 : 2.5 m丨劑量體積 N° 檸檬酸 (Μ) 二水合 檸檬酸 三鈉 (Μ) 蔗糖％ w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 brr* pH 在pH> 4時之 BRR* 時間 (分鐘） 在t=0 時之 病毒 滴度 (每疫 37〇C，lw 後之病 毒滴度 .苗劑量1〇: 37〇C > lw 後之病 毒損失 gioflu) 110 Λ 0.262 50% 6% 8.15^ ί4 5.7 4.8 「0.9 111 0.004 0.259 50% 6% 6.95 14 5.3 5.4 0 112 0.010 0.256 50% 6% 6.51 12-13 5.6 5.6 0 113 0.014 0.249 50% 6% 6.34 12 5.6 5.4 0.2 114 0.034 0.283 50% 6% 5.94 12-13 5.6 5.3 0.3 115 0.093 0.333 50% 6% 5.37 14 5.7 5.6 0.1 *藉由根據實例III.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試 來評價 已經以325 g(250 ml)總規模製成表6中所呈現的調配 物，其表示每次1.5 ml(1.95 g)之給藥166_6次。抗酸物質： 一水合檸檬酸（Mw 210)，二水合檸檬酸三鈉（Mw 294)。 已藉由將110.89 g水（其量係經定為可達到325 g之最終製· 備物）與以下成分混合來製備調配物128 : 31.78 g檸檬酸三 鈉（二水合檸檬酸三納，Mw 294)(對應於最終濃度432 mM)，0.328 g檸檬酸（一水合檸檬酸，Mw 210)(對應於最終 濃度6 mM)及162.50 g蔗糖（50% w/w)。完全溶解後，藉由 0.2 m膜過濾將溶液滅菌。 在無菌條件下添加含有必要數量之輪狀病毒的DMEM培 養基19.5 g以獲得每劑量106Gffu。在此狀況下劑量為i.5 ml 或 1.95 g。 使混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容器中。在此實 例中DMEM培養基表示6% w/w，對應於最終碟酸鹽濃度 108304.doc -39· 1358303 0.059 mM ° 已類似於調配物128所描述之程序製備調配物129及 130，同時根據表6修改成分量。簡言之，已藉由混合0.77 g 檸檬酸（一水合檸檬酸，Mw 210)(對應於最終濃度15 mM)及 31.36 g檸檬酸三鈉（二水合檸檬酸三鈉（Mw 294)對應於最 終濃度426 mM)製備調配物129。已藉由混合2.75 g檸檬酸 (一水合檸檬酸，Mw 210)(對應於最終濃度52 mM)及34.7 g 檸檬酸三鈉（二水合檸檬酸三鈉（Mw 294)對應於最終濃度 472 mM)製備調配物130。該等成分及比例之剩餘部分在表6 中〇 表6 : 1.5 ml劑量體積 N° 一水合檸檬 酸 (M) 二水合 檸檬酸 三鈉 (M) 蔗糖 % w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 BRR* pH 在pH >4時之 BRR* 時間 (分鐘） 在t=0 時之 病毒 滴度 (每疫苗 37〇C > lw 後之病 毒滴度 劑量log 10 37〇C，lw 後之病 毒損失 ffu) 128 0.006 0.432 50.0% 6% 6.97 13 6.1 5.8 0.3 129 0.015 0.426 50.0% 6% 6.55 12 5.9 5.8 0.1 130 0.052 0.472 50.0% 6% 5.92 13 5.9 5.8 0.1 *藉由根據實例III.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試 來評價 表7 : 1.5 ml劑量體積-室溫下之病毒穩定性

n° 室溫下隹 !存後之病毒滴定(每疫苗劑量logio ffu) 1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7m* 8m* 9m* 10m* 128 ND ND ND ND 5.4 5.1 ND ND ND ND 129 ND ND ND ND 5.4 5.0 ND ND ND ND 130 ND ND ND ND 5.6 5.0 ND ND ND ND * =月；ND =未測定 108304.doc • 40- 表8: 1.5 ml劑量體積-4eC下之病毒穩定性 n° 4°C下儲 存後之病 毒滴定(每疫苗劑量l〇gl〇 ffii) T-0 37eC， lw 後 1 m* 4°C 2 m* 4°C 4 m* 4°C 6 m* 4°C 9 m* 4°C 12 4°C 128 6.1 5.8 ND ND ND 5.8 ND 5 7 129 5.9 5.8 ND ND ND 5.8 ND 5 6 130 5.9 5.8 ND ND ND 5.9 ND 5.4 * =月；ND=未測定 1358303 1.2輪狀病毒穩定性及抗酸能力-結果 根據實例III. 1中給出之程序，已估計在不同時間點的輪 狀病毒病毒滴定且根據實例III.2中給出之實驗程序已估計 調配物之抗酸能力。結果在表2至8中予以說明。 無羧酸鹽及添加的磷酸鹽之對照調配物60之pH值無抗酸 能力且進一步展示接近於對病毒穩定性而言之上限pH 8.0» 對表5至8中測試之所有實驗調配物而言，除展示g o以上 之pH值的調配物110之外，pH維持在約5〇_7〇之範圍内。 自病毒滴度及病毒損失結果可見，液體調配物中之輪狀病 毒穩定性與此調配物之pH值有關。在約pH 5 ·4(意即調配物 115)至pH 7.0(意即調配物ill及128)之範圍内，在37°C下7 天後病毒損失保持在低水平（意即0·5 log以下），且此結果與 從調配物110(pH>8，病毒滴度損失為〇.9 log)獲得之結果形 成對比。 另外’調配物111 -11 5及12 8 -13 0顯示類似於調配物Π 0之 抗酸能力的抗酸能力，如藉由嬰兒羅塞特-賴斯檢定所評價 (見實例111.2.2)。此抗酸能力遠超過2.5 1111及1.5 1111劑量體積 調配物之下限8分鐘’且實際上達到最小值12分鐘，因此認 108304.doc •41 · 為此抗酸能力非常令人滿意β 亦已測試替代羧酸鹽，因為當需要相對低量之羧酸鹽時 (例如當以非常小劑量體積工作時），此等羧酸鹽可呈現技術 上可行之替代物。 含有該等替代羧酸鹽之調配物的實例在實例π及表10_39 中給出。 實例II-未添加磷酸鹽但具有替代羧酸鹽之調配物 已使用以下羧酸鹽於產生緩衝能力：乙酸鹽、丙二酸鹽、 丁二酸鹽、戊二酸鹽、己二酸鹽及蘋果酸鹽。根據給出羧 酸之pKa及取決於其分子量’可確定能在pH 5.0至pH 8.0間 之pH範圍内達到利用BRR測試評估為至少8分鐘，適合地至 少12分鐘之目標抗酸能力的調配量。 從化學上說，當將強酸（如HC1)與衍生自弱酸之鹽（如乙酸 鈉）混合時可得到"緩衝"效果。對應於緩衝液穩定水平之中 值的pH值即等於該弱酸之pKa。羧酸之pKa係酸強度之量測 標準’換言之，係化合物之有效緩衝範圍之指示。 由於輪狀病毒在pH 4以下快速降解（C. Weiss及H.F. Clark， 1985 J，Gen· Virol.，66, 2725-2730)，故需要pH 4以上之緩衝 液穩定水平，意即適合地pKa>4之羧酸鹽或平均pKa>4之二 叛酸鹽。適合羧酸鹽在表9中給出。給出數值平均ρΚ&值。 108304.doc 1358303

表9 :各種羧酸鹽之特徵 羧酸 MW pKai pKa2 pKa3 平均 pKa 毒性 (LD50經口， 在大鼠中） 檸檬酸* 192 6.39 4.76 3.13 4.76 3.0 g/kg pKa>4之其他羧酸 丙酸* 74 4.88 2.6 g/kg 丁酸 88 4.82 乙酸* 60 4.76 3.3 g/kg 平均pKa>4之二羧睃 順丁烯二酸 116 6.23 1.92 4.07 丙二酸 104 5.7 2.83 4.26 1.31 g/kg 丁二酸 118 5.6 4.21 4.90 2.26 g/kg 己二酸* 146 5.4 4.43 4.91 5.7 g/kg 戊二酸 132 5.22 4.34 4.78 蘋果酸* 134 5.05 3.40 4.22 1-6 g/kg 五種羧酸具有"食物添加劑”身份：檸檬酸E330、乙酸 E2 60、丙酸E280、蘋果酸E296及己二酸E355。

四種羧酸鹽之標準酸鹼滴定曲線（蘋果酸鈉、乙酸鈉、檸 檬酸鈉及己二酸鈉）於圖1中說明。其顯示在pH4.0與pH7.0 間之適用抗酸能力（例如）為72.50%、68.75%、57.70%及 41.25%，分別對於己二酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉及蘋果酸 納而言。 已用以下羧酸鹽製備調配物：乙酸鹽、丙二酸鹽、丁二 酸鹽、戊二酸鹽、己二酸鹽及蘋果酸鹽。在此實例中顯示 之所有調配物已以1.5 ml劑量體積製備。 II.1具有乙睃鹽之調配物 11.1.1已以表示每次1.5〇11(1.95§)之給藥166.6次的325呂 規模（250 ml)製成呈現在表10中的調配物。抗酸物質：乙酸 (Mw 60)，NaOH(Mw 40)。 108304.doc -43 - '⑧ 1358303 調配物36:將10.66gNaOH、達PH7.16之冰醋酸及130g 蔬糖（40% w/w)連續添加至148 84 g水（數量足以使最終製 備物達到325 g)中。完全溶解後，藉由〇.2 μιη膜過濾將溶液 滅菌。在無菌條件下，將含有必要數量之輪狀病毒的DMEM 培養基19.5 g添加至該溶液中以獲得每劑量1〇6·ο ffu。在此 狀況下劑量為1.5 ml或1.95 g »使混合物均勻化並將其分佈 在適當給藥容器中。在此實例中DMEM表示6 % w/w。 調配物3*7及42 :如調配物36之方法進行製備但根據表1〇 調整數量。 調配物87 :將以下物質連續添加至75 〇〇 g水中：8 〇〇 g NaOH、15.00 g冰醋酸、足量1N Na〇H溶液以達到pH 7.00(在 此狀況下添加2 g IN Na〇H)，額外水以達到足夠數量325 g(在此狀況下添加43.00 g水）及162.5〇 g蔗糖（5〇% w/w卜如 調配物36之方法執行此程序之剩餘部分。 調配物88-90之實例：除如表10中提及之數量修改之外， 如調配物n° 87之方法進行製備。 調配物33-35之實例.除如表1〇中提及之數量修改及由 Ca(OH)2代替NaOH之外，如調配物n。％之方法進行製備。 調配物33-35不包括於短期穩定性研究，因為其無法遵從在 37°C下一週的穩定性測試。但在額外鈣離子存在下在己二 酸系列中呈現令人滿意的結果（見實例π.5 4及表26)。 108304.doc •44, 1358303 表ίο N° NaOH (Μ) 乙酸 (Μ) 蔗糖％ w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 BRR* pH 在pH >48^·之 BRR* 時間 (分鐘） 在t=0 時之 病毒 滴度 (每癌 在37 °C，lw後 之病毒 滴度 .苗劑量1〇, 在37 °C，lw後 之病毒 損失 gioffii) 36 1.07 達pH 7.16 40% 6% 7.2/ 7.23° 13/14° 5.8 5.3 0.5 37 1.07 7.55 CAO/ J\J/Ki 6% 7.62/ 7.63° 13/15° c η J.O e a 丄Η Λ Λ υ.外 42 1.05 達pH 7.7 50% 6% 8.06/ 8.03° 15/16° 5.9 5.1 0.8 87 達pH 7·0 1 50% 6% 7.24 13 6.2 6.1 0.1 88 達 pH 6.5 1 50% 6% 6.7 13 5.8 5.9 0 89 達 pH 6.0 1 50% 6% 6.14 12 5.9 5.5 0.4 90 達 pH 6.0 1 55% 6% 6.10 13 6.0 5.5 0.5 Ca(OH)2 33 0.540 達pH 7.32 40% 6% 7.66 12 5.8 4.3 >1 34 0.540 達pH 7.55 45% 6% 8.09 13 5.9 <3.8 >1 35 0.540 達pH 7.35 50% 6% 7.76 13 6.3 <3.8 >1

*藉由根據實例III.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試 來評價；°=重複

II.1.2 已以表示每次1.5 ml(l.95 g)之給藥166.6次的325 g規模（250 ml)製成呈現在表11中的調配物。抗酸物質：三 水合乙酸納（Mw\13 6)。 調配物58之實例：將30.00 g三水合乙酸鈉及162.50 g蔗糖 (50% w/w)連續添加至113.00 g水（其量係經定為可達到325 g之最終製備物）中。完全溶解後，藉由0.2 μπι膜過濾將溶液 滅菌。在無菌條件下，將含有必要數量之輪狀病毒的DMEM 培養基19.5 g添加至該溶液中以獲得每劑量106 () ffu。在此 狀況下劑量為1.5 ml或1.95 g。使混合物均勻化並將其分佈 108304.doc -45- ⑤ 1358303 在適當給藥容器中。在此實例中DMEM表示6 % w/w。 實例59、66、69及70 :與調配物58類似而進行製備，數 量調整（見表11)。 表11 〜ΤΛ iN- 三水合乙酸 鈉 (M) 蔗糖％ w/w DMEM % w/w 在—Ο 時之 BRR* pH 在 pH>4 時之 BRR* 時間 (分鐘） 在t=0 時病 毒滴 度 (每癌 在37 。。，lw 後 之病毒 滴度 .苗劑量1〇, 在37 °C，lw 後 之病毒 損失 gioffu) 58 0.882 50% 6% 7.98 11 6.3 5.6 0.7 59 0.706 50% 6% 7.94 7 6.2 5.4 0.8 66 0.941 54% 6% 8.13/ 8.14° 13 5.9 5.3 0.6 69 0.753 55% 6% 8.15 8 6.0 5.3 0.7 70 1.338 50% 6% 8.23 20 6.0 5.4 0.6 *藉由根據實例ΙΠ.2.2所修改之嬰兒羅塞特·賴斯（BRR)測試 來評價；°=重複 II. 1.3輪狀病毒穩定性及抗酸能力-結果 根據實例III. 1中給出之程序已估計不同時間點的輪狀病 毒病毒滴定且根據實例IH.2.2中給出之實驗程序已估計調 配物之抗酸能力。結果在表10、11、12及13中予以說明。 總之’液體乙酸鹽調配物中之輪狀病毒穩定性與pH值有 關。適合工作範圍在PH 6.0至7_5之間。 ’ 表12-在室溫下之病毒穩定性 n° 室溫下4 睹存俠<病香滴定(每疫苗劑量los泡） 1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7m* 8m* 9m* 1 Om* 36 5.8 5.2 4.7 —-λ 37 5.8 5.5 5.3 5.0 5.0 4.4 42 5.2 5.4 5.1 4 7 87 6.0 5.9 __ 5.6 5.3 5.3^ 88 5.9 5.6 89 5.2 4.7 108304.doc -46- 1358303 _90 4.8 4.6 58 5.6 5.4 4.9 59 5.7 5.5 4.9 66 Γ 5.8 5.4 5.5 69 5.9 5.5 5.5 /U 5.9 5.5 5.4 *=月；空白框=未確定之標準 表13 : 4°C下之病毒穩定性 n° 4°C- T儲存後之病毒滴定(每疫苗劑量l〇gl0 fill) τ=ο 在37 °Γ， 1 m* 2 m* 4 m* 6 m* 9 m* 12 m* 15m* lw後 4°C 4°C 4°C 4t 4°C 4°C 4°C 36 5.8 5.3 5.8 5.8 5.6 37 5.8 5.4 5.9 5.8 5.8 5.7 ---- 42 5.9 5.1 5.9 5.7 5.7 87 6.2 6.1 6.3 6.1 6 1 88 5.8 6.0 6.0 89 5.9 5.5 5.8 — 90 6.0 5.5 5.7 58 6.3 5.6 6.2 5.8 6.0 59 6.2 5.4 6.2 5.7 6.0 66 5.9 5.3 5.9 5.8 69 6.0 5.3 6.0 5.9 70 6.0 5.4 6.0 5.9 * =月；空白框=未確定之標準 II.2·具有丙二酸鹽之調配物 Π.2.Ι.已以表示每次1.5 ml(1.95 g)之給藥166.6次的325 g總規模（250 ml)製成篮配物67d夹⑷〇抗酸物質：丙二 酸（Mw 104)，NaOH(Mw 40)。 已以表示每次1.75 ml(2.2 g)之給藥20次的44 g總規模（35 ml)製成調配物54(見表14) »抗酸物質：丙二酸（Mw 104)， NaOH(Mw 40)。 調配物 n〇 67 :將 14·00 g NaOH、18.230 g丙二酸及 162·5 g 嚴糖（50% w/w)連續添加至11〇7〇 g水（其量係經定為可達 10S304.doc -47- 到325 g之最終製備物）中。完全溶解後，藉由0.2 μπι膜過濾 將溶液滅菌。在無菌條件下，添加含有必要數量之輪狀病 毒的DMEM培養基19.5 g以獲得每劑量106Q ffu。在此狀況 下劑量為1.5 ml或1.95 g。使混合物均勻化並將其分佈在適 當給藥容器中。在此實例中DMEM表示6 °/〇 w/w。 調配物 η。54 :將 2.4 g NaOH、3.1213g 丙二酸及 19.5g蔗 糖（44% w/w>連續添加至16.64 g水（其量係經定為可達到44 g之最終製備物）中。完全溶解後，藉由0.2 μπι膜過德將溶液 滅菌。在無菌條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的 DMEM培養基2.34 g以獲得每劑量106Q ffu。在此狀況下劑 量為1.75 ml或2.2 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給 藥容器中。在此實例中DMEM表示6 % w/w。 表14 N0 NaOH 丙二酸 蔗糖 % w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 BRR1 pH 在 pH>4 時之 BRR1 時間 在t=0 時之 病毒 滴度 37〇C 1 lw 後之病 毒 滴度 37〇C ' lw 後之病 毒 損失 (Μ) (Μ) (分鐘） (每癌 .苗劑量1〇 5l〇ffu) 67 1.4 0.701 50% 6% 6.53 11-12 6.0 5.7 0.3 54 1.71 0.857 44% 6% 8.36 23 〇〇 00 00 108304.doc • 48- 1 藉由根據實例III.2.2·所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測 試來評價 。。將調配物54從長期穩定性研究中丟棄，因為其初始pH在 8.0以上。 II.2.2.已以表示每次1.75 ml(2.20 g)之給藥147.7次的 325 g總規模（250 ml)製成呈現於表15中之調配物。抗酸物 質：丙二酸二鈉（Mwl48)。 調配物n° 62 :將23.00 g丙二酸二鈉及144.00 g蔗糖（44% w/w)連續添加至138.50 g水（其量係經定為可達到325 g之最 終製備物）中。完全溶解後，藉由0.2 μιη膜過濾將溶液滅菌。 在無菌條件下，將含有必要數量之輪狀病毒的DMEM培養 基19.5 g添加至該溶液中以獲得每劑量106U ffu。在此狀況 下劑量為1.75 ml或2.20 g。使混合物均勻化並將其分佈在適 當給藥容器中。在此實例中DMEM表示6 °/〇 w/w。 表15 N° 丙二酸鈉 蔗糖％ w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 BRR1 PH 在 pH>4 時之 BRR1 時間 在t=0 時之 病毒 滴度 在37 〇C ’ lw 後 之病毒 滴度 在37 °C ’ lw後 之病毒 損失 (M) (分鐘） (每癌 .苗劑量1〇 gioffu) 62 0.601 44% 6% 8.21 12 6.1 5.0 0.9 108304.doc -49- 1 藉由根據實例III.2.2.所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測 試來評價 II.2.3.輪狀病毒穩定性及抗酸能力-結果 總之，液體丙二酸鹽調配物之輪狀病毒穩定性與pH值有 關：在37°C下1週期間pH 6.5給出好的穩定性，而在pH 8.2 時觀察到多於0.9 log之損失。 II.3具有丁二酸鹽之調配物 II.3.1.已以表示每次1·5 ml(1.95 g)之給藥166.6次的325 g規模（250 ml)製成調配物127(見表16)。抗酸物質：丁二酸 (Mw 118)，NaOH(Mw 40)。 已以表示每次1.75 ml(2.2 g)之給藥20次的44 g規模（35 ml)製成調配物51(見表16)。抗酸物質：丁二酸（Mw 118)， NaOH(Mw 40)。 調配物 127 :將 9.10 g NaOH、13.74 g丁 二酸及 162.5 g蔗 糖（50% w/w)連續添加至120.16 g水（其量係經定為可達到 325 g之最終製備物）中。調配步驟之剩餘部分與調配物67 中所描述之彼等步驟相同。在此實例中DMEM表示6 % w/w ° 調配物 51 :將 2.4 g NaOH、3.5414 g丁 二酸及 19.5 g蔗糖 (44% w/w)連續添加至16.22 g水（其量係經定為可達到44 g 之最終製備物）中。完全溶解後，藉由0.2 μπι膜過遽將溶液 滅菌。在無菌條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的 DMEM培養基2.34 g以獲得每劑量106G ffu。在此狀況下劑 量為1.75 ml或2.2 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給 藥容器中。在此實例中DMEM表示6 % w/w。 表16 N0 NaOH (Μ) 丁二酸 (Μ) 蔗糖％ w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 BRR1 pH 在 pH>4 時之 BRR1 時間 (分鐘） 在t=0 時之 病毒 滴度 (每癌 在37 〇C，lw後 之病毒 滴度 .苗劑量1〇 在37 〇C ’ lw後 之病毒 損失 gioffu) 127 0.91 0.466 50% 6% 6.33 9 5.9 5.7 0.2 51 1.71 0.857 44% 6% 7.20 >29 00 00 〇〇 108304.doc -50- 1 藉由根據實例III.2.2.所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測 試來評價 。。將調配物5 1從長期穩定性研究中丟棄，因為經測定其抗 酸能力時間太長 II.3.2.已以表示每次1. 5 ml(1.95 g)之給藥166.6次的325 g總規模（250 ml)製成呈現於表17中之調配物56。抗酸物 質：丁二酸二鈉（Mwl62)。 調配物56:將20.50 g丁二酸二鈉及162.50 g蔗糖（50% w/w) 連續添加至122.50 g水（其量係經定為可達到325 g之最終製 備物）中。調配步驟之剩餘部分與調配物62所描述之彼等步 驟相同。在此實例中DMEM表示6 % w/w。 表17 N° 丁二酸 二鈉 (M) 蔗糖 % w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 BRR* pH 在 pH>4 時之 BRR* 時間 (分鐘） 在t=0 時之病 毒 滴度 (每癌 在37 °C ’ lw 後 之病毒 滴度 .苗劑量1〇, 在37 〇C，lw後 之病毒 損失 gioffii) 56 0.506 50% 6% 8.12/ 8.30° 13 6.3 5.5 0.8 藉由根據實例ΙΠ.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試 來評價；°=重複 II.3.3.輪狀病毒穩定性及抗酸能力-結果 總之，液體丁二酸鹽調配物中之輪狀病毒穩定性與pH值 有關：在37°C下1週期間pH 6.3給出良好穩定性，而在pH 8.1 時觀察到0.8 log之損失。 II.4.具有戊二酸鹽之調配物 II.4.1.具有戊二酸鹽之調配物呈現在表18中。 已以表示每次1. 5 ml(l.95 g)之給藥164次的320.8 g總規 模（246 ml)製成調配物65。抗酸物質：戊二酸（Mw 132)， NaOH(Mw 40)。 將 9_3 gNaOH、15.40 g 戊二酸及 162.5 g 蔗糖（50.6% w/w) 連續添加至114.1 g水（其量係經定為可達到320.8 g之最終 108304.doc •51 - 製備物）中。完全溶解後，藉由0.2 μιη膜過濾將溶液滅菌。 在無菌條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的DMEM培 養基19.5 g以獲得每劑量106 G ffu。在此狀況下劑量為1.5 ml 或1.95g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容器中。 在此實例中DMEM表示6 .08% w/w。 已以表示每次1·75 ml(2.2 g)之給藥20次的44 g總規模（35 ml)製成調配物50。抗酸物質：戊二酸（Mw 132)，NaOH(Mw 40) ° 將 2.4 g NaOH、3.964 g戊二酸及 19.5 g蔗糖（44% w/w)連 續添加至15.8 g水（其量係經定為可達到44 g之最終製備物） 中。完全溶解後，藉由0.2 μηι膜過濾將溶液滅菌。在無菌 條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的DMEM培養基2.34 g以獲得每劑量1 〇6'G ffu。在此狀況下劑量為1.75 ml或2.2 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容器中。在此實 例中DMEM表示6 % w/w。 已以表示每次1. 5 ml(l.95 g)之給藥166.6次的325 g總規 模（250 ml)製成調配物125及126。抗酸物質：戊二酸（Mw 132)，NaOH(Mw 40)。 調配物 125 :將 9.10 g NaOH、15.40 g戊二酸及 162_5 g蔗 糖連續添加至100.35 g水（其量係經定為可達到325 g之最終 製備物）中。該調配物步驟之剩餘部分與調配物67中所描述 之彼等步驟相同。在此實例中DMEM表示6 % w/w。 調配物126:如調配物125之方法進行製備但調整數量（見 表 18)。 108304.doc -52- 1358303 表18 N° NaOH (Μ) 戊二酸 (Μ) 蔗糖 % w/w DMExM % w/w 在t=0 時之 BRR* pH 在 pH>4 時之 BRR* 時間 (分鐘） 在t=0 時之 病毒 滴度 (每疫 在37 °C，lw後 之病毒 滴度 .苗劑量1〇, 在37 t，lw後 之病毒 損失 ?10池） 125 0.910 0.467 50% 6% 6.17 10-11 5.8 5.7 0.1 65 0.945 η λίλ V·-ϊ / ~τ <0/. / U <0/. V / u 6.49 11 6.0 5.6 0.4 126 0.950 0.467 50% 6% 8.13 12 6.1 5.4 0.7 50 1.71 0.858 44% 6% 8.45 >29 00 00 00 *藉由根據實例III.2.2.所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測 試來評價 。。將調配物50從長期穩定性研究中丟棄，因為其初始pH值 (8.0以上）及其抗酸能力（經測定時間太長） II.4.2輪狀病毒穩定性及抗酸能力-結果 總之，液體戊二酸鹽調配物中之輪狀病毒穩定性與pH值 有關：在37°C下1週期間pH 6.17給出良好穩定性，而在pH 8.1時觀察到0.7 log之損失。 II.5.具有己二酸鹽之調配物 φ 11_5.1.除了已以表示每次1.75 1111(2.2 8)之給藥20次的44 g規模（35 ml)製成之調配物η。45及已以表示每次1.5 ml(l.95 g)之給藥164次的320,8 g規模（247 ml)製成之調配 物η。63之外，已以表示每次1.5 ml(1.95g)之給藥166.6次的 325 g規模（250 ml)製成呈現在表19中的含有己二酸鹽之調 配物。抗酸物質：己二酸（Mw 146)，NaOH(Mw 40)。 調配物45 :將2.4 g NaOH、4.3 809 g己二酸及19.5 g蔗糖 (44% w/w)連續添加至15.38 g水（其量係經定為可達到44 g 108304.doc -53- 之最終製備物）中。完全溶解後，藉由0 2μπ1膜過濾將溶液 滅困。在無菌條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的 DMEM培養基2.34 g以獲得每劑量1〇6.o ffu。在此狀況下劑 ^為1.75 ml或2.2 使混合物均勻化並將其分佈在適當給 藥容器中。在此實例中DMEM表示6.% w/w。 調配物63:將9.3 gNa〇H、17.00 g己二酸及1625 g蔗糖 連續添加至112.50 g水（其量係經定為可達到32〇 8 g之最終 製備物）中。完全溶解後，藉由〇 2 膜過濾將溶液滅菌。 在無菌條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的dmem培 養基19.5 g以獲得每劑量106.〇 ffu。在此狀況下劑量為〗5如 或1.95 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容器中。 在此實例中DMEM表示6.08 % w/w。 調配物81 :將9.28 g NaOH、1 乂〇〇 g己二酸及162 5 g蔗糖 (50% w/w)連續添加至116.7〇 g水（其量係經定為可達到3乃 g之最終製備物）中。該調配步驟之剩餘部分與調配物67所 描述之彼等步驟相同。在此實例中DMEM表示6 % w/w。 調配物 82、83、91-97、100-109、、m-134、 136-145、147、148 :以表19及23中描述之數量將NaOii、 己二酸及蔗糖連續添加至水（其量係經定為可達到325 g之 最終製備物）中。完全溶解後，藉由〇 2 μιη膜過濾將溶液滅 菌。在無菌條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的DMem 培養基19.5 g以獲得每劑量丨〇 。在此狀況下劑量為^ $ ml或1 ·95 g。使所得混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容 器中。在此實例中DMEM表示6% w/w » 108304.doc • 54· 1358303 已變化表19中以粗體顯示之若干參數以測試所得調配物 關於抗酸能力及病毒穩定性之效能。 表19

N° NaOH (Μ) 己二酸 (Μ) 蔗糖％ w/w DMEM % w/w 在t=0時 之 BRR* PH 在 pH>4 時之 BRR* 省 ，一· (分鐘） 在t=0時 之病毒 滴度 (每fs 在37°c， lw後之 病毒 滴度 L苗劑量1〇! 在37°c， lw後之 病毒 損失 ?i〇£Eu) 45 1.71 0.857 44% 6% 7.29 >29 00 隆影響％ 63 0.945 0.472 50.6% 6% 6.49 12 6.0 5.6 0.4 81 0.917 0.460 50% 6% 6.2 11-12 5.9 5.7 0.2 82 0.899 0.451 45% 6% 6.39 11-12 5.9 5.7 0.2 83 0.928 0.466 55% 6% 6.38 12 5.9 5.8 0.1 具有不同抗酸能力之謂 配物 91 0.71 0.358 50% 6% 6.37 8 6.0 5.7 0.3 92 0.925 0.464 50% 6% 6.24 11-12 6.0 5.7 0.3 93 1.100 0.553 50% 6% 6.5 15-16 6.1 5.8 0.3 94 1.324 0.664 50% 6% 6.11 19-20 5.9 5.8 0.1 三次重複 95 0.928 0.466 55% 6% 6.3 12 6.0 5.9 0.1 96 0.928 0.466 55% 6% 6.55 12-13 6.1 6.0 0.1 97 0.928 0.466 55% 6% 6.3 12-13 5.9 5.8 0.1 pHl 直之影響 103 達pH 5.09 0.466 55% 6% 4.94 〇〇 〇〇 〇〇 〇〇 104 0.610 0.466 55% 6% 4.94 〇〇 〇〇 〇〇 00 105 0.69 0.466 55% 6% 5.15 6 5.8 5.5 0.3 106 0.928 0.466 55% 6% 6.09/ 6.10° 12 6.1 6.0 0.1 107 0.928 0.466 55% 6% 00 12 00 〇〇 〇〇 108 0.69 0.630 53.15% 6% 00 〇〇 00 00 00 109 0.69 0.630 55% 6% 00 〇〇 〇〇 〇〇 〇〇 131 0.93 0.466 55% 6% 6.45 12 ND ND ND 132 0.94 0.466 55% 6% 6.76 13 6.1 5.8 0.3 136 0.94 0.463 55% 6% 9.36 〇〇 〇〇 〇〇 oo 137 0.94 0.460 55% 6% 9.37 〇〇 〇〇 00 oo 138 0.94 0.457 55% 6% 0。9.67 00 00 00 00 139 0.94 0.455 55% 6% 009.92 〇〇 00 〇〇 00 140 0.94 0.452 55% 6% 〇〇10.25 〇〇 〇〇 〇〇 oo 141 0.93 0.466 55% 6% 00 〇〇 〇〇 〇〇 00 142 0.93 0.471 55% 6% 00 〇〇 00 00 00 145 0.93 0.463 55% 6% 7.66/ 7.55° 13 6.1 5.8 0.3 108304.doc -55- 1358303 144 0.93 0.460 55% 6% 7.73/ 7.80° 12-13 6.1 6.0 0.1 143 0.93 0.458 55% 6% 7.96/ 7.90° 13-14 6.0 5.5 0.5 124 0.95 0.466 55% 6% 9.48 13 5.9 <2.85 >3 7 7售己二酸鹽之不同來源 122 0.92 0.466 55% 6% 6.36 12 6.0 5.9 0.1 123 0.92 0.466 55% 6% 6.32 13 5.8 5.7 0.1 市售蔗身 奢之不同ί 民源 133 0.92 0.466 55% 6% 6.34 13 5.8 5.8 0 147 0.92 0.466 55% 6% 6.32 11-12 6.0 5.7 0.3 134 0.92 0.466 55% 6% 6.34 13 6.3 5.8 0.5 148 0.92 0.466 55% 6% 6.34 11-12 5.8 5.9 0 *藉由根據實例III.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試 | 來評價；ND=未測定；。=重複 。。吾棄調配物45，因為抗酸能力太久 °。吾棄調配物103、104及108、109，因為己二酸一旦在4-8 °C下靜置即再結晶 。。丟棄調配物η。107、141及142，因為其與已在估計下之調 配物類似 。。丟棄調配物η。136-140，因為初始pH值太高 Π.5.2.輪狀病毒穩定性及抗酸能力-結果 φ 根據實例II1.1中給出之程序已估計在不同時間點的輪狀 病毒病毒滴定且根據實例III. 2.2中給出之實驗程序已估計 調配物之抗酸能力。結果在表19、20、21及22予以說明。 表2〇-在室溫下之病毒穩定性 Ν° 莖溫 (¾ 下儲存後之病毒滴定 t疫苗劑量l〇gin ffU) 1 m* 2 m* 3 m* 4 m* 5 m* 6 m* 7m* 8m* 63 5.8 5.8 5.5 5.5 5.0 81 5.5 4.9 82 5.4 4.9 83 5.6 5.1 5.0 91 5.6 5.4 5.3 5.0 —--- 108304.doc -56· ⑧ 1358303

表21-在4eC下之病毒穩定性

測（見實例III.2.2)並顯示在pH>4時達到8、12、16或2〇分鐘 之可能性。結果在表22及圖2A中顯示。 表22 108304.doc -57- (?) 1358303 Λ 調配物94 調配物93 調配物92 調配物91 時間(分鐘） pH pH pH pH 0 6.11 6.5 6.24 6.37 1 5.11 5.07 4.93 4.79 2 5.03 4.98 4.84 4.67 3 4.96 4.9 4.75 4.56 4 4.90 4.83 4.67 4.45 5 4.85 4.76 4.58 4.34 6 4.79 4.69 4.51 4.23 7 4.74 4.62 4.42 4.12 8 4.68 4.56 4.34 4.00 9 4.63 4.49 4.26 3.86 10 4.57 4.42 4.17 3.70 11 F 4.51 4.36 4.08 12 4.46 4.29 3.98 13 4.40 4.22 3.87 14 4.35 4.15 3.75 15 4.29 4.07 3.6 16 4.23 3.98 17 4.17 3.88 18 4.11 3.78 19 4.05 3.66 20 3.98 21 3.91 22 3.83 23 3.75 24 3.65 總之，如對其他羧酸鹽調配物之觀察，在己二酸鹽系列 中高pH值未給出良好的穩定性資料（見例如調配物124，其 具有9.5之pH值且在37°C下儲存1週後展示多於2.85 log的 病毒損失）。 PH值之最高可接受限值為約8.0(見例如對調配物143而 言獲得的7.96之pH值），對於此值而言在37°C下1週後觀察 到0.5 log之病毒損失。 對於此等調配物而言，適合pH值範圍係在約pH 5.5與約 pH 8之間，最適合範圍在pH 6.0與pH 7.7之間。 己二酸鹽（一種食物添加劑物質）調配物很好地兼顧最佳 108304.doc -58 * ⑤ 1358303 5.4及pKa2 4.43)，其使用合理數量之物質（每劑 里約100毫克）來達到目標抗酸能力（如t=12分鐘）。另外此 ..等數1與溶解度參數相容，藉此使疫苗以15ml之劑量體積 ， 調配。對常規檸檬酸鹽磷酸鹽調配物而言此為不可能，此 係歸因於技術不實用性，諸如磷酸鹽之結晶（見比較實例 IV)。其亦與鲁性參數相容，因為與其他羧酸鹽相比，己二 酸鹽之毒性資料相當低（大鼠之經口 LD5〇 : 5 7 g/kg)。 II.5.3疫苗劑量中病毒滴度對病毒穩定性之影響 > 進行以下實驗以估計i.5 ml疫苗劑量中之初始輪狀病毒 滴度（106。、1〇6.5、1〇5·2)對輪狀病毒穩定性之影響。 根據實例III.1中給定之方法已及時估計不同點的輪狀病 毒病毒滴定及根據實例ΠΙ.2.2中給定之方案已估計調配物 之抗酸能力。結果在表23 ' 24及25中予以說明》 表23 N° NaOH (Μ) 己二酸 (Μ) 目標病 毒滴度 logio ffu 蔗糖 % w/w 在t=0 時之 BRR1 pH 在 pH>4 4之 BRR1 時間 (分鐘） 在t=0 時之 病毒 滴度 (每疫 在37 °C，lw後 之病毒 滴度 .苗劑量1〇 在37 〇C，lw 後 之病毒 損失 ϊιο ffu) 1UU 0.928 0.466 6.0] 55% 6.59 叫 12 6.0 5.7 0.3 ιοί 0.928 0.466 6,5 55% 6.96 12 6.7 6.5 0.2 102 0.928 0.466 5.2 55% 6.45 12 5.4 5.4 0 108304.doc -59- ⑧ 1 藉由根據實例III.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試 來評價 1358303

表24 :室溫下之病毒穩定性 N° 室溫下儲存後之病毒滴定 (每疫苗劑量log10 5U)

.月，空白框=未測定 表25 : 4°C下之病毒穩定性 N° 1 nn 在t=o時之 病毒滴度 在37〇C，lw後 之病毒滴度 lm* 2m* 3m* 4m* 6m* 12m* 1UU 6.0 -5.7 6.0 5.8 101 1 ΛΛ 6.7 — _ 6.5 6.6 6.4 丄U2 5.4 5.4 5.3 5.2 一月，空白框=未測定

總之’在估計範圍内無論何種初始病毒滴度，輪狀病毒 穩定性均保持類似及可接受。 II.5.4在鈣離子存在下具有己二酸鹽之調配物

已報導飼可影響在盤基網柄菌（Dictyostelium discoideum) 中表達之輪狀病毒S A11糖蛋白VP7之穩定性及構形（K.R. Emslie4 人 ’ 1996，Journal of Biotechnology 50，149-159)。 將約離子添加至本發明之己二酸鹽輪狀病毒液體調配物中 可為有益’因為其可促進調配物内之輪狀病毒的穩定。因 此’在己二酸鹽調配物中已測試各種數量之鈣離子（表26)。 已測試兩種替代物：CaCl2及Ca(OH)2。

調配物98、116-118 :將以下各物連續添加至9.28 g NaOH 108304.doc •60· ⑧ 中：水（其量係經定為可達到325 g之最終製備物），17.00 g 己二酸，表26指定之CaCl2，（發生沉澱，但在室溫下攪拌 一小時後沉澱物再溶解，除了在調配物n° 117中之外），及 178.75 gM#。胃酉己 剩&杳酉己 等步驟相同。在此調配物中DMEM表示6% w/w。 調配物99 :將以下各物至連續添加水中（其量係經定為可 達到325 g之最終製備物）：表26指定之Ca(OH)2，17.00 g己 二酸，9.02 g NaOH及178.75 g蔗糖。調配步驟之剩餘部分 與調配物82所描述之彼等步驟相同。在此調配物中DMEM 表示6% w/w。根據實例III. 1中給出之程序已估計不同時間 點的輪狀病毒病毒滴定且根據實例III.2.2中給出之實驗程 序已估計該調配物之抗酸能力。結果在表26、27及28中予 以說明。 調配物119-121 :將以下各物連續添加至表26中所指定之 CaCl2中：水（其量係經定為可達到325 g之最終製備物），9.28 g NaOH(在此狀況下發生Ca(OH)2沉殿，但在添加己二酸之 後沉澱物再溶解，除了在調配物n° 121中之外），17.00 g己 二酸及178.75 g蔗糖。調配步驟之剩餘部分與調配物82所描 述之彼等步驟相同。在此調配物中DMEM表示6% w/w。 表26 N° NaOH (Μ) 己二酸 (Μ) CaCl2 (Μ) 蔗糖 % w/w 在 t=0時 之 BRR* pH 在 pH>4 時之 BRR* 時間 (分鐘） 在t=0 時之 病毒 滴度 (每疫 在37 〇C，lw後 之病毒 滴度 苗劑量1〇! 在37 °C ’ lw後 之病毒 滴度 98 0.928 0.466 0.013 55% 6.59 12-13 6 5.8 0.2 108304.doc •6卜 1358303 來評價

118 0.928 0.466 0.004 55% —6.96 1? 6 1 < 0 Λ Ί 116 0.928 0.466 0.0129 55% 6.45 12 5 9 J.O ^ Q Λ 1 119 117 0.928 0.928 0.466 0.466 0.0132 0.018 55% 55% 6.36 oo 12 〇〇 ^ 5.9 J.O 6 U. I 0 120 121 0.928 0.928 0.466 0.466 0.019 0,051 55% 55% 16.18 —53~~ JJ^12 〇0 6 5.8 00 0.2 ------ OO OO OO Ca(OH)2 (M) ----- ΊΤ~πγ 99 0.902 0.466 0 0086 55% 6 54 5.8 5.7 0.1 *藉由根據實例III.2.2所修改 々受兒雖塞特-賴斯（BRR)測試 。。丟棄調配物117及121，因為在其製備期間發生不溶物質 之一些沉澱 表27 :室溫下之病毒穩定性

之病毒狀(每疫關-

月，二白樞=未測定 表28 : 4°C之下病毒穩定性 2m* 3m* 4m* 6m* 12m* N° 在t=〇時·之 病毒滴度 在37°C，lw後 之·病毒滴度 lm*

月，二白樞：=未測定 5.8 6.2 5.9 JJJJ T9 6.0 6.1

6.1 ^9"UU 108304.doc •62· ⑧ 1358303 結論：說明在鈣離子存在下輪狀病毒的穩定性：在”乞 下1週後經歷不多於0.3 l〇g之損失，此結果與在相同條件下 製成且含有相同成分（除添加的鈣離子之外）之調配物所獲 得的結果類似（見例如表19-21中之調配物83) »

II·5.5在經口小兒麻痹病毒（〇ra| p〇n〇 Viruses)存在下具有 己二酸鹽之調配物

一些常規免疫方案可在相同時間點聯合經口小兒麻痹及 輪狀病毒接種。以下實驗之目標係評價兩個接種是否相 容。因此，製備一種實驗經口小兒麻痹/輪狀病毒組合疫苗。 用於調配物149、151-155之OPV培養基的組成 注射用水：80.00 L 乳白蛋白水解物：1500.00 g 注射用水：200.00 L 氣化鈉：2040.00 g 氣化鉀：120.00 g 七水合硫睃鎂：30.00 g KH2P〇4： 38.00 g 無水葡萄糠：1200.00 g 硫酸新黴素（Neomycine): 15.00 g Tween 80 ： 6.00 g 二水合氣化鈣：80.00 g 氫氧化鈉：30.00 g 碳酸氫納：660.00 g 盼紅：6.00 g 108304.doc -63 - 1358303

L-胱胺酸：30.00 g IN鹽酸：550.00 g 疏酸 Polymixixine B : 30.00 g 注射用水直至300.00 L。

調配物149-155 :將表29中描述之數量的NaOH及己二 酸，及178.75 g蔗糖連續添加至水（其量係經定為可達到325 g之最终製備物）中。完全溶解後，藉由0.2 μπι膜過滤將溶液 滅菌。在無菌條件下且根據表29中描述之數量，添加含有 必要數量之輪狀病毒的DMEM培養基以獲得每劑量106·5 CCID5〇i含有必要數量之小兒麻痹病毒的OPV培養基以獲 得每劑量 1〇66 CCID50 之 I型、105·6 CCID50 之 II型及 106·1 CCID50之III型。在此狀況下劑量為1.5 ml或1.95 g。使所得 混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容器中。在彼等實例 中，DMEM表示 6% w/w，蔗糖為 55% w/w，NaOH為 0.92M， 己二酸為0.466 Μ。 表29

NaOH 己二 酸 水 輪狀 病毒 DMEM 培養基 輪狀 病毒 OPV 培養基 OPV I型 OPV II型 OPV III型 G g g g g g g g g 149 9.2 17 92.55 19.5 - 8.00 - - - 150 9.2 17 100.55 14.24 5.26 - - - - 151 9.2 17 92.55 14.24 5.26 8.00 - - 152 9.2 17 92.55 19.5 - 0.07 5.30 0.53 2.10 153 9.2 17 92.55 19.5 _ 2.70 5.30 - - 154 9.2 17 92.55 19.5 - 7.47 - 0.53 - 155 9.2 17 92.55 19.5 - 5.90 - - 2.10 108304.doc • 64 - ⑧ 1358303 根據實例III. 1中給出之程序已估計不同時間點的輪狀病 毒病毒滴定且根據實例III.2.2中給出之實驗程序已估計該 調配物之抗酸能力。結果在表30中予以說明。 表30(在此表中：所有病毒滴度為CCID50/劑量"） BRR* 分鐘 目標 輪狀 病毒 目標 OPV I型 目標 OPVII 型 目標 OPVIII 型 輪狀 病毒· 滴度 t=0 4°C 輪狀 f· 4 -rr 滴度 lw 37〇C OPV I型滴 度 OPVI II型 滴度 OPVI III型 滴度 149 12 no no no no 150 10 05 no no no 106Z 10 151 10 63 no no no 1003 10 152 no 10 06 1056 10 01 ίο6·7 ΙΟ36 \ούΖ 153 no 10 bb no no 154 no no 10 36 no 155 no no no 10 01 *藉由根據實例ΙΠ.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測 試來評價。 * *可估計ffu與CCID50間之對應為約0.5 log(例如以 CCID5 0表示之106 G粗略等於以每劑量ffu表示之105·5)。 空白框：未測定 "no"意謂未將相應病毒合併入調配物中 結論· 1) 小兒麻痹培養基與抗酸能力相容（在調配物n° 149中 BRR 12分鐘） 2) 小兒麻痹培養基與輪狀病毒相容（將調配物n° 150與調 配物n° 1 5 1相比，其中可見對於兩種調配物而言，在t=0 4 °C下及在37°C —週後獲得相同滴度）。 3) 輪狀病毒組成與小兒麻痹病毒相容（在調配物n° 152中 108304.doc -65- ⑧ 1358303 獲得預期之小兒麻痹病毒滴度） II.S.6冰凍情況期間己二酸鹽調配物之穩定性 Π·5_6.1·於 _2〇°C 時冰凍 將輪狀病毒調配物η。95在+ 及+ 8°C間儲存6個月 後’根據以下時間安排（表3 1)經受3次連續冰凍（-20。〇）情 況》 工1.5.6.2.於-70。(：時冰凍 將輪狀病毒調配物η。95在+ 4。(：及+ 8°C間儲存14個月 後’根據以下時間安排（表31)經受一次_70°C冰凍情況。 表31

在-20°°C持續時間 T=+4°C T=-20°C T=-70°C t=0(在 4-8°C 儲存 6 個月後） 9瓶 t=120 天 自-20退回：9瓶 t=120天 3瓶：Ιχ-20。。 6瓶 t=196 天 自-20退回：6瓶 t=197 天 3瓶：2x-20°C 3瓶 t=224天 自-20退回：3瓶：3 x-20°C 在-70°°C持續時間 t=0(在 4_8UC 儲存 14 個月後） 3瓶 t=15 天 自-70退回：3瓶：1 x-70°C 分析該等樣品並將其與t=0(4t：)時的病毒滴度比較且亦 與通常冷箱溫度下儲存相同時期（在此狀況下+4<t下15個 108304.doc • 66 - 月）之樣品的病毒滴度比較。結果在表32中顯示β 表32 t=0，4〇C t=15個月，4°C N0 95 6.0 5.9 N0 95 lx-20°C 5.8 N° 95 2x-20〇C — 一 5.9 N° 95 3x-20〇C 5.9 N° 95 lx-70°C 「5.9 總之，調配物η° 95(己二酸鹽調配物）之組成與至少三次 連續-20°C下之冰凍情況相容。其亦與至少一次-70°C下之冰 凍情況相容。 II.6蘋果酸鹽作為羧酸鹽之調配物 11.6.1已以表示每次1.5 1111(1.95§)之給藥166.6次的325呂 規模（2 50 ml)製成呈現在表33中的調配物（除調配物46、 64、84、85及86之外）》抗酸物質：D,L-蘋果酸（Mw 146) ’ NaOH(Mw 40)。 已以表示每次1.75 ml(2.2 g)之給藥20次的44 g規模（35 ml)製成調配物n° 46。抗酸物質：D，L-蘋果酸（Mw 146)， NaOH(Mw 40)。 調配物46 :將2.4 g NaOH、4.0211 g蘋果酸及19.5 g蔗糖 (44% w/w)連續添加至15.74 g水（其量係經定為可達到44 g 之最終製備物）中。完全溶解後，藉由0.2 μπι膜過濾將溶液 滅菌。在無菌條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的 DMEM培養基2.34 g以獲得每劑量i〇6Q ffu〇在此狀況下劑 量為1.75 ml或2.2 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給 藥容器中。在此實例中DMEM表示6% w/w。 108304.doc •67· 1358303 已以表示每次1·5 ml(1.95 g)之认从 ie _ 给樂163次的318.4 g規模 (244.5 ml)製成調配物η。64。栝t , 坑酸物質：D，L-蘋果酸（Mw 146)，NaOH(Mw 40)。 0

已以表示每次1.5 ml( 1.95 ^ g)之给樂66.6次的130 g規模 (100 nil)製成調配物η。84。抗酴铷挤 、 犰瞍物質：D-蘋果酸（Mw 146)，

NaOH(Mw 40)。 已以表示每次L5 ml(1.95 g)之給藥心次的i3〇 §規模

(1〇〇ml)製成調配物η。85。抗酸物質：L-蘋果酸（Mwl46)， NaOH(Mw 40)。 已以表示每次L5 ml(1.95 g)之給藥㈤次的i3〇 g規模 000㈣製成調配物η。86。抗酸物質：D，L_蘋果酸（Mw 146)，NaOH(Mw 40) »

調配物64 :將14.6 g Ν_、24.50 g蘋果酸及162 5 g蔬糖 (5P/。w/w)連續添加至97.3沐（其量係經定為可達到3i84 g之最终製備物）卜完全溶解後，藉由膜過遽將溶液 滅菌。在無菌條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的 DMEM培養基19.5 g以獲得每劑量1〇6.G ffu。在此狀況下劑 量為1.5 ml或1.95 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給 藥容器中。在此實例中DMEM表示6 12% w/w。 調配物71 :將 14.90 g NaOH、25.00 g己二酸及 162 5 g蔗 糖（50% W/W)連續添加至103.9 g水（其量係經定為可達到 325 g之最終製備物）中。該調配步驟之剩餘部分與調配物67 所描述之彼等步驟相同。在此實例中£)1^1£]^表示6 % 調配物72-77、84-86 :如調配物71進行製備，但調整數量 108304.doc • 68· ⑤ 1358303 (見表33)。 調配物78:將下列各物連續添加至75.00 g水中：8.00 g NaOH，25.00 g蘋果酸，足夠1 N NaOH溶液以達到pH 6.48， 額外水以達到325 g及162.50 g蔗糖（50% w/w)。該調配步驟 之剩餘部分與調配物67所描述之彼等步驟相同。在此實例 中 DMEM表示 6 % w/w。 調配物79及80 :如調配物78進行製備，但調整數量（見表 33)。 表33 N° NaOH (Μ) 蘋果酸 (Μ) 蔗糖 % w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 BRR* pH 在 pH>4 卷之 BRR* 時間 (分鐘） 在t=0 時之 病毒 滴度 (每疫 在37 °C ’ lw 後 之病毒 滴度 .苗劑量Ιο, 在37 〇C，lw後 之病毒 損失 46 1.71 0.787 44% 6% 6.92 20 6.0 5.9 0.1 64 1.490 0.747 51% 6.12% 6.08 11-12 6.0 5.9 0.1 71 1.490 0.746 50% 6% 5.67 11 5.9 5.8 0.1 72 1.240 0.621 50% 6% 6.15/ 6.16° 8 5.8 5.8 0 73 2.00 0.918 50% 6% 00 OO OO OO OO 74 1.490 0.746 53% 6% 5.19 8 5.8 5.8 0 75 1.490 0.746 56% 6% oo OO OO OO oo 76 1.79 0.896 47% 6% 5.21 14 5.7 5.8 0 77 1.79 0.896 44% 6% 5.35 15 5.8 5.9 0 78 達pH 6.48 0.746 50% 6% 7.1/ 7.05° 9 5.9 5.6 0.3 79 達pH 5.98 0.746 50% 6% 6.42/ 6.41° 9 5.9 5.5 0.4 80 達pH 7.05 0.746 50% 6% 7.43 9-10 6.0 5.4 0.6 86 1.490 0.746 50% 6% 5.82 11 6.1 5.8 0.3 84 1.490 0.746 50% 6% 5.82 11 5.8 5.8 0 85 1.490 0.746 50% 6% 6.03 11 5.7 5.7 0

*藉由根據實例III.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測 試來評價；°=重複 108304.doc •69- ⑤ 1358303 °。因為減菌過濾期間之困難而丟棄調配物73，此困難歸因 於該溶液之高黏度 丢棄調配物7 5 ’因為蔬糖之緩慢溶液化 根據實例III.1中給出之程序已估計不同時間點的輪狀病 毒病毒滴定且根據實例III.2.2中給出之實驗程序已估計該 調配物之抗酸能力。結果在表33、34及35中予以說明。 表34:在室溫下之病毒穩定性

* =月；ND=未測定 表35·在4°C下之病毒穩定性 N° 在t=0時之病毒滴 度 在37〇C，lw後 之病毒滴度 1m* 2m* 3m* 4m* 6m* 12m* 64 6.0 5.9 5.8 5 8 ND 5 8 ND 85 5.7 5.8 ND 5.8 ND ND 5.6 5.7 * =月；ND=未測定 11.6.2輪狀病毒穩定性及抗酸能力·結果 液體蘋果酸鹽調配物中之輪狀病毒穩定性與pH值有關。 經調查之pH範圍意即6.0至7.0之pH範圍在37〇c下一週期間 給出良好穩定性。 ΙΙ·7·具有麩胺酸鹽之調配物 天冬胺SiL鹽及麵鹽為在其側鍵上具有缓酸鹽基團的 胺基酸。彼等側鏈羧酸之pKa值分別為3 65及4 25。因此具

108304.doc 有同於4之pKa的麵胺酸鹽可用作緩衝液以增強抗酸能力。 見表36。 調配物41 .以表36中描述之數量將NaOH、賴酸及嚴糖 連α添加至水（其量係經定為可達到325 g之最終製備物） 中。το全溶解後，藉由〇 2 μιη膜過濾將溶液滅菌。在無菌 條件下，添加含有必要數量之輪狀病毒的培養基Μ 5 g以獲得每劑量1〇6 〇 ffu。在此狀況下齊！量為15⑹或195 g。使所得混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容器中。在 此實例中DMEM表示6% w/w。 調配物43 .將7.1 g—水合麵胺酸一鈉及19 5〇 g蔗糖（44% w/w)連續添加至水（其量係經定為可達到44吕之最終製備物） 中。完全溶解後，藉由〇.2 μιη膜過渡將溶液滅菌。在無菌 條件下’將含有必要數量之輪狀病毒的DMEM培養基2.64g 添加至溶液中以獲得每劑量丨〇6.〇 ffu。在此狀況下劑量為 1.75 ml或2.2 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容 器中。在此實例中DMEM表示6〇/〇 w/w。 調配物61·將52.43 g—水合麵胺酸一納及丨44 g嚴糖（44% w/w)連續添加至水（其量係經定為可達到325呂之最終製備 物）中。完全溶解後，藉由〇.2 μπι膜過濾將溶液滅菌。在無 菌條件下，將含有必要數量之輪狀病毒的DMEM培養基19 5 g添加至該溶液中以獲得每劑量丨〇6.〇 ffu。在此狀況下劑量 為1.75 ml或2.2 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給藥 容器中。在此實例中DMEM表示6% w/w。 調配物68:將下列各物連續添加至水（其量係經定為可達 108304.doc 到250 g之最終製備物）中：0_2 g—水合麩胺酸一鈉、2.5 g 牛血清白蛋白、0.250 g Na2HP04.2H20、0.125 g KH2P04、 0.5 gEDTA及18.75 g蔗糖（7.5% w/w)。完全溶解後，藉由0.2 m膜過濾將溶液滅菌。在無菌條件下，將含有必要數量之 輪狀病毒的DMEM培養基19.5 g添加至該溶液中以獲得每 劑量10έ ί) ffu。在此狀況下劑量為1.5 ml或接近於1.5 g。使 混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容器中。在此實例中 DMEM表示 7.8% w/w。 根據實例III. 1中給出之程序已估計不同時間點的輪狀病 毒病毒滴定且根據實例III.2.2中給出之實驗程序已估計該 調配物之抗酸能力。結果在表36、37及38中予以說明。 表36 N° NaOH (Μ) 麩胺酸 (Μ) 蔗糖 % w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 BRR1 PH 在 pH>4 BRR1 時間 (分鐘） 在t=0 時之病 毒滴度 (每癌 在37 〇C，lw 後之病 毒滴度 .苗劑量1〇, 在37 t，lw後 之病毒 損失 l\〇 ffu) 41 1.06 0.542 51% 6% 10.36 15 〇〇 〇〇 麩胺酸鈉(Μ) 43 1.088 44% 6% 6.92 12 6.0 5.8 0.2 61 1.085 44% 6% 6.93 11-12 6.1 6.1 0 68 0.0043 7.5% 7.8% 6.85 <1 6.0 <3 >3 108304.doc -72- 1 藉由根據實例ΙΠ.2.2所修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測 試來評價。 。。丟棄調配物41，因為其初始pH值太高 。。將調配物68自長期穩定性研究中丟棄，因為在37°C下一 週後獲得之病毒損失結果不令人滿意。 表37 :室溫下之病毒穩定性 1358303 N。 41 1 m* ·. 2 m* t溫下傷 3 m* 普存後之 4 m* -病毒滴 5 m* 定(每疫 6 m* 苗劑量 7m* logio ffij 8m* 0 9m* 10m* 4J 61 68 6.1 Γ 5.7 5.6 *=月；空白框=未測定 表38 : 4°C下之病毒穩定性 N° 在t=〇時之病 毒滴度 在37°C，lw後之 病毒滴度 lm* 2m* 18m* 41 43 61 6.1 6.1 6.1 6.0 5 6 68 * =月；空白框=未測定

液體麩胺酸鹽調配物中之輪狀病毒穩定性與上文描述之 其他叛酸鹽獲得之穩定性類似《簡言之： -與鹼性更大的培養基（在調配物n。43中pH 10.36)相比，pH 值約為7(在調配物η。61中為6.93)時穩定性較好 -在高蔗糖百分比中穩定性亦較好（調配物η。6丨中之44〇/〇嚴 糖與調配物η° 68中之7.5%蔗糖相比）

-在37°C —週、室溫及4-8°C下之穩定性的分佈曲線與上文描 述之其他羧酸鹽類似》 Π·8.具有反丁烯二酸鹽之調配物 調配物 44 :將 2.4 g NaOH、3.4811 g反丁烯二酸及 19 5 g 嚴糖（44% w/w)連續添加至16.28 g水（其量係經定為可達到 44 g之最終製備物）中。在至溫下授拌一小時後不溶物質保 持懸濁液形式。丟棄該製備物。 Π.9.具有乳糖酸鹽之調配物 108304.doc •73- ⑤ 調配物 47:將 1.2gNa〇FT、 g aUH 1()‘7414g乳糖酸及13.7g蔗糖 (31% w/w)連續添加至l6,〇2 g水(其量係經定為可達到44荏 之最終製備物)中。疋全溶解後，藉由〇2㈣膜過濾將溶液 滅菌。在無菌條件下添加含有必要數量之輪狀病毒的 DMEM培養基2.34 g以獲得每劑量1〇6.0ffu。在此狀況下劑 星為1.75 ml或2.2 g »使’⑥合物均句化並將其分佈在適當給 藥容器中。在此實例中DMEN^示6 % w/w。 11.10.具有順丁烯二酸鹽之調配物 調配物48:將2.4gNa〇H、2.8821 _丁稀二酸針及195 g蔗糖（44% w/w)連續添加至16·88 g水（其量係經定為可達 到44 g之最終製備物）中。完全溶解後，藉由ο.〗膜過濾 將浴液滅菌。在無菌條件下添加含有必要數量之輪狀病毒 的DMEM培養基2,34 g以獲得每劑量1〇6_〇 ^在此狀況下 劑直為1.75 ml或2.2 g ^使混合物均勻化並將其分佈在適當 給藥容器中。在此實例中DmEM表示6.% w/w。 調配物57:將32.7 g順丁烯二酸二鈉及162.5 g蔗糖（50% W/W)連續添加至110·3 g水（其量係經定為可達到325 g之最 終製備物）中》完全溶解後，藉由〇 2 μιη膜過濾將溶液滅菌。 在無菌條件下添加含有必要數量之輪狀病毒的DMEM培養 基丨9.5 g以獲得每劑量1〇6.o ffu。.在此狀况下劑量為丨5 ml 或1.95 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給藥容器中。 在此實例中DMEM表示6.% w/w » II. 11·具有葡糖醛酸鹽之調配物 調配物49 :將1.2 g NaOH、5.8211 g葡糖醛酸及18.5 g蔗 108304.doc 1358303 糖（42% w/w)至連續添加16.14 g水（其量係經定為可達到料 g之最終製備物）中。完全溶解後，藉由〇.2 μιη膜過濾將溶液 滅菌。在無菌條件下添加含有必要數量之輪狀病毒的 DMEM培養基2.34 g以獲得每劑量10" 在此狀況下劑 量為1.75 ml或2.2 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給 藥容器中。在此實例中DMEM表示6.% w/w。 11.12. 具有半乳糖醛酸鹽之調配物 調配物52 :將1.2 g NaOH、5.8218 g半乳糖醛酸及18.5 g 蔗糖（42% w/w)連續添加至16.14 g水（其量係經定為可達到 44 g之最終製備物）中《完全溶解後，藉由〇2 ^111膜過濾將 溶液滅菌。在無菌條件下添加含有必要數量之輪狀病毒的 DMEM培養基2.34 g以獲得每劑量1〇6.o ffu〇在此狀況下劑 量為1.75 ml或2.2 g。使昆合物均句化並將其分佈在適當給 藥容器中。在此實例中DMEM表示6 % w/w。 11.13. 具有半乳糖二酸鹽之調配物 調配物 53 :將 2.4 g NaOH、ό 、6·30〇8 g半乳糖二酸及17.0 g

保持懸濁液形式。丟棄該製備物。 11.14.具有酒石酸鹽之調配物 調配物 55 :將 2.4 g NaOH、4 (44% w/w)連續添加至15 26 之最終製備物g)中》完全溶解後，肩 溶液滅菌。在無菌條件下添加含有 、4.4996 g酒石酸及19.5 g蔗糖 g水（其量係經定為可達到44 g ’藉由利用0.2 μπι膜過濾將 必要數量之輪狀病毒的 108304.doc •75· ⑤ 1358303 DMEM培養基2.34 g以獲得每劑量i〇6G ffu。在此狀況下劑 量為1·75 ml或2.2 g。使混合物均勻化並將其分佈在適當給 藥容器中。在此實例中DMEM表示6.% w/w。 II.15.含有羧酸鹽但未添加磷酸鹽之調配物的總結論 在未添加磷酸鹽的條件下用各種羧酸鹽製備若干穩定的 調配物。存在於此等實驗調配物中的唯一磷酸鹽係源自 DMEM緩衝液，且其從未超過0 059 mM(5% w/w DMEM)、 0.071 mM(6% w/w DMEM)或 0.094 mM(8% w/w DMEM)。所 有經測試之羧酸鹽皆顯示在中和胃酸度藉此預防或最小化 活性成分（意即存在於調配物中之輪狀病毒抗原）之失活上 充當緩衝劑的能力。以各種投與劑量體積（意即丨5 m卜2.0 ml及2.5 ml)製成之所有測試調配物皆展示在約pH 5.0至約 pH 8.0之間的pH值，且對於大部分調配物而言，展示約pH 5.5至約7.5之pH值。在三種測試儲存溫度下（意即37。〇、室 或4 C )’在穩定性測試期間此等調配物的表現良好。另 外，此等調配物展示令人滿意的抗酸能力，意即至少8分鐘 之抗k此力，且對於大部分調配物而言至少12分鐘，抗酸 旎力係藉由BRR測試（見實例ΙΠ.2.2中之程序）評價。 下表39中呈現經選擇之己二酸鹽調配物根據調配物之pH 值所％之穩定性資料的簡要概述。評價下列標準：丨）在π 下週期間儲存後的病毒損失（加速穩定性）（*)，u)病毒 商又損失保持在[〇 1〇g以下（在室溫下儲存後）之以月表示 。 以及在所述期間内達到的病毒滴度（**)，iii)在4 啫存年（12個月）後所達到之以ffu/疫苗劑量計之病 108304.doc -76- ⑤ 1358303

毒滴度（***)。 表39 pH$ 在37t，1 w後之病毒 損失 拿 室溫 <1 log 4°C 12M 本 幸 ! 嚴3 睹45% ! 82 6-39 0.2 _ 6M4.9i^ti 5.8 | 蔗糖50% ! 63 6.49 0.4 m 5M5.0 5.8 酬 81 6.2 0.2 6M4.9 6 m 55% I 124 9.48 >3 未做 143 8 0.5 m ο 未做 5.5 β 画 144 7.75 0.1 未做 5.4 画 145 7.35 0.3 [；Γ·.ί 未做 5.4 WM 132 6.76 0.3 SB 6M5.5 5.8 :广㈤ 96 6.55 0.1 mm 8M5.2 Π:' 5.9 SHfil WHM 83 6.38 0.1 麵 7M5.0 S 5.9 9SBB 95 6.3 0.1 鼸 8M5.1 S8BI 5.8 asm 97 6.3 0.1 圓 8M4.9 WKbs 5.8 p -:二 1 106 5.97 0.1 麵 6M5.2 mm 5.8 ^Π3 L...:么 105 5.98 0.3 _ 5M 4.8 5.7 sWWp mm 104 5.12 0.2 纖 結晶 yyBS9SE36T 103 5.09 0.4 繪: 結晶 M=月

=藉由根據實例m.2.2之BRR測試在T=〇(40C )下評價之pH 值 log之 *基於37°口—敎穩H料的最好結果„容許05 最大病毒滴度損失 * *基於室溫之穩定性測試 病毒滴度損失 的最好結果一容許10 log之最大 log之最 基於4-8°C之穩定性 大病毒滴度損失 測試的最好結果..容許0.5 病毒滴度損失20.5 log但 累積最好結果.根據此標準， 108304.doc •77· ⑤ 1358303 < 1·〇 log，且滴度損失<0·5丨〇g均容許，且均可接受 灰色陰影：針對所評價之標準（*、**、***或***)具有〈 0.5 log之病毒損失的可接受調配物；虛線框：針對所評價

之標準（*、**、*** 失的可接受調配物 調配物。 顯然，在經測試之己二酸鹽調配物中，約6 〇至約8〇(6_8) 之pH範圍展示與1.〇 i〇g之最大病毒滴度損失相容之良好、 可接受的穩定性概況，且約6.0至約6.8(6-6.8)之PH值子範圍 展示與0·5 log之最大病毒滴度損失相容之良好可接受的 穩定性概況〇 實例ΠΙ-方法 III.1輪狀病毒滴定 藉由在許可之MA104細胞（ATCC CRL 2378)上培育含有 輪狀病毒及各種組分的調配物來進行感染輪狀病毒之偵 如以上實例中所描述來調配輪狀病毒（如P43輪狀病毒， ECACC 990S1301)。培育病毒樣品後， 培育該等細胞16-18 個小時。接著固定細胞並用80%丙酮滲透。受感染細胞藉 由間接免疫螢光使用VP6蛋白質（Mab 9F6)之特異性單株抗 輪狀病毒抗體來鑑別，此藉由螢光素共軛之IgG偵測且在 uv顯微鏡下檢查《任何市售抵抗輪狀病毒vp6蛋白質的單 株抗體均適合，且適當有用稀釋度將藉由常規實驗來測 定。舉例而言，以下單株抗體為適合： 108304.doc -78- 1358303 -RV 11-2 (IgG2a，與螢光素異硫氰酸鹽共軛之腹水），購自 Rural Technologies Inc (www.ruraltechinc.com) ‘ -5F8 F9 (IgGl > 目錄號RVM-1601A-5)或 2F2 19 (IgG2b，目 ·» 錄號 RVM-1601B-5)，購自 Austral Biologicals (www.australbiologicals.com) • MABR10 (IgG片段），購自 Immunological and Biochemical •t testsystems Gmbh (www.afsbio.com) 抗Vp6輪狀病毒多株抗體，例如購自Chemicon (www.chemicon.com)之 AB1129F亦為適合。 • 每一螢光焦點對應於一種感染病毒。滴度以每毫升焦點 形成單位之對數表示（log (ffu/ml))。病毒滴定之精度為約+ 或-0.2 log。根據初始樣品體積劑量將以ffu/ml表示之病毒 滴定的結果轉變為每劑量ffu。在表中呈現之所有資料為每 劑量以10為底數之l〇g(l〇gi〇)ffu。 好的結果為"37°C下一週"（加速穩定性測試）期間達成< 0.5 log之減少的彼等結果。將展示1 log或1 log以上之病毒 損失的調配物自進一步穩定性測試中丟棄。 ^ III.2用於抗酸量測之方法：嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)滴定 III.2.1 介紹 已自最初為成人群體發展之羅塞特-賴斯滴定測試將嬰 兒羅塞特-賴斯（BRR)滴定測試修改為適合嬰兒群體。 羅塞特-賴斯滴定係用於抗酸劑領域之熟知測試（見N.E. Rossett及 Marion L. Rice在 Gastroenterology 中，1954年第 26 卷第 490-495 頁：‘An in vitro evaluation of the efficacy of the more frequently used antacids with particular attention to 108304.doc -79- ⑤ tablets')。羅塞特-賴斯滴定量測在具有0.1 N鹽酸及上升pH 值之持續期間的測試下抗酸物質之反應速率。為模擬空胃 中的條件，在量測開始時立即體積新鮮鹽酸。為模擬消化 過程期間胃中之條件，將新鮮鹽酸以恆定速率添加至測試 下之反應混合物中。 簡言之，成人羅塞特-賴斯滴定分為兩部分： -初始添加30 ml之0.1 N HC1，其表示空胃之大團塊的酸含 量； -接著以4 ml/min之速率連續添加0.1 NHC1，其模仿消化期 間的酸性胃分泌。 彼等條件為通常認為代表平均成人胃之實驗條件。 III.2.2嬰兒羅塞特-賴斯滴定分析法 基於最初程序中描述之標準羅塞特-賴斯條件，修改該測 試以代表六個月大嬰兒的胃且以下稱之為"嬰兒羅塞特-賴 斯（BRR)滴定檢定。 根據 Geigy Scientific Tables(第 1卷第 126 頁，Ciba-Geigy 1 98 1編輯），就所關心的胃HC1排泄物而言，以下資料為吾 人所關注（見表40): 表40 基本酸產量 最大酸產量 兒童 平均 極值範圍 平均 極值範圍 9-11 週 0.149 mmol/h 0.05-0.30 mmol/h 0.56 mmol/h 0.39-0.84 mmol/h 6-7月 0.193 mmol/h 0.07-0.40 mmol/h 2.08 mmol/h 1.33-2.88 mmol/h 108304.doc -80 - 1358303 因此，基於彼等資料，吾人選擇最嚴格條件以包括所有 情形： -最初鹽酸數量：0.40 mmol(4 ml 之 0.1 N HC1) -連續添加 0.1 N HC1數量：2.90 mmol/h(或 0.048 mmol /min)。實際上使用0.1 N HC1之0.5 ml/min的速率。 BRR之實驗配置的略圖顯示於圖2B中。 表41概述與最初公佈程序相比之BRR間的差別。 表41 試-名稱:__ 罗塞特-赖斯 嬰兒罗塞特·赖斯 參考 -Gastroenterology 1954 第26卷第490-495頁。 -亦見 Pharmacopeae 中之 抗酸測試 -GSK未公佈資料 -嬰兒胃HC1分泌速率數值來自 Geigy Scientific Tables (1981)第 1卷第126頁 應用於： 成人 六個月嬰兒 測試期間所應用之溫 度 37eC 37〇C 燒杯體積 400 ml 50 ml 最初水體積 70 ml 若抗酸樣品為1.5 ml則為8.5 ml 若抗酸樣品為2.0 ml則為8.0 ml 若抗酸樣品為2.5ml則為7.5 ml 抗酸劑數量 等於0.330 gAl203 可根據所測試樣品及劑量體積 而變化；通常在0.8與1.8毫當量 HC1之間 在t=o時體添加之最 J?0.1NHC1 數量 30 ml 4 ml 量測期間添加額外 0.1NHC1之速率 4 ml/min 0.5 ml/min 對待連到之pH的時 間量測 "pH=3 pH=4 _典型結果 在pH 3以上3-4小時 在pH 4以上8-20分鐘 ΠΙ·2·2_1 BRR檢定之工作程序 實驗配置呈現於圖2Β中。 1使用50 ml燒杯’在該燒杯中置放足夠的注射用水以在 108304.doc 1358303 步驟n° 4(下文）後具有10 ml之最終液體體積。 2°在水浴中安放燒杯。 3°調節水浴溫度以使在燒杯内獲得37°C。 4°將待量測之抗酸劑樣品添加至燒杯中。 5°在此階段pH值之量測表示"初始ρΗπ(資料表中t=(^ 6。立即添加4 ml之0.1 N HC1(0.40 mmol)且同時開啟時^ 及開啟泵（以0.5ml/min連續添加0.1 N HC1)。彼等三種行為 應在時鐘開啟點之最初5秒内全部發生。 7°隨著時間記錄pH值直至獲得pH 4。操作者在選擇時可 使pH值不斷減少直至獲得pH 3(如最初羅塞特-賴斯方法 中）’但在達到pH 4後記錄相應抗酸能力值。 8°停止時鐘及泵。 ΙΠ·2.2.2實驗資料之呈現 實驗資料在表中呈現（例如見表22)，自表中可畫出圖解表 示：例如見圖2Α。 ΙΙΙ.2.2.3結果解釋 當將輪狀病毒置放於pH 4以下時，其遭到破壞。接著為 保存病毒’考慮pH 4以上之時間。嬰兒羅塞特_賴斯滴定之 結果以時間單位（分鐘）表示。其為所量測之pH值在4以上之 時間’意即所謂之調配物的抗酸能力β在一些情況下記錄 兩個值（如表22中調配物η。92之11-22分鐘，其中在π分鐘 時pH值為4·08且在12分鐘時pH值為3.98，指示在ρΗ 4.00時 的一段值與11分鐘相比更接近於12分鐘。） III.2.2.4校準 108304.doc ⑧ • 82 · 1358303 用經校準之溫度計（_丨0〇c _+ 範圍）量測溫度。使用市 = PH7及pH4之標準緩衝液校準。

藉由相對於時間之體積量測來 』术調即泵速率以獲得0.5 如⑽。螺動泵為購自IS_C S.A. M〇del MS_Regl。之8滾 筒型。為避免液滴形成，沿著燒杯壁將管末端置放在液體 水平面上。 〇·1 N鹽酸為市售標準滴定溶液。

在分析未知抗酸劑樣品之前，使用已知標準緩衝溶液來 檢查實㈣置。此標準緩衝溶液由24.〇66g十二水合碟酸三 鈉（Merck產品n。i ·06578.丨000)溶於足量水中以獲得ι公升 溶液而製成。通常’在所描述之嬰兒羅塞特·賴斯滴定配置 中，10«11此溶液將給出在分鐘11。6與7之間出現的15119〇(第 一磷酸鹽pH跳躍）及在分鐘n。19與2〇之間出現的pH * 〇(第 二磷酸鹽pH跳躍）。結果顯示於表42中。 表42

10 ml 24.066克/公升 之 Na3P04.12H20 10 ml 水 時間(分鐘) 無抗酸劑 pH dH 0 12.4 5 94 1 11.7 1.31 2 11.58 1.23 3 11.44 1.18 4 11.27 1.14 5 11.02 1.11 第一 pH跳躍 6 10.6 1.10 7 8.86 1.07 8 7.95 1.05 9 7.6 1.03 10 7.38 1.01 11 7.19 0.99 12 7.03 0.98 -83 - 108304.doc ⑧ 1358303 13 6.88 0.97 14 6.74 0.96 15 6.58 0.95 16 6.41 0.95 17 6.21 0.94 18 5.93 0.93 第二pH跳躍 19 5.45 0.92 20 3.47 0.91 21 2.88 0.90 22 2.62 0.89 23 2.44 0.88 24 2.3 0.87 25 2.18 0.87 「26 2.09 0.86 27 「2.01 0.86 28 1.93 0.86 29 1.87 0.85 30 III.3給定調配物之反射率的量測 本發明中所說明之若干調配物以小體積製備（例如丨5 ml 劑量體積及低於1.5 ml劑量鹼積），含有高蔗糖濃度（如55%) 且仍然必須遵從穩定性及抗酸能力的需求。因此重要的是 驗證調配物已成功製備及每一成分之完全溶液化已達成。 一種進行此驗證之簡單方法為量測調配物之折射率。折射 率為一種熟知之簡單量測法，其既可用於羧酸鹽緩衝液階 段（添加輪狀病毒前）’亦可用於最後調配物步驟（添加輪狀 病毒後）。 ΠΙ.3.1方法 水溶液之折射率為測定溶液中蔗糖濃度之標準方法。折 射率對蔑糖濃度之表可在the handbook Of Chemistry and Physics 第7〇 版 1989_199〇CRCpress 第丑 386頁中找到。 使用一種折射率儀器自動折射計qpr u_37儀器，將一滴 ’合液置放在該儀器中並記錄折射率。將水用作標準來檢查 108304.doc I '⑤ 儀器（折射率為1.3330)。 ^ 已製備若干含有各種量之蔗糖的己二酸鹽調配物，且使 其經受折射率量測。進行一次重複量測。 111.3.2 結泉 彼等量測之結果顯示於圖3A及3B中。總之，在所測試濃 度範圍内’蔗糖濃度與其他可溶性成分及所量測之折射率 之間線形相關。 舉例而言’在調配物n。95中，成分完全溶解後，在羧酸 鹽緩衝液階段（添加輪狀病毒前）將獲得丨.4578之折射率值 (在此狀況下目標嚴糖濃度為5 8 · 5 % w/w);而在調配物之最 後階段（添加輪狀病毒或在安慰劑製劑狀況下添加6% w/w DMEM後）將獲得L4480之折射率（在此狀況下目標蔗糖濃 度為55% w/w)。在兩種狀況下，所量測折射率值高於單一 5 8.5%(折射率1.4385)或55% w/w(折射率1.4307)簾糖水溶 液所獲得之彼等折射率’指示緩衝液製劑之其他成分對折 射率的影響。 111.3.3 結論 因此，在過程中控制期間’折射率量測可用於快速檢查 調配物之所有添加成分的完全溶解。 實例IV-具有檸檬酸鹽磷酸鹽緩衝液之調配物比較實例 IV.1調配物之製備（表43& 44) 108304.doc • 85. 1358303 表43 N° NaH2 P04 2H20 Na2 HP04. 2H20 二水合 檸檬酸 三鈉 蔬糖％ w/w DMEM % w/w 在ί=0 時之 BRRS pH 在 pH>4 時之 BRR$ 時間 在t=0 時之 病毒 滴度 在37 °C « lw 後之病 毒滴度 在37 °C， 1 w後 之病毒 損失 (M) (M) (Μ) t=0 分鐘 (每疫1 在劑量l〇 iiofiu) 2.5 m 投與劑1 :體積-填酸鹽濃度=0.390 Μ 1 0.195 0.195 0.135 50% 3.33% 6.66 9 5.9 5.4 0.5 2 0.195 0.195 0.135 50% 5% 6.65 10 5.8 5.4 0.4 3 0.195 0.195 0.135 50% 8% 6.67 9 5.6 5.3 0.3 4 0.195 0.195 0.135 45% 3.33% 6.67 10 5.8 5.3 0.5 5 0.195 0.195 0.135 40% 3.33% 6.69 11 5.8 5.5 0.3 6 0.195 0.195 0.135 30% 3.33% 6.71 10 5.7 5.5 0.2 7 0.195 0.195 0.135 20% 3.33% 6.75 11 5.6 4.1 1.5 8 0.195 0.195 0.135 45% 8% 6.69 12 5.7 5.4 0.3 9 0.195 0.195 0.135 40% 8% 6.70 12 6.1 5.6 0.5 10 0.195 0.195 0.135 30% 8% 6.72 11 6.1 5.4 0.5 11 0.195 0.195 0.135 20% 8% 6.73 11 6.1 4.4 1.7 2 ml 才; :與劑量患 ί積-璃酸鹽濃度= 0.488 Μ** 17 0.244 0.244 0.162 50% 6% 6.68 10 5.7 5.5 0.2 1.5 ml: &與劑量體積-填酸鹽濃度=〇.650M** 12 0.325 0.325 0.216 40% 6% 〇〇 OO OO OO OO 13 0.325 0.325 0.216 40% 8% oo oo OO OO oo 14 0.325 0.325 0.216 40% 10% oo oo oo 00 00 15 0.325 0.325 0.216 45% 6% oo oo oo oo 00 16 0.325 0.325 0.216 45% 8% oo oo 00 00 00

$藉由根據實例ΙΠ.2.2修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試來 評價； **此等於在2.5 ml劑量體積中之0.390 Μ 。。丟棄調配物12-16,因為一旦在4-8°C靜置，即發生再結晶。 108304.doc 86 1358303 表44-在1.5 ml劑量體積中減少之磷酸鹽量 Ν。 NaH2 P04 2H20 Na2 ΗΡ04. 2Η20 二水合 檸檬酸 三鈉 庶糖 % w/w DMEM % w/w 在t=0 時之 BRR$ PH 在 ρΗ>4 時之 BRR$ 時間 在t=0 時之 病毒 滴度 在37 °C，lw 後之病 毒滴度 在37 °C * lw 後之病 毒損失 (Μ) (Μ) (Μ) t=0 分鐘 (每疫1 5劑量1〇1 Ϊ10 &) 1.5 ml投與劑量體積-減少之磷酸鹽量(對調配i 构25-29 而言 0.450 Μ)** 25 0.225 0.225 0.285 40% 6% 6.69 12 6.2 5.8 0.4 26 0.225 0.225 0.285 40% 8% 結晶發生-無可得資料 27 0.225 0.225 0.285 40% 10% 6.67 12 6.2 6.0 0.2 28 0.225 0.225 0.285 45% 6% 結晶發4 >無可得資料 29 0.225 0.225 0.285 45% 8% 6.69/ 6.72° 12/ 12-13° 6.1 6.1 0 1.5 ml投 J 良劑量體〗 陵-減少之磷酸鹽量(對調配物30-32、38^ 0而言0. 0085 M) •本幸 30 0.00424 0.00424 0.438 40% 6% 7.75 12-13 6.2 5.3 0.8 31* 0.00424 0.00424 0.438 45% 6% 7.9 13 6.1 5.8 0.3 32* 0.00424 0.00424 0.438 50% 6% 7.76 13-14 6.0 5,7 0.3 38 0.0042 0.0042 0.435 45% 6% 7.76 14 5.7 5.2 0.5 39 0.00424 0.00424 0.446 50% 6% 7.74 14 5.6 5.3 0.3 40 0.0043 0.0043 0.448 54% 6% 7.73 15 5.6 5.4 0.2 1.5 ml投與窄 射量體積-無磷酸1 里添加 18 - 0.438 40% 6% 8.42 12 5.7 4.5 1.2 19 0.437 40% 8% 8.42 11 5.7 4.3 1.4 20 0.437 40% 10% 8.31 11 5.7 4.4 1.3 21 0.437 45% 6% 8.35 11 5.9 4.7 1.2 22 0.437 45% 8% 8.35 10 5.8 4.9 0.9 23 0.437 45% 10% 8.37 12 5.7 4.7 1.0 24 - - 0.438 50% 6% 8.31 11 5.7 4.9 0.8

° =重複 $藉由根據實例III.2.2修改之嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)測試來 評價； *調配物31 & 32在不同之從頭開始的測試中重複，具有類似 資料（分別對應調配物38 & 39，未顯示） "此等於2.5 ml劑量體積中之0.271 Μ ;意即減少之磷酸鹽 ***此等於2.5 ml劑量體積中之0.0051 Μ，意即減少之磷酸

108304.doc -87· ⑤ 1358303 表44中之調配物18 24、26 3〇之结果的說明 自長期穩定性研究中丟棄調配物18_24及3〇，因為在37。匸 下一週穩定性測試期間獲得之結果不令人滿意。丟棄調配 -， 物26及28，因為一旦在心8。〇：靜置即發生結晶。|棄調配物 ， 25、27及29 ,因為在4-8eC靜置期間，再結晶之風險高。 IV. 1.1調配物1-11 : 2_5 ml劑量體積之調配物 以表不每次2.5 ml(3.25 g)之給藥1〇〇次的325 g規模（250 ml)製成調配物i_u(見表43) β抗酸物質：NaH2p〇4 2士〇 _ (Mw 156); Na2HP〇4.2H2〇(Mw 178);二水合檸檬酸三納（Mw 294)。 如下製備液體調配物1。將以下各物連續添加至125.84 g 水中（其量係經定為可達到325 g之最終製備物）：7.605 g

NaH2P04_2H20、8.677 g Na2HP04.2H20、9.555 g二水合檸 檬酸三鈉及162.5 g蔗糖。完全溶解後，藉由〇 2 μιη膜過濾 將溶液滅菌。 ^ 在無菌條件下添加含有必要數量之輪狀病毒的DMEM培 養基10.82 g以獲得每劑量1 〇6·0 ffu。使混合物均勻化並將其 分佈在適當給藥容器中。在此狀況下一個劑量由2.5 ml或 3.25 g最終經調配之製備物組成。在此實例中，DMEM培養 基表示3 · 3 3 % w/w。 -； 類似製得調配物2-11(見表43中之成分及比例）。 :在此系列中，測試不同蔗糖量及DMEM量。 除了用低蔗糖濃度（20%)製備之調配物7及11之外，獲得 類似結果，調配物7及11不足以穩定輪狀病毒。 108304.doc • 88 · 1358303 IV. 1·2調配物17 : 2.0 ml劑量體積之調配物 以表示每次2.0 ml(2.60 g)之給藥125次的325 g規模（250 * ml)製成調配物17(見表43)。抗酸物質：NaH2P〇4.2H20 (Mw • 1 56) ; Na2HP〇4.2H20(Mw 178);二水合擰檬酸三納（Mw 294)。簡言之，稱量110.7 g水（其量係經定為可達到325 g 之最终製備物）且連續添加9.51 g NaH2P04.2H20、10.84 g Na2HP04.2H20、11.94 g二水合檸檬酸三鈉及162.5 g蔗糖 (50% w/w)。在此實例中使用DMEM 19.5 g，其表示6% w/w。 • IV.l.3調配物12-16 : 1.5 ml劑量體積之調配物 將彼等檸檬酸鹽/磷酸鹽調配物之投與劑量體積（詳見表 43)減少至2 ml以下之體積的進一步嘗試失敗。 將用於調配物17(2 ml劑量體積）之成分的濃度調整至1.5 ml劑量體積。調配物一旦在4°C下儲存，磷璇鹽組分之再結 晶即迅速發生。此現象歸因於磷酸鹽檸檬酸鹽組分内之 Na2HP04的溶解度相當低（見表45)。 表45-磷酸鹽及檸檬酸鹽之理論溶解度限制 • __ 水中溶解度 NaH2P04.2H20 5.44M(20°〇 Na2HP04.2H20 0.52 M(20o〇C) 二水合檸檬酸三鈉 1.44 M(25°〇 根據此等參數，嘗試以1.5 ml劑量體積調配調配物17理論 上將導致最終磷酸鹽濃度為0.65 M((0.244 M+ 0.244 M) * 2/1.5)，其高於Na2HP04溶解度資料（〇_52M)。 為避免磷酸鹽之此低溶解度問題，建議不使用額外磷酸 鹽且藉由利用羧酸形式（R_C〇〇H)與羧酸鹽形式（R-COO)之 108304.doc -89- ⑧ 1358303 間的平衡來調整pH值。此實例以調配物1 〇〇-115或調配物 128-130給出’調配物ι00·ιΐ5以2.5 ml投與體積製成（見表 5) ’調配物128-130以1.5 ml投與體積實現（見表6)。 IV.1.4調配物25-32及38-40: 1.5 ml劑量體積調配物及減 少之磷酸鹽量 以表示每次1_5 ml(1.95 g)之給藥166.6次的325 g規模 (250 ml)製備若干含有減少量之磷酸鹽的調配物（詳見表 44)。為補償此磷酸鹽的減少同時維持可接受抗酸能力，增 加檸檬酸鹽濃度。簡言之，藉由混合8 76 g NaH2P04.2H20、 10-00 g Na2HP04.2H20、21.00 g二水合檸檬酸三鈉來製備調 配物25且連續添加130 g蔗糖（40% w/w)。在此實例中， DMEM表示6% w/w。除蔗糖及DMEM濃度略微改變之外（見 表44) ’類似地製成調配物26_29。藉由混合〇 1653 g

NaH2P04.2H2〇、0.1884 gNa2HP04.2H20、32.16 g上水合擰 檬酸二來製備調配物30且連續添加no g蔗糖（4〇% w/w) β 在此實例中，DMEM表示60/〇 w/w。除蔗糖及DMEM濃度略 微改變外（見表44) ’類似地製成調配物3丨及32。 儘官實情為在調配物25-29中總磷酸鹽濃度為〇45 M，意 即低於0.52 Μ的NkHPO4理論溶解度限制’但一些調配物 (例如調配物26及28)在+ 4»C下儲存期間展示再結晶。雖然 類似調配物獲得不一致結果（比較例如調配物26及27)，但理 响/合解度值與實際溶解度值之間的此實際差異可能歸因於 溶解於培養基中之其他化合物（嚴糖、檸檬酸鹽或經由 DMEM培養基進人之其他化合物）的存在。該等調配物經受 108304.doc •90- 、⑧ 之可變性與製備大規模調配物時需要之可靠性不相容，該 專大規模調配物經最短時間週期必須保持物理上穩定。 更進一步減少調配物中磷酸鹽的量（見表44tn。30_32及 3 8-40)在4-8°C病毒穩定性中給出不良結果（見表47)。 其他1.5 ml劑量體積之調配物（18_24)在缺乏添加的磷酸 鹽下亦已製成（詳見表44)〇使用更高濃度之檸檬酸三鈉（438 mM)使此等調配物之抗酸能力維持在目標值12分鐘。簡言 之，藉由混合143.34 g水（其量係經定為可達到325 g之最終 製備物）、32.16兩水合檸檬酸三鈉來製備調配物18並連續 添加130g蔗糖（40%w/w)〇對於調配物n。19 23，測試蔗糖 及DMEM之各種數量（見表44)。對調配物以，使用5〇%w/w 濃度之蔗糖（162.5 g)。在此等調配物中，〇ΜΕΜ表示6〇/〇 w/w。 此等調配物（η。18-24)之pH值超過8·3，在此pH值下輪狀 病毒的穩定性受影響，此影響藉由3rc下儲存一週後病毒 損失高於0.8來證明。 鑒於在3 7 C下快速測試期間此等調配物之不良，穩定性， 未進行室溫下或4°C下之中期穩定性計劃。 彼等結果指示，當調配物中包括越來越少的磷酸鹽而具 有越來越多的檸檬酸鹽（維持抗酸能力）時，調配物之所得 pH值增加地越來越多： -調配物25-29中pH值大約6.7 -調配物30-32及38-40中pH值大約77，且 -無鱗酸鹽之調配物η。18-24中pH值大約8 3 108304.doc •91· 1358303 如此後（表46及47)所顯示，彼等更高pH值不利於良好的 輪狀病毒穩定性。- 另外’彼等結果與從調配物110-115(見表5)及128-130(見 表6)獲得之結果一致’在該等調配物中僅藉由調整檸檬酸/ 檸檬酸鈉（因此無額外磷酸鹽）之比率來校正1?11值。 IV.2輪狀病毒滴定及抗酸能力 根據實例III. 1給出之程序已評估在不同時間點的輪狀病 毒病毒滴定且根據實例III.2給給出之實驗程序已評估調配 物之抗酸能力。結果在表46及47中予以說明。 表46-室溫下之病毒穩定性 η° 室溫_ F儲存後之病毒滴定(2〇-22°C) (每疫苗劑量logl0 ffii) 1個月 2個月 3個月 4個月 5個月 6個月 1 6.0 6.0 5.8 5.6 5 1 2 6.3 5.9 6.0 5.6 5 0 3 6.2 6.0 5.9 5.5 5 0 4 6.0 6.0 5.5 5.0 5 6.0 5.7 5.3 4.5 6 7 5.5 〇〇 5.1 00 4.8 〇〇 〇〇 8 6.0 5.6 5.5 4.9 οο 9 5.9 5.6 5.1 10 11 5.6 〇〇 5.1 00 4.6 〇〇 17 6.0 5.8 ~~~5T~~ 5.7 ΟΟ οο C A 25 5.9 5.5 Ζ 1 4.8 ^ ·\/ 27 29 5.8 ~~61 - j· 1 sn— ~5X— Τ Q 31 5.7 5.3 — 32 5.9 5.5 5Τ~~ 38 00 〇0 " οο 00 ΟΟ 39 5.3 Τ5~~" -- 40 5.5 ~~~ 空白框=未測定 ⑻將調配物7、η及38自長期穩定性中去棄，因為沉下 108304.doc -92- 1358303 週測試期間獲得不良結果。 表47-在4°C下之病毒穩定性 4°C下儲存後之病毒滴定(每疫苗劑量logio ffu) τ=ο 37〇C > lw後 1 m* 4°C 2 m* 4°C 4 m* 4t 6 m* 4°C 7m· 4°C 9 m* 4°C 12 m* 4°C 1 5.9 5.4 5.9 6.0 6.1 6.1 5.9 5.9 2 5.8 5.9 6 6 6 5.9 5.8 3 Γ~5Τ~ 6 6 6.2 5__ 4 5.8 5.3 5.7 6.0 6.1 5.9 5.9 5.7 5 5.8 5.5 6.1 6.1 6.1 5·8 6.0 5.7 6 5.7 5.5 6.0 6.0 5.9 5.4 5.6 4.9 7 5.6 4.1 8 5.7 5.4 5.9 6.0 5.9 5.8 5.9 5.6 9 \6Λ 5.6 6.1 6.1 5.8 5.7 5.6 5.5 10 6.1 ΓΤ4~ 6.0 5.5 5.5 11 6.1 4.4 17 5.7 L 5.5 5.7 5.9 6 5.8 5.9 5.9 25 6.2 5.8 5.9 5.9 NA* NA* NA* NA* 27 6.2 ΓόΤ- 6 5.8 NA* NA* NA* 29 6.1 6.1 6.1 5.9 5:9 62 31 6.1 5.8 5.7 ^ 5.7 5.6 5 6 32 6.0 5.7 6 5.8 5.6 5 6 38 5.7 5.2 39 5.6 5.3 5.7 5.4 40 5.6 5.4 5.7 5.3 NA=不可得-室溫下穩定性測試期間失敗

空白框=未測定 IV.3結果與結論 調配物2-3(2.5 1111劑量體積）及調配物17(自251111至21111 減少之劑量體積） 如表46及47所顯示 對於調配物2、3及17而言 病毒滴 度之1 log才貝失由室溫下儲存6個月引起。在代下經多達 12個月之儲存期未經歷病毒滴度之重大損失。 至1.5 ml劑量體積） 的調配物29外，在3個月 調配物25、27、29及31-32(減少 室溫下，除經4個月之時間週期 108304.doc -93· ⑤ 1358303 或更早時大體上達到病毒滴定之l-l〇g的損失。調配物25至 27在4C下之健存期間内再結晶，因此指示如上所述之減少 磷酸鹽濃度並不足夠。因此該等調配物不適於下至少一 年的儲存期》 當更進一步減少磷酸鹽濃度時（調配物3〇_32)，由於檸檬 酸鹽量的相對增加，最終調配物ipH值增加，此為維持抗 酸能力之相同值所需要。在室溫穩定性研究期間，pH值之 增加影響輪狀病毒之穩定性且可迅速偵測。當將磷酸鹽從 調配物（調配物18及24)中完全去除時確定彼等趨勢。 實例IV之總結輪 此等結果指示：與2.5 ml之劑量體積相比，為達到2ml以 下之劑量體積，調配物中存在之磷酸鹽的量必須減少，此 歸因於磷酸鹽之相對低的水溶解度及其再結晶傾向。因 此，為保持抗酸能力之相同目標值（意即藉由BRR測試評價 之最小值為至少8分鐘，適合地12分鐘），必須增加檸檬醆 鹽的數量。此|生調配物之最終阳值的增加，此對於液體 調配物中輪狀病毒之穩定性有害。 實例V-額外調配物 製備以下調配物（表48)，但由於其無法滿足設置標準之至 少-者’故其不包括在長期穩定性計劃中。丟棄—些調配 物之特定原因在表48之註釋攔中概述。 108304.doc -94· 1358303 表48

N° 調配物之簡要描述 參考調配 物 +表 註釋 7 2.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；20%蔗 糖 IV. 1 表 43 37°C下，1週時損失>1 log 11 2.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；20%蔗 糖 m表43 37°Γ下，1调 指生 > 1 Ιησ 擎 — 4 ，X、'、 辱尋▼ ^ 12 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；40%蔗 糖 IV. 1 表 43 一旦在+4°C下靜置即結晶 13 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽40%蔗糖 IV. 1 表 43 一旦在+4t下靜置即結晶 14 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；40%蔗 糖 IV. 1 表 43 一旦在下靜置即結晶 15 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；45%蔗 糖 IV. 1 表 43 一旦在+4°C下靜置即結晶 16 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；45%蔗 糖 IV. 1 表 43 一旦在+4t下靜置即結晶 18 1.5ml ;檸檬酸鹽；40%蔗糖；pH 8.42 IV. 1 表 44 37°C下，1週時損失>llog 19 1.5ml ;檸檬酸鹽；40%蔗糖；pH 8.42 IV. 1 表 44 37°C下，1週時損失>llog 20 1.5ml ;檸檬酸鹽；40%蔗糖；pH 8.31 IV. 1 表 44 37°C下，1週時損失>llog 21 1.5ml ;檸檬酸鹽；45%蔗糖；pH 8.35 IV. 1 表 44 37°C下，1週時損失>ll〇g 22 1.5ml ;檸檬酸鹽；45%蔗糖；pH 8.35 IV. 1 表 44 37°C下，1週時損失> 1 log 23 1.5ml ;檸檬酸鹽；45%蔗糖；pH 8.37 IV. 1 表 44 37〇C下，1週時損失>1 log 24 1.5ml ;擰檬酸鹽；.50%蔗糖；pH 8.31 IV. 1 表 44 37t下，1週時損失> 1 log 25 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；40%蔗 糖 IV. 1 表 44 在+4°C下有結晶危險 26 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；40%蔗 糖 IV. 1 表 44 一旦在+4°C下靜置即結晶 27 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；40%蔗 糖 IV. 1 表 44 在+4 C下有結晶危險 28 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；45%蔗 糖 IV, 1 表 44 一旦在+4°C下靜置即結晶 29 1.5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；45%蔗 糖 IV. 1 表 44 在+4°C下有結晶危險 30 l_5ml ;檸檬酸鹽；磷酸鹽；40%蔗 IV. 1 表 44 37°(：下，1週時損失0.81〇8 108304.doc •95· ⑤ 糖 33 1.5ml ;乙酸鹽+角 II. 1 表 10 37°C下’ 1週時損失>Uoe 34 1.5ml ;乙酸鹽+#5 II. 1 表 10 37°C下，1週時損失>Uoe 35 1.5ml ;乙酸鹽+鈣 II. 1 表 10 37C下，1週時損失> 1 ι〇ρ 4L· 1.5ml麩胺酸鹽；50%蔗糖 II.7 表 36 pH值太高：10.36 44 1.75ml ;反丁烯二酸鹽；44%蔗糖 II.8 不溶物質 45 1.75ml ;己二酸鹽；44%蔗糖 II.5 表 19 BRR太長：>29分鐘 47 1.75ml ;乳糖酸鹽；31%嚴糖 Π.9 BRJK太短：<1分鐘 48 1.75ml ;順丁烯二酸鹽；44%蔗糖 11.10 pH值太向：10.4，BRR太 長：24分鐘 49 1.75ml ;葡糖醛酸鹽；42%蔗糖 11.11 pH值太高：8.45 ; BRR太 短：<1分鐘 50 1.75ml ;戊二酸鹽；44%蔗糖 II.4表 18 BRR太長：>29分鐘 51 1.75ml ; 丁二酸鹽；44%蔗糖 II.3 表 16 BRR太長：>29分鐘 _ 52 1.75ml ;半乳糖醛酸鹽；42%廉糖 11.12 pH值太高：10.69，BRR太 短· <1分鐘 t>0 1.75ml ;半乳糖二酸鹽；38%簾糖 11.13 不溶物質 54 1.75ml ;丙二酸鹽；44%蔗糖 II.2 表 14 pH值太高：8.36 55 1.75ml ;酒石酸鹽；44%蔗糖 11.14 BRR太短：<1分鐘 57 1.75ml ;順丁烯二酸鹽；44%蔗糖 11.10 37UC下，1週時損失>ll〇g 68 l_5ml ; 4胺酸鹽；7.5%蔗糖 II.7 表 36 37°C下，1週時損失>U〇g 73 1.5ml ;蘋果酸鹽0.597 Μ ; 50%蔗糖 II.6 表 33 滅菌過濾太困難 1.5ml ;蘋果酸鹽；56%蔗糖 II.6 表 33 蔗糖溶液化困難 103 1.5ml ;己二酸鹽；55%蔗糖；pH 5.09 ΙΙ·5·1 表 19 一旦在+4°C下靜置，己二酸 即結晶 1U4 1.5ml ;己二酸鹽；55%蔗糖；pH 5.12 ΙΙ.5.1 表 19 一旦在+4°C下靜置，己二酸 即結晶 107 1.5ml ;己二酸鹽0.466 Μ ; 55%蔗糖 ΙΙ.5.1 表 19 很好但類似穩定性資料已在— 進行中 108 1.5ml ;己二酸鹽0.63 Μ ; 53.15%蔗 糖；pH 5.38 ΙΙ.5.1 表 19 一旦在+4°C下靜置，己二酸 即結晶 109 1.5ml ;己二酸鹽〇·ό3Μ ; 55%蔗 糖；pH 5.38 ΙΙ.5.1 表 19 一旦在+4°C下靜置，己二酸 即結晶 117 1.5ml ;己二酸鹽；550/。蔗糖；ca++ ΙΙ.5.4 表 26 己一酸鈣沉澱 121 1.5ml ;己—酸鹽；55%蔗糖；Ca++ ΙΙ.5.4 表 26 Γ 己二酸妈沉澱 133 1.5ml ;己二酸鹽；55%蔗糖 如η。134 無輪狀病毒之安慰劑 136 1.5ml ;己二酸鹽；55%蔗糖 ΙΙ.5.1 表 19 pH值太高：9.36 137 1.5ml ;己二酸鹽；55%蔗糖 ΙΙ.5.1 表 19 pH值太高：9.37 138 1.5ml ;己二酸鹽；55%蔗糖 ΙΙ.5.1 表 19 pH值太高：9.67 139 1.5ml ;色二酸鹽；55%蔗糖 ΙΙ.5.1 表 19 pH值太高：9.92 140 1.5ml ;己二酸鹽；55%蔗糖 ΙΙ.5.1 表 19 PH值太高：10.25 141 1.5ml ;己二酸鹽；55%蔗糖；pH 6.47 ΙΙ.5.1 表 19 很好但類似穩定性資料已進 行 142 1.5ml ;己二睃鹽；55%蔗糖；pH ΙΙ.5.1 表 19 很好但類似穩定性資料已進 108304.doc • 96- 1358303 6.30 行 146 1.5ml ;己二酸鹽；50%蔗糖 如 n°93 無輪狀病毒之安慰劑 149 1.5ml ;己二酸鹽；55%蔗糖 如 η。151 無病毒之安慰劑 實例νι-兩次經口給藥之人類單價輪狀病毒液體疫苗在健 康幼兒中之II期致免疫性、反應原性及安全性 VI.1介紹 進行隨機化II期、雙盲、安慰劑對照II期試驗以評估用於 幼兒免疫的含有人類減毒G1P8輪狀病毒株（以寄存號碼 99081301寄存在ECAAC-見WO 01/12797)之疫苗的致免疫 性、反應原性及安全性。該研究在芬蘭之多家中心執行。 研究設計之概述在圖4中給出。 在此試驗中，將疫苗之第一次給藥在約2.5個月大（在6與 12週之間）、第一次醫師檢查時投與，該疫苗或者為候選 HRV(人類輪狀病毒）疫苗的液體調配物（N=100)或者為HRV 疫苗之經冷凍乾燥的調配物（N= 100)及分別之安慰劑（兩 組，每組N=25)。第二次給藥在約3.5個月大時（在第二次醫 師檢查期間，通常在第一次給藥後4週）投與。在第二次給 藥後一個月，約4.5個月大時對血液抽取及致免疫性評估執 行後續檢查》 使臨床試驗隨機化、安慰劑對照及獨立。招收250名受試 者，每一HRV組100名且每一安慰劑組25名。在每一 HRV疫 苗調配物與其分別安慰劑之間以雙盲方式進行試驗。然而 在兩種不同調配物之間的盲法在技術上不可能。 根據當地實情給與常規兒童疫苗接種，但離HRV疫苗之 每一給藥至少14天。 108304.doc -97- ⑧ VI.2疫苗描述 特定而言，所使用之疫苗包含作為輪狀病毒組分之以 ECACC寄存99081301寄存的減毒G1人類株（W0 01/12797)。 疫苗為一種衍生自89-12 HRV株的減毒人類輪狀病毒 (HRV)候選疫苗，89·12 HRV株屬於血清型G1P1A及自美國 辛辛那提（Cmcinnad) —名15個月大之兒童的糞便分離出的 基因型[P8]。在兩年預期研究（Bernstein DI等人Protection from rotavirus reinfection: 2 years prospective study. J Infect Dis_ 1991;164: 277-83)中顯示 89-12 株之天然感染為 抵抗隨後疾病及抵抗再次感染提供保護。 該抗酸劑在經過胃期間將預防HRV失活。 表49比較根據WO 01/12797製備之己二酸鹽液體調配物 的組成及經冷凍乾燥之調配物的組成，且證明在大規模臨 床試驗中有效（De Vos等人Pediatr Infect Dis J. 2004年10月 23 曰（10 Suppl): S179-82) » 表49 HRV疫苗之己二酸鹽液體調配物及經冷凍乾燥之調 配物的定量组成（標定劑量） 己二酸鹽液體調配物 經冷凍乾燥之調配物(復水後） 活性物質 P43株-在存放期結束時每劑 量至少 106O CCID5〇(1.5 ml劑 量體積） P43株-在存放期結束時每劑 量至少 1060 CCID5〇(1.0 ml 劑 量體積） 穩定劑 薦糖 55%w/w (1.073 g) 活性物質 嚴糖 9 mg 葡聚糖 18 mg 山梨糖醇 13.5 mg 胺基酸 9 mg 抗酸劑 己二酸二鈉 132.74 mg 碳酸約 60 mg 增稠劑 三仙膠 2.5 mg 大量稀釋劑 DMEM** 6% w/w DMEM** 2.25 mg 溶劑 注射用水 q.s·投與1.5 ml 注射用水 q.s.投與1 ml 108304.doc •98· 1358303 **達爾伯克改良伊格爾培養基 HRV疫苗之兩種調配物之體積及抗酸能力的概述呈現於 表50中。 表50 HRV疫苗之己二酸鹽液體調配物及經冷凍乾燥調配 物之體積及抗酸能力 調配物 每劑量填充體積 抗酸能力(BRR*以分 鐘計） 己二酸鹽液體HRV瘙苗 1.5 ml 12 經冷凍乾燥之調配物 1.3 ml 17 *BRR=嬰兒羅塞特-賴斯（BRR)滴定測試；量測抗酸物質與 0.1 N鹽酸反應之速率及維持在4以上之PH值的持續時間。 見實例III.2.2中之程序。 根據優良製造規範（GMP)將單劑量的經調配之己二酸鹽 液體HRV疫苗填充入單劑量玻璃注射器中。 根據實例III· 1中詳述之程序’藉由間接免疫螢光鑑別感 染MA 104之細胞可量測輪狀病毒滴度（意即輪狀病毒效 力）。或者’ It由活體外滴定M A 10 4細胞上之病毒來量測， 病毒藉由使用特異性抗輪狀病毒抗體之直接免疫螢光來债 測。此方法測定感染50%細胞培養物的劑量且輪狀病毒滴 度以中間細胞培養物感染劑量（CCIDso)表示。已評估檢定内 及檢定間重現性且給出相同結果（可變性評價為〇 3 1〇g)。 VI.3投與 VI.3.1 HRV疫田之經冷;東乾燥調配物或安慰劑 為製備用於投與之疫苗及安慰劑，將含有碳酸鈣緩衝液 之預填充注射器的全部内含物注入經冷凍乾燥之產物（疫 108304.doc -99- ⑤ 1358303 苗或安慰劑）的瓶中且接著將再懸浮產物以單一經口劑量 平穩投與8 VI.3.2 HRV疫苗之液體調配物或安慰劑 在使用則振盪預填充之玻璃注射器。接著將產物（疫苗或 安慰劑）以單一經口劑量平穩投與。 VI.4安全性及反應原性 應用之以下安全性及反應原性標準：所要求之一般不利 事件為發熱、應激性/易怒、腹瀉、嘔吐、食慾缺乏及咳嗽/流 鼻涕。每一研究疫苗給藥後15天期間記錄該等事件，使用 提供給該等受試者之父母/監護人的日記卡片記錄所觀察 之症狀。證明所有胃腸炎事件（腹瀉）發生在檢查期間，且收 集糞便樣品（在胃腸炎發作後最近7天）。記錄發生在每一給 藥後3 1天内之未要求的不利事件。在整個研究時期記錄嚴 重不利事件。 VI.5實驗室檢定 VI.5.1糞便分析 在每一研究疫苗給藥之當天或前一天、在每一給藥後7± 1天及15±1天及在檢查3之當天或前—天收集自所有受試者 之糞便樣品在GSK Biologicah或GSK Bi〇1〇gicals指定之實 驗室進行㈣則請疫苗RV之存在，制_結免疫吸附 劑檢定部分）來評價病毒的排出。 若在HRV疫苗或安慰劑之給藥…當天受試者對輪狀病 毒呈陰性，則在給藥通至檢查3之預測定時間點收集的任 何糞便中藉由ELISA證明之輪狀病毒的存在被認作疫苗病 108304.doc ⑧ -100- 入）。在此狀況 ==:::r_p_

若以下兩槿結果均可得，則最初對輪狀病毒呈陰性之受

試者被定義為在預接種時間料i料之抗輪狀病毒IgA 抗體及糞便樣品中之輪狀病毒抗原呈陰性之受試者，或若 僅-種結果可得’則其可被定義為對此等標誌之至少一種 呈陰性之受試者。

在自檢查1直至檢查3之每—证事件期間收集之糞便樣 品亦在GSK Bi〇l〇gieals!GSK Bi〇i〇gicalM| 定之實驗室使 用ELISA進行測試以傾測RV。若呈陽性，則使用基於pcR 之方法測定G型。此等分子方法以vp7基因内之區域為目 標，該等區域在不同G型中非常不同且在每一特定G型内高 度守恆。舉例而言，由Gouvea等人（199〇,】CHn Micr〇bi〇i，

28:276-282)研製之RT_PCR方法使用定位於vp7基因之不同 區域中的不同基因型特異性引子的混合液。藉由凝膠電泳 估计之所得PCR產物的尺寸提供資訊以鑑別相應G基因 型。若偵測到任何G1 RV ,則藉由序列分析或等效方法將疫 苗病毒與野生型血清型區別》 將直至檢查3所收集之任何糞便中之疫苗病毒的任何偵 測視為疫苗反應之跡象（意即疫苗攝入）。 VI.5.1血清分析 自收集自每一研究檢查之受試者之全血樣品獲得的血清 藉由ELISA在GSK Biologicals所指定之實驗室測試以量測 也清抗輪狀病毒IgA抗體濃度》檢定臨界值為2〇 U/ml。對 108304.doc 1358303 抗輪狀病毒IgA抗體血清反應陰性之受試者被定義為具有 在檢定臨界值以下之抗體濃度的受試者。對抗輪狀病毒IgA 抗體血清反應陽性之受試者被定義為具有大於或等於檢定 臨界值之抗體濃度的受試者。 VI.6致免疫性•血清分析 VI.6.1藉由ELISA量測IgA抗體 此檢定允許人類血清中輪狀病毒IgA之偵測及最初由r. Ward( 1，2)設計且已由GSK Biologicals修改。其用作量測疫 苗接種及/或感染後之免疫反應。在GSK Biologicals (Rixensart，比利時）（或指定實驗室）分析樣品。 ELISA檢定之描述 藉由用抗輪狀病毒抗體稀釋液培育隔夜來塗覆96孔板》 沖洗該等孔且添加用疫苗株（陽性孔）感染或未感染（陰性孔） 之細胞的溶胞物。在一旋轉平臺上培育之後，沖洗該等板 並在兩種孔（陽性及陰性）令培育血清樣品或標準血清之稀 釋液。使用陰性孔允許評價非特異性IgA結合、 沖洗板並藉由添加生物素標記之兔抗人類IgA來偵測結 合之人類IgA(攪拌下3 0分鐘）。沖洗板後，將最佳濃度之過 氧化酶共輥之抗生物素蛋白-生物素添加至每一孔中且培 育（RT攪拌下30分鐘）β再次沖洗板且添加鄰苯二胺（〇pD)。 接著培育板（室溫（RT)下’在暗處30分鐘），然後用2 N H2S04 終止反應。在490/620 nm處量測光學吸收。藉由量測陽性 孔與陰性孔之間的差異來計算每一樣品/標準之特定光學 密度。藉由使用標準曲線產生之四參數邏輯函數來測定樣 108304.doc • 102- ⑧ 品之濃度。測定用於計算結果之標準曲線（工作範圍）的最精 確部分。藉由將屬於標準曲線之工作範圍的每一未知值平 均來計算相對於標準（濃度=1000U/ml)之以單位/毫升 (U/ml)計的抗體濃度，且接著用稀釋係數校正。每一實驗 包括陰性對照及陽性對照。 預測定所有試劑之最佳濃度。 參考文獻 1. Bernstein DI，Smith VE，Sherwood JR等人.Safety and immunogenicity of a live attenuated human rotavirus 89-12 vaccine· Vaccine. 1998; 16:381-7 o 2. Bernstein DI，Sack DA, Rothstein E等人· Efficacy of live attenuated human rotavirus vaccine 89-12 in infants: a randomised placebo-controlled trial. Lancet. 1999; 354:287-90 ° VI.7結果：抗輪狀病毒IgA抗體反應 表51呈現抗輪狀病毒IgA抗體GMC及血清轉化率（針對致 免疫性之總疫苗接種群）。表52呈現基於對抗輪狀病毒IgA 抗體呈血清陽性之受試者所計算的抗輪狀病毒IgA抗體 GMC，該等受試者基於總疫苗接種群而計算。 根據血清轉化率，第二次給藥後一個月時抗體對HRV疫 苗之反應在兩組疫苗組中類似（在HRV_經冷凍乾燥組中為 82.2%且在HRV_液體調配物組中為90.1%)。在所集中之安 慰劑組中，第二次給藥後一個月0%的受試者血清轉化，此 指示該研究係在社會中無野生型感染時進行。 108304.doc -103- 1358303 表51抗輪狀病毒丨gA抗體GMC及血清陽性率-針對致免疫性 之總疫苗接種群 >20U/ML GMC 95% Cl 95% Cl 組 時間選擇 N n % LL UL 數值 LL UL PRE 98 0 0.0 0.0 3.7 <20 - - 凉·長燥 ΡΤ(ΜΊ) 96 68 70.8 60.7 79.7 191.3 122.7 7QR ? ΡΠ(Μ2) 90 74 82.2 72.7 89.5 330.4 217.5 502.0 HRV_液體 PRE 98 0 0.0 0.0 3.7 <20 - - 調配物 PI(M1) 87 66 75.9 65.5 84.4 172.9 112.1 266.7 PIICM2) 81 73 90.1 81.5 95.6 292.3 199.3 428.8 卩乙集中 PRE 49 0 0.0 0.0 7.3 <20 - - PI(M1) 46 0 0.0 0.0 7.7 <20 - _ PII(M2) 48 0 0.0 0.0 7.4 <20 - - 1. N=具有可得結果之受試者數量 2. n/%=具有臨界值以上之濃度的受試者之數量/百分比 3. 95% CI=95°/〇信賴區間；LL=下限，UL=上限 4. PRE =在接種前 5. PI(M1)=HRV疫苗或安慰劑之第一次給藥後一個月（檢查 2) 6. PII(M2)=HRV疫苗或安慰劑之第二次給藥後一個月（檢查 3) 7. 資料庫版本=07DEC2005 表52基於對抗輪狀病毒IgA抗體呈血清陽性之受試者所計 算的抗輪狀病毒丨gA抗翘GMC-針對致免疫性之總疫苗接種 群 108304.doc •104 GMC 95% Cl 組 時間選擇 N 數值 LL UL HRV_經冷來 PI(Mi) 68 644.7 471.4 881.8 ϋ燥 ΡΠ(Μ2) 74 703.8 525.0 943.6 HRV_液體調 PI(1V[1) 66 428.1 302.1 606.8 配物 PII(M2) 73 423.1 305.9 585.2 1358303 1. N=對抗輪狀病毒IgA抗體呈血清陽性之受試者數量 2. 95% CI = 95%信賴區間；LL=下限，UL=上限 3. PI(M1)=HRV疫苗或安慰劑之第一次給藥後一個月（檢查 2) 4. PII(M2)=HRV疫苗或安慰劑之第二次給藥後一個月（檢查 3) 5. 資料庫版本=07DEC2005 VI.8結論 根據血清轉化率，兩種疫苗調配物中致免疫性類似。 根據〇、1月進程，當將疫苗之液體調配物投與兒童時其 非常致免疫。 因為IgA為輪狀病毒疫苗功效之良好標誌，所以此等資料 支持臨床中所測試之調配物的保護作用。 【圖式簡單說明】 圖1-四種羧酸鹽之標準酸鹼滴定曲線； 圖2 A-多種含己二酸鹽之調配物的抗酸能力； 圖2B-嬰兒羅塞特-賴斯檢定之實驗配置； 圖3-含己二酸鹽之調配物的折射率。圖3A顯示在己二酸 鹽緩衝步驟中，目標值為蔗糖58.5% w/w，其在混合物中給 108304.doc -105 - 1358303 出1.4578之折射率。圖3B顯示在最終調配步驟中，目標為 蔗糖55% w/w，其產生1.4480之折射率； 圖4-II期臨床研究設計概述。

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Claims (1)

1358303 ——- loo年丨《?月Π日修（更^正本 十、申請專利範圍： 第095105102號專利申請案 中每皁祷專44範遵!替換本(1〇〇年10月） 1. 一種適於經口投與人類幼兒之液體輪狀病毒致免疫組合 物，其包含輪狀病毒抗原、糖及羧酸鹽，其中該調配物 具有約pH 5.0與約pH 8.0之間的pH值且包含少於1 mM之 磷酸鹽，其中該羧酸鹽係衍生自平均pKa>4之二元羧酸。 2. 如請求項i之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組合物 包含少於0.1 mM之構酸鹽。 3. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組 合物不含磷酸鹽。 4. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組 合物之pH值係在約pH 5.5至約pH 7.5之間。 5. 如請求項4之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組合物 之pH值係在約pH 6.0與約pH 7.0之間。 6. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該羧 酸鹽係選自由以下各物組成之群：己二酸鹽、蘋果酸鹽、 丁二酸鹽、丙二酸鹽、戊二酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁 烯二酸鹽、酒石酸鹽及其兩者或兩者以上之任一組合。 7. 如請求項6之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該羧酸鹽 為己二酸鹽。 8. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該羧 酸鹽係以約50 mM與約2 Μ之間的濃度存在。 9. 如請求項8之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該羧酸鹽 係以約1 00 mM與約1 Μ之間的濃度存在。 10. 如請求項9之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該羧酸鹽 108304-1001013.doc 1358303 係以約400 mM與約700 mM之間的濃度存在。 11·如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該糖 係選自由以下各物組成之列：丙三醇、赤藻糖、赤藻糖 醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖、木糖、阿拉伯糖、葡 萄糖、塔格糖（tagalose)、甘露糖、半乳糖、果糖、肌醇、 山梨糖醇、甘露醇、半乳糖醇、葡萄糖與果糖之組合、 麥芽糖、槐糖、乳糖、纖維二糖、蜜二糖、海藻糖、蔗 糖、巴拉金糖（palatinose)、麥芽酮糖（maltulose)、乳果糖、 麥芽糖醇、乳糖醇、蜜三糖、麥芽三糖、松三糖、纖維 三糖、ciritol、麥芽四糖、水蘇糖、纖維四糖、麥芽五糖、 纖維五糖、麥芽六糖、纖維六糖、寡醣。 12. 如請求項11之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該糖為 蔗糖或右旋糖。 13. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該糖 之濃度係在約1% w/w與約70% w/w之間。 14. 如請求項13之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該糖之 濃度係在約25% w/w與約60% w/w之間。 15. 如請求項14之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該糖之 濃度係 50°/。w/w或 55% w/w。 16. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其進一步 包含鈣離子。 17. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該輪 狀病毒抗原為活輪狀病毒。 18. 如請求項17之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該活輪 108304*100]013.doc -2· 1358303 狀病毒為減毒者。 19. 如請求項18之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該活的 減毒輪狀病毒為活的減毒人類輪狀病毒。 20. 如請求項19之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該活的 減毒人類輪狀病毒係選自由以下各物組成之群：以登記 號ATCC VR 2272寄存之HRV 89-12C2株，其後代、基因 重置及免疫學活性衍生物；以登記號ECACC 99081301寄 存之HRV P43株，其後代、基因重置及免疫學活性衍生物。 21. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組 合物具有藉由嬰兒羅塞特-賴斯檢定（Baby Rosett-Rice assay)評價至少8分鐘的抗酸能力。 22. 如請求項21之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組合 物具有藉由嬰兒羅塞特-賴斯檢定評價至少12分鐘的抗酸 能力。 23. 如請求項21之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組合 物具有藉由嬰兒羅塞特-賴斯檢定評價在8與23分鐘之間 的抗酸能力。 24. 如請求項23之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組合 物具有藉由嬰兒羅塞特-賴斯檢定評價在12與2 3分鐘之間 的抗酸能力。 25. 如請求項21之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組合 物具有藉由嬰兒羅塞特-賴斯檢定評價在12與20分鐘之間 的抗酸能力。 26. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組 108304-1001013.doc 1358303 合物在以下條件之至少一者下穩定：37°C下7天、4°C下 一年、4°C下兩年。 27. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其為疫苗。 28. 如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該組 合物係以0.2 ml與2.0 ml之間的劑量體積提供。 29·如請求項28之液體輪狀病毒致免疫組合物’其中該組合 物係以0.5 ml與1.5 ml之間的劑量體積提供》 30.如請求項29之液體輪狀病毒致免疫組合物，其中該组合 物係以約1.5 ml之劑量體積提供。 31_如請求項1或2之液體輪狀病毒致免疫組合物，其係醫藥 用。 32· —種輪狀病毒抗原、糖及羧酸鹽之用途，其係用以製備 用於治療或預防輪狀病毒相關疾病之致免疫組合物，其 中該致免疫組合物係如請求項1至31中任一者所定義。 33_如请求項32之用途，其中該治療或預防包含將安全及有 效1之該人類活減毒輪狀病毒組合物之兩次經口給藥投 與在第一次給藥時4-15週内大的幼兒。 34. 如請求項32或33之用途，其係用於預防人類中輪狀病毒 感染。 35. 如吻求項32或33之用途，其係用於預防人類中輪狀病毒 胃腸炎。 36·如叫求項35之用途，其係用於預防人類中輪狀病毒嚴重 胃腸炎。 37.如請求項35之用途，其中該胃腸炎或嚴重胃腸炎係由輪 108304-1001013.doc 1358303 狀病毒株所引起，該輪狀病毒株之血清型與該液體組合 物中所含之輪狀病毒株的血清型不同。 38. 如請求項32或33之用途，其中該組合物係以〇2 m丨與2〇 ml之間的劑量體積提供。 39. 如請求項38之用途，其中該組合物係以〇 $…與丨5…之 間的劑量體積提供。 4〇.如請求項38之用途，其中該組合物係以約1.5 m 1之劑量體 積提供。 41. 一種製備如請求項1至31中任一項之液體輪狀病毒致免 疫組合物的方法，其包含將輪狀病毒抗原、糖及羧酸鹽 與醫藥學上可接受之稀釋劑混合。

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