BR112019017128A2 - extratos de planta enriquecidos com derivados de ipolamida como imunossupressores para tratamento de transtornos imunológicos - Google Patents

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Abstract

a invenção descreve compostos isolados inovadores e inventivos e o pro-cesso de produção de compostos e extratos com atividade imunossupressora, a par-tir de plantas do gênero stachytarpheta. dessa forma, o presente pedido descreve também composições inovadoras e inventivas e seu uso para o tratamento de trans-tornos imunológicos. a presente invenção se encontra nos campos da farmácia, medicina e química.

Description

“EXTRATOS DE PLANTA ENRIQUECIDOS COM DERIVADOS DE IPOLAMIDA COMO IMUNOSSUPRESSORES PARA TRATAMENTO DE TRANSTORNOS IMUNOLÓGICOS”
Campo da Invenção [001] A invenção a seguir descreve compostos e extratos isolados inovadores e inventivos com atividade imunossupressora e um processo de produção de compostos a partir de ipolamida e extratos de plantas do gênero Stachytarpheta. Dessa forma, o presente pedido descreve também composições inovadoras e inventivas e seu uso para o tratamento de transtornos imunológicos. A presente invenção está nos campos de farmácia, medicina e química.
Antecedentes da Invenção
Transtornos Imunológicos [002] Os transtornos imunológicos podem ser considerados como qualquer desequilíbrio ou mau funcionamento do sistema imune. Esse sistema é responsável principalmente por assistir na defesa do corpo contra agentes externos e desconhecidos através de anticorpos que reconhecem e combatem antígenos prejudiciais.
[003] As doenças autoimunes são um exemplo de transtornos imunológicos nos quais o organismo começa a produzir anticorpos contra suas próprias moléculas, sem fazer distinção entre agentes endógenos e exógenos. Em tais casos, os medicamentos com atividade imunossupressora seriam exigidos altamente para ajudar pacientes a aliviar os sintomas causados por esse tipo de transtorno.
[004] As doenças autoimunes, exceto artrite reumatoide e tireoide autoimune, são individualmente raras, mas juntas afetam aproximadamente 5% da população dos países ocidentais. Sua etiologia não é entendida completamente. Em doenças
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2/33 específicas de órgão e autoimunes sistemáticas, observa-se uma perda da capacidade do sistema imune em distinguir o que é ou o que não é o eu. Essa habilidade, chamada de autotolerância, é mantida nas células B e T imunocompetentes tanto por mecanismos centrais quanto por mecanismos periféricos. A perda de autotolerância pode ter causas intrínsecas ou extrínsecas. Fatores ambientais, como infecções bacterianas e virais, exposição a agentes físicos e químicos, como UV, pesticidas e drogas são exemplos de causas extrínsecas. As causas intrínsecas, ou seja, em relação às características do próprio indivíduo, são associadas usualmente a polimorfismos de moléculas de histocompatibilidade, componentes de imunidade inata, como o sistema de complemento e receptores do tipo Toll, componentes de imunidade adquirida linfócitos e citocinas regulatórios, além de fatores hormonais que estão sob controle genético.
[005] A estratégia terapêutica em doenças autoimunes consiste principalmente em suprimir o sistema imunológico que usam imunossupressores, que atuam na inibição dos estágios iniciais de desenvolvimento de imunidade. Essa terapia não realiza uma imunossupressão seletiva, o que leva ao desenvolvimento de uma variedade de anticorpos. Os agentes biológicos podem ser empregados para inibir o efeito de citocinas, conforme ocorre com anticorpos monoclonais anticitocina ou o uso de receptores solúveis que se ligam à citocina e bloqueiam seus efeitos nas células-alvo. As citocinas são usadas também em terapia biológica através de proteínas recombinantes análogas que imitam o efeito da citocina original. Os principais alvos terapêuticos em terapia de anticitocinas são as citocinas próinflamatórias interleucina-1 (IL-1), TNFa e IL-6, a principal terapia agonista de citocina é realizada com o uso de interferons tipo I (IFN). Na família de interferon tipo I, proteínas recombinantes de IFNa e de ΙΕΝβ são usadas em prática clínica, principalmente para o tratamento de hepatite viral (vírus da hepatite B e C) e de esclerose múltipla respectivamente. Para o último, o mecanismo de ação proposto é
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3/33 o antagonismo que ο ΙΝΕβ exerce contra IFNy, que tem grande importância na fisiopatologia de esclerose múltipla. O IFNa foi usado também no tratamento de manifestações mucocutâneas, oculares e neurológicas da doença de Behçet e da síndrome de Churg-Strauss. O fontolizumab é um agente anti-IFNy humanizado, que foi avaliado em pacientes com anormalidades em células dendríticas com bons resultados.
[006] Os anticorpos monoclonais têm vantagens no tratamento de doenças autoimunes quando em comparação com terapias convencionais, pois são uma terapia direcionada com especificidade e alta seletividade. Entretanto, os mesmos são usados como uma segunda linha de tratamento quando não há eficácia no controle de doenças autoimunes com terapias convencionais. Além de restrições na eficácia, anticorpos monoclonais têm ainda várias limitações em relação ao custo e à acessibilidade. Várias doenças autoimunes ainda não têm tratamentos eficazes com boa tolerabilidade por pacientes.
[007] Os produtos naturais foram usados por séculos no tratamento de doenças diferentes. Recentemente, maiores esforços foram feitos no desenvolvimento da nova pesquisa de produtos fitoterápicos com efeitos imunossupressores. Por exemplo, vários testes clínicos realizados nos Estados Unidos já mostraram benefícios significativos de extrato de T. wilfordiiem pacientes com artrite reumatoide. Embora haja várias espécies e seus constituintes ativos com mecanismos de ação descritos, ainda há um campo vasto a ser explorado considerando investigações in vitro e in vivo e testes clínicos futuros em doenças com base imunológica. Esses produtos naturais devem ser formulados em composições farmacêuticas apropriadas a fim de assegurar a eficácia do tratamento de doenças autoimunes.
[008] Uma doença autoimune para a qual, até o momento, não há medicação eficaz, muito menos uma opção de medicação obtida a partir de extratos naturais, pode ser exemplificada por vitiligo. O vitiligo é associado comumente à perda de
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4/33 melanócitos funcionais e é considerado o transtorno de despigmentação mais comum em seres humanos, afetando pelo menos 0,5% da população mundial. É caracterizado pelo desenvolvimento de máculas brancas, resultantes da perda de melanócitos epidérmicos, que pode resultar em destruição celular através de uma resposta imune citotóxica específica aos melanócitos e em danos ao sistema de adesão dos mesmos.
[009] Múltiplos mecanismos foram associados ao vitiligo, como predisposição genética, ativações ambientais, anomalias metabólicas e alterações nas respostas imunes e inflamatórias. Além disso, as condições, como exposição à radiação ultravioleta e estresse oxidativo, são conhecidas por agravar essa condição.
[010] Devido à ausência de conhecimento específico sobre o aparecimento inicial da doença, vários estudos tentam elucidar os caminhos biológicos envolvidos nessa patogênese. A maioria desses caminhos indicam a complexidade e os desafios em relação a tal doença, sendo muito difícil encontrar um tratamento eficiente. Não se deve esquecer que a maioria dos transtornos imunológicos tem um impacto social importante, causando um alto nível de estresse psicológico para os pacientes. Até o momento, não há intervenção capaz de entrega da cura de vitiligo.
[011] Dessa forma, torna-se eminente a necessidade de identificar novos compostos capazes de promover a atividade imunossupressora com efeito a longo prazo. Assim, a presente invenção aborda essa lacuna no tratamento de transtornos imunológicos através de compostos inovadores que, quando isolados, demonstram atividade imunossupressora e de extratos ativos que compreendem grupos de compostos ativos, que são obtidos de uma maneira exclusiva e inventiva.
[012] Destacando a complexidade e a ausência de conhecimento científico sobre vitiligo, até o momento, acredita-se que a estrutura de ipolamida na sua forma intacta podería ser associada à atividade imunossupressora, relevante ao tratamento de pacientes com vitiligo. Entretanto, na presente invenção, é demonstrado que essa atividade resulta de derivados específicos de ipolamida e dos extratos que
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5/33 compreendem tais compostos, de preferência, obtidos pelos processos de produção únicos e inventivos descritos no presente documento. Tanto os compostos quanto os extratos apresentam atividade imunossupressora confirmada experimentalmente. Essa atividade é demonstrada no presente documento por bloqueio da ativação de células de CD8+ T e da redução de secreção de IFN-γ. Esse mecanismo foi mostrado para ser promissor para vitiligo tendo em vista as descobertas clínicas recentes em relação a quantificação desses componentes na pele de pacientes. Especificamente, altas concentrações de células de CD8+ T e de IFN-γ são ligadas à apoptose de melanócitos e, portanto, a modulação dessas células é um mecanismo de ação promissor.
[013] A partir do que pode ser deduzido da literatura pesquisada, nenhum documento foi encontrado que antecipa ou sugere os ensinamentos da presente invenção, de modo que a solução técnica proposta no presente documento tem atividade de novidade e inventiva tendo em vista o estado da técnica.
Sumário da invenção [014] A presente invenção descreve compostos derivados de ipolamida inovadores e inventivos, que têm atividade imunossupressora. Portanto, os mesmos podem ser usados para o tratamento de transtornos imunológicos. Adicionalmente, a presente invenção descreve extratos vegetais enriquecidos com os ditos compostos, derivados de ipolamida, obtidos através de um processo único de produção, que têm também atividade imunossupressora.
[015] É, portanto, um objeto da presente invenção os derivados de ipolamida que compreendem compostos da fórmula geral:
Figure BR112019017128A2_D0001
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6/33 [016] em que R corresponde a H, OH, OGlic (Glicosídeo); Ri, Rt, Rr correspondem a H, OH; R2 corresponde a H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3 corresponde a H, OH, CH3; R4, R4’ correspondem a H, OH, CH2OH, CH3; Rs, Rs’ correspondem a H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH; Re corresponde a CHO, COOH, COOCH3; R7 corresponde a H, CH3; Rs, Rs’, Rs” correspondem a CHO, CH3, CH2OH, COOH e as ligações tracejadas representam uma ligação simples (C-C) ou uma ligação dupla (C=C) entre carbonos (até duas ligações duplas por estrutura).
[017] Em uma modalidade preferencial, pelo menos um composto preferencial da presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo que compreende as estruturas a seguir:
Figure BR112019017128A2_D0002
[018] Nessa modalidade preferencial, 0 composto de fórmula geral (I) compreende os compostos de fórmula (IV), (V), (VIII) e (IX), 0 composto de fórmula geral (II) compreende 0 composto de fórmula (VII), (X) e (XI) e 0 composto de fórmula geral (III) compreende 0 composto de fórmula (VI).
[019] É também um objeto da presente invenção um método de tratamento de transtornos imunológicos, que compreende administrar a um paciente um composto de fórmula geral (I), (II) e/ou (III) em quantidade suficiente para fornecer efeito imunossupressor. Em uma modalidade preferencial, 0 método de tratamento é destinado ao tratamento de vitiligo.
[020] Assim, pode se considerar 0 uso de pelo menos um composto de fórmula geral (I), (II) e/ou (III) em uma composição para tratamento de transtornos imunológicos.
[021] Adicionalmente, é um objeto da presente invenção uma composição farmacêutica para 0 tratamento de transtornos imunológicos, que compreende pelo
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7/33 menos um composto selecionado entre os grupos que compreendem os compostos de fórmula geral:
Figure BR112019017128A2_D0003
Figure BR112019017128A2_D0004
e/ou corresponde a H, OH, OGIic (Glicosídeo); R1, Rt, Rr
R2 corresponde a H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3 [022] em que R correspondem a H, OH; corresponde a H, OH, CH3; R4, R4’ correspondem a H, OH, CH2OH, CH3; Rs, Rs’ correspondem a H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH; Re corresponde a CHO, COOH, COOCH3; R7 corresponde a H, CH3; Rs, Rs’, Rs” correspondem a CHO, CH3, CH2OH, COOH e as ligações tracejadas representam uma ligação simples (C-C) ou uma ligação dupla (C=C) entre carbonos (até duas ligações duplas por estrutura); e
d) veículo farmaceuticamente aceitável.
[023] Em uma modalidade opcional, a composição da presente invenção compreende adicionalmente 0 composto de ipolamida.
[024] Em uma modalidade opcional, a composição da presente invenção pode compreender adicionalmente pelo menos um dos compostos a seguir:
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8/33
Figure BR112019017128A2_D0005
(XII) (XIII) (XIV)
Figure BR112019017128A2_D0006
Figure BR112019017128A2_D0007
(XV) (XVI) [025] Adicionalmente, a presente invenção descreve o processo para produção dos compostos de fórmula geral (I), (II) e/ou (III), que compreende a etapa de submeter pelo menos um composto de ipolamida a pelo menos uma etapa de aquecimento a altas temperaturas, na presença de pelo menos um solvente adequado por um tempo suficiente para obter os compostos das fórmulas gerais (I), (II) e/ou (III).
[026] Em uma modalidade preferencial, as altas temperaturas da presente invenção compreendem temperaturas acima de 35 °C, com mais preferência entre 35 °C e 165 °C.
[027] Em uma modalidade preferencial, o processo de produção dos compostos de fórmula geral (I), (II), e/ou (III) compreende submeter pelo menos um composto de ipolamida a uma etapa de hidrólise e/ou solvólise. Até mesmo mais idealmente, pelo menos um composto de ipolamida é submetido a uma etapa de hidrólise ácida. Opcionalmente, pelo menos um composto de ipolamida é submetido a uma etapa de hidrólise alcalina/ básica.
[028] Conforme mencionado previamente, verifica-se que a ipolamida isolada não demonstra atividade imunossupressora. Por outro lado, certos grupos de compostos derivados de ipolamida têm tal atividade. Ao mesmo tempo, especificouse também as vantagens de obtenção de remédios fitoterápicos para o tratamento de doenças, uma vez que esses sistemas de produção de composto permitem uma série de interações produtivas entre os componentes da planta e dos compostos ativos,
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9/33 frequentemente até mesmo sinergicamente. Assim, para obter adicionalmente um remédio fitoterápico que compreende tais compostos ativos, desenvolveu-se um processo de produção único que permite obter um extrato enriquecido com compostos de interesse. Conforme descrito abaixo, o processo de produção de extrato da presente invenção compreende etapas únicas que levam a extratos enriquecidos com os derivados de ipolamida com atividade imunossupressora. Verificou-se a relevância de pré-selecionar biomassas vegetais de entrada contendo entre 2,5% e 3,5% de ipolamida, que resulta em um extrato enriquecido com ipolamida e compostos derivados de ipolamida de cerca de 1% a cerca de 20%, de preferência, de cerca de 8,5% a cerca de 11,5% de teor de ipolamida e derivados.
[029] Conforme apresentado previamente, a biomassa vegetal que contém esse composto será usada como material de partida para o processo de produção de extrato. Apenas com o processo de produção da presente invenção, é possível obter um extrato enriquecido com compostos derivados específicos de ipolamida. Esse extrato enriquecido apresente adicionalmente atividade imunossupressora.
[030] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção um processo para produção de extrato enriquecido com compostos derivados de ipolamida, que compreende essencialmente as etapas de:
a) selecionar biomassa vegetal de entrada com um teor de ipolamida entre 2,5% e 3,5% obtida a partir de plantas do gênero Stachytarpheta;
b) submeter a biomassa selecionada de a) a secagem em forno à temperatura entre 40 a 80 °C, até obter a estabilização de umidade entre 10 to 12%;
c) moer a biomassa vegetal;
d) realizar a extração da biomassa vegetal através das etapas de:
i. aquecer a biomassa vegetal a uma temperatura entre 70 a 100 °C com agitação constante;
ii. macerar a biomassa vegetal à temperatura ambiente;
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10/33 iii. aquecer a biomassa vegetal com temperatura entre 70 a 100 QC.
[031] Em uma modalidade preferencial, o processo para produção da presente invenção compreende adicionalmente as etapas de:
iv. filtrar e concentrar o extrato;
v. secar no secador por aspersão, durante 1 a 60 segundos, com temperatura de entrada entre 155 a 165 °C e temperatura de saída entre 85 a 95 °C, acoplado a um desumidificador.
[032] Em uma modalidade preferencial, o processo para extração da presente invenção é um processo aquoso ou hidroalcoólico, ainda com mais preferência um processo aquoso.
[033] Portanto, o processo para produção da presente invenção permite obter um extrato enriquecido padronizado com compostos derivados de ipolamida, de preferência, com um rendimento de cerca de 8% a cerca de 10%.
[034] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção o extrato enriquecido com compostos derivados de ipolamida obtido pelo procedimento mencionado acima. O extrato enriquecido padronizado com compostos derivados de ipolamida da presente invenção compreende, de preferência, os compostos de fórmula (I), (II) e/ou (III).
[035] A biomassa vegetal da presente invenção compreende todas as partes de plantas do gênero Stachytarpheta. De preferência, a biomassa vegetal compreende as partes aéreas das plantas, com mais preferência, as folhas.
[036] Em uma modalidade preferencial, a biomassa vegetal de entrada compreende pelo menos uma biomassa vegetal com teor uniforme de ipolamida entre 2,5% e 3,5%. Em uma modalidade opcional, a biomassa vegetal de entrada compreende mais que uma biomassa vegetal, em que as biomassas vegetais diferentes têm teores diferentes de ipolamida independentemente, mas juntas alcançam um teor uniforme de ipolamida (entre 2,5% e 3,5%).
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11/33 [037] Em uma outra modalidade preferencial, o teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada pode ser usado como um parâmetro para prever o teor teórico de ipolamida e derivados no extrato obtido. Essa previsão pode ser realizada por um método que compreende a etapa de aplicar a Equação I a alguns parâmetros obtidos experimentalmente para encontrar as proporções ideais de ipolamida na biomassa vegetal de entrada, que projeta, de preferência, o teor de ipolamida e derivados no extrato de 8,5% a 11,5% da Equação I é definido abaixo:
[038] % Teor teórico de ipolamida e derivados no extrato = % Teor real de ipolamida na biomassa vegetal x DER / (< teor real de ipolamida e derivados no extrato/teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada >) ± desvio padrão (Equação I).
[039] Dessa forma, é possível prever o teor teórico de ipolamida e derivados no extrato a partir do teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada. De preferência, a razão entre o teor real de ipolamida e derivados no extrato/o teor de ipolamida na biomassa vegetal de entrada é entre cerca de 3,0 e cerca de 3,5.
[040] Em uma modalidade ainda mais preferencial, as plantas da presente invenção compreendem Stachytarpheta cayennensis.
[041] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção o uso de extrato enriquecido padronizado com compostos derivados de ipolamida, obtido a partir de plantas do gênero Stachytarpheta para a fabricação de um medicamento com atividade imunossupressora.
[042] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção pelo menos uma fração ativa de extrato enriquecido com compostos derivados de ipolamida. De preferência, pelo menos uma fração compreende pelo menos um composto derivado de ipolamida de fórmula (I), (II) e/ou (III).
[043] Em uma modalidade opcional, a fração ativa de extrato enriquecido compreende adicionalmente ipolamida.
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12/33 [044] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção o uso de pelo menos uma fração enriquecida padronizada com compostos derivados de ipolamida, obtida a partir de plantas do gênero Stachytarpheta para a fabricação de um medicamento com atividade imunossupressora.
[045] Esses e outros objetos da invenção serão apreciados prontamente por aqueles elementos versados na técnica e pelas companhias que têm interesse no segmento, e serão descritos em detalhe suficiente para sua reprodução na descrição a seguir.
Descrição detalhada das figuras [046] A Figura 1 é um fluxograma de resumo que descreve o processo de produção do extrato enriquecido ativo com derivados de ipolamida obtido a partir de.
[047] A Figura 2 é o efeito do extrato aquoso de Stachytarpheta cayennensis (3, 10 e 30 μΜ, concentração expressada em ipolamida) e da ipolamida isolada (3, 10 e 30 μΜ) na proliferação de células de CD8+ T ativadas por produção (B) de aCD3/CD28 (A) e de ΙΕΝγ. O efeito do pool de compostos (IV a VIII) e dos cinco compostos isolados inovadores (IV a VIII) gerado após a hidrólise ácida de ipolamida (30 μΜ) foi avaliado também nos mesmos experimentos, proliferação de células de CD8+ T ativadas por produção (D) de aCD3/CD28 (C) e de ΙΕΝγ. O tacrolimus (0,5 μΜ) foi usado como o controle positivo para todos os experimentos. Os dados são o meio ± DV de três repetições.
[048] A Figura 3 é o efeito da hidrólise ácida de ipolamida na formação de seus derivados. O cromatograma de ipolamida intacta (azul); de Ipolamida hidrolisada em 0,1 N de HCI a 40 °C por 1 h (verde); de Ipolamida hidrolisada em 0,1 N de HCI a 40 °C por 2 h (vermelho); de Ipolamida hidrolisada em 0,1 N de HCI a 40 °C por 5 h (magenta). IPO = Ipolamida.
[049] A Figura 4 é o cromatograma do extrato de Stachytarpheta cayennensis obtido a partir do processo de produção reivindicado no presente documento. A figura
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13/33 ilustra o marcador de ipolamida e seus derivados específicos em tempos de retenção: 5,5; 9,7; 12,0; 14,3; 17,3 min. IPO = Ipolamida.
Descrição detalhada da invenção [050] Os exemplos mostrados no presente documento são apenas para o único propósito de exemplificar um dos vários caminhos de execução da invenção, entretanto, sem limitar o escopo da mesma.
Compostos ativos [051] A presente invenção apresenta grupos de compostos inovadores e inventivos, que compreende as fórmulas gerais a seguir:
Figure BR112019017128A2_D0008
(l) , (») , C) [052] em que R corresponde a H, OH, OGIic (Glicosídeo); Ri, Rt, Rr correspondem a H, OH; R2 corresponde a H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3 corresponde a H, OH, CH3; R4, R4’ correspondem a H, OH, CH2OH, CH3; Rs, Rs’ correspondem a H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH; Re corresponde a CHO, COOH, COOCH3; R7 corresponde a H, CH3; Rs, Rs’, Rs” correspondem a CHO, CH3, CH2OH, COOH e as ligações tracejadas representam uma ligação simples (C-C) ou uma ligação dupla (C=C) entre carbonos (até duas ligações duplas por estrutura).
Exemplo 1: Os compostos de fórmula geral (I) compreendem as estruturas a seguir.
Figure BR112019017128A2_D0009
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14/33
Exemplo 2: Os compostos de fórmula geral (II) compreendem as estruturas a seguir.
Figure BR112019017128A2_D0010
Figure BR112019017128A2_D0011
G
Exemplo 3: Os compostos de fórmula geral (III) compreendem as estruturas a seguir.
Figure BR112019017128A2_D0012
H [053] Aquelas estruturas mencionadas acima exemplificam constituições de estruturas químicas incluídas nas fórmulas (I), (II) ou (III).
Transtornos imunológicos [054] O termo transtornos imunes da presente invenção compreende qualquer disfunção do sistema imune. Comumente, os transtornos podem ser caracterizados pelos componentes do sistema imune que são afetados ou pelo nível de atividade do sistema imune. Na presente invenção, de preferência, os transtornos imunes se referem a doenças que têm alguma evidência de autoimunidade. Pode se considerar na presente invenção, o vitiligo como sendo até mesmo escolhido com mais preferência dentre os possíveis transtornos imunes.
Método de Tratamento de Transtornos Imunes [055] A presente invenção descreve um método de tratamento de transtornos imunes, que compreende administrar a um paciente um composto de fórmula geral (I), (II) e/ou (III) em quantidade suficiente para fornecer efeito imunossupressor. Deve ser observado que, para o propósito do presente pedido de patente, o tratamento de
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15/33 transtornos imunes pode ser alcançado com o uso de derivados de ipolamida e/ou frações e/ou extratos que contêm derivados de ipolamida, qualquer um desses que tem atividade imunossupressora. Em uma modalidade preferencial, o método de tratamento é destinado ao tratamento de vitiligo.
Composição farmacêutica que compreende compostos derivados isolados de ipolamida.
[056] Em uma modalidade, a composição farmacêutica da presente invenção compreende derivados de ipolamida isolada, usados sozinhos ou em combinação, para o tratamento de transtornos imunes, em que os compostos compreendem pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que compreende:
e/ou '8 [057] em que R corresponde a H, OH, OGIic (Glicosídeo); Ri, Rr, Rr correspondem a H, OH; R2 corresponde a H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3 corresponde a H, OH, CH3; R4, R+ correspondem a H, OH, CH2OH, CH3; Rs, Rs’ correspondem a H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH; Re corresponde a CHO, COOH, COOCH3; R7 corresponde a H, CH3; Rs, Rs’, Rs” correspondem a CHO, CH3, CH2OH,
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COOH e as ligações tracejadas representam uma ligação simples (C-C) ou uma ligação dupla (C=C) entre carbonos (até duas ligações duplas por estrutura); e
d) veículo farmaceuticamente aceitável.
[058] Em uma modalidade opcional, a composição farmacêutica acima compreende adicionalmente o composto de ipolamida.
[059] Em uma modalidade preferencial, a composição farmacêutica da presente invenção compreende os compostos:
Figure BR112019017128A2_D0013
(IV) (V) (VI) (VII) (VIII) (IX) (X) (XI) [060] Nessa modalidade preferencial, o composto de fórmula geral (I) compreende os compostos de fórmula (IV), (V),(VIII) e (IX), o composto de fórmula geral (II) compreende o composto de fórmula (VII), (X) e (XI) e o composto de fórmula geral (III) compreende o composto de fórmula (VI).
[061] A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender adicionalmente os compostos a seguir:
Figure BR112019017128A2_D0014
Figure BR112019017128A2_D0015
Figure BR112019017128A2_D0016
(XV) (XVI) (XII) (XIII) e veículo farmaceuticamente aceitável.
veículo farmaceuticamente aceitável [062] Para executar sua atividade, os compostos de fórmula geral (I), (II) e/ou (III) devem ser administrados a um organismo animal, a um mamífero, particularmente, a um ser humano, de preferência, sob forma de uma composição farmacêutica, isto é, associada a veículos farmaceuticamente aceitáveis que são
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17/33 adequados para cada rota de administração.
[063] A composições farmacêuticas da presente invenção contêm como ingrediente ativo um ou mais compostos propostos no presente documento, associados a um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. O ingrediente ativo é misturado, diluído ou encapsulado comumente com pelo menos um veículo.
[064] Quando o veículo é um diluente, o mesmo pode estar na forma sólida, semissólida ou líquida, atuando como um carreador, excipiente ou meio para o ingrediente ativo. Portanto, a composição pode estar sob forma de comprimidos, pílulas, pós, sachês, suspensões, emulsões, soluções, aerossóis (em meio sólido ou líquido), cremes, cápsulas duras ou moles, supositórios, soluções injetáveis.
[065] Na presente invenção, de preferência, é considerado como veículo farmaceuticamente adequado qualquer substância diferente do composto de fórmula geral (I), (II) ou (III), que foi adicionada intencionalmente ao mesmo para produzir uma forma de dosagem farmacêutica apropriada para uma rota de administração. Exemplos não limitantes de excipientes farmacêuticos adequados para a preparação de composições farmacêuticas são descritos em Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations - Vol 1 a 6 - 2004 - Sarfaraz K. Niazi - CRC Press e Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing.
[066] Exemplos não limitantes de rotas de administração da composição que compreende o composto de fórmula geral (I), (II) ou (III) são as rotas tópicas, orais, parenterais, nasais, retais, transmucosais, transdérmicas.
[067] A dose terapêutica a ser empregada dos compostos da presente invenção deve ser planejada e calculada de acordo com a rota de administração escolhida, a idade, o peso e a condição do paciente e a severidade do transtorno tratado. Em geral, os compostos da presente invenção são administrados em doses terapeuticamente eficazes. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas em resposta à dose, derivadas de modelos in vitro ou animais. Tipicamente, o
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18/33 médico administrará o composto até que uma dose apropriada alcance o efeito desejado.
Processo de Produção de Compostos Ativos [068] A presente invenção descreve em detalhe o processo de produção de compostos ativos de fórmula geral (I), (II) e/ou (III). Essencialmente, o processo de produção de compostos isolados compreende a etapa de submeter pelo menos um composto de ipolamida a pelo menos uma etapa de aquecimento a altas temperaturas, em solvente adequado, por um tempo suficiente para obter os compostos derivados de ipolamida da fórmula geral (I), (II) e/ou (III).
[069] Em uma modalidade opcional, a composição da presente invenção compreende adicionalmente o composto de ipolamida.
[070] Em uma modalidade preferencial, o solvente da presente invenção compreende água.
[071] Adicionalmente, a presente invenção descreve o processo de produção os compostos de fórmula geral (I), (II) e/ou (III), que compreende a etapa de submeter pelo menos um composto de ipolamida a uma etapa de aquecimento a altas temperaturas, em solvente adequado, por um tempo suficiente para obter os compostos derivados de ipolamida da fórmula geral (I), (II) e/ou (III).
[072] Em uma modalidade preferencial, as altas concentrações dos compostos de fórmula (I), (II) e/ou (III) da presente invenção são obtidas a partir da conversão total (100%) do teor de ipolamida usado no respectivo processo de produção.
[073] Até mesmo com mais preferência, as altas concentrações da presente invenção compreendem cerca de 0,5% a cerca de 45% de cada composto (IV a VIII) em uma mistura. Nesse caso, as concentrações compreendem cerca de 1 a cerca de 5% do composto IV, de preferência 4%; cerca de 15 a cerca de 25% do composto V, de preferência 19%; cerca de 1% a cerca de 6% do composto VI, de preferência 3%;
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19/33 cerca de 35% a cerca de 45% do composto VII ou seus isômeros (por exemplo, composto X ou composto XI), de preferência 37%; cerca de 0,5% a cerca de 4% do composto VIII ou seus isômeros (por exemplo, composto IX), de preferência 2%.
[074] Em uma modalidade preferencial, as altas temperaturas da presente invenção compreendem temperaturas acima de 35 °C, com mais preferência entre 35 °C e 165 °C.
[075] Em uma outra modalidade preferencial, o solvente da presente invenção compreende outros solventes adequados.
[076] Em uma modalidade preferencial, o processo de produção dos compostos ativos derivados de ipolamida compreendem a etapa de hidrólise ou solvólise de ipolamida.
[077] Até mesmo com mais preferência, a hidrólise de ipolamida pode ser do tipo ácido. Dentre os ácidos adequados para hidrólise ácida de ipolamida, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, nítrico, fosfórico e acético podem ser mencionados, sem quaisquer restrições específicas a qualquer um dos mesmos. Em uma modalidade preferencial, na presente invenção, ácido clorídrico é usado.
[078] Em uma modalidade opcional, a hidrólise de ipolamida pode ser do tipo básico/alcalina. Dentre essas bases adequadas para hidrólise básica/alcalina de ipolamida, os hidróxidos de metal alcalino podem ser mencionados, sem restrições específicas a qualquer uma das mesmas. Em uma modalidade preferencial, na presente invenção, hidróxido de sódio é usado.
[079] Em uma modalidade ainda mais preferencial, a hidrólise em meio ácido é seguida por uma hidrólise em meio básico/alcalino. Como um exemplo, pode ser mencionado o processo de produção que compreende uma etapa de submeter pelo menos um composto de ipolamida a altas temperaturas e 0,1 N (eq/L) de ácido clorídrico, seguida por incubação por intervalos de tempo diferentes que podem variar de 0 a 120 minutos. Então, a hidrólise é interrompida por um processo de
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20/33 neutralização com o uso de, de preferência, hidróxido de sódio 0,1 N.
[080] Em uma modalidade opcional, o processo de produção dos compostos de fórmula geral (I), (II) e/ou (III) compreende uma etapa de hidrólise de ipolamida em meio básico, que é executada com solução de hidróxido de sódio aquoso a 0,1 N, mantida a 40 °C por 2 horas.
Processo de produção de frações ativas/extratos enriquecidos com derivados de ipolamida [081] Foi verificado pelos inventores que certos compostos isolados ativos da presente invenção podem ser obtidos por técnicas de desenho e síntese moleculares. Ao mesmo tempo, foram especificadas também as vantagens de obter remédios fitoterápicos para o tratamento de doenças, uma vez que esses sistemas de produção de composto permitem uma série de interações produtivas entre os componentes da planta e os compostos ativos, frequentemente até mesmo sinergicamente. Assim, para obter adicionalmente um medicamento fitoterápico que compreende tais compostos ativos, foi desenvolvido um processo de produção único que permite obter um extrato enriquecido com compostos de interesse.
[082] Conforme descrito abaixo, o processo de produção de extrato da presente invenção compreende etapas únicas que levam a extratos enriquecidos com os derivados de ipolamida com atividade imunossupressora. Verificou-se que a relevância de pré-selecionar biomassas vegetais de entrada que contêm entre 2,5% e 3,5% de ipolamida, que resulta em um extrato enriquecido com ipolamida e compostos derivados de ipolamida de cerca de 8,5% a cerca de 11,5%. Conforme apresentado previamente, a biomassa vegetal contendo ipolamida será usada como material de partida para o processo de produção do extrato. Apenas com o processo de produção da presente invenção é possível obter um extrato enriquecido com compostos derivados específicos de ipolamida. Esse extrato enriquecido apresenta adicionalmente atividade imunossupressora.
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21/33 [083] Assim, a presente invenção fornece um processo para produzir extrato enriquecido padronizado com derivados de ipolamida a partir de plantas do gênero Stachytarpheta.
[084] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção um processo para produção de extrato enriquecido com compostos derivados de ipolamida, que compreende essencialmente as etapas de:
a) selecionar biomassa vegetal de entrada com um teor de ipolamida entre 2,5% e 3,5% obtida a partir de plantas do gênero Stachytarpheta;
b) submeter a biomassa selecionada de a) a secagem em forno à temperatura entre 40 a 80 °C, até obter a estabilização de umidade entre 10 a 12%;
c) moer a biomassa vegetal;
d) realizar a extração da biomassa vegetal através das etapas de:
i. aquecer a biomassa vegetal a uma temperatura entre 70 a 100 °C com agitação constante;
ii. macerar a biomassa vegetal à temperatura ambiente;
iii. aquecer a biomassa vegetal com temperatura entre 70 a 100 QC.
[085] Em uma modalidade preferencial, o processo para produção da presente invenção compreende adicionalmente as etapas de:
iv. filtrar e concentrar o extrato;
v. secar no secador por aspersão, durante 1 a 60 segundos, com temperatura de entrada entre 155 e 165 °C e temperatura de saída entre 85 a 95 °C, acoplado a um desumidificador.
[086] Em uma modalidade preferencial, o processo para extração da presente invenção é um processo aquoso ou hidroalcoólico ainda com mais preferência, um processo aquoso.
[087] Portanto, o processo para produção da presente invenção permite obter um extrato enriquecido padronizado com compostos derivados de ipolamida, de
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22/33 preferência, com um rendimento de cerca de 8% a cerca de 10%.
[088] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção o extrato enriquecido com compostos derivados de ipolamida obtido pelo procedimento mencionado acima. O extrato enriquecido padronizado com compostos derivados de ipolamida da presente invenção compreende, de preferência, os compostos de fórmula (I), (II) e/ou (III).
[089] A biomassa vegetal da presente invenção compreende todas as partes de plantas do gênero Stachytarpheta. De preferência, a biomassa vegetal compreende as partes aéreas das plantas, com mais preferência, as folhas.
[090] Em uma modalidade preferencial, a biomassa vegetal de entrada compreende pelo menos uma biomassa vegetal com teor uniforme de ipolamida entre 2,5% e 3,5%. Em uma modalidade opcional, a biomassa vegetal de entrada compreende mais de uma biomassa vegetal, em que as biomassas vegetais diferentes têm teores diferentes de ipolamida independentemente, mas juntas alcançam um teor uniforme de ipolamida (entre 2,5% e 3,5%).
[091] Em uma outra modalidade preferencial, o teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada pode ser usado como um parâmetro para prever o teor teórico de ipolamida e derivados no extrato obtido. Essa previsão pode ser realizada por um método que compreende a etapa de aplicar a Equação I a alguns parâmetros obtidos experimentalmente para encontrar as proporções ideais de ipolamida na biomassa vegetal de entrada, que projetam, de preferência, o teor de ipolamida e derivados no extrato de 8,5% a 11,5% da Equação I é definido abaixo:
[092] % Teor teórico de ipolamida e derivados no extrato = % Teor real de ipolamida na biomassa vegetal x DER/(< teor real de ipolamida e derivados no extrato/teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada >) ± desvio padrão (Equação I).
[093] Dessa forma, é possível prever o teor teórico de ipolamida e derivados
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23/33 no extrato a partir do teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada. De preferência, a razão entre o teor real de ipolamida e derivados no extrato/o teor de ipolamida na biomassa vegetal de entrada é entre cerca de 3,0 e cerca de 3,5.
[094] A presente invenção adicionalmente reivindica extratos enriquecidos padronizados com compostos derivados de ipolamida de plantas do gênero Stachytarpheta obtidos a partir do processo de produção descrito acima.
[095] Em uma modalidade ainda mais preferencial, as plantas da presente invenção compreendem Stachytarpheta cayennensis.
[096] Os extratos padronizados de plantas do gênero Stachytarpheta são, de preferência, obtidos pelo processo de produção descrito acima que resulta em um extrato enriquecido com ipolamida e compostos derivados de ipolamida de cerca de 1% a cerca de 20%, de preferência, de cerca de 8,5% a cerca de 11,5% de teor de ipolamida e derivados.
[097] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção o uso de extratos padronizados de plantas do gênero Stachytarpheta que contêm compostos derivados de ipolamida para a fabricação de um medicamento com atividade imunossupressora. Mais especificamente, extratos padronizados de plantas do gênero Stachytarpheta que contêm compostos derivados de ipolamida de fórmula geral (I), (II) e/ou (III) para a fabricação de um medicamento com atividade imunossupressora.
[098] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção pelo menos uma fração ativa de extrato enriquecido com compostos derivados de ipolamida. De preferência, pelo menos uma fração compreende pelo menos um composto derivado de ipolamida de fórmula (I), (II) e/ou (III).
[099] Em uma modalidade opcional, a fração ativa de extrato enriquecido compreende adicionalmente ipolamida.
[0100] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção o uso de pelo menos uma fração enriquecida padronizada com compostos derivados de ipolamida
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24/33 obtida a partir de plantas do gênero Stachytarpheta para a fabricação de medicamento com atividade imunossupressora.
Exemplos - Modalidade Preferencial [0101] Os exemplos descritos na parte experimental têm o único propósito de exemplificar um dos vários caminhos de executar a invenção, entretanto, sem limitar o escopo da mesma.
Processo de Produção e Identificação de Compostos Ativos [0102] Os compostos isolados da presente invenção são obtidos por submissão do composto de ipolamida a ácido clorídrico a 0,1 N, a 40 °C e 100 °C, por 1 h, 2 h e 5 h. A Figura 3 ilustra a condição a 40 °C. A partir desse experimento, podería ser observado vários produtos dessa hidrólise e, com base nos cromatogramas, identificar vários derivados de ipolamida, como, por exemplo, as estruturas descritas abaixo, conforme ilustrado na figura 3.
Figure BR112019017128A2_D0017
(IV) (V) (VI) (VII) (VIII) [0103] Alternativamente, a hidrólise pode ser executada por variação da concentração de ácido clorídrico entre 0,1 a 1 N e a temperatura experimental pode variar entre 35 °C e 165 °C. Além disso, o tempo de hidrólise pode variar entre 1 minuto e 24 horas para facilitar a formação de concentrações maiores de certos derivados de ipolamida.
Processo para obter o extrato [0104] De acordo com a presente invenção, o processo para obter extrato aquoso de Stachytarpheta cayennensis rico em derivados de ipolamida compreende principalmente as etapas de produzir um extrato padronizado ilustrado no fluxograma da Figura 1 para obter material para o desenvolvimento de pesquisa pré-clínica em
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25/33 imunologia.
[0105] Primeiramente, as sementes selecionadas, de preferência, por genotipagem de Stachytarpheta cayennensis foram submetidas a um processo de semeadura por dois meses em um ambiente controlado relativo à temperatura, umidade e luz. A semeadura foi executada em bandejas de poliestireno expandido, depositada com substrato, e mantida nesse ambiente protegido com irrigação controlada. As mudas começam a aparecer em 10 a 15 dias. As bandejas permanecem nessas condições até as mudas alcançarem o tamanho e condições ideais para transplantação permanente.
[0106] As mudas com um tamanho aproximado de 5 a 8 cm de altura e com 2 a 3 pares de folhas definitivas foram transplantadas para o local de crescimento, que, de preferência, teve uma temperatura média anual de 30QC, umidade relativa média anual de menos que 55%, e no qual o solo teve, de preferência, mas não se limitou a, os resultados de análise química e física específica, por exemplo, acidez, cálcio, nitrogênio e uso de fertilização orgânica em todas as áreas.
[0107] Após o plantio das mudas, a primeira colheita foi executada após 6 meses, e o outro recrescimento a cada 4 meses, garantindo, assim, um ciclo de vida otimizado do arbusto visando maximizar o teor de ipolamida na biomassa vegetal de entrada.
[0108] Após o plantio, a biomassa vegetal foi estabilizada através de um processo de secagem em forno, sob condições definidas de temperatura e umidade. As plantas foram secas com trocador de calor, circulação de ar forçada e temperatura que varia de 50 a 70 °C, de preferência, 60 °C. A secagem consistiu na passagem de ar quente através das plantas, removendo a umidade, até a biomassa vegetal ter sido estabilizada com umidade entre 10 a 12%. Em uma modalidade preferencial, o tempo de secagem ocorre de 8 a 20 horas.
[0109] Conforme mostrado na Figurai, a biomassa vegetal foi submetida ao
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26/33 processo de moagem por meio de um moinho de martelo com 1800 RPM e uma peneira de 19 mm, obtendo uma produtividade de 50 a 150 kg/hora a temperatura ambiente. Após a moagem, a biomassa vegetal foi submetida a uma extração aquosa a temperatura entre 80 a 90 °C com agitação constante por 15 min. A quantidade de solução extrativa usada deve ser 10x a quantidade de biomassa vegetal usada, garantindo extração exaustiva da substância de interesse na biomassa vegetal.
[0110] Após a etapa anterior, o material foi submetido ao processo de maceração por 10 h a temperatura ambiente. Posteriormente, o material foi aquecido novamente a 80 a 90 °C por 15 min.
[0111] O material foi filtrado em um filtro giratório com malha de poliéster de 40 um. Após a etapa de filtração, o material foi concentrado em um evaporador Bernauer e/ou evaporador de filme descendente até cerca de 30% de sólidos totais.
[0112] O produto dessa etapa foi submetido a secagem em secador por aspersão, com temperatura de entrada entre 155 a 165 °C e temperatura de saída entre 85 a 95 °C acoplado a um desumidificador, de preferência, do tipo Bry-Air, durante 20 a 40 segundos, visando obter o teor de umidade residual mais baixo possível (Tabela 1). Esse processo aprimora substancialmente a qualidade do extrato enriquecido, uma vez que a umidade residual no material compromete inicialmente a estabilidade dos componentes de interesse, durante a vida útil do extrato/derivado de vegetal. Esse processo extrativo resultou em uma razão de 10 a 12:1 e em um rendimento que varia entre 8 a 10%.
Tabela 1 - Teor de umidade no extrato após a secagem somente e após a secagem com umidificador
Teor de umidade no extrato após a secagem com DV Teor de umidade no extrato após a secagem com DV + desumidificador
4,61% 1,77%
[0113] O processo extrativo descrito acima garantiu a extração de ipolamida exaustiva para assegurar a atividade imunossupressora do extrato devido à presença de derivados de ipolamida gerados no processo. Portanto, foi necessário estabelecer
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27/33 controles de processo para a biomassa vegetal de entrada, de modo que o teor real de ipolamida e derivados no extrato seja entre 8,5 e 11,5%, conforme segue na Tabela
2. O controle de ipolamida na biomassa vegetal assegura a presença de derivados de ipolamida com atividade imunossupressora no extrato, gerados pelo processo descrito no presente documento.
Tabela 2 - Teor de ipolamida na biomassa vegetal e no extrato.
Teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada Teor teórico de ipolamida e derivados no extrato Teor real de ipolamida e derivados no extrato Seleção de biomassa vegetal de entrada
1,57% 5,23% (4,44 - 6,02) 4,47% Não selecionada
2,20% 7,33% (6,23 - 8,43) 7,62% Não selecionada
3,00% 10% (8,5 - 11,5) 10,80% Selecionada
3,30% 11% (9,35- 12,.65) 11,20% Selecionada
3,07% 10.2% (8,67- 11.73) 8,90% Selecionada
3.65% 12,2% (10,37-14,03) 12,40% Não selecionada
A concordância entre os teores teóricos e reais de ipolamida e seus derivados no extrato demonstra a aplicabilidade da Equação I.
[0114] Com isso, foi possível determinar um método para prever o teor teórico de ipolamida e seus derivados no extrato ativo enriquecido. Para esse propósito, foi usada uma equação para projetar o teor que seria obtido pelo processo de extração (teórico) a partir do teor real de ipolamida na biomassa vegetal (Equação I).
[0115] % Teor teórico de ipolamida e derivados no extrato = % Teor real de ipolamida na biomassa vegetal x DER / (< teor real de ipolamida e derivados no extrato/teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada >) ± desvio padrão (Equação I).
[0116] Na equação descrita acima, DER pode ser entendido como a quantidade de biomassa vegetal exigida para obter 1 quilo de extrato nativo. A razão
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28/33 entre o teor real de ipolamida e derivados no extrato/o teor de ipolamida na biomassa vegetal de entrada é, de preferência, entre cerca de 3,0 e cerca e 3,5.
[0117] Assim, de uma forma prospectiva, com o uso da equação acima, é possível selecionar apenas a biomassa vegetal (cujo teor de ipolamida é obtido por métodos analíticos, como HPLC) que projeta um teor teórico adequado de ipolamida e derivados no extrato entre 8,5 e 11,5% e descartar aquelas que não projetarão nessa range. De uma maneira inovadora e inventiva, foi verificado na presente invenção que a relação entre o teor real de ipolamida e derivados no extrato e o teor de ipolamida na biomassa vegetal de entrada será, de preferência, entre 3,0 e 3,5.
[0118] A análise de HPLC compreende as etapas de preparar soluções e padrões de amostra, e aluição da mesma, conforme a seguir:
1. Preparação de soluções
1.1 - Solução de ácido fórmico a 0,1% (fase móvel A): Em um recipiente volumétrico de 1000 ml que contém 800 ml de água ultrapura, foi adicionado 1 ml de ácido fórmico. O volume de recipiente foi preenchido com água ultrapura e bem homogeneizado.
1.2 - Solução diluente de ácido fórmico: metanol (1:1): Em um béquer, foram misturados 50 ml da solução de ácido fórmico a 0,1% com 50 ml de metanol.
2. Preparação de amostra:
[0119] Matéria-prima (Herbal): 1,0 g do herbário triturado foi pesado e transferido para um erlenmeyer âmbar de 250 ml ou se cobriu com folha de alumínio. 50 ml de água destilada foram adicionados e extraídos sob refluxo a 80 °C por 2 horas. A solução foi filtrada em papel em um recipiente volumétrico de 50 ml e preenchido com água destilada. A mesma foi filtrada através de membrana de 0,22 ou 0,45 pm para um frasco de HPLC.
3. Preparação de padrões:
[0120] Padrão de ipolamida 100ppm: 1,0 mg de padrão de ipolamida foi
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29/33 pesado e transferido para um recipiente volumétrico âmbar de 10mL. 5 ml do diluente foram adicionados, que foi deixado em um banho ultrassônico por 10 minutos ou até dissolução completa. Foi preenchido com o diluente e, então, houve a homogeneização. A análise de umidade por Karl Fischer foi realizada para o padrão de ipolamida.
4. Análise por HPLC:
4.1-PARÂMETROS/EQUIPAMENTO
- Coluna: Zorbax SB-C18 (250 mm x 4 mm; 5 um)
-Fase móvel: (A) Ácido fórmico a 0,1%;
(B) Metanol.
Tabela 3 - Gradiente de Eluição de Ipolamida
Tempo (min) (%) A (%) B
0 80 20
27 58 42
32 58 42
32,1 0 100
36 0 100
36,1 80 20
45 80 20
- Taxa de fluxo: 1,0 ml/min
- Detecção: 254 nm.
- Tempo de análise: 45 minutos
- Volume de injeção: 30 pL
4.2 - CÁLCULO DE TEOR DE IPOLAMIDA
Teor de ipolamida (%) = amostra A x padrão M x padrão P x amostra D x (100
- padrão U);
padrão A x amostra M x padrão D x 10000/100;
em que:
amostra A: Área de pico de ipolamida na amostra padrão M: Massa da ipolamida padrão em mg
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30/33 padrão P: Pureza do padrão em decimais amostra D: Diluição da amostra em ml padrão A: Área de pico de ipolamida no padrão amostra M: Massa da amostra usada em g padrão D: Diluição do padrão em I padrão U: Umidade do padrão quantificada por Karl Fischer
10000: Conversão de unidades [0121] O resultado do teor no extrato foi determinado em base seca, ou seja, a umidade foi descontada. Portanto, o cálculo para a massa do extrato foi:
Amostra M = Massa x (100 - amostra U)/100;
em que:
Massa = Massa de extrato seco (em gramas)
Amostra U = Umidade do extrato seco em porcentagem, de acordo com iT2052.
5. Análise por HPLC para derivados de ipolamida
5.1 - PARÂMETROS/EQUIPAMENTOS
- Coluna: Eclipse XDB Agilent - C18 (150 X 4.6 MM) 5 microns
- Fase móvel: (A) tampão de Ácido fórmico a 0,1%;
(B) Acetonitrila
Tabela 4 - Gradiente de Eluição de Derivados de polamida
tempo (min) (%) A (%) B
0 95 5
5,00 90 10
8,00 80 20
10,00 90 10
12,00 95 5
- Fluxo: 1.2 ml/min
- Detecção: DAD (205 a 280nm).
- Tempo de análise: 15 minutos
- Volume de injeção: 20 pL
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31/33
5.2 CÁLCULO DE TEOR PARA DERIVADOS DE IPOLAMIDA [0122] Para análise de um determinado derivado de ipolamida (Y), submeteuse o mesmo a uma solução com concentração definida. Essa concentração é correlacionada diretamente com a área observada no cromatograma. Essa área quando em comparação com a área total do cromatograma, multiplicada pela concentração previamente definida, determina o valor de porcentagem do dito derivado (Y) na amostra, conforme visto abaixo:
„ . ~ , ,, Área do derivado Y , . . . . .
Concentração de amostra X-------X 100 = % de teor do derivado Y
Area total (Σ teor de derivados = % de teor total de derivados de ipolamida na amostra.) Atividade biológica/imunossupressora [0123] A avaliação da atividade biológica in vitro do extrato aquoso de Stachytarpheta cayennensis assim como de ipolamida e seus derivados foi conduzida conforme descrito abaixo.
[0124] O extrato de Stachytarpheta cayennensis e de ipolamida e derivados foram estudados em um modelo imunológico experimental in vitro que envolve células de CD8+ T e de ΙΡΝγ. O objetivo desse estudo foi avaliar se o extrato e outras substâncias, isoladas e misturadas, atuam por bloqueio da ativação de células de CD8+ T e da secreção consequente de ΙΡΝγ.
[0125] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de voluntários saudáveis foram isoladas de camadas de leucócito por centrifugação de Ficoll-Hystopaque. Depois disso, células humanas de CD8+ T foram isoladas com o uso do kit de isolamento de célula de CD8+ T (Miltenyi Biotec, nQ 130-096-495). Essas células (3x105 células/poço) foram incubadas em RPMI + 10% de meio de FBS, ativadas com aCD3/CD28 (1 pg/ml) e tratadas com concentrações diferentes de extrato aquoso de Stachytarpheta cayennensis padronizada em 10% de ipolamida, ipolamida isolada, e derivados de ipolamida obtidas por hidrólise ácida para estudar seu efeito sobre a prevenção da ativação de célula de CD8+ T e sobre a secreção de
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32/33
ΙΕΝγ. Para a avaliação de proliferação de célula, bromodesoxiuridina (BrdU), um análogo da timidina usado comumente para ensaios de proliferação, foi usado como um marcador para a proliferação. Especificamente, foi avaliada a incorporação de BrdU através do sistema ELISA da Biotrak (GE Healthcare, RPN250) pelas instruções do fabricante. A metodologia para quantificação de interferon gama compreendeu o uso do kit Ready-SET-Go Human IFNy ELISA (eBiosciences 88-7316-88) e seguiu as instruções do fabricante. Conforme ilustrado no gráfico apresentado da Figura 2, o extrato aquoso de Stachytarpheta cayennensis enriquecida com derivados de ipolamida bloqueou a ativação de células de CD8+ T induzida por aCD3/CD28. A ipolamida isolada não teve nenhum efeito sobre a proliferação de células de CD8+ T induzida por aCD3/CD28, ou sobre a secreção de IFNy. Entretanto, os compostos derivados de ipolamida em uma mistura obtida por sua hidrólise ácida reduziram significativamente a proliferação de célula de CD8+ Tea secreção de IFNy. Os derivados de ipolamida isolada dessa mistura demonstraram também uma redução estatisticamente significativa de proliferação de célula de CD8+ T e da secreção de IFNy. Tacrolimo, um agente imunossupressor bem conhecido foi usado como um composto de referência e como um controle positivo para o experimento. O efeito obtido pelo tacrolimus foi similar àquele efeito obtido com ipolamida hidrolisada tanto na proliferação de célula quanto na produção de IFNy.
[0126] Assim, os resultados mostraram que a atividade imunossupressora deriva dos derivados de ipolamida e não da molécula intacta. É importante reforçar que os compostos obtidos pela condição experimental de hidrólise ácida de ipolamida isolada estão presentes no extrato aquoso de Stachytarpheta cayennensis, conforme mostrado na Figura4. Entretanto, a presença de tais compostos é devido ao processo de extração usado na presente invenção.
[0127] Aqueles elementos versados na técnica apreciará o conhecimento apresentado no presente documento e podem reproduzir a invenção nas modalidades
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33/33 e em outras modalidades, que estão dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (32)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Compostos CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendem a fórmula geral:
    Figure BR112019017128A2_C0001
    em que R corresponde a H, OH, OGIic (Glicosídeo); Ri, Rt, Rr correspondem a H, OH; R2 corresponde a H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3 corresponde a H, OH, CH3; R4, R4’ corresponde a H, OH, CH2OH, CH3; Rs, Rs’ corresponde a H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH; Re corresponde a CHO, COOH, COOCH3; R7 corresponde a H, CH3; Rs, Rs’, Rs” correspondem a CHO, CH3, CH2OH, COOH e as ligações tracejadas representam uma ligação simples (C-C) ou uma ligação dupla (C=C) entre carbonos (até duas ligações duplas por estrutura).
  2. 2. Compostos, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que têm atividade imunossupressora.
  3. 3. Método de tratamento de transtornos imunes CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de administrar a um paciente um composto de fórmula geral (I), (II) e/ou (III), em quantidade suficiente para fornecer efeito imunossupressor.
  4. 4. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é para 0 tratamento de pacientes com vitiligo.
  5. 5. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende compostos derivados de ipolamida para 0 tratamento de transtornos imunes, em que os compostos compreendem pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que compreende:
    Petição 870190079740, de 16/08/2019, pág. 41/61
    2/6
    Figure BR112019017128A2_C0002
    Figure BR112019017128A2_C0003
    ς e/ou em que R corresponde a H, OH, OGlic (Glicosídeo); Ri, Rr, Rr correspondem a H, OH; R2 corresponde a H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3 corresponde a H, OH, CH3; R4, Rr correspondem a H, OH, CH2OH, CH3; Rs, Rs’ correspondem a H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH; Re corresponde a CHO, COOH, COOCH3; R7 corresponde a H, CH3; Rs, Rs’, Rs” correspondem a CHO, CH3, CH2OH, COOH e as ligações tracejadas representam uma ligação simples (C-C) ou uma ligação dupla (C=C) entre carbonos (até duas ligações duplas por estrutura); e
    d) veículo farmaceuticamente aceitável.
  6. 6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende adicionalmente 0 composto de ipolamida.
  7. 7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende pelo menos um dos compostos a seguir:
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    3/6
    Figure BR112019017128A2_C0004
    (iv) (V) (vi) (vii) (viii) (ix) (X) (Xi)
  8. 8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5,
    CARACTERIZADA pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos um dos compostos a seguir:
    Figure BR112019017128A2_C0005
    (XII) (XIII)
    Figure BR112019017128A2_C0006
    (XV) (XIV)
    Figure BR112019017128A2_C0007
    (XVI)
  9. 9. Processo para produção de compostos ativos CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de submeter pelo menos um composto de ipolamida a uma etapa de aquecimento a altas temperaturas em um solvente adequado por um tempo suficiente para obter os derivados de ipolamida de fórmula (I), (II) e/ou (III).
  10. 10. Processo para produção, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que os compostos ativos compreendem a atividade imunossupressora.
  11. 11. Processo para produção, de acordo com a reivindicação 9,
    CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente é água.
  12. 12. Processo para produção, de acordo com a reivindicação 9,
    CARACTERIZADO pelo fato de que permite obter altas concentrações dos compostos de fórmula (I), (II) e/ou (III).
  13. 13. Processo para produção, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que as altas concentrações compreendem cerca de 0,5% a cerca de 45% dos compostos de fórmula (I), (II) e/ou (III) em uma mistura.
  14. 14. Processo para produção, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que as altas temperaturas compreendem
    Petição 870190079740, de 16/08/2019, pág. 43/61
    4/6 temperaturas acima de 35 °C.
  15. 15. Processo para produção, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que as altas temperaturas compreendem temperaturas entre 35 °C e 165 °C.
  16. 16. Processo para produção, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de hidrólise.
  17. 17. Processo para produção, de acordo com a reivindicação 17,
    CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma etapa de hidrólise ácida.
  18. 18. Processo para produção, de acordo com a reivindicação 17,
    CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma etapa de hidrólise básica.
  19. 19. Processo para produção de extrato enriquecido com compostos derivados de ipolamida CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:
    a) selecionar biomassa vegetal de entrada com um teor de ipolamida entre 2,5% e 3,5% obtida a partir de plantas do gênero Stachytarpheta;
    b) submeter a biomassa selecionada a partir de a) a secagem em forno à temperatura entre 40 a 80 °C, até obter a estabilização de umidade entre 10 a 12%;
    c) moer a biomassa vegetal;
    d) realizar a extração da biomassa vegetal através das etapas de:
    i. aquecer a biomassa vegetal a uma temperatura entre 70 a 100 °C com agitação constante;
    ii. macerar a biomassa vegetal à temperatura ambiente;
    iii. aquecer a biomassa vegetal com temperatura entre 70 a 100 QC.
  20. 20. Processo para produção de extrato, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente as etapas de:
    iv. filtrar e concentrar o extrato;
    v. secar no secador por aspersão, durante 1 a 60 segundos, com temperatura de entrada entre 155 e 165 °C e temperatura de saída entre 85 a 95 °C, acoplado a
    Petição 870190079740, de 16/08/2019, pág. 44/61
    5/6 um desumidificador.
  21. 21. Processo para produção de extrato, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o aquecimento de biomassa vegetal de d) ocorre por 5 a 30 minutos.
  22. 22. Processo para produção de extrato, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o aquecimento de biomassa vegetal de d) ocorre por 5 a 15 horas.
  23. 23. Processo para produção de extrato, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a biomassa vegetal de entrada compreende as partes aéreas das plantas do gênero Stachytarpheta.
  24. 24. Processo para produção de extrato, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta é Stachytarpheta cayennensis.
  25. 25. Processo para produção de extrato, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o processo possibilita um rendimento de extração de cerca de 8 a cerca de 10%.
  26. 26. Processo para produção do extrato, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o processo compreende uma extração aquosa.
  27. 27. Processo para produção de extrato, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o processo fornece um extrato que contém cerca de 1% a cerca de 20% de ipolamida e derivados.
  28. 28. Processo para produção de extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de prever o teor teórico de ipolamida e derivados no extrato a partir do teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada com o uso da Equação I:
    % Teor teórico de ipolamida e derivados no extrato = % Teor real de ipolamida na biomassa vegetal x DER / (< teor atual de ipolamida e derivados no extrato/teor real de ipolamida na biomassa vegetal de entrada >) ± desvio padrão (Equação I).
    Petição 870190079740, de 16/08/2019, pág. 45/61
    6/6
  29. 29. Extratos padronizados CARACTERIZADOS pelo fato de que os extratos são obtidos a partir das plantas do gênero Stachytarpheta e compreendem pelo menos um composto de fórmula geral (I), (II) e/ou (III).
  30. 30. Extratos enriquecidos com compostos derivados de ipolamida CARACTERIZADOS pelo fato de que são obtidos pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 28.
  31. 31. Frações de extrato padronizado enriquecido das plantas do gênero Stachytarpheta CARACTERIZADAS pelo fato de que compreendem pelo menos um composto de fórmula geral (I), (II) e/ou (III).
  32. 32. Uso de extrato e/ou frações padronizadas CARACTERIZADO pelo fato de que compreendem compostos derivados de ipolamida de fórmula geral (I), (II) e/ou (III) para a fabricação de um medicamento com atividade imunossupressora para o tratamento de transtornos imunológicos.
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