CN103120699B - 环烯醚萜类化合物在制备抗sars的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有通式(I)的环烯醚萜类化合物在制备用于治疗或预防SARS的药物中的应用，其中R1选自H、CH3、COOH或COOCH3；R2选自H或OH；R3选自H、OH、OCOCH3；R4选自H、OH或CH3；R5选自H、CH3、OCOCH3、OH或CH2OH；R6选自H、OH或CH3；R7选自H或OH。其中化合物6β‑hydroxyipolamiide的IC50值为138.8μM，化合物山栀苷甲酯的IC50值为104.1μM，化合物8‑O‑乙酰山栀苷甲酯的IC50值为125μM。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体地说本发明涉及环烯醚萜类化合物的用途。
背景技术
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)是一种严重的急性呼吸系统传染病，也称传染性非典型肺炎。SARS病原体是冠状病毒属的一种病毒(Peiris J.et al.，Lancet，2003，361：1319-1325)。冠状病毒属隶属于冠状病毒科，冠状病毒是目前已知的、基因组最大的正链RNA病毒(Siddell S.G.et al.，Coronaviruses，toroviruses，and arteriviruses.in Topley & Wilson′s Microbiology and MicrobiaInfections，10th edition，Vol.Virology(eds.Mahy，B.W.J.&ter Meulen，V.)823-856(Hodder Arnold.London，2005)。冠状病毒属含有约26个种，按照它们的自然宿主、基因序列以及血清型关系又可以被分为三个组群(group)：第一组群有TGEV，猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus)等；第二组群有SARS冠状病毒等；第三组群有AIBV，禽传染性支气管炎病毒(Avian InfectiousBronchitis Virus)等(SpaanW.J.M.and Cavanagh D.Coronaviridae.in Virus taxonomy，VIIIth Report of theICTV.945-962(Elsevier-Academic Press.，London，2004)。
SARS冠状病毒2/3到3/4的基因组编码了两个复制酶多蛋白(replicasepolyproteins)ppla和pplab(Ziebuhr J.et al.，J Gen Virol.2000，81：853-79；ThielV.et al.，J Gen Virol 2001，82，1273-1281；Ziebuhr J.Curr Top MicrobiolImmunol.2005，287：57-94)，它们只有在病毒编码的蛋白酶切割成独立亚基之后才能使病毒完成正常转录、复制功能(Ziebuhr J.et al.，J Gen Virol.2000，81：853-79；BartlamM.et al.，Curr Opin Struct Biol 2005，15：664-72.)。SARS冠状病毒主要蛋白酶(mainprotease，简称主蛋白酶)在这个过程中起主要作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒的主蛋白酶是抗SARS药物筛选的一个主要靶标。
天然产物又称次级代谢产物(Secondary Metabolites)，具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(NewmanD.J.et al.，Nat Prod Rep，2000，17(3)：215-234；Lee K-H.J Nat Prod 2004，67(2)：273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的，因为中药在我国已有数千年应用的历史，是一个伟大的药物小分子化合物的宝库，因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。
环烯醚萜类化合物是一种从中草药中提取的活性化合物，具有广泛的生物活性。李林等在CN101843630A中公开了含有环烯醚萜类化合物例如莫诺苷和马钱素的组合物，其用于制备防治神经系统脱髓鞘疾病的药物的用途，以及用其治疗与神经系统髓鞘病损相关疾病；并在CN101254185中公开了环烯醚萜类化合物治疗与神经细胞增殖和/或分化相关疾病。张卫东等(CN101829080A)公开了环烯醚萜化合物具有选择性的卵巢癌细胞毒性杀伤作用，能抑制卵巢癌细胞的增殖，导致癌细胞的死亡；后来又在CN101444500中公开了环烯醚萜化合物可以作为活性成分制备抗癌药物。肖丹等(CN101732305A)公开了环烯醚萜类化合物在制备治疗良性前列腺增生的药物中的用途；范秋领等在CN101704858A中公开了环烯醚萜具有抗氧化作用；贾正平等(CN101402661)公开了环烯醚萜苷类化合物可用作止血、镇痛药物；姚新生等(CN101486743)公开了环烯醚萜类化合物可用于预防或治疗老年痴呆症等神经系统退行性疾病的药物；张伯熙等(CN1107472)公开了环烯醚萜类化合物可作为作物增产剂和生根促进剂。然而，天然环烯醚萜类化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制作用尚无相关报道。
发明内容
通过本发明的制备方法得到了若干环烯醚萜类化合物，通过对这些环烯醚萜类化合物进行SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性测定，发现这些环烯醚萜类化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶都有很好的抑制活性，这说明环烯醚萜类化合物具有能够有效的抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的活性，这一类化合物有望作为抑制SARS冠状病毒的潜在药物分子。
根据本发明的一个方面，本发明提供了环烯醚萜类化合物在制备用于治疗或预防SARS的药物中的应用，所述环烯醚萜类化合物的结构式如下：
其中R1选自H、CH3、COOH或COOCH3；R2选自H或OH；R3选自H、OH、OCOCH3；R4选自H、OH或CH3；R5选自H、CH3、OCOCH3、OH或CH2OH；R6选自H、OH或CH3；R7选自H或OH。
根据本发明的另一方面，其中所述R1选自COOH或COOCH3；R2选自H或OH；R3选自OH或OCOCH3；R4选自H；R5选自OH或OCOCH3；R6选自H；R7选自H。
本发明的环烯醚萜类化合物优选6β-hydroxyipolamiide、山栀苷甲酯或8-O-乙酰山栀苷甲酯。
本发明优选的环烯醚萜类化合物6β-hydroxyipolamiide、山栀苷甲酯或8-O-乙酰山栀苷甲酯是通过以下步骤制备的：
a.将秦艽(Radix Gentianae Macrophyllae)用溶剂进行提取，浓缩提取液，得浸膏；
b.将浸膏溶解，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；
c.将乙酸乙酯萃取物浓缩后进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂，得洗脱产物；
d.将洗脱产物浓缩后进行进一步的柱层析，以流动相洗脱，得洗脱产物；
e.将d中得到的洗脱产物进行进一步的分离纯化，得产物。
在上述制备方法中，其中步骤a的溶剂包括水、醇类或其混合物，优选95％乙醇。
在上述制备方法中，其中步骤c中二氯甲烷-甲醇的比值范围为10∶1至5∶1。
在上述制备方法中，其中在步骤d中，柱层析是指硅胶柱层析，流动相为二氯甲烷-甲醇10∶1。
在上述制备方法中，其中在步骤d中，柱层析是指凝胶柱层析，流动相为氯仿-甲醇1∶1。
在上述制备方法中，其中在步骤e中，分离纯化方法是薄层制备方法，展开剂为氯仿-甲醇3∶1。
在上述制备方法中，其中在步骤e中，分离纯化方法是高效液相制备方法，流动相为甲醇-水45∶55。
本发明的又一方面是提供了秦艽提取物、特别是秦艽的95％乙醇提取物在制备用于治疗或预防SARS冠状病毒感染的药物中的应用。
本发明还提供了秦艽的95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在制备用于治疗或预防SARS冠状病毒感染的药物中的应用。秦艽的95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性大于95％。
本发明提供了环烯醚萜类化合物在制备用于治疗或预防SARS冠状病毒感染的药物中的新用途。还提供了一种以活性为导向从传统中药中提取分离对SARS冠状病毒主蛋白酶具有抑制活性的环烯醚萜类化合物的方法。而且还发现了传统中药秦艽在制备用于治疗或预防SARS冠状病毒感染的药物中的新用途。
附图说明
图1示出根据本发明的具体实施例的秦艽乙醇提取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图。其中样品浓度为500μg/mL。
图2示出根据本发明的具体实施例秦艽各萃取物组分对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图。其中样品浓度为500μg/mL。
图3示出根据本发明的具体实施例的秦艽乙酸乙酯萃取物分段标准组分对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图。其中样品浓度为500μg/mL。
图4示出化合物(1)6β-hydroxyipolamiide的1H NMR图。
图5示出化合物(1)6β-hydroxyipolamiide的13C NMR图。
图6示出化合物(2)山栀苷甲酯的1H NMR图。
图7示出化合物(2)山栀苷甲酯的13C NMR图。
图8示出化合物(3)8-O-乙酰山栀苷甲酯的1H NMR图。
图9示出化合物(3)8-O-乙酰山栀苷甲酯的13C NMR图。
图10示出化合物(1-3)对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图。其中样品浓度为500μg/mL。
图11示出化合物(1)6β-hydroxyipolamiide对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性IC50曲线图。
图12示出化合物(2)山栀苷甲酯对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性IC50曲线图。
图13示出化合物(3)8-O-乙酰山栀苷甲酯对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性IC50曲线图。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的具体实施方式，这仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
实施例1SARS冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化和晶体生长
根据文献(Yang H.et al.，Proc Natl Acad Sci，2003 Nov；100(23)：13190-13915)进行SARS冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化和晶体生长，得到衍射分辨率较高(高于)的SARS冠状病毒主蛋白酶的晶体。具体方法如下：
1)SARS冠状病毒主蛋白酶的表达载体的构建，具体步骤包括：
a.利用北京华大基因中心提供的编号为BJ01的SARS病毒毒株的cDNA文库，用PCR技术进行体外扩增；
正向引物：5′-CGGGATCCAGTGGTTTTAGGAAAATG-3′
反向引物：5′-CCGCTCGAGTCATTGGAAGGTAACACCAGA-3′
b.经PCR扩增的基因片段经BamHI和XhoI双酶酶切后，用琼脂糖凝胶电泳回收大小为1kb左右的片段；
c.将回收片段与T载体进行连接，然后用连接产物转化大肠肝菌Escherichiacoli DH5α感受态细胞，并涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上，培养过夜；
d.从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有约5mL的LB的试管(该LB溶液中加入氨卞青霉素，使其终浓度为100mg/L)中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒(博大泰克公司B型质粒小量快速提取试剂盒)提取质粒，并用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收大小约为1kb左右的目标基因片段；
e.将目标载体pGEX-4T-1(购自Pharmacia公司)用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收酶切的片段；
f.将d和e获得的片段连接(将酶切回收后的目标基因片断和目标载体片段按照摩尔数3∶1-6∶1的比率混合，按照Takara DNA Ligation的要求在16℃反应30分钟-18小时)，转化大肠肝菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上培养过夜。将筛选到的阳性克隆，用于鉴定和测序。测序结果表明，SARS冠状病毒的主蛋白酶的编码基因已被正确地克隆到pGEX-4T-1载体中。
2)SARS冠状病毒主蛋白酶的表达与纯化，具体步骤包括：
a.将上述步骤1a中得到的含有编码SARS冠状病毒主蛋白酶基因的pGEX-4T-1载体转化Escherichia coli BL21(DE3)的菌株，并用LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)筛选阳性克隆；
b.在a中所述的LB平板上挑取阳性克隆(在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的单克隆)，培养过夜，然后转入1L的LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，当OD600达到0.6-0.8时，加入1mM左右的IPTG，在16℃培养12小时左右；
c.5000-8000rpm离心10-25min收集细胞，然后冰浴超声破菌20-50分钟；破菌液13000rpm-18000rpm离心20-60min后收集上清液；
d.将上清液加入PBS预平衡的GST亲和层析柱(GE公司)中，用PBS淋洗20-30个柱床体积去除杂蛋白。最后加入2mL 0.1mg/mL左右的人类鼻病毒3C蛋白酶，在4℃酶切12-20小时，之后收集SARS冠状病毒主蛋白酶；
e.将(2.4)获得的蛋白再用Mono Q(GE公司)阴离子交换层析进行纯化。
3)SARS冠状病毒的主蛋白酶的晶体生长
SARS冠状病毒的主蛋白酶的晶体生长是采用悬滴气相扩散法，在289-297K(K是温度单位开尔文，摄氏温度16℃～24℃)下，用组织培养板进行的。用Hampton Research公司的晶体生长试剂盒(Crystal ScreeningKit I & II，PEG/ION Kit，PEG 6000Grid Kit和(NH4)2SO4Kit)对初始结晶条件进行筛选。在PEG 6000Grid Kit的C3(20％PEG 6000，0.1MMES(pH 6.0))条件下的液滴中有红色球状沉淀，并在沉淀的边缘出现微晶。在此结晶条件下，使用不同pH值的缓冲液(如pH值从5.5到6.5之间进行)、不同聚合度的PEG(如从PEG3350到PEG 10000之间进行)、不同蛋白浓度(如从2mg/mL到30mg/mL之间进行)和各种添加剂(Hampton Research公司的添加剂试剂盒)等来优化晶体。最后，在1.8～12％的PEG6000，3％二甲基亚砜(DMSO)，1mM DTT，100mM MES缓冲液(pH5.0～PH6.0)以及蛋白浓度为5～12mg/mL时获得了衍射分辨率较高(高于)的晶体。
实施例2SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法
本发明所采用的筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法是饶子和等在CN101418334A中公开的筛选方法，具体方法如下：
SARS冠状病毒主蛋白酶的活性测定是使用荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(纯度大于95％，上海吉尔生化有限公司)来完成的。该荧光底物的氨基酸序列来源于SARS冠状病毒主蛋白酶的N端自剪切序列。
用于荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)，激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm。
在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS冠状病毒主蛋白酶(终浓度0.5μM)，加入备选样品的DMSO溶解物(使其终浓度为：100μg/mL，底物浓度为20μM，298K放置10分钟后，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2，终浓度20μM)。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。
对照：不加入备选样品，其余条件相同。
实施例3秦艽备选样品的制备
将2kg干燥粉碎的秦艽药材用7.5升95％乙醇回流提取3次，每次提取2个小时，分别将18kg秦艽药材分9次提取，将9次95％乙醇回流提取得到的提取液合并，浓缩得到浸膏4.5公斤。
将得到的4.5公斤浸膏分4部分用1.5升双蒸水悬浮超声2小时进行溶解，然后将其倒入5升分液漏斗之中，按照有机溶剂极性依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取每次用有机溶剂2.5升，充分振摇，静置6个小时，每种溶剂萃取3次，分离有机溶剂相和水相，合并各种溶剂层的萃取液用EYELA N1001型旋转蒸发仪浓缩，得到干膏状的秦艽石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取样品，其中得到石油醚萃取物380克、二氯甲烷萃取物110克、乙酸乙酯萃取物115克、正丁醇萃取物150克，作为SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制剂的筛选和进一步分离的样品。
实施例4秦艽备选样品的SARS冠状病毒主蛋白酶体外活性筛选
将实施例3中制备的4个干膏状的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取样品各称取5毫克分别溶于二甲基亚砜(DMSO)中使其终浓度为50mg/mL，分别制得4个备选样品的DMSO溶解物。
在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS冠状病毒主蛋白酶(终浓度0.5μM)，加入以上4个备选样品的DMSO溶解物(使其终浓度为：100μg/mL，底物浓度为20μM，298K放置10分钟后，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2，终浓度20μM)。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。
对照：不加入备选样品，其余条件相同。
对秦艽乙醇提取物和各萃取组分先后进行活性测试，结果分别如图1、图2所示，由图2可知秦艽乙酸乙酯萃取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性大于95％，具有较强的抑制活性，说明秦艽中的小分子抑制剂主要存在于乙酸乙酯萃取部位中。
实施例5秦艽乙酸乙酯萃取物的分离纯化
在活性指导下确定秦艽乙酸乙酯萃取物为小分子抑制剂主要集中的部位后，对其进行分离纯化旨在最终得到起抑制作用的小分子的化学结构，我们对秦艽乙酸乙酯萃取物进行了如下分离：
将乙酸乙酯萃取物115克样品用乙醇溶解，拌入100克硅胶(柱层析200-300目)，使用硅胶柱层析色谱柱进行分离(1.3公斤柱层析硅胶200-300目)，色谱柱规格为外径80毫米，长1000毫米。采用二氯甲烷-甲醇溶剂系统为流动相，分别以二氯甲烷-甲醇50∶1、二氯甲烷-甲醇30∶1、二氯甲烷-甲醇20∶1、二氯甲烷-甲醇10∶1、二氯甲烷-甲醇5∶1、二氯甲烷-甲醇1∶1进行洗脱，每个梯度洗脱4-5个柱体积。收集洗脱液进行减压浓缩，对每个馏分进行薄层色谱检测分析，按洗脱梯度合并组成相近的组分。得到6个部分E1-E6。对这6个部分按照步骤2采用的活性筛选方法进行活性测定，确定E4、E5为小分子抑制剂主要集中的部位(图3)，该部位大致对应于二氯甲烷-甲醇10∶1至二氯甲烷-甲醇5∶1的洗脱梯度。
实施例66β-hydroxyipolamiide(1)和山栀苷甲酯(2)的制备
将实施例5中得到的E4进行薄层色谱分析，继续使用硅胶柱层析对其进行分离，采用二氯甲烷-甲醇溶剂系统作为洗脱剂，分别用二氯甲烷15∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1进行洗脱，每个梯度洗脱4-5个柱体积通过薄层色谱分析按梯度合并组分得到5个部分E4a-E4e，之后对这5个部分进行步骤2采用的活性筛选方法进行活性测定，其中E4b的活性最佳，对其进行薄层分析后发现在254纳米下有两个主要的吸收斑点，通过进一步分析优化展开剂条件后选定氯仿-甲醇3∶1作为展开剂，使用薄层制备的方法得到化合物1(15mg)和化合物2(16mg)。
化合物1为白色无定型粉末，其核磁共振数据如下(图4、图5)：
1H NMR(CD3OD，400MHz，δ，ppm)：7.51(1H，s，H-3)，5.86(1H，s，H-1)，4.61(1H，d，J＝7.6Hz，H-1’)，4.07(1H，dd，J1＝8.4Hz，J2＝6.0Hz，H-6)，3.92(1H，dd，J1＝12Hz，J2＝2Hz，H-6’)，3.68(1H，dd，J1＝12Hz，J2＝5.6Hz，H-6’)，3.75(3H，s，Me-12)，3.39(1H，t，J＝9.2Hz，H-3’)，3.32(1H，m，H-5’)，3.39(1H，t，J＝8.6Hz，H-4’)，3.21(1H，dd，J1＝8.6Hz，J2＝7.9Hz，H-2’)，2.59(1H，s，H-9)，1.15(1H，s，H-10)；
13C NMR(CD3OD，150MHz，δ，ppm)：92.6(C-1)，152.7(C-3)，113.0(C-4)，70.3(C-5)，74.1(C-6)，50.5(C-7)，76.0(C-8)，59.3(C-9)，22.5(C-10)，166.9(C-11)，59.3(C-12)，98.3(C-1’)，74.1(C-2’)，77.0(C-3’)，72.9(C-4’)，77.0(C-5’)，61.2(C-6’)。
化合物1的1H NMR、13C NMR数据与Tayfun ERSOZ等发表的6β-hydroxyipolamiide(Tayfun ERSOZ，Duygu KAYA，et al.Iridoid Glucosides from Lamium garganicumsubsp.laevigatum，Turk J Chem，2007，155-162)的数据一致，确定为6β-hydroxyipolamiide。
化合物2为白色无定型粉末，其核磁共振数据如下(图6、图7)：
1H NMR(CD3OD，400MHz，δ，ppm)：7.42(1H，d，J＝1.2Hz，H-3)，5.59(1H，d，J＝2.8Hz，H-1)，4.63(1H，d，J＝8.0Hz，H-1’)，4.07(1H，ddd，J1＝6.4Hz，J2＝6.0Hz，J3＝3.2Hz，H-6)，3.89(1H，dd，J1＝12Hz，J2＝2Hz，H-6’)，3.65(1H，dd，J1＝12Hz，J2＝6.0Hz，H-6’)，3.75(3H，s，Me-12)，3.36(1H，t，J＝8.8Hz，H-3’)，3.32(1H，m，H-5’)，3.26(1H，dd，J1＝8.8Hz，J2＝8.7Hz，H-4’)，3.17(1H，dd，J1＝8.8Hz，J2＝8.0Hz，H-2’)，2.64(1H，d，J＝2.4Hz，H-9)，1.27(1H，d，J＝2.4Hz，H-10)；
13C NMR(CD3OD，100MHz，δ，ppm)：93.4(C-1)，151.4(C-3)，110.0(C-4)，40.0(C-5)，73.2(C-6)，50.4(C-7)，77.6(C-8)，50.5(C-9)，23.3(C-10)，168.3(C-11)，50.5(C-12)，98.3(C-1’)，76.1(C-2’)，76.9(C-3’)，70.2(C-4’)，76.6(C-5’)，61.5(C-6’).
化合物2的1HNMR、13CNMR数据与Tayfun ERSOZ等发表的山栀苷甲酯(Shanzhisidemethyl ester)(Tayfun ERSOZ，Duygu KAYA，et.al，Iridoid Glucosides from Lamiumgarganicum subsp.laevigatum，Turk J Chem，2007，155-162)的数据一致，确定为山栀苷甲酯。
实施例78-O-乙酰山栀苷甲酯(3)的制备
将通过实施例5描述的制备方法得到的E5进行薄层色谱分析，使用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，以氯仿-甲醇(1∶1)作为流动相，共接收合并得到E5a-E5f 6个部分，通过步骤2采用的活性筛选方法进行活性测定其中E5c活性最佳，将E5c用HPLC(色谱柱：YMCODS-A，150×4.6mm，10μm)进行制备，甲醇-水(45∶55)进行洗脱，得到化合物3(20mg)。
化合物3的核磁共振数据如下(图8、图9)：
1H NMR(CD3OD，400MHz，δ，ppm)：7.46(1H，d，J＝1.6Hz，H-3)，5.93(1H，d，J＝2Hz，H-1)，4.66(1H，d，J＝8Hz，H-1’)，3.93(1H，dd，J1＝12.4Hz，J2＝3.2Hz，H-6’)，3.69(1H，dd，J1＝12Hz，J2＝6.4Hz，H-6’)，3.74(3H，s，COOCH3)，3.38(1H，t，J＝8.8Hz，H-3’)，3.32(1H，m，H-5’)，3.26(1H，dd，J1＝8.8Hz，J2＝8.6Hz，H-4’)，3.19(1H，dd，J1＝8.8Hz，J2＝7.9Hz，H-2’)，3.09(1H，dd，J1＝9.2Hz，J2＝1.6Hz，H-9)，3.02(1H，dd，J1＝8.8Hz，J2＝2.4Hz，H-5)，2.22(1H，ddd，J1＝14.8Hz，J2＝14.8Hz，J3＝5.4Hz，H-7)，2.06(1H，ddd，J1＝14.8Hz，J2＝14.8Hz，J3＝5.4Hz，H-7)，2.03(3H，s，OCOCH3)，1.53(3H，s，H-10)；
13C NMR(CD3OD，100MHz，δ，ppm)：94.3(C-1)，152.3(C-3)，108.4(C-4)，40.1(C-5)，76.6(C-6)，46.2(C-7)，88.4(C-8)，48.6(C-9)，20.8(C-10)，167.6(C-11)，171.7(OCOCH3)，20.8(OCOCH3)，98.9(C-1’)，61.6(C-6’)，78.1(C-5’)，76.6(C-4’)，74.6(C-3’)，73.3(C-2’)。
化合物3的1H NMR、13C NMR数据与Tayfun ERSOZ等发表的8-O-乙酰山栀苷甲酯(Shanzhiside methyl ester)(Tayfun ERSOZ，Duygu KAYA，et.al，Iridoid Glucosidesfrom Lamium garganicum subsp.laeVigatum，Turk JChem，2007，155-162)数据一致，确认为8-O-乙酰山栀苷甲酯。
实施例8环烯醚萜类化合物1-3对SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性测定
对环烯醚萜类化合物1-3进行对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性测定(图10)。进一步对这三个化合物的IC50值进行测量，测定方法如下：将溶剂挥发干的化合物用95％的DMSO溶解成50mg/mL的溶液。取10μl的上述溶液用95％的DMSO进行2倍的梯度稀释，共稀释成12个左右的样品溶液。用上述测定方法测试不同化合浓度下的酶活动力曲线，并计算其剩余活性，平行重复3次。将稀释的化合物浓度除以相应化合物的分子量并取以10为底的对数值作为X轴，对应的剩余活性值为y轴，用GraphPad Prism 5作图并计算出相应的IC50值，得到3个化合物的IC50值，其中化合物1的IC50值为138.8μM(图11)，化合物2的IC50值为104.1μM(图12)，化合物3的IC50值为125μM(图13)。
由IC50值可以看出，以活性筛选为导向从秦艽中分离出的化合物1～3对SARS冠状病毒主蛋白酶都有很好的抑制活性。化合物1～3均为典型的环烯醚萜类化合物，这说明环烯醚萜类化合物具有能够有效的抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的活性，这一类化合物有望作为抑制SARS冠状病毒的潜在药物分子。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.环烯醚萜类化合物在制备用于治疗或预防SARS的药物中的应用，其中，所述环烯醚萜类化合物是6β-hydroxyipolamiide、山栀苷甲酯或者8-O-乙酰山栀苷甲酯。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物是抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的药物。
3.秦艽提取物在制备用于治疗或预防SARS冠状病毒感染的药物中的应用，其特征在于：所述秦艽提取物含有有效量的如权利要求1所述的环烯醚萜类化合物中的一种或多种作为活性成分。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述秦艽提取物是秦艽的95％乙醇提取物。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述秦艽提取物是秦艽的95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物。
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