EA012046B1 - Живая аттенуированная антиротавирусная вакцина для перорального введения - Google Patents

Abstract

В изобретении предложены жидкие антиротавирусные препараты, которые подходят для перорального введения человеческому ребенку. В частности, в изобретении предложены фармацевтические композиции и вакцины, содержащие ротавирусный антиген, сахар и карбоксилат, где указанная композиция имеет рН от 5,0 до 8,0 и не содержит фосфата или содержит менее 5 мМ фосфата. В изобретении также предложены способы получения указанных антиротавирусных препаратов и применение их в предупреждении или лечении ассоциированных с ротавирусом заболеваний у людей.

Description

Настоящее изобретение относится к новым жидким антиротавирусным препаратам, которые полезны в качестве фармацевтических композиций и вакцин, к способу их получения и к их применению для предупреждения ротавирусных, в частности ассоциированных с ротавирусом, заболеваний человека.

Технические предпосылки

Острая, инфекционная диарея является главной причиной заболевания и смерти во многих областях мира. В развивающихся странах влияние диарейного заболевания является очень важным. Для Азии, Африки и Латинской Америки оценили, что каждый год регистрируют от 3 до 4 биллионов случаев диареи и примерно 5-10 миллионов из этих случаев приводят к смерти (ХУаЕЕ. ТА. е! а1.: N. Епд1. 1. Меб., 301:967-974 (1979)).

Ротавирусы признаны в качестве одной из наиболее важных причин тяжелой диареи у детей грудного и младшего возраста (ЕкТек, М.К. Ко1ау|гн8е8 апб ТЕеи КерЕсабоп ίη Е1е1бк Уно1о§у, Т1игб Еббюп, еббеб Ьу Е1е1бк а! а1., Кауеп РиЬбкЕетк, РЫ1абе1рЫа, 1996). Оценивают, что ротавирусное заболевание ответственно за более чем 600000 смертей ежегодно. Болезнь, индуцированная ротавирусами, чаще всего поражает детей в возрасте от 6 до 24 месяцев, и максимальная распространенность заболевания обычно наблюдается во время более холодных месяцев в умеренных климатах и круглогодично в тропических областях. Ротавирусы типично передаются от человека человеку фекально-оральным путем с инкубационным периодом от примерно 1 до примерно 3 суток. В отличие от инфекции в 6-24-месячной возрастной группе новорожденные обычно не обнаруживают симптомов заболевания или у них наблюдается лишь легкое заболевание. В отличие от тяжелого заболевания, с которым обычно сталкиваются дети младшего возраста, большинство взрослых защищены в результате предшествующей ротавирусной инфекции, поэтому большинство инфекций у взрослых являются легкими или бессимптомными (Οίίίΐ, Р.А. е! а1. Сотр. ТЕег, 8(8):21-26, 1982).

Ротавирусы являются сферическими, и их название происходит от их характерной наружной и внутренней, или двухслойной структуры капсида. Типично, двухслойная структура капсида ротавируса окружает внутреннюю белковую оболочку или сердцевину, которая содержит геном. Геном ротавируса состоит из 11 сегментов двухцепочечной РНК, которые кодируют по меньшей мере 11 индивидуальных вирусных белков. Два из этих вирусных белков, обозначенные как УР4 (Р-белок) и УР7 (О-белок), представляют собой структурные белки, расположенные на наружной поверхности двухслойной структуры капсида. Внутренний капсид ротавируса представлен одним белком, который представляет собой ротавирусный белок, обозначенный как УР6. Относительная важность этих трех конкретных ротавирусных белков в вызывании иммунного ответа, который следует после ротавирусной инфекции, до сих пор не ясна. Тем не менее, белок УР6 определяет групповой и подгрупповой антиген, а белки УР4 и УР7 являются детерминантами серологической специфичности.

До настоящего времени были идентифицированы по меньшей мере 14 О-серотипов ротавируса и 11 Р-серотипов ротавируса (ЬшЕатек А.С. & Вгекке 1.8., Рап. Ат. 1. РиЬ1. НеаЕЕ 2000, 9, 305-330). Среди них 10 О-серотипов и 6 Р-серотипов были идентифицированы среди человека ротавирусов.

Белок УР7 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой (М^) 38000 (М^ 34000, когда негликозилирован), который является трансляционным продуктом геномного сегмента 7, 8 или 9, в зависимости от штамма. Этот белок стимулирует образование основного нейтрализующего антитела после ротавирусной инфекции. Белок УР4 представляет собой негликозилированный белок с М\У приблизительно 88000, который является трансляционным продуктом геномного сегмента 4. Этот белок также стимулирует нейтрализующее антитело после ротавирусной инфекции. Поскольку белки УР4 и УР7 представляют собой вирусные белки, против которых направлены нейтрализующие антитела, они, как полагают, являются главными кандидатами для разработки антиротавирусных вакцин, обеспечивающих защиту против ротавирусного заболевания.

Естественная ротавирусная инфекция в раннем детстве, как известно, вызывает защитный иммунитет.

Первые разработки вакцины для предупреждения ротавирусных инфекций начались в 1970-е годы после открытия вируса. В начале исследовали аттенуированные штаммы из животных и людей, тогда как современные попытки сфокусированы на химерных человеческих-животных вирусах.

Разработка новых антиротавирусных препаратов должна соответствовать многим требованиям, включая потенциал распространения во всем мире и стабильность в широком диапазоне условий окружающей среды и хранения. В частности, стабильность препарата, особенно фармацевтической или вакцинной композиции, будет в общем лучше при более низких температурах по сравнению с комнатной или более высокими температурами.

Поэтому один способ стабилизации заключался в создании вакцинных препаратов, которые могут храниться замороженными (от -20 до -70°С), или, альтернативно, в создании лиофилизированных вакцин, которые могут храниться в течение длительного периода времени при температуре, приближающейся к температуре холодильной камеры (2-8°С). Однако известно, что процесс лиофилизации имеет ограниченную производительность и связан с высокой стоимостью производства. Более того, лиофили

- 1 012046 зированные вакцины имеют более сложную технологическую обработку для введения, поскольку они могут требовать более сложных и, следовательно, относительно дорогостоящих устройств, такие как многокамерные/ампульные вакцины с активным ингредиентом в одной камере и жидкостью для растворения в другой камере. Лиофилизированные вакцины также связаны с более высокой стоимостью транспортировки и хранения. Эти условия могут быть неподходящими для некоторых развивающихся стран, где устройство для введения должно быть доступным с финансовой точки зрения и где инфраструктура производства и хранения может не соответствовать современным требованиям или является ненадежной.

Поскольку ротавирус обычно вводят перорально человеческим детям, то этот путь приводит к некоторым проблемам с иммуногенными антиротавирусными композициями.

Ротавирус быстро инактивируется в кислотном окружении, например, при воздействии кислого буфера или кислого желудочного сока (С. \Уе155 апб Н.Р. С1агк, 1985, 1. Сеп. νίτοί., 66, 2725-2730; Т. Уеыкап е! а1., 1984, Тйе Ьапсе!, р. 700; К..Н. Ро§!ег апб А.кХУарДаГГ. 1998, ΒίοΌπιρδ Рей: 9(2) 155-178). Поэтому желательно, чтобы антиротавирусные композиции были приготовлены так, чтобы они были стабильными во время хранения и после введения в хозяина-реципиента.

Антиротавирусные вакцины в основном предназначены для введения грудным детям уже в возрасте 4 недель. Небольшой дозовый объем вакцины, например меньше 2 мл или даже меньше 1,5 мл дозового объема, будет благоприятным для этой популяции. Поэтому желательно, чтобы антиротавирусные композиции были приготовлены в небольшом дозовом объеме.

Стабилизирующие препараты для жидких противовирусных вакцин известны. Например, в ЕР 0065905 раскрыты в общем стабилизирующие композиции, подходящие для группы вирусов, таких как вирусы, вызывающие корь или грипп, и, в частности, в нем раскрыты стабилизирующие растворы, содержащие фосфатный буфер, подходящие для живого аттенуированного вируса.

Другие стабилизирующие препараты раскрыты в \УО 98/13065 и в С1агк е! а1. (Реб1а!г 1пГес! Όίδ 1. 2003 Ос!; 22(10):914-20). Такие препараты также требуют, среди прочих компонентов, присутствия фосфата, действующего в качестве забуферивающего агента для нейтрализации кислотности желудочного сока. Однако эти препараты не совместимы с требованиями, изложенными выше для успешной разработки антиротавирусного препарата, конкретно они не совместимы с уменьшенным объемом вакцинной дозы, который лучше подходит для человеческого ребенка. В частности, автор настоящего изобретения обнаружил, что адаптация этого препарата из уровня техники к устройству маленького объема, такому как 1,5 мл или меньше, хотя и поддерживает эффективную антацидную способность, приводит к проблемам, происходящим из несоответствия концентрации компонентов препарата, в частности фосфатного буфера.

Поэтому необходимо разработать альтернативные антиротавирусные препараты, в частности альтернативные жидкие препараты, которые могут выдерживать кислотность желудочного сока и стабильны в холодильной камере, несмотря на отсутствие фосфата. Кроме того, необходимо, чтобы такие альтернативные препараты были также успешно приготовлены в минимально возможном объеме вакцинной дозы.

Поэтому в настоящем изобретении предложены не только альтернативные стабильные иммуногенные композиции, которые не содержат фосфата или содержат лишь минимальные количества фосфата, но также обеспечена возможность приготовления ротавируса в малом дозовом объеме, который подходит для перорального введения человеческому ребенку.

Описание графических материалов

Фиг. 1 - стандартные кривые кислотно-основного титрования для четырех карбоксилатов.

Фиг. 2А - антацидная способность различных адипатсодержащих препаратов.

Фиг. 2Б - экспериментальная установка для анализа Россетт-Райса у грудных детей (ВЕК от англ. Вайу Ко55еЦ-К|се).

Фиг. 3 - коэффициент преломления адипатсодержащих препаратов. На фиг. ЗА показано, что на стадии адипатного буфера целевым значением является 58,5% сахарозы (мас./мас.), которое дает коэффициент преломления 1,4578 в смеси. На фиг. 3Б показано, что на стадии конечного препарата целевым значением является 55% сахарозы (мас./мас.), которое дает коэффициент преломления 1,4480.

Фиг. 4 - обзор схемы клинического испытания фазы II.

Изложение сущности изобретения

Соответственно, в первом аспекте настоящего изобретения предложена жидкая антиротавирусная иммуногенная композиция, которая подходит для перорального введения человеческому ребенку, содержащая ротавирусный антиген, сахар и карбоксилат, где указанная композиция имеет рН от примерно рН 5,0 до примерно рН 8,0 и содержит менее 5 мМ фосфата. Предпочтительно, концентрация фосфата в заявленной композиции не превышает 1 мМ.

В конкретном аспекте изобретения подходящая вакцинная доза будет обычно составлять 1,5 мл или предпочтительно любой объем меньше 2,5 мл, такой как объем 2 мл или меньше, который подходит для перорального введения грудным детям или детям младшего возраста. В частности, дозовый объем будет таким, чтобы стало возможным техническое осуществление препарата и не было вреднего воздействия на иммуногенный потенциал препарата. Заявленные композиции дают преимущество над фосфатсодер

- 2 012046 жащими препаратами из уровня техники в том, что они могут выдерживать кислотность желудочного сока, остаются иммуногенными и стабильными в течение длительного срока хранения и в то же время совместимыми с препаратом в меньшем, чем обычно, дозовом объеме, таком как меньше 2,0 мл, или даже совместимыми с дозовым объемом 1,5 мл или меньше.

В конкретном воплощении жидкая иммуногенная композиция по изобретению обладает антацидной способностью от 6 и 23 мин при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей (модифицированного, как подробно описано в примере ΙΙΙ.2.2, относительно стандартного теста РоссеттРайса). Предпочтительно антацидная способность будет составлять по меньшей мере 8 мин, типично по меньшей мере 12 мин, а подходящий диапазон составляет от 12 до 20 мин. Неожиданно заявленные композиции продемонстрировали не только приемлемую, но более высокую антацидную способность даже в меньшем дозовом объеме, по сравнению с фосфатсодержащими препаратами из уровня техники.

В другом аспекте предложен способ получения указанной жидкой антиротавирусной иммуногенной композиции, включающий смешивание ротавирусного антигена, сахара и карбоксилата с фармацевтически приемлемым разбавителем.

Изобретение также охватывает в другом аспекте применение ротавирусного антигена в смеси с карбоксилатом и сахаром для изготовления пероральной иммуногенной композиции для предупреждения или лечения у людей заболеваний, ассоциированных с ротавирусом, где указанная композиция не содержит более чем 5 мМ фосфата и имеет рН от примерно рН 5,0 до примерно рН 8,0.

В еще одном аспекте также предложен способ лечения или предупреждения ассоциированных с ротавирусом заболеваний у людей путем введения человеку-субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества указанной жидкой иммуногенной композиции.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения описаны дополнительно в следующем подробном описании его предпочтительных воплощений.

Подробное описание

Автор настоящего изобретения разработал новые жидкие антиротавирусные композиции, которые являются иммуногенными, стабильными при температуре холодильной камеры (от 2 до 7°С, типично при 4°С), которые могут выдерживать внутреннюю кислотную природу желудка при пероральном введении и которые совместимы с маленьким дозовым объемом.

Жидкая композиция предназначена для обозначения препарата в жидкой форме, в противоположность сухой форме, объем которого является постоянным при постоянных конкретных услових (например, при комнатной температуре или температуре холодильной камеры, при атмосферном давлении) и форма которого определяется сосудом, который он заполняет.

Объект и информация, раскрытые в публикациях и патентах или заявках на патент, упомянутых в этом описании, включены в данное описание путем ссылки.

Термины содержащий, содержат и содержит в данном описании, как предполагает автор, могут быть заменены соответственно терминами состоящий из, состоят из и состоит из в каждом случае.

В настоящем изобретении предложена жидкая антиротавирусная иммуногенная композиция, содержащая ротавирусный антиген, сахар и карбоксилат, где указанная композиция имеет рН от примерно рН 5,0 до примерно рН 8,0 и содержит менее 5 мМ фосфата. Композиции по изобретению демонстрируют очень хороший профиль стабильности при сравнении с фосфатсодержащими препаратами, в то же время поддерживается профиль иммуногенности. Эти композиции являются, по меньшей мере, такими же стабильными, как их фосфатсодержащие прототипы. Другое преимущество композиций по настоящему изобретению состоит в том, что они могут быть получены в маленьком дозовом объеме, таком как меньше 2,0 мл, типично, например, 1,5 мл, по сравнению с препаратами из уровня техники, в которых присутствует фосфат.

В конкретном воплощении концентрация фосфата в иммуногенной композиции не превышает 5 мМ, предпочтительно 1 мМ, в частности она не превышает 0,5 мМ. Фосфат относится к соли фосфорной кислоты (также известной как ортофосфорная кислота (Н3РО4)), обычно используют натриевые или калиевые соли или смесь натриевых и калиевых солей (например: Ыа₃РО₄, Ыа₂НРО₄, ПаН₂РО₄, К₃РО₄, К₂НРО₄, КН₂РО₄). Предпочтительно, концентрация фосфата составляет 0,4 мМ или ниже, типично 0,2 мМ или ниже, идеально 0,1 мМ или ниже. В другом конкретном воплощении композиция, как заявлено в данном патенте, не содержит фосфата. Типично, фосфат, когда присутствует, поступает из среды для клеточных культур или солевого буфера, используемых в качестве разбавителя, таких как ΌΜΕΜ (среда игла в модификации Дульбекко), минимальная питательная среда игла ВМЕ или РВ8.

Концентрация фосфата, о которой идет речь в данном описании, будет представлять собой вычисленную концентрацию, которую определяют из количеств(а) фосфатсодержащих реагентов, используемых при получении заявленной(ых) композиции(й). Альтернативно, концентрация фосфата, присутствующего в композиции, как заявлено в данном описании, может быть измерена экспериментально с использованием аналитических рутинных методик.

Одной из подходящих методик является колориметрический анализ, названный Наноцвет (Ναηο- 3 012046 со1ог), продаваемый фирмой Масйегеу-Ыаде1 (каталожный № 91878). Этот способ основан на фотометрическом определении желтого комплекса, образованного фосфорной кислотой-молибдатом-ванадатом в кислотном растворе. Предел количества для данного анализа составляет 2 мкг/мл фосфата или 0,02 мМ.

Альтернативный способ представляет собой дозирование фосфора (Р) с помощью методики атомно-эмиссионной спектроскопии, такой как атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно связанной плазмой (1пбисйуе1у Соир1еб Ркшпа-АЮтю Етщыоп 8рес1го§сору, 1СР-АЕ8) (Во88 & Егебееп. в СопсерБ. 1п51гитеп1а1юп. апб Тес11пк|ие5 ίη 1пбис11уе1у Соир1еб Р1а§та Орйса1 Ет^щоп 8рес1го5сору, Регкш Е1тег еГО зесопб ебйюп, 1997 - см. Методологию на с. 72 и далее). Предел количества для данного анализа составляет 0,030 мкг/мл фосфора, соответствующего концентрации фосфата 0,00032 мМ.

В одном из воплощений рН композиции составляет от рН 5,0 до 8,0. В другом конкретном воплощении рН заявленной композиции составляет от примерно рН 5,5 до примерно рН 7,5. Под примерно рН подразумевают в пределах 0,2 ед. от заданного значения рН. В частности, рН композиции составляет от рН 5,5 до 7,5. Например, рН композиции составляет от примерно рН 6,0 до примерно рН 7,0, в частности от рН 6,0 до 7,0, типично от рН 6,2 до 6,8 или от рН 6,2 до 6,6. Подразумевается рН примерно 6,4, в частности 6,4. Известно, что кислый рН, такой как рН ниже 4,0, отрицательно влияет на ротавирус, и ожидают, что максимальная стабильность будет получена при нейтральном или даже слегка щелочном рН, т.е. диапазоне рН от 7,0 до 8,0, который получают, например, в забуференных фосфатом препаратах из уровня техники. Как показано в экспериментальной части, композиции по изобретению, несмотря на отсутствие фосфата, продемонстрировали хороший профиль стабильности в заявленном диапазоне рН и, более того, неожиданно продемонстрировали приемлемый профиль стабильности и иммуногенности даже в слабокислотных условиях, т.е. около рН от 6,0 до 7,0, при таком рН, как, например, около 6,4.

Жидкая композиция, как заявлено в данном описании, содержит карбоксилат.

Карбоксилат (-СОО^-) представляет собой диссоциированную форму карбоновой кислоты, полученную в результате нейтрализации кислотной функциональной группы (-СООН) щелочным веществом. Карбоновая кислота представляет собой соединение, содержащее карбоксильную группу: -СООН, которую формально получают путем объединения карбонильной группы (-СО-) и гидроксильной группы (-ОН). Однако взаимодействие между этими двумя частями так модифицирует их химические свойства, что целая группа рассматривается как новая функциональная группа с присущими ей характерными свойствами (Огдашс СНетМгу Ьу ЕВ. Непбпсккоп, Ό.Ι. Сгат, апб С.8. Наттопб, МсСга^-НШ Воок Сотрапу, 11нгб ебйюп, 1970, р. 131). Хотя Международный союз теоретической и прикладной химии (ГОРАС) рекомендует для применения номенклатуру алкановых кислот (монокарбоновых кислот) и алкандикарбоновых кислот (дикарбоновых кислот), в этом тексте использовали в основном тривиальные названия карбоновых кислот, поскольку эти продукты хорошо известны специалисту в данной области. Например, название уксусной кислоты согласно ГОРАС соответствует этановой кислоте, а для адипиновой кислоты название будет соответствовать гександикарбоновой кислоте.

В конкретном воплощении используют карбоксилатную соль из неорганической кислоты или предпочтительно из органической кислоты. В конкретном воплощении указанный карбоксилат получают из слабой кислоты. Например, указанный карбоксилат представляет собой карбоксилатную соль, выбранную из группы, состоящей из адипата, цитрата, малата, ацетата, сукцината, пропионата, бутирата, малоната, глутарата, малеата, гликолята, лактата, глюконата, фумарата, тартрата, пимелата и любой комбинации двух или более из них. Подходящие карбоксилаты представляют собой карбоксилаты, полученные из карбоновой кислоты с рК_а больше 4, или карбоксилаты, полученные из ди- или трикарбоновой кислоты (ди- или трикарбоксилаты) с численным средним рК_а больше 4 (табл. 9). Примеры первого класса включают в себя карбоксилаты, полученные из пропионовой, масляной и уксусной кислоты. Примеры второго класса включают в себя карбоксилаты, полученные из лимонной, малеиновой, малоновой, янтарной, адипиновой, глутаровой и яблочной кислоты.

В конкретном воплощении указанный карбоксилат относится к перечню СКА8, т.е. к карбоксилатам, которые признаны полностью безопасными Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (Еооб апб Эгид Абт1Ш81та1юп, ЕИА), и выбран из перечня, включающего в себя ацетат, пропионат, малат, глутарат, адипат, лактат, фумарат и тартрат. Предпочтительно, карбоксилат представляет собой соль адипиновой кислоты, т.е. мононатриевую соль адипиновой кислоты, монокалиевую соль адипиновой кислоты, предпочтительно динатрия адипат, или дикалия адипат, или кальция адипат.

В конкретном воплощении предпочтительно используют концентрацию карбоксилата от 50 мМ до 2 М в жидкой антиротавирусной композиции. Следует понимать, что концентрация карбоксилата в диапазоне, упомянутом выше, может быть соответственно адаптирована, посредством рутинного экспериментирования, в соответствии с природой карбоксилата, антацидной способностью, которую нужно достичь, и объемом вакцинной дозы. Например, высокие концентрации карбоксилата выше 1 М могут быть использованы, когда требуется высокий антацидный потенциал, такой как выше 8 мин, предпочтительно выше 10 мин или выше 12 мин при определении с помощью тест Россетт-Райса у грудных детей для дозового объема 1,5 мл. Типично используют концентрации 1 М или ниже, такие как концентрации от 100 мМ до 1 М, обычно концентрации от 200 до 800 мМ. Подходящие концентрации карбоксилата нахо

- 4 012046 дятся от примерно 300 до примерно 800 мМ, предпочтительно от 400 до 700 мМ. В частности, когда карбоксилат представляет собой адипат, подходящий диапазон концентраций составляет от 400 до 500 мМ. Однако специалист поймет, что подходящими могут быть концентрации в пределах 10-20% от заданных значений, т.е. если задается 100 мМ, то диапазон от 80-90 до 110-120 мМ также раскрыт и подразумевается, что он охвачен. Иллюстративные концентрации приведены для различных карбоксилатов в табл. 1 ниже.

Эти иллюстративные параметры приведены для дозового объема 1,5 мл и соответствуют номеру упомянутого примера, приведенному в табл. 1.

Таблица 1 Антацидная способность карбоксилатов при конкретной концентрации

Карбоксилат (Μνν)	Концентрация карбоксилата (М)	рН в ВПК при 1=0	Антацидная способность (мин)*	№ образца в Примере II
Адипат (144)	0,372	6,38	8	91
Адипат (144)	0,465	6,24	12	92
Адипат (144)	0,548	6,50	16	93
Адипат (144)	0,652	6,11	20	94
О,1.-малат(132)	0,621	6,15	8	72
О,1_-малат(132)	0,746	6,08	12	64
О,1_-малат(132)	0,895	5,35	15	77
Ацетат (59)	1,000	6,14	12	89
Цитрат (189)	0,441	6,55	12	129

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВЕК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

рН жидкой антиротавирусной иммуногенной композиции, заявленной в данном изобретении, может быть получен путем смешивания карбоновой кислоты и карбоксилатной соли. В частности, карбоновая кислота может быть использована в смеси с другой карбоксилатной солью, например, цитрат объединяют с адипиновой кислотой. Это может быть полезным при использовании имеющихся в продаже реагентов, некоторые из которых могут не быть легко доступными, или для упрощения стадии приготовления препарата. Например, одна (или более) указанная карбоновая кислота(ы) может быть выбрана из перечня, состоящего из адипиновой кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, угольной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, малоновой кислоты, глутаровой кислоты, малеиновой кислоты, гликолевой кислоты, молочной кислоты, глюконовой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, пимелиновой кислоты, и смешана(ы) в подходящих пропорциях с одной (или более) карбоксилатной солью, выбранной из перечня, состоящего из адипата, цитрата, малата, ацетата, сукцината, пропионата, бутирата, малоната, глутарата, малеата, гликолята, лактата, глюконата, фумарата, тартрата, пимелата.

Жидкая композиция, как заявлено в данном изобретении, содержит сахар. Сахароза является особенно подходящей. Декстроза представляет собой другой подходящий сахар. Другие сахара или сахарные спирты также могут быть использованы вместо сахарозы или декстрозы, включая, например, глицерин, эритрозу, эритрит, ксилит, арабит, рибозу, ксилозу, арабинозу, глюкозу, тагалозу, маннозу, галактозу, фруктозу, инозит, сорбит, маннит, галактит, смесь глюкозы и фруктозы, мальтозу, софорозу, лактозу, целлобиозу, мелибиозу, трегалозу, сахарозу, палатинозу, мальтулозу, лактулозу, мальтит, лактит, рафинозу, мальтотриозу, мелезитозу, целлотриозу, циритол, мальтотетраозу, стахиозу, целлотетраозу, мальтопентаозу, целлопентаозу, мальтогексаозу, целлогексаозу, олигосахариды.

Типичный диапазон концентраций сахара составляет от примерно 1 до примерно 70% мас./мас., например от примерно 25 до примерно 60% мас./мас. Однако специалисту будет понятно, что природа и концентрация сахара должна быть оптимизирована так, чтобы он обеспечивал удовлетворительную жизнеспособность вируса, поддерживая вязкость на уровне, который совместим со стадиями производства препарата, такими как фильтрация. В конкретном воплощении используют сахарозу. Типично, ее концентрацию поддерживают при минимальном значении 30% мас./мас. Более того, могут быть использованы более высокие, т.е. выше 30% мас./мас. концентрации сахарозы для обеспечения длительного хранения, поскольку ожидается, что высокое изоосмотическое давление таких препаратов будет предотвращать бактериальный рост. Соответственно, нижний предел для концентрации сахарозы в жидкой композиции, как заявлено в данном изобретении, составляет предпочтительно 30% мас./мас. или выше, такой как 35% мас./мас. или выше, предпочтительно 40% мас./мас. или выше. Подходящие диапазоны концентраций сахарозы составляют от примерно 40 до примерно 70% мас./мас. Например, подходящая концентрация сахарозы будет находиться между 45 и 60% мас./мас., предпочтительно между 50 и 55% мас./мас. В частности, используют сахарозу в концентрации примерно 50 или примерно 55% мас./мас. Конечные концентрации сахарозы 50 или 55% мас./мас. являются подходящими.

- 5 012046

Специалисту будет понятно, что когда сахарозу заменяют другим сахаром, может быть осуществлена рутинная оптимизация концентрации сахара для того, чтобы обеспечить стабильность вируса.

Более того, заданные значения для сахаров могут быть слегка адаптированы с учетом параметров препарата/изготовления, таких как дозовый объем. Поэтому специалисту будет понятно, что концентрации в пределах 10% от заданных значений могут быть подходящими, т.е. когда задают 50% мас./мас. тогда диапазон от 45 до 55% мас./мас. также раскрыт и подразумевается, что он охвачен.

Жидкая антиротавирусная иммуногенная композиция по настоящему изобретению также содержит ротавирусный антиген. В частности, жидкая композиция, как заявлено в данном изобретении, представляет собой иммуногенную композицию, например вакцинную композицию. Понятно, что ротавирусный антиген подразумевает любой ротавирусный антиген, который подходит для применения в вакцинном препарате. Главным образом рассматриваются пероральные живые ротавирусные антигены. Например, любой подходящий ротавирусный антиген может быть выбран из группы, состоящей из живого аттенуированного ротавируса животных или людей, в частности, живого аттенуированного ротавируса человека; химерного ротавируса, в частности, но не ограничиваясь этим, химерного ротавируса человека-человека, химерного ротавируса быка-человека или химерного ротавируса макака-резуса-человека.

Все ротавирусные штаммы, человеческие или животные штаммы, рассматриваются в настоящем изобретении. Подходящими являются человеческие штаммы ротавирусов. В частности, ротавирусный антиген представляет собой в одном из воплощений аттенуированную популяцию ротавирусов человека, включающую один вариант или по существу один вариант, причем указанный вариант определен нуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере один из основных вирусных белков, обозначенных как УР4 и УР7, как раскрыто в \УО 01/12797, в частности, любой, включая один или более, из вариантов, охарактеризованных мутациями, изложенными в табл. 2, 3.1 и 3.2 из \¥О 01/12797. В конкретных воплощениях ротавирусный антиген представляет собой любой из следующих живых аттенуированных штаммов ротавируса человека: штамм НКУ 89-12С2, депонированный под регистрационным номером АТСС УК 2272 (как описано в ЕР 0557427), его потомство, его химерные и иммунологически активные производные; штамм НКУ Р43, депонированный под регистрационным номером ЕСАСС 99081301 (как описано в \УО 01/12797), его потомство, его химерные и иммунологически активные производные.

Ротавирусные популяции, имеющие характеристики любого из вышеупомянутых депонированных штаммов, также представляют собой подходящие вакцинные штаммы. Производные из указанных депонированных штаммов могут быть получены путем подвергания указанных штаммов дополнительной обработке, например, путем их размножения с помощью дополнительного пассирования, клонирования или других методик с использованием живого вируса, или путем модификации указанных депонированных штаммов любым путем, включая методы генной инженерии или методы получения химер. Такие стадии и методы хорошо известны в данной области. Ротавирусные антигены, представляющие особый интерес, являются потомством любого из указанных депонированных штаммов и его иммунологически активными производными. Иммунологически активные производные представляют собой вещества, полученные из любого из депонированных штаммов или с любым из них, в частности, из штамма НКУ Р43, депонированного под регистрационным номером ЕСАСС 99081301, или с ним, особенно вирусные антигены, которые способны вызывать иммунный ответ, который является активным против ротавируса при инъекции в хозяина-животного.

Вещества, происходящие из депонированных штаммов, перечисленных выше, также представляют собой подходящие ротавирусные антигены, и включают в себя белок и генетический материал. Особый интерес представляют химерные ротавирусы, которые содержат по меньшей мере один антиген или по меньшей мере один сегмент любого из указанных депонированных штаммов, например химерные вирусы, которые содержат вирулентный штамм ротавируса, в котором один или часть одного из 11 геномных сегментов был(а) заменен(а) геномным сегментом или его частью из любого из указанных депонированных штаммов. Конкретно, ротавирусная химера, в которой сегмент или частичный сегмент, кодирующий Ν8Ρ4, представляет собой сегмент или частичный сегмент любого из указанных депонированных штаммов, может иметь полезные свойства. Химерные ротавирусы и методики их получения хорошо известны (Ео81ет, К.Н. апб ХУадЧаГГ, А.Г Те1гауа1еп1 Ко1ау1ги8 Уассше, а гс\зс\\'. ΛΩΙ8 бгид еуа1иабоп, ВюПтидк, Осу, 9(2), 155-178, 1998).

Ротавирусный антиген из заявленной композиции может быть получен согласно рутинным методикам получения. Типично, препараты ротавирусные антигенов могут быть получены с помощью способов культивирования тканей, используемых для размножения вируса или экспрессии рекомбинантных ротавирусных антигенов. Подходящие клеточные субстраты для выращивания вируса включают в себя, например, клетки почки собаки, такие как МОСК или клетки из клона МОСК, МЭСК-подобные клетки, клетки почки обезьяны, такие как клетки АОМК, включая клетки Уего, которые являются особенно подходящими, другие клеточные линии, происходящие из почки обезьяны, такие как В8С-1, ЕЬС-МК2 и МА 104, подходящие линии клеток свиньи, или любой другой тип клеток млекопитающих, подходящий для получения ротавируса для вакцинных целей. Подходящие клеточные субстраты также включают в себя человеческие клетки, например клетки МКС-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничива

- 6 012046 ются клеточными линиями; например, первичные клетки также включены.

Также в пределах объема изобретения находятся смеси любого из вышеперечисленных депонированных штаммов с другими вариантами ротавируса, например, другими клонированными вариантами или другим химерным ротавирусом, или с другими вирусами, в частности, другими аттенуированными вирусами. В частности, композиция по изобретению содержит два ротавирусных антигена. В частности, один антиген в композиции представляет собой штамм НРУ Р43, депонированный под регистрационным номером ЕСАСС 99081301, а другой антиген представляет собой его химерное производное или любое его иммунологически активное производное.

Ротавирусный антиген для включения в заявленную композицию может представлять собой моновалентный ротавирусный штамм, т.е. содержащий один ротавирусный штамм, или поливалентный, т.е. содержащий по меньшей мере два или более чем два ротавирусных штамма.

Специалисту будет понятно, что другие легко доступные аттенуированные штаммы человеческого или животного происхождения, которые получают из депозитарных учреждений, также являются подходящими и могут быть использованы в качестве заменителей перечисленных депонированных штаммов.

Согласно настоящему изобретению, подходящая иммуногенная композиция содержит ротавирусный антиген, в частности, человеческий аттенуированный штамм Р43 (депонированный под регистрационным номером ЕСАСС 99081301, см. \УО 01/12797) в концентрации 10⁵-10⁶ БОЕ на дозу (или эквивалент 10^5,5-10^6,5, выраженный в ССШ50 на дозу), 55% сахарозы мас./мас., 0,465 М динатрия адипата (соответствующих 132,74 мг на дозу), и имеет рН от примерно 6,2 до 6,6, в 1,5 мл дозовом объеме. Для этой композиции ΌΜΕΜ содержание составляет 6% мас./мас. и, следовательно, составляет менее 0,1 мМ фосфата.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать дополнительный антацидный компонент, такой как неорганический антацид, например гидроксид алюминия А1(ОН)₃ и гидроксид магния Мд(ОН)₂. Гидроксид алюминия является особенно подходящим. Другие имеющиеся в продаже антациды, которые являются подходящими для применения в изобретении, включают в себя Му1ап1а™, который содержит гидроксид алюминия и гидроксид магния. Они нерастворимы в воде и представлены в суспензии. Другой особенно подходящий антацид, который может быть дополнительно использован в вакцинной композиции по настоящему изобретению, представляет собой нерастворимую неорганическую соль карбонат кальция (СаСО3). Типичная концентрация СаСО3 составляет 80 мг на дозу вакцины, например.

Другие подходящие, нерастворимые в воде антациды представляют собой карбонат магния, карбонат алюминия, фосфат алюминия, смесь гидроксида алюминия и карбоната магния, гидрокарбонат алюминия-магния, гидроксид алюминия-карбонат магния-сорбит-маннит, гидроксиалюминия-натриякарбонат, дигидроксикарбонат алюминия-калия, магалдрат, гидротальцит, альмагцит, магния-алюминия силиката гидрат.

Иммуногенная композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые соединения и/или носители, в частности соединения, которые, как известно в данной области, подходят для перорального введения, особенно у грудных детей. Такие носители включают в себя, но не ограничиваются этим, углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты, гидроксид алюминия, гидроксид магния, гидроксиапатит, тальк, оксид титана, гидроксид железа, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, желатин, растительный пептон, ксантан, каррагенан, гуммиарабик, β-циклодекстрин.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать ионы кальция, которые были предложены для стабилизации ротавируса.

Вязкие агенты могут быть дополнительно включены в композицию.

Возможные вязкие агенты, которые могут быть использованы, включают в себя псевдопластические эксципиенты. Подходящие вязкие агенты включают в себя пропиленгликоль, гуммиарабик, трагантовую камедь, агар-агар, альгинат, пектин, натрий-карбоксиметилцеллюлозу (Ту1о5С5 С®), метилцеллюлозу (МеШосек А®, Уксо1тап8 МС®, Ту1о5С МН® и МВ®), гидроксипропилметилцеллюлозу (К1исе18®), гидроксипропилцеллюлозу (Мебюсек Ε® и К®, У1со1тап8 МРНС®), СатЬоро1®, ксантановую камедь, Уеедит® (магния-алюминия силикат), Ау1се1® (примерно 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% Ыа-карбоксиметилцеллюлозы). Ксантановая камедь или крахмал являются особенно подходящими вязкими агентами для дополнительного применения в жидкой композиции по изобретению.

Также может быть выгодным включать в заявленную композицию носители на основе липидов, такие как виросомы или липосомы, эмульсии типа масло в воде или частицы носителя. Альтернативно или кроме того, в композицию могут быть включены иммуностимуляторы, такие как иммуностимуляторы, известные в данной области для пероральных вакцин. Такие иммуностимуляторы включают в себя бактериальные токсины, особенно холерный токсин (СТ) в виде голотоксина (целая молекула) или только Вцепи (СТВ) и термолабильный энтеротоксин из Е. со11 (ЬТ). Мутантные ЬТ (тЬТ), которые меньше способны превращаться в свою активную форму, чем нативный ЬТ, описаны в \УО 96/06627, \УО 93/13202 и И8 5182109.

- 7 012046

Композиция по изобретению может дополнительно содержать адъювант или иммуностимулятор, такой как, но не ограничиваясь этим, детоксифицированный липид А из любого источника и нетоксичные производные липида А, сапонины и другие реагенты, способные стимулировать ответ ТН1-типа.

Уже давно известно, что энтеробактериальный липополисахарид (ЕР8) является мощным стимулятором иммунной системы, хотя его применение в адъювантах было ограничено из-за его токсических эффектов. Нетоксичное производное ЬР8, представляющее собой монофосфориллипид А (МРЬ), полученный путем удаления коровой углеводной группы и фосфата из редуцирующего концевого глюкозамина, было описано К1Ы с соавт. (1986, 1ттипо1оду апб 1ттипорйагтасо1оду о! Ьас(сг1а1 спбоЮхтх. Р1епит РиЬ1. Согр., ΝΥ, р. 407-419) и имеет следующую структуру:

Другой детоксифицированный вариант МРЬ получен путем удаления ацильной цепи из 3положения дисахаридного скелета и называется 3-О-деацилированный монофосфориллипид А (3ΌМРЬ). Он может быть очищен и получен способами, описанными в СВ 2122204В, в котором также раскрыто получение дифосфориллипида А и его 3-О-деацилированных вариантов.

Подходящая форма 30-МРЬ находится в форме эмульсии, имеющей маленький размер частиц менее 0,2 мкм в диаметре, и способ ее изготовления раскрыт в \УО 94/21292. Водные композиции, содержащие монофосфориллипид А и поверхностно-активное вещество, были описаны в \УО 9843670А2.

Адъюванты, происходящие из бактериального липополисахарида, которые будут включены в композиции по настоящему изобретению, могут быть очищены и обработаны из бактериальных источников, или альтернативно, они могут быть синтетическими. Например, очищенный монофосфориллипид А описан в К4Ь1 е( а1. 1986 (выше), а 3-О-деацилированный монофосфорил- или дифосфориллипид А, происходящий из 8а1топе11а хр., описан в СВ 2220211 и И8 4912094. Были описаны и другие очищенные и синтетические липополисахариды (Нбдетх е( а1., 1986, 1Ш. АгсН. А11егду. 1ттипо1., 79(4):392-6; Нйдегх е( а1., 1987, 1ттипо1оду, 60(1):141-6; и ЕР 0549074 В1). Особенно подходящим бактериальным липополисахаридным адъювантом является 3П-МРЬ.

Соответственно, производные ЬР8, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, представляют собой такие иммуностимуляторы, которые сходны по структуре с производными ЕР8, или МРЬ, или 30-МРЬ. В другом аспекте настоящего изобретения производные ЬР8 могут представлять собой ацилированный моносахарид, который является субфрагментом вышеприведенной структуры МРЬ.

Синтетические производные липида А также известны, включая, но не ограничиваясь этим

ОМ174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К.)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоно-в-Оглюкопиранозил]-2-[(К.)-3-гидрокситетрадеканоиламино]-а-О-глюкопиранозилдигидрофосфат), (ЛУО

95/14026);

ОМ 294 ОР (38,9В)-3-[(В)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К.)-[(К.)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1,10-бис(дигидрофосфат) (ЛУО 99/64301 и \УО 00/0462);

ОМ 197 МР-Ас ОР (38,9К.)-3-[(К.)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К.)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфата 10-(6-аминогексаноат) (ЛУО 01/46127).

Очищенные сапонины в качестве пероральных адъювантов описаны в УО 98/56415. Сапонины и монофосфориллипид А могут быть использованы раздельно или в комбинации (например, УО 94/00153) и могут быть приготовлены в адъювантных системах вместе с другими агентами. 30-МРЬ представляет собой хорошо известный адъювант, производимый фирмой К4Ь1 1ттипосйет, Моп1апа, и его изготовление описано в СВ 2122204.

Другой предпочтительный иммуностимулятор для применения в настоящем изобретении представляет собой сапонин Ош1 А и его производные. Сапонины описаны в ЬасаШе-ОиЬощ, М. апб Уадпег Н. (1996. А ге\зе\\' о! (Не Ью1одюа1 апб рбаттасо1одюа1 асбу1бе§ о! харошпх. РбуФтебкте, уо1 2, р. 363-386). Сапонины представляют собой стероидные или тритерпеновые гликозиды, широко распространенные в

- 8 012046 растительном царстве и царстве морских животных. Сапонины, как известно, образуют коллоидные растворы в воде, которые пенятся при встряхивании, и осаждают холестерин. Когда сапонины находятся близко к клеточным мембранам, они порождают пороподобные структуры в мембране, которые являются причиной разрыва мембраны. Гемолиз эритроцитов является примером этого феномена, который является свойством некоторых, но не всех, сапонинов.

Сапонины известны в качестве адъювантов в вакцинах для системного введения. Адъювантная и гемолитическая активность индивидуальных сапонинов широко исследовалась в данной области (ЬасаШс-ЭиЬой апб ХУадпсг. выше). Например, Οιιί1 А (происходящие из коры южно-американского дерева Ош11а)а харопапа Мойпа) и его фракции описаны в И8 5057540 и 8арошпх ах уассте абщуаий, Кепхй, С. К, Сгй Кеу ТЬегЭгид Сатлет 8ух1, 1996, 12 (1-2): 1-55; и ЕР 0362279 В1. Структуры в виде частиц, названные иммунными стимулирующими комплексами (18СОМ8, 1ттипе 8йти1айпд Сотр1ехех), содержащие фракции Οιιί1 А, являются гемолитическими и были использованы в изготовлении вакцин (Мотет, В., ЕР 0109942 В1; \УО 96/11711; \УО 96/33739). Гемолитические сапонины Р821 и Р817 (фракции Οιιίΐ А, очищенные с помощью ВЭЖХ) были описаны как мощные системные адъюванты, и способ их получения раскрыт в патенте И8 5057540 и ЕР 0362279 В1. 08-21 представляет собой природный сапонин, происходящий из коры Ош11а)а харопапа Мо1ша, который индуцирует СЭ8+ цитотоксические Тклетки (СТЬ), Тй1-клетки и преимущественный 1дС2а антительный ответ и представляет собой подходящий сапонин в контексте настоящего изобретения. Другие сапонины, которые были использованы в исследованиях системной вакцинации, включают сапонины, происходящие из других видов растений, таких как Оурхорййа и 8аропапа (ВотГогб е! а1., Уассте, 10(9):572-577, 1992).

Улучшенная система включает комбинацию нетоксичного производного липида А и производного сапонина, в частности, комбинацию 0821 и 3Э-МРЕ как раскрыто в \УО 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 гасится холестерином, как раскрыто в \УО 96/33739. Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть выделены в форме мицелл или могут находиться в форме больших упорядоченных структур, таких как 18СОМ (ЕР 0109942 В1) или липосомы, когда приготовлены с холестерином и липидом, или в форме эмульсии типа масло в воде (\УО 95/17210). Сапонины могут быть предпочтительно ассоциированы с солью металла, такой как гидроксид алюминия или фосфат алюминия (\УО 98/15287).

Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая 0821 и 30-МРЙ в эмульсии типа масло в воде, описана в \УО 95/17210 и в \УО 99/11241 и \УО 99/12565, и представляет собой подходящие композиции.

Общий обзор носителей и адъювантов для пероральной иммунизации можно найти в Уассте ЭеХ1дп, ТНе 8иЬипй апб Абщуап! Арртоасй, ебйеб Ьу РохуеП апб Ые^тап, Р1епит Ргехх, №\ν Уогк, 1995.

Вакцинная композиция по изобретению может содержать дополнительные компоненты, включая, например, корригенты (особенно для пероральной вакцины) и бактериостатические агенты.

В конкретном воплощении жидкая композиция по изобретению обладает антацидной способностью от 6 до 23 мин при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей (модифицированного, как подробно описано в примере ΙΙΙ.2.2, относительно стандартного теста Россетт-Райса). Согласно настоящему изобретению, под антацидной способностью подразумевают период времени, выраженный в минутах, в течение которого рН препарата в тесте остается выше 4, определяемый согласно экспериментальной методике, представленной в примере ΙΙΙ.2.2. Предпочтительно антацидная способность будет составлять от 12 до 20 мин. Антацидная способность выше 23 мин, такая как 29-30 мин, например, также совершенно приемлема с точки зрения разработки вакцины, но такая высокая способность является чрезмерной. В частности, особенно рассматривается антацидная способность по меньшей мере 8 мин, по меньшей мере 10 мин, по меньшей мере 12 мин. Подходит антацидная способность по меньшей мере 12 мин, по меньшей мере 13 мин, по меньшей мере 14 мин, по меньшей мере 15 мин, по меньшей мере 16 мин. Известно, что желудок маленьких детей, которые не ели в течение трех часов, имеет очень кислую среду, и что такой кислый рН отрицательно влияет на ротавирус. В экспериментах автора изобретения при работе с препаратом маленького объема, который является желательным, невозможно было измерить антацидную способность классических фосфатсодержащих препаратов, поскольку растворимость фосфата легко превышалась и наблюдалась кристаллизация компонентов во время приготовления и/или кратковременного хранения. В противоположность этому, заявленные композиции неожиданно продемонстрировали приемлемую, но более высокую антацидную способность даже в меньшем дозовом объеме, по сравнению с фосфатсодержащими препаратами из уровня техники.

В другом конкретном воплощении указанная жидкая иммуногенная композиция является стабильной при по меньшей мере одном из следующих условий: в течение 7 суток при 37°С, в течение одного года при 4°С, в течение 18 месяцев при 4°С, в течение двух лет при 4°С. Согласно настоящему изобретению, стабильность данной композиции определяется путем измерения вирусного титра (т.е. стабильности вируса) согласно методике, изложенной в примере ΙΙΙ.1, после хранения препарата в течение определенного периода времени при данной температуре. Стабильность композиции может быть определена с помощью ускоренного теста на стабильность, например, после хранения препарата в течение одной не

- 9 012046 дели при 37°С. Стабильность композиции может быть альтернативно определена в течение более длительного периода времени, такого как в течение нескольких месяцев, или при температуре холодильной камеры (от 2 до 7°С, типично при 4°С), или при комнатной температуре (20-22°С). В этих условиях стабильной композицией является композиция, которая имеет максимальное снижение ротавирусного титра 1, выраженное в 1од₁₀ БОЕ/дозу при определенных условиях тестирования. Особенно подходящие композиции представляют собой композиции, в которых происходит снижение максимум на 0,5 1од₁₀, например 0,4 или меньше, 0,3 или меньше, 0,2 или меньше или предпочтительно 0,1 1од₁₀ БОЕ на дозу вакцины в ускоренном тесте на стабильность при 37°С в течение одной недели.

Альтернативно, жидкая иммуногенная композиция, как заявлено в данном изобретении, может быть заморожена и может храниться в замороженном состоянии при -20°С или ниже, или при -70°С в течение нескольких лет, и оставаться стабильной при 4°С в течение по меньшей мере одного года после оттаивания. Типично, замороженный препарат будет стабильным в течение по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 2 лет или по меньшей мере 3 лет и будет оставаться стабильным при 4°С в течение по меньшей мере одного года, предпочтительно 18 месяцев или 2 лет после оттаивания.

Композиция по настоящему изобретению представляет собой иммуногенную композицию, например вакцину. Например, заявленная иммуногенная композиция способна, обычно после одной, предпочтительно двух доз с интервалом в один или два месяца, вызывать иммунный ответ, например превосходное приживление вакцины (уассте 1аке) и сывороточный, специфический к ротавирусу 1дА-ответ. Приживление вакцины определяют как процент субъектов, демонстрирующих или серологический ответ, например появление сывороточного фА к ротавирусу в сыворотках после иммунизации при титре не менее 20 ед./мл (ЕЫБА), и/или как шеддинг ротавируса (ЕЫБА) в любом образце испражнений. Приживление вакцины может быть определен как шеддинг вакцинного вируса в любом образце испражнений, собранном между первой дозой и вплоть до 1-2 месяцев после второй дозы. В конкретном воплощении вакцина по изобретению способна снижать распространение любого, и предпочтительно тяжелого, ротавирусного гастроэнтерита по сравнению с плацебо. Типично, данная вакцина способна обеспечивать перекрестную защиту против иных, чем те, которые присутствуют в вакцине, циркулирующих штаммов. Типично, когда вакцина содержит штамм 01-типа, такой как штамм аттенуированного человеческого вируса Р43, тогда иммунный ответ индуцируется к 01 и по меньшей мере одному из не-О1 серотипов, выбранных из группы, состоящей из 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 610, 011, 012, 013 и 014 серотипов. Предпочтительно, вакцина, содержащая штамм 01, способна обеспечивать защиту как против 01, так и не-01 штаммов, таких как штаммы 02, 03 и/или 04, и, в частности, против распространенного во всем мире серотипа 09.

В конкретном воплощении указанный гастроэнтерит или тяжелый гастроэнтерит вызван ротавирусным штаммом другого серотипа, чем тот, который содержится в заявленной композиции. В частности, если ротавирусный штамм, присутствующий в заявленной композиции, представляет собой серотип 01, такой как, но не ограничиваясь этим, живой аттенуированный штамм ротавируса человека НКУ Р43 (ЕСАСС 99081301), то обеспечивается профилактика против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусным штаммом 01-серотипа, а также ротавирусным штаммом не-01 серотипа, например ротавирусным штаммом, имеющим серотип, выбранный из перечня, состоящего из 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 010, 011, 012, 013 и 014. В конкретном воплощении иммуногенная композиция, заявленная в данном изобретении, способна индуцировать иммунный ответ и/или обеспечивать защиту против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного по меньшей мере одним, предпочтительно всеми из следующих не-01 серотипов: 02, 03, 04 и 09. В другом конкретном воплощении, если ротавирусный штамм, присутствующий в заявленной композиции, представляет собой ротавирус Р[8] типа, такой как, но не ограничиваясь этим, живой аттенуированный штамм ротавируса человека НКУ Р43 (ЕСАСС 99081301), то обеспечивается профилактика против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусным штаммом Р[8] типа и не-Р[8] типа, например ротавирусным штаммом, имеющим серотип, выбранный из перечня, состоящего из Р1, Р2, Р3, Р4, Р5, Р6, Р7, Р9 и Р11 типов. В частности, иммуногенная композиция, заявленная в данном изобретении, способна индуцировать иммунный ответ и/или обеспечивать защиту против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного по меньшей мере одним, предпочтительно всеми из следующих не-Р[8] типов: Р4, Р6. В другом воплощении заявленная композиция способна индуцировать иммунный ответ и/или обеспечивать защиту против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусным штаммом другого 0типа и другого Р-типа, чем тот, который присутствует в композиции для введения. Конкретно, заявленная композиция содержит ротавирусный штамм 01Р[8], а также способна индуцировать иммунный ответ и/или обеспечивать защиту против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусным штаммом 02Р[4].

Предпочтительно, композицию по изобретению вводят пероральным путем. Предпочтительно композиция поставляется в однодозовом устройстве, таком как стеклянная или пластмассовая ампула или шприц, подходящая(ий) для доставки маленьким детям.

- 10 012046

Вакцины по изобретению могут быть приготовлены и введены известными способами с использованием подходящего количества живого вируса для обеспечения эффективной защиты против ротавирусной инфекции без значительных вредных побочных эффектов в типичных вакцинах.

Соответственно, в настоящем изобретении предложен способ получения жидкого антиротавирусного препарата или иммуногенной композиции, как раскрыто в данном описании, включающий смешивание ротавирусного антигена, сахара и карбоксилата с фармацевтически приемлемым разбавителем.

Подходящее количество живого вируса будет обычно составлять от 10⁴ до 10⁷ БОЕ на дозу. Типичная доза вакцины может содержать 10⁵-10⁶ БОЕ на дозу и может даваться в нескольких дозах в течение некоторого периода времени, например, в двух дозах, которые дают с двухмесячным интервалом. Ротавирусный титр также может выражаться в ССГО50, и в контексте данного изобретения можно оценить, что ССГО50 10^6,0 эквивалентно БОЕ 10^5,5 на дозу. Однако преимущества могут быть получены при использовании более чем 2 доз, например схемы из 3 или 4 доз, особенно в развивающихся странах. Первую дозу предпочтительно можно давать детям в возрасте от 4 недель до 14 или 15 недель, предпочтительно в возрасте от 6 до 14 недель. Интервал между дозами составляет по меньшей мере 4 недели, но может составлять более или менее двух месяцев, например для второй дозы, и любая последующая доза, если это целесообразно, может даваться через один месяц или три месяца после предыдущей дозы, в зависимости от местного графика иммунизации. Оптимальное количество живого вируса для однократной дозы или для схемы с введением многократных доз и оптимальное время для введения доз могут быть определены стандартными исследованиями, включающими наблюдение за титрами антител и другими ответами у субъектов.

Типично, объем дозы вакцины по изобретению будет обычно составлять 2,5 мл или меньше, типично от 0,5 до 2,5 мл. В конкретном аспекте изобретения подходящая вакцинная доза будет обычно составлять 1,5 мл или предпочтительно любой объем меньше 2,5 мл, такой как объем 2 мл или меньше, который подходит для перорального введения грудным детям или детям младшего возраста. В частности, дозовый объем будет таким, чтобы стало возможным техническое осуществление препарата и не было вреднего воздействия на иммуногенный потенциал препарата. Заявленные композиции дают преимущество над фосфатсодержащими препаратами из уровня техники, поскольку они могут выдерживать кислотность желудочного сока, остаются иммуногенными и стабильными в течение длительного срока хранения и в то же время совместимыми с препаратом в меньшем, чем обычно, дозовом объеме, таком как меньше 2,0 мл или даже предпочтительно 1,5 мл или меньше. Типично, объем дозы вакцины по изобретению составляет от 0,5 до 2,0 мл, предпочтительно приблизительно от 1,0 до 1,5 мл, такой как приблизительно 1,3 мл, или приблизительно 1,4 мл, или приблизительно 1,5 мл. Типичный дозовый объем может также составлять 2 мл или меньше, такой как, например, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 или 1,5 мл. Объемы 1 мл или объемы меньше чем 1 мл, например от 200 до 800 мкл, также рассматриваются в пределах объема настоящего изобретения. Объем жидкости, который может быть введен перорально, может быть также частично определен устройством для доставки вакцины.

Иммуногенная композиция по изобретению может быть также приготовлена таким образом, чтобы содержать другие антигены, в частности антигены из других подходящих живых вирусов, для защиты против других заболеваний, например полиовирусных. Указанные дополнительные активные ингредиенты, подходящие для перорального введения, можно давать либо в смеси с антиротавирусной композицией, либо, альтернативно, можно совместно вводить (т.е. в отдельной дозе, но тогда же) с антиротавирусной композицией, заявленной в данном изобретении.

Заявленную композицию можно давать также параллельно с другими непероральными вакцинами, например с парентеральными вакцинами, подходящими для вакцинированной педиатрической популяции, такими как вакцины ΩΤΡ\ν или ИТРа (вакцины против Вогбе!е11а рег1икк1к - судорожный кашель, дифтерия, столбняк), вакцины против менингита, индуцированного НаеторШик тПиепха В, гепатита В, или кори, паротита, краснухи (ММК от англ. теак1ек, титрк, гиЬе11а), вакцины против §!гер!ососсик рпеитошае, для того, чтобы оптимизировать количество визитов к врачу.

В другом воплощении в изобретении также предложен способ лечения или предупреждения ассоциированных с ротавирусом заболеваний у людей, особенно у маленьких детей, таких как грудные дети или дети младшего возраста, путем введения указанному человеку-субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества жидкого препарата, в частности, иммуногенной композиции или вакцины, заявленной в данном изобретении. В частности, заявленные композиции будут предотвращать ротавирусные инфекции. В конкретном воплощении композиции, заявленные в данном изобретении, способны обеспечивать защиту против ротавирусного гастроэнтерита, в частности против тяжелого гастроэнтерита. Тяжелый гастроэнтерит определяют как случай, требующий госпитализации и/или регидратационной терапии (эквивалентна плану Б или В ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения)) в медицинском учреждении, или случай с баллом более 11 по 20-бальной шкале Весикари (Киикка Т апб Уеыкап Т. К.о!ауиик Лкеаке ίη Ρίηπίκΐι сЫИгеп: ике оГ питег1са1 ксогек Гог кеуегйу оГ б1аггйеа1 ер1кобек. §сапб 1 !пГес( Όίκ 1990, 22:259-67).

В еще одном воплощении в изобретении предложено применение ротавирусного антигена, карбоксилата и сахара в изготовлении иммуногенной композиции, например вакцины, для лечения или преду

- 11 012046 преждения ассоциированных с ротавирусом заболеваний у людей, где указанная иммуногенная композиция имеет рН от рН 5,0 до рН 8,0 и содержит менее 5 мМ фосфата. В частности, особенно рассматривается профилактика ротавирусных инфекций и/или защита против гастроэнтерита и более предпочтительно против тяжелого гастроэнтерита.

В другом конкретном воплощении в изобретении также предложено применение живого аттенуированного ротавируса человека для изготовления иммуногенной композиции, заявленной в данном изобретении, для лечения или предупреждения заболеваний, ассоциированных с ротавирусом, не вызывающих инвагинации кишечника. В частности, указанное лечение или предупреждение включает введение двух пероральных доз, или более, безопасного и эффективного количества композиции живого аттенуированного ротавируса человека ребенку в возрасте от 4 до 14 или 15 недель во время приема дозы 1. Типично, ребенок будет находиться в возрасте от 6 до 14 недель во время приема первой дозы. В контексте настоящего изобретения подразумевают, что человеческий ребенок представляет собой ребенка в возрасте от 4 до 14 или 15 недель после рождения.

В другом воплощении в изобретении также предложена жидкая иммуногенная композиция, содержащая ротавирусный антиген, сахар, фосфат и карбоксилат, где указанная композиция имеет рН от примерно 5,0 до примерно 8,0, и где указанный карбоксилат выбран из перечня, состоящего из: адипата, малата, ацетата, пропионата, бутирата, малоната, глутарата, гликолята, глюконата, пимелата и любой комбинации двух или более из них. В конкретном воплощении указанный карбоксилат представляет собой адипат. Типично фосфат будет присутствовать в концентрации от 10 мМ до 1 М. Автор настоящего изобретения обнаружил, что эти конкретные карбоксилаты, которые не были связаны с разработкой пероральных вакцинных препаратов, удовлетворяют всем желаемым требованиям стабильности, кислотоустойчивости, иммуногенности и приготовления препарата в маленьком дозовом объеме, как изложено в настоящем описании, для разработки подходящей пероральной антиротавирусной вакцины для человеческих детей. В частности, указанные карбоксилаты не оказывают вредного воздействия на титр ротавируса в препарате. Эти карбоксилаты могут в достаточной степени действовать в качестве альтернатив традиционным карбоксилатам, таким как сукцинат, глутамат и цитрат, например, в фосфатсодержащих антиротавирусных препаратах. Все другие конкретные воплощения, описанные выше, в равной степени относятся к этому аспекту настоящего изобретения. Типично, диапазон рН композиции является таким, как определено в данном описании, как и антацидная способность и стабильность при хранении. В изобретении также предложен способ получения указанной композиции, применения и способы предупреждения или лечения человеческих детей с использованием указанной композиции.

Изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.

Пример I. Препарат живой аттенуированной человеческой антиротавирусной жидкой вакцины 1) в отсутствие добавленного фосфата и карбоксилата, и 2) в присутствии цитрата в качестве карбоксилата в отсутствие добавленного фосфата.

1.1. Приготовление препаратов.

1.1.1. Состав среды ΌΜΕΜ (для приготовления 1 л ΌΜΕΜ):

Вода для инъекции: 0,8 литра

Растворяют последовательно следующие соединения:

Хлорид натрия. 6,40 г

Хлорид калия: 0,40 г

Сульфат магния-7 Н₂О: 0,20 г

Добавляют раствор нитрата железа в концентрации 0,1 г/л: 1,00 мл №Н₂РО₄ 2 Н₂О·. 0,1412 г

Пируват натрия: 0,11 г

Глюкоза безводн.: 4,50 г

Раствор витаминов (концентрированный 500х): 2,00 мл

Вода для инъекции: 1,50 мл

Соляная кислота (концентрированная): 0,083 мл

Ь-Цистин: 0,048 г

Ь-Тирозин: 0,072 г

Вода для инъекции: 2,00 мл

Раствор аминокислот: 20,00 мл

Б-Глутамин: 0,5846

Хлорид кальция-2Н₂О: 0,2649 г

Бикарбонат натрия: 3,70 г

Вода для инъекции: вплоть до 1 литра

- 12 012046

ΌΜΕΜ составляет 5, 6 или 8% препаратов, подробно описанных в примере II. Это соответствует конечной концентрации фосфата 0,059, 0,071 и 0,094 мМ соответственно и конечной концентрации пирувата 0,065, 0,078 и 0,104 мМ соответственно.

Раствор витаминов (концентрированный 500х):

Вода для инъекции: 80,00 л

Фолиевая кислота: 200,10 г

Пантеноат кальция: 200,10 г

Холина хлорид: 200,10 г

Инозит: 350,00 г

Никотинамид: 200,00 г

Пиридоксина хлоргидрат: 200,10 г

Тиамина хлоргидрат: 200,10 г

Рибофлавин: 20,002 г

Вода для инъекции: вплоть до 100 литров.

Раствор аминокислот:

Вода для инъекции: 144,00 л ί-Аргинин: 755,70 г

Глицин: 270,10 г ί-Гистидин: 378,00 г ί-Изолейцин: 943,40 г ί-Лейцин: 943,50 г

Ь-Лизин-2 НС1:1315,80 г ί-Метионин: 270,00 г ί-Фенилаланин: 594,10 г ί-Треонин: 856,30 г ί-Триптофан: 144,00 д ί-Серин: 377,90 г ί-Валин: 842,00 г

Вода для инъекции: вплоть до 180 литров.

Раствор нитрата железа

Вода для инъекции: 1035,000 мл

Нитрат железа-9 Н₂О: 0,115 г

Вода для инъекции: вплоть до 1,150 литров

1.1.2. Приготовление антиротавирусных препаратов в отсутствие добавленного фосфата и карбоксилата.

Препарат 60, представленный в табл. 2, был приготовлен с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая.

Препарат 60.

К 143 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) добавляют 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае дозовый объем составляет 1,5 мл. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Результаты в отношении антацидной способности, первоначального вирусного титра и стабильности вируса показаны в табл. 2-4.

- 13 012046

Таблица 2

Дозовый объем 1,5 мл

№	Сахароза % масс./ масс.	ϋΜΕΜ % масс./ масс.	ВНР* рн при (=0	ВРК* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при (=0 (1одю Б(	Вирусный титр после 1 нед. 37’С ЭЕ на дозу в	Потеря вируса после 1 нед. 37”С акцины)
60	50,0%	6%	7,82	<1	6,3	5,4	0,9

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВВК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

Таблица 3

Дозовый объем 1,5 мл - стабильность вируса при комнатной температуре

№	Титрование вируса после хранения при комнатной температуре Додю БОЕ на дозу вакцины)
	1 м*	2 м*	Зм*	4 м*	5 м*	6 м*	7м*	8м*	9м*	Юм*
60	5,6	5,6	5,0	НО	НО	НО	НО	НО	НО	НО

* месяц(ы); НО - не определено.

Таблица 4

Дозовый объем 1,5 мл - стабильность вируса при 4°С

№	Титрование вируса пс (!од10 БОЕ на	еле хранения при 4°С дозу вакцины)
	Т=0	после 1 нед. 37°С	1 м* 4°С	2 м* 4°С	4 м* 4°С	6 м* 4°С	9 м* 4°С	12 м* 4°С
60	6,3	5,4	6,2	5,8	6,0	5,5	НО	НО

* месяц(ы); НО - не определено.

1.1.3. Приготовление антиротавирусных препаратов, содержащих карбоксилат.

Лимонную кислоту (когда присутствует) и цитратную соль смешивают в пропорциях и условиях, показанных в табл. 5 и 6. Стабильность ротавируса и антацидную способность препаратов измеряют согласно способам, представленным в примерах ΙΙΙ.1 и ΙΙΙ.2 соответственно.

Получили препараты 110-115 и 128-130. Объем дозы составлял 2,5 мл для препаратов 110-115 и

1.5 мл для препаратов 128-130. Препараты 110-115, представленные в табл. 5, были приготовлены с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 100 дозам по 2,5 мл (3,25 г) каждая.

Препарат 110 получали следующим образом. К 123,71 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 19,29 г тринатрия цитрата (Να₃ цитрат-2Н₂О, М\т 294) (соответствующих конечной концентрации 262 мМ) и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае однократный дозовый объем составляет

2.5 мл или 3,25 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере.

В этом примере среда ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас., что соответствует конечной концентрации фосфата 0,059 мМ.

Препараты 111-115 получают согласно методике, аналогичной той, которая описана для препарата 110, за исключением того, что используют количества ингредиентов, подробно описанные в табл. 5. Например, препарат 111 получили путем смешивания следующих ингредиентов: 123,73 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г), 19,07 г тринатрия цитрата (Να₃ цитрат-2Н₂О, М\т 294) (соответствующих конечной концентрации 259 мМ), 0,197 г лимонной кислоты (М\т 192) (соответствующих конечной концентрации 4 мМ) и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальную часть данной методики осуществляли как для препарата 110.

Результаты в отношении антацидной способности, первоначального вирусного титра и стабильности вируса показаны в табл. 5-8.

Таблица 5

Дозовый объем 2,5 мл

№	Лимонная кислота (М)	Ыа3 цитрат· 2НгО <М>	Сахароза % масс./ масс.	ϋΜΕΜ % масс./ масс.	внк· рН при 1=0	внк· время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1=0 (Ιορί0 БО	Вирусный титр после 1 нед. 37°С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед. 37°С закцины)
110	0	0,262	50%	6%	8,15	14	5,7	4,8	0.9
111	0,004	0,259	50%	6%	6,95	14	5,3	5,4	0

- 14 012046

112	0,010	0,256	50%	6%	6,51	12-13	5,6	5,6	0
113	0,014	0,249	50%	6%	6,34	12	5,6	5,4	0,2
114	0,034	0,283	50%	6%	5,94	12-13	5,6	5,3	0,3
115	0,093	0,333	50%	6%	5,37	14	5,7	5,6	0,1

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВЕК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

Препараты, представленные в табл. 6, были приготовлены с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: лимонная кислота-1Н₂О (М\с 210), №₃ цитрат-2Н₂О (М\т 294).

Препарат 128 был получен путем смешивания 110,89 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) со следующими ингредиентами: 31,78 г тринатрия цитрата (Να₃ цитрат-2Н₂О, М\т 294) (соответствующих конечной концентрации 432 мМ), 0,328 г лимонной кислоты (лимонная кислота· 1Н₂О, М\т 210) (соответствующих конечной концентрации 6 мМ) и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране.

В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере среда ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас., что соответствует конечной концентрации фосфата 0,059 мМ.

Препараты 129 и 130 были получены аналогично методике, описанной для препарата 128, путем адаптации количеств ингредиентов согласно табл. 6. Кратко, препарат 129 был получен путем смешивания 0,77 г лимонной кислоты (лимонная кислота· 1Н₂О, М\т 210) (соответствующих конечной концентрации 15 мМ) и 31,36 г тринатрия цитрата (Να₃ цитраъ2Н₂О (М\т 294) (соответствующих конечной концентрации 426 мМ). Препарат 130 был получен путем смешивания 2,75 г лимонной кислоты (лимонная кислота· 1Н₂О, М\т 210) (соответствующих конечной концентрации 52 мМ) и 34,7 г тринатрия цитрата (Να₃ цитраъ2Н₂О (М\т 294) (соответствующих конечной концентрации 472 мМ). Оставшаяся часть ингредиентов и пропорций приведена в табл. 6.

Таблица 6

Дозовый объем 1,5 мл

№	Лимонная кислота- 1Н2О (М)	Ыа3 цитрат 2НгО (М)	Сахароза % масс./ масс.	ОМЕМ % масс,/ масс.	вкк· рН при 1=0	Во- время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при (=0 (1одю БО	Вирусный титр после 1 нед. 37’С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед.37’С эакцины)
128	0,006	0,432	50,0%	6%	6,97	13	6,1	5,8	0,3
129	0,015	0,426	50,0%	6%	6,55	12	5,9	5,8	0,1
130	0,052	0,472	50,0%	6%	5,92	13	5,9	5,8	0,1

* определено с помощью теста Россетт-Раиса у грудных детей (ВЕК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

Таблица 7

Дозовый объем 1,5 мл - стабильность вируса при комнатной температуре

№	Титрование вируса после хранения при комнатной температуре
1 м*	2 м*	Зм*	(!одю БОЕ на дозу вакцины)
4 м*	5 м*	6 м*	7м*	8м*	9м*	Юм*
128	НО	НО	НО	НО	5,4	5,1	НО	НО	НО	НО
129	НО	НО	НО	НО	5,4	5,0	но	НО	НО	НО
130	НО	НО	НО	НО	5,6	5,0	но	НО	НО	НО

* месяц(ы); НО - не определено.

Таблица 8

Дозовый объем 1,5 мл - стабильность вируса при 4°С

№	Титрование вируса после хранения при 4°С (!одю БОЕ на дозу вакцины)
	Т=0	после 1 нед. 37°С	1 м* 4°С	2 м* 4°С	4 м* 4°С	6 м* 4“С	9 м* 4°С	12 м* 4°С
128	6,1	5,8	НО	НО	НО	5,8	НО	5,7
129	5,9	5,8	НО	НО	НО	5,8	НО	5,6
130	5,9	5,8	НО	НО	НО	5,9	НО	5,4

* месяц(ы); НО - не определено.

- 15 012046

1.2 Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты.

Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере ΙΙΙ.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, приведенному в примере ΙΙΙ.2.

Результаты показаны в табл. 2-8.

рН для контрольного препарата 60, который не содержал карбоксилата и добавленного фосфата, не имел антацидной способности и дополнительно демонстрировал рН, приближающийся к верхнему пределу рН 8,0 для стабильности вируса.

Для всех экспериментальных препаратов, протестированных в табл. 5-8, рН поддерживали в диапазоне примерно 5,0-7,0, за исключением препарата 110, который демонстрировал рН выше 8,0. Как можно видеть из результатов в отношении вирусного титра и потери вируса, стабильность ротавируса в жидком препарате связана с рН этого препарата. В диапазоне от примерно рН 5,4 (т.е. препарат 115) до рН 7,0 (т.е. препараты 111 и 128), потеря вируса через 7 суток при 37°С удерживалась на низком уровне (т.е. ниже 0,5 1од), и это отличалось от результата, полученного для препарата 110 (рН >8, со снижением вирусного титра на 0,9 1од).

Кроме того, препараты 111-115 и 128-130 продемонстрировали похожую антацидную способность, что и препарат 110, при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей (см.пример ΙΙΙ.2.2). Эта антацидная способность намного превышала нижний предел 8 мин для препаратов с дозовым объемом 2,5 мл, а также 1,5 мл, и фактически достигала минимального значения 12 мин и поэтому считалась весьма удовлетворительной.

Альтернативные карбоксилаты также были протестированы, поскольку они могут представлять техническое осуществление альтернативных вариантов, когда могут быть желательными относительно низкие количества карбоксилатов, например, при работе с очень маленькими дозовыми объемами.

Примеры препаратов, содержащие такие альтернативные карбоксилаты, приведены в примере ΙΙ и табл. 10-39.

Пример ΙΙ. Препараты с альтернативной карбоксилатной солью в отсутствие добавленного фосфата.

Следующие карбоксилатные соли были использованы для создания буферной способности: ацетат, малонат, сукцинат, глутарат, адипат и малат. В соответствии с рК_а заданной карбоновой кислоты и в зависимости от ее молекулярной массы можно найти количества, которые необходимо добавить в препарат для достижения целевой антацидной способности по меньшей мере 8 мин, предпочтительно по меньшей мере 12 мин при определении с помощью теста ВЕК, в то время как окно рН составляет от рН 5,0 до рН 8,0.

С химической точки зрения, буферный эффект получают при смешивании сильной кислоты (подобной НС1) и соли, происходящей из слабой кислоты (подобной ацетату натрия). Значение рН, соответствующее середине буферного плато, равно рКа слабой кислоты. рКа карбоновой кислоты является показателем кислотной силы, другими словами, индикатором эффективного диапазона буферного действия данного соединения.

Поскольку ротавирус быстро разрушается при рН ниже 4 (С. \Уе155 апб Н.Р. С1агк, 1985 I Сеп. νίτο1., 66, 2725-2730), желательно буферное плато выше рН 4, т.е. предпочтительны карбоксилаты с рК_а больше 4 или дикарбоксилаты со средним рК_а больше 4. Подходящие карбоксилаты приведены в табл. 9. Приведены цифровые средние значения рКа.

Таблица 9

Характеристики различных карбоксилатов

Карбоновые кислоты	М№	ρΚ,ι	рКа2	рКаЗ	Средний рКа	Токсичность (Юйо перорально, у крыс)
Лимонная*	192	6,39	4,76	3,13	4,76	3,0 г/кг
Другие карбоновые кислоты с рКа > 4
Пропионовая*	74	4,88				2,6 г/кг
Масляная	88	4,82
Уксусная*	60	4,76				3,3 г/кг
Дикарбоновые кислоты со средним рКа > 4
Малеиновая	116	6,23	1,92		4,07
Малоновая	104	5,7	2,83		4,26	1,31 г/кг
Янтарная	118	5,6	4,21		4,90	2,26 г/кг
Адипиновая*	146	5,4	4,43		4,91	5,7 г/кг
Глутаровая	132	5,22	4,34		4,78
Яблочная*	134	5,05	3,40		4,22	1,6 г/кг

* Пять карбоновых кислот имеют статус пищевой добавки: лимонная Е330, уксусная Е260, пропионовая Е280, яблочная Е296 и адипиновая Е355.

Стандартная кривая кислотно-основного титрования для четырех карбоксилатов (малата натрия, ацетата натрия, цитрата натрия и адипата натрия) показана на фиг. 1. Показано, что полезная антацидная

- 16 012046 способность от рН 4,0 до рН 7,0, например, составляет 72,50, 68,75, 57,70 и 41,25% для адипата натрия, ацетата натрия, цитрата натрия и малата натрия соответственно.

Препараты были получены со следующими карбоксилатами: ацетатом, малонатом, сукцинатом, глутаратом, адипатом и малатом. Все препараты, представленные в этом примере, были получены в дозовом объеме 1,5 мл.

ΙΙ.1. Препараты с ацетатом.

ΙΙ.1.1. Препараты, представленные в табл. 10, были приготовлены с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: Уксусная кислота (Μ\ν 60), №ЮН (Μ» 40).

Препарат 36.

К 148,84 г воды (количество, достаточное для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 10,66 г №ЮН. ледяную уксусная кислоту вплоть до рН 7,16 и 130 г сахарозы (40% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях к данному раствору добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса, для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Препараты 37 и 42.

Методику осуществляют, как для препарата 36, но количества скорректированы согласно табл. 10.

Препарат 87.

К 75,00 г воды последовательно добавляют 8,00 г №ОН, 15,00 г ледяной уксусной кислоты, достаточное количество 1 н. раствора №ЮН для достижения рН 7,00 (в этом случае добавляли 2 г 1 н. №ОН), дополнительное количество воды для достижения достаточного количества 325 г (в этом случае добавляли 43,00 г воды) и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальную часть данной методики осуществляют, как для препарата 36.

Пример для препаратов 88-90.

Методику осуществляли, как для препарата 87, за исключением того, что используют количества, упомянутые в табл. 10.

Пример для препаратов 33-35.

Методику осуществляли, как для препарата 36, за исключением того, что использовали количества, упомянутые в табл. 10, и №ЮН заменяли на Са(ОН)₂. Препараты 33-35 не были включены в исследование кратковременной стабильности из-за отклонения в тесте на стабильность в течение 1 недели при 37°С.

Удовлетворительные результаты в присутствии дополнительных ионов кальция представлены, однако, в адипатной серии (см. пример 11.5.4 и табл. 26).

Таблица 10

№	ΝβΟΗ (М)	Уксусная кислота (М)	Сахарозе % масс./ масс.	ЭМЕМ % масс./ масс.	ВРР* рН при 1=0	ВНР* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при (=0 (!одю БС	Вирусный титр после 1 нед. 37’С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед. 37’С эакцины)
36	1,07	вплоть Дорн 7,16	40%	6%	7,2/ 7,23“	13/14’	5,8	5,3	0,5
37	1,07	ДорН 7,55	50%	6%	7,62/ 7,63“	13/15	5,8	5,4	0,4
42	1,05	до рН 7,7	50%	6%	8,06/ 8,03“	15/16	5,9	5,1	0,8
87	до рн 7,0	1	50%	6%	7,24	13	6,2	6,1	0,1
88	ДО рН 6,5	1	50%	6%	6,7	13	5,8	5,9	0
89	ДО рН 6,0	1	50%	6%	6,14	12	5,9	5,5	0,4
90	ДО рН 6,0	1	55%	6%	6,10	13	6,0	5,5	0.5
	Са(ОН);
33	0,540	вплоть ДО рН 7,32	40%	6%	7,66	12	5,8	4,3	>1
34	0,540	вплоть ДорН 7,55	45%	6%	8,09	13	5,9	<3,8	>1
35	0,540	вплоть ДорН 7,35	50%	6%	7,76	13	6,3	<3,8	>1

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2; ° - повторы.

- 17 012046

ΙΙ.1.2. Препараты, представленные в табл. 11, были приготовлены с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: Ацетат натрия-3Н₂О (Мте 136).

Пример для препарата 58.

К 113,00 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 30,00 г ацетата натрия-3Н₂О и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях к данному раствору добавляют 19,5 г среды ЭМЕМ. содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Препараты 59, 66, 69 и 70.

Методику осуществляют аналогично для препарата 58 с скорректированными количествами (см. табл. 11).

Таблица 11

№	Ацетат На- ЗН2О (М)	Сахароза % масс./ масс.	ОМ ЕМ % масс./ масс.	ВАР* рН при 1=0	ВАК* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1=0 (1од10 ВО	Вирусный титр после 1 нед. 37°С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед. 37°С !акцины)
58	0,882	50%	6%	7,98	11	6,3	5,6	0,7
59	0,706	50%	6%	7,94	7	6,2	5,4	0,8
66	0,941	54%	6%	8,13/ 8,14’	13	5,9	5,3	0,6
69	0,753	55%	6%	8,15	8	6,0	5,3	0,7
70	1,338	50%	6%	8,23	20	6,0	5,4	0,6

* как определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВВК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2; ° - повтор.

ΙΙ.1.3. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты.

Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере ΙΙΙ.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, приведенному в примере ΙΙΙ.2.2. Результаты показаны в табл. 10, 11, 12 и 13.

В заключение, стабильность ротавируса в жидком ацетатном препарате связана с рН. Подходящий рабочий диапазон составляет от рН 6,0 до 7,5.

Таблица 12

Стабильность вируса при комнатной температуре

№	Титрование вируса после хране (!ояю БОЕ на	ния при комнатной температуре дозу вакцины)
	1 м*	2 м*	3 м*	4 м*	5 м*	6 м*	7м*	8м*	9м*	10м*
36	5,8	5,2	4,7
37	5,8	5,5	5,3	5,0	5,0	4,4
42	5,2	5,4	5,1
87		6,0	5,9			5,6		5,3	5,3	4,7
88		5,9	5,6
89		5,2	4,7
90		4,8	4,6
58	5,6	5,4	4,9
59	5,7	5,5	4,9
66	5,8	5,4	5,5
69	5,9	5,5	5,5
70	5,9	5,5	5,4

* месяц(ы); пустые прямоугольники - параметры не определены.

- 18 012046

Таблица 13

Стабильность вируса при 4°С

№	Титрование вируса после хранения при 4°С (Ιοριο БОЕ на дозу вакцины)
	Т=0	после 1 нед. 37’С	1м’ 4°С	2 м* 4°С	4 М* 4’С	6 м* 4°С	9 М* 4°С	12 М* 4’С	15м* 4°С
36	5,8	5,3	5,8	5,8	5,6
37	5,8	5,4	5,9	5,8	5,8	5,7
42	5,9	5,1	5,9	5,7	5,7
87	6.2	6,1		6,3		6,1			6,1
88	5,8	6,0		6,0
89	5,9	5,5		5,8
90	6,0	5,5		5,7
58	6,3	5,6	6,2	5,8	6,0
59	6,2	5,4	6,2	5,7	6,0
66	5,9	5,3	5,9	5,8
69	6,0	5,3	6,0	5,9
70	6,0	5,4	6,0	5,9

* месяц(ы); пустые прямоугольники - параметры не определены.

ΙΙ.2. Препараты с малонатом.

ΙΙ.2.1. Препарат 67 (см. табл. 14) был приготовлен с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: малоновая кислота (Μ\ν 104), ΝαΟΗ (М^40).

Препарат 54 (см. табл. 14) был приготовлен с общим выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл (2,2 г) каждая. Антацидные вещества: малоновая кислота (Μ\ν 104), ΝαΟΗ (Μ\ν 40).

Препарат 67.

К 110,70 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 14,00 г ΝαΟΗ, 18,230 г малоновой кислоты и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Препарат 54.

К 16,64 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г ΝαΟΗ, 3,1213 г малоновой кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Таблица 14

N2	ЫаОН (М)	малоновая кислота (М)	Сахароза % масс./ масс.	ОМЕМ % масс./ масс.	ВНР* рН при 1=0	вин* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1=0 (1од10 БО	Вирусный титр после 1 нед. 37°С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед 37°С эакцины)
67	1,4	0,701	50%	6%	6,53	11-12	6,0	5,7	0,3
54	1,71	0,857	44%	6%	8,36	23	оо	00	оо

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

°° Препарат 54 исключили из исследования долговременной стабильности, так как его первоначальный рН был выше 8,0.

ΙΙ.2.2. Препарат, представленный в табл. 15, был приготовлен с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 147,7 дозам по 1,75 мл (2,20 г) каждая. Антацидное вещество: динатрия малонат (Μ\ν 148).

Препарат 62.

К 138,50 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 23,00 г динатрия малоната и 144,00 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях к данному раствору добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для

- 19 012046 получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,20 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Таблица 15

№	Малонат Ыа (М)	Сахароза % масс./ масс.	ЦМЕМ % масс./ масс.	ВИН* рН при 1=0	ВИН* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1=0 (1одю БС	Вирусный титр после 1 нед. 37°С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед. 37С акцины)
62	0,601	44%	6%	8,21	12	6,1	5,0	0,9

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

ΙΙ.2.3. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты.

В заключение, стабильность ротавируса в жидком малонатном препарате связана с рН: рН 6,5 дает хорошую стабильность в течение 1 недели при 37°С, тогда как при рН 8,2 наблюдается более чем 0,9 1од потери.

ΙΙ.3 Препараты с сукцинатом.

ΙΙ.3.1. Препарат 127 (см. табл. 16) был приготовлен с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: янтарная кислота (Мл 118), №ЮН (Мл 40).

Препарат 51 (см. табл. 16) был приготовлен с выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл (2,2 г) каждая. Антацидные вещества: янтарная кислота (Мл 118), №ЮН (Мл 40).

Препарат 127.

К 120,16 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 9,10 г №ОН, 13,74 г янтарной кислоты и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Препарат 51.

К 16,22 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г №ОН, 3,5414 г янтарной кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ЭМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Таблица 16

№	ИаОН (М)	Янтарная кислота (М)	Сахароза % масс./ масс.	ОМЕМ % масс./ масс.	ВРЯ* рН при (=0	ВРЯ* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1=0 (1од10 БО	Вирусный титр после 1 нед. 37°С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед. 37°С закцины)
127	0,91	0,466	50%	6%	6,33	9	5,9	5,7	0,2
51	1,71	0,857	44%	6%	7,20	>29	°°		°°

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

^оо Препарат 51 исключили из исследования долговременной стабильности, поскольку его антацидную способность определяли слишком долго.

ΙΙ.3.2. Препарат 56 представлен в табл. 17 и приготовлен с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: динатрия сукцинат (Мл 162).

Препарат 56.

К 122,50 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 20,50 г динатрия сукцината и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 62. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Таблица 17

№	Динатрия сукцинат (М)	Сахароза % масс./ масс.	ϋΜΕΜ % масс./ масс.	ВРЯ* рН при 1=0	вяк* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1=0 (1од10 БС	Вирусный титр после 1 нед. 37’С Е на дозу е	Потеря вируса после 1 нед. 37’С акцины)
56	0,506	50%	6%	8,12/ 8,30°	13	6,3	5,5	0.8

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2; ° - повтор.

- 20 012046

ΙΙ.3.3. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты.

В заключение, стабильность ротавируса в жидком сукцинатном препарате связана с рН: рН 6,3 дает хорошую стабильность в течение 1 недели при 37°С, тогда как при рН 8,1 наблюдается 0,8 1од потери.

ΙΙ.4. Препараты с глутаратом.

ΙΙ.4.1. Препараты с глутаратом представлены в табл. 18.

Препарат 65 был приготовлен с общим выходом 320,8 г (246 мл), соответствующим 164 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: глутаровая кислота (Мге 132), №1ОН (Мге 40). К 114,1 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 320,8 г) последовательно добавляют 9,3 г №ОН. 15,40 г глутаровой кислоты и 162,5 г сахарозы (50,6% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ЭМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6,08% мас./мас.

Препарат 50 был приготовлен с общим выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл (2,2 г) каждая. Антацидные вещества: глутаровая кислота (Мге 132), №1ОН (Мге 40). К 15,8 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г №ОН, 3,964 г глутаровой кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ЭМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Препараты 125 и 126 были приготовлены с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: глутаровая кислота (Мге 132), №1ОН (Мге 40).

Препарат 125.

К 100,35 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 9,10 г №ОН, 15,40 г глутаровой кислоты и 162,5 г сахарозы. Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примере ЭМ ЕМ составляет 6% мас./мас.

Препарат 126.

Методику осуществляли, как для препарата 125, но с скорректированными количествами (см. табл. 18).

Таблица 18

№	ЫаОН (М)	Глутаровая кислота (М)	Сахароза % масс./ масс.	ϋΜΕΜ % масс./ масс.	ВНЕГ рН при (=0	ВКЕГ время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при ΐ=0 (!одю ВО	Вирусный титр после 1 нед. 37°С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед. 37°С вакцины)
125	0,910	0,467	50%	6%	6.17	10-11	5,8	5,7	0,1
65	0,945	0,474	50,6%	6%	6,49	11	6,0	5,6	0,4
126	0,950	0,467	50%	6%	8,13	12	6,1	5,4	0,7
50	1,71	0,858	44%	6%	8,45	>29	<90		ОО

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

^оо Препарат 50 исключили из исследования долговременной стабильности из-за его первоначального рН (выше 8,0) и его антацидной способности (определяемой слишком долго).

ΙΙ.4.2. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты.

В заключение, стабильность ротавируса в жидком глутаратном препарате связана с рН: рН 6,17 дает хорошую стабильность в течение 1 недели при 37°С, тогда как при рН 8,1 наблюдается 0,7 1од потери.

ΙΙ.5. Препараты с адипатом.

ΙΙ.5.1 Адипатсодержащие препараты, представленные в табл. 19, были приготовлены с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая, за исключением препарата 45, который был получен с выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл (2,2 г) каждая, и препарата 63, который был получен с выходом 320,8 г (247 мл), соответствующим 164 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: адипиновая кислота (Мге 146), №1ОН (Мге 40).

Препарат 45.

К 15,38 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г №ОН, 4,3809 г адипиновой кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ЭМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

- 21 012046

Препарат 63.

К 112,50 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 320,8 г) последовательно добавляют 9,3 г ΝαΟΗ, 17,00 г адипиновой кислоты и 162,5 г сахарозы. После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6,08% мас./мас.

Препарат 81.

К 116,70 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 9,28 г ΝαΟΗ, 17,00 г адипиновой кислоты и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Препараты 82, 83, 91-97, 100-109, 122-124, 131-134, 136-145, 147, 148.

К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют ΝαΟΗ, адипиновую кислоту и сахарозу в количествах, приведенных в табл. 19 и 23. После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Полученную смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Некоторые параметры, показанные жирным шрифтом в табл. 19, варьировали для тестирования эффективности полученных препаратов в отношении антацидной способности и стабильности вируса.

Таблица 19

№	ЫаОН (М)	Адипиновая кислота (М)	Сахароза % масс./ масс.	ОМ ЕМ % масс./ масс.	ВПК* рН при 1=0	ВКК‘ время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1=0 (1одю 6С	Вирусный титр после 1 нед. 37’С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед. 37’С вакцины)
45	1,71	0,857	44%	6%	7,29	>29	00
Эффект % сахара
63	0,945	0,472	50,6%	6%	6,49	12	6,0	5,6	0,4
81	0,917	0,460	50%	6%	6,2	11-12	5,9	5,7	0,2
82	0,899	0,451	45%	6%	6,39	11-12	5,9	5,7	0,2
83	0,928	0,466	55%	6%	6,38	12	5,9	5,8	0,1
Препараты с разной антацидной способностью
91	0,71	0,358	50%	6%	6,37	8	6,0	5,7	0,3
92	0,925	0,464	50%	6%	6,24	11-12	6,0	5,7	0,3
93	1,100	0,553	50%	6%	6,5	15-16	6,1	5,8	0,3
94	1,324	0,664	50%	6%	6,11	19-20	5,9	5,8	0,1
Три повтора
95	0,928	0,466	55%	6%	6,3	12	6,0	5,9	0,1
96	0,928	0,466	55%	6%	6,55	12-13	6,1	6,0	0,1
97	0,928	0,466	55%	6%	6,3	12-13	5,9	5,8	0,1
Эффект рН
103	вплоть ДО рН 5,09	0,466	55%	6%	4,94
104	0,610	0,466	55%	6%	4,94	00	00	00	00
105	0,69	0,466	55%	6%	5,15	6	5,8	5,5	0,3
106	0,928	0,466	55%	6%	6,09/ 6,10’	12	6,1	6,0	0,1
107	0,928	0,466	55%	6%	оо	12	00	00	оо
108	0,69	0,630	53,15%	6%	оо	00	оо	00	04
109	0,69	0,630	55%	6%	00	00	00	00	00
131	0,93	0,466	55%	6%	6,45	12	но	но	НО
132	0,94	0,466	55%	6%	6,76	13	6,1	5,8	0,3
136	0,94	0,463	55%	6%	9,36	00	00	ОО	00

- 22 012046

137	0,94	0,460	55%	6%	9,37	00	оо	оо	ОО
138	0,94	0,457	55%	6%	9,67	00	оо	оо	00
139	0,94	0,455	55%	6%	9,92	ОО	ОС»	оо
140	0,94	0,452	55%	6%	”10,25	ОС	оо	О0	00
141	0,93	0,466	55%	6%	00	00	оо	00	оо
142	0,93	0,471	55%	6%	00	оо	оо	оо	00
145	0,93	0,463	55%	6%	7,66/ 7,55°	13	6,1	5,8	0,3
144	0,93	0,460	55%	6%	7,73/ 7,80°	12-13	6,1	6,0	0,1
143	0,93	0,458	55%	6%	7,96/ 7,90°	13-14	6,0	5,5	0,5
124	0,95	0,466	55%	6%	9,48	13	5,9	<2,85	>3
Различные источники коммерческого адипата
122	0,92	0,466	55%	6%	6,36	12	6,0	5,9	0,1
123	0,92	0,466	55%	6%	6,32	13	5,8	5,7	0,1
Различные источники коммерческой сахарозы
133	0,92	0,466	55%	6%	6,34	13	5,8	5,8	0
147	0,92	0,466	55%	6%	6,32	11-12	6.0	5,7	0,3
134	0,92	0,466	55%	6%	6,34	13	6,3	5,6	0,5
148	0,92	0,466	55%	6%	6,34	11-12	5,8	5,9	0

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (БЯК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2; НО - не определено; ° - повтор.

^оо Препарат 45 исключили, поскольку определение антацидной способности было слишком долгим.

^оо Препараты 103, 104 и 108, 109 исключили, поскольку адипиновая кислота перекристаллизуется при стоянии при 4-8°С.

^оо Препараты 107, 141 и 142 исключили, поскольку они аналогичны препарату, уже находящемуся на апробации.

^оо Препараты 136-140 исключили, поскольку первоначальный рН был слишком высоким.

ΙΙ.5.2. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты.

Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере ΙΙΙ.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, приведенному в примере ΙΙΙ.2.2. Результаты показаны в табл. 19, 20, 21 и 22.

Таблица 20 Стабильность вируса при комнатной температуре

№	Титрование вируса после хране (Ιοριο БОЕ на	ния при комнатной температуре дозу вакцины)
1 м*	2 м*	3 м*	4 м*	5 м*	6 м*	7м*	8м*
63	5.8	5,8	5,5	5,5	5,0
81		5,5				4,9
82		5,4				4,9
83		5,6				5,1	5,0
91		5,6			5,4	5,3	5,0
92		5,5			5,3	5,2	5,0
93		5,6			5,5	5,5	5,2	4,9
94		5,6			4,6
95		5,6		5,5	5,4	5,4	5,4	5,1
96		5,8		5,8	5,5	5,7	5,7	5,2
97		5,7		5,5	5,4	5,3	5,4	4,9
105					4,8
106						5.2	4,7
132				5,8	5,8	5,5

* месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено.

- 23 012046

Стабильность вируса при 4°С

Таблица 21

№	Титрование вируса после хранения при 4°С (!од,о БОЕ на дозу вакцины)
Т=0	после 1 нед. 37°С	1 М* 4’С	2 м* 4’С	4 м* 4°С	6 М* 4°С	9 м* 4°С	12 м* 4°С	15м* 4°С
63	6,0	5,6	6,0	5,9	6,1	6,0		5,8
81	5,9	5,7		5,6		5,4		6,0
82	5,9	5,7		5,7		5,4		5,8
83	5,9	5,8		5,8		5,7		5,9
91	6,0	5,7		5,8		5,8		5,8
92	6,0	5,7		5,9		5,9		5,8
93	6,1	5,8		5,7		6,1		5,7
94	5,9	5,8		6,1		6.2		5,8
95	6,0	5,9		5,9		5,8		5,8	5,9
96	6,1	6,0		5,7		5,9		5,9	5,8
97	5,9	5,8		5,7		5,8		5,8	5,9
105	5,8	5,5				5,9		5,7
106	6,1	6,0				6,0		5,8
132	6,1	5,8				5,8		5,8
122	6,0	5.9				5,8		5,9
123	5,8	5,7				5,9		5,8
133	5,8	5,8				6,0		5,8
134	6,3	5,8				6,0		5,7
143	6,0	5,5						5,5
144	6,1	6,0						5,4
145	6,1	5,8						5,4

* месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено.

Антацидную способность препаратов 91-94 измеряли с помощью способа Россетт-Райса у грудных детей (см.пример III.2.2) и показали возможность достижения 8, 12, 16, или 20 мин при рН больше 4. Результаты показаны в табл. 22 и на фиг. 2А.

Таблица 22

Время (мин)	Препарат 94	Препарат 93	Препарат 92	Препарат 91
рН	рН	рН	РН
0	6,11	6,5	6,24	6,37
1	5,11	5,07	4,93	4,79
2	5,03	4,98	4,84	4,67
3	4,96	4,9	4,75	4,56
4	4,90	4,83	4,67	4,45
5	4,85	4,76	4,58	4,34
6	4,79	4,69	4,51	4,23
7	4,74	4,62	4,42	4,12
8	4,68	4,56	4,34	4,00
9	4,63	4,49	4,26	3,86
10	4,57	4,42	4,17	3,70
11	4,51	4,36	4,08
12	4,46	4,29	3,98

- 24 012046

13	4,40	4,22	3,87
14	4,35	4,15	3,75
15	4,29	4,07	3,6
16	4,23	3,98
17	4,17	3,88
18	4,11	3,78
19	4,05	3,66
20	3,98
21	3,91
22	3,83
23	3,75
24	3,65

В заключение, как наблюдалали для других карбоксилатных препаратов, в адипатной серии высокое значение рН не дало данных о хорошей стабильности (смотри, например, препарат 124, который имеет рН 9,5 и демонстрирует более чем 2,85 1од потери вируса после 1 недели хранения при 37°С).

Максимальное приемлемое предельное значение рН составляет примерно 8,0 (смотри, например, значение рН 7,96, полученное для препарата 143), для которого наблюдается потеря вируса 0,5 1од после 1 недели при 37°С.

Подходящий диапазон рН для этих препаратов составляет от примерно рН 5,5 до примерно рН 8, с наиболее подходящим диапазоном от рН 6,0 до 7,7.

Адипатный (пищевая добавка) препарат обеспечивает хороший компромисс с оптимальными значениями рК_а (рК_а1 5,4 и рК_а2 4,43), которые позволяют достичь целевой антацидной способности (например, (=12 мин) с использованием допустимых количеств вещества (примерно 100 мг на дозу). Кроме того, эти количества совместимы с параметрами растворимости, обеспечивая при этом приготовление вакцины в дозовом объеме 1,5 мл. Это невозможно с классическими цитрат-фосфатными препаратами из-за технической неосуществимости, такой как кристаллизация фосфата (см. сравнительный пример IV). Они также совместимы с параметрами токсичности, поскольку данные по токсичности довольно низкие (пероральная ЬЭ50 у крыс: 5,7 г/кг) для адипата по сравнению с другими карбоксилатами.

ΙΙ.5.3. Эффект вирусного титра в вакцинной дозе на стабильность вируса.

Следующий эксперимент осуществляли для оценки эффекта первоначального ротавирусного титра (10^6,0, 10^6,5, 10^5,2) в вакцинной дозе 1,5 мл на стабильность ротавируса.

Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере III. 1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, представленному в примере Ш.2.2. Результаты показаны в табл. 23, 24, и 25.

Таблица 23

№	№ОН (М)	Адипиновая кислота (М)	Целевой вирусный титр 1одю БОЕ	Сахароза % масс./ масс.	вкк* рН при 1=0	ВВР* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1=0 (1одю БО	Вирусный титр после 1 нед. 37’С Е на дозу е	Потеря вируса после 1 нед.37*С акцины)
100	0,928	0,466	6,0	55%	6,59	12	6,0	5,7	0,3
101	0,928	0,466	6,5	55%	6,96	12	6,7	6,5	0,2
102	0,928	0,466	5,2	55%	6,45	12	5,4	5,4	0

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно примеру Ш.2.2.

Таблица 24

Стабильность вируса при комнатной температуре

№	Титрование вируса после хранения при комнатной температуре (!очто БОЕ на дозу вакцины)
	1 м*	2 м*	3 м*	4 м*	5 м*	6 м*	7м*	8м*	9м*	Юм*
100					5,4	5,0
101					6,0	5,5
102					4,9	4,4

* месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено.

- 25 012046

Таблица 25 Стабильность вируса при 4°С

№	Вирусный титр при 1=0	Вирусный титр после 1 нед. 37°С	1 м*	2 м*	3 м*	4 м*	6 м*	12 м*
100	6,0	5,7					6,0	5,8
101	6,7	6,5					6,6	6,4
102	5,4	5,4					5,3	5,2

* месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено.

В заключение, в оцененном диапазоне стабильность ротавируса остается аналогичной и приемлемой, какой бы ни был первоначальный вирусный титр.

П.5.4. Препараты с адипатом в присутствии ионов кальция.

Сообщили, что кальций может влиять на стабильность и конформацию ротавирусного 8Л11 гликопротеина УР7, экспрессирующегося в Οίοίνοδίοΐίιιιη б18С01беит (К.К. ЕтШс с1 а1., 1996, 1оита1 о£ Βίο1се1то1оду 50,149-159). Добавление ионов кальция к адипатсодержащему антиротавирусному жидкому препарату по изобретению может быть полезным, поскольку они могут способствовать стабилизации ротавируса в данном препарате. Соответственно, были протестированы различные количества ионов кальция в адипатном препарате (табл. 26). Протестировали два альтернативных варианта: СаС1₂ и Са(ОН)2.

Препараты 98, 116-118.

К 9,28 г ΝαΟΗ последовательно добавляют воду (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г), 17,00 г адипиновой кислоты, СаС1₂, как указано в табл. 26 (происходит осаждение, но осадок снова растворяется после одного часа перемешивания при комнатной температуре, за исключением препарата 117), и 178,75 г сахарозы. Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 82. В этом препарате ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Препарат 99.

К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют Са(ОН)₂, как указано в табл. 26,17,00 г адипиновой кислоты, 9,02 г №1ОН и 178,75 г сахарозы. Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 82. В этом препарате ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас. Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере ΙΙΙ.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, приведенному в примере ΙΙΙ.2.2. Результаты показаны в табл. 26, 27 и 28.

Препараты 119-121.

К СаС1₂, как указано в табл. 26, последовательно добавляют воду (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г), 9,28 г №1ОН (в этом случае происходит осаждение Са(ОН)₂, но осадок снова растворяется после добавления адипиновой кислоты, за исключением препарата 121), 17,00 г адипиновой кислоты и 178,75 г сахарозы. Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 82. В этом препарате ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Таблица 26

№	ИаОН (М)	Адипиновая кислота (М)	СаС1г (М)	Захарозг % масс./ масс.	ВИК* рН при (=0	вкк* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1=0 (1одю БС	Вирусный титр после 1 нед, 37”С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед. 37°С гакцины)
98	0,928	0,466	0,013	55%	6,59	12-13	6	5,8	0,2
118	0,928	0,466	0,004	55%	6,96	12	6,1	5,8	0,3
116	0,928	0,466	0,0129	55%	6,45	12	5,9	5,8	0,1
119	0,928	0,466	0,0132	55%	6,36	12	5,9	6	0
117	0,928	0,466	0,018	55%	«О	ое	«О	ОО	00
120	0,928	0,466	0,019	55%	6,18	11-12	6	5,8	0,2
121	0,928	0,466	0,051	55%	00	00	00	оо	оо

			Са(ОН)2 (М)
99	0,902	0,466	0,0086	55%	6,54	13-14	5,8	5,7	0,1

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ΒΒΚ), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

^оо Препараты 117 и 121 исключили, поскольку во время их получения осаждалось некоторое количество нерастворимого вещества.

- 26 012046

Таблица 27

Стабильность вируса при комнатной температуре

№	Титрование вируса после хранения при комнатной температуре (1одю БОЕ на дозу вакцины)
	1 м*	2 м*	Зм*	4 м*	5 м*	6 м*	7м*	8м*	9м*	Юм*
98					5,5	5,7	5,5	5,2
118					6,0	5,7				5,0
116					5,9	5,6				5,1
119					5,8	5,3
120					5,7	5,1
99					5,4	5,4	5,2	4,9

* месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено.

Таблица 28

Стабильность вируса при 4°С

Заключение: показана стабильность ротавируса в присутствии ионов кальция: после 1 недели при 37°С наблюдалась потеря не более чем 0,3 1од, что аналогично результату, полученному для препаратов, приготовленных в одних и тех же условиях и содержащих одни и те же ингредиенты, за исключением добавленных ионов кальция (см., например, препарат 83 в табл. 19-21).

ΙΙ.5.5 Препараты с адипатом в присутствии пероральных полиовирусов.

Некоторые рутинные схемы иммунизации могут объединить одновременно пероральные вакцинации против полно- и ротавирусов. Цель следующего эксперимента состояла в том, чтобы оценить, совместимы ли обе вакцинации. Поэтому получали экспериментальную пероральную объединенную вакцину против полио/ротавирусов.

Состав среды ОРУ (Ога1 Ройо Уйих), используемой для препаратов 149,151-155.

Вода для инъекции: 80,00 л

Лактальбумина гидролизат: 1500,00 г

Вода для инъекции: 200,00 л

Хлорид натрия: 2040,00 г

Хлорид калия: 120,00 г

Сульфат магния-7Н₂О: 30,00 г

КН₂РО₄: 38,00 г

Глюкоза безводн.: 1200,00 г

Неомицина сульфат: 15,00 г

Тм/ееп 80: 6,00 г

Хлорид кальция-2Н₂О: 80,00 г

Гидроксид натрия: 30,00 г

Бикарбонат натрия: 660,00 г

Феноловый красный: 6,00 г

I.-цистин: 30,00 г

Соляная кислота 1 н.: 550,00 г

Полимиксина В сульфат: 30,00 г

Вода для инъекции: вплоть до 300,00 л

Препараты 149-155.

К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют ЫаОН и адипиновую кислоту в количествах, указанных в табл. 29, и 178,75 г сахарозы. После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях и в соответствии с количествами, указанными в табл. 29, добавляли среду ОМЕМ, содержащую необходимое количество ротавируса для получения 10^6,5 ССГО50 на дозу и среду ОРУ, содержа

- 27 012046 щую необходимые количества полиовирусов для получения 10^6,6 типа Ι, 10^5,6 типа ΙΙ, 10^6,1 типа ΙΙΙ ССГО50 на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Полученную смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этих примерах ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас., сахароза составляет 55% мас./мас., №ОН составляет 0,92 М, адипиновая кислота составляет 0,466 М.

Таблица 29

	№ОН	Адипино- вая кислота	Вода	Среда ОМЕМ для ротавирусов	Ротавирус	Среда ΟΡν	ΟΡν типа I	ΟΡν типа II	ΟΡν типа III
	Г	г		г	г	г	г	г	Г
149	9,2	17	92,55	19,5		8,00	-	-
150	9,2	17	100,55	14,24	5,26	-	-	-	-
151	9,2	17	92,55	14,24	5,26	8,00	-	-
152	9,2	17	92,55	19,5	-	0,07	5,30	0,53	2,10
153	9,2	17	92,55	19,5	-	2,70	5,30	-	-

154	9,2	17	92,55	19,5	-	7,47	-	0,53	-
155	9,2	17	92,55	19,5	-	5,90	-	-	2,10

Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере ΙΙΙ.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, представленному в примере ΙΙΙ.2.2. Результаты показаны в табл. 30 (в этой таблице все вирусные титры в ССШ50/дозу* **).

Таблица 30

	ВКРГ мин	Целевой ротавирус	Целевой ОРУ типа I	Целевой ОРУ типа II	Целевой ορν типа III	Ротавирусный титр 1=0 4°С	Ротавирусный титр 1 нед. 37’С	Титр ορνι	Титр ОРУ II	Титр ορν III
149	12	нет	нет	нет	нет
150		Ю».=	нет	нет	нет	10°х
151		1О0Ь	нет	нет	нет	10в'й	ю“·3
152		нет	ю00	'юбД”	10ет				10йй	10й
153		нет	Ю0'0	нет	нет
154		нет	нет	105е	нет
155		нет	нет	нет	10й1

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВЕК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2.

** Можно оценить, что соответствие между БОЕ и ССШ50 составляет примерно 0,5 1од (например 10^6,0, выраженное в ССШ50, эквивалентно приблизительно 10^5,5, выраженному в БОЕ на дозу).

Пустые прямоугольники: не определено нет означают, что соответствующий вирус не был включен в формулу.

Выводы.

1) Среда для полиовирусов совместима с антацидной способностью (ВЕК 12 мин в препарате 149).

2) Среда для полиовирусов совместима с ротавирусом (сравнение препарата 150 с препаратом 151, где можно видеть, что для обоих препаратов получены одни и те же титры, как при !=0 (4°С), так и после одной недели при 37°С).

3) Антиротавирусная композиция совместима с полиовирусом (полученный ожидаемый полиовирусный титр в препарате 152).

ΙΙ.5.6 Стабильность адипатных препаратов в процессе замораживания.

ΙΙ. 5.6.1. Замораживание при -20°С.

Антиротавирусный препарат 95 после 6 месяцев хранения при температуре от +4 до +8°С подвергали 3 последовательным замораживаниям (-20°С) согласно следующему графику (табл. 31)

ΙΙ. 5.6.2. Замораживание при -70°С.

Антиротавирусный препарат 95 после 14 месяцев хранения при температуре от +4 до +8°С подвергали одному замораживанию при -70°С согласно следующему графику (табл. 31).

- 28 012046

Таблица 31

Продолжительность при -20‘С	Т=+4°С	Т=-20“С	Т=-70’С
1=0 (после 6 месяцев при 4-8°С)		9 ампул
1=120 суток	Обратно -20: 9 ампул
1=120 суток	3 ампулы: 1х-20°С	6 ампул
1=196 суток	Обратно -20: 6 ампул
1=197 суток	3 ампулы: 2х-20°С	3 ампулы
1=224 суток	Обратно -20: 3 ампулы: Зх -20°С
Продолжительность при -70°С
1=0 (после 14 месяцев при 4-8°С)			3 ампулы
(=15 суток	Обратно -70:3 ампулы 1х-70°С

Образцы анализировали и сравнивали с вирусным титром при ί=0 (4°С), а также с вирусным титром образцов с одинаковым сроком хранения при обычной температуре холодильной камеры (15 месяцев при +4°С в этом случае). Результаты показаны в табл. 32.

Таблица 32

	1=0, 4°С	(=15 месяцев, 4°С
№ 95	6,0	5,9

№ 95 1х-20°С		5,8
№ 95 2х-20°С		5,9
N8 95 Зх-20°С		5,9
№ 95 1х-70°С		5,9

В заключение, композиция препарата 95 (адипатный препарат) совместима с по меньшей мере 3 последовательными замораживаниями при -20°С. Она также совместима по меньшей мере с одним замораживанием при -70°С.

ΙΙ.6. Препараты с малатом в качестве карбоксилата.

ΙΙ.6.1. Препараты, представленные в табл. 33 (за исключением препаратов 46, 64, 84, 85 и 86), были приготовлены с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: Ό,Ό-яблочная кислота (Μν 146), №1ОН (Μν 40).

Препарат 46 был приготовлен с выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл (2,2 г) каждая. Антацидные вещества: Ό,Ό-яблочная кислота (Μν 146), №1ОН (Μν 40).

Препарат 46.

К 15,74 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г ЫаОН, 4,0211 г яблочной кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Препарат 64 был приготовлен с выходом 318,4 г (244,5 мл), соответствующим 163 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: О,Ь-яблочная кислота (Μν 146), №1ОН (Μν 40).

Препарат 84 был приготовлен с выходом 130 г (100 мл), соответствующим 66,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: Ό-яблочная кислота (Μν 146), ЫаОН (Μν 40).

Препарат 85 был приготовлен с выходом 130 г (100 мл), соответствующим 66,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества:

Ь-Яблочная кислота (Μν 146), ЫаОН (Μν 40).

Препарат 86 был приготовлен с выходом 130 г (100 мл), соответствующим 66,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: О,Ь-яблочная кислота (Μν 146), ЫаОН (Μν 40).

Препарат 64.

К 97,3 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 318,4 г) последовательно добавляют 14,6 г ЫаОН, 24,50 г яблочной кислоты и 162,5 г сахарозы (51% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6,12% мас./мас.

- 29 012046

Препарат 71.

К 103,9 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 14,90 г ЫаОН, 25,00 г адипиновой кислоты и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Препараты 72-77, 84-86: методику осуществляли, как для препарата 71, но с скорректированными количествами (см. табл. 33).

Препарат 78.

К 75,00 г воды последовательно добавляют 8,00 г ЫаОН, 25,00 г яблочной кислоты, достаточное количество 1 н. раствора ЫаОН для достижения рН 6,48, дополнительное количество воды для достижения 325 г и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Препараты 79 и 80.

Методику осуществляли, как для препарата 78, но с скорректированными количествами (см. табл. 33).

Таблица 33

N8	ЫаОН (М)	Яблочная кислота (М)	Захарове % масс./ масс.	ОМ ЕМ % масс./ масс.	ВАН* рН при 1=0	ВАА* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при ί=0 (1од50 60	Вирусный титр после 1 нед. 37’С Е на дозу	Потеря вируса после 1 нед.37°С закцины)
46	1,71	0,787	44%	6%	6,92	20	6,0	5,9	0,1
64	1,490	0,747	51%	6,12%	6,08	11-12	6,0	5,9	0,1
71	1,490	0,746	50%	6%	5,67	11	5,9	5,8	0,1
72	1,240	0,621	50%	6%	6,15/ 6,16°	8	5,8	5,8	0
73	2,00	0,918	50%	6%	00	•О О	00	оо	оо
74	1,490	0,746	53%	6%	5,19	8	5,8	5,8	0
75	1,490	0,746	56%	6%	00		00
76	1,79	0,896	47%	6%	5,21	14	5,7	5,8	0
77	1,79	0,896	44%	6%	5,35	15	5,8	5,9	0
78	ВПЛОТЬ до рН 6,48	0,746	50%	6%	7,1/ 7,05°	9	5,9	5,6	0,3
79	вплоть ДО рН 5,98	0,746	50%	6%	6,42/ 6,41°	9	5,9	5,5	0,4
80	вплоть ДО рН 7,05	0,746	50%	6%	7,43	9-10	6,0	5,4	0,6
86	1,490	0,746	50%	6%	5,82	11	6,1	5,8	0,3
84	1,490	0,746	50%	6%	5,82	11	5,8	5,8	0
85	1,490	0,746	50%	6%	6,03	11	5,7	5,7	0

Определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2; ° - повтор.

^оо Препарат 73 исключили из-за трудностей в процессе стерильной фильтрации из-за высокой вяз кости раствора.

^оо Препарат 75 исключили из-за медленного растворения сахарозы.

Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере ΙΙΙ.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, представленному в примере ΙΙΙ.2.2. Результаты показаны в табл. 33, 34 и 35.

Таблица 34

Стабильность вируса при комнатной температуре Титрование вируса после хранения при комнатной температуре

	1 м*	2 м*	3 м*	4 м*	5 м*	6 м*	7м*	8м*	9м*	Юм*
64	5,8	5,9	5,6	5,7	5,2	но	но	но	но	но
85	НО	5,7	5,2	НО	НО	4,7	но	но	но	но

* месяц(ы); НО - не определено.

- 30 012046

Таблица 35

Стабильность вируса при 4°С

№	Вирусный титр при (=0	Вирусный титр после 1 нед. 37’С	1 м*	2 м*	3 м*	4 м*	6 м*	12 м*
64	6,0	5,9	5,8	5,8	но	5,8	НО	5,5
85	5,7	5,8	НО	5,8	но	НО	5,6	5.7

* месяц(ы); НО - не определено.

ΙΙ.6.2. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты.

Стабильность ротавируса в жидком малатном препарате связана с рН. Диапазон рН, которые исследовали, т.е. диапазон рН от 6,0 до 7,0, дает хорошую стабильность в течение 1 недели при 37°С.

ΙΙ.7. Препараты с глутаматом.

Аспартат и глутамат представляют собой аминокислоты с карбоксилатной группой в их боковой цепи. Значения рК_а для этих карбоновых кислот боковой цепи составляют 3,65 и 4,25 соответственно. Таким образом, глутамат с рКа выше 4 может быть использован в качестве буфера для создания антацидной способности. См. табл. 36.

Препарат 41.

К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют ЫаОН, глутаминовую кислоту и сахарозу в количествах, указанных в табл. 36. После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ОМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Полученную смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Препарат 43.

К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 7,1 г мононатрия глутамата· 1Н₂О и 19,50 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях к данному раствору добавляют 2,64 г среды ЭМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Препарат 61.

К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 52,43 г мононатрия глутамата· 1Н₂О и 144 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях к данному раствору добавляют 19,5 г среды ОМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

Препарат 68.

К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 250 г) последовательно добавляют 0,2 г мононатрия глутамата· 1Н₂О, 2,5 г бычьего сывороточного альбумина, 0,250 г Ыа₂НРО₄^2Н₂О, 0,125 г КН₂РО₄, 0,5 г ЭДТА и 18,75 г сахарозы (7,5% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях к данному раствору добавляют 19,5 г среды ОМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или приближается к 1,5 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 7,8% мас./мас.

Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере ΙΙΙ.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, представленному в примере ΙΙΙ.2.2. Результаты показаны в табл. 36, 37 и 38.

Таблица 36

N8	Ν30Η (М)	Глутаминовая кислота (М)	Захарозё % масс./ масс.	□МЕМ % масс./ масс.	ВЕ?К рН при ΐ=0	ВРЯ* время при рН>4 (мин)	Вирусный титр при 1^0 (1од,0 БО	Вирусный титр после 1 нед. 37аС Е на дозу е	Потеря вируса после 1 нед. 37°С вакцины)
41	1,06	0,542	51%	6%	10,36	15	00	00
	глутамат Иа (М)
43	1,088	44%	6%	6,92	12	6,0 | 5,8	0,2

61	1,085	44%	6%	6,93	11-12	6,1	6,1	0
68	0,0043	7,5%	7,8%	6,85	<1	6,0	<3	>3

Определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно

- 31 012046 примеру ΙΙΙ.2.2.

^оо Препарат 41 исключили, поскольку его первоначальный рН был слишком высоким.

^оо Препарат 68 исключили из исследования долговременной стабильности из-за неудовлетворительного результата относительно потери вируса, полученного после 1 недели при 37°С.

Таблица 37

Стабильность вируса при комнатной температуре

Стабильность вируса при 4°С

№	Вирусный титр при 1=0	Вирусный титр после 1 нед. 37°С	1 м*	2 м*	18 м*
41
43
61	6,1	6,1	6,1	6,0	5,6
68

* месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено.

Стабильность ротавируса в жидком глутаматном препарате аналогична стабильности, полученной с другими карбоксилатами, описанными в данном изобретении выше.

Вкратце:

стабильность лучше при рН около 7 (6,93 в препарате 61), по сравнению с более щелочной средой (рН 10,36 в препарате 43), стабильность также лучше в высокой процентной концентрации сахарозы (44% сахарозы в препарате 61 по сравнению с 7,5% сахарозы в препарате 68), кривые профилей стабильности в течение 1 недели при 37°С, при комнатной температуре и при 48°С аналогичны для других карбоксилатов, описанных данном изобретении выше.

ΙΙ.8. Препараты с фумаратом.

Препарат 44.

К 16,28 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г ЫаОН, 3,4811 г фумаровой кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После одного часа перемешивания при комнатной температуре нерастворимое вещество остается в суспензии. Препарат исключили.

ΙΙ.9. Препараты с лактобионатом

Препарат 47.

К 16,02 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 1,2 г ЫаОН, 10,7414 г лактобионовой кислоты и 13,7 г сахарозы (31% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

ΙΙ.10. Препараты с малеатом.

Препарат 48.

К 16,88 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г ЫаОН, 2,8821 г малеинового ангидрида и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Препарат 57.

К 110,3 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 32,7 г динатрия малеата и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды ΌΜΕΜ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

- 32 012046

ΙΙ.11. Препараты с глюкуронатом.

Препарат 49.

К 16,14 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 1,2 г №ОН, 5,8211г глюкуроновой кислоты и 18,5 г сахарозы (42% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ОМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

ΙΙ.12. Препараты с галактуронатом.

Препарат 52.

К 16,14 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 1,2 г №ОН, 5,8218 г галактуроновой кислоты и 18,5 г сахарозы (42% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ОМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

ΙΙ.13. Препараты с галактаратом.

Препарат 53.

К 15,96 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г №ОН, 6,3008 г галактаровой кислоты и 17,0 г сахарозы (38% мас./мас.). После одного часа перемешивания при комнатной температуре нерастворимое вещество остается в суспензии. Препарат исключили.

ΙΙ.14. Препараты с тартратом.

Препарат 55.

К 15,26 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г №ОН, 4,4996 г винной кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды ОМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 10^6,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере ЭМЕМ составляет 6% мас./мас.

ΙΙ.15. Общее заключение о препаратах, содержащих карбоксилат в отсутствие добавленного фосфата.

Некоторые стабильные препараты были получены с разными карбоксилатами в отсутствие добавленного фосфата. Фосфат, присутствующий в этих экспериментальных препаратах, происходил только из буфера ЭМЕМ и никогда не превышал 0,059 мМ (5% мас./мас. ОМЕМ), 0,071 мМ (6% мас./мас. ЭМЕМ) или 0,094 мМ (8% мас./мас. ЭМЕМ). Все тестируемые карбоксилаты продемонстрировали способность действовать в качестве буферных агентов в нейтрализации кислотности желудочного сока, предупреждая или минимизируя таким образом инактивацию активного ингредиента, т. е. ротавирусного антигена, присутствующего в препарате. Все тестируемые препараты, приготовленные в различных дозовых объемах для введения (т.е. 1,5 мл, 2,0 мл и 2,5 мл), показали рН от примерно рН 5,0 до примерно рН 8,0, а для большинства препаратов рН от примерно рН 5,5 до примерно 7,5. Эти препараты продемонстрировали хорошую эффективность в процессе тестирования на стабильность при трех тестируемых температурах хранения (т.е. 37°С, комнатная температура или 4°С). Кроме того, эти препараты продемонстрировали удовлетворительную антацидную способность, т. е. антацидную способность по меньшей мере 8 мин, а для большинства препаратов по меньшей мере 12 мин при определении с помощью теста ВКК (см. методику в примере ΙΙΙ.2.2).

В нижеследующей табл. 39 представлено краткое резюме относительно данных по стабильности, полученных для выбранных адипатных препаратов, в соответствии с рН препарата. Оценивали следующие критерии: 1) потеря вируса после хранения в течение одной недели при 37°С (ускоренная стабильность) (*), 2) время, выраженное в месяцах, в течение которого снижение вирусного титра остается ниже 1,0 1од (после хранения при комнатной температуре) вместе с вирусным титром, достигнутым в упомянутый период времени (**), 3) вирусный титр в БОЕ/вакцинной дозе, достигнутый после хранения в течение одного года (12 месяцев) при 4°С (***).

- 33 012046

Таблица 39

	рН’	Потеря вируса после 1 нед. 37°С				Λ о -»· 3 О ’		4°С 12М
45% сахарозы
82	6,39	0,2			6М 4,9	5,8
50% сахарозы
63	6,49	0,4				5М 5,0		5,8
81	6,2	0,2				6М 4,9		6
55% сахарозы
124	9,48	>3				не делали
143	8	0,5	1			не делали		5,5			и
144	7,75	0,1				не делали		5,4	и		в
145	7,35	0,3				не делали		5,4
132	6,76	0,3				6М 5,5		5,8
96	6,55	0,1				8М 5,2		5,9
83	6,38	0,1				7М 5,0		5.9
95	6,3	0,1				8М 5,1		5,8
97	6,3	0,1				8М 4,9		5,8
106	5,97	0,1				6М 5,2		5,8
105	5,98	0,3				5М 4,8		5,7
104	5,12	0,2		кристалли М зуется
103	5,09	0,4		кристалли Ь зуется Н

М - месяцы;

$ - рН, как определено при Т=0 (4°С) с помощью теста ВКК согласно примеру ΙΙΙ.2.2;

* лучшие результаты теста на стабильность в течение 1 недели при 37°С - допускается максимальное снижение вирусного титра на 0,5 1од;

** лучшие результаты теста на стабильность при комнатной температуре - допускается максимальное снижение вирусного титра на 1,0 1од;

*** лучшие результаты теста на стабильность при 4-8°С - допускается максимальное снижение вирусного титра на 0,5 1од;

**** суммарные лучшие результаты - как снижение вирусного титра >0,5 1од, но <1,0 1од, так и снижение титра <0,5 1од допускаются, и то и другое приемлемо согласно этим критериям;

Серое затенение: приемлемый препарат для оцениваемых критериев (*, **, *** или ***) с потерей вируса <0,5 1од; заштрихованный прямоугольник: приемлемый препарат для оцениваемых критериев (*, **, *** или ***) с потерей вируса >0,5 1од, но <1,0 1од; черное затенение: неприемлемый препарат, поскольку происходит кристаллизация.

Очевидно, что в протестированных адипатных препаратах диапазон рН от примерно 6,0 до примерно 8,0 (6-8) продемонстрировал хороший, приемлемый профиль стабильности, совместимый с максимальным снижением вирусного титра на 1,0 1од, и субдиапазон рН от примерно 6,0 до 6,8 (6-6,8) хороший, приемлемый профиль стабильности, совместимый с максимальным снижением вирусного титра на 0,5 1од.

Пример ΙΙΙ. Способы.

ΙΙΙ.1. Титрование ротавируса.

Определение инфекционных ротавирусов осуществляют путем инкубации препарата, содержащего ротавирус и различные компоненты, на пермиссивных клетках МА104 (АТСС СКЬ 2378).

Ротавирус (например ротавирус Р43, ЕСАСС 99081301) приготавливали, как описано в примерах выше. После инокуляции вирусных образцов, клетки инкубируют в течение 16-18 ч. Затем клетки фиксируют и подвергают пермеабилизации ацетоном 80%. Инфицированные клетки идентифицируют с помощью непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител против ротавируса, специфичных в отношении белка УР6 (Μαό 9Е6), определяемых флуоресцеин-конъюгированным Ι§Ο и рассматриваемых под УФ микроскопом. Подходящими являются любые имеющиеся в продаже моноклональные антитела против ротавирусного белка УР6, и соответствующие рабочие разведения будут определяться рутинным экспериментированием. Например, подходящими являются следующие моноклональные антитела:

КУ 11-2 (Ι§62α. асцитная жидкость, конъюгированная с флуоресцеинизотиоцианатом) от фирмы Кига1 Тсе11по1од1С5 Ιηο (гегеге.гигаЙесЫис.сот);

5Е8 Е9 (Ι§Ο1, каталожный номер ΚνΜ-1601Α-5) или 2Е2 19 (Ι§Ο2ό, каталожный номер ΚνΜ1601В-5) от фирмы Аи8!га1 Вю1одюа18 (\у\у\у.аи51га1Ью1од1са15.со1п);

- 34 012046

МАВК10 (фракция !дС) от !ттипо1од1са1 апб Вюсйетюа1 (ехйухЫпх СтЬН (\\л\лу.аГхЬю.сот).

Поликлональные антитела против ротавирусного Vр6, например, АВ1129Е от фирмы Сйеткоп (\у\\'\у.сНет1соп.сот) также являются подходящими.

Каждый из флуоресцентных фокусов соответствует одному инфекционному вирусу. Титры выражаются как логарифм фокус-образующей единицы на мл (1од (БОЕ/мл)). Точность титрования вируса составляет около + или - 0,2 1од. Результаты титрования вируса в БОЕ/мл превращают в БОЕ/дозу согласно первоначальному объему дозы образца. Все данные, представленные в таблицах, даны в 1од по основанию 10(1о§1₀) БОЕ на дозу.

Хорошие результаты представляют собой результаты, в которых достигается уменьшение <0,5 1од в течение 1 недели при 37°С (ускоренный тест на стабильность). Препараты, которые демонстрируют потерю вируса 1 1од или выше, исключаются из последующего тестирования на стабильность.

Ш.2. Способ измерения антацидной способности: Титрование Россетт-Райса у грудных детей (ВИК).

Ш.2.1. Введение.

Тест титрования Россетт-Райса у грудных детей (ВКК) был модифицирован для популяции грудных детей относительно теста титрования Россетт-Райса, первоначально разработанного для взрослой популяции.

Титрование Россетт-Райса представляет собой хорошо известный тест, используемый в области антацидных средств (см. Ν.Ε. ЕоххеИ апб Мапоп Ь. К1се в Сайгоеп1его1оду, 1954 уо1ите 26 раде® 490-495: Ап т уйго еуа1иайоп оГ (Не еГПсасу оГ (Не тоге Ггес.|иеп11у нхеб агИаабх \νίΐ1ι рагйси1аг айепйоп 1о 1аЬ1е1х). В титровании Россетт-Райса измеряют скорость взаимодействия антацидного вещества в тесте с 0,1 н. соляной кислотой и продолжительность повышенного рН. Для имитации условий в пустом желудке свежую соляную кислоту добавляют непосредственно в начале измерения. Для имитации условий в желудке во время процесса пищеварения свежую соляную кислоту добавляют с постоянной скоростью в реакционную смесь при тестировании.

Кратко, титрование Россетт-Райса у взрослых разделено на две части:

первоначальное добавление 30 мл 0,1 н. НС1, что представляет кислотное содержание пищевого комочка в пустом желудке;

затем постоянное добавление со скоростью 4 мл/мин 0,1 н. НС1, что имитирует секрецию кислоты в желудке во время переваривания.

Они представляют собой экспериментальные условия, которые обычно считаются типичными для среднего взрослого желудка.

Ш.2.2. Анализ титрования Россетт-Райса у грудных детей.

Основываясь на стандартных условиях Россетт-Райса, описанных в оригинальной методике, данный тест адаптировали, чтобы имитировать желудок шестимесячного грудного ребенка, и обозначили ниже как анализ титрования Россетт-Райса (ВКК) у грудных детей.

Согласно научным таблицам Се1ду (том 1, с. 126, С1Ьа-Се1ду 1981, еб®), следующие данные представляют интерес, поскольку касаются выделения желудочной НС1 (см. табл. 40).

Таблица 40

	Основной выход кислоты		Максимальный выход кислоты
Дети	Средний	Экстремальный диапазон	Средний	Экстремальный диапазон
9-11 недель	0,149 ммоль/ч	0,05-0,30 ммоль/ч	0,56 ммоль/ч	0,39-0,84 ммоль/ч
6-7 месяцев	0,193 ммоль/ч	0.07-0,40 ммоль/ч	2,08 ммоль/ч	1,33-2,88 ммоль/ч

Итак, основываясь на этих данных, автор изобретения выбрал наиболее тяжелые состояния, чтобы охватить все ситуации.

Первоначальное количество НС1: 0,40 ммоль (4 мл 0,1 н. НС1).

Постоянное добавление количества 0,1 н. НС1: 2,90 ммоль/ч (или 0,048 ммоль/мин). Фактически используют скорость 0,5 мл/мин 0,1 н. НС1.

Схема экспериментальной установки для ВКК показана на фиг. 2Б.

Табл. 41 суммирует различие между ВКК по сравнению с оригинальной опубликованной методикой.

- 35 012046

Таблица 41

Название теста:	Россетт-Райса	Россетт-Райса у грудных | детей
Ссылка	- Саз1гоеп1его!оду 1954 νοΙ. 26 радев 490-495. - смотри также Антацидный тест в Фармакопее	- Неопубликованные данные 65К - Значения скоростей секреции желудочной НС1 для грудных детей взяты из научных таблиц Эе1ду (1981) том 1, с. 126.
Применение для:	Взрослые	6-месячные грудные дети
Температура, используемая во время теста	37°С	37°С
Объем химстакана	400 мл	50 мл
Первоначальный объем воды	70 мл	8.5 мл, если антацидный образец составляет 1,5 мл 8,0 мл, если антацидный образец составляет 2,0 мл 7.5 мл, если антацидный образец составляет 2,5 мл
Количество антацидного средства	Эквивалентно 0,330 гА12О3	Варьирует согласно тестируемому образцу и дозовому объему; обычно от 0,8 до 1,8 миллиэквивалента НС1
Первоначальное количество 0,1 н. НС1, добавленное при (=0	30 мл	4 мл
Скорость добавления дополнительной 0,1 н. НС1 во время измерения	4 мл/мин	0,5 мл/мин
Измерение времени	рН=3	рН=4
для достижения рН:
Типичные результаты	3-4 часа выше рН 3	8-20 мин выше рН 4

ΙΙΙ.2.2.1. Рабочая методика для анализа ВКК.

Экспериментальная установка представлена на фиг. 2Б.

1. Используя 50 мл химстакан, добавляют в него достаточное количество воды для инъекции для того, чтобы иметь после стадии 4 (ниже) конечный объем жидкости 10 мл.

2. Ставят химстакан в водяную баню.

3. Регулируют температуру водяной бани, чтобы получить 37°С в химстакане.

4. Образец антацидного средства, подлежащий измерению, добавляют в химстакан.

5. Измерение значения рН на этой стадии представляет собой первоначальный рН (1=0 в данной таблице).

6. Добавляют сразу же 4 мл 0,1 н. НС1 (0,40 ммоль) и одновременно включают часы и запускают насос (постоянное добавление 0,5 мл/мин 0,1 н. НС1). Все три действия должны происходить в пределах первых 5 с от начальной точки отсчета времени.

7. Регистрируют значения рН во времени до тех пор, пока не получат рН 4. По выбору оператора, снижение рН можно продолжать до тех пор, пока не получат рН 3 (как в оригинальном способе РоссеттРайс), но релевантные значения антацидной способности регистрируют после того, как достигнут рН 4.

8. Останавливают часы и насос.

ΙΙΙ.2.2.2. Представление экспериментальных данных.

Экспериментальные данные представлены в таблице, например, см. табл. 22, из которой графическое представление можно быть бгаетп: например, см. фиг. 2А.

ΙΙΙ. 2.2.3. Интерпретация результатов.

Ротавирус разрушается, будучи помещен при рН ниже 4. Для того чтобы затем сохранить вирус, рассматривают время выше рН 4. Результат титрования Россетт-Райса у грудных детей выражается в единицах времени (минуты). Это время, в течение которого значение рН измеряли выше 4, т. е. так назы

- 36 012046 ваемая антацидная способность препарата. В некоторых случаях регистрируют два значения (например, 11-12 мин, как для препарата 92 в табл. 22, где при 11 мин рН составлял 4,08, а при 12 мин рН составлял 3,98, что указывает на то, что временной интервал при рН 4,00 был ближе к 12 мин, чем к 11 мин).

ΙΙΙ.2.2.4. Калибрование.

Температуру измеряют откалиброванным термометром (шкала от -10 до +50°С). рН-метр калибруют, используя стандартные буферы при рН 7 и рН 4, которые имеются в продаже.

Мощность насоса регулируют путем измерения объема относительно времени, для того чтобы получить 0,5 мл/мин. Перистальтический насос представляет собой 8-вальцовую модель от БтаЮс 8.А. Μοάе1 Μ8-Яед1ο. Во избежание образования капель, конец трубки размещают вдоль стенки химического стакана выше уровня жидкости.

Соляная кислота 0,1 н. представляет собой коммерческий стандартный раствор для титрования.

Для проверки экспериментальной установки перед анализом неизвестных антацидных образцов используют известный стандартный буферный раствор. Этот стандартный буферный раствор приготавливают из 24,066 г тринатрияфосфата додекагидрата (продукт Μе^ск № 1.06578.1000), растворенного в достаточном количестве воды с получением 1 литра раствора. Типично, 10 мл этого раствора будут давать рН 9,0, имеющий место между минутами 6 и 7 (первый фосфатный скачок рН), и рН 4,0, имеющий место между минутами 19 и 20 (второй фосфатный скачок рН) в этой описанной установке для титрования Россетт-Райса у грудных детей. Результаты показаны в табл. 42.

Таблица 42

		10 мл №3РО4-12Н2О при 24,066 г/литр	10 мл воды
		Нет антацидного средства
	Время (мин)
		рН	рн
	0	12,4	5,94
	1	11,7	1,31
	2	11,58	1,23
	3	11,44	1,18
	4	11,27	1,14
	5	11,02	1,11
первый скачок рН	6	10,6	1,10
7	8,86	1,07
	8	7,95	1,05
	9	7,6	1,03
	10	7,38	1,01
	11	7,19	0,99
	12	7,03	0,98
	13	6,88	0,97
	14	6,74	0,96
	15	6,58	0,95
	16	6,41	0,95
	17	6,21	0,94
	18	5,93	0,93
второй скачок рн	19	5,45	0,92
20	3,47	0,91
	21	2,88	0,90
	22	2,62	0,89
	23	2,44	0,88
	24	2,3	0,87
	25	2,18	0,87
	26	2,09	0,86
	27	2,01	0,86
	28	1,93	0,86
	29	1,87	0,85
	30

ΙΙΙ.3. Измерение коэффициента преломления данного препарата.

Некоторые препараты, описанные в настоящем изобретении, приготовлены в маленьком объеме (дозовый объем 1,5 мл, например, и ниже), содержат высокую концентрацию сахарозы (например 55%) и еще должны удовлетворять требованиям стабильности и антацидной способности. Поэтому может быть важной проверка того, что препарат был успешно приготовлен и что было достигнуто полное растворение каждого компонента. Один простой способ сделать это состоит в том, чтобы измерить коэффициент преломления препарата. Коэффициент преломления представляет собой общеизвестное простое измерение, которое может быть использовано как на стадии карбоксилатного буфера (перед добавлением ротавируса), так и на стадии конечного препарата (после добавления ротавируса).

ΙΙΙ.3.1. Способ.

Коэффициент преломления водных растворов является стандартным способом определения концентрации сахарозы в растворе. Таблицу значений коэффициента преломления в зависимости от концентраций сахарозы можно найти в справочнике СНешМгу апб Рйуыск 70¹¹' ебйюп 1989-1990 СВС Рге§8 раде Ε 386.

При использовании автоматизированного рефрактометра с оптическим указателем модели СРВ 11

- 37 012046

37, каплю раствора помещают в данный прибор и регистрируют коэффициент преломления. Воду используют в качестве стандарта для проверки прибора (коэффициент преломления 1,3330).

Некоторые адипатные препараты, содержащие различные количества сахарозы, были получены и подвергнуты измерению коэффициента преломления. Делали повторное измерение.

ΙΙΙ.3.2. Результаты.

Результаты этих измерений показаны на фиг. 3А и 3Б. В заключение, в интервале протестированных концентраций существует линейная корреляция между концентрациями сахара и других растворимых ингредиентов и измеренным коэффициентом преломления.

Например, в препарате 95 после полного растворения ингредиентов на стадии карбоксилатного буфера (перед добавлением ротавируса) будет получено значение коэффициента преломления 1,4578 (составляет 58,5% мас./мас. в этом случае); тогда как на стадии конечного препарата (после добавления ротавируса или добавления 6% мас./мас. ЭМЕМ в случае плацебо препарата) будет получен коэффициент преломления 1,4480 (целевая концентрация сахарозы составляет 55% мас./мас. в этом случае). В обоих случаях значения измеренного коэффициента преломления выше, чем значения, полученные только для 58,5% (коэффициент преломления 1,4385) или 55% (коэффициент преломления 1,4307) сахарозы в водном растворе, что указывает на вклад в коэффициент преломления других ингредиентов буферного препарата.

ΙΙΙ.3.3. Заключение.

Таким образом, измерение коэффициента преломления можно использовать, чтобы быстро проверить, во время технологического процесса, полное растворение всех добавленных ингредиентов препарата.

Пример ГУ. Препарат с цитрат-фосфатным буфером - сравнительный пример.

ТУ.1. Получение препаратов (табл. 43 и 44).

Таблица 43

N9	ЫаН2 РО. 2НгО (М)	Ма2 НРО*· 2Н2О (М)	№. цитрат 2НгО (М)	Сахароза % масс./ масс.	ОМЕМ % масс./ масс.	вив· рН при 1=0	вяя* Время при рН>4 мин	Вирусный титр при 1=0 (1од,.э БОЕ	Вирусный титр после 1 нед. 37’С на дозу в	Потеря вируса после 1 нед. 37”С зкцины)
дозовый объем введения 2,5 мл	- концентрация фосфата = 0,390 М
1	0,195	0,195	0,135	50%	3,33%	6,66	9	5,9	5,4	0,5
2	0,195	0,195	0,135	50%	5%	6,65	10	5,8	5,4	0,4
3	0,195	0,195	0,135	50%	8%	6,67	9	5,6	5,3	0,3
4	0,195	0,195	0,135	45%	3,33%	6,67	10	5,8	5,3	0,5
5	0,195	0,195	0,135	40%	3,33%	6,69	11	5,8	5,5	0,3
6	0,195	0,195	0,135	30%	3,33%	6,71	10	5,7	5,5	0,2
7	0,195	0,195	0,135	20%	3,33%	6,75	11	5,6	4,1	1,5
8	0,195	0,195	0,135	45%	8%	6,69	12	5,7	5,4	0,3
9	0,195	0,195	0,135	40%	8%	6,70	12	6.1	5,6	0,5
10	0,195	0,195	0,135	30%	8%	6,72	11	6,1	5,4	0,5
11	0,195	0,195	0,135	20%	8%	6,73	11	6,1	4,4	1,7
дозовый объем введения 2 мл -	концентрация с	иэсфата = 0,488 М**
17	0,244	0,244	0,162	50%	6%	6,68	10	5,7	5,5	0,2
объем введения 1,5 мл	- концентрация фосфата = 0,650М*‘
12	0,325	0,325	0,216	40%	6%	о®	00	ОО	О»	00
13	0,325	0,325	0,216	40%	8%	оо	00	ОО	ОО	00
14	0,325	0,325	0,216	40%	10%	о®	©О	ОО		°°
15	0,325	0,325	0,216	45%	6%	00	©о	ОФ	©0	ОО
16	0,325	0,325	0,216	45%	8%	00	ОО	ОО	ОО	ОО

* определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВКК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2;

** Это эквивалентно 0,390 М в дозовом объеме 2,5 мл.

^оо Препараты 12-16 исключили, поскольку происходила перекристаллизация при стоянии при 4-8°С.

- 38 012046

Таблица 44 Уменьшенное количество фосфата в дозовом объеме 1,5 мл

N2	Ν3Η2 РОд 2Н2О (М)	№2 НРО4· 2Н2О (М)	Чаэ цитрат 2Н2О (М)	Сахароза % масс./ масс.	□МЕМ% масс/ масс.	рН при 1=0	вкн$ Время при рН>4 мин	Вирусный титр при 1=0 (1од1О БОЕ	Вирусный титр после 1 нед. 37°С на дозу ва	Потеря вируса после 1 нед. 37°С кцины)
ДОЗОВЫЙ 0 (0,450 Мд	бъем введения 1,5 мл - уменьшенное количество фосфата ля препаратов 25-29)*·
25	0,225	0,225	0,285	40%	6%	6,69	12	6,2	5,8	0,4
26	0,225	0,225	0,285	40%	8%	Происходит кристаллизация - данные не доступны
27	0,225	0,225	0,285	40%	10%	6,67	12	6,2	6,0	0,2
28	0,225	0,225	0,285	45%	6%	Происходит кристаллизация - данные не доступны
29	0,225	0,225	0,285	45%	8%	6,69/ 6,72°	12/ 12-13°	6,1	6,1	0
ДОЗОВЫЙ О (0,0085 М	бъем введения 1,5 мл для препаратов 30-32	- уменьшенное количество фосфата 38-40)***
30	0,00424	0,00424	0,438	40%	6%	7,75	12-13	6,2	5,3	0,8
31'	0,00424	0,00424	0,438	45%	6%	7,9	13	6,1	5,8	0,3
32’	0,00424	0,00424	0,438	50%	6%	7,76	13-14	6,0	5,7	0,3
38	0,0042	0,0042	0,435	45%	6%	7,76	14	5,7	5,2	0,5
39	0,00424	0,00424	0,446	50%	6%	7,74	14	5,6	5,3	0,3
40	0,0043	0,0043	0,448	54%	6%	7,73	15	5,6	5,4	0,2
дозовый объем введения 1,5 мл	- фосфат не добавляют
18	-	-	0,438	40%	6%	8,42	12	5,7	4,5	1,2
19			0,437	40%	8%	8,42	11	5,7	4,3	1,4
20			0,437	40%	10%	8,31	11	5,7	4,4	1,3
21			0,437	45%	6%	8,35	11	5,9	4,7	1,2
22			0,437	45%	8%	8,35	10	5,8	4.9	0,9
23			0,437	45%	10%	8,37	12	5,7	4,7	1,0
24	-	-	0,438	50%	6%	8,31	11	5,7	4,9	0,8

° - повтор;

$ определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (ВИК), модифицированного согласно примеру ΙΙΙ.2.2;

* препараты 31 и 32 повторяли в другом аЬ 1И1(1о тесте с похожими данными (препараты 38 и 39 соответственно не показаны);

** это эквивалентно 0,271 М в дозовом объеме 2,5 мл; т.е. уменьшенный фосфат;

*** это эквивалентно 0,0051 М в дозовом объеме 2,5 мл; т.е. уменьшенный фосфат.

Примечание относительно результатов для препаратов 18-24, 26-30 в табл. 44.

Препараты 18-24 и 30 исключили из исследования долговременной стабильности из-за неудовлетворительных результатов, полученных во время 1-недельного теста на стабильность при 37°С. Препараты 26 и 28 исключили, поскольку происходила кристаллизация при стоянии при 4-8°С. Препараты 25, 27 и 29 исключили из-за высокого риска перекристаллизации во время стояния при 4-8°С.

Ιν.1.1. Препараты 1-11: препараты в дозовом объеме 2,5 мл.

Препараты 1-11 (см. табл. 43) были приготовлены с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 100 дозам по 2,5 мл (3,25 г) каждая. Антацидные вещества: ЫаН₂РО₄^2Н₂О (Мте 156); Ыа₂НРО₄^2Н₂О (Мте 178); Ыа₃ цитрат2Н₂О (Мте 294).

Жидкий препарат 1 получали следующим образом. К 125,84 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 7,605 г ЫаН₂РО₄^2Н₂О, 8,677 г Ыа₂НРО₄^2Н₂О, 9,555 г Ыа₃ цитрат2Н₂О и 162,5 г сахарозы. После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 10,82 г среды ОМЕМ, содержащей необходимое количество ротавируса с получением 10^6,0 БОЕ на дозу. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом случае одна доза состоит из 2,5 мл или 3,25 г конечного приготовленного препарата. В этом примере среда ЭМЕМ составляет 3,33% мас./мас.

Препараты 2-11 получали аналогично (см. ингредиенты и пропорции в табл. 43). В этой серии тестировали различные количества сахарозы и ЭМЕМ. Получили похожие результаты, за исключением препаратов 7 и 11, приготовленных с низкой (20%) концентрацией сахарозы, которая недостаточно ста

- 39 012046 билизирует ротавирус.

ΐν.1.2. Препарат 17: препарат в дозовом объеме 2,0 мл.

Препарат 17 (см. табл. 43) был приготовлен с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 125 дозам по 2,0 мл (2,60 г) каждая. Антацидные вещества: ЫаН₂РО₄-2Н₂О (Μν 156); Ыа₂НРО₄-2Н₂О (Μ^ 178); Να₃ цитрат-2Н₂О (Μν 294). Кратко, 110,7 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) взвешивают и последовательно добавляют 9,51 г МаН₂РО₄-2Н₂О, 10,84 г Ыа₂НРО₄-2Н₂О, 11,94 г Να₃ цитрат-2Н₂О и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). В этом примере используют 19,5 г ΌΜΕΜ, что составляет 6% мас./мас.

ΐν.1.3. Препараты 12-16: препараты в дозовом объеме 1,5 мл.

Дополнительные попытки уменьшить дозовый объем введения этих цитрат/фосфатных препаратов (для деталей см. табл. 43) до объема меньше 2 мл были неудачными.

Концентрации ингредиентов, используемых для препарата 17 (дозовый объем 2 мл) скорректировали до дозового объема 1,5 мл. При хранении препарата при 4°С быстро происходила перекристаллизация фосфатного компонента. Этот феномен наблюдается из-за довольной низкой растворимости Ыа₂НРО₄ в пределах фосфат-цитратного компонента (см. табл. 45).

Таблица 45

Теоретические пределы растворимости для фосфата и цитрата

	Растворимость в воде
№Н2РО4-2Н2О	5,44 М (20°С)
Ма2НРО4-2Н2О	0,52 М (20’С)
№3Цитрат-2Н2О	1.44М (25°С)

Согласно этим параметрам попытки приготовить препарат 17 в дозовом объеме 1,5 мл будут теоретически приводить к конечной концентрации фосфата 0,65 М ((0,244М+0,244М)*2/1,5), которая выше, чем данные растворимости для Ыа₂НРО₄ (0,52 М).

Чтобы избежать проблем с такой низкой растворимостью фосфата, предлагают не использовать дополнительный фосфат и регулировать рН, играя на равновесии между формой карбоновой кислоты (КСООН) и формой карбоксилатной соли (К-СОО). Пример этого представлен в препаратах 100-115, приготовленных в объеме введения 2,5 мл (см. табл. 5), или в препаратах 128-130, приготовленных в объеме введения 1,5 мл (см. табл. 6).

ΐν.1.4. Препараты 25-32 и 38-40: препараты в дозовом объеме 1,5 мл и уменьшенное количество фосфата.

Некоторые препараты (см. табл. 44 для деталей), содержащие уменьшенное количество фосфата, получали с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Для того, чтобы компенсировать это уменьшение фосфата, поддерживая при этом приемлемую антацидную способность, увеличивали концентрацию цитрата. Кратко, препарат 25 получали путем смешивания 8,76 г №1Н₂РО.г2Н₂О. 10,00 г Ыа₂НРО₄-2Н₂О, 21,00 г Να₃ цитрат-2Н₂О и затем добавляли 130 г сахарозы (40% мас./мас.). В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас. Препараты 26-29 приготавливали аналогично, ожидая, что концентрации сахарозы и ΌΜΕΜ будут слегка изменены (см. табл. 44). Препарат 30 получали путем смешивания 0,1653 г ЫаН₂РО₄-2Н₂О, 0,1884 г Ыа₂НРО₄-2Н₂О, 32,16 г Να₃ цитрат-2Н₂О и затем добавляли 130 г сахарозы (40% мас./мас.). В этом примере ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас. Препараты 31 и 32 приготавливали аналогично, ожидая, что концентрации сахарозы и ΌΜΕΜ будут слегка изменены (см. табл. 44).

Несмотря на то что в препаратах 25-29 общая концентрация фосфата составляла 0,45 М, т.е. ниже теоретического предела растворимости 0,52 М для Ыа₂НРО₄, некоторые препараты (например, препараты 26 и 28) демонстрировали перекристаллизацию во время хранения при +4°С. Это фактическое различие между теоретическим значением растворимости и фактическим значением объясняется, возможно, присутствием других соединений, растворенных в среде (сахарозы, цитрата или других соединений, введенных через среду ΌΜΕΜ), хотя для похожих препаратов были получены противоречивые результаты (сравни, например, препараты 26 и 27). Вариабельность, полученная при тестировании таких препаратов, не совместима с надежностью, необходимой при крупномасштабном производстве препаратов, которые должны оставаться физически стабильными в течение минимального периода времени.

Еще большее уменьшение количества фосфата в формуле (см. № 30-32 и 38-40 в табл. 44) дает плохие результаты для стабильности вируса при 4-8°С (см. табл. 47).

Другие препараты в дозовом объеме 1,5 мл (18-24) были также приготовлены в отсутствие добавленного фосфата (см. табл. 44 для деталей). Антацидную способность этих препаратов поддерживали при целевом значении 12 мин, используя тринатрия цитрат в более высокой концентрации (438 мМ). Кратко, препарат 18 получали путем смешивания 143,34 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г), 32,16 г Να₃ цитрат-2Н₂О и затем добавляли 130 г сахарозы (40% мас./мас.). Для препаратов 19-23 тестировали различные количества сахарозы и ΌΜΕΜ (см. табл. 44). Для препарата 24 использовали сахарозу в концентрации 50% мас./мас. (162,5 г). В этих препаратах

- 40 012046

ΌΜΕΜ составляет 6% мас./мас.

Значение рН этих препаратов (18-24) превышало 8,3, оно влияло на стабильность ротавируса, как доказано потерей вируса более чем на 0,8 после одной недели хранения при 37°С.

При наличии плохой стабильности этих препаратов во время быстрого теста при 37°С, схему определения промежуточной стабильности или при комнатной температуре, или при 4°С не осуществляли.

Эти результаты показывают, что когда в препарат включают все меньше и меньше фосфата, с все большей и большей концентрацией цитрата (для поддержания антацидной способности), то полученный в результате рН препарата все более и более увеличивается:

рН около 6,7 в препаратах 25-29 рН около 7,7 в препаратах 30-32 и 38-40, и рН около 8,3 в препаратах 18-24 без фосфата

Как показано ниже (табл. 46 и 47), эти более высокие значения рН не указывают на хорошую стабильность ротавируса.

Кроме того, эти результаты находятся в соответствии с результатами, полученными для препаратов 110-115 (см. табл. 5) и 128-130 (см. табл. 6), где рН корректировали путем регулирования только соотношения лимонной кислоты/цитрата натрия (таким образом, без дополнительного фосфата).

Ιν.2. Титрование ротавируса и антацидная способность.

Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере ΙΙΙ.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, представленному в примере ΙΙΙ.2. Результаты показаны в табл. 46 и 47.

Таблица 46

Стабильность вируса при комнатной температуре

№	Титрование вируса после хранения при комнатной температуре (20-22’0 (1одю БОЕ на дозу вакцины)
1 месяц	2 месяца	3 месяца	4 месяца	5 месяцев	6 месяцев
1	6,0	6,0	5,8	5,6		5,1
2	6,3	5,9	6,0	5,6		5,0
3	6,2	6,0	5,9	5,5		5,0
4	6,0	6,0	5,5	5,0
5	6,0	5,7	5,3	4,5
6	5,5	5.1	4,8
7	00	00		ОО	оо	00
8	6,0	5,6	5,5	4,9
9	5,9	5,6	5,1
10	5,6	5,1	4,6
11	00	00	00	ОО	оо	00
17	6,0	5,8	5,8	5,7		5,0
25	5,9	5,5	4,8
27	5,8	5,1	4,7
29	6,1	5,7	5,5	5,4		3,9
31	5,7	5,3	4.7
32	5,9	5,5	5,0
38	оо	оо	оо	ОО	оо	ОО
39		5,3	5,5	4,5
40		5,5	5,2	4,8		4,6

Пустые прямоугольники - не определено;

^οο Препараты 7,11 и 38 исключили из исследования долговременной стабильности из-за плохих результатов, полученных во время 1-недельного теста при 37°С.

- 41 012046

Таблица 47

Стабильность вируса при 4°С

№	Титрование (1од	вируса после хранения при 4°С η БОЕ на дозу вакцины)
	Т=0	после 1 нед. 37°С	1 м* 4°С	2 м* 4°С	4 м* 4°С	6 м* 4°С	7 м* 4°С	9 м* 4°С	12 м* 4°С
1	5,9	5,4	5,9	6,0	6,1	6,1		5,9	5,9
2	5,8	5,4	5,9	6	6	6		5.9	5,8
3	5,6	5,3	6	6	6,2	6		6	5,9
4	5,8	5,3	5,7	6,0	6,1		5,9	5,9	5,7
5	5,8	5,5	6,1	6,1	6,1		5,8	6,0	5,7
6	5,7	5,5	6,0	6,0	5,9		5,4	5,6	4,9
7	5,6	4,1
8	5,7	5,4	5,9	6,0	5,9		5,8	5,9	5,6
9	6,1	5,6	6,1	6,1	5,8		5,7	5,6	5,5
10	6,1	5,4	6,0	5,5	5,5
11	6,1	4,4
17	5,7	5,5	5,7	5,9	6	5,8		5,9	5,9
25	6,2	5,8	5,9	5,9	нд*	НД*		нд*	нд*
27	6,2	6,0	6	5,8	нд*	НД*		нд*
29	6,1	6,1	6,1	5,9	5,9	6,2
31	6,1	5,8	5,7	5,7	5,6	5,6
32	6,0	5,7	6	5,8	5,6	5,6
38	5,7	5,2
39	5,6	5,3		5,7	5,4
40	5,6	5,4		5,7	5,3

* НД - не доступны - не удачный во время теста на стабильность при комнатной температуре;

Пустые прямоугольники - не определено.

Ιν.3. Результаты и выводы.

Препараты 2-3 (дозовый объем 2,5 мл) и препарат 17 (дозовый объем уменьшали с 2,5 мл до 2 мл).

Как показано в табл. 46 и 47, 1-1од снижение вирусного титра происходило вследствие 6-месячного хранения при комнатной температуре для препаратов 2, 3 и 17. При 4°С никакого значительного снижения вирусного титра не наблюдалось в течение периода хранения вплоть до 12 месяцев.

Препараты 25, 27, 29 и 31-32 (дозовый объем уменьшали до 1,5 мл).

При комнатной температуре 1-1од снижение вирусного титра обычно достигалось через 3 месяца или раньше, за исключением препарата 29, который выдержал 4-месячный период времени. Препараты 25-27 перекристаллизовывались в течение периода хранения при 4°С, указывая таким образом на то, что уменьшение концентрации фосфата является недостаточным, как указано выше. Поэтому такие препараты не подходят для периодов хранения, которые должны составлять по меньшей мере один год при 4°С.

При еще большем уменьшении концентрации фосфата (препараты 30-32), рН конечного препарата увеличивается благодаря относительному увеличению количества цитрата, который необходим для поддержания одного и того же значения антацидной способности. Это увеличение рН оказывает влияние на стабильность ротавируса и может быть быстро определено во время исследования стабильности при комнатной температуре. Эти тенденции подтверждаются, когда фосфат полностью удаляется из препарата (препараты 18 и 24).

Общий вывод из примера Ιν.

Эти результаты указывают на то, что для того, чтобы достичь дозового объема меньше 2 мл, по сравнению с дозовым объемом 2,5 мл, количество фосфата, присутствующего в препарате, должно быть уменьшено из-за его довольно низкой растворимости в воде и его свойства перекристаллизовываться. Как следствие, для того, чтобы сохранить одно и то же целевое значение антацидной способности (т.е. минимум по меньшей мере 8 мин, предпочтительно по меньшей мере 12 мин, как определено с помощью теста ВКК), количество цитратной соли должно быть увеличено. Это приводит к увеличению конечного рН препарата, что является вредным для стабильности ротавируса в жидком препарате.

Пример ν. Дополнительные препараты.

Следующие препараты получали (табл. 48), но не включали в планирование исследования долговременной стабильности из-за неудачи, с которой столкнулся по меньшей мере один из совокупности критериев. Конкретные причины исключения некоторых препаратов изложены в общих чертах в колонке комментариев в табл. 48.

- 42 012046

Таблица 48

№	Краткое описание препарата	Эталонный препарат + Таблица	Комментарии
7	2,5 мл; цитрат; фосфат; 20% сахарозы	IV. 1 Таблица 43	>1 !од потеря после 1 недели при 37°С
11	2,5 мл; цитрат; фосфат; 20% сахарозы	IV. 1 Таблица 43	>1 1од потеря после 1 недели при 37’С
12	1,5 мл; цитрат; фосфат; 40% сахарозы	IV,1 Таблица 43	Кристаллизуется при стоянии при +4°С
13	1,5 мл; цитрат; фосфат; 40% сахарозы	IV. 1 Таблица 43	Кристаллизуется при стоянии при +4°С
14	1,5 мл; цитрат; фосфат; 40% сахарозы	IV. 1 Таблица 43	Кристаллизуется при стоянии при +4’С
15	1,5 мл; цитрат; фосфат; 45% сахарозы	IV. 1 Таблица 43	Кристаллизуется при стоянии при +4°С
16	1,5 мл; цитрат; фосфат; 45% сахарозы	IV. 1 Таблица 43	Кристаллизуется при стоянии при +4°С
13	1,5 мл; цитрат; 40% сахарозы; рН 8,42	IV. 1 Таблица 44	>1 1од потеря после 1 недели при 37“С
19	1,5 мл; цитрат; 40% сахарозы; рН 8,42	IV. 1 Таблица 44	>1 1од потеря после 1 недели при 37’С
20	1,5 мл; цитрат; 40% сахарозы; рН 8,31	IV. 1 Таблица 44	>1 1од потеря после 1 недели при 37°С
21	1,5 мл; цитрат; 45% сахарозы; рН 8,35	IV. 1 Таблица 44	>1 1од потеря после 1 недели при 37°С
22	1,5 мл; цитрат; 45% сахарозы; рН 8,35 ί	IV. 1 Таблица 44	>1 1од потеря после 1 недели при 37’С
23	1,5 мл; цитрат; 45% сахарозы; рН 8,37	IV. 1 Таблица 44	>1 1од потеря после 1 недели при 37°С
24	1,5 мл; цитрат; 50% сахарозы: рН 8,31	ΐν.1 Таблица 44	>1 1од потеря после 1 недели при 37°С
25	1,5 мл; цитрат; фосфат;	IV. 1 Таблица 44	Риск кристаллизации при

- 43 012046

140% сахарозы		+4°С
26	1,5 мл; цитрат; фосфат; 40% сахарозы	IV. 1 Таблица 44	Кристаллизуется при стоянии при +4°С
27	1,5 мл; цитрат; фосфат; 40% сахарозы	IV. 1 Таблица 44	Риск кристаллизации при +4’С
28	1,5 мл; цитрат; фосфат; 45% сахарозы	IV. 1 Таблица 44	Кристаллизуется при стоянии при +4“С
29	1,5 мл; цитрат; фосфат; 45% сахарозы	ΐν.1 Таблица 44	Риск кристаллизации при +4°С
30	1,5 мл; цитрат; фосфат 40% сахарозы	IV. 1 Таблица 44	0,8 !од потеря после 1 недели при 37°С
33	1,5 мл; ацетат + кальций	11.1 Таблица 10	>1 1од потеря после 1 недели при 37°С
34	1,5 мл; ацетат + кальций	11.1 Таблица 10	>1 1од потеря после 1 недели при 37°С
35	1,5 мл; ацетат + кальций	11.1 Таблица 10	>1 1од потеря после 1 недели при 37°С
41	1,5 мл; глутамат; 50% сахарозы	ΙΙ.7 Таблица 36	рН слишком высокий: 10,36
44	1,75 мл; фумарат; 44% сахарозы	ΙΙ.8	Нерастворимые вещества
45	1,75 мл; адипат; 44% сахарозы	II.5 Таблица 19	ВЯН слишком долгий: >29 мин
47	1,75 мл; лактобионат; 31% сахарозы	ΙΙ.9	ВЯЯ слишком короткий: <1 мин
48	1,75 мл; малеат; 44% сахарозы	11.10	рН слишком высокий: 10,4, ВКР слишком долгий: 24 мин
49	1,75 мл; глюкуронат; 42% сахарозы	11.11	рН слишком высокий: 8,45; ВКР слишком короткий: <1 мин
50	1,75 мл; глутарат; 44% сахарозы	II.4 Таблица 18	ВЯЯ слишком долгий: >29 мин

- 44 012046

51	1,75 мл; сукцинат; 44% сахарозы	ΙΙ.3 Таблица 16	ВКЯ слишком долгий; >29 мин
52	1,75 мл; галактуронат; 42% сахарозы	11.12	рН слишком высокий: 10,69, ВКК слишком короткий: <1 мин
53	1,75 мл; галактарат; 38% сахарозы	11.13	Нерастворимые вещества
54	1,75 мл; малонат;44% сахарозы	ΙΙ.2 Таблица 14	рН слишком высокий: 8,36
55	1,75 мл; тартрат; 44% сахарозы	11.14	ВПК слишком короткий: <1 мин
57	1,75 мл; малеат; 44% сахарозы	11.10	>1 1од потеря после 1 недели при 37°С
68	1,5 мл; глутамат; 7,5% сахарозы	II.7 Таблица 36	>11од потеря после 1 недели при 37°С
73	1,5 мл; малат 0,597 М; 50% сахарозы	ΙΙ.6 Таблица 33	Стерильная фильтрация слишком трудная
75	1,5 мл; малат; 56% сахарозы	ΙΙ.6 Таблица 33	Трудности при растворении сахарозы
103	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы; рН 5,09	11.5.1 Таблица 19	Адипиновая кислота кристаллизуется при стоянии при +4°С
104	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы; рН5,12	11.5.1 Таблица 19	Адипиновая кислота кристаллизуется при стоянии при +4°С
107	1,5 мл; адипат 0,466 М; 55% сахарозы	11.5.1 Таблица 19	Годится, но похожие данные по стабильности уже имеются
108	1,5 мл; адипат 0,63 М; 53,15% сахарозы; рН 5,38	11.5.1 Таблица 19	Адипиновая кислота кристаллизуется при стоянии при +4°С
109	1,5 мл; адипат 0,63 М; 55% сахарозы; рН 5,38	11.5.1 Таблица 19	Адипиновая кислота кристаллизуется при

- 45 012046

			стоянии при +4°С
117	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы; Са++	11.5.4 Таблица 26	Осаждение адипата кальция
121	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы; Са++	11.5.4 Таблица 26	Осаждение адипата кальция
135	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы	как № 134	Плацебо без ротавируса
136	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы	11.5.1 Таблица 19	рН слишком высокий: 9,36
137	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы	11.5.1 Таблица 19	рН слишком высокий: 9,37
138	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы	11.5.1 Таблица 19	рН слишком высокий: 9,67
139	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы	11.5,1 Таблица 19	рН слишком высокий: 9,92
140	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы	11.5,1 Таблица 19	рН слишком высокий: 10,25
141	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы; рН 6,47	11.5.1 Таблица 19	Годится, но данные по стабильности уже имеются
142	1,5 мл; адипат; 55% сахарозы; рН 6,30	11.5.1 Таблица 19	Годится, но данные по стабильности уже имеются
146	1,5 мл, адипат; 50% сахарозы	как № 93	Плацебо без ротавируса
149	1,5 мл, адипат; 55% сахарозы	как № 151	Плацебо без вирусов

Пример νΙ. Иммуногенность, реактогенность и безопасность (фаза ΙΙ) двух пероральных доз человеческой моновалентной антиротавирусной жидкой вакцины у здоровых грудных детей.

νΙ.1. Введение.

Рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое испытание фазы ΙΙ проводили для оценки иммуногенности, реактогенности и безопасности вакцины, содержащей аттенуированный штамм С1Р8 ротавируса человека (депонированный в ЕСААС под депозитарным номером 99081301, см. \νϋ 01/12797), для иммунизации грудных детей. Исследование осуществляли в многочисленных центрах в Финляндии. Обзор схемы исследования представлен на фиг. 4.

Во время этого испытания первую дозу вакцины, или жидкого препарата кандидатной вакцины против ΗΚν (ротавирус человека) (N=100), или лиофилизированного препарата вакцины против ΗΚν (N=100) и соответствующее плацебо (2 группы с каждым N=25) вводили детям в возрасте около 2,5 месяцев (в возрасте от 6 до 12 недель) во время первого визита к врачу. Вторую дозу вводили в возрасте около 3,5 месяцев (во время второго визита к врачу, типично через 4 недели после первой дозы). Последующий визит осуществляли через 1 месяц после второй дозы в возрасте около 4,5 месяцев для взятия крови и оценки иммуногенности.

Клиническое испытание было рандомизированным, плацебо-контролируемым и автономным. Всего было зарегистрировано 250 субъектов, 100 в группе ΗΚν и 25 в группе плацебо. Его проводили двойным слепым методом между каждым препаратом вакцины против ΗΚν и его соответствующим плацебо. Однако между 2 разными препаратами слепой метод был технически не возможен.

Рутинные вакцинации у детей проводили согласно местной практике, но по крайней мере через 14 суток после каждой дозы вакцины против ΗΚν.

νΙ.2. Описание вакцины.

Конкретно, используемая вакцина содержит в качестве ротавирусного компонента аттенуированный человеческий штамм С1, депонированный в ЕСАСС (Еигореап СоИесйои оГ Ашта1 Се11 СиЙигек, Европейская коллекция клеточных культур животных) под депозитарным номером 99081301 (νθ 01/12797).

Вакцина представляет собой аттенуированную кандидатную вакцину против ротавируса человека (ΗΚν), происходящую из штамма 89-12 ΗΚν, относящегося к серотипу О1Р1А и генотипу [Р8], который выделили из испражнений 15-месячного ребенка в Цинциннати, США. Естественная инфекция, вызванная штаммом 89-12, как показано в двухлетнем перспективном исследовании, обеспечивает защиту против последующего заболевания и против повторной инфекции (Вегийет Ό.Ι., е1 а1. РгоГесбои Ггот ΐΌΐανίгц8 гетГесбоп: 2 уеагк ргокресбуе Чибу. Σ ΙηίεΟ Όίδ. 1991; 164: 277-83).

- 46 012046

Антацидное средство будет предотвращать инактивацию 4Ην во время прохождения через желудок.

В табл. 49 сравниваются композиции адипатного жидкого препарата и лиофилизированного препарата, полученного согласно УО 01/12797 и продемонстрировавшего эффективность в крупномасштабном клиническом испытании (Эе Vο8 е( а1. Реб1а(г [пГес( Όίδ 1. 2004 Ос( 23 (10 8ирр1): 8179-82).

Таблица 49

Количественная композиция адипатного жидкого препарата и лиофилизированный препарат вакцины против НК/ν (номинальная доза)

	Жидкий адипатный препарат	Лиофилизированный препарат(после растворения)
Активное вещество	Штамм Р43 - по меньшей мере 108 0 ССЮ50 на дозу в конце срока хранения (дозовый объем 1,5 мл)	Штамм Р43 - по меньшей мере 106 0 ССЮ50 на дозу в конце срока хранения (дозовый объем 1,0 мл)
Стабилизатор	Сахароза	55% масс./масс. (1,073 г)	Сахароза Декстран Сорбит Аминокислоты	9 мг 18 мг 13,5 мг 9 мг
Антацидное вещество	Динатрия адипат	132,74 мг	Карбонат кальция	60 мг
Загуститель	-		Ксантан	2,5 мг
Объемный разбавитель	ЦМЕМ”	6% масс ./масс.	□МЕМ	2,25 мг
Растворитель	Вода для инъекции	до 1,5 мл	Вода для инъекции	до 1 мл

** Среда Игла в модификации Дульбекко.

Краткий обзор объема и антацидной способности двух препаратов вакцины против НКУ представлен в табл. 50.

Таблица 50

Объем и антацидная способность адипатного жидкого препарата и лиофилизированного препарата вакцины против НКУ

Препарат	Объем наполнения на дозу	Антацидная способность (ВКК* в мин)
Адипатная жидкая вакцина против НК\/	1,5 мл	12
Лиофилизированный препарат	1,3 мл	17

* ВКК - тест титрования Россетт-Райса у грудных детей (ВКК): для измерения скорости взаимодействия антацидного вещества с 0,1 н. соляной кислотой и продолжительности поддерживания до рН выше

4. См. методику в примере Ш.2.2.

Однократные дозы приготовленной адипатной жидкой вакцины против НКУ помещали, в соответствии с нормами СМР (Сооб МапцГасШппд Ргасбсе®, унифицированные правила производства лекарственных препаратов), в однодозовые стеклянные шприцы.

Ротавирусный титр (т.е. эффективность ротавируса) можно измерить согласно методике, подробно описанной в примере III. 1, с инфицированными клетками МА104, идентифицируемыми с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Альтернативно, его измеряют путем титрования ш νίΐΐΌ вируса на клетках МА104 с вирусом, детектируемым с помощью прямой иммунофлуоресценции с использованием специфических антиротавирусных антител. Этот способ определяет дозу, инфицирующую 50% клеточных культур, и ротавирусные титры выражаются как средняя инфицирующая доза для клеточной культуры (ССШ50 от англ. Се11 Си1(иге ИкесН^'е Эохе). Оценивали меж- и внутрианализную воспроизводимость и получили эквивалентные результаты (вариабельность определяется при 0,3 1од).

νΤ3. Введение.

νΐ.3.1. Лиофилизированный препарат вакцины против 4Ην или плацебо

Для приготовления вакцины или плацебо для введения все содержимое одного предварительно заполненного шприца, содержащего кальций-карбонатный буфер, вводили в ампулу с лиофилизированным продуктом (вакцина или плацебо), и ресуспендированный продукт затем постепенно вводили в виде однократной пероральной дозы.

νΐ.3.2. Жидкий препарат вакцины против 4Ην или плацебо.

Предварительно заполненный стеклянный шприц встряхивали перед применением. Продукт (вакцину или плацебо) затем постепенно вводили в виде однократной пероральной дозы.

νΤ4. Безопасность и реактогенность.

Использовали следующие критерии безопасности и реактогенности: запрашиваемые общие нежела- 47 012046 тельные явления представляли собой лихорадку, раздражительность/нервозность, диарею, рвоту, потерю аппетита и кашель/сопливый нос. Их регистрировали в течение 15 суток после каждой исследуемой вакцинной дозы, используя личные карточки, предложенные родителям/опекунам субъектов для записи наблюдаемых сипмптомов. Все гастроэнтеритные явления (диарея), происходящие между визитами, документировали, и образцы испражнений собирали (самое позднее на 7 сутки после начала гастроэнтерита). Непредусмотренные нежелательные явления, происходящие в пределах 31 суток после каждой дозы, регистрировали. Серьезные нежелательные явления регистрировали в течение всего периода исследования.

νΙ.5. Лабораторные анализы.

νΙ.5.1 Анализ испражнений.

Образцы испражнений, собранные от всех субъектов в сутки введения каждой исследуемой вакцинной дозы или за сутки до этого, в Сутки 7±1 и в Сутки 15±1 после каждой дозы, и в сутки Визита 3 или за одни сутки до него, анализируют в С8К Вю1одюа18 или специализированной лаборатории С8К Вю1о§1са18 с целью определения присутствия вакцинного Κν, используя иммуноферментный анализ (ЕЫ8А - см. раздел νΙ.6.1) для оценки вирусного шеддинга.

Присутствие ротавирусного антигена, продемонстрированное с помощью ЕЫ8А в любом испражнении, собранном в заданные моменты времени после Дозы 1 вплоть до Визита 3, рассматривают как шеддинг вакцинного вируса и принимают в качестве доказательство вакцинного ответа (т.е. приживления вакцины), если субъект был отрицательным в отношении ротавируса в сутки введения Дозы 1 вакцины против НКУ или плацебо. Для субъектов, принимавших плацебо, в этом случае осуществляют секвенирование.

Субъекта, первоначально отрицательного в отношении ротавируса, определяют как субъекта, который был отрицательным в отношении антиротавирусных Ι§Λ антител в сыворотке и в отношении ротавирусного антигена в образце испражнений в момент времени перед вакцинацией, если доступны оба результата, или отрицательным в отношении по меньшей мере одного из этих маркеров, если доступен только один результат.

Кроме того, образцы испражнений, собранные во время каждого эпизода СЕ (гастроэнтерита) от Визита 1 до Визита 3, тестируются в С8К Вю1одюа18 или специализированной лаборатории С8К Вю1ощса1з с помощью ЕЫ8А для определения Κν. В случае положительного результата определяют С-тип, используя подходы на основе ПЦР. Эти молекулярные способы выявляют участки в пределах гена νΡ7, которые очень различаются у разных С-типов и являются весьма консервативными в пределах каждого данного С-типа. Например, в ОТ-ПЦР способе, разработанном Соиуеа с соавт. (1990, I С11п МюгоЬю1., 28:276-282), используют коктейль из различных генотип-специфических праймеров, расположенных в различных участках гена νΡ7. Размер полученных ПЦР-продуктов, оцениваемый с помощью гельэлектрофореза, обеспечивает информацию для идентификации соответствующих С-генотипов. Если определяется любой С1 Κν, то вакцинный вирус отличают от серотипа дикого типа с помощью анализа последовательностей или эквивалентного подхода.

Любое определение вакцинного вируса в любом испражнении, собранном вплоть до Визита 3, принимают в качестве доказательства вакцинного ответа (т.е. приживления вакцины).

νΙ.5.1. Анализ сыворотки.

Сыворотка, полученная из образцов цельной крови, собранных от субъектов при каждом визитеисследовании, тестировали с помощью ЕЫ8А в специализированной лаборатории С8К Вю1одюа18 с целью измерения концентрации антиротавирусных ЦА антител в сыворотке. Чувствительность анализа составляет 20 ед./мл. Сероотрицательного субъекта в отношении антиротавирусных ^А антител определяли как субъекта, который имел концентрацию антител ниже значения чувствительности анализа. Сероположительного субъекта в отношении антиротавирусных ЦА антител определяли как субъекта, который имел концентрацию антител, большую или равную значению чувствительности анализа.

νΙ.6. Иммуногенность. Анализ сыворотки.

νΙ.6.1. Измерение ЦА антител с помощью ЕЫ8А.

Этот анализ позволяет определять ротавирусные ^А в сыворотке человека и первоначально был разработан Κ. \Уагб (1, 2) и модифицирован С8К Вю1одюа18. Его использовали для измерения иммунного ответа после вакцинации и/или инфекции. Образцы анализировали в С8К Вю1одюа18, Шхепзай, Бельгия (или специализированной лаборатории).

Описание ЕЫ8А анализа.

На 96-луночные планшеты наносят в течение ночной инкубации разведения антиротавирусного антитела. Лунки промывают и добавляют лизат клеток, либо инфицированных вакцинным штаммом (положительные лунки), либо неинфицированных (отрицательные лунки). После инкубации на поворачивающейся платформе планшет промывают, и разведения образцов сыворотки или стандартную сыворотку инкубируют в обоих типах лунок (положительных и отрицательных). Использование отрицательных лунок позволяет оценить неспецифическое связывание ^А.

Планшет промывают, и связанные ^А человека определяют путем добавления биотинилированного кроличьего антитела против ^А человека (30 мин при встряхивании). После промывки планшета в

- 48 012046 каждую лунку добавляют конъюгированный с пероксидазой авидин-биотин в оптимальной концентрации и инкубируют (30 мин, КТ при встряхивании). Планшет снова промывают и добавляют ортофенилендиамин (ОРО). Планшет затем инкубируют (30 мин, комнатная температура (КТ) в темноте) перед тем, как остановить реакцию с помощью 2 н. Н₂8О₄. Оптическое поглощение измеряют при 490/620 нм. Специфические оптические плотности вычисляют для каждого образца/ стандарта путем измерения разницы между положительными и отрицательными лунками. Концентрации образцов определяют с использованием четырехпараметрической логарифмической функции, образованной стандартной кривой. Определяют наиболее точную часть стандартной кривой (рабочий диапазон) для расчета результатов. Концентрации антител в единицах на миллилитр (ед./мл) вычисляют относительно стандарта (концентрация = 1000 ед./мл) путем усреднения значений для каждого неизвестного, которые попадают в пределы рабочего диапазона стандартной кривой, и затем уточняют для коэффициента разведения. Каждый эксперимент включает отрицательные и положительные контроли. Для всех реагентов заранее определяют оптимальную концентрацию.

Ссылки.

1. Вегпйет Ό.Ι., διηίΐΐι ν.Ε., 8Нег\\'ооб ЕЕ. е1 а1. 8аГе1у апб пптиподешсНу оГ а 11уе айепиа1еб Еитап го1ау1гик 89-12 уассте. Уассте. 1998; 16:381-7.

2. Вегпйет Ό.Ι., 8аск Ό.Ά., Ео111к1ет Ε. е1 а1. ΕГйсасу оГ йуе айепиа1еб Еитап го1ау1гик уассте 89-12 ίη 1пГап1к: а гапбот1кеб р1асеЬо-соп1го11еб 1па1. Бапсе!. 1999; 354:287-90.

УЕ7. Результаты: К|Л антительный ответ против ротавирусов.

Табл. 51 представляет средние геометрические концентрации (ΟΜΟ) антиротавирусных Ι§Ά антител и показатель сероконверсии (Общая вакцинированная когорта иммуногенности). Табл. 52 представляет ΟΜΕ' антиротавирусных Ι§Ά антител, вычисленные для субъектов, сероположительных в отношении антиротавирусных Ι§Ά антител из расчета на общую вакцинированную когорту.

Антительный ответ на вакцину против НКУ в контексте показателей сероконверсии был похожим в обеих вакцинных группах через один месяц после второй дозы (82,2% в группе НКУ_Еуо и 90,1% в группе НКУ_Е|с.|). В объединенной группе плацебо 0% субъектов продемонстрировали сероконверсию через один месяц после второй дозы, что указывает на то, что исследование проводилось в то время, когда в данном сообществе не было инфекции дикого типа.

Таблица 51

ΟΜί'' антиротавирусных Ι§Ά антител и показатели сероположительной реакции.

Общая вакцинированная когорта на иммуногенность

	220 ед./мл	СМС
		95% ДИ		95% ДИ
Группа	График	N	п	%	НП	ВП	Значе -ние	НП	ВП
ΗΚν_ίΥΟ	РНЕ	98	0	0,0	0,0	3,7	<20	-	-
Р1(М1)	96	68	70,8	60,7	79,7	191,3	122,7	298,2
РП(М2)	90	74	82,2	72,7	89,5	330,4	217,5	502,0
Ηκν_ίΐο	РНЕ	98	0	0,0	0,0	3,7	<20	-	-
	Р1(М1)	87	66	75,9	65,5	84,4	172,9	112,1	266,7
	>20 ед./мл	СМС
		95% ДИ		95% ДИ
Г руппа	График	N	п	%	НП	ВП	Значе* ние	НП	ВП
	РП(М2)	81	73	90,1	81,5	95,6	292,3	199,3	428,8
Р1__РОО1_	РНЕ	49	0	0,0	0,0	7,3	<20	-	-
Р1(ПЛ1)	46	0	0,0	0,0	7,7	<20	-	-
РП(М2)	48	0	0,0	0,0	7,4	<20	-	-

1. N - количество субъектов с доступными результатами.

2. п/% - количество/процент субъектов с концентрацией выше значения чувствительности.

3. 95% ДИ - 95% доверительный интервал; НП = Нижний предел, ВП = Верхний предел.

4. ΡΚΕ - предварительная вакцинация.

5. РДМ1) - один месяц после первой дозы вакцины против НКУ или плацебо (визит 2).

6. РП(М2) - один месяц после второй дозы вакцины против НКУ или плацебо (визит 3).

7. Версия базы данных - 070НС2005.

- 49 012046

Таблица 52

СМС антиротавирусных Ι§Α антител, вычисленные для субъектов, сероположительных в отношении Ι§Α антител против ротавируса. Общая вакцинированная когорта на иммуногенность

	<змс
		95% ДИ
Г руппа	График	N	значение	НП	вп
ΗΚν_Ι.ΥΟ	Р1(М1)	68	644,7	471,4	881,8
	РН(М2)	74	703,8	525,0	943,6
Ηκν_ίΐα	Р1(М1)	66	428,1	302,1	606,8
	РП(М2)	73	423,1	305,9	585,2

N - количество субъектов, которые были сероположительными в отношении антиротавирусных Ι§Α антител;

95% ДИ - 95% доверительный интервал;

НП - Нижний предел;

ВП - Верхний предел;

РДМ1) - один месяц после первой дозы вакцины против 4Κν или плацебо (визит 2); РП(М2) - один месяц после второй дозы вакцины против 4Κν или плацебо (визит 3); Версия базы данных - 07ИЕС2005 νΙ.8.

Выводы.

Иммуногенность в контексте показателей сероконверсии была похожей между двумя вакцинными препаратами.

Жидкий препарат вакцины был очень иммуногенным, когда вводился детям в соответствии с 0-, 1месячным графиком.

Поскольку Ι§Α является хорошим маркером эффективности антиротавирусной вакцины, то эти данные подтверждают защитный эффект препарата, тестируемого в клиниках.

Claims (48)

1. Жидкая антиротавирусная иммуногенная композиция, подходящая для перорального введения человеческому ребенку, содержащая ротавирусный антиген, сахар и карбоксилат, где указанная композиция имеет рН от примерно 5,0 до примерно 8,0 и содержит менее 5 мМ фосфата, где указанный карбоксилат (1) получен из карбоновой кислоты с рК_а больше 4, или из дикарбоновой кислоты со средним рКа больше 4, или (2) выбран из группы, состоящей из адипата, малата, ацетата, сукцината, пропионата, бутирата, малоната, глутарата, малеата, гликолята, лактата, глюконата, фумарата, тартрата и любой комбинации двух или более из них.

2. Жидкая композиция по п.1, содержащая менее 0,1 мМ фосфата.

3. Жидкая композиция по п.1 или 2, не содержащая фосфата.

4. Жидкая композиция по любому из пп.1-3, где рН указанной композиции составляет от примерно 5,5 до примерно 7,5.

5. Жидкая композиция по п.4, где рН указанной композиции составляет от примерно 6,0 до примерно 7,0.

6. Жидкая композиция по любому из пп.1-5, где указанный карбоксилат представляет собой адипат.

7. Жидкая композиция по любому из пп.1-6, где указанный карбоксилат присутствует в концентрации от примерно 50 мМ до примерно 2 М.

8. Жидкая композиция по п.7, где указанный карбоксилат присутствует в концентрации от примерно 100 мМ до примерно 1 М.

9. Жидкая композиция по п.8, где указанный карбоксилат присутствует в концентрации от примерно 400 до примерно 700 мМ.

10. Жидкая композиция по любому из пп.1-9, где указанный сахар выбран из перечня, состоящего из глицерина, эритрозы, эритрита, ксилита, арабита, рибозы, ксилозы, арабинозы, глюкозы, тагалозы, маннозы, галактозы, фруктозы, инозита, сорбита, маннита, галактита, комбинации глюкозы и фруктозы, мальтозы, софорозы, лактозы, целлобиозы, мелибиозы, трегалозы, сахарозы, палатинозы, мальтулозы, лактулозы, мальтита, лактита, рафинозы, мальтотриозы, мелезитозы, целлотриозы, циритола, мальтотетраозы, стахиозы, целлотетраозы, мальтопентаозы, целлопентаозы, мальтогексаозы, целлогексаозы, олигосахаридов.

11. Жидкая композиция по п.10, где указанный сахар представляет собой сахарозу или декстрозу.

12. Жидкая композиция по любому из пп.1-11, где концентрация указанного сахара составляет от примерно 1 до примерно 70% мас./мас.

13. Жидкая композиция по п.12, где концентрация указанного сахара составляет от примерно 25 до примерно 60% мас./мас.

- 50 012046

14. Жидкая композиция по п.13, где концентрация указанного сахара составляет 50 или 55% мас./мас.

15. Жидкая композиция по любому из пп.1-14, дополнительно содержащая карбоновую кислоту.

16. Жидкая композиция по п.15, где указанная карбоновая кислота выбрана из перечня, состоящего из адипиновой кислоты, яблочной кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, угольной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, малоновой кислоты, глутаровой кислоты, малеиновой кислоты, гликолевой кислоты, молочной кислоты, глюконовой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты.

17. Жидкая композиция по любому из пп.1-16, дополнительно содержащая ионы кальция.

18. Жидкая композиция по любому из пп.1-17, где указанный ротавирусный антиген представляет собой живой ротавирус, такой как живой аттенуированный ротавирус.

19. Жидкая композиция по п.18, где указанный живой аттенуированный ротавирус представляет собой живой аттенуированный ротавирус человека.

20. Жидкая композиция по п.19, где указанный живой аттенуированный ротавирус человека выбран из группы, состоящей из штамма НКУ 89-12С2, депонированного под регистрационным номером АТСС УК 2272, его потомства, химерных и иммунологически активных производных; штамма НКУ Р43, депонированного под регистрационным номером ЕСАСС 99081301, его потомства, химерных и иммунологически активных производных.

21. Жидкая композиция по любому из пп.1-20, где указанная композиция обладает антацидной способностью по меньшей мере 8 мин при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей.

22. Жидкая композиция по п.21, где указанная композиция обладает антацидной способностью по меньшей мере 12 мин при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей.

23. Жидкая композиция по п.22, где указанная композиция обладает антацидной способностью от 8 до 23 мин при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей.

24. Жидкая композиция по п.23, где указанная композиция обладает антацидной способностью от 12 до 23 мин при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей.

25. Жидкая композиция по п.22 или 24, где указанная композиция обладает антацидной способностью от 12 до 20 мин при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей.

26. Жидкая композиция по любому из пп.1-25, где указанная композиция стабильна по меньшей мере при одном из следующих условий: в течение 7 суток при 37°С, в течение одного года при 4°С, в течение двух лет при 4°С.

27. Жидкая композиция по любому из пп.1-26, представляющая собой вакцину.

28. Жидкая композиция по любому из пп.1-27, представленная в дозовом объеме от 0,2 до 2,0 мл.

29. Жидкая композиция по п.28, представленная в дозовом объеме от 0,5 до 1,5 мл.

30. Жидкая композиция по п.29, представленная в дозовом объеме примерно 1,5 мл.

31. Применение жидкой композиции по любому из пп.1-30 для лечения или предупреждения заболеваний, ассоциированных с ротавирусом.

32. Применение по п.31, где указанное лечение или предупреждение включает введение двух пероральных доз безопасного и эффективного количества композиции живого человеческого аттенуированного ротавируса ребенку в возрасте от 4 до 15 недель во время приема дозы 1.

33. Применение по п.31 или 32 для предупреждения ротавирусной инфекции у людей.

34. Применение по пп.31, 32 или 33 для предупреждения ротавирусного гастроэнтерита у людей.

35. Применение по п.34 для предупреждения тяжелого ротавирусного гастроэнтерита у людей.

36. Применение по п.34 или 35, где указанный гастроэнтерит или тяжелый гастроэнтерит вызван ротавирусным штаммом другого серотипа, чем ротавирусный штамм, содержащийся в указанной жидкой композиции.

37. Применение по любому из пп.31-36, где указанная композиция представлена в дозовом объеме от 0,2 до 2,0 мл.

38. Применение по п.37, где указанная композиция представлена в дозовом объеме от 0,5 до 1,5 мл.

39. Применение по п.37 или 38, где указанная композиция представлена в дозовом объеме примерно 1,5 мл.

40. Способ предупреждения или лечения заболеваний, ассоциированных с ротавирусом, у людей путем введения человеку-субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества жидкой композиции по любому из пп.1-27.

41. Способ по п.40 предупреждения ротавирусной инфекции у людей.

42. Способ по п.40 предупреждения ротавирусного гастроэнтерита у людей.

43. Способ по п.42 предупреждения тяжелого ротавирусного гастроэнтерита у людей.

44. Способ по п.42 или 43, где указанный гастроэнтерит или тяжелый гастроэнтерит вызван ротавирусным штаммом другого серотипа, чем ротавирусный штамм, содержащийся в указанной жидкой композиции.

- 51 012046

45. Способ по любому из пп.40-44, где указанная композиция представлена в дозовом объеме от 0,2 до 2,0 мл.

46. Способ по п.45, где указанная композиция представлена в дозовом объеме от 0,5 до 1,5 мл.

47. Способ по п.45 или 46, где указанная композиция представлена в дозовом объеме примерно 1,5 мл.

48. Способ получения жидкой антиротавирусной композиции по любому из пп.1-30, включающий смешивание ротавирусного антигена, сахара и карбоксилата с фармацевтически приемлемым разбавителем.