KR20190121790A - 화합물, 화합물의 제조 방법, 강화된 추출물, 강화된 추출물 활성 분획, 강화된 추출물의 제조 방법, 강화된 추출물 제조를 위한 식물성 바이오매스의 선택 방법, 면역학적 장애의 치료를 위한 조성물 및 용도 - Google Patents

화합물, 화합물의 제조 방법, 강화된 추출물, 강화된 추출물 활성 분획, 강화된 추출물의 제조 방법, 강화된 추출물 제조를 위한 식물성 바이오매스의 선택 방법, 면역학적 장애의 치료를 위한 조성물 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역학적 장애의 치료를 위한 면역 억제제로서 아이폴라미이드 유도체가 풍부한 스타키타르페타 속 식물로부터 추출물을 기재하고 있다. 단리된 활성 화합물 및 이의 제조 방법 또한 기재되어 있다.

Description

화합물, 화합물의 제조 방법, 강화된 추출물, 강화된 추출물 활성 분획, 강화된 추출물의 제조 방법, 강화된 추출물 제조를 위한 식물성 바이오매스의 선택 방법, 면역학적 장애의 치료를 위한 조성물 및 용도
본 발명은 면역 억제 활성을 갖는 신규하고 독창적인 단리된 화합물과 추출물 및 스타키타르페타(Stachytarpheta) 속 식물로부터의 아이폴라미이드(ipolamiide)로부터 화합물 및 추출물을 제조하는 방법을 기술한다. 이러한 방식으로, 본 출원은 또한 신규하고 독창적인 조성물 및 면역학적 장애의 치료를 위한 이들의 용도를 기술한다. 본 발명은 약학, 의약 및 화학 분야에 관한 것이다.
면역학적 장애
면역학적 장애는 면역계의 불균형 또는 기능 장애로 간주될 수 있다. 이 시스템은 주로 해로운 항원을 인식하고 항원과 싸우는 항체를 통해 외부 또는 알려지지 않은 물질로부터 신체의 방어를 돕는 역할을 한다.
자가 면역 질환은 내인성과 외인성 물질 사이를 구별하지 않으면서, 유기체가 자신의 분자에 대해 항체를 생산하기 시작하는 면역학적 장애의 예이다. 이러한 경우에, 환자가 이러한 유형의 장애에 의해 야기되는 증상을 완화시키는 데 도움이 되도록 면역 억제 활성을 갖는 약제가 많이 요구될 것이다.
류마티스성 관절염 및 자가면역성 갑상선염을 제외한, 자가 면역 질환은 개별적으로 드물지만, 함께 서구 국가 인구의 약 5%에 영향을 미친다. 그들의 병인은 완전히 이해되지 않았다. 조직 특이적 및 전신 자가 면역 질환에서, 자기 자신과 자기 이외의 것을 구별하는 면역 시스템의 능력 상실이 관찰된다. 자가-관용(self-tolerance)이라고 하는 이 능력은 면역 능력이 있는 B 및 T 세포에서 중심과 말초 메커니즘에 의해 유지된다. 자가 관용의 상실은 내재적 또는 외부적 원인을 가질 수 있다. 박테리아 및 바이러스 감염과 같은 환경적 요인, UV, 살충제 및 약물과 같은 물리적 및 화학적 물질에 대한 노출은 외부적 원인의 예이다. 개인 자체의 특성과 관련 있는 내재적 원인은 일반적으로 유전자 제어 하에 있는 호르몬 인자에 더하여, 조직 적합성(histocompatibility) 분자의 다형성(polymorphism), 보체 시스템 및 톨-유사(Toll-like) 수용체와 같은 선천 면역의 성분, 조절 림프구 및 사이토카인과 같은 후천 면역의 성분과 관련이 있다.
자가 면역 질환의 치료 전략은 주로 면역 발달 초기 단계의 억제에 작용하는 면역 억제제를 사용하는 면역학적 시스템을 억제하는 것으로 구성된다. 이 치료는 선택적 면역 억제를 수행하지 않아서 다양한 항체의 발달로 이어졌다. 생물학적 제제는 항-사이토카인 단일 클론 항체 또는 사이토카인에 결합하고, 표적 세포에 대한 이들의 영향을 차단하는 가용성 수용체의 사용에서 발생하는 바와 같이, 사이토카인의 효과를 억제하는 데 사용될 수 있다. 사이토카인은 또한 원래의 사이토카인의 효과를 모방하는 유사한 재조합 단백질을 통한 생물학적 치료에 사용된다. 항-사이토카인 치료에서 주요 치료 목표는 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 인터루킨-1(IL-1), TNFα 및 IL-6이고, 주요 사이토카인 작용제 치료는 I형 인터페론(IFN)을 사용하여 수행된다. I형 인터페론 계열에서, IFNα 및 IFNβ의 재조합 단백질은 임상에서 주로 바이러스성 간염 (간염 바이러스 B 및 C) 및 다발성 경화증 각각의 치료에 사용된다. 후자의 경우, 제안된 작용 메커니즘은 IFNβ가 IFNγ에 대해 작용하는 길항 작용이고, 이는 다발성 경화증의 생리 병리학에서 매우 중요하다. IFNα는 또한 베체트병 및 처그-스트라우스 증후군의 점막-피부, 안구 및 신경학적 증상의 치료에 사용되었다. 폰톨리주맙(fontolizumab)은 인간화 된 항-IFNγ 제제이고, 이는 수지상 세포에서 이상이 있는 환자에서 우수한 결과로 평가되었다.
단일 클론 항체는 특이성 및 높은 선택성을 갖는 표적 치료이기 때문에, 통상적인 치료법과 비교할 때 자가 면역 질환의 치료에 유리하다. 그러나, 이들은 전통적인 치료법으로 자가 면역 질환의 제어에 효과가 없을 때 제2치료 라인으로 사용된다. 효능에 대한 제한 외에도, 단일 클론 항체는 여전히 비용 및 접근성과 관련된 여러가지 제한이 있다. 몇몇의 자가 면역 질환은 여전히 환자에 의한 우수한 내약성을 갖는 효과적인 치료법이 부족하다.
천연산물은 여러 질병의 치료에 수세기 동안 사용되어 왔다. 최근, 면역 억제 효과가 있는 약초 제품의 새로운 연구 개발에 많은 노력이 기울여지고 있다. 예를 들어, 미국에서 수행된 여러 임상 실험들은 류마티스 관절염을 가진 환자들에게서 뇌공등(T.wilfordii) 추출물의 상당한 이점을 이미 보여주었다. 기술된 작용 메커니즘을 갖는 몇몇 종 및 이들의 활성 성분이 있지만, 시험관 내 및 생체 내 연구 및 면역학적 기반 질환에서의 향후 임상 시험에 관한 광범위한 분야가 여전히 분석되고 있다. 이들 천연산물은 자가 면역 질환의 치료 효과를 보장하기 위해 적절한 약제학적 조성물로 제형화 되어야한다.
하물며, 지금까지, 효과적인 약물이 없고 천연 추출물로부터 얻은 약물 선택이 없는, 자가 면역 질환으로 백반증이 예시될 수 있다. 백반증은 일반적으로 기능성 멜라닌 세포의 손실과 관련이 있으며, 세계 인구의 적어도 0.5%에 영향을 미치는, 인간에서 가장 흔한 후천성 색소 침착 장애로 간주된다. 이것은 표피 멜라닌 세포의 소실로 인한 백색 반점의 발달을 특징으로 하며, 이는 멜라닌 세포에 대한 특이적 세포 독성 면역 반응을 통한 세포 파괴 및 이의 유착 시스템의 손상을 초래할 수 있다.
유전적 소인, 환경적인 활성화, 대사 이상 및 면역 및 염증 반응의 변화와 같은 다양한 메커니즘들이 백반증과 관련되어 있다. 또한, 자외선 노출 및 산화 스트레스와 같은 조건들은 이 질환을 더 악화시키는 것으로 알려져 있다.
질병의 초기 단계에 대한 구체적인 지식이 없기 때문에, 여러 연구들은 이 병인과 관련된 생물학적 경로를 설명하려고 한다. 그들 중 대부분은 그러한 질병과 관련된 복잡성과 어려움을 나타내며, 효율적인 치료법을 찾기가 매우 어렵다. 우리는 대부분의 면역학적 장애가 중요한 사회적 영향을 미쳐, 환자들에게 높은 수준의 심리적 스트레스를 유발한다는 것을 잊지 말아야한다. 현재까지, 백반증의 치료법을 전달할 수 있는 개입은 없다.
이러한 방식으로, 장기간 효과를 갖는 면역 억제 활성을 촉진할 수 있는 새로운 화합물을 식별할 필요성이 명백해진다. 따라서, 본 발명은 단리시, 면역 억제 활성을 나타내는 신규한 화합물 및 특유하고 독창적인 방식으로 수득된 활성 화합물의 군을 포함하는 활성 추출물을 통해 면역학적 질환의 치료에서 이러한 차이를 해결한다.
백반증에 대한 복잡성과 과학적 지식의 부족을 강조하면서, 지금까지, 아이폴라미이드의 구조는 온전한 형태로 백반증 환자의 치료와 관련된 면역 억제 활동과 관련이 있을 수 있다고 여겨졌다. 그러나, 본 발명에서, 우리는 이러한 활성은 아이폴라미이드의 특유의 유도체 및 본원에 기재된 특유하고 독창적인 제조 방법에 의해 바람직하게 수득된 이러한 화합물을 포함하는 추출물의 결과임을 설명한다. 화합물과 추출물 모두 실험적으로 확인된 면역 억제 활성을 나타낸다. 이 활성은 CD8+ T세포의 활성화 및 IFN-γ 분비의 감소를 차단함으로써 본원에서 입증된다. 이 메커니즘은 환자의 피부에서 이들 성분의 정량화와 관련된 최근의 임상적 결과의 관점에서 백반증에 대해 유망한 것으로 나타났다. 구체적으로, 고농도의 CD8+ T세포 및 IFN-γ는 멜라닌 세포의 세포 자멸과 관련되어 있고, 따라서, 이들의 조절은 유망한 작용 메커니즘이다.
연구된 문헌으로부터 추론할 수 있는 것으로부터, 본 발명의 교시를 예측하거나 제안하는 문헌이 발견되지 않았으므로, 본원에 제안된 기술적 해결책은 최신 기술의 관점에서 신규하고 독창적인 활동성을 갖는다.
본 발명은 면역 억제 활성을 갖는 아이폴라미이드로부터 유도된 신규하고 독창적인 화합물을 기술한다. 따라서, 그들은 면역학적 장애의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 특유의 제조 방법을 통해 수득되고, 또한 면역 억제 활성을 갖는 아이폴라미이드로부터 유도되고, 상기 화합물이 풍부한 식물성 추출물을 기술한다.
따라서, 본 발명의 대상은 하기 화학식의 화합물을 포함하는 아이폴라미이드 유도체이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
상기 식에서, R은 H, OH, OGlyc(글리코사이드)이고; R1, R1', R1"은 H, OH이고; R2는 H, COOH, COOCH3, CH3, CHO이고; R3은 H, OH, CH3이고; R4, R4'은 H, OH, CH2OH, CH3이고; R5, R5'은 H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH이고; R6은 CHO, COOH, COOCH3이고, R7은 H, CH3이고, R8, R8', R8"은 CHO, CH3, CH2OH, COOH이고, 점선 결합들은 탄소 간의 단일(C-C) 또는 이중(C=C)결합 (구조당 최대 2개 이중 결합)을 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 적어도 하나의 바람직한 화합물은 하기 구조를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
이 바람직한 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IV), (V), (VIII) 및 (IX)의 화합물을 포함하고, 화학식 (II)의 화합물은 화학식 (VII), (X) 및 (XI)의 화합물을 포함하고, 화학식 (III)은 화학식 (VI)의 화합물을 포함한다.
또한, 본 발명의 대상은 면역 억제 효과를 제공하기에 충분한 양으로, 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 면역학적 장애의 치료 방법이다. 바람직한 구체예에서, 치료 방법은 백반증의 치료를 위한 것이다.
따라서, 우리는 면역학적 장애의 치료를 위한 조성물에서 적어도 하나의 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물의 용도를 고려할 수도 있다.
또한, 본 발명의 대상은 하기 화학식의 화합물을 포함하는 군 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물;
a)
Figure pct00012
,
b)
Figure pct00013
,및/또는
c)
Figure pct00014
.
-상기 식에서, R은 H, OH, OGlyc(글리코사이드)이고; R1, R1', R1"은 H, OH이고; R2는 H, COOH, COOCH3, CH3, CHO이고; R3은 H, OH, CH3이고; R4, R4'은 H, OH, CH2OH, CH3이고; R5, R5'은 H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH이고; R6은 CHO, COOH, COOCH3이고, R7은 H, CH3이고, R8, R8', R8"은 CHO, CH3, CH2OH, COOH이고, 점선 결합들은 탄소간의 단일(C-C) 또는 이중(C=C)결합 (구조당 최대 2개 이중 결합)을 나타낸다-; 및
d) 약제학적으로 허용되는 비히클;을 포함하는 면역학적 장애 치료용 약제학적 조성물이다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 아이폴라미이드 화합물을 더 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하기 화합물 중 적어도 하나를 더 포함한다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
또한, 본 발명은 적어도 하나의 아이폴라미이드 화합물을 적어도 하나의 적절한 용매의 존재 하에, 화학식 (I),(II) 및/또는 (III)의 화합물을 수득하기에 충분한 시간 동안 고온에서, 적어도 하나의 가열 단계에 적용하는 단계를 포함하는, 화학식 (I),(II) 및/또는 (III)의 화합물의 제조 방법을 기술한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 고온은 35℃ 이상, 보다 바람직하게는 35℃내지 165℃의 온도를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물의 제조 방법은 적어도 하나의 가수 분해 및/또는 가용매 분해 단계에 적어도 하나의 아이폴라미이드 화합물을 적용하는 단계를 포함한다. 더 이상적으로, 적어도 하나의 아이폴라미이드 화합물은 산 가수 분해 단계에 적용된다. 임의로, 적어도 하나의 아이폴라미이드 화합물은 알카리/염기성 가수 분해 단계에 적용된다.
앞서 언급된 바와 같이, 우리는 단리된 아이폴라미이드가 면역 억제 확성을 나타내지 않음을 확인하였다. 한편, 아이폴라미이드로부터 유도된 특정 군의 화합물은 그러한 활성을 갖는다. 동시에, 이러한 화합물 제조 시스템은 식물 성분과 활성 화합물 사이 일련의 생산적인 상호작용을 가능하게 하며, 심지어 상승 작용에 의하기 때문에, 우리는 또한 질병 치료를 위한 약초를 수득하는 이점을 명시하였다. 따라서, 그러한 활성 화합물을 포함하는 약초를 추가로 수득하기 위해, 우리는 관심 화합물이 풍부한 추출물을 수득할 수 있는 특유의 제조 방법을 개발하였다. 후술하는 바와 같이, 본 발명의 추출물 제조 방법은 면역 억제 활성을 갖는 아이폴라미이드 유도체가 풍부한 추출물을 유도하는 특유의 단계를 포함한다. 우리는 2.5% 내지 3.5%의 아이폴라미이드를 함유하는 투입 식물성 바이오매스를 사전 선택하는 것과의 관련성을 확인하였고, 아이폴라미이드가 풍부한 추출물 및 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 약 1%에서 약 20%, 바람직하게는 아이폴라미이드 및 유도체의 함량의 약 8.5%에서 약 11.5%가 된다.
전술한 바와 같이, 이 화합물을 함유하는 식물성 바이오매스는 추출물의 제조 방법을 위한 출발 물질로서 사용될 것이다. 본 발명의 제조 방법에 의해서만 아이폴라미이드로부터 유도된 특정 화합물이 풍부한 추출물을 얻을 수 있다. 이 풍부한 추출물은, 또한, 면역 억제 활성을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 본질적으로 다음 단계를 포함하는 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 추출물의 제조 방법이다:
a) 스타키타르페타(Stachytarpheta) 속 식물로부터 수득된 2.5% 내지 3.5%의 아이폴라미이드의 함량을 갖는 투입 식물성 바이오매스를 선택하는 단계;
b) 10 내지 12%의 습도 안정화를 얻을 때까지, a)로부터 선택된 바이오매스를 40 내지 80℃의 온도에서 오븐 건조시키는 단계;
c) 식물성 바이오매스를 분쇄하는 단계;
d) 다음 단계를 통해 식물성 바이오매스의 추출을 수행하는 단계;
i. 일정한 교반하에 70 내지 100℃의 온도에서 식물성 바이오매스의 가열;
ii. 상온에서 식물성 바이오매스의 마세레이션(maceration);
iii. 70 내지 100℃의 온도로 식물성 바이오매스의 가열.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 제조 방법은 다음 단계를 더 포함한다.
iv. 추출물의 여과 및 농축;
v. 제습기에 연결된 155℃ 내지 165℃의 입구 온도 및 85℃ 내지 95℃의 출구 온도를 갖는 분무 건조기에서 1 내지 60초 동안 건조.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 추출 방법은 수성 또는 하이드로알콜성 방법, 더 바람직하게는 수성 방법이다.
따라서, 본 발명의 제조 방법은 바람직하게는 약 8% 내지 약 10%의 수율로 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 표준화된 추출물을 수득하게 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 상기 언급된 절차에 의해 수득된 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 표준화된 추출물이다. 본 발명의 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 표준화된 추출물은 바람직하게는 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 식물성 바이오매스는 스타키타르페타 속 식물의 모든 부분을 포함한다. 바람직하게는, 식물성 바이오매스는 식물의 지상부, 더 바람직하게는 잎을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 투입 식물성 바이오매스는 2.5% 내지 3.5%의 균일한 함량의 아이폴라미이드를 갖는 적어도 하나의 식물성 바이오매스를 포함한다. 임의의 구체예에서, 투입 식물성 바이오매스는 하나 이상의 식물성 바이오매스를 포함하고, 여기서 상이한 식물성 바이오매스는 독립적으로 다른 함량의 아이폴라미이드를 갖지만, 함께 균일한 함량의 아이폴라미이드(2.5% 내지 3.5%)를 달성한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 투입 식물성 바이오매스에서 아이폴라미이드의 실제 함량은 수득된 추출물에서 아이폴라미이드 및 유도체의 이론적 함량을 예측하기 위한 파라미터로서 사용될 수 있다. 이 예측은 투입 식물성 바이오매스에서 이상적인 비율의 아이폴라미이드를 찾기 위해 실험적으로 얻어진 일부 파라미터에 식 I을 적용하는 단계를 포함하는 방법에 의해 달성될 수 있고, 이는 바람직하게 8.5% 내지 11.5%까지 추출물에 있는 아이폴라미이드 및 유도체의 함량을 예상한다. 식 I은 아래와 같이 정의된다:
추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 이론적 함량 % = 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량 % x DER / (<추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 실제 함량/투입 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량>) ± 표준편차 (식I).
이러한 방식으로, 투입 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량으로부터 추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 이론적 함량을 예측할 수 있다. 바람직하게는, 추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 실제 함량/투입 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 함량 간의 비율은 약 3.0 내지 3.5이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 식물은 스타키타르페타 카엔넨시스(Stachytarpheta cayennensis)를 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 면역 억제 활성을 갖는 약제의 제조를 위한 스타키타르페타 속 식물로부터 수득된, 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 표준화된 추출물의 용도이다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 추출물의 적어도 하나의 활성 분획이다. 바람직하게는, 적어도 하나의 분획은 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 아이폴라미이드로부터 유도된 적어도 하나의 화합물을 포함한다.
임의의 구체예에서, 활성 분획의 풍부한 추출물은 아이폴라미이드를 더 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 면역 억제 활성을 갖는 약제의 제조를 위한 스타키타르페타 속 식물로부터 수득된, 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 적어도 하나의 표준화된 분획의 용도이다
본 발명의 이들 및 다른 대상은 당해 기술 분야의 기술자 및 부분에서 관심을 갖는 회사에 의해 쉽게 인정될 것이고, 하기 설명에서 그의 재생산에 대한 충분히 상세한 설명이 기술될 것이다.
도 1은 스타키타르페타 카엔넨시스로부터 수득된 아이폴라미이드 유도체가 풍부한 활성 추출물의 제조 방법을 설명하는 요약 흐름도이다.
도 2는 αCD3/CD28 (A) 및 IFNγ생산(B)에 의해 활성화된 CD8+ T세포의 증식에 대한 스타키타르페타 카엔넨시스 (3, 10 및 30 μM, 아이폴라미이드로 표현된 농도) 및 단리된 아이폴라미이드 (3, 10 및 30 μM)의 수성 추출물의 효과. 아이폴라미이드(30μM)의 산 가수 분해 후 생성된 화합물(IV 내지 VIII) 풀 및 5가지 신규한 단리된 화합물(IV 내지 VIII)의 효과는 또한 동일한 실험, αCD3/CD28 (C) 및 IFNγ생산 (D)에 의해 활성화된 CD8+ T세포의 증식에서도 평가되었다. 타크로리무스(tacrolimus)(0.5μM)는 모든 실험에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 데이터는 세 번의 반복 실험의 평균 ± SD이다.
도 3은 아이폴라미이드의 산 가수 분해가 이의 유도체의 형성에 미치는 영향. 완전한 아이폴라미이드의 크로마토그램(청색); 0.1N HCl에서 40℃에서 1시간 동안 가수 분해된 아이폴라미이드(녹색); 0.1N HCl에서 40℃에서 2시간 동안 가수 분해된 아이폴라미이드(적색); 0.1N HCl에서 40℃에서 5시간 동안 가수 분해된 아이폴라미이드(자홍색). IPO는 아이폴라미이드.
도 4는 본원에 청구된 제조 방법으로부터 수득된 스타키타르페타 카엔넨시스 추출물의 크로마토그램. 상기 도면은 보유 시간(retention time):5.5; 9.7; 12.0; 14.3; 17.3분에서, 아이폴라미이드 마커 및 그의 특정 유도체를 설명한다. IPO는 아이폴라미이드.
본 명세서에 도시된 예는 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 본 발명을 수행하는 몇 가지 방법 중 하나를 예시하기 위한 목적으로만 사용된다.
활성 화합물
본 발명은 하기 화학식을 포함하는 신규하고 독창적인 화합물 군을 제공한다:
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
상기 식에서, R은 H, OH, OGlyc(글리코사이드)이고; R1, R1', R1"은 H, OH이고; R2는 H, COOH, COOCH3, CH3, CHO이고; R3은 H, OH, CH3이고; R4, R4'은 H, OH, CH2OH, CH3이고; R5, R5'은 H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH이고; R6은 CHO, COOH, COOCH3이고, R7은 H, CH3이고, R8, R8', R8"은 CHO, CH3, CH2OH, COOH이고, 점선 결합들은 탄소 간의 단일(C-C) 또는 이중(C=C)결합 (구조당 최대 2개 이중 결합)을 나타낸다.
실시예 1: 화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 포함한다.
Figure pct00031
실시예 2: 화학식 (II)의 화합물은 하기 구조를 포함한다.
Figure pct00032
실시예 3: 화학식 (III)의 화합물은 하기 구조를 포함한다.
Figure pct00033
상기 언급된 구조는 화학식 (I), (II) 또는 (III)에 포함된 구조 골격을 예시한다.
면역학적 장애
본 발명의 용어 "면역 장애"는 면역 시스템의 임의의 기능 장애를 포함한다. 일반적으로 장애는 영향을 받는 면역 시스템의 구성 요소에 의해 또는 면역 시스템의 활성 수준에 의해 특징 지을 수 있다. 본 발명에서, 바람직하게는, 면역 장애는 자가 면역의 일부 증거를 갖는 질환을 지칭한다. 본 발명에서 백반증은 가능한 면역 장애 중에서 더욱 바람직하게 선택되는 것으로 간주할 수 있다.
면역 장애의 치료 방법
본 발명은 면역 억제 효과를 제공하기에 충분한 양으로 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 면역 장애의 치료 방법을 기술한다. 본 특허 출원의 목적 상, 면역 장애의 치료는 면역 억제 활성을 갖는 아이폴라미이드 유도체 및/또는 아이폴라미이드 유도체를 함유하는 분획 및/또는 추출물을 사용하여 달성될 수 있음에 유의해야한다. 바람직한 구체예에서, 치료 방법은 백반증의 치료를 위한 것이다.
아이폴라미이드로부터 유도된 단리된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
일 실시예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 면역 장애의 치료를 위해 단독 또는 조합하여 사용된 단리된 아이폴라미이드 유도체를 포함하고, 여기서 하기 화학식의 화합물을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물;
a)
Figure pct00034
b)
Figure pct00035
및/또는
c)
Figure pct00036
-상기 식에서, R은 H, OH, OGlyc(글리코사이드)이고; R1, R1', R1"은 H, OH이고; R2는 H, COOH, COOCH3, CH3, CHO이고; R3은 H, OH, CH3이고; R4, R4'은 H, OH, CH2OH, CH3이고; R5, R5'은 H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH이고; R6은 CHO, COOH, COOCH3이고, R7은 H, CH3이고, R8, R8', R8"은 CHO, CH3, CH2OH, COOH이고, 점선 결합들은 탄소간의 단일(C-C) 또는 이중(C=C)결합 (구조당 최대 2개 이중 결합)을 나타낸다-; 및
d) 약제학적으로 허용되는 비히클;을 포함한다.
임의의 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 아이폴라미이드 화합물을 더 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 하기 화합물을 포함한다:
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
이 바람직한 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IV), (V), (VIII) 및 (IX)의 화합물을 포함하고, 화학식 (II)의 화합물은 화학식 (VII), (X) 및 (XI)의 화합물을 포함하고, 화학식 (III)은 화학식 (VI)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하기 화합물; 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함할 수 있다:
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
약제학적으로 허용되는 비히클.
이들의 활성을 수행하기 위해, 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물은 바람직하게는 약제학적 조성물의 형태로, 동물 유기체, 포유 동물, 특히 인간에게 투여되어야 한다. 즉, 각 투여 경로에 적합한 약제학적으로 허용되는 비히클과 연관된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 비히클과 관련된 본원에서 제안된 하나 이상의 화합물을 활성 성분으로서 함유한다. 활성 성분은 일반적으로 적어도 하나의 비히클과 혼합, 희석 또는 캡슐화된다.
비히클이 희석제인 경우, 이는 활성 성분을 위한 담체, 부형제 또는 매질로서 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 형태일 수 있다. 따라서, 조성물은 정제(tablets), 환제(pills), 산제(powders), 향낭(sachets), 현탁액(suspensions), 유제(emulsions), 용액, 에어로졸 (고체 또는 액체 매질), 크림, 경질 또는 연질 캡슐, 좌제(suppositories), 주사액의 형태 일 수 있다.
본 발명에서, 바람직하게는 투여 경로에 적합한 약제학적 투여 형태를 생성하기 위해 의도적으로 첨가된 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 화합물과 상이한 임의의 물질을 약제학적으로 적합한 비히클로 간주한다. 약제학적 조성물의 제조에 적합한 약제학적 부형제의 비제한적인 예는 Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations - Vol. 1 to 6 - 2004 - Sarfaraz K. Niazi - CRC Press e Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing에 기재되어 있다.
화학식 (I), (II) 또는 (III)의 화합물을 포함하는 조성물의 투여 경로의 비 제한적인 예는 국소, 경구, 비경구, 비강, 직장, 점막경유, 피부경유의 경로이다.
본 발명의 화합물에 사용되는 치료 용량은 선택된 투여 경로, 환자의 연령, 체중 및 상태 및 치료된 장애의 중증도에 따라 계획되고 계산되어야 한다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은 치료적으로 유효량으로 투여된다. 유효량은 체외 또는 동물 모델로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하기 위해 적절한 용량이 될 때까지 화합물을 투여할 것이다.
활성 화합물의 제조 방법
본 발명은 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 활성 화합물의 제조 방법을 상세히 설명한다. 본질적으로, 단리된 화합물의 제조 방법은 적어도 하나의 아이폴라미이드 화합물을 적절한 용매 중에서 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물을 수득하기에 충분한 시간 동안 고온에서, 적어도 하나의 가열 단계에 적용하는 단계를 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 아이폴라미이드 화합물을 더 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 용매는 물을 포함한다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 아이폴라미이드 화합물을 적절한 용매 중에서 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물을 수득하기에 충분한 시간 동안 고온에서, 가열 단계에 적용하는 단계를 포함하는 화학식 (I),(II) 및/또는 (III)의 화합물의 제조 방법을 기술한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 고농도의 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물은 각 생산 공정에서 사용된 아이폴라미이드의 함량의 총 전환 (100%)으로부터 수득된다.
더 바람직하게, 본 발명의 고농도는 혼합물 중 각 화합물 (IV 내지 VIII)의 약 0.5% 내지 약 45%를 포함한다. 이 경우, 농도는 화합물 IV의 약 1 내지 약 5%, 바람직하게는 4%; 화합물 V의 약 15 내지 약 25%, 바람직하게는 19%; 화합물 VI의 약 1% 내지 약 6%, 바람직하게는 3%; 화합물 VII 또는 이의 이성질체 (예를 들어, 화합물 X 또는 화합물 XI)의 약 35% 내지 약 45%, 바람직하게는 37%; 화합물 VIII 또는 이의 이성질체(예를 들어, 화합물 IX)의 약 0.5% 내지 약 4%, 바람직하게는 2%를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 고온은 35℃ 이상, 보다 바람직하게는 35℃ 내지 165℃의 온도를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 용매는 다른 적절한 용매를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 아이폴라미이드로부터 유도된 활성 화합물의 제조 방법은 아이폴라미이드의 가수 분해 또는 가용매 분해 단계를 포함한다.
더 바람직하게, 아이폴라미이드의 가수 분해는 산 유형일 수 있다. 아이폴라미이드의 산 가수 분해에 적합한 산 중에서, 염화수소산, 염산, 황산, 질산, 인산 및 아세트산이 언급될 수 있고, 이들 중 임의의 것에 특정한 제한이 없다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 염산이 사용된다.
임의의 구체예에서, 아이폴라미이드의 가수 분해는 염기성/알칼리성 유형일 수 있다. 아이폴라미이드의 염기성/알칼리성 가수 분해에 적합한 염기 중에서, 알칼리-금속 수산화물이 언급될 수 있고, 이들 중 임의의 것에 특정한 제한이 없다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 수산화 나트륨이 사용된다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 산성 매질에서 가수 분해 후에 염기성/알칼리성 매질에서 가수 분해가 이어진다. 한 예로서, 적어도 하나의 아이폴라미이드 화합물을 고온 및 0.1N (eq/L)의 염산에 적용한 후, 0 내지 120분 범위의 상이한 시간 간격 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 제조 방법을 언급할 수 있다. 이어서, 바람직하게는 수산화 나트륨 0.1N을 사용하는 중화 공정에 의해 가수 분해가 중단된다.
임의의 구체예에서, 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물의 제조 방법은 수성 수산화 나트륨 용액 0.1N로 수행되는 염기성 매질에서, 40℃, 2시간 동안 유지되는, 아이폴라미이드의 가수 분해 단계를 포함한다.
아이폴라미이드 유도체가 풍부한 활성 분획/추출물의 제조 방법
발명자에 의해 본 발명의 특정 단리된 활성 화합물은 분자 설계 및 합성 기술에 의해 수득될 수 있음을 확인하였다. 동시에, 이러한 화합물 제조 시스템은 식물 성분과 활성 화합물 사이 일련의 생산적인 상호작용을 가능하게 하며, 심지어 상승 작용에 의하기 때문에, 우리는 또한 질병 치료를 위한 약초를 수득하는 이점을 명시하였다. 따라서, 그러한 활성 화합물을 포함하는 약초를 추가로 수득하기 위해, 우리는 관심 화합물이 풍부한 추출물을 수득할 수 있는 특유의 제조 방법을 개발하였다.
후술하는 바와 같이, 본 발명의 추출물 제조 방법은 면역 억제 활성을 갖는 아이폴라미이드가 풍부한 추출물을 유도하는 특유의 단계를 포함한다. 우리는 2.5%내지 3.5%의 아이폴라미이드를 함유하는 투입 식물성 바이오매스를 사전 선택하는 것과의 관련성을 확인하였고, 아이폴라미이드 및 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 약 8.5% 내지 약 11.5%로 강화된 추출물을 생성시켰다. 앞서 제시한 바와 같이, 아이폴라미이드를 함유하는 식물성 바이오매스는 추출물 제조 방법을 위한 출발 물질로서 사용될 것이다. 본 발명의 제조 방법에 의해서만 아이폴라미이드로부터 유도된 특정 화합물이 풍부한 추출물을 수득할 수 있다. 이 강화된 추출물은 면역 억제 활성을 한층 더 나타낸다.
따라서, 본 발명은 스타키타르페타 속 식물로부터 아이폴라미이드 유도체가 풍부한 표준화된 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 본질적으로 다음 단계를 포함하는 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 추출물의 제조 방법이다:
a) 스타키타르페타(Stachytarpheta) 속 식물로부터 수득된 2.5% 내지 3.5%의 아이폴라미이드의 함량을 갖는 투입 식물성 바이오매스를 선택하는 단계;
b) 10 내지 12%의 습도 안정화를 얻을 때까지, a)로부터 선택된 바이오매스를 40 내지 80℃의 온도에서 오븐 건조시키는 단계;
c) 식물성 바이오매스를 분쇄하는 단계;
d) 다음 단계를 통해 식물성 바이오매스의 추출을 수행하는 단계;
i. 일정한 교반하에 70 내지 100℃의 온도에서 식물성 바이오매스의 가열;
ii. 상온에서 식물성 바이오매스의 마세레이션(maceration);
iii. 70 내지 100℃의 온도로 식물성 바이오매스의 가열.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 제조 방법은 다음 단계를 더 포함한다.
iv. 추출물의 여과 및 농축;
v. 제습기에 연결된 155℃ 내지 165℃의 입구 온도 및 85℃ 내지 95℃의 출구 온도를 갖는 분무 건조기에서 1 내지 60초 동안 건조.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 추출 방법은 수성 또는 하이드로알콜성 방법, 더 바람직하게는 수성 방법이다.
따라서, 본 발명의 제조 방법은 바람직하게는 약 8% 내지 약 10%의 수율로 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 표준화된 추출물을 수득하게 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 상기 언급된 절차에 의해 수득된 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 표준화된 추출물이다. 본 발명의 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 표준화된 추출물은 바람직하게는 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 식물성 바이오매스는 스타키타르페타 속 식물의 모든 부분을 포함한다. 바람직하게는, 식물성 바이오매스는 식물의 지상부, 더 바람직하게는 잎을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 투입 식물성 바이오매스는 2.5% 내지 3.5%의 균일한 함량의 아이폴라미이드를 갖는 적어도 하나의 식물성 바이오매스를 포함한다. 임의의 구체예에서, 투입 식물성 바이오매스는 하나 이상의 식물성 바이오매스를 포함하고, 여기서 상이한 식물성 바이오매스는 독립적으로 다른 함량의 아이폴라미이드를 갖지만, 함께 균일한 함량의 아이폴라미이드(2.5% 내지 3.5%)를 달성한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 투입 식물성 바이오매스에서 아이폴라미이드의 실제 함량은 수득된 추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 이론적 함량을 예측하기 위한 파라미터로서 사용될 수 있다. 이 예측은 투입 식물성 바이오매스에서 이상적인 비율의 아이폴라미이드를 찾기 위해 실험적으로 얻어진 일부 파라미터에 식 I을 적용하는 단계를 포함하는 방법에 의해 달성될 수 있고, 이는 바람직하게 8.5% 내지 11.5%까지 추출물에 있는 아이폴라미이드 및 유도체의 함량을 예상한다. 식I은 아래와 같이 정의된다:
추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 이론적 함량 % = 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량 % x DER / (<추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 실제 함량/투입 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량>) ± 표준편차 (식I).
이러한 방식으로, 투입 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량으로부터 추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 이론적 함량을 예측할 수 있다. 바람직하게는, 추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 실제 함량/투입 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 함량 간의 비율은 약 3.0 내지 3.5이다.
본 발명은 또한 상기 언급된 제조 방법으로부터 수득된 스타키타르페타 속 식물로부터의 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 표준화된 추출물을 청구한다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 식물은 스타키타르페타 카엔넨시스(Stachytarpheta cayennensis)를 포함한다.
스타키타르페타 속 식물로부터 표준화된 추출물은 바람직하게는 상기 기술된 제조 방법에 의해 수득되고, 아이폴라미이드 및 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 강화된 추출물이 약 1% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 8.5% 내지 11.5%의 함량의 아이폴라미이드 및 유도체를 생성한다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 면역 억제 활성을 갖는 약제의 제조를 위한 스타키타르페타 속 식물로부터 수득된, 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 표준화된 추출물의 용도이다. 보다 구체적으로, 면역 억제 활성을 갖는 약제의 제조를 위한 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물을 포함하는 스타키타르페타 속 식물의 표준화된 추출물이다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 추출물의 적어도 하나의 활성 분획이다. 바람직하게는, 적어도 하나의 분획은 화학식 (I), (II) 및/또는 (III)의 아이폴라미이드로부터 유도된 적어도 하나의 화합물을 포함한다.
임의의 구체예에서, 활성 분획의 풍부한 추출물은 아이폴라미이드를 더 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 면역 억제 활성을 갖는 약제의 제조를 위한 스타키타르페타 속 식물로부터 수득된, 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 적어도 하나의 표준화된 분획의 용도이다
실시예 - 바람직한 구체예
실험 부분에 기술된 예는 본 발명을 수행하는 몇 가지 방법 중 하나를 예시하기 위한 유일한 목적을 가지지만, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
활성 화합물의 제조 방법 및 확인
본 발명의 단리된 화합물은 아이폴라미이드 화합물을 40℃ 및 100℃에서, 1시간, 2시간 및 5시간 동안, 0.1N 염산에 적용함으로써 수득된다. 도 3은 40℃에서의 상태를 도시한다. 이 실험으로부터, 우리는 가수 분해로부터 몇 가지 생성물을 관찰할 수 있으며, 크로마토그램을 기초로, 도 3에 도시된 바와 같이, 예를 들어, 아래 설명된 구조와 같은 아이폴라미이드의 여러 유도체를 식별할 수 있다.
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
.
대안적으로, 가수 분해는 0.1 내지 1N의 염산 농도를 변화시킴으로써 수행될 수 있고, 실험 온도는 35℃ 내지 165℃에서 변할 수 있다. 또한, 가수 분해 시간은 특정 아이폴라미이드 유도체의 더 높은 농도의 형성을 촉진하기 위해 1분과 24시간 사이에서 변할 수 있다.
추출물 수득 과정
본 발명에 따르면, 아이폴라미이드 유도체가 풍부한 스타키타르페타 카엔넨시스 수성 추출물을 수득 과정은 주로 면역학에서 임상 전 연구의 개발을 위한 물질을 수득하기 위해 도 1의 순서도에 도시된 표준화된 추출물을 제조하는 단계를 포함한다.
우선, 스타키타르페타 카엔넨시스의 유전자형 분석에 의해 바람직하게 선택된 종자는 온도, 습도 및 광에 관한 제어된 환경에서 2개월 동안 파종하는 과정에 적용되었다. 파종은 팽창된 폴리스티렌 트레이에서 수행되고, 기질로 채워지고, 제어된 관개로 보호된 환경에서 유지되었다. 파종은 10 내지 15일 안에 나타나기 시작하였다. 모종이 크기 및 영구 이식을 위한 이상적인 조건에 도달할 때까지 트레이를 이러한 조건으로 유지하였다.
대략 5 내지 8 센티미터 높이의 크기 및 2 내지 3쌍의 결정 잎을 갖는 모종은 성장 부위에 이식되고, 이는 바람직하게는 연평균 온도가 30℃, 연평균 상태 습도가 55% 미만이고, 토양은 특정 화학적 및 물리적 토양 분석 결과, 예를 들어, 산도, 칼슘, 질소 및 모든 영역에서 유기질 시비의 사용이 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다.
모종을 심은 후, 첫번째 수확은 6개월 후에 수행되었고, 다른 수확물은 4개월마다 재성장하여, 투입 식물성 바이오매스에서 아이폴라미이드 함량을 최대화로 하는 것을 목표로하는 관목에 대한 최적화된 수명 주기를 보장한다.
식재 후, 식물성 바이오매스는 규정된 온도 및 습도의 조건 하에서, 온실 건조 과정을 통해 안정화되었다. 식물은 강제 공기 순환 및 50 내지 70℃, 바람직하게는 60℃ 범위의 온도로 열교환기와 함께 건조기에서 건조되었다. 건조는 식물성 바이오매스가 10 내지 12%의 습도로 안정화될 때까지, 식물을 통해 열풍을 통과하여 습도를 제거하는 것으로 이루어졌다. 바람직한 구체예에서, 건조 시간은 8 내지 20 시간이다.
도 1에서 도시된 바와 같이, 식물성 바이오매스는 1800RPM 및 19mm 체를 갖는 해머밀(hammer mill)에 의해 분쇄 과정에 적용되어, 실온에서 시간당 50 내지 150 킬로그램의 생산성을 얻었다. 분쇄 후, 식물성 바이오매스는 15분 동안 일정하게 교반하면서, 80 내지 90℃의 온도에서 수성 추출물에 적용되었다. 사용되는 추출 용약의 양은 사용된 식물성 바이오매스의 10배이어야하고, 이는 식물성 바이오매스에서 관심 물질의 완전한 추출을 보장한다.
이전 단계 후, 물질은 상온에서 10시간 동안 마세레이션 단계에 적용되었다. 이어서, 물질은 다시 15분 동안 80 내지 90℃에서 가열되었다.
물질은 40 μm의 폴리에스터 메쉬로 회전식 필터에서 여과되었다. 여과 단계 후, 물질은 "베르나우어(Bernauer)" 증발기 및/또는 낙하 필름 증발기에서 총 고체의 약 30%로 농축되었다.
이 단계의 생성물은 가능한 가장 낮은 잔류 습도 함량을 얻는 것을 목표로하여 (표 1), 바람직하게는 브라이-에어 유형의, 제습기에 연결된 155 내지 165℃의 입구 온도 및 85 내지 95℃의 출구 온도를 갖는 분무 건조기에서 20 내지 40초 동안, 건조시켰다. 이 과정은 식물성 추출물/유도체의 저장 수명 동안 물질의 잔류 습도가 초기에 관심 성분의 안정성을 손상시키기 때문에, 강화된 추출물의 품질을 실질적으로 개선시킨다. 이 추출 과정은 10 내지 12:1의 비율을 가져오고, 수율은 8 내지 10%로 변하였다.
건조 후 및 가습기로 건조 후 추출물의 습도 함량
SD로 건조 후 추출물의 습도 함량 SD+제습기로 건조 후 추출물의 습도 함량
4.61% 1.77%
전술한 추출 과정은 과정에서 생성된 아이폴라미이드 유도체의 존재로 인한 추출물의 면역 억제 활성을 보장하기 위해 아이폴라미이드의 완전한 추출물을 보장하였다. 따라서, 이는 추출물에서 아이폴라미이드 및 유도체의 실제 함량이 표 2에서 다음과 같이, 8.5 내지 11.5%가 되도록, 투입 식물성 바이오매스에 대한 공정 제어를 확립할 필요가 있었다. 식물성 바이오매스에서 아이폴라미이드의 제어는 본원에서 기술된 과정에 의해 생성된 추출물에서 면역 억제 활성을 갖는 아이폴라미이드 유도체의 존재를 보장한다.
식물성 바이오매스 및 추출물 중 아이폴라미이드의 함량
투입 식물성바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량 추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 이론적 함량 추출물a 중 아이폴라미이드 및 유도체의 실제 함량 투입 식물성 바이오매스의 선택
1.57% 5.23%
(4.44 - 6.02)		 4.47% 선택되지 않음
2.20% 7.33%
(6.23 - 8.43)		 7.62% 선택되지 않음
3.00% 10%
(8.5 - 11.5)		 10.80% 선택됨
3.30% 11%
(9.35 - 12.65)		 11.20% 선택됨
3.07% 10.2%
(8.67 - 11.73)		 8.90% 선택됨
3.65% 12.2%
(10.37 - 14.03)		 12.40% 선택되지 않음
a추출물 중 아이폴라미이드와 그의 유도체의 이론적 및 실제 함량 사이의 일치는 식1의 적용 가능성을 보여준다.
이것에 의해, 강화된 활성 추출물 중 아이폴라미이드 및 이의 유도체의 이론적 함량을 예측하는 방법을 결정할 수 있다. 이 목적을 위해, 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량으로부터 추출 과정 (이론적)에 의해 수득된 함량을 투영하는 식을 사용했다 (식I).
추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 이론적 함량 % = 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량 % x DER / (<추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 실제 함량/투입 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량>) ± 표준편차 (식I).
상기 전술한 식에서, DER은 1킬로의 천연 추출물을 수득하는 데 필요한 식물성 바이오매스의 양으로 이해될 수 있다. 투입 식물성 바이오매스 중 추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 실제 함량/아이폴라미이드의 함량 사이 비율은 바람직하게는 약 3.0 내지 약 3.5이다.
따라서, 상기 식을 사용하여 예상된 방법으로, 추출물에서 8.5 내지 11.5%의 아이폴라미이드 및 유도체의 적절한 이론적 함량을 예상하는 식물성 바이오매스(HPCL과 같은 분석 방법에 의해 수득된 아이폴라미이드의 함량)만을 선택할 수 있고, 이 범위를 예상하지 않는 것을 버릴 수 있다. 신규하고 독창적인 방식으로, 본 발명에서 추출물에서 아이폴라미이드 및 유도체의 실제 함량과 투입 식물성 바이오매스에서 아이폴라미이드의 함량 사이 관계는 바람직하게 3.0 내지 3.5일 것이라고 확인되었다.
HPLC 분석은 다음과 같이, 샘플 용액 및 표준을 준비하는 단계 및 이의 용출을 포함하였다:
1. 용액 제조
1.1 - 포름산 용액 0.1% (이동상 A): 약 800ml의 초순수(ultra-pure water)를 함유하는 1000mL 부피 플라스크에, 1ml의 포름산을 첨가하였다. 플라스크 부피는 초순수로 채우고 잘 균질화시켰다.
1.2 - 포름산 희석액: 메탄올 (1:1): 비이커에서, 50mL의 0.1% 포름산 용액을 50mL의 메탄올과 혼합하였다.
2. 샘플 제조:
원료 (약초): 1.0g의 분쇄된 약초를 칭량하여, 황색 250ml 삼각 플라스크에 옮기거나 알루미늄 호일로 덮었다. 증류수 50mL를 첨가하고, 80℃에서 2시간 동안 환류 추출하였다. 용액은 50mL 부피 플라스크로 종이-여과되고, 증류수로 채워졌다. 0.22 OR 0.45μm 막을 통해 HPLC 바이알로 여과하였다.
3. 표준 제조:
아이폴라미이드 표준 100ppm: 1.0mg의 아이폴라미이드 표준을 칭량하여, 황색 10mL 부피 플라스크에 옮겼다. 5ml의 희석제를 첨가하고, 이를 초음파 수조에 10분 동안 또는 완전히 용해될 때까지 두었다. 희색제로 채워진 후 균질화가 있었다. 칼 피셔(Karl Fischer)에 의한 습도 분석은 아이폴라미이드 표준에 대해 수행되었다.
HPLC에 의한 분석:
4.1 - 매개변수/장비
- 칼럼: Zorbax SB-C18 (250 mm x 4 mm; 5um)
- 이동상: (A) 0.1% 포름산;
(B) 메탄올.
아이폴라미이드 기울기 용리(Elution Gradient)
시간 (분) (%) A (%) B
0 80 20
27 58 42
32 58 42
32.1 0 100
36 0 100
36.1 80 20
45 80 20
- 유속: 1.0mL/분
- 검출: 254 nm.
- 분석 시간: 45분
- 주입량: 30μL
4.2 - 아이폴라미이드 함량 계산
아이폴라미이드 함량 (%) = A 샘플 x M 표준 x P 표준 x D 샘플 x (100 - U 표준);
A 표준 x M 샘플 x D 표준 x 10000/100;
여기서:
A 샘플: 샘플 중 아이폴라미이드의 피크 면적
M 표준: 표준 아이폴라미이드의 질량 (mg)
P 표준: 10의 표준 순도
D 샘플: 샘플의 희석 (mL)
A 표준: 표준 중 아이폴라미이드의 피크 면적
M 샘플: 사용된 샘플의 질량 (g)
D 표준: 표준의 희석 (L)
U 표준: 칼 피셔에 의해 정량화된 표준의 습도
10000: 단위 변환
추출물에서 함량의 결과는 건조 기초로 주어졌으며, 즉 습도가 무시되었다. 따라서, 추출물의 질량에 대한 계산은 다음과 같다:
M 샘플: 질량 x (100 - U 샘플)/100
여기서:
질량 = 건조 추출물의 질량 (g)
U 샘플 = iT2-052에 따른 건조 추출물의 습도 (%)
5. 아이폴라미이드 유도체에 대한 HPLC에 의한 분석
5.1 - 매개변수/장비
- 칼럼: Eclipse XDB Agilent - C18 (150 X 4.6 MM) 5 MICRONS
- 이동상: (A) 0.1% 포름산 완충액;
(B) 아세토나이트릴
아이폴라미이드 유도체 기울기 용리
시간 (분) (%) A (%) B
0 95 5
5.00 90 10
8.00 80 20
10.00 90 10
12.00 95 5
- 유속: 1.2mL/분
- 검출: DAD (205-280 nm).
- 분석 시간: 15분
- 주입량: 20μL
5.2 아이폴라미이드 유도체에 대한 함량 계산
주어진 아이폴라미이드 유도체(Y)의 분석을 위해, 이를 한정된 농도의 용액에 적용하였다. 이 농도는 크로마토그램에서 관찰된 면적과 직접적으로 관련되어 있다. 이 면적은, 크로마토그램의 총 면적과 비교할 때, 미리 정의된 농도를 곱한 것으로, 아래에서 볼 수 있듯이, 샘플 중 상기 유도체(Y)의 백분율 값을 제공한다.
Figure pct00055
(∑ 유도체의 함량 = 샘플 중 아이폴라미이드 유도체의 전체 함량 %)
생물학적/면역 억제 활성
아이폴라미이드 및 그의 유도체뿐만 아니라 스타키타르페타 카엔넨시스의 수성 추출물의 시험관 내 생물학적 활성의 평가는 하기 기재된 바와 같이 수행되었다.
스타키타르페타 카엔넨시스, 아이폴라미이드 및 유도체의 추출물은 CD8+ T세포 및 IFNγ를 포함하는 실험의 시험관 내 면역학적 모델에서 연구되었다. 이 연구의 목적은 추출물과 단리된 또는 혼합된 다른 물질이 CD8+ T세포의 활성화 및 그에 따른 IFNγ의 분비를 차단하여 작용하는지 여부를 평가하는 것이었다.
건강한 지원자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 Ficoll-Hystopaque 원심분리에 의해 백혈구 층으로부터 분리하였다. 그 후, CD8+ T세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, #130-096-495)를 사용하여 인간 CD8+ T세포를 분리하였다. 이들 세포 (3x105 cells/well)를 RPMI+10%의 FBS 배지에서 배양하고, αCD3/CD28 (1μg/mL)로 활성화시키고, 10%의 아이폴라미이드, 단리된 아이폴라미이드 및 CD8+ T세포 활성화의 예방 및 IFNγ의 분비에 대한 그들의 효과를 연구하기 위해 산 가수 분해에 의해 수득된 아이폴라미이드 유도체로 표준화된 스타키타르페타 카엔넨시스의 수성 추출물의 상이한 농도로 처리되었다. 세포 증식의 평가를 위해, 증식 분석에 일반적으로 사용되는 티미딘 유사체인 브로모데옥시우리딘 (BrdU)을 증식 마커로 사용하였다. 구체적으로, 제조사의 지시에 따라 Biotrak ELISA System(GE Healthcare, RPN250)을 통한 BrdU의 혼합이 평가되었다. 인터페론 감마의 정량 방법은 Human IFNγ ELISA Ready-SET-Go 키트(eBiosciences 88-7316-88)의 사용을 포함하고, 제조사의 지침을 따랐다. 도 2의 그래프 세트에 도시된 바와 같이, 아이폴라미이드 유도체가 풍부한 스타키타르페타 카엔넨시스의 수성 추출물은 αCD3/CD28에 의해 유도된 CD8+ T세포의 활성을 차단하였다. 단리된 아이폴라미이드는 αCD3/CD28에 의해 유도된 CD8+ T세포의 증식, 또는 IFNγ의 분비에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 산 가수 분해를 위해 수득된 혼합물 중 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물은 CD8+ T세포 증식 및 IFNγ 분비를 상당히 감소시켰다. 이 혼합물로부터 단리된 아이폴라미이드 유도체는 또한 CD8+ T세포 증식 및 IFNγ 분비의 통계적으로 상당한 감소를 입증하였다. 잘 알려진 면역억제제인 타크로리무스는 기준 화합물 및 실험의 양성 대조군으로 사용하였다. 타크로리무스에 의해 수득된 효과는 세포 증식과 IFNγ 생산 모두에서 가수 분해된 아이폴라미이드로 수득된 효과와 유사하였다.
따라서, 상기 결과는 면역 억제 활성이 온전한 분자가 아닌 아이폴라미이드로부터 유도됨을 보여주었다. 단리된 아이폴라미이드의 산 가수 분해 실험 조건에 의해 수득된 화합물이 도 4에 도시된 것과 같이 스타키타르페타 카엔넨시스의 수성 추출물에 존재하는 것을 강화하는 것이 중요하다. 그러나, 이러한 화합물의 존재는 본 발명에 사용된 추출 과정에 기인한다.
이 분야에 당업자는 본 명세서에 제시된 지식을 이해할 것이고, 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 제시된 실시예 및 다른 실시예에서 본 발명을 재현할 수 있다.

Claims (31)

  1. 하기 화학식을 포함하는 화합물:
    Figure pct00056
    Figure pct00057

    상기 식에서, R은 H, OH, OGlyc(글리코사이드)이고; R1, R1', R1"은 H, OH이고; R2는 H, COOH, COOCH3, CH3, CHO이고; R3은 H, OH, CH3이고; R4, R4'은 H, OH, CH2OH, CH3이고; R5, R5'은 H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH이고; R6은 CHO, COOH, COOCH3이고, R7은 H, CH3이고, 점선 결합들은 탄소간의 단일(C-C) 또는 이중(C=C)결합 (구조당 최대 2개 이중 결합)을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 면역 억제 활성을 갖는 화합물.
  3. 면역 억제 효과를 제공하기에 충분한 양으로 화학식 (I) 및/또는 (II)의 하나의 화합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 장애의 치료 방법.
  4. 제3항에 있어서, 백반증 환자의 치료를 위한 치료 방법.
  5. a)
    Figure pct00058
    및/또는
    b)
    Figure pct00059
    ,
    ―상기 식에서, R은 H, OH, OGlyc(글리코사이드)이고; R1, R1', R1"은 H, OH이고; R2는 H, COOH, COOCH3, CH3, CHO이고; R3은 H, OH, CH3이고; R4, R4'은 H, OH, CH2OH, CH3이고; R5, R5'은 H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH이고; R6은 CHO, COOH, COOCH3이고, R7은 H, CH3이고, 점선 결합들은 탄소간의 단일(C-C) 또는 이중(C=C)결합 (구조당 최대 2개 이중 결합)을 나타낸다―
    을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물 및
    d) 약제학적으로 허용되는 비히클;
    을 포함하는, 면역 장애 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 아이폴라미이드 화합물을 더 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 하기 화합물 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물:
    Figure pct00060
    Figure pct00061
    Figure pct00062
    Figure pct00063

    Figure pct00064
    Figure pct00065
    Figure pct00066
  8. 적어도 하나의 아이폴라미이드 화합물을 적합한 용매 중에서 화학식 (I) 및/또는 (II)의 아이폴라미이드 유도체를 수득하기에 충분한 시간 동안 고온에서 가열 단계에 적용하는 단계를 포함하는, 활성 화합물의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 활성 화합물이 면역 억제 활성을 포함하는, 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서, 용매가 물인, 제조 방법.
  11. 제8항에 있어서, 고농도의 화학식 (I) 및/또는 (II)의 화합물을 수득할 수 있는, 제조 방법.
  12. 제8항에 있어서, 고농도는 혼합물에서 약 0.5% 내지 약 45%의 화학식 (I) 및/또는 (II)의 화합물을 포함하는, 제조 방법.
  13. 제8항에 있어서, 고온은 35℃ 초과의 온도를 포함하는, 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 고온은 35℃ 내지 165℃의 온도를 포함하는, 제조 방법.
  15. 제8항에 있어서, 가수 분해 단계를 포함하는, 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 산 가수 분해 단계를 포함하는, 제조 방법.
  17. 제15항에 있어서, 염기 가수 분해 단계를 포함하는, 제조 방법.
  18. 다음 단계를 포함하는, 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 추출물의 제조 방법:
    a) 스타키타르페타(Stachytarpheta) 속의 식물로부터 수득된 2.5% 내지 3.5%의 아이폴라미이드의 함량을 갖는 투입 식물성 바이오매스를 선택하는 단계;
    b) 10 내지 12%의 습도 안정화를 얻을 때까지, a)로부터 선택된 바이오매스를 40 내지 80℃의 온도에서 오븐 건조시키는 단계;
    c) 식물성 바이오매스를 분쇄하는 단계;
    d) 다음 단계를 통해 식물성 바이오매스의 추출을 수행하는 단계:
    i. 일정한 교반하에 70 내지 100℃의 온도에서 식물성 바이오매스의 가열;
    ii. 상온에서 식물성 바이오매스의 마세레이션(maceration);
    iii. 70 내지 100℃의 온도로 식물성 바이오매스의 가열.
  19. 제18항에 있어서, 다음의 단계를 더 포함하는, 추출물의 제조 방법:
    iv. 추출물의 여과 및 농축;
    v. 제습기에 연결된 155℃ 내지 165℃의 입구 온도 및 85℃ 내지 95℃의 출구 온도를 갖는 분무 건조기에서 1 내지 60초 동안 건조.
  20. 제18항에 있어서, d)의 식물성 바이오매스 가열이 5 내지 30분 동안 발생하는, 추출물의 제조 방법.
  21. 제18항에 있어서, d)의 식물성 바이오매스 가열이 5 내지 15시간 동안 발생하는, 추출물의 제조 방법.
  22. 제18항에 있어서, 투입 식물성 바이오매스가 스타키타르페타 속 식물의 지상부를 포함하는, 추출물의 제조 방법.
  23. 제18항에 있어서, 식물이 스타키타르페타 카엔넨시스(Stachytarpheta cayennensis)인, 추출물의 제조 방법.
  24. 제18항에 있어서, 약 8 내지 약 10%의 추출 수율을 가능하게 하는, 추출물의 제조 방법.
  25. 제18항에 있어서, 수성 추출을 포함하는, 추출물의 제조 방법.
  26. 제18항에 있어서, 약 1% 내지 약 20%의 아이폴라미이드 및 유도체를 함유하는 추출물을 제공하는, 추출물의 제조 방법.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 식 I을 사용하여 투입 식물성 바이오매스 중 아이폴라미이드의 실제 함량으로부터 추출물 중 아이폴라미이드 및 유도체의 이론적 함량을 예측하는 단계를 포함하는, 추출물의 제조 방법:
    식 I:
    Figure pct00067
  28. 스타키타르페타 속 식물로부터 수득되고 적어도 하나의 화학식 (I) 및/또는 (II)의 화합물을 포함하는, 표준화된 추출물.
  29. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 수득된, 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물이 풍부한 추출물.
  30. 적어도 하나의 화학식 (I) 및/또는 (II)의 화합물을 포함하는 스타키타르페타 속 식물로부터의 풍부한 표준화된 추출물 분획.
  31. 면역학적 장애 치료용의 면역 억제 활성을 갖는 약제의 제조를 위한, 화학식 (I) 및/또는 (II)의 아이폴라미이드로부터 유도된 화합물을 포함하는 추출물 및/또는 표준화된 분획의 용도.
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