KR20180127538A - 상처 치유 조성물의 제조를 위한 방법, 튜브 및 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조직 재생 분야에 관한 것이다. 본 발명은 보다 특히, 단독으로 또는 세포 추출물과 병용된, 트롬빈, 혈소판 농축물 및 상처 치유 제제에 대한 신규의 방법, 튜브 및 장치, 세포 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

상처 치유 조성물의 제조를 위한 방법, 튜브 및 장치{PROCESS, TUBE AND DEVICE FOR THE PREPARATION OF WOUND HEALANT COMPOSITION}
본 발명은 조직 재생 분야에 관한 것이다. 본 발명은 보다 특히 트롬빈, 혈소판 농축물 및 상처 치유 제제에 대한 신규의 방법, 튜브 및 장치, 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
치유 과정에서 생물학적 자기 조직 물질의 중요성은 충분히 입증되어 왔다. 가장 중요하게는, 하기 2 개의 생물학적 자기 조직 물질이 혈전 구조의 형성에 직접 관련되는 것으로 입증되었으며, 상기 혈전은 지혈을 보장하고 상처를 봉합하는 역할을 갖는 지혈 차단층을 제공한다: (1) 혈장 피브리노겐을 트롬빈의 작용을 통해 2 개의 가닥으로 분리시키는 것으로부터 유도되는 피브린, 및 (2) 혈소판의 활성화된 막. 상기 상처 치유 과정을 일반적으로는 응고 단계, 염증 과정 및 재생 과정의 연속으로서 나타낸다. 상기 응고 단계(혈액 응고 또는 혈전 형성)는 복잡한 과정이며 이에 의해, 손상된 혈관 벽이 피브린 덩어리로 덮여 출혈이 멈추고 혈소판 알파 과립으로부터 다량의 사이토킨 및 성장 인자의 방출에 의해 상기 손상된 혈관의 수복이 개시된다. 혈전(다른 혈액 성분들 중에서도 피브린, 혈소판 및 적혈구에 의해 생리학적 조건 중에서 형성됨)의 형성은 조직 외상으로부터 생성되는 자연적인 현상이며, 상기 상처 치유 과정뿐만 아니라 골절의 결합에 있어서 그의 역할은 널리 공지되어 있다.
혈액 응고는 캐스케이드를 통한 다수의 단백질 응고 인자의 복잡한 상호작용의 결과이다. 일반적으로, 혈관 내피에 대한 손상은 내피-하 구조를 노출시키고, 상기 구조는 혈소판을 끌어당겨 가역적인 응집을 유도한다. 상기 응고 경로의 활성화 도중 형성된 단백질인 트롬빈은 피브린 단백질의 불용성의 가교결합된 피브릴을 생성시키고 상기 혈소판을 비가역적으로 응집되게 한다. 상기 생성되는 혈소판-피브린 덩어리는 혈액이 혈관계로부터 상실되는 것에 대한 유효 차단층이며 또한 상기 혈관 내층의 후속 수복을 위한 골격으로서 작용한다.
혈전의 형성에 따른 염증 과정은 백혈구 및 혈소판에 의해 방출되는 다수의 혈관활성 매개체 및 화학주성 인자(단백질의 형성에 특이적인 신호)에 의해 자극된다. 상기 신호는 상기 부위를 새로운 세포의 이동에 앞서 세균 및 외래 입자뿐만 아니라 적혈구로부터 "청소하는" 대식세포를 끌어당긴다. 상기 조직 재생 단계는 혈전에 의해 형성된 골격(또는 성장 기질)에서 분화되지 않은 세포의 화학활성화(chemoattraction) 및 유사분열을 수반한다. 혈소판 성장 인자의 자극 하에서 배가되는 새로운 세포들은 대식세포에 의해 모인 손상되거나 파괴된 세포를 대체할 것이다. 성장 인자, 및 혈전 내 세포 이동 및 분열을 촉진하는 다수의 혈장 단백질들(또한 신호전달 분자라 칭한다)은 상처 치유 과정에서 중대한 역할을 한다.
바이오접착성 봉합제(sealant) 및 피브린 접착제는 최종 혈액 응고 단계의 생물학적 과정을 복제하는 비교적 새로운 기술적 진보를 나타낸다. 임상 보고서는 심혈관, 가슴, 이식, 두경부, 구강, 위장, 정형외과, 신경수술, 및 성형수술과 같은 다양한 수술 분야에서 피브린 접착제의 유용성을 입증한다. 수술 시, 상기 피브린 접착제를 포함하는 2 개의 주요 성분인 피브리노겐 및 트롬빈은 함께 혼합되어 혈전을 형성한다. 상기 혈전은 수 초 내에 필수적인 조직, 뼈 또는 신경에 들러붙지만, 피브린용해에 의해 대략 10일 안에 신체에 의해 서서히 재흡수된다. 피브린 접착제의 중요한 특징은 (1) 특히 봉합사로 접근하기 어렵거나 또는 봉합사 배치가 과도하게 어려운 구역의 혈관 문합 시 지혈을 성취할 수 있고; (2) 봉합만으로는 억제할 수 없는 동맥 파열 또는 바늘 구멍으로부터의 출혈을 억제할 수 있고; (3) 헤파린 치료된 환자 또는 응고장애 환자에게서 지혈을 획득할 수 있는 상기 접착제의 능력이다. 문헌[Borst, H. G., et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 84:548-553 (1982)]; [Walterbusch, G. J, et al., Thorac Cardiovasc. Surg., 30:234-235 (1982)]; 및 [Wolner, F. J, et al., Thorac. Cardiovasc. Surg., 30:236-237 (1982)]을 참조하시오.
이론적으로는, 적혈구를 버리고 성장 인자의 농도를 증가시킴으로써 상기 상처-치유 캐스케이드에서의 상기 첫 번째 단계의 효과를 증폭시키는 것이 가능하다.
혈액 응고 증폭을 "농축된 혈전(EC)"의 형성으로서 정의할 수 있다. EC는 혈소판 농축물의 사용을 통해 획득되며 문헌[Platelets and Megacaryocytes 2004, vol 1 & 2, as "Structure and signals", Ed. Gibbins and Mahaut-Smith, Humana Press, New Jersey]에 개시되었다. 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 작은 부피의 혈장 중의 혈소판의 자기조직 농축물로서 정의할 수 있으며; 이는 자기조직 생물물질로서 개발되었고 조직의 치유 및 재생에 유용한 것으로 입증되었다(문헌[Marx et al, 2004, J. Oral Maxillofac. Surg., 62, 489-496]). PRP는 혈소판 농축물일 뿐만 아니라 혈소판에 의해 능동적으로 분비되는 성장 인자들(예를 들어 혈소판 유래된 성장 인자: PDGF, 혈관 내피 성장 인자: VEGF, 형질전환 성장 인자: TGF 및 표피 성장 인자: EGF 등)을 함유하고 상처 치유 개시 과정에서 기본적인 역할을 하는 것으로 공지되어 있다.
예를 들어, PDGF는 뼈 재생 및 수복을 포함한, 결합 조직 치유를 개시하는 것으로 공지되어 있다. PDGF는 또한 세포분열 촉진(세포 치유), 혈관형성(기능성 모세관으로의 내피 유사분열) 및 대식세포 활성화를 증가시킨다. 백혈구에 의해 방출된 VEGF는 또한 내피 세포 상에서 효능 있는 혈관형성, 유사분열 및 혈관 침투성-촉진 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. TGF-[베타]는 결합 조직 및 뼈의 세포 유사분열 및 분화를 촉진하고, 중간엽 줄기세포, 전조골세포 및 섬유아세포 상에서 작용하고, 파골세포 형성을 억제한다. EGF는 상피 발생을 유도하고 혈관형성을 촉진하는 것으로 공지되어 있다. 혈소판 농축물은 일반적으로는, 현저하게는 미국에서 치아 이식 및 뼈 수술에 사용된다. 원심분리 방법에 의한 PRP의 다양한 제조 기법들이 개발되었다. 그러나, 혈소판 세포의 민감성 및 상기 혈소판의 적혈구로부터의 분리 방법의 효율성의 가변성으로 인해, 혈소판 농축물의 제조에 사용되는 방법들 사이에는 큰 가변성이 존재한다. 바이오멧(Biomet) PCCS & GPS(상기 문헌[Marx et al, 2004])로부터의 자동화된 설비는 큰 혈액 샘플 처리의 경우 엄청나게 비싼 비용과 함께 복잡한 공정이라는 결점을 나타낸다. 상기 시스템에서, 환자들로부터 귀중한 생물학적 조직의 중대한 손실이 또한 존재하며, 따라서 고 수율로, 사용하기 용이하고 비용 효과적인, 신뢰성 있는 혈장 세포의 수집 방법을 개발할 필요가 있다.
또한, 혈소판 농축물의 획득은 비교적 복잡한 키트와 비용적으로 헌신적인 기계 및 동시에 비용적으로 어려운 전문 기술인의 사용을 여전히 필요로 한다. 이러한 결점은 현행의 공지된 PRP 제조 방법을 현장 사용에 적합하지 않게 한다.
더욱이, 이식, 수술 후 재생에 사용하거나 또는 심미적인 목적을 위한 세포 또는 조직 재생에 비추어 세포 제제는 세포 및 조직의 장기적인 보존 문제에 직면한다. 조직 또는 세포, 특히 혈소판의 장기적인 유지에 조직 및 세포 저온저장이 일반적으로 사용되지만, 상기 기법은 심각한 결점과 문제, 예를 들어 결정 형성, 삼투 문제, 응집, 단백질 합성 능력의 억제, 열 스트레스에 대한 스트레스 단백질 발현을 나타내었다. 따라서, 조직 또는 세포 저온 저장은 세포 생육력 및 안정성을 변경시키는 것으로 공지되어 있다(문헌[Agence francaise de seurite sanitaire, 2003]; [Arnaud et al., 1999, Cryobiology, 38, 192-199]; [Tablin et al., 2001, Cryobiology, 43(2), 114-23]). 상기 저온 저장 부작용들 중 일부는 동결 방지제, 예를 들어 DMSO 또는 글리세롤 또는 다른 저온보존제의 사용에 의해 제한될 수도 있지만(미국 특허 제 5,5891,617 호, Oh et al., Cornea, 26, 840-846) 상기 작용제의 농축물은 그의 독성 및 부작용을 제한하기에 적합해야 한다.
따라서, 특히 성장 인자 분비 능력 및 생육력에 관하여 본래의 능력을 보존하면서 즉석에서 사용하기에 적합한 세포 및 조직의 신규 또는 대안적인 제조 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 조직 재생 분야에 관한 것이다. 본 발명은 보다 특히 트롬빈, 혈소판 농축물 및 상처 치유 제제에 대한 신규의 방법, 튜브 및 장치, 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규의 세포 제형, 신규의 혈소판-풍부 혈장(PRP) 제제, 신규의 세포 제형 또는 PRP 제형의 제조 방법, 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수 세포, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 지방 조직, 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포 또는 아킬레스 건 세포의 자기조직 추출물과 임의로 혼합된, 상기와 같은 세포 또는 PRP 제제의 용도에 관한 것이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 완전한 자기조직 및 즉석 상처 치유 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 자기조직 상처 치유 또는 조직 치유 조성물에 대한 모든 혈액 성분들은 상기 자기조직 상처 치유 또는 조직 치유 조성물이 적용될 단일 환자(동일한 환자)로부터 유래한다.
하나의 태양에서, 본 발명은
a) 요변성(thixotropic) 젤을 함유하는 튜브 중에 전혈을 수집하고,
b) 트롬빈 혈청이 유리될 때까지 상기 튜브를 원심분리하고,
c) 상기 트롬빈 혈청을 수집하는
단계들을 포함하는, 트롬빈 혈청의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 바람직하게는 히아루론산, 요변성 젤 및/또는 응고 방지제, 바람직하게는 나트륨 시트레이트를 함유하는 튜브 중에 전혈을 수집하고,
b) 상기 튜브를, 바람직하게는 상기 요변성 젤 아래에 적혈구가 이동하고 바람직하게는 상기 농축된 혈장 위에 히아루론산이 이동할 때까지 원심분리하고,
c) 상기 히아루론산 및 농축된 혈장을, 바람직하게는 상기 튜브를 뒤집음으로써 임의로 혼합하고,
d) 상기 히아루론산 및 농축된 혈장을 함유하는 상등액을 수집하는
단계들을 포함하는, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
i) 크기 및 직경이 상이한 2 개의 별도의 부분,
ii) 상기 두 부분을 분리시키는 필터, 및
iii) 임의로 요변성 젤 및 응고 방지제
를 포함하는 유체 샘플을 수집하고 분리시키기 위한 튜브를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 튜브는 도 1 내지 14에 예시된 바와 같은 특징들로 이루어진다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 혈액 성분의 수집, 보관, 사용 및 전달에 유용한 여러 개의 주머니 또는 튜브를 포함하는 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브에 관한 것이다.
바람직한 태양에서, 본 발명은 도 15에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 2 개 이상의 주머니 또는 튜브에 연결된 연결기 도관으로 다수의 도관 연결기에 연결된 단일 유입 도관을 포함하는 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브를 제공하며, 여기에서 상기 다수의 도관 연결기의 각각의 연결기 도관은 하나의 단일 주머니 또는 튜브에 연결된다.
상기 채혈 튜브는 바람직하게는 공기가 배출되고, 밀폐되며 요변성 젤 및 응고 방지제로 충전된다.
본 발명에 포함되고 명세서의 일부를 형성하는 첨부 도면은 본 발명의 바람직한 실시태양을 예시하며, 묘사와 함께 본 발명의 원리를 설명하고자 한다.
도 1A 및 1B는 본 발명에 따른 튜브의 도식적인 표현이다.
도 2 및 3은 본 발명에 따른 튜브의 내부의 도식적인 표현이다.
도 4는 본 발명에 따른 튜브의 필터의 내부의 도식적인 표현이다. 상기 필터는 깔때기가 있는 내부 층과 사다리꼴 모양 구조를 갖는 외부 층을 포함한다.
도 5a는 본 발명에 따른 튜브의 내부의 도식적인 표현이다.
도 5b는 뚜껑과 튜브 접점의 도식적인 표현이다.
도 6은 뚜껑의 도식적인 표현이다.
도 7A 및 7B는 본 발명에 따른 튜브의 필터의 2 개의 다른 시선을 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 튜브의 필터의 바닥면도를 나타낸다. 도 8은 또한 본 발명에 따른 외부 층 또는 하부 층의 3 개 열의 구멍들의 4 개의 대칭적인 세트를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 튜브의 필터의 상면도를 나타낸다. 도 9는 또한 본 발명에 따른 내부 층 또는 상부 층의 2 개 열의 구멍들의 4 개의 대칭적인 세트를 나타낸다.
도 10 및 11은 본 발명에 따른 튜브의 필터의 상세도를 나타낸다.
도 12는 본 발명에 따른 튜브의 필터의 중심 부분의 상세도를 나타낸다.
도 13은 본 발명에 따른 튜브의 필터의 내부의 상세한 표현이다. 상기 필터는 깔때기가 있는 내부 층과 사다리꼴 모양 구조를 갖는 외부 층을 포함한다. 각각의 깔때기와 사다리꼴은 교번 방식으로 필터에 통합된다(첫 번째 사다리꼴에 이어서 첫 번째 깔대기가 있고, 이어서 두 번째 사다리꼴이 있고, 이어서 두 번째 깔때기가 있으며 세 번째 사다리꼴에 의해 끝난다).
도 14는 본 발명에 따른 튜브의 깔때기 및 사다리꼴을 포함하는 필터의 상세도이다.
도 15는 본 발명의 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브의 도면이다.
도 16은 PRP 및 히아루론산을 포함하는 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법에 대한 도식적인 표현이다.
하기 단락은 본 발명에 따른 용어들의 정의를 제공하며 이를, 달리 명백히 정의를 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구의 범위 전체에 걸쳐 균일하게 적용하고자 한다.
"요변성"이란 표현은 교반 또는 가압의 결과로서 보다 유동성으로 되는 젤, 즉 교반 또는 가압의 결과로서 점도가 감소하는 젤을 의미한다. 점도란 용어는 명시된 물질(들)의 젤화 정도, 예를 들어 상기 물질이 유체와 같은 흐름에 저항하는 정도인, 상기 물질의 경도 또는 견고성을 결정하는 상기 물질의 특성을 지칭한다. 본 발명에 따른 요변성 젤은 수 불용성이고 본 발명에 따라 사용될 수 있는 혈액 구성성분들에 대해 화학적으로 불활성인 폴리에스터 젤 또는 그의 혼합물을 포함한다. 전형적인 요변성 젤을 진단 및 프로테오믹스를 위한 혈구 분리에 사용한다. 요변성 젤을 또한 본 발명에서는 "세포 선택자 젤"이라 지칭한다. 다른 젤들을 본 발명에 사용할 수도 있다.
"현장용"이란 표현은 임상 환자에게 제공되는 모든 서비스를 의미한다.
"사혈 부속물" 또는 "정맥 천자 부속물"이란 표현은 혈액을 채혈할 목적으로 바늘로 정맥을 찌를 수 있게 하는 부속물을 의미한다.
"상처 치유제" 또는 "상처 봉합제" 또는 "조직 치유제" 또는 "조직 봉합제" 또는 "상처 치유 조성물" 또는 "조직 치유 조성물"에 대한 대안적인 표현들은 "바이오접착성 봉합제" 또는 "피브린 접착제"이다.
"상처 치유제" 또는 "상처 봉합제" 또는 "조직 치유제" 또는 "조직 봉합제" 또는 "상처 치유 조성물" 또는 "조직 치유 조성물" 또는 "바이오접착성 밀폐제" 또는 "피브린 접착제"란 표현은 상처의 아물기의 속도 및/또는 질을 촉진 및/또는 증가시킬 수 있는 작용제 또는 조성물을 의미한다. "상처"란 표현은 예를 들어 외상 또는 수술에 따른 임의의 손상된 조직을 의미한다. 포유동물에 있어서 상처는 예를 들어 욕창, 궤양, 열상 및 화상, 이식 부위(이식 공여 및 수용 부위), 누공, 치주 조직 손상, 당뇨성 비-치유성 상처, 외상 또는 임의의 수술 행위의 결과들을 포함한다. 상기 표현은 그의 일반적인 의미로 피부 표면이 약간의 함몰, 꼭 그런 것은 아니지만, 그 표면상의 절단, 예를 들어 연령 관련된 조직 손상(예를 들어 주름) 및 흉터, 예를 들어 여드름(특히 박피 치료 후) 또는 풍진 흉터를 나타내는 피부 손상을 또한 포함함을 의미한다. "PRP"란 표현은 적혈구를 펠릿화 및 제거하고 고유 전혈에 비해 혈장에 백혈구, 혈소판 및 부착 단백질을 농축시키기 위해 본 발명의 방법에 의해 제조된, 바람직하게는 포유동물 기원 또는 인간 기원의, 보다 바람직하게는 자기조직의 혈소판 풍부 혈장을 의미한다. "자기조직" 또는 "자생적" 또는 "내생적"이란 표현은 단일 공여자의 혈액, 조직 및/또는 세포를 사용하고 상기 공여자로부터 추출한 혈액, 조직 및/또는 세포를 동일한 공여자에 대해 사용하고자 하는 생체 내 방법을 의미한다. 상반되게, "동종이계" 방법은 공여자("상동" 또는 "비상동")에 대해 사용하기 위해 하나 이상의 제 3 자로부터의 혈액, 조직 및/또는 세포를 사용한다. 자기조직 생성물은 제 3 자로부터의 생물학적 물질의 사용과 관련된 통상적인 문제들 중 일부를 하지 않게 한다, 예를 들어 공여자가 환자와 생물학적으로 또는 면역학적으로 적합한지를 확인하고 간염, HIV, 프리온, 광우병 등에 의한 잠재적인 오염을 선별하는 것을 하지 않게 한다. "응고 활성제"란 표현은 혈장의 응고 및 혈소판 응집을 촉발하거나 활성화할 수 있는 작용제, 예를 들어 효소를 의미한다. 응고 활성제는 트롬빈 활성제 및/또는 피브리노겐 활성제 및/또는 트롬빈 및/또는 자기조직 트롬빈 및/또는 자기조직 트롬빈 혈청 및/또는 염화 칼슘 및/또는 칼슘 글루코네이트를 포함한다. 조성물의 경도를 변화시키기 위해서 응고를 병행할 수도 있다.
"트롬빈 활성제"란 표현은 트롬빈을 활성화하고 응고를 촉발할 수 있는 작용제를 의미한다. 전형적인 트롬빈 활성제는 몇몇 보조인자, 예를 들어 나트륨 또는 칼슘이다. 본 발명의 실시에서, 트롬빈 활성화는 바람직하게는 칼슘 이온의 존재 하에서 발생한다. 칼슘 이온을 일반적으로는 염 용액으로서 혈소판 농축물에 첨가하여 최종 농도, 일반적으로는 약 0.1 ㎎/㎖의 혈소판 농축물을 제공한다. 적합한 칼슘염은 비제한적으로 CaCO3, CaSO4 또는 CaCl2를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 칼슘염은 칼슘 글루코네이트(CaGL)이다. CaGL을 칼슘 젤 주사, USP 10%(레젠 랩(Regen Lab), 스위스 소재)로서 입수할 수 있다. "피브리노겐 활성제"란 표현은 피브리노겐의 피브린으로의 전환을 활성화하고 혈전의 형성을 촉발할 수 있는 작용제를 의미한다. 전형적인 피브리노겐 활성제는 트롬빈 또는 바트록소빈이다. 트롬빈이란 용어는 10%의 칼슘 글루코네이트 수용액 1 ㎖당 약 100 내지 약 10 단위의 트롬빈의 석회화된 트롬빈을 포함할 수 있으며; 석회화된 소 트롬빈, 동종이계 트롬빈 또는 재조합 인간 트롬빈, 바람직하게는 자기조직 트롬빈을 포함할 수도 있다. 피브리노겐 활성제는 농축된 트롬빈 조성물, 예를 들어 US 6,472,162에 개시된 바와 같은 트롬빈 조성물 또는 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈 혈청일 수 있다. "치료 유효량"이란 표현은 상처 치유, 예를 들어 상처의 부피 또는 표면적의 감소, 육아 조직, 또는 콜라겐 저장, 혈관 성장, 섬유아세포 증식 또는 전반적인 치유를 촉진하는 다른 생물학적 물질의 양의 증가를 향상시키기에 필요한 구성성분 요소 또는 이들의 조합의 양을 의미하며; 본 원에 개시된 본 발명의 버전들은 모두 치료 유효량의 구성성분 물질 또는 이들의 조합을 갖는 것으로 가정된다. "약학적으로 허용 가능한 담체"란 표현은 약학적으로 허용 가능한 추가적인 성분, 예를 들어 안정제, 항균제, 완충제, 보조제, 마취제, 코르티코스테로이드 등을 의미한다. "화장품학적으로 허용 가능한 담체"란 표현은 화장품학적으로 허용 가능한 추가적인 성분, 예를 들어 안정제, 완충제, 착색제, 풍미제, 보조제 등을 의미한다.
"환상 올레핀 공중합체"(COC) 또는 "환상 올레핀 중합체"(COP)란 표현은 비결정성 중합체, 에틸렌 공중합체; COC; COP; 사이클로 올레핀공중합체; 환상 올레핀 중합체; 에틸렌-노르보넨 공중합체를 의미한다. COP는 단일 유형의 단량체를 사용하는 반면 COC는 상이한 유형의 단량체를 사용한다. 본 발명은 상이한 유형의 환상 단량체를 기본으로 하는 환상 올레핀 공중합체 및 중합 방법을 포함한다. 본 발명의 환상 올레핀 공중합체 또는 중합체를, 환상 단량체, 예를 들어 8,9,10-트라이노르본-2-엔(노르보넨) 또는 1,2,3,4,4a,5,8,8a-옥타하이드로-1,4:5,8-다이메타노나프탈렌과 에텐, 티코나(Ticona)의 TOPAS, 미츠이 케미칼(Mitsui Chemical)의 APEL과의 연쇄 공중합에 의해서, 또는 다양한 환상 단량체의 개환 복분해 중합에 이은 수소화에 의해 생성시킬 수도 있다(예를 들어 일본 합성 고무(Japan Synthetic Rubber)의 아르톤(ARTON), 제온 케미칼(Zeon Chemical)의 제오넥스(Zeonex) 및 제오노어(Zeonor)).
"히아루론산"(또한 히아루로난 또는 히아루로네이트라 칭함)이란 표현은 결합, 상피, 및 신경 조직 전체를 통해 광범위하게 분포하는 음이온성의 비황산화된글리코스아미노글리칸을 의미한다. 글리코스아미노글리칸들 중에서도, 상기는 골지체 대신에 혈장 막 중에 있는 비황산화된 형태이고 매우 클 수 있다(그의 분자량은 종종 백만에 달한다)는 점에서 독특하다. 세포외 기질의 주된 성분들 중 하나인 히아루로난은 세포 증식 및 이동에 현저하게 기여한다.
"키토산"이란 표현은 랜덤하게 분포된 β-(1-4)-결합된 D-글루코스아민(탈아세틸화된 단위) 및 N-아세틸-D-글루코스아민(아세틸화된 단위)으로 구성된 선형 폴리사카라이드를 의미한다. 키토산은 키틴(갑각류(게, 새우 등)의 외골격과 진균 세포벽의 구조 요소이다)의 탈아세틸화에 의해 상업적으로 생산된다. 탈아세틸화의 정도(%DD)를 NMR 분광학에 의해 측정할 수 있으며, 상업적인 키토산의 %DD는 60 내지 100%의 범위이다. 평균적으로, 상업적으로 생산된 키토산의 분자량은 3800 내지 20,000 달톤이다. 키토산의 통상적인 합성 방법은 용매로서 물과 시약으로서 과잉의 수산화 나트륨을 사용하는 키틴의 탈아세틸화이다. 상기 반응 경로는, 완료에 이르는 것이 허용되는 경우(완전한 탈아세틸화), 98%까지의 생성물을 제공한다. 키토산 중의 아미노 그룹은 약 6.5의 pKa 값을 가지며, 이는 pH 및 %DA-값에 따른 전하 밀도를 갖는 산성 내지 중성 용액에서 양자 부가(protonation)를 유도한다. 이는 키토산을 수용성이면서 음으로 하전된 표면에, 예를 들어 점막에 쉽게 결합하는 바이오접착성으로 만든다. 키토산은 극성 약물의 상피 표면을 가로지르는 수송을 증대시키며 생체적합성이고 생분해성이다.
하나의 태양에서, 본 발명은
a) 바람직하게는 요변성 젤을 함유하는 튜브 중에 전혈을 수집하고,
b) 트롬빈 혈청이 유리될 때까지 상기 튜브를 원심분리하고,
c) 상기 트롬빈 혈청을 수집하는
단계들을 포함하는, 트롬빈 혈청의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
피를 흘리는 행위는 응고 반응을 개시하며, 상기 과정을 멈추기 위한 무언가를 하지 않으면, 혈전이 자연적으로 형성될 것이다.
바람직하게는, 상기 요변성 젤을 상기 튜브의 기부 가까이에 배치한다. 원심분리 중에, 적혈구가 상기 젤 아래로 이동할 것이다. 이러는 동안, 상기 젤 상에 혈전의 형성과 함께 피브리노겐의 중합이 발생한다. 충분한 원심분리력 및/또는 충분한 원심분리 시간 하에서, 상기 혈전은 더욱 침전되어 피브린 그물을 형성할 것이며, 이는 농축된 활성화된 트롬빈을 포함하는 혈청이라 지칭되는 액체 상등액을 유리시킬 것이다. 트롬빈은 응고를 자극하는 효소이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 트롬빈 혈청을 단지 충분한 원심분리 시간 동안 전혈 및 요변성 젤을 함유하는 튜브의 간단한 원심분리에 의해서 소수의 단계로 수득할 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 따른 트롬빈 혈청의 제조 방법은 바로 사용 가능한 트롬빈 혈청을 제공한다.
본 발명에서 상기 트롬빈 혈청은 트롬빈 농축된 제제, 트롬빈 농축된 혈청, 농축된 활성화된 트롬빈 혈청, 농축된 활성화된 트롬빈 제제, 트롬빈 풍부 활성화된 혈청, 트롬빈 풍부 활성화된 제제로서 지칭된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 바람직하게는 요변성 젤을 함유하는 튜브 중에 전혈을 수집하고,
b) 적혈구가 상기 요변성 젤 아래로 이동하고 바람직하게는 상기 요변성 젤 상에 피브린 그물이 형성될 때까지 상기 튜브를 원심분리하고,
c) 상등액 또는 트롬빈 혈청을 수집하는
단계들을 포함하는, 트롬빈 혈청의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 원심분리 단계를 대략 30 분 동안 약 1500 g의 힘에서 수행한다. 추가의 실시태양에서, 상기 원심분리 단계를 약 20 분 내지 약 40 분 중에서 선택된 시간 동안 약 1000 g 내지 약 2000 g의 힘에서, 바람직하게는 약 25 분 내지 약 35 분 중에서 선택된 시간 동안 약 1500 g의 힘에서, 바람직하게는 약 30 분 동안 1500 g의 힘에서 수행한다.
바람직하게는, 상기 원심분리 단계를 트롬빈 혈청이 유리될 때까지 충분한 시간 동안 수행한다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 상기 액체 혈청의 보존을 허용하며, 상기 트롬빈은 용해성으로 남아있는다.
표준 방법은 트롬빈 혈청의 유리시까지 상기 혈전을 분쇄한다. 유리하게는, 이 단계는 본 발명에 따른 트롬빈 혈청의 제조에 필요하지 않다. 이러한 대안의 트롬빈 혈청을 본 발명과 관련하여 트롬빈 농축된 제제로서 또한 사용할 수도 있다.
유리하게는, 응고제를 사용하지 않으며, 응고는 자발적으로 일어난다. 이는 비용을 절감하고 상기 공정을 단순화하는 이점을 갖는다. 상기 튜브 중에 시트레이트가 존재하지 않으므로, 유리하게는 응고를 개시하기 위해 응고제(또한 수복제로서 지칭된다)가 필요하지 않다. 유리하게는, 에탄올 용액 및/또는 염화 칼슘이 필요하지 않다.
유리하게는, 본 발명에 개시된 트롬빈 혈청의 제조 공정 또는 방법은 수행하기 간단하여, 혈전 분쇄가 필요하지 않으므로 인간 참석 시간의 양을 감소시키고, 이는 오래된 제조 방법에 비해 경제적인 이점을 나타낸다.
본 발명과 관련하여 트롬빈 농축된 제제로서 사용되는 또 다른 자기조직 트롬빈 혈청은, 튜브 중에 수집된 환자의 전혈 샘플(예를 들어 10 ㎖)에 95% v. 에탄올 용액(예를 들어 1 ㎖) 및 10% 염화 칼슘(예를 들어 1 ㎖)을 첨가함을 포함하는 오래된 방법에 의해 제조된다. 이어서 상기 혼합물을 실온에서 약 30 분간 침전되게 한다. 30 분 후에, 항-트롬빈(다른 단백질들 중에서도 피브리노겐과 같은)의 거의 80%가 침전되며; 이어서 상기 튜브를 약 8 내지 10 분 동안 약 1500 g에서 원심분리시키고, 상기 자기조직 트롬빈 혈청은 혈소판-풍부 농축물과 함께 바로 사용이 가능하다.
바람직하게는, 본 발명은 자기조직 트롬빈 혈청의 제조 공정 또는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 모든 태양 및/또는 실시태양은 자기조직용이다. 따라서, 본 발명은 공여자 및 수용자가 동일한 사람 또는 동물인 완전히 자기조직인 트롬빈 혈청의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 트롬빈 혈청 제조용 튜브는 유리, 바람직하게는 폴리에스터 기재 요변성 젤을 함유하는 유리 분리기 튜브로 제조된다.
가장 바람직한 실시태양에서, 상기 트롬빈 혈청의 제조 방법은, 시트레이트가 첨가되지 않은 본 발명에 따른 튜브를 사용한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 바람직하게는 요변성 젤을 함유하는 튜브 중에 전혈을 수집하고,
b) 바람직하게는 트롬빈 혈청이 유리될 때까지 상기 튜브를 원심분리하고,
c) 상등액 또는 상기 트롬빈 혈청을 수집하고,
d) 상기 트롬빈 혈청을 PRP 조성물 또는 단리된 혈소판 농축 조성물과 혼합하는
단계들을 포함하는, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 바람직하게는 요변성 젤을 함유하는 튜브 중에 전혈을 수집하고,
b) 바람직하게는 트롬빈 혈청이 유리될 때까지 상기 튜브를 원심분리하고,
c) 상기 트롬빈 혈청을 수집하고,
d) 상기 트롬빈 혈청을 PRP 조성물 또는 단리된 혈소판 농축 조성물과 혼합하고,
e) 단계 d)의 생성 조성물을 세포 추출물, 세포 조성물, TCP, 키토산, 히아루론산, 크림, 크림 마스크, 지방 세포, 지방 조직, 골수 농축물, 루브리신, cd-젤라틴, 보툴리늄 독소 및/또는 줄기 세포와 혼합하는
단계들을 포함하는, 상처 또는 조직 치유 조성물, 세포 조성물 및/또는 세포 제제의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 전혈을 하나 이상의 튜브에 수집한다. 상기 튜브를 본 발명에서는 분리기 튜브로서 정의할 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법 및/또는 공정은 모두 본 발명에 따른 하나 이상의 튜브를 사용할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 모든 방법 및/또는 공정은 본 발명에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치 또는 상기와 같은 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치를 포함하는 장치 또는 키트에 수집된 전혈을 사용할 수 있다.
"빈" 튜브는 본 발명에서 물질, 조성물 또는 그 밖의 것들이 상기 튜브에 삽입 및/또는 첨가되지 않은 튜브를 지칭한다.
본 발명의 임의의 공정 및 방법을 본 발명에 따른 하나 이상의 튜브를 사용하여 준비할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 튜브 중에 전혈을 수집하고,
b) 상기 튜브를 원심분리하고,
c) 혈전을 수집하는
단계들을 포함하는, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
유리하게는, 상기 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조에 응고제가 사용되지 않는다. 유리하게는, 상기 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물은 바로 사용이 가능한 조성물을 나타낸다. 상기와 같은 조성물을 당뇨성 궤양에 직접 적용할 수도 있다.
바람직하게는, 상기 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조 공정 또는 방법은 치과 및/또는 정형외과에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 치과, 정형외과, 관절염, 의사-관절염 등에 사용하기 위한 혈전을 포함하는 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물을 제공한다. 하나의 태양에서, 상기 혈전을 포함하는 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물을 치아 구멍, 당뇨성 궤양, 천공 궤양, 당뇨성 천공 궤양 등에 적용한다. 상기 혈전을 포함하는 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 치료 방법 및 용도가 또한 본 발명에 포함된다.
하나의 실시태양에서, 상기 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물을 바람직하게는 혈전의 형성 전에 삼칼슘 포스페이트(TCP) 또는 임의의 뼈 대용물과 배합할 수도 있다.
상기 TCP를 포함하는 상처 치유 조성물을 바람직하게는 바이알 중에서 제조할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물을 바람직하게는 혈전의 형성 전에 히아루론산(HA)과 배합할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 바람직하게는 나트륨 시트레이트 및/또는 요변성 젤을 포함하는 본 발명에 따른 튜브 중에서 전혈을 원심분리하고,
b) 혈소판 풍부 혈장을 수집하는
단계들을 포함하는, 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
상기 원심분리 단계는 혈장으로부터 적혈구(RBC)를 제거할 것이다. 상부 상은 혈소판 풍부 혈장(PRP)이고, 기부 상은 상기 혈소판 풍부 혈장이 제거된 응고방지된 전혈이다.
바람직하게는, 상기 원심분리 단계를 약 1500 g 내지 약 2000 g의 힘에서 수행한다. 바람직하게는, 상기 원심분리 단계를 혈소판, 림프구 및 단핵구를 함유하는 혈장과 적혈구를 함유하는 젤 사이에 차단층이 형성되기에 충분한 시간 동안 수행한다.
바람직하게는, 상기 분리 단계 b)를 상기 차단층의 상부로부터 상등액을 수집함으로써 수행한다. 하나의 실시태양에서, 상기 농축된 혈소판 풍부 혈장을, 혈소판 부족 혈장을 함유하는 상등액의 절반을 제거함으로써 전체 혈장으로부터 분리시킨다. 바람직하게는, 상기 농축된 혈장은 고유 전혈에 비해 백혈구, 혈소판 및 부착 단백질(예를 들어 피브로넥틴(용해성 단백질) 또는 비트로넥틴(혈소판에 의해 분비되는 단백질))이 풍부하다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈소판 풍부 혈장의 제조에 사용되는 튜브를
i) 폴리에스터 기재 요변성 젤 및 0.10 M의 완충된 나트륨 시트레이트 용액을 함유하는 유리 분리기 튜브,
ii) 중합체 혼합물 및 3.5 ㎎/㎖의 무수 나트륨 시트레이트에 의해 형성된 고도의 요변성 젤을 함유하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 분리기 튜브,
iii) 폴리에스터 기재 요변성 젤 및 0.1 M의 완충된 나트륨 시트레이트 용액을 함유하는 환상 올레핀 공중합체(COC) 또는 환상 올레핀 중합체(COP) 분리기 튜브, 및
iv) 0.10 M의 완충된 나트륨 시트레이트 용액 또는 3.5 ㎎/㎖의 무수 나트륨 시트레이트를 함유하는 환상 올레핀 공중합체(COC) 또는 환상 올레핀 중합체(COP) 필터 분리기 튜브
중에서 선택한다.
가장 바람직한 실시태양에서, 혈소판 농축물의 제조 방법은 시트레이트(예를 들어 0.10 M의 완충된 나트륨 시트레이트 용액 또는 3.5 ㎎/㎖의 무수 나트륨 시트레이트)가 첨가된 본 발명에 따른 튜브를 사용한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 바람직하게는 나트륨 시트레이트 및/또는 요변성 젤을 포함하는 본 발명에 따른 튜브에서 전혈을 원심분리하고,
b) 혈소판 풍부 혈장을 수집하고,
c) 상기 혈소판 풍부 혈장을 세포 추출물, 세포 조성물, TCP, 키토산, 히아루론산, 크림, 크림 마스크, 지방 세포, 지방 조직, 골수 농축물, 루브리신, cd-젤라틴, 보툴리늄 독소 및/또는 줄기 세포와 혼합하는
단계들을 포함하는, 상처 치유 또는 조직 치유 조성물의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 혈소판 풍부 혈장 또는 혈장 농축물, 및
b) TCP, 키토산, 히아루론산, 크림, 크림 마스크, 지방 세포, 지방 조직, 골수 농축물, 루브리신, cd-젤라틴, 보툴리늄 독소 및/또는 줄기 세포
를 포함하는, 상처 치유 또는 조직 치유 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 트롬빈 혈청,
b) 바람직하게는 본 발명에 따른 혈소판 풍부 혈장 또는 혈장 농축물, 및
c) TCP, 키토산, 히아루론산, 크림, 크림 마스크, 지방 세포, 지방 조직, 골수 농축물, 루브리신, cd-젤라틴, 보툴리늄 독소 및/또는 줄기 세포
를 포함하는, 상처 치유 또는 조직 치유 조성물을 제공한다.
혈전의 형성은 다단계 공정 또는 캐스케이드이며, 이들 단계 중 몇 개는 칼슘 이온의 존재를 필요로 한다. 혈액을 시트레이트 중에서 수집하는 경우의 효과로서, 전혈 중에 존재하는 칼슘 이온을 제거함으로써, 상기 혈액이 응고되는 것을 방지할 수 있다. 칼슘 킬레이트제는, 혈액 중에 존재하는 칼슘이 혈액 응고에서 더 이상 작용할 수 없도록 하는 방식으로, 상기 칼슘과 반응하는 화학물질이다. 가장 통상적인 킬레이트제는 시트르산의 염(시트레이트)인데, 그 이유는 상기 염이 응고 시스템의 성분들에 대해 최소의 부작용을 갖기 때문이다. 시트레이트와 같은 칼슘 킬레이트제를 함유하는 매질 내로 혈액을 수집함으로써, 샘플 수집 및 상기 시트레이트화된 샘플의 추가적인 제조를 수 시간 이하의 기간 동안 수행할 수 있다. 바람직한 칼슘 킬레이트제는 나트륨 시트레이트이다.
3.5 ㎎/㎖의 나트륨 시트레이트 수집 매질이 혈액의 수집 및 보존에 흔히 사용되는 것이지만, 당해 분야의 숙련가는 나트륨 시트레이트 대 전혈의 비가 상이한 범위로 존재할 수 있음을 알 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 혈장;
b) 300 x 109 세포/L 이상 농도의 혈소판;
c) 7 x 109 세포/L 이상 농도의 백혈구;
d) 3 ㎎/L 이상 농도의 피브리노겐
을 포함하는 단리된 혈소판 농축 조성물을 제공하며, 여기에서 적혈구 농도는 0.6 x 1012 세포/L 미만이다.
혈소판 풍부 혈장 조성물을 또한 본 발명에서는 혈장 농축 조성물이라 칭한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물을 삼칼슘 포스페이트(TCP) 및/또는 부피 보정제(10 내지 30 마이크론의 TCP)로서, 치과, 정형외과(50 마이크론의 TCP)에서 사용하기 위한 임의의 하나의 대용물과 배합할 수도 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 히아루론산을 포함하는 튜브에서 전혈을 원심분리하고,
b) 농축된 혈소판 풍부 혈장 및 히아루론산을 전체 혈장으로부터 임의로 분리하고,
c) 상기 농축된 혈소판 풍부 혈장 및 히아루론산을 임의로 혼합하는
단계들을 포함하는, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법 또는 공정을 제공한다.
바람직하게는, 상기 튜브는 바람직하게는 상기 튜브의 기부에 히아루론산, 다음에 요변성 젤 및 이어서 응고방지제, 바람직하게는 나트륨 시트레이트를 포함한다(도 16).
바람직하게는, 상기 분리 단계 b)를 상기 차단층의 상단으로부터 상등액을 수집함으로써 수행한다. 하나의 실시태양에서, 상기 농축된 혈소판 풍부 혈장 및 히아루론산을, 혈소판 부족 혈장을 함유하는 상등액의 절반을 제거함으로써 전체 혈장으로부터 분리시킨다. 바람직하게는, 상기 농축된 혈장은 고유 전혈에 비해 백혈구, 혈소판 및 부착 단백질(예를 들어 피브로넥틴(용해성 단백질) 또는 비트로넥틴(혈소판에 의해 분비되는 단백질))이 풍부하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 바람직하게는 히아루론산, 요변성 젤 및/또는 응고방지제, 바람직하게는 나트륨 시트레이트를 함유하는 튜브에서 전혈을 수집하고,
b) 바람직하게는 적혈구가 요변성 젤 아래로 이동하고 바람직하게는 히아루론산이 농축된 혈장 위로 이동할 때까지 상기 튜브를 원심분리하고,
c) 바람직하게는 상기 튜브를 뒤집음으로써, 상기 히아루론산 및 농축된 혈장을 임의로 혼합하고,
*d) 상기 농축된 혈장 및 히아루론산을 함유하는 상등액을 수집하고,
e) 상기 히아루론산 및 상기 농축된 혈장을 임의로 추가로 혼합하는
단계들을 포함하는, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법 또는 공정을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 바람직하게는 히아루론산, 요변성 젤 및/또는 응고방지제, 바람직하게는 나트륨 시트레이트를 함유하는 튜브에서 전혈을 수집하고,
b) 바람직하게는 상기 튜브의 상단으로부터 제 1 층으로서 히아루론산층이 형성된 다음 농축된 혈장 또는 PRP로 이루어진 제 2 층이 형성될 때까지 상기 튜브를 원심분리하고,
c) 바람직하게는 상기 튜브를 뒤집음으로써, 상기 히아루론산 및 농축된 혈장을 임의로 혼합하고,
d) 상기 농축된 혈장 및 히아루론산을 함유하는 상등액을 수집하고,
e) 상기 히아루론산 및 상기 농축된 혈장을 임의로 추가로 혼합하는
단계들을 포함하는, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법 또는 공정을 제공한다.
상기 원심분리 단계는 혈장으로부터 적혈구(RBC)를 제거할 것이다. 원심분리 후에, 상부 상은 히아루론산이고, 이때 바닥면은 혈소판 풍부 혈장(PRP)이 있고, 이어서 요변성 젤이 있으며, 기부 상은 혈소판 풍부 혈장이 제거된, 적혈구를 함유하는 응고방지된 전혈이다(도 16). 원심분리 중에, 히아루론산은 혈장 위로 이동한다(도 16).
바람직하게는, 상기 튜브는 약 1 ㎖ 내지 약 2 ㎖의 히아루론산, 약 2 g의 세포 선택자 또는 요변성 젤 및 약 1 ㎖의 0.109 M의 나트륨 시트레이트를 함유한다.
히아루론산 및 PRP를 포함하는 상처 치유 조성물의 제조 방법의 도식적인 표현을 도 16에 제공한다.
바람직하게는, 상기 농축된 혈소판 풍부 혈장 및 히아루론산을 상기 튜브의 간단한 뒤집기에 의해 혼합한다.
유리하게는, 상기 농축된 혈소판 풍부 혈장과 히아루론산을 혼합하는 경우, 상기 히아루론산은 혈장 및 세포에 의해 팽창되어 그 자체가 확대된다.
유리하게는, 상기 수득된 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물은 바로 사용이 가능한 조성물이다. 유리하게는, 상기 수득된 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물은 주입에 적합한 점성 젤 또는 생물학적 접착제이며, 예를 들어 역학적 지지체 또는 충전제로서 사용될 수도 있다.
유리하게는, 상기 상처 치유 조성물, 조직 치유 조성물 또는 점성 젤의 제조 방법 또는 공정은 경제적이고, 간단하며 신속하다.
바람직하게는, 상기 원심분리 단계를 적혈구가 요변성 젤 아래로 이동하고 바람직하게는 히아루론산이 농축된 혈장 위로 이동할 때까지 충분한 시간 동안 수행한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 원심분리 단계를 대략 5 분간 약 1500 g의 힘에서 수행한다. 추가의 실시태양에서, 상기 원심분리 단계를 약 3 분 내지 약 7 분 중에서 선택된 시간 동안 약 1000 g 내지 약 2000 g의 힘에서, 바람직하게는 약 3 분 내지 약 7 분 중에서 선택된 시간 동안 1500 g에서 수행한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산 및 응고방지제를 포함하는 튜브를 제공한다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산, 응고방지제 및 전혈을 포함하는 튜브를 제공한다. 바람직하게는 상기 응고방지제는 나트륨 시트레이트이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산 및 세포 선택자 젤을 포함하는 튜브를 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산, 세포 선택자 젤 및 전혈을 포함하는 튜브를 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포 선택자 젤은 요변성 젤이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산, 응고방지제 및 세포 선택자 젤을 포함하는 튜브를 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산, 응고방지제, 세포 선택자 젤 및 전혈을 포함하는 튜브를 제공한다. 바람직하게는 상기 응고방지제는 나트륨 시트레이트이다. 바람직하게는, 상기 세포 선택자 젤은 요변성 젤이다. 바람직하게는, 히아루론산을 상기 튜브의 기부에 배치시킨 다음, 요변성 젤을 배치시키고 위에 응고방지제, 바람직하게는 나트륨 시트레이트를 배치시킨다(도 16).
또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산 및 PRP를 포함하는 튜브를 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산, PRP 및 세포 선택자 젤을 포함하는 튜브를 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산, PRP 및 응고방지제를 포함하는 튜브를 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산, PRP, 응고방지제 및 세포 선택자 젤을 포함하는 튜브를 제공한다. 바람직하게는 상기 응고방지제는 나트륨 시트레이트이다. 바람직하게는, 상기 세포 선택자 젤은 요변성 젤이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 튜브를 본 발명에 따른 방법 또는 공정에 사용한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산 및 PRP를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 히아루론산 및 PRP를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 조성물은 본 발명에 따른 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법에 의해 수득된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 튜브를 포함하는 키트 또는 의료 장치를 제공한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은
i) 폴리에스터 기재 요변성 젤 및 0.10 M의 완충된 나트륨 시트레이트 용액 및 히아루론산을 함유하는 유리 분리기 튜브,
ii) 중합체 혼합물, 3.5 ㎎/㎖의 무수 나트륨 시트레이트 및 히아루론산에 의해 형성된 고도의 요변성 젤을 함유하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 분리기 튜브,
iii) 폴리에스터 기재 요변성 젤, 0.10 M의 완충된 나트륨 시트레이트 용액 및 히아루론산을 함유하는 환상 올레핀 공중합체(COC) 또는 환상 올레핀 중합체(COP) 분리기 튜브, 및
iv) 히아루론산 및 0.10 M의 완충된 나트륨 시트레이트 용액 또는 3.5 ㎎/㎖의 무수 나트륨 시트레이트를 함유하는 환상 올레핀 공중합체(COC) 또는 환상 올레핀 중합체(COP) 필터 분리기 튜브
중에서 선택된, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조에 사용될 수 있는 튜브를 제공한다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 시트레이트 및 히아루론산(예를 들어 히아루론산 및 0.10 M의 완충된 나트륨 시트레이트 용액 또는 3.5 ㎎/㎖의 무수 나트륨 시트레이트)을 추가로 포함하는, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조에 사용될 수 있는, 본 발명에 따른 튜브를 제공한다.
바람직하게는, 프탈레이트는 인간 용도로 사용되지 않는다.
한편으로, 히루딘, 벤질설포닐-d-Arg-Pro-4-아미디노벤질아미드(BAPA), 헤파린, 시트레이트, 산 시트레이트 덱스트로스(ACD), 시트레이트-테오필린-아데노신-다이피리다몰(CTAD) 또는 칼륨-에틸렌다이아민테트라-산(EDTA)을 응고방지제로서 사용할 수도 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 혈장;
b) 300 x 109 세포/L 이상 농도의 혈소판;
c) 7 x 109 세포/L 이상 농도의 백혈구;
d) 3 ㎎/L 이상 농도의 피브리노겐;
e) 약 1 ㎖ 내지 약 2 ㎖의 히아루론산
을 포함하는 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물을 제공하며, 여기에서 적혈구 농도는 0.6 x 1012 세포/L 미만이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물을 삼칼슘 포스페이트(TCP) 및/또는 부피 보정제(10 내지 30 마이크론의 TCP)로서, 치과, 정형외과(50 마이크론의 TCP)에서 사용하기 위한 임의의 하나의 대용물과 배합할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 상처 치유 조성물, 조직 치유 조성물, 지혈제, 혈소판 농축 조성물, 혈소판 풍부 혈장 조성물을 히아루론산이 있는 채혈 튜브 중에서 배합할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 트롬빈 혈청 또는 본 발명에 따른 트롬빈 혈청을 혈소판 풍부 혈장 조성물, 본 발명에 따른 혈소판 풍부 혈장 조성물, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물과 혼합하는 단계를 포함하는, 지혈제, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 혈소판 농축물 또는 본 발명의 혈소판 농축물을 제공하고,
b) 상기 혈소판 농축물을 응고 활성제, 트롬빈 혈청 또는 본 발명에 따른 트롬빈 혈청과 혼합하고,
c) 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 혈액 전구 세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포 또는 아킬레스 건 세포의 추출물과 임의로 혼합함
을 포함하는 상처 치유 조성물, 조직 치유 조성물 또는 지혈제의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 자기조직 혈소판 농축물, 자기조직 트롬빈 및/또는 자기조직 세포 추출물을 사용한다. 보다 바람직하게는, 자기조직 혈소판 농축물 및 자기조직 트롬빈 및 자기조직 세포 추출물을 사용한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 튜브를 사용한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 혈소판 농축물을 본 발명의 임의의 태양에 따른 자기조직 트롬빈 혈청과 혼합하고,
b) 하나 이상의 자기조직 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포 또는 아킬레스 건 세포의 추출물과 임의로 혼합함
을 포함하는 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 자기조직 혈소판 농축물을 트롬빈 혈청과 혼합하고, 여기에서 상기 자기조직 혈소판 농축물 및/또는 트롬빈 혈청은 본 발명에 따른 튜브를 사용하여 제조되며,
b) 하나 이상의 자기조직 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포 또는 아킬레스 건 세포의 추출물과 임의로 혼합함
을 포함하는 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 혈소판 농축물, 바람직하게는 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축물을 제공하고,
b) 상기 혈소판 농축물을 트롬빈 혈청, 바람직하게는 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈 혈청과 혼합하고,
c) 하나 이상의 세포 추출물, 바람직하게는 자기조직 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포 또는 아킬레스 건 세포의 추출물과 임의로 혼합함
을 포함하는 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제의 제조 공정 또는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 자기조직 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제의 제조 방법 또는 공정을 제공한다. 본 발명에서 자기조직 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제는 혈소판 농축물 또는 트롬빈 혈청이 자기조직인 조성물을 의미한다.
가장 바람직한 태양에서, 본 발명은 완전히 자기조직 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제의 제조 방법 또는 공정을 제공한다. 본 발명에서 완전히 자기조직 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제는 혈소판 농축물 또는 트롬빈 혈청이 모두 자기조직인 조성물을 의미한다. 본 발명의 상기 바람직한 태양에서, 상기 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제에 대한 혈액 성분들은 모두 상기 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제가 적용되는 동일한 환자 또는 동물로부터 유래한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하나 이상의 자기조직 세포 추출물과 병용되는 완전히 자기조직 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제의 제조 방법 또는 공정을 제공한다. 이 태양에서, 상기 혈소판 농축물, 트롬빈 혈청 및 세포 추출물(들)은 모두 자기조직이며 따라서 모두 동일한 환자 또는 동물로부터 유래한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 자기조직 혈소판 농축물, 바람직하게는 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축물을 자기조직 트롬빈 혈청, 바람직하게는 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈과 혼합하고,
b) 하나 이상의 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포 또는 아킬레스 건 세포의 추출물과 임의로 혼합함
을 포함하는 자기조직 상처 치유 조성물 또는 자기조직 조직 치유 조성물 또는 자기조직 지혈제의 제조 공정 또는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 자기조직 혈소판 농축물 및 자기조직 트롬빈은 모두 동일한 환자 또는 동일한 동물로부터 유래한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 자기조직 혈소판 농축물, 바람직하게는 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축물을 자기조직 트롬빈 혈청, 바람직하게는 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈과 혼합하고,
b) 하나 이상의 자기조직 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포 또는 아킬레스 건 세포의 추출물과 임의로 혼합함
을 포함하는 자기조직 상처 치유 조성물 또는 자기조직 조직 치유 조성물 또는 자기조직 지혈제의 제조 공정 또는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 자기조직 혈소판 농축물, 자기조직 트롬빈 및 자기조직 세포 추출물은 모두 동일한 환자 또는 동일한 동물로부터 유래한다.
본 발명의 혈소판 풍부 혈장, 자기조직 혈소판 풍부 혈장, 트롬빈 혈청, 자기조직 트롬빈 혈청, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 하나 이상의 세포 추출물과 병용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포 추출물은 각질세포, 골수, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포 및 아킬레스 건 세포 중에서 선택된다.
본 발명의 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제는 세포 재생을 자극하여, 조직 부착을 촉진하기 위해서 생물 접착제로서 작용할 것이다.
하나의 실시태양에서, 트롬빈 혈청 대신에, 또 다른 응고 활성제, 예를 들어 염화 칼슘, 바람직하게는 칼슘 글루코네이트를 사용할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 다수의 응고 활성제들을 함께, 바람직하게는 트롬빈 혈청과 칼슘 글루코네이트를 함께 사용할 수도 있다.
바람직하게는, 상기 응고 활성제 또는 트롬빈 혈청을 혈소판 농축물과 약 10:1 내지 약 10:3의 부피 비(혈소판 농축물:응고 활성제)로 혼합한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 액체 혈청을 혈소판 풍부 혈장에 대해 1:1 비율, 3:1 비율 또는 10:1 비율로 수집한다. 상기 사용되는 특정한 비율은 지혈제 경도를 변경시킬 것이다. 3:1 비율에서, 강한 지혈제가 수득된다. 10:1 비율의 경우, 보다 연질의 작용제가 수득된다.
하나의 실시태양에서, 상기 PRP 또는 혈장 농축물을 단독으로 또는 세포 추출물뿐만 아니라 본 발명의 제제 또는 조성물과 함께, 상처에 직접 적용되는 침액 무세포 기질과 배합 또는 통합하거나 또는 적용 전에 실험실에서 배양할 수도 있다. 콜라젠(colagene) 기질 또는 합성 기질, 예를 들어 인테그라(Integra) 기질을 사용할 수도 있다.
또 다른 실시태양은 인간 재조합 트롬보플라스틴을 혈소판 풍부 혈장과 직접 혼합하여 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 형성시킴을 고려한다. 한편으로, 인간 재조합 트롬보플라스틴을 사용하여 작은 분액의 혈장 중에 트롬빈을 생성시키고 이어서 생성되는 트롬빈을 상기 혈소판 풍부 혈장과 배합하여 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 형성시킨다.
하나의 실시태양에서, 상기 사용되는 튜브는 습윤성 표면(예를 들어 실리카, 규조토, 카올린 등) 또는 비-습윤성 표면(예를 들어 플라스틱, 실리콘 처리된 유리 등)을 가질 수 있다. 표면이 혈액 응고 활성화에 한 역할을 하므로, 상기 선택된 분리기 튜브의 표면은 혈전 형성을 신속하게 또는 느리게 원하는 지에 따라 변한다. 화학적 활성제, 예를 들어 카올린을 또한 응고 시간의 가속을 위해 사용할 수 있지만; 이의 후속 제거가 또한 필요할 것이다.
유리하게는, 본 발명의 혈소판 풍부 혈장, 혈소판 농축물, 트롬빈 혈청, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제의 제조는 에탄올 및/또는 칼슘의 존재를 필요로 하지 않는다. 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈을 사용함으로써, 본 발명은 상기 혈전 형성 과정을 복원할 필요가 없다. 그 자체로서, 응고 방지제의 효과를 역전시키기 위해(시트레이트화된 혈액의 응고 활성을 복원함에 있어서) 염화 칼슘 또는 칼슘 글루코네이트와 같은 작용제(또는 복원제)가 필요하지 않다.
염화 칼슘은 복원제로서 사용하기에 널리 공지된 칼슘염이지만, 염화 칼슘과 유사한 방식으로 작용하는 임의의 칼슘염을 복원제로서 고려할 수 있다. 유사하게, 다수의 혈액 응고 반응들이 현재 보조인자로서 칼슘 이온을 필요로 하는 것으로 여겨지지만, 이러한 응고 반응을 촉진함에 있어서 칼슘과 작용상 동등한 것으로 공지되거나 또는 후속적으로 발견된 임의의 물질을 개별적으로 또는 칼슘과 함께 복원제로서 고려할 수 있다. 상기 사용되는 응고 방지제가 헤파린인 경우, 헤파리나제를 복원제로서 사용하여 상기 응고 방지제의 효과를 역전시킬 것이다.
유리하게는, 본 발명은 소 및 재조합 인간 트롬빈의 사용과 관련된 위험이 제거된 혈소판 풍부 혈장, 혈소판 농축물, 트롬빈 혈청, 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 제공한다.
유리하게는, 보다 고 농도의 PRP, 성장 인자, 백혈구, 피브리노겐 및/또는 다른 단백질을 본 발명의 방법에 의해 수득한다. 유리하게는, 통상적인 혈액 수준에 비해 2 배 농도의 PRP, 성장 인자, 백혈구, 피브리노겐 및/또는 다른 단백질이 수득된다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 세포 팽창에 최적의 세포 생산성을 부여한다.
*유리하게는, 본 발명의 방법은 전 과정 동안, 채혈로부터 완전히 폐쇄된 회로의 혈액 조작, 환자에게 적용 또는 주사시까지의 조작을 허용한다. 따라서 모든 장치 및 키트는 혈액과 공기의 직접적인 접촉을 피하기 위해서 완전히 폐쇄된 회로의 조작에 적합하다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 산화 응력을 감소시키고 생체 외 조작 시간을 감소시킨다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 응집된 혈소판 및 활성화된 중합된 피브리노겐으로 구성된 고체의 자기조직 봉합성 막의 형성을 허용한다.
본 발명의 제제(예를 들어 골수 세포 제제)를 단독으로 사용하거나 또는 본 발명에 따른 혈소판 농축물에 혼합하거나 또는 칼슘 글루코네이트와 다시 원심분리시켜 봉합성 막을 형성시키고 환자의 손상된 부위에 적용기로 적용하거나 주사할 수 있다.
본 발명에 따른 골수 세포 제제는 골 결함 또는 연골 결함의 치료에 유용하다. 상기 뼈 세포 제제를 단독으로 또는 본 발명에 따른 혈장 농축물과 함께 사용할 수 있다. 연골막을 또한 칼슘 글루코네이트와 함께 사용할 수도 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 원심분리 단계(예를 들어 봉합성 막의 경우)를 15 내지 25 분 동안 약 3000 g의 힘에서 수행한다. 하나의 실시태양에서, 상기 원심분리 단계를 약 10 분 내지 약 30 분 중에서 선택된 시간 동안 약 2500 g 내지 약 3500 g의 힘에서 수행한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 전혈을 인간 또는 동물로부터 수집한다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 상기 전혈을 인간으로부터 수집하는 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 혈장;
b) 300 x 109 세포/L 이상 농도의 혈소판;
c) 7 x 109 세포/L 이상 농도의 백혈구;
d) 3 ㎎/L 이상 농도의 피브리노겐;
e) 응고 활성제, 자기조직 트롬빈 혈청 또는 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈 혈청,
f) 임의로 자기조직 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수 세포, 조골세포; 연골세포, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포, 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포의 추출물
을 포함하는 본 발명에 따라 제조된 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 제공하며, 여기에서 적혈구 농도는 0.6 x 1012 세포/L 미만이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 혈장;
b) 300 x 109 세포/L 이상 농도의 혈소판;
c) 7 x 109 세포/L 이상 농도의 백혈구;
d) 3 ㎎/L 이상 농도의 피브리노겐;
e) 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈 혈청,
f) 임의로 자기조직 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수 세포, 조골세포; 연골세포, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포, 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포의 추출물
을 포함하는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 제공하며, 여기에서 적혈구 농도는 0.6 x 1012 세포/L 미만이다.
바람직하게는, 상기 응고 활성제 또는 자기조직 트롬빈 혈청은 약 10:1 내지 약 10:3의 부피 비(혈소판 농축물:응고 활성제)로 존재한다.
유리하게는, 본 발명의 혈장은 공지된 것들에 비해 이상적인 세포 배양 배지를 나타낸다. 유리하게는, 본 발명의 혈장은 세포의 수송에 이상적인 배지를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 혈장은 최적의 세포 성장 및 생존을 위한 모든 세포 및 성장 인자들을 함유한다. 따라서, 본 발명의 혈장은 환자에 대한 세포의 이식에, 예를 들어 수술 상처와 같은 아토피 용도로서, 노화 방지 주사, 관절 내 주사, 근육 내 주사에, 또는 췌장 재생(췌장 섬)에 매우 적합한 배지를 나타낸다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 자기조직 트롬빈 혈청의 제조를 위한 장치를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 튜브를 포함하는 장치를 제공한다.
바람직하게는, 상기 장치는 상기 전혈을 도입하기 위한 유입구를 가지며, 상기 전혈 샘플을 흡출하기 위해 진공 하에서 유지되고, 멸균성이며, 약 8 내지 약 10 ㎖의 유용한 진공을 갖고, 원심분리 수행에 적합하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상처의 치유 또는 뼈 또는 치근막 성장 및/또는 뼈 및/또는 조직 재생의 촉진을 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 트롬빈 혈청의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 노화 방지제 또는 피부 회복제, 예를 들어 흉터 회복제, 주름 충전 및/또는 회복제로서 사용하기 위한 화장품 제제의 제조를 위한 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 트롬빈 혈청의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 화장품 제제, 미용 제제, 노화 관리, 부피 보정제, 주름 느낌, 갈색 반점 감소 및/또는 모발 자극제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 트롬빈 혈청을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물을 눈, 입술, 눈꺼풀, 얼굴, 목, 가슴, 두피, 모발, 손 및 신체의 모든 나머지 부분 및/또는 남성 및 여성 생식기에 적용한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 인대 및/또는 연골 재건에 사용하기 위한 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 본 발명에 따른 상처 치유 조성물 또는 조직 치유 조성물 또는 트롬빈 혈청을 제공한다. 유리하게는, 본 발명의 조성물을 사용하는 인대 및/또는 연골 재건 시간은 공지된 방법들에 비해 인자 2 또는 3에 의해 분류된다.
하나의 실시태양에서, 상기 화장품 제제 및/또는 미용 제제를 화장제, 화장용 크림 또는 화장용 마스크와 배합한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 트롬빈 혈청 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 트롬빈 혈청 및 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 히아루론산과 임의로 배합된 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 치유 조성물을 포함하는 침투성 코어, 및
b) 임의로 상기 코어를 둘러싸는 외부 재킷(상기 재킷은 생체 적합성 물질, 바람직하게는 체내 생분해성, 바람직하게는 히아루론산을 포함한다)
을 포함하는, 조직 재생 요법에 사용하기 위한 이식 가능한 장치를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 튜브를 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 혈소판 농축물 제조용 튜브 및/또는 본 발명에 따른 트롬빈 혈청 제조용 튜브를 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 트롬빈 혈청의 제조를 위한 하나 이상의 튜브를 포함하는 키트를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 키트는 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 트롬빈 혈청의 제조를 위한 하나 이상의 튜브를 추가로 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 키트는 상처 또는 조직 치유제, 및 상기 상처에 본 발명에 따른 혈소판 농축 조성물 또는 혈소판 풍부 혈장 조성물 또는 지혈제 또는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 트롬빈 혈청을 동시에 분배하기 위한 적용기 장치(예를 들어 이중 주사기)의 제조를 위한 사혈 부속품을 추가로 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 키트는 조직 재생에 적합하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 상처 치유 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 제공하고,
b) 상처, 손상된 조직 또는 손상된 뼈에 치료 유효량의 상기 상처 또는 조직 치유제 또는 지혈제를 적용함
을 포함하는, 인간 또는 동물의 상처 또는 조직에서 상처 치유 또는 조직 치유 및/또는 봉합 및/또는 조직 및/또는 뼈 재생을 촉진하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 상처 치유 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 제공하고,
b) 상처, 손상된 조직 또는 손상된 뼈에 치료 유효량의 상기 상처 또는 조직 치유제 또는 지혈제를 적용함
을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 제공하고,
b) 상처 또는 조직 또는 치주 결함 및 공동에 치료 유효량의 상기 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 적용하고,
c) 임의로 치주 차단층을 삽입하고,
d) 상기 상처 또는 조직을 폐쇄함
을 포함하는, 치주 질환 또는 치주 재생을 필요로 하는 다른 병이 있는 포유동물의 상처 또는 치주 결함에서 치주 재생을 유도하기 위한 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 차단층을 잇몸 조직과 상기 단계 a) 및 b)에 따라 치료된 상처 또는 조직 사이에 배치한다. 하나의 실시태양에서, 상기 차단층을 막, 생분해성 중합체 및/또는 생체적합성 다공성 물질 중에서 선택한다.
상기 막을, PRP 및 10% 칼슘 글루코네이트를 각각 30 대 70 또는 50:50의 비율로 배합함으로써 수득할 수 있다. 원심분리를 대략 30 분 동안 수행한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 제공하고,
b) 피부 흉터 또는 주름살에 상기 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 충전함
을 포함하는, 인간 또는 동물의 흉터 또는 주름에서 피부 재생을 촉진하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 전혈을 본 발명에 따른 튜브에서 원심분리하고,
b) 전체 혈장으로부터 농축된 혈소판 풍부 혈장을 임의로 분리시키고,
c) 상기 농축된 혈장을 재-현탁하고,
d) 세포 추출물, 예를 들어 피부 세포, 예를 들어 각질세포, 섬유아세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 골수 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 골막 여과 세포; 각막 세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포, 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포의 추출물을 제공하고,
e) 단계 c)에서 수득한 혈소판 농축물을 d)에서 수득한 세포 추출물과 혼합하는
단계들을 포함하는, 세포 조성물의 제조 공정을 제공한다.
바람직하게는, 상기 원심분리 단계를 약 1500 g 내지 약 2000 g의 힘에서 수행한다. 바람직하게는, 상기 원심분리 단계를 혈소판, 림프구 및 단핵구를 함유하는 혈장과 적혈구를 함유하는 펠릿 사이에 차단층을 형성하기에 충분한 시간 동안 수행한다.
바람직하게는, 상기 분리 단계 b)를 상기 차단층의 상부로부터 상등액을 수집함으로써 수행한다. 하나의 실시태양에서, 상기 농축된 혈소판 풍부 혈장을, 혈소판 부족 혈장을 함유하는 상등액의 절반을 제거함으로써 전체 혈장으로부터 분리시킨다. 바람직하게는, 상기 농축된 혈장은 고유 전혈에 비해 백혈구, 혈소판 및 부착 단백질(예를 들어 피브로넥틴)이 풍부하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 전혈을 본 발명에 따른 튜브 또는 분리기 튜브에서 원심분리하고,
b) 전체 혈장으로부터 농축된 혈소판 풍부 혈장을 임의로 분리시키고,
c) 상기 농축된 혈장을 재-현탁하고,
d) 단계 c)에서 수득한 혈소판 농축물을 응고 활성제, 트롬빈 혈청, 자기조직 트롬빈 혈청 또는 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈 혈청과 혼합하고,
e) 세포 추출물, 예를 들어 피부 세포, 예를 들어 각질세포, 섬유아세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 골수 세포, 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 골막 여과 세포; 각막 세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포, 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포의 추출물을 제공하고,
f) 단계 d)에서 수득한 혈소판 농축물을 e)에서 수득한 세포 추출물과 혼합하는
단계들을 포함하는, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 공정을 제공한다.
바람직하게는, 상기 원심분리 단계를 약 1500 g 내지 약 2000 g의 힘에서 수행한다. 바람직하게는, 상기 원심분리 단계를 혈소판, 림프구 및 단핵구를 함유하는 혈장과 적혈구를 함유하는 펠릿 사이에 차단층을 형성하기에 충분한 시간 동안 수행한다.
바람직하게는, 상기 분리 단계 b)를 상기 차단층의 상부로부터 상등액을 수집함으로써 수행한다. 하나의 실시태양에서, 상기 농축된 혈소판 풍부 혈장을, 혈소판 부족 혈장을 함유하는 상등액의 절반을 제거함으로써 전체 혈장으로부터 분리시킨다. 바람직하게는, 상기 농축된 혈장은 고유 전혈에 비해 백혈구, 혈소판 및 부착 단백질(예를 들어 피브로넥틴)이 풍부하다.
바람직하게는, 상기 응고 활성제 또는 자기조직 트롬빈 혈청이 약 10:1 내지 약 10:3의 부피 비(혈소판 농축물:응고 활성제)로 존재한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 혈장;
b) 300 x 109 세포/L 이상 농도의 혈소판;
c) 7 x 109 세포/L 이상 농도의 백혈구;
d) 3 ㎎/L 이상 농도의 피브리노겐;
e) 세포 추출물, 예를 들어 피부 세포, 예를 들어 각질세포, 섬유아세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 골수 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 골막 여과 세포; 각막 세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포, 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포의 추출물
을 포함하는 본 발명에 따라 제조된 단리된 세포 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 세포는 약 105 내지 약 106 세포/혈장 또는 농축된 혈장의 ㎖의 농도로 존재하며, 적혈구 농도는 0.6 x 1012 세포/L 미만이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
*a) 혈장;
b) 300 x 109 세포/L 이상 농도의 혈소판;
c) 7 x 109 세포/L 이상 농도의 백혈구;
d) 3 ㎎/L 이상 농도의 피브리노겐;
e) 응고 활성제, 트롬빈 혈청, 자기조직 트롬빈 혈청 또는 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈 혈청,
f) 세포 추출물, 예를 들어 피부 세포, 예를 들어 각질세포, 섬유아세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 골수 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골세포; 연골세포; 골막 여과 세포; 각막 세포; 탯줄 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포, 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포의 추출물
을 포함하는 본 발명에 따라 제조된 단리된 세포 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 응고 활성제 또는 자기조직 트롬빈 혈청이 약 10:1 내지 약 10:3의 부피 비(혈소판 농축물:응고 활성제)로 존재한다.
바람직하게는, 상기 세포는 약 105 내지 약 106 세포/혈장 또는 농축된 혈장의 ㎖의 농도로 존재하며, 적혈구 농도는 0.6 x 1012 세포/L 미만이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 세포 조성물을 포함하는 상처 또는 조직 치유 조성물 또는 지혈제를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제 또는 세포 조성물을 제공하고,
b) 상처, 손상된 조직 또는 손상된 연골 또는 손상된 뼈에 치료 유효량의 상기 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제 또는 세포 조성물을 적용함
을 포함하는, 인간 또는 동물에서 조직 및/또는 연골 및/또는 뼈 및/또는 신경의 상처 또는 조직 치유 및/또는 봉합 및/또는 재생을 촉진하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 지방 세포 조성물을 제공하고,
b) PRP 또는 본 발명에 따른 혈장 농축물과 함께 치료 또는 화장품학적 유효량의 상기 지방 세포 조성물을 피부 지방 이식편 또는 지방 조직 재생을 필요로 하는 상기 지방 조직에 적용하고,
c) 외과용 플랩 또는 이식물을 임의로 삽입함(여기에서 상기 외과용 플랩 또는 이식물을 재생 또는 부피 확대가 필요한 부위에 배치하며, 상기 외과용 플랩 또는 이식물은 본 발명에 따른 지방 세포 제제 및 PRP, 혈장 농축물 또는 농축된 혈장 물질의 조합을 포함한다)
을 포함하는, 피부 지방 이식편 또는 지방조직 재생이 필요한 다른 병이 있는 포유동물에게서 지방조직 부피를 증가시키는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 근육 세포 또는 골수 세포 조성물을 제공하고,
b) 재생을 필요로 하는 심근 조직에 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 치료 유효량의 상기 근육 세포 조성물을 적용함
을 포함하는, 심근 결함 또는 심근 재생 조직 재생을 필요로 하는 다른 병이 있는 포유동물에게서 심근 재생을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 각막 세포 조성물을 제공하고,
b) 재생을 필요로 하는 각막 조직에 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 치료 유효량의 상기 각막 세포 조성물을 적용함
을 포함하는, 각막 결함 또는 각막 재생을 필요로 하는 다른 병이 있는 포유동물에게서 각막 재생을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 연골 세포 또는 골수 세포 조성물을 제공하고,
b) 재생을 필요로 하는 관절 또는 연골 조직에 PRP 또는 본 발명에 따른 혈장 농축물과 함께 치료 유효량의 상기 연골 세포 조성물을 적용하고,
c) 외과용 플랩 또는 이식물을 임의로 삽입함(여기에서 상기 외과용 플랩 또는 이식물을 연골의 결함에 또는 골막 패치 아래에 배치하며, 상기 외과용 플랩 또는 이식물은 본 발명에 따른 연골세포 또는 골수 세포 조성물 및 PRP, 혈장 농축물 또는 농축된 혈장 물질을 포함한다)
을 포함하는, 관절 또는 연골 결함 또는 관절 또는 연골 조직 재생이 필요한 다른 병이 있는 포유동물에게서 관절 또는 연골 재생을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제 또는 세포 조성물을 제공하고,
b) 피부 흉터, 주름살 또는 지방 결핍부분을 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 상기 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제 또는 세포 조성물로 충전함
을 포함하는, 인간 또는 이보다 하등동물로부터 흉터, 주름 또는 지방 결핍부분에서 피부 재생을 촉진하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 슈반 세포 조성물을 제공하고,
b) 재생을 필요로 하는 말초 신경에 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 치료 유효량의 상기 슈반 세포 조성물을 적용함
을 포함하는, 말초 신경 손상, 신경 봉합 또는 척수 손상, 또는 말초 신경 재생이 필요한 다른 병이 있는 포유동물에게서 말초 신경 재생을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 골수 세포 또는 조골세포 조성물을 제공하고,
b) 재생을 필요로 하는 뼈에 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 치료 유효량의 상기 골수 세포 또는 조골세포 조성물을 적용함
을 포함하는, 뼈 손상, 뼈 결함, 또는 뼈 재생이 필요한 다른 병이 있는 포유동물에게서 뼈 재생을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 췌장 섬 세포 조성물을 제공하고,
b) 환자에게, 예를 들어 주사에 의해 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 치료 유효량의 상기 췌장 섬 세포 조성물을 적용함
을 포함하는, 포유동물에게서 I형 당뇨병, 인슐린 의존성 당뇨병 또는 고혈당증을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 근원 세포 조성물을 제공하고,
b) 재생을 필요로 하는 방광경부에 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 치료 유효량의 상기 근원세포 조성물을 적용함
을 포함하는, 요실금 또는 방광 재생이 필요한 다른 병이 있는 포유동물의 치료 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 근원세포 조성물을 제공하고,
b) 재생을 필요로 하는 항문 주변 영역에 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 치료 유효량의 상기 근원세포 조성물을 적용함
을 포함하는, 변실금 또는 항문근육 재생이 필요한 다른 병이 있는 포유동물의 치료 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 근원 세포 조성물을 제공하고,
b) 재생을 필요로 하는 식도 괄약근에 본 발명에 따른 PRP 또는 혈장 농축물과 함께 치료 유효량의 상기 근원 세포 조성물을 적용함
을 포함하는, 역류성 식도염 또는 위-식도 역류 장애 또는 식도 괄약근 재생이 필요한 다른 병이 있는 포유동물의 치료 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상처 또는 조직, 메조테라피, 근육 내 치유, 또는 뼈 또는 치근막 성장 및/또는 뼈 및/또는 조직 재생, 예를 들어 피부, 연골, 근육, 힘줄, 지방조직, 각막, 말초 신경, 척수 또는 골 재생을 촉진하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 노화방지제 또는 피부 회복제, 예를 들어 흉터 회복제, 지방위축 회복제 또는 주름 충전 및/또는 회복제로서 사용하기 위한 화장품 제제의 제조를 위한 본 발명에 따른 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
*또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제 및 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 임의로 히아루론산과 함께 본 발명에 따른 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 상처 제제를 포함하는 침투성 코어, 및
b) 상기 코어를 둘러싸는 외부 재킷(상기 재킷은 생체 적합성 물질, 바람직하게는 체내 생분해성, 바람직하게는 히아루론산을 포함한다)
을 포함하는, 조직 재생 요법에 사용하기 위한 이식 가능한 장치를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 조성물, 상처 또는 치유 조성물, 세포 추출물, 세포 조성물, 혈장 농축물 및 트롬빈 제제는 동종이계 물질, 조성물, 혈액 또는 세포를 사용한다.
본 발명에 따른 용도, 방법 및 조성물은 조직, 뼈 및/또는 연골의 재생 및/또는 회춘에 유용하다. 본 발명에 다른 용도, 방법 및 조성물은 당뇨성 신경병성 궤양 또는 욕창; 뼈 및 연골 손상, 예를 들어 심부 관절 연골 또는 연골 손상, 예를 들어 단열된 힘줄의 수술 치료; 외상 또는 노화에 의해 유발된 관절의 관절염; 회전 근개 장애; 치유되지 않는 상처, 예를 들어 보다 하등의 말 다리에서 혈관염 유발된 상처와 같은 치유되지 않는 상처; 치주 질병; 이식 수술; 심혈관, 가슴, 이식, 두경부, 구강, 위장, 정형외과, 신경외과, 및 성형외과; 메조테라피 및/또는 메조테라피 주사; 심근 손상, 예를 들어 만성 심장 장애, 심부전, 허혈성 및 비-허혈성 질환, 심근병증; 위-식도 역류 질병; 변 또는 요실금; 안면 수술, 예를 들어 안면 수술 유발된 탈모증(구레나룻 영역의 모낭 손실에 기인한 탈모증), 모발 손실, 탈모증, 주름 제거 수술(주름살 절제술), 융비술, 피부 지방 이식(안면 확대, 선천적인 안면편측 위축증, 예를 들어 선천적인 연골 코 위축 및 지방위축증, 예를 들어 HIV/AIDS를 앓고 있는 환자에게서, 생식기 기능장애, 미란 및 관절경검사의 치료에서); 상처 치유 합병증, 예를 들어 안검 미용 성형 수술; 각막 질환, 예를 들어 각막 불투명, 예를 들어 화학적 화상에 의해 유발된 것, 스티븐 존슨 증후군에 의한 병 및 각막 궤양; 각막의 흉터; 안구 건조 증후군; 혈액 질병, 예를 들어 지중해 빈혈; 말초 신경 손상, 신경 봉합 및 척수 손상; 뼈 결함 또는 질환, 예를 들어 뼈 이식 또는 골절, 피부 손상 또는 질환, 예를 들어 여드름(특히 박피술 치료 후), 화상, 풍진 또는 곰보, 백반증, 지방위축증, 카포시 육종, 피부 스켈로이드 또는 뒤피트랑 손바닥 섬유종증의 치료에 특히 유용하다.
본 발명의 용도, 방법 및 조성물은 뼈 재생 및 회복, 유사분열 유도, 혈관형성 및/또는 대식세포 활성화를 포함한 조직 치유에 유용하다.
본 발명의 추가적인 이점 및 신규의 특징은 하기의 설명에 부분적으로 열거될 것이며, 부분적으로 하기 명세서의 검토 시 당해 분야의 숙련가들에게 자명하거나 본 발명의 실시에 의해 알 수 있게 될 것이다. 본 발명의 목적 및 이점은 첨부된 청구의 범위에서 특별히 지적한 수단, 조합, 조성물, 및 방법에 의해 실현되고 획득될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물, 용도 및 방법은 지혈, 조직의 재생, 활력 부여, 수화 및/또는 자극에, 생물학적 접착제, 바이오접착성 봉합제 또는 생물학적 필터로서 특히 유용하다.
유리하게는, 본 발명의 강한 생물학적 접착제는, 특히 모든 침습성 수술적 중재들에 대해서 다른 공지된 것들보다 더 높은 역학적 강도를 갖는다. 본 발명의 상기와 같은 생물학적 접착제는 적합한 세포, 혈소판, 백혈구, 성장 인자, 및 결과적인 감염을 감소/방지하는 다른 인자들에 의해 손상된 조직을 치유하는 증가된 능력을 갖는다.
본 발명에 따른 조성물, 용도 및 방법은 정형외과용 상처 치유, 수술, 주사, 및 미용, 화장 또는 부피 보정용 주사에 특히 유용하다.
또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 용도, 방법 및 조성물은 피부 조직의 재생 및/또는 회춘에, 특히 피부 재생의 촉진 및/또는 개시, 예를 들어 피부 주름, 깊은 주름, 여드름(특히 박피술 치료 후), 화상, 풍진 또는 곰보, 백반증 및 지방위축증(예를 들어 노화 방지 조성물 및 피부 재생 조성물)의 감소, 코입술선의 개선 및 피부 손상 또는 질환, 예를 들어 피부 화상, 카포시 육종, 피부 스켈로이드 또는 뒤피트랑 손바닥 섬유종증의 치료, 피부 및 조직 재생과 관련된 통증의 감소, 치질 쿠션, 발기 부전, 해면체, 해면체 섬유증, 라페이로니 병, 질 및/또는 음순의 치료에 유용하다.
본 발명에 따른 조성물, 용도 및 방법은 무릎, 팔꿈치, (단열된) 근육, 척추, 척추 디스크, 힘줄, 인대의 상처 또는 조직 치유, 재생 치료 또는 스포츠용 약품, 외상 또는 수술 상처, 예를 들어 천연 또는 인공 이식편(또한 이식편 공여 부위를 포함하여, 특히 피부, 뼈 이식편 및/또는 치과 보철 또는 이식물 등)의 정합 및/또는 유지 및/또는 봉합에서의 치료; 관절염, 무릎관절염, 건염, 회전 근개의 치료, 혈관염의 치료; 궤양, 예를 들어 당뇨성 신경병성 궤양 또는 욕창; 방사선피부염(예를 들어 상피 피부 암종상에 조사 후) 및 폐쇄 누공(예를 들어 사이클리스트의 경우)의 치료에 특히 유용하다.
더욱이, 본 발명에 따른 조성물, 용도 및 방법은 심장 질환, 심장 재생의 치료, 예를 들어 심부전, 만성 심부전, 허혈성 및 비-허혈성 심부전 및 심근병증의 치료에 특히 유용하다.
더욱이, 본 발명에 따른 조성물, 용도 및 방법은 요 및/또는 변 실금의 치료에 특히 유용하다.
더욱이, 본 발명에 따른 조성물, 용도 및 방법은 역류성 식도염 및/또는 위-식도 역류성 질환의 치료에 특히 유용하다.
더욱이, 본 발명에 따른 조성물, 용도 및 방법은 피부 손상, 예를 들어 방사선에 의해 손상된 피부(방사선 피부염 또는 일광 손상된 피부), 노화된 피부 또는 화상 피부의 치료 및/또는 안면 주름, 굵은 주름, 여드름(특히 박피술 치료 후), 화상, 풍진 또는 곰보, 지방 위축증 또는 지방 이상증, 카포시 육종, 피부 스켈로이드 또는 뒤피트랑 손바닥 섬유종증의 개선 및/또는 피부 회춘 치료에 특히 유용하다.
더욱이, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법은 HIV/AIDS 환자 및 다른 선천적인 안면 편측위축, 예를 들어 선천적인 연골 코 위축에서와 같은 지방위축증의 치료에 특히 유용하다. 더욱이, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법은 뼈, 연골 및 관절 질환, 예를 들어 연골 손상, 관절염, 연골 및/또는 뼈 손상, 예를 들어 심부 연골 손상 및/또는 미란 및/또는 관절경검사, 힘줄 파열 및 어깨의 회전 근개의 치료에 특히 유용하다.
더욱이, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법은 혈액 질병, 예를 들어 지중해 빈혈의 치료에 특히 유용하다.
더욱이, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법은 각막 질환, 예를 들어 안구 건조 증후군; 각막 불투명, 예를 들어 화학적 화상에 의해 유발된 것, 스티븐 존슨 증후군에 의한 병; 각막의 흉터 및 각막 궤양의 치료에 특히 유용하다.
더욱이, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법은 말초 신경 손상, 신경 봉합 및 척수 손상의 치료에 특히 유용하다.
더욱이, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법은 I형 당뇨병, 인슐린-의존성 당뇨병 및/또는 고혈당증의 치료에 특히 유용하다.
*더욱이, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법은 뼈 결함 또는 질환, 예를 들어 뼈 이식 또는 골절의 치료에 특히 유용하다.
본 발명의 생성 조성물의 용도를 치료 목적에 따라 적용 전에 추가로 변경할 수도 있다.
본 발명의 조성물을 골 충전 물질, 특히 재흡수성 충전 물질, 예를 들어 하이드록시아파타이트(생물물질로서 사용되는 칼슘 포스페이트 세라믹) 또는 탈무기질화된 뼈와 함께 사용하거나, 또는 예를 들어 두개 안면 및 정형외과 시술에서 뼈의 재성장 과정에 뼈 추출물과의 혼합물로서 사용할 수 있다.
상기 용도 또는 질병에 따라, 본 발명의 조성물을 10% 히아루론산, 20% 히아루론산, 30% 히아루론산, 40% 히아루론산 및/또는 50% 히아루론산과 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을, 예를 들어 (신생)혈관형성 고속화를 포함하여, 조직 재생을 촉진하기 위한 종양학에서, 화상 이식 및 다른 자유 피부 이식 용도를 포함한 성형술에 상처 봉합제로서 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 피부 이식편 공여 부위의 상처 치유 치료에 특히 유용하다. 건강한 피부 상의 피부 이식편의 제거는 공여자의 부위에 새로운 상처를 생성시키며, 이는 12 내지 14일 사이에 자발적으로 치유된다. 그러나, 이러한 상처 아물기는, 특히 상기 공여 부위가 넓거나 또는 사람이 덜 내성인 경우(예를 들어 화상 피해자, 다수의 외상으로 고통받는 사람들, 코르티코이드로 치료된 사람들, 어린이나 노인) 몸이 대단히 힘들며, 심지어 새로운 상처로부터 체액 손실에 의해 유발된 무기질, 미량 원소 및 단백질의 손실에 의해 에너지 손실이 증가한다. 또한, 처음 8일간의 현저한 통증이 종종 상기 이식편 공여 부위 상에 존재한다. 통증 감소 치료, 예를 들어 진통제(예를 들어 몰핀) 및/또는 하이드로셀룰라 상처 드레싱재가 종종 사용되지만, 통증은 특히 이식편 제거 후 48 시간 내지 1 주일 이내에 피할 수 없이 발생하는 상기 드레싱의 교환 중에 여전히 존재한다. 또한, 상기 하이드로셀룰라 상처 드레싱재는 다소 비쌀뿐만 아니라 상기 상처 위에 습기를 유지시켜 상기 상처의 건조를 막고, 상기 상처 깊이를 증가시키고, 세균 감염의 돌발을 촉진하고 심미적이지 않은 흉터에 이르게 한다는 단점들을 갖는다. 따라서, 상기 피부 이식편 공여 부위 치유의 자극이 매우 바람직하다.
본 발명의 조성물은 상처 치유 캐스케이드를 촉진하기에 충분한 혈액 순환이 부족할 수 있는 만성적인 상처에 특히 적합하다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법을 또한 치주 조직의 상실 및/또는 손상이 관찰되는 치주 질환의 치료, 예를 들어 치주 조직 재생이 필요한 인간 또는 하등 동물의 치주 부위 또는 공동에 본 발명에 따른 조성물을 배치함을 포함하는 치료에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 상기 용도에서 수술 후 출혈 및 장액 또는 다른 체액의 혈관 밖 유출 또는 손실을 제거하거나 크게 감소시키고, 대부분의 세균에 의해 유발된 감염 위험성을 감소시키기에 유효하고/하거나 자연 치유(즉 외부 작용제가 첨가되지 않음) 또는 공지된 방법으로 제조된 다른 혈소판 농축물의 사용을 통해 획득되는 치유에 비해 결합 조직 형성을 향상시킨다. 본 발명에 따른 조성물은 상처 치유 및/또는 조직 재생의 촉진 및/또는 개시를 위한 약제의 제조, 또는 피부 재생, 예를 들어 피부 주름, 여드름(특히 박피술 치료 후), 풍진 또는 곰보, 백반증 및 지방 위축증용 화장품 조성물(예를 들어 노화 방지 조성물 및 피부 재생 조성물)의 제조에 특히 유용하다.
본 발명의 조성물을 국소로 투여하거나 또는 상처 또는 이식된 기관 또는 그 부근에 주사하거나 피하 주사할 수 있다. 국소 투여는 상처나 결함 부위에의 주사에 의해 또는 상기 부위에 고체 담체의 삽입 또는 부착에 의해 또는 크림이나 유화액과의 혼합물에 의해, 또는 티슈 또는 종이 또는 하이드로젤 담체 중에 포함시켜, 또는 본 발명 조성물의 직접적인 국소 적용에 의해, 예를 들어 점안약의 형태로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 쉽게 주사 가능한 조성물이다. 투여 방식, 단일 또는 수회 용량으로서 개인에게 투여되는 투여량은 다양한 인자들, 예를 들어 약동학적 성질, 환자 조건 및 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 동반되는 치료, 치료 회수 및 목적하는 효과에 따라 변할 것이다.
본 발명의 조성물을 조직 재생의 치료에 유용한 공동-작용제, 예를 들어 치유제, 주름 충전제, 노화 방지제, 예를 들어 노화 방지 비타민 복합체, 항균제, 항생제, 코르티코스테로이드제, 진통제, 또는 아드레날린과 같은 마취제 등과 함께 투여할 수도 있다. 본 발명은 상처 치유, 뼈 및 치근막 성장 회복과 같은 조직 재생 요법에 동시에, 별도로 또는 연속적으로 사용하기 위한 조직 재생 치료에 유용한 공동-작용제와 배합된 조성물을 포함한다.
본 발명의 조성물, 본 발명의 자기조직 혈소판 농축물 또는 세포 조성물의 제조를 위한 장치 및 과정이 치료용으로, 특히 예를 들어 치과 이식학, 피부 및 뼈 수술, 연골 및 힘줄 수술, 각막 및 말초 신경 재생 및 심장 수술에서 조직 재생의 생리학적 과정을 촉진하고자 하는 지혈 시스템에 자기조직 생물학적 접착제로서 특히 유용하다. 본 발명의 조성물, 본 발명의 자기조직 혈소판 농축물 및 세포 조성물의 제조를 위한 장치 및 과정은 화장품 용으로, 특히 예를 들어 주름, 흉터 또는 지방 결핍 충전제로서, 단독으로 또는 하나 이상의 노화 방지제와 함께 사용하고자 하는 자기조직 회춘 물질로서 유용하다.
본 발명의 혈소판 농축물을 자기조직 세포 추출물 제제, 예를 들어 각질세포, 골수 세포, 조골세포, 연골세포, 섬유아세포, 골막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 골수 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 골막 여과 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 각막 세포; 탯줄 세포; 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포와 배합할 수도 있다. 각질세포를 문헌[Reinwald and Green, 1975, Cell, 6(3):331-43]에 개시된 방법을 통해 수확할 수 있다. 다른 언급된 세포들을 문헌["Culture de cellules animales; methologies-applications", 2003, Ed. Barlovatz-Meimom and Adolphe, INSERM editions, Paris]에 개시된 방법을 통해 수확할 수 있다. 한편으로, 세포 추출물은 세포 은행 또는 세포 배양물로부터 유래하거나 또는 하기 실시예에 개시된 바와 같이 수확된다.
본 발명의 혈소판 농축물 및 세포 조성물은 상처, 심지어 만성의 치유되지 않는 상처의 치유 과정을 가속화 및/또는 촉진하여, 수 주일의 통상적인 요법이 실패한 경우 성공적인 폐쇄에 이르게 하고 감염 위험성을 감소시키고, 환자의 회복 및 편안함을 개선시키고 의료 비용을 감소시키고 보다 양호한 심미적인 최종 결과를 성취하는데 진정으로 이로운 것으로 입증되었다.
본 발명의 조성물을 물론 다수의 확인된 공여자들로부터 유래한 혈장으로부터도 또한 제조할 수 있다. 본 발명은 자기조직 생물 물질, 예를 들어 상처입은 자신의 생물 물질로부터의 농축된 혈소판의 수집물로 제한되지 않는다. 본 발명은 하나 이상의 제3자로부터 수득한 생물 물질의 사용을 포함하며, 상기 제3자는 상기와 같은 제3자의 생물 물질의 사용으로부터 생체-부적합성이 생성되지 않는 한, 본 발명에 개시된 상처 치유 조성물로 치료되는 상처가 있는 환자와 동일한 종의 것일 필요는 없다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 혈소판 농축 조성물 또는 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 전혈로부터 혈소판 농축 조성물을 제조하기 위한 장치를 제공한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 원심분리 단계를 약 3 분 내지 약 15 분 중에서 선택된 시간 동안 약 1500 g 내지 약 1700 g에서, 바람직하게는 약 8 분 동안 1500 g에서 수행하는 트롬빈 혈청 및/또는 혈소판 농축 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 튜브가 전혈 도입용 유입구를 갖고, 상기 전혈 샘플을 흡출하도록 되어 있는 진공 하에서 유지되고, 멸균성이고, 8 내지 10 ㎖의 사용 가능한 진공을 가지며, 원심분리를 수행하기에 적합한, 혈소판 농축 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 튜브가 중합체 혼합물 및 3.5 ㎎/㎖의 무수 나트륨 시트레이트에 의해 형성된 고도의 요변성 젤을 함유하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 튜브인, 혈소판 농축 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 실시태양에서 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로부터 수득할 수 있는 단리된 혈소판 농축 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은
a) 혈장;
b) 300 x 109 세포/L 이상, 바람직하게는 350 x 109 세포/L 이상, 보다 바람직하게는 400 x 109 세포/L 이상 농도의 혈소판;
c) 7 x 109 세포/L 이상, 바람직하게는 8 x 109 세포/L 이상 농도의 백혈구;
d) 3 ㎎/L 이상 농도의 피브리노겐
을 포함하는, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 단리된 혈소판 농축물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 적혈구 농도는 0.4 x 1012 세포/L 또는 0.5 x 1012 세포/L 미만이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은
a) 혈장;
b) 300 x 109 세포/L 이상, 바람직하게는 350 x 109 세포/L 이상, 보다 바람직하게는 400 x 109 세포/L 이상 농도의 혈소판;
c) 7 x 109 세포/L 이상, 바람직하게는 8 x 109 세포/L 이상 농도의 백혈구;
d) 3 ㎎/L 이상 농도의 피브리노겐,
e) 본 발명에 따른 트롬빈 혈청, 및
f) 임의로 자기조직 세포 추출물, 예를 들어 각질세포, 골수 세포, 섬유아세포, 골막 세포, 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 골수 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성세포; 조골 세포; 연골 세포; 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 각막 세포; 탯줄 세포; 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포의 추출물
을 포함하는 상처 또는 조직 치유 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 응고 활성제 또는 트롬빈 혈청은 약 10:1 내지 약 10:3의 부피 비(혈소판 농축물:응고 활성제)로 존재한다.
바람직하게는, 상기 세포는 혈장 또는 농축된 혈장의 약 105 내지 약 106 세포/㎖의 농도이고 상기 적혈구 농축물은 0.4 x 1012 세포/L 또는 0.5 x 1012 세포/L 미만이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 응고 활성제가 칼슘 글루코네이트 또는 10% 염화 칼슘과 혼합된 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 혈소판 농축물(PRP)과 혼합된 응고 활성제가 트롬빈 농축된 제제이고, 이를 칼슘 글루코네이트 또는 염화 칼슘과 추가로 배합할 수도 있는 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법을 제공한다. 생물학적 접착제에 사용하기 위한 트롬빈의 제조 방법은, 8 내지 20% ETOH를 일정 부피의 혈장에 첨가함에 의한 것이며 US 6,472,162에 개시되어 있고, 상기 제제를 본 발명과 관련하여 트롬빈 농축된 제제로서 사용할 수도 있다. 한편으로, 자기조직 트롬빈 혈청(ATS)을 본 발명과 관련하여 트롬빈 농축된 제제로서 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 또 다른 자기조직 트롬빈 혈청을 (i) 본 발명의 분리기 튜브에 수집한 환자의 전혈 샘플(예를 들어 8 ㎖)에 10% 염화 칼슘의 최종 부피의 10%(예를 들어 1 ㎖) 및 95% v. 에탄올 용액 제제의 최종 부피의 10%(예를 들어 1 ㎖)을 첨가하고 (ii) 실온에서 약 30 분간 침전시킴을 포함하는 방법에 의해 수득한다. 30 분 후에, 약 8 내지 10 분 동안 약 1500 g에서 원심분리를 수행한다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 트롬빈 농축된 제제 및 바람직하게는 자기조직 트롬빈 혈청을 상처 위에서 직접 혈소판 농축물(PRP)과 혼합한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 단계 b)에서 수득한 활성화된 혈소판-풍부 제제 조성물(혈소판 농축물을 응고 활성제 또는 자기조직 트롬빈 혈청과 혼합하여 수득됨)을, 자기조직 세포외 기질의 재조성을 기다리는 동안 예를 들어 공동 또는 조직 결함을 충전시키기에 또는 성장 기질("골격")로서 적합한 장치에 의해 조작될 수 있는 반-고형 젤을 수득하기 위해서, 드레싱재의 미세한 줄에 의한 오염을 피하기 위해 유연한 소수성 층으로 덮인 상처 드레싱재의 접촉에 의해 부분적으로 탈수시킬 수도 있는 단계 b')를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 수득된 상처 또는 조직 치유제는 상처, 조직 또는 치주 결함 또는 공동에서 치주 재생을 유도하는 방법에 특히 유용하다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명에 따른 혈소판 농축물, 상처 또는 조직 치유 조성물, 세포 조성물을 100% 알부민의 알부젤(Albugel)(EP1543846) 제제와 같은 하이드로젤, 또는 알부민 및 폴리에틸렌 글리콜 또는 임의의 다른 성분과 같은 다른 화학적 화합물의 망상화로부터 생성되는 임의의 다른 하이드로젤과 배합하여, 종이 기재의 고도로 친수성인 담체를 사용하여 혈소판 풍부 혈장이 흡수될 때까지 피부와 접촉하게 둔다.
본 발명의 상처 또는 조직 치유 조성물의 인장 강도는 칼슘 이온의 첨가에 의해 영향을 받을 수 있다. 결과적으로, 보다 강한 상처 또는 조직 치유 조성물을 목적하는 경우, 보다 많은 칼슘 이온을, 상기 혈청을 혈소판 농축물과 혼합하는 시기에 첨가할 수 있다. 한편으로, 칼슘 이온을 상기 혈소판 농축물에 직접 도입시킬 수 있으며, 상기 상처 또는 조직 치유 조성물이 각각 혈성될 것이다.
하기에 추가로 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 상처 또는 조직 치유 조성물의 형성에 필요한 시간은 첨가되는 혈청의 양에 따라 변한다. 1:4, 1:2 및 3:4의 혈청 대 혈소판 농축물의 비는 각각 대략 90, 55 및 30 초 안에 상기 상처 또는 조직 치유 조성물을 형성시킨다. 더욱 또한, 트롬빈을 바람직하게는 5 시간의 제조 시간 이내에, 바람직하게는 2 시간 이내에, 이상적으로는 바로 사용한다. 트롬빈은 실온에서 10일 후에도 여전히 활성이므로, 트롬빈을 나중 단계에 사용할 수도 있다. 한편으로, 상기 혈청을 무기한으로 냉장 또는 동결할 수 있으며, 바람직하게는 보관 1 개월 이전에 사용할 수 있다.
본 발명의 상처 또는 치유 조성물을, 일단 상기가 젤화되기 시작했으면 적합한 양의 혈소판 농축물을 수술 상처에 적용함으로써 상기 상처의 봉합에 사용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 상처 또는 조직 치유 조성물을 상기 상처 또는 조직 치유 조성물을 수용하는 환자로부터 유래한 혈액 성분으로부터만 제조할 수 있다는 사실에 기인하여, 상기 환자에게 새로운 혈액 전염 질병이 도입될 확률은 없다.
본 발명의 방법을, 형성되는 상처 또는 조직 치유 조성물이 지혈제로서 뿐만 아니라 상처 치유에 대한 보조제로서 및 다른 생물 활성을 갖는 약물 및 단백질의 전달을 위한 기질로서 작용하도록 추가로 변경시킬 수도 있다. 예를 들어, 피브린 접착제는 성형 수술 또는 큰 뼈 골절의 회복에서와 같이, 뼈 단편들의 결합에 큰 친화성을 가지며, 이는 골 재건에 유용한 것으로 널리 공지되어 있다. 결과적으로, 본 발명의 상처 또는 조직 치유 조성물의 자기조직 성질을 유지하면서, 환자로부터 자기조직 뼈를 분쇄하거나 분말 등으로 만들고 본 발명의 혈소판 농축물에 혼합할 수 있다. 이어서 트롬빈을 포함하는 혈청을, 생성되는 젤을 응결을 원하는 장소에 적용하기에 충분한 양으로 상기 혈소판 농축물 및 뼈 단편과 혼합한다.
본 발명의 목적하는 상처 또는 조직 치유 조성물을 다른 생물 활성을 갖는 약물 및 단백질의 전달 장치로서 추가로 작용하도록 하는 경우에, 본 발명의 방법을 하기와 같이 변경시킬 수 있다. 상기 혈소판 농축물에 트롬빈을 포함하는 혈청을 첨가하기 전에, 다른 생물 활성을 갖는 광범위하게 다양한 약물 또는 단백질을 상기 혈소판 농축물에 첨가할 수 있다. 상기 혈청의 첨가 전에 상기 혈소판 농축물에 첨가되는 작용제의 예로는 비 제한적으로 진통 화합물, 살균 화합물 및 세포생육저지 화합물을 포함한 항균 화합물, 항생제(예를 들어 아드리아마이신, 에리쓰로마이신, 젠티마이신, 페니실린, 토브라마이신), 항진균 화합물, 소염제, 항기생충 화합물, 항바이러스 화합물, 효소, 효소 억제제, 당단백질, 성장 인자, 재조합된 것들(예를 들어 림포카인, 사이토킨), 호르몬, 스테로이드, 글루코코르티코스테로이드, 면역조절제, 면역글로불린, 무기질, 신경이완제, 단백질, 펩타이드, 지단백질, 종양 억제 화합물, 종양정지 화합물, 독소 및 비타민(예를 들어 비타민 A, 비타민 E, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 또는 이들의 유도체)이 있다. 선택된 단편, 부분, 유도체, 또는 상기 중 일부 또는 전부의 동족체를 사용할 수 있음이 또한 고려된다.
다수의 상이한 의료 장치 및 시험 방법이 혈액의 응고 및 응고-관련 활성의 측정을 위해 존재한다. 이러한 장치 및 방법을 사용하여 본 발명의 상처 또는 조직 치유 조성물의 형성에 필요한 활성제, 즉 트롬빈, 혈소판 농축물 및 혈장의 최적 제형화의 결정을 도울 수 있다. 혈액 응고 및 응고의 평가에 더욱 성공적인 기법들 중 일부는 쿠퍼(Cooper) 등의 미국 특허 제 4,599,219 호, 잭슨(Jackson) 등의 제 4,752,449 호, 및 스미스(Smith)의 제 5,174,961 호(이들 특허는 본 발명에 참고로 인용된다)에 의해 예시된 플런저 기법이다.
본 발명의 혈장 농축물, PRP, 조성물을 삼칼슘 포스페이트(TCP), 히아루론산(HA), 키토산, 크림, 크림 마스크, 세포 추출물, 지방 세포, 루브리신, cd-젤라틴 및/또는 보툴리늄 독소와 혼합할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 혈장 농축물 또는 PRP 조성물을 삼칼슘 포스페이트(TCP), 히아루론산(HA), 키토산, 크림, 크림 마스크, 세포 추출물, 지방 세포, 루브리신, cd-젤라틴 및/또는 보툴리늄 독소와 혼합할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 바람직하게는 본 발명의 혈장 농축물 또는 PRP 조성물을 삼칼슘 포스페이트(TCP), 히아루론산(HA), 키토산, 크림, 크림 마스크, 세포 추출물, 지방 세포, 루브리신, cd-젤라틴 및/또는 보툴리늄 독소와 혼합할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 바람직하게는 본 발명의 혈장 농축물 또는 PRP 조성물을 트롬빈, 바람직하게는 본 발명의 트롬빈 혈청과 혼합할 수 있으며, 삼칼슘 포스페이트(TCP), 히아루론산(HA), 키토산, 크림, 크림 마스크, 세포 추출물, 지방 세포, 루브리신, cd-젤라틴 및/또는 보툴리늄 독소와 추가로 혼합할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 바람직하게는 본 발명의 혈장 농축물 또는 PRP 조성물을 트롬빈, 바람직하게는 본 발명의 트롬빈 혈청과 혼합할 수 있으며, 세포 추출물 및 삼칼슘 포스페이트(TCP), 히아루론산(HA), 키토산, 크림, 크림 마스크, 다른 세포 추출물, 지방 세포, 루브리신, cd-젤라틴 및/또는 보툴리늄 독소와 추가로 혼합할 수 있다.
응고 및 응고 관련 활성의 측정 및 검출을 위한 상기 플런저 기법을 사용하는 자동화된 장치는 일반적으로 플런저 센서 카트리지 또는 카트리지들 및 상기 카트리지가 삽입되는 마이크로프로세서 조절된 장치를 포함한다. 상기 장치는 상기 카트리지 및 그 안에 놓인 혈액 샘플에 대해 작용하여 응고 관련 사건을 유발하고 검출한다. 상기 카트리지는 다수의 시험 셀을 포함하며, 이들 셀은 각각 플런저 조립체가 위치하고 분석 시험이 수행되는 상부 반응 챔버, 및 시약 또는 시약들을 함유하는 시약 챔버를 갖는 튜브형 부재에 의해 한정된다. 예를 들어 활성화된 응고 시간(ACT) 시험의 경우, 상기 시약들은 상기 혈액의 응고를 활성화하는 활성화 시약을 포함한다. 플러그 부재는 시약 챔버의 기부를 밀폐시킨다. 시험이 개시되면, 상기 시약 챔버의 내용물이 상기 반응 챔버 내로 강제로 들어가 유체, 대개는 인간 혈액 또는 그의 성분들과 혼합되게 된다. 상기 장치의 일부인 작동기는 상기 플런저 조립체를 들어올리고 낮추며, 이에 의해 상기 플런저 조립체가 상기 반응 챔버 중에서 유체의 풀을 통해 왕복 운동한다. 상기 플런저 조립체는 중력에 의해 하강하고, 상기 반응 챔버 중의 유체의 성질, 예를 들어 점도에 의해 저지된다. 상기 샘플의 성질이 응고 관련 활성의 개시 또는 발생의 결과로서 소정의 방식으로 변하는 경우, 상기 플런저 조립체의 하강속도가 변한다. 상기 하강 속도의 충분한 변화 시, 상기 응고 관련 활성이 검출되며 상기 장치에 의해 지시된다.
본 발명에 개시된 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물, 단리된 세포 조성물, 세포 제제 또는 세포 추출물을 혈소판 농축물(PRP)과 배합할 수 있다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 각질세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 각질세포의 자기조직 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 골격근 세포, 예를 들어 근육 전구 세포 또는 위성 줄기 세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 섬유아세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 지방세포, 지방 전구 세포, 내피 전구 세포, 중간엽 줄기 세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 연골세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 줄기 세포, 예를 들어 탯줄 줄기 세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 힘줄 세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 골막 여과 또는 잇몸 세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 각막 세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 골수세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 조골세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 슈반세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 추출물이 췌장 섬 세포의 추출물인 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 또는 세포 제제의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명의 단리된 혈소판 농축 조성물, 상처 또는 조직 치유 조성물, 트롬빈 농축된 혈청, 세포 추출물, 상처 또는 조직 치유 조성물, 지혈제, 세포 조성물 및/또는 세포 제제는 자기조직이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 칼슘 글루코네이트, 알부민, 키토산, 크림, 루브리신, TCP, ETOH 및/또는 CaCl2를 함유하는 별도의 바이알, 주사기 홀더, 클럼퍼 및/또는 이중 출구가 있는 팁 적용기를 추가로 포함하는, 본 발명에 따른 조직 재생에 적합한 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 자기조직 트롬빈 혈청의 사용은 ETOH, CaCl2와 같은 첨가제가 상처 치유 또는 PRP 제제의 제조에 필요하지 않다는 이점을 갖는다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 단계 d) 또는 e)에서 제공된 세포 추출물을
(A) 본 발명에 따른 혈소판 농축물 중에 상기 세포를 제공하고,
(B) 임의로 상기 세포를 배양하고,
(C) 단계 (B)에서 수득된 배양된 세포를 본 발명에 따른 혈소판 농축물에 재현탁하는
단계들을 포함하는 방법에 의해 수득되는, 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 단계 (A)의 세포 팽창을 본 발명에 따른 혈소판 농축물 중에서, 혈소판 중의 최종 농도가 배양 배지 부피의 약 5% 내지 약 40%를 포함하도록 수행하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 배양 단계 (B)가 예를 들어 세포 배양 표면, 예를 들어 페트리 디쉬 또는 배양 플라스크 상에 상기 세포를 도말하는 하나 이상의 단계를 포함하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 배양 단계 (B) 후에 세포를 수확하는 하나 이상의 추가의 단계를 포함하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 배양 단계 (B)를 37 ℃에서 수행하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 배양 단계 (B)를 산소 또는 공기 및 이산화 탄소를 포함하는 기류 하에서 수행하고, 전형적으로 상기 기류가 95%의 산소 또는 공기 및 5%의 이산화 탄소를 포함하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 배양 단계 (B)를 약 3 내지 약 4 주 동안 지속하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 배양 단계 (B) 동안, 상기 세포 배양 배지를 배양 중에, 전형적으로는 대략 매 3일마다 규칙적으로 교환하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 배양 단계 (B)가 상기 세포를 약 10 분 동안 가시광에, 전형적으로는 약 633 ㎚에서 노출하는 하나 이상의 단계를 포함하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다. 또 다른 태양에서, 상기 가시광에의 노출 단계를 세포 배양 동안 1 주일에 1 회 반복한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 조성물이 각질세포 또는 섬유아세포 조성물이고 상기 세포 배양 단계 (B)가 상기 세포를 약 10 분 동안 가시광에, 전형적으로는 약 633 ㎚에서 노출하는 하나 이상의 단계를 포함하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다. 또 다른 태양에서, 상기 가시광에의 노출 단계를 세포 배양 동안 1 주일에 1 회 반복한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 배양 단계 (B)가, 혈소판의 최종 농도가 배양 배지 부피의 약 5% 내지 약 40% 이도록 본 발명에 따른 희석된 혈소판 농축물의 하나 이상의 첨가 단계를 포함하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 세포 조성물이 각질세포 또는 섬유아세포 조성물이고 상기 세포 배양 단계 (B)가, 혈소판의 최종 농도가 배양 배지 부피의 약 5% 내지 약 40% 이도록 본 발명에 따른 희석된 혈소판 농축물의 하나 이상의 첨가 단계를 포함하는 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로부터 수득할 수 있는 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 지방세포 조성물과 같은 지방 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 근원세포 또는 위성 줄기 세포 조성물과 같은 근육 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 각막 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 연골세포 세포 조성물과 같은 연골 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 섬유아세포 또는 각질세포 조성물과 같은 피부 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 골막 여과 또는 잇몸 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 힘줄 세포 조성물과 같은 힘줄 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 탯줄 줄기 세포 조성물과 같은 줄기 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 골수 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 슈반 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 췌장 섬 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 조골 세포 조성물인 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 세포가 혈장 또는 농축된 혈장의 약 3 x 105 내지 약 106 세포/㎖의 농도로 존재하는 단리된 세포 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은, 인간 또는 하등 동물의 상처에서 상처 또는 조직 밀폐 및/또는 조직 및/또는 뼈 재생을 촉진하기 위한 조성물, 방법 및 용도를 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간의 상처에서 상처 또는 조직 봉합 및/또는 조직 및/또는 뼈 재생을 촉진하기 위한 조성물, 방법 및 용도를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 치주 질병 또는 본 발명에 개시된 바와 같은 다른 병이 있는 포유동물의 상처 또는 치주 결함에서 치주 재생을 유도하기 위한 조성물, 방법 및 용도를 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 치주 질병 또는 다른 병이 있는 포유동물(여기에서 상기 포유동물은 인간이다)의 상처 또는 치주 결함 또는 공동에서 치주 재생을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 상처 또는 치주 결함 또는 공동에서 치주 재생을 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 치료 유효량의 상처 또는 조직 치유 조성물을, 예를 들어 문헌[Garg et al., 2000, Dental Implantology Update, 11(6), 41-44]에 개시된 바와 같이 상기 상처 또는 상기 치주 결함 또는 공동에 반-고형 젤 또는 성장 기질의 형태로 적용한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 흉터 또는 주름의 피부 조직 재생을 촉진하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 심근 재생을 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 본 발명에 따른 상기 치료 유효량의 상기 근육 세포 조성물을 심근, 전형적으로는 좌심실 심근에 혈소판 농축물(PRP)과 함께 주입한다. 주입은 직접 주입 또는 다중 카테터 주입으로서 수행될 수 있다. 근원세포 또는 위성 세포를 본 설명에서 단층으로서, 상피-제거되고 UV 조사된 인간 생물 양막 및 생체복합체 구조상에서 본 설명에 개시된 바와 같이 생체 외 조작할 수 있다. 이어서 상기 양막을 상기 심실 벽 및 근세포의 수축력을 개선시키기 위해서, 하부 조직에 줄기 세포를 다시 이주시키기 위해 허혈성 심장 외막에 합쳐 봉합한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 심근 재생을 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 본 발명에 따른 상기 치료 유효량의 상기 근육 세포 조성물을 혈소판 농축물(PRP)과 병용하여 본 발명에 따른 치료 유효량의 섬유아세포 조성물과 함께 심근에 주입한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 심근 재생을 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 치료 유효량의 본 발명에 따른 상기 근육 세포 조성물을, 바람직하게는 본 발명에 따른 근원세포 및 위성 줄기 세포 조성물 내로 배양된 양막 패치의 형태로 심실 표면상에 혈소판 농축물(PRP)과 함께 적용한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 각막 재생을 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 혈소판 농축물(PRP)과 함께 상기 치료 유효량의 본 발명에 따른 상기 각막 세포 조성물을 바람직하게는 용해성 콘택트 렌즈 상에 펴바르는 양막 패치의 형태로 각막 조직에 적용한다.
상기 상처, 조직 또는 질병의 치료 방법은 본 발명에 개시된 조성물들 중 어느 하나의 용도를 포함할 수 있으며; 상기는 본 발명에 개시된 방법들 중 임의의 방법에 의해 제조된 임의의 조성물의 용도를 또한 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 방법, 장치 및 키트는 실행이 용이하고 현장 적용에 적합한 단일 시행으로 시간-효과적이고 비교적 저렴한 혈소판 농축물 수득 방식을 제공하는 이점을 제공한다. 본 발명의 방법은 혈소판이 고 수율로 농축되어 있을 뿐만 아니라 적혈구 함량도 낮은 농축된 제제를 도출한다는 이점을 제공한다. 본 발명의 조성물은 생체 내에서 후속의 치료학적 용도를 위한 성질을 완벽하게 유지하면서 높은 혈소판 함량, 낮은 적혈구 함량을 갖는다는 이점을 제공한다. 보다 구체적으로, 수일간(또는 30일의 혈소판 수명 동안)의 수준으로 조직 재생에 관련된 주요한 성장 인자(PDGF, TGF-베타, IGF, VEGF 및 EGF)를 방출하는 상기 혈소판의 능력이 유지된다. 또한, 본 발명의 조성물을 자기조직 혈액으로부터 제조하는 만큼, 본 발명에 개시된 발명은 하나 이상의 제3자로부터 획득한 생물 물질로부터 제조된 치료 물질의 사용과 관련된 질병 전염 및 면역반응 위험성이 감소한다. 따라서 본 발명은 조직, 예를 들어 피부, 연골 및 뼈 재생, 특히 상처 치유 및/또는 회춘을 촉진하는, 바람직하게는 자기조직의 개선된 생물학적 상처 치유 및 조직 재생 물질을 제공한다. 본 발명의 이점은 현장 서비스에 적합하고 치유 시간, 관련된 통증 및 의료 비용을 감소시키는 것으로 입증된 개선된 상처 치유 및 조직 재생 물질의 간단하고 신속한 제조 방법을 포함한다. 더욱이, 상기 상처 치유 및 조직 재생 물질은 이식편 거부 위험성을 감소시키고 이식편 성공률을 개선시킨다. 더욱이, 상기 개선된 상처 치유 및 조직 재생 물질은 훨씬 더 양호한 심미적인 최종 외관을 갖는 흉터, 및 흉터 및 주름의 항구적인 충전을 도출한다.
전형적으로, 세포 추출물을 조직 생검으로부터 수득하며, 여기에서 상기 생검은 바람직하게는 혈소판 농축물과의 혼합이 수행되는 날과 같은 날에 수행한다. 상기 생검의 크기는 목적하는 치료 목적과 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조에 사용되는 세포의 유형에 적합하다. 생검의 예는 하기 상이한 유형의 조직에 대한 실시예에 제공된다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 2 개의 부분으로 튜브를 분리하는 하나 이상의 필터를 포함하는 튜브를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하나 이상, 바람직하게는 하나의 필터에 의해 2 개의 부분으로 분리된 튜브를 제공한다.
하나의 실시태양에서 상기 튜브는 유체 샘플의 수집 및/또는 분리에 사용된다.
바람직하게는, 상기 2 개의 부분은 크기 및/또는 직경이 상이하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
i) 크기 및 직경이 상이한 2 개의 별도의 부분,
ii) 상기 2 개의 부분을 분리하는 하나 이상의 필터, 및
iii) 임의로 응고방지제
를 포함하는 유체 샘플의 수집 및 분리를 위한 튜브를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 튜브는 도 1 내지 14에 예시된 바와 같은 특징들로 이루어진다.
바람직한 실시태양에서, 상기 튜브는 환상 올레핀 중합체(COP) 또는 환상 올레핀 공중합체(COC)로 제조된다.
하나의 실시태양에서, 상기 튜브는 응고방지제, 바람직하게는 완충된 나트륨 시트레이트 용액 또는 무수 나트륨 시트레이트를 함유한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 튜브는 0.10 M의 완충된 나트륨 시트레이트 용액 또는 3.5 ㎎/㎖의 무수 나트륨 시트레이트를 함유한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 필터를 상기 튜브에 고정시킨다. 바람직하게는 상기 필터는 연장된 표면을 상기 튜브와 접촉하게 하기 위해서 수직으로 연장된다(상기 튜브의 수직 축 상에 연장된다). 이는 상기 필터의 안정성을 증가시키는 이점을 가지며, 이는 상기 필터의 어떠한 움직임도 방지한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 튜브는 2 개의 층으로 만들어진 필터를 포함한다. 바람직하게는 상기 2 개의 층은 겹쳐 놓인다(하나 위에 다른 하나; 도 4, 도 10 내지 14). 바람직하게는, 외부 층이 상기 튜브와 접촉하기 위해서 수직으로 연장된다(상기 튜브의 수직 축 상에 연장된다 도 2, 3 및 5A). 바람직하게는, 내부 층이 또한 상기 외부 층과 정렬하기 위해서 연장된다. 하나의 실시태양에서, 상기 내부 층은 연장되지 않는다(단지 수평 축 상에 있다). 하나의 실시태양에서, 2, 3, 4 또는 5 개 이상의 필터가 상기 튜브 중에 포함된다.
바람직한 실시태양에서, 상기 튜브의 상부 또는 상단 부분에 배치된 튜브의 제 1 부분은 상기 튜브의 하부 또는 기부 부분에 배치된 제 2 부분보다 더 큰 부피를 갖는다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 필터를 포함하는 상기 튜브의 제 1 부분은 약 9.5 ㎤의 부피를 가지며 상기 튜브의 제 2 부분은 약 3.5 ㎤의 부피를 갖는다(도 5A).
바람직한 실시태양에서, 상기 필터를 포함하는 튜브의 상부 부분에 배치된 튜브의 제 1 부분의 부피는 상기 튜브의 전체 부피의 약 70%를 차지한다. 하나의 실시태양에서, 상기 필터를 포함하는 튜브의 상부 부분에 배치된 튜브의 제 1 부분의 부피는 상기 튜브의 전체 부피의 약 51%, 55%, 60%, 65%, 68%, 70%, 73%, 75%, 80%, 90%, 95% 이상을 차지한다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 튜브의 하부 부분에 배치된 튜브의 제 2 부분의 부피는 상기 튜브의 전체 부피의 약 30%를 차지한다. 하나의 실시태양에서, 상기 튜브의 하부 부분에 배치된 튜브의 제 2 부분의 부피는 상기 튜브의 전체 부피의 약 49%, 45%, 40%, 35%, 32%, 30%, 27%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하를 자치한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 튜브는 약 13 ㎤의 전체 부피를 갖는다(도 5A).
바람직한 실시태양에서, 상기 튜브의 하부 부분 중에 배치된 튜브의 제 2 부분은 상기 튜브의 상부 부분 중에 배치된 튜브의 제 1 부분보다 더 작은 직경을 갖는다. 이는 상기 필터가 원심분리 또는 임의의 다른 기계적 응력 하에서 그의 위치에 머무를 것이라는 이점을 갖는다.
바람직한 실시태양에서, 상기 튜브의 상부 부분 중에 배치된 튜브의 제 1 부분의 외부 직경은 약 15.5 ㎜ 또는 약 15.4 ㎜이다(도 3). 바람직한 실시태양에서, 상기 튜브의 상부 부분 중에 배치된 튜브의 제 1 부분의 내부 직경은 약 13.32 ㎜ 또는 약 13.31 ㎜이다(도 3).
바람직한 실시태양에서, 상기 튜브의 하부 부분 중에 배치된 튜브의 제 2 부분의 외부 직경은 약 13.7 ㎜이다(도 5A). 바람직한 실시태양에서, 상기 튜브의 하부 부분 중에 배치된 튜브의 제 2 부분의 내부 직경은 약 11.6 ㎜이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 2 개의 층으로 제조된 필터는 상기 튜브의 2 개 부분을 분리시킨다. 바람직하게는, 상기 2 개 층은 겹쳐 놓인다(하나 위에 다른 하나; 도 4, 도 10 내지 14).
바람직한 필터를 도 4 및 도 7 내지 14에 도시한다. 바람직하게는, 상기 필터는 내부 층과 외부 층을 포함한다(도 10, 11 및 13).
바람직한 실시태양에서, 상기 필터를 상기 튜브에 고정시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 필터를 상기 튜브에 고정시키지 않는다.
하나의 실시태양에서, 상기 필터는 도 7A, 7B, 8 및 9에 도시된 바와 같이 배치된 구멍이 있는 대칭적인 세트의 열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 필터는 세트당 2 개 열의 4 개의 대칭적인 세트로 이루어지며, 각각의 열은 구멍으로 이루어진다. 상기 튜브의 중심을 향해 배치된 구멍의 첫 번째 열에 대해서, 하나의 구멍의 내부 부분과 또 다른 구멍의 내부 부분간의 거리는 약 5.13 ㎜이다(도 4, 4 항). 상기 튜브의 중심을 향해 배치된 구멍의 첫 번째 열에 대해서, 하나의 구멍의 외부 부분과 또 다른 구멍의 외부 부분간의 거리는 약 5.67 ㎜이다(도 4, 3 항). 상기 튜브의 경계를 향해 배치된 구멍의 두 번째 열에 대해서, 하나의 구멍의 내부 부분과 또 다른 구멍의 내부 부분간의 거리는 약 7.73 ㎜이다(도 4, 2 항). 상기 튜브의 경계를 향해 배치된 구멍의 두 번째 열에 대해서, 하나의 구멍의 외부 부분과 또 다른 구멍의 외부 부분간의 거리는 약 8.27 ㎜이다(도 4, 1 항). 하나의 실시태양에서, 각 구멍의 거리는 약 0.53 또는 0.54 ㎜이다(도 9 및 도 14, 21 항).
바람직하게는 상부 또는 내부 층은 세트당 2 개 열을 갖는 4 개의 대칭적인 세트의 열로 이루어지며(도 9, 13 및 14), 각각의 열은 규칙적으로 배치된 적합한 수의 깔때기로 이루어진다(도 13 및 14). 바람직하게는, 각 깔때기의 기부에 배치된 틈 또는 구멍은 약 0.27 ㎜의 길이를 갖는다(도 14, 26 항). 바람직하게는, 상기 깔때기의 하나의 끝에서부터 다른 끝까지의 거리는 약 1 ㎜이며, 이는 상부 층의 두께에 상응한다(도 14, 24 항). 바람직하게는 상기 상부 층의 두께는 약 1 ㎜이다(도 12, 34 항 및 도 14, 24 항). 상기 깔때기들의 수는 상기 층의 크기에 따라 변할 것이다. 바람직하게는, 상기 깔때기는 그의 기부에 폐쇄된 구멍을 포함한다(도 14의 26 항).
바람직하게는, 상기 하부 또는 외부 층은 세트당 3 개 열을 갖는 4 개의 대칭적인 세트의 열로 이루어지며(도 8, 13 및 14), 각각의 열은 규칙적으로 배치된 적합한 수의 사다리꼴로 이루어진다(도 13 및 14). 상기 사다리꼴의 수는 상기 층의 크기에 따라 변할 것이다. 바람직하게는, 각각의 사다리꼴은 약 0.53 ㎜의 거리로 분리된다(도 14). 각 사다리꼴의 기부는 약 0.77 ㎜의 길이를 갖는다(도 14). 바람직하게는, 각 사다리꼴의 높이는 약 0.5 ㎜이다(도 14). 바람직하게는 상기 하부 층의 두께는 약 1 ㎜이다(도 12 항 및 도 14).
바람직하게는, 상기 상부 및 하부 층의 열들은 항상 서로 엇갈려 있다. 바람직하게는, 상기 하부 층의 사다리꼴의 제1열 다음에 상부 층의 깔때기의 제1열이 있고, 그 다음에 하부 층의 사다리꼴의 제2열 다음에 상부 층의 깔때기의 제2열이 있고, 마지막으로 하부 층의 사다리꼴의 제3열이 있을 것이다(도 4, 13 및 14).
바람직하게는, 상기 상부 층의 각각의 깔때기는 상기 깔때기의 중심의 연장 부분이 대략 하부 층의 2 개의 사다리꼴 사이로 떨어지도록 하는 방식으로 위치한다(도 4, 13 및 14). 보다 바람직하게는, 상기 상부 층의 각각의 깔때기는 상기 깔때기의 중심의 연장 부분이 정확하게 하부 층의 2 개의 사다리꼴 사이로 떨어지도록 하는 방식으로 위치한다(도 4, 13 및 14). 바람직하게는, 사다리꼴은 깔때기와 연속적으로 엇갈려 있다.
본 발명의 튜브를 원심분리하는 경우, 상기 깔때기의 기부의 폐쇄된 구멍(도 14의 26항)은, 2 개의 사다리꼴 사이를 향하고 최종적으로는 상기 튜브의 하부 부분을 향하는 적혈구의 통과를 허용하는 원심력으로 인해 개방된다. 일단 원심분리가 멈추면, 상기 깔때기의 구멍이 폐쇄되어 상기 적혈구가 상기 튜브의 상부 부분으로 역류하는 것을 방해할 것이다. 각각의 깔때기 바로 아래에 위치하는 하부 층의 사다리꼴은 상기 튜브의 하부 부분으로의 적혈구의 통과를 촉진하고 상기 적혈구의 역류를 방지하는 것을 도울 것이다.
바람직하게는, 상기 상부 층의 부피는 약 0.26 ㎤이다. 바람직하게는, 상기 하부 층의 부피는 약 0.29 ㎤이다.
바람직하게는, 상기 상부 층은 폴리프로필렌(PP)으로 제조된다. 바람직하게는, 상기 하부 층은 열가소성 탄성중합체(TPE)로 제조된다. 다른 성분들을 본 발명에 개시되거나 숙련가에 의해 공지된 바와 같이 사용할 수도 있다.
바람직하게는, 상기 필터의 중심은 구부러져 있다(도 4, 10 내지 13). 이는 전혈이 상기 깔때기를 향해 흘러든다는 이점을 갖는다. 바람직하게는, 상기 필터는 상기 튜브의 중심으로부터 하부 층의 기부까지 약 0.5 ㎜의 길이를 갖도록 하는 방식으로 구부러져 있다(도 12, 36 항).
바람직하게는, 상기 하부 층의 높이는 약 8 ㎜이다(도 2 및 도 10, 14 항). 바람직하게는, 상기 하부 층의 외부 직경은 약 12.74 ㎜이다(도 10, 17 항). 바람직하게는, 상기 상부 층의 내부 직경은 약 9.6 ㎜이다(도 10, 16 항). 바람직하게는, 상기 상부 층의 구부러져 있지 않은 상부 표면으로부터 상기 층의 높이는 약 6 ㎜이다(도 10, 9 항). 바람직하게는, 상기 상부 층의 구부러져 있는 상부 표면의 중심으로부터 상기 층의 높이는 약 5.5 ㎜이다(도 10, 11 항).
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 튜브는 오직 깔때기가 있는 필터만을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 깔때기 및/또는 사다리꼴의 수는 다양할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 깔때기 및/또는 사다리꼴의 수는 다양할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 깔때기 및/또는 사다리꼴의 열들의 대칭적인 세트의 수는 다양할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 튜브는 2 개의 대칭적인 깔때기 및/또는 사다리꼴 열의 세트로 이루어진다.
본 발명은 또한 모든 요소들의 길이가 본 발명에 개시된 경우와 상이한 튜브를 포함한다. 본 발명은 또한 모든 요소들의 길이가 약 0.1 ㎜, 0.2 ㎜, 0.3 ㎜, 0.5 ㎜, 1 ㎜, 1.5 ㎜, 2 ㎜, 5 ㎜, 8 ㎜, 10 ㎜, 15 ㎜, 20 ㎜, 50 ㎜, 75 ㎜, 1 ㎝, 2 ㎝, 5 ㎝, 10 ㎝ 이상의 길이로 본 발명에 개시된 바와 상이한 튜브를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 필터를 레이저로 성형하거나 모양을 만들 수 있다.
본 발명의 튜브는 혈장으로부터 적혈구를 높은 효능으로 분리시키는 이점을 갖는다. 본 발명의 튜브를 사용하여, 혈장 중의 RBC의 백분율을 전혈 중에 존재하는 RBC의 백분율에 비해 99%, 98%, 95%, 93%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 또는 60% 초과까지 감소시킨다.
COC 또는 COP는, 비용 절감 및 경질의 강한 의료 물질임을 별개로, 그의 투명성이 그의 천연 형태에서 유리와 유사하다는 이점을 갖는다. 전형적인 COC 물질은 HDPE(고 밀도 폴리에틸렌(HDPE) 또는 폴리에틸렌 고 밀도(PEHD)는 석유로부터 제조된 열가소성 폴리에틸렌이다) 및 PP(폴리프로필렌 또는 폴리프로펜(PP)은 열가소성 중합체이다)보다 더 높은 모듈러스를 가질 것이다. COC는 또한 낮은 흡수율과 함께 투명한 중합체에 대해 높은 수분 불투과성을 갖는다. 의료용도에서, COC는 낮은 추출물을 갖는 고 순도의 생성물임이 주목된다. COC는 또한 할로겐 비-함유 생성물이다.
COC 물질은 탁월한 광학 투명성 및 수증기에 대한 높은 불투과성을 갖는다. 상기 물질은 높은 충실도(fidelity)로 미세한 특징들을 성형하며, 모든 통상적인 멸균 방법을 견디고, 가수분해 및 광범위한 화학물질에 대해 저항성이 있다.
COC 물질은 또한 양호한 내열성, 기계적 성질, 경도, 치수 안정성, 및 절연성을 갖는다. 상기 물질은 추출물이 매우 낮고 탁월한 생체 내 및 시험관 내 생체적합성을 가지므로, USP 등급 VI 및 ISO 10993 요건을 충족하고 FDA 약물 및 장치 마스터 파일 번호를 부여받았다.
또한, COC는 그의 투명성, 경도, 낮은 중량, 내열성 및 내화학성, 생체적합성, 수분 불투과성에 대한 치수 안정성(낮은 수분 불투과성), 성형성, 및 할로겐의 결여와 함께, 사용 시 다수의 이점들을 제공한다. 상기 물질은 유리에 비해 장치 및 포장 시 파손을 줄이고, 약물 저장 수명을 연장하며, UV 파장에서 진단학적 판독을 허용하고, 진단 장비를 더 작고 더 빠르게 할 수 있다. 또한, COC 등급은 또한 감마선, 증기 및 에틸렌 옥사이드에 의한 멸균을 겪을 수 있고 따라서 모든 통상적인 방법들에 의해 멸균시킬 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 도 15에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브를 제공한다.
본 발명에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치에 수집되고/되거나 보관된 혈액을 본 발명에 따른 방법, 조성물, 생성물, 용도 중 어느 하나에 사용할 수 있다.
상기 채혈 튜브 또는 주머니를 공기를 배출시키고/시키거나 밀봉시킬 수 있다. 상기 채혈 튜브 또는 주머니에 요변성 젤 및/또는 응고방지제를 충전시킬 수도 있다.
본 발명의 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치는 혈장 및 세포 성분들을 여러 개의 주머니 또는 튜브로 전달할 수 있게 하는 다-채널 채혈기이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 2 개 이상의 주머니 또는 튜브에 연결된 연결기 도관으로 다수의 도관 연결기에 연결된 단일의 유입 도관을 포함하는 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브를 제공하며, 여기에서 상기 다수의 도관 연결기의 연결기 도관은 하나의 단일 주머니 또는 튜브에 연결된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 단일 유입 도관,
b) 연결기 도관을 갖는 다수의 도관 연결기, 및
c) 2 개 이상의 주머니 또는 튜브
를 포함하는 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브를 제공하며, 여기에서 상기 단일 유입 도관은 상기 다수의 도관 연결기에 연결되고 상기 다수의 도관 연결기의 각각의 연결기 도관은 하나의 단일 주머니 또는 튜브에 연결된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 혈액 성분들을 모으기 위한 본 발명에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치를 제공한다.
바람직하게는, 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치는 도 15에 예시된 바와 같이 유입 도관(1), 다수의 도관 연결기(2), 연결기 도관(3) 및 2 개 이상의 주머니 또는 튜브(4)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈액 주머니 또는 채혈 튜브 장치는 하나 이상의 고정 유닛(5)을 추가로 포함한다(도 15). 바람직하게는, 하나의 고정 유닛이 각각의 연결기 도관에 제공된다. 하나의 실시태양에서, 2 개 이상의 고정 유닛이 각각의 연결기 도관에 제공된다.
바람직하게는, 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치의 각 주머니는 뚜껑을 추가로 포함한다. 도 15는 각각의 주머니(4)가 뚜껑(6)을 포함하는 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치를 예시한다. 바람직하게는, 상기 뚜껑을 멸균 주사기의 연결을 위해서 열거나 풀 수 있다. 상기 뚜껑은 상기 주머니의 내용물을 멸균 조건 하에서 쉽게 흡출되게 하는 이점을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 루어-락(Luer-Lock) 주사기를 사용할 수 있다. 한편으로, 뚜껑 대신에 바늘을 사용할 수도 있다.
바람직하게는, 상기 유입 도관 및 연결기 도관은 가요성이다. 바람직하게는, 상기 유입 도관 및 연결기 도관은 관상이다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 개 이상의 주머니 또는 튜브를 포함한다. 바람직하게는, 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치는 8 개의 주머니 또는 튜브를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 단일 사용을 위한 일회용 주머니 또는 튜브를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 각각의 주머니는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 ㎖ 이상의 혈액을 함유할 수 있다. 바람직하게는 각각의 주머니는 약 10 ㎖의 혈액을 함유한다. 바람직하게는, 각 주머니의 부피는 단일 사용에 적합하다. 바람직하게는, 각 주머니 중에 채혈된 혈액의 양은 1 회의 단일 사용에 충분한 양이다.
바람직하게는, 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치는 밀폐된 유체 연통을 제공한다. 보다 바람직하게는, 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치는 밀폐되고 멸균성인 유체 연통을 제공한다.
바람직하게는, 각각의 주머니는 일단 상기 주머니 또는 튜브가 충전되면 개별적으로 밀봉될 수 있다. 이는 개별적이고, 사용 준비가 된 단일의 일회용 주머니 또는 튜브를 갖는다는 이점을 갖는다.
바람직하게는, 각각의 주머니는 진공 단계가 가해진다. 바람직하게는, 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치는 진공 단계가 가해진다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 각각의 주머니는 제 2 보호구 또는 봉투에 삽입된다. 이는 포장 시 ISO 표준에 따른 이중 보호를 제공한다는 이점을 갖는다(ISO11607-1 및/또는 ISO11607-2).
바람직하게는, 각각의 주머니를 진공 후 제2의 봉투에 삽입한다. 바람직하게는, 상기 제2의 봉투는 진공이 가해지고 밀봉된다. 멸균, 진공 단계 및 이중 보호는 사용하기에 매우 안전한 주머니 또는 튜브를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 유체 흐름을 스냅 오프 플러그, 제거 가능한 플러그, 또는 슬라이드 클램프와 같은 통상적인 밸브 수단에 의해 조절할 수 있다.
상기 혈액 주머니 또는 튜브 시스템은 혈액 상용성, 가요성, 반투명성이고 멸균 가능한 플라스틱 물질로 제조되는 통상적인 구조를 가질 수 있다. 상기 플라스틱은 폴리비닐클로라이드, 폴리에스터, 폴리올레핀, 폴리유레탄 등일 수 있으며, 상기 물질들의 혼합물을 포함할 수도 있다. 상기 유입 도관 및/또는 연결기 도관은 상기 혈액 주머니 또는 튜브의 상기 플라스틱 물질과 동일하거나 상이한 플라스틱 물질로 제조될 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 여과 수단을 본 발명의 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치에 통합시킬 수 있다. 상기 여과 수단은 강성의 폴리비닐클로라이드 등으로 제조된 틀 및 튜빙 부속품을 포함할 수 있다. 여과 수단에 탈지면 또는 셀룰로스 아세테이트 또는 다른 합성 섬유, 예를 들어 폴리에스터, 폴리아미드 등과 같은 여과 매질을 충전시킬 수도 있다. 상기 여과 매질의 양은 여과되는 적혈구의 양에 따라 변한다. 대개는 약 20 내지 50 그램의 여과 매질을 200 내지 250 ㎖의 적혈구 농축물에 대해 사용한다.
하나의 실시태양에서, 적혈구의 보관 수명을 연장하기 위해서 첨가제 용액을 가한다. 상기 첨가제 용액은 적혈구 농축물 200 내지 250 ㎖ 당 약 50 내지 100 ㎖의 양의, 예를 들어 문헌[Ginzburg et al, Bibl. Haemotol., 1971, No. 3, Pt. 2, 217-220]; [Wood et al, Blood, Vol. 42, No. 1, 1973, 17-25]; [Beutler, "The Red Cell in Vitro", Grum and Stratton, New York, N.Y., 1974, p. 201]; [Lovric et al, Medical Journal of Australia, Vol. 2, 183-186, 1977]; 미국 특허 제 4,267,269 호에 개시된 바와 같은 통상적인 적혈구 보관 용액일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치의 주머니 또는 튜브는 응고방지제, 예를 들어 아데닌-시트레이트-덱스트로스(ACD), 시트레이트-포스페이트-덱스트로스(CPD), 시트레이트 포스페이트-277 밀리몰 덱스트로스(CP2D), CPD 플러스 아데닌, 또는 다른 통상적인 응고방지제를, 상기와 혼합되는 채혈된 혈액과 함께 함유할 수 있다. 이어서 상기 채혈된 혈액을 직접 처리하거나 또는 대개는 약 4 내지 6 ℃에서 보관할 수 있다. 처리 시, 상기 주머니 시스템을 당해 분야에 통상적인 바와 같이 원심분리시켜 상기 혈액 중의 적혈구가 상기 주머니의 기부에 침강하게 한다. 혈장은 통상적인 기법에 의해 신선한 혈장 및 혈소판 농축물에 의해 표현된다.
상기 주머니 또는 튜브 중에 함유된 혈액을 본 발명의 임의의 태양 및/또는 실시태양에 사용할 수 있다.
상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치를 의료 분야에서 큰 유용성으로 쉽게 제조하고 생산한다. 본 발명을 사용함으로써, 채혈이 용이하게 수행되고, 보다 안전하고 보다 효율적으로 된다. 유리하게는, 본 발명은 보다 용이한 추적성을 제공한다. 유리하게는, 본 발명은 임의의 혈액 성분의 용이하고, 신속하며 안전한 채혈, 보관 및 전달을 허용하는 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치 및/또는 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치를 포함하는 키트 및/또는 장치를 제공한다. 추기의 이점은 ISO 표준에 따른 멸균 조건 하에서 상기 혈액 성분의 채집, 보관 및 전달을 수행한다는 것이다. 추가의 이점은 상기 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치 및/또는 키트 및/또는 장치가 현장에서 사용하기에 특히 적합하다는 것이다.
바람직하게는, 상기 혈액 성분의 채집, 보관 및 전달을 멸균 조건 하에서 수행한다.
하나의 실시태양에서, 제조 시 아크릴 수지와 같은 물질을 사용하여, 일회용일 수 있는 밸브를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치를 포함하는 멸균 키트 및/또는 장치를 제공한다. 혈액 성분을 안전하고 경제적으로 모을 수 있게 하는, 혈액 성분을 모으는데 필요한 모든 기구가 멸균 키트에 제공된다.
본 발명에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치 및/또는 키트 및/또는 장치에 의해 제공된 혈액을, 본 발명에 개시된 임의의 태양 및/또는 실시태양에 따르든지 아니든지 간에, 트롬빈, 혈소판 풍부 혈장, 혈소판 농축물, 세포 추출물, 세포 조성물, 상처 치유제 및/또는 조직 치유제 또는 지혈제 또는 생물학적 접착제의 제조에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치 및/또는 키트 및/또는 장치에 의해 제공된 혈액을 본 발명에 개시된 모든 용도에 대해 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치 및/또는 키트에 의해 제공된 혈액을 수술, 이동하는 조건 하에서 또는 만성적인 상처에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치 및/또는 키트 및/또는 장치에 의해 제공된 혈액을 동종 또는 자기조직 성분으로서 사용할 수도 있다.
동종 성분으로서 사용 시, 본 발명에 따른 혈액 주머니 시스템 또는 채혈 튜브 장치 및/또는 키트 및/또는 장치에 의해 제공된 혈액 및/또는 혈액 성분은 공지된 시스템에 대해 유리한 효율, 간단하고 저렴한 대안을 나타낸다. 상기는 자기조직 혈액의 수집이 가능하지 않은 경우를 나타낸다.
본 발명을 예시하는 실시예들을, 이후에 보다 상세한 방식으로 도면에 나타낸 실시태양들을 참고하여 개시할 것이다.
실시예
하기의 약어는 각각 하기의 정의를 지칭한다:
ATS(자기조직 트롬빈 혈청); BU(박소트로빈 단위); DMEM(둘베코의 최소 필수 배지); DMSO(다이메틸 설폭사이드); EC(농축된 혈전); FCS(송아지 태아 혈청); HT(치유 시간); IU(국제 단위); PBS(포스페이트 완충된 염수); PET(폴리에틸렌 테레프탈레이트); PRP(혈소판 풍부 혈장); PPP(혈소판 부족 혈장); USP(미국 약전); cm(센티미터); dL(데시리터); g(그램); Gy(회색); J(주울); L(리터); min(분); mm(밀리미터); M(몰); ㎖(밀리리터); nm(나노미터); rpm(분당 회전수); Vol.(부피).
일반적인 과정 & 조건
상처 치유 및/또는 뼈 및/또는 조직 재생을 촉진함에 있어서 본 발명 조성물의 유효성을 측정하기 위해서, 하기의 실험들을 수행한다. 인간 전혈 샘플을 본 발명에 따른 분리기 튜브에 수집한다. 사용될 수 있는 튜브는 예를 들어 2 내지 3 ㎖의 폴리에스터 기재 요변성 젤뿐만 아니라 0.1 M의 나트륨 시트레이트 용액 1 ㎖을 함유하고 약 8.0 내지 10 ㎖의 사용 가능한 진공을 함유하는 대략 10 내지 15 ㎖의 유리 튜브(직경 16 ㎜ 및 길이 120 내지 130 ㎜)이다. 상기 튜브는 본 발명의 혈소판 농축 조성물의 제조를 위한 바로 사용 가능한 장치를 구성한다.
사용될 수 있는 튜브의 또 다른 예는 중합체 혼합물 및 나트륨 시트레이트 용액(약 0.1 M)을 포함하는 요변성 젤 2 ㎖을 함유하고 약 8 내지 10 ㎖의 사용 가능한 진공을 함유하는 대략 10 ㎖의 PET(폴리에틸렌 테레프탈레이트) 튜브이고, 본 발명에 따른 혈소판 농축물의 제조를 위한 바로 사용 가능한 장치를 구성한다. 사용될 수 있는 튜브의 또 다른 예는 본 발명에 따른 튜브이다. 이들 튜브를 2 개의 성분으로 충전하고, 진공 흡출하고, 조사에 의해 멸균하고(ISO 11137, UNI EN ISO 11737-2, UNI EN 552, UNI EN 556에 의해 처방된 바와 같이), 유리 튜브용의 얼룩진 브로모부틸 통상적인 고무 마개 및 작동기 안전을 위한 폴리에틸렌 커버를 갖는 클로로부틸 마개와 같은 전통적인 뚜껑에 의해 밀봉 밀폐시킨다. 이어서, 상기 튜브를 약 3 내지 10 분 동안 약 1500 g 내지 약 2000 g에서, 즉 약 2,500 rpm 내지 약 3,800 rpm에서, 진동 회전자를 갖고 반경이 14 ㎝인 원심분리기로 원심분리시킨다. 약 45°의 고정 각도의 회전자를 갖는 원심분리기의 경우에, 상기 원심분리 시간은 5 내지 약 15 분 동안 지속되어야 한다. 한편으로, 상기 튜브를 본 발명에 따라 원심분리시킨다.
원심분리 후에, 상기 혈소판 농축물을 본 발명의 치료 또는 화장품 용도에 사용하기 위해서, 또는 추가의 작용제, 예를 들어 세포 추출물, 바람직하게는 자기조직(예를 들어 각질세포, 섬유아세포, 골수 세포, 조골세포, 연골세포, 근원세포, 각막 세포, 슈반 세포, 지방 세포, 탯줄 줄기 세포, 힘줄 세포, 췌장 섬 세포, 인대 및 잇몸 세포, 골막 세포) 및/또는 뼈 대용물 및/또는 응고 활성제와의 혼합물을 통해 상기 수득된 혈소판 농축물을 함유하는 추가의 조성물의 제조를 위해서 수집한다.
본 발명의 혈장 농축물, PRP, 조성물을 삼칼슘 포스페이트(TCP), 히아루론산(HA), 키토산, 크림, 크림 마스크, 세포 추출물, 지방 세포, 루브리신, cd-젤라틴 및/또는 보툴리늄 독소와 혼합할 수 있다.
세포 조성물의 제조를 위해서, 본 발명에 따라, 하기와 같은 일반적인 프로토콜에 따라 세포를 제조한다:
a) 생검
상응하는 조직의 생검을 멸균 조건 하에서 수집할 특정 세포에 적합한 표준 방법을 사용하여 수득한다. 상기 세포를 세척, 원심분리 또는 침강에 의해 정제할 수 있다. 상기 세포를 원심분리에 의해, 효소적 절단(트립신, 콜라게나제 또는 재조합된 트립신)에 의해 단리할 수 있다. 상기 세포를 하기와 같이 생체 외 배양 및 세포 증식 후에 즉석에서 또는 임의로 사용한다.
b) 세포 외 배양 및 세포 증식
세포 조성물의 제조에 사용되는 세포, 예를 들어 각질세포, 골수세포, 섬유아세포; 골막 또는 각막 세포, 예를 들어 각막 주변부 줄기 세포; 멜라닌 세포 및 랑게르한스 세포; 지방 세포; 근육 세포, 예를 들어 근원세포 및 위성 세포; 조골세포; 연골세포; 탯줄 세포; 슈반 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구세포, 내피 전구 세포, 힘줄 또는 췌장 세포를, 바람직하게는 자기조직의, 피브로넥틴이 농축된 혈소판 농축물로 코팅된 플레이트(예를 들어 페트리 디쉬 또는 배양 플라스크) 상의 세포 담체 배지(예를 들어 DMEM 또는 햄스(Ham's) 배지) 중에서 전통적으로 팽창시킨다. 유리하게는, 약 5% 내지 약 20% 농도의 본 발명의 혈장 농축물 또는 PRP의 사용으로 DMEM 또는 햄스 배지와 같은 세포 담체 배지가 필요하지 않다. 또한, 유리하게는, 이는 상기 세포 제제를 20% 이상 유효하게 한다. 상기 세포 제제는 최종적으로 피브로넥틴이 농축될 수 있다. 상기 배양 배지를 바람직하게는, 예를 들어 각질세포의 경우 DMEM으로 농축시킬 수도 있다. 조골세포, 연골세포 및 근원세포와 같은 세포의 경우, 예를 들어 콜라게나제 또는 트립신의 존재 하에서 상응하는 조직의 효소적 절단이 도말 전에 필요하다. 상기 플레이트 상에서의 배양을 95% 산소 또는 공기 및 5% 이산화 탄소의 기류 하에 37 ℃에서 수행한다.
전형적으로, 배양 시간은 10 내지 20 분으로 다양하다. 상기 세포 팽창을 광선 요법(예를 들어 상기 배양기간 중 1주일에 한 번, 2 J/㎠에서 약 10 분의 633 ㎚에서의 광 노출)에 의해 최종적으로 향상시킬 수 있다(예를 들어 근원세포, 섬유아세포 및 연골세포의 경우에서와 같이).
상기 외부 이식물(explant)을 공수(air-lifting) 기법(Molnar et al., 1996, Tissue & Cell, 28:547-556) 및 공기 계면 방법(Meller et al, 2002, Br. J. Opht., 86, 463-471)을 사용하여 페트리 디쉬 또는 배양 플라스크에서 배양할 수 있으며, 이때 상기 외부 이식물의 절반이 공기에 노출된다. 상기 배양 배지를 배양 중에 규칙적으로, 예를 들어 매 3일마다 교환한다. 예를 들어 근원세포, 섬유아세포 및 연골세포의 경우 평면 단층으로서 2D 방식으로 상기 세포의 팽창이 획득된다. 예를 들어 각막, 근원세포, 섬유아세포, 연골세포, 지방세포 및 각질세포의 경우, 배양 배지에 혈장 또는 농축된 혈장의 약 5 내지 약 40% 부피로 본 발명에 따른 희석된 자기조직 혈소판 농축 조성물을 첨가함으로써 3D 세포 성장 패턴을 획득할 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따른 희석된 자기조직 혈소판 농축 조성물의 첨가를 상기 배양 시간 동안 2 또는 3 회 수행할 수 있다. 이어서 상기 획득된 3D 생물학적 골격은 자기조직 줄기 세포 운반에 유용한 세포외 기질이 증대되게 한다.
배양 후, 세포를, 상기 세포를 상승시키고 펠릿화를 허용하는 온화한 트립신 절단에 의해 디쉬로부터 방출시킬 수 있다. 한편으로, 상기 세포를 열민감성으로 만들어 열에 의해 방출시킬 수도 있다(열민감성 중합체 의해 코팅된 페트리 디쉬를 사용할 수도 있다).
c) 세포 품질 및 안전성 검사
상기와 같이 수득된 세포 제제에서 세포 생육력을 표준 기법에 의해 조직 마커 상에서의 면역화학과 함께 현미경에 의한 세포 카운트, 유식 세포 측정계에 의한 세포 카운트에 의해 검사한다. 세포 생육력을 또한 트립신에 의한 세포 방출 직 후에 트립판-블루를 통해 시험한다. 상기 제제의 안전성을 또한, 바이러스 또는 세균에 의한 오염을 배제시키고 동물 매개 감염의 이전을 피하기 위해서 미생물학적 분석을 통한 오염 검사를 통해 검사한다. 송아지 태아 혈청(FCS)의 사용을 피하며, 이에 의해 광우병의 전염을 방지한다.
d) 세포 제제의 투여
상기 수득한 세포 제제를 환자에게 전달하기 전에 최종적으로 운반용 세포 담체 비히클로서 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물 중에 넣는다. 이어서, 상기 수득된 세포 제제를 상기 환자에게 주입하거나 이식한다. 상기 주입 또는 이식 방식은 본 발명에 따른 세포 제제 중에 함유된 세포의 유형 및 목적하는 치료 또는 미용 효과에 적합해야 한다. 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법 및 용도에 대한 보다 상세한 내용을, 보다 구체적으로 상기 세포의 유형 및 목적하는 치료 또는 미용 효과에 따라 하기 실시예에 제공한다.
본 발명에 따른 각질세포 또는 섬유아세포 제제를 상술한 바와 같이 수집 후에 또는 세포 배양 후에 바로 사용할 수도 있다. 그러나, 본 발명에 따른 세포 제제를 상술한 바와 같이 세포 배양 후에 제조할 수도 있다.
본 발명에 따른 세포 제제는 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물이 없는 배지에서 제조된 세포보다 더 양호한 생육력 및 안정성(단백질을 합성하는 능력 및 성장 인자를 전달하는 능력과 같이 세포 성질의 완전성이 보존됨을 포함하여)을 제공한다. 더욱이, 상기와 같이 획득된 세포 증식이 증대된다: 세포가 대조용 배지 및 혈정 결핍 배지에 비해 더 빠르게 성장하고(약 2 내지 5일 더 빠르게) 더 농축된다. 본 발명에 따른 세포 조성물의 제조 방법의 이점은 동일한 자기조직 배지를 세포 배양, 세포 보존, 세포 주입용 벡터, 세포 생물-자극 및 조직 재생용 벡터로서 사용한다는 것이다.
실시예 1: 자기조직 트롬빈 농축된 혈청과 병용된 본 발명의 자기조직 혈소판 농축물의 치료학적 용도
트롬빈 농축된 제제로서 사용되는 자기조직 트롬빈 혈청을 본 발명에 따라 제조한다.
상기 방법의 독창성 중 하나는 상기 자기조직 트롬빈 혈청 제제 및 상기 혈소판 농축물 제제를 각각 함유하는 본 발명의 분리기 튜브들을 동시에 제조할 수 있다는 것이다. 상기 자기조직 트롬빈 혈청(ATS) 제조용 유리 튜브를 약 8 분 내지 약 10 분 원심분리시킨다. 혈장 농축물 또는 PRP 조성물 제조용 플라스틱 튜브(COC 또는 COP) 또는 유리 튜브를 약 8 분 내지 약 10 분 원심분리시킨다. 따라서, 유리하게는 상기 ATS 및 PRP 조성물은 대략 동시에 사용 준비가 된다.
피브리노겐의 피브린 망으로의 중합(응고 과정 중 발생한다)을 상처에 상기 혈소판 풍부 제제를 적용하는 순간에만 발생하도록 하기 위해서, 상기 혈소판 농축 조성물 및 자기조직 트롬빈 혈청(응고 활성제)을 용도에 따라, 약 10:1, 10:3 내지 약 10:10의 부피 비(농축물 대 응고 활성제 비)로 동시에 적용한다. 상기 비율의 차이는 접착제 효과에 대한 응고의 신속성을 변경시킨다.
상기 두 제제의 동시 전달은, 예를 들어 상기 제제들을 상처와 접촉시 동시에 혼합하고 중합하도록 방출하는 2 개의 주사기(예를 들어 혈소판 농축 조성물용 10-㎖ 주사기 및 트롬빈 혈청용 1-㎖ 또는 3-㎖ 주사기)를 포함하는 장치에 의해 성취된다.
실시예 2: 본 발명의 자기조직 혈소판 농축물의 화장품 용도
본 발명의 자기조직 혈소판 농축물의 화장품 용도의 예는 하기를 포함한다:
본 발명에 따른 혈소판 농축물을 상처에 적용 전에, 수술 후에 또는 건강한 피부 위에 크림, 바람직하게는 유화액과 혼합한다. 흡수 과정 동안, 상기 혈소판 제제는 수화 이점을 확대하고 피부의 재생 또는 회춘을 생체-자극하기 위해서 크림 또는 유화액에 의해 상기 피부로 운반된다. 피부층에의 주입은 손 또는 바늘 없는 장치에 의한 반복되는 주입에 의해 메조테라피의 기법으로 수행될 수 있다. 주입을 부피 보정을 위해 주름에 피하로 수행할 수 있다. 충전 효과 및/또는 꾸준한 부피 보정을 위한, 자기조직 트롬빈 혈청과 10:1 또는 10:3의 비로 배합된 혈소판 농축물의 주입을 주름, 이마, 턱, 어금니 부위, 뺨, 턱 목 및/또는 가슴에서 수행할 수 있다. 적합한 경우, 새로 흡출된 지방 조직에 약 10:10의 비로 배합된 혈장 농축물의 주입을 안면의 중요한 부피 보정을 위해 피하로 수행할 수 있다. 적합한 경우, 새로 흡출된 지방 조직에 약 10:3 또는 약 10:2의 비로 배합된 혈장 농축물의 주입을 가슴의 중요한 부피 보정 또는 윤곽성형을 위해 피하로 수행할 수 있다.
혈소판 풍부 혈장이 흡수될 때까지 피부와 접촉된 채로 남기기 위한 운반체인, 고도로 친수성인 종이를 사용하여, 100% 알부민의 알부젤(EP 1 543 846) 제제와 같은 하이드로젤, 또는 알부민 및 다른 화학적 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 임의의 다른 성분의 그물화로부터 생성되는 임의의 다른 하이드로젤의 을 사용한다.
본 발명은 하기의 메조테라피 주입 방법을 포함한다:
-유두진피에서,
-망상진피에서 피하로, 또는
-골막 위의 심부 수준에서.
<<의학적 안면 리프팅>>이라 또한 지칭되는 상기 3 개 수준의 주입을 혈장 단독, 혈장 + 지방조직 및/또는 혈장 + 삼칼슘 포스페이트를 사용하여 수행할 수 있다.
실시예 3: 자기조직 근육 세포 결합 제제
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 골격 근육 세포(근육 전구 세포 또는 위성 줄기 세포)가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용함으로써 제조할 수 있다.
a) 근원세포 전구 줄기 세포
골격근 생검을 외측광근으로부터 수득하며 크기는 7x3 ㎝이다. 근육을 제안된 생검 부위(어느 한쪽의, 상기 외측광근 및 무릎 관절 바로 위에 놓인 넓적다리의 측면 쪽 상의 10 x 15 ㎝ 피부 영역)에 근육 내 주사에 의해 데카돈 및 마르카인(오래 작용하는 리그노카인)으로 생검 전날 준비한다. 근육을 썰고 콜라게나제, 프로나제 및 트립신(Worthington)의 조합에 의해 효소 절단한다. 근육 외부 이식물을 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물로 코팅된 페트리 디쉬에 도말하고, 3 내지 4 주 동안 37 ℃에서 95% 산소 및 5% 이산화 탄소 중에서 배양한다. 데스민 또는 CD-56 발현을 섬유아세포로부터 근원세포를 동정하기 위한 근원섬유 마커로서 사용한다. 3D의 근원세포 전구 세포 증식을 도 3에 나타낸다. 세포 증식을 배양 중에 10 분간 2 J/㎠의 633 ㎚ 광 노출에 의해 증대시킬 수 있다. 이식일(예를 들어 3 내지 4 주의 배양 후)에, 상기 골격 근 세포를 트립신에 의해 또는 본 발명에 개시된 바와 같은 임의의 방법에 의해 방출시키고 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물 중에 넣을 수 있다. 상기 심근 내로의 주입은 좌심실 심근 내로의 직접 주입 또는 수 회의 카테터 주입으로서 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 근원세포 제제는 심장 질환, 예를 들어 심장 재생, 심부전, 만성 심부전, 허혈성 및 비-허혈성 심부전 및 비-허혈성 심근증의 치료에 유용하다. 박출 계수를, 골격 근원세포의 심장 수용자의 경우 9%까지 개선시킬 수 있다.
상기 세포 제제는 또한 요실금(상술한 바와 같이 제조되고 방광 경부 내로 주입된 근원세포 추출물), 역류성 식도염 또는 위-식도 역류 질환(상술한 바와 같이 제조되고 하부 식도 괄약근 내로 주입된 근원세포 추출물) 및 변실금(상술한 바와 같이 제조되고 항문 주변 영역에 주입된 근원세포 추출물)의 치료에 유용할 수 있다.
한편으로, 섬유아세포 및 근원세포의 결합된 제조를 수행할 수 있다(섬유아세포는 근육 생검 중에 존재하고 근관 및 위성 줄기 세포와 나란히 있는 근육 다발막으로부터 성장한다). 심장 질환 치료의 경우에, 섬유아세포 제제와 근원세포 제제의 혼합물(상기 가리킨 바와 같이 수득됨)을 약 30:70의 섬유아세포/근원세포 비로 심근에 삽입한다.
방광 경부 실금 치료의 경우, 섬유아세포의 별도의 배양물을 상술한 바와 같이 근원세포와 동시에 제조하고 상기 섬유아세포 제제를 요도 주변에 주입하고 근원 세포 제제를 초음파 조절 하에서 횡문근성괄약근에 주입한다.
b) 위성 줄기 세포
근원세포 및 위성 줄기 세포를 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물의 존재 하에서 생체 외에서 배양한다. 세포 증식 기폭이 7일의 1차 배양 후에 관찰된다.
이어서 세포를 약 3 내지 4 주 후에 수확하고 4 x 4 ㎝ 크기의 인간 상피-제거된 양막 패치를 함유하는 조직 배양 배지(DMEM + 5 내지 20% 부피의 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물)에 놓는다. 한편으로, 자기조직 활성화된 피브린 중합체의 패치를 사용할 수도 있다. 상기 자기조직 활성화된 피브린 중합체를, 혈장을 칼슘 글루코네이트와 약 10:3 또는 약 10:10의 비로 원심분리함으로써 제조한다. 이어서 상기 제제에 10 분간 UV를 조사한다. 배양 중에(전형적으로는 약 2 내지 약 3 주), 상기 세포가 상기 양막 구조물 위에 퍼지고 단층을 형성한다. 생육력 및 단층 진행을 매주 2 회 패치 테두리의 생검 및 단층의 두께에 대한 조직학적 평가에 의해 평가한다.
이식일(예를 들어 약 3 내지 4 주의 배양 후)에, 심실 표면에 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물을 펴 바르고 이어서 상기 수득된 패치를, 상기 패치 상의 줄기 세포가 심실 주입 후 허혈 부분에 이주하도록 하기 위해서 상기 허혈성 심실의 원래 표면 위로 세포 아랫면을 놓는다. 세포 체류는 삽입되는 양막에 의해 유지되며 면역학적 반응은 유발되지 않는다.
본 발명에 따른 위성 줄기 세포 제제는 심근성형술을 위한 조직 공학 제제로서 심장 재생 및 심부전의 치료에 유용하다.
실시예 4: 자기조직 섬유아세포 결합 제제
본 발명에 따른 자기조직 섬유아세포 결합의 예를 피부 섬유아세포가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
피부 섬유아세포를 단리하고 하기 과정에 따라 팽창시킨다: 생검 한 달 전에, 최초 공여 피부 영역(전액와 주름의 귀 뒤, 예를 들어 일광 노화되지 않은 영역)을 비타민 A 크림으로 처리하여 피부 섬유아세포를 활성화한다. 10x6 ㎜ 전체 두께의 피부 생검을 수행하고 현미경 하에서 절제하여 모든 상피를 제거한다. 이어서 상기 상피화된 생검(진피)을 외부 이식물로서 3x3 ㎜ 블록으로 절단한다. 이어서 상기 유두진피를 위로 놓고 공수 기법(상기 Molnar et ah, 1996) 및 공기 계면(상기 Metier et al., 2002)을 사용하여 배양하며, 이때 상기 외부 이식물의 절반이 공기에 노출된다. 상기 외부 이식물을 DMEM에 도말하고(예를 들어 웰당 6 개의 외부 이식물) 페트리 디쉬 또는 배양 플라스크에서 약 3-5 내지 9일 동안 95% 산소 및 5% CO2에서 37 ℃에서 배양한다. 상기 배지를 매 3일마다 교환한다. 정적인 성장으로서, 평면 단층으로서의 2D 방식의 섬유아세포 팽창이 배양 중에 관찰된다. 배양 시작 후 7 내지 9일째에, 본 발명에 따른 희석된 5 내지 20% 자기조직 혈소판 농축 조성물을 상기 배양 배지에 첨가함으로써 증식 및 3D로의 표현형 패턴의 변화를 획득한다: 세포를 단지 베이스를 덮기 위해서 상기 자기조직 혈소판 농축 조성물(웰당 0.2 ㎖)로 자극한다. 이어서 세포가 3D 피브린 젤 기질로서 성장한다. 이어서 세포는 분화하여 피브린 젤 중에 생물학적 골격 또는 망상을 형성한다. 세포 수를 격자 하에서 매일 카운트하여 측정하고 세포사멸에 대해 평가한다: 전도된 현미경(Olympus(등록상표))을 사용한다.
3 내지 6 주의 배양 후에, 상기 세포를 상기 피브린 젤로부터 수확한다. 세포 생육력을 고전적인 트립판 블루 방법으로 분석하고 바이러스 오염을 포함하여 세균학적 평가에 의해 평가한다. 상기 수득된 팽창된 섬유아세포 추출물을 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물의 존재 하에서 주사기 중에 넣고 상기 제제를 안면 주름에, 보다 구체적으로 상기 주름 아래에 주입한다. 주입은 이마, 턱, 어금니 부위, 뺨, 턱과 목을 덮도록 안면 전체에 걸쳐 수행한다. 세포 팽창을 633 ㎚에서 세포 배양물의 광 노출에 의해 증가시킬 수도 있다. 본 발명에 따른 섬유아세포 제제는 안면 회춘, 안면 주름 및 굵은 주름의 개선, 방사선에 의해 손상된 피부(방사선 피부염 또는 일광 손상된 피부), 노화된 피부 또는 화상 피부의 치료, 및/또는 안면 주름, 굵은 주름, 여드름(특히 박피술 치료 후), 화상, 풍진 또는 곰보, 백반증, 지방 위축증 또는 지방 이상증, 예를 들어 AIDS-관련된 지방 이상증; 카포시 육종, 피부 스켈로이드 또는 뒤피트랑 손바닥 섬유종증의 개선 및/또는 피부 회춘 치료에 유용하다.
실시예 5: 자기조직 지방 조직 & 지방 세포 결합 제제
지방 조직을 바람직하게는 하복부 영역에서 흡출하고, PBS 세척에 의해 정제하고, 트라이글리세라이드 및 찌꺼기로부터 지방 조직을 단리하기 위해 원심분리하고, 침강시킨다. 그동안, 본 발명에 따른 혈장 농축물 또는 PRP 조성물의 제조를 위해 혈액을 수집하고 원심분리시킨다. 상기 지방 조직 및 PRP 조성물의 배합을, 일단 트라이글리세라이드가 감소되었으면, PRP 조성물의 흡출을 위한 멸균 운반 장치를 사용함으로써, 상기 지방 흡출에 사용된 주사기에서 수행한다. 상기 혈장 농축물과 지방 조직의 비는 안면의 경우 10:10이고 가슴 및 윤곽 성형의 경우 10:3이다.
바람직하게는, 상기 주입을 상기 두 농축된 세포 모두에 대한 최소의 제조 시간 안에, 생체 외에서 최소의 세포 조작 시간 동안 즉석에서 수행한다.
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 예를 들어 지방 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC)가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다. MSC를 콜라게나제에 의해 단리하고(지방 전구 세포, 내피 전구 세포) 피하, 관절 내를 포함하여, 또는 정형외과 수술을 위해 주입된 PRP 및 상기 제제가 있는 현탁액에 넣을 수 있다. 상기 제제를 상처에 직접 적용되는 침액 무세포 기질과 배합하거나, 또는 적용 전에 실험실에서 배양할 수도 있다. 성인 지방 줄기 세포를 5 내지 20% 부피의 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물 중에서 표준 배양 방법에 의해 단리한다. 이어서 상기 제제를 적용기로, 조직 결함, 예를 들어 외상 후 결함을 앓고 있는 환자, 또는 약 40 세 부근의 연령 관련된 결함이 있는 환자에게 주입한다. 본 발명에 따른 지방 세포 제제는 HIV/AIDS 환자 및 다른 얼굴반위축 환자에서와 같이 지방 이상증의 치료에 유용하다.
실시예 6: 자기조직 연골세포 결합 제제
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 연골 세포를 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공하는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
연골을 공여자의 무릎(생검 크기 10 x 5 ㎜)으로부터 단리하고 썬다. 상기 연골의 연골세포를 본 발명에 따른 희석된 5 내지 20% 자기조직 혈소판 농축 조성물이 농축된 배지에서 4 내지 6 주간 배양한다. 이어서 연골세포를 효소 절단(콜라게나제 및 프로나제)에 의해 방출시킨다. 이어서 상기 세포 제제를 수술에 의해, 깊은 연골 결함 및 손상을 갖는 환자에게 통합시킨다.
본 발명에 따른 연골세포 제제는 깊은 연골 손상 및 미란의 치료 또는 관절경 검사에 유용하다.
본 발명에 따른 연골세포 제제의 용도의 또 다른 예는 단일 주입 시술에 의한 코성형술에서의 용도이다: 선천적인 연골 코 이상증을 앓고 있는 환자.
주입 전날, 귀 연골 0.4 x 0.4 ㎝의 생검을 수행하고 DMEM 및 항생제가 충전된 멸균 수용자에 넣는다. 상기 생검을 트립신 및 콜라게나제를 포함하는 효소 절단으로 처리한다. 이어서 방출된 연골세포를 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물에 재현탁한다. 상기 환자에게 먼저 국소 마취제를 제공하고 코를 소독한다. 이어서, 상기 연골세포 제제를 부피의 증대 또는 리프팅을 요하는 부위의 연골 표면 및/또는 골막에 주입한다. 두 번째 단계에서, 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물을 상기 피부의 재생 및 회춘을 생체 자극하기 위해서 상기 코 피부의 표면 부분에 주입한다. 1 시간 후에, 주입을 성취하고 환자는 집으로 돌아갈 수 있었다. 생육성 세포의 탁월한 회복이 관찰된다: 회복되고 주입된 연골세포 및 혈장 세포의 양은 약 109 세포였다. 따라서 본 발명에 따른 연골세포 제제는, 외과적 시술 없이, 오직 주입에 의해서만, 코 연골 결함의 치료에 유용하다.
실시예 7: 자기조직 탯줄 줄기 세포 결합 제제
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 탯줄 줄기 세포가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 탯줄 줄기 세포를 단리하고 이어서 저온보존하고 혈액 질환의 치료에 사용한다.
본 발명에 따른 탯줄 줄기 세포 제제는 혈액 질병(지중해 빈혈)의 치료에 유용하다.
주입 방법은 혈장 농축물 중의 줄기 세포의 재현탁에 이은 재주입이다.
실시예 8: 자기조직 힘줄 세포 결합 제제
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 힘줄 세포가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
힘줄 섬유아세포를 5 내지 20% 부피의 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물에서 표준 과정에 따라 단리한다. 상기 힘줄 섬유아세포를 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물이 농축된 배양 배지에서 약 1 내지 약 3 주간 배양한다. 주입 전에, 상기 세포를 새로 가공된 혈장 농축물 중에 재현탁한다. 이어서 상기 세포 제제를 손상 부위(예를 들어 단열된 힘줄, 관절염 영역)에서 환자에게 주입한다. 상기 주입은 상기 손상된 부위의 국소화 및 이식된 용액의 보다 양호한 융합을 위해서 초음파 진단에 의해 유도될 수 있다.
상기 힘줄 섬유아세포 제제의 주입을 또한 어깨의 회전 근개 옆에서 수행할 수 있다: 먼저 상기 회전 근개 파열을 관절경 검사에 의해 복원하고, 이어서 상기 힘줄 섬유아세포 제제를 봉합된 영역 위로 긴 카테터를 통해 주입한다. 이는 상기 회전 근개의 테두리에서 상기 힘줄 섬유아세포의 치유를 개선하고, 봉우리 아래의 한정된 공간에서 혈종을 방지하고, 치유를 가속화하고 회복 및 관절 운동을 향상시킴으로써 곱은 어깨를 방지한다. 본 발명에 따른 힘줄 세포 제제는 힘줄 단열, 외상 또는 노화에 의해 유발된 관절염, 어깨의 회전 근개의 치료에 유용하다.
실시예 9: 자기조직 인대 및 잇몸 세포 결합 제제
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 골막 및 잇몸 세포가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
전신 및 국소 마취 하에서, 골막(대략 10 x 10 ㎜)을 4 명의 건강한 암컷 비글개의 아랫턱 몸의 볼 쪽에서 무균 수확한다. 상기 수확된 골막을 3 x 3 ㎜ 조각으로 절단한다. 상기 조직을 6-웰 플레이트에 직접 놓고 5 내지 20%의 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물이 농축된 배양 배지에서 37 ℃에서 5% CO2 및 95% 공기의 가습 분위기 하에서 배양한다(약 3 내지 약 주간). 상기 골막 및 잇몸 세포를 효소 절단에 의해 단리하고 정적인 기법에 의해 배양한다.
전형적으로는, 6 주의 배양이면 이식에 적합한 골막 두께를 획득하기에 충분하다.
*상기 자기조직 혈소판 농축 조성물 및 세포 제제를 재현탁 후 손상 부위에서 환자에게 주입한다.
실시예 10: 자기조직 각막 세포 결합 제제
콜라게나제 또는 트립신과 같은 효소 용액 없이 세포의 수집을 위해서, 열민감성 코팅 막이 있는 페트리 디쉬 상에서 제조한다.
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 각막 세포가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
생검을 상기 각막 테두리 상의 내측 눈구석 주름으로부터 취하고 상기 각막 윤부 줄기 세포를, 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물로 코팅된 페트리 디쉬 또는 플라스크에서 4 주의 배양 후에 같은 사람에게서 자기조직 이식을 위해 팽창시켰다.
상기 각막 배양된 줄기 세포(윤부 기원)를 단층으로 상피 제거된 인간 양막의 표면상으로 생체 외 조작하고, 그 후에 본 발명에 따른 배양되고 생육성인 각막 각질세포의 현탁액을 상기 구조물에 시딩할 수 있다. 약 500,000 개의 세포를 상기 시딩을 위해 사용하며 상기 세포는 추가로 약 3 주의 추가 배양 후에 상기 구조물의 표면을 덮게 된다. 상기 세포에 의한 조작은 약 3 주의 1차 세포 배양 후에 발생하며, 재-시딩이 필요할 수도 있다. 상기 생성되는 생물학적 세포-생물복합체 구조물은 콜라겐, 양막 섬유 및 각막 각질세포로 이루어지며, 세포막과 세포의 단층으로 이루어진다. 본 발명에 따른 각막 세포 제제를 손상된 각막에 적용되는 용해성 콘택트 렌즈 상에 펴 바를 수 있다. 상기 콘택트 렌즈는 사라지고 세포가 각막 결함을 뒤덮는다. 본 발명에 따른 각막 세포 제제를 안구 건조증을 앓고 있는 환자에게 점안액으로 국소 투여할 수 있다. 한편으로, 상기 양막을 상처 난 각막 또는 구조물에 단독으로 사용할 수 있으며 본 발명에 따른 세포 제제를 생물학적 또는 인공 콘택트 렌즈의 내부에 부착시키고 이어서 상기 각막에 적용하고 안대로 덮을 수 있다.
한편으로, 각막 세포를 적용 전에 새로 가공한 혈장 농축물 중에 재현탁한다.
본 발명에 따른 각막 세포 제제는 안구 건조증의 통증을 경감하고, 스티븐스 존슨 증후군 및 공장에서 산 및 부식성 알칼리 화상으로 인한 각막 실명, 각막 궤양, 예를 들어 불응성 신경 영양성, 헤르페스성 및 면역학적으로 유발된 각막 궤양의 치료에 유용하다.
실시예 11: 자기조직 골수세포 결합 제제
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 골수세포가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
엉덩이 골수를 흡출하고, 수확하고 적혈구의 분리를 위해 골수 농축물의 즉시 사용 장치에서 원심분리한다. 상기 골수 세포 제제를 단독으로 사용하거나 또는 이어서 본 발명에 따른 혈소판 농축물에 혼합하거나 다시 칼슘 글루코네이트와 함께 원심분리시켜 봉합성 막을 형성하고 적용하거나 또는 적용기로 환자의 손상된 부위에 주입한다. 본 발명에 따른 골수 세포 제제는 뼈 결함 또는 연골 결함의 치료에 유용하다. 상기 골수 세포 제제를 단독으로 또는 본 발명에 따른 혈장 농축물과 함께 사용할 수 있다. 연골막을 또한 칼슘 글루코네이트와 함께 사용할 수도 있다.
실시예 12: 자기조직 슈반 세포 결합 제제
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 슈반 세포가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
국소 마취하에서, 생검을 하지 중의 복재 신경 또는 비복 신경 중 어느 하나에서 수행한다. 상기 신경 생검을 작은 블록으로 절단하고 1차 배양을 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물 풍부 페트리 디쉬에서 유도한다.
단층을 3D에서 확대하고 세포를 최종적으로 트립신 절단에 의해 수확하고, 외과적으로 노출되고 손상된 척수의 국소 침윤을 위해 주사기 중의 새로 수확된 혈소판 농축물 중에 재현탁한다. 상기 배양된 세포는 마이엘린을 함유하는 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 슈반 세포 제제는 말초 신경 손상, 신경 봉합 및 척수 손상의 치료에 유용하다.
실시예 13: 자기조직 인간 섬 세포 제제
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 췌장 섬 세포가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
췌장 섬을 개방 생검에 의해 수확하고 통상적인 효소 절단 및 피콜(Ficol) 또는 하이파크(Hypaqe) 분리(Page et ah, 2007, Diba. Vas. Dis. Res., 7-12)에 의해 분리하고, 이어서 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물이 농축된 배지에 재현탁한다.
이어서 상기 췌장 섬 세포 제제를 간문맥을 통해 간으로 주입한다. 본 발명에 따른 췌장 섬 세포 제제는 전형적인 당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨병의 치료 및 당뇨병의 고혈당증의 역전에 유용하다.
실시예 14: 자기조직 인간 조골세포 제제
본 발명에 따른 자기조직 세포 결합의 예를, 조골 세포가 단계 (d) 또는 (e) 하에서 제공되는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
골 피질 펀치 생검은 국소 마취 하에서 장골 능 또는 동등한 부위(악골)로부터 유래한다. 상기 골 생검을 생체 외 골 및 조골세포 배양 분야의 숙련가에 의해 4 ℃에서 DMEM 배지에 또는 동등한 운반 배지에 무균적으로 놓는다. 이어서 상기 골 생검을 다지고 층류 후드 하에서 37 ℃에서 15 분 동안 희석된 10% 유형-1 콜라게나제(Sigma 또는 Boehringer) 중에서 절단한다. 한편으로, 트립신 절단(Worthington)을 대안으로 사용할 수 있다. 효소 절단을 4 ℃에서 DMEM 중의 10%의 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물로 3 회 세척에 의해 종료시킨다. 상기 제제를 원심분리하고, 펠릿화하고 재현탁한다. 외부 이식물로서 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물 중의 상기 골 단편을 공수 기술에 의해 페트리 디쉬 또는 플라스크 상에 도말한다. 상기 제제를 95% 공기 및 5% CO2의 기류 하에서 37 ℃에서 항생제, 젠티마이신 및 암포테리신-B와 함께 배양한다. 상기 배양 배지를 주당 3회 교환하고, 매번 DMEM 배지에 10 내지 20% 부피의 본 발명에 따른 자기조직 혈소판 농축 조성물을 첨가한다. 상기 세포 생육력 및 형태를 1주일에 3 회 평가하여 세포 포복, 세포사멸 및 3D 차원 단층 진행을 평가한다. 미세섬유 및 분화의 형성을 전도된 현미경 검사(Olympus(등록상표))에 의해 평가한다. 세균 및 바이러스 오염의 부재가 검사된다. 조골세포를 약 10:3 또는 약 10:10의 비의 혈소판 농축물과 칼슘 글루코네이트의 원심분리에 의해 새로 수확한 자기조직 피브린 중합체 막에서 조작할 수 있다. 상기 피브린 중합체는 봉합성이다. 조골세포를, 상기 수득한 바와 같은 100,000 개의 세포로 막 시딩하고 3 내지 4 주에 걸쳐 단층 막이 팽창되게 한 후에 인간 양막 상에서 조작하여 세포 생물복합체 골격 및 세포 단층 담체/구조물을 생성시켜 임의의 부위에서 골절의 비-결합에 따른 골 결함 또는 이식된 영역을 덮기 위해 사용 및 운반하기 위한 조골세포-양막-막 구조물의 독특한 구조를 허용할 수 있다. 한편으로 조골세포를 주입/적용 전에 새로운 골수 농축물 및 혈소판 농축물에 혼합하고 연질 젤이 필요한 경우 자기조직 트롬빈 혈청과 추가로 배합시킬 수 있다.
본 발명에 따른 조골세포 제제는 골 결함, 골 이식 또는 골 질환의 치료에 유용하다.

Claims (27)

  1. 튜브(tube);
    상기 튜브 내에 배치된 요변성 젤(thixotropic gel);을 포함하고,
    상기 요변성 젤은 전혈로부터 트롬빈 혈청을 분리하는데 적합한 요변성 젤이며,
    상기 튜브는 트롬빈 혈청이 분리되기까지의 충분한 시간 동안 원심분리되기에 적합한 튜브인, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 원심분리는 8 분 내지 10 분 동안, 1000 g 내지 2000g 의 힘에서 수행되는 것인, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 튜브는 상기 요변성 젤만을 함유하고 있는, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 튜브는 유리 튜브(glass tube)인, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 트롬빈 혈청은 자기조직(autologous)인, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  6. 원심분리에 적합한 튜브(tube);
    상기 튜브 내에 배치된 요변성 젤(thixotropic gel);및
    상기 튜브 내에 배치된 응고 활성제(coagulation activator);를 포함하고,
    상기 요변성 젤은 전혈로부터 트롬빈 혈청을 분리하는데 적합한 요변성 젤인, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 튜브는 응고 활성제 하부에 배치된 요변성 젤만을 포함하는, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 응고 활성제는 칼슘 글루코네이트인, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  9. 원심분리에 적합한 유리 튜브;
    상기 튜브 내에 배치된 요변성 젤(thixotropic gel);을 포함하고,
    상기 요변성 젤은 8분 내지 10분 동안 원심분리를 할때, 전혈로부터 트롬빈 혈청을 분리하는데 적합한 요변성 젤이며,
    상기 튜브는 요변성 젤, 또는 요변성 젤과 응고 활성제만을 포함하고, 다른 첨가제는 포함하지 않는, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 튜브는 응고 활성제를 포함하는, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청 제조용 분리기 시스템.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 분리기 시스템에서 전혈로부터 원심분리를 통해 생성된, 상처 치유, 조직 재생 또는 지혈에 사용하기 위한 트롬빈 혈청.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 분리기 시스템; 및
    사혈 부속물;을 포함하는 키트.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 키트는 트롬빈 혈청 및 혈소판 농축물을 동시에 분배하기 위한 이중 주사기를 더 포함하는, 키트.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 키트는 상기 튜브의 원심분리를 위한 원심분리기를 더 포함하는, 키트.
  15. 트롬빈 혈청을 분리하기까지 제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나에 따른 분리기 시스템에서 전혈을 원심분리하는 단계;를 포함하는 트롬빈 혈청의 제조 방법.
  16. a) 제 11항에 따른 트롬빈 혈청, 및
    b) 혈소판 풍부 혈장(PRP) 조성물 또는 혈장 농축 조성물
    을 포함하는 상처 치유 또는 조직 치유 조성물.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 하나의 세포 추출물, 세포 조성물, TCP, 뼈 대체물, 키토산, 히아루론산, 크림, 크림 마스크, 지방 세포, 지방 조직, 골수 농축물, 루브리신, cd-젤라틴, 보툴리늄 독소, 칼슘 글루코네이트 및/또는 줄기 세포를 더 포함하는, 상처 치유 또는 조직 치유 조성물.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 세포 추출물은 각질세포, 골수 세포, 골아 세포, 연골 세포, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포, 랑게르한스 세포, 지방 세포(fat cell), 근육 세포, 탯줄 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 지방 세포(adipocyte), 줄기 세포, 골막 세포, 잇몸 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포, 인대 세포, 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포 중에서 선택된, 상처 치유 또는 조직 치유 조성물.
  19. 제 17항에 있어서,
    상기 PRP, 혈장 농축 조성물, 트롬빈 혈청, 및/또는 적어도 하나의 세포 추출물은 자기조직인, 상처 치유 또는 조직 치유 조성물.
  20. a) 제 11항에 따른 트롬빈 혈청을 제공하는 단계, 및
    b) PRP 조성물 또는 혈소판 농축 조성물과 상기 트롬빈 혈청을 혼합(admixing)하는 단계
    를 포함하는, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 하나의 세포 추출물, 세포 조성물, TCP, 뼈 대체물, 키토산, 히아루론산, 크림, 크림 마스크, 지방 세포, 지방 조직, 골수 농축물, 루브리신, cd-젤라틴, 보툴리늄 독소, 칼슘 글루코네이트 및/또는 줄기 세포와 함께 혼합하는 단계를 더 포함하는, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 세포 추출물은 각질세포, 골수 세포, 골아 세포, 연골 세포, 섬유아세포, 골막 또는 각막 세포, 멜라닌 세포, 랑게르한스 세포, 지방 세포(fat cell), 근육 세포, 탯줄 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방 전구 세포, 지방 세포(adipocyte), 줄기 세포, 골막 세포, 잇몸 세포, 내피 전구 세포, 슈반 세포, 인대 세포, 힘줄 세포 또는 췌장 섬 세포 중에서 선택된 것인, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법.
  23. 제 21항에 있어서,
    상기 트롬빈 혈청, PRP, 혈장 농축 조성물,및/또는 적어도 하나의 세포 추출물은 자기조직인, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법.
  24. 제 20항에 있어서,
    상기 PRP 또는 혈소판 농축 조성물을 트롬빈 혈청과 1:1 비, 3:1 비, 또는 10:1 비로 혼합하는, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법.
  25. 제 20항에 있어서,
    상기 트롬빈 혈청과 상기 PRP 또는 혈소판 농축 조성물은 동시에 제조되는, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 트롬빈 혈청과 상기 PRP 또는 혈소판 농축 조성물은 8분 내지 10분 동안 원심분리를 통해 제조되는, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법.
  27. 제 20항에 있어서,
    상기 방법은 상기 트롬빈 혈청과 상기 PRP 또는 혈소판 농축 조성물을 환자에 동시에 투여하는 단계를 더 포함하는, 상처 또는 조직 치유 조성물의 제조 방법.
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