KR20170109652A - 돼지 유행성 설사 바이러스 감염에 대한 백신 - Google Patents

Abstract

본원은 ATCC 수탁 번호 PTA-121847 하에 기탁된 단리된 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 스트레인, 및 기탁된 스트레인의 배양 중 연속 계대에 의해 생성된 약독화된 스트레인에 관한 것이다. 또한, 본원은 PEDV 감염으로 인한 임상 증상의 발생 또는 중증도를 감소시키기 위한 면역원성 조성물, 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

돼지 유행성 설사 바이러스 감염에 대한 백신

관련 출원의 상호 참조

본 출원은, "돼지 유행성 설사 바이러스 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) 감염에 대한 신규 백신"이란 표제 하에 2015년 2월 3일자로 출원된 미국 가출원 제 62/111,324호의 우선권을 주장하며, 이의 내용 전체가 본원에서 참조로 원용된다.

서열 목록

본 출원은, 2016년 2월 2일 37 KB로 작성된 "46731-PCTSequenceListing" 라는 표제 하에 ASCII 형식의 텍스트 파일로 제출된 컴퓨터 판독 가능한 형식 (CRF)의 서열 목록을 포함한다. CRF의 내용은 본원에 참고로 원용된다.

발명의 분야

본 발명은 PEDV의 약독화된 스트레인, 백신 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)는 감염된 신생 새끼 돼지의 최대 100%에서 극심한 탈수 및 죽음을 초래하거나, 성체 돼지에서 중증 설사 및 구토를 유발하는 코로나바이러스이다. 첫번째 PEDV 사례는 UK 1971에 보고되었으며, 1970년대 및 1980년대 동안 PEDV는 유럽 전역에 확산되었다. 고전 PEDV 스트레인 CV777 (계통 발생학적으로 아그룹 1로 분류됨)은 1976년 벨기에에서 단리되었다. 지난 30여 년간, 아그룹 1 스트레인이 또한 집단발병하여 일부 아시아 국가에서 극심한 경제적 손실과 더불어 유아 새끼 돼지에서 최대 80% 내지 100%의 이환 및 50% 내지 90% 사망을 일으켰다. 미국에서는, 2013년 처음 PEDV가 집단발병하였으며, 이후 이어서 US PEDV 스트레인 (아그룹 2a) PED는 또한 대부분의 주뿐만 아니라 캐나다 및 멕시코로 빠르게 확산되었다. 또한, U.S. PEDV 스트레인은 아시아 및 유럽 국가에서 집단발병하여 전세계적으로 상당한 경제적 및 공중 보건 문제를 일으킨 것으로 보고되었다. PEDV 아그룹 1 스트레인에 대한 변형된 생 약독화된 백신 (MLV)이 유럽 및 아시아 국가에서 사용가능하며, 이들은 PEDV를 조절하는 주요 수단이었다. 그러나, 상기 아그룹 1 MLV는 유전적 다양성 (최대 10%)으로 인해, 유포된 아그룹 2a PEDV 스트레인에 대한 효과적인 보호 면역을 제공하지 못할 수 있다. 현재 미국에서 단지 2개의 조건부 승인된 백신 (Zoetis)이 존재한다: 알파바이러스-기반 백신 (Harris vaccines) 및 비활성화된 백신 (Zoetis). 그러나, MLV는 PEDV U.S. 스트레인에 대해 아직 사용가능하지 않다.

임신한 암퇘지에서 MLV에 이어서 추가접종량 (booster dose)의 비활성화된 백신 또는 MLV를 투여하는 것이 일반적으로 PEDV를 조절하기 위한 효과적인 수단으로 간주되며; MLV는, 신생 새끼 돼지로 전달되어 가장 감염에 취약한 기간 (<2주령) 동안 바이러스 감염으로부터 이들을 보호하는 항체를 생산하기 위하여, 임신한 암퇘지, 특히 PEDV 나이브한 (naive) 암퇘지의 면역계를 효과적으로 초회항원자극 (prime)할 것이다. PEDV U.S. 스트레인에 대한 생 약독화된 백신에 관한 상당한 필요성이 존재한다.

본 발명은 광범위하게는 ATCC 수탁 번호 PTA-121847 하에 기탁된 단리된 PEDV 스트레인의 배양 중 연속 계대에 의해 생성된, 생(live) 약독화된 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 스트레인에 관한 것이다.

또한, 약학적으로 허용가능한 담체 중에 분산된 본 발명에 따른 약독화된 PEDV를 포함하는 면역원성 조성물이 기재된다.

대상체에서 PEDV로 인한 임상 증상의 발생 또는 중증도를 감소시키는 방법이 또한 기재된다. 상기 방법은 일반적으로 대상체에게 본 발명의 다양한 실시형태에 따른 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다.

대상체에서 PEDV 감염에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 키트가 또한 기재된다. 상기 키트는 본 발명의 생 약독화된 PEDV 스트레인을 포함하는 면역원성 조성물; 및 상기 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하기 위한 지침을 포함한다.

대상체에서 PEDV 감염에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 다양한 실시형태에 따른 생 약독화된 PEDV를 포함하는 면역원성 조성물의 용도가 또한 기재된다.

본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 도시된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 있는 이러한 특허 또는 특허 출원 문헌은 요청시 및 필요한 수수료 지불시 사무소에 의해 제공될 것이다.
도 1은 각각의 8aa PEDV 계대의 연속 희석물을 접종하고, 1 ㎍/ml 트립신과 함께 항온처리하고, 이어서 4% 포름알데히드로 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 베로 세포 (Vero cell)의 이미지를 도시하고;
도 2는 A. IFA; 및 B. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 측정된 다양한 배양 조건에서의 PEDV 8aa (P21)의 성장을 도시하고;
도 3은 농축된 PEDV KD (P120), PEDV AA (P103) 또는 PEDV 8aa (P70)와 연속 희석물을 항-PEDV 항혈청으로 웨스턴 블롯 분석한 이미지를 도시하고;
도 4는 A. 생존 곡선; 및 B. PEDV KD P120 (KD P120), PEDV AA P103 (AA P103), PEDV 8aa T5 (T5) 또는 PEDV 8aa E10 (E10)를 1-4일령 새끼 돼지에게 접종한 후의 바이러스 방출 (viral shedding)에 관한 그래프를 도시하고;
도 5는 A. 생존 곡선; 및 B. PEDV 8aa P40 (8aa P40), PEDV 8aa P70 (8aa P70) 또는 PEDV 8aa P105 (8aa P105)를 1-4일령 새끼 돼지에게 접종한 후의 바이러스 방출에 관한 그래프를 도시하고;
도 6은 야생형 PEDV 스트레인으로 공격 (challenge)한 후의 바이러스 방출 결과에 관한 그래프를 도시한다. 도 4 (PEDV E10) 또는 도 5 (PEDV P70)로부터의 동물을 초기 접종 24일 후 야생형 PEDV 스트레인으로 공격하였다. 또한 연령 일치된 (age-matched) 동물을 대조군으로서 공격 연구에 사용하였고;
도 7은 야생형 PEDV로의 공격 전후 공격 연구에서의 동물의 연속 SN 역가의 그래프를 도시한다. A-C: 공격 전 (접종-후 각각의 적응된 PEDV 스트레인) 또는 공격 후 (공격 이후)의 PEDV 8aa E10, PEDV 8aa P70 또는 대조군 그룹에 관한 개별 SN 역가. D: PEDV 공격 전후 모든 그룹의 평균 SN 역가.

본 발명은 이전에 보고된 PEDV 스트레인과는 상이한 미국으로부터의 PEDV 스트레인에 관한 것이다. 본 발명은 단리된 U.S. PEDV 스트레인으로부터 생성된 약독화된 PEDV RNA 바이러스, PEDV 감염에 대해 백신접종하기 위한 면역원성 조성물, 및 이와 관련된 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 2014년 12월 11일 부다페스트 국제 조약하에 ATCC 수탁 번호 PTA-121847로 미국 버지니아주 20110-2209 매너서스 10801 유니버시티 불리버드 (University Boulevard)에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 기탁된, 8aa PEDV P40로 지정된 PEDV 스트레인에 관한 것이며, 이는 본원에 참조로 원용된다. ATCC에 기탁된 PEDV 스트레인은 글리코케노데옥시콜산 (GCDCA)을 함유하는 배양 중의 베로 세포 (Vero cell)에서 적어도 40회 연속 계대 (P40) 함으로써 약독화되었다. 하나 이상의 실시형태에서, 본 발명은 8aa PEDV P40을 추가로 연속 계대하여 유래된 생 약독화된 바이러스 (즉, 기탁된 바이러스의 자손)에 관한 것이다. 용어 "로부터 유래된" 또는 "로부터 생성된"은 상기 기탁된 스트레인을 본원에 기재된 조건 (예: 컨쥬게이션된 담즙산, 단순 배지, 효소가 없는 배지 등) 하에 세포 배양 중 연속 계대함으로써 이의 자손 (유도체라고도 함)이 발생된 것을 지칭한다. 하나 이상의 실시형태에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 PTA-121847 하에 기탁된 PEDV에 관한 것이며, 이는 이후에 배양 중 적어도 30회 연속적으로 계대되어 본원에서 PEDV 8aa P70으로 지정된 완전 약독화된 자손 바이러스를 생성한다. 하나 이상의 실시형태에서, 상기 스트레인은 배양 중 적어도 65회 추가로 연속적으로 계대되어 본원에 PEDV 8aa P105로서 표시되는 완전 약독화된 자손 바이러스를 생성한다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 바람직하게는 담즙산 (예: GCDCA)을 함유하는 배양 중 적어도 총 70회 (P70), 및 바람직하게는 적어도 총 105회 (P105) 계대된 PEDV ATCC 수탁 번호 PTA-121847의 PEDV에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, PEDV는 계대수 20 후 배지 중에서 임의의 효소 또는 GCDCA의 첨가 없이 증식될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 바이러스는 트립신 및/또는 엘라스타아제 없이 계대된다. 하나 이상의 실시형태에서, 상기 바이러스의 연속 계대용 배양은 실질적으로 엘라스타아제, 트립신, 및/또는 GCDCA가 없다. 본원에 사용되는 용어 "실질적으로 없는"은 성분이 조성물에 의도적으로 첨가되지 않은 것을 의미하며, 본 발명을 벗어나지 않으면서 미량 또는 불순물이 조성물 내에 존재할 수도 있는 것으로 이해된다. 달리 말하면, 제외되는 성분은 바람직하게는 약 0.1 ㎍/ml 미만, 보다 바람직하게는 약 0.1 ug/ml 미만의 양으로 존재한다. 바람직하게는, 바이러스 계대용 배양 배지는 GCDCA (100 μM) 또는 소 태아 혈청 (FBS)이 존재 또는 부재하는 단순 최소 필수 배지 (MEM)를 포함한다.

따라서, 바람직한 실시형태에서, PEDV는 효소-독립적이며, 구체적으로는 트립신- 또는 엘라스타아제-독립적이다. 용어 "효소-독립적인 (enzyme-independent)" 및 이의 관련 용어는 바이러스가 성장하는데 효소를 필요로 하지 않으며, 효소 없이 배양물 중에서 성장할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 효소-독립적인 PEDV는, 엘라스타아제 (약 5x10⁶ TCID₅₀/ml) 또는 트립신 (약 5x10⁶ TCID₅₀/ml)에서 성장한 PEDV보다, GCDCA (100 μM)의 존재 또는 부재하에서 성장한 PEDV에서 일관성있게 더 높은 역가 (>1x10⁸ TCID₅₀/ml)를 산출한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 담즙산을 사용한 효소-독립적인 바이러스의 생산 방법이 기재된다. 효소-독립적인 PEDV를 담즙산의 존재하에서 적어도 20회 계대하고, 이어서 담즙산의 존재 또는 부재하에서 적어도 50회 (총 P70 동안) 계대함으로써 PEDV를 약독화시키는 방법이 또한 기재된다. 고도로-계대된 (>P100) 효소-독립적인 PEDV가 또한 기재된다. 10-20회 동안 계대한 후, 이러한 효소-독립적인 PEDV (PEDV-8aa)의 성장은 세포 배양물 중 트립신 또는 엘라스타아제의 존재하에 급격히 제한되고; 따라서, 돼지 (swine)에서 약독화를 나타낸다. 하나 이상의 실시형태에서, 효소-독립적인 PEDV는 트립신 및/또는 엘라스타아제 (<1x10² TCID₅₀/ml)의 존재하의 배양 중에서 성장이 제한되었다. 효소-독립적인 PEDV는 생체내 P70 이상에서 완전 약독화된다. 보다 구체적으로는, 실시예에서 입증된 바와 같이, 고도로-계대된 (P70 또는 P105) 효소-독립적인 PEDV는, 경구 영양을 통해 접종된 경우 1 또는 2일령 새끼 돼지에서 완전 약독화된다.

일 실시형태의 본 발명은, 돼지에서 PEDV 감염의 발생을 감소시키거나 중증도를 경감시키기 위해, 돼지에게 사용하기 위한 약독화된 백신 (면역원성 조성물), 및 돼지에서 PEDV와 관련된 임상 증상의 발생을 감소시키거나 중증도를 감소시키기는 방법을 포함한다. PEDV 감염과 관련된 임상 증상은 묽은 변, 바이러스 방출, 설사, 체중 감소, 식욕부진 (음식 혐오), 기면증, 및/또는 사망을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 바이러스 방출의 양 또는 길이 또는 이러한 증상이 있는 기간을 감소시킨다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 설사의 양 또는 기간, 또는 이러한 증상이 있는 기간을 감소시킨다.

상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 분산된 본원에 기재된 약독화된 PEDV RNA 바이러스를 포함한다. 조성물은 담체 중에 분산된 치료학적 유효량의 바이러스를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "치료학적 유효" 량은, 연구원 또는 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하고, 특히, 바이러스 복제를 억제 및/또는 감염 중증도를 경감시킴으로써 바이러스 감염에 대한 일부 목적하는 치료 또는 예방 효과를 발생시키는 양을 지칭한다. 당업자는, 상기 양이, 병태가 완전히 근절되거나 예방되지 않고, 이의 증상 및/또는 효과가 대상체에서 부분적으로 개선되거나 완화될지라도 치료학적으로 "효과적인" 것으로 간주될 수 있는 양이라는 것을 알 것이다. 하나 이상의 실시형태에서, 상기 조성물은 단위 용량 당 적어도 약 1x10⁷ TCID₅₀ (접종된 배양물의 50%를 감염시키는 조직 배양 감염 용량)의 약독화된 PEDV, 및 바람직하게는 단위 용량 당 약 1x10⁴ 내지 약 1x10⁹ TCID₅₀의 약독화된 PEDV를 포함할 것이다. 달리 말하면, 각 용량 중 바이러스의 농도는 최대 약 7 log₁₀ TCID₅₀/ml, 보다 바람직하게는 약 4 내지 약 9 log₁₀ TCID₅₀/ml, 및 보다 더 바람직하게는 약 6 내지 8 log₁₀ TCID₅₀/ml 이어야 한다. 치료학적 유효량의 약독화된 바이러스는 대상체의 크기 및 종, 및 투여 방식에 따라 다를 수 있다.

본원에 사용되는 용어 담체는 약독화된 바이러스가 투여를 위해 분산될 수 있는 희석제, 부형제 및 비히클 등을 지칭한다. 적합한 담체는 약학적으로 허용가능할 것이다. 적합한 담체는 수의용으로 적합한 것뿐 아니라 인간의 약제학 용도로도 적합한 것을 포함하며, 이는 투여 경로에 따라 상이할 것이다. 예시적인 담체로는 수성 용액, 예컨대, 물, 생리 (n.) 식염수 (~0.9% NaCl), 인산염 완충 식염수 (PBS), 멸균된 물/증류 가압멸균된 물 (DAW), 덱스트로오스, 다양한 수중유 또는 유중수 에멀젼, 및 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 에탄올, 글리세롤, 또는 다른 허용가능한 희석제 등을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한"이란, 과도한 독성, 자극, 또는 알러지 반응이 없이 대상체에게 투여될 수 있고, 허용가능하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않거나 조성물의 임의의 다른 성분과 해로운 방식으로 상호작용하지 않는다는 점에서, 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않다는 것을 의미한다. 당업자에게 잘 공지되 있는 바와 같이, 약학적으로 허용가능한 담체는 바이러스 또는 다른 작용제의 임의의 분해를 최소화하고, 대상체에서 임의의 부작용을 최소화하기 위하여 자연히 선택될 것이다.

조성물에 사용하기 위한 추가의 약학적으로 허용가능한 성분은 애주번트, 추가 항원, 완충제, 염, 안정화제, 희석제, 보존제, 항생제, 등장성제, 세포 배지 (예: MEM, FBS) 및 착향료 등을 포함한다. 예시적인 등장성제는 덱스트로오스, 락토오스, 당 알콜 (예: 소르비톨, 만니톨) 등을 포함한다. 안정화제는 당, 예컨대, 슈크로오스 및 락토오스, 아미노산, 예컨대, 글리신 또는 글루탐산의 일나트륨 염 및 단백질, 예컨대, 알부민 또는 젤라틴, 및 이의 혼합물을 포함한다. 예시적인 보존제로는 포름알데히드, 티메로살 등을 포함한다. 용어 "애주번트"는 활성제 (이 경우, 약독화된 바이러스)에 대한 면역반응을 강화시키거나 조절하는 성분을 지칭한다. 예시적인 애주번트로는 알루미늄 염, (예: Al(OH)₃, AlPO₄ 등), 미네랄유, 식물성유, 스쿠알렌 (AS03, MF59), 사포닌 (QS-21) 등을 포함한다. 존재하는 경우, 애주번트는, 100% 부피로 취해진 전체 면역원성 조성물 부피의 약 0.01 내지 50%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 30%, 보다 바람직하게는 약 5% 내지 약 25%, 및 가장 바람직하게는 약 10% 내지 약 20% 농도로 조성물 중에서 사용된다.

본원에 기재된 실시형태에 따른 조성물은 대상체 (예: 돼지)에서 PEDV로부터의 바이러스 감염을 치료하는데 및/또는 감염으로 인한 임상 증상을 예방 또는 감소시키는데 유용하다. 따라서, 본원에 기재된 실시형태는 치료적 및/또는 예방적 용도를 가지며, 특히 바이러스 감염의 예방적 치료에 사용될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 예방적으로 투여된다, 즉, 대상체가 감염의 검출가능한 임상 징후를 나타내기 전에, 대상체가 바이러스에 의한 감염에 대해 적응 면역 반응을 발생시키도록 투여된다. 이처럼, 상기 방법은, 바이러스 감염으로부터 관찰가능한 임상 증상의 발생을 예방하는데, 및/또는 임상 증상 및/또는 감염 효과의 발생 또는 중증도를 감소시키는데, 및/또는 감염/증상/효과의 지속기간을 감소시키는데, 및/또는 바이러스 방출 (예: 감염된 대상체로부터 바이러스 또는 바이러스 입자의 배출 또는 방출)을 감소시키는데, 및/또는 감염된 대상체로부터의 바이러스 또는 바이러스 입자의 방출 기간을 감소시키는데 유용하다. 따라서, 상기 조성물은 바이러스 감염으로 인한 이환의 정도를 단지 부분적으로 예방 및/또는 경감시킬 수 있다 (즉, 증상의 중증도 및/또는 감염 효과를 감소시킴, 및/또는 감염/증상/효과의 지속기간을 감소시킴). 그러나, 상기 조성물은 표적 감염 또는 질환을 치료 또는 예방하는 것으로도 간주된다.

상기 방법은 대상체에게 면역원성 조성물읕 투여함을 포함한다. 일반적으로, 대상체는 PEDV에 취약한 동물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역원성 조성물은 임신한 동물에게 투여되어 간접적으로 이의 새끼에게 모체 항체를 수동 전달함으로써 면역성을 유도한다. 예를 들어, 본 발명은 임신한 암퇘지에게 유효량의 약독화된 PEDV를 투여함으로써 새끼 돼지에게 PEDV에 대한 면역성을 부여하는 방법에 관한 것이며, 여기서 결과적으로 새끼 돼지는 백신접종되지 않은 암퇘지가 낳은 새끼 돼지에 비해 이환률 및/또는 사망률이 감소되었다. 기재된 실시형태는 사용되는 특정 담체 및 다른 성분에 따라 다양한 투여 경로에 적합하다. 예를 들어, 조성물은 근육내, 피하, 피내 또는 정맥내로 주사될 수 있다. 또한 이는 점막을 통해, 예컨대, 비강내로 투여될 수 있으나, 바람직한 실시형태에서는 경구로 투여된다. 경구 투여는 예를 들어 상기 조성물을 동물의 먹이 또는 음료에 첨가함을 포함할 수 있다.

상술된 실시형태는 병용 요법으로 또는 다른 면역원성 물질 및 백신과 함께 면역화 일정의 일부로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 초회항원자극-및-추가접종 (prime-and-boost) 요법이 사용될 수 있으며, 이는 약독화된 바이러스를 적어도 하나의 1차 (primary) 투여 및 적어도 하나의 추가접종 투여함으로 구성된다.

이와 관계없이, 약독화된 바이러스를 투여하는 것은 동물 (또는 가능한 경우 새끼)에서 면역 반응을 유도한다. 이러한 "면역 반응"은 예를 들어 약독화된 바이러스의 항원 또는 항원성 성분에 특이적으로 지시된 항체, B 세포 및/또는 다양한 T 세포의 생산 또는 활성화를 포함한다. 면역 반응은 관찰가능한 임상 증상의 부재, 감염된 동물에 의해 일반적으로 나타나는 임상 증상의 감소, 감염으로부터의 빠른 회복 기간 및 바이러스 방출의 감소된 지속기간 또는 양 등을 통해 입증될 것이다. 따라서, 백신접종된 동물은 백신접종되지 않은 동물에 비해 신규 감염 (또는 관찰 가능한 감염 징후)에 대한 저항성 또는 감소된 감염 중증도를 나타낼 것이다. 본 발명은 특히 신생, 배아 및 태아기를 비롯한 모든 발달 단계의 돼지 (pig)에 관한 것이다.

임상 증상 및/또는 바이러스 방출의 발생, 중증도 및/또는 지속기간을 "감소시킴"은 백신접종되지 않은 동물 중 야생형 감염에 비해, 그룹 내 감염된 동물 수 감소, 감염의 임상 증상을 나타내는 동물 수 감소 또는 제거, 또는 동물 중에 존재하는 임의의 임상 증상의 중증도 감소시킴을 의미한다. 바람직하게는, 이는, 백신을 투여하지 않아 감염될 가능성이 있는 동물에 비해 본 발명의 약독화된 PEDV를 투여한 동물에서 적어도 10%까지 감소된다. 보다 바람직하게는, 감염의 임상 증상은 백신을 투여한 동물에서 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 및 보다 훨씬 더 바람직하게는 적어도 50%까지 감소된다.

일부 실시형태에서, 백신은 적절한 용기 내 단위 투여형으로 제공될 수 있다. 용어 "단위 투여형"은 동물용 단위 용량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다. 각 단위 투여형은 담체 중에 목적하는 효과를 생성하도록 계산된 기결정된 양의 백신 (및/또는 다른 활성제)을 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, 백신은 대상체로 투여하기 전 현장에서 혼합할 수 있도록 담체로부터 분리되어 (예: 자체 바이알, 앰풀, 사셰, 또는 다른 적합한 용기 내에) 제공될 수 있다. 면역원성 조성물을 포함하는 키트가 또한 본원에 기재된다. 키트는 대상체에게 백신을 투여하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 바이러스는 약학적으로 허용가능한 담체 중에 이미 분산된 투여 용량의 일부로 제공되거나, 담체로부터 분리되어 제공될 수 있다. 키트는 대상체로 투여하기 위한 바이러스를 제조하기 위한 지침, 예를 들어, 바이러스를 적절한 담체 중에 분산시키기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 PEDV를 약독화시키고/시키거나 고 역가의 PEDV를 산출하는 방법에 관한 것이다. PEDV가 "약독화되는 것"은, 이전의 독성 바이러스가 이의 독성 특성을 실질적으로 제거하면서도 그의 면역원성은 유지하도록 변형되는 것을 의미한다. 하나 이상의 실시형태에서, 단리된 (바람직하게는 야생형) PEDV 스트레인은 감염성 바이러스 입자의 생산 및 바이러스 입자의 회수에 적합한 조건하에서 베로 세포 중에서 연속적으로 계대된다. 회수된 바이러스는 처음의 (야생형) 단리된 PEDV와 비교한 바와 같이 약독화되었다. 보다 특히, 본 방법은 엘라스타아제 또는 컨쥬게이션된 담즙산을 함유하는 배양물 중의 세포를 항온처리하여 각각 엘라스타아제-적응된 PEDV 또는 효소-독립적인 PEDV를 수득하는 것을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, PEDV는 엘라스타아제 중에서 성장하며 적어도 20회 계대된다. 엘라스타아제-계대된 PEDV는 후에 트립신으로 적정되는 경우 트립신 (3x10⁶ TCID₅₀/ml) 중에서 성장한 PEDV보다 다소 더 높은 역가 (5x10⁶ TCID₅₀/ml)를 산출한다. 하나 이상의 실시형태에서, PEDV는 컨쥬게이션된 담즙산 (예: GCDCA) 중에서 성장하고 적어도 20회 계대되어 효소-독립적인 PEDV를 생성한다. P20의 효소-독립적인 PEDV는 이어서 배양 중 담즙산 없이 증식되나, 이들보다 빠르게 성장한다. 효소-독립적인 PEDV는 담즙산의 존재 또는 부재하에 단순 MEM 또는 FBS 중에서 배양될 수 있다.

높은 역가의 효소-독립적인 PEDV 외에도, 이는 백신 제조에서 트립신 (또는 엘라스타아제) 중에서 성장한 PEDV 보다 이점을 갖는다: 프로테아제는 바이러스 배양 과정 및 백신 제조 동안에 세포 또는 바이러스에 영향을 끼쳐 일정하지 않은 역가 또는 변형된 항원을 산출할 수 있다. 백신학에서 효소-독립성을 갖는 바이러스의 이점 이외에도, 효소-독립적인 바이러스의 한가지 특히 유용한 적용대상은 혈청 중화 분석 (serum neutralizing assay)이다: 혈청-중화 분석 중의 혈청은, 트립신 또는 엘라스타아제 활성을 억제함으로써 분석능을 방해하여 일정하지 않은 결과를 가져올 수 있다. PEDV 항체에 대한 동물 혈액의 진단 및/또는 평가에서 이러한 분석의 효소-독립적인 바이러스의 이용은, 효소-의존적인 바이러스를 사용하는 분석보다 더 정확하고 일정한 결과를 제공한다.

본 발명의 다양한 실시형태의 추가적인 이점은 본원의 기재 및 하기 실시예에 따라 당업자에게 자명할 것이다. 본원에 기재된 다양한 실시형태는 달리 지시되지 않는 한 반드시 상호 배타적이지 않다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에 기재되거나 묘사된 특징은 또한 다른 실시형태에도 포함될 것이나, 반드시 그런 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 구체적인 실시형태의 다양한 조합 및/또는 통합을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 2개 이상의 항목이 나열되는 경우 사용되는 어구 "및/또는"은 나열된 항목 중 임의의 하나가 그 자체로 사용될 수 있거나, 또는 나열된 항목 중 2개 이상의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 조성물이 구성요소 A, B, 및/또는 C를 포함하거나 제외한다와 같이 기술되는 경우, 상기 조성물은 A 단독; B 단독; C 단독; A 및 B를 조합하여; A 및 C를 조합하여; B 및 C를 조합하여; 또는 A, B, 및 C를 조합하여 포함하거나 제외할 수 있다.

본 설명은 또한 본 발명의 다양한 실시형태에 관한 특정 파라미터를 정량화하기 위한 수치 범위를 사용한다. 수치 범위가 제공되는 경우, 이러한 범위는 낮은 값의 범위 만을 열거하는 청구 범위뿐만 아니라 높은 값의 범위 만을 열거하는 청구 범위에 대한 문자적 지원을 제공하는 것으로 해석되야 한다는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 약 10 내지 약 100의 수치 범위는 "약 10 초과" (상한 없음) 및 "약 100 미만"을 열거하는 청구항에 대한 문자적 지원을 제공한다.

실시예

하기 실시예로 본 발명에 따른 방법을 설명한다. 그러나, 이러한 실시예는 설명으로써 제공되며, 본 발명의 전체 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 것으로 이해된다.

재료 및 방법

실시예 1 - PEDV 스트레인의 단리 및 재료

ATCC (Manassas, VA)로부터 베로 세포 (Vero cell)를 수득하고, 5% 소 태아 혈청 및 항생제 (클로르테트라사이클린 [25 ㎍/ml], 페니실린 [250 U/ml], 및 스트렙토마이신 [250 ㎍/ml])를 함유하는 둘베코의 최소 필수 배지 (DMEM)에서 이를 유지시켰다. 돼지 공격 연구 (challenge study)로부터 바이러스 접종 후 43일에 수집된 개별 또는 풀링된 회복기 (convalescent)의 돼지 혈청을 항-PEDV 항체의 공급원으로 사용하였다. 바이러스 접종 전 풀링된 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. L-1-토실아미드-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤 (TPCK)-처리된 트립신 및 GCDCA를 시그마-알드리치 [Sigma-Aldrich (St Louis, MO)]로부터 구입하고, 돼지 (porcine) 췌장으로부터의 엘라스타아제를 프로메가 [Promega (Madison, WI)]로부터 수득하였다.

PEDV US 스트레인의 단리를 위하여, 4일에 진단 샘플 (2013년 PEDV 집단발병 경험이 있는 인디애나 농장에서 제출됨)로 접종된 돼지로부터의 장 내용물을 1:10으로 최소 필수 배지 (MEM)에 희석시키고, 0.2 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하였다. 제조된 샘플을 6-웰 플레이트 중에서 성장한 융합성 (confluent) 베로 세포에 접종하고, 트립신 존재하에 (1-2 ㎍/ml) 임의의 보충물이 없는 MEM 중에 항온처리하였다. 접종 4일 후, 바이러스 감염된 세포 (플레이트)를 3회 동결/해동을 반복하여 분해시키고, 이어서 상기 액체를 새로운 베로 세포 내로 접종 (계대)하였다. 2회 계대 후, 바이러스-특이적 세포변성 효과를 관찰하고, 이를 베로 세포에서 추가로 계대하였다. 추가 계대 동안 한계 희석법으로 바이러스를 추가로 클로닝하였다.

면역형광법 (IFA) 및 스파이크 (S) 유전자를 서열분석함으로써 클로닝한 바이러스를 PEDV로 확인한 후, 배지 중 트립신 (1 ㎍/ml), 엘라스타아제 (1 ㎍/ml) 또는 글리코케노데옥시콜산 (GCDCA) (100 μM)을 포함하는 상이한 조건 하에서 이를 추가로 계대하고, 생성된 바이러스를 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이 각각 PEDV KD, PEDV AA 또는 PEDV 8aa로 지정하였다. 바이러스를 최대 120 계대까지 각 조건하에 추가로 계대하였다. 매 3-5회 계대마다, PEDV KD, PEDV AA 또는 PEDV 8aa의 역가를 각각 트립신 (1 ㎍/ml), 엘라스타아제 (1 ㎍/ml) 또는 GCDCA (100 μM)의 존재하에 TCID₅₀ 방법 (Reed-Muench method)으로 측정하였다.

이러한 새롭게 계대된 바이러스 이외에도, 본 발명자들은 또한 계대수 120에서 PEDV 8aa로 감염된 세포의 배지 중에 엘라스타아제 (1 ㎍/ml)를 도입하고, 엘라스타아제의 존재하에서 이를 10회 계대하였다. 이러한 세포를 PEDV 8aa E10로 지정하였다. PEDV 8aa E10를 트립신 (1 ㎍/ml)의 존재하에서 5회 추가로 계대하고, 생성된 바이러스를 PEDV 8aa T5로 지정하였다. 실시간 qRT-PCR, IFA 및 웨스턴 블롯 분석을 비롯한 다양한 실험을 PEDV KD, AA, 8aa, 8aa E10 및 8aa T5의 특성에 대해 수행하였다.

실시예 2 - 트립신- 계대된 PEDV (KD P1, P2, P3 등으로 지정)

실시예 1에 기재된 바와 같이 PEDV를 트립신 (1-2 ㎍/ml)의 존재하에서 단리하고 계대하였다. 약 20회 계대 후, 바이러스는 더 빨리 성장하기 시작했고 (세포변성 효과 (CPE)가 더 빨리 진행됨), 더 큰 융합체 (syncytia)가 세포 단층에서 나타났다. 각 계대에서, 바이러스를 1:1,000 희석으로 새로운 베로 세포에 옮기고, 30h 미만에서 이를 수확하고 이어서 바이러스를 접종하였다. 트립신-적응된 바이러스 ("KD"로 지정)를 2014년 12월 11일 부다페스트 국제 조약하에 ATCC 수탁 번호 PTA-121846로서, 미국 버지니아주 20110-2209 매너서스 10801 유니버시티 불리버드에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁하였고, 이는 본원에 참조로 원용된다.

실시예 3 - 엘라스타아제-계대된 PEDV (AA P1, P2, P3 등으로 지정)

실시예 1에 기재된 바와 같이 트립신의 존재하에서 PEDV를 처음 단리하고, 이어서 이를 췌장 엘라스타아제 (1-2 ㎍/ml)의 존재하에 계대하였다. 약 10회 계대 후, 바이러스는 더 빨리 성장하기 시작하였다 (CPE가 더 빨리 진행됨). 각 계대에서, 새로운 베로 세포를 1:500 희석으로 바이러스로 접종하고, 바이러스를 30h 미만에서 수확하고 이어서 바이러스를 접종하였다. 엘라스타아제-계대된 바이러스는 트립신 존재하에서도 양호하게 성장할 수 있고, 대분의 바이러스 적정을 트립신 (1-2 ㎍/ml)으로 수행하였다. 바이러스를 6-웰 플레이트 또는 175 cm² 플라스크 중에서 계대하였다. 엘라스타아제-적응된 바이러스 ("AA"로 지정)를 2014년 12월 11일 부다페스트 조약하에 ATCF 수탁 번호 PTA-121845로서, 미국 버지니아주 매너서스 10801 유니버시티 불리버드에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁하였고, 이는 본원에 참조로 원용된다.

실시예 4 - 임의의 효소 없이 PEDV 성장 ( 8aa P1, P2, P3 등)

PEDV를 임의의 프로테아제 없이 적응시켜 성장시키고 계대하였다. PEDV를 컨쥬게이션된 담즙산 (GCDCA, 100 uM 포함)의 존재하에 베로 세포 중에서 계대함으로써 이를 달성하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리된 PEDV를 베로 세포 중에 접종하고, 다양한 농도의 GCDCA (1-200 μM)를 함유하는 MEM으로 4일 동안 항온처리하였다. 이 후, 바이러스 감염된 세포 (플레이트)를 동결/해동을 3회 반복하여 분해시키고, 이어서 상기 액체를 GCDCA (100 μM) 존재하에 새로운 베로 세포 내로 접종 (계대)하였다. 3-4회 계대 후, 바이러스는 세포 배양물 중 임의의 효소가 없는 조건 (단순 MEM) 중에서 양호하게 성장하였다. 바이러스를 1:200 희석으로 새로운 베로 세포에 옮겨 GCDCA (100 μM)와 함께 추가로 계대하고, 바이러스 접종 후 48h 미만에서 이를 수확하였다. 이러한 바이러스는, 바이러스 복제 말기에 세포에 괴사를 유도하는 것으로 보이는 트립신 또는 엘라스타아제의 존재하에서 성장한 PEDV의 특징적인 형태인 융합체 (syncytium)를 형성하지 않고 성장한다. 따라서, 세포 단층의 집중적인 괴사는 바이러스 감염 후 약 40-48h에서 나타난다. GCDCA와 함께 계대된 PEDV는 또한 GCDCA의 부재하에 (GCDCA 없이 CPE가 보다 느리게 진행됨) 또는 소 태아 혈청 (FBS)의 존재하에 단순 MEM에서 성장할 수 있다. GCDCA가 있는 세포 배양물에 완전히 적응되고 나면, 바이러스는 트립신의 존재하에서 (엘라스타아제 적응된 PEDV와는 달리) 더 이상 양호하게 복제되지 않으며 (표 2 및 도 1), 이는 이러한 바이러스의 성장이 동물 중에서 약독화될 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 이러한 효소-독립적인 PEDV (8aa)는 사멸된 및 약독화된 백신에 대한 뛰어난 후보일 수 있다. 또한, 트립신 존재하의 8aa PEDV의 제한된 성장을 IFA 및 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다 (도 2). 효소-독립적인 바이러스 (본원에서 "8aa"로 지정됨)를 2014년 12월 11일 부다페스트 국제 조약하에 ATCC 수탁 번호 PTA-121847로서, 미국 버지니아주 20110-2209 매너서스 10801 유니버시티 불리버드에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁하였고, 이는 본원에 참조로 원용된다.

실시예 5. 생성된 스트레인의 항원성

실시간 qRT-qPCR: 대변 샘플 또는 세포 배양물로부터 PEDV RNA를 추출하고 이어서 제조 프로토콜에 따라 RNeasy 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 동결 및 해동을 반복하였다. N 유전자를 표적화하는 하기 프라이머 및 프로브 (-3')를 이용하여 One-Step Platinum qRT-PCR 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 실시간 qRT-PCR를 수행하였다:

정방향 프라이머- 5'-TCTCGTAAGAGTCCGCTAGCTC-3' (서열 번호 4)

역방향 프라이머- 5'-GCTATGCTCAGATCGCCAGT-3' (서열 번호 5)

프로브- 5'-TGCTCTTTGGTGGTAATGTGGC-3' (서열 번호 6)

프로브는 내부 ZEN Quencher (비-염기 조절제, 5' 염료로부터 9 염기에 위치됨) 및 3' Iowa Black® Fluorescent Quencher (IABkFQ)가 있는 5' FAM™ 염료 (Applied Biosystems)를 포함한다. 하기 조건을 이용하여 Rotor-Gene Q (Qiagen) 중에서 qRT-PCR 증폭을 수행하였다: 50 ℃에서 30분 및 95 ℃에서 5분, 이어서 95 ℃에서 15초 변성, 60 ℃에서 60초 어닐링 및 72 ℃에서 30초 신장으로 30 사이클. 세포 배양물 중에서 성장한 PEDV를 연속 희석하여 생성된 표준 곡선으로부터 유도된 방정식에 기초하여 Ct 값을 TCID50 당량/ ml로 변환시켰다.

웨스턴 블롯: 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 6 웰 플레이트 중에 성장한 융합성 베로 세포를 각각 트립신, 엘라스타아제 또는 GCDCA의 존재하에 PEDV KD, PEDV AA 또는 PEDV 8aa (2 MOI)로 감염시켰다. 유사하게는, 트립신, 엘라스타아제 또는 GCDCA의 존재 또는 부재하에서 PEDV 8aa의 성장을 또한 웨스턴 블롯 분석으로 모니터링하였다. 바이러스 감염 24시간 후, SDS-PAGE 용 세포 용해물 (12% 트리스-글리신 겔)을 제조하고, 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 양성 또는 음성 돼지 혈청에 이어서 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-컨주게이션된 염소 돼지(swine) IgG 항체로 프로빙하였다. 단백질을 화학발광법 (Thermo Scientific)으로 시각화하였다. 초원심분리 (30% 슈크로오스 쿠션 중에서 100,000xg로 2시간 동안)로 농축된 (X100) PEDV KD, PEDV AA 또는 PEDV 8aa를 또한 웨스턴 블롯 분석으로 관찰하였다. 웨스턴 블롯 분석용 SDS-PAGE를 위해 각각의 농축된 PEDV (1:5, 1:50 또는 1:500) 계대의 연속 희석물을 제조하였다. US PEDV 스트레인으로 감염된 돼지로부터 풀링된 회복기 혈청 (43일)에 대해 엘라스타아제-적응된 (AA) 또는 효소-독립적인 PEDV (8aa PEDV)로 웨스턴 블롯 분석하거나, 트립신-적응된 (KD), 엘라스타아제-적응된 (AA) 또는 효소-독립적인 PEDV (8aa PEDV)로 혈청 중화 분석한 결과, US PEDV 스트레인으로부터의 혈청 중의 항체가 KD, AA 및 8aa의 바이러스 단백질을 인식한다는 것을 입증하였고 (도 3), 이는 이러한 스트레인이 이의 모 KD 스트레인 및 US PEDV 스트레인으로부터의 중화 항체를 비롯한 유사한 면역원성 에피토프를 보유한다는 것을 의미한다.

면역현광 분석 (IFA): 바이러스 단백질 분석을 위하여, 96 웰 플레이트 중에 성장한 융합성 베로 세포를 각각 트립신, 엘라스타아제 또는 GCDCA의 존재하에서 PEDV KD, PEDV AA 또는 PEDV 8aa (2 MOI)로 감염시켰다. 감염 24시간 후, 세포를 차가운 메탄올로 고정시켰다. IFA를 위하여, 양성 또는 음성 혈청을 각 웰에 첨가하고, 이어서 FITC-컨주게이션된 염소 항-돼지(swine) IgG로 항온처리하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고 형광 현미경 하에서 형광으로 시각화시켰다.

항체 적정 및 혈청 중화: 돼지 혈청 샘플 중 PEDV KD 또는 PEDV 8aa에 대한 IFA 항체 역가를 측정하기 위하여, 바이러스 감염된 세포를 PEDV KD 또는 PEDV 8aa를 MOI 1의 융합성 베로 세포로 접종하여 제조하였다. 바이러스-감염된 세포를 트립신 또는 GCDCA의 존재하에 37 ℃에서 24시간 동안 항온처리한 후, 차가운 메탄올로 고정시켰다. 각각의 혈청 샘플을 PBS 중에서 2 또는 10배 희석시켰고, 50 ㎕의 희석된 샘플을 PEDV-감염된 세포를 함유하는 각 웰에 첨가하였다. 37 ℃에서 1시간 항온처리한 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고, FITC-컨주게이션된 토끼 항-돼지(swine) Ig를 염색을 위하여 각 웰에 첨가하였다. 염색 30분 후, 형광 현미경으로 세포 중 형광 시그널을 관찰하였다. 형광 시그널을 나타내는 마지막 희석으로서 IFA 역가를 측정하였다.

동일한 회복기 혈청 (43일) 및 트립신-적응된 (KD), 엘라스타아제-적응된 (AA) 또는 효소-독립적인 PEDV (8aa PEDV)로 혈청 중화 분석 (SN)을 수행하였다. 풀링된 혈청을 MEM 중에서 2배 희석하고, 동일한 부피 (각 50 ul)의 각 KD, AA 또는 8aa PEDV (200 TCID₅₀ 역가)와 혼합하였다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 30분 동안 항온처리하고, 이어서 새로운 베로 세포로 옮기고, 트립신 (1-2 ug/ml) 존재하에 KD 또는 AA PEDV를, 또는 GCDCA (100 μM) 존재하에 8aa PEDV를 항온처리하였다. 항온처리 3일 동안 CPE의 외형을 관찰함으로써 혈청 중화 역가를 측정하였다. 역가를 상반된(reciprocal) 혈청 희석으로 CPE 억제를 측정하였다. 반복된 분석으로 역가가 KD 또는 AA PEDV에 비해 8aa PEDV가 보다 더 일정하다는 것이 나타났으며, 이는 혈청과 트립신/엘라스타아제 활성과의 상호작용 때문일 수 있다. 풀링된 혈청의 IFA 또는 SN 역가는 각각 ~ 400 또는 ~ 80에서 8aa 또는 KD PEDV와 필적하였다.

실시예 6 - 8aa PEDV P40 접종된 새끼 돼지에 대한 면역 반응

8aa PED에 대한 면역 반응을 측정하는 동물 연구를 수행하였다. 4마리의 4일령 사육(nursing) 새끼 돼지를 경구 영양으로 동물 당 8aa PEDV P40 1X10⁶ TCID₅₀로 접종하였다. 새끼 돼지로부터 방출된 PEDV로 성체 돼지가 감염되도록 새끼 돼지 및 성체 돼지를 함께 감금하였다. 새끼 돼지로부터의 바이러스 방출 및 설사를 비롯한 임상 증상이 바이러스 접종 후 약 3일부터 발생하였다. 3주 후, 혈청 샘플을 각 새끼 돼지 및 암퇘지로부터 수집하였다. 8aa 또는 KD PEDV에 대한 IFA 및 SN 역가에 대해 수집된 혈청 샘플을 시험하였다. SN 시험을 각각 GCDCA (100 μM) 또는 트립신 (1 ㎍/ml)의 존재하에 8aa 또는 KD PEDV를 사용하여 수행하였다. 새끼 돼지 혈청의 IFA 역가는 400 - 1000 범위였으며, 암퇘지 혈청의 IFA 역가는 1500이었다. 8aa 또는 KD PEDV에 대한 SN 역가는 새끼 돼지 혈청에 대해 100 - 160에, 암퇘지 혈청에 대해 ~ 200에 필적하였다. 이러한 결과는 8aa PEDV가 어린 및 성체 돼지에서 양호한 면역 반응을 유도한다는 것을 시사한다. 중요하게는 8aa PEDV는 8aa 및 KD (트립신-의존적인) PEDV에 대한 중화 항체를 생산하며, 이는 8aa PEDV이 US에서 단리된 모 트립신-성장 PEDV 바이러스를 중화시키는데 필수적이고 면역화에 사용될 수 있는 에피토프를 보유한다는 것을 의미한다.

상이한 방법으로 생성된 PEDV의 항원성 (약독화)을 측정하기 위하여, 분만틀 (farrowing crate)에 수용된 PEDV-음성 암퇘지로부터의 1 - 4일령 신생 새끼 돼지를 PEDV KD (P154), PEDV AA (P103), PEDV 8aa (P40, P70 및 P105), PEDV 8aa E10 또는 PEDV 8aa T5로 접종하였다. 각 PEDV를 1 - 4일령 신생 새끼 돼지에게 동물 당 1X10⁶ TCID₅₀로 경구 투여하였다. 접종 후, 임상 증상, 사망률 (생존) 및 바이러스 방출 (매일 직장 면봉법: daily rectal swab)을 최대 14일 동안 조사하였다. 바이러스 방출을 상기 기재된 바와 같이 실시간 qRT-PCR로 조사하였다. 혈청 샘플을 매주 각 새끼 돼지로부터 수집하고, PEDV 8aa에 대해 IFA 및 SN 역가에 대해 시험하였다.

실시예 7 - 경구 투여에 의한 신생 새끼 돼지 (1 - 3일령 새끼 돼지)에서의 KD (P154), AA (P103) 또는 8aa PEDV (P105)의 안정성

경구 투여에 의해 신생 새끼 돼지 (1-3일령 새끼 돼지)에서의 KD (P154), AA (P103) 또는 8aa PEDV (P105)의 안정성을 측정하는 동물 연구를 수행하였다. 각 스트레인을 경구 영양으로 동물 당 1X10⁶ TCID₅₀로 접종하고, 임상 증상, 사망률 및 바이러스 방출 (매일 직장 면봉법)에 대해 10일 동안 조사하였다. 돼지 그룹에서, KD 스트레인 (P154)를 6마리의 1일령 새끼 돼지로 접종하고, 임상 증상, 사망률 및 바이러스 방출 (매일 직장 면봉법)에 대해 8일 동안 조사하였다. 연구 기간 동안, > 1X10⁵ TCID₅₀의 바이러스 방출을 바이러스 접종 2일 후부터 관찰하였고, KD 그룹에서 60%의 사망률을 관찰하였다. 이러한 결과는 KD PEDV가 계대수 154에서 부분적으로 약독화된다 것을 의미한다. AA PEDV (P103)의 경우, 3마리의 1일령 및 12마리의 2일령 새끼 돼지 (총 15마리)를 상기 스트레인으로 접종하였다. 바이러스 접종 후 1 내지 10일까지 매우 높은 바이러스 방출 (>1X10⁵ TCID₅₀)을 보였으며, 50%의 사망률을 AA 그룹에서 관찰하였다. 8aa PEDV (P105)의 경우, 9마리의 1일령 및 7마리의 2일령 새끼 돼지 (총 16마리)를 상기 스트레인으로 접종하였다. 이 기간 동안, 설사 또는 사망의 증거가 없었으며, 8aa로 접종된 모든 새끼 돼지에서 낮은 수준의 바이러스 방출 (<1X10² TCID₅₀)을 관찰하였다. 이러한 결과는, AA PEDV가 계대수 103에서 부분적으로 약독화되는 반면, 계대수 105에서 8aa PEDV가 신생 새끼 돼지에서 완전히 약독화된다는 것을 의미한다.

실시예 8 - PEDV 공격 연구

PEDV 8aa P70 또는 8aa E10의 바이러스 접종 후 24일에, 동물 (각각 N=16 또는 12)를 독성 야생형 PEDV로 공격하였다. 대조군 동물 (연령 일치된, PEDV-나이브한 동물, N=10). 바이러스 공격 후, 임상 증상 및 바이러스 방출 (매일 직장 면봉법)을 최대 14일 동안 조사하였다. 또한 혈청 샘플을 매주 각 새끼 돼지로부터 수집하고, 상기 기재된 바와 같이 IFA 및 SN 역가에 대해 시험하였다.

실시예 9 - 트립신-적응된 (KD), 엘라스타아제-적응된 (AA) 또는 효소-독립적인 (8aa) PEDV의 S 유전자의 서열 분석

트립신-적응된 (KD), 엘라스타아제-적응된 (AA) 또는 효소-독립적인 (8aa) PEDV의 S 유전자의 서열 분석은, 이들이 콜로라도 (Colorado) 스트레인을 비롯한 기존의 US 스트레인에 매우 상동적일 뿐만 아니라 상기 유전자 중 소수의 돌연변이를 갖는다는 것을 나타낸다. 엘라스타아제-적응된 (AA) 또는 효소-독립적인 (8aa) PEDV에서 보다 많은 돌연변이를 관찰하였고, 이는 엘라스타아제 또는 GCDCA에 의한 선택압의 결과일 수 있다.

(1) 실시예 4로부터의 효소-독립적인 PEDV (8aa PEDV, P21). S 유전자 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호 1).

KGLNTVAHALTKVQEVVNSQGAALTQLTVQLQHNFQAISSSIDDIYSRLDILSADAQVDRLITGRLSALNAFVAQTLTKYTEVQASRKLAQQKVNECVKSQSQRYGFCGGDGEHIFSLVQAAPQGLLFLHTVLVPSDFVDVIAIAGLCVNDEIALTLREPGLVLFTHELQNHTATEYFVSSRRMFEPRKPTVSDFVQIESCVVTYVNLTRDQLPDVIPDYIDVNKTLYEILASLPNRTGPSLPLDVFNATYLNLTGEIADLEQRSESLRNTTEELQSLIYNINNTLVDLEWLNRVETYIKWPWWVWLIIFIVLIFVVSLLVFCCISTGCCGCCGCCCACFSGCCRGPRLQPYEVFEKVHVQ.

- 8aa P21 및 콜로라도 스트레인의 비교 (GenBank 수탁 번호 KF272920.1):

10개 아미노산 변화: T326I, L375F, A457T, P486T, A775P, E856D, I958T, Y976D, V1081A, D1253Y

- 콜로라도 스트레인 (GenBank 수탁 번호 KF272920.1) vs 고전 유럽 스트레인 CV777 (GenBank 수탁 번호 AF353511.1): 약 90% 동일.

(2) 실시예 1 및 2로부터의 트립신-적응된 PEDV (KD PEDV, P33). S 유전자 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호 2)

KGLNTVAHALTKVQEVVNSQGAALTQLTVQLQHNFQAISSSIDDIYSRLDILSADVQVDRLITGRLSALNAFVAQTLTKYTEVQASRKLAQQKVNECVKSQSQRYGFCGGDGEHIFSLVQAAPQGLLFLHTVLVPSDFVDVIAIAGLCVNDEIALTLREPGLVLFTHELQNHTATEYFVSSRRMFEPRKPTVSDFVQIESCVVTYVNLTRDQLPDVIPDYIDVNKTLDEILASLPNRTGPSLPLDVFNATYLNLTGEIADLEQRSESLRNTTEELQSLIYNINNTLVDLEWLNRVETYIKWPWWVWLIIFIVLIFVVSLLVFCCISTGCCGCCGCCCACFSGCCRGPRLQPYEVFEKVHVQ.

- KD P33 및 콜로라도 스트레인 (GenBank 수탁 번호 KF272920.1)의 비교:

상기 S 단백질에서 3개 아미노산 변화: S1 영역, A243V, G523D, F643S에서 모두.

(3) 실시예 3으로부터의 엘라스타아제-적응된 PEDV (AA PEDV, P17). S 유전자 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호 3)

KGLNTVAHALTKVQEVVNSQGAALTQLTVQLQHKFQAISSSIDDIYSRLDILLADAQVDRLITGRLSALNAFVAQTLTKYTEVQASRKLAQQKVNECVKSQSQRYGFCGGDGEHIFSLVQAAPQGLLFLHTVLVPSDFVDVIAIAGLCVNDEIALTLREPGLVLFTHELQNHTATEYFVSSRRMFEPRKPTVSDFVQIESCVVTYVNLTRDQLPDVIPDYIDVNKTLDEILASLPNRTGPSLPLDVFNATYLNLTGEIADLEQRSESLRNTTEELQSLIYNINNTLVDLEWLNRVETYIKWPWWVWLIIFIVLIFVVSLLVFCCISTGCCGCCGCCCACFSGCCRGPRLQPYEVFEKVHVQ.

- AA P17 및 콜로라도 스트레인 (GenBank 수탁 번호 KF272920.1)의 비교

7개 아미노산 변화: A243V, L375K, P486T, E856D, N1059K, S1078L, V1081A.

결과 및 고찰

세포 배양 적응. PEDV U.S. 스트레인을 단리하기 위한 초기의 시도는 베로 세포 중 분명한 CPE가 나타날 때까지 2-3회 블라인드 계대 (blind passage)를 필요로 하였다. 세포 배양물 중 바이러스 성장을 PEDV 특이적 항혈청을 사용한 IFA 염색으로 확인하였고, 바이러스의 S 유전자를 서열 분석한 결과 콜로라도 US PEDV 스트레인 (GenBank: KF272920.1, 본원에 참고로 원용됨)의 것보다 99% 초과의 아미노산 상동성을 나타냈다. 한계 희석법으로 바이러스를 클로닝한 후, PEDV를 상이한 배양 조건 하에서 추가로 계대하였다. 트립신 (1-2 ㎍/ml) 존재하에서, 0.1 - 1 MOI의 야생형 PEDV를 약 20회 계대한 후, PEDV KD는 접종 24시간 후 (post inoculation: PI) 분명한 CPE가 나타난 것을 근거로 더 빠르게 성장하기 시작했으며, 48hr PI 후 완전한 세포 용해가 유도되었다. 또한, 세포 단층 중 더 큰 융합체를 관찰하였다. 계대수 20 후, PEDV KD 역가는 일정하게 6.2 -6.5 log₁₀ TCID₅₀/ml에 도달하였다 (표 1).

야생형 PEDV를 엘라스타아제 (1-2 ㎍/ml)의 존재하에서 계대하였고, 2-3회 계대 후 분명한 CPE를 관찰하였다. 이러한 엘라스타아제-계대된 바이러스 (PEDV AA)는 트립신 또는 엘라스타아제의 존재하에서 양호하게 성장하였으나, 엘라스타아제와 함께 적정이 이뤄지는 경우에 비해, 배지 중 트립신의 존재하에서 적정이 이뤄지는 경우 보다 높은 역가를 나타냈다 (표 1). 엘라스타아제에서 처음 20회 계대한 경우, PEDV AA 역가는 점진적으로 증가하였고, 트립신 또는 엘라스타아제와 함께 각각 6.5-6.8 또는 5.1-5.5 log10 TCID₅₀/ml로 일정하였다. 트립신 존재하의 PEDV AA 바이러스 역가는 PEDV KD의 것보다 약간 높았다 (표 1).

지시된(표시,나타난) 바와 같이 트립신, 엘라스타아제 또는 GCDCA의 존재하에서 측정된 PEDV 역가 (log₁₀ TCID₅₀/ml).

PEDV KD		PEDV AA			PEDV 8aa
계대수	하기로 적정	계대수	하기로 적정		계대수	하기로 적정
	트립신		트립신	엘라스타아제		GCDCA	트립신
P4	5.1	P4	3.8	2.5	P4	2.5	3.1
P10	5.8	P10	5.2	4.1	P14	6.6	5.1
P20	6.3	P20	6.7	5.3	P17	7.5	2.2
P30	6.2	P30	6.5	5.1	P21	8.1	< 2
P40	6.5	P40	6.7	5.5	P30	8.2	< 2
P60	6.2	P60	6.8	5.3	P70	8.2	< 2
P120	6.3	P120	6.7	5.2	P120	8.1	< 2

또한, 야생형 PEDV를 컨쥬게이션된 담즙산 (GCDCA, 100 μM)의 존재하에서 베로 세포 (PEDV 8aa) 에서 계대함으로써, 임의의 프로테아제 없이 바이러스를 적응시켜 증식시킬 수 있었다. PEDV 8aa는 10회 계대 후 효과적으로 성장하기 시작하였으며, 바이러스 성장은, 트립신 또는 엘레스타아제의 존재하에서 바이러스-감염된 세포 중 관찰되는 특징적 CPE인 융합체를 형성하지 않았다. 바이러스 감염 약 40-48시간 후 PEDV 8aa로 감염된 세포 단층의 광범위한 세포 사멸 (괴사)이 발생하였다. 바이러스 역가는 계대수 20 이후 8.0 log10 TCID₅₀/ml 초과에 도달하였으며 (표 1), 이는 PEDV KD 또는 PEDV AA의 경우보다 현저히 높았다 (표 1). 흥미롭게도, GCDCA로 초기 적응한 것을 10회 계대한 후, PEDV 8aa는 또한 GCDCA의 부재 하에 또는 소 태아 혈청 (FBS)의 존재하에 MEM에서 성장할 수 있었다. GCDCA가 배양 배지 중에 존재하는 경우 CPE가 보다 빠르게 진행되었으나, GCDCA, MEM (FBS 없음) 또는 2% FBS를 함유하는 MEM 중에서 성장한 PEDV 8aa의 역가는 이들 간에 필적하였다 (도 2).

흥미롭게도, 계대수 20 이후 GCDCA의 존재하에서 성장하도록 완전히 적응하면, PEDV 8aa의 복제는 트립신에 의해 크게 억제되며 (표 1 및 도 2); 바이러스 역가는 < 2.0 log10 TCID₅₀ ml로 감소한다 (표 1). 또한, 트립신의 존재하에 8aa PEDV (계대수 21)의 성장 감소를 IFA 및 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다 (도 1). IFA 염색으로부터, 트립신 (1 ㎍/ml)의 존재하에 성장한 PEDV 8aa로 감염된 세포 배양물에서는 소수의 양성 세포가 관찰되었고, GCDCA 또는 모의 (mock)를 함유하는 MEM 중에서 성장한 PEDV 8aa로 감염된 세포 배양물에서는 대부분의 세포가 PEDV에 대해 양성으로 염색되었다 (도 1). 배지 중에 상이한 농도의 트립신 (0.01, 0.1 또는 1 ㎍/ml)을 첨가함으로써, PEDV 8aa 복제의 트립신-의존적인 억제를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다: N 단백질 수준은 높은 트립신 농도에서 감소하였다 (도 1).

또한, US PEDV 스트레인으로 감염된 돼지로부터 풀링된 회복기 혈청에 대한 농축된 PEDV KD, PEDV AA 또는 PEDV 8aa에 관하여 웨스턴 블롯 분석한 결과, PEDV KD 및 AA에 비해 더 높은 수준의 PEDV 8aa 바이러스 복제를 입증하고 확인하였다 (도 3). PEDV KD 또는 PEDV 8aa의 IFA 또는 SN 역가는 서로 비슷했으며; PEDV KD 또는 PEDV 8aa의 IFA 역가는 각각 1255 ± 23 또는 1243 ± 31이고, PEDV KD 또는 PEDV 8aa의 SN 역가는 각각 48 ± 16 또는 52 ± 4이었다. 이러한 결과는, PEDV 8aa 및 KD 스트레인 모두 모 야생형 PEDV 스트레인에 대해 교차-반응성을 보유한다는 것을 의미한다.

신생 새끼 돼지에서 PEDV의 항원성. 신생 새끼 돼지에서 PEDV KD, AA, 8aa (P40, P70 및 P105), 8aa E10 및 8aa T5의 항원성을 측정한 동물 연구의 결과를 표 2에 요약한다. 상이한 바이러스 접종 그룹 간에 사망률은 0 내지 100%로 다양하였다 (표 1, 도 3 및 4). 증상 (설사) 및 바이러스 방출의 지속 기간 또한 그룹 간에 상이하였다 (표 1, 도 4 및 5).

PEDV KD P120로 접종된 2일령 새끼 돼지의 그룹에서, 6마리 중 4마리 새끼 돼지가 감염후 (DPI) 6 내지 8일 동안에 사망하였다 (사망률 67%). 바이러스 방출 및 설사는 각각 2 및 3 DPI에 시작하였다. 배설물의 바이러스 역가는 4 DPI에서 4.5 log10 TCID₅₀ 당량/ml에 달했고, 11 DPI까지 (관찰 종료시) 3-4 log10 TCID₅₀ 당량/ml 이상을 유지했다 (도 4). PEDV AA P103로 접종된 2일령 새끼 돼지의 그룹에서, 14마리 중 7마리 새끼 돼지가 5 내지 8 DPI 동안 사망하였다 (사망률 50%)(표 2 및 도 4). 바이러스 방출 및 설사는 각각 1 및 2 DPI에 시작하였다. 배설물의 바이러스 역가는 1 및 2 DPI에서 각각 5.2 및 5.5 log10 TCID₅₀ 당량/ml에 달했고, 9 DPI 후 점진적으로 1 log10 TCID50 당량/ml 이하로 감소하였다 (도 4).

1-4일령 새끼 돼지에서 상이한 계대수의 PEDV KD, AA 및 8aa의 항원성 (약독화) 연구의 요약

그룹	접종물	접종시 연령 (마리수)	생존 동물수 (사망률 %)	임상 증상 및 바이러스 방출
1	PEDV KD P120	2일령 (N=6)	2/6 (67%)	설사 : 3 - 9 DPI; 2 DPI에 바이러스 방출 시작
2	PEDV AA P103	2일령 (N=14)	7/14 (50%)	설사: 2 - 9 DPI; 1 DPI에 바이러스 방출 시작
3	PEDV 8aa E10	1일령 (N=17)	12/17 (29%)	묽은 변: 1 -2 DPI; 설사 3-7 DPI; 2 DPI에 바이러스 방출 시작
4	PEDV 8aa T5	1일령 (N=18)	0/18 (100%)	1 DPI부터 설사 시작; 4 DPI까지 모두 사망; 1 DPI부터 바이러스 방출
5	PEDV 8aa P40	2 또는 4일령 (N=24)	4/24 (83%)	설사: 3 - 8 DPI; 2 DPI부터 바이러스 방출
6	PEDV 8aa P70	1일령 (N=17)	16/17 (6%) 사고로 1마리 사망	1-2 DPI에 묽은 변; 제한된 바이러스 방출
7	PEDV 8aa P105	1 또는 2일령 (N=16)	16/16 (0%)	설사 없음; 제한된 바이러스 방출

PEDV 8aa E10로 접종된 1일령 새끼 돼지의 그룹에서, 17마리 중 5마리 동물이 5 내지 7 DPI 동안 사망하였다 (사망률 29%)(표 1, 도 4). 바이러스 방출 및 설사는 각각 2 및 3 DPI에 시작하였다. 배설물의 바이러스 역가는 4 DPI에서 6.0 log10 TCID₅₀ 당량/ml에 달했고, 9 DPI 후 2 log10 TCID₅₀ 당량/ml 이하로 점진적으로 감소하였다 (도 4). 1일령 새끼 돼지를 PEDV 8aa T5로 감염시켰고, 4 DPI까지 모두 사망하였다 (사망률 100%)(표 1). 이러한 그룹에서, 높은 바이러스 방출 및 설사가 1 DPI에 시작되었고, 배설물의 바이러스 역가는 1 DPI에 6.7 log10 TCID₅₀ 에 달하였다 (도 4).

3개 상이한 계대수 (P40, P70 및 P105)의 PEDV 8aa로 접종된 3개 그룹을 바이러스 접종 시 1일령 (P70), 1-2일령 (P105) 또는 2 또는 4일령 (P40) 새끼 돼지와 비교하였다 (표 1). PEDV 8aa P40로 감염된 이들 새끼 돼지는 2-8 DPI 동안 높은 사망률 (사망률 83%)을 지속하였으며, 2 및 3 DPI에 각각 높은 사망률 및 설사가 시작되었다 (도 5). 이러한 그룹에서, 배설물의 바이러스 역가는 4 DPI에서 7.0 log10 TCID₅₀ 에 달했으며, 8 DPI까지 6-7 log10 TCID₅₀ 이상을 유지했다 (도 5). 반대로, 새끼 돼지의 생존률 및 바이러스 방출/설사는 계대수 70 (P70) 이후 크게 약독화되었다. 1일 또는 2일령 새끼 돼지가 PEDV-기인한 사망에 매우 취약한 것으로 알려졌음에도 불구하고, PEDV 8aa P70 또는 P105를 접종하여 각각 단 1마리가 사망하거나 (사망률 6%) 아무도 사망하지 않았다. PEDV 8aa P70 접종 후 사망한 1마리의 돼지는, 임상 증상 또는 바이러스 방출이 나타나지 않았기 때문에 PEDV와는 관련이 없는 것으로 보인다 (표 2, 도 5). PEDV 8aa P70로 감염된 일부 동물에서, 1 및 2 DPI에 묽은 변을 관찰하였으며, 이는 2 DPI 후에 해결되었고, 15 DPI까지 제한된 바이러스 방출 (< 1 log10 TCID₅₀ 당량/ml)을 관찰하였다 (도 5). PEDV 8aa P105의 그룹에서, 묽은 변 또는 설사를 관찰할 수 없었고, 13 DPI까지 제한된 바이러스 방출 (< 1 log10 TCID₅₀ 당량/ml)이 나타났다 (도 5).

이전에 PEDV 8aa P70 또는 8aa E10로 감염된 새끼 돼지에서 야생형 바이러스 공격 연구. 이전의 항원성 연구에서 PEDV 8aa P70 또는 PEDV 8aa E10로 접종된 이들 새끼 돼지를 본 연구에 사용하였다. 24 DPI 후, 이들 새끼 돼지를 야생형 PEDV로 공격하였다. 또한, 연령 일치된, PEDV-나이브한 새끼 돼지를 대조군 그룹으로 본 연구에 포함하였다 (표 3).

야생형 PEDV 감염 후, 모든 그룹에서 사망률은 관찰되지 않았다 (표 3). 그러나, PEDV 8aa E10 그룹이 아닌 대조군 및 PEDV 8aa P70 그룹에서, 야생형 PEDV 감염 후 3 및 4일 동안 경미한 설사를 관찰하였다 (표 2). PEDV 8aa E10 그룹에서, 야생형 바이러스 전염 후 바이러스 방출이 제한되었다. 그러나, PEDV 8aa P70 및 대조군 그룹에서 더 높은 수준의 바이러스 방출을 관찰하였으며, 2-4 일에 6.2 log10 TCID₅₀ 당량/ml까지 도달하였고, 이는 공격 11일 후 < 3 log10 TCID₅₀ 당량/ml으로 점진적으로 감소하였다. 흥미롭게도, PEDV P70 그룹의 바이러스 역가는 공격 후 4 및 11일 동안 대조군 그룹의 역가보다 현저히 낮았다 (도 6).

면역원성 ( SN 역가). 공격 연구에서의 동물을 (3개 그룹) 야생형 PEDV 공격 전후의 연속 SN 역가에 대해 모니터링하였다. 평균 SN 역가를 표 3 및 도 7D에 도시하고, 개별 SN 역가를 도 7 A-C에 도시하였다. 대조군 그룹의 돼지를 공격 전 PEDV-음성인 것으로 확인하였다 (표 3, 도 7). 상기 대조군 그룹에서, 공격 후 8일에 SN 역가를 검출하고 (36.3의 평균 SN 역가), 공격 후 21일까지 꾸준히 유지하였다 (표 3, 도 7). PEDV 8aa E10 그룹에서, PEDV 8aa E10의 초기 감염 후 12일에 SN 역가를 검출하였으며, 이는 공격 전 시간 동안 증가하였다 (표 3, 도 7). 공격 후, 평균 SN 역가는 공격 후 15일에 가장 높았다가 (148.2) 이내 감소하였다 (표 3, 도 7). PEDV 8aa P70 그룹에서, 공격 전 SN 역가가 검출되지 않았다 (표 3, 도 7). 그러나, 평균 역가는 공격 후 8 - 21일에 > 200에 달했다. 흥미롭게도, 이러한 그룹에서, 약 40%의 동물은 250 초과의 높은 SN 역가를 보였으며 (기왕성 면역 반응: anamnestic immune response), 다른 동물은 제한된 SN 역가를 나타냈다 (< 50)(도 7B).

고찰. 아시아에 퍼진 PEDV 스트레인은 아그룹 1에 속하며, 이들 국가에서 PEDV를 조절하기 위하여 MLV가 사용되고 있다. US PEDV 스트레인은 아그룹 1에 비해 약 10%의 다양성을 가지며, 계통 발생적으로 아그룹 2a로 분류된다. PEDV US의 이질성은 US 및 아시아 스트레인 간에 제한된 교차-반응성이 있을 수 있다는 것을 시사하며, 이로 인해 US에서 효과적인 PEDV 조절을 위한 PEDV US 스트레인의 특이적 백신의 개발을 필요로 할 수 있다. 사멸된 백신 또는 MLV의 생산을 위하여, 세포 배양물 중 높은 역가에 대한 PEDV 생성은 매우 중요하다. 그러나, 높은 역가에 대한 PEDV의 증식 (>8 log10 TCID₅₀/ml)은 쉽게 달성되지 않는다. 이러한 연구에서, 백신 생산에 적합한 특성을 갖는 PEDV US 스트레인을 생성하기 위하여, 본 발명자들은 세포 배양물 중 본 발명의 PEDV US 단리물을 연속-계대함으로써 바이러스 성장 특성을 변화시키는 다양한 선택압의 효과를 조사하였다. PEDV의 종래 배양에서는, 세포 배양물에서의 단리 및 증식을 위하여 소장에 고 농도로 존재하는 트립신을 필요로 한다. 본 연구에서, 본 발명자들 또한 트립신의 존재하에서 PEDV를 계대하여 PEDV KD 스트레인을 생성하였다. 일단 베로 세포 중에서 양호하게 적응하고 나면, PEDV KD는 CPE의 빠른 진행과 함께 융합체를 갖는 전형적이고 광범위한 세포 융합을 유도하며, 심지어 낮은 MOI (< 0.05)에서도 감염 후 48시간 까지 모든 단층화된 세포의 사멸을 야기한다. 이러한 PEDV KD는 계대수 10 이후, 다른 그룹에서 보고된 바와 비슷하게 역가 5.8-6.5 log10 TCID₅₀/ml를 산출하였다 (표 1). 본 발명자들과 다른 그룹에서 관찰한 결과, 바이러스 증식에서 트립신의 존재는 일정하지 않은 바이러스 역가를 산출하는 경향이 있으며, 이는 아마도 융합체를 형성하는 CPE 진행에서의 고유한 변이성으로 인한 것일 것이다. 따라서, 본 발명자들은 바이러스 증식을 위해 트립신을 필요로 하지 않는 바이러스를 생성하려고 노력하였다.

엘라스타아제는 췌장 (엘라스타아제 1) 또는 호중구 (엘라스타아제 2)에 의해 생성되는 단백질분해 효소이며, 각각 엘라스틴, 또는 폐 내 염증 동안 박테리아의 분해를 촉매하는데 관여한다. 엘라스타아제는 단백질 분해 활성을 위하여 글리신, 알라닌 및 발린과 같은 작은 소수성 아미노산의 카복실 그룹을 인식한다. 이러한 효소를 사용하여 PEDV AA 계대를 얻었다. 엘라스타아제 (1 ㎍/ml) 중에서 효율적으로 복제하는데 3-5 계대 (트립신과 함께 초기 단리하여)가 소요되었고, 일단 웰에 적응하고 나면 (계대수 10 후), 바이러스 감염은 PEDV KD와 유사한 광범위한 융합을 유도하였으며, 심지어 낮은 MOI (< 0.05) 감염으로 48시간까지 완전한 CPE 진행을 유도하였다. PEDV KD는 단지 트립신만 있는 경우에도 잘 성장할 수 있으나 (엘라스타아제 없이), PEDV AA 계대는 트립신 및 엘라스타아제 모두가 있는 경우 잘 성장할 수 있고, 이들을 트립신 또는 엘라스타아제로 적정할 수 있다. 트립신으로 적정하는 경우 역가는 6.8 log10 TCID₅₀/ml에 달했고, PEDV KD 계대보다 약간 높았다. 그러나, PEDV AA를 엘라스타아제의 존재하에 적정하는 경우, 역가는 트립신의 존재하에 적정하는 경우보다 약 10-배 더 낮았다 (표 1). PEDV KD 또는 PEDV AA 간의 항원 덩어리 (antigenic mass)는, 각각의 바이러스를 동일한 비율로 농축한 후 웨스턴 블롯 분석으로 평가한 경우 유사하였다 (도 3).

담즙산은 간에서 합성되며 담낭에 저장된다 (320 mM 정도로). 이들이 십이지장으로 방출되는 것은 식이 지방의 존재에 대한 반응으로 주로 유발되며, 위쪽 소장 내 담즙 농도는 > 1 mM 에 달할 수 있다. 담즙산은 장관을 따라 이동하면서, 이의 대부분 (> 95%)은 (간문맥을 통해) 혈관계로 재흡수되며, 수동 확산에 의해 또는 장내 특이적 담즙산 운반체를 사용하는 능동 메커니즘에 의해 간으로 재흡수된다. 일단 간으로 되돌아가면, 담즙산은 십이지장으로 재-방출될 것이다 (장간 순환). 이러한 순환은 유효한 농도의 담즙산 및 콜레스테롤 항상성을 유지하는데 필수적이다. 본 발명자들 및 다른 그룹은 담즙산이 돼지 장 칼리시바이러스 (porcine enteric calicivirus), B형 및 C형 간염 바이러스 및 로타바이러스를 비롯한, 담즙이 풍부한 기관 (간 및 장)을 표적화하는 다양한 바이러스의 복제에 영향을 끼칠 수 있다는 것을 밝혔다. 또한 PEDV는 소장을 표적화하기 때문에, 본 발명자들은 담즙산이 GCDCA의 존재하에 바이러스를 계대함으로써 PEDV 복제를 조절할 수 있는 지의 여부를 시험하였다.

PEDV 8aa를 GCDCA 100 μM의 조건에 점차 적응시켰고, 마침내 8.2 log10 TCID₅₀/ml 까지의 높은 바이러스 역가로 성장할 수 있었다 (표 1). 게다가, 상기 조건에 완전히 적응시키면, PEDV 8aa는 임의의 보충물이 없는 단순 MEM에서 또는 FBS의 존재하에서 성장할 수 있었다 (도 1). PEDV KD 또는 PEDV AA와는 달리, PEDV 8aa는 융합이 없는 CPE 및 바이러스 감염 후 24-48시간 동안 발생하는 광범위한 세포 사멸 (괴사)를 유도하였다. 흥미롭게도, 초기 계대수 동안 (계대 4 내지 20), PEDV 8aa는 점진적으로 트립신의 존재하에서 성장할 수 있는 능력을 상실했다 (표 1). 계대수 20 후, PEDV 8aa의 성장은 트립신 (또는 엘라스타아제)의 존재하에서 < 2 log10 TCID₅₀/ml 까지 급격히 감소하였고 (표 1), 이는 PEDV 복제가 고 농도의 트립신 (또는 엘라스타아제)가 존재하는 장내에서 일어나기 때문에 동물 중에서의 잠재적인 약독화를 시사한다. 또한, IFA 및 웨스턴 블롯 분석으로 트립신의 존재하에서 바이러스가 성장하지 않은 것을 확인하였다 (도 2). 세포 배양물 중의 효소에 대한 독립성에 기인한 높은 역가 외에도, 이러한 바이러스 역가는 PEDV KD 또는 AA의 역가보다 더 일정하였다.

회복기 혈청에 대한 PEDV KD, PEDV AA, PEDV 8aa 계대를 사용하여 웨스턴 블롯 분석 또는 SN 분석한 결과는, PEDV 계대가 중화 에피토프를 비롯한 유사한 면역원성 에피토프를 보유한다는 것을 시사한다. 풀링된 혈청의 IFA 또는 SN 역가는 PEDV KD, PEDV AA 또는 PEDV 8aa와 필적하였다. 본 발명자들은 SN 적정을 위하여 PEDV 8aa를 사용하는 것이 PEDV KD 또는 PEDV AA를 사용하는 것보다 분명한 이점을 가지며, 여러 혈청 샘플을 사용한 보다 일정한 역가를 갖는다는 것을 관찰하였다. 이는 PEDV KD 또는 PEDV AA를 사용한 분석에서 혈청 샘플과 트립신/엘라스타아제 활성 간의 상호작용에 기인한 것일 수 있다.

경구 투여로써 신생 새끼 돼지에서 PEDV KD (P154), PEDV AA (P103) 또는 PEDV 8aa (P40, P70 및 P105), PEDV 8aa E10, PEV 8aa T5의 병원성 (약독화)을 측정하는 동물 연구를 수행하였다. 이러한 다양한 PEDV 계대를 이용한 결과 사망률은 0 내지 100%였고, 바이러스 방출 및 임상 증상은 이러한 연구에서 서로 상관관계가 있었다 (표 2, 도 4 및 5). 베로 세포 중 약 100 계대의 PEDV가 새끼 돼지에서 약독화를 유도하여 MLV로서 뛰어난 후보일 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 이러한 연구에서, 본 발명자들은 부분적 약독화에 대한 일부 증거가 있을지라도, PEDV KD 또는 PEDV AA가 100 초과의 계대수에서 여전히 독성이 남아있다는 것을 발견하였다 (표 2, 도 4). PEDV 8aa 계대의 경우, 계대수 40 (P40)이 부분적으로 약독화된 반면, P70 및 P105는 모두 신생 새끼 돼지에서 완전 약독화되었다 (표 2, 도 5). PEDV 8aa P70 및 P105의 경우, 가장 감염 취약한 연령 (1일령 새끼 돼지)에서 조차도 일시적인 설사와 함께 바이러스 방출이 제한되거나 (P70) 임상 증상이 없었다 (P105) (표 2, 도 5). 흥미롭게도, 약독화된 PEDV 8aa를 다시 엘라스타아제 (PEDV 8aa E10)에 이어서 트립신 (PEDV 8aa T5) 중에 적응시킨 경우, 이들은 독성을 얻음과 동시에 각각 29% 및 100%의 사망률을 나타냈다 (표 2, 도 4). PEDV 8aa E10 및 PEDV 8aa T5 모두로 접종된 새끼 돼지로부터 각각 2일 및 1일에 바이러스 방출이 시작되는 것을 관찰하였다 (표 2, 도 4). 이러한 결과는, 트립신 또는 엘라스타에제 중에서 PEDV 8aa의 성장이 억제되는 것이 새끼 돼지에서 PEDV 8aa 계대의 완전 약독화된 현상의 핵심이었음을 시사한다. 현재, 본 발명자들은 세포 배양물 중 트립신 또는 엘라스타아제의 존재하에 PEDV 8aa의 성장이 제한되는 것에 대한 메커니즘을 조사중이다.

야생형 PEDV에 대한 보호와 활성 면역 반응을 평가하기 위하여, PEDV 8aa P70 또는 PEDV 8aa E10의 접종으로부터 생존한 동물을 초기 접종 24일 후 야생형 PEDV로 공격하였다. 또한, 대조군으로서 연령 일치된 동물을 야생형 PEDV로 공격하였다. 공격 전후의 면역 반응 (SN 역가)을 또한 모니터링하였다. 종합하면, 공격에 대한 면역 반응 (SN 역가) 및 보호는 이전 임상 증상과 상관 관계가 있었으며, 제한된 설사 및 바이러스 방출 (PEDV 8aa P70)을 갖는 동물보다 높은 바이러스 방출 (PEDV 8aa E10)과 함께 설사가 있는 동물이 공격 전 더 높은 면역 반응 및 공격에 대한 더 큰 보호를 나타내었다.

공격 후, 대조군 동물 및 PEDV 8aa에 노출된 동물은 3일 및 4일에 일시적인 설사와 함께 2일부터 바이러스 방출이 진행되었으며, 그룹 간 4일 내지 11일 동안의 바이러스 방출에 상이한 차이가 있었다 (p<0.05) (도 6). 이러한 차이는 PEDV 8aa P70에 노출된 동물이 대조군 동물보다 PEDV 감염이 빨리 해결된다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 공격 후 PEDV 8aa P70에 노출된 일부 동물 중에서 기왕 면역 반응 (SN 역가)이 있었다 (도 7). 상기 그룹 중 약 40%의 동물에서 진행되었으며 공격 1주 후 높은 SN 역가를 유지하였고 (도 7), 이는 초기 감염 동안 면역 초회 항원 자극되었음을 시사한다. 그러나, 왜 그룹 중 단지 절반의 동물만이 기왕 반응을 나타냈는지는 분명하지 않다. 6 log10 TCID₅₀/동물의 용량에서 PEDV 8aa P70으로 초기 감염된 후의 동물 중 감염 수준이 상이할 수 있다. 신생 새끼 돼지에서의 약독화, 및 바이러스 방출의 빠른 해결뿐만 아니라 공격 후 기왕 면역 반응을 근거로, 본 발명자들은 PEDV 8aa P70 (및 P105)이 US PEDV 출현시 MLV로서 뛰어한 후보라는 결론을 내렸다. 현재 본 발명자들은 임신한 암퇘지 및 신생 새끼 돼지에서의 수동 보호 면역에 관한 PEDV 8aa P70 (또는 P105)를 연구할 계획이다.

트립신-적응된 (KD), 엘라스타아제-적응된 (AA) 또는 효소-독립적인 PEDV (8aa PEDV) KD, AA) 또는 효소-독립적인 (8aa) PEDV의 S 유전자를 서열 분석한 결과, 이들은 콜로라도 스트레인을 비롯한 기존 US 스트레인에 대해 고도로 상동적 (> 99%)이라는 것이 밝혀졌다.

SEQUENCE LISTING <110> KANSAS STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION <120> VACCINES FOR PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS INFECTIONS <130> IPA170804-US <150> US 62/111,324 <151> 2015-02-03 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1386 <212> PRT <213> porcine epidemic diarrhea virus <400> 1 Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe 20 25 30 Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val 35 40 45 Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr 50 55 60 Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile 65 70 75 80 Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser 85 90 95 Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala 100 105 110 Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe 115 120 125 Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr 130 135 140 Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu 145 150 155 160 His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe 165 170 175 Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val 180 185 190 Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr 195 200 205 Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly 210 215 220 Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn 225 230 235 240 Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe 245 250 255 Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys 260 265 270 Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro 275 280 285 Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp 290 295 300 Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg 305 310 315 320 Phe Asn Ile Asn Asp Ile Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val 325 330 335 Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser 340 345 350 Ser Asn Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln 355 360 365 Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Phe Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val 370 375 380 Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile 385 390 395 400 Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu 405 410 415 Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp 420 425 430 Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp 435 440 445 Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Thr Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys 450 455 460 Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu 465 470 475 480 Asp Asp Gly Phe Tyr Thr Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu 485 490 495 Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe 500 505 510 Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn 515 520 525 Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val 530 535 540 Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser 545 550 555 560 Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu 565 570 575 Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr 580 585 590 Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu 595 600 605 Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys 610 615 620 Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp 625 630 635 640 Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly 645 650 655 Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala 660 665 670 Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn 675 680 685 Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu 690 695 700 Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu 705 710 715 720 Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr 725 730 735 His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser 740 745 750 Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln 755 760 765 Ser Gly Gln Val Lys Ile Pro Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile 770 775 780 Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr 785 790 795 800 Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn 805 810 815 Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr 820 825 830 Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val 835 840 845 Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Asp Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile 850 855 860 Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val 865 870 875 880 Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe 885 890 895 Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr 900 905 910 Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp 915 920 925 Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val 930 935 940 Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Thr Gly Gly 945 950 955 960 Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Asp 965 970 975 Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu 980 985 990 Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly 995 1000 1005 Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln 1010 1015 1020 Thr Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val 1025 1030 1035 Gln Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr 1040 1045 1050 Val Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp 1055 1060 1065 Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Ala Gln Val 1070 1075 1080 Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val 1085 1090 1095 Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys 1100 1105 1110 Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln 1115 1120 1125 Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu 1130 1135 1140 Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu 1145 1150 1155 Val Pro Ser Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys 1160 1165 1170 Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val 1175 1180 1185 Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe 1190 1195 1200 Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser 1205 1210 1215 Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu 1220 1225 1230 Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val 1235 1240 1245 Asn Lys Thr Leu Tyr Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr 1250 1255 1260 Gly Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn 1265 1270 1275 Leu Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu 1280 1285 1290 Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn 1295 1300 1305 Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr 1310 1315 1320 Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu 1325 1330 1335 Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly 1340 1345 1350 Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys 1355 1360 1365 Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr Glu Val Phe Glu Lys Val 1370 1375 1380 His Val Gln 1385 <210> 2 <211> 1386 <212> PRT <213> porcine epidemic diarrhea virus <400> 2 Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe 20 25 30 Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val 35 40 45 Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr 50 55 60 Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile 65 70 75 80 Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser 85 90 95 Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala 100 105 110 Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe 115 120 125 Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr 130 135 140 Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu 145 150 155 160 His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe 165 170 175 Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val 180 185 190 Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr 195 200 205 Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly 210 215 220 Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn 225 230 235 240 Val Phe Val Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe 245 250 255 Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys 260 265 270 Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro 275 280 285 Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp 290 295 300 Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg 305 310 315 320 Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val 325 330 335 Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser 340 345 350 Ser Asn Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln 355 360 365 Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val 370 375 380 Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile 385 390 395 400 Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu 405 410 415 Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp 420 425 430 Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp 435 440 445 Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys 450 455 460 Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu 465 470 475 480 Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu 485 490 495 Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe 500 505 510 Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Asp His Ser Gly Ala Asn 515 520 525 Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val 530 535 540 Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser 545 550 555 560 Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu 565 570 575 Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr 580 585 590 Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu 595 600 605 Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys 610 615 620 Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp 625 630 635 640 Val Ser Ser Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly 645 650 655 Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala 660 665 670 Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn 675 680 685 Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu 690 695 700 Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu 705 710 715 720 Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr 725 730 735 His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser 740 745 750 Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln 755 760 765 Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile 770 775 780 Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr 785 790 795 800 Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn 805 810 815 Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr 820 825 830 Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val 835 840 845 Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile 850 855 860 Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val 865 870 875 880 Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe 885 890 895 Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr 900 905 910 Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp 915 920 925 Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val 930 935 940 Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly 945 950 955 960 Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr 965 970 975 Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu 980 985 990 Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly 995 1000 1005 Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln 1010 1015 1020 Thr Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val 1025 1030 1035 Gln Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr 1040 1045 1050 Val Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp 1055 1060 1065 Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val 1070 1075 1080 Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val 1085 1090 1095 Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys 1100 1105 1110 Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln 1115 1120 1125 Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu 1130 1135 1140 Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu 1145 1150 1155 Val Pro Ser Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys 1160 1165 1170 Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val 1175 1180 1185 Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe 1190 1195 1200 Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser 1205 1210 1215 Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu 1220 1225 1230 Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val 1235 1240 1245 Asn Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr 1250 1255 1260 Gly Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn 1265 1270 1275 Leu Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu 1280 1285 1290 Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn 1295 1300 1305 Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr 1310 1315 1320 Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu 1325 1330 1335 Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly 1340 1345 1350 Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys 1355 1360 1365 Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr Glu Val Phe Glu Lys Val 1370 1375 1380 His Val Gln 1385 <210> 3 <211> 1386 <212> PRT <213> porcine epidemic diarrhea virus <220> <221> misc_feature <222> (568)..(568) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe 20 25 30 Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val 35 40 45 Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr 50 55 60 Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile 65 70 75 80 Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser 85 90 95 Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala 100 105 110 Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe 115 120 125 Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr 130 135 140 Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu 145 150 155 160 His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe 165 170 175 Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val 180 185 190 Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr 195 200 205 Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly 210 215 220 Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn 225 230 235 240 Val Phe Val Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe 245 250 255 Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys 260 265 270 Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro 275 280 285 Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp 290 295 300 Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg 305 310 315 320 Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val 325 330 335 Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser 340 345 350 Ser Asn Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln 355 360 365 Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Phe Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val 370 375 380 Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile 385 390 395 400 Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu 405 410 415 Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp 420 425 430 Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp 435 440 445 Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys 450 455 460 Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu 465 470 475 480 Asp Asp Gly Phe Tyr Thr Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu 485 490 495 Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe 500 505 510 Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn 515 520 525 Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val 530 535 540 Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser 545 550 555 560 Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Xaa Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu 565 570 575 Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr 580 585 590 Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu 595 600 605 Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys 610 615 620 Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp 625 630 635 640 Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly 645 650 655 Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala 660 665 670 Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn 675 680 685 Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu 690 695 700 Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu 705 710 715 720 Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr 725 730 735 His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser 740 745 750 Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln 755 760 765 Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile 770 775 780 Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr 785 790 795 800 Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn 805 810 815 Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr 820 825 830 Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val 835 840 845 Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Asp Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile 850 855 860 Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val 865 870 875 880 Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe 885 890 895 Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr 900 905 910 Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp 915 920 925 Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val 930 935 940 Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly 945 950 955 960 Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr 965 970 975 Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu 980 985 990 Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly 995 1000 1005 Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln 1010 1015 1020 Thr Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val 1025 1030 1035 Gln Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr 1040 1045 1050 Val Gln Leu Gln His Lys Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp 1055 1060 1065 Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Leu Ala Asp Ala Gln Val 1070 1075 1080 Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val 1085 1090 1095 Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys 1100 1105 1110 Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln 1115 1120 1125 Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu 1130 1135 1140 Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu 1145 1150 1155 Val Pro Ser Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys 1160 1165 1170 Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val 1175 1180 1185 Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe 1190 1195 1200 Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser 1205 1210 1215 Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu 1220 1225 1230 Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val 1235 1240 1245 Asn Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr 1250 1255 1260 Gly Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn 1265 1270 1275 Leu Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu 1280 1285 1290 Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn 1295 1300 1305 Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr 1310 1315 1320 Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu 1325 1330 1335 Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly 1340 1345 1350 Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys 1355 1360 1365 Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr Glu Val Phe Glu Lys Val 1370 1375 1380 His Val Gln 1385 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer <400> 4 tctcgtaaga gtccgctagc tc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer <400> 5 gctatgctca gatcgccagt 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 6 tgctctttgg tggtaatgtg gc 22

Claims (20)

1. ATCC 수탁 번호 PTA-121847 하에 기탁된 단리된 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 스트레인의 배양 중 연속 계대에 의해 생성된, 생(live) 약독화된 PEDV 스트레인.
2. 제1항에 있어서,
   상기 약독화된 PEDV 스트레인이, ATCC 수탁 번호 PTA-121847 하에 기탁된 상기 단리된 PEDV 스트레인의 배양 중 총 적어도 70 계대 동안 적어도 30회 연속 계대에 의해 생성되는, 약독화된 PEDV.
3. 제1항에 있어서,
   상기 약독화된 PEDV 스트레인이, ATCC 수탁 번호 PTA-121847 하에 기탁된 상기 단리된 PEDV 스트레인의 배양 중 총 적어도 105 계대 동안 적어도 65회 연속 계대에 의해 생성되는, 약독화된 PEDV.
4. 제1항에 있어서,
   상기 배양이 실질적으로 트립신이 없는 것인, 약독화된 PEDV.
5. 제1항에 있어서,
   상기 배양이 실질적으로 엘라스타아제가 없는 것인, 약독화된 PEDV.
6. 제1항에 있어서,
   상기 배양이 최소 필수 배지 또는 소 태아 혈청, 및 임의로 컨쥬게이션된 담즙산을 포함하는 것인, 약독화된 PEDV.
7. 제6항에 있어서,
   상기 컨쥬게이션된 담즙산이 글리코케노데옥시콜산인 것인, 약독화된 PEDV.
8. 제1항에 있어서,
   상기 생 약독화된 PEDV 스트레인이 효소-독립적인(enzyme-independent), 약독화된 PEDV.
9. 제1항에 있어서,
   상기 생 약독화된 PEDV 스트레인이 트립신- 또는 엘라스타아제-독립적인, 약독화된 PEDV.
10. 약학적으로 허용가능한 담체 중에 분산된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 생 약독화된 PEDV를 포함하는, 면역원성 조성물.
11. 제10항에 있어서, 단위 용량 당 적어도 약 1x 10⁶ TCID₅₀/m의 약독화된 PEDV를 포함하는, 면역원성 조성물.
12. 제10항에 있어서,
    애주번트, 추가 항원, 완충제, 염, 안정화제, 희석제, 보존제, 항생제, 등장성제, 세포 배지, 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 약학적으로 허용가능한 성분을 추가로 포함하는, 조성물.
13. 제10항에 있어서,
    상기 담체가 물, 생리 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로오스, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 디메틸 설폭사이드, 에탄올, 글리세롤, 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 조성물.
14. 대상체에서 PEDV로 인한 임상 증상의 발생 또는 중증도를 감소시키는 방법으로서, 약학적으로 허용가능한 담체 중에 분산된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 생 약독화된 PEDV를 포함하는 면역원성 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
15. 제14항에 있어서,
    상기 임상 증상이 묽은 변, 바이러스 방출, 설사, 체중 감소, 식욕 부진, 기면증, 및/또는 사망으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 방법.
16. 제14항에 있어서,
    상기 대상체가 임신한 동물이고, 상기 동물에 의해 이후에 태어난 자손이 상기 면역원성 조성물이 투여되지 않은 동물에 의해 태어난 자손에 비해 PEDV로 인한 임상 증상의 발생 또는 중증도가 감소되는 것인, 방법.
17. 제14항에 있어서,
    상기 면역원성 조성물이 경구 또는 근육내로 투여되는 것인, 방법.
18. 제14항에 있어서,
    상기 임상 증상이 면역원성 조성물이 투여되지 않은 동물에 비해 면역원성 조성물이 투여된 동물에서 적어도 10% 감소되는 것인, 방법.
19. 대상체에서 PEDV 감염에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 하기를 포함하는 키트:
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 생 약독화된 PEDV를 포함하는 면역원성 조성물; 및
    상기 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하기 위한 지침.
20. 대상체에서 PEDV 감염에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 생 약독화된 PEDV를 포함하는 면역원성 조성물의 용도.
    
    

Images